KR20200130337A - Aav 키메라 - Google Patents
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Abstract
본원에는 상이한 혈청형의 역위 말단 반복부 (ITR) 및 rep 유전자를 사용하고/하거나 키메라 rep 유전자를 사용하는 것을 포함하는, 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV) 입자를 패키징하기 위한 조성물 및 방법이 제공된다.
Description
관련 출원
본 출원은 2018년 3월 6일에 출원된 미국 가출원 번호 62/639,466을 우선권 주장하며, 이 가출원의 전체 개시 내용은 본원에 참조로 포함된다.
아데노-연관 바이러스 (AAV) 입자는 통상적으로 연구에 사용되고, 또한 임상 개발에 있어서의 몇 가지를 포함한 유전자 요법 적용에 사용된다.
재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV) 입자를 소규모와 대규모 둘 다로 생산하기 위한 방법 및 조성물은 연구, 전임상 및 임상 적용에 유용하다.
재조합 AAV 입자 생산은 세포를 배양하는 단계, 이들 세포에, rAAV 입자에 패키징되기를 원하는 관심 유전자 및 AAV 유전자를 도입하는 단계, 및 세포가 rAAV 입자를 패키징 (또는 생산)할 수 있도록 하는 단계를 포함할 수 있다. rAAV 입자를 패키징하거나 또는 생산하는 세포는 본원에서 "생산자 세포"로서 지칭되기도 한다. 생산자 세포에 도입되는 AAV 유전자는 일반적으로, rep, cap, 헬퍼 유전자, 및 하나 이상의 관심 유전자를 플랭킹하는 역위 말단 반복부 (ITR)를 포함한다. 지난 10년 동안, 다수의 자연 혈청형 및 변이체로부터의 수많은 AAV cap 유전자가 상이한 유전자 요법 적용에 활용되어 왔다. 대조적으로, rep 및 ITR 서열의 변이, 및 이들이 rAAV 입자 패키징에 어떻게 영향을 미치는지는 탐구되지 않았다. 본 출원은 적어도 부분적으로, rep와 ITR 서열 둘 다가 상이한 혈청형의 rAAV 입자의 패키징을 개선하기 위해 변할 수 있다는 발견에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본 출원에 기재된 바와 같은 재조합 Rep 단백질 (예를 들어, 키메라 Rep 단백질) 및/또는 이를 코딩하는 유전자는 본 출원에 기재된 바와 같은 (예를 들어, 상이한 혈청형의) ITR 서열에 의해 플랭킹된 하나 이상의 관심 유전자를 포함한 재조합 rAAV 핵산을 포함하는 rAAV 입자의 생산에 사용될 수 있다.
따라서, 한 측면에서, 본원에는 rep 유전자를 포함하는 핵산을 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 rep 유전자는 키메라이다. 일부 실시양태에서, rep 유전자는 N-말단 및 C-말단 (c)을 포함한다. 일부 실시양태에서, N 말단은 N-말단 도메인 (n), DNA 결합 도메인 (d), 및 헬리카제 도메인 (h)을 포함한다. 일부 실시양태에서, C 말단은 NLS/p40 프로모터 도메인 (y) 및 아연 핑거 도메인 (z)을 포함한다. 일부 실시양태에서, rep 유전자는 혈청형 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV6, AAV12, AAV13, AAV1 및 AAV2, 또는 AAV5 및 AAV2의 것이거나, 또는 키메라이다.
일부 실시양태에서, N 말단은 AAV1 혈청형의 것이고 C 말단은 AAV2 혈청형의 것이다. 일부 실시양태에서, N 말단은 AAV2 혈청형의 것이고 C 말단은 AAV1 혈청형의 것이다. 일부 실시양태에서, N 말단은 AAV2 혈청형의 것이고 C 말단은 AAV5 혈청형의 것이다. 일부 실시양태에서, N 말단은 AAV5 혈청형의 것이고 C 말단은 AAV2 혈청형의 것이다.
일부 실시양태에서, n, d, y, 및 z 도메인은 AAV2 혈청형의 것이고 h 도메인은 AAV1 혈청형의 것이다. 일부 실시양태에서, n, h, y, 및 z 도메인은 AAV2 혈청형의 것이고 d 도메인은 AAV1 혈청형의 것이다. 일부 실시양태에서, d, h, y, 및 z 도메인은 AAV2 혈청형의 것이고 n 도메인은 AAV1 혈청형의 것이다. 일부 실시양태에서, n, d, 및 h 도메인은 AAV1 혈청형의 것이고 y 및 z 도메인은 AAV1 혈청형의 것이다. 일부 실시양태에서, d 및 h 도메인은 AAV1 혈청형의 것이고 n, y 및 z 도메인은 AAV2 혈청형의 것이다. 일부 실시양태에서, n 및 d 도메인은 AAV1 혈청형의 것이고 h, y, 및 z 도메인은 AAV2 혈청형의 것이다.
일부 실시양태에서, n, d, 및 h 도메인은 AAV2 혈청형의 것이고 y 및 z 도메인은 AAV3 혈청형의 것이다. 일부 실시양태에서, AAV2 혈청형의 것인 n, d, 및 h 도메인 및 AAV3 혈청형의 것인 y 및 z 도메인을 갖는 rep 유전자는 서열 ACG의 출발 코돈을 갖는다. 일부 실시양태에서, rep 유전자는 AAV3 혈청형의 것이고 서열 ATG의 출발 코돈을 갖는다.
일부 실시양태에서, rep 유전자는 AAV4 혈청형의 것이고, 서열 ACG의 출발 코돈을 갖는다.
일부 실시양태에서, rep 유전자는 AAV2 혈청형의 것이고, 서열 ACG의 출발 코돈을 갖는다.
일부 실시양태에서, n 및 h 도메인은 AAV8 혈청형의 것이고 d, y 및 z 도메인은 AAV2 혈청형의 것이다. 일부 실시양태에서, n 및 d 도메인은 AAV1 혈청형의 것이고 h, y, 및 z 도메인은 AAV2 혈청형의 것이다.
일부 실시양태에서, rep 유전자는 AAV2 혈청형의 것이고, 서열 ACG의 출발 코돈을 갖는다. 일부 실시양태에서, rep 유전자는 AAV7 혈청형의 것이고, 서열 ACG의 출발 코돈을 갖는다.
일부 실시양태에서, n 및 h 도메인은 AAV8 혈청형의 것이고 d, y, 및 z 도메인은 AAV2 혈청형의 것이며, rep 유전자는 서열 ATG의 출발 코돈을 갖는다. 일부 실시양태에서, n, h 및 d 도메인은 AAV1 혈청형의 것이고 y 및 z 도메인은 AAV2 혈청형의 것이며, rep 유전자는 서열 ATG의 출발 코돈을 갖는다. 일부 실시양태에서, n 및 h 도메인은 AAV8 혈청형의 것이고, 서열식별번호 (SEQ ID NO): 125에 따른 하기 뉴클레오티드: T574, C592, C607, A637, G644, 및 C657이 d 도메인에서 결실되며 (결과적으로 서열식별번호: 126), y 및 z 도메인은 AAV2 혈청형의 것이고, rep 유전자는 서열 ATG의 출발 코돈을 갖는다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물 중 어느 하나는 cap 유전자를 포함하는 핵산을 추가로 포함한다. cap 유전자는 임의의 혈청형 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 13)의 것일 수 있다.
일부 실시양태에서, rep 유전자를 포함하는 핵산 및 cap 유전자를 포함하는 핵산은 핵산 벡터에 의해 포함된다. 일부 실시양태에서, rep 유전자를 포함하는 핵산 및 cap 유전자를 포함하는 핵산을 포함하는 핵산 벡터는 ITR 쌍을 포함하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 관심 유전자는 이러한 ITR 쌍에 의해 플랭킹된다.
따라서, 한 측면에서, 본원에는 제1 혈청형의 rep 유전자를 발현하는 세포를 제2 혈청형의 역위 말단 반복부 (ITR) 쌍을 포함하는 재조합 핵산과 접촉시키는 단계를 포함하는, 재조합 아데노-연관 바이러스 (AAV) 입자를 패키징하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, rep 유전자는 이러한 rep 유전자를 코딩하는 핵산으로 상기 세포를 형질감염 또는 감염시킴으로써 발현된다. 일부 실시양태에서, rep 유전자는 키메라이다. 키메라 rep 유전자는 1개 초과의 AAV 혈청형의 상응하는 핵산 염기를 포함하는 유전자이다. 일부 실시양태에서, rep 유전자는 혈청형 1, 2, 3, 4, 6, 12, 13, 1 및 2, 또는 5 및 2의 것이다.
본원에 개시된 방법 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 혈청형 1 및 2의 rep 유전자에 의해 코딩된 Rep 단백질은 N 말단 내에 혈청형 1의 아미노산 및 C 말단 내에 혈청형 2의 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 혈청형 1 및 2의 rep 유전자에 의해 코딩된 Rep 단백질은 N 말단 내에 혈청형 2의 아미노산 및 C 말단 내에 혈청형 1의 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 혈청형 2 및 5의 rep 유전자에 의해 코딩된 Rep 단백질은 N 말단 내에 혈청형 2의 아미노산 및 C 말단 내에 혈청형 5의 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 혈청형 5 및 2의 rep 유전자에 의해 코딩된 Rep 단백질은 N 말단 내에 혈청형 5의 아미노산 및 C 말단 내에 혈청형 2의 아미노산을 포함한다.
본원에 개시된 방법 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, rep 유전자의 제1 혈청형은 혈청형 1이다. 일부 실시양태에서, rep 유전자의 제1 혈청형은 혈청형 1이고, ITR의 제2 혈청형은 혈청형 1, 2, 3, 4, 또는 7이다. 일부 실시양태에서, rep 유전자의 제1 혈청형은 혈청형 1이고, ITR의 제2 혈청형은 혈청형 1이다. 일부 실시양태에서, rep 유전자의 제1 혈청형은 혈청형 1이고, ITR의 제2 혈청형은 혈청형 2이다. 일부 실시양태에서, rep 유전자의 제1 혈청형은 혈청형 1이고, ITR의 제2 혈청형은 혈청형 3이다. 일부 실시양태에서, rep 유전자의 제1 혈청형은 혈청형 1이고, ITR의 제2 혈청형은 혈청형 4이다. 일부 실시양태에서, rep 유전자의 제1 혈청형은 혈청형 1이고, ITR의 제2 혈청형은 혈청형 7이다.
본원에 개시된 방법 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, ITR의 제2 혈청형은혈청형 6이다. 본원에 개시된 방법 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, ITR의 제2 혈청형은 혈청형 6이고, rep 유전자의 제1 혈청형은 혈청형 2, 3, 4, 6, 12, 또는 13이다. 본원에 개시된 방법 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, ITR의 제2 혈청형은 혈청형 6이고, rep 유전자의 제1 혈청형은 혈청형 2이다. 본원에 개시된 방법 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, ITR의 제2 혈청형은 혈청형 6이고, rep 유전자의 제1 혈청형은 혈청형 3이다. 본원에 개시된 방법 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, ITR의 제2 혈청형은 혈청형 6이고, rep 유전자의 제1 혈청형은 혈청형 4이다. 본원에 개시된 방법 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, ITR의 제2 혈청형은 혈청형 6이고, rep 유전자의 제1 혈청형은 혈청형 6이다. 본원에 개시된 방법 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, ITR의 제2 혈청형은 혈청형 6이고, rep 유전자의 제1 혈청형은 혈청형 12이다. 본원에 개시된 방법 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, ITR의 제2 혈청형은 혈청형 6이고, rep 유전자의 제1 혈청형은 혈청형 13이다.
본원에 개시된 방법 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, ITR의 제2 혈청형은 혈청형 1이다. 본원에 개시된 방법 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, ITR의 제2 혈청형은 혈청형 1이고, rep 유전자의 제1 혈청형은 혈청형 2, 3, 4, 12, 또는 13이다. 본원에 개시된 방법 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, ITR의 제2 혈청형은 혈청형 1이고, rep 유전자의 제1 혈청형은 혈청형 2이다. 본원에 개시된 방법 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, ITR의 제2 혈청형은 혈청형 1이고, rep 유전자의 제1 혈청형은 혈청형 3이다. 본원에 개시된 방법 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, ITR의 제2 혈청형은 혈청형 1이고, rep 유전자의 제1 혈청형은 혈청형 4이다. 본원에 개시된 방법 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, ITR의 제2 혈청형은 혈청형 1이고, rep 유전자의 제1 혈청형은 혈청형 12이다. 본원에 개시된 방법 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, ITR의 제2 혈청형은 혈청형 1이고, rep 유전자의 제1 혈청형은 혈청형 13이다.
일부 실시양태에서, 혈청형 1 및 2의 rep 유전자에 의해 코딩된 Rep 단백질은 N 말단 내에 혈청형 1의 아미노산 및 C 말단 내에 혈청형 2의 아미노산을 포함하고, ITR의 제2 혈청형은 혈청형 1이다. 일부 실시양태에서, 혈청형 1 및 2의 rep 유전자에 의해 코딩된 Rep 단백질은 N 말단 내에 혈청형 1의 아미노산 및 C 말단 내에 혈청형 2의 아미노산을 포함하고, ITR의 제2 혈청형은 혈청형 6이다.
일부 실시양태에서, 혈청형 2 및 1의 rep 유전자에 의해 코딩된 Rep 단백질은 N 말단 내에 혈청형 2의 아미노산 및 C 말단 내에 혈청형 1의 아미노산을 포함하고, ITR의 제2 혈청형은 혈청형 1이다. 일부 실시양태에서, 혈청형 2 및 1의 rep 유전자에 의해 코딩된 Rep 단백질은 N 말단 내에 혈청형 2의 아미노산 및 C 말단 내에 혈청형 1의 아미노산을 포함하고, ITR의 제2 혈청형은 혈청형 6이다.
일부 실시양태에서, 혈청형 2 및 5의 rep 유전자에 의해 코딩된 Rep 단백질은 N 말단 내에 혈청형 2의 아미노산 및 C 말단 내에 혈청형 5의 아미노산을 포함하고, ITR의 제2 혈청형은 혈청형 2이다.
일부 실시양태에서, 혈청형 5 및 2의 rep 유전자에 의해 코딩된 Rep 단백질은 N 말단 내에 혈청형 5의 아미노산 및 C 말단 내에 혈청형 2의 아미노산을 포함하고, ITR의 제2 혈청형은 혈청형 5이다.
일부 실시양태에서, n, d, y, 및 z 도메인은 AAV2 혈청형의 것이고 h 도메인은 AAV1 혈청형의 것이다. 일부 실시양태에서, n, h, y, 및 z 도메인은 AAV2 혈청형의 것이고 d 도메인은 AAV1 혈청형의 것이다. 일부 실시양태에서, d, h, y, 및 z 도메인은 AAV2 혈청형의 것이고 n 도메인은 AAV1 혈청형의 것이다. 일부 실시양태에서, n, d, 및 h 도메인은 AAV1 혈청형의 것이고 y 및 z 도메인은 AAV1 혈청형의 것이다. 일부 실시양태에서, d 및 h 도메인은 AAV1 혈청형의 것이고 n, y 및 z 도메인은 AAV2 혈청형의 것이다. 일부 실시양태에서, n 및 d 도메인은 AAV1 혈청형의 것이고 h, y, 및 z 도메인은 AAV2 혈청형의 것이다.
일부 실시양태에서, n, d, 및 h 도메인은 AAV2 혈청형의 것이고 y 및 z 도메인은 AAV3 혈청형의 것이다. 일부 실시양태에서, AAV2 혈청형의 것인 n, d, 및 h 도메인 및 AAV3 혈청형의 것인 y 및 z 도메인을 갖는 rep 유전자는 서열 ACG의 출발 코돈을 갖는다. 일부 실시양태에서, rep 유전자는 AAV3 혈청형의 것이고, 서열 ATG의 출발 코돈을 갖는다.
일부 실시양태에서, rep 유전자는 AAV4 혈청형의 것이고, 서열 ACG의 출발 코돈을 갖는다.
일부 실시양태에서, rep 유전자는 AAV2 혈청형의 것이고, 서열 ACG의 출발 코돈을 갖는다.
일부 실시양태에서, n 및 h 도메인은 AAV8 혈청형의 것이고 d, y 및 z 도메인은 AAV2 혈청형의 것이다. 일부 실시양태에서, n 및 d 도메인은 AAV1 혈청형의 것이고 h, y, 및 z 도메인은 AAV2 혈청형의 것이다.
일부 실시양태에서, rep 유전자는 AAV2 혈청형의 것이고, 서열 ACG의 출발 코돈을 갖는다. 일부 실시양태에서, rep 유전자는 AAV7 혈청형의 것이고, 서열 ACG의 출발 코돈을 갖는다.
일부 실시양태에서, n 및 h 도메인은 AAV8 혈청형의 것이고 d, y, 및 z 도메인은 AAV2 혈청형의 것이며, rep 유전자는 서열 ATG의 출발 코돈을 갖는다. 일부 실시양태에서, n, h 및 d 도메인은 AAV1 혈청형의 것이고 y 및 z 도메인은 AAV2 혈청형의 것이며, rep 유전자는 서열 ATG의 출발 코돈을 갖는다. 일부 실시양태에서, n 및 h 도메인은 AAV8 혈청형이고, 서열식별번호: 125에 따른 하기 뉴클레오티드: T574, C592, C607, A637, G644, 및 C657이 d 도메인에서 결실되며 (결과적으로 서열식별번호: 126), y 및 z 도메인은 AAV2 혈청형의 것이고, rep 유전자는 서열 ATG의 출발 코돈을 갖는다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물 중 어느 하나는 cap 유전자를 포함하는 핵산을 추가로 포함한다. cap 유전자는 임의의 혈청형 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 13)의 것일 수 있다.
본원에 개시된 방법 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 세포는 또한, cap 유전자를 포함하는 재조합 핵산과 접촉된다. 본원에 개시된 방법 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, rep 유전자를 발현하고, 제2 혈청형의 역위 말단 반복부 (ITR) 쌍을 포함하는 재조합 핵산과 접촉되는 세포는 또한, cap 유전자를 발현한다.
일부 측면에서, 본 출원은 또한, 제1 혈청형의 rep 유전자 및 제2 혈청형의 ITR 쌍을 포함하는 세포를 제공한다. 본원에 제공된 바와 같은 세포는 본원에 개시된 ITR 및 rep 유전자의 조합 중 어느 하나를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 세포 중 어느 하나는 cap 유전자를 추가로 포함한다.
하기 도면은 본 명세서의 일부를 형성하고 본 출원의 특정 측면을 추가로 입증하기 위해 포함되며, 이는 본원에 제시된 구체적 실시양태의 상세한 설명과 조합하여 이들 도면 중 하나 이상을 참조함으로써 더 잘 이해될 수 있다. 본 도면에 예시된 데이터는 본 출원의 범위를 어떠한 방식으로든 제한하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 AAV 혈청형 1-13의 rep 및 ITR 서열의 정렬을 도시한다.
도 2는 상이한 AAV 혈청형 간에 발견된 염기쌍에 있어서의 변이를 갖는 AAV ITR의 구조를 도시한다. RBE: AAV Rep78 및 Rep68 단백질이 결합하는 Rep 결합 요소.
도 3은 AAV1 대 AAV2 Rep 단백질 서열 동일성의 그래프 표현을 도시한다.
도 4는 표준 AAV 벡터 생산 시스템을 보여주는 개략도이다.
도 5는 AAV 혈청형 1-9에 대한 AAV ITR 및 Rep78에 대한 퍼센트 서열 동일성 분석을 도시한다.
도 6은 역위 말단 반복부 (ITR)에 의해 플랭킹된 2개의 오픈 리딩 프레임을 갖는 AAV 게놈의 개요를 도시한다. 확대는 Rep 단백질의 도메인과 Rep78/68/52/40의 발현으로 이어지는 전사체의 예시를 도시한다. 하이브리드 세대에 사용되는 rep 유전자의 영역은 소문자로 표시된다: n = N-말단, d = DNA 결합 도메인, h = 헬리카제, c = C-말단, y = 핵 국소화 신호 (NLS)/p40 프로모터, z = 아연 핑거 도메인.
도 7a-7b는 AAV1 벡터 생산을 위한 rep 유전자의 특징규명 및 최적화를 도시한다. 도 7a는 rep 유전자에 있어서의 변이를 갖는 AAV 플라스미드 디자인의 예를 도시한다. pR2V1은 AAV1 서열의 cap 유전자, 및 AAV2 서열의 rep 유전자를 갖는 플라스미드를 나타낸다. pR2h1V1은 헬리카제 도메인 (h)이 AAV1 서열의 것인 점을 제외하고는, AAV1 서열의 cap 유전자 및 AAV2 서열의 rep 유전자를 갖는 플라스미드를 나타낸다. pR2d1V1은 DNA 결합 도메인 (d)이 AAV1 서열의 것인 점을 제외하고는, AAV1 서열의 cap 유전자 및 AAV2 서열의 rep 유전자를 갖는 플라스미드를 나타낸다. pR2n1V1은 N-말단 도메인 (n)이 AAV1 서열의 것인 점을 제외하고는, AAV1 서열의 cap 유전자 및 AAV2 서열의 rep 유전자를 갖는 플라스미드를 나타낸다. pR1c2V1은 NLS/p40 프로모터 도메인 (y) 및 아연 핑거 도메인 (z)으로 이루어지는 C 말단 (c)이 AAV2 서열의 것인 점을 제외하고는, AAV1 서열의 cap 유전자 및 AAV1 서열의 rep 유전자를 갖는 플라스미드를 나타낸다. pR1hc2V1은 C 말단 (c) 및 헬리카제 도메인 (h)이 AAV2 서열의 것인 점을 제외하고는, AAV1 서열의 cap 유전자 및 AAV1 서열의 rep 유전자를 갖는 플라스미드를 나타낸다. pR1dc2V1은 DNA 결합 도메인 (d), 및 C 말단 (c)이 AAV2 서열의 것인 점을 제외하고는, AAV1 서열의 cap 유전자 및 AAV1 서열의 rep 유전자를 갖는 플라스미드를 나타낸다. pR1nc2V1은 N-말단 도메인 (n), 및 C 말단 (c)이 AAV2 서열의 것인 점을 제외하고는, AAV1 서열의 cap 유전자 및 AAV1 서열의 rep 유전자를 갖는 플라스미드를 나타낸다.
도 7b는 도 7a에 도시된 플라스미드의 게놈 패키징 효율을 도시한다. 게놈 패키징 효율은 혈청형 1의 캡시드 단백질 및 혈청형 2의 rep 단백질 (참조)을 갖는 입자와 비교해서 rAAV 입자에 패키징된 게놈의 양으로서 계산된다.
도 8은 새로 생성된 AAV1 생산 플라스미드 및 그의 표현형의 개요를 제공한다. 플라스미드 명칭, rep 유전자의 설명, VP 발현 및 게놈 패키징 효율이 제시된다.
도 9a-9d는 AAV3 벡터 생산을 위한 rep 유전자의 특징규명 및 최적화를 제공한다. 도 9a는 자연적으로 발생하는 ACG 출발 코돈, 또는 ATG 출발 코돈을 수반한 AAV2 및 AAV3 rep 변이의 예를 보여주는 개략도이다. 도 9b는 도 9a에 도시된 플라스미드에 대한 캡시드 단백질 또는 VP 단백질 및 Rep 단백질의 발현을 도시한다. AAV3 Rep78은 ACG 출발 코돈을 수반한 것으로 보이지 않는다. 도 9c는 도 9a에 도시된 바와 같이 ACG-R2C3, ACG-R3V3 및 ATG-R3V3의 15 cm 플레이트 당 벡터 게놈의 수율 (x1012)을 제공한다. 도 9d는 시험된 AAV3 발현 플라스미드의 플라스미드 명칭 및 설명을 보여주는 차트이다.
도 10a-10d는 AAV4 벡터 생산을 위한 rep 유전자의 특징규명 및 최적화를 제공한다. 도 10a는 자연적으로 발생하는 ACG 출발 코돈, 또는 ATG 출발 코돈을 수반한 AAV2 및 AAV4 rep 변이의 예를 보여주는 개략도이다. 도 10b는 도 10a에 도시된 플라스미드에 대한 캡시드 단백질 또는 VP 단백질 및 Rep 단백질의 발현을 도시한다. 별표는 A1 항체의 공지된 교차 반응성을 나타낸다. 도 10c는 도 10a에 도시된 바와 같이 ACG-R2C3, ACG-R3V3 및 ATG-R3V3의 15 cm 플레이트 당 벡터 게놈의 수율 (x1012)을 제공한다. 도 10d는 AAV4 발현 플라스미드의 명칭 및 설명을 보여주는 차트이다.
도 11a-11d는 AAV5 벡터 생산을 위한 rep 유전자의 특징규명 및 최적화를 제공한다. 도 11a는 자연적으로 발생하는 ACG 출발 코돈, 또는 ATG 출발 코돈을 수반한 AAV2 및 AAV5 rep 변이의 예를 보여주는 개략도이다. 도 11b는 도 11a에 도시된 플라스미드에 대한 캡시드 단백질 또는 VP 단백질 및 Rep 단백질의 발현을 도시한다. AAV5 Rep78은 ACG 출발 코돈을 수반한 것으로 보이지 않는다. 도 11c는 ACG-R2V5, ACG-R5V5, 및 ATG-R5V5의 15 cm 플레이트 당 플라스미드 수율 (x1012)을 도시한다. 도 11d는 AAV5 발현 플라스미드의 명칭 및 설명을 보여주는 차트이며, 이들 모두는 AAV5 cap 유전자를 함유한다.
도 12a-12c는 AAV6 벡터 생산을 위한 rep 유전자의 특징규명 및 최적화를 제공한다. 도 12a는 표시된 플라스미드에 대한 캡시드 단백질 또는 VP 단백질 및 Rep 단백질의 발현뿐만 아니라 대조군 (비-형질감염된 세포)과 비교한 그들의 수율을 도시한다. 도 12b는 R2V6과 비교한 R8d1c3V6 및 R1hc2V6에 대한 게놈 패키징 효율을 제공한다. 도 12c는 AAV6 발현 플라스미드의 명칭 및 설명을 보여주는 차트이다.
도 13a-13d는 AAV7 벡터 생산을 위한 rep 유전자의 특징규명 및 최적화를 제공한다. 도 13a는 자연적으로 발생하는 ACG 출발 코돈, 또는 ATG 출발 코돈을 수반한 AAV2 및 AAV7 rep 변이의 예를 보여주는 개략도이다. 도 13b는 도 13a에 도시된 플라스미드에 대한 캡시드 단백질 또는 VP 단백질 및 Rep 단백질의 발현을 도시한다. 도 13c는 ACG-R2V7, ACG-R7V7 및 ATG-R7V7의 15 cm 플레이트 당 플라스미드 수율 (x1012)을 도시한다. 도 13d는 AAV7 발현 플라스미드의 명칭 및 설명을 보여주는 차트이다.
도 14a-14b는 AAV8 벡터 생산을 위한 rep 유전자의 특징규명 및 최적화를 제공한다. 도 14a는 R2V8, R8c2V8, R1c2V8, R8n1c2V8, R8d1c2V8, 및 R8h1c2V8에 대한 15 cm 플레이트 당 플라스미드 수율 (gp)을 도시한다. 도 14b는 예시적 AAV1, AAV2 및 AAV8 rep 변이의 개략도를 도시한다.
도 15a-15b는 본원에 기재된 바와 같이 rep 키메라를 사용한 벡터 생산과 비교해서 '표준' AAV 벡터 생산에 대한 게놈 함유 AAV8 입자의 비율의 예를 도시한다.
도 16a는 pR2V8과 비교한 VP 단백질의 게놈 패키징 효율 및 발현과 함께, AAV8 발현 플라스미드의 명칭 및 설명을 보여주는 차트이다. 도 16b는 도 16a에 열거된 마지막 하이브리드에 대한 AAV8의 DNA 결합 도메인 (d)에서 뉴클레오티드가 결실되었다는 것을 보여준다.
도 1은 AAV 혈청형 1-13의 rep 및 ITR 서열의 정렬을 도시한다.
도 2는 상이한 AAV 혈청형 간에 발견된 염기쌍에 있어서의 변이를 갖는 AAV ITR의 구조를 도시한다. RBE: AAV Rep78 및 Rep68 단백질이 결합하는 Rep 결합 요소.
도 3은 AAV1 대 AAV2 Rep 단백질 서열 동일성의 그래프 표현을 도시한다.
도 4는 표준 AAV 벡터 생산 시스템을 보여주는 개략도이다.
도 5는 AAV 혈청형 1-9에 대한 AAV ITR 및 Rep78에 대한 퍼센트 서열 동일성 분석을 도시한다.
도 6은 역위 말단 반복부 (ITR)에 의해 플랭킹된 2개의 오픈 리딩 프레임을 갖는 AAV 게놈의 개요를 도시한다. 확대는 Rep 단백질의 도메인과 Rep78/68/52/40의 발현으로 이어지는 전사체의 예시를 도시한다. 하이브리드 세대에 사용되는 rep 유전자의 영역은 소문자로 표시된다: n = N-말단, d = DNA 결합 도메인, h = 헬리카제, c = C-말단, y = 핵 국소화 신호 (NLS)/p40 프로모터, z = 아연 핑거 도메인.
도 7a-7b는 AAV1 벡터 생산을 위한 rep 유전자의 특징규명 및 최적화를 도시한다. 도 7a는 rep 유전자에 있어서의 변이를 갖는 AAV 플라스미드 디자인의 예를 도시한다. pR2V1은 AAV1 서열의 cap 유전자, 및 AAV2 서열의 rep 유전자를 갖는 플라스미드를 나타낸다. pR2h1V1은 헬리카제 도메인 (h)이 AAV1 서열의 것인 점을 제외하고는, AAV1 서열의 cap 유전자 및 AAV2 서열의 rep 유전자를 갖는 플라스미드를 나타낸다. pR2d1V1은 DNA 결합 도메인 (d)이 AAV1 서열의 것인 점을 제외하고는, AAV1 서열의 cap 유전자 및 AAV2 서열의 rep 유전자를 갖는 플라스미드를 나타낸다. pR2n1V1은 N-말단 도메인 (n)이 AAV1 서열의 것인 점을 제외하고는, AAV1 서열의 cap 유전자 및 AAV2 서열의 rep 유전자를 갖는 플라스미드를 나타낸다. pR1c2V1은 NLS/p40 프로모터 도메인 (y) 및 아연 핑거 도메인 (z)으로 이루어지는 C 말단 (c)이 AAV2 서열의 것인 점을 제외하고는, AAV1 서열의 cap 유전자 및 AAV1 서열의 rep 유전자를 갖는 플라스미드를 나타낸다. pR1hc2V1은 C 말단 (c) 및 헬리카제 도메인 (h)이 AAV2 서열의 것인 점을 제외하고는, AAV1 서열의 cap 유전자 및 AAV1 서열의 rep 유전자를 갖는 플라스미드를 나타낸다. pR1dc2V1은 DNA 결합 도메인 (d), 및 C 말단 (c)이 AAV2 서열의 것인 점을 제외하고는, AAV1 서열의 cap 유전자 및 AAV1 서열의 rep 유전자를 갖는 플라스미드를 나타낸다. pR1nc2V1은 N-말단 도메인 (n), 및 C 말단 (c)이 AAV2 서열의 것인 점을 제외하고는, AAV1 서열의 cap 유전자 및 AAV1 서열의 rep 유전자를 갖는 플라스미드를 나타낸다.
도 7b는 도 7a에 도시된 플라스미드의 게놈 패키징 효율을 도시한다. 게놈 패키징 효율은 혈청형 1의 캡시드 단백질 및 혈청형 2의 rep 단백질 (참조)을 갖는 입자와 비교해서 rAAV 입자에 패키징된 게놈의 양으로서 계산된다.
도 8은 새로 생성된 AAV1 생산 플라스미드 및 그의 표현형의 개요를 제공한다. 플라스미드 명칭, rep 유전자의 설명, VP 발현 및 게놈 패키징 효율이 제시된다.
도 9a-9d는 AAV3 벡터 생산을 위한 rep 유전자의 특징규명 및 최적화를 제공한다. 도 9a는 자연적으로 발생하는 ACG 출발 코돈, 또는 ATG 출발 코돈을 수반한 AAV2 및 AAV3 rep 변이의 예를 보여주는 개략도이다. 도 9b는 도 9a에 도시된 플라스미드에 대한 캡시드 단백질 또는 VP 단백질 및 Rep 단백질의 발현을 도시한다. AAV3 Rep78은 ACG 출발 코돈을 수반한 것으로 보이지 않는다. 도 9c는 도 9a에 도시된 바와 같이 ACG-R2C3, ACG-R3V3 및 ATG-R3V3의 15 cm 플레이트 당 벡터 게놈의 수율 (x1012)을 제공한다. 도 9d는 시험된 AAV3 발현 플라스미드의 플라스미드 명칭 및 설명을 보여주는 차트이다.
도 10a-10d는 AAV4 벡터 생산을 위한 rep 유전자의 특징규명 및 최적화를 제공한다. 도 10a는 자연적으로 발생하는 ACG 출발 코돈, 또는 ATG 출발 코돈을 수반한 AAV2 및 AAV4 rep 변이의 예를 보여주는 개략도이다. 도 10b는 도 10a에 도시된 플라스미드에 대한 캡시드 단백질 또는 VP 단백질 및 Rep 단백질의 발현을 도시한다. 별표는 A1 항체의 공지된 교차 반응성을 나타낸다. 도 10c는 도 10a에 도시된 바와 같이 ACG-R2C3, ACG-R3V3 및 ATG-R3V3의 15 cm 플레이트 당 벡터 게놈의 수율 (x1012)을 제공한다. 도 10d는 AAV4 발현 플라스미드의 명칭 및 설명을 보여주는 차트이다.
도 11a-11d는 AAV5 벡터 생산을 위한 rep 유전자의 특징규명 및 최적화를 제공한다. 도 11a는 자연적으로 발생하는 ACG 출발 코돈, 또는 ATG 출발 코돈을 수반한 AAV2 및 AAV5 rep 변이의 예를 보여주는 개략도이다. 도 11b는 도 11a에 도시된 플라스미드에 대한 캡시드 단백질 또는 VP 단백질 및 Rep 단백질의 발현을 도시한다. AAV5 Rep78은 ACG 출발 코돈을 수반한 것으로 보이지 않는다. 도 11c는 ACG-R2V5, ACG-R5V5, 및 ATG-R5V5의 15 cm 플레이트 당 플라스미드 수율 (x1012)을 도시한다. 도 11d는 AAV5 발현 플라스미드의 명칭 및 설명을 보여주는 차트이며, 이들 모두는 AAV5 cap 유전자를 함유한다.
도 12a-12c는 AAV6 벡터 생산을 위한 rep 유전자의 특징규명 및 최적화를 제공한다. 도 12a는 표시된 플라스미드에 대한 캡시드 단백질 또는 VP 단백질 및 Rep 단백질의 발현뿐만 아니라 대조군 (비-형질감염된 세포)과 비교한 그들의 수율을 도시한다. 도 12b는 R2V6과 비교한 R8d1c3V6 및 R1hc2V6에 대한 게놈 패키징 효율을 제공한다. 도 12c는 AAV6 발현 플라스미드의 명칭 및 설명을 보여주는 차트이다.
도 13a-13d는 AAV7 벡터 생산을 위한 rep 유전자의 특징규명 및 최적화를 제공한다. 도 13a는 자연적으로 발생하는 ACG 출발 코돈, 또는 ATG 출발 코돈을 수반한 AAV2 및 AAV7 rep 변이의 예를 보여주는 개략도이다. 도 13b는 도 13a에 도시된 플라스미드에 대한 캡시드 단백질 또는 VP 단백질 및 Rep 단백질의 발현을 도시한다. 도 13c는 ACG-R2V7, ACG-R7V7 및 ATG-R7V7의 15 cm 플레이트 당 플라스미드 수율 (x1012)을 도시한다. 도 13d는 AAV7 발현 플라스미드의 명칭 및 설명을 보여주는 차트이다.
도 14a-14b는 AAV8 벡터 생산을 위한 rep 유전자의 특징규명 및 최적화를 제공한다. 도 14a는 R2V8, R8c2V8, R1c2V8, R8n1c2V8, R8d1c2V8, 및 R8h1c2V8에 대한 15 cm 플레이트 당 플라스미드 수율 (gp)을 도시한다. 도 14b는 예시적 AAV1, AAV2 및 AAV8 rep 변이의 개략도를 도시한다.
도 15a-15b는 본원에 기재된 바와 같이 rep 키메라를 사용한 벡터 생산과 비교해서 '표준' AAV 벡터 생산에 대한 게놈 함유 AAV8 입자의 비율의 예를 도시한다.
도 16a는 pR2V8과 비교한 VP 단백질의 게놈 패키징 효율 및 발현과 함께, AAV8 발현 플라스미드의 명칭 및 설명을 보여주는 차트이다. 도 16b는 도 16a에 열거된 마지막 하이브리드에 대한 AAV8의 DNA 결합 도메인 (d)에서 뉴클레오티드가 결실되었다는 것을 보여준다.
rAAV 입자를 패키징하기 위해, 두 개의 플랭킹 ITR 사이에서 발견되는 바이러스 게놈을 하나 이상의 제어 서열 (예를 들어, 프로모터)과 함께 하나 이상의 관심 유전자로 대체한다. 일반적으로, rAAV 입자를 구축할 때, 패키징될 유전자는 시스-활성 ITR에 의해 플랭킹되는 반면, 야생형 게놈에서 코딩되는 rep 및 cap 유전자는 트랜스로 공급될 수 있다. cap 유전자는 패키징된 유전 물질을 캡슐화하는 캡시드 단백질을 코딩한다. rep 유전자는 바이러스 DNA의 복제에 관여하는 단백질을 코딩한다. 지난 10년 동안, 다수의 자연 혈청형 및 변이체로부터의 수많은 AAV cap 유전자가 상이한 유전자 요법 적용에 활용되어 왔다. 일반적으로, 혈청형 2의 ITR 및 rep 유전자는 다양한 혈청형의 rAAV 입자를 패키징하는 데 사용된다. 본 출원은 상이한 혈청형의 ITR 및 rep 유전자를 사용하여 rAAV 입자를 패키징하기 위한 신규 방법 및 조성물을 제공한다. 본원에 사용된 바와 같이, "rAAV 입자의 패키징"은 하나 이상의 관심 유전자를 포함할 수 있는, ITR에 의해 플랭킹되는 핵산 서열을 rAAV 입자 내로 패킹하는 것을 의미한다.
본 출원의 발명자들은 rAAV 입자의 패키징을 개선하기 위해 ITR 및 rep 유전자의 서열이 어떻게 변할 수 있는지를 탐구하였다. 따라서, 본원에는 생산자 세포뿐만 아니라, rAAV 입자를 생산하는 데 사용되는 ITR의 혈청형과 상이한 혈청형의 Rep 단백질을 발현하는 세포를 형질감염시키는 데 사용하기 위한, 키메라 rep 유전자를 포함한 상이한 혈청형의 ITR 및/또는 rep를 포함하는 핵산 (예를 들어, 벡터, 예컨대 플라스미드 내에 포함됨)의 조성물이 제공된다. 본원에 정의된 바와 같이, "하이브리드" AAV 유전자로서 지칭되기도 하는 "키메라" AAV 유전자 (예를 들어, rep 또는 cap), 또는 "하이브리드" AAV 단백질로서 지칭되기도 하는 "키메라" AAV 단백질 (예를 들어, Rep (예를 들어, Rep78, Rep68, Rep52, 또는 Rep40) 또는 캡시드 단백질 (예를 들어, VP1, VP2, 및 VP3))은 각각 2가지 이상의 AAV 혈청형의 뉴클레오티드 또는 아미노산을 갖는 유전자 또는 단백질이다.
rAAV 입자 패키징을 개선하기 위해 상이한 혈청형의 ITR 및 rep 유전자를 사용하는 방법이 또한 본원에 개시된다. 일부 실시양태에서, 키메라 ITR 및/또는 키메라 rep 유전자가 rAAV 입자 패키징에 사용된다.
AAV 구조
AAV 게놈은 양성 또는 음성 센스되는 단일 가닥 데옥시리보핵산 (ssDNA)으로 구성된다. DNA 가닥의 각각의 끝에는 역위 말단 반복부 (ITR)가 있다. ITR 사이에는 2개의 오픈 리딩 프레임 (ORF)인 rep 및 cap가 있다. cap ORF는 캡시드 단백질: VP1, VP2 및 VP3의 중복되는 뉴클레오티드 서열을 함유하며, 이들은 함께 상호작용하여 20면체 대칭의 캡시드를 형성한다. AAV 입자의 혈청형은 캡시드 단백질을 구성하는 서열에 기인한다.
도 2는 AAV ITR의 구조를 도시한다. 각각의 AAV ITR은 헤어핀을 형성하며, 이는 제2 DNA 가닥의 프리마제 독립적 합성을 허용하는 소위 자가 프라이밍에 기여한다. ITR은 AAV DNA를 숙주 DNA에 통합하고, 효율적으로 캡슐화하며, 완전히 어셈블리된 DNAse 내성 AAV 입자를 생성하는 데 필요하다. ITR은 일반적으로, rAAV 입자로 패키징되기를 원하는 하나 이상의 유전자 바로 옆에 시스로 요구되는 것으로 간주된다. 서열식별번호: 1-7은 각각 혈청형 1-7 (AAV1-AAV7)의 야생형 ITR 서열의 예에 상응한다.
야생형 AAV1 ITR의 예시적 서열:
야생형 AAV2 ITR의 예시적 서열:
야생형 AAV3 ITR의 예시적 서열:
야생형 AAV4 ITR의 예시적 서열:
야생형 AAV5 ITR의 예시적 서열:
야생형 AAV6 ITR의 예시적 서열:
야생형 AAV7 ITR의 예시적 서열:
rep ORF는 AAV 수명 주기에 필요한 Rep 단백질을 코딩하는 4개의 중복 유전자로 구성된다. 4개의 Rep 단백질의 명칭은 그들의 크기를 킬로 달톤 (kDa)으로 묘사한다: Rep78, Rep68, Rep52 및 Rep40. Rep78 및 Rep68은 자기 프라이밍 행위에서 ITR에 의해 형성된 헤어핀과 결합하고, 헤어핀 내의 말단 분해능 부위로 지명된 특이적 영역에서 절단된다. 4개의 Rep 단백질은 모두 ATP와 결합하고 헬리카제 활성을 보유한다. 그들은 p40 프로모터로부터의 전사를 상향조절하고 p5와 p19 프로모터 활성 둘 다를 하향조절한다.
서열식별번호: 8-20은 각각 혈청형 1-13의 야생형 AAV rep 유전자의 예시적 서열에 상응한다.
서열식별번호: 21-33은 각각 혈청형 1-13의 야생형 AAV Rep78 단백질의 예시적 서열에 상응한다. Rep78은 621개의 아미노산을 갖는다. Rep68은 Rep78의 아미노산 1-529 및 C 말단 내의 서열 LARGHSL (서열식별번호: 38)을 포함한다. Rep52는 Rep78의 아미노산 225-621을 포함한다. Rep40은 Rep78의 아미노산 225-621 및 C 말단 내의 LARGHSL (서열식별번호: 38)을 포함한다.
야생형 AAV1
rep
핵산 서열의 예:
야생형 AAV2
rep
핵산 서열의 예:
야생형 AAV3 rep 핵산 서열의 예:
야생형 AAV4
rep
핵산 서열의 예:
야생형 AAV5
rep
핵산 서열의 예:
야생형 AAV6
rep
핵산 서열의 예:
야생형 AAV7
rep
핵산 서열의 예:
야생형 AAV8
rep
핵산 서열의 예:
야생형 AAVrH.8
rep
핵산 서열의 예:
야생형 AAV10
rep
핵산 서열의 예:
야생형 AAV11
rep
핵산 서열의 예:
야생형 AAV12
rep
핵산 서열의 예:
야생형 AAV13
rep
핵산 서열의 예:
야생형 AAV1 Rep78 아미노산 서열의 예:
야생형 AAV2 Rep78 아미노산 서열의 예:
야생형 AAV3 Rep78 아미노산 서열의 예:
야생형 AAV4 Rep78 아미노산 서열의 예:
야생형 AAV5 Rep78 아미노산 서열의 예:
야생형 AAV6 Rep78 아미노산 서열의 예:
야생형 AAV7 Rep78 아미노산 서열의 예:
야생형 AAV8 Rep78 아미노산 서열의 예:
야생형 AAVrh.8 Rep78 아미노산 서열의 예:
야생형 AAV10 Rep78 아미노산 서열의 예:
야생형 AAV11 Rep78 아미노산 서열의 예:
야생형 AAV12 Rep78 아미노산 서열의 예:
야생형 AAV13 Rep78 아미노산 서열의 예:
본원에 정의된 바와 같이, rep 유전자 또는 Rep 단백질은 N-말단 및 C-말단 (c)을 포함하며, 여기서 N 말단은 N-말단 도메인 (n), DNA 결합 도메인 (d), 및 헬리카제 도메인 (h)을 포함하고, C 말단 (c)은 NLS/p40 프로모터 도메인 (y) 및 아연 핑거 도메인 (z)을 포함한다. 표 1은 상이한 AAV 혈청형에 대한 이들 도메인의 예시적 서열을 제공한다.
<표 1>
상이한 AAV 혈청형에 대한 rep 유전자 및 Rep 단백질 도메인의 예시적 서열
일부 실시양태에서, 본원에는 키메라 rep 유전자가 개시된다. 일부 실시양태에서, 키메라 rep 유전자는 대부분의 rep 유전자의 혈청형과 상이한 혈청형, 또는 다른 도메인 또는 말단의 혈청형의 것인 적어도 하나의 도메인 (예를 들어, n, d, h, y, 또는 z) 또는 적어도 하나의 말단 (예를 들어, N 말단 또는 C 말단)을 갖는다. 일부 실시양태에서, N 말단은 C 말단의 혈청형 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13)과 상이한 혈청형 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 13)의 것이다. 일부 실시양태에서, N 말단은 하나의 혈청형의 것이고, C-말단은 제2 혈청형 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 13)의 것이다.
일부 실시양태에서, n 도메인은 AAV 혈청형 1의 것이고, d, h, y, 및 z 각각은 AAV1 이외의 혈청형 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 13)의 것이다. 예를 들어, d, h, y, 및 z 도메인 각각은 동일한 혈청형 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 13)의 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, d, h, y, 및 z 도메인 각각은 서로에 대해 상이한 혈청형의 것일 수 있으며, 예를 들어, d, h, 및 y는 AAV2 혈청형의 것일 수 있는 반면, z는 AAV3 혈청형의 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, n 도메인은 AAV 혈청형 2의 것이고, d, h, y, 및 z 도메인 각각은 AAV2 이외의 혈청형 (예를 들어, 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 13)의 것이다. d, h, y, 및 z 도메인 각각의 혈청형은 동일할 수 있거나, 또는 서로 상이할 수 있다. 일부 실시양태에서, n 도메인은 AAV 혈청형 3의 것이고, d, h, y, 및 z 도메인 각각은 AAV3 이외의 혈청형 (예를 들어, 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 13)의 것이다. d, h, y, 및 z 도메인 각각의 혈청형은 동일할 수 있거나, 또는 서로 상이할 수 있다. 일부 실시양태에서, n 도메인은 AAV 혈청형 4의 것이고, d, h, y, 및 z 도메인 각각은 AAV4 이외의 혈청형 (예를 들어, 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 13)의 것이다. d, h, y, 및 z 도메인 각각의 혈청형은 동일할 수 있거나, 또는 서로 상이할 수 있다. 일부 실시양태에서, n 도메인은 AAV 혈청형 5의 것이고, d, h, y, 및 z 도메인 각각은 AAV5 이외의 혈청형 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 13)의 것이다. d, h, y, 및 z 도메인 각각의 혈청형은 동일할 수 있거나, 또는 서로 상이할 수 있다. 일부 실시양태에서, n 도메인은 AAV 혈청형 6의 것이고, d, h, y, 및 z 도메인 각각은 AAV6 이외의 혈청형 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 13)의 것이다. d, h, y, 및 z 도메인 각각의 혈청형은 동일할 수 있거나, 또는 서로 상이할 수 있다. 일부 실시양태에서, n 도메인은 AAV 혈청형 7의 것이고, d, h, y, 및 z 도메인 각각은 AAV7 이외의 혈청형 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 13)의 것이다. d, h, y, 및 z 도메인 각각의 혈청형은 동일할 수 있거나, 또는 서로 상이할 수 있다. 일부 실시양태에서, n 도메인은 AAV 혈청형 8의 것이고, d, h, y, 및 z 도메인 각각은 AAV8 이외의 혈청형 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 또는 13)의 것이다. d, h, y, 및 z 도메인 각각의 혈청형은 동일할 수 있거나, 또는 서로 상이할 수 있다. 일부 실시양태에서, n 도메인은 AAV 혈청형 9의 것이고, d, h, y, 및 z 도메인 각각은 AAV9 이외의 혈청형 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 11, 12, 또는 13)의 것이다. d, h, y, 및 z 도메인 각각의 혈청형은 동일할 수 있거나, 또는 서로 상이할 수 있다. 일부 실시양태에서, n 도메인은 AAV 혈청형 10의 것이고, d, h, y, 및 z 도메인 각각은 AAV10 이외의 혈청형 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 또는 13)의 것이다. d, h, y, 및 z 도메인 각각의 혈청형은 동일할 수 있거나, 또는 서로 상이할 수 있다. 일부 실시양태에서, n 도메인은 AAV 혈청형 11의 것이고, d, h, y, 및 z 도메인 각각은 AAV11 이외의 혈청형 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 또는 13)의 것이다. d, h, y, 및 z 도메인 각각의 혈청형은 동일할 수 있거나, 또는 서로 상이할 수 있다. 일부 실시양태에서, n 도메인은 AAV 혈청형 12의 것이고, d, h, y, 및 z 도메인 각각은 AAV12 이외의 혈청형 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 13)의 것이다. d, h, y, 및 z 도메인 각각의 혈청형은 동일할 수 있거나, 또는 서로 상이할 수 있다. 일부 실시양태에서, n 도메인은 AAV 혈청형 13의 것이고, d, h, y, 및 z 도메인 각각은 AAV13 이외의 혈청형 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12)의 것이다. d, h, y, 및 z 도메인 각각의 혈청형은 동일할 수 있거나, 또는 서로 상이할 수 있다.
일부 실시양태에서, d 도메인은 AAV 혈청형 1의 것이고, n, h, y, 및 z 각각은 AAV1 이외의 혈청형 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 13)의 것이다. 예를 들어, n, h, y, 및 z 도메인 각각은 동일한 혈청형 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 13)의 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, n, h, y, 및 z 도메인 각각은 서로에 대해 상이한 혈청형의 것일 수 있으며, 예를 들어, n, h, 및 y는 AAV2 혈청형의 것일 수 있는 반면, z는 AAV3 혈청형의 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, d 도메인은 AAV 혈청형 2의 것이고, n, h, y, 및 z 도메인 각각은 AAV2 이외의 혈청형 (예를 들어, 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 13)의 것이다. n, h, y, 및 z 도메인 각각의 혈청형은 동일할 수 있거나, 또는 서로 상이할 수 있다. 일부 실시양태에서, d 도메인은 AAV 혈청형 3의 것이고, n, h, y, 및 z 도메인 각각은 AAV3 이외의 혈청형 (예를 들어, 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 13)의 것이다. n, h, y, 및 z 도메인 각각의 혈청형은 동일할 수 있거나, 또는 서로 상이할 수 있다. 일부 실시양태에서, d 도메인은 AAV 혈청형 4의 것이고, n, h, y, 및 z 도메인 각각은 AAV4 이외의 혈청형 (예를 들어, 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 13)의 것이다. n, h, y, 및 z 도메인 각각의 혈청형은 동일할 수 있거나, 또는 서로 상이할 수 있다. 일부 실시양태에서, d 도메인은 AAV 혈청형 5의 것이고, n, h, y, 및 z 도메인 각각은 AAV5 이외의 혈청형 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 13)의 것이다. n, h, y, 및 z 도메인 각각의 혈청형은 동일할 수 있거나, 또는 서로 상이할 수 있다. 일부 실시양태에서, d 도메인은 AAV 혈청형 6의 것이고, n, h, y, 및 z 도메인 각각은 AAV6 이외의 혈청형 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 13)의 것이다. n, h, y, 및 z 도메인 각각의 혈청형은 동일할 수 있거나, 또는 서로 상이할 수 있다. 일부 실시양태에서, d 도메인은 AAV 혈청형 7의 것이고, n, h, y, 및 z 도메인 각각은 AAV7 이외의 혈청형 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 13)의 것이다. n, h, y, 및 z 도메인 각각의 혈청형은 동일할 수 있거나, 또는 서로 상이할 수 있다. 일부 실시양태에서, d 도메인은 AAV 혈청형 8의 것이고, n, h, y, 및 z 도메인 각각은 AAV8 이외의 혈청형 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 또는 13)의 것이다. n, h, y, 및 z 도메인 각각의 혈청형은 동일할 수 있거나, 또는 서로 상이할 수 있다. 일부 실시양태에서, d 도메인은 AAV 혈청형 9의 것이고, n, h, y, 및 z 도메인 각각은 AAV9 이외의 혈청형 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 11, 12, 또는 13)의 것이다. n, h, y, 및 z 도메인 각각의 혈청형은 동일할 수 있거나, 또는 서로 상이할 수 있다. 일부 실시양태에서, d 도메인은 AAV 혈청형 10의 것이고, n, h, y, 및 z 도메인 각각은 AAV10 이외의 혈청형 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 또는 13)의 것이다. n, h, y, 및 z 도메인 각각의 혈청형은 동일할 수 있거나, 또는 서로 상이할 수 있다. 일부 실시양태에서, d 도메인은 AAV 혈청형 11의 것이고, n, h, y, 및 z 도메인 각각은 AAV11 이외의 혈청형 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 또는 13)의 것이다. n, h, y, 및 z 도메인 각각의 혈청형은 동일할 수 있거나, 또는 서로 상이할 수 있다. 일부 실시양태에서, d 도메인은 AAV 혈청형 12의 것이고, n, h, y, 및 z 도메인 각각은 AAV12 이외의 혈청형 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 13)의 것이다. n, h, y, 및 z 도메인 각각의 혈청형은 동일할 수 있거나, 또는 서로 상이할 수 있다. 일부 실시양태에서, d 도메인은 AAV 혈청형 13의 것이고, n, h, y, 및 z 도메인 각각은 AAV13 이외의 혈청형 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12)의 것이다. n, h, y, 및 z 도메인 각각의 혈청형은 동일할 수 있거나, 또는 서로 상이할 수 있다.
일부 실시양태에서, h 도메인은 AAV 혈청형 1의 것이고, d, n, y, 및 z 각각은 AAV1 이외의 혈청형 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 13)의 것이다. 예를 들어, d, n, y, 및 z 도메인 각각은 동일한 혈청형 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 13)의 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, d, n, y, 및 z 도메인 각각은 서로에 대해 상이한 혈청형의 것일 수 있으며, 예를 들어, d, n, 및 y는 AAV2 혈청형의 것일 수 있는 반면, z는 AAV3 혈청형의 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, h 도메인은 AAV 혈청형 2의 것이고, d, n, y, 및 z 도메인 각각은 AAV2 이외의 혈청형 (예를 들어, 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 13)의 것이다. d, n, y, 및 z 도메인 각각의 혈청형은 동일할 수 있거나, 또는 서로 상이할 수 있다. 일부 실시양태에서, h 도메인은 AAV 혈청형 3의 것이고, d, n, y, 및 z 도메인 각각은 AAV3 이외의 혈청형 (예를 들어, 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 13)의 것이다. d, n, y, 및 z 도메인 각각의 혈청형은 동일할 수 있거나, 또는 서로 상이할 수 있다. 일부 실시양태에서, h 도메인은 AAV 혈청형 4의 것이고, d, n, y, 및 z 도메인 각각은 AAV4 이외의 혈청형 (예를 들어, 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 13)의 것이다. d, n, y, 및 z 도메인 각각의 혈청형은 동일할 수 있거나, 또는 서로 상이할 수 있다. 일부 실시양태에서, h 도메인은 AAV 혈청형 5의 것이고, d, n, y, 및 z 도메인 각각은 AAV5 이외의 혈청형 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 13)의 것이다. d, n, y, 및 z 도메인 각각의 혈청형은 동일할 수 있거나, 또는 서로 상이할 수 있다. 일부 실시양태에서, h 도메인은 AAV 혈청형 6의 것이고, d, n, y, 및 z 도메인 각각은 AAV6 이외의 혈청형 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 13)의 것이다. d, n, y, 및 z 도메인 각각의 혈청형은 동일할 수 있거나, 또는 서로 상이할 수 있다. 일부 실시양태에서, h 도메인은 AAV 혈청형 7의 것이고, d, n, y, 및 z 도메인 각각은 AAV7 이외의 혈청형 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 13)의 것이다. d, n, y, 및 z 도메인 각각의 혈청형은 동일할 수 있거나, 또는 서로 상이할 수 있다. 일부 실시양태에서, h 도메인은 AAV 혈청형 8의 것이고, d, n, y, 및 z 도메인 각각은 AAV8 이외의 혈청형 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 또는 13)의 것이다. d, n, y, 및 z 도메인 각각의 혈청형은 동일할 수 있거나, 또는 서로 상이할 수 있다. 일부 실시양태에서, h 도메인은 AAV 혈청형 9의 것이고, d, n, y, 및 z 도메인 각각은 AAV9 이외의 혈청형 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 11, 12, 또는 13)의 것이다. d, n, y, 및 z 도메인 각각의 혈청형은 동일할 수 있거나, 또는 서로 상이할 수 있다. 일부 실시양태에서, h 도메인은 AAV 혈청형 10의 것이고, d, n, y, 및 z 도메인 각각은 AAV10 이외의 혈청형 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 또는 13)의 것이다. d, n, y, 및 z 도메인 각각의 혈청형은 동일할 수 있거나, 또는 서로 상이할 수 있다. 일부 실시양태에서, h 도메인은 AAV 혈청형 11의 것이고, d, n, y, 및 z 도메인 각각은 AAV11 이외의 혈청형 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 또는 13)의 것이다. d, n, y, 및 z 도메인 각각의 혈청형은 동일할 수 있거나, 또는 서로 상이할 수 있다. 일부 실시양태에서, h 도메인은 AAV 혈청형 12의 것이고, d, n, y, 및 z 도메인 각각은 AAV12 이외의 혈청형 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 13)의 것이다. d, n, y, 및 z 도메인 각각의 혈청형은 동일할 수 있거나, 또는 서로 상이할 수 있다. 일부 실시양태에서, h 도메인은 AAV 혈청형 13의 것이고, d, n, y, 및 z 도메인 각각은 AAV13 이외의 혈청형 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12)의 것이다. d, n, y, 및 z 도메인 각각의 혈청형은 동일할 수 있거나, 또는 서로 상이할 수 있다.
일부 실시양태에서, y 도메인은 AAV 혈청형 1의 것이고, n, d, h, 및 z 각각은 AAV1 이외의 혈청형 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 13)의 것이다. 예를 들어, n, d, h, 및 z 도메인 각각은 동일한 혈청형 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 13)의 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, n, d, h, 및 z 도메인 각각은 서로에 대해 상이한 혈청형의 것일 수 있으며, 예를 들어, d, h는 AAV2 혈청형의 것일 수 있는 반면, z는 AAV3 혈청형의 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, y 도메인은 AAV 혈청형 2의 것이고, n, d, h, 및 z 도메인 각각은 AAV2 이외의 혈청형 (예를 들어, 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 13)의 것이다. n, d, h, 및 z 도메인 각각의 혈청형은 동일할 수 있거나, 또는 서로 상이할 수 있다. 일부 실시양태에서, y 도메인은 AAV 혈청형 3의 것이고, n, d, h, 및 z 도메인 각각은 AAV3 이외의 혈청형 (예를 들어, 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 13)의 것이다. n, d, h, 및 z 도메인 각각의 혈청형은 동일할 수 있거나, 또는 서로 상이할 수 있다. 일부 실시양태에서, y 도메인은 AAV 혈청형 4의 것이고, n, d, h, 및 z 도메인 각각은 AAV4 이외의 혈청형 (예를 들어, 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 13)의 것이다. n, d, h, 및 z 도메인 각각의 혈청형은 동일할 수 있거나, 또는 서로 상이할 수 있다. 일부 실시양태에서, y 도메인은 AAV 혈청형 5의 것이고, n, d, h, 및 z 도메인 각각은 AAV5 이외의 혈청형 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 13)의 것이다. n, d, h, 및 z 도메인 각각의 혈청형은 동일할 수 있거나, 또는 서로 상이할 수 있다. 일부 실시양태에서, y 도메인은 AAV 혈청형 6의 것이고, n, d, h, 및 z 도메인 각각은 AAV6 이외의 혈청형 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 13)의 것이다. n, d, h, 및 z 도메인 각각의 혈청형은 동일할 수 있거나, 또는 서로 상이할 수 있다. 일부 실시양태에서, y 도메인은 AAV 혈청형 7의 것이고, n, d, h, 및 z 도메인 각각은 AAV7 이외의 혈청형 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 13)의 것이다. n, d, h, 및 z 도메인 각각의 혈청형은 동일할 수 있거나, 또는 서로 상이할 수 있다. 일부 실시양태에서, y 도메인은 AAV 혈청형 8의 것이고, n, d, h, 및 z 도메인 각각은 AAV8 이외의 혈청형 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 또는 13)의 것이다. n, d, h, 및 z 도메인 각각의 혈청형은 동일할 수 있거나, 또는 서로 상이할 수 있다. 일부 실시양태에서, y 도메인은 AAV 혈청형 9의 것이고, n, d, h, 및 z 도메인 각각은 AAV9 이외의 혈청형 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 11, 12, 또는 13)의 것이다. n, d, h, 및 z 도메인 각각의 혈청형은 동일할 수 있거나, 또는 서로 상이할 수 있다. 일부 실시양태에서, y 도메인은 AAV 혈청형 10의 것이고, n, d, h, 및 z 도메인 각각은 AAV10 이외의 혈청형 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 또는 13)의 것이다. n, d, h, 및 z 도메인 각각의 혈청형은 동일할 수 있거나, 또는 서로 상이할 수 있다. 일부 실시양태에서, y 도메인은 AAV 혈청형 11의 것이고, n, d, h, 및 z 도메인 각각은 AAV11 이외의 혈청형 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 또는 13)의 것이다. n, d, h, 및 z 도메인 각각의 혈청형은 동일할 수 있거나, 또는 서로 상이할 수 있다. 일부 실시양태에서, y 도메인은 AAV 혈청형 12의 것이고, n, d, h, 및 z 도메인 각각은 AAV12 이외의 혈청형 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 13)의 것이다. n, d, h, 및 z 도메인 각각의 혈청형은 동일할 수 있거나, 또는 서로 상이할 수 있다. 일부 실시양태에서, y 도메인은 AAV 혈청형 13의 것이고, n, d, h, 및 z 도메인 각각은 AAV13 이외의 혈청형 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12)의 것이다. n, d, h, 및 z 도메인 각각의 혈청형은 동일할 수 있거나, 또는 서로 상이할 수 있다.
일부 실시양태에서, z 도메인은 AAV 혈청형 1의 것이고, n, d, h, 및 y 각각은 AAV1 이외의 혈청형 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 13)의 것이다. 예를 들어, n, d, h, 및 y 도메인 각각은 동일한 혈청형 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 13)의 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, n, d, h, 및 y 도메인 각각은 서로에 대해 상이한 혈청형의 것일 수 있으며, 예를 들어, d, h는 AAV2 혈청형의 것일 수 있는 반면, z는 AAV3 혈청형의 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, z 도메인은 AAV 혈청형 2의 것이고, n, d, h, 및 y 도메인 각각은 AAV2 이외의 혈청형 (예를 들어, 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 13)의 것이다. n, d, h, 및 y 도메인 각각의 혈청형은 동일할 수 있거나, 또는 서로 상이할 수 있다. 일부 실시양태에서, z 도메인은 AAV 혈청형 3의 것이고, n, d, h, 및 y 도메인 각각은 AAV3 이외의 혈청형 (예를 들어, 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 13)의 것이다. n, d, h, 및 y 도메인 각각의 혈청형은 동일할 수 있거나, 또는 서로 상이할 수 있다. 일부 실시양태에서, z 도메인은 AAV 혈청형 4의 것이고, n, d, h, 및 y 도메인 각각은 AAV4 이외의 혈청형 (예를 들어, 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 13)의 것이다. n, d, h, 및 y 도메인 각각의 혈청형은 동일할 수 있거나, 또는 서로 상이할 수 있다. 일부 실시양태에서, z 도메인은 AAV 혈청형 5의 것이고, n, d, h, 및 y 도메인 각각은 AAV5 이외의 혈청형 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 13)의 것이다. n, d, h, 및 y 도메인 각각의 혈청형은 동일할 수 있거나, 또는 서로 상이할 수 있다. 일부 실시양태에서, z 도메인은 AAV 혈청형 6의 것이고, n, d, h, 및 y 도메인 각각은 AAV6 이외의 혈청형 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 13)의 것이다. n, d, h, 및 y 도메인 각각의 혈청형은 동일할 수 있거나, 또는 서로 상이할 수 있다. 일부 실시양태에서, z 도메인은 AAV 혈청형 7의 것이고, n, d, h, 및 y 도메인 각각은 AAV7 이외의 혈청형 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 13)의 것이다. n, d, h, 및 y 도메인 각각의 혈청형은 동일할 수 있거나, 또는 서로 상이할 수 있다. 일부 실시양태에서, z 도메인은 AAV 혈청형 8의 것이고, n, d, h, 및 y 도메인 각각은 AAV8 이외의 혈청형 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 또는 13)의 것이다. n, d, h, 및 y 도메인 각각의 혈청형은 동일할 수 있거나, 또는 서로 상이할 수 있다. 일부 실시양태에서, z 도메인은 AAV 혈청형 9의 것이고, n, d, h, 및 y 도메인 각각은 AAV9 이외의 혈청형 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 11, 12, 또는 13)의 것이다. n, d, h, 및 y 도메인 각각의 혈청형은 동일할 수 있거나, 또는 서로 상이할 수 있다. 일부 실시양태에서, z 도메인은 AAV 혈청형 10의 것이고, n, d, h, 및 y 도메인 각각은 AAV10 이외의 혈청형 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 또는 13)의 것이다. n, d, h, 및 y 도메인 각각의 혈청형은 동일할 수 있거나, 또는 서로 상이할 수 있다. 일부 실시양태에서, z 도메인은 AAV 혈청형 11의 것이고, n, d, h, 및 y 도메인 각각은 AAV11 이외의 혈청형 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 또는 13)의 것이다. n, d, h, 및 y 도메인 각각의 혈청형은 동일할 수 있거나, 또는 서로 상이할 수 있다. 일부 실시양태에서, z 도메인은 AAV 혈청형 12의 것이고, n, d, h, 및 y 도메인 각각은 AAV12 이외의 혈청형 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 13)의 것이다. n, d, h, 및 y 도메인 각각의 혈청형은 동일할 수 있거나, 또는 서로 상이할 수 있다. 일부 실시양태에서, z 도메인은 AAV 혈청형 13의 것이고, n, d, h, 및 y 도메인 각각은 AAV13 이외의 혈청형 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12)의 것이다. n, d, h, 및 y 도메인 각각의 혈청형은 동일할 수 있거나, 또는 서로 상이할 수 있다.
도 7-16은 키메라 rep 유전자의 예를 제공한다. 도메인의 임의의 조합은 다른 도메인의 혈청형과 상이한 혈청형의 것일 수 있음을 이해해야 한다. 예를 들어, 하나의 도메인만이 다른 도메인의 혈청형과 상이한 혈청형을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 5개의 도메인 모두는 상이한 혈청형을 갖는다. 일부 실시양태에서, 키메라 rep 유전자의 도메인은 2가지 상이한 혈청형 (예를 들어, R1h2, 즉 AAV2의 h 도메인 및 AAV1의 다른 도메인)의 것이다. 일부 실시양태에서, 키메라 rep 유전자의 도메인은 3가지 상이한 혈청형 (예를 들어, R1c3h4, 즉 AAV3의 C 말단, AAV4의 h 도메인 및 AAV1의 n 및 d 도메인)의 것이다. 일부 실시양태에서, 키메라 rep 유전자의 도메인은 4가지 상이한 혈청형 (예를 들어, R1h2d3y4, 즉 AAV2의 h 도메인, AAV3의 d 도메인, AAV3의 y 도메인 및 AAV1의 n 및 y 도메인)의 것이다. 일부 실시양태에서, 키메라 rep 유전자의 도메인은 5가지 상이한 혈청형 (예를 들어, R1n2d3h4y8)의 것이다.
일부 실시양태에서, 도메인은 말단절단된다. 일부 실시양태에서, 키메라 rep 유전자의 도메인은 이러한 도메인의 N 말단 끝에서 말단절단된다. 일부 실시양태에서, 키메라 rep 유전자는 도메인의 C 말단 끝에서 말단절단된다. 일부 실시양태에서, 비-연속 뉴클레오티드가 결실되도록 도메인이 변형된다. 일부 실시양태에서, 도메인은 1 내지 18개의 뉴클레오티드 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 또는 18개 뉴클레오티드)에 의해 말단절단된다. 예를 들어, d 도메인은 N 말단 끝 또는 C 말단 끝에서 6개 뉴클레오티드에 의해 말단절단될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 rep 유전자 중 임의의 것은 서열 ACG를 갖는 출발 코돈을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 rep 유전자 중 임의의 것은 ACG 이외의 서열 또는 ACG와 상이한 서열을 갖는 출발 코돈을 포함한다. 일부 실시양태에서, ACG와 상이한 서열을 갖는 출발 코돈은 ATG이다.
본 개시 내용은 또한, 본원에 개시된 키메라 rep 유전자 중 어느 하나에 의해 코딩되는 임의의 키메라 Rep 단백질뿐만 아니라 본원에 개시된 바와 같은 키메라 Rep 단백질 중 어느 하나를 코딩할 수 있는 임의의 키메라 rep 유전자를 제공하는 것으로 이해되어야 한다.
본 출원의 일부 실시양태에서, Rep 단백질은 2가지 이상의 AAV 혈청형으로부터의 아미노산 서열을 포함한다는 점에서 키메라이다. 일부 실시양태에서, 키메라 Rep 단백질은 하나의 AAV 혈청형 (예를 들어, AAV1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13)으로부터의 아미노산을 포함하는 N 말단 및 또 다른 AAV 혈청형 (예를 들어, AAV1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 13)으로부터의 아미노산을 포함하는 C 말단을 포함할 수 있다. 예를 들어, Rep 단백질은 AAV1 Rep 단백질의 상응하는 아미노산을 포함하는 N 말단 및 AAV2 Rep 단백질의 상응하는 아미노산을 포함하는 C 말단을 포함할 수 있다 (예를 들어, AAV1의 N 말단 및 AAV2의 C 말단을 포함하는 Rep78의 경우 서열식별번호: 34). Rep 단백질은 AAV2 Rep 단백질의 상응하는 아미노산을 포함하는 N 말단, 및 AAV1 Rep 단백질의 상응하는 아미노산을 포함하는 C 말단을 포함할 수 있다 (예를 들어, AAV2의 N 말단 및 AAV1의 C 말단을 포함하는 Rep78의 경우 서열식별번호: 35). 또 다른 비-제한적인 예에서, Rep 단백질은 AAV2 Rep 단백질의 상응하는 아미노산을 포함하는 N 말단, 및 AAV5 Rep 단백질의 상응하는 아미노산을 포함하는 C 말단을 포함한다 (예를 들어, AAV2의 N 말단 및 AAV5의 C 말단을 포함하는 Rep78의 경우 서열식별번호: 36). 또 다른 비-제한적인 예에서, Rep 단백질은 AAV5 Rep 단백질의 상응하는 아미노산을 포함하는 N 말단, 및 AAV2 Rep 단백질의 상응하는 아미노산을 포함하는 C 말단을 포함한다 (예를 들어, AAV5의 N 말단 및 AAV2의 C 말단을 포함하는 Rep78의 경우 서열식별번호: 37). 일부 실시양태에서, Rep 단백질은 3가지 이상의 AAV 혈청형 (예를 들어, 3가지, 4가지 또는 5가지의 AAV 혈청형)의 상응하는 아미노산을 포함한다. 3가지 AAV 혈청형의 상응하는 아미노산을 포함하는 Rep 단백질의 비-제한적인 예는 AAV1, AAV2 및 AAV5로부터의 상응하는 아미노산을 갖는 Rep 단백질이다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "상응하는 아미노산"은 상이한 AAV 혈청형의 아미노산 서열에서 서로 정렬되는 위치 내의 아미노산을 의미한다. 일부 실시양태에서, 2가지 AAV 혈청형 간의 상응하는 아미노산은 동일한 위치를 갖고 있다. 일부 실시양태에서, 2가지 AAV 혈청형 간의 상응하는 아미노산은 서로로부터 1 내지 5개의 아미노산이 이동된 위치에 있다. 아미노산 서열을 정렬하는 방법은 관련 기술 분야에 공지되어 있으며, 이러한 정렬을 수행하는 알고리즘도 쉽게 이용가능하다 (예를 들어, 문헌 [Michael S. Rosenberg, Sequence Alignment: Methods, Models, Concepts, and Strategies, 2009, http://www.jstor.org/stable/10.1525/j.ctt1pps7t] 참조). 예를 들어, AAV ITR 및/또는 Rep 단백질의 정렬은 단백질 BLAST를 사용하여 수행될 수 있다 (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&BLAST_SPEC=blast2seq&LINK_LOC=blasttab).
AAV1 N 말단 및 AAV2 C 말단을 갖는 Rep78 아미노산 서열의 예:
AAV2 N 말단 및 AAV1 C 말단을 갖는 Rep78 아미노산 서열의 예:
AAV2 N 말단 및 AAV5 C 말단을 갖는 Rep78 아미노산 서열의 예:
AAV5 N 말단 및 AAV2 C 말단을 갖는 Rep78 아미노산 서열의 예:
비-제한적인 키메라 Rep 단백질 및 이를 코딩하는 핵산 서열의 예:
R1c2 아미노산 서열:
R1hc2 아미노산:
R2d1 아미노산:
R2h1 아미노산:
R8d1c2 아미노산:
R8p1/2c2 아미노산:
R1c2 유전자 서열:
R1hc2 유전자 서열:
R2d1 유전자 서열:
R2h1 유전자 서열:
R8d1c2 유전자 서열:
R8p1/2c2 유전자 서열:
입자를 패키징하는 방법
rAAV 입자를 생산하는 방법은 관련 기술 분야에 공지되어 있으며 시약은 상업적으로 이용가능하다 (예를 들어, 문헌 [Zolotukhin et al. Production and purification of serotype 1, 2, and 5 recombinant adeno-associated viral vectors. Methods 28 (2002) 158-167]; 및 미국 특허 공개 번호 US20070015238 및 US20120322861 (본원에 참조로 포함됨); 및 ATCC 및 셀 바이오랩스, 인크.(Cell Biolabs, Inc.)로부터 이용가능한 플라스미드 및 키트 참조).
일반적으로, rAAV 생산은 세포를 배양하는 단계, AAV 유전자 및 패키징되기를 원하는 임의의 관심 유전자 (예를 들어, ITR에 의해 플랭킹됨)를 세포에 도입하는 단계, 및 세포가 rAAV를 생산하거나 또는 패키징하도록 허용하는 단계를 포함한다. 마지막 단계에 이어 rAAV 입자를 수거하는 단계 및 후속 정제 단계가 뒤따른다. AAV 유전자 및 rAAV 입자로 패키징되기를 원하는 임의의 유전자는 형질감염 방법 (예를 들어, 플라스미드 벡터 및 형질감염제를 사용함) 또는 감염 방법 (예를 들어, 바이러스 벡터를 사용함)에 의해 세포에 도입될 수 있다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 관심 유전자, rep 유전자 (예를 들어, 야생형 또는 재조합, 예를 들어 본 출원에 기재된 바와 같은 키메라 Rep 단백질을 코딩한다), cap 유전자 및 헬퍼 유전자 (예를 들어, E1a 유전자, E1b 유전자, E4 유전자, E2a 유전자 및 VA 유전자)가 세포에 도입되며, 여기서 이들 유전자는 하나 이상의 벡터 (예를 들어, 플라스미드)에 포함되어 세포가 이러한 벡터에 의해 형질감염되거나 감염되도록 한다. 명확성을 위해, 헬퍼 유전자는 헬퍼 단백질 E1a, E1b, E4, E2a 및 VA를 코딩하는 유전자이다. 일부 실시양태에서, 단지 하나 이상의 관심 유전자 및 이들에 작동가능하게 연결된 제어 요소가 하나의 벡터에 포함되는 반면, rep, cap 및 헬퍼 유전자 중 하나 이상은 별도의 벡터 중 하나 이상에 포함된다. 예를 들어, 제1 벡터는 하나 이상의 관심 유전자를 포함할 수 있는 반면, 제2 벡터는 rep, cap 및 헬퍼 유전자를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 벡터는 하나 이상의 관심 유전자를 포함할 수 있는 반면, 제2 벡터는 rep를 포함할 수 있고, 제3 벡터는 헬퍼 유전자 및 cap를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 벡터는 하나 이상의 관심 유전자를 포함할 수 있는 반면, 제2 벡터는 rep를 포함할 수 있고, 제3 벡터는 헬퍼 유전자를 포함할 수 있고, 제4 벡터는 cap를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 관심 유전자 또는 AAV 유전자를 생산자 세포에 전달하는 데 사용되는 핵산 벡터는 원형이다. 일부 실시양태에서, 핵산 벡터는 단일 가닥이다. 일부 실시양태에서, 핵산 벡터는 이중 가닥이다. 일부 실시양태에서, 이중 가닥 핵산 벡터는, 예를 들어, 핵산 벡터의 또 다른 영역에 상보적인 핵산 벡터의 영역을 함유하는 자기 상보적 벡터일 수 있어, 핵산 벡터의 이중 가닥의 형성을 개시한다.
본원에 개시된 방법 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, ITR에 의해 플랭킹되는 핵산의 영역 (예를 들어, 이종 핵산 영역)은 하나 이상의 관심 유전자를 포함한다. ITR에 의해 플랭킹되는 핵산의 영역은 또한, 하나 이상의 관심 유전자에 작동가능하게 연결되는 제어 요소를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서 rep 유전자 또는 cap 유전자 또는 rep 유전자와 cap 유전자 둘 다는 ITR에 의해 플랭킹된다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 관심 유전자가 도입되는 세포는 이미 rAAV 입자를 패키징하는 데 유용한 하나의 rep 유전자, cap 유전자, 및/또는 헬퍼 유전자 중 하나 이상을 포함한다. 비-제한적인 예로서, 세포는 이미 rep를 포함하고 Rep 단백질 Rep78, Rep68, Rep52 및 Rep40을 발현할 수 있다. Rep 단백질을 발현하는 이러한 세포는 ITR-플랭킹된 관심 유전자를 포함하는 벡터, 및 cap 및 헬퍼 유전자를 발현하는 벡터에 도입될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 이미 rep 및 헬퍼 유전자를 포함할 수 있다.
세포를 형질감염시키는 방법은 관련 기술 분야에 공지되어 있다. 세포를 형질감염시키는 비-제한적인 방법은 CaPO4 매개 형질감염, 지질 또는 중합체성 분자, 예컨대 폴리에틸렌이민 (PEI)을 사용한 형질감염, 및 전기 천공이다. 바이러스 벡터 (예를 들어, HSV 벡터 또는 바쿨로바이러스)를 사용하여 세포를 핵산에 도입할 수도 있다.
하나 이상의 관심 유전자, rep 유전자, cap 유전자 및 헬퍼 유전자 중 하나 이상을, 형질감염 또는 감염에 의해 세포에 유입되는 방식으로 세포에 도입한 후, rAAV 입자가 세포에서 생산되고 세포로부터 탈출하게 될 조건 하에서 상기 세포를 인큐베이션한다. 이어서, rAAV 입자는 관련 기술 분야에 공지되거나 또는 본원에 기재된 임의의 방법을 사용하여, 예를 들어, 아이오딕사놀 단계 구배, CsCl 구배, 크로마토그래피 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 침전에 의해 정제될 수 있다.
상이한 혈청형의 ITR 및 rep의 조합 및/또는 키메라 rep 유전자를 사용하여 AAV 입자의 패키징을 개선하는 것
본원에는 상이한 혈청형의 rep 및 ITR의 조합이 개시되며, 이들을 rAAV 입자를 생산 또는 패키징하기 위한 임의의 방법에 사용하면, 동일한 혈청형의 ITR 및 rep 유전자가 사용되는 유사한 조건과 비교해서 더 큰 패키징 또는 생산 효율이 초래된다. 따라서, 본원에는 또한, 제1 혈청형의 rep 유전자를 발현하는 세포를 제2 혈청형의 ITR 쌍을 포함하는 재조합 핵산과 접촉시키는 단계를 포함하는, rAAV 입자를 패키징하는 방법이 개시된다. 일부 실시양태에서, 제1 혈청형과 제2 혈청형은 동일하다. 일부 실시양태에서, 제1 혈청형과 제2 혈청형은 상이하다.
본원에 개시된 rAAV 입자 생산 방법 중 어느 하나에 대한 일부 실시양태에서, rep 유전자는 이러한 rep 유전자를 코딩하는 핵산으로 세포를 형질감염시키거나 또는 감염시킴으로써 본원에 개시된 생산자 세포 중 어느 하나에서 발현된다.
일부 실시양태에서, rep 유전자의 제1 혈청형은 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 및 13 중 어느 하나이다. 일부 실시양태에서, AAV ITR의 제2 혈청형은 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 및 13 중 어느 하나이다. 일부 실시양태에서, rep에 대한 제1 혈청형 중 어느 하나는 ITR에 대한 임의의 혈청형과 함께 사용된다. 예를 들어, 혈청형 1의 rep는 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 및 13 중 어느 하나의 ITR과 함께 사용될 수 있다. 또 다른 예로서, 혈청형 2의 rep는 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 및 13 중 어느 하나의 ITR과 함께 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 혈청형 1의 rep는 혈청형 1, 2, 3, 4, 또는 7의 ITR과 함께 사용된다.
일부 실시양태에서, 혈청형 6의 ITR은 혈청형 2, 3, 4, 6, 12, 또는 13의 rep와 함께 사용된다. 일부 실시양태에서, 혈청형 1의 ITR은 혈청형 2, 3, 4, 12, 또는 13의 rep와 함께 사용된다.
일부 실시양태에서, rep 유전자는 키메라이다. 키메라 AAV 유전자는 2가지 이상의 혈청형의 아미노산을 포함하는 유전자이다. 서열식별번호: 34-37은 키메라 Rep78 단백질의 예를 제공한다. 일부 실시양태에서, 혈청형 6의 ITR은 혈청형 1 및 2의 키메라 rep와 함께 사용된다. 일부 실시양태에서, 혈청형 1의 ITR은 혈청형 1 및 2의 키메라 rep와 함께 사용된다. 일부 실시양태에서, 혈청형 2의 ITR은 혈청형 2 및 5의 키메라 rep와 함께 사용된다. 일부 실시양태에서, 혈청형 5의 ITR은 혈청형 2 및 5의 키메라 rep와 함께 사용된다.
키메라 rep 유전자 및 Rep 단백질은 상기에 기재되어 있으며, 본원에 기재된 바와 같이 rAAV 입자를 패키징하는 방법 중 어느 하나에 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 키메라 Rep 단백질은 N 말단 내에 제1 혈청형의 상응하는 아미노산 및 C 말단 내에 제2 혈청형의 상응하는 아미노산을 포함할 수 있다. 예를 들어, Rep 단백질은 N 말단 내에 혈청형 1의 아미노산 및 C 말단 내에 혈청형 2의 아미노산을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, Rep 단백질은 N 말단 내에 혈청형 2의 아미노산 및 C 말단 내에 혈청형 1의 아미노산을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, Rep 단백질은 N 말단 내에 혈청형 2의 아미노산 및 C 말단 내에 혈청형 5의 아미노산을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, Rep 단백질은 N 말단 내에 혈청형 5의 아미노산 및 C 말단 내에 혈청형 2의 아미노산을 포함할 수 있다. 키메라 rep 유전자는 rAAV 입자를 생산하기 위한 임의의 혈청형, 또는 임의의 혈청형 또는 가성 혈청형의 ITR과 조합하여 사용될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 표 2는 rAAV 입자 생산을 개선하기 위해 상이한 혈청형의 ITR과 함께 사용될 수 있는 rep 혈청형의 조합의 예를 제공한다. 표 2에 제공된 ITR 및 rep 유전자의 조합에 더하여, 어느 하나의 키메라 rep 유전자 또는 키메라 Rep 단백질이 본원에 기재된 바와 같은 ITR 중 어느 하나와 조합하여 사용될 수 있으며, 이는 결국, rAAV 입자를 생산하기 위해 본원에 기재된 cap 유전자 및 캡시드 단백질 중 어느 하나와 함께 사용될 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
<표 2>
생성되고 시험될 ITR과 Rep 조합의 예 (키메라의 예 포함)
1. AAV1_ITR+AAV1_Rep
2. AAV2_ITR+AAV1_Rep
3. AAV3_ITR+AAV1_Rep
4. AAV4_ITR+AAV1_Rep
5. AAV7_ITR+AAV1_Rep
6. AAV6_ITR+AAV2_Rep
7. AAV6_ITR+AAV3_Rep
8. AAV6_ITR+AAV4_Rep
9. AAV6_ITR+AAV6_Rep
10. AAV6_ITR+AAV12_Rep
11. AAV6_ITR+AAV13_Rep
12. AAV1_ITR+AAV2_Rep
13. AAV1_ITR+AAV3_Rep
14. AAV1_ITR+AAV4_Rep
15. AAV1_ITR+AAV12_Rep
16. AAV1_ITR+AAV13_Rep
17. AAV6_ITR+AAV1N/2C_키메라_Rep
18. AAV1_ITR+AAV1N/2C_키메라_Rep
19. AAV6_ITR+AAV2N/1C_키메라_Rep
20. AAV1_ITR+AAV2N/1C_키메라_Rep
21. AAV2_ITR+AAV2N/5C_키메라_Rep
22. AAV5_ITR+AAV5N/2C_키메라_Rep
생산자 세포
본원에 개시된 바와 같은 상이한 혈청형의 ITR, cap 및/또는 rep의 조합을 사용하여 rAAV 입자를 생산하는 데 사용되는 세포가 본원에 제공된다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 생산자 세포는 제1 AAV 혈청형의 rep 및 제2 AAV 혈청형의 ITR을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 생산자 세포는 rep 및 ITR의 조합을 포함하며, 여기서 rep 및 ITR의 혈청형은 본원에 개시된 조합 중 어느 하나이다.
일부 실시양태에서, 패키징은 헬퍼 세포 또는 생산자 세포, 예컨대 포유동물 세포 또는 곤충 세포에서 수행된다. 예시적인 포유동물 세포는 HEK293 세포, COS 세포, HeLa 세포, BHK 세포 또는 CHO 세포를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다 (예를 들어, ATCC® CRL-1573™, ATCC® CRL-1651™, ATCC® CRL-1650™, ATCC® CCL-2, ATCC® CCL-10™, 또는 ATCC® CCL-61™ 참조). 예시적인 곤충 세포는 Sf9 세포를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다 (예를 들어, ATCC® CRL-1711™ 참조). 헬퍼 세포는 본원에 기재된 방법에 사용하기 위한 Rep 단백질 및/또는 Cap 단백질을 코딩하는 rep 및/또는 cap 유전자를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 패키징은 시험관내에서 수행된다.
rAAV 입자 수율에 있어서의 개선
재조합 AAV 입자 수율은 ITR 및 Rep 단백질의 혈청형의 특별한 조합을 제외하고는 동일한 rAAV 생산 프로세스와 비교해서 본원에 기재된 방법 중 어느 하나를 사용함으로써 개선될 수 있다. 일부 실시양태에서, 입자 수율은 생산된 rAAV 입자의 양에 의해 규정된다. 일부 실시양태에서, 입자 수율은 생산된 가득 찬 rAAV 입자 (즉, 핵산 또는 게놈을 함유하는 입자)의 양에 의해 규정된다. 일부 실시양태에서, rAAV 입자의 수율은 혈청형 2의 ITR이 rAAV를 패키징하기 위해 사용되는 경우와 비교하여 증가된다. 일부 실시양태에서, ITR 및 Rep 단백질의 혈청형의 특별한 조합 중 어느 하나를 수반하는 rAAV 생산의 수율은 혈청형 2의 ITR이 사용되는 rAAV 생산 프로세스와 비교해서, 2 내지 20% (예를 들어, 2-4%. 2-10%, 5-10%, 5-20%, 15-20% 또는 10-20%)만큼 증가될 수 있거나, 또는 심지어 5 내지 10배 이하 또는 100배 이상 (예를 들어, 2배 이하, 3배 이하, 5배 이하, 10배 이하, 20배 이하, 50배 이하, 또는 100배 이하 또는 그 초과)만큼 증가될 수 있다.
재조합 AAV 입자 수율은 키메라 유전자 내의 대부분의 뉴클레오티드에 가장 가까운 야생형 혈청형인 혈청형의 rep 유전자를 사용하는 생산 프로세스를 사용하여 생산된 rAAV 입자와 비교해서, 본원에 기재된 키메라 rep 유전자 중 어느 하나를 사용함으로써 개선될 수 있다. 예를 들어, AAV2의 ITR, AAV3의 cap, 및 혈청형 8의 h 도메인 (R2h8)을 갖는 것을 제외하고는 혈청형 2의 키메라 rep를 사용하여 생산된 입자에 대한 패키징 또는 입자 수율은 AAV2의 ITR, AAV3의 cap 및 AAV2의 rep를 사용하여 생산된 입자에 대한 패키징 수율과 비교할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 패키징 수율은 AAV2의 ITR 및 AAV2의 rep와 함께 제조된 동일한 혈청형의 입자의 수율과 비교된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 키메라 rep 유전자 중 어느 하나를 사용함으로써 달성된 입자 수율은 적어도 1.5배 (예를 들어, 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 또는 적어도 10배)만큼 개선된다.
rAAV 입자의 패키징을 측정하는 방법은 관련 기술 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 게놈의 양은 PCR (예를 들어, 정량적 PCR)과 같은 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 캡시드 또는 입자의 양은 단백질 기반 검정, 예컨대 ELISA를 사용하여 측정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 전자 현미경 (예를 들어, 저온 전자 현미경)은 가득 찬 캡시드 (즉, 핵산 또는 게놈을 포함하는 캡시드)로부터 시각적으로 비어 있는 캡시드를 구별하기 위해 사용될 수 있다.
Cap 유전자 및 캡시드 단백질
rAAV 입자 또는 rAAV 제제 내의 입자는 임의의 유도체 또는 유사형을 포함한 임의의 AAV 혈청형의 것일 수 있다 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 2/1, 2/5, 2/8, 2/9, 3/1, 3/5, 3/8 또는 3/9). cap 유전자를 사용하여 rAAV 게놈 또는 본원에 기재된 바와 같은 ITR 중 어느 하나에 의해 플랭킹되는 임의의 관심 유전자를 패키징할 수 있다. 결과적으로, 본원에 기재된 방법 중 어느 하나로부터 생산된 rAAV 입자는 임의의 혈청형 또는 유사형의 것일 수 있으며, 이는 결국, 본원에 기재된 키메라 rep 유전자 중 어느 하나를 사용할 수 있다. 본원에 개시된 방법 중 어느 하나를 사용하여 생산된 rAAV 입자 (예를 들어, rep 유전자 중 어느 하나, cap 유전자 중 어느 하나, 및/또는 본원에 기재된 ITR 중 어느 하나를 수반함)를 사용하여 관심 유전자를 세포 (예를 들어, 대상체의 체내에 있는 세포, 또는 시험관내 세포)에 전달할 수 있거나, 또는 대상체에서의 병태 또는 질환을 치료할 수 있다.
rAAV 바이러스 입자의 혈청형은 재조합 바이러스의 캡시드 단백질의 혈청형을 지칭한다. 유도체 및 유사형의 비-제한적인 예는 rAAV2/1, rAAV2/5, rAAV2/8, rAAV2/9, AAV2-AAV3 하이브리드, AAVrh.10, AAVhu.14, AAV3a/3b, AAVrh32.33, AAV-HSC15, AAV-HSC17, AAVhu.37, AAVrh.8, CHt-P6, AAV2.5, AAV6.2, AAV2i8, AAV-HSC15/17, AAVM41, AAV9.45, AAV6(Y445F/Y731F), AAV2.5T, AAV-HAE1/2, AAV 클론 32/83, AAVShH10, AAV2 (Y->F), AAV8 (Y733F), AAV2.15, AAV2.4, AAVM41, 및 AAVr3.45를 포함한다. 일부 실시양태에서, cap 단백질은 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는다. 이러한 AAV 혈청형 및 유도체/유사형, 및 이러한 유도체/유사형을 생산하는 방법은 관련 기술 분야에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Mol Ther. 2012 Apr;20(4):699-708. doi: 10.1038/mt.2011.287. Epub 2012 Jan 24. The AAV vector toolkit: poised at the clinical crossroads. Asokan A1, Schaffer DV, Samulski RJ] 참조). 일부 실시양태에서, rAAV 입자는 (a) 하나의 혈청형 (예를 들어, AAV2, AAV3)으로부터의 ITR을 포함하는 핵산 벡터 및 (b) 또 다른 혈청형 (예를 들어, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, 또는 AAV10)으로부터 유래된 캡시드 단백질로 구성된 캡시드를 포함하는 유사형 rAAV 입자이다. 유사형 rAAV 벡터를 생산하고 사용하는 방법은 관련 기술 분야에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Duan et al., J. Virol., 75:7662-7671, 2001; Halbert et al., J. Virol., 74:1524-1532, 2000; Zolotukhin et al., Methods, 28:158-167, 2002; 및 Auricchio et al., Hum. Molec. Genet., 10:3075-3081, 2001] 참조).
헬퍼 유전자 및 벡터
일부 실시양태에서, 하나 이상의 헬퍼 벡터 (예를 들어, 플라스미드)는 rep 유전자 및/또는 cap 유전자를 포함하는 제1 헬퍼 플라스미드, 및 하기 헬퍼 유전자 중 하나 이상을 포함하는 제2 헬퍼 플라스미드를 포함한다: E1a 유전자, E1b 유전자, E4 유전자, E2a 유전자 및 VA 유전자. 명확성을 위해, 헬퍼 유전자는 헬퍼 단백질 E1a, E1b, E4, E2a 및 VA를 코딩하는 유전자이다. 일부 실시양태에서, cap 유전자는 단백질 VP1, VP2 및 VP3 중 하나 이상이 발현되지 않도록 변형된다. 일부 실시양태에서, cap 유전자는 VP2가 발현되지 않도록 변형된다. 이러한 변형을 만드는 방법은 관련 기술 분야에 공지되어 있다 (Lux et al. (2005), J Virology, 79: 11776-87).
헬퍼 플라스미드 및 이러한 플라스미드를 만드는 방법은 관련 기술 분야에 공지되어 있고, 상업적으로 이용가능하다 (예를 들어, 플라스미드팩토리 (PlasmidFactory; 독일 빌레펠트)로부터의 pDF6, pRep, pDM, pDG, pDP1rs, pDP2rs, pDP3rs, pDP4rs, pDP5rs, pDP6rs, pDG(R484E/R585E), 및 pDP8.ape 플라스미드; 벡터 바이오랩스 (Vector Biolabs; 미국 펜실베니아주 필라델피아); 셀바이오랩스 (Cellbiolabs; 미국 캘리포니아주 샌디에이고); 애질런트 테크놀로지스 (Agilent Technologies; 미국 캘리포니아주 산타 클라라); 및 애드젠 (Addgene; 미국 매사추세츠주 케임브리지)으로부터 이용가능한 다른 제품 및 서비스; pxx6; 문헌 [Grimm et al. (1998), Novel Tools for Production and Purification of Recombinant Adeno associated Virus Vectors, Human Gene Therapy, Vol. 9, 2745-2760; Kern, A. et al. (2003), Identification of a Heparin-Binding Motif on Adeno-Associated Virus Type 2 Capsids, Journal of Virology, Vol. 77, 11072-11081.; Grimm et al. (2003), Helper Virus-Free, Optically Controllable, and Two-Plasmid-Based Production of Adeno-associated Virus Vectors of Serotypes 1 to 6, Molecular Therapy, Vol. 7, 839-850; Kronenberg et al. (2005), A Conformational Change in the Adeno-Associated Virus Type 2 Capsid Leads to the Exposure of Hidden VP1 N Termini, Journal of Virology, Vol. 79, 5296-5303; 및 Moullier, P. and Snyder, R.O. (2008), International efforts for recombinant adeno-associated viral vector reference standards, Molecular Therapy, Vol. 16, 1185-1188] 참조). 특이적 혈청형에 대한 야생형 AAV 코딩 영역을 코딩하는 플라스미드가 또한 공지되어 있으며 이용가능하다. 예를 들어 pSub201은 야생형 AAV2 게놈의 코딩 영역을 포함하는 플라스미드이다 (Samulski et al. (1987), J Virology, 6:3096-3101).
관심 유전자 및 제어 요소
관심 유전자는 관심 단백질을 코딩하는 유전자이다. 관심 단백질은 검출가능한 마커 또는 치료용 단백질일 수 있다. 검출가능한 마커는 (예를 들어, 육안을 이용하거나 또는 현미경을 이용하여) 시각화될 수 있는 분자이다. 일부 실시양태에서, 검출가능한 마커는 형광 분자, 생물 발광 분자, 또는 색상을 제공하는 분자 (예를 들어, β-갈락토시다제, β-락타마제, β-글루쿠로니다제 및 스페리오데논)이다. 일부 실시양태에서, 검출가능한 마커는 형광 단백질 또는 그의 기능적 펩티드 또는 기능적 폴리펩티드이다.
일부 실시양태에서, 관심 유전자는 치료용 단백질을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 치료 유전자는 항체, 펩티바디, 성장 인자, 응고 인자, 호르몬, 막 단백질, 시토카인, 케모카인, 세포 표면 수용체 또는 이온 채널에 작용하는 활성화 또는 억제성 펩티드, 세포 내 프로세스를 표적화하는 세포 투과성 펩티드, 혈전 용해제, 효소, 뼈 형태 형성 단백질, 유전자 편집에 사용되는 뉴클레아제 또는 다른 단백질, Fc-융합 단백질, 항응고제, 뉴클레아제, 가이드 RNA 또는 다른 핵산, 또는 유전자 편집을 위한 단백질을 코딩한다.
일부 실시양태에서, 핵산 벡터는 핵산 (예를 들어, 이종 핵산)의 발현을 촉진시키는 서열, 예를 들어 핵산에 작동가능하게 연결된 발현 제어 서열을 포함하는 하나 이상의 영역을 포함한다. 이러한 제어 요소는 생산자 세포로 전달되어 생산자 세포에서의 하나 이상의 단백질의 발현을 돕도록 할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제어 요소는 하나 이상의 관심 유전자와 함께 패키징되도록 생산자 세포에 전달되어, 이와 같이 패키징된 rAAV 입자가 표적 세포, 조직 또는 기관을 감염시키기 위해 사용될 때, 이러한 표적 세포, 조직 또는 기관에서의 관심 유전자의 산물의 발현을 도와준다.
수많은 제어 요소가 관련 기술 분야에 공지되어 있다. 제어 요소의 비-제한적인 예는 프로모터, 인슐레이터, 사일렌서, 반응 요소, 인트론, 인핸서, 개시 부위, 종결 신호 및 폴리(A) 꼬리를 포함한다. 이러한 제어 요소의 임의의 조합이 본원에서 고려된다 (예를 들어, 프로모터와 인핸서). 관심 단백질 또는 폴리펩티드의 적절한 발현 수준을 달성하기 위해, 선택된 숙주 세포에 사용하기 적합한 수많은 프로모터 중 임의의 것이 이용될 수 있다. 프로모터는, 예를 들어, 구성적 프로모터, 조직 특이적 프로모터, 유도성 프로모터 또는 합성 프로모터일 수 있다. 예를 들어, 상이한 강도의 구성적 프로모터가 사용될 수 있다. 본원에 기재된 핵산 벡터는 하나 이상의 구성적 프로모터, 예컨대 전사를 촉진시키는 데 일반적으로 활성인 포유동물 유전자로부터의 프로모터 또는 바이러스 프로모터를 포함할 수 있다. 구성적 바이러스 프로모터의 비-제한적인 예는 단순 포진 바이러스 (HSV), 티미딘 키나제 (TK), 라우스 육종 바이러스 (RSV), 유인원 바이러스 40 (SV40), 마우스 유방 종양 바이러스 (MMTV), Ad E1A 및 시토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터를 포함한다. 구성적 포유동물 프로모터의 비-제한적인 예는 β-액틴 프로모터 (예를 들어, 치킨 β-액틴 프로모터) 및 인간 신장 인자-1α (EF-1α) 프로모터에 의해 예시된 바와 같이, 다양한 하우스키핑 유전자 프로모터를 포함한다. 관심 단백질 또는 폴리펩티드의 적절한 발현 수준을 달성하기 위해 유도성 프로모터 및/또는 조절 요소가 또한 고려될 수 있다. 적합한 유도성 프로모터의 비-제한적인 예는 시토크롬 P450 유전자, 열 충격 단백질 유전자, 메탈로티오네인 유전자 및 호르몬 유도성 유전자, 예컨대 에스트로겐 유전자 프로모터와 같은 유전자로부터의 것들을 포함한다. 유도성 프로모터의 또 다른 예는 테트라사이클린에 반응하는 tetVP16 프로모터이다. 조직 특이적 프로모터 및/또는 조절 요소가 또한 본원에서 고려된다. 사용될 수 있는 이러한 프로모터의 비-제한적인 예는 기도 상피 세포 특이적 프로모터를 포함한다. 합성 프로모터가 또한 본원에서 고려된다. 합성 프로모터는, 예를 들어, 공지된 프로모터의 영역, 조절 요소, 전사 인자 결합 부위, 인핸서 요소, 억제인자 요소 등을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 임의로 하나 이상의 제어 요소를 포함한 관심 유전자는 ITR에 의해 플랭킹된다. 일부 실시양태에서, ITR에 의해 플랭킹되는 관심 유전자를 포함하는 핵산 벡터는 RNA, DNA, ssDNA 또는 자기 상보적 DNA 분자이다. 일부 실시양태에서, 핵산 벡터는 본 출원에 기재된 하나 이상의 기술을 사용하여 바이러스 입자로 패키징된다 (예를 들어, 핵산 벡터를, 예를 들어 형질감염을 통해, 키메라 rep 유전자 또는 관심 유전자를 플랭킹하는 ITR과 상이한 혈청형의 것인 유전자를 발현하는 생산자 세포 내로 도입하는 것에 의하며, 여기서 생산자 세포는 하나 이상의 cap 유전자 및/또는 헬퍼 유전자를 추가로 임의로 발현한다).
추가 설명없이, 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 상기 설명에 기초하여, 본 출원을 최대한 활용할 수 있다고 여겨진다. 따라서, 하기 구체적 실시양태는 단지 예시적인 것으로 해석되어야 하며, 어떤 방식으로든 본 출원의 나머지 부분을 제한하지 않는다. 본원에 인용된 모든 간행물은 본원에 언급된 목적 또는 주제를 위해 참조로 포함된다.
본원에 기재된 방법에 의해 생산된 바와 같은 rAAV 입자의 용도
본원에 개시된 방법 중 어느 하나를 사용하여 생산된 rAAV 입자 (예를 들어, rep 유전자 중 어느 하나, cap 유전자 중 어느 하나 및/또는 본원에 기재된 ITR 중 어느 하나를 수반한다)를 사용하여 관심 유전자를 세포 (예를 들어, 대상체의 체내에 있는 세포, 또는 시험관내 세포)에 전달할 수 있거나, 또는 대상체에서의 병태 또는 질환을 치료할 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 포유동물 (예를 들어, 인간)이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 상기 기재된 바와 같은 관심 유전자로의 치료를 필요로 한다.
일부 실시양태에서, "투여하는 것" 또는 "투여"는 약리학적으로 유용한 방식으로 대상체에게 물질을 제공하는 것을 의미한다. 일부 실시양태에서, rAAV 입자는 대상체에게 장을 경유하여 투여된다. 일부 실시양태에서, 필수 금속 원소(들)의 장내 투여는 경구이다. 일부 실시양태에서, rAAV 입자는 대상체에게 비경구로 투여된다. 일부 실시양태에서, rAAV 입자는 피하로, 안구내로, 유리체내로, 망막하로, 정맥내로 (IV), 뇌실내로, 근육내로, 척수강내로 (IT), 뇌조내로, 복강내로, 흡입을 통해, 국소적으로, 또는 하나 이상의 세포, 조직 또는 기관으로의 직접 주사에 의해 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, rAAV 입자는 간 동맥 또는 문맥으로 주사함으로써 대상체에게 투여된다.
본원에 사용되는 용어로서 질환을 "치료"하는 것은 대상체가 경험하는 질환 또는 장애의 적어도 하나의 징후 또는 증상의 빈도 또는 중증도를 감소시키는 것을 의미한다. 상기 또는 본원의 다른 곳에 기재된 조성물은 전형적으로, 유효량, 즉 바람직한 결과를 초래할 수 있는 양으로 대상체에게 투여된다. 바람직한 결과는 투여되는 활성제에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, rAAV 입자의 유효량은 발현 구축물을 숙주 기관, 조직 또는 세포로 전달할 수 있는 입자의 양일 수 있다. 치료상 허용되는 양은 질환, 예를 들어, 프리드라이히(Friedreich) 운동 실조증을 치료할 수 있는 양일 수 있다. 의학 및 수의학 분야에 널리 공지된 바와 같이, 어느 한 대상체에 대한 투여량은 대상체의 크기, 신체 표면적, 연령, 투여할 특별한 조성물, 조성물 내의 활성 성분(들), 투여 시간 및 경로, 일반적 건강, 및 공동으로 투여되는 다른 약물을 포함한 많은 요인에 따라 달라진다.
일부 실시양태에서, 상기 조성물은 제약상 허용되는 담체를 포함한다. 용어 "담체"는 rAAV 입자와 함께 투여되는 희석제, 아주반트, 부형제 또는 비히클을 지칭한다. 이러한 제약 담체는 멸균 액체, 예컨대 물; 및 페트로리움 오일, 예컨대 미네랄 오일, 식물성 오일, 예컨대 땅콩유, 대두유 및 참깨유, 동물성 오일, 또는 합성 기원의 오일의 것을 포함한 오일일 수 있다. 식염수 용액과 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액이 또한 액상 담체로서 이용될 수 있다.
실시예
실시예 1: 상이한 혈청형의 AAV ITR 및 Rep 단백질의 비교
상이한 혈청형의 AAV Rep 단백질 및/또는 AAV ITR을 사용하는 것이 게놈 패키징 효율에 미치는 영향을 탐구하기 위해, AAV1 내지 AAV13의 Rep 및 이용가능한 ITR 서열을 비교하였다 (도 1). ITR 서열은 AAV1-AAV7에 대해서만 이용가능하다. AAV1 및 AAV6은 Rep (99.4%) 및 Cap (99.2%) 단백질 모두에서 높은 서열 동일성을 공유한다. 대조적으로, 그들의 ITR 서열은 발산을 보여준다 (81.6%). AAV6 ITR은 AAV2 ITR과 동일하지만, Rep 및 Cap 단백질 서열은 각각 87.3% 및 83.4%로 더 다양하다. 이것은 AAV6이 AAV1과 AAV2 간의 키메라인 것과 일치한다. AAV1 및 AAV6 Rep는 AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 및 AAV11에 대해 높은 서열 상동성 (≥95.0%)을 공유하지만, 그들의 Cap 단백질 서열은 더 다양하다 (도 1). 중요하게도, AAV5는 다른 AAV와 비교해서 그의 ITR 서열, Rep 단백질 및 Cap 단백질에 있어서 일관되게 다양하다 (도 1).
ITR 내의 서열 변이의 위치 분석은 A-영역에 있어서의 약간의 변이를 보여주지만 D-서열과 헤어핀 (B- 및 C-영역)에서는 더 높은 변이를 보여준다 (도 2). D-서열은 보고에 의하면 AAV 패키징에 중요한 반면, 헤어핀에서의 서열은 2차 구조가 유지되는 한 교환가능하다. 한 예로서, AAV1 및 AAV2의 비교 그래프 표현은 DNA 결합 도메인과 헬리카제 도메인 둘 다에 변이가 존재한다는 것을 보여준다 (도 3). 이러한 관찰 결과는 그들의 기능과 관련될 수 있는 이들 필수 바이러스 요소에 있어서의 복잡성 수준을 나타낸다.
실시예 2: 상이한 혈청형의 ITR 및 Rep 단백질의 조합을 사용하는 것이 rAAV 입자 패키징에 미치는 효과
먼저, 모든 AAV 혈청형의 Rep 단백질과 AAV6 캡시드의 패키징 간의 비교를 수행한다. AAV1 내지 AAV6의 ITR에 의해 플랭킹된 게놈을 갖는 벡터 구축물이 사용된다. AAV2 rep 유전자를 함유하는 기존의 Rep2 (AAV2의 것)-cap6 (AAV6의 것) 헬퍼 플라스미드는 다른 AAV 혈청형으로부터의 rep 유전자에 의해 대체된다. 이들 구축물은 HEK293 세포를 형질감염시켜 rAAV6 (rAAVX/6) 벡터를 생성하는 데 사용된다. 대체 AAV 혈청형으로부터의 ITR에 의해 플랭킹된 AAV 벡터 게놈은, ITR과 Rep 단백질의 매칭 쌍 (예를 들어, AAV1 ITR + AAV1 rep 또는 AAV3 ITR + AAV3 rep 등)으로 시작하여 AAV6 벡터 생산에 사용된다. 이와 같이 생성된 벡터는 AVB 세파로스에 의해 정제되어, 게놈 함유 입자뿐만 아니라 비어 있는 (DNA 없음) AAV 입자를 정제한다. 가득 찬 캡시드와 비어 있는 캡시드는 밀도 구배 (예를 들어, 아이오딕사놀) 또는 침강 구배 (예를 들어, 수크로스 구배)에 의해 분리되며, 각각의 샘플에 대해 캡시드 ELISA (ADK1a 항체를 이용함)를 사용하여 캡시드 역가를 정량화한다. 연속해서, 개별 벡터 제제를 대상으로 비어 있는:가득 찬 비율, 전반적인 생산 수율 및 유전자 발현 효율에 대하여 분석하고 비교한다.
동일한 트랜스진의 패키징 효율에 있어서의 유의한 차이가 관찰되는 경우, 그러한 차이에 중요한 잔기를 확인하기 위해 특정 잔기의 돌연변이와 함께 두 Rep 도메인 내의 잔기 차이에 대한 더 정밀한 분석이 수행된다.
그 다음, AAV1 내지 AAV13의 Rep 서열을 비교하여, 그들 간의 차이가 어디에 위치하는지를 결정하였다. 이어서, 패키징에서의 그들의 역할을 조사한다. AAV5 ITR은 AAV5 Rep 단백질로만 패키징될 수 있는 것으로 공지되어 있으므로, 키메라는 DNA 결합 도메인과 헬리카제 도메인 둘 다를 시험하여 이러한 요구 사항의 결정 인자를 정확히 찾아낼 수 있을 것이다. 패키징 효율 또는 벡터 생산성에 있어서의 유의한 차이가 혈청형 Rep 또는 ITR에 의해 결정되는 것으로 밝혀지는 경우, 도메인이 바이러스 간에 교환되고 (예를 들어, AAV1 DNA 결합 도메인 및/또는 헬리카제/ATPase의 활용 또는 AAV1로부터의 D-서열의 활용), rAAV 입자 패키징에 미치는 영향을 대하여 시험된다.
실시예 3: 다양한 혈청형의 rAAV 입자를 생산하기 위해 키메라
rep
유전자를 사용하는 효과.
도 4는 rAAV 입자를 생산하는 데 사용되는 표준 AAV 생산 시스템의 개략도를 도시한다. 헬퍼 또는 생산자 세포라고도 하는 세포는 Rep 및 캡시드 단백질을 코딩하는 유전자, 및 임의로 ITR 사이의 관심 유전자를 포함하는 하나 이상의 플라스미드로 형질감염되어, rAAV 입자 내에 패키징될 수 있다. 표준 기술은 다양한 키메라 및 변형된 cap 유전자를 활용하지만 통상적으로 혈청형 2의 rep 및 ITR을 사용한다. 하기는 rep 유전자가 변형되고 AAV2의 서열을 갖는 ITR과 함께 사용되어 상이한 혈청형의 캡시드를 생산하는 실험 및 그로부터의 데이터를 기재한다. 시험된 변형된 rep 유전자는 도메인 또는 다른 혈청형으로 대체되는 도메인을 갖는 키메라 rep 유전자이다.
ITR AAV1-7 및 Rep78 AAV1-8에 대한 DNA 서열 동일성 분석이 수행되었다 (도 5). AAV8 ITR, AAV9 ITR 및 AAV9 Rep에 대한 서열은 이용가능하지 않다.
도 5는 AAV 혈청형 1-9에 대한 AAV ITR 및 Rep78에 대한 퍼센트 서열 동일성 분석을 도시한다. 도 6은 AAV 게놈 내의 rep 및 cap 유전자, 및 rep 유전자로부터 발현된 AAV Rep 단백질의 다양한 도메인의 배열을 보여주는 개략도를 제공한다. 역위 말단 반복부 (ITR)에 의해 플랭킹된 2개의 오픈 리딩 프레임을 갖는 AAV 게놈의 개략도가 도시된다. 확대는 Rep 단백질의 도메인과 Rep78/68/52/40의 발현으로 이어지는 전사체의 예시를 도시한다. 하이브리드 세대에 사용되는 rep 유전자의 특이적 도메인이 다음과 같이 표시된다:
n = N-말단 도메인,
d = DNA 결합 도메인,
h = 헬리카제 도메인,
y = NLS/p40 프로모터 도메인, 및
z = 아연 핑거 도메인;
여기서, 본원에 정의된 바와 같은 N-말단은 도메인 n, d, 및 h로 이루어지고; C-말단 (c)은 도메인 y 및 z로 이루어진다.
AAV1 벡터 생산을 위한 rep 유전자의 특징규명 및 최적화는 도 7a-7b에 도시된다. 개선된 게놈 패키징에 책임이 있는 도메인을 확인하기 위해 AAV1과 AAV2 rep 유전자 간의 교환이 이루어졌다. DNA 결합 도메인 (DBD, d)은 중요한 역할을 하는데, 이는 AAV2 DBD가 패키징에 상당한 영향을 미치기 때문이다. 헬리카제 도메인 (h)은 AAV2 헬리카제와도 관련이 있을 가능성이 높아, 개선된 패키징을 또한 나타낸다. 전반적으로, 변이체 R1hc2V1 (즉, C 말단 (c) 및 헬리카제 도메인 (h)이 AAV2 서열의 것인 점을 제외하고는, AAV1 서열의 cap 유전자 및 AAV1 서열의 rep 유전자를 갖는 플라스미드를 나타낸다) 및 R2d1V1 (DNA 결합 도메인 (d)이 AAV1 서열의 것인 점을 제외하고는, AAV1 서열의 cap 유전자 및 AAV2 서열의 rep 유전자를 갖는 플라스미드를 나타낸다) (둘 다 AAV1 DBD 및 AAV2 헬리카제를 갖는다)은 AAV1 캡시드 내에 최상의 벡터 게놈 패키징 표현형을 갖는다. AAV1의 rAAV 입자를 생산하기 위한 rep 변형에 대한 부가의 데이터가 도 8에 제공된다. 이들 변이체의 경우, rep 유전자 내의 도메인은 하기와 같이 정의된다: n = N-말단: aa 1 - 102, d = DNA 결합 도메인: aa 103 - 242, h = 헬리카제 도메인: aa 243 - 370, c = C-말단: aa 371 - 621.
AAV3 입자의 생산을 위해 AAV2 rep 유전자를 AAV3 rep 유전자로 대체하였다 (도 9a-9d). 표준 생산 시스템의 경우, AAV2 rep에 대한 ACG-출발 코돈이 사용되었다. ACG 및 ATG 출발 코돈 둘 다는 AAV3 rep 유전자로 시험되었다. ATG 출발 코돈을 이용한 경우에는, AAV3 Rep78이 가시적이었고 ACG 출발 코돈을 이용한 경우에는 가시적이지 않았다. AAV3 rep 구축물의 VP 발현은 AAV2 rep 유전자 구축물과 비교해서 약간 더 낮았다. 그럼에도 불구하고, ATG-R3V3의 게놈 역가는 ACG-R2V3의 게놈 역가와 거의 동등한 수준이었다. 따라서, 패키징은 AAV3 Rep의 경우에 약간 더 우수하였다 (도 9a-9d).
다음으로, AAV4 입자의 생산을 위해 AAV2 rep 유전자를 AAV4 rep 유전자로 대체하였다 (도 10a-10d). ACG 및 ATG 출발 코돈 둘 다는 AAV4 rep 유전자로 시험되었다. ATG 출발 코돈을 이용한 경우에는, AAV4 Rep78이 가시적이었고 ACG 출발 코돈을 이용한 경우에는 가시적이지 않았다. AAV4 rep 구축물로의 VP1 발현은 AAV2 rep 유전자 구축물과 거의 동등한 수준이었다. 그럼에도 불구하고, ACG-R4V4의 게놈 역가는 ACG-R2V4와 비교해서 더 높았다. 따라서, 패키징은 AAV2 Rep와 비교해서 AAV4 Rep의 경우에 더 우수할 것이다.
AAV5 입자의 생산을 위해 AAV2 rep 유전자를 AAV5 rep 유전자로 대체하였다 (도 11a-11d). ACG 및 ATG 출발 코돈 둘 다는 AAV5 rep 유전자로 시험되었다. ATG 출발 코돈을 이용한 경우에는, AAV5 Rep78이 가시적이었고 ACG 출발 코돈을 이용한 경우에는 가시적이지 않았다. AAV5 rep 구축물로의 VP 발현은 AAV2 rep 유전자 구축물과 비교해서 약간 더 낮은 것으로 여겨졌다. 그러나, AAV5에서는 패키징된 게놈이 검출되지 않았다. AAV5 Rep는 AAV2 ITR과 상호작용할 수 없는 것으로 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Chiorini et al., J Virol. 1999 May;73(5):4293-8] 참조).
AAV6 벡터의 생산을 위해 AAV2 rep 유전자를 AAV6 rep 유전자로 대체하였다 (도 12a-12d). ACG 및 ATG 출발 코돈 둘 다는 AAV6 rep 유전자로 시험되었다. AAV 혈청형 AAV1, AAV2, AAV6 및 AAV8 간의 다양한 Rep 하이브리드가 또한 분석되었다. Rep 변이체 플라스미드 R8d1c2V6 및 R1hc2V6에 대해 최상의 벡터 게놈 패키징 표현형이 관찰되었다. 그러나, 두 플라스미드는 모두 참조 플라스미드 pR2V6과 거의 동등하게 높은 VP 발현을 유지하였다.
AAV7 입자의 생산을 위해 AAV2 rep 유전자를 AAV7 rep 유전자로 대체하였다 (도 13a-13d). ACG 및 ATG 출발 코돈 둘 다는 AAV7 rep 유전자로 시험되었다. ATG 출발 코돈을 이용한 경우에는, AAV7 Rep78이 가시적이었고 ACG 출발 코돈을 이용한 경우에는 가시적이지 않았다. AAV7 rep 구축물로의 VP 발현은 AAV2 rep 유전자 구축물과 비교해서 더 낮았다. 그럼에도 불구하고, ACG-R7V7의 게놈 역가는 ACG-R2V7과 거의 동등한 수준이었다. 따라서, 패키징은 ACG-R7V7의 경우에 더 우수하였다.
개선된 게놈 패키징에 책임이 있는 도메인을 확인하고 AAV8 벡터 생산을 위해 rep 유전자를 최적화하기 위해 AAV1, AAV2, 및 AAV8 rep 유전자 간의 교환이 이루어졌다 (도 14a-14b). DNA 결합 도메인 (DBD)이 VP 발현에 중요한 역할을 하는 것으로 여겨지는데, 이는 AAV8 DBD를 AAV1 DBD로 대체하면 VP 발현이 증가하였기 때문이다. R1c2V8 및 R8d1c2V8 하이브리드/키메라는 AAV2 rep 유전자와 비교해서 벡터 게놈을 AAV8 캡시드 내로 더 효율적으로 패키징한다. 이들 변이체의 경우, rep 도메인은 하기과 같이 정의된다: n = N-말단: aa 1-102, d = DNA 결합 도메인: aa 103 - 224, h = 헬리카제 도메인: aa 225 - 372, c = C-말단: aa 373 - 623.
rep 키메라를 사용한 AAV8 입자의 게놈 패키징에 있어서의 개선은 도 15a-15b에 도시되어 있다. 새로운 rep 키메라 R1c2 및 R8d1c2의 활용은 더 높은 백분율 (3 내지 4배)의 게놈 함유 입자로 이어진다.
도 16a-16b는 AAV8 입자를 패키징하기 위해 더 많은 rep 키메라에 대한 데이터를 제공한다. AAV2 rep 외에 열거된 rep 키메라가 사용되는 경우, 게놈 패키징이 개선된다는 것을 알 수 있다.
다른 실시양태
본 명세서에 개시된 모든 특징은 임의의 조합으로 조합될 수 있다. 본 명세서에 개시된 각각의 특징은 동일하거나, 동등하거나, 또는 유사한 목적을 제공하는 대안적인 특징으로 대체될 수 있다. 따라서, 달리 명시적으로 언급되지 않는 한, 개시된 각각의 특징은 일반적인 일련의 동등하거나 유사한 특징의 예일 뿐이다.
상기 설명으로부터, 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 본 출원의 본질적인 특징을 쉽게 확인할 수 있으며, 그의 취지와 범위를 벗어나지 않고서도 다양한 활용과 조건에 적응하기 위해 다양한 변화 및 변형을 할 수 있다. 따라서, 다른 실시양태 또한 본 청구범위 내에 있다.
등가물
몇 가지 발명의 실시양태가 본원에 기재되고 예시되었지만, 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 기능을 수행하고/하거나 본원에 기재된 결과 및/또는 하나 이상의 이점을 수득하기 위한 다양한 다른 수단 및/또는 구조를 쉽게 구상할 것이며, 그러한 변이 및/또는 변형 각각은 본원에 기재된 발명의 실시양태의 범위 내에 있는 것으로 간주된다. 보다 일반적으로, 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 본원에 기재된 모든 파라미터, 치수, 물질 및 구성이 예시적인 것을 의미한다는 것과, 실제 파라미터, 치수, 물질 및/또는 구성이, 본 발명의 교시가 사용되는 구체적 적용(들)에 의존한다는 것을 쉽게 인식할 것이다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 단지 일상적인 실험을 사용하여 본원에 기재된 구체적인 발명의 실시양태에 대한 많은 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 따라서, 전술한 실시양태는 단지 예로서 제시된 것이며, 첨부된 청구범위 및 그에 대한 등가물의 범위 내에서, 발명의 실시양태는 구체적으로 기재되고 청구된 것과 달리 실시될 수 있다는 것을 이해해야 한다. 본 출원의 발명의 실시양태는 본원에 기재된 각각의 개별적인 특징, 시스템, 물품, 물질, 키트 및/또는 방법에 관한 것이다. 또한, 그러한 특징, 시스템, 물품, 물질, 키트 및/또는 방법 중 둘 이상의 임의의 조합은 그러한 특징, 시스템, 물품, 물질, 키트 및/또는 방법이 서로 불일치하지 않는 경우에는 본 출원의 발명 범위 내에 포함된다.
본원에서 정의되고 사용된 바와 같은 모든 정의는 사전적 정의, 참조로 포함된 문서 내에서의 정의 및/또는 정의된 용어의 통상적인 의미보다 우선하는 것으로 이해되어야 한다.
본원에 개시된 모든 참고문헌, 특허 및 특허 출원은 각각이 인용된 주제와 관련하여 참조로 포함되며, 일부 경우에는 문서 전체를 포함할 수 있다.
본 명세서 및 청구범위에서 사용되는 바와 같은 단수 형태는 달리 명확하게 나타내지 않는 한, "적어도 하나"를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서 및 청구범위에서 사용되는 바와 같은 문구 "및/또는"은 이렇게 결합된 요소, 즉 일부 경우에 결합적으로 존재하고 다른 경우에는 분리적으로 존재하는 요소의 "하나 또는 둘 다"를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. "및/또는"으로 열거된 다수의 요소는 동일한 방식으로 해석되어야 하는데, 즉 이렇게 결합된 요소 중 "하나 이상"이 해당된다. "및/또는" 절에 의해 구체적으로 확인된 요소 이외의 다른 요소는, 구체적으로 확인된 요소와 관련이 있는지의 여부에 관계없이 임의로 존재할 수 있다. 따라서, 비-제한적인 예로서, 개방형 언어, 예컨대 "포함하는"과 연계해서 사용될 때 "A 및/또는 B"에 대한 언급은 한 실시양태에서 A만을 지칭할 수 있고 (임의로, B 이외의 요소를 포함함); 또 다른 실시양태에서, B만을 지칭할 수 있으며 (임의로, A 이외의 요소를 포함함); 또한 또 다른 실시양태에서, A와 B 둘 다를 지칭할 수 있는 등이다 (임의로, 다른 요소를 포함함).
본 명세서 및 청구범위에서 사용된 바와 같은 "또는"은 상기 정의된 바와 같은 "및/또는"과 동일한 의미를 갖는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 목록 내의 항목들을 분리할 때, "또는" 또는 "및/또는"은 포괄적인 것으로 해석되어야 하는데, 즉 요소의 수 또는 목록 중 적어도 하나를 포함하지만, 둘 이상도 포함하고, 임의로 부가의 열거되지 않은 항목도 포함한다. 명확하게 달리 나타낸 유일한 용어, 예컨대 "다음 중 단 하나" 또는 "다음 중 정확히 하나", 또는 청구범위에서 사용되는 경우 "이루어지는"은 요소의 수 또는 목록 중 정확히 하나의 요소를 포함하는 것을 지칭할 것이다. 일반적으로, 본원에 사용되는 바와 같은 용어 "또는"은 "둘 중 하나", "다음 중 하나", "다음 중 단 하나" 또는 "다음 중 정확히 하나"와 같은 배타성 용어가 선행될 때 배타적 대안 (즉, "하나 또는 다른 것이지만, 둘 다가 아닌")을 나타내는 것으로만 해석될 것이다. 청구범위에 사용될 때 "본질적으로 이루어지는"은 특허법 분야에서 사용되는 바와 같은 통상적인 의미를 가질 것이다.
본 명세서 및 청구범위에 사용되는 바와 같이, 하나 이상의 요소의 목록과 관련하여 "적어도 하나"라는 문구는 요소 목록 내의 요소 중 임의의 하나 이상으로부터 선택된 적어도 하나의 요소를 의미하는 것으로 이해되어야 하지만, 요소 목록 내에 구체적으로 열거된 각각의 및 모든 요소 중 적어도 하나를 반드시 포함하는 것은 아니고, 요소 목록 내의 요소의 임의의 조합을 배제하지 않는다. 이러한 정의는 또한, 구체적으로 확인된 요소와 관련이 있는지의 여부와 관계없이, "적어도 하나"라는 문구가 지칭하는 요소 목록 내에 구체적으로 확인된 요소 이외의 요소가 임의로 존재할 수 있도록 허용한다. 따라서, 비-제한적인 예로서, "A 및 B 중 적어도 하나" (또는 동등하게 "A 또는 B 중 적어도 하나" 또는 동등하게 "A 및/또는 B 중 적어도 하나")는 한 실시양태에서, B가 존재하지 않는, 임의로 둘 이상을 포함한 적어도 하나의 A를 지칭할 수 있고 (임의로 B 이외의 요소를 포함함); 또 다른 실시양태에서, A가 존재하지 않는, 임의로 둘 이상을 포함한 적어도 하나의 B를 지칭할 수 있으며 (임의로 A 이외의 요소를 포함함); 또한 또 다른 실시양태에서, 임의로 둘 이상을 포함한 적어도 하나의 A, 및 임의로 둘 이상을 포함한 적어도 하나의 B를 지칭할 수 있는 등이다 (임의로 다른 요소를 포함함).
달리 명확하게 나타내지 않는 한, 둘 이상의 단계 또는 행위를 포함하는 본원에 청구된 임의의 방법에서, 방법의 단계 또는 행위의 순서가 반드시, 이러한 방법의 단계 또는 행위가 나열되는 순서로 제한되지 않는다는 것을 이해해야 한다.
청구범위뿐만 아니라 상기 명세서에서, 모든 과도기적 문구, 예컨대 "포함하는", "포함한", "운반하는", "갖는", "함유하는", "수반하는", "유지하는", "구성된" 등은 개방형, 즉 포함하나 이에 제한되지는 않는 것을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 과도기적 문구 "이루어진" 및 "본질적으로 이루어진" 만이 각각 미국 특허청 특허 심사 절차 매뉴얼, 섹션 2111.03에 명시된 바와 같이 폐쇄형 또는 반 폐쇄형 과도기적 문구일 것이다. 개방형 과도기적 문구 (예를 들어, "포함하는")를 사용하여 본 명세서에서 기재된 실시양태는 또한, 대안 실시양태에서 개방형 과도기적 문구에 의해 기재된 특징으로 "이루어진" 및 "본질적으로 이루어지는" 것으로 고려된다는 것을 인지해야 한다. 예를 들어, 본 출원이 "A 및 B를 포함하는 조성물"을 기재하는 경우, 본 출원은 또한, "A와 B로 이루어진 조성물" 및 "A와 B로 본질적으로 이루어진 조성물"의 대안적인 실시양태를 고려한다.
SEQUENCE LISTING
<110> University of Florida Research Foundation Incorporated
<120> AAV CHIMERAS
<130> U1197.70132WO00
<140> Not Yet Assigned
<141> Concurrently herewith
<150> US 62/639,466
<151> 2018-03-06
<160> 187
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 147
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 1
ttgcccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcggtgggg cctgcggacc aaaggtccgc 60
agacggcaga gctctgctct gccggcccca ccgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120
ggcaactcca tcactagggg taatcgc 147
<210> 2
<211> 145
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 2
ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60
cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120
gccaactcca tcactagggg ttcct 145
<210> 3
<211> 146
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 3
tggccactcc ctctatgcgc actcgctcgc tcggtggggc ctggcgacca aaggtcgcca 60
gacggacgtg ctttgcacgt ccggccccac cgagcgagcg agtgcgcata gagggagtgg 120
ccaactccat cactagaggt atggca 146
<210> 4
<211> 148
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 4
ttggccactc cctctatgcg cgctcgctca ctcactcggc cctggagacc aaaggtctcc 60
agactgccgg cctctggccg gcagggccga gtgagtgagc gagcgcgcat agagggagtg 120
gccaactcca tcatctaggt ttgcccac 148
<210> 5
<211> 176
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 5
ctctcccccc tgtcgcgttc gctcgctcgc tggctcgttt gggggggtgg cagctcaaag 60
agctgccaga cgacggccct ctggccgtcg cccccccaaa cgagccagcg agcgagcgaa 120
cgcgacaggg gggagagtgc cacactctca agcaaggggg ttttgtaagc agtgat 176
<210> 6
<211> 145
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 6
ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60
cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120
gccaactcca tcactagggg ttcct 145
<210> 7
<211> 146
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 7
ttggccactc cctctatgcg cgctcgctcg ctcggtgggg cctgcggacc aaaggtccgc 60
agacggcaga gctctgctct gccggcccca ccgagcgagc gagcgcgcat agagggagtg 120
gccaactcca tcactagggg taccgc 146
<210> 8
<211> 1872
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 8
atgccgggct tctacgagat cgtgatcaag gtgccgagcg acctggacga gcacctgccg 60
ggcatttctg actcgtttgt gagctgggtg gccgagaagg aatgggagct gcccccggat 120
tctgacatgg atctgaatct gattgagcag gcacccctga ccgtggccga gaagctgcag 180
cgcgacttcc tggtccaatg gcgccgcgtg agtaaggccc cggaggccct cttctttgtt 240
cagttcgaga agggcgagtc ctacttccac ctccatattc tggtggagac cacgggggtc 300
aaatccatgg tgctgggccg cttcctgagt cagattaggg acaagctggt gcagaccatc 360
taccgcggga tcgagccgac cctgcccaac tggttcgcgg tgaccaagac gcgtaatggc 420
gccggagggg ggaacaaggt ggtggacgag tgctacatcc ccaactacct cctgcccaag 480
actcagcccg agctgcagtg ggcgtggact aacatggagg agtatataag cgcctgtttg 540
aacctggccg agcgcaaacg gctcgtggcg cagcacctga cccacgtcag ccagacccag 600
gagcagaaca aggagaatct gaaccccaat tctgacgcgc ctgtcatccg gtcaaaaacc 660
tccgcgcgct acatggagct ggtcgggtgg ctggtggacc ggggcatcac ctccgagaag 720
cagtggatcc aggaggacca ggcctcgtac atctccttca acgccgcttc caactcgcgg 780
tcccagatca aggccgctct ggacaatgcc ggcaagatca tggcgctgac caaatccgcg 840
cccgactacc tggtaggccc cgctccgccc gcggacatta aaaccaaccg catctaccgc 900
atcctggagc tgaacggcta cgaacctgcc tacgccggct ccgtctttct cggctgggcc 960
cagaaaaggt tcgggaagcg caacaccatc tggctgtttg ggccggccac cacgggcaag 1020
accaacatcg cggaagccat cgcccacgcc gtgcccttct acggctgcgt caactggacc 1080
aatgagaact ttcccttcaa tgattgcgtc gacaagatgg tgatctggtg ggaggagggc 1140
aagatgacgg ccaaggtcgt ggagtccgcc aaggccattc tcggcggcag caaggtgcgc 1200
gtggaccaaa agtgcaagtc gtccgcccag atcgacccca cccccgtgat cgtcacctcc 1260
aacaccaaca tgtgcgccgt gattgacggg aacagcacca ccttcgagca ccagcagccg 1320
ttgcaggacc ggatgttcaa atttgaactc acccgccgtc tggagcatga ctttggcaag 1380
gtgacaaagc aggaagtcaa agagttcttc cgctgggcgc aggatcacgt gaccgaggtg 1440
gcgcatgagt tctacgtcag aaagggtgga gccaacaaaa gacccgcccc cgatgacgcg 1500
gataaaagcg agcccaagcg ggcctgcccc tcagtcgcgg atccatcgac gtcagacgcg 1560
gaaggagctc cggtggactt tgccgacagg taccaaaaca aatgttctcg tcacgcgggc 1620
atgcttcaga tgctgtttcc ctgcaagaca tgcgagagaa tgaatcagaa tttcaacatt 1680
tgcttcacgc acgggacgag agactgttca gagtgcttcc ccggcgtgtc agaatctcaa 1740
ccggtcgtca gaaagaggac gtatcggaaa ctctgtgcca ttcatcatct gctggggcgg 1800
gctcccgaga ttgcttgctc ggcctgcgat ctggtcaacg tggacctgga tgactgtgtt 1860
tctgagcaat aa 1872
<210> 9
<211> 1866
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 9
atgccggggt tttacgagat tgtgattaag gtccccagcg accttgacgg gcatctgccc 60
ggcatttctg acagctttgt gaactgggtg gccgagaagg aatgggagtt gccgccagat 120
tctgacatgg atctgaatct gattgagcag gcacccctga ccgtggccga gaagctgcag 180
cgcgactttc tgacggaatg gcgccgtgtg agtaaggccc cggaggccct tttctttgtg 240
caatttgaga agggagagag ctacttccac atgcacgtgc tcgtggaaac caccggggtg 300
aaatccatgg ttttgggacg tttcctgagt cagattcgcg aaaaactgat tcagagaatt 360
taccgcggga tcgagccgac tttgccaaac tggttcgcgg tcacaaagac cagaaatggc 420
gccggaggcg ggaacaaggt ggtggatgag tgctacatcc ccaattactt gctccccaaa 480
acccagcctg agctccagtg ggcgtggact aatatggaac agtatttaag cgcctgtttg 540
aatctcacgg agcgtaaacg gttggtggcg cagcatctga cgcacgtgtc gcagacgcag 600
gagcagaaca aagagaatca gaatcccaat tctgatgcgc cggtgatcag atcaaaaact 660
tcagccaggt acatggagct ggtcgggtgg ctcgtggaca aggggattac ctcggagaag 720
cagtggatcc aggaggacca ggcctcatac atctccttca atgcggcctc caactcgcgg 780
tcccaaatca aggctgcctt ggacaatgcg ggaaagatta tgagcctgac taaaaccgcc 840
cccgactacc tggtgggcca gcagcccgtg gaggacattt ccagcaatcg gatttataaa 900
attttggaac taaacgggta cgatccccaa tatgcggctt ccgtctttct gggatgggcc 960
acgaaaaagt tcggcaagag gaacaccatc tggctgtttg ggcctgcaac taccgggaag 1020
accaacatcg cggaggccat agcccacact gtgcccttct acgggtgcgt aaactggacc 1080
aatgagaact ttcccttcaa cgactgtgtc gacaagatgg tgatctggtg ggaggagggg 1140
aagatgaccg ccaaggtcgt ggagtcggcc aaagccattc tcggaggaag caaggtgcgc 1200
gtggaccaga aatgcaagtc ctcggcccag atagacccga ctcccgtgat cgtcacctcc 1260
aacaccaaca tgtgcgccgt gattgacggg aactcaacga ccttcgaaca ccagcagccg 1320
ttgcaagacc ggatgttcaa atttgaactc acccgccgtc tggatcatga ctttgggaag 1380
gtcaccaagc aggaagtcaa agactttttc cggtgggcaa aggatcacgt ggttgaggtg 1440
gagcatgaat tctacgtcaa aaagggtgga gccaagaaaa gacccgcccc cagtgacgca 1500
gatataagtg agcccaaacg ggtgcgcgag tcagttgcgc agccatcgac gtcagacgcg 1560
gaagcttcga tcaactacgc agacaggtac caaaacaaat gttctcgtca cgtgggcatg 1620
aatctgatgc tgtttccctg cagacaatgc gagagaatga atcagaattc aaatatctgc 1680
ttcactcacg gacagaaaga ctgtttagag tgctttcccg tgtcagaatc tcaacccgtt 1740
tctgtcgtca aaaaggcgta tcagaaactg tgctacattc atcatatcat gggaaaggtg 1800
ccagacgctt gcactgcctg cgatctggtc aatgtggatt tggatgactg catctttgaa 1860
caataa 1866
<210> 10
<211> 1875
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 10
atgccggggt tctacgagat tgtcctgaag gtcccgagtg acctggacga gcacctgccg 60
ggcatttcta actcgtttgt taactgggtg gccgagaagg aatgggagct gccgccggat 120
tctgacatgg atccgaatct gattgagcag gcacccctga ccgtggccga aaagcttcag 180
cgcgagttcc tggtggagtg gcgccgcgtg agtaaggccc cggaggccct cttttttgtc 240
cagttcgaaa agggggagac ctacttccac ctgcacgtgc tgattgagac catcggggtc 300
aaatccatgg tggtcggccg ctacgtgagc cagattaaag agaagctggt gacccgcatc 360
taccgcgggg tcgagccgca gcttccgaac tggttcgcgg tgaccaaaac gcgaaatggc 420
gccgggggcg ggaacaaggt ggtggacgac tgctacatcc ccaactacct gctccccaag 480
acccagcccg agctccagtg ggcgtggact aacatggacc agtatttaag cgcctgtttg 540
aatctcgcgg agcgtaaacg gctggtggcg cagcatctga cgcacgtgtc gcagacgcag 600
gagcagaaca aagagaatca gaaccccaat tctgacgcgc cggtcatcag gtcaaaaacc 660
tcagccaggt acatggagct ggtcgggtgg ctggtggacc gcgggatcac gtcagaaaag 720
caatggattc aggaggacca ggcctcgtac atctccttca acgccgcctc caactcgcgg 780
tcccagatca aggccgcgct ggacaatgcc tccaagatca tgagcctgac aaagacggct 840
ccggactacc tggtgggcag caacccgccg gaggacatta ccaaaaatcg gatctaccaa 900
atcctggagc tgaacgggta cgatccgcag tacgcggcct ccgtcttcct gggctgggcg 960
caaaagaagt tcgggaagag gaacaccatc tggctctttg ggccggccac gacgggtaaa 1020
accaacatcg cggaagccat cgcccacgcc gtgcccttct acggctgcgt aaactggacc 1080
aatgagaact ttcccttcaa cgattgcgtc gacaagatgg tgatctggtg ggaggagggc 1140
aagatgacgg ccaaggtcgt ggagagcgcc aaggccattc tgggcggaag caaggtgcgc 1200
gtggaccaaa agtgcaagtc atcggcccag atcgaaccca ctcccgtgat cgtcacctcc 1260
aacaccaaca tgtgcgccgt gattgacggg aacagcacca ccttcgagca tcagcagccg 1320
ctgcaggacc ggatgtttaa atttgaactt acccgccgtt tggaccatga ctttgggaag 1380
gtcaccaaac aggaagtaaa ggactttttc cggtgggctt ccgatcacgt gactgacgtg 1440
gctcatgagt tctacgtcag aaagggtgga gctaagaaac gccccgcctc caatgacgcg 1500
gatgtaagcg agccaaaacg gcagtgcacg tcacttgcgc agccgacaac gtcagacgcg 1560
gaagcaccgg cggactacgc ggacaggtac caaaacaaat gttctcgtca cgtgggcatg 1620
aatctgatgc tttttccctg taaaacatgc gagagaatga atcaaatttc caatgtctgt 1680
tttacgcatg gtcaaagaga ctgtggggaa tgcttccctg gaatgtcaga atctcaaccc 1740
gtttctgtcg tcaaaaagaa gacttatcag aaactgtgtc caattcatca tatcctggga 1800
agggcacccg agattgcctg ttcggcctgc gatttggcca atgtggactt ggatgactgt 1860
gtttctgagc aataa 1875
<210> 11
<211> 1872
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 11
atgccggggt tctacgagat cgtgctgaag gtgcccagcg acctggacga gcacctgccc 60
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cagttcgaga agggggacag ctacttccac ctgcacatcc tggtggagac cgtgggcgtc 300
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taccgcgggg tcgagccgca gcttccgaac tggttcgcgg tgaccaagac gcgtaatggc 420
gccggaggcg ggaacaaggt ggtggacgac tgctacatcc ccaactacct gctccccaag 480
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aatctcgcgg agcgtaaacg gctggtggcg cagcatctga cgcacgtgtc gcagacgcag 600
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tcacaaatca aggccgcgct ggacaatgcc tccaaaatca tgagcctgac aaagacggct 840
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caaaagaagt tcgggaagag gaacaccatc tggctctttg ggccggccac gacgggtaaa 1020
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tctgtcgtca gaaagcggac gtatcagaaa ctgtgtccga ttcatcacat catggggagg 1800
gcgcccgagg tggcctgctc ggcctgcgaa ctggccaatg tggacttgga tgactgtgac 1860
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<210> 12
<211> 1833
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 12
atggctacct tctatgaagt cattgttcgc gtcccatttg acgtggagga acatctgcct 60
ggaatttctg acagctttgt ggactgggta actggtcaaa tttgggagct gcctccagag 120
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cgcgtgttcc tgtacgagtg gaacaaattt tccaagcagg agtccaaatt ctttgtgcag 240
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tccatggtcc tcggccgcta cgtgagtcag attcgcgccc agctggtgaa agtggtcttc 360
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gtggggagct ccgttcccga ggacatttca aaaaacagaa tctggcaaat ttttgagatg 900
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gaggccatcg cccacactgt gcccttttac ggctgcgtga actggaccaa tgaaaacttt 1080
ccctttaatg actgtgtgga caaaatgctc atttggtggg aggagggaaa gatgaccaac 1140
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tgtgtggtgg tggatgggaa ttccacgacc tttgaacacc agcagccgct ggaggaccgc 1320
atgttcaaat ttgaactgac taagcggctc ccgccagatt ttggcaagat tactaagcag 1380
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tctgtcgtca gaaaaacgta tcagaaactg tgcatccttc atcagctccg gggggcaccc 1800
gagatcgcct gctctgcttg cgaccaactc aaccccgatt tggacgattg ccaatttgag 1860
caataa 1866
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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tctgacatgg atctgaatct gattgagcag gcacccctaa ccgtggccga aaagctgcaa 180
cgcgaattcc tggtcgagtg gcgccgcgtg agtaaggccc cggaggccct cttctttgtt 240
cagttcgaga agggggacag ctacttccac ctacacattc tggtggagac cgtgggcgtg 300
aaatccatgg tggtgggccg ctacgtgagc cagattaaag agaagctggt gacccgcatc 360
taccgcgggg tcgagccgca gcttccgaac tggttcgcgg tgaccaagac gcgtaatggc 420
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aatctcgcgg agcgtaaacg gctggtggcg cagcatctga cgcacgtgtc gcagacgcag 600
gagcagaaca aagagaacca gaatcccaat tctgacgcgc cggtgatcag atcaaaaacc 660
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caaaagaagt tcgggaagag gaacaccatc tggctctttg ggccggccac gacgggtaaa 1020
accaacatcg ctgaagctat cgcccacgcc gtgccctttt acggctgcgt gaactggacc 1080
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aatctgatgc tttttccctg ccggcaatgc gagagaatga atcagaatgt ggacatttgc 1680
ttcacgcacg gggtcatgga ctgtgccgag tgcttccccg tgtcagaatc tcaacccgtg 1740
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atggagcaat aa 1872
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305 310 315 320
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325 330 335
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450 455 460
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<220>
<223> Synthetic polypeptide
<400> 25
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165 170 175
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195 200 205
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<212> DNA
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cgctacatgg agctggtcgg gtggctggtg gaccggggca tcacctccga gaagcagtgg 420
<210> 42
<211> 381
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 42
atccaggagg accaggcctc gtacatctcc ttcaacgccg cttccaactc gcggtcccag 60
atcaaggccg ctctggacaa tgccggcaag atcatggcgc tgaccaaatc cgcgcccgac 120
tacctggtag gccccgctcc gcccgcggac attaaaacca accgcatcta ccgcatcctg 180
gagctgaacg gctacgaacc tgcctacgcc ggctccgtct ttctcggctg ggcccagaaa 240
aggttcggga agcgcaacac catctggctg tttgggccgg ccaccacggg caagaccaac 300
atcgcggaag ccatcgccca cgccgtgccc ttctacggct gcgtcaactg gaccaatgag 360
aactttccct tcaatgattg c 381
<210> 43
<211> 765
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 43
gtcgacaaga tggtgatctg gtgggaggag ggcaagatga cggccaaggt cgtggagtcc 60
gccaaggcca ttctcggcgg cagcaaggtg cgcgtggacc aaaagtgcaa gtcgtccgcc 120
cagatcgacc ccacccccgt gatcgtcacc tccaacacca acatgtgcgc cgtgattgac 180
gggaacagca ccaccttcga gcaccagcag ccgttgcagg accggatgtt caaatttgaa 240
ctcacccgcc gtctggagca tgactttggc aaggtgacaa agcaggaagt caaagagttc 300
ttccgctggg cgcaggatca cgtgaccgag gtggcgcatg agttctacgt cagaaagggt 360
ggagccaaca aaagacccgc ccccgatgac gcggataaaa gcgagcccaa gcgggcctgc 420
ccctcagtcg cggatccatc gacgtcagac gcggaaggag ctccggtgga ctttgccgac 480
aggtaccaaa acaaatgttc tcgtcacgcg ggcatgcttc agatgctgtt tccctgcaag 540
acatgcgaga gaatgaatca gaatttcaac atttgcttca cgcacgggac gagagactgt 600
tcagagtgct tccccggcgt gtcagaatct caaccggtcg tcagaaagag gacgtatcgg 660
aaactctgtg ccattcatca tctgctgggg cgggctcccg agattgcttg ctcggcctgc 720
gatctggtca acgtggacct ggatgactgt gtttctgagc aataa 765
<210> 44
<211> 495
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 44
gtcgacaaga tggtgatctg gtgggaggag ggcaagatga cggccaaggt cgtggagtcc 60
gccaaggcca ttctcggcgg cagcaaggtg cgcgtggacc aaaagtgcaa gtcgtccgcc 120
cagatcgacc ccacccccgt gatcgtcacc tccaacacca acatgtgcgc cgtgattgac 180
gggaacagca ccaccttcga gcaccagcag ccgttgcagg accggatgtt caaatttgaa 240
ctcacccgcc gtctggagca tgactttggc aaggtgacaa agcaggaagt caaagagttc 300
ttccgctggg cgcaggatca cgtgaccgag gtggcgcatg agttctacgt cagaaagggt 360
ggagccaaca aaagacccgc ccccgatgac gcggataaaa gcgagcccaa gcgggcctgc 420
ccctcagtcg cggatccatc gacgtcagac gcggaaggag ctccggtgga ctttgccgac 480
aggtaccaaa acaaa 495
<210> 45
<211> 270
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 45
tgttctcgtc acgcgggcat gcttcagatg ctgtttccct gcaagacatg cgagagaatg 60
aatcagaatt tcaacatttg cttcacgcac gggacgagag actgttcaga gtgcttcccc 120
ggcgtgtcag aatctcaacc ggtcgtcaga aagaggacgt atcggaaact ctgtgccatt 180
catcatctgc tggggcgggc tcccgagatt gcttgctcgg cctgcgatct ggtcaacgtg 240
gacctggatg actgtgtttc tgagcaataa 270
<210> 46
<211> 102
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<400> 46
Met Pro Gly Phe Tyr Glu Ile Val Ile Lys Val Pro Ser Asp Leu Asp
1 5 10 15
Glu His Leu Pro Gly Ile Ser Asp Ser Phe Val Ser Trp Val Ala Glu
20 25 30
Lys Glu Trp Glu Leu Pro Pro Asp Ser Asp Met Asp Leu Asn Leu Ile
35 40 45
Glu Gln Ala Pro Leu Thr Val Ala Glu Lys Leu Gln Arg Asp Phe Leu
50 55 60
Val Gln Trp Arg Arg Val Ser Lys Ala Pro Glu Ala Leu Phe Phe Val
65 70 75 80
Gln Phe Glu Lys Gly Glu Ser Tyr Phe His Leu His Ile Leu Val Glu
85 90 95
Thr Thr Gly Val Lys Ser
100
<210> 47
<211> 140
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<400> 47
Met Val Leu Gly Arg Phe Leu Ser Gln Ile Arg Asp Lys Leu Val Gln
1 5 10 15
Thr Ile Tyr Arg Gly Ile Glu Pro Thr Leu Pro Asn Trp Phe Ala Val
20 25 30
Thr Lys Thr Arg Asn Gly Ala Gly Gly Gly Asn Lys Val Val Asp Glu
35 40 45
Cys Tyr Ile Pro Asn Tyr Leu Leu Pro Lys Thr Gln Pro Glu Leu Gln
50 55 60
Trp Ala Trp Thr Asn Met Glu Glu Tyr Ile Ser Ala Cys Leu Asn Leu
65 70 75 80
Ala Glu Arg Lys Arg Leu Val Ala Gln His Leu Thr His Val Ser Gln
85 90 95
Thr Gln Glu Gln Asn Lys Glu Asn Leu Asn Pro Asn Ser Asp Ala Pro
100 105 110
Val Ile Arg Ser Lys Thr Ser Ala Arg Tyr Met Glu Leu Val Gly Trp
115 120 125
Leu Val Asp Arg Gly Ile Thr Ser Glu Lys Gln Trp
130 135 140
<210> 48
<211> 127
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<400> 48
Ile Gln Glu Asp Gln Ala Ser Tyr Ile Ser Phe Asn Ala Ala Ser Asn
1 5 10 15
Ser Arg Ser Gln Ile Lys Ala Ala Leu Asp Asn Ala Gly Lys Ile Met
20 25 30
Ala Leu Thr Lys Ser Ala Pro Asp Tyr Leu Val Gly Pro Ala Pro Pro
35 40 45
Ala Asp Ile Lys Thr Asn Arg Ile Tyr Arg Ile Leu Glu Leu Asn Gly
50 55 60
Tyr Glu Pro Ala Tyr Ala Gly Ser Val Phe Leu Gly Trp Ala Gln Lys
65 70 75 80
Arg Phe Gly Lys Arg Asn Thr Ile Trp Leu Phe Gly Pro Ala Thr Thr
85 90 95
Gly Lys Thr Asn Ile Ala Glu Ala Ile Ala His Ala Val Pro Phe Tyr
100 105 110
Gly Cys Val Asn Trp Thr Asn Glu Asn Phe Pro Phe Asn Asp Cys
115 120 125
<210> 49
<211> 254
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<400> 49
Val Asp Lys Met Val Ile Trp Trp Glu Glu Gly Lys Met Thr Ala Lys
1 5 10 15
Val Val Glu Ser Ala Lys Ala Ile Leu Gly Gly Ser Lys Val Arg Val
20 25 30
Asp Gln Lys Cys Lys Ser Ser Ala Gln Ile Asp Pro Thr Pro Val Ile
35 40 45
Val Thr Ser Asn Thr Asn Met Cys Ala Val Ile Asp Gly Asn Ser Thr
50 55 60
Thr Phe Glu His Gln Gln Pro Leu Gln Asp Arg Met Phe Lys Phe Glu
65 70 75 80
Leu Thr Arg Arg Leu Glu His Asp Phe Gly Lys Val Thr Lys Gln Glu
85 90 95
Val Lys Glu Phe Phe Arg Trp Ala Gln Asp His Val Thr Glu Val Ala
100 105 110
His Glu Phe Tyr Val Arg Lys Gly Gly Ala Asn Lys Arg Pro Ala Pro
115 120 125
Asp Asp Ala Asp Lys Ser Glu Pro Lys Arg Ala Cys Pro Ser Val Ala
130 135 140
Asp Pro Ser Thr Ser Asp Ala Glu Gly Ala Pro Val Asp Phe Ala Asp
145 150 155 160
Arg Tyr Gln Asn Lys Cys Ser Arg His Ala Gly Met Leu Gln Met Leu
165 170 175
Phe Pro Cys Lys Thr Cys Glu Arg Met Asn Gln Asn Phe Asn Ile Cys
180 185 190
Phe Thr His Gly Thr Arg Asp Cys Ser Glu Cys Phe Pro Gly Val Ser
195 200 205
Glu Ser Gln Pro Val Val Arg Lys Arg Thr Tyr Arg Lys Leu Cys Ala
210 215 220
Ile His His Leu Leu Gly Arg Ala Pro Glu Ile Ala Cys Ser Ala Cys
225 230 235 240
Asp Leu Val Asn Val Asp Leu Asp Asp Cys Val Ser Glu Gln
245 250
<210> 50
<211> 165
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<400> 50
Val Asp Lys Met Val Ile Trp Trp Glu Glu Gly Lys Met Thr Ala Lys
1 5 10 15
Val Val Glu Ser Ala Lys Ala Ile Leu Gly Gly Ser Lys Val Arg Val
20 25 30
Asp Gln Lys Cys Lys Ser Ser Ala Gln Ile Asp Pro Thr Pro Val Ile
35 40 45
Val Thr Ser Asn Thr Asn Met Cys Ala Val Ile Asp Gly Asn Ser Thr
50 55 60
Thr Phe Glu His Gln Gln Pro Leu Gln Asp Arg Met Phe Lys Phe Glu
65 70 75 80
Leu Thr Arg Arg Leu Glu His Asp Phe Gly Lys Val Thr Lys Gln Glu
85 90 95
Val Lys Glu Phe Phe Arg Trp Ala Gln Asp His Val Thr Glu Val Ala
100 105 110
His Glu Phe Tyr Val Arg Lys Gly Gly Ala Asn Lys Arg Pro Ala Pro
115 120 125
Asp Asp Ala Asp Lys Ser Glu Pro Lys Arg Ala Cys Pro Ser Val Ala
130 135 140
Asp Pro Ser Thr Ser Asp Ala Glu Gly Ala Pro Val Asp Phe Ala Asp
145 150 155 160
Arg Tyr Gln Asn Lys
165
<210> 51
<211> 89
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<400> 51
Cys Ser Arg His Ala Gly Met Leu Gln Met Leu Phe Pro Cys Lys Thr
1 5 10 15
Cys Glu Arg Met Asn Gln Asn Phe Asn Ile Cys Phe Thr His Gly Thr
20 25 30
Arg Asp Cys Ser Glu Cys Phe Pro Gly Val Ser Glu Ser Gln Pro Val
35 40 45
Val Arg Lys Arg Thr Tyr Arg Lys Leu Cys Ala Ile His His Leu Leu
50 55 60
Gly Arg Ala Pro Glu Ile Ala Cys Ser Ala Cys Asp Leu Val Asn Val
65 70 75 80
Asp Leu Asp Asp Cys Val Ser Glu Gln
85
<210> 52
<211> 306
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 52
acgccggggt tttacgagat tgtgattaag gtccccagcg accttgacga gcatctgccc 60
ggcatttctg acagctttgt gaactgggtg gccgagaagg aatgggagtt gccgccagat 120
tctgacatgg atctgaatct gattgagcag gcacccctga ccgtggccga gaagctgcag 180
cgcgactttc tgacggaatg gcgccgtgtg agtaaggccc cggaggccct tttctttgtg 240
caatttgaga agggagagag ctacttccac atgcacgtgc tcgtggaaac caccggggtg 300
aaatcc 306
<210> 53
<211> 420
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 53
atggttttgg gacgtttcct gagtcagatt cgcgaaaaac tgattcagag aatttaccgc 60
gggatcgagc cgactttgcc aaactggttc gcggtcacaa agaccagaaa tggcgccgga 120
ggcgggaaca aggtggtgga tgagtgctac atccccaatt acttgctccc caaaacccag 180
cctgagctcc agtgggcgtg gactaatatg gaacagtatt taagcgcctg tttgaatctc 240
acggagcgta aacggttggt ggcgcagcat ctgacgcacg tgtcgcagac gcaggagcag 300
aacaaagaga atcagaatcc caattctgat gcgccggtga tcagatcaaa aacttcagcc 360
aggtacatgg agctggtcgg gtggctcgtg gacaagggga ttacctcgga gaagcagtgg 420
<210> 54
<211> 381
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 54
atccaggagg accaggcctc atacatctcc ttcaatgcgg cctccaactc gcggtcccaa 60
atcaaggctg ccttggacaa tgcgggaaag attatgagcc tgactaaaac cgcccccgac 120
tacctggtgg gccagcagcc cgtggaggac atttccagca atcggattta taaaattttg 180
gaactaaacg ggtacgatcc ccaatatgcg gcttccgtct ttctgggatg ggccacgaaa 240
aagttcggca agaggaacac catctggctg tttgggcctg caactaccgg gaagaccaac 300
atcgcggagg ccatagccca cactgtgccc ttctacgggt gcgtaaactg gaccaatgag 360
aactttccct tcaacgactg t 381
<210> 55
<211> 759
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 55
gtcgacaaga tggtgatctg gtgggaggag gggaagatga ccgccaaggt cgtggagtcg 60
gccaaagcca ttctcggagg aagcaaggtg cgcgtggacc agaaatgcaa gtcctcggcc 120
cagatagacc cgactcccgt gatcgtcacc tccaacacca acatgtgcgc cgtgattgac 180
gggaactcaa cgaccttcga acaccagcag ccgttgcaag accggatgtt caaatttgaa 240
ctcacccgcc gtctggatca tgactttggg aaggtcacca agcaggaagt caaagacttt 300
ttccggtggg caaaggatca cgtggttgag gtggagcatg aattctacgt caaaaagggt 360
ggagccaaga aaagacccgc ccccagtgac gcagatataa gtgagcccaa acgggtgcgc 420
gagtcagttg cgcagccatc gacgtcagac gcggaagctt cgatcaacta cgcagacagg 480
taccaaaaca aatgttctcg tcacgtgggc atgaatctga tgctgtttcc ctgcagacaa 540
tgcgagagaa tgaatcagaa ttcaaatatc tgcttcactc acggacagaa agactgttta 600
gagtgctttc ccgtgtcaga atctcaaccc gtttctgtcg tcaaaaaggc gtatcagaaa 660
ctgtgctaca ttcatcatat catgggaaag gtgccagacg cttgcactgc ctgcgatctg 720
gtcaatgtgg atttggatga ctgcatcttt gaacaataa 759
<210> 56
<211> 492
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 56
gtcgacaaga tggtgatctg gtgggaggag gggaagatga ccgccaaggt cgtggagtcg 60
gccaaagcca ttctcggagg aagcaaggtg cgcgtggacc agaaatgcaa gtcctcggcc 120
cagatagacc cgactcccgt gatcgtcacc tccaacacca acatgtgcgc cgtgattgac 180
gggaactcaa cgaccttcga acaccagcag ccgttgcaag accggatgtt caaatttgaa 240
ctcacccgcc gtctggatca tgactttggg aaggtcacca agcaggaagt caaagacttt 300
ttccggtggg caaaggatca cgtggttgag gtggagcatg aattctacgt caaaaagggt 360
ggagccaaga aaagacccgc ccccagtgac gcagatataa gtgagcccaa acgggtgcgc 420
gagtcagttg cgcagccatc gacgtcagac gcggaagctt cgatcaacta cgcagacagg 480
taccaaaaca aa 492
<210> 57
<211> 267
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 57
tgttctcgtc acgtgggcat gaatctgatg ctgtttccct gcagacaatg cgagagaatg 60
aatcagaatt caaatatctg cttcactcac ggacagaaag actgtttaga gtgctttccc 120
gtgtcagaat ctcaacccgt ttctgtcgtc aaaaaggcgt atcagaaact gtgctacatt 180
catcatatca tgggaaaggt gccagacgct tgcactgcct gcgatctggt caatgtggat 240
ttggatgact gcatctttga acaataa 267
<210> 58
<211> 102
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<400> 58
Thr Pro Gly Phe Tyr Glu Ile Val Ile Lys Val Pro Ser Asp Leu Asp
1 5 10 15
Gly His Leu Pro Gly Ile Ser Asp Ser Phe Val Asn Trp Val Ala Glu
20 25 30
Lys Glu Trp Glu Leu Pro Pro Asp Ser Asp Met Asp Leu Asn Leu Ile
35 40 45
Glu Gln Ala Pro Leu Thr Val Ala Glu Lys Leu Gln Arg Asp Phe Leu
50 55 60
Thr Glu Trp Arg Arg Val Ser Lys Ala Pro Glu Ala Leu Phe Phe Val
65 70 75 80
Gln Phe Glu Lys Gly Glu Ser Tyr Phe His Met His Val Leu Val Glu
85 90 95
Thr Thr Gly Val Lys Ser
100
<210> 59
<211> 140
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<400> 59
Met Val Leu Gly Arg Phe Leu Ser Gln Ile Arg Glu Lys Leu Ile Gln
1 5 10 15
Arg Ile Tyr Arg Gly Ile Glu Pro Thr Leu Pro Asn Trp Phe Ala Val
20 25 30
Thr Lys Thr Arg Asn Gly Ala Gly Gly Gly Asn Lys Val Val Asp Glu
35 40 45
Cys Tyr Ile Pro Asn Tyr Leu Leu Pro Lys Thr Gln Pro Glu Leu Gln
50 55 60
Trp Ala Trp Thr Asn Met Glu Gln Tyr Leu Ser Ala Cys Leu Asn Leu
65 70 75 80
Thr Glu Arg Lys Arg Leu Val Ala Gln His Leu Thr His Val Ser Gln
85 90 95
Thr Gln Glu Gln Asn Lys Glu Asn Gln Asn Pro Asn Ser Asp Ala Pro
100 105 110
Val Ile Arg Ser Lys Thr Ser Ala Arg Tyr Met Glu Leu Val Gly Trp
115 120 125
Leu Val Asp Lys Gly Ile Thr Ser Glu Lys Gln Trp
130 135 140
<210> 60
<211> 127
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<400> 60
Ile Gln Glu Asp Gln Ala Ser Tyr Ile Ser Phe Asn Ala Ala Ser Asn
1 5 10 15
Ser Arg Ser Gln Ile Lys Ala Ala Leu Asp Asn Ala Gly Lys Ile Met
20 25 30
Ser Leu Thr Lys Thr Ala Pro Asp Tyr Leu Val Gly Gln Gln Pro Val
35 40 45
Glu Asp Ile Ser Ser Asn Arg Ile Tyr Lys Ile Leu Glu Leu Asn Gly
50 55 60
Tyr Asp Pro Gln Tyr Ala Ala Ser Val Phe Leu Gly Trp Ala Thr Lys
65 70 75 80
Lys Phe Gly Lys Arg Asn Thr Ile Trp Leu Phe Gly Pro Ala Thr Thr
85 90 95
Gly Lys Thr Asn Ile Ala Glu Ala Ile Ala His Thr Val Pro Phe Tyr
100 105 110
Gly Cys Val Asn Trp Thr Asn Glu Asn Phe Pro Phe Asn Asp Cys
115 120 125
<210> 61
<211> 252
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<400> 61
Val Asp Lys Met Val Ile Trp Trp Glu Glu Gly Lys Met Thr Ala Lys
1 5 10 15
Val Val Glu Ser Ala Lys Ala Ile Leu Gly Gly Ser Lys Val Arg Val
20 25 30
Asp Gln Lys Cys Lys Ser Ser Ala Gln Ile Asp Pro Thr Pro Val Ile
35 40 45
Val Thr Ser Asn Thr Asn Met Cys Ala Val Ile Asp Gly Asn Ser Thr
50 55 60
Thr Phe Glu His Gln Gln Pro Leu Gln Asp Arg Met Phe Lys Phe Glu
65 70 75 80
Leu Thr Arg Arg Leu Asp His Asp Phe Gly Lys Val Thr Lys Gln Glu
85 90 95
Val Lys Asp Phe Phe Arg Trp Ala Lys Asp His Val Val Glu Val Glu
100 105 110
His Glu Phe Tyr Val Lys Lys Gly Gly Ala Lys Lys Arg Pro Ala Pro
115 120 125
Ser Asp Ala Asp Ile Ser Glu Pro Lys Arg Val Arg Glu Ser Val Ala
130 135 140
Gln Pro Ser Thr Ser Asp Ala Glu Ala Ser Ile Asn Tyr Ala Asp Arg
145 150 155 160
Tyr Gln Asn Lys Cys Ser Arg His Val Gly Met Asn Leu Met Leu Phe
165 170 175
Pro Cys Arg Gln Cys Glu Arg Met Asn Gln Asn Ser Asn Ile Cys Phe
180 185 190
Thr His Gly Gln Lys Asp Cys Leu Glu Cys Phe Pro Val Ser Glu Ser
195 200 205
Gln Pro Val Ser Val Val Lys Lys Ala Tyr Gln Lys Leu Cys Tyr Ile
210 215 220
His His Ile Met Gly Lys Val Pro Asp Ala Cys Thr Ala Cys Asp Leu
225 230 235 240
Val Asn Val Asp Leu Asp Asp Cys Ile Phe Glu Gln
245 250
<210> 62
<211> 164
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<400> 62
Val Asp Lys Met Val Ile Trp Trp Glu Glu Gly Lys Met Thr Ala Lys
1 5 10 15
Val Val Glu Ser Ala Lys Ala Ile Leu Gly Gly Ser Lys Val Arg Val
20 25 30
Asp Gln Lys Cys Lys Ser Ser Ala Gln Ile Asp Pro Thr Pro Val Ile
35 40 45
Val Thr Ser Asn Thr Asn Met Cys Ala Val Ile Asp Gly Asn Ser Thr
50 55 60
Thr Phe Glu His Gln Gln Pro Leu Gln Asp Arg Met Phe Lys Phe Glu
65 70 75 80
Leu Thr Arg Arg Leu Asp His Asp Phe Gly Lys Val Thr Lys Gln Glu
85 90 95
Val Lys Asp Phe Phe Arg Trp Ala Lys Asp His Val Val Glu Val Glu
100 105 110
His Glu Phe Tyr Val Lys Lys Gly Gly Ala Lys Lys Arg Pro Ala Pro
115 120 125
Ser Asp Ala Asp Ile Ser Glu Pro Lys Arg Val Arg Glu Ser Val Ala
130 135 140
Gln Pro Ser Thr Ser Asp Ala Glu Ala Ser Ile Asn Tyr Ala Asp Arg
145 150 155 160
Tyr Gln Asn Lys
<210> 63
<211> 88
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<400> 63
Cys Ser Arg His Val Gly Met Asn Leu Met Leu Phe Pro Cys Arg Gln
1 5 10 15
Cys Glu Arg Met Asn Gln Asn Ser Asn Ile Cys Phe Thr His Gly Gln
20 25 30
Lys Asp Cys Leu Glu Cys Phe Pro Val Ser Glu Ser Gln Pro Val Ser
35 40 45
Val Val Lys Lys Ala Tyr Gln Lys Leu Cys Tyr Ile His His Ile Met
50 55 60
Gly Lys Val Pro Asp Ala Cys Thr Ala Cys Asp Leu Val Asn Val Asp
65 70 75 80
Leu Asp Asp Cys Ile Phe Glu Gln
85
<210> 64
<211> 306
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 64
atgccggggt tctacgagat tgtcctgaag gtcccgagtg acctggacga gcacctgccg 60
ggcatttcta actcgtttgt taactgggtg gccgagaagg aatgggagct gccgccggat 120
tctgacatgg atccgaatct gattgagcag gcacccctga ccgtggccga aaagcttcag 180
cgcgagttcc tggtggagtg gcgccgcgtg agtaaggccc cggaggccct cttttttgtc 240
cagttcgaaa agggggagac ctacttccac ctgcacgtgc tgattgagac catcggggtc 300
aaatcc 306
<210> 65
<211> 420
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 65
atggtggtcg gccgctacgt gagccagatt aaagagaagc tggtgacccg catctaccgc 60
ggggtcgagc cgcagcttcc gaactggttc gcggtgacca aaacgcgaaa tggcgccggg 120
ggcgggaaca aggtggtgga cgactgctac atccccaact acctgctccc caagacccag 180
cccgagctcc agtgggcgtg gactaacatg gaccagtatt taagcgcctg tttgaatctc 240
gcggagcgta aacggctggt ggcgcagcat ctgacgcacg tgtcgcagac gcaggagcag 300
aacaaagaga atcagaaccc caattctgac gcgccggtca tcaggtcaaa aacctcagcc 360
aggtacatgg agctggtcgg gtggctggtg gaccgcggga tcacgtcaga aaagcaatgg 420
<210> 66
<211> 381
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 66
attcaggagg accaggcctc gtacatctcc ttcaacgccg cctccaactc gcggtcccag 60
atcaaggccg cgctggacaa tgcctccaag atcatgagcc tgacaaagac ggctccggac 120
tacctggtgg gcagcaaccc gccggaggac attaccaaaa atcggatcta ccaaatcctg 180
gagctgaacg ggtacgatcc gcagtacgcg gcctccgtct tcctgggctg ggcgcaaaag 240
aagttcggga agaggaacac catctggctc tttgggccgg ccacgacggg taaaaccaac 300
atcgcggaag ccatcgccca cgccgtgccc ttctacggct gcgtaaactg gaccaatgag 360
aactttccct tcaacgattg c 381
<210> 67
<211> 768
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 67
gtcgacaaga tggtgatctg gtgggaggag ggcaagatga cggccaaggt cgtggagagc 60
gccaaggcca ttctgggcgg aagcaaggtg cgcgtggacc aaaagtgcaa gtcatcggcc 120
cagatcgaac ccactcccgt gatcgtcacc tccaacacca acatgtgcgc cgtgattgac 180
gggaacagca ccaccttcga gcatcagcag ccgctgcagg accggatgtt taaatttgaa 240
cttacccgcc gtttggacca tgactttggg aaggtcacca aacaggaagt aaaggacttt 300
ttccggtggg cttccgatca cgtgactgac gtggctcatg agttctacgt cagaaagggt 360
ggagctaaga aacgccccgc ctccaatgac gcggatgtaa gcgagccaaa acggcagtgc 420
acgtcacttg cgcagccgac aacgtcagac gcggaagcac cggcggacta cgcggacagg 480
taccaaaaca aatgttctcg tcacgtgggc atgaatctga tgctttttcc ctgtaaaaca 540
tgcgagagaa tgaatcaaat ttccaatgtc tgttttacgc atggtcaaag agactgtggg 600
gaatgcttcc ctggaatgtc agaatctcaa cccgtttctg tcgtcaaaaa gaagacttat 660
cagaaactgt gtccaattca tcatatcctg ggaagggcac ccgagattgc ctgttcggcc 720
tgcgatttgg ccaatgtgga cttggatgac tgtgtttctg agcaataa 768
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 68
gtcgacaaga tggtgatctg gtgggaggag ggcaagatga cggccaaggt cgtggagagc 60
gccaaggcca ttctgggcgg aagcaaggtg cgcgtggacc aaaagtgcaa gtcatcggcc 120
cagatcgaac ccactcccgt gatcgtcacc tccaacacca acatgtgcgc cgtgattgac 180
gggaacagca ccaccttcga gcatcagcag ccgctgcagg accggatgtt taaatttgaa 240
cttacccgcc gtttggacca tgactttggg aaggtcacca aacaggaagt aaaggacttt 300
ttccggtggg cttccgatca cgtgactgac gtggctcatg agttctacgt cagaaagggt 360
ggagctaaga aacgccccgc ctccaatgac gcggatgtaa gcgagccaaa acggcagtgc 420
acgtcacttg cgcagccgac aacgtcagac gcggaagcac cggcggacta cgcggacagg 480
taccaaaaca aa 492
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 69
tgttctcgtc acgtgggcat gaatctgatg ctttttccct gtaaaacatg cgagagaatg 60
aatcaaattt ccaatgtctg ttttacgcat ggtcaaagag actgtgggga atgcttccct 120
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ccaattcatc atatcctggg aagggcaccc gagattgcct gttcggcctg cgatttggcc 240
aatgtggact tggatgactg tgtttctgag caataa 276
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<400> 70
Met Pro Gly Phe Tyr Glu Ile Val Leu Lys Val Pro Ser Asp Leu Asp
1 5 10 15
Glu His Leu Pro Gly Ile Ser Asn Ser Phe Val Asn Trp Val Ala Glu
20 25 30
Lys Glu Trp Glu Leu Pro Pro Asp Ser Asp Met Asp Pro Asn Leu Ile
35 40 45
Glu Gln Ala Pro Leu Thr Val Ala Glu Lys Leu Gln Arg Glu Phe Leu
50 55 60
Val Glu Trp Arg Arg Val Ser Lys Ala Pro Glu Ala Leu Phe Phe Val
65 70 75 80
Gln Phe Glu Lys Gly Glu Thr Tyr Phe His Leu His Val Leu Ile Glu
85 90 95
Thr Ile Gly Val Lys Ser
100
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<400> 71
Met Val Val Gly Arg Tyr Val Ser Gln Ile Lys Glu Lys Leu Val Thr
1 5 10 15
Arg Ile Tyr Arg Gly Val Glu Pro Gln Leu Pro Asn Trp Phe Ala Val
20 25 30
Thr Lys Thr Arg Asn Gly Ala Gly Gly Gly Asn Lys Val Val Asp Asp
35 40 45
Cys Tyr Ile Pro Asn Tyr Leu Leu Pro Lys Thr Gln Pro Glu Leu Gln
50 55 60
Trp Ala Trp Thr Asn Met Asp Gln Tyr Leu Ser Ala Cys Leu Asn Leu
65 70 75 80
Ala Glu Arg Lys Arg Leu Val Ala Gln His Leu Thr His Val Ser Gln
85 90 95
Thr Gln Glu Gln Asn Lys Glu Asn Gln Asn Pro Asn Ser Asp Ala Pro
100 105 110
Val Ile Arg Ser Lys Thr Ser Ala Arg Tyr Met Glu Leu Val Gly Trp
115 120 125
Leu Val Asp Arg Gly Ile Thr Ser Glu Lys Gln Trp
130 135 140
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<211> 127
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<400> 72
Ile Gln Glu Asp Gln Ala Ser Tyr Ile Ser Phe Asn Ala Ala Ser Asn
1 5 10 15
Ser Arg Ser Gln Ile Lys Ala Ala Leu Asp Asn Ala Ser Lys Ile Met
20 25 30
Ser Leu Thr Lys Thr Ala Pro Asp Tyr Leu Val Gly Ser Asn Pro Pro
35 40 45
Glu Asp Ile Thr Lys Asn Arg Ile Tyr Gln Ile Leu Glu Leu Asn Gly
50 55 60
Tyr Asp Pro Gln Tyr Ala Ala Ser Val Phe Leu Gly Trp Ala Gln Lys
65 70 75 80
Lys Phe Gly Lys Arg Asn Thr Ile Trp Leu Phe Gly Pro Ala Thr Thr
85 90 95
Gly Lys Thr Asn Ile Ala Glu Ala Ile Ala His Ala Val Pro Phe Tyr
100 105 110
Gly Cys Val Asn Trp Thr Asn Glu Asn Phe Pro Phe Asn Asp Cys
115 120 125
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<400> 73
Val Asp Lys Met Val Ile Trp Trp Glu Glu Gly Lys Met Thr Ala Lys
1 5 10 15
Val Val Glu Ser Ala Lys Ala Ile Leu Gly Gly Ser Lys Val Arg Val
20 25 30
Asp Gln Lys Cys Lys Ser Ser Ala Gln Ile Glu Pro Thr Pro Val Ile
35 40 45
Val Thr Ser Asn Thr Asn Met Cys Ala Val Ile Asp Gly Asn Ser Thr
50 55 60
Thr Phe Glu His Gln Gln Pro Leu Gln Asp Arg Met Phe Lys Phe Glu
65 70 75 80
Leu Thr Arg Arg Leu Asp His Asp Phe Gly Lys Val Thr Lys Gln Glu
85 90 95
Val Lys Asp Phe Phe Arg Trp Ala Ser Asp His Val Thr Asp Val Ala
100 105 110
His Glu Phe Tyr Val Arg Lys Gly Gly Ala Lys Lys Arg Pro Ala Ser
115 120 125
Asn Asp Ala Asp Val Ser Glu Pro Lys Arg Gln Cys Thr Ser Leu Ala
130 135 140
Gln Pro Thr Thr Ser Asp Ala Glu Ala Pro Ala Asp Tyr Ala Asp Arg
145 150 155 160
Tyr Gln Asn Lys Cys Ser Arg His Val Gly Met Asn Leu Met Leu Phe
165 170 175
Pro Cys Lys Thr Cys Glu Arg Met Asn Gln Ile Ser Asn Val Cys Phe
180 185 190
Thr His Gly Gln Arg Asp Cys Gly Glu Cys Phe Pro Gly Met Ser Glu
195 200 205
Ser Gln Pro Val Ser Val Val Lys Lys Lys Thr Tyr Gln Lys Leu Cys
210 215 220
Pro Ile His His Ile Leu Gly Arg Ala Pro Glu Ile Ala Cys Ser Ala
225 230 235 240
Cys Asp Leu Ala Asn Val Asp Leu Asp Asp Cys Val Ser Glu Gln
245 250 255
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<400> 74
Val Asp Lys Met Val Ile Trp Trp Glu Glu Gly Lys Met Thr Ala Lys
1 5 10 15
Val Val Glu Ser Ala Lys Ala Ile Leu Gly Gly Ser Lys Val Arg Val
20 25 30
Asp Gln Lys Cys Lys Ser Ser Ala Gln Ile Glu Pro Thr Pro Val Ile
35 40 45
Val Thr Ser Asn Thr Asn Met Cys Ala Val Ile Asp Gly Asn Ser Thr
50 55 60
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65 70 75 80
Leu Thr Arg Arg Leu Asp His Asp Phe Gly Lys Val Thr Lys Gln Glu
85 90 95
Val Lys Asp Phe Phe Arg Trp Ala Ser Asp His Val Thr Asp Val Ala
100 105 110
His Glu Phe Tyr Val Arg Lys Gly Gly Ala Lys Lys Arg Pro Ala Ser
115 120 125
Asn Asp Ala Asp Val Ser Glu Pro Lys Arg Gln Cys Thr Ser Leu Ala
130 135 140
Gln Pro Thr Thr Ser Asp Ala Glu Ala Pro Ala Asp Tyr Ala Asp Arg
145 150 155 160
Tyr Gln Asn Lys
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<211> 91
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<400> 75
Cys Ser Arg His Val Gly Met Asn Leu Met Leu Phe Pro Cys Lys Thr
1 5 10 15
Cys Glu Arg Met Asn Gln Ile Ser Asn Val Cys Phe Thr His Gly Gln
20 25 30
Arg Asp Cys Gly Glu Cys Phe Pro Gly Met Ser Glu Ser Gln Pro Val
35 40 45
Ser Val Val Lys Lys Lys Thr Tyr Gln Lys Leu Cys Pro Ile His His
50 55 60
Ile Leu Gly Arg Ala Pro Glu Ile Ala Cys Ser Ala Cys Asp Leu Ala
65 70 75 80
Asn Val Asp Leu Asp Asp Cys Val Ser Glu Gln
85 90
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<211> 306
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 76
acgccggggt tctacgagat cgtgctgaag gtgcccagcg acctggacga gcacctgccc 60
ggcatttctg actcttttgt gagctgggtg gccgagaagg aatgggagct gccgccggat 120
tctgacatgg acttgaatct gattgagcag gcacccctga ccgtggccga aaagctgcaa 180
cgcgagttcc tggtcgagtg gcgccgcgtg agtaaggccc cggaggccct cttctttgtc 240
cagttcgaga agggggacag ctacttccac ctgcacatcc tggtggagac cgtgggcgtc 300
aaatcc 306
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<211> 420
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 77
atggtggtgg gccgctacgt gagccagatt aaagagaagc tggtgacccg catctaccgc 60
ggggtcgagc cgcagcttcc gaactggttc gcggtgacca agacgcgtaa tggcgccgga 120
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cccgagctcc agtgggcgtg gactaacatg gaccagtata taagcgcctg tttgaatctc 240
gcggagcgta aacggctggt ggcgcagcat ctgacgcacg tgtcgcagac gcaggagcag 300
aacaaggaaa accagaaccc caattctgac gcgccggtca tcaggtcaaa aacctccgcc 360
aggtacatgg agctggtcgg gtggctggtg gaccgcggga tcacgtcaga aaagcaatgg 420
<210> 78
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 78
atccaggagg accaggcgtc ctacatctcc ttcaacgccg cctccaactc gcggtcacaa 60
atcaaggccg cgctggacaa tgcctccaaa atcatgagcc tgacaaagac ggctccggac 120
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gagatgaacg ggtacgatcc gcagtacgcg gcctccgtct tcctgggctg ggcgcaaaag 240
aagttcggga agaggaacac catctggctc tttgggccgg ccacgacggg taaaaccaac 300
atcgcggaag ccatcgccca cgccgtgccc ttctacggct gcgtgaactg gaccaatgag 360
aactttccgt tcaacgattg c 381
<210> 79
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 79
gtcgacaaga tggtgatctg gtgggaggag ggcaagatga cggccaaggt cgtagagagc 60
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ttccggtggg cgtcagatca cgtgaccgag gtgactcacg agttttacgt cagaaagggt 360
ggagctagaa agaggcccgc ccccaatgac gcagatataa gtgagcccaa gcgggcctgt 420
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gagtgcttcc ccgtgtcaga atctcaaccc gtgtctgtcg tcagaaagcg gacgtatcag 660
aaactgtgtc cgattcatca catcatgggg agggcgcccg aggtggcctg ctcggcctgc 720
gaactggcca atgtggactt ggatgactgt gacatggaac aataa 765
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<211> 492
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 80
gtcgacaaga tggtgatctg gtgggaggag ggcaagatga cggccaaggt cgtagagagc 60
gccaaggcca tcctgggcgg aagcaaggtg cgcgtggacc aaaagtgcaa gtcatcggcc 120
cagatcgacc caactcccgt gatcgtcacc tccaacacca acatgtgcgc ggtcatcgac 180
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ctcaccaagc gcctggagca cgactttggc aaggtcacca agcaggaagt caaagacttt 300
ttccggtggg cgtcagatca cgtgaccgag gtgactcacg agttttacgt cagaaagggt 360
ggagctagaa agaggcccgc ccccaatgac gcagatataa gtgagcccaa gcgggcctgt 420
ccgtcagttg cgcagccatc gacgtcagac gcggaagctc cggtggacta cgcggacagg 480
taccaaaaca aa 492
<210> 81
<211> 273
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 81
tgttctcgtc acgtgggtat gaatctgatg ctttttccct gccggcaatg cgagagaatg 60
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attcatcaca tcatggggag ggcgcccgag gtggcctgct cggcctgcga actggccaat 240
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<400> 82
Thr Pro Gly Phe Tyr Glu Ile Val Leu Lys Val Pro Ser Asp Leu Asp
1 5 10 15
Glu His Leu Pro Gly Ile Ser Asp Ser Phe Val Ser Trp Val Ala Glu
20 25 30
Lys Glu Trp Glu Leu Pro Pro Asp Ser Asp Met Asp Leu Asn Leu Ile
35 40 45
Glu Gln Ala Pro Leu Thr Val Ala Glu Lys Leu Gln Arg Glu Phe Leu
50 55 60
Val Glu Trp Arg Arg Val Ser Lys Ala Pro Glu Ala Leu Phe Phe Val
65 70 75 80
Gln Phe Glu Lys Gly Asp Ser Tyr Phe His Leu His Ile Leu Val Glu
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Thr Val Gly Val Lys Ser
100
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<400> 83
Met Val Val Gly Arg Tyr Val Ser Gln Ile Lys Glu Lys Leu Val Thr
1 5 10 15
Arg Ile Tyr Arg Gly Val Glu Pro Gln Leu Pro Asn Trp Phe Ala Val
20 25 30
Thr Lys Thr Arg Asn Gly Ala Gly Gly Gly Asn Lys Val Val Asp Asp
35 40 45
Cys Tyr Ile Pro Asn Tyr Leu Leu Pro Lys Thr Gln Pro Glu Leu Gln
50 55 60
Trp Ala Trp Thr Asn Met Asp Gln Tyr Ile Ser Ala Cys Leu Asn Leu
65 70 75 80
Ala Glu Arg Lys Arg Leu Val Ala Gln His Leu Thr His Val Ser Gln
85 90 95
Thr Gln Glu Gln Asn Lys Glu Asn Gln Asn Pro Asn Ser Asp Ala Pro
100 105 110
Val Ile Arg Ser Lys Thr Ser Ala Arg Tyr Met Glu Leu Val Gly Trp
115 120 125
Leu Val Asp Arg Gly Ile Thr Ser Glu Lys Gln Trp
130 135 140
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<211> 127
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<400> 84
Ile Gln Glu Asp Gln Ala Ser Tyr Ile Ser Phe Asn Ala Ala Ser Asn
1 5 10 15
Ser Arg Ser Gln Ile Lys Ala Ala Leu Asp Asn Ala Ser Lys Ile Met
20 25 30
Ser Leu Thr Lys Thr Ala Pro Asp Tyr Leu Val Gly Gln Asn Pro Pro
35 40 45
Glu Asp Ile Ser Ser Asn Arg Ile Tyr Arg Ile Leu Glu Met Asn Gly
50 55 60
Tyr Asp Pro Gln Tyr Ala Ala Ser Val Phe Leu Gly Trp Ala Gln Lys
65 70 75 80
Lys Phe Gly Lys Arg Asn Thr Ile Trp Leu Phe Gly Pro Ala Thr Thr
85 90 95
Gly Lys Thr Asn Ile Ala Glu Ala Ile Ala His Ala Val Pro Phe Tyr
100 105 110
Gly Cys Val Asn Trp Thr Asn Glu Asn Phe Pro Phe Asn Asp Cys
115 120 125
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<400> 85
Val Asp Lys Met Val Ile Trp Trp Glu Glu Gly Lys Met Thr Ala Lys
1 5 10 15
Val Val Glu Ser Ala Lys Ala Ile Leu Gly Gly Ser Lys Val Arg Val
20 25 30
Asp Gln Lys Cys Lys Ser Ser Ala Gln Ile Asp Pro Thr Pro Val Ile
35 40 45
Val Thr Ser Asn Thr Asn Met Cys Ala Val Ile Asp Gly Asn Ser Thr
50 55 60
Thr Phe Glu His Gln Gln Pro Leu Gln Asp Arg Met Phe Lys Phe Glu
65 70 75 80
Leu Thr Lys Arg Leu Glu His Asp Phe Gly Lys Val Thr Lys Gln Glu
85 90 95
Val Lys Asp Phe Phe Arg Trp Ala Ser Asp His Val Thr Glu Val Thr
100 105 110
His Glu Phe Tyr Val Arg Lys Gly Gly Ala Arg Lys Arg Pro Ala Pro
115 120 125
Asn Asp Ala Asp Ile Ser Glu Pro Lys Arg Ala Cys Pro Ser Val Ala
130 135 140
Gln Pro Ser Thr Ser Asp Ala Glu Ala Pro Val Asp Tyr Ala Asp Arg
145 150 155 160
Tyr Gln Asn Lys Cys Ser Arg His Val Gly Met Asn Leu Met Leu Phe
165 170 175
Pro Cys Arg Gln Cys Glu Arg Met Asn Gln Asn Val Asp Ile Cys Phe
180 185 190
Thr His Gly Val Met Asp Cys Ala Glu Cys Phe Pro Val Ser Glu Ser
195 200 205
Gln Pro Val Ser Val Val Arg Lys Arg Thr Tyr Gln Lys Leu Cys Pro
210 215 220
Ile His His Ile Met Gly Arg Ala Pro Glu Val Ala Cys Ser Ala Cys
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245 250
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<211> 164
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<400> 86
Val Asp Lys Met Val Ile Trp Trp Glu Glu Gly Lys Met Thr Ala Lys
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Val Val Glu Ser Ala Lys Ala Ile Leu Gly Gly Ser Lys Val Arg Val
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Asp Gln Lys Cys Lys Ser Ser Ala Gln Ile Asp Pro Thr Pro Val Ile
35 40 45
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100 105 110
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115 120 125
Asn Asp Ala Asp Ile Ser Glu Pro Lys Arg Ala Cys Pro Ser Val Ala
130 135 140
Gln Pro Ser Thr Ser Asp Ala Glu Ala Pro Val Asp Tyr Ala Asp Arg
145 150 155 160
Tyr Gln Asn Lys
<210> 87
<211> 90
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<400> 87
Cys Ser Arg His Val Gly Met Asn Leu Met Leu Phe Pro Cys Arg Gln
1 5 10 15
Cys Glu Arg Met Asn Gln Asn Val Asp Ile Cys Phe Thr His Gly Val
20 25 30
Met Asp Cys Ala Glu Cys Phe Pro Val Ser Glu Ser Gln Pro Val Ser
35 40 45
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50 55 60
Met Gly Arg Ala Pro Glu Val Ala Cys Ser Ala Cys Glu Leu Ala Asn
65 70 75 80
Val Asp Leu Asp Asp Cys Asp Met Glu Gln
85 90
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<211> 303
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 88
atggctacct tctatgaagt cattgttcgc gtcccatttg acgtggagga acatctgcct 60
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cgcgtgttcc tgtacgagtg gaacaaattt tccaagcagg agtccaaatt ctttgtgcag 240
tttgaaaagg gatctgaata ttttcatctg cacacgcttg tggagacctc cggcatctct 300
tcc 303
<210> 89
<211> 411
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 89
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gcgctcgtca actggctcgt ggagcacggc atcacttccg agaagcagtg g 411
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 90
atccaggaaa atcaggagag ctacctctcc ttcaactcca ccggcaactc tcggagccag 60
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tccttcaaca agaggaacac cgtctggctc tacggacccg ccacgaccgg caagaccaac 300
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aactttccct ttaatgactg t 381
<210> 91
<211> 738
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 91
gtggacaaaa tgctcatttg gtgggaggag ggaaagatga ccaacaaggt ggttgaatcc 60
gccaaggcca tcctgggggg ctcaaaggtg cgggtcgatc agaaatgtaa atcctctgtt 120
caaattgatt ctacccctgt cattgtaact tccaatacaa acatgtgtgt ggtggtggat 180
gggaattcca cgacctttga acaccagcag ccgctggagg accgcatgtt caaatttgaa 240
ctgactaagc ggctcccgcc agattttggc aagattacta agcaggaagt caaggacttt 300
tttgcttggg caaaggtcaa tcaggtgccg gtgactcacg agtttaaagt tcccagggaa 360
ttggcgggaa ctaaaggggc ggagaaatct ctaaaacgcc cactgggtga cgtcaccaat 420
actagctata aaagtctgga gaagcgggcc aggctctcat ttgttcccga gacgcctcgc 480
agttcagacg tgactgttga tcccgctcct ctgcgaccgc tcaattggaa ttcaaggtat 540
gattgcaaat gtgactatca tgctcaattt gacaacattt ctaacaaatg tgatgaatgt 600
gaatatttga atcggggcaa aaatggatgt atctgtcaca atgtaactca ctgtcaaatt 660
tgtcatggga ttcccccctg ggaaaaggaa aacttgtcag attttgggga ttttgacgat 720
gccaataaag aacagtaa 738
<210> 92
<211> 549
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 92
gtggacaaaa tgctcatttg gtgggaggag ggaaagatga ccaacaaggt ggttgaatcc 60
gccaaggcca tcctgggggg ctcaaaggtg cgggtcgatc agaaatgtaa atcctctgtt 120
caaattgatt ctacccctgt cattgtaact tccaatacaa acatgtgtgt ggtggtggat 180
gggaattcca cgacctttga acaccagcag ccgctggagg accgcatgtt caaatttgaa 240
ctgactaagc ggctcccgcc agattttggc aagattacta agcaggaagt caaggacttt 300
tttgcttggg caaaggtcaa tcaggtgccg gtgactcacg agtttaaagt tcccagggaa 360
ttggcgggaa ctaaaggggc ggagaaatct ctaaaacgcc cactgggtga cgtcaccaat 420
actagctata aaagtctgga gaagcgggcc aggctctcat ttgttcccga gacgcctcgc 480
agttcagacg tgactgttga tcccgctcct ctgcgaccgc tcaattggaa ttcaaggtat 540
gattgcaaa 549
<210> 93
<211> 189
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 93
tgtgactatc atgctcaatt tgacaacatt tctaacaaat gtgatgaatg tgaatatttg 60
aatcggggca aaaatggatg tatctgtcac aatgtaactc actgtcaaat ttgtcatggg 120
attcccccct gggaaaagga aaacttgtca gattttgggg attttgacga tgccaataaa 180
gaacagtaa 189
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<211> 101
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<400> 94
Met Ala Thr Phe Tyr Glu Val Ile Val Arg Val Pro Phe Asp Val Glu
1 5 10 15
Glu His Leu Pro Gly Ile Ser Asp Ser Phe Val Asp Trp Val Thr Gly
20 25 30
Gln Ile Trp Glu Leu Pro Pro Glu Ser Asp Leu Asn Leu Thr Leu Val
35 40 45
Glu Gln Pro Gln Leu Thr Val Ala Asp Arg Ile Arg Arg Val Phe Leu
50 55 60
Tyr Glu Trp Asn Lys Phe Ser Lys Gln Glu Ser Lys Phe Phe Val Gln
65 70 75 80
Phe Glu Lys Gly Ser Glu Tyr Phe His Leu His Thr Leu Val Glu Thr
85 90 95
Ser Gly Ile Ser Ser
100
<210> 95
<211> 137
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<400> 95
Met Val Leu Gly Arg Tyr Val Ser Gln Ile Arg Ala Gln Leu Val Lys
1 5 10 15
Val Val Phe Gln Gly Ile Glu Pro Gln Ile Asn Asp Trp Val Ala Ile
20 25 30
Thr Lys Val Lys Lys Gly Gly Ala Asn Lys Val Val Asp Ser Gly Tyr
35 40 45
Ile Pro Ala Tyr Leu Leu Pro Lys Val Gln Pro Glu Leu Gln Trp Ala
50 55 60
Trp Thr Asn Leu Asp Glu Tyr Lys Leu Ala Ala Leu Asn Leu Glu Glu
65 70 75 80
Arg Lys Arg Leu Val Ala Gln Phe Leu Ala Glu Ser Ser Gln Arg Ser
85 90 95
Gln Glu Ala Ala Ser Gln Arg Glu Phe Ser Ala Asp Pro Val Ile Lys
100 105 110
Ser Lys Thr Ser Gln Lys Tyr Met Ala Leu Val Asn Trp Leu Val Glu
115 120 125
His Gly Ile Thr Ser Glu Lys Gln Trp
130 135
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<211> 127
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<400> 96
Ile Gln Glu Asn Gln Glu Ser Tyr Leu Ser Phe Asn Ser Thr Gly Asn
1 5 10 15
Ser Arg Ser Gln Ile Lys Ala Ala Leu Asp Asn Ala Thr Lys Ile Met
20 25 30
Ser Leu Thr Lys Ser Ala Val Asp Tyr Leu Val Gly Ser Ser Val Pro
35 40 45
Glu Asp Ile Ser Lys Asn Arg Ile Trp Gln Ile Phe Glu Met Asn Gly
50 55 60
Tyr Asp Pro Ala Tyr Ala Gly Ser Ile Leu Tyr Gly Trp Cys Gln Arg
65 70 75 80
Ser Phe Asn Lys Arg Asn Thr Val Trp Leu Tyr Gly Pro Ala Thr Thr
85 90 95
Gly Lys Thr Asn Ile Ala Glu Ala Ile Ala His Thr Val Pro Phe Tyr
100 105 110
Gly Cys Val Asn Trp Thr Asn Glu Asn Phe Pro Phe Asn Asp Cys
115 120 125
<210> 97
<211> 245
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<400> 97
Val Asp Lys Met Leu Ile Trp Trp Glu Glu Gly Lys Met Thr Asn Lys
1 5 10 15
Val Val Glu Ser Ala Lys Ala Ile Leu Gly Gly Ser Lys Val Arg Val
20 25 30
Asp Gln Lys Cys Lys Ser Ser Val Gln Ile Asp Ser Thr Pro Val Ile
35 40 45
Val Thr Ser Asn Thr Asn Met Cys Val Val Val Asp Gly Asn Ser Thr
50 55 60
Thr Phe Glu His Gln Gln Pro Leu Glu Asp Arg Met Phe Lys Phe Glu
65 70 75 80
Leu Thr Lys Arg Leu Pro Pro Asp Phe Gly Lys Ile Thr Lys Gln Glu
85 90 95
Val Lys Asp Phe Phe Ala Trp Ala Lys Val Asn Gln Val Pro Val Thr
100 105 110
His Glu Phe Lys Val Pro Arg Glu Leu Ala Gly Thr Lys Gly Ala Glu
115 120 125
Lys Ser Leu Lys Arg Pro Leu Gly Asp Val Thr Asn Thr Ser Tyr Lys
130 135 140
Ser Leu Glu Lys Arg Ala Arg Leu Ser Phe Val Pro Glu Thr Pro Arg
145 150 155 160
Ser Ser Asp Val Thr Val Asp Pro Ala Pro Leu Arg Pro Leu Asn Trp
165 170 175
Asn Ser Arg Tyr Asp Cys Lys Cys Asp Tyr His Ala Gln Phe Asp Asn
180 185 190
Ile Ser Asn Lys Cys Asp Glu Cys Glu Tyr Leu Asn Arg Gly Lys Asn
195 200 205
Gly Cys Ile Cys His Asn Val Thr His Cys Gln Ile Cys His Gly Ile
210 215 220
Pro Pro Trp Glu Lys Glu Asn Leu Ser Asp Phe Gly Asp Phe Asp Asp
225 230 235 240
Ala Asn Lys Glu Gln
245
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<211> 183
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<400> 98
Val Asp Lys Met Leu Ile Trp Trp Glu Glu Gly Lys Met Thr Asn Lys
1 5 10 15
Val Val Glu Ser Ala Lys Ala Ile Leu Gly Gly Ser Lys Val Arg Val
20 25 30
Asp Gln Lys Cys Lys Ser Ser Val Gln Ile Asp Ser Thr Pro Val Ile
35 40 45
Val Thr Ser Asn Thr Asn Met Cys Val Val Val Asp Gly Asn Ser Thr
50 55 60
Thr Phe Glu His Gln Gln Pro Leu Glu Asp Arg Met Phe Lys Phe Glu
65 70 75 80
Leu Thr Lys Arg Leu Pro Pro Asp Phe Gly Lys Ile Thr Lys Gln Glu
85 90 95
Val Lys Asp Phe Phe Ala Trp Ala Lys Val Asn Gln Val Pro Val Thr
100 105 110
His Glu Phe Lys Val Pro Arg Glu Leu Ala Gly Thr Lys Gly Ala Glu
115 120 125
Lys Ser Leu Lys Arg Pro Leu Gly Asp Val Thr Asn Thr Ser Tyr Lys
130 135 140
Ser Leu Glu Lys Arg Ala Arg Leu Ser Phe Val Pro Glu Thr Pro Arg
145 150 155 160
Ser Ser Asp Val Thr Val Asp Pro Ala Pro Leu Arg Pro Leu Asn Trp
165 170 175
Asn Ser Arg Tyr Asp Cys Lys
180
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<211> 62
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<400> 99
Cys Asp Tyr His Ala Gln Phe Asp Asn Ile Ser Asn Lys Cys Asp Glu
1 5 10 15
Cys Glu Tyr Leu Asn Arg Gly Lys Asn Gly Cys Ile Cys His Asn Val
20 25 30
Thr His Cys Gln Ile Cys His Gly Ile Pro Pro Trp Glu Lys Glu Asn
35 40 45
Leu Ser Asp Phe Gly Asp Phe Asp Asp Ala Asn Lys Glu Gln
50 55 60
<210> 100
<211> 306
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 100
atgccggggt tttacgagat tgtgattaag gtccccagcg accttgacga gcatctgccc 60
ggcatttctg acagctttgt gaactgggtg gccgagaagg aatgggagtt gccgccagat 120
tctgacatgg atctgaatct gattgagcag gcacccctga ccgtggccga gaagctgcag 180
cgcgacttcc tggtccagtg gcgccgcgtg agtaaggccc cggaggccct cttctttgtt 240
cagttcgaga agggcgagtc ctacttccac ctccatattc tggtggagac cacgggggtc 300
aaatcc 306
<210> 101
<211> 420
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 101
atggtgctgg gccgcttcct gagtcagatt agggacaagc tggtgcagac catctaccgc 60
gggatcgagc cgaccctgcc caactggttc gcggtgacca agacgcgtaa tggcgccgga 120
ggggggaaca aggtggtgga cgagtgctac atccccaact acctcctgcc caagactcag 180
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gccgagcgca aacggctcgt ggcgcacgac ctgacccacg tcagccagac ccaggagcag 300
aacaaggaga atctgaaccc caattctgac gcgcctgtca tccggtcaaa aacctccgca 360
cgctacatgg agctggtcgg gtggctggtg gaccggggca tcacctccga gaagcagtgg 420
<210> 102
<211> 381
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 102
atccaggagg accaggcctc gtacatctcc ttcaacgccg cctccaactc gcggtcccag 60
atcaaggccg ctctggacaa tgccggcaag atcatggcgc tgaccaaatc cgcgcccgac 120
tacctggtag gccccgctcc gcccgccgac attaaaacca accgcattta ccgcatcctg 180
gagctgaacg gctacgaccc tgcctacgcc ggctccgtct ttctcggctg ggcccagaaa 240
aggttcggaa aacgcaacac catctggctg tttgggccgg ccaccacggg caagaccaac 300
atcgcggaag ccatcgccca cgccgtgccc ttctacggct gcgtcaactg gaccaatgag 360
aactttccct tcaacgattg c 381
<210> 103
<211> 765
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 103
gtcgacaaga tggtgatctg gtgggaggag ggcaagatga cggccaaggt cgtggagtcc 60
gccaaggcca ttctcggcgg cagcaaggtg cgcgtggacc aaaagtgcaa gtcgtccgcc 120
cagatcgatc ccacccccgt gatcgtcacc tccaacacca acatgtgcgc cgtgattgac 180
gggaacagca ccaccttcga gcaccagcag ccgttgcagg accggatgtt caaatttgaa 240
ctcacccgcc gtctggagca tgactttggc aaggtgacaa agcaggaagt caaagagttc 300
ttccgctggg cgcaggatca cgtgaccgag gtggcgcatg agttctacgt cagaaagggt 360
ggagccaaca agagacccgc ccccgatgac gcggataaaa gcgagcccaa gcgggcctgc 420
ccctcagtcg cggatccatc gacgtcagac gcggaaggag ctccggtgga ctttgccgac 480
aggtaccaaa acaaatgttc tcgtcacgcg ggcatgcttc agatgctgtt tccctgcaaa 540
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aaactctgtg ccattcatca tctgctgggg cgggctcccg agattgcttg ctcggcctgc 720
gatctggtca acgtggatct ggatgactgt gtttctgagc aataa 765
<210> 104
<211> 495
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 104
gtcgacaaga tggtgatctg gtgggaggag ggcaagatga cggccaaggt cgtggagtcc 60
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cagatcgatc ccacccccgt gatcgtcacc tccaacacca acatgtgcgc cgtgattgac 180
gggaacagca ccaccttcga gcaccagcag ccgttgcagg accggatgtt caaatttgaa 240
ctcacccgcc gtctggagca tgactttggc aaggtgacaa agcaggaagt caaagagttc 300
ttccgctggg cgcaggatca cgtgaccgag gtggcgcatg agttctacgt cagaaagggt 360
ggagccaaca agagacccgc ccccgatgac gcggataaaa gcgagcccaa gcgggcctgc 420
ccctcagtcg cggatccatc gacgtcagac gcggaaggag ctccggtgga ctttgccgac 480
aggtaccaaa acaaa 495
<210> 105
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 105
tgttctcgtc acgcgggcat gcttcagatg ctgtttccct gcaaaacatg cgagagaatg 60
aatcagaatt tcaacatttg cttcacgcac gggaccagag actgttcaga atgtttcccc 120
ggcgtgtcag aatctcaacc ggtcgtcaga aagaggacgt atcggaaact ctgtgccatt 180
catcatctgc tggggcgggc tcccgagatt gcttgctcgg cctgcgatct ggtcaacgtg 240
gatctggatg actgtgtttc tgagcaataa 270
<210> 106
<211> 102
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<400> 106
Met Pro Gly Phe Tyr Glu Ile Val Ile Lys Val Pro Ser Asp Leu Asp
1 5 10 15
Glu His Leu Pro Gly Ile Ser Asp Ser Phe Val Asn Trp Val Ala Glu
20 25 30
Lys Glu Trp Glu Leu Pro Pro Asp Ser Asp Met Asp Leu Asn Leu Ile
35 40 45
Glu Gln Ala Pro Leu Thr Val Ala Glu Lys Leu Gln Arg Asp Phe Leu
50 55 60
Val Gln Trp Arg Arg Val Ser Lys Ala Pro Glu Ala Leu Phe Phe Val
65 70 75 80
Gln Phe Glu Lys Gly Glu Ser Tyr Phe His Leu His Ile Leu Val Glu
85 90 95
Thr Thr Gly Val Lys Ser
100
<210> 107
<211> 140
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<400> 107
Met Val Leu Gly Arg Phe Leu Ser Gln Ile Arg Asp Lys Leu Val Gln
1 5 10 15
Thr Ile Tyr Arg Gly Ile Glu Pro Thr Leu Pro Asn Trp Phe Ala Val
20 25 30
Thr Lys Thr Arg Asn Gly Ala Gly Gly Gly Asn Lys Val Val Asp Glu
35 40 45
Cys Tyr Ile Pro Asn Tyr Leu Leu Pro Lys Thr Gln Pro Glu Leu Gln
50 55 60
Trp Ala Trp Thr Asn Met Glu Glu Tyr Ile Ser Ala Cys Leu Asn Leu
65 70 75 80
Ala Glu Arg Lys Arg Leu Val Ala His Asp Leu Thr His Val Ser Gln
85 90 95
Thr Gln Glu Gln Asn Lys Glu Asn Leu Asn Pro Asn Ser Asp Ala Pro
100 105 110
Val Ile Arg Ser Lys Thr Ser Ala Arg Tyr Met Glu Leu Val Gly Trp
115 120 125
Leu Val Asp Arg Gly Ile Thr Ser Glu Lys Gln Trp
130 135 140
<210> 108
<211> 127
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<400> 108
Ile Gln Glu Asp Gln Ala Ser Tyr Ile Ser Phe Asn Ala Ala Ser Asn
1 5 10 15
Ser Arg Ser Gln Ile Lys Ala Ala Leu Asp Asn Ala Gly Lys Ile Met
20 25 30
Ala Leu Thr Lys Ser Ala Pro Asp Tyr Leu Val Gly Pro Ala Pro Pro
35 40 45
Ala Asp Ile Lys Thr Asn Arg Ile Tyr Arg Ile Leu Glu Leu Asn Gly
50 55 60
Tyr Asp Pro Ala Tyr Ala Gly Ser Val Phe Leu Gly Trp Ala Gln Lys
65 70 75 80
Arg Phe Gly Lys Arg Asn Thr Ile Trp Leu Phe Gly Pro Ala Thr Thr
85 90 95
Gly Lys Thr Asn Ile Ala Glu Ala Ile Ala His Ala Val Pro Phe Tyr
100 105 110
Gly Cys Val Asn Trp Thr Asn Glu Asn Phe Pro Phe Asn Asp Cys
115 120 125
<210> 109
<211> 254
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<400> 109
Val Asp Lys Met Val Ile Trp Trp Glu Glu Gly Lys Met Thr Ala Lys
1 5 10 15
Val Val Glu Ser Ala Lys Ala Ile Leu Gly Gly Ser Lys Val Arg Val
20 25 30
Asp Gln Lys Cys Lys Ser Ser Ala Gln Ile Asp Pro Thr Pro Val Ile
35 40 45
Val Thr Ser Asn Thr Asn Met Cys Ala Val Ile Asp Gly Asn Ser Thr
50 55 60
Thr Phe Glu His Gln Gln Pro Leu Gln Asp Arg Met Phe Lys Phe Glu
65 70 75 80
Leu Thr Arg Arg Leu Glu His Asp Phe Gly Lys Val Thr Lys Gln Glu
85 90 95
Val Lys Glu Phe Phe Arg Trp Ala Gln Asp His Val Thr Glu Val Ala
100 105 110
His Glu Phe Tyr Val Arg Lys Gly Gly Ala Asn Lys Arg Pro Ala Pro
115 120 125
Asp Asp Ala Asp Lys Ser Glu Pro Lys Arg Ala Cys Pro Ser Val Ala
130 135 140
Asp Pro Ser Thr Ser Asp Ala Glu Gly Ala Pro Val Asp Phe Ala Asp
145 150 155 160
Arg Tyr Gln Asn Lys Cys Ser Arg His Ala Gly Met Leu Gln Met Leu
165 170 175
Phe Pro Cys Lys Thr Cys Glu Arg Met Asn Gln Asn Phe Asn Ile Cys
180 185 190
Phe Thr His Gly Thr Arg Asp Cys Ser Glu Cys Phe Pro Gly Val Ser
195 200 205
Glu Ser Gln Pro Val Val Arg Lys Arg Thr Tyr Arg Lys Leu Cys Ala
210 215 220
Ile His His Leu Leu Gly Arg Ala Pro Glu Ile Ala Cys Ser Ala Cys
225 230 235 240
Asp Leu Val Asn Val Asp Leu Asp Asp Cys Val Ser Glu Gln
245 250
<210> 110
<211> 165
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<400> 110
Val Asp Lys Met Val Ile Trp Trp Glu Glu Gly Lys Met Thr Ala Lys
1 5 10 15
Val Val Glu Ser Ala Lys Ala Ile Leu Gly Gly Ser Lys Val Arg Val
20 25 30
Asp Gln Lys Cys Lys Ser Ser Ala Gln Ile Asp Pro Thr Pro Val Ile
35 40 45
Val Thr Ser Asn Thr Asn Met Cys Ala Val Ile Asp Gly Asn Ser Thr
50 55 60
Thr Phe Glu His Gln Gln Pro Leu Gln Asp Arg Met Phe Lys Phe Glu
65 70 75 80
Leu Thr Arg Arg Leu Glu His Asp Phe Gly Lys Val Thr Lys Gln Glu
85 90 95
Val Lys Glu Phe Phe Arg Trp Ala Gln Asp His Val Thr Glu Val Ala
100 105 110
His Glu Phe Tyr Val Arg Lys Gly Gly Ala Asn Lys Arg Pro Ala Pro
115 120 125
Asp Asp Ala Asp Lys Ser Glu Pro Lys Arg Ala Cys Pro Ser Val Ala
130 135 140
Asp Pro Ser Thr Ser Asp Ala Glu Gly Ala Pro Val Asp Phe Ala Asp
145 150 155 160
Arg Tyr Gln Asn Lys
165
<210> 111
<211> 89
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<400> 111
Cys Ser Arg His Ala Gly Met Leu Gln Met Leu Phe Pro Cys Lys Thr
1 5 10 15
Cys Glu Arg Met Asn Gln Asn Phe Asn Ile Cys Phe Thr His Gly Thr
20 25 30
Arg Asp Cys Ser Glu Cys Phe Pro Gly Val Ser Glu Ser Gln Pro Val
35 40 45
Val Arg Lys Arg Thr Tyr Arg Lys Leu Cys Ala Ile His His Leu Leu
50 55 60
Gly Arg Ala Pro Glu Ile Ala Cys Ser Ala Cys Asp Leu Val Asn Val
65 70 75 80
Asp Leu Asp Asp Cys Val Ser Glu Gln
85
<210> 112
<211> 306
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 112
acgccgggtt tctacgagat cgtgatcaag gtgccgagcg acctggacga gcacctgccg 60
ggcatttctg actcgtttgt gaactgggtg gccgagaagg aatgggagct gcccccggat 120
tctgacatgg atctgaatct gatcgagcag gcacccctga ccgtggccga gaagctgcag 180
cgcgacttcc tggtccaatg gcgccgcgtg agtaaggccc cggaggccct gttctttgtt 240
cagttcgaga agggcgagag ctacttccac cttcacgttc tggtggagac cacgggggtc 300
aagtcc 306
<210> 113
<211> 420
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 113
atggtgctag gccgcttcct gagtcagatt cgggagaagc tggtccagac catctaccgc 60
ggggtcgagc ccacgctgcc caactggttc gcggtgacca agacgcgtaa tggcgccggc 120
ggggggaaca aggtggtgga cgagtgctac atccccaact acctcctgcc caagacccag 180
cccgagctgc agtgggcgtg gactaacatg gaggagtata taagcgcgtg tttgaacctg 240
gccgaacgca aacggctcgt ggcgcagcac ctgacccacg tcagccagac gcaggagcag 300
aacaaggaga atctgaaccc caattctgac gcgcccgtga tcaggtcaaa aacctccgcg 360
cgctacatgg agctggtcgg gtggctggtg gaccggggca tcacctccga gaagcagtgg 420
<210> 114
<211> 381
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 114
atccaggagg accaggcctc gtacatctcc ttcaacgccg cctccaactc gcggtcccag 60
atcaaggccg cgctggacaa tgccggcaag atcatggcgc tgaccaaatc cgcgcccgac 120
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aagttcggga agcgcaacac catctggctg tttgggcccg ccaccaccgg caagaccaac 300
attgcggaag ccatcgccca cgccgtgccc ttctacggct gcgtcaactg gaccaatgag 360
aactttccct tcaacgattg c 381
<210> 115
<211> 765
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 115
gtcgacaaga tggtgatctg gtgggaggag ggcaagatga cggccaaggt cgtggagtcc 60
gccaaggcca ttctcggcgg cagcaaggtg cgcgtggacc aaaagtgcaa gtcgtccgcc 120
cagatcgacc ccacccccgt gatcgtcacc tccaacacca acatgtgcgc cgtgattgac 180
gggaacagca ccaccttcga gcaccagcag ccgttgcagg accggatgtt caaatttgaa 240
ctcacccgcc gtctggagca cgactttggc aaggtgacga agcaggaagt caaagagttc 300
ttccgctggg ccagtgatca cgtgaccgag gtggcgcatg agttctacgt cagaaagggc 360
ggagccagca aaagacccgc ccccgatgac gcggatataa gcgagcccaa gcgggcctgc 420
ccctcagtcg cggatccatc gacgtcagac gcggaaggag ctccggtgga ctttgccgac 480
aggtaccaaa acaaatgttc tcgtcacgcg ggcatgattc agatgctgtt tccctgcaaa 540
acgtgcgaga gaatgaatca gaatttcaac atttgcttca cacacggggt cagagactgt 600
ttagagtgtt tccccggcgt gtcagaatct caaccggtcg tcagaaaaaa gacgtatcgg 660
aaactctgcg cgattcatca tctgctgggg cgggcgcccg agattgcttg ctcggcctgc 720
gacctggtca acgtggacct ggacgactgc gtttctgagc aataa 765
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<213> Artificial Sequence
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gtcgacaaga tggtgatctg gtgggaggag ggcaagatga cggccaaggt cgtggagtcc 60
gccaaggcca ttctcggcgg cagcaaggtg cgcgtggacc aaaagtgcaa gtcgtccgcc 120
cagatcgacc ccacccccgt gatcgtcacc tccaacacca acatgtgcgc cgtgattgac 180
gggaacagca ccaccttcga gcaccagcag ccgttgcagg accggatgtt caaatttgaa 240
ctcacccgcc gtctggagca cgactttggc aaggtgacga agcaggaagt caaagagttc 300
ttccgctggg ccagtgatca cgtgaccgag gtggcgcatg agttctacgt cagaaagggc 360
ggagccagca aaagacccgc ccccgatgac gcggatataa gcgagcccaa gcgggcctgc 420
ccctcagtcg cggatccatc gacgtcagac gcggaaggag ctccggtgga ctttgccgac 480
aggtaccaaa acaaa 495
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
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tgttctcgtc acgcgggcat gattcagatg ctgtttccct gcaaaacgtg cgagagaatg 60
aatcagaatt tcaacatttg cttcacacac ggggtcagag actgtttaga gtgtttcccc 120
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catcatctgc tggggcgggc gcccgagatt gcttgctcgg cctgcgacct ggtcaacgtg 240
gacctggacg actgcgtttc tgagcaataa 270
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Thr Pro Gly Phe Tyr Glu Ile Val Ile Lys Val Pro Ser Asp Leu Asp
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Glu His Leu Pro Gly Ile Ser Asp Ser Phe Val Asn Trp Val Ala Glu
20 25 30
Lys Glu Trp Glu Leu Pro Pro Asp Ser Asp Met Asp Leu Asn Leu Ile
35 40 45
Glu Gln Ala Pro Leu Thr Val Ala Glu Lys Leu Gln Arg Asp Phe Leu
50 55 60
Val Gln Trp Arg Arg Val Ser Lys Ala Pro Glu Ala Leu Phe Phe Val
65 70 75 80
Gln Phe Glu Lys Gly Glu Ser Tyr Phe His Leu His Val Leu Val Glu
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Thr Thr Gly Val Lys Ser
100
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<220>
<223> Synthetic polypeptide
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Met Val Leu Gly Arg Phe Leu Ser Gln Ile Arg Glu Lys Leu Val Gln
1 5 10 15
Thr Ile Tyr Arg Gly Val Glu Pro Thr Leu Pro Asn Trp Phe Ala Val
20 25 30
Thr Lys Thr Arg Asn Gly Ala Gly Gly Gly Asn Lys Val Val Asp Glu
35 40 45
Cys Tyr Ile Pro Asn Tyr Leu Leu Pro Lys Thr Gln Pro Glu Leu Gln
50 55 60
Trp Ala Trp Thr Asn Met Glu Glu Tyr Ile Ser Ala Cys Leu Asn Leu
65 70 75 80
Ala Glu Arg Lys Arg Leu Val Ala Gln His Leu Thr His Val Ser Gln
85 90 95
Thr Gln Glu Gln Asn Lys Glu Asn Leu Asn Pro Asn Ser Asp Ala Pro
100 105 110
Val Ile Arg Ser Lys Thr Ser Ala Arg Tyr Met Glu Leu Val Gly Trp
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Leu Val Asp Arg Gly Ile Thr Ser Glu Lys Gln Trp
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<223> Synthetic polypeptide
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Ile Gln Glu Asp Gln Ala Ser Tyr Ile Ser Phe Asn Ala Ala Ser Asn
1 5 10 15
Ser Arg Ser Gln Ile Lys Ala Ala Leu Asp Asn Ala Gly Lys Ile Met
20 25 30
Ala Leu Thr Lys Ser Ala Pro Asp Tyr Leu Val Gly Pro Ser Leu Pro
35 40 45
Ala Asp Ile Lys Thr Asn Arg Ile Tyr Arg Ile Leu Glu Leu Asn Gly
50 55 60
Tyr Asp Pro Ala Tyr Ala Gly Ser Val Phe Leu Gly Trp Ala Gln Lys
65 70 75 80
Lys Phe Gly Lys Arg Asn Thr Ile Trp Leu Phe Gly Pro Ala Thr Thr
85 90 95
Gly Lys Thr Asn Ile Ala Glu Ala Ile Ala His Ala Val Pro Phe Tyr
100 105 110
Gly Cys Val Asn Trp Thr Asn Glu Asn Phe Pro Phe Asn Asp Cys
115 120 125
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<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic polypeptide
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Val Asp Lys Met Val Ile Trp Trp Glu Glu Gly Lys Met Thr Ala Lys
1 5 10 15
Val Val Glu Ser Ala Lys Ala Ile Leu Gly Gly Ser Lys Val Arg Val
20 25 30
Asp Gln Lys Cys Lys Ser Ser Ala Gln Ile Asp Pro Thr Pro Val Ile
35 40 45
Val Thr Ser Asn Thr Asn Met Cys Ala Val Ile Asp Gly Asn Ser Thr
50 55 60
Thr Phe Glu His Gln Gln Pro Leu Gln Asp Arg Met Phe Lys Phe Glu
65 70 75 80
Leu Thr Arg Arg Leu Glu His Asp Phe Gly Lys Val Thr Lys Gln Glu
85 90 95
Val Lys Glu Phe Phe Arg Trp Ala Ser Asp His Val Thr Glu Val Ala
100 105 110
His Glu Phe Tyr Val Arg Lys Gly Gly Ala Ser Lys Arg Pro Ala Pro
115 120 125
Asp Asp Ala Asp Ile Ser Glu Pro Lys Arg Ala Cys Pro Ser Val Ala
130 135 140
Asp Pro Ser Thr Ser Asp Ala Glu Gly Ala Pro Val Asp Phe Ala Asp
145 150 155 160
Arg Tyr Gln Asn Lys Cys Ser Arg His Ala Gly Met Ile Gln Met Leu
165 170 175
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180 185 190
Phe Thr His Gly Val Arg Asp Cys Leu Glu Cys Phe Pro Gly Val Ser
195 200 205
Glu Ser Gln Pro Val Val Arg Lys Lys Thr Tyr Arg Lys Leu Cys Ala
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Ile His His Leu Leu Gly Arg Ala Pro Glu Ile Ala Cys Ser Ala Cys
225 230 235 240
Asp Leu Val Asn Val Asp Leu Asp Asp Cys Val Ser Glu Gln
245 250
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
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Val Asp Lys Met Val Ile Trp Trp Glu Glu Gly Lys Met Thr Ala Lys
1 5 10 15
Val Val Glu Ser Ala Lys Ala Ile Leu Gly Gly Ser Lys Val Arg Val
20 25 30
Asp Gln Lys Cys Lys Ser Ser Ala Gln Ile Asp Pro Thr Pro Val Ile
35 40 45
Val Thr Ser Asn Thr Asn Met Cys Ala Val Ile Asp Gly Asn Ser Thr
50 55 60
Thr Phe Glu His Gln Gln Pro Leu Gln Asp Arg Met Phe Lys Phe Glu
65 70 75 80
Leu Thr Arg Arg Leu Glu His Asp Phe Gly Lys Val Thr Lys Gln Glu
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Val Lys Glu Phe Phe Arg Trp Ala Ser Asp His Val Thr Glu Val Ala
100 105 110
His Glu Phe Tyr Val Arg Lys Gly Gly Ala Ser Lys Arg Pro Ala Pro
115 120 125
Asp Asp Ala Asp Ile Ser Glu Pro Lys Arg Ala Cys Pro Ser Val Ala
130 135 140
Asp Pro Ser Thr Ser Asp Ala Glu Gly Ala Pro Val Asp Phe Ala Asp
145 150 155 160
Arg Tyr Gln Asn Lys
165
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<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic polypeptide
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Cys Ser Arg His Ala Gly Met Ile Gln Met Leu Phe Pro Cys Lys Thr
1 5 10 15
Cys Glu Arg Met Asn Gln Asn Phe Asn Ile Cys Phe Thr His Gly Val
20 25 30
Arg Asp Cys Leu Glu Cys Phe Pro Gly Val Ser Glu Ser Gln Pro Val
35 40 45
Val Arg Lys Lys Thr Tyr Arg Lys Leu Cys Ala Ile His His Leu Leu
50 55 60
Gly Arg Ala Pro Glu Ile Ala Cys Ser Ala Cys Asp Leu Val Asn Val
65 70 75 80
Asp Leu Asp Asp Cys Val Ser Glu Gln
85
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<212> DNA
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atgccgggct tctacgagat cgtgatcaag gtgccgagcg acctggacga gcacctgccg 60
ggcatttctg actcgtttgt gaactgggtg gccgagaagg aatgggagct gcccccggat 120
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cagttcgaga agggcgagag ctactttcac ctgcacgttc tggtcgagac cacgggggtc 300
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 125
atggtgctag gccgcttcct gagtcagatt cgggaaaagc ttggtccaga ccatctaccc 60
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 128
gtcgacaaga tggtgatctg gtgggaggag ggcaagatga cggccaaggt cgtggagtcc 60
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ctcacccgcc gtctggagca cgactttggc aaggtgacaa agcaggaagt caaagagttc 300
ttccgctggg ccagtgatca cgtgaccgag gtggcgcatg agttttacgt cagaaagggc 360
ggagccagca aaagacccgc ccccgatgac gcggataaaa gcgagcccaa gcgggcctgc 420
ccctcagtcg cggatccatc gacgtcagac gcggaaggag ctccggtgga ctttgccgac 480
aggtaccaaa acaaatgttc tcgtcacgcg ggcatgcttc agatgctgtt tccctgcaaa 540
acgtgcgaga gaatgaatca gaatttcaac atttgcttca cacacggggt cagagactgc 600
tcagagtgtt tccccggcgt gtcagaatct caaccggtcg tcagaaagag gacgtatcgg 660
aaactctgtg cgattcatca tctgctgggg cgggctcccg agattgcttg ctcggcctgc 720
gatctggtca acgtggacct ggatgactgt gtttctgagc aataa 765
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<213> Artificial Sequence
<220>
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gtcgacaaga tggtgatctg gtgggaggag ggcaagatga cggccaaggt cgtggagtcc 60
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gggaacagca ccaccttcga gcaccagcag cctctccagg accggatgtt taagttcgaa 240
ctcacccgcc gtctggagca cgactttggc aaggtgacaa agcaggaagt caaagagttc 300
ttccgctggg ccagtgatca cgtgaccgag gtggcgcatg agttttacgt cagaaagggc 360
ggagccagca aaagacccgc ccccgatgac gcggataaaa gcgagcccaa gcgggcctgc 420
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aggtaccaaa acaaa 495
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
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Met Pro Gly Phe Tyr Glu Ile Val Ile Lys Val Pro Ser Asp Leu Asp
1 5 10 15
Glu His Leu Pro Gly Ile Ser Asp Ser Phe Val Asn Trp Val Ala Glu
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Lys Glu Trp Glu Leu Pro Pro Asp Ser Asp Met Asp Arg Asn Leu Ile
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Glu Gln Ala Pro Leu Thr Val Ala Glu Lys Leu Gln Arg Asp Phe Leu
50 55 60
Val Gln Trp Arg Arg Val Ser Lys Ala Pro Glu Ala Leu Phe Phe Val
65 70 75 80
Gln Phe Glu Lys Gly Glu Ser Tyr Phe His Leu His Val Leu Val Glu
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100
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Met Val Leu Gly Arg Phe Leu Ser Gln Ile Arg Glu Lys Leu Gly Pro
1 5 10 15
Asp His Leu Pro Ala Gly Ser Ser Pro Thr Leu Pro Asn Trp Phe Ala
20 25 30
Val Thr Lys Asp Ala Val Met Ala Pro Ala Gly Gly Asn Lys Val Val
35 40 45
Asp Glu Cys Tyr Ile Pro Asn Tyr Leu Leu Pro Lys Thr Gln Pro Glu
50 55 60
Leu Gln Trp Ala Trp Thr Asn Met Glu Glu Tyr Ile Ser Ala Cys Leu
65 70 75 80
Asn Leu Ala Glu Arg Lys Arg Leu Val Ala Gln His Leu Thr His Val
85 90 95
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100 105 110
Ala Pro Val Ile Arg Ser Lys Thr Ser Ala Arg Tyr Met Glu Leu Val
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Gly Trp Leu Val Asp Arg Gly Ile Thr Ser Glu Lys Gln Trp
130 135 140
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<400> 133
Met Val Leu Gly Arg Phe Leu Ser Gln Ile Arg Glu Lys Leu Val Gln
1 5 10 15
Thr Ile Tyr Arg Gly Val Glu Pro Thr Leu Pro Asn Trp Phe Ala Val
20 25 30
Thr Lys Thr Arg Asn Gly Ala Gly Gly Gly Asn Lys Val Val Asp Glu
35 40 45
Cys Tyr Ile Pro Asn Tyr Leu Leu Pro Lys Thr Gln Pro Glu Leu Gln
50 55 60
Trp Ala Trp Thr Asn Met Glu Glu Tyr Ile Ser Ala Cys Leu Asn Leu
65 70 75 80
Ala Glu Arg Lys Arg Leu Val Ala Gln His Leu Thr His Val Ser Gln
85 90 95
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100 105 110
Val Ile Arg Ser Lys Thr Ser Ala
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<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic polypeptide
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Arg Tyr Met Glu Leu Val Gly Trp Leu Val Asp Arg Gly Ile Thr Ser
1 5 10 15
Glu Lys Gln Trp Ile Gln Glu Asp Gln Ala Ser Tyr Ile Ser Phe Asn
20 25 30
Ala Ala Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ile Lys Ala Ala Leu Asp Asn Ala
35 40 45
Gly Lys Ile Met Ala Leu Thr Lys Ser Ala Pro Asp Tyr Leu Val Gly
50 55 60
Pro Ser Leu Pro Ala Asp Ile Thr Gln Asn Arg Ile Tyr Arg Ile Leu
65 70 75 80
Ala Leu Asn Gly Tyr Asp Pro Ala Tyr Ala Gly Ser Val Phe Leu Gly
85 90 95
Trp Ala Gln Lys Lys Phe Gly Lys Arg Asn Thr Ile Trp Leu Phe Gly
100 105 110
Pro Ala Thr Thr Gly Lys Thr Asn Ile Ala Glu Ala Ile Ala His Ala
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Val Pro Phe Tyr Gly Cys Val Asn Trp Thr Asn Glu Asn Phe Pro Phe
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Asn Asp Cys
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
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Val Asp Lys Met Val Ile Trp Trp Glu Glu Gly Lys Met Thr Ala Lys
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Val Val Glu Ser Ala Lys Ala Ile Leu Gly Gly Ser Lys Val Arg Val
20 25 30
Asp Gln Lys Cys Lys Ser Ser Ala Gln Ile Asp Pro Thr Pro Val Ile
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Val Thr Ser Asn Thr Asn Met Cys Ala Val Ile Asp Gly Asn Ser Thr
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65 70 75 80
Leu Thr Arg Arg Leu Glu His Asp Phe Gly Lys Val Thr Lys Gln Glu
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100 105 110
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180 185 190
Phe Thr His Gly Val Arg Asp Cys Ser Glu Cys Phe Pro Gly Val Ser
195 200 205
Glu Ser Gln Pro Val Val Arg Lys Arg Thr Tyr Arg Lys Leu Cys Ala
210 215 220
Ile His His Leu Leu Gly Arg Ala Pro Glu Ile Ala Cys Ser Ala Cys
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Asp Leu Val Asn Val Asp Leu Asp Asp Cys Val Ser Glu Gln
245 250
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<400> 136
Val Asp Lys Met Val Ile Trp Trp Glu Glu Gly Lys Met Thr Ala Lys
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Val Val Glu Ser Ala Lys Ala Ile Leu Gly Gly Ser Lys Val Arg Val
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Asp Asp Ala Asp Lys Ser Glu Pro Lys Arg Ala Cys Pro Ser Val Ala
130 135 140
Asp Pro Ser Thr Ser Asp Ala Glu Gly Ala Pro Val Asp Phe Ala Asp
145 150 155 160
Arg Tyr Gln Asn Lys
165
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<400> 137
Cys Ser Arg His Ala Gly Met Leu Gln Met Leu Phe Pro Cys Lys Thr
1 5 10 15
Cys Glu Arg Met Asn Gln Asn Phe Asn Ile Cys Phe Thr His Gly Val
20 25 30
Arg Asp Cys Ser Glu Cys Phe Pro Gly Val Ser Glu Ser Gln Pro Val
35 40 45
Val Arg Lys Arg Thr Tyr Arg Lys Leu Cys Ala Ile His His Leu Leu
50 55 60
Gly Arg Ala Pro Glu Ile Ala Cys Ser Ala Cys Asp Leu Val Asn Val
65 70 75 80
Asp Leu Asp Asp Cys Val Ser Glu Gln
85
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<213> Artificial Sequence
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cagttcgaga agggcgagtc ctactttcac ctgcacgttc tggtcgagac cacgggggtc 300
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<210> 139
<211> 420
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 139
atggtcctgg gccgcttcct gagtcagatc agagacaggc tggtgcagac catctaccgc 60
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 140
atccaggagg accaggcctc gtacatctcc ttcaacgccg cctccaactc gcggtcccag 60
atcaaggccg cgctggacaa tgccggaaag atcatggcgc tgaccaaatc cgcgcccgac 120
tacctggtag gcccgtcctt acccgcggac attaaggcca accgcatcta ccgcatcctg 180
gagctcaacg gctacgaccc cgcctacgcc ggctccgtct tcctgggctg ggcgcagaaa 240
aagttcggta aaaggaatac aatttggctg ttcgggcccg ccaccaccgg caagaccaac 300
atcgcggaag ccatcgccca cgccgtgccc ttctacggct gcgtcaactg gaccaatgag 360
aactttccct tcaacgattg c 381
<210> 141
<211> 762
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 141
gtcgacaaga tggtgatctg gtgggaggag ggcaagatga ccgccaaggt cgtggagtcc 60
gccaaggcca ttctgggcgg aagcaaggtg cgcgtcgacc aaaagtgcaa gtcctcggcc 120
cagatcgacc ccacgcccgt gatcgtcacc tccaacacca acatgtgcgc cgtgatcgac 180
gggaacagca ccaccttcga gcaccagcag cccctgcagg accgcatgtt caagttcgag 240
ctcacccgcc gtctggagca cgactttggc aaggtgacca agcaggaagt caaagagttc 300
ttccgctggg ctcaggatca cgtgactgag gtgacgcatg agttctacgt cagaaagggc 360
ggagccacca aaagacccgc ccccagtgac gcggatataa gcgagcccaa gcgggcctgc 420
ccctcagttg cggagccatc gacgtcagac gcggaagcac cggtggactt tgcggacagg 480
taccaaaaca aatgttctcg tcacgcgggc atgcttcaga tgctgtttcc ctgcaagaca 540
tgcgagagaa tgaatcagaa tttcaacgtc tgcttcacgc acggggtcag agactgctca 600
gagtgcttcc ccggcgcgtc agaatctcaa cctgtcgtca gaaaaaagac gtatcagaaa 660
ctgtgcgcga ttcatcatct gctggggcgg gcacccgaga ttgcgtgttc ggcctgcgat 720
ctcgtcaacg tggacttgga tgactgtgtt tctgagcaat aa 762
<210> 142
<211> 492
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 142
gtcgacaaga tggtgatctg gtgggaggag ggcaagatga ccgccaaggt cgtggagtcc 60
gccaaggcca ttctgggcgg aagcaaggtg cgcgtcgacc aaaagtgcaa gtcctcggcc 120
cagatcgacc ccacgcccgt gatcgtcacc tccaacacca acatgtgcgc cgtgatcgac 180
gggaacagca ccaccttcga gcaccagcag cccctgcagg accgcatgtt caagttcgag 240
ctcacccgcc gtctggagca cgactttggc aaggtgacca agcaggaagt caaagagttc 300
ttccgctggg ctcaggatca cgtgactgag gtgacgcatg agttctacgt cagaaagggc 360
ggagccacca aaagacccgc ccccagtgac gcggatataa gcgagcccaa gcgggcctgc 420
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taccaaaaca aa 492
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 143
tgttctcgtc acgcgggcat gcttcagatg ctgtttccct gcaagacatg cgagagaatg 60
aatcagaatt tcaacgtctg cttcacgcac ggggtcagag actgctcaga gtgcttcccc 120
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gacttggatg actgtgtttc tgagcaataa 270
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<400> 144
Met Pro Gly Phe Tyr Glu Ile Val Ile Lys Val Pro Ser Asp Leu Asp
1 5 10 15
Glu His Leu Pro Gly Ile Ser Asp Ser Phe Val Asn Trp Val Ala Glu
20 25 30
Lys Glu Trp Glu Leu Pro Pro Asp Ser Asp Met Asp Arg Asn Leu Ile
35 40 45
Glu Gln Ala Pro Leu Thr Val Ala Glu Lys Leu Gln Arg Asp Phe Leu
50 55 60
Val His Trp Arg Arg Val Ser Lys Ala Pro Glu Ala Leu Phe Phe Val
65 70 75 80
Gln Phe Glu Lys Gly Glu Ser Tyr Phe His Leu His Val Leu Val Glu
85 90 95
Thr Thr Gly Val Lys Ser
100
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<211> 140
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<400> 145
Met Val Leu Gly Arg Phe Leu Ser Gln Ile Arg Asp Arg Leu Val Gln
1 5 10 15
Thr Ile Tyr Arg Gly Val Glu Pro Thr Leu Pro Asn Trp Phe Ala Val
20 25 30
Thr Lys Thr Arg Asn Gly Ala Gly Gly Gly Asn Lys Val Val Asp Glu
35 40 45
Cys Tyr Ile Pro Asn Tyr Leu Leu Pro Lys Thr Gln Pro Glu Leu Gln
50 55 60
Trp Ala Trp Thr Asn Met Glu Glu Tyr Ile Ser Ala Cys Leu Asn Leu
65 70 75 80
Ala Glu Arg Lys Arg Leu Val Ala Gln His Leu Thr His Val Ser Gln
85 90 95
Thr Gln Glu Gln Asn Lys Glu Asn Leu Asn Pro Asn Ser Asp Ala Pro
100 105 110
Val Ile Arg Ser Lys Thr Ser Ala Arg Tyr Met Glu Leu Val Gly Trp
115 120 125
Leu Val Asp Arg Gly Ile Thr Ser Glu Lys Gln Trp
130 135 140
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<211> 127
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<400> 146
Ile Gln Glu Asp Gln Ala Ser Tyr Ile Ser Phe Asn Ala Ala Ser Asn
1 5 10 15
Ser Arg Ser Gln Ile Lys Ala Ala Leu Asp Asn Ala Gly Lys Ile Met
20 25 30
Ala Leu Thr Lys Ser Ala Pro Asp Tyr Leu Val Gly Pro Ser Leu Pro
35 40 45
Ala Asp Ile Lys Ala Asn Arg Ile Tyr Arg Ile Leu Glu Leu Asn Gly
50 55 60
Tyr Asp Pro Ala Tyr Ala Gly Ser Val Phe Leu Gly Trp Ala Gln Lys
65 70 75 80
Lys Phe Gly Lys Arg Asn Thr Ile Trp Leu Phe Gly Pro Ala Thr Thr
85 90 95
Gly Lys Thr Asn Ile Ala Glu Ala Ile Ala His Ala Val Pro Phe Tyr
100 105 110
Gly Cys Val Asn Trp Thr Asn Glu Asn Phe Pro Phe Asn Asp Cys
115 120 125
<210> 147
<211> 253
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<400> 147
Val Asp Lys Met Val Ile Trp Trp Glu Glu Gly Lys Met Thr Ala Lys
1 5 10 15
Val Val Glu Ser Ala Lys Ala Ile Leu Gly Gly Ser Lys Val Arg Val
20 25 30
Asp Gln Lys Cys Lys Ser Ser Ala Gln Ile Asp Pro Thr Pro Val Ile
35 40 45
Val Thr Ser Asn Thr Asn Met Cys Ala Val Ile Asp Gly Asn Ser Thr
50 55 60
Thr Phe Glu His Gln Gln Pro Leu Gln Asp Arg Met Phe Lys Phe Glu
65 70 75 80
Leu Thr Arg Arg Leu Glu His Asp Phe Gly Lys Val Thr Lys Gln Glu
85 90 95
Val Lys Glu Phe Phe Arg Trp Ala Gln Asp His Val Thr Glu Val Thr
100 105 110
His Glu Phe Tyr Val Arg Lys Gly Gly Ala Thr Lys Arg Pro Ala Pro
115 120 125
Ser Asp Ala Asp Ile Ser Glu Pro Lys Arg Ala Cys Pro Ser Val Ala
130 135 140
Glu Pro Ser Thr Ser Asp Ala Glu Ala Pro Val Asp Phe Ala Asp Arg
145 150 155 160
Tyr Gln Asn Lys Cys Ser Arg His Ala Gly Met Leu Gln Met Leu Phe
165 170 175
Pro Cys Lys Thr Cys Glu Arg Met Asn Gln Asn Phe Asn Val Cys Phe
180 185 190
Thr His Gly Val Arg Asp Cys Ser Glu Cys Phe Pro Gly Ala Ser Glu
195 200 205
Ser Gln Pro Val Val Arg Lys Lys Thr Tyr Gln Lys Leu Cys Ala Ile
210 215 220
His His Leu Leu Gly Arg Ala Pro Glu Ile Ala Cys Ser Ala Cys Asp
225 230 235 240
Leu Val Asn Val Asp Leu Asp Asp Cys Val Ser Glu Gln
245 250
<210> 148
<211> 164
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<400> 148
Val Asp Lys Met Val Ile Trp Trp Glu Glu Gly Lys Met Thr Ala Lys
1 5 10 15
Val Val Glu Ser Ala Lys Ala Ile Leu Gly Gly Ser Lys Val Arg Val
20 25 30
Asp Gln Lys Cys Lys Ser Ser Ala Gln Ile Asp Pro Thr Pro Val Ile
35 40 45
Val Thr Ser Asn Thr Asn Met Cys Ala Val Ile Asp Gly Asn Ser Thr
50 55 60
Thr Phe Glu His Gln Gln Pro Leu Gln Asp Arg Met Phe Lys Phe Glu
65 70 75 80
Leu Thr Arg Arg Leu Glu His Asp Phe Gly Lys Val Thr Lys Gln Glu
85 90 95
Val Lys Glu Phe Phe Arg Trp Ala Gln Asp His Val Thr Glu Val Thr
100 105 110
His Glu Phe Tyr Val Arg Lys Gly Gly Ala Thr Lys Arg Pro Ala Pro
115 120 125
Ser Asp Ala Asp Ile Ser Glu Pro Lys Arg Ala Cys Pro Ser Val Ala
130 135 140
Glu Pro Ser Thr Ser Asp Ala Glu Ala Pro Val Asp Phe Ala Asp Arg
145 150 155 160
Tyr Gln Asn Lys
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<211> 89
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<400> 149
Cys Ser Arg His Ala Gly Met Leu Gln Met Leu Phe Pro Cys Lys Thr
1 5 10 15
Cys Glu Arg Met Asn Gln Asn Phe Asn Val Cys Phe Thr His Gly Val
20 25 30
Arg Asp Cys Ser Glu Cys Phe Pro Gly Ala Ser Glu Ser Gln Pro Val
35 40 45
Val Arg Lys Lys Thr Tyr Gln Lys Leu Cys Ala Ile His His Leu Leu
50 55 60
Gly Arg Ala Pro Glu Ile Ala Cys Ser Ala Cys Asp Leu Val Asn Val
65 70 75 80
Asp Leu Asp Asp Cys Val Ser Glu Gln
85
<210> 150
<211> 306
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 150
atgccgggct tctacgagat cgtgatcaag gtgccgagcg acctggacga gcacctgccg 60
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cagttcgaga agggcgagtc ctacttccac ctccacgttc tcgtcgagac cacgggggtc 300
aagtcc 306
<210> 151
<211> 420
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 151
atggtcctgg gccgcttcct gagtcagatc agagacaggc tggtgcagac catctaccgc 60
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cgctacatgg agctggtcgg gtggctggtg gaccggggca tcacctccga gaagcagtgg 420
<210> 152
<211> 381
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 152
atccaggagg accaggcctc gtacatctcc ttcaacgccg cctccaactc gcggtcccag 60
atcaaggccg cgctggacaa tgccggaaag atcatggcgc tgaccaaatc cgcgcccgac 120
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gagctcaacg gctacgaccc cgcctacgcc ggctccgtct tcctgggctg ggcgcagaaa 240
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aactttccct tcaacgattg c 381
<210> 153
<211> 762
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 153
gtcgacaaga tggtgatctg gtgggaggag ggcaagatga ccgccaaggt cgtggagtcc 60
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ttccgctggg ctcaggatca cgtgactgag gtggcgcatg agttctacgt cagaaagggc 360
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ctcgtcaacg tggacttgga tgactgtgtt tctgagcaat aa 762
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<211> 492
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 154
gtcgacaaga tggtgatctg gtgggaggag ggcaagatga ccgccaaggt cgtggagtcc 60
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ttccgctggg ctcaggatca cgtgactgag gtggcgcatg agttctacgt cagaaagggc 360
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 155
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
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Met Pro Gly Phe Tyr Glu Ile Val Ile Lys Val Pro Ser Asp Leu Asp
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Glu His Leu Pro Gly Ile Ser Asp Ser Phe Val Asn Trp Val Ala Glu
20 25 30
Lys Glu Trp Glu Leu Pro Pro Asp Ser Asp Met Asp Arg Asn Leu Ile
35 40 45
Glu Gln Ala Pro Leu Thr Val Ala Glu Lys Leu Gln Arg Asp Phe Leu
50 55 60
Val His Trp Arg Arg Val Ser Lys Ala Pro Glu Ala Leu Phe Phe Val
65 70 75 80
Gln Phe Glu Lys Gly Glu Ser Tyr Phe His Leu His Val Leu Val Glu
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Thr Thr Gly Val Lys Ser
100
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<211> 140
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<400> 157
Met Val Leu Gly Arg Phe Leu Ser Gln Ile Arg Asp Arg Leu Val Gln
1 5 10 15
Thr Ile Tyr Arg Gly Val Glu Pro Thr Leu Pro Asn Trp Phe Ala Val
20 25 30
Thr Lys Thr Arg Asn Gly Ala Gly Gly Gly Asn Lys Val Val Asp Glu
35 40 45
Cys Tyr Ile Pro Asn Tyr Leu Leu Pro Lys Thr Gln Pro Glu Leu Gln
50 55 60
Trp Ala Trp Thr Asn Met Glu Glu Tyr Ile Ser Ala Cys Leu Asn Leu
65 70 75 80
Ala Glu Arg Lys Arg Leu Val Ala Gln His Leu Thr His Val Ser Gln
85 90 95
Thr Gln Glu Gln Asn Lys Glu Asn Leu Asn Pro Asn Ser Asp Ala Pro
100 105 110
Val Ile Arg Ser Lys Thr Ser Ala Arg Tyr Met Glu Leu Val Gly Trp
115 120 125
Leu Val Asp Arg Gly Ile Thr Ser Glu Lys Gln Trp
130 135 140
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<211> 127
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<400> 158
Ile Gln Glu Asp Gln Ala Ser Tyr Ile Ser Phe Asn Ala Ala Ser Asn
1 5 10 15
Ser Arg Ser Gln Ile Lys Ala Ala Leu Asp Asn Ala Gly Lys Ile Met
20 25 30
Ala Leu Thr Lys Ser Ala Pro Asp Tyr Leu Val Gly Pro Ser Leu Pro
35 40 45
Ala Asp Ile Lys Ala Asn Arg Ile Tyr Arg Ile Leu Glu Leu Asn Gly
50 55 60
Tyr Asp Pro Ala Tyr Ala Gly Ser Val Phe Leu Gly Trp Ala Gln Lys
65 70 75 80
Lys Phe Gly Lys Arg Asn Thr Ile Trp Leu Phe Gly Pro Ala Thr Thr
85 90 95
Gly Lys Thr Asn Ile Ala Glu Ala Ile Ala His Ala Val Pro Phe Tyr
100 105 110
Gly Cys Val Asn Trp Thr Asn Glu Asn Phe Pro Phe Asn Asp Cys
115 120 125
<210> 159
<211> 253
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<400> 159
Val Asp Lys Met Val Ile Trp Trp Glu Glu Gly Lys Met Thr Ala Lys
1 5 10 15
Val Val Glu Ser Ala Lys Ala Ile Leu Gly Gly Ser Lys Val Arg Val
20 25 30
Asp Gln Lys Cys Lys Ser Ser Ala Gln Ile Asp Pro Thr Pro Val Ile
35 40 45
Val Thr Ser Asn Thr Asn Met Cys Ala Val Ile Asp Gly Asn Ser Thr
50 55 60
Thr Phe Glu His Gln Gln Pro Leu Gln Asp Arg Met Phe Lys Phe Glu
65 70 75 80
Leu Thr Arg Arg Leu Glu His Asp Phe Gly Lys Val Thr Lys Gln Glu
85 90 95
Val Lys Glu Phe Phe Arg Trp Ala Gln Asp His Val Thr Glu Val Ala
100 105 110
His Glu Phe Tyr Val Arg Lys Gly Gly Ala Thr Lys Arg Pro Ala Pro
115 120 125
Ser Asp Ala Asp Ile Ser Glu Pro Lys Arg Ala Cys Pro Ser Val Pro
130 135 140
Glu Pro Ser Thr Ser Asp Ala Glu Ala Pro Val Asp Phe Ala Asp Arg
145 150 155 160
Tyr Gln Asn Lys Cys Ser Arg His Ala Gly Met Leu Gln Met Leu Phe
165 170 175
Pro Cys Lys Thr Cys Glu Arg Met Asn Gln Asn Phe Asn Val Cys Phe
180 185 190
Thr His Gly Val Arg Asp Cys Ser Glu Cys Phe Pro Gly Ala Ser Glu
195 200 205
Ser Gln Pro Val Val Arg Lys Lys Thr Tyr Gln Lys Leu Cys Ala Ile
210 215 220
His His Leu Leu Gly Arg Ala Pro Glu Ile Ala Cys Ser Ala Cys Asp
225 230 235 240
Leu Val Asn Val Asp Leu Asp Asp Cys Val Ser Glu Gln
245 250
<210> 160
<211> 164
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<400> 160
Val Asp Lys Met Val Ile Trp Trp Glu Glu Gly Lys Met Thr Ala Lys
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Val Val Glu Ser Ala Lys Ala Ile Leu Gly Gly Ser Lys Val Arg Val
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Asp Gln Lys Cys Lys Ser Ser Ala Gln Ile Asp Pro Thr Pro Val Ile
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Val Thr Ser Asn Thr Asn Met Cys Ala Val Ile Asp Gly Asn Ser Thr
50 55 60
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Leu Thr Arg Arg Leu Glu His Asp Phe Gly Lys Val Thr Lys Gln Glu
85 90 95
Val Lys Glu Phe Phe Arg Trp Ala Gln Asp His Val Thr Glu Val Ala
100 105 110
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115 120 125
Ser Asp Ala Asp Ile Ser Glu Pro Lys Arg Ala Cys Pro Ser Val Pro
130 135 140
Glu Pro Ser Thr Ser Asp Ala Glu Ala Pro Val Asp Phe Ala Asp Arg
145 150 155 160
Tyr Gln Asn Lys
<210> 161
<211> 89
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<400> 161
Cys Ser Arg His Ala Gly Met Leu Gln Met Leu Phe Pro Cys Lys Thr
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35 40 45
Val Arg Lys Lys Thr Tyr Gln Lys Leu Cys Ala Ile His His Leu Leu
50 55 60
Gly Arg Ala Pro Glu Ile Ala Cys Ser Ala Cys Asp Leu Val Asn Val
65 70 75 80
Asp Leu Asp Asp Cys Val Ser Glu Gln
85
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<211> 306
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 162
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cgcgagttcc tggtggaatg gcgccgagtg agtaaatttc tggaggccaa gttttttgtg 240
cagtttgaaa agggggactc gtactttcat ttgcatattc tgattgaaat taccggcgtg 300
aaatcc 306
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 163
atggtggtgg gccgctacgt gagtcagatt agggataaac tgatccagcg catctaccgc 60
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<210> 164
<211> 381
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 164
atccaggagg accaggcctc gtacatctcc ttcaacgcgg cctccaactc ccggtcgcag 60
atcaaggcgg ccctggacaa tgcctccaaa atcatgagcc tcaccaaaac ggctccggac 120
tatctcatcg ggcagcagcc cgtgggggac attaccacca accggatcta caaaatcctg 180
gaactgaacg ggtacgaccc ccagtacgcc gcctccgtct ttctcggctg ggcccagaaa 240
aagtttggaa agcgcaacac catctggctg tttgggcccg ccaccaccgg caagaccaac 300
atcgcggaag ccatcgccca cgcggtcccc ttctacggct gcgtcaactg gaccaatgag 360
aactttccct tcaacgactg c 381
<210> 165
<211> 759
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 165
gtcgacaaaa tggtgatttg gtgggaggag ggcaagatga ccgccaaggt cgtagagtcc 60
gccaaggcca ttctgggcgg cagcaaggtg cgcgtggacc aaaaatgcaa ggcctctgcg 120
cagatcgacc ccacccccgt gatcgtcacc tccaacacca acatgtgcgc cgtgattgac 180
gggaacagca ccaccttcga gcaccagcag cccctgcagg accggatgtt caagtttgaa 240
ctcacccgcc gcctcgacca cgactttggc aaggtcacca agcaggaagt caaggacttt 300
ttccggtggg cggctgatca cgtgactgac gtggctcatg agttttacgt cacaaagggt 360
ggagctaaga aaaggcccgc cccctctgac gaggatataa gcgagcccaa gcggccgcgc 420
gtgtcatttg cgcagccgga gacgtcagac gcggaagctc ccggagactt cgccgacagg 480
taccaaaaca aatgttctcg tcacgcgggt atgctgcaga tgctctttcc ctgcaagacg 540
tgcgagagaa tgaatcagaa ttccaacgtc tgcttcacgc acggtcagaa agattgcggg 600
gagtgctttc ccgggtcaga atctcaaccg gtttctgtcg tcagaaaaac gtatcagaaa 660
ctgtgcatcc ttcatcagct ccggggggca cccgagatcg cctgctctgc ttgcgaccaa 720
ctcaaccccg atttggacga ttgccaattt gagcaataa 759
<210> 166
<211> 492
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 166
gtcgacaaaa tggtgatttg gtgggaggag ggcaagatga ccgccaaggt cgtagagtcc 60
gccaaggcca ttctgggcgg cagcaaggtg cgcgtggacc aaaaatgcaa ggcctctgcg 120
cagatcgacc ccacccccgt gatcgtcacc tccaacacca acatgtgcgc cgtgattgac 180
gggaacagca ccaccttcga gcaccagcag cccctgcagg accggatgtt caagtttgaa 240
ctcacccgcc gcctcgacca cgactttggc aaggtcacca agcaggaagt caaggacttt 300
ttccggtggg cggctgatca cgtgactgac gtggctcatg agttttacgt cacaaagggt 360
ggagctaaga aaaggcccgc cccctctgac gaggatataa gcgagcccaa gcggccgcgc 420
gtgtcatttg cgcagccgga gacgtcagac gcggaagctc ccggagactt cgccgacagg 480
taccaaaaca aa 492
<210> 167
<211> 267
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 167
tgttctcgtc acgcgggtat gctgcagatg ctctttccct gcaagacgtg cgagagaatg 60
aatcagaatt ccaacgtctg cttcacgcac ggtcagaaag attgcgggga gtgctttccc 120
gggtcagaat ctcaaccggt ttctgtcgtc agaaaaacgt atcagaaact gtgcatcctt 180
catcagctcc ggggggcacc cgagatcgcc tgctctgctt gcgaccaact caaccccgat 240
ttggacgatt gccaatttga gcaataa 267
<210> 168
<211> 102
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<400> 168
Met Pro Gly Phe Tyr Glu Val Val Ile Lys Val Pro Ser Asp Leu Asp
1 5 10 15
Glu His Leu Pro Gly Ile Ser Asp Ser Phe Val Asn Trp Val Ala Glu
20 25 30
Lys Glu Trp Glu Leu Pro Pro Asp Ser Asp Met Asp Gln Asn Leu Ile
35 40 45
Glu Gln Ala Pro Leu Thr Val Ala Glu Lys Leu Gln Arg Glu Phe Leu
50 55 60
Val Glu Trp Arg Arg Val Ser Lys Phe Leu Glu Ala Lys Phe Phe Val
65 70 75 80
Gln Phe Glu Lys Gly Asp Ser Tyr Phe His Leu His Ile Leu Ile Glu
85 90 95
Ile Thr Gly Val Lys Ser
100
<210> 169
<211> 140
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<400> 169
Met Val Val Gly Arg Tyr Val Ser Gln Ile Arg Asp Lys Leu Ile Gln
1 5 10 15
Arg Ile Tyr Arg Gly Val Glu Pro Gln Leu Pro Asn Trp Phe Ala Val
20 25 30
Thr Lys Thr Arg Asn Gly Ala Gly Gly Gly Asn Lys Val Val Asp Glu
35 40 45
Cys Tyr Ile Pro Asn Tyr Leu Leu Pro Lys Val Gln Pro Glu Leu Gln
50 55 60
Trp Ala Trp Thr Asn Met Glu Glu Tyr Ile Ser Ala Cys Leu Asn Leu
65 70 75 80
Ala Glu Arg Lys Arg Leu Val Ala Gln His Leu Thr His Val Ser Gln
85 90 95
Thr Gln Glu Gly Asp Lys Glu Asn Leu Asn Pro Asn Ser Asp Ala Pro
100 105 110
Val Ile Arg Ser Lys Thr Ser Ala Arg Tyr Met Glu Leu Val Gly Trp
115 120 125
Leu Val Asp Lys Gly Ile Thr Ser Glu Lys Gln Trp
130 135 140
<210> 170
<211> 127
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<400> 170
Ile Gln Glu Asp Gln Ala Ser Tyr Ile Ser Phe Asn Ala Ala Ser Asn
1 5 10 15
Ser Arg Ser Gln Ile Lys Ala Ala Leu Asp Asn Ala Ser Lys Ile Met
20 25 30
Ser Leu Thr Lys Thr Ala Pro Asp Tyr Leu Ile Gly Gln Gln Pro Val
35 40 45
Gly Asp Ile Thr Thr Asn Arg Ile Tyr Lys Ile Leu Glu Leu Asn Gly
50 55 60
Tyr Asp Pro Gln Tyr Ala Ala Ser Val Phe Leu Gly Trp Ala Gln Lys
65 70 75 80
Lys Phe Gly Lys Arg Asn Thr Ile Trp Leu Phe Gly Pro Ala Thr Thr
85 90 95
Gly Lys Thr Asn Ile Ala Glu Ala Ile Ala His Ala Val Pro Phe Tyr
100 105 110
Gly Cys Val Asn Trp Thr Asn Glu Asn Phe Pro Phe Asn Asp Cys
115 120 125
<210> 171
<211> 252
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<400> 171
Val Asp Lys Met Val Ile Trp Trp Glu Glu Gly Lys Met Thr Ala Lys
1 5 10 15
Val Val Glu Ser Ala Lys Ala Ile Leu Gly Gly Ser Lys Val Arg Val
20 25 30
Asp Gln Lys Cys Lys Ala Ser Ala Gln Ile Asp Pro Thr Pro Val Ile
35 40 45
Val Thr Ser Asn Thr Asn Met Cys Ala Val Ile Asp Gly Asn Ser Thr
50 55 60
Thr Phe Glu His Gln Gln Pro Leu Gln Asp Arg Met Phe Lys Phe Glu
65 70 75 80
Leu Thr Arg Arg Leu Asp His Asp Phe Gly Lys Val Thr Lys Gln Glu
85 90 95
Val Lys Asp Phe Phe Arg Trp Ala Ala Asp His Val Thr Asp Val Ala
100 105 110
His Glu Phe Tyr Val Thr Lys Gly Gly Ala Lys Lys Arg Pro Ala Pro
115 120 125
Ser Asp Glu Asp Ile Ser Glu Pro Lys Arg Pro Arg Val Ser Phe Ala
130 135 140
Gln Pro Glu Thr Ser Asp Ala Glu Ala Pro Gly Asp Phe Ala Asp Arg
145 150 155 160
Tyr Gln Asn Lys Cys Ser Arg His Ala Gly Met Leu Gln Met Leu Phe
165 170 175
Pro Cys Lys Thr Cys Glu Arg Met Asn Gln Asn Ser Asn Val Cys Phe
180 185 190
Thr His Gly Gln Lys Asp Cys Gly Glu Cys Phe Pro Gly Ser Glu Ser
195 200 205
Gln Pro Val Ser Val Val Arg Lys Thr Tyr Gln Lys Leu Cys Ile Leu
210 215 220
His Gln Leu Arg Gly Ala Pro Glu Ile Ala Cys Ser Ala Cys Asp Gln
225 230 235 240
Leu Asn Pro Asp Leu Asp Asp Cys Gln Phe Glu Gln
245 250
<210> 172
<211> 164
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<400> 172
Val Asp Lys Met Val Ile Trp Trp Glu Glu Gly Lys Met Thr Ala Lys
1 5 10 15
Val Val Glu Ser Ala Lys Ala Ile Leu Gly Gly Ser Lys Val Arg Val
20 25 30
Asp Gln Lys Cys Lys Ala Ser Ala Gln Ile Asp Pro Thr Pro Val Ile
35 40 45
Val Thr Ser Asn Thr Asn Met Cys Ala Val Ile Asp Gly Asn Ser Thr
50 55 60
Thr Phe Glu His Gln Gln Pro Leu Gln Asp Arg Met Phe Lys Phe Glu
65 70 75 80
Leu Thr Arg Arg Leu Asp His Asp Phe Gly Lys Val Thr Lys Gln Glu
85 90 95
Val Lys Asp Phe Phe Arg Trp Ala Ala Asp His Val Thr Asp Val Ala
100 105 110
His Glu Phe Tyr Val Thr Lys Gly Gly Ala Lys Lys Arg Pro Ala Pro
115 120 125
Ser Asp Glu Asp Ile Ser Glu Pro Lys Arg Pro Arg Val Ser Phe Ala
130 135 140
Gln Pro Glu Thr Ser Asp Ala Glu Ala Pro Gly Asp Phe Ala Asp Arg
145 150 155 160
Tyr Gln Asn Lys
<210> 173
<211> 88
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<400> 173
Cys Ser Arg His Ala Gly Met Leu Gln Met Leu Phe Pro Cys Lys Thr
1 5 10 15
Cys Glu Arg Met Asn Gln Asn Ser Asn Val Cys Phe Thr His Gly Gln
20 25 30
Lys Asp Cys Gly Glu Cys Phe Pro Gly Ser Glu Ser Gln Pro Val Ser
35 40 45
Val Val Arg Lys Thr Tyr Gln Lys Leu Cys Ile Leu His Gln Leu Arg
50 55 60
Gly Ala Pro Glu Ile Ala Cys Ser Ala Cys Asp Gln Leu Asn Pro Asp
65 70 75 80
Leu Asp Asp Cys Gln Phe Glu Gln
85
<210> 174
<211> 306
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 174
atgccgggat tctacgagat tgtcctgaag gtgcccagcg acctggacga gcacctgcct 60
ggcatttctg actcttttgt aaactgggtg gcggagaagg aatgggagct gccgccggat 120
tctgacatgg atctgaatct gattgagcag gcacccctaa ccgtggccga aaagctgcaa 180
cgcgaattcc tggtcgagtg gcgccgcgtg agtaaggccc cggaggccct cttctttgtt 240
cagttcgaga agggggacag ctacttccac ctacacattc tggtggagac cgtgggcgtg 300
aaatcc 306
<210> 175
<211> 420
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 175
atggtggtgg gccgctacgt gagccagatt aaagagaagc tggtgacccg catctaccgc 60
ggggtcgagc cgcagcttcc gaactggttc gcggtgacca agacgcgtaa tggcgccgga 120
ggcgggaaca aggtggtgga cgactgctac atccccaact acctgctccc caagacccag 180
cccgagctcc agtgggcgtg gactaatatg gaccagtatt taagcgcctg tttgaatctc 240
gcggagcgta aacggctggt ggcgcagcat ctgacgcacg tgtcgcagac gcaggagcag 300
aacaaagaga accagaatcc caattctgac gcgccggtga tcagatcaaa aacctccgcg 360
aggtacatgg agctggtcgg gtggctggtg gaccgcggga tcacgtcaga aaagcaatgg 420
<210> 176
<211> 381
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 176
atccaggagg accaggcctc ttacatctcc ttcaacgccg cctccaactc gcggtcacaa 60
atcaaggccg cactggacaa tgcctccaaa tttatgagcc tgacaaaaac ggctccggac 120
tacctggtgg gaaacaaccc gccggaggac attaccagca accggatcta caaaatcctc 180
gagatgaacg ggtacgatcc gcagtacgcg gcctccgtct tcctgggctg ggcgcaaaag 240
aagttcggga agaggaacac catctggctc tttgggccgg ccacgacggg taaaaccaac 300
atcgctgaag ctatcgccca cgccgtgccc ttttacggct gcgtgaactg gaccaatgag 360
aactttccgt tcaacgattg c 381
<210> 177
<211> 765
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 177
gtcgacaaga tggtgatctg gtgggaggag ggcaagatga cggccaaggt cgtggagtcc 60
gccaaggcca ttctgggcgg aagcaaggtg cgcgtggacc aaaagtgcaa gtcatcggcc 120
cagatcgacc caactcccgt catcgtcacc tccaacacca acatgtgcgc ggtcatcgac 180
ggaaattcca ccaccttcga gcaccaacaa ccactccaag accggatgtt caagttcgag 240
ctcaccaagc gcctggagca cgactttggc aaggtcacca agcaggaagt caaggacttt 300
ttccggtggg cgtcagatca cgtgactgag gtgtctcacg agttttacgt cagaaagggt 360
ggagctagaa agaggcccgc ccccaatgac gcagatataa gtgagcccaa gcgggcctgt 420
ccgtcagttg cgcagccatc gacgtcagac gcggaagctc cggtggacta cgcggacagg 480
taccaaaaca aatgttctcg tcacgtgggc atgaatctga tgctttttcc ctgccggcaa 540
tgcgagagaa tgaatcagaa tgtggacatt tgcttcacgc acggggtcat ggactgtgcc 600
gagtgcttcc ccgtgtcaga atctcaaccc gtgtctgtcg tcagaaagcg gacatatcag 660
aaactgtgtc cgattcatca catcatgggg agggcgcccg aggtggcttg ttcggcctgc 720
gatctggcca atgtggactt ggatgactgt gacatggagc aataa 765
<210> 178
<211> 492
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 178
gtcgacaaga tggtgatctg gtgggaggag ggcaagatga cggccaaggt cgtggagtcc 60
gccaaggcca ttctgggcgg aagcaaggtg cgcgtggacc aaaagtgcaa gtcatcggcc 120
cagatcgacc caactcccgt catcgtcacc tccaacacca acatgtgcgc ggtcatcgac 180
ggaaattcca ccaccttcga gcaccaacaa ccactccaag accggatgtt caagttcgag 240
ctcaccaagc gcctggagca cgactttggc aaggtcacca agcaggaagt caaggacttt 300
ttccggtggg cgtcagatca cgtgactgag gtgtctcacg agttttacgt cagaaagggt 360
ggagctagaa agaggcccgc ccccaatgac gcagatataa gtgagcccaa gcgggcctgt 420
ccgtcagttg cgcagccatc gacgtcagac gcggaagctc cggtggacta cgcggacagg 480
taccaaaaca aa 492
<210> 179
<211> 273
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 179
tgttctcgtc acgtgggcat gaatctgatg ctttttccct gccggcaatg cgagagaatg 60
aatcagaatg tggacatttg cttcacgcac ggggtcatgg actgtgccga gtgcttcccc 120
gtgtcagaat ctcaacccgt gtctgtcgtc agaaagcgga catatcagaa actgtgtccg 180
attcatcaca tcatggggag ggcgcccgag gtggcttgtt cggcctgcga tctggccaat 240
gtggacttgg atgactgtga catggagcaa taa 273
<210> 180
<211> 102
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<400> 180
Met Pro Gly Phe Tyr Glu Ile Val Leu Lys Val Pro Ser Asp Leu Asp
1 5 10 15
Glu His Leu Pro Gly Ile Ser Asp Ser Phe Val Asn Trp Val Ala Glu
20 25 30
Lys Glu Trp Glu Leu Pro Pro Asp Ser Asp Met Asp Leu Asn Leu Ile
35 40 45
Glu Gln Ala Pro Leu Thr Val Ala Glu Lys Leu Gln Arg Glu Phe Leu
50 55 60
Val Glu Trp Arg Arg Val Ser Lys Ala Pro Glu Ala Leu Phe Phe Val
65 70 75 80
Gln Phe Glu Lys Gly Asp Ser Tyr Phe His Leu His Ile Leu Val Glu
85 90 95
Thr Val Gly Val Lys Ser
100
<210> 181
<211> 140
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<400> 181
Met Val Val Gly Arg Tyr Val Ser Gln Ile Lys Glu Lys Leu Val Thr
1 5 10 15
Arg Ile Tyr Arg Gly Val Glu Pro Gln Leu Pro Asn Trp Phe Ala Val
20 25 30
Thr Lys Thr Arg Asn Gly Ala Gly Gly Gly Asn Lys Val Val Asp Asp
35 40 45
Cys Tyr Ile Pro Asn Tyr Leu Leu Pro Lys Thr Gln Pro Glu Leu Gln
50 55 60
Trp Ala Trp Thr Asn Met Asp Gln Tyr Leu Ser Ala Cys Leu Asn Leu
65 70 75 80
Ala Glu Arg Lys Arg Leu Val Ala Gln His Leu Thr His Val Ser Gln
85 90 95
Thr Gln Glu Gln Asn Lys Glu Asn Gln Asn Pro Asn Ser Asp Ala Pro
100 105 110
Val Ile Arg Ser Lys Thr Ser Ala Arg Tyr Met Glu Leu Val Gly Trp
115 120 125
Leu Val Asp Arg Gly Ile Thr Ser Glu Lys Gln Trp
130 135 140
<210> 182
<211> 127
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<400> 182
Ile Gln Glu Asp Gln Ala Ser Tyr Ile Ser Phe Asn Ala Ala Ser Asn
1 5 10 15
Ser Arg Ser Gln Ile Lys Ala Ala Leu Asp Asn Ala Ser Lys Phe Met
20 25 30
Ser Leu Thr Lys Thr Ala Pro Asp Tyr Leu Val Gly Asn Asn Pro Pro
35 40 45
Glu Asp Ile Thr Ser Asn Arg Ile Tyr Lys Ile Leu Glu Met Asn Gly
50 55 60
Tyr Asp Pro Gln Tyr Ala Ala Ser Val Phe Leu Gly Trp Ala Gln Lys
65 70 75 80
Lys Phe Gly Lys Arg Asn Thr Ile Trp Leu Phe Gly Pro Ala Thr Thr
85 90 95
Gly Lys Thr Asn Ile Ala Glu Ala Ile Ala His Ala Val Pro Phe Tyr
100 105 110
Gly Cys Val Asn Trp Thr Asn Glu Asn Phe Pro Phe Asn Asp Cys
115 120 125
<210> 183
<211> 254
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<400> 183
Val Asp Lys Met Val Ile Trp Trp Glu Glu Gly Lys Met Thr Ala Lys
1 5 10 15
Val Val Glu Ser Ala Lys Ala Ile Leu Gly Gly Ser Lys Val Arg Val
20 25 30
Asp Gln Lys Cys Lys Ser Ser Ala Gln Ile Asp Pro Thr Pro Val Ile
35 40 45
Val Thr Ser Asn Thr Asn Met Cys Ala Val Ile Asp Gly Asn Ser Thr
50 55 60
Thr Phe Glu His Gln Gln Pro Leu Gln Asp Arg Met Phe Lys Phe Glu
65 70 75 80
Leu Thr Lys Arg Leu Glu His Asp Phe Gly Lys Val Thr Lys Gln Glu
85 90 95
Val Lys Asp Phe Phe Arg Trp Ala Ser Asp His Val Thr Glu Val Ser
100 105 110
His Glu Phe Tyr Val Arg Lys Gly Gly Ala Arg Lys Arg Pro Ala Pro
115 120 125
Asn Asp Ala Asp Ile Ser Glu Pro Lys Arg Ala Cys Pro Ser Val Ala
130 135 140
Gln Pro Ser Thr Ser Asp Ala Glu Ala Pro Val Asp Tyr Ala Asp Arg
145 150 155 160
Tyr Gln Asn Lys Cys Ser Arg His Val Gly Met Asn Leu Met Leu Phe
165 170 175
Pro Cys Arg Gln Cys Glu Arg Met Asn Gln Asn Val Asp Ile Cys Phe
180 185 190
Thr His Gly Val Met Asp Cys Ala Glu Cys Phe Pro Val Ser Glu Ser
195 200 205
Gln Pro Val Ser Val Val Arg Lys Arg Thr Tyr Gln Lys Leu Cys Pro
210 215 220
Ile His His Ile Met Gly Arg Ala Pro Glu Val Ala Cys Ser Ala Cys
225 230 235 240
Asp Leu Ala Asn Val Asp Leu Asp Asp Cys Asp Met Glu Gln
245 250
<210> 184
<211> 164
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<400> 184
Val Asp Lys Met Val Ile Trp Trp Glu Glu Gly Lys Met Thr Ala Lys
1 5 10 15
Val Val Glu Ser Ala Lys Ala Ile Leu Gly Gly Ser Lys Val Arg Val
20 25 30
Asp Gln Lys Cys Lys Ser Ser Ala Gln Ile Asp Pro Thr Pro Val Ile
35 40 45
Val Thr Ser Asn Thr Asn Met Cys Ala Val Ile Asp Gly Asn Ser Thr
50 55 60
Thr Phe Glu His Gln Gln Pro Leu Gln Asp Arg Met Phe Lys Phe Glu
65 70 75 80
Leu Thr Lys Arg Leu Glu His Asp Phe Gly Lys Val Thr Lys Gln Glu
85 90 95
Val Lys Asp Phe Phe Arg Trp Ala Ser Asp His Val Thr Glu Val Ser
100 105 110
His Glu Phe Tyr Val Arg Lys Gly Gly Ala Arg Lys Arg Pro Ala Pro
115 120 125
Asn Asp Ala Asp Ile Ser Glu Pro Lys Arg Ala Cys Pro Ser Val Ala
130 135 140
Gln Pro Ser Thr Ser Asp Ala Glu Ala Pro Val Asp Tyr Ala Asp Arg
145 150 155 160
Tyr Gln Asn Lys
<210> 185
<211> 90
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<400> 185
Cys Ser Arg His Val Gly Met Asn Leu Met Leu Phe Pro Cys Arg Gln
1 5 10 15
Cys Glu Arg Met Asn Gln Asn Val Asp Ile Cys Phe Thr His Gly Val
20 25 30
Met Asp Cys Ala Glu Cys Phe Pro Val Ser Glu Ser Gln Pro Val Ser
35 40 45
Val Val Arg Lys Arg Thr Tyr Gln Lys Leu Cys Pro Ile His His Ile
50 55 60
Met Gly Arg Ala Pro Glu Val Ala Cys Ser Ala Cys Asp Leu Ala Asn
65 70 75 80
Val Asp Leu Asp Asp Cys Asp Met Glu Gln
85 90
<210> 186
<211> 174
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 186
aagtccatgg tgctaggccg cttcctgagt cagattcggg aaaagctggt ccagaccatc 60
taccgcgggg tcgagcccac cttgcccaac tggttcgcgg tgaccaagac gcgtaatggc 120
gccggggggg ggaacaaggt ggtggacgag tgctacatcc ccaactacct cctg 174
<210> 187
<211> 180
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 187
gtcctccatc aacccctaca tcgtgagcag gtggtggaac aagggggggc ggccgcggta 60
atggcgcaga aaccagtggc gcttggtcaa cccgttccac cccgagctgg ggcgcccatc 120
taccagacct ggttcgaaaa gggcttagac tgagtccttc gccggatcgt ggtacctgaa 180
Claims (98)
- 제1 혈청형의 rep 유전자를 발현하는 세포를, 제2 혈청형의 역위 말단 반복부 (ITR) 쌍을 포함하는 재조합 핵산과 접촉시키는 단계
를 포함하는, 재조합 아데노-연관 바이러스 (AAV) 입자를 패키징하는 방법. - 제1항에 있어서, rep 유전자가 세포를 rep 유전자를 코딩하는 핵산으로 형질감염 또는 감염시킴으로써 발현되는 것인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, rep 유전자가 키메라이고, N-말단 및 C-말단 (c)을 포함하며, 여기서
N 말단이 N-말단 도메인 (n), DNA 결합 도메인 (d), 및 헬리카제 도메인 (h)을 포함하고,
C 말단이 NLS/p40 프로모터 도메인 (y) 및 아연 핑거 도메인 (z)을 포함하는
것인 방법. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, rep 유전자가 혈청형 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV6, AAV12, AAV13, AAV1 및 AAV2, 또는 AAV5 및 AAV2의 것이거나, 또는 rep 유전자가 키메라인 방법.
- 제3항 또는 제4항에 있어서, N 말단이 AAV1 혈청형의 것이고 C 말단이 AAV2 혈청형의 것인 방법.
- 제3항 또는 제4항에 있어서, N 말단이 AAV2 혈청형의 것이고 C 말단이 AAV1 혈청형의 것인 방법.
- 제3항 또는 제4항에 있어서, N 말단이 AAV2 혈청형의 것이고 C 말단이 AAV5 혈청형의 것인 방법.
- 제3항 또는 제4항에 있어서, N 말단이 AAV5 혈청형의 것이고 C 말단이 AAV2 혈청형의 것인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 제1 혈청형이 AAV1 혈청형인 방법.
- 제9항에 있어서, 제2 혈청형이 AAV1 혈청형인 방법.
- 제9항에 있어서, 제2 혈청형이 AAV2 혈청형인 방법.
- 제9항에 있어서, 제2 혈청형이 AAV3 혈청형인 방법.
- 제9항에 있어서, 제2 혈청형이 AAV4 혈청형인 방법.
- 제9항에 있어서, 제2 혈청형이 AAV7 혈청형인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 제2 혈청형이 AAV6 혈청형인 방법.
- 제15항에 있어서, 제1 혈청형이 AAV2 혈청형인 방법.
- 제15항에 있어서, 제1 혈청형이 AAV3 혈청형인 방법.
- 제15항에 있어서, 제1 혈청형이 AAV4 혈청형인 방법.
- 제15항에 있어서, 제1 혈청형이 AAV6 혈청형인 방법.
- 제15항에 있어서, 제1 혈청형이 AAV12 혈청형인 방법.
- 제15항에 있어서, 제1 혈청형이 AAV13 혈청형인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 제2 혈청형이 혈청형 1인 방법.
- 제22항에 있어서, 제1 혈청형이 AAV2 혈청형인 방법.
- 제22항에 있어서, 제1 혈청형이 AAV3 혈청형인 방법.
- 제22항에 있어서, 제1 혈청형이 AAV4 혈청형인 방법.
- 제22항에 있어서, 제1 혈청형이 AAV12 혈청형인 방법.
- 제22항에 있어서, 제1 혈청형이 AAV13 혈청형인 방법.
- 제5항에 있어서, 제2 혈청형이 AAV1 혈청형인 방법.
- 제5항에 있어서, 제2 혈청형이 AAV6 혈청형인 방법.
- 제6항에 있어서, 제2 혈청형이 AAV1 혈청형인 방법.
- 제6항에 있어서, 제2 혈청형이 AAV6 혈청형인 방법.
- 제7항에 있어서, 제2 혈청형이 AAV2 혈청형인 방법.
- 제8항에 있어서, 제2 혈청형이 AAV5 혈청형인 방법.
- 제3항에 있어서, rAAV 입자가 AAV1 혈청형의 것인 방법.
- 제34항에 있어서, n, d, y, 및 z 도메인이 AAV2 혈청형의 것이고 h 도메인이 AAV1 혈청형의 것인 방법.
- 제34항에 있어서, n, h, y, 및 z 도메인이 AAV2 혈청형의 것이고 d 도메인이 AAV1 혈청형의 것인 방법.
- 제34항에 있어서, d, h, y, 및 z 도메인이 AAV2 혈청형의 것이고 n 도메인이 AAV1 혈청형의 것인 방법.
- 제34항에 있어서, n, d, 및 h 도메인이 AAV1 혈청형의 것이고 y 및 z 도메인이 AAV1 혈청형의 것인 방법.
- 제34항에 있어서, d 및 h 도메인이 AAV1 혈청형의 것이고 n, y 및 z 도메인이 AAV2 혈청형의 것인 방법.
- 제34항에 있어서, n 및 d 도메인이 AAV1 혈청형의 것이고 h, y, 및 z 도메인이 AAV2 혈청형의 것인 방법.
- 제3항에 있어서, rAAV 입자가 AAV3 혈청형의 것인 방법.
- 제41항에 있어서, n, d, 및 h 도메인이 AAV2 혈청형의 것이고 y 및 z 도메인이 AAV3 혈청형의 것인 방법.
- 제42항에 있어서, rep 유전자가 서열 ACG의 출발 코돈을 갖는 것인 방법.
- 제41항에 있어서, rep 유전자가 AAV3 혈청형의 것이고, 서열 ATG의 출발 코돈을 갖는 것인 방법.
- 제3항에 있어서, rAAV 입자가 AAV4 혈청형의 것인 방법.
- 제45항에 있어서, rep 유전자가 AAV4 혈청형의 것이고, 서열 ACG의 출발 코돈을 갖는 것인 방법.
- 제3항에 있어서, rAAV 입자가 AAV5 혈청형의 것인 방법.
- 제47항에 있어서, rep 유전자가 AAV2 혈청형의 것이고, 서열 ACG의 출발 코돈을 갖는 것인 방법.
- 제3항에 있어서, rAAV 입자가 AAV6 혈청형의 것인 방법.
- 제49항에 있어서, n 및 h 도메인이 AAV8 혈청형의 것이고 d, y 및 z 도메인이 AAV2 혈청형의 것인 방법.
- 제49항에 있어서, n 및 d 도메인이 AAV1 혈청형의 것이고 h, y, 및 z 도메인이 AAV2 혈청형의 것인 방법.
- 제3항에 있어서, rAAV 입자가 AAV7 혈청형의 것인 방법.
- 제52항에 있어서, rep 유전자가 AAV2 혈청형의 것이고, 서열 ACG의 출발 코돈을 갖는 것인 방법.
- 제52항에 있어서, rep 유전자가 AAV7 혈청형의 것이고, 서열 ACG의 출발 코돈을 갖는 것인 방법.
- 제3항에 있어서, rAAV 입자가 AAV8 혈청형의 것인 방법.
- 제55항에 있어서, n 및 h 도메인이 AAV8 혈청형의 것이고 d, y, 및 z 도메인이 AAV2 혈청형의 것이며, rep 유전자가 서열 ATG의 출발 코돈을 갖는 것인 방법.
- 제55항에 있어서, n, h 및 d 도메인이 AAV1 혈청형의 것이고 y 및 z 도메인이 AAV2 혈청형의 것이며, rep 유전자가 서열 ATG의 출발 코돈을 갖는 것인 방법.
- 제55항에 있어서, n 및 h 도메인이 AAV8 혈청형의 것이고, 서열식별번호: 125에 따른 하기 뉴클레오티드: T574, C592, C607, A637, G644, 및 C657이 d 도메인에서 결실되며, y 및 z 도메인이 AAV2 혈청형의 것이고, rep 유전자가 서열 ATG의 출발 코돈을 갖는 것인 방법.
- 제1항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 평균적으로 rAAV 입자 내로 패키징된 게놈의 양이, AAV2 혈청형의 rep 유전자 및 AAV2 혈청형의 ITR 쌍을 사용하는 동일한 혈청형의 입자의 평균 패키징에 비해 적어도 1.5배만큼 더 높은 것인 방법.
- 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 세포를, cap 유전자를 포함하는 재조합 핵산과 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제1항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 cap 유전자를 발현하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항의 세포에 따른 제1 혈청형의 rep 유전자 및 제2 혈청형의 ITR 쌍을 포함하는 세포.
- 제36항에 있어서, cap 유전자를 추가로 포함하는 세포.
- rep 유전자를 포함하는 핵산을 포함하는 조성물이며, 여기서 rep 유전자가 키메라이고, N-말단 및 C-말단 (c)을 포함하며,
N 말단이 N-말단 도메인 (n), DNA 결합 도메인 (d), 및 헬리카제 도메인 (h)을 포함하고,
C 말단이 NLS/p40 프로모터 도메인 (y) 및 아연 핑거 도메인 (z)을 포함하는
것인 조성물. - 제64항에 있어서, rep 유전자가 혈청형 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV6, AAV12, AAV13, AAV1 및 AAV2, 또는 AAV5 및 AAV2의 것이거나, 또는 rep 유전자가 키메라인 조성물.
- 제64항에 있어서, N 말단이 AAV1 혈청형의 것이고 C 말단이 AAV2 혈청형의 것인 조성물.
- 제64항에 있어서, N 말단이 AAV2 혈청형의 것이고 C 말단이 AAV1 혈청형의 것인 조성물.
- 제64항에 있어서, N 말단이 AAV2 혈청형의 것이고 C 말단이 AAV5 혈청형의 것인 조성물.
- 제64항에 있어서, N 말단이 AAV5 혈청형의 것이고 C 말단이 AAV2 혈청형의 것인 조성물 .
- 제64항에 있어서, n, d, y, 및 z 도메인이 AAV2 혈청형의 것이고 h 도메인이 AAV1 혈청형의 것인 조성물.
- 제64항에 있어서, n, h, y, 및 z 도메인이 AAV2 혈청형의 것이고 d 도메인이 AAV1 혈청형의 것인 조성물.
- 제64항에 있어서, d, h, y, 및 z 도메인이 AAV2 혈청형의 것이고 n 도메인이 AAV1 혈청형의 것인 조성물.
- 제64항에 있어서, n, d, 및 h 도메인이 AAV1 혈청형의 것이고 y 및 z 도메인이 AAV1 혈청형의 것인 조성물.
- 제64항에 있어서, d 및 h 도메인이 AAV1 혈청형의 것이고 n, y 및 z 도메인이 AAV2 혈청형의 것인 조성물.
- 없음
- 제64항에 있어서, n 및 d 도메인이 AAV1 혈청형의 것이고 h, y, 및 z 도메인이 AAV2 혈청형의 것인 조성물.
- 제70항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, cap 유전자를 포함하는 핵산을 추가로 포함하며, 여기서 cap 유전자가 AAV1 혈청형의 것인 조성물.
- 제64항에 있어서, n, d, 및 h 도메인이 AAV2 혈청형의 것이고 y 및 z 도메인이 AAV3 혈청형의 것인 조성물.
- 제64항에 있어서, rep 유전자가 서열 ACG의 출발 코돈을 갖는 것인 조성물.
- 제64항에 있어서, rep 유전자가 AAV3 혈청형의 것이고, 서열 ATG의 출발 코돈을 갖는 것인 조성물.
- 제78항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, cap 유전자를 포함하는 핵산을 추가로 포함하며, 여기서 cap 유전자가 AAV3 혈청형의 것인 조성물.
- 제64항에 있어서, rep 유전자가 AAV4 혈청형의 것이고, 서열 ACG의 출발 코돈을 갖는 것인 조성물.
- 제82항에 있어서, cap 유전자를 포함하는 핵산을 추가로 포함하며, 여기서 cap 유전자가 AAV4 혈청형의 것인 조성물.
- 제64항에 있어서, rep 유전자가 AAV2 혈청형의 것이고, 서열 ACG의 출발 코돈을 갖는 것인 조성물.
- 제84항에 있어서, cap 유전자를 포함하는 핵산을 추가로 포함하며, 여기서 cap 유전자가 AAV5 혈청형의 것인 조성물.
- 제64항에 있어서, n 및 h 도메인이 AAV8 혈청형의 것이고 d, y 및 z 도메인이 AAV2 혈청형의 것인 조성물.
- 제64항에 있어서, n 및 d 도메인이 AAV1 혈청형의 것이고, h, y, 및 z 도메인이 AAV2 혈청형의 것인 조성물.
- 제86항 또는 제87항에 있어서, cap 유전자를 포함하는 핵산을 추가로 포함하며, 여기서 cap 유전자가 AAV6 혈청형의 것인 조성물.
- 제64항에 있어서, rep 유전자가 AAV2 혈청형의 것이고, 서열 ACG의 출발 코돈을 갖는 것인 조성물.
- 제64항에 있어서, rep 유전자가 AAV7 혈청형의 것이고, 서열 ACG의 출발 코돈을 갖는 것인 조성물.
- 제89항 또는 제90항에 있어서, cap 유전자를 포함하는 핵산을 추가로 포함하며, 여기서 cap 유전자가 AAV7 혈청형의 것인 조성물.
- 제64항에 있어서, n 및 h 도메인이 AAV8 혈청형의 것이고 d, y, 및 z 도메인이 AAV2 혈청형의 것이며, rep 유전자가 서열 ATG의 출발 코돈을 갖는 것인 조성물.
- 제64항에 있어서, n, h 및 d 도메인이 AAV1 혈청형의 것이고 y 및 z 도메인이 AAV2 혈청형의 것이며, rep 유전자가 서열 ATG의 출발 코돈을 갖는 것인 조성물.
- 제64항에 있어서, n 및 h 도메인이 AAV8 혈청형의 것이고, 서열식별번호: 125에 따른 하기 뉴클레오티드: T574, C592, C607, A637, G644, 및 C657이 d 도메인에서 결실되며, y 및 z 도메인이 AAV2 혈청형의 것이고, rep 유전자가 서열 ATG의 출발 코돈을 갖는 것인 조성물.
- 제92항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, cap 유전자를 포함하는 핵산을 추가로 포함하며, 여기서 cap 유전자가 AAV8 혈청형의 것인 조성물.
- 제77항, 제81항, 제85항, 제88항, 제91항 및 제95항 중 어느 한 항에 있어서, rep 유전자를 포함하는 핵산 및 cap 유전자를 포함하는 핵산이 핵산 벡터에 의해 포함되는 것인 조성물.
- 제64항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, ITR 쌍을 포함하는 핵산을 추가로 포함하는 조성물.
- 제97항에 있어서, ITR을 포함하는 핵산이, ITR 쌍에 의해 플랭킹된 관심 유전자를 추가로 포함하는 것인 조성물.
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