JP2021514659A - Aavキメラ - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、その全開示が参照により本明細書に組み込まれる、2018年3月6日に出願された米国特許仮出願第62/639,466号の利益を主張する。
AAV構造
rAAV粒子の生成方法は当技術分野で公知であり、試薬は市販されている(例えば、Zolotukhin et al. Production and purification of serotype 1, 2, and 5 recombinant adeno−associated viral vectors. Methods 28 (2002) 158−167;ならびに、米国特許出願公開第20070015238号および米国特許出願公開第20120322861号を参照、これらは参照により本明細書に組み込まれる;プラスミドおよびキットはATCCおよびCell Biolabs,Inc.から入手可能である)。
rAAV粒子を生成またはパッケージする任意の方法におけるそれらの使用が、同じ血清型のITRおよびrep遺伝子が使用される類似条件と比較してより大きなパッケージングまたは生成効率をもたらすような、異なる血清型のrepおよびITRの組合せが、ここで開示される。したがって、rAAV粒子をパッケージする方法であって、第1の血清型のrep遺伝子を発現する細胞を、第2の血清型の一対のITRを含む組換え核酸と接触させることを含む方法も本明細書で開示される。一部の実施形態では、第1の血清型および第2の血清型は同じである。一部の実施形態では、第1および第2の血清型は異なる。
1.AAV1_ITR+AAV1_Rep
2.AAV2_ITR+AAV1_Rep
3.AAV3_ITR+AAV1_Rep
4.AAV4_ITR+AAV1_Rep
5.AAV7_ITR+AAV1_Rep
6.AAV6_ITR+AAV2_Rep
7.AAV6_ITR+AAV3_Rep
8.AAV6_ITR+AAV4_Rep
9.AAV6_ITR+AAV6_Rep
10.AAV6_ITR+AAV12_Rep
11.AAV6_ITR+AAV13_Rep
12.AAV1_ITR+AAV2_Rep
13.AAV1_ITR+AAV3_Rep
14.AAV1_ITR+AAV4_Rep
15.AAV1_ITR+AAV12_Rep
16.AAV1_ITR+AAV13_Rep
17.AAV6_ITR+AAV1N/2C_キメラ_Rep
18.AAV1_ITR+AAV1N/2C_キメラ_Rep
19.AAV6_ITR+AAV2N/1C_キメラ_Rep
20.AAV1_ITR+AAV2N/1C_キメラ_Rep
21.AAV2_ITR+AAV2N/5C_キメラ_Rep
22.AAV5_ITR+AAV5N/2C_キメラ_Rep
本明細書に開示される異なる血清型のITR、capおよび/またはrepの組合せを使用してrAAV粒子を生成するために使用される細胞が、本明細書で提供される。したがって、一部の実施形態では、本明細書に開示される産生細胞は、第1のAAV血清型のrepおよび第2のAAV血清型のITRを含む。一部の実施形態では、本明細書に開示される産生細胞は、repおよびITRの組合せを含み、ここで、repおよびITRの血清型は本明細書に開示される組合せのいずれか1つである。
ITRおよびRepタンパク質の血清型の特定の組合せ以外は同じであるrAAV生成プロセスと比較して、本明細書に記載される方法のいずれか1つを使用して、組換えAAV粒子の収量を向上させることができる。一部の実施形態では、粒子の収量は、生成されるrAAV粒子の量によって規定される。一部の実施形態では、粒子の収量は、生成される完全なrAAV粒子(すなわち、核酸またはゲノムを含有するもの)の量によって規定される。一部の実施形態では、rAAV粒子の収量は、rAAVのパッケージングのために血清型2のITRが使用される場合と比較して増加する。一部の実施形態では、ITRおよびRepタンパク質の血清型の特定の組合せのいずれか1つを含むrAAV生成の収量は、血清型2のITRが使用されるrAAV生成プロセスと比較して、2〜20%(例えば、2〜4%、2〜10%、5〜10%、5〜20%、15〜20%または10〜20%)または、さらに最大で5〜10倍もしくは100倍もしくはそれより多く(例えば、最大で2倍、最大で3倍、最大で5倍、最大で10倍、最大で20倍、最大で50倍または最大で100倍またはそれより多く)増加することができる。
rAAV調製物の中のrAAV粒子または粒子は、任意の誘導体または偽型を含む任意のAAV血清型(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、2/1、2/5、2/8、2/9、3/1、3/5、3/8または3/9)であってよい。cap遺伝子は、本明細書に記載されるITRのいずれか1つが隣接した、目的のrAAVゲノムまたは任意の遺伝子をパッケージするために使用することができる。その結果、本明細書に記載される方法のいずれか1つから生成されるrAAV粒子は、任意の血清型または偽型であってよく、それもまた、本明細書に記載されるキメラrep遺伝子のいずれか1つを使用することができる。本明細書に開示される方法のいずれか1つ(例えば、rep遺伝子のいずれか1つ、cap遺伝子のいずれか1つおよび/またはここで記載されるITRのいずれか1つによる)を使用して生成されるrAAV粒子は、目的の遺伝子を細胞(例えば、被験体の体内の細胞またはin vitroの細胞)に送達するために、または、被験体における状態もしくは疾患を処置するために使用することができる。
一部の実施形態では、1つまたは複数のヘルパーベクター(例えば、プラスミド)は、rep遺伝子および/またはcap遺伝子を含む第1のヘルパープラスミド、ならびに以下のヘルパー遺伝子:E1a遺伝子、E1b遺伝子、E4遺伝子、E2a遺伝子およびVA遺伝子の1つまたは複数を含む第2のヘルパープラスミドを含む。明瞭さのために、ヘルパー遺伝子は、ヘルパータンパク質E1a、E1b、E4、E2aおよびVAをコードする遺伝子である。一部の実施形態では、cap遺伝子は、タンパク質VP1、VP2およびVP3の1つまたは複数が発現されないように改変される。一部の実施形態では、cap遺伝子は、VP2が発現されないように改変される。そのような改変を作製する方法は、当技術分野で公知である(Lux et al. (2005), J Virology, 79: 11776−87)。
目的の遺伝子は、目的のタンパク質をコードする遺伝子である。目的のタンパク質は、検出可能なマーカーまたは治療的タンパク質であってよい。検出可能なマーカーは、可視化することができる(例えば、裸眼で、または顕微鏡の下で)分子である。一部の実施形態では、検出可能なマーカーは、蛍光分子、生物発光分子、または発色分子である(例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−ラクタマーゼ、β−グルクロニダーゼおよびスフェロイデノン(spheriodenone))。一部の実施形態では、検出可能なマーカーは、蛍光タンパク質またはその機能的ペプチドもしくは機能的ポリペプチドである。
本明細書に開示される方法のいずれか1つ(例えば、rep遺伝子のいずれか1つ、cap遺伝子のいずれか1つおよび/またはここで記載されるITRのいずれか1つによる)を使用して生成されるrAAV粒子は、目的の遺伝子を細胞(例えば、被験体の体内の細胞またはin vitroの細胞)に送達するために、または、被験体における状態もしくは疾患を処置するために使用することができる。一部の実施形態では、被験体は、哺乳動物(例えば、ヒト)である。一部の実施形態では、被験体は、上記の目的の遺伝子による処置を必要とする。
ゲノムパッケージング効率に及ぼす異なる血清型のAAV Repタンパク質および/またはAAV ITRの使用の影響を探究し始めるために、AAV1〜AAV13のRepおよび入手可能なITR配列を比較した(図1)。ITR配列は、AAV1〜AAV7にかぎり入手可能である。AAV1およびAAV6は、Rep(99.4%)およびCap(99.2%)タンパク質の両方で高い配列同一性を共有する。対照的に、それらのITR配列は相違(81.6%)を示す。AAV6 ITRはAAV2 ITRのそれと同一であるが、RepおよびCapタンパク質配列はそれぞれ87.3%および83.4%でより多様である。このことは、AAV6がAAV1とAAV2の間のキメラであることと一貫している。AAV1およびAAV6のRepは、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10およびAAV11と高い配列相同性(≧95.0%)を共有するが、それらのCapタンパク質配列はより多様である(図1)。顕著なことに、他のAAVと比較して、AAV5はそのITR配列、Repタンパク質およびCapタンパク質において一貫して多様である(図1)。
最初に、全てのAAV血清型のRepタンパク質によるAAV6キャプシドのパッケージングの間の比較を行う。AAV1からAAV6のITRが隣接したゲノムを有するベクター構築物が使用される。AAV2 rep遺伝子を含有する既存のRep2(AAV2の)−cap6(AAV6の)ヘルパープラスミドは、他のAAV血清型からのrep遺伝子によって置換される。これらの構築物は、rAAV6(rAAVX/6)ベクターを生成するためにHEK293細胞をトランスフェクトするために使用される。一致したITRおよびRepタンパク質対(例えば、AAV1 ITRプラスAAV1 rep、またはAAV3 ITRプラスAAV3 rep等)から開始して、代替のAAV血清型からのITRが隣接したAAVベクターゲノムが、AAV6ベクター生成のために使用される。結果として生じるベクターは、ゲノム含有のならびに空の(無DNA)AAV粒子を精製する、AVBセファロースによって精製する。完全なおよび空のキャプシドは、密度勾配(例えば、イオジキサノール)または沈降勾配(例えば、スクロース勾配)のいずれかによって分離され、各試料についてキャプシド力価を定量化するために、キャプシドELISA(ADK1a抗体による)が使用される。個々のベクター調製物がその後分析され、それらの空:完全比、全体の生成収量および遺伝子発現効率について比較される。
図4は、rAAV粒子を生成するために使用される標準のAAV生成システムの概略図を示す。ヘルパーまたは産生細胞とも呼ばれる細胞を、Repおよびキャプシドタンパク質をコードする遺伝子、および必要に応じて目的の遺伝子を、rAAV粒子の中にパッケージすることができるようにITRの間に含む、1つまたは複数のプラスミドでトランスフェクトする。標準の技術は、様々なキメラのおよび改変されたcap遺伝子を利用するが、通常は、血清型2のrepおよびITRである。以下に、異なる血清型のキャプシドを生成するために、rep遺伝子が改変され、AAV2の配列を有するITRとともに使用される実験、およびそこからのデータを記載する。試験した改変rep遺伝子は、他の血清型のドメインで置換されたドメインを有するキメラrep遺伝子である。
n=N末端ドメイン、
d=DNA結合性ドメイン、
h=ヘリカーゼドメイン、
y=NLS/p40プロモータードメイン、および
z=ジンクフィンガードメイン;
ここで、本明細書で定義されるN末端は、ドメインn、dおよびhからなり;C末端(c)は、ドメインyおよびzからなる。
この明細書で開示される特徴の全ては、任意の組合せで組み合わせることができる。この明細書で開示される各特徴は、同じか、同等であるかまたは類似の目的の役目をする代替の特徴と置き換えることができる。したがって、明示的に特記されない限り、開示される各特徴は、一般的な一連の同等または類似の特徴の例にすぎない。
本明細書でいくつかの発明の実施形態が記載され、例示されたが、当業者は、機能を果たしおよび/もしくは結果を得るための様々な他の手段および/もしくは構造を容易に想定し、ならびに/または、本明細書に記載される利点の1つまたは複数、およびそのような変異および/もしくは改変の各々は、本明細書に記載される発明の実施形態の範囲内であると考えられる。より一般的には、当業者は、本明細書に記載される全てのパラメータ、寸法、材料および構成は例示的なものであること、ならびに、実際のパラメータ、寸法、材料および/または構成は、発明の教示が使用される具体的な適用(複数可)に依存することを容易に理解する。当業者は、通常の実験だけしか使用せずに、本明細書に記載される具体的な発明の実施形態の多くの均等物を認識するか、または確かめることができる。したがって、上述の実施形態は例として提示されているにすぎないこと、ならびに添付の特許請求の範囲およびその均等物の範囲内で、具体的に記載され、請求されるものと別の方法で発明の実施形態を実施することができることが理解される。本出願の発明の実施形態は、本明細書に記載される各個々の特徴、システム、物品、材料、キットおよび/または方法に関する。さらに、そのような特徴、システム、物品、材料、キットおよび/または方法が相互に矛盾しないならば、2つまたはそれより多くのそのような特徴、システム、物品、材料、キットおよび/または方法の任意の組合せは、本出願の発明の範囲に含まれる。
Claims (97)
- 組換えアデノ随伴ウイルス(AAV)粒子をパッケージする方法であって、
第1の血清型のrep遺伝子を発現する細胞を、第2の血清型の一対の末端逆位配列(ITR)を含む組換え核酸と接触させることを含む、方法。 - 前記rep遺伝子が、前記rep遺伝子をコードする核酸によって前記細胞をトランスフェクトまたは感染させることによって発現される、請求項1に記載の方法。
- 前記rep遺伝子がキメラであり、N末端およびC末端(c)を含み、
前記N末端がN末端ドメイン(n)、DNA結合性ドメイン(d)およびヘリカーゼドメイン(h)を含み、
前記C末端がNLS/p40プロモータードメイン(y)およびジンクフィンガードメイン(z)を含む、請求項1または2に記載の方法。 - 前記rep遺伝子が、血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV6、AAV12、AAV13、AAV1およびAAV2、またはAAV5およびAAV2であるか、または前記rep遺伝子がキメラである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記N末端がAAV1血清型であり、前記C末端がAAV2血清型である、請求項3または4に記載の方法。
- 前記N末端がAAV2血清型であり、前記C末端がAAV1血清型である、請求項3または4に記載の方法。
- 前記N末端がAAV2血清型であり、前記C末端がAAV5血清型である、請求項3または4に記載の方法。
- 前記N末端がAAV5血清型であり、前記C末端がAAV2血清型である、請求項3または4に記載の方法。
- 前記第1の血清型がAAV1血清型である、請求項1または2に記載の方法。
- 前記第2の血清型がAAV1血清型である、請求項9に記載の方法。
- 前記第2の血清型がAAV2血清型である、請求項9に記載の方法。
- 前記第2の血清型がAAV3血清型である、請求項9に記載の方法。
- 前記第2の血清型がAAV4血清型である、請求項9に記載の方法。
- 前記第2の血清型がAAV7血清型である、請求項9に記載の方法。
- 前記第2の血清型がAAV6血清型である、請求項1または2に記載の方法。
- 前記第1の血清型がAAV2血清型である、請求項15に記載の方法。
- 前記第1の血清型がAAV3血清型である、請求項15に記載の方法。
- 前記第1の血清型がAAV4血清型である、請求項15に記載の方法。
- 前記第1の血清型がAAV6血清型である、請求項15に記載の方法。
- 前記第1の血清型がAAV12血清型である、請求項15に記載の方法。
- 前記第1の血清型がAAV13血清型である、請求項15に記載の方法。
- 前記第2の血清型が血清型1である、請求項1または2に記載の方法。
- 前記第1の血清型がAAV2血清型である、請求項22に記載の方法。
- 前記第1の血清型がAAV3血清型である、請求項22に記載の方法。
- 前記第1の血清型がAAV4血清型である、請求項22に記載の方法。
- 前記第1の血清型がAAV12血清型である、請求項22に記載の方法。
- 前記第1の血清型がAAV13血清型である、請求項22に記載の方法。
- 前記第2の血清型がAAV1血清型である、請求項5に記載の方法。
- 前記第2の血清型がAAV6血清型である、請求項5に記載の方法。
- 前記第2の血清型がAAV1血清型である、請求項6に記載の方法。
- 前記第2の血清型がAAV6血清型である、請求項6に記載の方法。
- 前記第2の血清型がAAV2血清型である、請求項7に記載の方法。
- 前記第2の血清型がAAV5血清型である、請求項8に記載の方法。
- 前記rAAV粒子がAAV1血清型である、請求項3に記載の方法。
- 前記n、d、yおよびzドメインがAAV2血清型であり、前記hドメインがAAV1血清型である、請求項34に記載の方法。
- 前記n、h、yおよびzドメインがAAV2血清型であり、前記dドメインがAAV1血清型である、請求項34に記載の方法。
- 前記d、h、yおよびzドメインがAAV2血清型であり、前記nドメインがAAV1血清型である、請求項34に記載の方法。
- 前記n、dおよびhドメインがAAV1血清型であり、前記yおよびzドメインがAAV1血清型である、請求項34に記載の方法。
- 前記dおよびhドメインがAAV1血清型であり、前記n、yおよびzドメインがAAV2血清型である、請求項34に記載の方法。
- 前記nおよびdドメインがAAV1血清型であり、前記h、yおよびzドメインがAAV2血清型である、請求項34に記載の方法。
- 前記rAAV粒子がAAV3血清型である、請求項3に記載の方法。
- 前記n、dおよびhドメインがAAV2血清型であり、前記yおよびzドメインがAAV3血清型である、請求項41に記載の方法。
- 前記rep遺伝子が配列ACGの開始コドンを有する、請求項42に記載の方法。
- 前記rep遺伝子がAAV3血清型であり、配列ATGの開始コドンを有する、請求項41に記載の方法。
- 前記rAAV粒子がAAV4血清型である、請求項3に記載の方法。
- 前記rep遺伝子がAAV4血清型であり、配列ACGの開始コドンを有する、請求項45に記載の方法。
- 前記rAAV粒子がAAV5血清型である、請求項3に記載の方法。
- 前記rep遺伝子がAAV2血清型であり、配列ACGの開始コドンを有する、請求項47に記載の方法。
- 前記rAAV粒子がAAV6血清型である、請求項3に記載の方法。
- 前記nおよびhドメインがAAV8血清型であり、前記d、yおよびzドメインがAAV2血清型である、請求項49に記載の方法。
- 前記nおよびdドメインがAAV1血清型であり、前記h、yおよびzドメインがAAV2血清型である、請求項49に記載の方法。
- 前記rAAV粒子がAAV7血清型である、請求項3に記載の方法。
- rep遺伝子がAAV2血清型であり、配列ACGの開始コドンを有する、請求項52に記載の方法。
- rep遺伝子がAAV7血清型であり、配列ACGの開始コドンを有する、請求項52に記載の方法。
- 前記rAAV粒子がAAV8血清型である、請求項3に記載の方法。
- 前記nおよびhドメインがAAV8血清型であり、前記d、yおよびzドメインがAAV2血清型であり、前記rep遺伝子が配列ATGの開始コドンを有する、請求項55に記載の方法。
- 前記n、hおよびdドメインがAAV1血清型であり、前記yおよびzドメインがAAV2血清型であり、前記rep遺伝子が配列ATGの開始コドンを有する、請求項55に記載の方法。
- 前記nおよびhドメインがAAV8血清型であり、以下のヌクレオチド:配列番号125にしたがうT574、C592、C607、A637、G644およびC657が前記dドメインにおいて欠失しており、前記yおよびzドメインがAAV2血清型であり、前記rep遺伝子が配列ATGの開始コドンを有する、請求項55に記載の方法。
- 前記rAAV粒子にパッケージされるゲノムの量が、AAV2血清型のrep遺伝子およびAAV2血清型の一対のITRを使用した同じ血清型の粒子の平均パッケージングと比較して、平均して少なくとも1.5倍高い、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞を、cap遺伝子を含む組換え核酸と接触させることをさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞がcap遺伝子を発現する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1〜35のいずれか一項に記載の細胞にしたがう、第1の血清型のrep遺伝子および第2の血清型の一対のITRを含む細胞。
- 前記細胞がcap遺伝子をさらに含む、請求項36に記載の細胞。
- rep遺伝子を含む核酸を含む組成物であって、前記rep遺伝子がキメラであり、N末端およびC末端(c)を含み、
前記N末端がN末端ドメイン(n)、DNA結合性ドメイン(d)およびヘリカーゼドメイン(h)を含み、
前記C末端がNLS/p40プロモータードメイン(y)およびジンクフィンガードメイン(z)を含む、組成物。 - 前記rep遺伝子が、血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV6、AAV12、AAV13、AAV1およびAAV2、またはAAV5およびAAV2であるか、または前記rep遺伝子がキメラである、請求項64に記載の組成物。
- 前記N末端がAAV1血清型であり、前記C末端がAAV2血清型である、請求項64に記載の組成物。
- 前記N末端がAAV2血清型であり、前記C末端がAAV1血清型である、請求項64に記載の組成物。
- 前記N末端がAAV2血清型であり、前記C末端がAAV5血清型である、請求項64に記載の組成物。
- 前記N末端がAAV5血清型であり、前記C末端がAAV2血清型である、請求項64に記載の組成物。
- 前記n、d、yおよびzドメインがAAV2血清型であり、前記hドメインがAAV1血清型である、請求項64に記載の組成物。
- 前記n、h、yおよびzドメインがAAV2血清型であり、前記dドメインがAAV1血清型である、請求項64に記載の組成物。
- 前記d、h、yおよびzドメインがAAV2血清型であり、前記nドメインがAAV1血清型である、請求項64に記載の組成物。
- 前記n、dおよびhドメインがAAV1血清型であり、前記yおよびzドメインがAAV1血清型である、請求項64に記載の組成物。
- 前記dおよびhドメインがAAV1血清型であり、前記n、yおよびzドメインがAAV2血清型である、請求項64に記載の組成物。
- 前記nおよびdドメインがAAV1血清型であり、前記h、yおよびzドメインがAAV2血清型である、請求項64に記載の組成物。
- cap遺伝子を含む核酸をさらに含み、前記cap遺伝子がAAV1血清型である、請求項70〜76のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記n、dおよびhドメインがAAV2血清型であり、前記yおよびzドメインがAAV3血清型である、請求項64に記載の組成物。
- 前記rep遺伝子が配列ACGの開始コドンを有する、請求項64に記載の組成物。
- 前記rep遺伝子がAAV3血清型であり、配列ATGの開始コドンを有する、請求項64に記載の組成物。
- cap遺伝子を含む核酸をさらに含み、前記cap遺伝子がAAV3血清型である、請求項78〜80のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記rep遺伝子がAAV4血清型であり、配列ACGの開始コドンを有する、請求項64に記載の組成物。
- cap遺伝子を含む核酸をさらに含み、前記cap遺伝子がAAV4血清型である、請求項82に記載の組成物。
- 前記rep遺伝子がAAV2血清型であり、配列ACGの開始コドンを有する、請求項64に記載の組成物。
- cap遺伝子を含む核酸をさらに含み、前記cap遺伝子がAAV5血清型である、請求項84に記載の組成物。
- 前記nおよびhドメインがAAV8血清型であり、前記d、yおよびzドメインがAAV2血清型である、請求項64に記載の組成物。
- 前記nおよびdドメインがAAV1血清型であり、前記h、yおよびzドメインがAAV2血清型である、請求項64に記載の組成物。
- cap遺伝子を含む核酸をさらに含み、前記cap遺伝子がAAV6血清型である、請求項86または87に記載の組成物。
- rep遺伝子がAAV2血清型であり、配列ACGの開始コドンを有する、請求項64に記載の組成物。
- rep遺伝子がAAV7血清型であり、配列ACGの開始コドンを有する、請求項64に記載の組成物。
- cap遺伝子を含む核酸をさらに含み、前記cap遺伝子がAAV7血清型である、請求項89または90に記載の組成物。
- 前記nおよびhドメインがAAV8血清型であり、前記d、yおよびzドメインがAAV2血清型であり、前記rep遺伝子が配列ATGの開始コドンを有する、請求項64に記載の組成物。
- 前記n、hおよびdドメインがAAV1血清型であり、前記yおよびzドメインがAAV2血清型であり、前記rep遺伝子が配列ATGの開始コドンを有する、請求項64に記載の組成物。
- 前記nおよびhドメインがAAV8血清型であり、以下のヌクレオチド:配列番号125にしたがうT574、C592、C607、A637、G644およびC657が前記dドメインにおいて欠失しており、前記yおよびzドメインがAAV2血清型であり、前記rep遺伝子が配列ATGの開始コドンを有する、請求項64に記載の組成物。
- cap遺伝子を含む核酸をさらに含み、前記cap遺伝子がAAV8血清型である、請求項92〜94のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記rep遺伝子を含む核酸および前記cap遺伝子を含む核酸が、核酸ベクターに含まれる、請求項77、81、85、88、91または95のいずれか一項に記載の組成物。
- 一対のITRを含む核酸をさらに含む、請求項64〜96のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ITRを含む核酸が、前記一対のITRが隣接する目的の遺伝子をさらに含む、請求項97に記載の組成物。
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