CN112166195A - Aav嵌合体 - Google Patents

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Abstract

本文中提供了用于包装重组腺相关病毒(rAAV)颗粒的组合物和方法，其包括使用不同血清型的反向末端重复(ITR)和rep基因和/或使用嵌合rep基因。

Description

AAV嵌合体
相关申请
本申请要求于2018年3月6日提交的美国临时申请No.62/639,466的权益，其全部公开内容通过引用并入本文。
背景技术
腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)颗粒通常用于研究并且还用于基因治疗应用，包括在临床开发中的数种。
用于小规模和大规模生产重组腺相关病毒(recombinant adeno-associatedvirus，rAAV)颗粒的方法和组合物可用于研究、临床前和临床应用。
发明概述
重组AAV颗粒的生产可包括：培养细胞，向这些细胞引入AAV基因和期望被包装到rAAV颗粒中的目的基因，以及允许细胞包装(或生产)rAAV颗粒。包装或生产rAAV颗粒的细胞在本文中也称为“生产细胞(producer cell)”。被引入至生产细胞的AAV基因通常包括rep、cap、辅助基因和位于一个或更多个目的基因侧翼的反向末端重复(invertedterminal repeat，ITR)。在过去的十年中，来自多种天然血清型的许多AAV cap基因和变体已用于不同的基因治疗应用。相比之下，尚未探索rep和ITR序列的变异以及它们如何影响rAAV颗粒包装。本申请至少部分地与以下发现相关：rep和ITR序列二者均可改变以改善不同血清型的rAAV颗粒的包装。在一些实施方案中，如本申请中所述的重组Rep蛋白(例如，嵌合Rep蛋白)和/或其编码基因可用于生产包含重组rAAV核酸的rAAV颗粒，所述重组rAAV核酸包含如本申请中所述的以(例如，不同血清型的)ITR序列为侧翼的一个或更多个目的基因。
因此，在一个方面中，本文中提供了包含含有rep基因的核酸的组合物，其中所述rep基因是嵌合的。在一些实施方案中，rep基因包含N端和C端(c)。在一些实施方案中，N端包含N端结构域(n)、DNA结合结构域(d)和解旋酶结构域(h)。在一些实施方案中，C端包含NLS/p40启动子结构域(y)和锌指结构域(z)。在一些实施方案中，rep基因为血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV6、AAV12、AAV13、AAV1和AAV2、或AAV5和AAV2，或者是嵌合的。
在一些实施方案中，N端为AAV1血清型，并且C端为AAV2血清型。在一些实施方案中，N端为AAV2血清型，并且C端为AAV1血清型。在一些实施方案中，N端为AAV2血清型，并且C端为AAV5血清型。在一些实施方案中，N端为AAV5血清型，并且C端为AAV2血清型。
在一些实施方案中，n、d、y和z结构域为AAV2血清型，并且h结构域为AAV1血清型。在一些实施方案中，n、h、y和z结构域为AAV2血清型，并且d结构域为AAV1血清型。在一些实施方案中，d、h、y和z结构域为AAV2血清型，并且n结构域为AAV1血清型。在一些实施方案中，n、d和h结构域为AAV1血清型，并且y和z结构域为AAV1血清型。在一些实施方案中，d和h结构域为AAV1血清型，并且n、y和z结构域为AAV2血清型。在一些实施方案中，n和d结构域为AAV1血清型，并且h、y和z结构域为AAV2血清型。
在一些实施方案中，n、d和h结构域为AAV2血清型，并且y和z结构域为AAV3血清型。在一些实施方案中，n、d和h结构域为AAV2血清型且y和z结构域为AAV3血清型的rep基因具有起始密码子序列ACG。在一些实施方案中，rep基因为AAV3血清型，并且具有起始密码子序列ATG。
在一些实施方案中，rep基因为AAV4血清型，并且具有起始密码子序列ACG。
在一些实施方案中，rep基因为AAV2血清型，并且具有起始密码子序列ACG。
在一些实施方案中，n和h结构域为AAV8血清型，并且d、y和z结构域为AAV2血清型。在一些实施方案中，n和d结构域为AAV1血清型，并且h、y和z结构域为AAV2血清型。
在一些实施方案中，rep基因为AAV2血清型，并且具有起始密码子序列ACG。在一些实施方案中，rep基因为AAV7血清型，并且具有起始密码子序列ACG。
在一些实施方案中，n和h结构域为AAV8血清型且d、y和z结构域为AAV2血清型，并且rep基因具有起始密码子序列ATG。在一些实施方案中，n、h和d结构域为AAV1血清型且y和z结构域为AAV2血清型，并且rep基因具有起始密码子序列ATG。在一些实施方案中，n和h结构域为AAV8血清型；以下核苷酸在d结构域中缺失：根据SEQ ID NO：125的T574、C592、C607、A637、G644和C657(并且产生SEQ ID NO：126)；y和z结构域为AAV2血清型；并且rep基因具有起始密码子序列ATG。
在一些实施方案中，本文中所述的任一种组合物还包含含有cap基因的核酸。cap基因可为任何血清型(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13)。
在一些实施方案中，含有rep基因的核酸和含有cap基因的核酸包含在核酸载体中。在一些实施方案中，包含含有rep基因的核酸和含有cap基因的核酸的核酸载体还包含含有ITR对的核酸。在一些实施方案中，目的基因以ITR对为侧翼。
因此，在一个方面中，本文中提供了包装重组腺相关病毒(AAV)颗粒的方法，其包括使表达rep基因的细胞与包含反向末端重复(ITR)对的重组核酸接触，所述rep基因为第一血清型，所述反向末端重复(ITR)对为第二血清型。在一些实施方案中，通过用编码rep基因的核酸转染或感染细胞来表达rep基因。在一些实施方案中，rep基因是嵌合的。嵌合rep基因是包含多于一种AAV血清型的相应核酸碱基的rep基因。在一些实施方案中，rep基因为血清型1、2、3、4、6、12、13、1和2、或5和2。
在本文中公开的任一种方法的一些实施方案中，由为血清型1和2的rep基因编码的Rep蛋白包含在N端的为血清型1的氨基酸和在C端的为血清型2的氨基酸。在一些实施方案中，由为血清型1和2的rep基因编码的Rep蛋白包含在N端的为血清型2的氨基酸和在C端的为血清型1的氨基酸。在一些实施方案中，由为血清型2和5的rep基因编码的Rep蛋白包含在N端的为血清型2的氨基酸和在C端的为血清型5的氨基酸。在一些实施方案中，由为血清型5和2的rep基因编码的Rep蛋白包含在N端的为血清型5的氨基酸和在C端的为血清型2的氨基酸。
在本文中公开的任一种方法的一些实施方案中，rep基因的第一血清型为血清型1。在一些实施方案中，rep基因的第一血清型为血清型1，并且ITR的第二血清型为血清型1、2、3、4或7。在一些实施方案中，rep基因的第一血清型为血清型1，并且ITR的第二血清型为血清型1。在一些实施方案中，rep基因的第一血清型为血清型1，并且ITR的第二血清型为血清型2。在一些实施方案中，rep基因的第一血清型为血清型1，并且ITR的第二血清型为血清型3。在一些实施方案中，rep基因的第一血清型为血清型1，并且ITR的第二血清型为血清型4。在一些实施方案中，rep基因的第一血清型为血清型1，并且ITR的第二血清型为血清型7。
在本文中公开的任一种方法的一些实施方案中，ITR的第二血清型为血清型6。在本文中公开的任一种方法的一些实施方案中，ITR的第二血清型为血清型6，并且rep基因的第一血清型为血清型2、3、4、6、12或13。在本文中公开的任一种方法的一些实施方案中，ITR的第二血清型为血清型6，并且rep基因的第一血清型为血清型2。在本文中公开的任一种方法的一些实施方案中，ITR的第二血清型为血清型6，并且rep基因的第一血清型为血清型3。在本文中公开的任一种方法的一些实施方案中，ITR的第二血清型为血清型6，并且rep基因的第一血清型为血清型4。在本文中公开的任一种方法的一些实施方案中，ITR的第二血清型为血清型6，并且rep基因的第一血清型为血清型6。在本文中公开的任一种方法的一些实施方案中，ITR的第二血清型为血清型6，并且rep基因的第一血清型为血清型12。在本文中公开的任一种方法的一些实施方案中，ITR的第二血清型为血清型6，并且rep基因的第一血清型为血清型13。
在本文中公开的任一种方法的一些实施方案中，ITR的第二血清型为血清型1。在本文中公开的任一种方法的一些实施方案中，ITR的第二血清型为血清型1，并且rep基因的第一血清型为血清型2、3、4、12或13。在本文中公开的任一种方法的一些实施方案中，ITR的第二血清型为血清型1，并且rep基因的第一血清型为血清型2。在本文中公开的任一种方法的一些实施方案中，ITR的第二血清型为血清型1，并且rep基因的第一血清型为血清型3。在本文中公开的任一种方法的一些实施方案中，ITR的第二血清型为血清型1，并且rep基因的第一血清型为血清型4。在本文中公开的任一种方法的一些实施方案中，ITR的第二血清型为血清型1，并且rep基因的第一血清型为血清型12。在本文中公开的任一种方法的一些实施方案中，ITR的第二血清型为血清型1，并且rep基因的第一血清型为血清型13。
在一些实施方案中，由为血清型1和2的rep基因编码的Rep蛋白包含在N端的为血清型1的氨基酸和在C端的为血清型2的氨基酸，并且ITR的第二血清型为血清型1。在一些实施方案中，由为血清型1和2的rep基因编码的Rep蛋白包含在N端的为血清型1的氨基酸和在C端的为血清型2的氨基酸，并且ITR的第二血清型为血清型6。
在一些实施方案中，由为血清型2和1的rep基因编码的Rep蛋白包含在N端的为血清型2的氨基酸和在C端的为血清型1的氨基酸，并且ITR的第二血清型为血清型1。在一些实施方案中，由为血清型2和1的rep基因编码的Rep蛋白包含在N端的为血清型2的氨基酸和在C端的为血清型1的氨基酸，并且ITR的第二血清型为血清型6。
在一些实施方案中，由为血清型2和5的rep基因编码的Rep蛋白包含在N端的为血清型2的氨基酸和在C端的为血清型5的氨基酸，并且ITR的第二血清型为血清型2。
在一些实施方案中，由为血清型5和2的rep基因编码的Rep蛋白包含在N端的为血清型5的氨基酸和在C端的为血清型2的氨基酸，并且ITR的第二血清型为血清型5。
在一些实施方案中，n、d、y和z结构域为AAV2血清型，并且h结构域为AAV1血清型。在一些实施方案中，n、h、y和z结构域为AAV2血清型，并且d结构域为AAV1血清型。在一些实施方案中，d、h、y和z结构域为AAV2血清型，并且n结构域为AAV1血清型。在一些实施方案中，n、d和h结构域为AAV1血清型，并且y和z结构域为AAV1血清型。在一些实施方案中，d和h结构域为AAV1血清型，并且n、y和z结构域为AAV2血清型。在一些实施方案中，n和d结构域为AAV1血清型，并且h、y和z结构域为AAV2血清型。
在一些实施方案中，n、d和h结构域为AAV2血清型，并且y和z结构域为AAV3血清型。在一些实施方案中，n、d和h结构域为AAV2血清型且y和z结构域为AAV3血清型的rep基因具有起始密码子序列ACG。在一些实施方案中，rep基因为AAV3血清型，并且具有起始密码子序列ATG。
在一些实施方案中，rep基因为AAV4血清型，并且具有起始密码子序列ACG。
在一些实施方案中，rep基因为AAV2血清型，并且具有起始密码子序列ACG。
在一些实施方案中，n和h结构域为AAV8血清型，并且d、y和z结构域为AAV2血清型。在一些实施方案中，n和d结构域为AAV1血清型，并且h、y和z结构域为AAV2血清型。
在一些实施方案中，rep基因为AAV2血清型，并且具有起始密码子序列ACG。在一些实施方案中，rep基因为AAV7血清型，并且具有起始密码子序列ACG。
在一些实施方案中，n和h结构域为AAV8血清型且d、y和z结构域为AAV2血清型，并且rep基因具有起始密码子序列ATG。在一些实施方案中，n、h和d结构域为AAV1血清型且y和z结构域为AAV2血清型，并且rep基因具有起始密码子序列ATG。在一些实施方案中，n和h结构域为AAV8血清型；以下核苷酸在d结构域中缺失：根据SEQ ID NO：125的T574、C592、C607、A637、G644和C657(并且产生SEQ ID NO：126)；y和z结构域为AAV2血清型；并且rep基因具有起始密码子序列ATG。
在一些实施方案中，本文中所述的任一种组合物还包含含有cap基因的核酸。cap基因可为任何血清型(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13)。
在本文中公开的任一种方法的一些实施方案中，细胞还与包含cap基因的重组核酸接触。在本文中公开的任一种方法的一些实施方案中，表达rep基因并且与包含为第二血清型的反向末端重复(ITR)对之重组核酸接触的细胞还表达cap基因。
在一些方面中，本申请还提供了包含为第一血清型的rep基因和为第二血清型的ITR对的细胞。本文中提供的细胞可包含本文中公开的ITR和rep基因的任一种组合。在一些实施方案中，本文中提供的任一种细胞还包含cap基因。
附图简述
以下附图构成本说明书的一部分，并且被包括在内以进一步说明本申请的某些方面，通过参照这些附图中的一幅或更多幅并与本文中所示具体实施方案的详细描述相结合，可更好地理解这些方面。应理解，附图中所示的数据决不限制本申请的范围。
图1示出了为AAV血清型1至13的rep和ITR序列的比对。
图2示出了AAV ITR的结构，其在不同AAV血清型之间存在碱基对变异。RBE：Rep结合元件(Rep binding element)，AAV Rep78和Rep68蛋白在此结合。
图3示出了AAV1与AAV2 Rep蛋白序列同一性的图示。
图4是示出了标准AAV载体生产系统的示意图。
图5示出了针对AAV血清型1至9的AAV ITR和Rep78的百分比序列同一性分析。
图6示出了AAV基因组的概况，其被示出为以反向末端重复(ITR)为侧翼的两个开放阅读框。放大图示出了Rep蛋白的结构域和导致Rep78/68/52/40表达的转录物的图示。用于产生杂合体的rep基因的区域用小写字母表示：n＝N端，d＝DNA结合结构域，h＝解旋酶，c＝C端，y＝核定位信号(nuclear localization signal，NLS)/p40启动子，z＝锌指结构域。
图7A至7B示出了用于AAV1载体生产的rep基因的表征和优化。图7A示出了在rep基因中具有变异的AAV质粒设计的一些实例。pR2V1表示cap基因为AAV1序列且rep基因为AAV2序列的质粒。pR2h1V1表示cap基因为AAV1序列且rep基因除解旋酶结构域(h)为AAV1序列之外为AAV2序列的质粒。pR2d1V1表示cap基因为AAV1序列且rep基因除DNA结合结构域(d)为AAV1序列之外为AAV2序列的质粒。pR2n1V1表示cap基因为AAV1序列且rep基因除N端结构域(n)为AAV1序列之外为AAV2序列的质粒。pR1c2V1表示cap基因为AAV1序列且rep基因除由NLS/p40启动子结构域(y)和锌指结构域(z)组成的C端(c)为AAV2序列之外为AAV1序列的质粒。pR1hc2V1表示cap基因为AAV1序列且rep基因除C端(c)和解旋酶结构域(h)为AAV2序列之外为AAV1序列的质粒。pR1dc2V1表示cap基因为AAV1序列且rep基因除DNA结合结构域(d)和C端(c)为AAV2序列之外为AAV1序列的质粒。pR1nc2V1表示cap基因为AAV1序列且rep基因除N端结构域(n)和C端(c)为AAV2序列之外为AAV1序列的质粒。
图7B示出了图7A中所示质粒的基因组包装效率。基因组包装效率如下计算：与衣壳蛋白为血清型1且rep蛋白为血清型2的颗粒(参考)相比包装到rAAV颗粒中的基因组的量。
图8提供了新产生的AAV1生产质粒及其表型的概述。示出了质粒名称、rep基因的描述、VP表达和基因组包装效率。
图9A至9D提供了用于AAV3载体生产的rep基因的表征和优化。图9A是示出了具有天然存在的ACG起始密码子或ATG起始密码子的AAV2和AAV3 rep变异的一些实例的示意图。图9B示出了图9A中所示质粒的衣壳蛋白或VP蛋白和Rep蛋白的表达。在ACG起始密码子的情况下，AAV3 Rep78不可见。图9C提供了如图9A中所示的ACG-R2C3、ACG-R3V3和ATG-R3V3的每15cm板的载体基因组的产量(×1012)。图9D是示出了受试的AAV3表达质粒的质粒名称和描述的图。
图10A至10D提供了用于AAV4载体生产的rep基因的表征和优化。图10A是示出了具有天然存在的ACG起始密码子或ATG起始密码子的AAV2和AAV4 rep变异的一些实例的示意图。图10B示出了图10A中所示质粒的衣壳蛋白或VP蛋白和Rep蛋白的表达。星号表示A1抗体的已知交叉反应性。图10C提供了如图10A中所示的ACG-R2C3、ACG-R3V3和ATG-R3V3的每15cm板的载体基因组的产量(×1012)。图10D是示出了AAV4表达质粒的名称和描述的图。
图11A至11D提供了用于AAV5载体生产的rep基因的表征和优化。图11A是示出了具有天然存在的ACG起始密码子或ATG起始密码子的AAV2和AAV5 rep变异的一些实例的示意图。图11B示出了图10A中所示质粒的衣壳蛋白或VP蛋白和Rep蛋白的表达。在ACG起始密码子的情况下，AAV5 Rep78不可见。图11C示出了ACG-R2V5、ACG-R5V5和ATG-R5V5的每15cm板的质粒产量(×1012)。图10D是示出了AAV5表达质粒(其全部包含AAV5 cap基因)的名称和描述的图。
图12A至12D提供了用于AAV6载体生产的rep基因的表征和优化。图12A示出了所示质粒的衣壳蛋白或VP蛋白和Rep蛋白的表达，以及其相对于对照(未转染的细胞)的产量。图12B提供了R8d1c3V6和R1hc2V6相对于R2V6的基因组包装效率。图12C是示出了AAV6表达质粒的名称和描述的图。
图13A至13D提供了用于AAV7载体生产的rep基因的表征和优化。图13A是示出了具有天然存在的ACG起始密码子或ATG起始密码子的AAV2和AAV7 rep变异的一些实例的示意图。图13B示出了图13A中所示质粒的衣壳蛋白或VP蛋白和Rep蛋白的表达。图13C示出了ACG-R2V7、ACG-R7V7和ATG-R7V7的每15cm板的质粒产量(×1012)。图13D是示出了AAV7表达质粒的名称和描述的图。
图14A至14B提供了用于AAV8载体生产的rep基因的表征和优化。图14A示出了R2V8、R8c2V8、R1c2V8、R8n1c2V8、R8d1c2V8和R8h1c2V8的每15cm板的质粒产量(gp)。图14B示出了示例性AAV1、AAV2和AAV8 rep变异的示意图。
图15A至15B示出了与使用如本文中所述的rep嵌合体的载体生产相比的用于“标准”AAV载体生产的含基因组AAV8颗粒的比率的一个实例。
图16A是示出了AAV8表达质粒的名称和描述以及其相对于pR2V8的基因组包装效率和VP蛋白表达的图。图16B示出了对于图16A中列出的最后一个杂合体在AAV8的DNA结合(d)结构域中缺失的核苷酸。
发明详述
为了包装rAAV颗粒，将存在于两个侧翼ITR之间的病毒基因组替换为一个或更多个目的基因，以及一个或更多个控制序列(例如启动子)。通常，当构建rAAV颗粒时，待包装的基因以顺式活性ITR为侧翼，而rep和cap基因(其在野生型基因组中编码)可以以反式提供。cap基因编码使包装的遗传物质衣壳化的衣壳蛋白。rep基因编码参与病毒DNA复制的蛋白质。在过去的十年中，来自多种天然血清型的许多AAV cap基因和变体已用于不同的基因治疗应用。通常，为血清型2的ITR和rep基因用于包装多种血清型的rAAV颗粒。本申请提供了用于使用为不同血清型的ITR和rep基因包装rAAV颗粒的新的方法和组合物。本文中使用的“rAAV颗粒的包装”意指将以ITR为侧翼的核酸序列(其可包含一个或更多个目的基因)包装到rAAV颗粒中。
本申请的发明人已探索了ITR和rep基因的序列可如何改变以提高rAAV颗粒的包装。因此，本文中提供了包含为不同血清型的ITR和/或rep(包括嵌合rep基因)的核酸(例如，包含在载体例如质粒中)的组合物，其用于转染生产细胞以及表达血清型与用于生产rAAV颗粒的ITR的血清型不同的Rep蛋白的细胞。如本文中所定义的，“嵌合”AAV基因(例如，rep或cap)(也称为“杂合体”AAV基因)或“嵌合”AAV蛋白(例如，Rep(例如，Rep78、Rep68、Rep52或Rep40)或衣壳蛋白(例如，VP1、VP2和VP3))(也称为“杂合体”AAV蛋白)分别是核苷酸或氨基酸为多于一种AAV血清型的基因或蛋白质。
本文中还公开了使用为不同血清型的ITR和rep基因来提高rAAV颗粒包装的方法。在一些实施方案中，嵌合ITR和/或嵌合rep基因用于rAAV颗粒包装。
AAV结构
AAV基因组由正义或负义单链脱氧核糖核酸(single-strandeddeoxyribonucleic acid，ssDNA)构建。DNA链的每个末端处都存在反向末端重复(ITR)。在ITR之间有两个开放阅读框(open reading frame，ORF)：rep和cap。cap ORF包含衣壳蛋白VP1、VP2和VP3的重叠核苷酸序列，这些衣壳蛋白一起相互作用而形成二十面体对称衣壳。AAV颗粒的血清型归因于衣壳蛋白包含的序列。
图2示出了AAV ITR的结构。每个AAV ITR形成发夹，该发夹有助于所谓的自引发(self-priming)，其允许第二条DNA链进行不依赖于引发酶的合成。ITR是将AAV DNA整合到宿主DNA中、有效衣壳化以及产生完全组装的DNA酶抗性AAV颗粒所需的。通常认为要求ITR以顺式紧挨着一个或更多个期望被包装到rAAV颗粒中的基因。SEQ ID NO：1至7分别对应于血清型1至7(AAV1至AAV7)的野生型ITR序列的实例。
野生型AAV1 ITR的示例性序列：
Figure BPA0000294727170000101
野生型AAV2 ITR的示例性序列：
Figure BPA0000294727170000102
野生型AAV3 ITR的示例性序列：
Figure BPA0000294727170000103
野生型AAV4 ITR的示例性序列：
Figure BPA0000294727170000111
野生型AAV5 ITR的示例性序列：
Figure BPA0000294727170000112
野生型AAV6 ITR的示例性序列：
Figure BPA0000294727170000113
野生型AAV7 ITR的示例性序列：
Figure BPA0000294727170000114
rep ORF由编码AAV生命周期所需的Rep蛋白的四种重叠基因构成。四种Rep蛋白的名称示出了它们以千道尔顿(kilodalton，kDa)计的大小：Rep78、Rep68、Rep52和Rep40。Rep78和Rep68以自引发作用结合由ITR形成的发夹，并且在发夹内的特定区域(指定的末端分解位点)处切割。所有四种Rep蛋白均与ATP结合并且具有解旋酶活性。它们上调来自p40启动子的转录，并且下调p5和p19启动子二者的活性。
SEQ ID NO：8至20分别对应于为血清型1至13的野生型AAV rep基因的示例性序列。
SEQ ID NO：21至33分别对应于为血清型1至13的野生型AAV Rep78蛋白的示例性序列。Rep78具有621个氨基酸。Rep68由Rep78的第1至529位氨基酸和C端的序列LARGHSL(SEQ ID NO：38)构成。Rep52包含Rep78的第225至621位氨基酸。Rep40由Rep78的第225至621位氨基酸和C端的LARGHSL(SEQ ID NO：38)构成。
示例性的野生型AAV1 rep核酸序列：
Figure BPA0000294727170000121
示例性的野生型AAV2 rep核酸序列：
Figure BPA0000294727170000131
示例性的野生型AAV3 rep核酸序列：
Figure BPA0000294727170000132
Figure BPA0000294727170000141
示例性的野生型AAV4 rep核酸序列：
Figure BPA0000294727170000142
Figure BPA0000294727170000151
示例性的野生型AAV5 rep核酸序列：
Figure BPA0000294727170000152
示例性的野生型AAV6 rep核酸序列：
Figure BPA0000294727170000153
Figure BPA0000294727170000161
示例性的野生型AAV7 rep核酸序列：
Figure BPA0000294727170000162
Figure BPA0000294727170000171
示例性的野生型AAV8 rep核酸序列：
Figure BPA0000294727170000172
示例性的野生型AAVrH.8 rep核酸序列：
Figure BPA0000294727170000173
Figure BPA0000294727170000181
示例性的野生型AAV10 rep核酸序列：
Figure BPA0000294727170000182
Figure BPA0000294727170000191
示例性的野生型AAV11 rep核酸序列：
Figure BPA0000294727170000192
示例性的野生型AAV12 rep核酸序列：
Figure BPA0000294727170000201
示例性的野生型AAV13 rep核酸序列：
Figure BPA0000294727170000202
Figure BPA0000294727170000211
示例性的野生型AAV1 Rep78氨基酸序列：
Figure BPA0000294727170000212
示例性的野生型AAV2 Rep78氨基酸序列：
Figure BPA0000294727170000213
Figure BPA0000294727170000221
示例性的野生型AAV3 Rep78氨基酸序列：
Figure BPA0000294727170000222
示例性的野生型AAV4 Rep78氨基酸序列：
Figure BPA0000294727170000223
Figure BPA0000294727170000231
示例性的野生型AAV5 Rep78氨基酸序列：
Figure BPA0000294727170000232
示例性的野生型AAV6 Rep78氨基酸序列：
Figure BPA0000294727170000233
示例性的野生型AAV7 Rep78氨基酸序列：
Figure BPA0000294727170000234
Figure BPA0000294727170000241
示例性的野生型AAV8 Rep78氨基酸序列：
Figure BPA0000294727170000242
示例性的野生型AAVrh.8 Rep78氨基酸序列：
Figure BPA0000294727170000243
Figure BPA0000294727170000251
示例性的野生型AAV10 Rep78氨基酸序列：
Figure BPA0000294727170000252
示例性的野生型AAV11 Rep78氨基酸序列：
Figure BPA0000294727170000253
示例性的野生型AAV12 Rep78氨基酸序列：
Figure BPA0000294727170000261
示例性的野生型AAV13 Rep78氨基酸序列：
Figure BPA0000294727170000262
如本文中所限定的，rep基因或Rep蛋白包含N端和C端(c)，其中N端包含N端结构域(n)、DNA结合结构域(d)和解旋酶结构域(h)，并且C端(c)包含NLS/p40启动子结构域(y)和锌指结构域(z)。表1提供了不同AAV血清型的这些结构域的示例性序列。
表1：不同AAV血清型的rep基因和Rep蛋白结构域的示例性序列
Figure BPA0000294727170000271
Figure BPA0000294727170000281
Figure BPA0000294727170000291
Figure BPA0000294727170000301
Figure BPA0000294727170000311
Figure BPA0000294727170000321
Figure BPA0000294727170000331
Figure BPA0000294727170000341
Figure BPA0000294727170000351
Figure BPA0000294727170000361
Figure BPA0000294727170000371
Figure BPA0000294727170000381
Figure BPA0000294727170000391
Figure BPA0000294727170000401
Figure BPA0000294727170000411
Figure BPA0000294727170000421
Figure BPA0000294727170000431
Figure BPA0000294727170000441
Figure BPA0000294727170000451
Figure BPA0000294727170000461
Figure BPA0000294727170000471
Figure BPA0000294727170000481
Figure BPA0000294727170000491
Figure BPA0000294727170000501
Figure BPA0000294727170000511
Figure BPA0000294727170000521
Figure BPA0000294727170000531
Figure BPA0000294727170000541
在一些实施方案中，本文中公开了嵌合rep基因。在一些实施方案中，嵌合rep基因的至少一个结构域(例如，n、d、h、y或z)或至少一个末端(例如，N端或C端)的血清型不同于rep基因中大部分的血清型或者其他结构域或末端的血清型。在一些实施方案中，N端的血清型(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13)不同于C端的血清型(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13)。在一些实施方案中，N端为一种血清型，并且C端为第二种血清型(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13)。
在一些实施方案中，n结构域为AAV血清型1，并且d、h、y和z各自为除AAV1之外的血清型(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13)。例如，d、h、y和z结构域各自可为相同的血清型(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13)。在一些实施方案中，d、h、y和z结构域各自可以相对于彼此为不同的血清型，例如，d、h和y可为AAV2血清型，而z可为AAV3血清型。在一些实施方案中，n结构域为AAV血清型2，并且d、h、y和z结构域各自为除AAV2之外的血清型(例如，1、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13)。d、h、y和z结构域各自的血清型可以是相同的，或者可以是彼此不同的。在一些实施方案中，n结构域为AAV血清型3，并且d、h、y和z结构域各自为除AAV3之外的血清型(例如，1、2、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13)。d、h、y和z结构域各自的血清型可以是相同的，或者可以是彼此不同的。在一些实施方案中，n结构域为AAV血清型4，并且d、h、y和z结构域各自为除AAV4之外的血清型(例如，1、2、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13)。d、h、y和z结构域各自的血清型可以是相同的，或者可以是彼此不同的。在一些实施方案中，n结构域为AAV血清型5，并且d、h、y和z结构域各自为除AAV5之外的血清型(例如，1、2、3、4、6、7、8、9、10、11、12或13)。d、h、y和z结构域各自的血清型可以是相同的，或者可以是彼此不同的。在一些实施方案中，n结构域为AAV血清型6，并且d、h、y和z结构域各自为除AAV6之外的血清型(例如，1、2、3、4、5、7、8、9、10、11、12或13)。d、h、y和z结构域各自的血清型可以是相同的，或者可以是彼此不同的。在一些实施方案中，n结构域为AAV血清型7，并且d、h、y和z结构域各自为除AAV7之外的血清型(例如，1、2、3、4、5、6、8、9、10、11、12或13)。d、h、y和z结构域各自的血清型可以是相同的，或者可以是彼此不同的。在一些实施方案中，n结构域为AAV血清型8，并且d、h、y和z结构域各自为除AAV8之外的血清型(例如，1、2、3、4、5、6、7、9、10、11、12或13)。d、h、y和z结构域各自的血清型可以是相同的，或者可以是彼此不同的。在一些实施方案中，n结构域为AAV血清型9，并且d、h、y和z结构域各自为除AAV9之外的血清型(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、10、11、12或13)。d、h、y和z结构域各自的血清型可以是相同的，或者可以是彼此不同的。在一些实施方案中，n结构域为AAV血清型10，并且d、h、y和z结构域各自为除AAV10之外的血清型(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12或13)。d、h、y和z结构域各自的血清型可以是相同的，或者可以是彼此不同的。在一些实施方案中，n结构域为AAV血清型11，并且d、h、y和z结构域各自为除AAV11之外的血清型(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12或13)。d、h、y和z结构域各自的血清型可以是相同的，或者可以是彼此不同的。在一些实施方案中，n结构域为AAV血清型12，并且d、h、y和z结构域各自为除AAV12之外的血清型(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或13)。d、h、y和z结构域各自的血清型可以是相同的，或者可以是彼此不同的。在一些实施方案中，n结构域为AAV血清型13，并且d、h、y和z结构域各自为除AAV13之外的血清型(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12)。d、h、y和z结构域各自的血清型可以是相同的，或者可以是彼此不同的。
在一些实施方案中，d结构域为AAV血清型1，并且n、h、y和z各自为除AAV1之外的血清型(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13)。例如，n、h、y和z结构域各自可为相同的血清型(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13)。在一些实施方案中，n、h、y和z结构域各自可以相对于彼此是不同的血清型，例如，n、h和y可为AAV2血清型，而z可为AAV3血清型。在一些实施方案中，d结构域为AAV血清型2，并且n、h、y和z结构域各自为除AAV2之外的血清型(例如，1、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13)。n、h、y和z结构域各自的血清型可以是相同的，或者可以是彼此不同的。在一些实施方案中，d结构域为AAV血清型3，并且n、h、y和z结构域各自为除AAV3之外的血清型(例如，1、2、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13)。n、h、y和z结构域各自的血清型可以是相同的，或者可以是彼此不同的。在一些实施方案中，d结构域为AAV血清型4，并且n、h、y和z结构域各自为除AAV4之外的血清型(例如，1、2、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13)。n、h、y和z结构域各自的血清型可以是相同的，或者可以是彼此不同的。在一些实施方案中，d结构域为AAV血清型5，并且n、h、y和z结构域各自为除AAV5之外的血清型(例如，1、2、3、4、6、7、8、9、10、11、12或13)。n、h、y和z结构域各自的血清型可以是相同的，或者可以是彼此不同的。在一些实施方案中，n结构域为AAV血清型6，并且n、h、y和z结构域各自为除AAV6之外的血清型(例如，1、2、3、4、5、7、8、9、10、11、12或13)。n、h、y和z结构域各自的血清型可以是相同的，或者可以是彼此不同的。在一些实施方案中，d结构域为AAV血清型7，并且n、h、y和z结构域各自为除AAV7之外的血清型(例如，1、2、3、4、5、6、8、9、10、11、12或13)。n、h、y和z结构域各自的血清型可以是相同的，或者可以是彼此不同的。在一些实施方案中，n结构域为AAV血清型8，并且n、h、y和z结构域各自为除AAV8之外的血清型(例如，1、2、3、4、5、6、7、9、10、11、12或13)。n、h、y和z结构域各自的血清型可以是相同的，或者可以是彼此不同的。在一些实施方案中，d结构域为AAV血清型9，并且n、h、y和z结构域各自为除AAV9之外的血清型(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、10、11、12或13)。n、h、y和z结构域各自的血清型可以是相同的，或者可以是彼此不同的。在一些实施方案中，d结构域为AAV血清型10，并且n、h、y和z结构域各自为除AAV10之外的血清型(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12或13)。n、h、y和z结构域各自的血清型可以是相同的，或者可以是彼此不同的。在一些实施方案中，d结构域为AAV血清型11，并且n、h、y和z结构域各自为除AAV11之外的血清型(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12或13)。n、h、y和z结构域各自的血清型可以是相同的，或者可以是彼此不同的。在一些实施方案中，d结构域为AAV血清型12，并且n、h、y和z结构域各自为除AAV12之外的血清型(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或13)。n、h、y和z结构域各自的血清型可以是相同的，或者可以是彼此不同的。在一些实施方案中，d结构域为AAV血清型13，并且n、h、y和z结构域各自为除AAV13之外的血清型(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12)。n、h、y和z结构域各自的血清型可以是相同的，或者可以是彼此不同的。
在一些实施方案中，h结构域为AAV血清型1，并且d、n、y和z各自为除AAV1之外的血清型(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13)。例如，d、n、y和z结构域各自可为相同的血清型(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13)。在一些实施方案中，d、n、y和z结构域各自可以相对于彼此是不同的血清型，例如，d、n和y可为AAV2血清型，而z可为AAV3血清型。在一些实施方案中，h结构域为AAV血清型2，并且d、n、y和z结构域各自为除AAV2之外的血清型(例如，1、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13)。d、n、y和z结构域各自的血清型可以是相同的，或者可以是彼此不同的。在一些实施方案中，h结构域为AAV血清型3，并且d、n、y和z结构域各自为除AAV3之外的血清型(例如，1、2、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13)。d、n、y和z结构域各自的血清型可以是相同的，或者可以是彼此不同的。在一些实施方案中，h结构域为AAV血清型4，并且d、n、y和z结构域各自为除AAV4之外的血清型(例如，1、2、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13)。d、n、y和z结构域各自的血清型可以是相同的，或者可以是彼此不同的。在一些实施方案中，h结构域为AAV血清型5，并且d、n、y和z结构域各自为除AAV5之外的血清型(例如，1、2、3、4、6、7、8、9、10、11、12或13)。d、n、y和z结构域各自的血清型可以是相同的，或者可以是彼此不同的。在一些实施方案中，h结构域为AAV血清型6，并且d、n、y和z结构域各自为除AAV6之外的血清型(例如，1、2、3、4、5、7、8、9、10、11、12或13)。d、n、y和z结构域各自的血清型可以是相同的，或者可以是彼此不同的。在一些实施方案中，h结构域为AAV血清型7，并且d、n、y和z结构域各自为除AAV7之外的血清型(例如，1、2、3、4、5、6、8、9、10、11、12或13)。d、n、y和z结构域各自的血清型可以是相同的，或者可以是彼此不同的。在一些实施方案中，h结构域为AAV血清型8，并且d、n、y和z结构域各自为除AAV8之外的血清型(例如，1、2、3、4、5、6、7、9、10、11、12或13)。d、n、y和z结构域各自的血清型可以是相同的，或者可以是彼此不同的。在一些实施方案中，h结构域为AAV血清型9，并且d、n、y和z结构域各自为除AAV9之外的血清型(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、10、11、12或13)。d、n、y和z结构域各自的血清型可以是相同的，或者可以是彼此不同的。在一些实施方案中，h结构域为AAV血清型10，并且d、n、y和z结构域各自为除AAV10之外的血清型(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12或13)。d、n、y和z结构域各自的血清型可以是相同的，或者可以是彼此不同的。在一些实施方案中，h结构域为AAV血清型11，并且d、n、y和z结构域各自为除AAV11之外的血清型(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12或13)。d、n、y和z结构域各自的血清型可以是相同的，或者可以是彼此不同的。在一些实施方案中，h结构域为AAV血清型12，并且d、n、y和z结构域各自为除AAV12之外的血清型(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或13)。d、n、y和z结构域各自的血清型可以是相同的，或者可以是彼此不同的。在一些实施方案中，h结构域为AAV血清型13，并且d、n、y和z结构域各自为除AAV13之外的血清型(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12)。d、n、y和z结构域各自的血清型可以是相同的，或者可以是彼此不同的。
在一些实施方案中，y结构域为AAV血清型1，并且n、d、h和z各自为除AAV1之外的血清型(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13)。例如，n、d、h和z结构域各自可为相同的血清型(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13)。在一些实施方案中，n、d、h和z结构域各自可以相对于彼此是不同的血清型，例如，d、h可为AAV2血清型，而z可为AAV3血清型。在一些实施方案中，y结构域为AAV血清型2，并且n、d、h和z结构域各自为除AAV2之外的血清型(例如，1、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13)。n、d、h和z结构域各自的血清型可以是相同的，或者可以是彼此不同的。在一些实施方案中，y结构域为AAV血清型3，并且n、d、h和z结构域各自为除AAV3之外的血清型(例如，1、2、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13)。n、d、h和z结构域各自的血清型可以是相同的，或者可以是彼此不同的。在一些实施方案中，y结构域为AAV血清型4，并且n、d、h和z结构域各自为除AAV4之外的血清型(例如，1、2、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13)。n、d、h和z结构域各自的血清型可以是相同的，或者可以是彼此不同的。在一些实施方案中，y结构域为AAV血清型5，并且n、d、h和z结构域各自为除AAV5之外的血清型(例如，1、2、3、4、6、7、8、9、10、11、12或13)。n、d、h和z结构域各自的血清型可以是相同的，或者可以是彼此不同的。在一些实施方案中，y结构域为AAV血清型6，并且n、d、h和z结构域各自为除AAV6之外的血清型(例如，1、2、3、4、5、7、8、9、10、11、12或13)。n、d、h和z结构域各自的血清型可以是相同的，或者可以是彼此不同的。在一些实施方案中，y结构域为AAV血清型7，并且n、d、h和z结构域各自为除AAV7之外的血清型(例如，1、2、3、4、5、6、8、9、10、11、12或13)。n、d、h和z结构域各自的血清型可以是相同的，或者可以是彼此不同的。在一些实施方案中，y结构域为AAV血清型8，并且n、d、h和z结构域各自为除AAV8之外的血清型(例如，1、2、3、4、5、6、7、9、10、11、12或13)。n、d、h和z结构域各自的血清型可以是相同的，或者可以是彼此不同的。在一些实施方案中，y结构域为AAV血清型9，并且n、d、h和z结构域各自为除AAV9之外的血清型(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、10、11、12或13)。n、d、h和z结构域各自的血清型可以是相同的，或者可以是彼此不同的。在一些实施方案中，y结构域为AAV血清型10，并且n、d、h和z结构域各自为除AAV10之外的血清型(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12或13)。n、d、h和z结构域各自的血清型可以是相同的，或者可以是彼此不同的。在一些实施方案中，y结构域为AAV血清型11，并且n、d、h和z结构域各自为除AAV11之外的血清型(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12或13)。n、d、h和z结构域各自的血清型可以是相同的，或者可以是彼此不同的。在一些实施方案中，y结构域为AAV血清型12，并且n、d、h和z结构域各自为除AAV12之外的血清型(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或13)。n、d、h和z结构域各自的血清型可以是相同的，或者可以是彼此不同的。在一些实施方案中，y结构域为AAV血清型13，并且n、d、h和z结构域各自为除AAV13之外的血清型(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12)。n、d、h和z结构域各自的血清型可以是相同的，或者可以是彼此不同的。
在一些实施方案中，z结构域为AAV血清型1，并且n、d、h和y各自为除AAV1之外的血清型(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13)。例如，n、d、h和y结构域各自可为相同的血清型(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13)。在一些实施方案中，n、d、h和y结构域各自可以相对于彼此是不同的血清型，例如，d、h可为AAV2血清型，而z可为AAV3血清型。在一些实施方案中，z结构域为AAV血清型2，并且n、d、h和y结构域各自为除AAV2之外的血清型(例如，1、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13)。n、d、h和y结构域各自的血清型可以是相同的，或者可以是彼此不同的。在一些实施方案中，z结构域为AAV血清型3，并且n、d、h和y结构域各自为除AAV3之外的血清型(例如，1、2、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13)。n、d、h和y结构域各自的血清型可以是相同的，或者可以是彼此不同的。在一些实施方案中，z结构域为AAV血清型4，并且n、d、h和y结构域各自为除AAV4之外的血清型(例如，1、2、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13)。n、d、h和y结构域各自的血清型可以是相同的，或者可以是彼此不同的。在一些实施方案中，z结构域为AAV血清型5，并且n、d、h和y结构域各自为除AAV5之外的血清型(例如，1、2、3、4、6、7、8、9、10、11、12或13)。n、d、h和y结构域各自的血清型可以是相同的，或者可以是彼此不同的。在一些实施方案中，z结构域为AAV血清型6，并且n、d、h和y结构域各自为除AAV6之外的血清型(例如，1、2、3、4、5、7、8、9、10、11、12或13)。n、d、h和y结构域各自的血清型可以是相同的，或者可以是彼此不同的。在一些实施方案中，z结构域为AAV血清型7，并且n、d、h和y结构域各自为除AAV7之外的血清型(例如，1、2、3、4、5、6、8、9、10、11、12或13)。n、d、h和y结构域各自的血清型可以是相同的，或者可以是彼此不同的。在一些实施方案中，z结构域为AAV血清型8，并且n、d、h和y结构域各自为除AAV8之外的血清型(例如，1、2、3、4、5、6、7、9、10、11、12或13)。n、d、h和y结构域各自的血清型可以是相同的，或者可以是彼此不同的。在一些实施方案中，z结构域为AAV血清型9，并且n、d、h和y结构域各自为除AAV9之外的血清型(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、10、11、12或13)。n、d、h和y结构域各自的血清型可以是相同的，或者可以是彼此不同的。在一些实施方案中，z结构域为AAV血清型10，并且n、d、h和y结构域各自为除AAV10之外的血清型(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12或13)。n、d、h和y结构域各自的血清型可以是相同的，或者可以是彼此不同的。在一些实施方案中，z结构域为AAV血清型11，并且n、d、h和y结构域各自为除AAV11之外的血清型(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12或13)。n、d、h和y结构域各自的血清型可以是相同的，或者可以是彼此不同的。在一些实施方案中，z结构域为AAV血清型12，并且n、d、h和y结构域各自为除AAV12之外的血清型(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或13)。n、d、h和y结构域各自的血清型可以是相同的，或者可以是彼此不同的。在一些实施方案中，z结构域为AAV血清型13，并且n、d、h和y结构域各自为除AAV13之外的血清型(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12)。n、d、h和y结构域各自的血清型可以是相同的，或者可以是彼此不同的。
图7至16提供了嵌合rep基因的一些实例。应理解，任意结构域组合可为与其他结构域的血清型不同的血清型。例如，仅一个结构域可具有与其他结构域的血清型不同的血清型。在一些实施方案中，所有五个结构域具有不同的血清型。在一些实施方案中，嵌合rep基因的结构域为两种不同的血清型(例如，R1h2，即，h结构域为AAV2且其他结构域为AAV1)。在一些实施方案中，嵌合rep基因的结构域为三种不同的血清型(例如，R1c3h4，即，C端为AAV3，h结构域为AAV4且n和d结构域为AA1)。在一些实施方案中，嵌合rep基因的结构域为四种不同的血清型(例如，R1h2d3y4，即，h结构域为AA2，d结构域为AAV3，y结构域为AAV3，且n和y结构域为AAV1)。在一些实施方案中，嵌合rep基因的结构域为五种不同的血清型(例如，R1n2d3h4y8)。
在一些实施方案中，结构域是截短的。在一些实施方案中，嵌合rep基因的结构域在该结构域的N末端被截短。在一些实施方案中，嵌合rep基因在该结构域的C末端被截短。在一些实施方案中，结构域被修饰，以使得缺失不连续的核苷酸。在一些实施方案中，结构域被截短1至18个核苷酸(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个核苷酸)。例如，d结构域可在N末端或C末端被截短6个核苷酸。
在一些实施方案中，本文中所述的任一rep基因包含具有序列ACG的起始密码子。在一些实施方案中，本文中所述的任一rep基因包含具有除ACG之外或不同于ACG的序列的起始密码子。在一些实施方案中，具有不同于ACG的序列的起始密码子是ATG。
还应理解，本公开内容还提供了由本文中公开的任一种嵌合rep基因编码的任何嵌合Rep蛋白，以及可编码本文中公开的任一种嵌合Rep蛋白的任何嵌合rep基因。
在本申请的一些实施方案中，Rep蛋白是嵌合的，因为其包含来自多于一种AAV血清型的氨基酸序列。在一些实施方案中，嵌合Rep蛋白可以包含含有来自一种AAV血清型(例如，AAV1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13)的氨基酸的N端和含有来自另一种AAV血清型(例如，AAV1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13)的氨基酸的C端。例如，Rep蛋白可包含含有AAV1 Rep蛋白的相应氨基酸的N端和含有AAV2 Rep蛋白的相应氨基酸的C端(例如，Rep78的SEQ ID NO：34包含AAV1的N端和AAV2的C端)。Rep蛋白可包含含有AAV2 Rep蛋白的相应氨基酸的N端和含有AAV1 Rep蛋白的相应氨基酸的C端(例如，Rep78的SEQ ID NO：35包含AAV2的N端和AAV1的C端)。在另一个非限制性实例中，Rep蛋白包含含有AAV2 Rep蛋白的相应氨基酸的N端和含有AAV5 Rep蛋白的相应氨基酸的C端(例如，Rep78的SEQ ID NO：36包含AAV2的N端和AAV5的C端)。在另一个非限制性实例中，Rep蛋白包含含有AAV5 Rep蛋白的相应氨基酸的N端和含有AAV2 Rep蛋白的相应氨基酸的C端(例如，Rep78的SEQ ID NO：37包含AAV5的N端和AAV2的C端)。在一些实施方案中，Rep蛋白包含多于两种AAV血清型(例如，三种、四种或五种AAV血清型)的相应氨基酸。包含三种AAV血清型的相应氨基酸的Rep蛋白的一个非限制性实例是具有来自AAV1、AAV2和AAV5的相应氨基酸的Rep蛋白。本文中使用的术语“相应氨基酸”意指在不同AAV血清型的氨基酸序列中彼此比对的位置处的氨基酸。在一些实施方案中，两种AAV血清型之间的相应氨基酸具有相同的位置。在一些实施方案中，两种AAV血清型之间的相应氨基酸处于彼此移动1至5个氨基酸的位置处。对氨基酸序列进行比对的方法在本领域中是已知的，并且进行这样的比对的算法也是容易获得的。参见例如，MichaelS.Rosenberg，Sequence Alignment：Methods，Models，Concepts，and Strategies，2009，http：//www.jstor.org/stable/10.1525/j.ctt1pps7t。例如，可使用Protein BLAST(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PROGRAM＝blastp&PAGE_TYPE＝ BlastSearch&BLAST_SPEC＝blast2seq&LINK_LOC＝blasttab)进行AAV ITR和/或Rep蛋白的比对。
示例性的具有AAV1 N端和AAV2 C端的Rep78氨基酸序列：
Figure BPA0000294727170000631
示例性的具有AAV2 N端和AAV1 C端的Rep78氨基酸序列：
Figure BPA0000294727170000632
示例性的具有AAV2 N端和AAV5 C端的Rep78氨基酸序列：
Figure BPA0000294727170000641
示例性的具有AAV5 N端和AAV2 C端的Rep78氨基酸序列：
Figure BPA0000294727170000642
非限制性嵌合Rep蛋白和编码其的核酸序列的实例：
R1c2氨基酸序列：
Figure BPA0000294727170000651
R1hc2氨基酸：
Figure BPA0000294727170000652
R2d1氨基酸：
Figure BPA0000294727170000661
R2h1氨基酸：
Figure BPA0000294727170000662
R8d1c2氨基酸：
Figure BPA0000294727170000671
R8p1/2c2氨基酸：
Figure BPA0000294727170000672
R1c2基因序列：
Figure BPA0000294727170000681
Figure BPA0000294727170000691
R1hc2基因序列：
Figure BPA0000294727170000692
Figure BPA0000294727170000701
R2d1基因序列：
Figure BPA0000294727170000702
Figure BPA0000294727170000711
R2h1基因序列：
Figure BPA0000294727170000712
Figure BPA0000294727170000721
R8d1c2基因序列：
Figure BPA0000294727170000722
Figure BPA0000294727170000731
R8p1/2c2基因序列：
Figure BPA0000294727170000732
Figure BPA0000294727170000741
包装颗粒的方法
生产rAAV颗粒的方法是本领域已知的，并且试剂是可商购获得的(参见，例如，Zolotukhin et al.Production and purification of serotype 1，2，and 5recombinant adeno-associated viral vectors.Methods 28(2002)158-167；和美国专利公开号US20070015238和US20120322861，其通过引用并入本文；以及质粒和试剂盒可从ATCC和Cell Biolabs，Inc.获得)。
通常，rAAV生产涉及：培养细胞，引入AAV基因和期望被包装到细胞中的任何目的基因(例如，以ITR为侧翼的)以及允许细胞生产或包装rAAV。最后一个步骤之后是收获rAAV颗粒和随后的纯化步骤。AAV基因和期望被包装到rAAV颗粒中的任何基因可通过转染方法(例如，使用质粒载体和转染剂)或感染方法(例如，使用病毒载体)引入到细胞。
在一些实施方案中，一个或更多个目的基因、rep基因(例如，编码野生型或重组Rep蛋白，例如如本申请中所述的嵌合Rep蛋白)、cap基因和辅助基因(例如，E1a基因、E1b基因、E4基因、E2a基因和VA基因)被引入到细胞，其中所述基因包含在一种或更多种载体(例如质粒)中，以使得细胞被所述载体转染或感染。为清楚起见，辅助基因是编码辅助蛋白E1a、E1b、E4、E2a和VA的基因。在一些实施方案中，仅一个或更多个目的基因和与其可操作地连接的控制元件包含在一个载体中，而rep、cap和辅助基因中的一个或更多个包含在一个或更多个独立的载体中。例如，第一载体可包含一个或更多个目的基因，而第二载体可包含rep、cap和辅助基因。在一些实施方案中，第一载体可包含一个或更多个目的基因，而第二载体可包含rep，并且第三载体可包含辅助基因和cap。在一些实施方案中，第一载体可包含一个或更多个目的基因，而第二载体可包含rep，第三载体可包含辅助基因，并且第四载体可包含cap。
在一些实施方案中，用于将目的基因或AAV基因递送至生产细胞的核酸载体是环状的。在一些实施方案中，核酸载体是单链的。在一些实施方案中，核酸载体是双链的。在一些实施方案中，双链核酸载体可以是例如自互补型(self-complimentary)载体，其包含与核酸载体的一个区域互补从而引起形成双链核酸载体的另一核酸载体区域。
在本文中公开的任一种方法的一些实施方案中，以ITR为侧翼的核酸区域(例如，异源核酸区域)包含一个或更多个目的基因。以ITR为侧翼的核酸区域还可包含与一个或更多个目的基因可操作地连接的控制元件。在一些实施方案中，rep基因或cap基因或者rep和cap基因两者以ITR为侧翼。
在一些实施方案中，引入一个或更多个目的基因的细胞已包含可用于包装rAAV颗粒的一个rep基因、cap基因和/或辅助基因中的一个或更多个。作为一个非限制性实例，细胞可已包含rep并且表达Rep蛋白Rep78、Rep68、Rep52和Rep40。可向这样的表达Rep蛋白的细胞引入包含以ITR为侧翼的目的基因的载体，以及表达cap和辅助基因的载体。在一些实施方案中，细胞可已包含rep和辅助基因。
转染细胞的方法是本领域已知的。转染细胞的一些非限制性方法是CaPO4介导的转染、使用脂质或聚合物分子(例如聚乙烯亚胺(Polyethylenimine，PEI))进行的转染以及电穿孔。还可使用病毒载体(例如HSV载体或杆状病毒)向细胞引入核酸。
将一个或更多个目的基因、rep基因、cap基因和辅助基因中的一个或更多个以其通过转染或感染进入细胞的方式引入到细胞之后，在rAAV颗粒将在细胞中生产并从细胞逃脱的条件下孵育细胞。然后可使用本领域已知或本文中所述的任何方法，例如通过碘克沙醇逐步梯度、CsCl梯度、色谱法或聚乙二醇(PEG)沉淀来纯化rAAV颗粒。
使用为不同血清型的ITR和rep的组合和或嵌合rep基因来提高AAV颗粒的包装
在此公开的是为不同血清型的rep和ITR的组合，以使得它们用于生产或包装rAAV颗粒的任何方法与使用为相同血清型的ITR和rep基因的相似条件相比均产生更高的包装或生产效率。因此，本文中还公开了包装rAAV颗粒的方法，其包括使表达rep基因的细胞与包含ITR对的重组核酸接触，所述rep基因为第一血清型，所述ITR对为第二血清型。在一些实施方案中，第一血清型和第二血清型是相同的。在一些实施方案中，第一和第二血清型是不同的。
在本文中公开的任一种rAAV颗粒生产方法的一些实施方案中，通过用编码rep基因的核酸转染或感染本文中公开的任一种生产细胞来在该细胞中表达rep基因。
在一些实施方案中，rep基因的第一血清型为血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12和13中的任一种。在一些实施方案中，AAV ITR的第二血清型为血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12和13中的任一种。在一些实施方案中，rep的第一血清型中的任一种与ITR的任何血清型一起使用。例如，为血清型1的rep可与为血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12和13中任一种的ITR一起使用。作为另一实例，为血清型2的rep可与为血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12和13中任一种的ITR一起使用，等等。
在一些实施方案中，为血清型1的rep与为血清型1、2、3、4或7的ITR一起使用。
在一些实施方案中，为血清型6的ITR与为血清型2、3、4、6、12或13的rep一起使用。在一些实施方案中，为血清型1的ITR与为血清型2、3、4、12或13的rep一起使用。
在一些实施方案中，rep基因是嵌合的。嵌合AAV基因是包含多于一种血清型的氨基酸的AAV基因。SEQ ID NO：34至37提供了嵌合Rep78蛋白的一些实例。在一些实施方案中，为血清型6的ITR与为血清型1和2的嵌合rep一起使用。在一些实施方案中，为血清型1的ITR与为血清型1和2的嵌合rep一起使用。在一些实施方案中，为血清型2的ITR与为血清型2和5的嵌合rep一起使用。在一些实施方案中，为血清型5的ITR与为血清型2和5的嵌合rep一起使用。
嵌合rep基因和Rep蛋白在上文进行描述，并且可用于本文中所述的任一种包装rAAV颗粒的方法中。
在一些实施方案中，嵌合Rep蛋白可包含在N端的为第一血清型的相应氨基酸和在C端的为第二血清型的相应氨基酸。例如，Rep蛋白可包含在N端的为血清型1的氨基酸和在C端的为血清型2的氨基酸。在一些实施方案中，Rep蛋白可包含在N端的为血清型2的氨基酸和在C端的为血清型1的氨基酸。在一些实施方案中，Rep蛋白可包含在N端的为血清型2的氨基酸和在C端的为血清型5的氨基酸。在一些实施方案中，Rep蛋白可包含在N端的为血清型5的氨基酸和在C端的为血清型2的氨基酸。应理解，嵌合rep基因可与为任何血清型的ITR组合使用以生产任何血清型或假血清型的rAAV颗粒。表2提供了可与不同血清型的ITR一起使用以提高rAAV颗粒生产的rep血清型的组合的一些实例。应理解，除了表2中提供的ITR和rep基因的组合之外，任一种嵌合rep基因或嵌合Rep蛋白均可与本文中所述的任一种ITR组合使用，其转而可与本文中所述的任一种cap基因和衣壳蛋白一起使用以生产rAAV颗粒。
表2.待产生和测试的ITR与Rep组合(包括嵌合体的一些实例)的一些实例
1.AAV1_ITR+AAV1_Rep
2.AAV2_ITR+AAV1_Rep
3.AAV3_ITR+AAV1_Rep
4.AAV4_ITR+AAV1_Rep
5.AAV7_ITR+AAV1_Rep
6.AAV6_ITR+AAV2_Rep
7.AAV6_ITR+AAV3_Rep
8.AAV6_ITR+AAV4_Rep
9.AAV6_ITR+AAV6_Rep
10.AAV6_ITR+AAV12_Rep
11.AAV6_ITR+AAV13_Rep
12.AAV1_ITR+AAV2_Rep
13.AAV1_ITR+AAV3_Rep
14.AAV1_ITR+AAV4_Rep
15.AAV1_ITR+AAV12_Rep
16.AAV1_ITR+AAV13_Rep
17.AAV6_ITR+AAV1N/2C_嵌合_Rep
18.AAV1_ITR+AAV1N/2C_嵌合_Rep
19.AAV6_ITR+AAV2N/1C_嵌合_Rep
20.AAV1_ITR+AAV2N/1C_嵌合_Rep
21.AAV2_ITR+AAV2N/5C_嵌合_Rep
22.AAV5_ITR+AAV5N/2C_嵌合_Rep
生产细胞
本文中提供了用于使用如本文中公开的为不同血清型的ITR、cap和/或rep的组合来生产rAAV颗粒的细胞。因此，在一些实施方案中，本文中公开的生产细胞包含为第一AAV血清型的rep和为第二AAV血清型的ITR。在一些实施方案中，本文中公开的生产细胞包含rep与ITR的组合，其中rep和ITR的血清型是本文中公开的任一种组合。
在一些实施方案中，包装在辅助细胞或生产细胞，例如哺乳动物细胞或昆虫细胞中进行。示例性的哺乳动物细胞包括但不限于HEK293细胞、COS细胞、HeLa细胞、BHK细胞或CHO细胞(参见，例如，
Figure BPA0000294727170000791
CRL-1573TM、
Figure BPA0000294727170000792
CRL-1651TM、
Figure BPA0000294727170000793
CRL-1650TM、
Figure BPA0000294727170000794
CCL-2、
Figure BPA0000294727170000795
CCL-10TM或
Figure BPA0000294727170000796
CCL-61TM)。示例性昆虫细胞包括但不限于Sf9细胞(参见，例如，
Figure BPA0000294727170000797
CRL-1711TM)。辅助细胞可包含用于本文中所述方法的编码Rep蛋白和/或Cap蛋白的rep和/或cap基因。在一些实施方案中，包装在体外进行。
rAAV颗粒产量的提高
与除ITR和Rep蛋白的血清型的特定组合之外相同的rAAV生产方法相比，通过使用本文中所述的任一种方法，重组AAV颗粒的产量可提高。在一些实施方案中，颗粒产量由生产的rAAV颗粒的量限定。在一些实施方案中，颗粒产量由生产的完整rAAV颗粒(即，包含核酸或基因组的颗粒)的量限定。在一些实施方案中，相对于使用为血清型2的ITR包装rAAV时，rAAV颗粒的产量提高。在一些实施方案中，与其中使用为血清型2的ITR的rAAV生产方法相比，涉及ITR和Rep蛋白的血清型的任一种特定组合的rAAV生产的产量可提高2％至20％(例如，2％至4％、2％至10％、5％至10％、5％至20％、15％至20％或10％至20％)，或者甚至提高高至5至10倍或100倍或更多(例如，高至2倍、高至3倍、高至5倍、高至10倍、高至20倍、高至50倍或高至100倍或更高)。
与使用血清型是最接近嵌合基因中大多数核苷酸的野生型血清型的rep基因的生产方法所生产的rAAV颗粒相比，通过使用本文中所述的任一种嵌合rep基因，重组AAV颗粒的产量可提高。例如，使用为AAV2的ITR、为AAV3的cap和除h结构域为血清型8之外为血清型2的嵌合rep(R2h8)生产的颗粒的包装或颗粒产量可与使用为AAV2的ITR、为AAV3的cap和为AAV2的rep生产的颗粒的包装产量进行比较。在一些实施方案中，本文中所述的包装产量与用为AAV2的ITR和为AAV2的rep制备的为相同血清型的颗粒的包装产量进行比较。在一些实施方案中，通过使用本文中所述的任一种嵌合rep基因获得的颗粒产量提高了至少1.5倍(例如，至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或至少10倍)。
测量rAAV颗粒包装的方法是本领域已知的。例如，可使用例如PCR(例如定量PCR)的方法来测量基因组的量。可使用基于蛋白质的测定(例如ELISA)测量衣壳或颗粒的量。在一些实施方案中，电子显微术(例如，冷冻电子显微术)可用于区分视觉上空的衣壳与完整的衣壳(即，包含核酸或基因组的衣壳)。
cap基因和衣壳蛋白
rAAV颗粒或rAAV制备物中的颗粒可为任何AAV血清型，包括任何衍生型(derivative)或假型(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、2/1、2/5、2/8、2/9、3/1、3/5、3/8或3/9)。cap基因可用于包装rAAV基因组或本文中所述的以任一种ITR为侧翼的任何目的基因。因此，由本文中所述的任一种方法生产的rAAV颗粒可为任何血清型或假型，其反过来可使用本文中所述的任一种嵌合rep基因。使用本文中公开的任一种方法(例如，用在此描述的任一种rep基因、任一种cap基因和/或任一种ITR)生产的rAAV颗粒可用于将目的基因递送至细胞(例如，对象体内的细胞或体外细胞)或在对象中治疗病症或疾病。
rAAV病毒颗粒的血清型是指重组病毒的衣壳蛋白的血清型。衍生型和假型的一些非限制性实例包括rAAV2/1、rAAV2/5、rAAV2/8、rAAV2/9、AAV2-AAV3杂合体、AAVrh.10、AAVhu.14、AAV3a/3b、AAVrh32.33、AAV-HSC15、AAV-HSC17、AAVhu.37、AAVrh.8、CHt-P6、AAV2.5、AAV6.2、AAV2i8、AAV-HSC15/17、AAVM41、AAV9.45、AAV6(Y445F/Y731F)、AAV2.5T、AAV-HAE1/2、AAV克隆32/83、AAVShH10、AAV2(Y-＞F)、AAV8(Y733F)、AAV2.15、AAV2.4、AAVM41和AAVr3.45。在一些实施方案中，cap蛋白具有一个或更多个氨基酸替换。这样的AAV血清型和衍生型/假型，以及生产这样的衍生型/假型的方法是本领域已知的(参见，例如，Mol Ther.2012 Apr；20(4)：699-708.doi：10.1038/mt.2011.287.Epub 2012 Jan 24.TheAAV vector toolkit：poised at the clinical crossroads.Asokan A1，Schaffer DV，Samulski RJ.)。在一些实施方案中，rAAV颗粒是假型化rAAV颗粒，其包含：(a)含有来自一种血清型(例如，AAV2、AAV3)的ITR的核酸载体，和(b)由来源于另一种血清型(例如，AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9或AAV10)的衣壳蛋白构成的衣壳。用于生产和使用假型化rAAV载体的方法是本领域已知的(参见，例如，Duan et al.，J.Virol.，75：7662-7671，2001；Halbert et al.，J.Virol.，74：1524-1532，2000；Zolotukhin et al.，Methods，28：158-167，2002；和Auricchio et al.，Hum.Molec.Genet.，10：3075-3081，2001)。
辅助基因和载体
在一些实施方案中，一种或更多种辅助载体(例如质粒)包含含有rep基因和/或cap基因的第一辅助质粒，以及含有以下辅助基因中一种或更多种的第二辅助质粒：E1a基因、E1b基因、E4基因、E2a基因和VA基因。为清楚起见，辅助基因是编码辅助蛋白E1a、E1b、E4、E2a和VA的基因。在一些实施方案中，cap基因被修饰，以使得蛋白质VP1、VP2和VP3中的一种或更多种不表达。在一些实施方案中，cap基因被修饰，以使得VP2不表达。用于进行这样的修饰的方法是本领域已知的(Lux et al.(2005)，J Virology，79：11776-87)。
辅助质粒和制备这样的质粒的方法是本领域已知的并且是可商购获得的(参见，例如，来自PlasmidFactory，Bielefeld，Germany的pDF6、pRep、pDM、pDG、pDP1rs、pDP2rs、pDP3rs、pDP4rs、pDP5rs、pDP6rs、pDG(R484E/R585E)和pDP8.ape质粒；可获自以下的其他产品和服务：Vector Biolabs，Philadelphia，PA；Cellbiolabs，San Diego，CA；AgilentTechnologies，Santa Clara，Ca；和Addgene，Cambridge，MA；pxx6；Grimm et al.(1998)，Novel Tools for Production and Purification of Recombinant Adeno associatedVirus Vectors，Human Gene Therapy，Vol.9，2745-2760；Kern，A.et al.(2003)，Identification of a Heparin-Binding Motif on Adeno-Associated Virus Type 2Capsids，Journal of Virology，Vol.77，11072-11081.；Grimm et al.(2003)，HelperVirus-Free，Optically Controllable，and Two-Plasmid-Based Production of Adeno-associated Virus Vectors of Serotypes 1 to 6，Molecular Therapy，Vol.7，839-850；Kronenberg et al.(2005)，A Conformational Change in the Adeno-Associated VirusType 2 Capsid Leads to the Exposure of Hidden VP1 N Termini，Journal ofVirology，Vol.79，5296-5303；以及Moullier，P.和Snyder，R.O.(2008)，Internationalefforts for recombinant adeno-associated viral vector reference standards，Molecular Therapy，Vol.16，1185-1188)。编码为特定血清型的野生型AAV编码区的质粒也是已知和可获得的。例如，pSub201是包含野生型AAV2基因组的编码区的质粒(Samulski etal.(1987)，J Virology，6：3096-3101)。
目的基因和控制元件
目的基因是编码目的蛋白的基因。目的蛋白可以是可检测标记或治疗性蛋白质。可检测标记是可被可视化(例如，使用裸眼或在显微镜下)的分子。在一些实施方案中，可检测标记是荧光分子、生物发光分子或提供颜色的分子(例如，β-半乳糖苷酶、β-内酰胺酶、β-葡糖醛酸糖苷酶和球形烯酮(spheriodenone))。在一些实施方案中，可检测标记是荧光蛋白或其功能性肽或功能性多肽。
在一些实施方案中，目的基因编码治疗性蛋白质。在一些实施方案中，治疗性基因编码抗体、肽体(peptibody)、生长因子、凝血因子、激素、膜蛋白、细胞因子、趋化因子、作用于细胞表面受体或离子通道的激活或抑制性肽、靶向胞内过程的细胞渗透肽、溶血栓剂、酶、骨形态发生蛋白、核酸酶或用于基因编辑的其他蛋白质、Fc融合蛋白、抗凝剂、核酸酶、指导RNA或者用于基因编辑的其他核酸或蛋白质。
在一些实施方案中，核酸载体包含一个或更多个以下区域，其包含促进核酸(例如，异源核酸)表达的序列，例如与核酸有效连接的表达控制序列。这样的控制元件可被递送至生产细胞，以使得其有助于生产细胞中一种或更多种蛋白质的表达。在一些实施方案中，将控制元件递送至生产细胞，以使得其与一个或更多个目的基因一起包装，以使包装的rAAV颗粒当用于感染靶细胞、组织或器官时有助于目的基因在靶细胞、组织或器官中表达产物。
许多控制元件在本领域中是已知的。控制元件的一些非限制性实例包括启动子、绝缘子、沉默子、响应元件、内含子、增强子、起始位点、终止信号和poly(A)尾。本文中考虑了这样的控制元件的任意组合(例如，启动子和增强子)。为了实现目的蛋白或多肽的适当表达水平，可采用适合于在所选宿主细胞中适用的众多启动子中的任一种。启动子可以是例如组成型启动子、组织特异性启动子、诱导型启动子或合成启动子。例如，可使用不同强度的组成型启动子。本文中所述的核酸载体可包含一种或更多种组成型启动子，例如通常在促进转录中具有活性的病毒启动子或来自哺乳动物基因的启动子。组成型病毒启动子的一些非限制性实例包括单纯疱疹病毒(Herpes Simplex virus，HSV)、胸苷激酶(thymidinekinase，TK)、劳斯肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus，RSV)、猿猴病毒40(Simian Virus 40，SV40)、小鼠乳腺肿瘤病毒(Mouse Mammary Tumor Virus，MMTV)、Ad E1A和巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)启动子。组成型哺乳动物启动子的一些非限制性实例包括多种持家基因启动子，如通过β-肌动蛋白启动子(例如，鸡β-肌动蛋白启动子)和人延伸因子-1α(elongation factor-1α，EF-1α)启动子所例示的。还可考虑诱导型启动子和/或调节元件以实现目的蛋白或多肽的适当表达水平。合适的诱导型启动子的一些非限制性实例包括来自例如以下基因的那些：细胞色素P450基因、热休克蛋白基因、金属硫蛋白基因和激素诱导型基因，例如雌激素基因启动子。诱导型启动子的另一个实例是对四环素有响应的tetVP16启动子。本文中还考虑了组织特异性启动子和/或调节元件。可使用的这样的启动子的一些非限制性实例包括气道上皮细胞特异性启动子。本文中还考虑了合成启动子。合成启动子可包含例如已知启动子的区域、调节元件、转录因子结合位点、增强子元件、阻遏子元件等。
在一些实施方案中，任选地包含一个或更多个控制元件的目的基因以ITR为侧翼。在一些实施方案中，包含以ITR为侧翼的目的基因的核酸载体是RNA、DNA、ssDNA或自互补型DNA分子。在一些实施方案中，使用本申请中描述的一种或更多种技术将核酸载体包装到病毒颗粒中(例如，通过将核酸载体(例如通过转染)引入到表达嵌合rep基因或与在目的基因侧翼的ITR为不同血清型的基因的生产细胞中，其中所述生产细胞还任选地表达一种或更多种cap基因和/或辅助基因)。
无需进一步阐述即可认为本领域技术人员可基于以上描述以其最大程度利用本申请。因此，以下具体实施方案应被解释为仅是举例说明性的，并且不以任何方式限制本申请的其余部分。本文中引用的所有出版物出于本文中引用的目的或主题通过引用并入。
如通过本文中所述方法生产的rAAV颗粒的用途
使用本文中公开的任一种方法(例如，用在此描述的任一种rep基因、任一种cap基因和/或任一种ITR)生产的rAAV颗粒可用于将目的基因递送至细胞(例如，对象体内的细胞或体外细胞)或在对象中治疗病症或疾病。在一些实施方案中，对象是哺乳动物(例如人)。在一些实施方案中，对象需要用如上所述的目的基因进行的治疗。
在一些实施方案中，“施用”意指以药理学上可用的方式向对象提供物质。在一些实施方案中，rAAV颗粒肠内施用于对象。在一些实施方案中，必需金属元素的肠内施用是经口的。在一些实施方案中，rAAV颗粒肠胃外施用于对象。在一些实施方案中，rAAV颗粒皮下、眼内、玻璃体内、视网膜下、静脉内(intravenously，IV)、脑室内、肌内、鞘内(intrathecally，IT)、脑池内、腹膜内、通过吸入、表面或通过直接注射至一个或更多个细胞、组织或器官施用于对象。在一些实施方案中，rAAV颗粒通过注射到肝动脉或门静脉中施用于对象。
“治疗”疾病如该术语在本文中使用意指降低对象经受的疾病或病症的至少一种体征或症状的频率或严重程度。上文或本文中其他地方描述的组合物通常以有效量(即能够产生所期望结果的量)施用于对象。所期望的结果将取决于正施用的活性剂。例如，rAAV颗粒的有效量可以是能够将表达构建体转移至宿主器官、组织或细胞的颗粒的量。治疗上可接受的量可以是能够治疗疾病(例如弗里德赖希共济失调(Friedreich’s ataxia))的量。如医学和兽医学领域中公知的，对于任一个对象的剂量取决于许多因素，包括对象的尺寸、体表面积、年龄、待施用的特定组合物、组合物中的活性成分、施用时间和途径、总体健康和同时施用的其他药物。
在一些实施方案中，组合物包含可药用载体。术语“载体”是指与rAAV颗粒一起施用的稀释剂、辅料、赋形剂或载剂。这样的药用载体可以是无菌液体，例如水和油，包括石油(例如矿物油)、植物油(例如花生油、大豆油和芝麻油)、动物油或合成来源的油的那些。盐水溶液以及右旋糖和甘油水溶液也可用作液体载体。
实施例
实施例1：不同血清型的AAV ITR和Rep蛋白的比较
为了开始探索使用不同血清型的AAV Rep蛋白和/或AAV ITR对基因组包装效率的影响，比较了为AAV1至AAV13的Rep和可用ITR序列(图1)。ITR序列仅对于AAV1至AAV7可用。AAV1和AAV6在Rep(99.4％)和Cap(99.2％)蛋白二者中均共享高序列同一性。相比之下，它们的ITR序列显示出分歧性(divergence)(81.6％)。AAV6 ITR与AAV2 ITR相同，而Rep和Cap蛋白序列更多样(分别为87.3％和83.4％)。这与AAV6是AAV1与AAV2之间的嵌合体一致。AAV1和AAV6 Rep与AAV7、AAV8、AAV9、AAV10和AAV11共享高序列同源性(≥95.0％)，但是它们的Cap蛋白序列更多样(图1)。明显地，与其他AAV相比，AAV5在其ITR序列、Rep蛋白和Cap蛋白方面一致地多样(图1)。
对ITR内序列变异的位置的分析显示，A区中变异较小，但D序列和发夹(B区和C区)中变异较高(图2)。据报道，D序列对于AAV包装很重要，而发夹中的序列是可交换的，只要保持二级结构即可。作为一个实例，AAV1和AAV2的比较的图示表明DNA结合结构域和解旋酶结构域二者中均存在变异(图3)。这些观察结果指出了这些必需的病毒元件可与其功能相关的复杂性水平。
实施例2：使用不同血清型的ITR和Rep蛋白的组合对rAAV颗粒包装的影响
首先，进行了AAV6衣壳与所有AAV血清型的Rep蛋白的包装之间的比较。使用具有以AAV1至AAV6的ITR为侧翼之基因组的载体构建体。将包含AAV2 rep基因的现有Rep2(AAV2)-cap6(AAV6)辅助质粒用来自其他AAV血清型的rep基因替代。这些构建体用于转染HEK293细胞以产生rAAV6(rAAVX/6)载体。使用以来自替代AAV血清型的ITR为侧翼的AAV载体基因组进行AAV6载体的生产，其以ITR和Rep蛋白的匹配对(例如，AAV1 ITR+AAV1 rep、或AAV3 ITR+AAV3 rep，等等)开始。所得的载体通过AVB琼脂糖纯化，其纯化含有基因组的AAV颗粒以及空(无DNA)AAV颗粒。通过密度梯度(例如碘克沙醇)或沉降梯度(例如蔗糖梯度)分离完整和空的衣壳，并且对于每个样品，使用衣壳ELISA(具有ADK1a抗体)来量化衣壳滴度。随后分析单独的载体制备物，并比较它们的空：完整比率、总生产产量和基因表达效率。
如果观察到相同转基因的包装效率有显著差异，则对两个Rep结构域中的残基差异进行更精细的分析，并对某些残基进行突变，以鉴定对这些差异来说重要的残基。
然后，比较AAV1至AAV13的Rep序列，以确定它们之间的差异位于何处。然后检测它们在包装中的作用。已知，AAV5 ITR仅可与AAV5 Rep蛋白一起包装，因此将测试嵌合体的DNA结合结构域和解旋酶结构域二者，以查明这一要求的决定因素。如果发现包装效率或载体生产力的显著差异是由血清型Rep或ITR决定的，则在病毒之间交换结构域(例如，利用AAV1 DNA结合结构域和/或解旋酶/ATP酶或者利用来自AAV1的D序列)并测试它们对rAAV颗粒包装的影响。
实施例3：使用嵌合rep基因生产不同血清型的rAAV颗粒的效果
图4示出了用于生产rAAV颗粒的标准AAV生产系统的示意图。用一种或更多种质粒转染细胞(也称为辅助细胞或生产细胞)，所述质粒包含编码Rep和衣壳蛋白的基因并且任选地包含在ITR之间的目的基因以使得其可被包装到rAAV颗粒中。标准技术利用多种嵌合和经修饰的cap基因，但通常使用为血清型2的rep和ITR。下面描述了实验及其数据，其中rep基因被修饰并且与具有AAV2的序列的ITR一起使用以生产不同血清型的衣壳。受试的经修饰rep基因是具有被其他血清型的结构域替代之结构域的嵌合rep基因。
进行了ITR AAV1至7和Rep78 AAV1至8的DNA序列同一性的分析(图5)。AAV8 ITR、AAV9 ITR和AAV9 Rep的序列不可用。
图5示出了针对AAV血清型1至9的AAV ITR和Rep78的百分比序列同一性分析。图6提供了示出了AAV基因组中rep和cap基因的布置以及由rep基因表达的AAV Rep蛋白的多种结构域的示意图。示出了AAV基因组的示意图，其具有以反向末端重复(ITR)为侧翼的两个开放阅读框。放大图示出了Rep蛋白的结构域和导致Rep78/68/52/40表达的转录物。用于产生杂合体的rep基因的特定结构域标示如下：
n＝N端结构域，
d＝DNA结合结构域，
h＝解旋酶结构域，
y＝NLS/p40启动子结构域，并且
z＝锌指结构域；
其中如本文中所限定的N端由结构域n、d和h组成；并且C端(c)由结构域y和z组成。
用于AAV1载体生产的rep基因的表征和优化示于图7A至7B中。产生了AAV1和AAV2rep基因之间的交换，以鉴定负责提高基因组包装的结构域。DNA结合结构域(DNA bindingdomain，DBD；d)起重要作用，因为AAV2 DBD显著影响包装。解旋酶结构域(h)也可能参与其中，因为AAV2解旋酶也显示出提高包装。总体而言，都具有AAV1 DBD和AAV2解旋酶的变体R1hc2V1(即，表示cap基因为AAV1序列且rep基因除C端(c)和解旋酶结构域(h)为AAV2序列之外为AAV1序列的质粒)和R2d1V1(表示cap基因为AAV1序列且rep基因除DNA结合结构域(d)为AAV1序列之外为AAV2序列的质粒)具有AAV1衣壳的最佳载体基因组包装表型。图8中提供了用于生产AAV1的rAAV颗粒的rep修饰的另外的数据。对于这些变体，rep基因中的结构域限定如下：n＝N端：第1至102位aa，d＝DNA结合结构域：第103至242位aa，h＝解旋酶结构域：第243至370位aa，c＝C端：第371至621位aa。
将AAV2 rep基因替换为AAV3 rep基因以生产AAV3颗粒(图9A至9D)。对于标准生产系统，对于AAV2 rep使用了ACG起始密码子。在AAV3 rep基因的情况下测试了ACG和ATG起始密码子二者。在ATG起始密码子的情况下，AAV3 Rep78是可见的，而其在ACG起始密码子的情况下则不可见。与AAV2 rep基因构建体相比，AAV3 rep构建体的VP表达略低。尽管如此，ATG-R3V3的基因组滴度与ACG-R2V3的相当。因此，在AAV3 Rep的情况下的包装稍微更好(图9A至9D)。
接下来，将AAV2 rep基因替换为AAV4 rep基因以生产AAV4颗粒(图10A至10D)。在AAV4 rep基因的情况下测试了ACG和ATG起始密码子二者。在ATG起始密码子的情况下，AAV4Rep78可见，而其在ACG起始密码子的情况下则不可见。在AAV4 rep构建体的情况下的VP1表达与AAV2 rep基因构建体的相当。尽管如此，相比于ACG-R2V4，ACG-R4V4的基因组滴度更高。因此，相比于AAV2 Rep，在AAV4 Rep的情况下的包装可更好。
将AAV2 rep基因替换为AAV5 rep基因以生产AAV5颗粒(图11A至11D)。在AAV5 rep基因的情况下测试了ACG和ATG起始密码子二者。在ATG起始密码子的情况下，AAV5 Rep78可见，而其在ACG起始密码子的情况下则不可见。与AAV2 rep基因构建体相比，在AAV5 rep构建体的情况下的VP表达显示略低。然而，在AAV5的情况下没有检测到包装的基因组。已知AAV5 Rep不能与AAV2 ITR相互作用(参见，例如，Chiorini et al.，J Virol.1999 May；73(5)：4293-8)。
将AAV2 rep基因替换为AAV6 rep基因以生产AAV6载体(图12A至12D)。在AAV6 rep基因的情况下测试了ACG和ATG起始密码子二者。还分析了AAV血清型AAV1、AAV2、AAV6与AAV8之间的多种Rep杂合体。对于Rep变体质粒R8d1c2V6和R1hc2V6，观察到了最佳载体基因组包装表型。然而，这两种质粒均维持了与参考质粒pR2V6相当的高VP表达。
将AAV2 rep基因替换为AAV7 rep基因以生产AAV7颗粒(图13A至13D)。在AAV7 rep基因的情况下测试了ACG和ATG起始密码子二者。在ATG起始密码子的情况下，AAV7 Rep78可见，而其在ACG起始密码子的情况下则不可见。与AAV2 rep基因构建体相比，在AAV7 rep构建体的情况下的VP表达较低。尽管如此，ACG-R7V7的基因组滴度与ACG-R2V7相当。因此，在ACG-R7V7的情况下的包装更好。
产生了AAV1、AAV2与AAV8 rep基因之间的交换，以鉴定负责提高基因组包装的结构域并优化rep基因以用于AAV8载体生产(图14A至14B)。DNA结合结构域(DBD)显示对于VP表达起重要作用，因为用AAV1 DBD替代AAV8 DBD提高了VP表达。与AAV2 rep基因相比，R1c2V8和R8d1c2V8杂合体/嵌合体将载体基因组更有效地包装到AAV8衣壳中。对于这些变体，rep结构域限定如下：n＝N端：第1至102位aa，d＝DNA结合结构域：第103至224位aa，h＝解旋酶结构域：第225至372位aa，c＝C端：第373至623位aa。
使用rep嵌合体的AAV8颗粒的基因组包装的提高示于图15A至15B中。利用新的rep嵌合体R1c2和R8d1c2产生更高百分比(3至4倍)的包含基因组的颗粒。
图16A至16B提供了包装AAV8颗粒的更多rep嵌合体的数据。可以看出，相比于AAV2rep，当使用所列出的rep嵌合体时，基因组包装得到提高。
其他实施方案
本说明书中公开的所有特征可以以任意组合进行组合。本说明书中公开的每个特征可由用于相同、等同或相似目的的替代特征代替。因此，除非另外明确指出，否则所公开的每个特征仅是一系列上位等同或相似特征的一个实例。
根据以上描述，本领域技术人员可容易地确定本申请的基本特征，并且在不脱离其精神和范围的情况下，可对本申请进行多种改变和修改以使其适用于多种用途和情况。因此，其他实施方案也在权利要求书之内。
等同方案
虽然本文中已对数个本发明实施方案进行了描述和说明，但是本领域普通技术人员将容易想到多种其他方法和/或结构来实现本文中所述功能和/或获得本文中所述结果和/或一个或更多个优点，并且认为这样的变化和/或修改中的每一个均在本文中所述的本发明实施方案的范围内。更一般地，本领域技术人员将容易理解，本文中所述的所有参数、尺寸、材料和构造均意在为示例性的，并且实际参数、尺寸、材料和/或构造将取决于使用本发明教导的具体应用。本领域技术人员将认识到或者能够仅使用常规实验就确定本文中所述的具体本发明实施方案的许多等同方案。因此，应理解，前述实施方案仅作为实例示出，并且在所附权利要求书及其等同文件的范围内，本发明实施方案可以以不同于具体描述和要求保护的方式实施。本申请的本发明实施方案涉及本文中所述的每一个单独的特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法。另外，如果这样的特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法并非互相不一致，则两个或更多个这样的特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法的任意组合也包括在本申请的发明范围内。
本文中定义和使用的所有定义应理解为优先于字典定义、通过引用并入的文献中的定义和/或所定义术语的一般含义。
本文中公开的所有参考文献、专利和专利申请均关于其各自被引用的主题通过引用并入，在一些情况下，其可涵盖文件的全部内容。
除非明确指出相反，否则本文中在说明书和权利要求书中使用的没有数量词修饰的名词应理解为意指“至少一个/种”。
如本文中在说明书和权利要求书中所使用的，短语“和/或”应理解为意指这样连接的要素，即在一些情况下共同存在而在另一些情况下分别存在的要素中的“任一个或二者”。用“和/或”列举的多个要素应以相同方式理解，即这样连接的要素中的“一个或更多个”。除了由“和/或”子句具体指明的要素之外，其他要素也可以任选地存在，无论与具体指明的那些要素相关还是无关。因此，作为一个非限制性实例，当与开放式语言例如“包含/包括”结合使用时，对“A和/或B”的提及可在一个实施方案中仅指A(任选地包括除B之外的要素)；在另一个实施方案中，仅指B(任选地包括除A之外的要素)；在又一个实施方案中，指A和B二者(任选地包括其他要素)；等等。
如本文中在说明书和权利要求书中所使用的，“或/或者”应理解为与如上定义的“和/或”具有相同的含义。例如，当分离列表中的项目时，“或/或者”或“和/或”应被解释为包括性的，即包括多个要素或要素列表中的至少一个，但也包括多于一个，并且任选地包括另外的未列出项目。仅明确指出相反的术语，例如“仅之一”或“恰好之一”，或者当用于权利要求书中时“由......组成”，是指包括多个要素或要素列表中的恰好一个要素。一般而言，当之前有排他性术语(例如“任一”、“之一”、“仅之一”或“恰好之一”)时，本文中使用的术语“或/或者”应仅被解释为表示排他性的替代方案(即“一个或另一个，而非二者”)。“基本上由......组成”当在权利要求书中使用时应具有其在专利法领域中所使用的一般含义。
如本文中在说明书和权利要求书中所使用的，短语“至少一个/种”在提及一个或更多个要素的列表时应理解为意指从要素列表中的任意一个或更多个要素中选择的至少一个要素，但并不一定包括要素列表内具体列举的各个和每个要素的至少一个，并且也不排除要素列表中要素的任意组合。该定义还允许可以任选地存在要素列表中除短语“至少一个/种”所提及的具体指出的要素之外的要素，无论与具体指出的那些要素相关还是无关。因此，作为一个非限制性实例，“A和B中的至少一个”(或等同地，“A或B中的至少一个”，或等同地，“A和/或B中的至少一个”)可在一个实施方案中指至少一个A，任选地包括多于一个A，但不存在B(并且任选地包括除B之外的要素)；在另一个实施方案中，指至少一个B，任选地包括多于一个B，但不存在A(并且任选地包括除A之外的要素)；在又一个实施方案中，指至少一个A，任选地包括多于一个A，和至少一个B，任选地包括多于一个B(并且任选地包括其他要素)；等等。
还应理解，除非明确指出相反，否则在本文中要求保护的包括多于一个步骤或操作的任何方法中，该方法的步骤或操作的顺序不必限于记载该方法的步骤或操作的顺序。
在权利要求书中以及上述说明书中，所有过渡性短语例如“包含”、“包括”、“携有”、“具有”、“含有”、“涉及”、“持有”、“由......构成”等都应理解为开放式的，即，意指包括但不限于。如美国专利局专利审查程序手册(United States Patent Office Manual ofPatent Examining Procedures)第2111.03节中所述，仅过渡性短语“由......组成”和“基本上由......组成”应分别为封闭式或半封闭式的过渡性短语。应理解，在本文件中使用开放式过渡性短语(例如，“包含/包括”)描述的实施方案也在替代实施方案中被考虑为“由该开放式过渡性短语描述的特征组成”和“基本上由该开放式过渡性短语描述的特征组成”。例如，如果本申请描述“包含A和B的组合物”，则本申请还考虑了替代实施方案：“由A和B组成的组合物”和“基本上由A和B组成的组合物”。
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Claims (97)

1.包装重组腺相关病毒(AAV)颗粒的方法，其包括：
使表达rep基因的细胞与包含反向末端重复(ITR)对的重组核酸接触，所述rep基因为第一血清型，所述反向末端重复(ITR)对为第二血清型。
2.权利要求1所述的方法，其中通过用编码所述rep基因的核酸转染或感染所述细胞来表达所述rep基因。
3.权利要求1或2所述的方法，其中所述rep基因是嵌合的且包含N端和C端(c)，并且
其中所述N端包含N端结构域(n)、DNA结合结构域(d)和解旋酶结构域(h)，以及
其中所述C端包含NLS/p40启动子结构域(y)和锌指结构域(z)。
4.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述rep基因为血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV6、AAV12、AAV13、AAV1和AAV2、或AAV5和AAV2，或者其中所述rep基因是嵌合的。
5.权利要求3或4所述的方法，其中所述N端为AAV1血清型，并且所述C端为AAV2血清型。
6.权利要求3或4所述的方法，其中所述N端为AAV2血清型，并且所述C端为AAV1血清型。
7.权利要求3或4所述的方法，其中所述N端为AAV2血清型，并且所述C端为AAV5血清型。
8.权利要求3或4所述的方法，其中所述N端为AAV5血清型，并且所述C端为AAV2血清型。
9.权利要求1或2所述的方法，其中所述第一血清型为AAV1血清型。
10.权利要求9所述的方法，其中所述第二血清型为AAV1血清型。
11.权利要求9所述的方法，其中所述第二血清型为AAV2血清型。
12.权利要求9所述的方法，其中所述第二血清型为AAV3血清型。
13.权利要求9所述的方法，其中所述第二血清型为AAV4血清型。
14.权利要求9所述的方法，其中所述第二血清型为AAV7血清型。
15.权利要求1或2所述的方法，其中所述第二血清型为AAV6血清型。
16.权利要求15所述的方法，其中所述第一血清型为AAV2血清型。
17.权利要求15所述的方法，其中所述第一血清型为AAV3血清型。
18.权利要求15所述的方法，其中所述第一血清型为AAV4血清型。
19.权利要求15所述的方法，其中所述第一血清型为AAV6血清型。
20.权利要求15所述的方法，其中所述第一血清型为AAV12血清型。
21.权利要求15所述的方法，其中所述第一血清型为AAV13血清型。
22.权利要求1或2所述的方法，其中所述第二血清型为血清型1。
23.权利要求22所述的方法，其中所述第一血清型为AAV2血清型。
24.权利要求22所述的方法，其中所述第一血清型为AAV3血清型。
25.权利要求22所述的方法，其中所述第一血清型为AAV4血清型。
26.权利要求22所述的方法，其中所述第一血清型为AAV12血清型。
27.权利要求22所述的方法，其中所述第一血清型为AAV13血清型。
28.权利要求5所述的方法，其中所述第二血清型为AAV1血清型。
29.权利要求5所述的方法，其中所述第二血清型为AAV6血清型。
30.权利要求6所述的方法，其中所述第二血清型为AAV1血清型。
31.权利要求6所述的方法，其中所述第二血清型为AAV6血清型。
32.权利要求7所述的方法，其中所述第二血清型为AAV2血清型。
33.权利要求8所述的方法，其中所述第二血清型为AAV5血清型。
34.权利要求3所述的方法，其中所述rAAV颗粒为AAV1血清型。
35.权利要求34所述的方法，其中所述n、d、y和z结构域为AAV2血清型，并且所述h结构域为AAV1血清型。
36.权利要求34所述的方法，其中所述n、h、y和z结构域为AAV2血清型，并且所述d结构域为AAV1血清型。
37.权利要求34所述的方法，其中所述d、h、y和z结构域为AAV2血清型，并且所述n结构域为AAV1血清型。
38.权利要求34所述的方法，其中所述n、d和h结构域为AAV1血清型，并且所述y和z结构域为AAV1血清型。
39.权利要求34所述的方法，其中所述d和h结构域为AAV1血清型，并且所述n、y和z结构域为AAV2血清型。
40.权利要求34所述的方法，其中所述n和d结构域为AAV1血清型，并且所述h、y和z结构域为AAV2血清型。
41.权利要求3所述的方法，其中所述rAAV颗粒为AAV3血清型。
42.权利要求41所述的方法，其中所述n、d和h结构域为AAV2血清型，并且所述y和z结构域为AAV3血清型。
43.权利要求42所述的方法，其中所述rep基因具有起始密码子序列ACG。
44.权利要求41所述的方法，其中所述rep基因为AAV3血清型，并且具有起始密码子序列ATG。
45.权利要求3所述的方法，其中所述rAAV颗粒为AAV4血清型。
46.权利要求45所述的方法，其中所述rep基因为AAV4血清型，并且具有起始密码子序列ACG。
47.权利要求3所述的方法，其中所述rAAV颗粒为AAV5血清型。
48.权利要求47所述的方法，其中所述rep基因为AAV2血清型，并且具有起始密码子序列ACG。
49.权利要求3所述的方法，其中所述rAAV颗粒为AAV6血清型。
50.权利要求49所述的方法，其中所述n和h结构域为AAV8血清型，并且所述d、y和z结构域为AAV2血清型。
51.权利要求49所述的方法，其中所述n和d结构域为AAV1血清型，并且所述h、y和z结构域为AAV2血清型。
52.权利要求3所述的方法，其中所述rAAV颗粒为AAV7血清型。
53.权利要求52所述的方法，其中rep基因为AAV2血清型，并且具有起始密码子序列ACG。
54.权利要求52所述的方法，其中rep基因为AAV7血清型，并且具有起始密码子序列ACG。
55.权利要求3所述的方法，其中所述rAAV颗粒为AAV8血清型。
56.权利要求55所述的方法，其中所述n和h结构域为AAV8血清型且所述d、y和z结构域为AAV2血清型，并且其中所述rep基因具有起始密码子序列ATG。
57.权利要求55所述的方法，其中所述n、h和d结构域为AAV1血清型且所述y和z结构域为AAV2血清型，并且其中所述rep基因具有起始密码子序列ATG。
58.权利要求55所述的方法，其中所述n和h结构域为AAV8血清型；以下核苷酸在所述d结构域中缺失：根据SEQ ID NO：125的T574、C592、C607、A637、G644和C657；所述y和z结构域为AAV2血清型；并且其中所述rep基因具有起始密码子序列ATG。
59.前述权利要求中任一项所述的方法，其中包装到所述rAAV颗粒中的基因组的平均量相对于使用为AAV2血清型的rep基因和为AAV2血清型的ITR对的相同血清型的颗粒的平均包装高至少1.5倍。
60.前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括使所述细胞与包含cap基因的重组核酸接触。
61.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞表达cap基因。
62.细胞，其包含根据权利要求1至35中任一项所述细胞的为第一血清型的rep基因和为第二血清型的ITR对。
63.权利要求36所述的细胞，其中所述细胞还包含cap基因。
64.组合物，其包含含有rep基因的核酸，其中所述rep基因是嵌合的且包含N端和C端(c)，并且
其中所述N端包含N端结构域(n)、DNA结合结构域(d)和解旋酶结构域(h)，以及
其中所述C端包含NLS/p40启动子结构域(y)和锌指结构域(z)。
65.权利要求64所述的组合物，其中所述rep基因为血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV6、AAV12、AAV13、AAV1和AAV2、或AAV5和AAV2，或者其中所述rep基因是嵌合的。
66.权利要求64所述的组合物，其中所述N端为AAV1血清型，并且所述C端为AAV2血清型。
67.权利要求64所述的组合物，其中所述N端为AAV2血清型，并且所述C端为AAV1血清型。
68.权利要求64所述的组合物，其中所述N端为AAV2血清型，并且所述C端为AAV5血清型。
69.权利要求64所述的组合物，其中所述N端为AAV5血清型，并且所述C端为AAV2血清型。
70.权利要求64所述的组合物，其中所述n、d、y和z结构域为AAV2血清型，并且所述h结构域为AAV1血清型。
71.权利要求64所述的组合物，其中所述n、h、y和z结构域为AAV2血清型，并且所述d结构域为AAV1血清型。
72.权利要求64所述的组合物，其中所述d、h、y和z结构域为AAV2血清型，并且所述n结构域为AAV1血清型。
73.权利要求64所述的组合物，其中所述n、d和h结构域为AAV1血清型，并且所述y和z结构域为AAV1血清型。
74.权利要求64所述的组合物，其中所述d和h结构域为AAV1血清型，并且所述n、y和z结构域为AAV2血清型。
75.权利要求64所述的组合物，其中所述n和d结构域为AAV1血清型，并且所述h、y和z结构域为AAV2血清型。
76.权利要求70至76中任一项所述的组合物，其还包含含有cap基因的核酸，其中所述cap基因为AAV1血清型。
77.权利要求64所述的组合物，其中所述n、d和h结构域为AAV2血清型，并且所述y和z结构域为AAV3血清型。
78.权利要求64所述的组合物，其中所述rep基因具有起始密码子序列ACG。
79.权利要求64所述的组合物，其中所述rep基因为AAV3血清型，并且具有起始密码子序列ATG。
80.权利要求78至80中任一项所述的组合物，其还包含含有cap基因的核酸，其中所述cap基因为AAV3血清型。
81.权利要求64所述的组合物，其中所述rep基因为AAV4血清型，并且具有起始密码子序列ACG。
82.权利要求82所述的组合物，其还包含含有cap基因的核酸，其中所述cap基因为AAV4血清型。
83.权利要求64所述的组合物，其中所述rep基因为AAV2血清型，并且具有起始密码子序列ACG。
84.权利要求84所述的组合物，其还包含含有cap基因的核酸，其中所述cap基因为AAV5血清型。
85.权利要求64所述的组合物，其中所述n和h结构域为AAV8血清型，并且所述d、y和z结构域为AAV2血清型。
86.权利要求64所述的组合物，其中所述n和d结构域为AAV1血清型，并且所述h、y和z结构域为AAV2血清型。
87.权利要求86或87所述的组合物，其还包含含有cap基因的核酸，其中所述cap基因为AAV6血清型。
88.权利要求64所述的组合物，其中rep基因为AAV2血清型，并且具有起始密码子序列ACG。
89.权利要求64所述的组合物，其中rep基因为AAV7血清型，并且具有起始密码子序列ACG。
90.权利要求89或90所述的组合物，其还包含含有cap基因的核酸，其中所述cap基因为AAV7血清型。
91.权利要求64所述的组合物，其中所述n和h结构域为AAV8血清型且所述d、y和z结构域为AAV2血清型，并且其中所述rep基因具有起始密码子序列ATG。
92.权利要求64所述的组合物，其中所述n、h和d结构域为AAV1血清型且所述y和z结构域为AAV2血清型，并且其中所述rep基因具有起始密码子序列ATG。
93.权利要求64所述的组合物，其中所述n和h结构域为AAV8血清型；以下核苷酸在所述d结构域中缺失：根据SEQ ID NO：125的T574、C592、C607、A637、G644和C657；所述y和z结构域为AAV2血清型；并且其中所述rep基因具有起始密码子序列ATG。
94.权利要求92至94中任一项所述的组合物，其还包含含有cap基因的核酸，其中所述cap基因为AAV8血清型。
95.权利要求77、81、85、88、91或95中任一项所述的组合物，其中所述含有rep基因的核酸和所述含有cap基因的核酸包含在核酸载体中。
96.权利要求64至96中任一项所述的组合物，其还包含含有ITR对的核酸。
97.权利要求97所述的组合物，其中包含ITR的核酸还包含以所述ITR对为侧翼的目的基因。
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