JP2023171525A - Ａａｖキメラ - Google Patents

Abstract

【課題】ＡＡＶキメラの提供。【解決手段】組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子をパッケージするための組成物および方法であって、異なる血清型の末端逆位配列（ＩＴＲ）およびｒｅｐ遺伝子を使用することならびに／またはキメラｒｅｐ遺伝子を使用することを含む組成物および方法が本明細書で提供される。一局面において、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子をパッケージする方法が提供され、この方法は、第１の血清型のｒｅｐ遺伝子を発現する細胞を、第２の血清型の一対の末端逆位配列（ＩＴＲ）を含む組換え核酸と接触させることを含む。【選択図】なし

Description

関連出願
本出願は、その全開示が参照により本明細書に組み込まれる、２０１８年３月６日に出願された米国特許仮出願第６２／６３９，４６６号の利益を主張する。

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子は、一般的に研究のために、および臨床開発におけるいくつかを含む遺伝子療法適用のためにも使用される。

小規模および大規模の両方における、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を生成する方法および組成物は、研究、前臨床および臨床適用のために有益である。

組換えＡＡＶ粒子の生成は、細胞を培養すること、ＡＡＶ遺伝子およびｒＡＡＶ粒子にパッケージすることが所望される目的の遺伝子をそれらの細胞に導入すること、および細胞がｒＡＡＶ粒子をパッケージすること（または、生成すること）を可能にすることを含むことができる。ｒＡＡＶ粒子をパッケージまたは生成する細胞は、本明細書において「産生細胞」とも呼ばれる。産生細胞に導入されるＡＡＶ遺伝子は、ｒｅｐ、ｃａｐ、ヘルパー遺伝子、および目的の１つまたは複数の遺伝子に隣接する末端逆位配列（ＩＴＲ）を一般的に含む。最近の１０年間で、複数の天然の血清型および変異体からの多数のＡＡＶ
ｃａｐ遺伝子が、異なる遺伝子療法適用のために利用されている。対照的に、ｒｅｐおよびＩＴＲ配列の変異、ならびにそれらがｒＡＡＶ粒子パッケージングにどのように影響するかは調査されていない。本出願は、異なる血清型のｒＡＡＶ粒子のパッケージングを向上させるために、ｒｅｐおよびＩＴＲ配列の両方を変更することができるとの知見に、少なくとも一部関する。一部の実施形態では、本出願に記載される組換えＲｅｐタンパク質（例えば、キメラＲｅｐタンパク質）および／またはそれらをコードする遺伝子は、本出願に記載されるＩＴＲ配列（例えば、異なる血清型の）が隣接する１つまたは複数の目的の遺伝子を含む組換えｒＡＡＶ核酸を含むｒＡＡＶ粒子の生成において使用することができる。

したがって、一態様では、ｒｅｐ遺伝子を含む核酸を含む組成物が本明細書で提供され、ここで、ｒｅｐ遺伝子はキメラである。一部の実施形態では、ｒｅｐ遺伝子は、Ｎ末端およびＣ末端（ｃ）を含む。一部の実施形態では、Ｎ末端はＮ末端ドメイン（ｎ）、ＤＮＡ結合性ドメイン（ｄ）およびヘリカーゼドメイン（ｈ）を含む。一部の実施形態では、Ｃ末端は、ＮＬＳ／ｐ４０プロモータードメイン（ｙ）およびジンクフィンガードメイン（ｚ）を含む。一部の実施形態では、ｒｅｐ遺伝子は、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ６、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１およびＡＡＶ２、またはＡＡＶ５およびＡＡＶ２であるか、またはキメラである。

一部の実施形態では、Ｎ末端はＡＡＶ１血清型であり、Ｃ末端はＡＡＶ２血清型である。一部の実施形態では、Ｎ末端はＡＡＶ２血清型であり、Ｃ末端はＡＡＶ１血清型である。一部の実施形態では、Ｎ末端はＡＡＶ２血清型であり、Ｃ末端はＡＡＶ５血清型である。一部の実施形態では、Ｎ末端はＡＡＶ５血清型であり、Ｃ末端はＡＡＶ２血清型である。

一部の実施形態では、ｎ、ｄ、ｙおよびｚドメインはＡＡＶ２血清型であり、ｈドメインはＡＡＶ１血清型である。一部の実施形態では、ｎ、ｈ、ｙおよびｚドメインはＡＡＶ２血清型であり、ｄドメインはＡＡＶ１血清型である。一部の実施形態では、ｄ、ｈ、ｙおよびｚドメインはＡＡＶ２血清型であり、ｎドメインはＡＡＶ１血清型である。一部の実施形態では、ｎ、ｄおよびｈドメインはＡＡＶ１血清型であり、ｙおよびｚドメインはＡＡＶ１血清型である。一部の実施形態では、ｄおよびｈドメインはＡＡＶ１血清型であり、ｎ、ｙおよびｚドメインはＡＡＶ２血清型である。一部の実施形態では、ｎおよびｄドメインはＡＡＶ１血清型であり、ｈ、ｙおよびｚドメインはＡＡＶ２血清型である。

一部の実施形態では、ｎ、ｄおよびｈドメインはＡＡＶ２血清型であり、ｙおよびｚドメインはＡＡＶ３血清型である。一部の実施形態では、ｎ、ｄおよびｈドメインを有するｒｅｐ遺伝子はＡＡＶ２血清型であり、ｙおよびｚドメインを有するものはＡＡＶ３血清型であり、配列ＡＣＧの開始コドンを有する。一部の実施形態では、ｒｅｐ遺伝子はＡＡＶ３血清型であり、配列ＡＴＧの開始コドンを有する。

一部の実施形態では、ｒｅｐ遺伝子はＡＡＶ４血清型であり、配列ＡＣＧの開始コドンを有する。

一部の実施形態では、ｒｅｐ遺伝子はＡＡＶ２血清型であり、配列ＡＣＧの開始コドンを有する。

一部の実施形態では、ｎおよびｈドメインはＡＡＶ８血清型であり、ｄ、ｙおよびｚドメインはＡＡＶ２血清型である。一部の実施形態では、ｎおよびｄドメインはＡＡＶ１血清型であり、ｈ、ｙおよびｚドメインはＡＡＶ２血清型である。

一部の実施形態では、ｒｅｐ遺伝子はＡＡＶ２血清型であり、配列ＡＣＧの開始コドンを有する。一部の実施形態では、ｒｅｐ遺伝子はＡＡＶ７血清型であり、配列ＡＣＧの開始コドンを有する。

一部の実施形態では、ｎおよびｈドメインはＡＡＶ８血清型であり、ｄ、ｙおよびｚドメインはＡＡＶ２血清型であり、ｒｅｐ遺伝子は配列ＡＴＧの開始コドンを有する。一部の実施形態では、ｎ、ｈおよびｄドメインはＡＡＶ１血清型であり、ｙおよびｚドメインはＡＡＶ２血清型であり、ｒｅｐ遺伝子は配列ＡＴＧの開始コドンを有する。一部の実施形態では、ｎおよびｈドメインはＡＡＶ８血清型であり、以下のヌクレオチド：配列番号１２５にしたがうＴ５７４、Ｃ５９２、Ｃ６０７、Ａ６３７、Ｇ６４４およびＣ６５７はｄドメインにおいて欠失しており（配列番号１２６をもたらす）、ｙおよびｚドメインはＡＡＶ２血清型であり、ｒｅｐ遺伝子は配列ＡＴＧの開始コドンを有する。

一部の実施形態では、本明細書に記載される組成物のいずれか１つは、ｃａｐ遺伝子を含む核酸をさらに含む。ｃａｐ遺伝子は、任意の血清型（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３）であってよい。

一部の実施形態では、ｒｅｐ遺伝子を含む核酸およびｃａｐ遺伝子を含む核酸は、核酸ベクターに含まれる。一部の実施形態では、ｒｅｐ遺伝子を含む核酸およびｃａｐ遺伝子を含む核酸を含む核酸ベクターは、一対のＩＴＲを含む核酸をさらに含む。一部の実施形態では、目的の遺伝子は、一対のＩＴＲが隣接する。

したがって、一態様では、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子をパッケージする方法であって、第１の血清型のｒｅｐ遺伝子を発現する細胞を、第２の血清型の一対の末端逆位配列（ＩＴＲ）を含む組換え核酸と接触させることを含む方法が本明細書で提供される。一部の実施形態では、ｒｅｐ遺伝子は、ｒｅｐ遺伝子をコードする核酸によって細胞をトランスフェクトまたは感染させることによって発現される。一部の実施形態では、ｒｅｐ遺伝子はキメラである。キメラｒｅｐ遺伝子は、１つより多いＡＡＶ血清型の対応する核酸塩基を含むものである。一部の実施形態では、ｒｅｐ遺伝子は、血清型１、２、３、４、６、１２、１３、１および２、または５および２である。

本明細書に開示される方法のいずれか１つの一部の実施形態では、血清型１および２のｒｅｐ遺伝子によってコードされるＲｅｐタンパク質は、Ｎ末端に血清型１のアミノ酸を、およびＣ末端に血清型２のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、血清型１および２のｒｅｐ遺伝子によってコードされるＲｅｐタンパク質は、Ｎ末端に血清型２のアミノ酸を、およびＣ末端に血清型１のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、血清型２および５のｒｅｐ遺伝子によってコードされるＲｅｐタンパク質は、Ｎ末端に血清型２のアミノ酸を、およびＣ末端に血清型５のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、血清型５および２のｒｅｐ遺伝子によってコードされるＲｅｐタンパク質は、Ｎ末端に血清型５のアミノ酸を、およびＣ末端に血清型２のアミノ酸を含む。

本明細書に開示される方法のいずれか１つの一部の実施形態では、ｒｅｐ遺伝子の第１の血清型は、血清型１である。一部の実施形態では、ｒｅｐ遺伝子の第１の血清型は血清型１であり、ＩＴＲの第２の血清型は血清型１、２、３、４または７である。一部の実施形態では、ｒｅｐ遺伝子の第１の血清型は血清型１であり、ＩＴＲの第２の血清型は血清型１である。一部の実施形態では、ｒｅｐ遺伝子の第１の血清型は血清型１であり、ＩＴＲの第２の血清型は血清型２である。一部の実施形態では、ｒｅｐ遺伝子の第１の血清型は血清型１であり、ＩＴＲの第２の血清型は血清型３である。一部の実施形態では、ｒｅｐ遺伝子の第１の血清型は血清型１であり、ＩＴＲの第２の血清型は血清型４である。一部の実施形態では、ｒｅｐ遺伝子の第１の血清型は血清型１であり、ＩＴＲの第２の血清型は血清型７である。

本明細書に開示される方法のいずれか１つの一部の実施形態では、ＩＴＲの第２の血清型は、血清型６である。本明細書に開示される方法のいずれか１つの一部の実施形態では、ＩＴＲの第２の血清型は、血清型６であり、ｒｅｐ遺伝子の第１の血清型は、血清型２、３、４、６、１２または１３である。本明細書に開示される方法のいずれか１つの一部の実施形態では、ＩＴＲの第２の血清型は血清型６であり、ｒｅｐ遺伝子の第１の血清型は血清型２である。本明細書に開示される方法のいずれか１つの一部の実施形態では、ＩＴＲの第２の血清型は血清型６であり、ｒｅｐ遺伝子の第１の血清型は血清型３である。本明細書に開示される方法のいずれか１つの一部の実施形態では、ＩＴＲの第２の血清型は血清型６であり、ｒｅｐ遺伝子の第１の血清型は血清型４である。本明細書に開示される方法のいずれか１つの一部の実施形態では、ＩＴＲの第２の血清型は血清型６であり、ｒｅｐ遺伝子の第１の血清型は血清型６である。本明細書に開示される方法のいずれか１つの一部の実施形態では、ＩＴＲの第２の血清型は血清型６であり、ｒｅｐ遺伝子の第１の血清型は血清型１２である。本明細書に開示される方法のいずれか１つの一部の実施形態では、ＩＴＲの第２の血清型は血清型６であり、ｒｅｐ遺伝子の第１の血清型は血清型１３である。

本明細書に開示される方法のいずれか１つの一部の実施形態では、ＩＴＲの第２の血清型は、血清型１である。本明細書に開示される方法のいずれか１つの一部の実施形態では、ＩＴＲの第２の血清型は、血清型１であり、ｒｅｐ遺伝子の第１の血清型は、血清型２、３、４、１２または１３である。本明細書に開示される方法のいずれか１つの一部の実施形態では、ＩＴＲの第２の血清型は血清型１であり、ｒｅｐ遺伝子の第１の血清型は血清型２である。本明細書に開示される方法のいずれか１つの一部の実施形態では、ＩＴＲの第２の血清型は血清型１であり、ｒｅｐ遺伝子の第１の血清型は血清型３である。本明細書に開示される方法のいずれか１つの一部の実施形態では、ＩＴＲの第２の血清型は血清型１であり、ｒｅｐ遺伝子の第１の血清型は血清型４である。本明細書に開示される方法のいずれか１つの一部の実施形態では、ＩＴＲの第２の血清型は血清型１であり、ｒｅｐ遺伝子の第１の血清型は血清型１２である。本明細書に開示される方法のいずれか１つの一部の実施形態では、ＩＴＲの第２の血清型は血清型１であり、ｒｅｐ遺伝子の第１の血清型は血清型１３である。

一部の実施形態では、血清型１および２のｒｅｐ遺伝子によってコードされるＲｅｐタンパク質は、Ｎ末端に血清型１のアミノ酸を、およびＣ末端に血清型２のアミノ酸を含み、ＩＴＲの第２の血清型は血清型１である。一部の実施形態では、血清型１および２のｒｅｐ遺伝子によってコードされるＲｅｐタンパク質は、Ｎ末端に血清型１のアミノ酸を、およびＣ末端に血清型２のアミノ酸を含み、ＩＴＲの第２の血清型は血清型６である。

一部の実施形態では、血清型２および１のｒｅｐ遺伝子によってコードされるＲｅｐタンパク質は、Ｎ末端に血清型２のアミノ酸を、およびＣ末端に血清型１のアミノ酸を含み、ＩＴＲの第２の血清型は血清型１である。一部の実施形態では、血清型２および１のｒｅｐ遺伝子によってコードされるＲｅｐタンパク質は、Ｎ末端に血清型２のアミノ酸を、およびＣ末端に血清型１のアミノ酸を含み、ＩＴＲの第２の血清型は血清型６である。

一部の実施形態では、血清型２および５のｒｅｐ遺伝子によってコードされるＲｅｐタンパク質は、Ｎ末端に血清型２のアミノ酸を、およびＣ末端に血清型５のアミノ酸を含み、ＩＴＲの第２の血清型は血清型２である。

一部の実施形態では、血清型５および２のｒｅｐ遺伝子によってコードされるＲｅｐタンパク質は、Ｎ末端に血清型５のアミノ酸を、およびＣ末端に血清型２のアミノ酸を含み、ＩＴＲの第２の血清型は血清型５である。

一部の実施形態では、ｎ、ｄ、ｙおよびｚドメインはＡＡＶ２血清型であり、ｈドメインはＡＡＶ１血清型である。一部の実施形態では、ｎ、ｈ、ｙおよびｚドメインはＡＡＶ２血清型であり、ｄドメインはＡＡＶ１血清型である。一部の実施形態では、ｄ、ｈ、ｙおよびｚドメインはＡＡＶ２血清型であり、ｎドメインはＡＡＶ１血清型である。一部の実施形態では、ｎ、ｄおよびｈドメインはＡＡＶ１血清型であり、ｙおよびｚドメインはＡＡＶ１血清型である。一部の実施形態では、ｄおよびｈドメインはＡＡＶ１血清型であり、ｎ、ｙおよびｚドメインはＡＡＶ２血清型である。一部の実施形態では、ｎおよびｄドメインはＡＡＶ１血清型であり、ｈ、ｙおよびｚドメインはＡＡＶ２血清型である。

一部の実施形態では、ｎ、ｄおよびｈドメインはＡＡＶ２血清型であり、ｙおよびｚドメインはＡＡＶ３血清型である。一部の実施形態では、ｎ、ｄおよびｈドメインを有するｒｅｐ遺伝子はＡＡＶ２血清型であり、ｙおよびｚドメインを有するものはＡＡＶ３血清型であり、配列ＡＣＧの開始コドンを有する。一部の実施形態では、ｒｅｐ遺伝子はＡＡＶ３血清型であり、配列ＡＴＧの開始コドンを有する。

一部の実施形態では、ｒｅｐ遺伝子はＡＡＶ４血清型であり、配列ＡＣＧの開始コドンを有する。

一部の実施形態では、ｒｅｐ遺伝子はＡＡＶ２血清型であり、配列ＡＣＧの開始コドンを有する。

一部の実施形態では、ｎおよびｈドメインはＡＡＶ８血清型であり、ｄ、ｙおよびｚドメインはＡＡＶ２血清型である。一部の実施形態では、ｎおよびｄドメインはＡＡＶ１血清型であり、ｈ、ｙおよびｚドメインはＡＡＶ２血清型である。

一部の実施形態では、ｒｅｐ遺伝子はＡＡＶ２血清型であり、配列ＡＣＧの開始コドンを有する。一部の実施形態では、ｒｅｐ遺伝子はＡＡＶ７血清型であり、配列ＡＣＧの開始コドンを有する。

一部の実施形態では、ｎおよびｈドメインはＡＡＶ８血清型であり、ｄ、ｙおよびｚドメインはＡＡＶ２血清型であり、ｒｅｐ遺伝子は配列ＡＴＧの開始コドンを有する。一部の実施形態では、ｎ、ｈおよびｄドメインはＡＡＶ１血清型であり、ｙおよびｚドメインはＡＡＶ２血清型であり、ｒｅｐ遺伝子は配列ＡＴＧの開始コドンを有する。一部の実施形態では、ｎおよびｈドメインはＡＡＶ８血清型であり、以下のヌクレオチド：配列番号１２５にしたがうＴ５７４、Ｃ５９２、Ｃ６０７、Ａ６３７、Ｇ６４４およびＣ６５７はｄドメインにおいて欠失しており（配列番号１２６をもたらす）、ｙおよびｚドメインはＡＡＶ２血清型であり、ｒｅｐ遺伝子は配列ＡＴＧの開始コドンを有する。

一部の実施形態では、本明細書に記載される組成物のいずれか１つは、ｃａｐ遺伝子を含む核酸をさらに含む。ｃａｐ遺伝子は、任意の血清型（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３）であってよい。

本明細書に開示される方法のいずれか１つの一部の実施形態では、細胞は、ｃａｐ遺伝子を含む組換え核酸とも接触させられる。本明細書に開示される方法のいずれか１つの一部の実施形態では、ｒｅｐ遺伝子を発現し、第２の血清型の一対の末端逆位配列（ＩＴＲ）を含む組換え核酸と接触させられる細胞は、ｃａｐ遺伝子も発現する。

一部の態様では、本出願は、第１の血清型のｒｅｐ遺伝子および第２の血清型の一対のＩＴＲを含む細胞も提供する。本明細書で提供される細胞は、本明細書に開示されるＩＴＲおよびｒｅｐ遺伝子の組合せのいずれか１つを含むことができる。一部の実施形態では、本明細書で提供される細胞のいずれか１つは、ｃａｐ遺伝子をさらに含む。

以下の図は本明細書の一部を形成し、本出願の特定の態様をさらに実証するために含まれ、本出願は、本明細書に提示される具体的な実施形態の詳細な記載と一緒にこれらの図の１つまたは複数を参照することによってより深く理解することができる。図に例示されるデータは、本出願の範囲を限定するものでは決してないことを理解すべきである。

図１は、ＡＡＶ血清型１～１３のｒｅｐおよびＩＴＲ配列のアラインメントを示す。

図２は、異なるＡＡＶ血清型の間で見出される塩基対の変異を有するＡＡＶ ＩＴＲの構造を示す。ＲＢＥ：ＡＡＶ Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ６８タンパク質が結合するＲｅｐ結合性エレメント。

図３は、ＡＡＶ１対ＡＡＶ２ Ｒｅｐタンパク質配列同一性のグラフ図を示す。

図４は、標準のＡＡＶベクター生成システムを示す概略図である。

図５は、ＡＡＶ血清型１～９のためのＡＡＶ ＩＴＲおよびＲｅｐ７８のパーセント配列同一性分析を示す。

図６は、末端逆位配列（ＩＴＲ）が隣接するその２つのオープンリーディングフレームと一緒に示されるＡＡＶゲノムの概要を示す。拡大図は、Ｒｅｐタンパク質のドメインおよびＲｅｐ７８／６８／５２／４０の発現につながる転写物の図示を示す。ハイブリッドの生成のために使用されるｒｅｐ遺伝子の領域は、小文字で示す：ｎ＝Ｎ末端、ｄ＝ＤＮＡ結合性ドメイン、ｈ＝ヘリカーゼ、ｃ＝Ｃ末端、ｙ＝核局在化シグナル（ＮＬＳ）／ｐ４０プロモーター、ｚ＝ジンクフィンガードメイン。

図７Ａ～７Ｂは、ＡＡＶ１ベクター生成のためのｒｅｐ遺伝子の特徴付けおよび最適化を示す。図７Ａは、ｒｅｐ遺伝子における変異を有するＡＡＶプラスミド設計の例を示す。ｐＲ２Ｖ１は、ＡＡＶ１配列のｃａｐ遺伝子およびＡＡＶ２配列のｒｅｐ遺伝子を有するプラスミドを表す。ｐＲ２ｈ１Ｖ１は、ヘリカーゼドメイン（ｈ）がＡＡＶ１配列のものであることを除いて、ＡＡＶ１配列のｃａｐ遺伝子およびＡＡＶ２配列のｒｅｐ遺伝子を有するプラスミドを表す。ｐＲ２ｄ１Ｖ１は、ＤＮＡ結合性ドメイン（ｄ）がＡＡＶ１配列のものであることを除いて、ＡＡＶ１配列のｃａｐ遺伝子およびＡＡＶ２配列のｒｅｐ遺伝子を有するプラスミドを表す。ｐＲ２ｎ１Ｖ１は、Ｎ末端ドメイン（ｎ）がＡＡＶ１配列のものであることを除いて、ＡＡＶ１配列のｃａｐ遺伝子およびＡＡＶ２配列のｒｅｐ遺伝子を有するプラスミドを表す。ｐＲ１ｃ２Ｖ１は、ＮＬＳ／ｐ４０プロモータードメイン（ｙ）およびジンクフィンガードメイン（ｚ）からなるＣ末端（ｃ）がＡＡＶ２配列のものであることを除いて、ＡＡＶ１配列のｃａｐ遺伝子およびＡＡＶ１配列のｒｅｐ遺伝子を有するプラスミドを表す。ｐＲ１ｈｃ２Ｖ１は、Ｃ末端（ｃ）およびヘリカーゼドメイン（ｈ）がＡＡＶ２配列のものであることを除いて、ＡＡＶ１配列のｃａｐ遺伝子およびＡＡＶ１配列のｒｅｐ遺伝子を有するプラスミドを表す。ｐＲ１ｄｃ２Ｖ１は、ＤＮＡ結合性ドメイン（ｄ）およびＣ末端（ｃ）がＡＡＶ２配列のものであることを除いて、ＡＡＶ１配列のｃａｐ遺伝子およびＡＡＶ１配列のｒｅｐ遺伝子を有するプラスミドを表す。ｐＲ１ｎｃ２Ｖ１は、Ｎ末端ドメイン（ｎ）およびＣ末端（ｃ）がＡＡＶ２配列のものであることを除いて、ＡＡＶ１配列のｃａｐ遺伝子およびＡＡＶ１配列のｒｅｐ遺伝子を有するプラスミドを表す。 図７Ａ～７Ｂは、ＡＡＶ１ベクター生成のためのｒｅｐ遺伝子の特徴付けおよび最適化を示す。図７Ｂは、図７Ａに示すプラスミドのゲノムパッケージング効率を示す。ゲノムパッケージング効率は、血清型１のキャプシドタンパク質および血清型２（参照）のｒｅｐタンパク質を有する粒子と比較した、ｒＡＡＶ粒子にパッケージされたゲノムの量として計算される。

図８は、新たに生成されたＡＡＶ１生成プラスミドおよびそれらの表現型の概要を提示する。プラスミド名称、ｒｅｐ遺伝子の記載、ＶＰ発現およびゲノムパッケージング効率が示される。

図９Ａ～９Ｄは、ＡＡＶ３ベクター生成のためのｒｅｐ遺伝子の特徴付けおよび最適化を提示する。図９Ａは、天然に存在するＡＣＧ開始コドンまたはＡＴＧ開始コドンのいずれかを有するＡＡＶ２およびＡＡＶ３ ｒｅｐ変異の例を示す概略図である。図９Ｂは、図９Ａに示すプラスミドのためのキャプシドタンパク質またはＶＰタンパク質およびＲｅｐタンパク質の発現を示す。ＡＡＶ３ Ｒｅｐ７８は、ＡＣＧ開始コドンが可視的でない。図９Ｃは、図９Ａに示すＡＣＧ－Ｒ２Ｃ３、ＡＣＧ－Ｒ３Ｖ３およびＡＴＧ－Ｒ３Ｖ３の１５ｃｍプレートあたりのベクターゲノムの収量（×１０^１２）を提示する。図９Ｄは、試験したＡＡＶ３発現プラスミドのプラスミド名称および記載を示すチャートである。 図９Ａ～９Ｄは、ＡＡＶ３ベクター生成のためのｒｅｐ遺伝子の特徴付けおよび最適化を提示する。図９Ａは、天然に存在するＡＣＧ開始コドンまたはＡＴＧ開始コドンのいずれかを有するＡＡＶ２およびＡＡＶ３ ｒｅｐ変異の例を示す概略図である。図９Ｂは、図９Ａに示すプラスミドのためのキャプシドタンパク質またはＶＰタンパク質およびＲｅｐタンパク質の発現を示す。ＡＡＶ３ Ｒｅｐ７８は、ＡＣＧ開始コドンが可視的でない。図９Ｃは、図９Ａに示すＡＣＧ－Ｒ２Ｃ３、ＡＣＧ－Ｒ３Ｖ３およびＡＴＧ－Ｒ３Ｖ３の１５ｃｍプレートあたりのベクターゲノムの収量（×１０^１２）を提示する。図９Ｄは、試験したＡＡＶ３発現プラスミドのプラスミド名称および記載を示すチャートである。

図１０Ａ～１０Ｄは、ＡＡＶ４ベクター生成のためのｒｅｐ遺伝子の特徴付けおよび最適化を提示する。図１０Ａは、天然に存在するＡＣＧ開始コドンまたはＡＴＧ開始コドンのいずれかを有するＡＡＶ２およびＡＡＶ４ ｒｅｐ変異の例を示す概略図である。図１０Ｂは、図１０Ａに示すプラスミドのためのキャプシドタンパク質またはＶＰタンパク質およびＲｅｐタンパク質の発現を示す。アスタリスクは、Ａ１抗体の公知の交差反応性を表す。図１０Ｃは、図１０Ａ．４に示すＡＣＧ－Ｒ２Ｃ３、ＡＣＧ－Ｒ３Ｖ３およびＡＴＧ－Ｒ３Ｖ３の１５ｃｍプレートあたりのベクターゲノムの収量（×１０^１２）を提示する。図１０Ｄは、ＡＡＶ４発現プラスミドの名称および記載を示すチャートである。 図１０Ａ～１０Ｄは、ＡＡＶ４ベクター生成のためのｒｅｐ遺伝子の特徴付けおよび最適化を提示する。図１０Ａは、天然に存在するＡＣＧ開始コドンまたはＡＴＧ開始コドンのいずれかを有するＡＡＶ２およびＡＡＶ４ ｒｅｐ変異の例を示す概略図である。図１０Ｂは、図１０Ａに示すプラスミドのためのキャプシドタンパク質またはＶＰタンパク質およびＲｅｐタンパク質の発現を示す。アスタリスクは、Ａ１抗体の公知の交差反応性を表す。図１０Ｃは、図１０Ａ．４に示すＡＣＧ－Ｒ２Ｃ３、ＡＣＧ－Ｒ３Ｖ３およびＡＴＧ－Ｒ３Ｖ３の１５ｃｍプレートあたりのベクターゲノムの収量（×１０^１２）を提示する。図１０Ｄは、ＡＡＶ４発現プラスミドの名称および記載を示すチャートである。

図１１Ａ～１１Ｄは、ＡＡＶ５ベクター生成のためのｒｅｐ遺伝子の特徴付けおよび最適化を提示する。図１１Ａは、天然に存在するＡＣＧ開始コドンまたはＡＴＧ開始コドンのいずれかを有するＡＡＶ２およびＡＡＶ５ ｒｅｐ変異の例を示す概略図である。図１１Ｂは、図１０Ａに示すプラスミドのためのキャプシドタンパク質またはＶＰタンパク質およびＲｅｐタンパク質の発現を示す。ＡＡＶ５ Ｒｅｐ７８は、ＡＣＧ開始コドンが可視的でない。図１１Ｃは、ＡＣＧ－Ｒ２Ｖ５、ＡＣＧ－Ｒ５Ｖ５およびＡＴＧ－Ｒ５Ｖ５の１５ｃｍプレートあたりのプラスミド収量（×１０^１２）を示す。図１１Ｄは、ＡＡＶ５発現プラスミドの名称および記載を示すチャートであり、その全てはＡＡＶ５のｃａｐ遺伝子を含有する。 図１１Ａ～１１Ｄは、ＡＡＶ５ベクター生成のためのｒｅｐ遺伝子の特徴付けおよび最適化を提示する。図１１Ａは、天然に存在するＡＣＧ開始コドンまたはＡＴＧ開始コドンのいずれかを有するＡＡＶ２およびＡＡＶ５ ｒｅｐ変異の例を示す概略図である。図１１Ｂは、図１０Ａに示すプラスミドのためのキャプシドタンパク質またはＶＰタンパク質およびＲｅｐタンパク質の発現を示す。ＡＡＶ５ Ｒｅｐ７８は、ＡＣＧ開始コドンが可視的でない。図１１Ｃは、ＡＣＧ－Ｒ２Ｖ５、ＡＣＧ－Ｒ５Ｖ５およびＡＴＧ－Ｒ５Ｖ５の１５ｃｍプレートあたりのプラスミド収量（×１０^１２）を示す。図１１Ｄは、ＡＡＶ５発現プラスミドの名称および記載を示すチャートであり、その全てはＡＡＶ５のｃａｐ遺伝子を含有する。

図１２Ａ～１２Ｄは、ＡＡＶ６ベクター生成のためのｒｅｐ遺伝子の特徴付けおよび最適化を提示する。図１２Ａは、示されたプラスミドのためのキャプシドタンパク質またはＶＰタンパク質およびＲｅｐタンパク質の発現、ならびに対照（トランスフェクトされていない細胞）と比較したそれらの収量を示す。図１２Ｂは、Ｒ２Ｖ６と比較したＲ８ｄ１ｃ３Ｖ６およびＲ１ｈｃ２Ｖ６のためのゲノムパッケージング効率を提示する。図１２Ｃは、ＡＡＶ６発現プラスミドの名称および記載を示すチャートである。 図１２Ａ～１２Ｄは、ＡＡＶ６ベクター生成のためのｒｅｐ遺伝子の特徴付けおよび最適化を提示する。図１２Ａは、示されたプラスミドのためのキャプシドタンパク質またはＶＰタンパク質およびＲｅｐタンパク質の発現、ならびに対照（トランスフェクトされていない細胞）と比較したそれらの収量を示す。図１２Ｂは、Ｒ２Ｖ６と比較したＲ８ｄ１ｃ３Ｖ６およびＲ１ｈｃ２Ｖ６のためのゲノムパッケージング効率を提示する。図１２Ｃは、ＡＡＶ６発現プラスミドの名称および記載を示すチャートである。 図１２Ａ～１２Ｄは、ＡＡＶ６ベクター生成のためのｒｅｐ遺伝子の特徴付けおよび最適化を提示する。図１２Ａは、示されたプラスミドのためのキャプシドタンパク質またはＶＰタンパク質およびＲｅｐタンパク質の発現、ならびに対照（トランスフェクトされていない細胞）と比較したそれらの収量を示す。図１２Ｂは、Ｒ２Ｖ６と比較したＲ８ｄ１ｃ３Ｖ６およびＲ１ｈｃ２Ｖ６のためのゲノムパッケージング効率を提示する。図１２Ｃは、ＡＡＶ６発現プラスミドの名称および記載を示すチャートである。

図１３Ａ～１３Ｄは、ＡＡＶ７ベクター生成のためのｒｅｐ遺伝子の特徴付けおよび最適化を提示する。図１３Ａは、天然に存在するＡＣＧ開始コドンまたはＡＴＧ開始コドンのいずれかを有するＡＡＶ２およびＡＡＶ７ ｒｅｐ変異の例を示す概略図である。図１３Ｂは、図１３Ａに示すプラスミドのためのキャプシドタンパク質またはＶＰタンパク質およびＲｅｐタンパク質の発現を示す。図１３Ｃは、ＡＣＧ－Ｒ２Ｖ７、ＡＣＧ－Ｒ７Ｖ７およびＡＴＧ－Ｒ７Ｖ７の１５ｃｍプレートあたりのプラスミド収量（×１０^１２）を示す。図１３Ｄは、ＡＡＶ７発現プラスミドの名称および記載を示すチャートである。 図１３Ａ～１３Ｄは、ＡＡＶ７ベクター生成のためのｒｅｐ遺伝子の特徴付けおよび最適化を提示する。図１３Ａは、天然に存在するＡＣＧ開始コドンまたはＡＴＧ開始コドンのいずれかを有するＡＡＶ２およびＡＡＶ７ ｒｅｐ変異の例を示す概略図である。図１３Ｂは、図１３Ａに示すプラスミドのためのキャプシドタンパク質またはＶＰタンパク質およびＲｅｐタンパク質の発現を示す。図１３Ｃは、ＡＣＧ－Ｒ２Ｖ７、ＡＣＧ－Ｒ７Ｖ７およびＡＴＧ－Ｒ７Ｖ７の１５ｃｍプレートあたりのプラスミド収量（×１０^１２）を示す。図１３Ｄは、ＡＡＶ７発現プラスミドの名称および記載を示すチャートである。

図１４Ａ～１４Ｂは、ＡＡＶ８ベクター生成のためのｒｅｐ遺伝子の特徴付けおよび最適化を提示する。図１４Ａは、Ｒ２Ｖ８、Ｒ８ｃ２Ｖ８、Ｒ１ｃ２Ｖ８、Ｒ８ｎ１ｃ２Ｖ８、Ｒ８ｄ１ｃ２Ｖ８およびＲ８ｈ１ｃ２Ｖ８のための１５ｃｍプレートあたりのプラスミド収量（ｇｐ）を示す。図１４Ｂは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２およびＡＡＶ８ ｒｅｐ変異の例の概略図を示す。

図１５Ａ～１５Ｂは、本明細書に記載されるｒｅｐキメラを使用したベクター生成と比較した、「標準の」ＡＡＶベクター生成のためのゲノム含有ＡＡＶ８粒子の比の例を示す。

図１６Ａは、ＡＡＶ８発現プラスミドの名称および記載を、ｐＲ２Ｖ８と比較したそれらのゲノムパッケージング効率およびＶＰタンパク質の発現とともに示すチャートである。図１６Ｂは、図１６Ａに掲載される最後のハイブリッドのためのＡＡＶ８のＤＮＡ結合性（ｄ）ドメインにおいてヌクレオチドが欠失していることを示す。 図１６Ａは、ＡＡＶ８発現プラスミドの名称および記載を、ｐＲ２Ｖ８と比較したそれらのゲノムパッケージング効率およびＶＰタンパク質の発現とともに示すチャートである。図１６Ｂは、図１６Ａに掲載される最後のハイブリッドのためのＡＡＶ８のＤＮＡ結合性（ｄ）ドメインにおいてヌクレオチドが欠失していることを示す。

ｒＡＡＶ粒子をパッケージするために、２つの隣接ＩＴＲの間で見出されるウイルスゲノムを、１つまたは複数の制御配列（例えば、プロモーター）とともに１つまたは複数の目的の遺伝子によって置き換える。一般的に、ｒＡＡＶ粒子を構築する場合、パッケージされる遺伝子にはシス活性ＩＴＲが隣接するが、野生型ゲノムでコードされるｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子はトランスで供給することができる。ｃａｐ遺伝子は、パッケージされた遺伝物質をキャプシドに包むキャプシドタンパク質をコードする。ｒｅｐ遺伝子は、ウイルスＤＮＡの複製に関与するタンパク質をコードする。最近の１０年間で、複数の天然の血清型および変異体からの多数のＡＡＶ ｃａｐ遺伝子が、異なる遺伝子療法適用のために利用されている。一般的に、様々な血清型のｒＡＡＶ粒子をパッケージするために、血清型２のＩＴＲおよびｒｅｐ遺伝子が使用される。本出願は、異なる血清型のＩＴＲおよびｒｅｐ遺伝子を使用してｒＡＡＶ粒子をパッケージするための、新規の方法および組成物を提供する。本明細書で使用されるように、「ｒＡＡＶ粒子のパッケージング」は、１つまたは複数の目的の遺伝子を含むことができる、ＩＴＲが隣接する核酸配列のｒＡＡＶ粒子へのパッキングを意味する。

本出願の発明者らは、ｒＡＡＶ粒子のパッケージングを向上させるためにＩＴＲおよびｒｅｐ遺伝子の配列をどのように変えることができるかについて探究した。したがって、産生細胞のトランスフェクションで使用するための、キメラｒｅｐ遺伝子を含む異なる血清型のＩＴＲおよび／またはｒｅｐを含む核酸の組成物（例えば、プラスミドなどのベクターに含まれる）、ならびにｒＡＡＶ粒子の生成で使用するＩＴＲの血清型と異なる血清型のＲｅｐタンパク質を発現する細胞が本明細書で提供される。本明細書に定義されるように、「ハイブリッド」ＡＡＶ遺伝子または「キメラ」ＡＡＶタンパク質（例えば、Ｒｅｐ（例えば、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２またはＲｅｐ４０）またはキャプシドタンパク質（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３））とも呼ばれ、さらに「ハイブリッド」ＡＡＶタンパク質とも呼ばれる「キメラ」ＡＡＶ遺伝子（例えば、ｒｅｐまたはｃａｐ）は、それぞれ１つより多いＡＡＶ血清型のヌクレオチドまたはアミノ酸を有する遺伝子またはタンパク質である。

ｒＡＡＶ粒子パッケージングを向上させるための異なる血清型のＩＴＲおよびｒｅｐ遺伝子を使用する方法も、本明細書に開示される。一部の実施形態では、キメラＩＴＲおよび／またはキメラｒｅｐ遺伝子が、ｒＡＡＶ粒子パッケージングのために使用される。
ＡＡＶ構造

ＡＡＶゲノムは、正または負のいずれかのセンスの一本鎖デオキシリボ核酸（ｓｓＤＮＡ）で構築される。ＤＮＡ鎖の各末端には、末端逆位配列（ＩＴＲ）がある。ＩＴＲの間には、２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）：ｒｅｐおよびｃａｐがある。ｃａｐ ＯＲＦは、一緒に相互作用して正二十面体対称のキャプシドを形成するキャプシドタンパク質：ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３のオーバーラップするヌクレオチド配列を含有する。ＡＡＶ粒子の血清型は、キャプシドタンパク質を含む配列に起因している。

図２は、ＡＡＶ ＩＴＲの構造を示す。各ＡＡＶ ＩＴＲはヘアピンを形成し、それは、第２のＤＮＡ鎖のプライマーゼ非依存性合成を可能にするいわゆるセルフプライミングに寄与する。ＩＴＲは、宿主ＤＮＡへのＡＡＶ ＤＮＡの組入れ、効率的なキャプシド形成、および完全にアセンブルされたＤＮアーゼ抵抗性ＡＡＶ粒子の生成のために必要とされる。ＩＴＲは、ｒＡＡＶ粒子にパッケージされることが所望される１つまたは複数の遺伝子の隣にシスであることが要求されると一般的に考えられている。配列番号１～７は、血清型１～７（ＡＡＶ１～ＡＡＶ７）の野生型ＩＴＲ配列の例にそれぞれ対応する。

ｒｅｐ ＯＲＦは、ＡＡＶライフサイクルのために必要とされるＲｅｐタンパク質をコードする４つのオーバーラップする遺伝子で構成される。４つのＲｅｐタンパク質の名称は、それらのサイズをキロダルトン（ｋＤａ）で表す：Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０。Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ６８は、セルフプライミングにおいてＩＴＲによって形成されるヘアピンに結合し、ヘアピン内部の末端分解部位と呼ばれる特異的領域に作用して切断する。全ての４つのＲｅｐタンパク質はＡＴＰに結合し、ヘリカーゼ活性を有する。それらはｐ４０プロモーターからの転写を上方制御し、ｐ５およびｐ１９プロモーター活性を下方制御する。

配列番号８～２０は、血清型１～１３の野生型ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の配列の例にそれぞれ対応する。

配列番号２１～３３は、血清型１～１３の野生型ＡＡＶ Ｒｅｐ７８タンパク質の配列の例にそれぞれ対応する。Ｒｅｐ７８は、６２１アミノ酸を有する。Ｒｅｐ６８は、Ｃ末端にＲｅｐ７８のアミノ酸１～５２９および配列ＬＡＲＧＨＳＬ（配列番号３８）を含む。Ｒｅｐ５２は、Ｒｅｐ７８のアミノ酸２２５～６２１を含む。Ｒｅｐ４０は、Ｃ末端にＲｅｐ７８のアミノ酸２２５～６２１およびＬＡＲＧＨＳＬ（配列番号３８）を含む。

本明細書で定義されるように、ｒｅｐ遺伝子またはＲｅｐタンパク質は、Ｎ末端およびＣ末端（ｃ）を含み、ここで、Ｎ末端はＮ末端ドメイン（ｎ）、ＤＮＡ結合性ドメイン（ｄ）およびヘリカーゼドメイン（ｈ）を含み、Ｃ末端（ｃ）は、ＮＬＳ／ｐ４０プロモータードメイン（ｙ）およびジンクフィンガードメイン（ｚ）を含む。表１は、異なるＡＡＶ血清型のためのこれらのドメインの配列例を提示する。

一部の実施形態では、キメラｒｅｐ遺伝子が本明細書に開示される。一部の実施形態では、キメラｒｅｐ遺伝子は、ｒｅｐ遺伝子の大半の血清型または他のドメインもしくは末端の血清型とは異なる血清型の、少なくとも１つのドメイン（例えば、ｎ、ｄ、ｈ、ｙまたはｚ）または少なくとも１つの末端（例えば、Ｎ末端またはＣ末端）を有する。一部の実施形態では、Ｎ末端は、Ｃ末端の血清型（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３）と異なる血清型（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３）のものである。一部の実施形態では、Ｎ末端は１つの血清型のものであり、Ｃ末端は、第２の血清型（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３）のものである。

一部の実施形態では、ｎドメインはＡＡＶ血清型１であり、ｄ、ｈ、ｙおよびｚの各々は、ＡＡＶ１以外の血清型（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３）である。例えば、ｄ、ｈ、ｙおよびｚドメインの各々は、同じ血清型（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３）であってよい。一部の実施形態では、ｄ、ｈ、ｙおよびｚドメインの各々は、互いに異なる血清型であってよく、例えば、ｄ、ｈおよびｙはＡＡＶ２血清型であり、一方でｚはＡＡＶ３血清型であってよい。一部の実施形態では、ｎドメインはＡＡＶ血清型２であり、ｄ、ｈ、ｙおよびｚドメインの各々は、ＡＡＶ２以外の血清型（例えば、１、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３）である。ｄ、ｈ、ｙおよびｚドメインの各々の血清型は、同じであってもまたは互いに異なってもよい。一部の実施形態では、ｎドメインはＡＡＶ血清型３であり、ｄ、ｈ、ｙおよびｚドメインの各々は、ＡＡＶ３以外の血清型（例えば、１、２、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３）である。ｄ、ｈ、ｙおよびｚドメインの各々の血清型は、同じであってもまたは互いに異なってもよい。一部の実施形態では、ｎドメインはＡＡＶ血清型４であり、ｄ、ｈ、ｙおよびｚドメインの各々は、ＡＡＶ４以外の血清型（例えば、１、２、３、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３）である。ｄ、ｈ、ｙおよびｚドメインの各々の血清型は、同じであってもまたは互いに異なってもよい。一部の実施形態では、ｎドメインはＡＡＶ血清型５であり、ｄ、ｈ、ｙおよびｚドメインの各々は、ＡＡＶ５以外の血清型（例えば、１、２、３、４、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３）である。ｄ、ｈ、ｙおよびｚドメインの各々の血清型は、同じであってもまたは互いに異なってもよい。一部の実施形態では、ｎドメインはＡＡＶ血清型６であり、ｄ、ｈ、ｙおよびｚドメインの各々は、ＡＡＶ６以外の血清型（例えば、１、２、３、４、５、７、８、９、１０、１１、１２または１３）である。ｄ、ｈ、ｙおよびｚドメインの各々の血清型は、同じであってもまたは互いに異なってもよい。一部の実施形態では、ｎドメインはＡＡＶ血清型７であり、ｄ、ｈ、ｙおよびｚドメインの各々は、ＡＡＶ７以外の血清型（例えば、１、２、３、４、５、６、８、９、１０、１１、１２または１３）である。ｄ、ｈ、ｙおよびｚドメインの各々の血清型は、同じであってもまたは互いに異なってもよい。一部の実施形態では、ｎドメインはＡＡＶ血清型８であり、ｄ、ｈ、ｙおよびｚドメインの各々は、ＡＡＶ８以外の血清型（例えば、１、２、３、４、５、６、７、９、１０、１１、１２または１３）である。ｄ、ｈ、ｙおよびｚドメインの各々の血清型は、同じであってもまたは互いに異なってもよい。一部の実施形態では、ｎドメインはＡＡＶ血清型９であり、ｄ、ｈ、ｙおよびｚドメインの各々は、ＡＡＶ９以外の血清型（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、１０、１１、１２または１３）である。ｄ、ｈ、ｙおよびｚドメインの各々の血清型は、同じであってもまたは互いに異なってもよい。一部の実施形態では、ｎドメインはＡＡＶ血清型１０であり、ｄ、ｈ、ｙおよびｚドメインの各々は、ＡＡＶ１０以外の血清型（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１１、１２または１３）である。ｄ、ｈ、ｙおよびｚドメインの各々の血清型は、同じであってもまたは互いに異なってもよい。一部の実施形態では、ｎドメインはＡＡＶ血清型１１であり、ｄ、ｈ、ｙおよびｚドメインの各々は、ＡＡＶ１１以外の血清型（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２または１３）である。ｄ、ｈ、ｙおよびｚドメインの各々の血清型は、同じであってもまたは互いに異なってもよい。一部の実施形態では、ｎドメインはＡＡＶ血清型１２であり、ｄ、ｈ、ｙおよびｚドメインの各々は、ＡＡＶ１２以外の血清型（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１３）である。ｄ、ｈ、ｙおよびｚドメインの各々の血清型は、同じであってもまたは互いに異なってもよい。一部の実施形態では、ｎドメインはＡＡＶ血清型１３であり、ｄ、ｈ、ｙおよびｚドメインの各々は、ＡＡＶ１３以外の血清型（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２）である。ｄ、ｈ、ｙおよびｚドメインの各々の血清型は、同じであってもまたは互いに異なってもよい。

一部の実施形態では、ｄドメインはＡＡＶ血清型１であり、ｎ、ｈ、ｙおよびｚの各々は、ＡＡＶ１以外の血清型（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３）である。例えば、ｎ、ｈ、ｙおよびｚドメインの各々は、同じ血清型（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３）であってよい。一部の実施形態では、ｎ、ｈ、ｙおよびｚドメインの各々は、互いに異なる血清型であってよく、例えば、ｎ、ｈおよびｙはＡＡＶ２血清型であり、一方でｚはＡＡＶ３血清型であってよい。一部の実施形態では、ｄドメインはＡＡＶ血清型２であり、ｎ、ｈ、ｙおよびｚドメインの各々は、ＡＡＶ２以外の血清型（例えば、１、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３）である。ｎ、ｈ、ｙおよびｚドメインの各々の血清型は、同じであってもまたは互いに異なってもよい。一部の実施形態では、ｄドメインはＡＡＶ血清型３であり、ｎ、ｈ、ｙおよびｚドメインの各々は、ＡＡＶ３以外の血清型（例えば、１、２、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３）である。ｎ、ｈ、ｙおよびｚドメインの各々の血清型は、同じであってもまたは互いに異なってもよい。一部の実施形態では、ｄドメインはＡＡＶ血清型４であり、ｎ、ｈ、ｙおよびｚドメインの各々は、ＡＡＶ４以外の血清型（例えば、１、２、３、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３）である。ｎ、ｈ、ｙおよびｚドメインの各々の血清型は、同じであってもまたは互いに異なってもよい。一部の実施形態では、ｄドメインはＡＡＶ血清型５であり、ｎ、ｈ、ｙおよびｚドメインの各々は、ＡＡＶ５以外の血清型（例えば、１、２、３、４、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３）である。ｎ、ｈ、ｙおよびｚドメインの各々の血清型は、同じであってもまたは互いに異なってもよい。一部の実施形態では、ｎドメインはＡＡＶ血清型６であり、ｎ、ｈ、ｙおよびｚドメインの各々は、ＡＡＶ６以外の血清型（例えば、１、２、３、４、５、７、８、９、１０、１１、１２または１３）である。ｎ、ｈ、ｙおよびｚドメインの各々の血清型は、同じであってもまたは互いに異なってもよい。一部の実施形態では、ｄドメインはＡＡＶ血清型７であり、ｎ、ｈ、ｙおよびｚドメインの各々は、ＡＡＶ７以外の血清型（例えば、１、２、３、４、５、６、８、９、１０、１１、１２または１３）である。ｎ、ｈ、ｙおよびｚドメインの各々の血清型は、同じであってもまたは互いに異なってもよい。一部の実施形態では、ｎドメインはＡＡＶ血清型８であり、ｎ、ｈ、ｙおよびｚドメインの各々は、ＡＡＶ８以外の血清型（例えば、１、２、３、４、５、６、７、９、１０、１１、１２または１３）である。ｎ、ｈ、ｙおよびｚドメインの各々の血清型は、同じであってもまたは互いに異なってもよい。一部の実施形態では、ｄドメインはＡＡＶ血清型９であり、ｎ、ｈ、ｙおよびｚドメインの各々は、ＡＡＶ９以外の血清型（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、１０、１１、１２または１３）である。ｎ、ｈ、ｙおよびｚドメインの各々の血清型は、同じであってもまたは互いに異なってもよい。一部の実施形態では、ｄドメインはＡＡＶ血清型１０であり、ｎ、ｈ、ｙおよびｚドメインの各々は、ＡＡＶ１０以外の血清型（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１１、１２または１３）である。ｎ、ｈ、ｙおよびｚドメインの各々の血清型は、同じであってもまたは互いに異なってもよい。一部の実施形態では、ｄドメインはＡＡＶ血清型１１であり、ｎ、ｈ、ｙおよびｚドメインの各々は、ＡＡＶ１１以外の血清型（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２または１３）である。ｎ、ｈ、ｙおよびｚドメインの各々の血清型は、同じであってもまたは互いに異なってもよい。一部の実施形態では、ｄドメインはＡＡＶ血清型１２であり、ｎ、ｈ、ｙおよびｚドメインの各々は、ＡＡＶ１２以外の血清型（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１３）である。ｎ、ｈ、ｙおよびｚドメインの各々の血清型は、同じであってもまたは互いに異なってもよい。一部の実施形態では、ｄドメインはＡＡＶ血清型１３であり、ｎ、ｈ、ｙおよびｚドメインの各々は、ＡＡＶ１３以外の血清型（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２）である。ｎ、ｈ、ｙおよびｚドメインの各々の血清型は、同じであってもまたは互いに異なってもよい。

一部の実施形態では、ｈドメインはＡＡＶ血清型１であり、ｄ、ｎ、ｙおよびｚの各々は、ＡＡＶ１以外の血清型（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３）である。例えば、ｄ、ｎ、ｙおよびｚドメインの各々は、同じ血清型（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３）であってよい。一部の実施形態では、ｄ、ｎ、ｙおよびｚドメインの各々は、互いに異なる血清型であってよく、例えば、ｄ、ｎおよびｙはＡＡＶ２血清型であり、一方でｚはＡＡＶ３血清型であってよい。一部の実施形態では、ｈドメインはＡＡＶ血清型２であり、ｄ、ｎ、ｙおよびｚドメインの各々は、ＡＡＶ２以外の血清型（例えば、１、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３）である。ｄ、ｎ、ｙおよびｚドメインの各々の血清型は、同じであってもまたは互いに異なってもよい。一部の実施形態では、ｈドメインはＡＡＶ血清型３であり、ｄ、ｎ、ｙおよびｚドメインの各々は、ＡＡＶ３以外の血清型（例えば、１、２、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３）である。ｄ、ｎ、ｙおよびｚドメインの各々の血清型は、同じであってもまたは互いに異なってもよい。一部の実施形態では、ｈドメインはＡＡＶ血清型４であり、ｄ、ｎ、ｙおよびｚドメインの各々は、ＡＡＶ４以外の血清型（例えば、１、２、３、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３）である。ｄ、ｎ、ｙおよびｚドメインの各々の血清型は、同じであってもまたは互いに異なってもよい。一部の実施形態では、ｈドメインはＡＡＶ血清型５であり、ｄ、ｎ、ｙおよびｚドメインの各々は、ＡＡＶ５以外の血清型（例えば、１、２、３、４、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３）である。ｄ、ｎ、ｙおよびｚドメインの各々の血清型は、同じであってもまたは互いに異なってもよい。一部の実施形態では、ｈドメインはＡＡＶ血清型６であり、ｄ、ｎ、ｙおよびｚドメインの各々は、ＡＡＶ６以外の血清型（例えば、１、２、３、４、５、７、８、９、１０、１１、１２または１３）である。ｄ、ｎ、ｙおよびｚドメインの各々の血清型は、同じであってもまたは互いに異なってもよい。一部の実施形態では、ｈドメインはＡＡＶ血清型７であり、ｄ、ｎ、ｙおよびｚドメインの各々は、ＡＡＶ７以外の血清型（例えば、１、２、３、４、５、６、８、９、１０、１１、１２または１３）である。ｄ、ｎ、ｙおよびｚドメインの各々の血清型は、同じであってもまたは互いに異なってもよい。一部の実施形態では、ｈドメインはＡＡＶ血清型８であり、ｄ、ｎ、ｙおよびｚドメインの各々は、ＡＡＶ８以外の血清型（例えば、１、２、３、４、５、６、７、９、１０、１１、１２または１３）である。ｄ、ｎ、ｙおよびｚドメインの各々の血清型は、同じであってもまたは互いに異なってもよい。一部の実施形態では、ｈドメインはＡＡＶ血清型９であり、ｄ、ｎ、ｙおよびｚドメインの各々は、ＡＡＶ９以外の血清型（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、１０、１１、１２または１３）である。ｄ、ｎ、ｙおよびｚドメインの各々の血清型は、同じであってもまたは互いに異なってもよい。一部の実施形態では、ｈドメインはＡＡＶ血清型１０であり、ｄ、ｎ、ｙおよびｚドメインの各々は、ＡＡＶ１０以外の血清型（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１１、１２または１３）である。ｄ、ｎ、ｙおよびｚドメインの各々の血清型は、同じであってもまたは互いに異なってもよい。一部の実施形態では、ｈドメインはＡＡＶ血清型１１であり、ｄ、ｎ、ｙおよびｚドメインの各々は、ＡＡＶ１１以外の血清型（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２または１３）である。ｄ、ｎ、ｙおよびｚドメインの各々の血清型は、同じであってもまたは互いに異なってもよい。一部の実施形態では、ｈドメインはＡＡＶ血清型１２であり、ｄ、ｎ、ｙおよびｚドメインの各々は、ＡＡＶ１２以外の血清型（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１３）である。ｄ、ｎ、ｙおよびｚドメインの各々の血清型は、同じであってもまたは互いに異なってもよい。一部の実施形態では、ｈドメインはＡＡＶ血清型１３であり、ｄ、ｎ、ｙおよびｚドメインの各々は、ＡＡＶ１３以外の血清型（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２）である。ｄ、ｎ、ｙおよびｚドメインの各々の血清型は、同じであってもまたは互いに異なってもよい。

一部の実施形態では、ｙドメインはＡＡＶ血清型１であり、ｎ、ｄ、ｈおよびｚの各々は、ＡＡＶ１以外の血清型（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３）である。例えば、ｎ、ｄ、ｈおよびｚドメインの各々は、同じ血清型（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３）であってよい。一部の実施形態では、ｎ、ｄ、ｈおよびｚドメインの各々は、互いに異なる血清型であってよく、例えば、ｄ、ｈはＡＡＶ２血清型であり、一方でｚはＡＡＶ３血清型であってよい。一部の実施形態では、ｙドメインはＡＡＶ血清型２であり、ｎ、ｄ、ｈおよびｚドメインの各々は、ＡＡＶ２以外の血清型（例えば、１、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３）である。ｎ、ｄ、ｈおよびｚドメインの各々の血清型は、同じであってもまたは互いに異なってもよい。一部の実施形態では、ｙドメインはＡＡＶ血清型３であり、ｎ、ｄ、ｈおよびｚドメインの各々は、ＡＡＶ３以外の血清型（例えば、１、２、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３）である。ｎ、ｄ、ｈおよびｚドメインの各々の血清型は、同じであってもまたは互いに異なってもよい。一部の実施形態では、ｙドメインはＡＡＶ血清型４であり、ｎ、ｄ、ｈおよびｚドメインの各々は、ＡＡＶ４以外の血清型（例えば、１、２、３、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３）である。ｎ、ｄ、ｈおよびｚドメインの各々の血清型は、同じであってもまたは互いに異なってもよい。一部の実施形態では、ｙドメインはＡＡＶ血清型５であり、ｎ、ｄ、ｈおよびｚドメインの各々は、ＡＡＶ５以外の血清型（例えば、１、２、３、４、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３）である。ｎ、ｄ、ｈおよびｚドメインの各々の血清型は、同じであってもまたは互いに異なってもよい。一部の実施形態では、ｙドメインはＡＡＶ血清型６であり、ｎ、ｄ、ｈおよびｚドメインの各々は、ＡＡＶ６以外の血清型（例えば、１、２、３、４、５、７、８、９、１０、１１、１２または１３）である。ｎ、ｄ、ｈおよびｚドメインの各々の血清型は、同じであってもまたは互いに異なってもよい。一部の実施形態では、ｙドメインはＡＡＶ血清型７であり、ｎ、ｄ、ｈおよびｚドメインの各々は、ＡＡＶ７以外の血清型（例えば、１、２、３、４、５、６、８、９、１０、１１、１２または１３）である。ｎ、ｄ、ｈおよびｚドメインの各々の血清型は、同じであってもまたは互いに異なってもよい。一部の実施形態では、ｙドメインはＡＡＶ血清型８であり、ｎ、ｄ、ｈおよびｚドメインの各々は、ＡＡＶ８以外の血清型（例えば、１、２、３、４、５、６、７、９、１０、１１、１２または１３）である。ｎ、ｄ、ｈおよびｚドメインの各々の血清型は、同じであってもまたは互いに異なってもよい。一部の実施形態では、ｙドメインはＡＡＶ血清型９であり、ｎ、ｄ、ｈおよびｚドメインの各々は、ＡＡＶ９以外の血清型（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、１０、１１、１２または１３）である。ｎ、ｄ、ｈおよびｚドメインの各々の血清型は、同じであってもまたは互いに異なってもよい。一部の実施形態では、ｙドメインはＡＡＶ血清型１０であり、ｎ、ｄ、ｈおよびｚドメインの各々は、ＡＡＶ１０以外の血清型（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１１、１２または１３）である。ｎ、ｄ、ｈおよびｚドメインの各々の血清型は、同じであってもまたは互いに異なってもよい。一部の実施形態では、ｙドメインはＡＡＶ血清型１１であり、ｎ、ｄ、ｈおよびｚドメインの各々は、ＡＡＶ１１以外の血清型（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２または１３）である。ｎ、ｄ、ｈおよびｚドメインの各々の血清型は、同じであってもまたは互いに異なってもよい。一部の実施形態では、ｙドメインはＡＡＶ血清型１２であり、ｎ、ｄ、ｈおよびｚドメインの各々は、ＡＡＶ１２以外の血清型（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１３）である。ｎ、ｄ、ｈおよびｚドメインの各々の血清型は、同じであってもまたは互いに異なってもよい。一部の実施形態では、ｙドメインはＡＡＶ血清型１３であり、ｎ、ｄ、ｈおよびｚドメインの各々は、ＡＡＶ１３以外の血清型（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２）である。ｎ、ｄ、ｈおよびｚドメインの各々の血清型は、同じであってもまたは互いに異なってもよい。

一部の実施形態では、ｚドメインはＡＡＶ血清型１であり、ｎ、ｄ、ｈおよびｙの各々は、ＡＡＶ１以外の血清型（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３）である。例えば、ｎ、ｄ、ｈおよびｙドメインの各々は、同じ血清型（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３）であってよい。一部の実施形態では、ｎ、ｄ、ｈおよびｙドメインの各々は、互いに異なる血清型であってよく、例えば、ｄ、ｈはＡＡＶ２血清型であり、一方でｚはＡＡＶ３血清型であってよい。一部の実施形態では、ｚドメインはＡＡＶ血清型２であり、ｎ、ｄ、ｈおよびｙドメインの各々は、ＡＡＶ２以外の血清型（例えば、１、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３）である。ｎ、ｄ、ｈおよびｙドメインの各々の血清型は、同じであってもまたは互いに異なってもよい。一部の実施形態では、ｚドメインはＡＡＶ血清型３であり、ｎ、ｄ、ｈおよびｙドメインの各々は、ＡＡＶ３以外の血清型（例えば、１、２、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３）である。ｎ、ｄ、ｈおよびｙドメインの各々の血清型は、同じであってもまたは互いに異なってもよい。一部の実施形態では、ｚドメインはＡＡＶ血清型４であり、ｎ、ｄ、ｈおよびｙドメインの各々は、ＡＡＶ４以外の血清型（例えば、１、２、３、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３）である。ｎ、ｄ、ｈおよびｙドメインの各々の血清型は、同じであってもまたは互いに異なってもよい。一部の実施形態では、ｚドメインはＡＡＶ血清型５であり、ｎ、ｄ、ｈおよびｙドメインの各々は、ＡＡＶ５以外の血清型（例えば、１、２、３、４、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３）である。ｎ、ｄ、ｈおよびｙドメインの各々の血清型は、同じであってもまたは互いに異なってもよい。一部の実施形態では、ｚドメインはＡＡＶ血清型６であり、ｎ、ｄ、ｈおよびｙドメインの各々は、ＡＡＶ６以外の血清型（例えば、１、２、３、４、５、７、８、９、１０、１１、１２または１３）である。ｎ、ｄ、ｈおよびｙドメインの各々の血清型は、同じであってもまたは互いに異なってもよい。一部の実施形態では、ｚドメインはＡＡＶ血清型７であり、ｎ、ｄ、ｈおよびｙドメインの各々は、ＡＡＶ７以外の血清型（例えば、１、２、３、４、５、６、８、９、１０、１１、１２または１３）である。ｎ、ｄ、ｈおよびｙドメインの各々の血清型は、同じであってもまたは互いに異なってもよい。一部の実施形態では、ｚドメインはＡＡＶ血清型８であり、ｎ、ｄ、ｈおよびｙドメインの各々は、ＡＡＶ８以外の血清型（例えば、１、２、３、４、５、６、７、９、１０、１１、１２または１３）である。ｎ、ｄ、ｈおよびｙドメインの各々の血清型は、同じであってもまたは互いに異なってもよい。一部の実施形態では、ｚドメインはＡＡＶ血清型９であり、ｎ、ｄ、ｈおよびｙドメインの各々は、ＡＡＶ９以外の血清型（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、１０、１１、１２または１３）である。ｎ、ｄ、ｈおよびｙドメインの各々の血清型は、同じであってもまたは互いに異なってもよい。一部の実施形態では、ｚドメインはＡＡＶ血清型１０であり、ｎ、ｄ、ｈおよびｙドメインの各々は、ＡＡＶ１０以外の血清型（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１１、１２または１３）である。ｎ、ｄ、ｈおよびｙドメインの各々の血清型は、同じであってもまたは互いに異なってもよい。一部の実施形態では、ｚドメインはＡＡＶ血清型１１であり、ｎ、ｄ、ｈおよびｙドメインの各々は、ＡＡＶ１１以外の血清型（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２または１３）である。ｎ、ｄ、ｈおよびｙドメインの各々の血清型は、同じであってもまたは互いに異なってもよい。一部の実施形態では、ｚドメインはＡＡＶ血清型１２であり、ｎ、ｄ、ｈおよびｙドメインの各々は、ＡＡＶ１２以外の血清型（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１３）である。ｎ、ｄ、ｈおよびｙドメインの各々の血清型は、同じであってもまたは互いに異なってもよい。一部の実施形態では、ｚドメインはＡＡＶ血清型１３であり、ｎ、ｄ、ｈおよびｙドメインの各々は、ＡＡＶ１３以外の血清型（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２）である。ｎ、ｄ、ｈおよびｙドメインの各々の血清型は、同じであってもまたは互いに異なってもよい。

図７～１６は、キメラｒｅｐ遺伝子の例を提示する。ドメインの任意の組合せが、他のドメインの血清型と異なる血清型であってよいことを理解すべきである。例えば、１つのドメインだけが、他のドメインの血清型と異なる血清型を有することができる。一部の実施形態では、５つの全てのドメインは、異なる血清型を有する。一部の実施形態では、キメラｒｅｐ遺伝子のドメインは、２つの異なる血清型（例えば、Ｒ１ｈ２、すなわち、ＡＡＶ２のｈドメインおよびＡＡＶ１の他のドメイン）である。一部の実施形態では、キメラｒｅｐ遺伝子のドメインは、３つの異なる血清型である（例えば、Ｒ１ｃ３ｈ４、すなわち、ＡＡＶ３のＣ末端、ＡＡＶ４のｈドメインならびにＡＡ１のｎおよびｄドメイン）。一部の実施形態では、キメラｒｅｐ遺伝子のドメインは、４つの異なる血清型である（例えば、Ｒ１ｈ２ｄ３ｙ４、すなわち、ＡＡ２のｈドメイン、ＡＡＶ３のｄドメイン、ＡＡＶ３のｙドメインならびにＡＡＶ１のｎおよびｙドメイン）。一部の実施形態では、キメラｒｅｐ遺伝子のドメインは、５つの異なる血清型である（例えば、Ｒ１ｎ２ｄ３ｈ４ｙ８）。

一部の実施形態では、ドメインは短縮される。一部の実施形態では、キメラｒｅｐ遺伝子のドメインは、ドメインのＮ末端で短縮される。一部の実施形態では、キメラｒｅｐ遺伝子は、ドメインのＣ末端で短縮される。一部の実施形態では、ドメインは、不連続のヌクレオチドが欠失するように改変される。一部の実施態様では、ドメインは１～１８ヌクレオチド（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７または１８ヌクレオチド）短縮される。例えば、ｄドメインは、Ｎ末端またはＣ末端のいずれかで６ヌクレオチド短縮されてもよい。

一部の実施形態では、本明細書に記載されるｒｅｐ遺伝子のいずれも、配列ＡＣＧを有する開始コドンを含む。一部の実施形態では、本明細書に記載されるｒｅｐ遺伝子のいずれも、ＡＣＧ以外のまたはそれとは異なる配列を有する開始コドンを含む。一部の実施形態では、ＡＣＧと異なる配列を有する開始コドンは、ＡＴＧである。

本開示は、本明細書に開示されるキメラｒｅｐ遺伝子のいずれか１つによってコードされる任意のキメラＲｅｐタンパク質、ならびに本明細書に開示されるキメラＲｅｐタンパク質のいずれか１つをコードすることができる任意のキメラｒｅｐ遺伝子も提供することも理解すべきである。

本出願の一部の実施形態では、Ｒｅｐタンパク質は、１つより多いＡＡＶ血清型からのアミノ酸配列を含むという点で、キメラである。一部の実施形態では、キメラＲｅｐタンパク質は、１つのＡＡＶ血清型（例えば、ＡＡＶ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３）からのアミノ酸を含むＮ末端、および別のＡＡＶ血清型（例えば、ＡＡＶ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３）からのアミノ酸を含むＣ末端を含むことができる。例えば、Ｒｅｐタンパク質は、ＡＡＶ１
Ｒｅｐタンパク質の対応するアミノ酸を含むＮ末端およびＡＡＶ２ Ｒｅｐタンパク質の対応するアミノ酸を含むＣ末端を含むことができる（例えば、ＡＡＶ１のＮ末端およびＡＡＶ２のＣ末端を含むＲｅｐ７８の配列番号３４）。Ｒｅｐタンパク質は、ＡＡＶ２ Ｒｅｐタンパク質の対応するアミノ酸を含むＮ末端およびＡＡＶ１ Ｒｅｐタンパク質の対応するアミノ酸を含むＣ末端を含むことができる（例えば、ＡＡＶ２のＮ末端およびＡＡＶ１のＣ末端を含むＲｅｐ７８の配列番号３５）。別の非限定例では、Ｒｅｐタンパク質は、ＡＡＶ２ Ｒｅｐタンパク質の対応するアミノ酸を含むＮ末端およびＡＡＶ５ Ｒｅｐタンパク質の対応するアミノ酸を含むＣ末端を含む（例えば、ＡＡＶ２のＮ末端およびＡＡＶ５のＣ末端を含むＲｅｐ７８の配列番号３６）。別の非限定例では、Ｒｅｐタンパク質は、ＡＡＶ５ Ｒｅｐタンパク質の対応するアミノ酸を含むＮ末端およびＡＡＶ２
Ｒｅｐタンパク質の対応するアミノ酸を含むＣ末端を含む（例えば、ＡＡＶ５のＮ末端およびＡＡＶ２のＣ末端を含むＲｅｐ７８の配列番号３７）。一部の実施形態では、Ｒｅｐタンパク質は、２つより多いＡＡＶ血清型（例えば、３つ、４つまたは５つのＡＡＶ血清型）の対応するアミノ酸を含む。３つのＡＡＶ血清型の対応するアミノ酸を含むＲｅｐタンパク質の非限定例は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２およびＡＡＶ５からの対応するアミノ酸を有するＲｅｐタンパク質である。本明細書で使用される用語「対応するアミノ酸」は、異なるＡＡＶ血清型のアミノ酸配列において互いにアラインメントする位置のアミノ酸を意味する。一部の実施形態では、２つのＡＡＶ血清型の間の対応するアミノ酸は、同じ位置を有する。一部の実施形態では、２つのＡＡＶ血清型の間の対応するアミノ酸は、互いから１～５アミノ酸ずれた位置にある。アミノ酸配列をアラインメントさせる方法は当技術分野で公知であり、そのようなアラインメントを実行するアルゴリズムも容易に入手できる。例えば、Ｍｉｃｈａｅｌ Ｓ． Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ， Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ： Ｍｅｔｈｏｄｓ， Ｍｏｄｅｌｓ， Ｃｏｎｃｅｐｔｓ， ａｎｄ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ， ２００９、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｊｓｔｏｒ．ｏｒｇ／ｓｔａｂｌｅ／１０．１５２５／ｊ．ｃｔｔ１ｐｐｓ７ｔを参照。例えば、ＡＡＶ ＩＴＲおよび／またはＲｅｐタンパク質のアラインメントは、Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＬＡＳＴ、ｈｔｔｐｓ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ？ＰＲＯＧＲＡＭ＝ｂｌａｓｔｐ＆ＰＡＧＥ＿ＴＹＰＥ＝ＢｌａｓｔＳｅａｒｃｈ＆ＢＬＡＳＴ＿ＳＰＥＣ＝ｂｌａｓｔ２ｓｅｑ＆ＬＩＮＫ＿ＬＯＣ＝ｂｌａｓｔｔａｂ．を使用して実行することができる。

粒子をパッケージする方法
ｒＡＡＶ粒子の生成方法は当技術分野で公知であり、試薬は市販されている（例えば、Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｒｏｔｙｐｅ １， ２， ａｎｄ ５ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ２８ （２００２） １５８－１６７；ならびに、米国特許出願公開第２００７００１５２３８号および米国特許出願公開第２０１２０３２２８６１号を参照、これらは参照により本明細書に組み込まれる；プラスミドおよびキットはＡＴＣＣおよびＣｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．から入手可能である）。

一般的に、ｒＡＡＶの生成は、細胞を培養すること、細胞にパッケージすることが所望されるＡＡＶ遺伝子および任意の目的の遺伝子（例えば、ＩＴＲが隣接している）を導入すること、ならびに細胞にｒＡＡＶを生成し、パッケージさせることを含む。最後のステップの後に、ｒＡＡＶ粒子の採収および以降の精製ステップが続く。ＡＡＶ遺伝子およびｒＡＡＶ粒子にパッケージすることが所望される任意の遺伝子は、トランスフェクション方法（例えば、プラスミドベクターおよびトランスフェクション剤を使用する）または感染方法（例えば、ウイルスベクターを使用する）のいずれかによって細胞に導入することができる。

一部の実施形態では、１つまたは複数の目的の遺伝子、ｒｅｐ遺伝子（例えば、野生型または組換え（例えば、キメラ）の本出願に記載のＲｅｐタンパク質をコードする）、ｃａｐ遺伝子およびヘルパー遺伝子（例えば、Ｅ１ａ遺伝子、Ｅ１ｂ遺伝子、Ｅ４遺伝子、Ｅ２ａ遺伝子およびＶＡ遺伝子）が細胞に導入され、ここで、細胞がベクターによってトランスフェクトまたは感染するために、遺伝子は１つまたは複数のベクター（例えば、プラスミド）に含まれる。明瞭さのために、ヘルパー遺伝子は、ヘルパータンパク質Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ４、Ｅ２ａおよびＶＡをコードする遺伝子である。一部の実施形態では、１つまたは複数の目的の遺伝子およびそれらが作動可能に連結される制御エレメントだけが、１つのベクターの中に含まれ、一方ｒｅｐ、ｃａｐおよびヘルパー遺伝子の１つまたは複数は、別個のベクターの１つまたは複数の中に含まれる。例えば、第１のベクターは１つまたは複数の目的の遺伝子を含むことができ、一方第２のベクターはｒｅｐ、ｃａｐおよびヘルパー遺伝子を含むことができる。一部の実施形態では、第１のベクターは１つまたは複数の目的の遺伝子を含むことができ、一方で第２のベクターはｒｅｐを含むことができ、第３のベクターはヘルパー遺伝子およびｃａｐを含むことができる。一部の実施形態では、第１のベクターは１つまたは複数の目的の遺伝子を含むことができ、一方で第２のベクターはｒｅｐを含むことができ、第３のベクターはヘルパー遺伝子を含むことができ、第４のベクターはｃａｐを含むことができる。

一部の実施形態では、目的の遺伝子またはＡＡＶ遺伝子を産生細胞へ送達するために使用される核酸ベクターは、環状である。一部の実施形態では、核酸ベクターは、一本鎖である。一部の実施形態では、核酸ベクターは、二本鎖である。一部の実施形態では、二本鎖の核酸ベクターは、例えば、核酸ベクターの別の領域に相補的である核酸ベクターの領域を含有し、核酸ベクターの二本鎖の形成を開始する、自己相補的ベクターであってよい。

本明細書に開示される方法のいずれか１つの一部の実施形態では、ＩＴＲが隣接する核酸領域（例えば、異種核酸領域）は、１つまたは複数の目的の遺伝子を含む。ＩＴＲが隣接する核酸領域は、１つまたは複数の目的の遺伝子に作動可能に連結される制御エレメントを含むこともできる。一部の実施形態では、ｒｅｐ遺伝子またはｃａｐ遺伝子のいずれか、またはｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子の両方がＩＴＲに隣接する。

一部の実施形態では、１つまたは複数の目的の遺伝子が既に導入されている細胞は、ｒＡＡＶ粒子をパッケージするのに有益である、１つのｒｅｐ遺伝子、ｃａｐ遺伝子および／またはヘルパー遺伝子の１つまたは複数を含む。非限定的な例として、細胞は、既にｒｅｐを含み、Ｒｅｐタンパク質Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０を発現することができる。Ｒｅｐタンパク質を発現するそのような細胞に、ＩＴＲに隣接し目的の遺伝子を含むベクター、ならびにｃａｐおよびヘルパー遺伝子を発現するベクターを導入することができる。一部の実施形態では、細胞はｒｅｐおよびヘルパー遺伝子を既に含んでいてもよい。

細胞をトランスフェクトする方法は、当技術分野で公知である。細胞をトランスフェクトする非限定的な方法は、ＣａＰＯ４媒介トランスフェクション、脂質またはポリマー分子、例えばポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を使用したトランスフェクション、および電気穿孔法である。ウイルスベクター（例えば、ＨＳＶベクターまたはバキュロウイルス）を使用して、細胞に核酸を導入することもできる。

１つまたは複数の目的の遺伝子、ｒｅｐ遺伝子、ｃａｐ遺伝子およびヘルパー遺伝子の１つまたは複数を、それらがトランスフェクションまたは感染によって細胞に入る方法で細胞に導入した後、ｒＡＡＶ粒子が細胞内で生成され、細胞から脱出する条件下で、細胞はインキュベートされる。当技術分野で公知であるかまたは本明細書に記載される任意の方法を使用して、例えば、イオジキサノール段階勾配、ＣｓＣｌ勾配、クロマトグラフィーまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿によって、ｒＡＡＶ粒子を次に精製することができる。

異なる血清型のＩＴＲおよびｒｅｐの組合せ、ならびにまたはキメラｒｅｐ遺伝子を使用して、ＡＡＶ粒子のパッケージングを向上させること
ｒＡＡＶ粒子を生成またはパッケージする任意の方法におけるそれらの使用が、同じ血清型のＩＴＲおよびｒｅｐ遺伝子が使用される類似条件と比較してより大きなパッケージングまたは生成効率をもたらすような、異なる血清型のｒｅｐおよびＩＴＲの組合せが、ここで開示される。したがって、ｒＡＡＶ粒子をパッケージする方法であって、第１の血清型のｒｅｐ遺伝子を発現する細胞を、第２の血清型の一対のＩＴＲを含む組換え核酸と接触させることを含む方法も本明細書で開示される。一部の実施形態では、第１の血清型および第２の血清型は同じである。一部の実施形態では、第１および第２の血清型は異なる。

本明細書に開示されるｒＡＡＶ粒子生成方法のいずれか１つに関する一部の実施形態では、ｒｅｐ遺伝子は、ｒｅｐ遺伝子をコードする核酸によって細胞をトランスフェクトまたは感染させることによって本明細書に開示される産生細胞のいずれか１つにおいて発現される。

一部の実施形態では、ｒｅｐ遺伝子の第１の血清型は、血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２および１３のいずれか１つである。一部の実施形態では、ＡＡＶ ＩＴＲの第２の血清型は、血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２および１３のいずれか１つである。一部の実施形態では、ｒｅｐのための第１の血清型のいずれか１つは、ＩＴＲのためのいずれかの血清型とともに使用される。例えば、血清型１のｒｅｐは、血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２および１３のいずれか１つのＩＴＲとともに使用することができる。別の例として、血清型２のｒｅｐは、血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２および１３のいずれか１つのＩＴＲとともに使用することができる、等である。

一部の実施形態では、血清型１のｒｅｐは、血清型１、２、３、４または７のＩＴＲとともに使用される。

一部の実施形態では、血清型６のＩＴＲは、血清型２、３、４、６、１２または１３のｒｅｐとともに使用される。一部の実施形態では、血清型１のＩＴＲは、血清型２、３、４、１２または１３のｒｅｐとともに使用される。

一部の実施形態では、ｒｅｐ遺伝子はキメラである。キメラＡＡＶ遺伝子は、１つより多い血清型のアミノ酸を含むものである。配列番号３４～３７は、キメラＲｅｐ７８タンパク質の例を提供する。一部の実施形態では、血清型６のＩＴＲは、血清型１および２のキメラｒｅｐとともに使用される。一部の実施形態では、血清型１のＩＴＲは、血清型１および２のキメラｒｅｐとともに使用される。一部の実施形態では、血清型２のＩＴＲは、血清型２および５のキメラｒｅｐとともに使用される。一部の実施形態では、血清型５のＩＴＲは、血清型２および５のキメラｒｅｐとともに使用される。

キメラｒｅｐ遺伝子およびＲｅｐタンパク質が上に記載され、本明細書に記載されるｒＡＡＶ粒子のパッケージング方法のいずれか１つにおいて使用することができる。

一部の実施形態では、キメラＲｅｐタンパク質は、Ｎ末端に第１の血清型の対応するアミノ酸を、およびＣ末端に第２の血清型の対応するアミノ酸を含むことができる。例えば、Ｒｅｐタンパク質は、Ｎ末端に血清型１のアミノ酸を、およびＣ末端に血清型２のアミノ酸を含むことができる。一部の実施形態では、Ｒｅｐタンパク質は、Ｎ末端に血清型２のアミノ酸を、およびＣ末端に血清型１のアミノ酸を含むことができる。一部の実施形態では、Ｒｅｐタンパク質は、Ｎ末端に血清型２のアミノ酸を、およびＣ末端に血清型５のアミノ酸を含むことができる。一部の実施形態では、Ｒｅｐタンパク質は、Ｎ末端に血清型５のアミノ酸を、およびＣ末端に血清型２のアミノ酸を含むことができる。キメラｒｅｐ遺伝子は、任意の血清型または偽血清型（ｐｓｅｕｄｏ－ｓｅｒｏｔｙｐｅ）のｒＡＡＶ粒子を生成するために、任意の血清型のＩＴＲと組み合わせて使用することができることを理解すべきである。表２は、ｒＡＡＶ粒子生成を向上させるために、異なる血清型のＩＴＲとともに使用することができるｒｅｐ血清型の組合せの例を提示する。表２に提示されるＩＴＲおよびｒｅｐ遺伝子の組合せに加えて、いずれか１つのキメラｒｅｐ遺伝子またはキメラＲｅｐタンパク質は、本明細書に記載されるＩＴＲのいずれか１つと組み合わせて使用することができ、それは次に、ｒＡＡＶ粒子を生成するために本明細書に記載されるｃａｐ遺伝子およびキャプシドタンパク質のいずれか１つとともに使用することができることを理解すべきである。

表２．生成および試験されるＩＴＲおよびＲｅｐの組合せ（キメラの例を含む）の例
１．ＡＡＶ１＿ＩＴＲ＋ＡＡＶ１＿Ｒｅｐ
２．ＡＡＶ２＿ＩＴＲ＋ＡＡＶ１＿Ｒｅｐ
３．ＡＡＶ３＿ＩＴＲ＋ＡＡＶ１＿Ｒｅｐ
４．ＡＡＶ４＿ＩＴＲ＋ＡＡＶ１＿Ｒｅｐ
５．ＡＡＶ７＿ＩＴＲ＋ＡＡＶ１＿Ｒｅｐ
６．ＡＡＶ６＿ＩＴＲ＋ＡＡＶ２＿Ｒｅｐ
７．ＡＡＶ６＿ＩＴＲ＋ＡＡＶ３＿Ｒｅｐ
８．ＡＡＶ６＿ＩＴＲ＋ＡＡＶ４＿Ｒｅｐ
９．ＡＡＶ６＿ＩＴＲ＋ＡＡＶ６＿Ｒｅｐ
１０．ＡＡＶ６＿ＩＴＲ＋ＡＡＶ１２＿Ｒｅｐ
１１．ＡＡＶ６＿ＩＴＲ＋ＡＡＶ１３＿Ｒｅｐ
１２．ＡＡＶ１＿ＩＴＲ＋ＡＡＶ２＿Ｒｅｐ
１３．ＡＡＶ１＿ＩＴＲ＋ＡＡＶ３＿Ｒｅｐ
１４．ＡＡＶ１＿ＩＴＲ＋ＡＡＶ４＿Ｒｅｐ
１５．ＡＡＶ１＿ＩＴＲ＋ＡＡＶ１２＿Ｒｅｐ
１６．ＡＡＶ１＿ＩＴＲ＋ＡＡＶ１３＿Ｒｅｐ
１７．ＡＡＶ６＿ＩＴＲ＋ＡＡＶ１Ｎ／２Ｃ＿キメラ＿Ｒｅｐ
１８．ＡＡＶ１＿ＩＴＲ＋ＡＡＶ１Ｎ／２Ｃ＿キメラ＿Ｒｅｐ
１９．ＡＡＶ６＿ＩＴＲ＋ＡＡＶ２Ｎ／１Ｃ＿キメラ＿Ｒｅｐ
２０．ＡＡＶ１＿ＩＴＲ＋ＡＡＶ２Ｎ／１Ｃ＿キメラ＿Ｒｅｐ
２１．ＡＡＶ２＿ＩＴＲ＋ＡＡＶ２Ｎ／５Ｃ＿キメラ＿Ｒｅｐ
２２．ＡＡＶ５＿ＩＴＲ＋ＡＡＶ５Ｎ／２Ｃ＿キメラ＿Ｒｅｐ

産生細胞
本明細書に開示される異なる血清型のＩＴＲ、ｃａｐおよび／またはｒｅｐの組合せを使用してｒＡＡＶ粒子を生成するために使用される細胞が、本明細書で提供される。したがって、一部の実施形態では、本明細書に開示される産生細胞は、第１のＡＡＶ血清型のｒｅｐおよび第２のＡＡＶ血清型のＩＴＲを含む。一部の実施形態では、本明細書に開示される産生細胞は、ｒｅｐおよびＩＴＲの組合せを含み、ここで、ｒｅｐおよびＩＴＲの血清型は本明細書に開示される組合せのいずれか１つである。

一部の実施形態では、パッケージングは、ヘルパー細胞または産生細胞、例えば哺乳動物細胞または昆虫細胞において行われる。例示的な哺乳動物細胞には、限定されずに、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ細胞またはＣＨＯ細胞（例えば、ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１５７３（商標）、ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１６５１（商標）、ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１６５０（商標）、ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－２、ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－１０（商標）またはＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－６１（商標）を参照）が含まれる。例示的な昆虫細胞には、限定されずに、Ｓｆ９細胞（例えば、ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１７１１（商標）を参照）が含まれる。ヘルパー細胞は、本明細書に記載される方法で使用するためのＲｅｐタンパク質および／またはＣａｐタンパク質をコードするｒｅｐおよび／またはｃａｐ遺伝子を含むことができる。一部の実施形態では、パッケージングは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで行われる。

ｒＡＡＶ粒子収量の向上
ＩＴＲおよびＲｅｐタンパク質の血清型の特定の組合せ以外は同じであるｒＡＡＶ生成プロセスと比較して、本明細書に記載される方法のいずれか１つを使用して、組換えＡＡＶ粒子の収量を向上させることができる。一部の実施形態では、粒子の収量は、生成されるｒＡＡＶ粒子の量によって規定される。一部の実施形態では、粒子の収量は、生成される完全なｒＡＡＶ粒子（すなわち、核酸またはゲノムを含有するもの）の量によって規定される。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子の収量は、ｒＡＡＶのパッケージングのために血清型２のＩＴＲが使用される場合と比較して増加する。一部の実施形態では、ＩＴＲおよびＲｅｐタンパク質の血清型の特定の組合せのいずれか１つを含むｒＡＡＶ生成の収量は、血清型２のＩＴＲが使用されるｒＡＡＶ生成プロセスと比較して、２～２０％（例えば、２～４％、２～１０％、５～１０％、５～２０％、１５～２０％または１０～２０％）または、さらに最大で５～１０倍もしくは１００倍もしくはそれより多く（例えば、最大で２倍、最大で３倍、最大で５倍、最大で１０倍、最大で２０倍、最大で５０倍または最大で１００倍またはそれより多く）増加することができる。

本明細書に記載されるキメラｒｅｐ遺伝子のいずれか１つを使用することによって、キメラ遺伝子の大半のヌクレオチドに最も近い野生型血清型である血清型のｒｅｐ遺伝子を使用する生成プロセスを使用して生成されたｒＡＡＶ粒子と比較して、組換えＡＡＶ粒子の収量を向上させることができる。例えば、ＡＡＶ２のＩＴＲ、ＡＡＶ３のｃａｐ、および、血清型８のｈドメイン（Ｒ２ｈ８）を有することを除いて血清型２のキメラｒｅｐを使用して生成される粒子のパッケージングまたは粒子収量は、ＡＡＶ２のＩＴＲ、ＡＡＶ３のｃａｐおよびＡＡＶ２のｒｅｐを使用して生成される粒子のパッケージング収量と比較することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載されるパッケージング収量は、ＡＡＶ２のＩＴＲおよびＡＡＶ２のｒｅｐで作製される同じ血清型の粒子のものと比較される。一部の実施形態では、本明細書に記載されるキメラｒｅｐ遺伝子のいずれか１つを使用して達成される粒子収量は、少なくとも１．５倍（例えば、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍または少なくとも１０倍）向上する。

ｒＡＡＶ粒子のパッケージングを測定する方法は、当技術分野で公知である。例えば、ゲノムの量は、ＰＣＲ（例えば、定量ＰＣＲ）などの方法を使用して測定することができる。キャプシドまたは粒子の量は、ＥＬＩＳＡなどのタンパク質ベースのアッセイを使用して測定することができる。一部の実施形態では、空のキャプシドを完全なキャプシド（すなわち、核酸またはゲノムを含むもの）から視覚的に区別するために、電子顕微鏡法（例えば、低温電子顕微鏡法）を使用することができる。

ｃａｐ遺伝子およびキャプシドタンパク質
ｒＡＡＶ調製物の中のｒＡＡＶ粒子または粒子は、任意の誘導体または偽型を含む任意のＡＡＶ血清型（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、２／１、２／５、２／８、２／９、３／１、３／５、３／８または３／９）であってよい。ｃａｐ遺伝子は、本明細書に記載されるＩＴＲのいずれか１つが隣接した、目的のｒＡＡＶゲノムまたは任意の遺伝子をパッケージするために使用することができる。その結果、本明細書に記載される方法のいずれか１つから生成されるｒＡＡＶ粒子は、任意の血清型または偽型であってよく、それもまた、本明細書に記載されるキメラｒｅｐ遺伝子のいずれか１つを使用することができる。本明細書に開示される方法のいずれか１つ（例えば、ｒｅｐ遺伝子のいずれか１つ、ｃａｐ遺伝子のいずれか１つおよび／またはここで記載されるＩＴＲのいずれか１つによる）を使用して生成されるｒＡＡＶ粒子は、目的の遺伝子を細胞（例えば、被験体の体内の細胞またはｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞）に送達するために、または、被験体における状態もしくは疾患を処置するために使用することができる。

ｒＡＡＶウイルス粒子の血清型は、組換えウイルスのキャプシドタンパク質の血清型を指す。誘導体および偽型の非限定的な例には、ｒＡＡＶ２／１、ｒＡＡＶ２／５、ｒＡＡＶ２／８、ｒＡＡＶ２／９、ＡＡＶ２－ＡＡＶ３ハイブリッド、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｈｕ．１４、ＡＡＶ３ａ／３ｂ、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ＡＡＶ－ＨＳＣ１５、ＡＡＶ－ＨＳＣ１７、ＡＡＶｈｕ．３７、ＡＡＶｒｈ．８、ＣＨｔ－Ｐ６、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ２ｉ８、ＡＡＶ－ＨＳＣ１５／１７、ＡＡＶＭ４１、ＡＡＶ９．４５、ＡＡＶ６（Ｙ４４５Ｆ／Ｙ７３１Ｆ）、ＡＡＶ２．５Ｔ、ＡＡＶ－ＨＡＥ１／２、ＡＡＶクローン３２／８３、ＡＡＶＳｈＨ１０、ＡＡＶ２（Ｙ－＞Ｆ）、ＡＡＶ８（Ｙ７３３Ｆ）、ＡＡＶ２．１５、ＡＡＶ２．４、ＡＡＶＭ４１およびＡＡＶｒ３．４５が含まれる。一部の実施形態では、ｃａｐタンパク質は、１つまたは複数のアミノ酸置換を有する。そのようなＡＡＶ血清型および誘導体／偽型、ならびにそのような誘導体／偽型を生成する方法は、当技術分野で公知である（例えば、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ． ２０１２ Ａｐｒ；２０（４）：６９９－７０８． ｄｏｉ： １０．１０３８／ｍｔ．２０１１．２８７． Ｅｐｕｂ ２０１２ Ｊａｎ ２４． Ｔｈｅ ＡＡＶ ｖｅｃｔｏｒ ｔｏｏｌｋｉｔ： ｐｏｉｓｅｄ ａｔ ｔｈｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｃｒｏｓｓｒｏａｄｓ． Ａｓｏｋａｎ Ａ１， Ｓｃｈａｆｆｅｒ ＤＶ， Ｓａｍｕｌｓｋｉ ＲＪ．を参照）。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は偽型化ｒＡＡＶ粒子であり、それは（ａ）１つの血清型（例えば、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３）からのＩＴＲを含む核酸ベクター、および（ｂ）別の血清型（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９またはＡＡＶ１０）から誘導されるキャプシドタンパク質で構成されるキャプシドを含む。偽型化ｒＡＡＶベクターを生成し、使用する方法は、当技術分野で公知である（例えば、Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ７５：７６６２－７６７１， ２００１；Ｈａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ７４：１５２４－１５３２， ２０００；Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ， ２８：１５８－１６７， ２００２；およびＡｕｒｉｃｃｈｉｏ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ． Ｍｏｌｅｃ． Ｇｅｎｅｔ．， １０：３０７５－３０８１，
２００１を参照）。

ヘルパー遺伝子およびベクター
一部の実施形態では、１つまたは複数のヘルパーベクター（例えば、プラスミド）は、ｒｅｐ遺伝子および／またはｃａｐ遺伝子を含む第１のヘルパープラスミド、ならびに以下のヘルパー遺伝子：Ｅ１ａ遺伝子、Ｅ１ｂ遺伝子、Ｅ４遺伝子、Ｅ２ａ遺伝子およびＶＡ遺伝子の１つまたは複数を含む第２のヘルパープラスミドを含む。明瞭さのために、ヘルパー遺伝子は、ヘルパータンパク質Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ４、Ｅ２ａおよびＶＡをコードする遺伝子である。一部の実施形態では、ｃａｐ遺伝子は、タンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の１つまたは複数が発現されないように改変される。一部の実施形態では、ｃａｐ遺伝子は、ＶＰ２が発現されないように改変される。そのような改変を作製する方法は、当技術分野で公知である（Ｌｕｘ ｅｔ ａｌ． （２００５）， Ｊ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ７９： １１７７６－８７）。

ヘルパープラスミドおよびそのようなプラスミドを作製する方法は当技術分野で公知であり、市販されている（例えば、ＰｌａｓｍｉｄＦａｃｔｏｒｙ、Ｂｉｅｌｅｆｅｌｄ、ＧｅｒｍａｎｙからのｐＤＦ６、ｐＲｅｐ、ｐＤＭ、ｐＤＧ、ｐＤＰ１ｒｓ、ｐＤＰ２ｒｓ、ｐＤＰ３ｒｓ、ｐＤＰ４ｒｓ、ｐＤＰ５ｒｓ、ｐＤＰ６ｒｓ、ｐＤＧ（Ｒ４８４Ｅ／Ｒ５８５Ｅ）およびｐＤＰ８．ａｐｅプラスミド；Ｖｅｃｔｏｒ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ；Ｃｅｌｌｂｉｏｌａｂｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ；Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ；およびＡｄｄｇｅｎｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡから入手可能な他の製品およびサービス；ｐｘｘ６；Ｇｒｉｍｍ ｅｔ ａｌ． （１９９８）， Ｎｏｖｅｌ Ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｄｅｎｏ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ｖｏｌ． ９， ２７４５－２７６０；Ｋｅｒｎ， Ａ．
ｅｔ ａｌ． （２００３）， Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｈｅｐａｒｉｎ－Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｍｏｔｉｆ ｏｎ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｔｙｐｅ ２ Ｃａｐｓｉｄｓ， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，
Ｖｏｌ． ７７， １１０７２－１１０８１．；Ｇｒｉｍｍ ｅｔ ａｌ． （２００３）， Ｈｅｌｐｅｒ Ｖｉｒｕｓ－Ｆｒｅｅ， Ｏｐｔｉｃａｌｌｙ Ｃｏｎｔｒｏｌｌａｂｌｅ， ａｎｄ Ｔｗｏ－Ｐｌａｓｍｉｄ－Ｂａｓｅｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｏｆ Ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ １ ｔｏ ６， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ｖｏｌ． ７， ８３９－８５０；Ｋｒｏｎｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ． （２００５）， Ａ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ Ｃｈａｎｇｅ ｉｎ ｔｈｅ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｔｙｐｅ ２ Ｃａｐｓｉｄ Ｌｅａｄｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｏｆ Ｈｉｄｄｅｎ ＶＰ１ Ｎ Ｔｅｒｍｉｎｉ， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． ７９， ５２９６－５３０３；およびＭｏｕｌｌｉｅｒ， Ｐ． ａｎｄ Ｓｎｙｄｅｒ， Ｒ．Ｏ． （２００８）， Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｅｆｆｏｒｔｓ ｆｏｒ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｔａｎｄａｒｄｓ，
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ｖｏｌ． １６， １１８５－１１８８を参照）。特異的血清型のための野生型ＡＡＶコード領域をコードするプラスミドも公知であり、入手可能である。例えば、ｐＳｕｂ２０１は、野生型ＡＡＶ２ゲノムのコード領域を含むプラスミドである（Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ． （１９８７）， Ｊ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ６：３０９６－３１０１）。

目的の遺伝子および制御エレメント
目的の遺伝子は、目的のタンパク質をコードする遺伝子である。目的のタンパク質は、検出可能なマーカーまたは治療的タンパク質であってよい。検出可能なマーカーは、可視化することができる（例えば、裸眼で、または顕微鏡の下で）分子である。一部の実施形態では、検出可能なマーカーは、蛍光分子、生物発光分子、または発色分子である（例えば、β－ガラクトシダーゼ、β－ラクタマーゼ、β－グルクロニダーゼおよびスフェロイデノン（ｓｐｈｅｒｉｏｄｅｎｏｎｅ））。一部の実施形態では、検出可能なマーカーは、蛍光タンパク質またはその機能的ペプチドもしくは機能的ポリペプチドである。

一部の実施形態では、目的の遺伝子は、治療的タンパク質をコードする。一部の実施形態では、治療的遺伝子は、抗体、ペプチボディ、増殖因子、凝固因子、ホルモン、膜タンパク質、サイトカイン、ケモカイン、細胞表面受容体もしくはイオンチャネルに作用する活性化もしくは阻害性ペプチド、細胞内プロセスを標的にする細胞浸透ペプチド、血栓溶解剤、酵素、骨形成タンパク質、遺伝子編集のために使用されるヌクレアーゼもしくは他のタンパク質、Ｆｃ融合タンパク質、抗凝固剤、ヌクレアーゼ、ガイドＲＮＡまたは他の核酸、または遺伝子編集のためのタンパク質をコードする。

一部の実施形態では、核酸ベクターは、核酸（例えば、異種核酸）の発現を促進する配列、例えば、核酸に作動可能に連結される発現制御配列を含む、１つまたは複数の領域を含む。そのような制御エレメントは、それが産生細胞内の１つまたは複数のタンパク質の発現を支援するように、産生細胞に送達することができる。一部の実施形態では、制御エレメントは、それが１つまたは複数の目的の遺伝子と一緒にパッケージされるように産生細胞に送達され、そのため、パッケージされたｒＡＡＶ粒子は、標的細胞、組織または臓器を感染させるために使用される場合、標的細胞、組織または臓器における目的の遺伝子の生成物の発現を支援する。

多数の制御エレメントが当技術分野で公知である。制御エレメントの非限定的な例には、プロモーター、インシュレータ、サイレンサー、応答エレメント、イントロン、エンハンサー、開始部位、終止シグナルおよびポリ（Ａ）テールが含まれる。そのような制御エレメントの任意の組合せが、本明細書で企図される（例えば、プロモーターおよびエンハンサー）。目的のタンパク質またはポリペプチドの適当な発現レベルを達成するために、選択される宿主細胞で使用するのに好適ないくつかのプロモーターのいずれかを用いることができる。プロモーターは、例えば、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、誘導可能なプロモーターまたは合成プロモーターであってよい。例えば、異なる強度の構成的プロモーターを使用することができる。本明細書に記載される核酸ベクターは、１つまたは複数の構成的プロモーター、例えば、転写の促進において一般的に活性であるウイルスプロモーターまたは哺乳動物遺伝子からのプロモーターを含むことができる。構成的ウイルスプロモーターの非限定的な例には、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）、Ａｄ Ｅ１Ａおよびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターが含まれる。構成的哺乳動物プロモーターの非限定的な例には、β－アクチンプロモーター（例えば、ニワトリβ－アクチンプロモーター）およびヒト伸長因子－１α（ＥＦ－１α）プロモーターを例とする、様々なハウスキーピング遺伝子プロモーターが含まれる。目的のタンパク質またはポリペプチドの適当な発現レベルを達成するために、誘導可能なプロモーターおよび／または調節エレメントを企図することもできる。好適な誘導可能プロモーターの非限定的な例には、チトクロームＰ４５０遺伝子、ヒートショックタンパク質遺伝子、メタロチオネイン遺伝子およびホルモンによって誘導可能な遺伝子などの遺伝子からのもの、例えば、エストロゲン遺伝子プロモーターが含まれる。誘導可能なプロモーターの別の例は、テトラサイクリンに応答性であるｔｅｔＶＰ１６プロモーターである。組織特異的プロモーターおよび／または調節エレメントも、本明細書で企図される。使用することができるそのようなプロモーターの非限定的な例には、気道上皮細胞特異的プロモーターが含まれる。合成プロモーターも、本明細書で企図される。合成プロモーターは、例えば、公知のプロモーター、調節エレメント、転写因子結合性部位、エンハンサーエレメント、リプレッサーエレメントなどの領域を含むことができる。

一部の実施形態では、必要に応じて１つまたは複数の制御エレメントを含む目的の遺伝子には、ＩＴＲが隣接する。一部の実施形態では、ＩＴＲが隣接する目的の遺伝子を含む核酸ベクターは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ｓｓＤＮＡまたは自己相補的ＤＮＡ分子である。一部の実施形態では、核酸ベクターは、本出願に記載される１つまたは複数の技術を使用してウイルス粒子の中にパッケージされる（例えば、核酸ベクターを、例えばトランスフェクションを通して、キメラｒｅｐ遺伝子または目的の遺伝子に隣接するＩＴＲと異なる血清型である遺伝子を発現する産生細胞の中に導入することによって、ここで、産生細胞は、１つまたは複数のｃａｐ遺伝子および／またはヘルパー遺伝子を必要に応じてさらに発現する）。

さらなる精緻化なしで、上の記載に基づいて、当業者は本出願をその最大限まで利用することができると考えられている。したがって、以下の具体的な実施形態は、単に例示的であって、本出願の残りを限定するものでは決してないと解釈するべきである。本明細書に引用される全ての刊行物は、本明細書で参照される目的または対象発明のために、参照により組み込まれる。

本明細書に記載される方法によって生成されるｒＡＡＶ粒子の使用
本明細書に開示される方法のいずれか１つ（例えば、ｒｅｐ遺伝子のいずれか１つ、ｃａｐ遺伝子のいずれか１つおよび／またはここで記載されるＩＴＲのいずれか１つによる）を使用して生成されるｒＡＡＶ粒子は、目的の遺伝子を細胞（例えば、被験体の体内の細胞またはｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞）に送達するために、または、被験体における状態もしくは疾患を処置するために使用することができる。一部の実施形態では、被験体は、哺乳動物（例えば、ヒト）である。一部の実施形態では、被験体は、上記の目的の遺伝子による処置を必要とする。

一部の実施形態では、「投与すること」または「投与」は、薬理的に有益である方法で材料を被験体に提供することを意味する。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、被験体に対して経腸的に投与される。一部の実施形態では、必須金属元素（複数可）の経腸投与は、経口である。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、被験体に対して非経口的に投与される。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、皮下、眼内、硝子体内、網膜下、静脈内（ＩＶ）、脳室内、筋肉内、髄腔内（ＩＴ）、槽内、腹腔内、吸入、局所的、または１つもしくは複数の細胞、組織もしくは臓器への直接注入によって被験体に投与される。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、被験体に対して肝臓動脈または門脈への注射によって投与される。

本明細書で使用する場合の、疾患を「処置する」という用語は、被験体が経験する疾患または障害の少なくとも１つの徴候または症状の頻度または重症度を低減することを意味する。本明細書の上でまたは他の場所に記載される組成物は、被験体に対して有効量で、すなわち、望ましい結果をもたらすことが可能な量で一般的に投与される。望ましい結果は、投与される活性薬剤に依存する。例えば、ｒＡＡＶ粒子の有効量は、発現構築物を宿主の臓器、組織または細胞に移入することが可能である粒子の量であってよい。治療的に許容される量は、疾患、例えばフリートライヒ運動失調を処置することが可能である量であってよい。医学および獣医学の分野で周知であるように、任意の１被験体のための投薬量は、被験体のサイズ、体表面積、年齢、投与される特定の組成物、組成物中の有効成分（複数可）、投与の時間および経路、一般健康状態ならびに同時並行的に投与される他の薬物を含む、多くの因子に依存する。

一部の実施形態では、組成物は、薬学的に許容される担体を含む。用語「担体」は、ｒＡＡＶ粒子が一緒に投与される、希釈剤、補助薬、賦形剤またはビヒクルを指す。そのような医薬担体は、鉱油などの石油、落花生油、大豆油およびゴマ油などの植物油、動物油、または合成起源の油のものを含む、水および油などの無菌の液体であってよい。食塩溶液および水性デキストロースおよびグリセロール溶液を、液体担体として用いることもできる。

（実施例１：異なる血清型のＡＡＶ ＩＴＲおよびＲｅｐタンパク質の比較）
ゲノムパッケージング効率に及ぼす異なる血清型のＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質および／またはＡＡＶ ＩＴＲの使用の影響を探究し始めるために、ＡＡＶ１～ＡＡＶ１３のＲｅｐおよび入手可能なＩＴＲ配列を比較した（図１）。ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ１～ＡＡＶ７にかぎり入手可能である。ＡＡＶ１およびＡＡＶ６は、Ｒｅｐ（９９．４％）およびＣａｐ（９９．２％）タンパク質の両方で高い配列同一性を共有する。対照的に、それらのＩＴＲ配列は相違（８１．６％）を示す。ＡＡＶ６ ＩＴＲはＡＡＶ２ ＩＴＲのそれと同一であるが、ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質配列はそれぞれ８７．３％および８３．４％でより多様である。このことは、ＡＡＶ６がＡＡＶ１とＡＡＶ２の間のキメラであることと一貫している。ＡＡＶ１およびＡＡＶ６のＲｅｐは、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０およびＡＡＶ１１と高い配列相同性（≧９５．０％）を共有するが、それらのＣａｐタンパク質配列はより多様である（図１）。顕著なことに、他のＡＡＶと比較して、ＡＡＶ５はそのＩＴＲ配列、Ｒｅｐタンパク質およびＣａｐタンパク質において一貫して多様である（図１）。

ＩＴＲの中の配列変異の位置の分析はＡ領域における軽微な変異を示すが、Ｄ配列およびヘアピン（ＢおよびＣ領域）においてより高い変異を示す（図２）。Ｄ配列はＡＡＶパッケージングにとって重要であると報告されているが、ヘアピンの配列は二次構造が維持される限り交換可能である。例としてＡＡＶ１およびＡＡＶ２の比較のグラフ表示は、ＤＮＡ結合性およびヘリカーゼドメインの両方に変異が存在することを示す（図３）。これらの観察は、それらの機能に関するかもしれないこれらの必須のウイルスエレメントにおける複雑性のレベルを示す。

（実施例２：異なる血清型のＩＴＲおよびＲｅｐタンパク質の組合せの使用のｒＡＡＶ粒子のパッケージングに対する影響）
最初に、全てのＡＡＶ血清型のＲｅｐタンパク質によるＡＡＶ６キャプシドのパッケージングの間の比較を行う。ＡＡＶ１からＡＡＶ６のＩＴＲが隣接したゲノムを有するベクター構築物が使用される。ＡＡＶ２ ｒｅｐ遺伝子を含有する既存のＲｅｐ２（ＡＡＶ２の）－ｃａｐ６（ＡＡＶ６の）ヘルパープラスミドは、他のＡＡＶ血清型からのｒｅｐ遺伝子によって置換される。これらの構築物は、ｒＡＡＶ６（ｒＡＡＶＸ／６）ベクターを生成するためにＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトするために使用される。一致したＩＴＲおよびＲｅｐタンパク質対（例えば、ＡＡＶ１ ＩＴＲプラスＡＡＶ１ ｒｅｐ、またはＡＡＶ３ ＩＴＲプラスＡＡＶ３ ｒｅｐ等）から開始して、代替のＡＡＶ血清型からのＩＴＲが隣接したＡＡＶベクターゲノムが、ＡＡＶ６ベクター生成のために使用される。結果として生じるベクターは、ゲノム含有のならびに空の（無ＤＮＡ）ＡＡＶ粒子を精製する、ＡＶＢセファロースによって精製する。完全なおよび空のキャプシドは、密度勾配（例えば、イオジキサノール）または沈降勾配（例えば、スクロース勾配）のいずれかによって分離され、各試料についてキャプシド力価を定量化するために、キャプシドＥＬＩＳＡ（ＡＤＫ１ａ抗体による）が使用される。個々のベクター調製物がその後分析され、それらの空：完全比、全体の生成収量および遺伝子発現効率について比較される。

同じ導入遺伝子のパッケージング効率において有意な差が観察される場合、差にとって重要な残基を同定するために、ある特定の残基の突然変異とともに２つのＲｅｐドメインにおける残基差のより細かい分析を行う。

次に、それらの間の差が位置する場所を決定するために、ＡＡＶ１～ＡＡＶ１３のＲｅｐ配列を比較した。パッケージングにおけるそれらの役割を、次に調べる。ＡＡＶ５ ＩＴＲはＡＡＶ５ Ｒｅｐタンパク質でのみパッケージすることができることが公知であり、したがって、この必要条件の決定因子を特定するために、キメラはＤＮＡ結合性およびヘリカーゼドメインの両方で試験される。パッケージング効率またはベクター生産性における有意な差が血清型ＲｅｐまたはＩＴＲによって決定されることが見出されるならば、ドメインをウイルスの間で交換し（例えば、ＡＡＶ１ ＤＮＡ結合性ドメインおよび／またはヘリカーゼ／ＡＴＰアーゼの利用、またはＡＡＶ１からのＤ配列の利用）、ｒＡＡＶ粒子パッケージングに及ぼすそれらの影響を試験する。

（実施例３：様々な血清型のｒＡＡＶ粒子を生成するためにキメラｒｅｐ遺伝子を使用することの効果）
図４は、ｒＡＡＶ粒子を生成するために使用される標準のＡＡＶ生成システムの概略図を示す。ヘルパーまたは産生細胞とも呼ばれる細胞を、Ｒｅｐおよびキャプシドタンパク質をコードする遺伝子、および必要に応じて目的の遺伝子を、ｒＡＡＶ粒子の中にパッケージすることができるようにＩＴＲの間に含む、１つまたは複数のプラスミドでトランスフェクトする。標準の技術は、様々なキメラのおよび改変されたｃａｐ遺伝子を利用するが、通常は、血清型２のｒｅｐおよびＩＴＲである。以下に、異なる血清型のキャプシドを生成するために、ｒｅｐ遺伝子が改変され、ＡＡＶ２の配列を有するＩＴＲとともに使用される実験、およびそこからのデータを記載する。試験した改変ｒｅｐ遺伝子は、他の血清型のドメインで置換されたドメインを有するキメラｒｅｐ遺伝子である。

ＩＴＲ ＡＡＶ１～７およびＲｅｐ７８ ＡＡＶ１～８のためのＤＮＡ配列同一性の分析を行った（図５）。ＡＡＶ８ ＩＴＲ、ＡＡＶ９ ＩＴＲおよびＡＡＶ９ Ｒｅｐのための配列は、入手できない。

図５は、ＡＡＶ血清型１～９のＡＡＶ ＩＴＲおよびＲｅｐ７８のパーセント配列同一性分析を示す。図６は、ＡＡＶゲノムにおけるｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、ならびにｒｅｐ遺伝子から発現されるＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質の様々なドメインの配置を示す概略図を提示する。ＡＡＶゲノムの概略図が、末端逆位配列（ＩＴＲ）に隣接したその２つのオープンリーディングフレームと一緒に示される。拡大図は、Ｒｅｐタンパク質のドメインおよびＲｅｐ７８／６８／５２／４０の発現につながる転写物の図示を示す。ハイブリッドの生成のために使用されるｒｅｐ遺伝子の具体的なドメインを、以下に示す：
ｎ＝Ｎ末端ドメイン、
ｄ＝ＤＮＡ結合性ドメイン、
ｈ＝ヘリカーゼドメイン、
ｙ＝ＮＬＳ／ｐ４０プロモータードメイン、および
ｚ＝ジンクフィンガードメイン；
ここで、本明細書で定義されるＮ末端は、ドメインｎ、ｄおよびｈからなり；Ｃ末端（ｃ）は、ドメインｙおよびｚからなる。

ＡＡＶ１ベクター生成のためのｒｅｐ遺伝子の特徴付けおよび最適化を、図７Ａ～７Ｂに示す。ゲノムパッケージングの向上の役割を担うドメインを同定するために、ＡＡＶ１およびＡＡＶ２ ｒｅｐ遺伝子の間の交換を行った。ＡＡＶ２ ＤＢＤはパッケージングにかなりの影響を及ぼすので、ＤＮＡ結合性ドメイン（ＤＢＤ、ｄ）は重要な役割を果たす。ヘリカーゼドメイン（ｈ）も、同じく向上したパッケージングを示すＡＡＶ２ヘリカーゼに含まれる可能性がある。全体的に、変異体Ｒ１ｈｃ２Ｖ１（すなわち、Ｃ末端（ｃ）およびヘリカーゼドメイン（ｈ）がＡＡＶ２配列のものであることを除いて、ＡＡＶ１配列のｃａｐ遺伝子およびＡＡＶ１配列のｒｅｐ遺伝子を有するプラスミドを表す）、およびＲ２ｄ１Ｖ１（ＤＮＡ結合性ドメイン（ｄ）がＡＡＶ１配列のものであることを除いて、ＡＡＶ１配列のｃａｐ遺伝子およびＡＡＶ２配列のｒｅｐ遺伝子を有するプラスミドを表す）の両方はＡＡＶ１ ＤＢＤおよびＡＡＶ２ヘリカーゼを有し、ＡＡＶ１キャプシドにおける最良のベクターゲノムパッケージング表現型を有する。ＡＡＶ１のｒＡＡＶ粒子の生成のためのｒｅｐ改変の追加のデータは、図８に提示される。これらの変異体のために、ｒｅｐ遺伝子のドメインは、以下の通りに定義される：ｎ＝Ｎ末端：ａａ １～１０２、ｄ＝ＤＮＡ結合性ドメイン：ａａ １０３～２４２、ｈ＝ヘリカーゼドメイン：ａａ ２４３～３７０、ｃ＝Ｃ末端：ａａ ３７１～６２１。

ＡＡＶ３粒子の生成のために、ＡＡＶ２ ｒｅｐ遺伝子をＡＡＶ３ ｒｅｐ遺伝子で置換した（図９Ａ～９Ｄ）。標準の生成システムのために、ＡＡＶ２ ｒｅｐのためのＡＣＧ開始コドンを使用した。ＡＣＧおよびＡＴＧ開始コドンの両方を、ＡＡＶ３ ｒｅｐ遺伝子で試験した。ＡＴＧ開始コドンでは、ＡＡＶ３ Ｒｅｐ７８は可視的であり、それはＡＣＧ開始コドンでは見られなかった。ＡＡＶ３ ｒｅｐ構築物のＶＰ発現は、ＡＡＶ２
ｒｅｐ遺伝子構築物と比較してわずかに低かった。それにもかかわらず、ＡＴＧ－Ｒ３Ｖ３のゲノム力価は、ＡＣＧ－Ｒ２Ｖ３のそれに同等であった。したがって、パッケージングはＡＡＶ３ Ｒｅｐでわずかに優れていた（図９Ａ～９Ｄ）。

次に、ＡＡＶ４粒子の生成のために、ＡＡＶ２ ｒｅｐ遺伝子をＡＡＶ４ ｒｅｐ遺伝子で置換した（図１０Ａ～１０Ｄ）。ＡＣＧおよびＡＴＧ開始コドンの両方を、ＡＡＶ４
ｒｅｐ遺伝子で試験した。ＡＴＧ開始コドンでは、ＡＡＶ４ Ｒｅｐ７８は可視的であり、それはＡＣＧ開始コドンでは見られなかった。ＡＡＶ４ ｒｅｐ構築物によるＶＰ１発現は、ＡＡＶ２ ｒｅｐ遺伝子構築物のそれと同等であった。それにもかかわらず、ＡＣＧ－Ｒ４Ｖ４のゲノム力価は、ＡＣＧ－Ｒ２Ｖ４と比較して高かった。したがって、パッケージングは、ＡＡＶ２ Ｒｅｐと比較してＡＡＶ４ Ｒｅｐでより優れているかもしれない。

ＡＡＶ５粒子の生成のために、ＡＡＶ２ ｒｅｐ遺伝子をＡＡＶ５ ｒｅｐ遺伝子で置換した（図１１Ａ～１１Ｄ）。ＡＣＧおよびＡＴＧ開始コドンの両方を、ＡＡＶ５ ｒｅｐ遺伝子で試験した。ＡＴＧ開始コドンでは、ＡＡＶ５ Ｒｅｐ７８は可視的であり、それはＡＣＧ開始コドンでは見られなかった。ＡＡＶ５ ｒｅｐ構築物によるＶＰ発現は、ＡＡＶ２ ｒｅｐ遺伝子構築物と比較してわずかに低いようであった。しかし、いかなるパッケージされたゲノムも、ＡＡＶ５で検出されなかった。ＡＡＶ５ Ｒｅｐは、ＡＡＶ２ ＩＴＲと相互作用することができないことが公知である（例えば、Ｃｈｉｏｒｉｎｉ
ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｖｉｒｏｌ． １９９９ Ｍａｙ；７３（５）：４２９３－８を参照）。

ＡＡＶ６ベクターの生成のために、ＡＡＶ２ ｒｅｐ遺伝子をＡＡＶ６ ｒｅｐ遺伝子で置換した（図１２Ａ～１２Ｄ）。ＡＣＧおよびＡＴＧ開始コドンの両方を、ＡＡＶ６ ｒｅｐ遺伝子で試験した。ＡＡＶ血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ６およびＡＡＶ８の間の様々なＲｅｐハイブリッドも分析した。Ｒｅｐ変異体プラスミドＲ８ｄ１ｃ２Ｖ６およびＲ１ｈｃ２Ｖ６で、最良のベクターゲノムパッケージング表現型が観察された。しかし、両方のプラスミドは、参照プラスミドｐＲ２Ｖ６のそれに同等である高いＶＰ発現を維持した。

ＡＡＶ７粒子の生成のために、ＡＡＶ２ ｒｅｐ遺伝子をＡＡＶ７ ｒｅｐ遺伝子で置換した（図１３Ａ～１３Ｄ）。ＡＣＧおよびＡＴＧ開始コドンの両方を、ＡＡＶ７ ｒｅｐ遺伝子で試験した。ＡＴＧ開始コドンでは、ＡＡＶ７ Ｒｅｐ７８は可視的であり、それはＡＣＧ開始コドンでは見られなかった。ＡＡＶ７ ｒｅｐ構築物によるＶＰ発現は、ＡＡＶ２ ｒｅｐ遺伝子構築物と比較して低かった。それにもかかわらず、ＡＣＧ－Ｒ７Ｖ７のゲノム力価は、ＡＣＧ－Ｒ２Ｖ７に同等であった。したがって、パッケージングは、ＡＣＧ－Ｒ７Ｖ７でより優れていた。

ゲノムパッケージングの向上の役割を担うドメインを同定するために、ならびに、ＡＡＶ８ベクター生成のためにｒｅｐ遺伝子を最適化するために、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２およびＡＡＶ８ ｒｅｐ遺伝子の間の交換を行った（図１４Ａ～１４Ｂ）。ＡＡＶ１ ＤＢＤによるＡＡＶ８ ＤＢＤの置換はＶＰ発現を増加させたので、ＤＮＡ結合性ドメイン（ＤＢＤ）はＶＰ発現のために重要な役割を果たすようであった。Ｒ１ｃ２Ｖ８およびＲ８ｄ１ｃ２Ｖ８ハイブリッド／キメラは、ＡＡＶ２ ｒｅｐ遺伝子と比較してベクターゲノムをＡＡＶ８キャプシドの中により効率的にパッケージする。これらの変異体のために、ｒｅｐドメインは、以下の通りに定義される：ｎ＝Ｎ末端：ａａ １～１０２、ｄ＝ＤＮＡ結合性ドメイン：ａａ １０３～２２４、ｈ＝ヘリカーゼドメイン：ａａ ２２５～３７２、ｃ＝Ｃ末端：ａａ ３７３～６２３。

ｒｅｐキメラを使用したＡＡＶ８粒子のゲノムパッケージングの向上は、図１５Ａ～１５Ｂに示される。新しいｒｅｐキメラＲ１ｃ２およびＲ８ｄ１ｃ２の利用は、ゲノム含有粒子のより高い百分率（３倍～４倍）につながる。

図１６Ａ～１６Ｂは、ＡＡＶ８粒子をパッケージするより多くのｒｅｐキメラのためのデータを提示する。掲載されるｒｅｐキメラがＡＡＶ２ ｒｅｐよりも使用される場合、ゲノムパッケージングが向上することがわかる。

他の実施形態
この明細書で開示される特徴の全ては、任意の組合せで組み合わせることができる。この明細書で開示される各特徴は、同じか、同等であるかまたは類似の目的の役目をする代替の特徴と置き換えることができる。したがって、明示的に特記されない限り、開示される各特徴は、一般的な一連の同等または類似の特徴の例にすぎない。

上の記載から、当業者は本出願の本質的な特徴を容易に確かめることができ、その精神および範囲を逸脱しない範囲で、様々な使用および条件にそれを適合させるために本出願の様々な変更および改変を加えることができる。したがって、他の実施形態も特許請求の範囲内である。

均等物
本明細書でいくつかの発明の実施形態が記載され、例示されたが、当業者は、機能を果たしおよび／もしくは結果を得るための様々な他の手段および／もしくは構造を容易に想定し、ならびに／または、本明細書に記載される利点の１つまたは複数、およびそのような変異および／もしくは改変の各々は、本明細書に記載される発明の実施形態の範囲内であると考えられる。より一般的には、当業者は、本明細書に記載される全てのパラメータ、寸法、材料および構成は例示的なものであること、ならびに、実際のパラメータ、寸法、材料および／または構成は、発明の教示が使用される具体的な適用（複数可）に依存することを容易に理解する。当業者は、通常の実験だけしか使用せずに、本明細書に記載される具体的な発明の実施形態の多くの均等物を認識するか、または確かめることができる。したがって、上述の実施形態は例として提示されているにすぎないこと、ならびに添付の特許請求の範囲およびその均等物の範囲内で、具体的に記載され、請求されるものと別の方法で発明の実施形態を実施することができることが理解される。本出願の発明の実施形態は、本明細書に記載される各個々の特徴、システム、物品、材料、キットおよび／または方法に関する。さらに、そのような特徴、システム、物品、材料、キットおよび／または方法が相互に矛盾しないならば、２つまたはそれより多くのそのような特徴、システム、物品、材料、キットおよび／または方法の任意の組合せは、本出願の発明の範囲に含まれる。

本明細書で定義され、使用される全ての定義は、辞書の定義、参照により組み込まれている文書の中の定義、および／または定義される用語の通常の意味に優先して支配することを理解すべきである。

本明細書で開示される全ての参照、特許および特許出願は、各々がそのために引用される対象発明に関して参照により組み込まれ、それは、一部の場合にはその文書の全体を包含することがある。

明細書および特許請求の範囲においてここで使用される不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、明確に反対の事項が示されない限り、「少なくとも１つ」を意味すると理解すべきである。

ここで、明細書および特許請求の範囲で使用される語句「および／または」は、そのように結び付けられる要素、すなわち、一部の場合には一緒に存在し、他の場合には離れて存在する要素の「一方または両方」を意味すると理解すべきである。「および／または」で掲載される複数の要素は、同じように、すなわち、そのように結び付けられる要素の「１つまたは複数」と解釈されるべきである。「および／または」の文節によって具体的に特定される要素以外に、具体的に特定されるそれらの要素に関係するか無関係であるにせよ、他の要素が必要に応じて存在することができる。したがって、非限定例として、「含む」などのオープンエンドな言語と一緒に使用される場合、「Ａおよび／またはＢ」への言及は、一実施形態ではＡだけ（必要に応じてＢ以外の要素を含む）；別の実施形態ではＢだけ（必要に応じてＡ以外の要素を含む）；さらに別の実施形態ではＡとＢの両方（必要に応じて他の要素を含む）；等を指すことができる。

ここで、明細書および特許請求の範囲で使用されるように、「または」は、上で定義される「および／または」と同じ意味を有すると理解すべきである。例えば、リスト中の項目を抽出する場合、「または」または「および／または」は包括的であると、すなわちいくつかの要素リストのうちの少なくとも１つを含むが、複数も含み、必要に応じて追加の未掲載項目を含むと解釈されるものとする。明らかにそれとは反対に示される用語だけ、例えば「１つだけ」もしくは「正確に１つ」、または、特許請求の範囲において使用される場合の「からなる」は、いくつかの要素リストのうちの正確に１つの要素を含むことを指す。一般に、本明細書で使用される用語「または」は、排他性の用語、例えば「いずれか」、「のうちの１つ」、「のうちの１つだけ」または「のうちの正確に１つ」が先行する場合に、排他的代替物（すなわち、「いずれか一方であるが両方でない」）を示すとだけ解釈されるものとする。特許請求の範囲において使用する場合、「から事実上なる」は、特許法の分野で使用されるその通常の意味を有するものとする。

ここで、明細書および特許請求の範囲で使用されるように、１つまたは複数の要素のリストに関する語句「少なくとも１つ」は、要素のリスト中の要素の任意の１つまたは複数から選択される少なくとも１つの要素を意味するが、要素のリストの中に具体的に掲載されるいずれの要素の少なくとも１つを必ずしも含むとは限らず、要素のリストの中の要素のいかなる組合せも排除しないと理解すべきである。この定義は、具体的に特定されるそれらの要素と関係するにせよ無関係であるにせよ、「少なくとも１つの」という語句が指す要素のリストの中の具体的に特定される要素以外の要素が必要に応じて存在してもよいことも可能にする。したがって、非限定的な例として、「ＡおよびＢの少なくとも１つ」（または、同等に、「ＡまたはＢの少なくとも１つ」、または同等に「Ａおよび／またはＢの少なくとも１つ」）は、一実施形態では、必要に応じて複数を含む少なくとも１つのＡを指すことができるがＢは存在せず（必要に応じてＢ以外の要素を含む）；別の実施形態では、必要に応じて複数を含む少なくとも１つのＢを指すことができるがＡは存在せず（必要に応じてＡ以外の要素を含む）；さらに別の実施形態では、必要に応じて複数を含む少なくとも１つのＡを、および必要に応じて複数を含む少なくとも１つのＢを指すことができる（必要に応じて他の要素を含む）；等々である。

明確に反対の事項が示されない限り、複数のステップまたは行為を含む本明細書で請求される任意の方法では、方法のステップまたは行為の順序は、方法のステップまたは行為が列挙されている順序に必ずしも限定されないことも理解すべきである。

特許請求の範囲、ならびに上の明細書では、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｃａｒｒｙｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する」、「含む（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」、「保持する」、「構成される」などの全ての移行句は、オープンエンドであること、すなわち、限定されずに含むことを意味すると理解すべきである。米国特許庁特許審査基準セクション２１１１．０３に示される通り、移行句「からなる」および「から事実上なる」だけは、それぞれクローズドなまたはセミクローズドな移行句であるものとする。オープンエンドの移行句（例えば、「含む」）を使用してこの文書で記載される実施形態は、代替の実施形態では、オープンエンドの移行句によって記載される特徴「からなる」および「から事実上なる」とも考えられることを認識すべきである。例えば、出願が「ＡおよびＢを含む組成物」と記載する場合、出願は、代替の実施形態「ＡおよびＢからなる組成物」および「ＡおよびＢから事実上なる組成物」も企図する。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目１)
組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子をパッケージする方法であって、
第１の血清型のｒｅｐ遺伝子を発現する細胞を、第２の血清型の一対の末端逆位配列（ＩＴＲ）を含む組換え核酸と接触させることを含む、方法。
(項目２)
前記ｒｅｐ遺伝子が、前記ｒｅｐ遺伝子をコードする核酸によって前記細胞をトランスフェクトまたは感染させることによって発現される、項目１に記載の方法。
(項目３)
前記ｒｅｐ遺伝子がキメラであり、Ｎ末端およびＣ末端（ｃ）を含み、
前記Ｎ末端がＮ末端ドメイン（ｎ）、ＤＮＡ結合性ドメイン（ｄ）およびヘリカーゼドメイン（ｈ）を含み、
前記Ｃ末端がＮＬＳ／ｐ４０プロモータードメイン（ｙ）およびジンクフィンガードメイン（ｚ）を含む、項目１または２に記載の方法。
(項目４)
前記ｒｅｐ遺伝子が、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ６、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１およびＡＡＶ２、またはＡＡＶ５およびＡＡＶ２であるか、または前記ｒｅｐ遺伝子がキメラである、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目５)
前記Ｎ末端がＡＡＶ１血清型であり、前記Ｃ末端がＡＡＶ２血清型である、項目３または４に記載の方法。
(項目６)
前記Ｎ末端がＡＡＶ２血清型であり、前記Ｃ末端がＡＡＶ１血清型である、項目３または４に記載の方法。
(項目７)
前記Ｎ末端がＡＡＶ２血清型であり、前記Ｃ末端がＡＡＶ５血清型である、項目３または４に記載の方法。
(項目８)
前記Ｎ末端がＡＡＶ５血清型であり、前記Ｃ末端がＡＡＶ２血清型である、項目３または４に記載の方法。
(項目９)
前記第１の血清型がＡＡＶ１血清型である、項目１または２に記載の方法。
(項目１０)
前記第２の血清型がＡＡＶ１血清型である、項目９に記載の方法。
(項目１１)
前記第２の血清型がＡＡＶ２血清型である、項目９に記載の方法。
(項目１２)
前記第２の血清型がＡＡＶ３血清型である、項目９に記載の方法。
(項目１３)
前記第２の血清型がＡＡＶ４血清型である、項目９に記載の方法。
(項目１４)
前記第２の血清型がＡＡＶ７血清型である、項目９に記載の方法。
(項目１５)
前記第２の血清型がＡＡＶ６血清型である、項目１または２に記載の方法。
(項目１６)
前記第１の血清型がＡＡＶ２血清型である、項目１５に記載の方法。
(項目１７)
前記第１の血清型がＡＡＶ３血清型である、項目１５に記載の方法。
(項目１８)
前記第１の血清型がＡＡＶ４血清型である、項目１５に記載の方法。
(項目１９)
前記第１の血清型がＡＡＶ６血清型である、項目１５に記載の方法。
(項目２０)
前記第１の血清型がＡＡＶ１２血清型である、項目１５に記載の方法。
(項目２１)
前記第１の血清型がＡＡＶ１３血清型である、項目１５に記載の方法。
(項目２２)
前記第２の血清型が血清型１である、項目１または２に記載の方法。
(項目２３)
前記第１の血清型がＡＡＶ２血清型である、項目２２に記載の方法。
(項目２４)
前記第１の血清型がＡＡＶ３血清型である、項目２２に記載の方法。
(項目２５)
前記第１の血清型がＡＡＶ４血清型である、項目２２に記載の方法。
(項目２６)
前記第１の血清型がＡＡＶ１２血清型である、項目２２に記載の方法。
(項目２７)
前記第１の血清型がＡＡＶ１３血清型である、項目２２に記載の方法。
(項目２８)
前記第２の血清型がＡＡＶ１血清型である、項目５に記載の方法。
(項目２９)
前記第２の血清型がＡＡＶ６血清型である、項目５に記載の方法。
(項目３０)
前記第２の血清型がＡＡＶ１血清型である、項目６に記載の方法。
(項目３１)
前記第２の血清型がＡＡＶ６血清型である、項目６に記載の方法。
(項目３２)
前記第２の血清型がＡＡＶ２血清型である、項目７に記載の方法。
(項目３３)
前記第２の血清型がＡＡＶ５血清型である、項目８に記載の方法。
(項目３４)
前記ｒＡＡＶ粒子がＡＡＶ１血清型である、項目３に記載の方法。
(項目３５)
前記ｎ、ｄ、ｙおよびｚドメインがＡＡＶ２血清型であり、前記ｈドメインがＡＡＶ１血清型である、項目３４に記載の方法。
(項目３６)
前記ｎ、ｈ、ｙおよびｚドメインがＡＡＶ２血清型であり、前記ｄドメインがＡＡＶ１血清型である、項目３４に記載の方法。
(項目３７)
前記ｄ、ｈ、ｙおよびｚドメインがＡＡＶ２血清型であり、前記ｎドメインがＡＡＶ１血清型である、項目３４に記載の方法。
(項目３８)
前記ｎ、ｄおよびｈドメインがＡＡＶ１血清型であり、前記ｙおよびｚドメインがＡＡＶ１血清型である、項目３４に記載の方法。
(項目３９)
前記ｄおよびｈドメインがＡＡＶ１血清型であり、前記ｎ、ｙおよびｚドメインがＡＡＶ２血清型である、項目３４に記載の方法。
(項目４０)
前記ｎおよびｄドメインがＡＡＶ１血清型であり、前記ｈ、ｙおよびｚドメインがＡＡＶ２血清型である、項目３４に記載の方法。
(項目４１)
前記ｒＡＡＶ粒子がＡＡＶ３血清型である、項目３に記載の方法。
(項目４２)
前記ｎ、ｄおよびｈドメインがＡＡＶ２血清型であり、前記ｙおよびｚドメインがＡＡＶ３血清型である、項目４１に記載の方法。
(項目４３)
前記ｒｅｐ遺伝子が配列ＡＣＧの開始コドンを有する、項目４２に記載の方法。
(項目４４)
前記ｒｅｐ遺伝子がＡＡＶ３血清型であり、配列ＡＴＧの開始コドンを有する、項目４１に記載の方法。
(項目４５)
前記ｒＡＡＶ粒子がＡＡＶ４血清型である、項目３に記載の方法。
(項目４６)
前記ｒｅｐ遺伝子がＡＡＶ４血清型であり、配列ＡＣＧの開始コドンを有する、項目４５に記載の方法。
(項目４７)
前記ｒＡＡＶ粒子がＡＡＶ５血清型である、項目３に記載の方法。
(項目４８)
前記ｒｅｐ遺伝子がＡＡＶ２血清型であり、配列ＡＣＧの開始コドンを有する、項目４７に記載の方法。
(項目４９)
前記ｒＡＡＶ粒子がＡＡＶ６血清型である、項目３に記載の方法。
(項目５０)
前記ｎおよびｈドメインがＡＡＶ８血清型であり、前記ｄ、ｙおよびｚドメインがＡＡＶ２血清型である、項目４９に記載の方法。
(項目５１)
前記ｎおよびｄドメインがＡＡＶ１血清型であり、前記ｈ、ｙおよびｚドメインがＡＡＶ２血清型である、項目４９に記載の方法。
(項目５２)
前記ｒＡＡＶ粒子がＡＡＶ７血清型である、項目３に記載の方法。
(項目５３)
ｒｅｐ遺伝子がＡＡＶ２血清型であり、配列ＡＣＧの開始コドンを有する、項目５２に記載の方法。
(項目５４)
ｒｅｐ遺伝子がＡＡＶ７血清型であり、配列ＡＣＧの開始コドンを有する、項目５２に記載の方法。
(項目５５)
前記ｒＡＡＶ粒子がＡＡＶ８血清型である、項目３に記載の方法。
(項目５６)
前記ｎおよびｈドメインがＡＡＶ８血清型であり、前記ｄ、ｙおよびｚドメインがＡＡＶ２血清型であり、前記ｒｅｐ遺伝子が配列ＡＴＧの開始コドンを有する、項目５５に記載の方法。
(項目５７)
前記ｎ、ｈおよびｄドメインがＡＡＶ１血清型であり、前記ｙおよびｚドメインがＡＡＶ２血清型であり、前記ｒｅｐ遺伝子が配列ＡＴＧの開始コドンを有する、項目５５に記載の方法。
(項目５８)
前記ｎおよびｈドメインがＡＡＶ８血清型であり、以下のヌクレオチド：配列番号１２５にしたがうＴ５７４、Ｃ５９２、Ｃ６０７、Ａ６３７、Ｇ６４４およびＣ６５７が前記ｄドメインにおいて欠失しており、前記ｙおよびｚドメインがＡＡＶ２血清型であり、前記ｒｅｐ遺伝子が配列ＡＴＧの開始コドンを有する、項目５５に記載の方法。
(項目５９)
前記ｒＡＡＶ粒子にパッケージされるゲノムの量が、ＡＡＶ２血清型のｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶ２血清型の一対のＩＴＲを使用した同じ血清型の粒子の平均パッケージングと比較して、平均して少なくとも１．５倍高い、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目６０)
前記細胞を、ｃａｐ遺伝子を含む組換え核酸と接触させることをさらに含む、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目６１)
前記細胞がｃａｐ遺伝子を発現する、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目６２)
項目１～３５のいずれか一項に記載の細胞にしたがう、第１の血清型のｒｅｐ遺伝子および第２の血清型の一対のＩＴＲを含む細胞。
(項目６３)
前記細胞がｃａｐ遺伝子をさらに含む、項目３６に記載の細胞。
(項目６４)
ｒｅｐ遺伝子を含む核酸を含む組成物であって、前記ｒｅｐ遺伝子がキメラであり、Ｎ末端およびＣ末端（ｃ）を含み、
前記Ｎ末端がＮ末端ドメイン（ｎ）、ＤＮＡ結合性ドメイン（ｄ）およびヘリカーゼドメイン（ｈ）を含み、
前記Ｃ末端がＮＬＳ／ｐ４０プロモータードメイン（ｙ）およびジンクフィンガードメイン（ｚ）を含む、組成物。
(項目６５)
前記ｒｅｐ遺伝子が、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ６、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１およびＡＡＶ２、またはＡＡＶ５およびＡＡＶ２であるか、または前記ｒｅｐ遺伝子がキメラである、項目６４に記載の組成物。
(項目６６)
前記Ｎ末端がＡＡＶ１血清型であり、前記Ｃ末端がＡＡＶ２血清型である、項目６４に記載の組成物。
(項目６７)
前記Ｎ末端がＡＡＶ２血清型であり、前記Ｃ末端がＡＡＶ１血清型である、項目６４に記載の組成物。
(項目６８)
前記Ｎ末端がＡＡＶ２血清型であり、前記Ｃ末端がＡＡＶ５血清型である、項目６４に記載の組成物。
(項目６９)
前記Ｎ末端がＡＡＶ５血清型であり、前記Ｃ末端がＡＡＶ２血清型である、項目６４に記載の組成物。
(項目７０)
前記ｎ、ｄ、ｙおよびｚドメインがＡＡＶ２血清型であり、前記ｈドメインがＡＡＶ１血清型である、項目６４に記載の組成物。
(項目７１)
前記ｎ、ｈ、ｙおよびｚドメインがＡＡＶ２血清型であり、前記ｄドメインがＡＡＶ１血清型である、項目６４に記載の組成物。
(項目７２)
前記ｄ、ｈ、ｙおよびｚドメインがＡＡＶ２血清型であり、前記ｎドメインがＡＡＶ１血清型である、項目６４に記載の組成物。
(項目７３)
前記ｎ、ｄおよびｈドメインがＡＡＶ１血清型であり、前記ｙおよびｚドメインがＡＡＶ１血清型である、項目６４に記載の組成物。
(項目７４)
前記ｄおよびｈドメインがＡＡＶ１血清型であり、前記ｎ、ｙおよびｚドメインがＡＡＶ２血清型である、項目６４に記載の組成物。
(項目７６)
前記ｎおよびｄドメインがＡＡＶ１血清型であり、前記ｈ、ｙおよびｚドメインがＡＡＶ２血清型である、項目６４に記載の組成物。
(項目７７)
ｃａｐ遺伝子を含む核酸をさらに含み、前記ｃａｐ遺伝子がＡＡＶ１血清型である、項目７０～７６のいずれか一項に記載の組成物。
(項目７８)
前記ｎ、ｄおよびｈドメインがＡＡＶ２血清型であり、前記ｙおよびｚドメインがＡＡＶ３血清型である、項目６４に記載の組成物。
(項目７９)
前記ｒｅｐ遺伝子が配列ＡＣＧの開始コドンを有する、項目６４に記載の組成物。
(項目８０)
前記ｒｅｐ遺伝子がＡＡＶ３血清型であり、配列ＡＴＧの開始コドンを有する、項目６４に記載の組成物。
(項目８１)
ｃａｐ遺伝子を含む核酸をさらに含み、前記ｃａｐ遺伝子がＡＡＶ３血清型である、項目７８～８０のいずれか一項に記載の組成物。
(項目８２)
前記ｒｅｐ遺伝子がＡＡＶ４血清型であり、配列ＡＣＧの開始コドンを有する、項目６４に記載の組成物。
(項目８３)
ｃａｐ遺伝子を含む核酸をさらに含み、前記ｃａｐ遺伝子がＡＡＶ４血清型である、項目８２に記載の組成物。
(項目８４)
前記ｒｅｐ遺伝子がＡＡＶ２血清型であり、配列ＡＣＧの開始コドンを有する、項目６４に記載の組成物。
(項目８５)
ｃａｐ遺伝子を含む核酸をさらに含み、前記ｃａｐ遺伝子がＡＡＶ５血清型である、項目８４に記載の組成物。
(項目８６)
前記ｎおよびｈドメインがＡＡＶ８血清型であり、前記ｄ、ｙおよびｚドメインがＡＡＶ２血清型である、項目６４に記載の組成物。
(項目８７)
前記ｎおよびｄドメインがＡＡＶ１血清型であり、前記ｈ、ｙおよびｚドメインがＡＡＶ２血清型である、項目６４に記載の組成物。
(項目８８)
ｃａｐ遺伝子を含む核酸をさらに含み、前記ｃａｐ遺伝子がＡＡＶ６血清型である、項目８６または８７に記載の組成物。
(項目８９)
ｒｅｐ遺伝子がＡＡＶ２血清型であり、配列ＡＣＧの開始コドンを有する、項目６４に記載の組成物。
(項目９０)
ｒｅｐ遺伝子がＡＡＶ７血清型であり、配列ＡＣＧの開始コドンを有する、項目６４に記載の組成物。
(項目９１)
ｃａｐ遺伝子を含む核酸をさらに含み、前記ｃａｐ遺伝子がＡＡＶ７血清型である、項目８９または９０に記載の組成物。
(項目９２)
前記ｎおよびｈドメインがＡＡＶ８血清型であり、前記ｄ、ｙおよびｚドメインがＡＡＶ２血清型であり、前記ｒｅｐ遺伝子が配列ＡＴＧの開始コドンを有する、項目６４に記載の組成物。
(項目９３)
前記ｎ、ｈおよびｄドメインがＡＡＶ１血清型であり、前記ｙおよびｚドメインがＡＡＶ２血清型であり、前記ｒｅｐ遺伝子が配列ＡＴＧの開始コドンを有する、項目６４に記載の組成物。
(項目９４)
前記ｎおよびｈドメインがＡＡＶ８血清型であり、以下のヌクレオチド：配列番号１２５にしたがうＴ５７４、Ｃ５９２、Ｃ６０７、Ａ６３７、Ｇ６４４およびＣ６５７が前記ｄドメインにおいて欠失しており、前記ｙおよびｚドメインがＡＡＶ２血清型であり、前記ｒｅｐ遺伝子が配列ＡＴＧの開始コドンを有する、項目６４に記載の組成物。
(項目９５)
ｃａｐ遺伝子を含む核酸をさらに含み、前記ｃａｐ遺伝子がＡＡＶ８血清型である、項目９２～９４のいずれか一項に記載の組成物。
(項目９６)
前記ｒｅｐ遺伝子を含む核酸および前記ｃａｐ遺伝子を含む核酸が、核酸ベクターに含まれる、項目７７、８１、８５、８８、９１または９５のいずれか一項に記載の組成物。
(項目９７)
一対のＩＴＲを含む核酸をさらに含む、項目６４～９６のいずれか一項に記載の組成物。
(項目９８)
前記ＩＴＲを含む核酸が、前記一対のＩＴＲが隣接する目的の遺伝子をさらに含む、項目９７に記載の組成物。

Claims (1)

1. 明細書に記載の発明。