CN115925819A

CN115925819A - 腺相关病毒突变体及其应用

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Publication number: CN115925819A
Application number: CN202211731065.4A
Authority: CN
Inventors: 李华鹏; 卜晔; 钟育健; 代志勇; 张有为; 潘越; 陈欢
Original assignee: Guangzhou Packgene Biotech Co ltd
Current assignee: Guangzhou Packgene Biotech Co ltd
Priority date: 2022-12-30
Filing date: 2022-12-30
Publication date: 2023-04-07
Anticipated expiration: 2042-12-30
Also published as: WO2024138809A1; CN115925819B

Abstract

本文提供了腺相关病毒2(AAV2)衣壳蛋白突变体，其在IV可变区包括氨基酸序列KTINGSGQNQQTLK或与其相比有1、2、3或4个氨基酸改变的氨基酸序列；在V可变区包括氨基酸序列TTVTQ或与其相比有1或2个氨基酸序列改变的氨基酸序列。本文提供的腺相关病毒突变体具有低肝脏嗜性和低肝毒性。

Description

腺相关病毒突变体及其应用

技术领域

本发明涉及生物领域中的病毒体及其应用，尤其是涉及一种具有低肝脏嗜性、高特异性的腺相关病毒突变体及其应用。

背景技术

腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)是一类包裹着线性单链DNA基因组的无包膜小病毒，属于微小病毒科(Parvoviridae)依赖病毒属(Dependovirus)，需要辅助病毒(通常为腺病毒)参与复制。AAV基因组为单链DNA片段，包含于非包膜病毒衣壳中，可分成三个功能区域：两个开放阅读框(Rep基因、Cap基因)和末端反向重复序列(ITR)。重组腺相关病毒载体(rAAV)源于非致病的野生型腺相关病毒，由于其具有宿主范围广、非致病性、低免疫原性、长期稳定表达外源基因、良好的扩散性能和物理性质稳定等优点，作为基因转移载体在基因治疗和疫苗研究中得到广泛应用。在医学研究中，rAAV被用于多种疾病的基因治疗的研究(包括体内、体外实验)，如基因功能研究、构建疾病模型、制备基因敲除鼠等方面。

目前在临床试验中已有多种AAV载体被广泛使用，其中使用频率最高的是AAV2,例如已上市药物Luxturna。另外一些更新和更有效的衣壳，如AAV8、AAV9和AAVrh.10正在用于越来越多的试验。虽然可供选择的血清型不少，但每种血清型均存在一定的缺陷，尤其是由肝毒性引起的不良反应或者死亡是一个关键点。例如，诺华制药今年8月报告了两名儿童患者在接受用于治疗脊髓性肌肉萎缩症(SMA)的Zolgensma基因疗法后因急性肝衰竭而死亡。虽然这是这款“神药”首次出现这种事故，但监管机构曾警告，Zolgensma可能导致严重和潜在的致命肝脏并发症。同年2月，Homology Medicines宣布FDA已暂停HMI-102治疗苯丙酮尿症(PKU)成人患者的临床试验，暂停原因是一名受试者肝功能检查结果异常。同样的还有安斯泰来的基因疗法AT132，该药物用于治疗X连锁肌小管性肌病，使用AAV8载体递送肌管蛋白基因至骨骼肌，从而增加组织中肌管蛋白的表达。该试验被多次暂停，原因之一即是摆脱不掉的严重肝毒性副反应。

AAV2是人类发现最早、研究最早的血清型之一，在这几十年的研究中AAV2也是研究得最清楚的血清型。相较于AAV2,AAV9在体内更为高效，在多种组织中均能有效感染。但AAV9缺点之一是其特异性差，可以同时靶向多种组织器官，特别是肝脏，例如上述药物Zolgensma就是基于AAV9为载体的。

综合上述，虽然AAV是当前最安全的基因治疗载体之一，已广泛应用于基因治疗领域，但受阻于特异性问题，特别是肝毒性的影响，很多AAV临床用药被迫中断甚至导致用药者死亡。因此开发出一款肝嗜性低，特异性好的AAV，或者基于该款AAV“骨架”为基础加入特异性靶向肽，从而到达更加特异、低毒和高效的目的，将具有巨大的临床价值和商业应用场景。

发明内容

在一方面，本文提供了腺相关病毒2(AAV2)衣壳蛋白突变体，其在IV可变区包括氨基酸序列KTINGSGQNQQTLK(SEQ ID NO:2)或与其相比有1、2、3或4个氨基酸改变的氨基酸序列；在V可变区包括氨基酸序列TTVTQ(SEQ ID NO:3)或与其相比有1或2个氨基酸序列改变的氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述IV可变区的12-16个连续氨基酸被氨基酸序列KTINGSGQNQQTLK(SEQ ID NO:2)或与其相比有1、2、3或4个氨基酸改变的氨基酸序列替换，在V可变区的4-6个连续氨基酸被氨基酸序列TTVTQ(SEQ ID NO:3)或与其相比有1或2个氨基酸序列改变的氨基酸序列替换。

在一些实施方案中，所述衣壳蛋白突变体第447-461位氨基酸被氨基酸序列KTINGSGQNQQTLK(SEQ ID NO:2)或与其相比有1、2、3或4个氨基酸改变的氨基酸序列替换，第490-494位氨基酸被氨基酸序列TTVTQ(SEQ ID NO:3)或与其相比有1或2个氨基酸序列改变的氨基酸序列替换，其中所述氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1所示野生型VP1蛋白氨基酸序列的位置。

在一些实施方案中，所述衣壳蛋白突变体在所述IV可变区的氨基酸序列RTNTPSGTTTQSRLQ(SEQ ID NO:4)被氨基酸序列KTINGSGQNQQTLK(SEQ ID NO:2)或与其相比有1、2、3或4个氨基酸改变的氨基酸序列替换，在所述V可变区的氨基酸序列KTSAD(SEQ IDNO:5)被氨基酸序列TTVTQ(SEQ ID NO:3)或与其相比有1或2个氨基酸序列改变的氨基酸序列替换。

在一些实施方案中，所述衣壳蛋白突变体第585位氨基酸为非碱性氨基酸，其中所述氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1所示野生型VP1蛋白氨基酸序列的位置。

在一些实施方案中，所述衣壳蛋白突变体第585位精氨酸(R)突变为丙氨酸(A)，其中所述氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1所示野生型VP1蛋白氨基酸序列的位置。

在一些实施方案中，所述衣壳蛋白突变体第585-587位氨基酸缺失，其中所述氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1所示野生型VP1蛋白氨基酸序列的位置。

在一些实施方案中，所述的衣壳蛋白突变体为衣壳蛋白VP1、VP2或VP3突变体。

在一些实施方案中，所述衣壳蛋白突变体，包括SEQ ID NO:6-8任一项所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:6-8任一项所示的氨基酸序列至少有80％、至少90％、至少95％、或至少98％序列一致性的氨基酸序列。

另一方面，本文提供了分离的核酸分子，其编码上述衣壳蛋白突变体。

在一些实施方案中，所述核酸分子包括SEQ ID NO:10-12任一项所示核苷酸序列。

另一方面，本文提供了表达载体，其包括上述核酸分子。

另一方面，本文提供了宿主细胞，其包括上述核酸分子或表达载体。

另一方面，本文提供了宿主细胞，表达上述衣壳蛋白突变体

另一方面，本文提供了腺相关病毒(AAV)，其上述衣壳蛋白突变体。

另一方面，本文提供了制备重组腺相关病毒(rAAV)的方法，包括至少将如下组分引入宿主细胞：

1)上述核酸分子或表达载体；

2)包括目的基因的GOI质粒。

在一些实施方案中，所述目的基因的表达产物为蛋白或RNA。

另一方面，本文提供了通过上述方法制备的rAAV。

在一些实施方案中，所述rAAV与野生型AAV2或AAV9相比具有更低的肝脏靶向性。

在一些实施方案中，所述rAAV与野生型AAV2或AAV9相比具有更高的肌肉、心脏、大脑、脊髓、肺、肾或眼靶向性。

另一方面，本文提供了药物组合物，其包括上述rAAV和药学上可接受的载体。

另一方面，本文提供了上述核酸分子、表达载体或rAAV在制备药物中的用途。

在一些实施方案中，所述药物用于治疗肌肉、心脏、大脑、脊髓、肺、肾或眼相关疾病。

本文提供的腺相关病毒突变体具有低肝脏嗜性、低肝毒性，并且特异性更好。利用本文提供的AAV衣壳蛋白突变体构建得到的重组腺相关病毒载体特异性更高，安全性更好，应用范围广。

附图说明

图1显示了不同血清型对C57小鼠肝脏靶向性的分析结果(4周)。(A)肝脏的mRNA相对表达水平；(B)肝脏蛋白相对表达水平.

图2显示了不同血清型对C57小鼠股四头肌靶向性的分析结果(4周)。(A)股四头肌mRNA相对表达水平；(B)mRNA水平的股四头肌/肝脏比；(C)股四头肌的蛋白相对表达水平。

图3显示了不同血清型对C57小鼠心脏靶向性的分析结果(4周)。(A)心脏mRNA相对表达水平；(B)mRNA水平的心脏/肝脏比，(C)心脏的蛋白相对表达水平。

图4显示了不同血清型对C57小鼠腹肌靶向性的分析结果(4周)。(A)腹肌mRNA相对表达水平；(B)mRNA水平的腹肌/肝脏比

图5显示了不同血清型对C57小鼠大脑靶向性的分析结果(4周)。(A)大脑mRNA相对表达水平；(B)mRNA水平的大脑/肝脏比

图6显示了不同血清型对C57小鼠脊髓靶向性的分析结果(4周)。(A)脊髓的mRNA相对表达水平；(B)mRNA水平的脊髓/肝脏比。

图7显示了不同血清型对C57小鼠肺、肾、眼睛靶向性的分析结果(4周)。(A)肺mRNA相对表达水平；(B)肾mRNA相对表达水平；(C)眼睛mRNA相对表达水平。

具体实施方式

除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有本领域普通技术人员所通常理解的含义。

除非上下文明确地另外指出，术语“或”是指列举的可选择要素中的单个要素，术语“和/或”是指所列举的可选择要素中的任意一个、任意两个、任意三个、任意更多个或其全部。

术语“包含”或“包括”指包括所述的要素、整数或步骤，但是不排除任意其他要素、整数或步骤。在文中，当使用术语“包含”或“包括”时，除非另有指明，否则也涵盖由所述及的要素、整数或步骤组成的情形。例如，当提及“包括”某个具体序列的多肽时，也旨在涵盖由该具体序列组成的多肽。

“腺相关病毒(AAV)”是细小病毒科的非包膜二十面体衣壳病毒，包括单链DNA病毒基因组。细小病毒科包括依赖病毒属，其包括AAV，依赖于辅助病毒如腺病毒的存在来进行其复制。归因于结构相对简单，能够感染多种细胞(包括静止和分裂细胞)而不整合到宿主基因组中以及其相对温和的免疫原性特征，AAV已被证明可用作生物学工具用于在体外或体内表达目的基因。本文还考虑了基于AAV的表达载体，包括带有目的基因而用于治疗目的的重组AAV(rAAV)。

野生型AAV病毒基因组是一个线性、单链DNA(ssDNA)分子，长度为约5,000个核苷酸(nt)。AAV病毒基因组通常包括两个反向末端重复序列(ITR)，分别在5'和3'末端对病毒基因组封端，为病毒基因组提供复制起点。这些ITR具有特征性T形发夹结构，具有多种功能，包括但不限于通过充当宿主病毒复制细胞的内源DNA聚合酶复合物的引物来充当DNA复制的起点。

野生型AAV病毒基因组还包括Rep基因和Cap基因，分别为四个非结构性Rep蛋白(Rep78、Rep68、Rep52、Rep40)编码和为三个衣壳蛋白或结构性蛋白(VP1、VP2、VP3)编码。Rep蛋白与病毒复制和包装相关，而衣壳蛋白则组装形成AAV的蛋白外壳或AAV衣壳。交替的剪接和交替的起始密码子和启动子导致在Rep基因中从单个开放阅读框产生四种不同的Rep蛋白，并在Cap基因中从单个开放阅读框产生三种衣壳蛋白。

提及AAV情况下，所用的术语“病毒衣壳蛋白”或“衣壳蛋白”指AAV的能够自装配以产生AAV颗粒的蛋白质，也称为外壳蛋白或VP蛋白。VP蛋白包括三种亚基VP1、VP2和VP3，因而VP蛋白突变体相对于野生型VP蛋白的变化可体现在VP1、VP2和VP3亚基的氨基酸序列变化上。相应地，在本文中，“衣壳蛋白突变体”包括VP蛋白突变体，也包括VP1、VP2和/或VP3亚基突变体。由于从同一Cap基因表达的VP1、VP2和VP3亚基之间氨基酸序列的一致性，对Cap基因中编码序列进行改动时，例如对VP3亚基的编码序列进行改动时，同时改变了所表达的VP1和VP2亚基的氨基酸序列。

提及AAV情况下所用的术语“血清型”用于指AAV的衣壳蛋白在血清学上不同于其它AAV血清型的区别。血清学独特性的确定是基于一种抗体与一种AAV之间具有反应性，而与其他或另一种AAV缺乏交叉反应性。这种交叉反应性差异通常是由于衣壳蛋白序列(或其亚基序列)/抗原决定簇的差异(例如，由于血清型AAV2的VP1、VP2和/或VP3序列差异)所致。目前已经发现了多种AAV血清型，包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11和AAV12，以及它们的突变体。

提及AAV的衣壳蛋白或其亚基时，“可变区”指其氨基酸序列在不同血清型之间变动相对较大的区域。通常可通过比对众多血清型AAV衣壳蛋白的氨基酸序列，确定相对保守的区域后，位于它们之间的序列则为可变区序列。可变区可能与AAV对细胞表面受体的结合有关。对于AAV2血清型，可包括多个可变区，例如可变区I至可变区IX(或者也称为环I至环IX)。在优选的实施方案中，本文参照Bennett等人给出的区域确定方式来确定AAV2衣壳蛋白中可变区IV和可变区V的位置(Bennett A,Keravala A,Makal V,et al.Structurecomparison of the chimeric AAV2.7m8 vector with parental AAV2.J StructBiol.2020；209(2):107433)。

“重组AAV载体”指通过使用分子生物学方法从AAV基因组中去除部分野生型基因(例如Rep基因和Cap基因)，并以异源核酸序列(例如用于治疗目的的蛋白或RNA的编码序列)替换而衍生的AAV基因组。通常，对于重组AAV载体来说，AAV基因组的一个或两个反向末端重复(ITR)序列保留其中。大多数情况下，重组AAV载体是复制缺陷的，在其病毒基因组中缺乏编码功能性Rep和Cap蛋白的序列。这些复制缺陷的AAV颗粒可能缺乏大多数亲本编码序列，并且基本上仅携带一个或两个AAV ITR序列和用于递送至细胞、组织、器官或生物体的目标核酸。包括重组AAV载体的AAV在本文称为重组AAV(rAAV)。

“GOI质粒”在本文中指在制备重组AAV时与辅助质粒和或辅助病毒等一起引入宿主细胞的质粒，其携带有目的基因以及位于目的基因两侧的ITR序列。为了有助于制备的重组AAV颗粒在体内外表达，该目的基因(蛋白或RNA编码序列)通常与表达相关的调控序列可操作地连接，例如启动子和多聚腺苷酸加尾信号。术语“可操作地连接”指多核苷酸元件之间具有功能关系的连接。当核酸或多核苷酸序列被置于与另一核酸序列具有功能关系时，它们之间是“可操作地连接的”。比如，转录调控序列例如启动子、增强子或本领域中公知的其它表达控制元件如果影响编码序列的转录，则其与该编码序列是可操作地连接的。

“氨基酸改变”在本文中包括氨基酸替换、缺失或插入。突变体序列相对于母体序列发生氨基酸改变的数量可以以氨基酸替换的数量、缺失氨基酸的数量和插入氨基酸的数量的总和计。

本文中，术语“核酸分子”、“核酸”和“多核苷酸”可互换使用，指核苷酸聚合物。此类核苷酸聚合物可含有天然和/或非天然核苷酸且包括(但不限于)DNA、RNA和PNA。“核酸序列”指包含于核酸分子或多核苷酸中的核苷酸线性序列。“分离的核酸分子”指该核酸分子脱离了其所存在的天然环境(如细胞内环境)，基本上不含通常与其天然相关联的一种或更多种物质，例如蛋白质、核酸、脂质、碳水化合物、细胞膜等，或者为人工制备的(如人工合成的)核酸分子。

术语“表达载体”指包含各种表达元件以用于在宿主细胞中表达目的蛋白或目的RNA的核酸分子。对于用于在真核细胞中表达目的蛋白的表达载体，这些表达元件通常包括启动子、增强子、多腺苷酸化信号序列等。为了方便在大肠杆菌中扩增，该表达载体通常还包括大肠杆菌复制子序列。此外，表达载体还可包括用于筛选的抗生素抗性基因或选择标记基因(例如氨苄青霉素抗性基因(AmpR)，胸苷激酶基因(TK)，卡那霉素抗性基因(KanR)，新霉素抗性基因(NeoR)等)和用于目的基因插入的多克隆位点(MCS)。

术语“宿主细胞”指表达载体可在其中维持和/或复制的细胞，包括原核细胞和真核细胞，例如细菌(如大肠杆菌)、真菌(酵母菌)、昆虫细胞(如SF9)以及哺乳动物细胞(如HEK-293T)。

提及药物组合物，所使用的术语“药学上可接受的载体”指可以安全地进行施用的固体或液体稀释剂、填充剂、抗氧化剂、稳定剂等物质，这些物质适合于人和/或动物给药而无过度的不良副反应，同时适合于维持位于其中的药物或活性剂的活力。依照给药途径，可以施用本领域众所周知的各种不同的载体，包括，但不限于糖类、淀粉、纤维素及其衍生物、麦芽糖、明胶、滑石、硫酸钙、植物油、合成油、多元醇、藻酸、磷酸缓冲液、乳化剂、等渗盐水、和/或无热原水等。

AAV或rAAV的“靶向性”指将其引入体内时，其相对地在特定组织或器官中聚集的现象。例如，靶向性可以表现为在A组织中浓度高于在B组织中的浓度。可通过检测其基因组在不同组织或器官中的含量或浓度来反映这种靶向性。

当提及氨基酸或核苷酸序列时，术语“序列一致性(sequence identity)”(也称为“序列同一性”)指两氨基酸或核苷酸序列(例如查询序列和参照序列)之间一致性程度的量，一般以百分比表示。通常，在计算两氨基酸或核苷酸序列之间的一致性百分比之前，先进行序列比对(alignment)并引入缺口(gap)(如果有的话)。如果在某个比对位置，两序列中的氨基酸残基或碱基相同，则认为两序列在该位置一致或匹配；两序列中的氨基酸残基或碱基不同，则认为在该位置不一致或错配。在一些算法中，用匹配位置数除以比对窗口中的位置总数以获得序列一致性。在另一些算法中，还将缺口数量和/或缺口长度考虑在内。常用的序列对比算法或软件包括DANMAN、CLUSTALW、MAFFT、BLAST、MUSCLE等。出于本发明的目的，可以采用公开的比对软件BLAST(可从https://www.ncbi.nlm.nih.gov/获得)，通过使用缺省设置来获得最佳序列比对并计算出两氨基酸或核苷酸序列之间的序列一致性。

本发明至少部分地基于这样的发现，对AAV2的衣壳蛋白的部分序列(以下称为“被替换序列”)进行替换，可获得对器官靶向性进行改变的衣壳蛋白突变体，尤其是降低了嗜肝性。用于替换的序列(以下称为“替换序列”)可以来自其他血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，所使用的替换序列来自AAV9衣壳蛋白。在一些实施方案中，替换序列为KTINGSGQNQQTLK(SEQ ID NO:2)。在另一些实施方案中，替换序列为与SEQ ID NO:2相比有1、2、3或4个氨基酸改变的氨基酸序列。在一些实施方案中，替换序列为TTVTQ(SEQ ID NO:3)。在另一些实施方案中，替换序列为与SEQ ID NO:3相比有1或2个氨基酸改变的氨基酸序列。在一些实施方案中，对AAV2的衣壳蛋白的两个或多个位点进行序列替换。在一些实施方案中，被替换序列位于IV可变区。在另一些实施方案中，被替换序列位于V可变区。在一些实施方案中，被替换序列位于IV可变区和V可变区。优选地，可以用替换序列SEQ ID NO:2或与其相比有1、2、3或4个氨基酸改变的氨基酸序列替换野生型AAV2的衣壳蛋白的序列SEQ IDNO:4。优选地，可以用替换序列SEQ ID NO:3或与其相比有1或2个氨基酸改变的氨基酸序列替换野生型AAV2的衣壳蛋白的序列SEQ ID NO:5。更优选地，可以用替换序列SEQ ID NO:2或与其相比有1、2、3或4个氨基酸改变的氨基酸序列替换野生型AAV2的衣壳蛋白的序列SEQID NO:4，并且用替换序列SEQ ID NO:3或与其相比有1或2个氨基酸改变的氨基酸序列替换野生型AAV2的衣壳蛋白的序列SEQ ID NO:5。最优选地，可以用替换序列SEQ ID NO:2替换野生型AAV2的衣壳蛋白的序列SEQ ID NO:4，并且用替换序列SEQ ID NO:3替换野生型AAV2的衣壳蛋白的序列SEQ ID NO:5。

本发明还涉及在上述突变体基础上进一步突变，以获得靶向性进一步优化的衣壳蛋白突变体。在一些实施方案中，所述突变体包括第585位氨基酸突变。具体地，可包括突变R585A，或者可包括自585位起的3氨基酸缺失，例如RGN缺失。

本文在提及具体的氨基酸位置时均为对应于SEQ ID NO:1所示野生型VP1蛋白氨基酸序列的位置。

相应地，本文提供了3种具有突变衣壳蛋白的重组腺相关病毒(rAAV)病毒体，并展示了这些病毒体不同的器官靶向特征。其中突变体1具有远低于亲本AAV2和AAV9的肝嗜性，是首次公开的利用该序列特征改造降低肝嗜性的方法。突变体2和3则具有优越的肌肉/肝脏比，特别是突变体2，虽然其主要改造序列来源于AAV2，更是具有接近AAV9的肌肉、心脏靶向能力和更好的脊髓嗜性。这些突变体根据各自靶向性特点或者基于其共有骨架衍生新的突变体的特性，将产生巨大的社会价值和经济效益。

具体地，本文提供了低肝脏靶向性的AAV衣壳蛋白突变体，其中：

(a)所述突变体的氨基酸序列为如SEQ ID NO:6-8任一项所示的序列；或者

(b)所述突变体为SEQ ID NO:6-8任一项所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有(a)中所述突变体活性的蛋白。

本文还提供了重组腺相关病毒病毒体，其包括：

(a)上述AAV衣壳蛋白突变体；以及

(b)编码异源基因产物的异源多核苷酸。

在一些实施方案中，所述基因产物是多肽。

在另一些实施方案中，所述基因产物选自干扰RNA、适配体、内切核酸酶和指导RNA。

本文还提供了上述重组腺相关病毒病毒体在制备用于将基因产物递送至受试者细胞或组织的药物中的用途。

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1：AAV突变体的设计、构建和病毒生产

1)AAV突变体的设计：

发明人通过分析AAV2(PDB：6IH9)和AAV9(PDB:3UX1)三维结构及文献资料，并对AAV2受体靶向结合相关的关键部位，如IV环(AAV2:R447-Q461替换为AAV9:K449-K462)和V环(AAV2:K490-D494替换为AAV9:T491-Q495)进行序列替换，得到目的血清型突变体1(SEQID NO:6)。由于AAV2的R585是与HSPG受体结合的关键氨基酸位点，且HSPG是介导AAV2肝嗜性的主要受体之一，因此我们对此进一步突变，形成突变体2(AAV2：R585突变成A585)(SEQID NO:7)和突变体3(AAV2：R585GN缺失突变)(SEQ ID NO:8)，并进一步进行相关的动物体内活性测试。

2)突变体血清型载体的构建和质粒提取：

将Rep-CAP质粒用SmiI和BshTI双酶切，凝胶电泳并切下5000bp左右的片段条带进行凝胶回收，得到酶切的骨架片段。

根据突变体1的Cap序列，设计以下引物，具体步骤为：以AAV2的Rep-CAP质粒为模板使用Cap-f+YJ69-R引物进行扩增并胶回收得到目的产物246-1，以AAV2的Rep-CAP质粒为模板使用YJ69-F+YJ72-R引物进行扩增并胶回收得到目的产物246-2，以AAV2的Rep-CAP质粒为模板使用YJ72-F+cap-r引物进行扩增并胶回收得到目的产物246-3。骨架与片段，片段与片段间具有同源臂序列，可通过Gisbon进行多片段组装成完整载体。通过以下步骤和比例混合骨架片段、246-1、246-2、246-3，即可重组构建突变体1的Rep-CAP质粒；

根据突变体2的Cap序列，设计以下引物，具体步骤为：以AAV2的Rep-CAP质粒为模板使用Cap-f+YJ69-R引物进行扩增并胶回收得到目的产物246-1，以AAV2的Rep-CAP质粒为模板使用YJ69-F+YJ72-R引物进行扩增并胶回收得到目的产物246-2，以AAV2的Rep-CAP质粒为模板使用YJ72-F+247-R引物进行扩增并胶回收得到目的产物247-3，以AAV2的Rep-CAP质粒为模板使用247-F+cap-r引物进行扩增并胶回收得到目的产物247-4。骨架与片段，片段与片段间具有同源臂序列，可通过Gisbon进行多片段组装成完整载体。通过以下步骤和比例混合骨架片段、246-1、246-2、247-3、247-4，即可重组构建突变体2的Rep-CAP质粒；

根据突变体3的Cap序列，设计以下引物，具体步骤为：以AAV2的Rep-CAP质粒为模板使用Cap-f+YJ69-R引物进行扩增并胶回收得到目的产物246-1，以AAV2的Rep-CAP质粒为模板使用YJ69-F+YJ72-R引物进行扩增并胶回收得到目的产物246-2，以AAV2的Rep-CAP质粒为模板使用YJ72-F+248-R引物进行扩增并胶回收得到目的产物248-3，以AAV2的Rep-CAP质粒为模板使用248-F+cap-r引物进行扩增并胶回收得到目的产物248-4。骨架与片段，片段与片段间具有同源臂序列，可通过Gisbon进行多片段组装成完整载体。通过以下步骤和比例混合骨架片段、246-1、246-2、248-3、248-4，即可重组构建突变体3的Rep-CAP质粒。

上述AAV衣壳蛋白突变体1～3的Rep-CAP载体构建中涉及的引物为：

取1个干净的200uL PCR管做好标记并放在冰盒上，将上述酶切骨架、各个目的片段，按骨架：片段摩尔比为1:3配制反应液，PCR仪中50℃反应30min进行重组连接。取50μL感受态细胞在冰上解冻，10μL的连接产物与DH5α感受态细胞混合，冰上放置20-30分钟；42℃热激45秒；快速置于冰上冰浴2分钟，加入400μL复苏SOC培养基(不含抗生素)，37℃,200rpm培养1h；均匀涂于Amp抗性平板(50μg/ml)，37℃培养14个小时。挑选单克隆菌，在4ml液体LB培养基(Amp+抗性)中扩大培养，37℃培养14小时。

菌液经过12000rpm离心1分钟，倒掉上清培养基；加入250μL的buffer P1/RNaseA混合液，高速涡旋重悬细菌；加入250μL的buffer P2，上下颠倒8-10次；加入350μL的bufferP3，立即颠倒混匀8-10次让溶液彻底中和；13000rpm离心10分钟，取上清过柱；12000离心1分钟，倒掉废液，加入500μL的PW1，12000离心1分钟，倒掉废液；加入600μL的PW2，12000离心1分钟，倒掉上清；加入600μL的PW2，12000离心1分钟，倒掉上清；12000rpm空转2分钟；加入55℃预热洗脱液30-50μL，静置2分钟，12000rpm离心1分钟。使用微量核酸定量仪进行浓度检测。

获得质粒经过浓度检测，经过酶切鉴定的阳性质粒取10μL送测序，阳性质粒保存在-20℃。测序结果表明，获得质粒能够编码变异型衣壳蛋白VP1。最后根据后期测试需要的病毒量提取相关的Helper质粒，各组Rep-Cap质粒(AAV2,AAV9及本发明突变体)质粒以及GOI质粒(ssAAV.CAG.Fluc-2a-eGFP.WPRE.SV40pA)。

3)突变体血清型病毒的包装和纯化

将得到各组(AAV2，AAV9和本发明AAV突变体)的Rep-Cap质粒，表达萤火虫荧光素酶(Fluc)和绿色荧光蛋白(EGFP)的质粒，pHelper质粒以合适的量共转于HEK-293T细胞中，采用碘克沙醇梯度超高速离心纯化AAV病毒，测量病毒滴度在1E+12GC/mL-1E+13GC/mL为合适滴度，放置-80℃备用。

实施例2：突变体血清型各指标的对比测试

1)动物注射及解剖

动物实验使用6-8周龄的C57雄性小鼠，按照设计好的实验组和对照组配制相关病毒，每组按每只小鼠注射1E12GC病毒，在注射4周后进行动物解剖及各器官取材，样本取材后立即进行液氮速冻，并分别用于后续RNA提取和WB检测等实验。

2)目的基因mRNA表达水平检测

2.1)总RNA提取及反转录：

样品的研磨：提前10min预冷研磨仪并设置好研磨参数。将保存于-80℃冰箱动物组织样品取出，取约50-100mg组织，于无菌培养皿内剪成黄豆粒大小后，转移至1.5mlRNase-free EP管内。按照每50-100mg组织：1ml TransZol Up的比例加入适量的TransZolUp，然后加入干净无菌的3mm研磨钢珠两颗，缠上封口膜。将样品置于24孔研磨适配器内并配平，拧紧螺旋，按下关盖按钮。启动研磨程序，待仪器运行结束后取出样品，观察样品研磨粒度，如无大块组织残留，即可进行后续提取操作。研磨后的样品在4℃，12,000×g转速离心2min，吸取上清转移至新的做好相应标记的1.5ml RNase-free EP管内。

样品总RNA的提取：具体参照TransZol Up Plus RNA Kit(北京全式金，货号：ER501)说明书。每使用1ml TranZol up，加0.2ml RNA Extraction Agent，剧烈震荡5min；12,000×g，4℃离心10min。此时样品分为三层，转移无色的水相于新的1.5ml RNase-freeEP管中，加入等体积的无水乙醇(此时可能会出现沉淀)，轻轻颠倒混匀；将得到的溶液和沉淀一起加入离心柱中，12,000×g室温离心30s，弃滤液；加500μL CB9，12,000×g室温离心30s，弃滤液；重复上步骤一次；加入500μL WB9，12,000×g室温离心30s，弃滤液；重复上步骤一次；12,000×g室温离心2min，彻底去除残留的乙醇；将离心柱放入1.5ml RNase-freeEP管中，加入30-50μL(视组织大小而定)RNase-free Water在离心柱的中央，室温静置1min；12,000×g室温离心1min，洗脱RNA；

样品核酸浓度测定:使用微量核酸定量仪检测器检测RNA浓度，记录浓度、OD260/280、OD260/230，把RNA保存于-80℃。

反转录：每组RNA样品使用All-in-One First-Strand cDNASynthesis SuperMix for qPCR(One-Step gDNA Removal)(北京全式金，货号：AE341-03)，具体步骤参考说明书。

2.2)定量PCR(qPCR)实验：

取每组cDNA作为模板，按照2x SYBR Green qPCR Master Mix(Bimake，货号：B21203)说明书进行qPCR体系配置：

qPCR体系

qPCR程序设置

2.3)数据分析

根据每组的Ct值，按公式2^-ΔΔct计算相对表达量。

3)WB检测目的蛋白的表达水平

样品预处理:把组织剪切成细小的碎片，称量并且记录重量后，放置1.5ml或者2ml离心管中，标记管子，在-80℃中冷冻待用，预冷冷冻研磨仪；溶解RIPA(碧云天，P0013B)裂解液(在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF终浓度为1mM)；按照每20mg组织加入150-250μL裂解液的比例加入上述完全裂解液，然后加入两颗已灭菌的氧化锆研磨珠，直接在裂解液中研磨样品(脑、脊髓等组织样品：温度-20℃，频率70Hz，时间每震荡50s停顿10s，循环3-4次；肌肉、肝脏等样品：温度-20℃，频率70Hz，时间每震荡50s停顿10s，5-7次)。样品研磨完后，将样品在冷冻离心机中，4℃，12,000×g离心5-10min，后取上清转移至新的灭菌EP管中，-20℃或-80℃保存；

蛋白浓度测定：按照改良型BCA法蛋白质浓度测定试剂盒(生工，货号C503051)中的方法测定蛋白浓度后，根据所需用量取适量的蛋白匀浆样品，与相应量的5X SDS-PAGE蛋白上样缓冲液混合，沸水浴10min，冷却后低速离心片刻，等待上样。

WB(Western Blot)检测：

SDS-PAGE电泳：根据蛋白浓度及表达水平确定适当的上样量，小于20μL/孔，组织匀浆蛋白上样量约为20-50μg，电泳具体操作流程如下：将预制胶上的梳子拔出，将凝胶安装到电泳槽，内、外槽均加入电泳缓冲液，其中内槽加入新配制的缓冲液，并检漏，若无漏则可在外槽加入电泳缓冲液；取适量处理好的蛋白样品上样，用预染的标准蛋白作为参照，在天能电泳装置上进行100V恒压电泳，电泳时间为100min，直到溴酚蓝到达胶底部。关闭电源，小心卸下预制胶板，取下凝胶，置于转膜缓冲液中等待后续操作；

转膜：据胶面积剪取6张滤纸和1张PVDF膜。PVDF膜在甲醇中浸泡5-10sec，然后转移至转膜缓冲液浸泡5min，滤纸也在转膜缓冲液中预湿润；安装转移装置：负极(黑板)-海绵-3层润湿的滤纸-凝胶-PVDF膜-3层润湿的滤纸-海绵-正极(透明板)。赶走每层气泡以避免影响转移效果，夹紧支架，放入电转槽内；使用100V恒压冰浴转膜100min；根据预染蛋白质分子量标准条带是否完全转至PVDF膜来判断转膜成功与否；将转好的PVDF膜浸泡在PBST溶液中室温洗涤5min，按照需求裁剪PVDF膜，裁膜过程中注意勿让PVDF膜变干；

封闭及抗体孵育：用封闭液(5％脱脂奶粉)孵育PVDF膜，室温2h或4℃过夜；将封闭好的PVDF膜转入一抗杂交液(Luciferase Rabbit Polyclonal antibody(Proteintech，27986-1-AP)按1:2000；GADPH Rabbit Polyclonal antibody(Proteintech，10494-1-AP)按1:2000；Rabbit GFP tag Polyclonal antibody(Proteintech，50430-2-AP)按1:2000，分别加入至4ml QuickBlock^TMWestern一抗稀释液(碧云天，P0256)中，即配为一抗杂交液)，室温孵育1h或4℃孵育过夜，然后用PBST洗膜，3×5min；将洗涤后的PVDF膜转入二抗杂交液(HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)(Proteintech，SA00001-2)按1:5000加入至4ml QuickBlock^TMWestern二抗稀释液(碧云天，P0258)中，即配为二抗杂交液)，室温孵育1h，PBST洗膜，3×5min；

显色：将ECL化学发光试剂盒的A液与B液等体积混合，震荡混匀后，将发光液滴在PVDF膜上以使PVDF膜上全都覆盖有发光液，调整不同的曝光时间使蛋白条带清晰，仪器拍照。

4)结果：

经上述对不同的改造突变体与AAV2、AAV9对照相比，可以发现3个改造突变体均具有低肝脏嗜性的特点，突变体1、突变体2和突变体3的肝脏mRNA水平(图1A)比AAV9分别低806倍、2.39倍和403倍，与AAV2相比，突变体1和突变体3则低101倍和50.5倍。目的蛋白水平(萤火虫荧光素酶和eGFP)(图1B)的检测也证实了低肝脏嗜性这一特点。此外我们还对不同的组织器官的靶向性进行了检测和分析。

针对肌肉和心脏的靶向性，突变体2和突变体3对股四头肌、腹肌和心脏的感染能力均高于AAV2(mRNA水平对比，股四头肌(图2A)为836倍和20倍，腹肌(图4A)为280倍和26倍，心脏(图3A)为232倍和26倍；蛋白水平对比，股四头肌(图2C)和心脏(图3C)中，突变体2、3均高于AAV2)，而突变体2在mRNA和蛋白水平更是接近AAV9的水平(图2C)，靶组织/肝脏比更是高于AAV9(股四头肌(图2B)为1.8倍，腹肌(图4B)为2.6倍，心脏(图3B)为2.1倍)。

针对大脑和脊髓的靶向性，突变体2较突变体1和3展示出更佳的靶向优势，突变体2对大脑(图5A)和脊髓(图6A)的感染能力比AAV2分别高9倍和32倍，对脊髓感染力更是优于AAV9。其中靶组织/肝脏比中更显示出其独特优势，例如其中突变体2的大脑/肝脏比是AAV9的1.5倍(图5B)，而脊髓/肝脏比更是达到43.5倍(图6B)，特异性优势十分明显。此外，值得注意的是突变体1、3的感染大脑和脊髓的能力较弱(即使其靶组织/肝脏比很高)。

针对肺、肾脏和眼睛的靶向性，突变体2除了肺低于AAV9约5.5倍之外，肾脏和眼睛的感染能力均略高于AAV9。而跟AAV2比更是分别达到约2.4倍(图7A，肺)、18倍(图7B，肾)和13倍(图7C，眼睛)之多。

综合以上结果，证明了共有一致骨架序列的3个突变体，均具有低肝脏靶向性的优势，但由于CAP蛋白的VIII环少数氨基酸的差异而展现出不同的特点。如突变体1的肝嗜性比AAV2低101倍，但对各器官靶向性也低。由于突变体1除了特定位点的AAV9序列替换外，其它序列均与AAV2一致，充分的证实了所替换的序列(即骨架序列)，能极大降低肝嗜性的作用，这也是本发明的一个新发现。突变体2是在突变体1的基础上进一步突变(AAV2:R585A)，出现了媲美AAV9的肌肉、心脏靶向性和更优的脊髓靶向性。突变体3除了很低的肝脏嗜性外，肌肉和心脏的靶向能力则低于AAV9强于AAV2，其它器官的靶向性也低，具有肌肉和心脏特异靶向性很高的特点。

因此，本发明通过分析设计和“Loop Swapping”技术，构造了3个低肝脏嗜性AAV血清型“嵌合体”，其结合了AAV2和AAV9的一些优点。除了3个突变体自身展示的对不同器官靶向性的特点外，基于其优异的靶器官/肝脏比，仍可以利用其作为“通用型”改造骨架，通过特定位点插入靶向肽、抗体等特异序列，增强其到特异组织但保留更低肝嗜性的特点，从而达到更优的特异性，规避当前临床试验中出现的肝毒性的问题，为广大患者提供更安全可靠的基因治疗产品。本申请利用两者的优势互补，利用基于AAV结构的理性设计分析方法和“loop swapping”技术，目的在于改造出一个肝嗜性低，特定组织靶向性好的AAV血清型。此外，通过对CAP结构表面(如表面突出的环)进行区段序列替换，也是规避亲本在体内受预存中和抗体影响的简单有效的方法，我们未来将做进一步的探讨。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

本文中提到的氨基酸和核苷酸序列如下。

SEQ ID NO:1(野生型AAV2 VP1氨基酸序列)

MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNRQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL*

SEQ ID NO:2(替换序列)

KTINGSGQNQQTLK

SEQ ID NO:3(替换序列)

TTVTQ

SEQ ID NO:4(被替换序列)

RTNTPSGTTTQSRLQ

SEQ ID NO:5(被替换序列)

KTSAD

SEQ ID NO:6(突变体1VP1氨基酸序列)

MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSKTINGSGQNQQTLKFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSTTVTQNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNRQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL*

SEQ ID NO:7(突变体2VP1氨基酸序列)

MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSKTINGSGQNQQTLKFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSTTVTQNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQAGNRQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL*

SEQ ID NO:8(突变体3VP1氨基酸序列)

MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSKTINGSGQNQQTLKFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSTTVTQNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL*

SEQ ID NO:9(AAV2 VP1核酸序列(5’->3’))ATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACACTCTCTCTGAAGGAATAAGACAGTGGTGGAAGCTCAAACCTGGCCCACCACCACCAAAGCCCGCAGAGCGGCATAAGGACGACAGCAGGGGTCTTGTGCTTCCTGGGTACAAGTACCTCGGACCCTTCAACGGACTCGACAAGGGAGAGCCGGTCAACGAGGCAGACGCCGCGGCCCTCGAGCACGACAAAGCCTACGACCGGCAGCTCGACAGCGGAGACAACCCGTACCTCAAGTACAACCACGCCGACGCGGAGTTTCAGGAGCGCCTTAAAGAAGATACGTCTTTTGGGGGCAACCTCGGACGAGCAGTCTTCCAGGCGAAAAAGAGGGTTCTTGAACCTCTGGGCCTGGTTGAGGAACCTGTTAAGACGGCTCCGGGAAAAAAGAGGCCGGTAGAGCACTCTCCTGTGGAGCCAGACTCCTCCTCGGGAACCGGAAAGGCGGGCCAGCAGCCTGCAAGAAAAAGATTGAATTTTGGTCAGACTGGAGACGCAGACTCAGTACCTGACCCCCAGCCTCTCGGACAGCCACCAGCAGCCCCCTCTGGTCTGGGAACTAATACGATGGCTACAGGCAGTGGCGCACCAATGGCAGACAATAACGAGGGCGCCGACGGAGTGGGTAATTCCTCGGGAAATTGGCATTGCGATTCCACATGGATGGGCGACAGAGTCATCACCACCAGCACCCGAACCTGGGCCCTGCCCACCTACAACAACCACCTCTACAAACAAATTTCCAGCCAATCAGGAGCCTCGAACGACAATCACTACTTTGGCTACAGCACCCCTTGGGGGTATTTTGACTTCAACAGATTCCACTGCCACTTTTCACCACGTGACTGGCAAAGACTCATCAACAACAACTGGGGATTCCGACCCAAGAGACTCAACTTCAAGCTCTTTAACATTCAAGTCAAAGAGGTCACGCAGAATGACGGTACGACGACGATTGCCAATAACCTTACCAGCACGGTTCAGGTGTTTACTGACTCGGAGTACCAGCTCCCGTACGTCCTCGGCTCGGCGCATCAAGGATGCCTCCCGCCGTTCCCAGCAGACGTCTTCATGGTGCCACAGTATGGATACCTCACCCTGAACAACGGGAGTCAGGCAGTAGGACGCTCTTCATTTTACTGCCTGGAGTACTTTCCTTCTCAGATGCTGCGTACCGGAAACAACTTTACCTTCAGCTACACTTTTGAGGACGTTCCTTTCCACAGCAGCTACGCTCACAGCCAGAGTCTGGACCGTCTCATGAATCCTCTCATCGACCAGTACCTGTATTACTTGAGCAGAACAAACACTCCAAGTGGAACCACCACGCAGTCAAGGCTTCAGTTTTCTCAGGCCGGAGCGAGTGACATTCGGGACCAGTCTAGGAACTGGCTTCCTGGACCCTGTTACCGCCAGCAGCGAGTATCAAAGACATCTGCGGATAACAACAACAGTGAATACTCGTGGACTGGAGCTACCAAGTACCACCTCAATGGCAGAGACTCTCTGGTGAATCCGGGCCCGGCCATGGCAAGCCACAAGGACGATGAAGAAAAGTTTTTTCCTCAGAGCGGGGTTCTCATCTTTGGGAAGCAAGGCTCAGAGAAAACAAATGTGGACATTGAAAAGGTCATGATTACAGACGAAGAGGAAATCAGGACAACCAATCCCGTGGCTACGGAGCAGTATGGTTCTGTATCTACCAACCTCCAGAGAGGCAACAGACAAGCAGCTACCGCAGATGTCAACACACAAGGCGTTCTTCCAGGCATGGTCTGGCAGGACAGAGATGTGTACCTTCAGGGGCCCATCTGGGCAAAGATTCCACACACGGACGGACATTTTCACCCCTCTCCCCTCATGGGTGGATTCGGACTTAAACACCCTCCTCCACAGATTCTCATCAAGAACACCCCGGTACCTGCGAATCCTTCGACCACCTTCAGTGCGGCAAAGTTTGCTTCCTTCATCACACAGTACTCCACGGGACAGGTCAGCGTGGAGATCGAGTGGGAGCTGCAGAAGGAAAACAGCAAACGCTGGAATCCCGAAATTCAGTACACTTCCAACTACAACAAGTCTGTTAATGTGGACTTTACTGTGGACACTAATGGCGTGTATTCAGAGCCTCGCCCCATTGGCACCAGATACCTGACTCGTAATCTGTAA

SEQ ID NO:10(突变体1VP1核酸序列(5’->3’))

ATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACACTCTCTCTGAAGGAATAAGACAGTGGTGGAAGCTCAAACCTGGCCCACCACCACCAAAGCCCGCAGAGCGGCATAAGGACGACAGCAGGGGTCTTGTGCTTCCTGGGTACAAGTACCTCGGACCCTTCAACGGACTCGACAAGGGAGAGCCGGTCAACGAGGCAGACGCCGCGGCCCTCGAGCACGACAAAGCCTACGACCGGCAGCTCGACAGCGGAGACAACCCGTACCTCAAGTACAACCACGCCGACGCGGAGTTTCAGGAGCGCCTTAAAGAAGATACGTCTTTTGGGGGCAACCTCGGACGAGCAGTCTTCCAGGCGAAAAAGAGGGTTCTTGAACCTCTGGGCCTGGTTGAGGAACCTGTTAAGACGGCTCCGGGAAAAAAGAGGCCGGTAGAGCACTCTCCTGTGGAGCCAGACTCCTCCTCGGGAACCGGAAAGGCGGGCCAGCAGCCTGCAAGAAAAAGATTGAATTTTGGTCAGACTGGAGACGCAGACTCAGTACCTGACCCCCAGCCTCTCGGACAGCCACCAGCAGCCCCCTCTGGTCTGGGAACTAATACGATGGCTACAGGCAGTGGCGCACCAATGGCAGACAATAACGAGGGCGCCGACGGAGTGGGTAATTCCTCGGGAAATTGGCATTGCGATTCCACATGGATGGGCGACAGAGTCATCACCACCAGCACCCGAACCTGGGCCCTGCCCACCTACAACAACCACCTCTACAAACAAATTTCCAGCCAATCAGGAGCCTCGAACGACAATCACTACTTTGGCTACAGCACCCCTTGGGGGTATTTTGACTTCAACAGATTCCACTGCCACTTTTCACCACGTGACTGGCAAAGACTCATCAACAACAACTGGGGATTCCGACCCAAGAGACTCAACTTCAAGCTCTTTAACATTCAAGTCAAAGAGGTCACGCAGAATGACGGTACGACGACGATTGCCAATAACCTTACCAGCACGGTTCAGGTGTTTACTGACTCGGAGTACCAGCTCCCGTACGTCCTCGGCTCGGCGCATCAAGGATGCCTCCCGCCGTTCCCAGCAGACGTCTTCATGGTGCCACAGTATGGATACCTCACCCTGAACAACGGGAGTCAGGCAGTAGGACGCTCTTCATTTTACTGCCTGGAGTACTTTCCTTCTCAGATGCTGCGTACCGGAAACAACTTTACCTTCAGCTACACTTTTGAGGACGTTCCTTTCCACAGCAGCTACGCTCACAGCCAGAGTCTGGACCGTCTCATGAATCCTCTCATCGACCAGTACCTGTATTACTTGAGCAAGACTATTAACGGTTCTGGACAGAATCAACAAACGCTAAAATTTTCTCAGGCCGGAGCGAGTGACATTCGGGACCAGTCTAGGAACTGGCTTCCTGGACCCTGTTACCGCCAGCAGCGAGTATCAACCACTGTGACTCAAAACAACAACAGTGAATACTCGTGGACTGGAGCTACCAAGTACCACCTCAATGGCAGAGACTCTCTGGTGAATCCGGGCCCGGCCATGGCAAGCCACAAGGACGATGAAGAAAAGTTTTTTCCTCAGAGCGGGGTTCTCATCTTTGGGAAGCAAGGCTCAGAGAAAACAAATGTGGACATTGAAAAGGTCATGATTACAGACGAAGAGGAAATCAGGACAACCAATCCCGTGGCTACGGAGCAGTATGGTTCTGTATCTACCAACCTCCAGAGAGGCAACAGACAAGCAGCTACCGCAGATGTCAACACACAAGGCGTTCTTCCAGGCATGGTCTGGCAGGACAGAGATGTGTACCTTCAGGGGCCCATCTGGGCAAAGATTCCACACACGGACGGACATTTTCACCCCTCTCCCCTCATGGGTGGATTCGGACTTAAACACCCTCCTCCACAGATTCTCATCAAGAACACCCCGGTACCTGCGAATCCTTCGACCACCTTCAGTGCGGCAAAGTTTGCTTCCTTCATCACACAGTACTCCACGGGACAGGTCAGCGTGGAGATCGAGTGGGAGCTGCAGAAGGAAAACAGCAAACGCTGGAATCCCGAAATTCAGTACACTTCCAACTACAACAAGTCTGTTAATGTGGACTTTACTGTGGACACTAATGGCGTGTATTCAGAGCCTCGCCCCATTGGCACCAGATACCTGACTCGTAATCTGTAA

SEQ ID NO:11(突变体2VP1核酸序列(5’->3’))

ATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACACTCTCTCTGAAGGAATAAGACAGTGGTGGAAGCTCAAACCTGGCCCACCACCACCAAAGCCCGCAGAGCGGCATAAGGACGACAGCAGGGGTCTTGTGCTTCCTGGGTACAAGTACCTCGGACCCTTCAACGGACTCGACAAGGGAGAGCCGGTCAACGAGGCAGACGCCGCGGCCCTCGAGCACGACAAAGCCTACGACCGGCAGCTCGACAGCGGAGACAACCCGTACCTCAAGTACAACCACGCCGACGCGGAGTTTCAGGAGCGCCTTAAAGAAGATACGTCTTTTGGGGGCAACCTCGGACGAGCAGTCTTCCAGGCGAAAAAGAGGGTTCTTGAACCTCTGGGCCTGGTTGAGGAACCTGTTAAGACGGCTCCGGGAAAAAAGAGGCCGGTAGAGCACTCTCCTGTGGAGCCAGACTCCTCCTCGGGAACCGGAAAGGCGGGCCAGCAGCCTGCAAGAAAAAGATTGAATTTTGGTCAGACTGGAGACGCAGACTCAGTACCTGACCCCCAGCCTCTCGGACAGCCACCAGCAGCCCCCTCTGGTCTGGGAACTAATACGATGGCTACAGGCAGTGGCGCACCAATGGCAGACAATAACGAGGGCGCCGACGGAGTGGGTAATTCCTCGGGAAATTGGCATTGCGATTCCACATGGATGGGCGACAGAGTCATCACCACCAGCACCCGAACCTGGGCCCTGCCCACCTACAACAACCACCTCTACAAACAAATTTCCAGCCAATCAGGAGCCTCGAACGACAATCACTACTTTGGCTACAGCACCCCTTGGGGGTATTTTGACTTCAACAGATTCCACTGCCACTTTTCACCACGTGACTGGCAAAGACTCATCAACAACAACTGGGGATTCCGACCCAAGAGACTCAACTTCAAGCTCTTTAACATTCAAGTCAAAGAGGTCACGCAGAATGACGGTACGACGACGATTGCCAATAACCTTACCAGCACGGTTCAGGTGTTTACTGACTCGGAGTACCAGCTCCCGTACGTCCTCGGCTCGGCGCATCAAGGATGCCTCCCGCCGTTCCCAGCAGACGTCTTCATGGTGCCACAGTATGGATACCTCACCCTGAACAACGGGAGTCAGGCAGTAGGACGCTCTTCATTTTACTGCCTGGAGTACTTTCCTTCTCAGATGCTGCGTACCGGAAACAACTTTACCTTCAGCTACACTTTTGAGGACGTTCCTTTCCACAGCAGCTACGCTCACAGCCAGAGTCTGGACCGTCTCATGAATCCTCTCATCGACCAGTACCTGTATTACTTGAGCAAGACTATTAACGGTTCTGGACAGAATCAACAAACGCTAAAATTTTCTCAGGCCGGAGCGAGTGACATTCGGGACCAGTCTAGGAACTGGCTTCCTGGACCCTGTTACCGCCAGCAGCGAGTATCAACCACTGTGACTCAAAACAACAACAGTGAATACTCGTGGACTGGAGCTACCAAGTACCACCTCAATGGCAGAGACTCTCTGGTGAATCCGGGCCCGGCCATGGCAAGCCACAAGGACGATGAAGAAAAGTTTTTTCCTCAGAGCGGGGTTCTCATCTTTGGGAAGCAAGGCTCAGAGAAAACAAATGTGGACATTGAAAAGGTCATGATTACAGACGAAGAGGAAATCAGGACAACCAATCCCGTGGCTACGGAGCAGTATGGTTCTGTATCTACCAACCTCCAGGCTGGCAACAGACAAGCAGCTACCGCAGATGTCAACACACAAGGCGTTCTTCCAGGCATGGTCTGGCAGGACAGAGATGTGTACCTTCAGGGGCCCATCTGGGCAAAGATTCCACACACGGACGGACATTTTCACCCCTCTCCCCTCATGGGTGGATTCGGACTTAAACACCCTCCTCCACAGATTCTCATCAAGAACACCCCGGTACCTGCGAATCCTTCGACCACCTTCAGTGCGGCAAAGTTTGCTTCCTTCATCACACAGTACTCCACGGGACAGGTCAGCGTGGAGATCGAGTGGGAGCTGCAGAAGGAAAACAGCAAACGCTGGAATCCCGAAATTCAGTACACTTCCAACTACAACAAGTCTGTTAATGTGGACTTTACTGTGGACACTAATGGCGTGTATTCAGAGCCTCGCCCCATTGGCACCAGATACCTGACTCGTAATCTGTAA

SEQ ID NO:12(突变体3VP1核酸序列(5’->3’))

ATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACACTCTCTCTGAAGGAATAAGACAGTGGTGGAAGCTCAAACCTGGCCCACCACCACCAAAGCCCGCAGAGCGGCATAAGGACGACAGCAGGGGTCTTGTGCTTCCTGGGTACAAGTACCTCGGACCCTTCAACGGACTCGACAAGGGAGAGCCGGTCAACGAGGCAGACGCCGCGGCCCTCGAGCACGACAAAGCCTACGACCGGCAGCTCGACAGCGGAGACAACCCGTACCTCAAGTACAACCACGCCGACGCGGAGTTTCAGGAGCGCCTTAAAGAAGATACGTCTTTTGGGGGCAACCTCGGACGAGCAGTCTTCCAGGCGAAAAAGAGGGTTCTTGAACCTCTGGGCCTGGTTGAGGAACCTGTTAAGACGGCTCCGGGAAAAAAGAGGCCGGTAGAGCACTCTCCTGTGGAGCCAGACTCCTCCTCGGGAACCGGAAAGGCGGGCCAGCAGCCTGCAAGAAAAAGATTGAATTTTGGTCAGACTGGAGACGCAGACTCAGTACCTGACCCCCAGCCTCTCGGACAGCCACCAGCAGCCCCCTCTGGTCTGGGAACTAATACGATGGCTACAGGCAGTGGCGCACCAATGGCAGACAATAACGAGGGCGCCGACGGAGTGGGTAATTCCTCGGGAAATTGGCATTGCGATTCCACATGGATGGGCGACAGAGTCATCACCACCAGCACCCGAACCTGGGCCCTGCCCACCTACAACAACCACCTCTACAAACAAATTTCCAGCCAATCAGGAGCCTCGAACGACAATCACTACTTTGGCTACAGCACCCCTTGGGGGTATTTTGACTTCAACAGATTCCACTGCCACTTTTCACCACGTGACTGGCAAAGACTCATCAACAACAACTGGGGATTCCGACCCAAGAGACTCAACTTCAAGCTCTTTAACATTCAAGTCAAAGAGGTCACGCAGAATGACGGTACGACGACGATTGCCAATAACCTTACCAGCACGGTTCAGGTGTTTACTGACTCGGAGTACCAGCTCCCGTACGTCCTCGGCTCGGCGCATCAAGGATGCCTCCCGCCGTTCCCAGCAGACGTCTTCATGGTGCCACAGTATGGATACCTCACCCTGAACAACGGGAGTCAGGCAGTAGGACGCTCTTCATTTTACTGCCTGGAGTACTTTCCTTCTCAGATGCTGCGTACCGGAAACAACTTTACCTTCAGCTACACTTTTGAGGACGTTCCTTTCCACAGCAGCTACGCTCACAGCCAGAGTCTGGACCGTCTCATGAATCCTCTCATCGACCAGTACCTGTATTACTTGAGCAAGACTATTAACGGTTCTGGACAGAATCAACAAACGCTAAAATTTTCTCAGGCCGGAGCGAGTGACATTCGGGACCAGTCTAGGAACTGGCTTCCTGGACCCTGTTACCGCCAGCAGCGAGTATCAACCACTGTGACTCAAAACAACAACAGTGAATACTCGTGGACTGGAGCTACCAAGTACCACCTCAATGGCAGAGACTCTCTGGTGAATCCGGGCCCGGCCATGGCAAGCCACAAGGACGATGAAGAAAAGTTTTTTCCTCAGAGCGGGGTTCTCATCTTTGGGAAGCAAGGCTCAGAGAAAACAAATGTGGACATTGAAAAGGTCATGATTACAGACGAAGAGGAAATCAGGACAACCAATCCCGTGGCTACGGAGCAGTATGGTTCTGTATCTACCAACCTCCAGAGACAAGCAGCTACCGCAGATGTCAACACACAAGGCGTTCTTCCAGGCATGGTCTGGCAGGACAGAGATGTGTACCTTCAGGGGCCCATCTGGGCAAAGATTCCACACACGGACGGACATTTTCACCCCTCTCCCCTCATGGGTGGATTCGGACTTAAACACCCTCCTCCACAGATTCTCATCAAGAACACCCCGGTACCTGCGAATCCTTCGACCACCTTCAGTGCGGCAAAGTTTGCTTCCTTCATCACACAGTACTCCACGGGACAGGTCAGCGTGGAGATCGAGTGGGAGCTGCAGAAGGAAAACAGCAAACGCTGGAATCCCGAAATTCAGTACACTTCCAACTACAACAAGTCTGTTAATGTGGACTTTACTGTGGACACTAATGGCGTGTATTCAGAGCCTCGCCCCATTGGCACCAGATACCTGACTCGTAATCTGTAA

Claims

1.腺相关病毒2(AAV2)衣壳蛋白突变体，其在IV可变区包括氨基酸序列KTINGSGQNQQTLK(SEQ ID NO:2)或与其相比有1、2、3或4个氨基酸改变的氨基酸序列；在V可变区包括氨基酸序列TTVTQ(SEQ ID NO:3)或与其相比有1或2个氨基酸序列改变的氨基酸序列。

2.如权利要求1所述的衣壳蛋白突变体，其在所述IV可变区的12-16个连续氨基酸被氨基酸序列KTINGSGQNQQTLK(SEQ ID NO:2)或与其相比有1、2、3或4个氨基酸改变的氨基酸序列替换，在所述V可变区的4-6个连续氨基酸被氨基酸序列TTVTQ(SEQ ID NO:3)或与其相比有1或2个氨基酸序列改变的氨基酸序列替换。

3.如权利要求1或2所述的衣壳蛋白突变体，其第447-461位氨基酸被氨基酸序列KTINGSGQNQQTLK(SEQ ID NO:2)或与其相比有1、2、3或4个氨基酸改变的氨基酸序列替换，第490-494位氨基酸被氨基酸序列TTVTQ(SEQ ID NO:3)或与其相比有1或2个氨基酸序列改变的氨基酸序列替换，其中所述氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1所示野生型VP1蛋白氨基酸序列的位置。

4.如权利要求1-3任一项所述的衣壳蛋白突变体，其在所述IV可变区的氨基酸序列RTNTPSGTTTQSRLQ(SEQ ID NO:4)被氨基酸序列KTINGSGQNQQTLK(SEQ ID NO:2)或与其相比有1、2、3或4个氨基酸改变的氨基酸序列替换，在所述V可变区的氨基酸序列KTSAD(SEQ IDNO:5)被氨基酸序列TTVTQ(SEQ ID NO:3)或与其相比有1或2个氨基酸序列改变的氨基酸序列替换。

5.如权利要求1-4任一项所述的衣壳蛋白突变体，其第585位氨基酸为非碱性氨基酸，其中所述氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1所示野生型VP1蛋白氨基酸序列的位置。

6.如权利要求1-5任一项所述的衣壳蛋白突变体，其第585位精氨酸(R)突变为丙氨酸(A)，其中所述氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1所示野生型VP1蛋白氨基酸序列的位置。

7.如权利要求1-4任一项所述的衣壳蛋白突变体，其第585-587位氨基酸缺失，其中所述氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1所示野生型VP1蛋白氨基酸序列的位置。

8.如权利要求1-7任一项所述的衣壳蛋白突变体，为衣壳蛋白VP1、VP2或VP3突变体。

9.如权利要求1-8任一项所述的衣壳蛋白突变体，包括SEQ ID NO:6-8任一项所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:6-8任一项所示的氨基酸序列至少有80％、至少90％、至少95％、或至少98％序列一致性的氨基酸序列。

10.分离的核酸分子，其编码权利要求1-9任一项所述的衣壳蛋白突变体。

11.如权利要求10所述的核酸分子，其中所述核酸分子包括SEQ ID NO:10-12任一项所示核苷酸序列。

12.表达载体，其包括权利要求10或11所述的核酸分子。

13.宿主细胞，其包括权利要求10或11所述的核酸分子或权利要求12所述的表达载体。

14.宿主细胞，其表达权利要求1-9任一项所述的衣壳蛋白突变体。

15.腺相关病毒(AAV)，其包括权利要求1-9任一项所述的衣壳蛋白突变体。

16.制备重组腺相关病毒(rAAV)的方法，包括至少将如下组分引入宿主细胞：

1)权利要求10或11所述的核酸分子或权利要求12所述的表达载体；

2)包括目的基因的GOI质粒。

17.如权利要求16所述的方法，其所述目的基因的表达产物为蛋白或RNA。

18.权利要求16或17所述的方法制备的rAAV。

19.如权利要求18所述的rAAV，其与野生型AAV2或AAV9相比具有更低的肝脏靶向性。

20.如权利要求17或18所述的rAAV，其与野生型AAV2或AAV9相比具有更高的肌肉、心脏、大脑、脊髓、肺、肾或眼靶向性。

21.药物组合物，包括权利要求18所述的rAAV和药学上可接受的载体。

22.权利要求9或10所述的核酸分子、权利要求12所述的表达载体、或权利要求18所述的rAAV在制备药物中的用途。

23.如权利要求22所述的用途，其中所述药物用于治疗肌肉、心脏、大脑、脊髓、肺、肾或眼相关疾病。