CN117886898A - 腺相关病毒变体及其应用 - Google Patents

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CN117886898A CN202211253341.0A CN202211253341A CN117886898A CN 117886898 A CN117886898 A CN 117886898A CN 202211253341 A CN202211253341 A CN 202211253341A CN 117886898 A CN117886898 A CN 117886898A
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Abstract

本发明公开了腺相关病毒变体及其应用。本发明提供了腺相关病毒衣壳蛋白变体为向腺相关病毒衣壳蛋白的氨基酸序列的如下a)和b)两个位置处分别插入SEQ IDNo.1至SEQ ID No.21所示多肽中的任意一个后得到：a)第450‑460位之间；b)第580‑590位之间；并且提供了一种腺相关病毒变体，含有所述腺相关病毒衣壳蛋白变体。本发明所提供的腺相关病毒变体可用于包括癌细胞的基因转导。本发明的AAV颗粒对癌细胞和正常细胞均具有高侵染率，通过AAV颗粒转导的基因可以强烈表达。

Description

腺相关病毒变体及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及腺相关病毒变体及其应用。
背景技术
腺相关病毒(adeno-associated viruses，AAV)为一类小型、无包膜病毒，病毒内包装的基因组为一条长度约4.70kb的线状单链DNA基因组(ssDNA)。AAV的直径为25nm，衣壳为二十面体稳定结构，衣壳主要负责结合宿主细胞受体，单链DNA包含两个功能基因。AAV衣壳由三种衣壳蛋白VP1、VP2和VP3组成，三种蛋白的比例为1:1:10，60个衣壳蛋白组成一个完整的AAV衣壳，VP1和VP2蛋白共享VP3。
AAV病毒载体作为一种基因导入系统，具有安全性好，免疫原性低，能感染分裂细胞和非分裂细胞，能介导基因的长期稳定表达等等优点。腺相关病毒的衣壳识别细胞受体，直接跟宿主接触，这在很大程度上决定了AAV的侵染效率和靶向性。提高AAV侵染效率从而降低治疗成本仍是目前亟需解决的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种腺相关病毒变体及其应用。
第一方面，本发明要求保护一种腺相关病毒衣壳蛋白变体。
本发明要求保护的腺相关病毒衣壳蛋白变体为在腺相关病毒衣壳蛋白的氨基酸序列的如下a)和b)两个位置处分别插入SEQ ID No.1至SEQ ID No.21所示多肽中的任意一个后得到：
a)第450-460位之间；
b)第580-590位之间。
其中，两个位置处插入的多肽可以是相同的，也可以是不同的。
进一步地，所述a)具体可为第454-455位之间；所述b)具体可为第588-589位之间。
本发明AAV衣壳蛋白质变体可以通过将所述多肽插入至任何AAV(诸如AAV类型1(AAV1)、AAV类型2(AAV2)、AAV类型3(AAV3)、AAV类型4(AAV4)、AAV类型5(AAV5)、AAV类型6(AAV6)、AAV类型7(AAV7)、AAV类型8(AAV8)、AAV类型9(AAV9)、AAV类型10(AAV10)、AAV类型11(AAV11)、禽AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV或羊AAV)的AAV衣壳蛋白质，或使用所述多肽替换部分AAV衣壳蛋白质氨基酸序列(换而言之，通过产生包含所述多肽的AAV衣壳蛋白质)制备。并且可以进一步包括插入、添加、替换或缺失一个至数个氨基酸或多于一个氨基酸。
进一步地，所述腺相关病毒为9型腺相关病毒。
在本发明的具体实施方式中，所述腺相关病毒衣壳蛋白变体为在9型腺相关病毒衣壳蛋白VP1的氨基酸序列的第588-589位之间插入SEQ ID No.1所示多肽，并且第454-455位之间插入SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示多肽后得到。
在本发明的一些案例中，所述插入为将SEQ ID No.1所示多肽插入9型腺相关病毒的衣壳蛋白VP1(氨基酸序列如SEQ ID No.26所示)的第588和589位氨基酸之间【对应9型腺相关病毒的衣壳蛋白VP2(氨基酸序列如SEQ ID No.26的第138-736位所示)的第451和452位氨基酸之间，同时对应9型腺相关病毒的衣壳蛋白VP3(氨基酸序列如SEQ ID No.26的第203-736位所示)的第386和387位氨基酸之间】，同时将SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示多肽插入9型腺相关病毒的衣壳蛋白VP1(氨基酸序列如SEQ ID No.26所示)的第454和455位氨基酸之间【对应9型腺相关病毒的衣壳蛋白VP2(氨基酸序列如SEQ ID No.26的第138-736位所示)的第317和318位氨基酸之间，同时对应9型腺相关病毒的衣壳蛋白VP3(氨基酸序列如SEQ IDNo.26的第203-736位所示)的第252和253位氨基酸之间】。
本领域技术人员可以容易地鉴定AAV9之外的AAV血清型和分化体的衣壳蛋白质的氨基酸对应于在AAV9 VP1氨基酸编号588和454的氨基酸。例如，AAV9 VP1的氨基酸编号588对应AAV1的氨基酸编号588、AAV2的氨基酸编号587和AAV8的氨基酸编号590。
此外，可以向所述多肽的N端和/或C端添加间隔序列(spacer sequence)后插入或替换入AAV衣壳蛋白。间隔序列优选地由1至5个氨基酸残基组成。组成间隔序列的氨基酸残基是特别限制的。例如，间隔序列可以包括选自丙氨酸和丝氨酸的氨基酸。
第二方面，本发明要求保护一种核酸分子。
本发明要求保护的核酸分子为编码前文第一方面中所述腺相关病毒衣壳蛋白变体的核酸分子。
在本发明的一些案例中，在所述腺相关病毒衣壳蛋白变体中，编码VP1蛋白的核酸分子如SEQ ID No.25所示，编码VP2蛋白的核酸分子如SEQ ID No.25的第412-2262位所示，编码VP3蛋白的核酸分子如SEQ ID No.25的第607-2262位所示。
在本发明的一些案例中，在所述腺相关病毒衣壳蛋白变体中，编码VP1蛋白的核酸分子如SEQ ID No.27所示，编码VP2蛋白的核酸分子如SEQ ID No.27的第412-2259位所示，编码VP3蛋白的核酸分子如SEQ ID No.27的第607-2259位所示。
其中，SEQ ID No.25为在AAV9的Cap基因(SEQ ID No.24)的第1764和1765位之间插入SEQ ID No.22所示DNA片段，同时在AAV9的Cap9序列(SEQ ID No.24)的第1362-1363位之间插入SEQ ID No.23所示DNA片段后所得。SEQ ID No.27为在AAV9的Cap基因(SEQ IDNo.24)的第1764和1765位之间插入SEQ ID No.22所示DNA片段，同时在AAV9的Cap9序列(SEQ ID No.24)的第1362-1363位之间插入SEQ ID No.22所示DNA片段后所得。SEQ IDNo.22为SEQ ID No.1所示多肽的编码基因。SEQ ID No.23为SEQ ID No.2所示多肽的编码基因。
本发明的核酸可以操作地连接至合适的启动子序列、聚腺甘酸化信号、转录终止序列、上游调节域、复制起始位点、内部核糖体进入位点(IRES)和/或增强子。启动子序列的实例包括诱导型启动子序列和组成型启动子序列。所述启动子序列、聚腺甘酸化信号、转录终止序列、上游调节域、复制起始位点、内部核糖体进入位点(IRES)和/或增强子可以是衣壳蛋白质来源的AAV的内源性或外源性序列、天然序列或合成的序列。
本发明的核酸分子可用于在体外、先体外后体内或在体内递送至细胞，并且赋予细胞表达AAV衣壳蛋白质变体的能力。随后，被递送本发明核酸的细胞可用于生产AAV颗粒。所述细胞可为动物细胞(优选哺乳动物细胞)中。
第三方面，本发明要求保护含有前文第二方面中所述核酸分子的表达盒或重组载体或重组菌或转基因细胞系。
在本发明中，所述载体可为质粒DNA、噬菌体DNA、转座子、粘粒DNA、附加体DNA或病毒载体。
本发明还提供了转基因细胞系，涉及宿主细胞，例如分离的宿主细胞，其含有本发明的核酸分子。分离的细胞是，例如，在体外维持的细胞系。如下文解释的，本发明的宿主细胞可用于本发明的AAV颗粒的生产。当本发明的宿主细胞被用于AAV颗粒的生产时，宿主细胞可以称为“包装细胞”或“生产者细胞(producer cell)”。本发明的宿主细胞可以包括在细胞中保留所述核酸分子或所述表达载体从而瞬时表达AAV衣壳蛋白质变体。
本发明的所述核酸分子或所述表达载体至宿主细胞的导入可以通过已知方法执行。例如，可以使用电穿孔、磷酸钙沉淀、直接显微注射至细胞中、脂质体介导的基因转染或使用高速颗粒基因枪的核酸递送。当使用病毒载体时，可以选择适合用于载体的感染方法。通过使用这样的已建立的技术，本发明的所述核酸分子或所述表达载体被稳定地导入至宿主细胞的染色体中或暂时进入宿主细胞的细胞质中。为了稳定的转染，可以将选择性标记，例如，熟知的选择性标记诸如新霉素抗性基因(编码新霉素磷酸转移酶)或潮霉素B抗性基因(编码氨基糖昔磷酸转移酶(APH))连接至本发明的所述核酸分子或所述表达载体。
作为宿主细胞，可以使用多种细胞，例如，哺乳动物细胞，包括小鼠细胞和灵长类动物细胞(例如，人细胞)或昆虫细胞。合适的哺乳动物细胞的实例包括，但不限于灵长类动物和细胞系。合适的细胞系的实例包括HEK293T细胞、A375细胞、RKO细胞、HeLa细胞、SW620细胞、K562细胞、Huh7细胞、A549细胞和衍生自它们的细胞。
第四方面，本发明要求保护一种腺相关病毒变体。
本发明要求保护的腺相关病毒变体(或AAV颗粒)，含有前文第一方面中所述腺相关病毒衣壳蛋白变体。
本发明的AAV颗粒为包含在AAV9衣壳蛋白的氨基酸序列的a)第450-460位之间和b)第580-590位之间这两个位置处分别插入SEQ ID No.1至SEQ ID No.21所示多肽中的任意一个后(多肽可相同也可不同)得到的变体的AAV颗粒；AAV颗粒可以从上文的转基因细胞系中生产。本发明的AAV颗粒具有对癌细胞的噬性，并且可以将基因导入上述细胞中。
为了AAV颗粒的生产，可以将包括AAV颗粒生产所需的一些元件的细胞用作包装细胞。第一元件是用于重组AAV的载体基因组，其可以在宿主细胞中复制并且包装在AAV颗粒中。重组AAV载体基因组包括目标异源多核苷酸和位于目标异源多核苷酸每一侧的5'和3'末端反向重复(ITR)序列。ITR序列的核苷酸序列是已知的。例如，AAV2 ITR序列。作为AAVITR序列，可以使用来源于任意多种AAV血清型的ITR序列，所述AAV血清型包括AAV 1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV7、AAV9等。在本发明中使用的ITR序列可以来源于野生型AAV或可以通过插入、缺失或替换一个或多个核苷酸而被修改。ITR序列能够在Rep蛋白质存在下复制重组AAV载体基因组，并且使得能够在AAV颗粒的形成中将重组AAV载体基因组并入衣壳颗粒。
可以在本发明的AAV颗粒中含有的目标异源多核苷酸的大小通常小于约5千个碱基(kb)。目标异源多核苷酸可以是，例如，编码受体缺少或丢失的目标蛋白质的基因、编码具有特定生物学或治疗活性(例如，抗微生物、抗病毒或抗肿瘤活性)的蛋白质的基因、编码抑制有害蛋白质产生的核苷酸序列或编码抗原蛋白质的核苷酸序列。可以根据目的合适地选择目标异源多核苷酸。
生产AAV颗粒所需的第二元件是提供AAV辅助功能的构建体。编码AAV来源基因的构建体提供了AAV颗粒形成所需要的AAV基因产物。为了本发明的AAV颗粒的生产，至少将编码包含具有SEQ ID No.1的氨基酸序列的多肽的AAV衣壳蛋白质变体的核酸作为cap基因使用。可以将上文所述的转基因细胞系用于AAV颗粒的生产。AAV颗粒具有由很多衣壳蛋白质构成的壳。全部衣壳蛋白质可以是变体，或部分衣壳蛋白质可以是变体并且其它的可以是野生型衣壳蛋白质。本发明的AAV颗粒可以包括一种衣壳蛋白质变体或数种衣壳蛋白质变体。
生产AAV颗粒所需的第三元件是用于AAV复制的辅助病毒功能(也称为附属功能)。为导入辅助功能，通常使用腺病毒。然而，还可以使用其它病毒诸如单纯疱疹病毒(herpessimplex virus)类型T或类型-2和牛痘病毒。当使用病毒时，使用作为辅助病毒的病毒感染宿主细胞。例如，因为包装AAV颗粒只需要腺病毒早期基因的表达，可以使用不展示晚期基因表达的腺病毒。还可以使用缺少晚期基因表达(例如，tslOOK或tsl49腺病毒变体)的腺病毒变体。还可以通过使用从辅助病毒分离的辅助病毒功能所需的核酸制备提供辅助病毒功能的核酸构建体，并且随后可以将其导入至宿主细胞中。提供辅助病毒功能的结构包括提供一种或多种辅助病毒功能的核苷酸序列，并且是以质粒、噬菌体、转座子、粘粒或其它病毒的形式提供至宿主细胞。
为了生产AAV颗粒，执行(a)将第一元件，重组AAV载体基因组导入至宿主细胞的步骤，(b)将第二元件，提供AAV辅助功能的构建体导入至宿主细胞的步骤，和(c)将第三元件，辅助病毒功能导入至宿主细胞的步骤。步骤(a)至(c)的顺序可以是任何顺序。当第一至第三元件被导入至宿主细胞时，rep基因表达产物切除并且复制重组载体基因组。表达的衣壳蛋白质形成衣壳，并且将重组载体基因组包装至衣壳中以生产AAV颗粒。当宿主细胞表达AAV衣壳蛋白质变体时，生产的AAV颗粒的壳包括AAV衣壳蛋白质变体。
AAV颗粒可以从宿主细胞的培养上清液或裂解产物通过多种提纯方法(诸如CaCl密度梯度离心)分离和纯化。例如，当病毒在上文描述的步骤(c)中使用时，可以添加将AAV颗粒(基于它们的大小)从辅助病毒分离的步骤。AAV颗粒还可以基于对肝素的亲和性的差异从辅助病毒分离。此外，可以通过已知方法使剩余的辅助病毒失活。例如，约60℃加热20分钟或以上使腺病毒失活。因为AAV颗粒对热非常稳定，上文描述的处理对作为辅助病毒使用的腺病毒的选择性移除是有效的。
第五方面，本发明要求保护前文第一方面中所述腺相关病毒变体在作为基因导入载体中的应用。如应用于眼、脑、肌肉、心脏、肝脏的遗传性疾病，如杜氏肌营养不良症DMD，脊髓性肌萎缩症SMN等。
通过上文获得的本发明的AAV颗粒被用于为了基因治疗目的或其它目的将目标异源多核苷酸递送至细胞。AAV颗粒通常在体内或在体外导入至细胞中。对于在体外导入，将AAV颗粒与从活体获得的细胞接触。随后，所述细胞也可以被移植至活体中。对于将细胞导入至活体，可以将细胞配制为药物组合物，并且可以使用多种技术，诸如肌内、静脉内、皮下和腹膜内施用。对于在体内转导，将AAV颗粒配制为药物组合物，并且通常在肠道外施用(例如，通过肌内、皮下、瘤内、经皮肤或脊柱内途径施用)。包括AAV颗粒的药物组合物含有药物可接受的载体和，必要的，其它试剂、药物、稳定剂、载体、佐剂、稀释剂等。
所述基因导入可为在体外向细胞(如正常细胞或癌细胞)导入目的基因。在本发明的具体实施方式中，所述细胞包括人胚胎肾细胞(如HEK293T)、人结肠癌细胞(如RKO)。
第六方面，本发明要求保护如下任一应用：
P1、SEQ ID No.1至SEQ ID No.21所示21个多肽中的任意2个(可相同或不同)在制备前文第一方面中所述腺相关病毒衣壳蛋白变体中的应用；
P2、SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示两个多肽在制备前文第一方面中所述腺相关病毒衣壳蛋白变体中的应用；
P3、前文第一方面中所述腺相关病毒衣壳蛋白变体或前文第二方面中所述核酸分子或前文第三方面中所述表达盒或重组载体或重组菌或转基因细胞系在制备前文第四方面中所述腺相关病毒变体中的应用。
第七方面，本发明要求保护如下任一生物材料：
Q1、多肽组合，由SEQ ID No.1至SEQ ID No.21所示21个多肽中的任意2个(可相同或不同)组成；
Q2、多肽组合，由SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示两个多肽组成；
Q3、多肽，为SEQ ID No.2至SEQ ID No.21所示21个多肽中的任意1个；
Q4、编码Q1或Q2中所述多肽组合的核酸分子或核酸分子组合；
Q4、编码Q1或Q2中所述多肽组合的核酸分子或核酸分子组合；
Q5、编码Q3中所述多肽的核酸分子；
Q6、含有Q3中所述核酸分子或核酸分子组合或Q5中所述核酸分子的表达盒或重组载体或重组菌或转基因细胞系；
Q7、重组腺相关病毒，为携带有目的基因的权利要求7所述腺相关病毒变体。
本发明通过将SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示多肽双插入腺相关病毒衣壳蛋白的氨基酸序列中，提供了可用于包括癌细胞的基因转导系统。本发明的AAV颗粒对癌细胞和正常细胞均具有高侵染率，通过AAV颗粒转导的基因可以强烈表达。
附图说明
图1为Rep2Cap9质粒图谱。
图2为AAV-AA在不同细胞系中的侵染效率流式分析。a为293T细胞；b为RKO细胞。
具体实施方式
定义：
在本文中使用的“腺相关病毒”指的是属于依赖病毒属(dependovirus)的小病毒，其属于细小病毒科(parvovirdiae)，且能够感染灵长类动物包括人和其它哺乳动物。AAV是一类小型、无包膜的病毒，病毒内部包装的基因组为线状单链DNA基因组。AAV直径为25nm，拥有二十面体稳定结构的衣壳。如在本文中使用的，除非另有说明，AAV包括野生型病毒及其衍生物，并且包括AAV的全部血清型和分化体。在下文中，将腺相关病毒简写为AAV。
在本文中使用的“载体”意指用于介导多核苷酸对细胞递送的分子或缔合分子(associated molecule)，并且其包括多核苷酸或与多核苷酸缔合。除非另有说明，载体的实例包括载体DNA，诸如质粒载体和噬菌体载体，病毒载体颗粒、脂质体和其它用于基因递送的载体。
在本文中使用的“衣壳蛋白质”意指通过存在于AAV基因组中的Cap基因编码并且构成AAV衣壳的蛋白质。野生型AAV基因组编码三种衣壳蛋白质，它们是VP1、VP2和VP3。如在本文中使用的，衣壳蛋白质包括VP1、VP2和VP3。
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明所涉及的多肽序列如表1所示。
表1、本发明所涉及的多肽
实施例1、pAAV-454seq2-588seq1的构建
以AAV9为例，将SEQ ID No.1所示多肽转化为DNA序列，如SEQ ID No.22所示，并插入Cap9序列(SEQ ID No.24)的第1764和1765位之间，并且将SEQ ID No.2所示多肽转化为DNA序列，如SEQ ID No.23所示，并插入Cap9序列(SEQ ID No.24)的第1362-1363位之间，得到SEQ ID No.25所示DNA片段。
AAV9的Cap9基因有3个转录本，分别编码VP1、VP2和VP3。SEQ ID No.24全长为VP1的编码序列，SEQ ID No.24的第412-2211位为VP2的编码序列，SEQ ID No.24的第607-2211位为VP3的编码序列。SEQ ID No.24的第1764和1765位之间以及第1362-1363位之间均为VP1、VP2和VP3的共享区域，外源基因插入此处，最终所得VP1、VP2和VP3中会同时含有外源基因编码多肽。
完成插入后，在最终所得的腺相关病毒衣壳蛋白变体编码基因中，编码VP1蛋白的核酸分子如SEQ ID No.25所示，编码VP2蛋白的核酸分子如SEQ ID No.25的第412-2262位所示，编码VP3蛋白的核酸分子如SEQ ID No.25的第607-2262位所示。
其中，SEQ ID No.1所示多肽插入AAV9的VP1氨基酸序列(SEQ ID No.26)的第588至589位之间，SEQ ID No.2所示多肽插入AAV9的VP1氨基酸序列(SEQ ID No.26)的第454-455位之间。
将pAAV2/9n载体(addgene,#112865)作为模板经历overlapping PCR，引物分别为F1/R1，F2/R2，F3/R3。
F1：5’-GGACTCAGACTATCAGCTCCCGTACGTGCTCGGGTCGGCTCACGAG-3’；
R1：5’-ACAGAAGCAATCTCCCCGGCAGTCACAAGAACCGTTAATAGTCTTTG-3’；
F2：5’-TGTGACTGCCGGGGAGATTGCTTCTGTGGACAGAATCAACAAACGCT-3’。
R2：5’-CCGGGGGAATGGGCCCTGTCTTTGTTGGGCACTCTGGTGGTTTG-3’；
F3：5’-CAAAGACAGGGCCCATTCCCCCGGGCACAGGCGCAGACCGGCTG-3’；
R3：5’-ACCTCTAGTCCTGCAGGTTTAAACGAATTCGCCCTTCGCAG-3’。
以获得三段带有同源臂及插入序列SEQ ID No.22和SEQ ID No.23的片段。使用BsiWI-HF(由NEB生产)及PmeI(由NEB生产)消化pAAV2/9n载体，以获得双酶切载体。用NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix(New England Biolabs生产)将三段PCR片段连接到双酶切pAAV2/9n载体上，转入Trans-T1(由全式金生物技术有限公司生产)菌体扩增并提质粒，这样获得的克隆提取质粒DNA，并且将质粒DNA命名为pAAV-454seq2-588seq1，即包装载体。图1展示pAAV2/9n载体的骨架序列。
pAAV-454seq2-588seq1的结构描述为：在pAAV2/9n载体的BsiWI-HF和PmeI之间插入SEQ ID No.25所示DNA片段后所得重组质粒。
相类似的方法，构建单插入载体pAAV-588seq1和pAAV-454seq1。pAAV-588seq1的结构描述为：在pAAV2/9n载体的BsiWI-HF和PmeI之间插入“在SEQ ID No.24的第1764位和1765位之间插入SEQ ID No.22后所得序列”后所得重组质粒。pAAV-454seq1的结构描述为：在pAAV2/9n载体的BsiWI-HF和PmeI之间插入“在SEQ ID No.24的第1362和1363位之间插入SEQ ID No.22所得序列”后所得重组质粒。
实施例2、AAV-454-RGD/588-AA病毒制备
1、接种细胞并转染
将293T细胞从已经汇合的15cm培养皿板上，用4mL PBS清洗两遍，再用4mL 0.05％的Trypsin消化，室温静置约5min至贴壁细胞漂浮，加入8mL高糖DMEM+10％FBS培养基终止消化，用移液枪轻柔将皿底细胞吹下，吹打多次至细胞完全吹散，将液体移入15mL离心管，1000rpm，3min离心，弃去上清后重悬沉底细胞，混匀后分到3皿15cm培养皿中，每一皿用24mL带10％血清DMEM培养基在湿润的含有0.5％的CO2的培养箱中培养。24h后，当细胞汇合度达到70-90％时，配制如下表2所示的转染体系(一个15cm培养皿板的量)，混匀，静置15min。将室温孵育混合物加入培养皿，6-24h后，更换培养基。
表2、转染体系(一个15cm培养皿板的量)
体系 用量
基因组载体pAAV质粒 7μg
pAdDeltaF6 20μg
pAAV-454seq2-588seq1衣壳质粒 7μg
PEI 120μl
Opti-MEM无血清培养基 补足至5mL
pAdDeltaF6：addgene的Plasmid#112867。
基因组载体pAAV质粒：为addgene编号为#50465的质粒pAAV-hSyn-EGFP，携带EGFP。
2、AAV-454-RGD/588-AA病毒收集
转染后72h，用细胞刮把细胞从培养皿上刮下，把细胞和培养基一起转移到50ml离心管中，室温1000rpm离心10min，弃上清。把所有细胞沉淀用5mL PBS重悬，反复吹打后，再室温1000rpm离心10min，弃上清，用5mL细胞裂解缓冲液(即表3中的AAV提取裂解液)重悬细胞沉淀。把重悬液放入-80℃冰箱冷冻，待10min后完全结冰，再取出置于37℃水浴静置10min，待其完全解冻，Vortex尽量使细胞分散，再次放入-80℃冰箱冷冻。来回重复三次，确保每次都完全结冰与解冻。在溶液中加入5μL浓度为1M的MgCl2，使其终浓度达到1mM。加入5μL浓度为25KU/mL的Benzonase全能核酸酶(Merck生产)，使其终浓度达到250U/ml。混匀，37℃孵育30min至细胞完全裂解。将裂解液以4000rpm，4℃离心30min。保留上清(即AAV粗提液)。
表3、AAV提取裂解液配方
成份 用量
Tris 2.423g
氯化钠NaCl 8.775g
注：表3中成分加入去离子水约1L，磁力搅拌器加速溶解。加入盐酸调整pH值至8.0，定容至1L，0.22μm滤膜过滤除菌，4℃保存备用。
提前配制碘克沙醇梯度溶液如表4所示。
表4、AAV梯度离心液配方
用8cm注射针头吸取6ml 17％碘克沙醇溶液注射于一个干净的36ml Optiseal离心管底部，再依次从最底部加入6ml 25％碘克沙醇溶液、5ml 40％碘克沙醇溶液、4ml 60％碘克沙醇溶液，使得不同梯度的溶液分层，在60％溶液和40％溶液之间划条线标记。将AAV粗提液(即前文上清)逐滴滴入已分层的溶液上，再用裂解缓冲液或PBS填满整个离心管，盖上管盖，将离心管放入70Ti转子，用配套压盖封住离心管，盖上转子盖并拧紧，放入超高速冷冻离心机Optima L8-80XP，在14℃进行53000rpm离心160min。离心结束后取消离心机的真空环境，待内外压强一致时，取出转子，将10mL针管的针头插入标记处，收集含有rAAV的40％碘克沙醇溶液。在Ultra 100K超滤管中加入5ml PBS(已经加入0.5μL体积PluronicTMF-68 Non-ionic表面活性剂)，4℃，3500rpm离心5min，活化滤膜。将收集的包含病毒的40％碘克沙醇溶液加入过滤柱中，然后加入PBS(已加F-68)至超滤柱最大容纳体积，翻转混匀，4℃，3500rpm离心20min。弃去废液，再次向过滤柱中加入PBS(已加F-68)至超滤柱最大容纳体积，翻转混匀，4℃，3500rpm离心20min。重复两次。从超滤柱中回收浓缩的病毒AAV-454-RGD/588-AA。
取5μl用qPCR方法测定病毒滴度。
3、通过实时PCR的AAV-454-RGD/588-AA载体溶液的滴度定量
向5μL浓缩后的AAV-454-RGD/588-AA添加5μL 10×DNase I缓冲剂、39μL注射用水和1μL DNasel(由NEB生产)，并且将混合物在37℃孵育15分钟以移除游离的基因组DNA和质粒DNA。为了使DNasel失活，将混合物在95℃加热10分钟。随后，添加44μL注射用水、5μL 10×DNase I缓冲剂和1μL Proteinase K(由天根生化生产)，并且将混合物在37℃孵育1小时。随后，为了使Proteinase K失活，将混合物在95℃加热10分钟，得到AAV-454-RGD/588-AA的基因组。根据试剂盒附加的说明书使用SuperRealPreMix Plus(SYBR Green)(由天根生化生产)和引物对qRT-F/qRT-R对AAV-454-RGD/588-AA的基因组进行AAV滴度定量。
qRT-F：5’-ggacggcgacgtaaacggcc-3’；
qRT-R：5’-agcttgccggtggtgcagat-3’。
将已知浓度的DNA样品(pAAV-hSyn-EGFP)作为标准品使用，并配制7个浓度梯度为10ng/μL、1ng/μL、10-1ng/μL、10-2ng/μL、10-3ng/μL、10-4ng/μL、10-5ng/μL的标准品。
再根据如下公式，计算出不同浓度的质粒的分子量。其中质粒片段长度为5265bp，本实验的质粒浓度为277μg/mL。
分子质量＝片段长度(bp)×650道尔顿/bp(g/mol)
将7个梯度稀释样品和用于实验的AAV-454-RGD/588-AA基因组样品按如下表5进行配制。注意所有qPCR反应(反应程序如表6所示)需要至少3个平行组，每一个样品需要用枪头上下吹打数次，混匀。
表5、qPCR反应体系
表6、qPCR反应程序
待程序运行完成，根据标准样品的分子数与循环阈值(cycle threshold，Ct)绘制Ct值与分子数对应的标准曲线，如图2所示，根据标准曲线方程，可以通过病毒基因组的Ct值计算出其分子数。通常情况下，AAV-454-RGD/588-AA的滴度为1.0×1012-1013vg/mL。
采用同样的方法制备单插入病毒AAV-454-AA和AAV-588-AA，差别仅在于步骤1“接种细胞并转染”中的pAAV-454seq2-588seq1质粒分别替换为pAAV-588seq1和pAAV-454seq1。
采用同样的方法制备双插入病毒AAV-454-AA/588-AA，差别仅在于步骤1“接种细胞并转染”中的pAAV-454seq2-588seq1质粒分别替换为pAAV-454seq1-588seq1。其中引物R1与F2变为：
R1：5’-CCGGGGGAATGGGCCCTGTCTTTGAGAACCGTTAATAGTCTTTG-3’；
F2：5’-CAAAGACAGGGCCCATTCCCCCGGTGGACAGAATCAACAAACGCT-3’；
对应基因层面，是将SEQ ID No.22所示DNA片段插入到了AAV9的Cap9序列(SEQ IDNo.24)的第1764和1765位之间，同时将SEQ ID No.22所示DNA片段插入到了AAV9的Cap9序列(SEQ ID No.24)的第1362-1363位之间，得到SEQ ID No.27所示DNA片段。完成插入后，在最终所得的腺相关病毒衣壳蛋白变体编码基因中，编码VP1蛋白的核酸分子如SEQ IDNo.27所示，编码VP2蛋白的核酸分子如SEQ ID No.27的第412-2259位所示，编码VP3蛋白的核酸分子如SEQ ID No.27的第607-2259位所示。然后继续参照上述方法制备野生型AAV9并测定病毒滴度，差别仅在于步骤1“接种细胞并转染”中的pAAV-454seq2-588seq1质粒替换为pAAV2/9n。
实施例3、AAV-454-AA/588-AA和AAV-454-RGD/588-AA在癌细胞中嗜性的评估
将在实施例2中获得的搭载EGFP基因(来源于pAAV-hSyn-EGFP)纯化的454-RGD/588-AA和454-AA/588-AA溶液或野生型AAV9侵染到96孔板HEK293T(人胚胎肾细胞)、RKO(人结肠癌细胞)中。细胞汇合度在50％以下进行重组腺相关病毒侵染。设置病毒用量梯度为100vg/细胞，500vg/细胞，1000vg/细胞。将相应量的浓缩毒液贴壁加入孔中，轻柔来回震荡孔板使其混合均匀，置于37℃、5％ CO2的条件下培养过夜。病毒侵染24h后，观察孔内病毒状态，用排枪吸出培养基和毒液，换入新鲜预热的10％ FBS的DMEM培养基。在腺相关病毒侵染72h后，用排枪吸出培养基，换入预热PBS，轻柔浸润细胞后吸出，换入预热0.05％Trpsin，室温孵育3min后加入10％ FBS的DMEM培养基中和反应，并使用BD FACSverse流式细胞分析仪分析侵染后细胞GFP阳性比率。结果如图2所示。由图可知454-RGD/588-AA、454-AA/588-AA的侵染效率比野生型WT、454-AA、588-AA突变体都高，最高比野生型AAV(WT)侵染效率高7倍，且比588-AA高75％。
在上文结果中可以看到的，相比于包括野生型衣壳的AAV载体，当使用在AAV9的VP1氨基酸编号450至460位置处插入SEQ ID No.1-SEQ ID No.21的氨基酸序列的肽之一，同时在585至590的位置处插入SEQ ID No.1-SEQ ID No.21的氨基酸序列的肽之一时，在细胞系中具有更高侵染性。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (10)

1.腺相关病毒衣壳蛋白变体，其特征在于：所述腺相关病毒衣壳蛋白变体为在腺相关病毒衣壳蛋白的氨基酸序列的如下a)和b)两个位置处分别插入SEQ ID No.1至SEQ IDNo.21所示多肽中的任意一个后得到：
a)第450-460位之间；
b)第580-590位之间。
2.根据权利要求1所述的腺相关病毒衣壳蛋白变体，其特征在于：所述a)为第454和455位之间；
和/或
所述b)为第588和589位之间。
3.根据权利要求1或2所述的腺相关病毒衣壳蛋白变体，其特征在于：所述腺相关病毒为AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV-DJ、禽AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV或羊AAV；
进一步地，所述腺相关病毒为9型腺相关病毒或DJ型腺相关病毒；
和/或
所述腺相关病毒衣壳蛋白变体为在9型腺相关病毒衣壳蛋白VP1的氨基酸序列的第588和589位之间插入SEQ ID No.1所示多肽，并且第454和455位之间插入SEQ ID No.1或SEQID No.2所示多肽后得到。
4.编码权利要求1-3中任一所述腺相关病毒衣壳蛋白变体的核酸分子。
5.根据权利要求4所述的核酸分子，其特征在于：在所述腺相关病毒衣壳蛋白变体中，编码VP1蛋白的核酸分子如SEQ ID No.25所示，编码VP2蛋白的核酸分子如SEQ ID No.25的第412-2262位所示，编码VP3蛋白的核酸分子如SEQ ID No.25的第607-2262位所示；或
在所述腺相关病毒衣壳蛋白变体中，编码VP1蛋白的核酸分子如SEQ ID No.27所示，编码VP2蛋白的核酸分子如SEQ ID No.27的第412-2259位所示，编码VP3蛋白的核酸分子如SEQ ID No.27的第607-2259位所示。
6.含有权利要求4或5所述核酸分子的表达盒或重组载体或重组菌或转基因细胞系。
7.一种腺相关病毒变体，含有权利要求1-3中任一所述腺相关病毒衣壳蛋白变体。
8.权利要求7所述腺相关病毒变体在作为基因导入载体中的应用。
9.如下任一应用：
P1、SEQ ID No.1至SEQ ID No.21所示21个多肽中的任意2个在制备权利要求1-3中任一所述腺相关病毒衣壳蛋白变体中的应用；
P2、SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示两个多肽在制备权利要求1-3中任一所述腺相关病毒衣壳蛋白变体中的应用；
P3、权利要求1-3中任一所述腺相关病毒衣壳蛋白变体或权利要求4或5所述核酸分子或权利要求6所述表达盒或重组载体或重组菌或转基因细胞系在制备权利要求7所述腺相关病毒变体中的应用。
10.如下任一生物材料：
Q1、多肽组合，由SEQ ID No.1至SEQ ID No.21所示21个多肽中的任意2个组成；
Q2、多肽组合，由SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示两个多肽组成；
Q3、多肽，为SEQ ID No.2至SEQ ID No.21所示21个多肽中的任意1个；
Q4、编码Q1或Q2中所述多肽组合的核酸分子或核酸分子组合；
Q5、编码Q3中所述多肽的核酸分子；
Q6、含有Q3中所述核酸分子或核酸分子组合或Q5中所述核酸分子的表达盒或重组载体或重组菌或转基因细胞系；
Q7、重组腺相关病毒，为携带有目的基因的权利要求7所述腺相关病毒变体。
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