CN112225793A - 一种溶酶体靶向肽及其融合蛋白、携带融合蛋白编码序列的腺相关病毒载体及其应用 - Google Patents

一种溶酶体靶向肽及其融合蛋白、携带融合蛋白编码序列的腺相关病毒载体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种人成熟的胰岛素样生长因子Ⅱ(IGFⅡ)突变体及其融合蛋白，本发明还公开了一种重组核酸分子，其包含可操作连接的表达调控序列、编码上述IGFⅡ突变体的核酸序列和编码功能性酸性α‑葡糖苷酶的核酸序列。本发明还公开了一种重组腺相关病毒，其包含AAV衣壳和载体基因组，所述载体基因组包含上述重组核酸分子。本发明还公开了所述重组腺相关病毒载体用于更有效地治疗庞贝氏症的用途。

Description

一种溶酶体靶向肽及其融合蛋白、携带融合蛋白编码序列的 腺相关病毒载体及其应用
技术领域
本发明涉及生物治疗领域，尤其涉及一种溶酶体靶向肽及其融合蛋白、携带融合蛋白编码序列的腺相关病毒载体及其应用。
背景技术
庞贝氏症(Pompe disease)是一种由于溶酶体缺乏酸性α-葡糖苷酶(GAA)而导致的溶酶体糖原贮积症，GAA缺乏造成糖原无法分解，因此也被称为Ⅱ型糖原贮积症。所有患者病程相同，随着糖原在不同组织中的逐渐堆积，最终导致组织衰竭甚至死亡。庞贝氏分为早发型和迟发型。早发型明显的临床症状包括巨舌、肝脏肿大、心脏肥大、肌张力减弱，一般会在一岁之前死于心脏及呼吸系统衰竭；迟发型主要临床症状包括由下肢开始的慢性四肢肌肉退化、呼吸功能不全、神经系统影响、除Wolff-Parkinson-White综合征(左心室肥大，主动脉上行支扩张)不伴随明显心脏疾病；其它非典型症状包括脊柱僵直、脊椎侧弯、体重下降。庞贝氏症发病率约为1/30000到1/50000，严重影响身体健康，还给社会和家庭造成沉重的负担。
目前已上市的蛋白药物是Genzyme公司研发的lumizyme，给药剂量为20mg/kg，给药方式为静脉给药，两周一次。这是一种酶替代疗法(ERT)疗法，是将重组人溶酶体酶(例如酸性α-葡糖苷酶)给予患者以补充其缺乏的生物活性以改善临床症状。此类蛋白药物的主要缺点是在体内半衰期短、有效利用率低、给药频率高、易造成患者依从性差，长时间治疗给患者家庭造成经济负担。
溶酶体贮积症治疗的前提是溶酶体酶必须在溶酶体内发挥作用，因而需要一种由细胞外进入细胞，随后递送至溶酶体的机制。为提高药物的利用率，使其有效递送至溶酶体，也做了大量的研究工作。研究发现，在哺乳动物中，对大多数可溶性溶酶体酶而言，其蛋白骨架上的分支碳水化合物结构被修饰形成甘露糖-6-磷酸(M6P)的特殊碳水化合物结构。M6P是天然生物信号，其通过膜结合M6P受体将溶酶体酶转移到溶酶体中。这种方法虽然已显示出一定的安全性，但其在减轻临床症状的效果方面存在差异，主要是由于不同溶酶体酶M6P含量不同所致，其中某些重组溶酶体酶的M6P含量较低，细胞摄取减少，因而降低药物疗效。因此需要更高剂量才能达到治疗效果，但这样不仅增加成本，还延长输注时间，导致显著的免疫应答，造成过敏反应。
为改善药物的疗效，实现溶酶体酶的靶向性运输至溶酶体中的一种潜在策略是引入靶向肽以有效地将治疗性溶酶体酶运输到溶酶体而不需要传统M6P碳水化合物结构。研究发现，非阳离子依赖型M6P受体(CI-MPR)存在于大多数细胞类型的表面上，且同时具有胰岛素样生长因子Ⅱ(IGFⅡ)的结合结构域，因此该受体也称为IGFⅡ/CI-MPR受体。CI-MPR受体对于IGFⅡ的亲和力明显高于其对于M6P的亲和力，因此可使用IGFⅡ作为靶向肽把重组溶酶体酶运输到溶酶体中。虽然IGFⅡ还可以和胰岛素受体、IGFⅠ受体、IGF结合蛋白结合，但亲和力较低，并且通过对IGFⅡ的截断和突变，可以维持IGFⅡ与CI-MPR的高亲和力，并显著降低其与其它受体的亲和力，例如：27位的Leu取代Tyr，43位的Leu取代Val的IGFⅡ突变体可显著减少或消除IGFⅡ与IGFⅠ受体结合(Torres等人，J.Mol.Biol(1995).248(2):385-401)。26位的Ser取代Phe能够降低IGFⅡ对IGFBP-1和IGFBP-6的亲和力(Bach等人，J.Biol.Chem(1993).268(13):9246-9254)。因此IGFⅡ肽可能被用作替代传统M6P碳水化合物结构的靶向基序以促使重组溶酶体酶被细胞摄取并转运到溶酶体中。
腺相关病毒(AAV)具有多种血清型，普遍存在于人类和灵长类动物体内。rAAV作为基因治疗载体，具有非常多的优势，如感染效率高、感染范围广、长期表达的高安全性等。目前已被广泛应用于临床实验。
庞贝氏病治疗的策略主要针对迟发性患者，此类患者生存时间长，但是由于四肢退化问题，直接影响生活质量。以骨骼肌及外周神经组织为主要靶向组织，并能同时靶向心脏的AAV血清型是首选。目前AAV9已经被应用于神经性疾病—脊髓性肌萎缩的基因治疗药物中，并显示出很好的治疗效果，由此可见，该载体是安全的。
综上所述，应用溶酶体靶向肽、包含溶酶体靶向肽的融合蛋白以及携带融合蛋白编码序列的腺相关病毒载体治疗庞贝氏症等溶酶体贮积症，能有效提高药物利用率，有望取得更好的治疗效果。
发明内容
基于以上，本发明提供了高效的基因治疗药物，候选药物通过病毒载体携带正常的酸性α-葡糖苷酶(GAA)，同时可操作地连接启动子、编码溶酶体靶向结构域IGFⅡ突变体的核酸序列，使患者体内高效产生正常的GAA，降低糖原的积累，从而达到治疗庞贝氏症的目的。
在一方面，本发明提供了一种人成熟的胰岛素样生长因子Ⅱ(IGFⅡ)突变体，其中，所述突变体与人成熟的全长胰岛素样生长因子Ⅱ(SEQ ID NO：1)具有至少70％的同源性，所述突变体以不依赖甘露糖-6-磷酸的方式与人的非阳离子依赖型甘露糖-6-磷酸受体结合，并且，相对于天然存在的人胰岛素生长因子Ⅱ，所述胰岛素样生长因子Ⅱ突变体可以更有效地把治疗性溶酶体酶运输到溶酶体。
优选地，所述人成熟的胰岛素样生长因子Ⅱ突变体，其氨基酸序列包含：
(1)人成熟的全长胰岛素样生长因子Ⅱ的第1位和8-67位的氨基酸序列组成的序列，其具体氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；或，
(2)人成熟的全长胰岛素样生长因子Ⅱ的第1位和8-67位的氨基酸序列组成的序列，其中第12位谷氨酸突变为精氨酸，第30位精氨酸突变为丙氨酸，其具体氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
在另一方面，本发明提供了一种融合蛋白，其包含前述的人成熟胰岛素样生长因子Ⅱ突变体和需要运输到溶酶体的目的蛋白。所述目的蛋白优选为酸性α-葡糖苷酶(GAA)，所述酸性α-葡糖苷酶选自野生型全长酸性α-葡糖苷酶或由野生型全长酸性α-葡糖苷酶第70-952位氨基酸形成的多肽。
在一方面，本发明提供了编码前述人成熟的胰岛素样生长因子Ⅱ突变体或融合蛋白的核酸。
在另一方面，本发明提供了一种重组核酸分子，其包含可操作连接的启动子和前述编码融合蛋白的核酸序列。
其中所述启动子是巨细胞病毒(CMV)启动子、结蛋白(DES)启动子、突触蛋白Ⅰ(SYN)启动子或肌肉肌酸激酶(MCK)启动子。优选地，所述启动子是巨细胞病毒(CMV)启动子。
其中所述重组核酸分子进一步包含多聚腺苷酸、Kozak序列、WPRE和转录后调节元件中的一种或多种。
优选地，所述重组核酸分子包含：
1)SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5所示多核苷酸序列；或，
2)SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5所示多核苷酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个核苷酸而得到的核苷酸序列；或，
3)与SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5所示的多核苷酸序列具有80％以上序列同一性的多核苷酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的序列；更优选地，具有98％或99％以上同一性的序列。
其中所述重组核酸分子还包含AAV反向末端重复序列；优选地，所述AAV反向末端重复序列选自不同血清型的AAV；优选地，所述AAV反向末端重复序列选自进化支A-F中的任意血清型的AAV或AAV1型、AAV2型、AAV3型、AAV4型、AAV5型、AAV6型、AAV7型、AAV8型、AAV9型或其杂交/嵌合型中的任意一个；更优选地，所述AAV反向末端重复序列来自AAV2型。
在一方面，本发明提供了一种重组载体，其包含前述的重组核酸分子，其中，所述载体选自质粒载体，噬菌体载体和病毒载体组；其中病毒载体选自腺相关病毒载体、腺病毒载体、慢病毒载体和杂合病毒载体组。
在一方面，本发明提供了一种重组腺相关病毒，其中，所述重组腺相关病毒包含AAV衣壳和载体基因组，所述载体基因组包含前述的重组核酸分子，优选地，所述重组腺相关病毒的衣壳优选AAV9，更优选地，所述重组腺相关病毒为单链腺相关病毒。
在一方面，本发明提供了一种分离的宿主细胞，其包含前述的人成熟胰岛素样生长因子Ⅱ突变体、融合蛋白、重组核酸分子、重组载体或重组腺相关病毒。
在一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含前述的人成熟胰岛素样生长因子Ⅱ突变体、融合蛋白、重组核酸分子、重组载体、重组腺相关病毒和/或前述的宿主细胞以及药学上可接受的载体和/或其它常规药用成分(如防腐剂和/或稳定剂)。所述药物组合物可配制为用于静脉注射、鞘内注射、脑室内注射、胸腔注射、口服、吸入、鼻内、气管内、动脉内、眼内、肌内、腹内和/或其它肠胃外途径进行给药。
在一方面，本发明提供了前述的人成熟胰岛素样生长因子Ⅱ突变体、融合蛋白、重组核酸分子、重组载体、重组腺相关病毒、宿主细胞和/或前述的药物组合物在制备用于预防或治疗庞贝氏症的药物中的用途。
根据前一方面的用途，其中前述的人成熟的胰岛素样生长因子Ⅱ突变体、融合蛋白、重组核酸分子、重组载体、重组腺相关病毒、宿主细胞和/或药物组合物可以与另一疗法联合施用。
在一方面，本发明提供了一种在受试者中治疗庞贝氏症的方法，所述方法包括向需要其的受试者施用前述的人成熟的胰岛素样生长因子Ⅱ突变体、融合蛋白、重组核酸分子、重组载体、重组腺相关病毒、宿主细胞和/或前述的药物组合物；优选地，所述受试者是哺乳动物；更优选地，所述受试者是人。
本发明的积极效果在于：
本发明提供了一组人成熟的胰岛素样生长因子Ⅱ突变体，包含此组人成熟的胰岛素样生长因子Ⅱ突变体的融合蛋白，以及包含融合蛋白编码序列的腺相关病毒载体，可以使酸性α-葡糖苷酶(GAA)等溶酶体酶更有效地靶向溶酶体，相比现有技术，可以更持久有效地治疗庞贝氏症等溶酶体贮积症。
下面结合附图和具体实施方式对本公开做进一步说明，并非对本公开的限制。凡是依照本专利申请公开内容所进行的任何本领域等同替换，均属于本专利的保护范围。
附图说明
图1示出了此发明相关质粒图谱。
图2示出了此发明相关主体药物结构。
图3示出了含有不同启动子元件的重组腺相关病毒及以不同给药方式注射小鼠后，不同组织中酸性α-葡糖苷酶活性比较。其中图3A示出了给药7天后不同组织中酸性α-葡糖苷酶活性检测结果，图3B示出了给药28天后不同组织中酸性α-葡糖苷酶的活性检测结果。
图4示出了不同重组腺相关病毒感染C2C12细胞后胞内外酸性α-葡糖苷酶活性及蛋白表达量检测结果。其中图4A表示不同重组腺相关病毒感染C2C12细胞后胞内外酸性α-葡糖苷酶活性检测结果，图4B表示不同重组病毒感染C2C12细胞后胞内外酸性α-葡糖苷酶表达量检测结果。
图5示出了候选药物感染小鼠原代成肌细胞后胞内外酸性α-葡糖苷酶活性检测结果。
图6示出了候选药物感染小鼠原代成肌细胞后的糖原清除检测结果。
图7示出了候选药物施用模型鼠后，不同组织中酸性α-葡糖苷酶活性检测结果。
图8示出了候选药物施用模型鼠后，不同组织中糖原清除检测结果。
具体实施方式
I.定义
除非另外指出，本发明的实践将采用本领域技术中的常规化学、生物化学、重组DNA技术和免疫学的方法。这样的技术在文献中有充分解释(参见例如FundamentalVirology，第二版，vol.I&Ⅱ(B.N.Fields和D.M.Knipe编)；Handbook ofExperimentalImmunology，VoIs.I-FV(D.M.Weir和CC.Blackwell编，BlackwellScientificPublications)；T.E.Creighton，Proteins:Structures and MolecularProperties(W.H.Freeman和Company，1993)；A.L.Lehninger，Biochemistry(WorthPublishers,Inc.，current addition)；Sambrook,等，Molecular Cloning:ALaboratoryManual(第2版，1989)；Methods In Enzymology(S.Colowick和N.Kaplan编，AcademicPress,Inc.)。
为了便于理解本公开内容的各个实施方案，提供了特定术语的以下解释：
酶替代疗法(ERT)是通过将缺失的酶注入到体内以纠正酶缺乏的治疗策略。为使溶酶体酶替代疗法有效，必须将治疗性酶运输到相应的细胞溶酶体中。传统的溶酶体酶替代疗法采用天然连接到蛋白的碳水化合物(M6P)以配合靶细胞表面上的特定受体来进行递送。
非阳离子依赖型甘露糖-6-磷酸受体(CI-MPR或M6P/IGFⅡ受体或CI-MPR/IGFⅡ受体),因其广泛存在于大多数细胞型表面，特别适用于靶向替代溶酶体酶。
非糖基化作用依赖型溶酶体靶向技术(GILT)是采用多肽代替M6P以配合用于溶酶体靶向的CI-MPR，典型地GILT多肽是一种以非甘露糖-6-磷酸依赖型方式结合CI-MPR的蛋白、多肽或其它部分。该技术以不依赖于甘露糖-6-磷酸的方式模拟了用于吸收溶酶体酶的正常生物机制。
优选的GILT多肽来源于人胰岛素样生长因子Ⅱ(IGFⅡ)。人IGFⅡ是CI-MPR的高亲和配体。GILT多肽连接的治疗用酶与CI-MPR受体结合使得该蛋白经胞吞途径靶向溶酶体。该方法相对于糖基化方法具有简单和成本有效性等多种优势。
融合蛋白或治疗性融合蛋白是指一种蛋白或治疗性蛋白与至少另一种蛋白或多肽连接。在一些实施例中，融合蛋白是一种含有两个或两个以上蛋白质或片段通过肽键共价连接形成的蛋白质分子。在另一些实施例中，融合蛋白包含一种治疗性蛋白和信号肽或增加融合蛋白内吞作用的的多肽。在一些实施例中，增加细胞内吞作用的多肽为可与CI-MPR结合的多肽。
通过将编码恰当GILT多肽(如IGFⅡ)的序列融合到GAA编码序列，即为GILT多肽-GAA(IGFⅡ-GAA)，可以高亲和力结合于CI-MPR，而不依赖于蛋白上的M6P含量。GILT多肽-GAA(IGFⅡ-GAA)对CI-MPR具有高亲和力，并且比传统的酶替代疗法更有效。增加的效能可以使治疗剂量更低，从而减少成本，并减轻患者的免疫反应，减少输注时间。
IGFⅡ优选特异性靶向CI-MPR，IGFⅡ多肽中的突变可产生以高亲和力结合CI-MPR的蛋白，同时不再以明显亲和力结合其它IGFⅡ受体。例如，用Ser替代IGFⅡ的Phe 26可以降低IGFⅡ对IGFBP-1和IGFBP-6的亲和力，而不影响对M6P/IGFⅡ受体的结合(Bach等人.J.Biol.Chem(1993).268(13):9246-9254)。其它替代，例如Leu取代Tyr27，Leu取代Val43的IGFⅡ突变体可显著减少或消除IGFⅡ与IGFⅠ受体结合(Torres等人，J.Mol.Biol(1995).248(2):385-401)。IGFⅡ的C端截短(残基62-67)可以将IGFⅡ对IGFⅠ受体的亲和力显著降低(Roth等人，Biochem.Biophys.Res.Commun(1991).181(2):907-914)。
蛋白或多肽突变：可以通过将适当的核苷酸变化引入到IGFⅡDNA中或通过合成所期望的IGFⅡ多肽来制备IGFⅡ突变蛋白。变化可以是编码IGFⅡ的一个或多个密码子的取代、缺失或插入，与天然的人成熟IGFⅡ相比，其导致IGFⅡ的氨基酸序列发生变化。氨基酸取代可以用具有类似结构和/或化学性质的另一种氨基酸替代一种氨基酸的结果，即保守氨基酸替代。氨基酸取代还可以是用具有不相似的结构和/或化学性质的另一种氨基酸替代一种氨基酸的结果，即非保守氨基酸替代。
还可以使用扫描氨基酸分析来沿着连续序列鉴别一个或多个氨基酸。在优选的扫描中，氨基酸为相对较小的中性氨基酸。这样的氨基酸包括丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸和半胱氨酸。其中丙氨酸通常是优选的。
可以使用本领域已知的方法进行所述改变，如寡核苷酸介导的定向突变、丙氨酸扫描和PCR突变或其它已知技术来产生IGFⅡ突变蛋白。
GILT多肽可以融合到GAA多肽的N端或C端，GILT多肽可以直接融合到GAA多肽或可以通过连接区(linker)或间隔区(spacer)与GAA多肽分开。连接区可以是相对短的，也可以是较长的，例如10-25个氨基酸的长度。在一个优选的实施方案中，连接区序列是Gly-Ala-Pro。
GILT多肽-GAA融合蛋白可以在各种哺乳动物细胞系中表达，包括但不限于人胚肾(HEK)293细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、猴肾(COS)细胞、Hela细胞、C127、L-929细胞等。GILT多肽-GAA融合蛋白可以在各种非哺乳动物细胞系中表达，如昆虫(例如sf-9、sf21)细胞、植物(例如豆科植物)细胞、酵母(例如酿酒酵母)细胞、原核生物细胞或真菌细胞等。
GILT多肽-GAA融合蛋白纯化方法一般采用常规纯化方法，包括但不限于凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析、亲和层析、疏水作用层析等。
腺相关病毒(AAV)：感染人和其他一些灵长类物种的小的复制缺陷性无包膜病毒。已知AAV不造成疾病并且引起非常轻微的免疫应答。使用AAV的基因疗法载体可以感染分裂细胞和静止期细胞，并且可以保持染色体外状态而不整合到宿主细胞的基因组中。这些特征使得AAV成为用于基因疗法的有吸引力的病毒载体。
给药/给予：通过有效的途径向受试者提供或给予药剂，例如治疗剂(例如，重组AAV)。示例性给药途径包括但不限于注射(例如，皮下、肌内、真皮内、腹膜内和静脉内)、口服、导管内、舌下、直肠、经皮、鼻内、阴道和吸入途径。
密码子优化的：“密码子优化的”核酸是指已经被改变以使得密码子最适于特定系统(例如，特定物种或物种的组)中的表达的核酸序列。例如，核酸序列可以优化用于在哺乳动物细胞或特定哺乳动物物种(例如人细胞)中表达。密码子优化不改变所编码蛋白质的氨基酸序列。
增强子：通过提高启动子的活性来提高转录速率的核酸序列。
内含子：基因中不包含蛋白质的编码信息的一段DNA。内含子在信使RNA翻译之前被移除。杂合内含子(hybrid intron)：是一种组合内含子，其包括来自一个以上天然内含子的序列。
反向末端重复(ITR)：有效复制所需的腺相关病毒基因组中的对称核酸序列。ITR序列位于AAV DNA基因组的每一端。ITR充当病毒DNA合成的复制起点，并且是产生AAV整合型载体的必要的顺式元件。
分离的：“分离的”生物组分(例如，核酸分子、蛋白质、病毒或细胞)已经被从其中所述组分天然存在的生物体的细胞或组织中或者生物体本身中的其他生物组分(例如其他染色体和染色体外DNA和RNA、蛋白质和细胞)中基本上分离或纯化。已经“分离”的核酸分子和蛋白质包括通过标准纯化方法纯化的那些。该术语还包括通过在宿主细胞中重组表达制备的核酸分子和蛋白质，以及化学合成的核酸分子和蛋白质。
可操作地连接：当第一核酸序列与第二核酸序列被放置为具有功能关系时，第一核酸序列与第二核酸序列可操作地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子与编码序列可操作地连接。通常，可操作地连接的DNA序列是连续的，并且当有必要连接两个蛋白质编码区时，其在相同阅读框中。
可药用载体：本公开内容中可以使用的可药用载体(溶剂(vehicle))是常规的。Remington’s Pharmaceutical Sciences,by E.W.Martin,MackPublishing Co.,Easton,PA,15th Edition(1975)描述了适合一种或更多种治疗性化合物、分子或试剂的药物递送的组合物和制剂。
通常，载体的性质取决于所使用的特定给药方式。例如，胃肠外制剂通常包含可注射流体，其包括药学和生理学上可接受的流体，例如水、生理盐水、平衡盐溶液、水性右旋糖、甘油等作为溶剂。对于固体组合物(例如，粉末剂、丸剂、片剂或胶囊剂形式)，可以包含常规无毒固体载体，例如药物级甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除了生物学中性载体外，待给予的药物组合物还可以包含少量无毒辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂和pH缓冲剂等，例如醋酸钠或脱水山梨糖醇单月桂酸酯。
预防、治疗或改善疾病：“预防”疾病是指抑制疾病的全面发生。“治疗”是指在疾病开始发生后改善疾病或病理病症的体征或症状的治疗性介入。“改善”是指降低疾病的体征或症状的数目或严重性。
启动子：指导/引起核酸(例如，基因)的转录的DNA区域。启动子包括转录起始位点附近的必要核酸序列。通常，启动子位于其转录的基因附近。启动子区域还任选地包括远端增强子或阻遏物元件，其可以位于距转录起始位点数千个碱基对远。
重组：重组核酸分子是指这样的核酸分子，其具有非天然存在的序列，或者具有通过两个序列片段的人为组合(否则地话，其将是分开的)制备的序列。这种人为组合可以通过化学合成或者通过分离的核酸分子片段的人为操作(如通过基因工程技术)实现。
同样地，重组病毒是包含非天然存在的序列或通过至少两个不同来源的序列的人为组合制备的序列的病毒。术语“重组”还包括仅通过天然核酸分子、蛋白质或病毒的一部分的添加、置换或缺失改变的核酸、蛋白质和病毒。本文使用的“重组AAV”是指其中包装有重组核酸分子(例如，编码G6Pase-α的重组核酸分子)的AAV颗粒。
血清型：通过抗原的特征组区分的一类密切相关的微生物(例如，病毒)。
受试者：活的多细胞脊椎动物生物体，包括人和非人哺乳动物的类别。
合成：通过人工手段在实验室产生，例如合成核酸可以在实验室化学合成。
治疗有效量：足以在用试剂治疗的受试者或者细胞中取得所需效果的特定药物或治疗试剂(例如重组AAV)的量。试剂的有效量取决于多种因素，包括但不限于被治疗的受试者或细胞，以及治疗性组合物的给药方式。
载体：载体是允许插入外源核酸而不破坏载体在宿主细胞中复制和/或整合的能力的核酸分子。载体可以包含允许其在宿主细胞中复制的核酸序列，例如复制起点。载体还可以包含一种或更多种选择性标记基因和其他遗传元件。表达载体是包含必要的调控序列以允许插入的基因转录和翻译的载体。在本文的一些实施方案中，载体是AAV载体。
序列同一性：两个或更多个核酸序列之间或者两个或更多个氨基酸序列之间的同一性或相似性是根据序列之间的同一性或相似性表示。序列同一性可以根据百分比同一性测量；百分比越高，序列越相同。序列相似性可以根据百分比相似性测量(考虑保守性氨基酸置换)；百分比越高，序列越相似。当使用标准方法比对时，核酸或氨基酸序列的同源物或直系同源物具有相对高的序列同一性/相似性程度。与来自相关性更远的物种(例如，人和线虫(C.elegans)序列)相比，当直系同源蛋白质或cDNA来自更紧密相关的物种(例如，人和小鼠序列)时，这种同源性更显著。
序列同一性比较的长度可在基因组的全长上，基因编码序列的全长，或至少大约500至5000个核苷酸的片段是期望的。但是，在较小片段(例如具有至少大约9个核苷酸，通常至少大约20至24个核苷酸、至少大约28至32个核苷酸、至少大约36或更多个核苷酸)中的同一性也可以是期望的。
可在全长的蛋白、多肽、大约32个氨基酸、大约330个氨基酸或其肽片段或相应的核酸序列编码序列上容易地测定氨基酸序列的百分比同一性。合适的氨基酸片段的长度可以为至少大约8个氨基酸，并可以为至最多大约700个氨基酸。通常，当提到两种不同序列之间的“同一性”、“同源性”或“相似性”时，参照“比对”序列确定“同一性”、“同源性”或“相似性”。“比对”序列或“比对”是指多个核酸序列或蛋白(氨基酸)序列，其通常含有与参考序列相比缺失或额外的碱基或氨基酸的校正。
使用任何公共或市售可得的多序列比对程序来进行比对。序列比对程序可用于氨基酸序列，例如“Clustal X”、“MAP”、“PIMA”、“MSA”、“BLOCKMAKER”、“MEME”和“Match-Box”程序。通常，这些程序中的任一种以默认设置使用，尽管本领域技术人员可以按需改变这些设置。或者，本领域技术人员可以采用至少提供如参考算法或程序所提供的同一性或比对水平的另一算法或计算机程序。参见例如J.D.Thomson等人,Nucl.Acids.Res.,“Acomprehensive comparison of multiple sequence alignments”,27(13):2682-2690(1999)。
多序列比对程序还可用于核酸序列。此类程序的实例包括“Clustal W”、“CAPSequence Assembly”、“BLAST”、“MAP”和“MEME”，其可以通过互联网上的Web服务器来访问。此类程序的其它来源是本领域技术人员已知的。或者，还使用Vector NTI应用程序。还存在许多可用于测量核苷酸序列同一性的本领域已知的算法，包括在上述程序中包含的那些。作为另一实例，可以使用FastaTM(GCG Version 6.1中的一个程序)来比较多核苷酸序列。FastaTM提供了询问与搜索序列之间最佳重叠区域的比对和百分比序列同一性。例如，可以使用FastaTM以其在GCG Version 6.1(经此引用并入本文)中提供的默认参数(字长为6，和用于打分矩阵的NOPAM因子)来确定核酸序列之间的百分比序列同一性。
在一方面，提供了编码GAA蛋白的氨基酸序列及其编码序列。各种GAA的核苷酸和氨基酸序列是已知的，在NCBI中可以查到。本发明所述的GAA蛋白可以来源于不同物种。在一个实施方案中，本发明的GAA蛋白是天然存在的成熟GAA蛋白。在另一实施方案中，本发明的GAA蛋白也包括保留了生物学活性的各种突变体或衍生物。在一个实施方案中，提供了修饰的GAA编码序列。优选地，修饰的GAA编码序列与全长天然GAA编码序列具有小于大约80％的同一性，优选大约75％或更小的同一性。在一个实施方案中，修饰的GAA编码序列的特征在于在AAV介导的递送之后与天然GAA相比具有改进的翻译速率。在一个实施方案中，修饰的GAA编码序列与全长天然GAA编码序列共享小于大约80％、79％、78％、77％、76％、75％、74％、73％、72％、71％、70％、69％、68％、67％、66％、65％、64％、63％、62％、61％或更小的同一性。
在一个实施方案中，修饰的GAA编码序列是密码子优化的序列，针对受试物种中的表达而进行了优化。本文中所用的“受试者”是哺乳动物，例如人、小鼠、大鼠、豚鼠、狗、猫、马、牛、猪或非人灵长类，如猴子、黑猩猩、狒狒或大猩猩。在一个优选实施方案中，该受试者是人。在一个实施方案中，该序列经密码子优化用于在人内表达。
密码子优化的编码区可以通过各种不同的方法来设计。可以使用可在线获得的方法(例如GeneArt)、公开的方法、或提供密码子优化服务的公司，例如DNA2.0(Menlo Park,CA)来进行这种优化。例如，在国际专利公开号WO 2015/012924A2中描述了一种密码子优化方法，其经此引用全文并入本文。还参见例如US2014/0032186A1和US2006/0136184A1。适当地，修改该产品的开放阅读框(ORF)的整个长度。但是，在一些实施方案中，可以仅改变ORF的片段。通过使用这些方法中的一种，可以对任意给定的多肽序列施加所述频率，并生产编码该多肽的密码子优化的编码区的核酸片段。
许多选择可用于对密码子进行实际改变或用于合成如本文中所述设计的密码子优化的编码区。可以使用本领域普通技术人员熟知的标准和常规的分子生物学操作来进行此类修饰或合成。在一种方法中，通过标准方法合成了各自长度为80-90个核苷酸并跨越所需序列长度的一系列互补寡核苷酸对。合成这些寡核苷酸对，使得它们在退火时形成含有粘性末端的80-90个碱基对的双链片段，例如合成该对中的各寡核苷酸以超出与该对中另一寡核苷酸互补的区域延伸3、4、5、6、7、8、9、10或更多个碱基。各寡核苷酸对的单链末端被设计为与另一寡核苷酸对的单链末端退火。使该寡核苷酸对退火，并随后使这些双链片段中的大约五至六个经由粘性单链末端一起退火，和随后它们连接在一起并克隆到标准细菌克隆载体中，例如可获自Invitrogen Corporation,Carlsbad,Calif的
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载体。随后通过标准方法对该构建体进行测序。制备数个由连接在一起的5至6个80至90个碱基对的片段(即大约500个碱基对的片段)组成的这些构建体，以使整个所需序列显示为一系列的质粒构建体。随后用适当的限制酶切割这些质粒的插入物，并连接在一起以形成最终构建体。最终构建体随后克隆到标准细菌克隆载体中，并进行测序。另外的方法对本领域技术人员会是显而易见的。此外，基因合成容易购得。
在一个实施方案中，将本文中描述的修饰的GAA基因工程化为可用于生成病毒载体和/或递送至宿主细胞的合适的遗传元件(载体)，例如裸DNA、噬菌体、转座子、粘粒、游离基因等等，其传送在其上携带的GAA序列。所选载体可以通过任何合适的方法来递送，包括转染、电穿孔、脂质体递送、膜融合技术、高速DNA包覆小球、病毒感染和原生质体融合。用于制造此类构建体的方法是核酸操作领域技术人员已知的，并包括基因工程、重组工程和合成技术。参见例如Sambrook等人,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,ColdSpringHarbor Press,Cold Spring Harbor,NY。
在一方面，提供了包含该GAA核酸序列的表达盒。本文中所用的“表达盒”是指包含启动子和GAA序列的核酸分子，并为此可以包括其它调节序列，该表达盒可以包装到病毒载体(例如病毒粒子)的衣壳中。通常，用于生成病毒载体的此类表达盒含有本文中描述的GAA序列，其侧接病毒基因组的包装信号，以及其它表达控制序列，如本文中描述的那些。例如，对于AAV病毒载体而言，包装信号是5’反向末端重复(ITR)和3’ITR。当包装到AAV衣壳中时，与该表达盒结合的ITRs在本文中被称为“重组AAV(rAAV)基因组”或“载体基因组”。
由此，在一方面，提供了腺相关病毒载体，其包含AAV衣壳和至少一种表达盒，其中所述至少一种表达盒包含编码GAA的核酸序列和引导GAA序列在宿主细胞中表达的表达控制序列。该AAV载体还包含AAV ITR序列。在一个实施方案中，该ITRs来自于与提供衣壳不同的AAV血清型。在一个优选实施方案中，该ITR序列来自AAV2，或其缺失版本(ΔITR)，其可能因方便起见而使用并加速调节许可(regulatory approval)。但是，可以选择来自其它AAV来源的ITR。当ITR的来源是来自AAV2且AAV衣壳来自另一AAV源时，所得载体可以被称为是假型的。通常，AAV载体基因组包含AAV 5’ITR(GAA编码序列和任何调节序列)以及AAV 3’ITR。但是，这些元件的其它构造可能是合适的。已经描述了其中缺失D-序列和末端解析位点(trs)的5’ITR的缩短版本(称为ΔITR)。在一些实施方案中，使用全长AAV 5’和3’ITRs。
在一方面，提供了一种构建体，其是可用于生成病毒载体的DNA分子(例如质粒)。含有所需载体元件的说明性质粒包含如SEQ ID NO：4或5所示的多核苷酸序列。该SEQ IDNO：4所示的多核苷酸序列包含以下元件：巨细胞病毒启动子(CMV)、IGFⅡ的第1和8-67位氨基酸编码序列、GAA的第70-952位氨基酸编码序列。该SEQ ID NO：5所示的多核苷酸序列包含以下元件：巨细胞病毒启动子(CMV)、IGFⅡ的第1和8-67位氨基酸且其中第12位氨基酸E突变为R、第30位氨基酸R突变成A的编码序列、GAA的第70-952位氨基酸编码序列。
使用本文中所述的其它合成GAA编码序列和本文中所述的其它表达控制元件可以生成其它表达盒。
该表达盒通常含有启动子序列作为表达控制序列的一部分，例如位于所选5’ITR序列与该GAA编码序列之间。可以使用不同强度的组成型启动子，包括但不限于单纯疱疹病毒(HSV)启动子、胸苷激酶(TK)启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子、猿猴病毒40(SV40)启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、β肌动蛋白启动子。本文中描述的说明性质粒和载体使用巨细胞病毒(CMV)启动子。
诱导型启动子也可用于本发明。合适的诱导型启动子包括来自基因(例如细胞色素P450基因、热休克蛋白基因、金属硫蛋白基因)以及来自激素诱导型基因的启动子，例如雌激素基因启动子。诱导型启动子的另一个实例是响应于四环素的tetVP16启动子。
本发明使用的启动子还包括但不限于：神经元特异性启动子，例如突触蛋白Ⅰ(SYN)启动子；肌肉肌酸激酶(MCK)启动子；CBA启动子和结蛋白(DES)启动子。
除了启动子之外，表达盒和/或载体可以含有一种或多种其它合适的转录起始、终止、增强子序列、有效RNA加工信号如剪接和聚腺苷酸化(polyA)信号；稳定细胞质mRNA的序列，例如WPRE；增强翻译效率的序列(即Kozak共有序列)；增强蛋白稳定性的序列；以及在需要时，增强编码产物分泌的序列。合适的polyA序列的实例包括例如SV40、SV50、牛生长激素(bGH)、人生长激素和合成polyA。合适的增强子的一个实例是CMV增强子。在一个实施方案中，该表达盒包含一种或多种表达增强子。在一个实施方案中，该表达盒含有两种或更多种表达增强子。这些增强子可以是相同的，或可以彼此不同。例如，增强子可以包括CMV即时早期增强子。这种增强子可以存在于彼此相邻定位的两个拷贝中。或者，该增强子的双拷贝可以通过一个或多个序列分隔。在又一实施方案中，该表达盒进一步含有内含子，例如鸡β肌动蛋白内含子。其它合适的内含子包括本领域中已知的那些，例如描述在WO 2011/126808中。任选地，可以选择一种或多种序列以稳定mRNA。此类序列的一个实例是修饰的WPRE序列，其可以在该polyA序列的上游和该编码序列的下游工程化，参见例如MAZanta-Boussif等人,Gene Therapy(2009)16:605-619。
这些控制序列“可操作地连接”到GAA基因序列上。本文中所用的术语“可操作地连接”是指与相关基因邻接的表达控制序列和以反式或在一定距离上起作用以控制相关基因的表达控制序列两者。
腺相关病毒(AAV)病毒载体是用于递送至靶细胞的可将外源核酸序列包装至AAV蛋白衣壳之中的AAV DNase抗性粒子。AAV衣壳由60个衣壳蛋白亚基VP1、VP2和VP3组成，其根据所选AAV以大约1:1:10至1:1:20的比以二十面体对称排列。该AAV衣壳可以选自本领域已知的那些AAV衣壳，包括其变体。在一个实施方案中，该AAV衣壳选自可有效转导神经元细胞的那些AAV衣壳。在一个实施方案中，该AAV衣壳选自AAV1、AAV2、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh.10、AAV5、AAVhu.11、AAV8DJ、AAVhu.32、AAVhu.37、AAVpi.2、AAVrh.8、AAVhu.48R3及其变体，参见Royo等人,Brain Res,2008年1月,1190:15-22；Petrosyan等人,GeneTherapy,2014年12月,21(12):991-1000；Holehonnur等人,BMC Neuroscience,2014,15:28；以及Cearley等人,Mol Ther.2008年10月,16(10):1710–1718，其各自经此引用并入本文。本文中可用的其它AAV衣壳包括AAVrh.39、AAVrh.20、AAVrh.25、AAV10、AAVbb.1和AAVbb.2及其变体。作为AAV病毒载体(DNase抗性病毒粒子)的衣壳的来源，可以选择其它AAV血清型，例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV8、AAV9、rh10、AAVrh64R1、AAVrh64R2、rh8、rh.10、任何已知或提及的AAV的变体或尚待发现的AAV，参见例如US20070036760A1；US20090197338A1；EP 1310571A2。还参见WO 2003/042397A2(AAV7和其它猿猴AAV)、US7790449B2和US7282199B2(AAV8)、WO2005/033321A2和US 7,906,111B2(AAV9)、以及WO 2006/110689A2和WO 2003/042397A2(rh.10)。或者，基于任何所述AAV的重组AAV可以用作AAV衣壳的来源。这些文献还描述了可以选择用于生成AAV的其它AAV，并经此引用并入。在一些实施方案中，用于该病毒载体的AAV衣壳可以通过前述AAV衣壳之一或其编码核酸的诱变(即通过插入、缺失或取代)来产生。在一些实施方案中，该AAV衣壳是嵌合的，包含来自两种或三种或四种或更多种前述AAV衣壳蛋白的结构域。在一些实施方案中，该AAV衣壳是来自两种或三种不同的AAV或重组AAV的Vpl、Vp2和Vp3单体的嵌合体。如本文中所用，关于AAV，术语变体是指衍生自已知AAV序列的任何AAV序列，包括在氨基酸或核酸序列上共享至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或更大的序列同一性。在另一实施方案中，该AAV衣壳包括与任何所述或已知AAV衣壳序列包含至最多大约10％变异的变体。也就是说，该AAV衣壳与本文中提供的和/或本领域已知的AAV衣壳共享大约90％～99.9％的同一性、大约95％～99％的同一性、或大约97％～98％的同一性。在一个实施方案中，该AAV衣壳与AAV衣壳共享至少95％的同一性。当确定AAV衣壳的百分比同一性时，可以对任何可变蛋白(例如vp1、vp2或vp3)进行该比较。在一个实施方案中，该AAV衣壳与AAV8 vp3共享至少95％的同一性。在另一实施方案中，使用自身互补型AAV(scAAV)。在另一个实施方案中，使用单链AAV(ssAAV)。
在一个实施方案中，该衣壳是AAV9衣壳或其变体。
在一个实施方案中，提供了单链AAV(ssAAV)。
在一个实施方案中，提供了自身互补型AAV。上下文中的缩写“sc”是指自身互补型。“自身互补型AAV”是指其中重组AAV核酸序列所携带的编码区被设计为形成分子内双链DNA模板的构建体。在感染时而不是等待第二链的细胞介导合成，该scAAV的两个互补半部将缔合以形成准备即时复制和转录的一个双链DNA(dsDNA)单元，参见例如D M McCarty等人,“Self-complementary recombinant adeno-associated virus(scAAV)vectorspromote efficient transduction independently of DNAsynthesis”,GeneTherapy(2001年8月),第8卷,第16期,第1248-1254页。自身互补型AAV描述在例如US6,596,535B1；US7,125,717B2和US7,456,683B2中，其各自经此引用全文并入本文。
生成和分离适于递送至受试者的AAV病毒载体的方法在本领域中是已知的。参见例如US2007/0036760A1(2007年2月15日)；US7790449B2；US7282199B2；WO 2003/042397A2；WO 2005/033321A2；WO 2006/110689A2和US7588772B2。在一种系统中，用编码侧接ITR的转基因的构建体和编码rep与cap的构建体瞬时转染生产细胞系。在第二系统中，用编码侧接ITR的转基因的构建体瞬时转染稳定提供rep和cap的包装细胞系。在各自这些系统中，AAV病毒体响应于感染辅助腺病毒或疱疹病毒而产生，其中需要从污染病毒中分离rAAV。近来，开发了不需要用辅助病毒感染以回收AAV的系统，由该系统以反式还提供了所需辅助功能(即腺病毒E1、E2a、VA和E4或疱疹病毒UL5、UL8、UL52和UL29以及疱疹病毒聚合酶)。在这些较新的系统中，辅助功能可以通过用编码所需辅助功能的构建体瞬时转染该细胞来提供，或者该细胞可以被工程化以稳定含有编码该辅助功能的基因，其表达可以以转录水平或转录后水平来控制。在又一种系统中，通过用基于杆状病毒的载体感染将侧接ITR的转基因和rep/cap基因引入到昆虫细胞中。对于这些生产系统的概述，通常参见例如Zhang等人,2009,“Adenovirus-adeno-associated virus hybrid for large-scale recombinantadeno-associated virus production”,Human Gene Therapy 20:922-929，其各自的内容经此引用全文并入本文。制造和使用这些和其它AAV生产系统的方法还描述在下列美国专利中，其各自的内容经此引用全文并入本文，这些美国专利的专利号为：5,139,941；5,741,683；6,057,152；6,204,059；6,268,213；6,491,907；6,660,514；6,951,753；7,094,604；7,172,893；7,201,898；7,229,823和7,439,065。
任选地，本文中所述的GAA基因也可用于产生其它的病毒载体。此类其它病毒载体可以包括适于可采用的基因疗法的任何病毒，包括但不限于腺病毒；疱疹病毒；慢病毒；逆转录病毒等等。合适地，当产生这些其它载体中的一种时，其作为复制缺陷型病毒载体产生。
“复制缺陷型病毒”或“病毒载体”是指合成或人工病毒粒子，其中含有相关基因的表达盒包装在病毒衣壳或包膜中，其中也包装在该病毒衣壳或包膜中的任何病毒基因组序列是复制缺陷的；即它们不能产生子代病毒体，但是保留了感染靶细胞的能力。在一个实施方案中，该病毒载体的基因组不包括编码复制所需的酶的基因(该基因组可以被工程化为“无内容”——仅含有侧接扩增和包装人工基因组所需信号的相关转基因)，但是这些基因可以在生产过程中提供。因此，其被认为对用于基因疗法是安全的，因为除了在复制所需病毒酶的存在下，复制和被子代病毒体感染不会发生。此类复制缺陷型病毒可以是腺相关病毒(AAV)、腺病毒、慢病毒(整合或非整合)或另一合适的病毒源。
本文中还提供的是药物组合物。本文中描述的药物组合物设计为通过任何合适的途径或不同途径的组合递送至需要其的受试者。在一个实施方案中，该组合物经由静脉注射来递送。在一个实施方案中，直接递送至CNS并可经由鞘内注射来进行。在一个实施方案中，该组合物经由脑室内病毒注射来递送。在另一实施方案中，该组合物经由胸腔注射来递送。在另一个实施方案中，可以进行靶组织的原位注射。或者，可以选择其它施用途径(例如口服、吸入、鼻内、气管内、动脉内、眼内、肌内、腹内和其它肠胃外途径)。
本文中描述的GAA递送构建体可以以单一组合物或多种组合物递送。任选地，可以递送两种或多种不同的AAV[参见例如WO 2011/126808A2和WO 2013/049493A1]。在另一实施方案中，此类多种病毒可以含有不同的复制缺陷型病毒(例如AAV、腺病毒和/或慢病毒)。或者，可以通过非病毒构建体，例如“裸DNA”、“裸质粒DNA”、RNA和mRNA来介导递送；与各种递送组合物和纳米粒子结合，包括例如胶束、脂质体、阳离子脂质-核酸组合物、聚多糖(poly-glycan)组合物和其它聚合物、基于脂质和/或胆固醇-核酸缀合物，以及如本文中所述的其它构建体，参见例如X.Su等人,Mol.Pharmaceutics,2011,8(3),第774-787页；网络出版:2011年3月21日；WO2013/182683A1、WO 2010/053572A2和WO 2012/170930A1，其均经此引用并入本文，此类非病毒GAA递送构建体可以通过前述途径施用。
该病毒载体，或非病毒DNA或RNA转移部分，可以用生理可接受载体配制以用于基因转移和基因疗法应用。可以选择多种合适的纯化方法。描述适于从载体粒子中分离空衣壳的纯化方法的实例，例如2016年12月9日提交的国际专利申请号PCT/US16/65976及其优先权文件，2016年4月13日提交的美国专利临时申请号62/322,098和2015年12月11日提交的且题为“Scalable Purification Method for AAV8”的美国专利临时申请号62/266,341中描述的方法，其经此引用并入本文。还参见以下文献中描述的纯化方法：2016年12月9日提交的国际专利申请号PCT/US16/65974，及其优先权文件，2016年4月13日提交的美国专利临时申请号62/322,083，和2015年12月11日提交的62/266,351(AAV1)；2016年12月9日提交的国际专利申请号PCT/US16/66013，及其优先权文件，2016年4月13日提交的美国临时申请号62/322,055和2015年12月11日提交的62/266,347(AAVrh10)；和2016年12月9日提交的国际专利申请号PCT/US16/65970，及其优先权申请美国临时申请号62/266,357和62/266,357(AAV9)，其经此引用并入本文。简而言之，描述了两步骤纯化方案，其从rAAV生产细胞培养物的澄清浓缩上清液中选择性捕获并分离含有基因组的rAAV载体粒子。该方法利用了在高盐浓度下进行的亲和捕获方法，随后是在高pH下进行的阴离子交换树脂方法，以提供基本不含rAAV中间体的rAAV载体粒子。
在AAV病毒载体的情况下，病毒基因组(vg)的定量可以用作制剂中所含剂量的量度。以本文公开的方法施用的rAAV的剂量将根据例如特定的rAAV、施用方式、治疗目标、个体和靶向的细胞类型而变化，并且可以通过本领域标准方法确定。剂量可以以病毒基因组(vg)为单位表示(即，分别为1×107vg、1×108vg、1×109vg、1×1010vg、1×1011vg、1×1012vg、1×1013vg、1×l014vg、1×1015vg、1×1016vg)。剂量也可以以每千克(kg)体重的病毒基因组(vg)为单位表示(即，分别为1×1010vg/kg、1×1011vg/kg、1×1012vg/kg、1×1013vg/kg、1×1014vg/kg、1×1015vg/kg、1×1016vg/kg)。滴定AAV的方法描述于Clark等人《人类基因治疗(Hum.GeneTher)》1999年；10:1031-1039。
这些上述剂量可以在各种体积的载体、赋形剂或缓冲剂制剂中施用，所述体积在大约25微升至大约15毫升的范围内，包括该范围内的所有数字，取决于待处理的区域的尺寸、所用病毒滴度、施用途径和该方法的预期效果。在一个实施方案中，载体、赋形剂或缓冲剂的体积为至少大约25μL。在一个实施方案中，该体积为大约50μL。在另一实施方案中，该体积为大约100μL。在另一实施方案中，该体积为大约200μL。在另一实施方案中，该体积为大约300μL。在另一实施方案中，该体积为大约400μL。在另一实施方案中，该体积为大约500μL。在又一实施方案中，该体积为大约600μL。在另一实施方案中，该体积为大约700μL。在又一实施方案中，该体积为大约800μL。在又一实施方案中，该体积为大约900μL。在又一实施方案中，该体积为大约1mL。在又一实施方案中，该体积为大约2mL。在另一实施方案中，该体积为大约3mL。在另一实施方案中，该体积为大约4mL。在另一实施方案中，该体积为大约5mL。在另一实施方案中，该体积为大约6mL。在另一实施方案中，该体积为大约7mL。在另一实施方案中，该体积为大约8mL。在另一实施方案中，该体积为大约9mL。在另一实施方案中，该体积为大约10mL。在另一个实施方案中，该体积为大约15ml。
上述重组载体可以根据公开的方法递送至宿主细胞。该rAAV，优选悬浮在生理相容性载体中，可以施用于人或非人哺乳动物患者。在另一实施方案中，该组合物包括载体、稀释剂、赋形剂和/或佐剂。合适的载体可以由本领域技术人员鉴于转移病毒针对的适应症容易地选择。例如，合适的载体包括盐水，其可以用多种缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲盐水)配制。其它示例性载体包括无菌盐水、乳糖、蔗糖、磷酸钙、明胶、葡聚糖、琼脂、果胶、花生油、芝麻油和水。该缓冲剂/载体应包括防止rAAV附着到输注管但不会干扰rAAV体内结合活性的组分。
任选地，本发明的组合物除了rAAV与载体之外可以含有其它常规药物成分，如防腐剂或化学稳定剂。合适的示例性防腐剂包括氯丁醇、山梨酸钾、山梨酸、二氧化硫、没食子酸丙酯、对羟基苯甲酸酯类、乙基香草醛、甘油、苯酚和对氯苯酚。合适的化学稳定剂包括明胶和白蛋白。
本发明的组合物可以包含如上定义的药学上可接受的载体。合适地，本文中描述的组合物包含悬浮在药学上合适的载体中和/或与合适的赋形剂混合的有效量的一种或多种AAV，其设计为经由注射、渗透泵、鞘内导管递送至受试者，或通过另一装置或途径递送。
本文中描述的病毒载体可用于制备药物以便将GAA递送至需要其的受试者(例如人患者)、向受试者提供功能性GAA和/或治疗庞贝氏症。治疗过程可以任选包括重复施用相同的病毒载体(例如AAV9载体)或不同的病毒载体(例如AAV9和AAV10)。仍可以使用本文中描述的病毒载体和非病毒递送系统选择其它组合。
本文中描述的GAAcDNA序列可以使用本领域中熟知的技术体内合成产生。例如，可以采用长DNA序列方法的基于PCR的精确合成(PAS)，如Xiong等人,PCR-basedaccuratesynthesis of long DNAsequences,Nature Protocols 1,791-797(2006)所述。由Young和Dong描述了结合双不对称PCR和重叠延伸PCR法的方法，Two-step totalgene synthesismethod,Nucleic Acids Res.2004；32(7):e59。还参见Gordeeva等人,J MicrobiolMethods.Improved PCR-based gene synthesis method and itsapplication to theCitrobacter freundii phytase gene codon modification.2010年5月；81(2):147-52.Epub 2010年3月10日；还参见关于寡核苷酸合成和基因合成的以下专利，GeneSeq.2012年4月；6(1):10-21；US 8008005和US 7985565。这些文献各自经此引用并入本文。此外，经由PCR生成DNA的试剂盒与方案是市售可得的。这些包括使用聚合酶，包括但不限于Taq聚合酶；
Figure BDA0002724433410000171
(New England Biolabs)；
Figure BDA0002724433410000172
High-Fidelity DNA聚合酶(NewEngland Biolabs)；和
Figure BDA0002724433410000173
G2聚合酶(Promega)。还可以由用含有本文中所述的GAA序列的质粒转染的细胞生成DNA。试剂盒和方案是已知和市售可得的，并包括但不限于QIAGEN质粒试剂盒；
Figure BDA0002724433410000181
Pro Filter质粒试剂盒(Invitrogen)；和GenEluteTM质粒试剂盒(Sigma Aldrich)。在本文中可用的其它技术包括序列特异性等温扩增方法，其消除了对热循环的需要。这些方法通常使用链置换DNA聚合酶如Bst DNA聚合酶、大片段(LargeFragment)(New England Biolabs)而非加热来分离双链体DNA。DNA还可以经由使用逆转录酶(RT)通过扩增由RNA分子生成，所述逆转录酶是RNA依赖性DNA聚合酶。RT聚合与原始RNA模板互补的DNA链，并被称为cDNA。这种cDNA随后可以通过PCR或如上所述的等温法进一步扩增。定制DNA也可以经商业途径由公司生成，所述公司包括但不限于GenScript；
Figure BDA0002724433410000182
(Life Technologies)和Integrated DNATechnologies。
术语“表达”在本文中以其最广泛的含义使用，并包括生产DNA或RNA和蛋白。就RNA而言，术语“表达”或“翻译”特别涉及生产肽或蛋白。表达可以是瞬时的，或可以是稳定的。
在本发明上下文中的术语“翻译”涉及在核糖体处的过程，其中mRNA链控制氨基酸序列的组装以生成蛋白或肽。
根据本发明，如本文中所述“治疗有效量”是指在剂量上和必要的时间段内有效实现所期望的治疗结果例如提高受试者中功能性GAA的水平，以便导致功能性GAA产生至足以改善庞贝氏病一种或多种症状的水平的量。给定物质的有效量将随着诸如物质的本性、给药的途径、受试者年龄、以及给予所述的物质的目的之类的因素而改变。在各种个体情况下的有效量可以由技术人员根据本领域建立的方法凭经验确定。
通过本文描述的方法或组合物治疗的受试者是患有庞贝氏症或者具有发展成为庞贝氏症可能的个体，所述个体可能具有残余的内源GAA活性，或者没有可测量的活性。
在另一实施方案中，该构建体在晚些时候重新施用。任选地，允许超过一次的重新施用。此类重新施用可以具有相同类型的载体、不同的病毒载体、或经由本文中所述的非病毒递送。例如，如果用编码GAA的rAAV9治疗患者，并需要二次治疗的话，可以随后施用rAAV10，并且反之亦然。
Pompe患者的治疗可能需要联合疗法，如在用本发明的组合物治疗之前、期间和/或之后用免疫抑制剂瞬时共治疗。用于此类共疗法的免疫抑制剂包括但不限于类固醇、抗代谢物、T细胞抑制剂和烷化剂。例如，此类瞬时治疗可以包括以递减剂量每日一次服用类固醇(例如泼尼松(prednisole))7天，开始为大约60毫克的量，且每天减少10毫克(第7天无剂量)。可以选择其它剂量和免疫抑制剂。
“功能性GAA”是指编码天然GAA蛋白的基因，或提供GAA蛋白天然存活的至少大约50％、至少大约75％、至少大约80％、至少大约90％或大致相同、或超过100％的生物活性水平的另一GAA蛋白，或其与疾病无关的天然变体或多形体。
要注意的是，术语“一种”或“一个”是指一种(个)或多种(个)。由此，术语“一种”(或“一个”)、“一种或多种”和“至少一种”在本文中可互换使用。
词语“包含(comprise、comprises和comprising)”应解释为包含性的而非排他性的。词语“组成(consist、consisting)”及其变体应解释为排他性的而非包含性的。虽然说明书中的各种实施方案出现使用“包含”的语言，但是在其它情况下，相关实施方案也意在使用“由……组成”或“基本由……组成”的语言来解释和描述。
本文中所用的术语“大约”是指与给定的参考值相差10％(±10％)，除非另行规定。
本文中所用的“疾病”、“障碍”和“病症”可互换使用，以指示受试者体内的异常状态。
除非在本说明书中另行定义，本文中使用的技术和科学术语具有与本领域普通技术人员，并且通过参照公开文本通常理解的相同的含义，其向本领域技术人员提供了对许多本申请中使用的术语的一般指导。
II.具体实施方式
在一方面，本发明提供了一种人成熟的胰岛素样生长因子Ⅱ(IGFⅡ)突变体，其中，所述突变体与人成熟的全长胰岛素样生长因子Ⅱ(SEQ ID NO：1)具有至少70％的同源性，所述突变体以不依赖甘露糖-6-磷酸的方式与人的非阳离子依赖型甘露糖-6-磷酸受体结合，并且，相对于天然存在的人胰岛素生长因子Ⅱ，所述胰岛素样生长因子Ⅱ突变体可以更有效地把治疗性溶酶体酶运输到溶酶体。
优选地，所述人成熟的胰岛素样生长因子Ⅱ突变体，其氨基酸序列包含：
(1)人成熟的全长胰岛素样生长因子Ⅱ的第1位和8-67位的氨基酸序列组成的序列，其具体氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；或，
(2)人成熟的全长胰岛素样生长因子Ⅱ的第1位和8-67位的氨基酸序列组成的序列，其中第12位谷氨酸突变为精氨酸，第30位精氨酸突变为丙氨酸，其具体氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
在另一方面，本发明提供了一种融合蛋白，其包含前述的人成熟胰岛素样生长因子Ⅱ突变体和需要运输到溶酶体的目的蛋白。所述目的蛋白优选为酸性α-葡糖苷酶(GAA)，所述酸性α-葡糖苷酶选自野生型全长酸性α-葡糖苷酶或由野生型全长酸性α-葡糖苷酶第70-952位氨基酸形成的多肽。
在一方面，本发明提供了编码前述人成熟的胰岛素样生长因子Ⅱ突变体或融合蛋白的核酸。
在另一方面，本发明提供了一种重组核酸分子，其包含可操作连接的启动子和前述编码融合蛋白的核酸序列。
其中所述启动子是巨细胞病毒(CMV)启动子、结蛋白(DES)启动子、突触蛋白Ⅰ(SYN)启动子或肌肉肌酸激酶(MCK)启动子。优选地，所述启动子是巨细胞病毒(CMV)启动子。
其中所述重组核酸分子进一步包含多聚腺苷酸、Kozak序列、WPRE和转录后调节元件中的一种或多种。
优选地，所述重组核酸分子包含：
1)SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5所示多核苷酸序列；或，
2)SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5所示多核苷酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个核苷酸而得到的核苷酸序列；或，
3)与SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5所示的多核苷酸序列具有80％以上序列同一性的多核苷酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的序列；更优选地，具有98％或99％以上同一性的序列；
其中所述重组核酸分子还包含AAV反向末端重复序列；优选地，所述AAV反向末端重复序列选自不同血清型的AAV；优选地，所述AAV反向末端重复序列选自进化支A-F中的任意血清型的AAV或AAV1型、AAV2型、AAV3型、AAV4型、AAV5型、AAV6型、AAV7型、AAV8型、AAV9型或其杂交/嵌合型中的任意一个；更优选地，所述AAV反向末端重复序列来自AAV2型。
在一方面，本发明提供了一种重组载体，其包含前述的重组核酸分子，其中，所述载体选自质粒载体，噬菌体载体和病毒载体组；其中病毒载体选自腺相关病毒载体、腺病毒载体、慢病毒载体和杂合病毒载体组。
在一方面，本发明提供了一种重组腺相关病毒，其中，所述重组腺相关病毒包含AAV衣壳和载体基因组，所述载体基因组包含前述的重组核酸分子，优选地，所述重组腺相关病毒的衣壳优选AAV9，更优选地，所述重组腺相关病毒为单链腺相关病毒。
在一方面，本发明提供了一种分离的宿主细胞，其包含前述的人成熟胰岛素样生长因子Ⅱ突变体、融合蛋白、重组核酸分子、重组载体或重组腺相关病毒。
在一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含前述的人成熟胰岛素样生长因子Ⅱ突变体、融合蛋白、重组核酸分子、重组载体、重组腺相关病毒和/或前述的宿主细胞以及药学上可接受的载体和/或其它常规药用成分(如防腐剂和/或稳定剂)。所述药物组合物可配制为用于静脉注射、鞘内注射、脑室内注射、胸腔注射、口服、吸入、鼻内、气管内、动脉内、眼内、肌内、腹内和/或其它肠胃外途径进行给药。
在一方面，本发明提供了前述的人成熟胰岛素样生长因子Ⅱ突变体、融合蛋白、重组核酸分子、重组载体、重组腺相关病毒、宿主细胞和/或前述的药物组合物在制备用于预防或治疗庞贝氏症的药物中的用途。
根据前一方面的用途，其中前述的人成熟的胰岛素样生长因子Ⅱ突变体、融合蛋白、重组核酸分子、重组载体、重组腺相关病毒、宿主细胞和/或药物组合物可以与另一疗法联合施用。
在一方面，本发明提供了一种在受试者中治疗庞贝氏症的方法，所述方法包括向需要其的受试者施用前述的人成熟的胰岛素样生长因子Ⅱ突变体、融合蛋白、重组核酸分子、重组载体、重组腺相关病毒、宿主细胞和/或前述的药物组合物；优选地，所述受试者是哺乳动物；更优选地，所述受试者是人。
下面的实施例仅仅是说明性的，而非意在限制本发明。
实施例1载体构建
1.1 pSNAV2.0-CMV-GAA质粒构建
EcoRI酶切pSNAV2.0-CMV-EGFP载体(图1A所示)，回收大片段，即骨架载体。合成GAA编码序列(Genebank NM_000152.5)和无缝引物(F：CCAGCCTCCCCGGGCGGCCGCGCCACCATGGGAGTGAGGCACCCGCCCT，R：GCAGATCTGTCGACGAATTCCTAACACCAGCTGACGAGAAAC，由北京诺赛基因组研究中心有限公司合成)，通过无缝克隆PCR方法将GAA编码序列插入到骨架载体CMV启动子与BGH多聚腺苷酸之间，构建成pSNAV2.0-CMV-GAA质粒载体(图1B所示)，其主体结构见图2A。
1.2 pSNAV2.0-CMV-IGFⅡ-GAA质粒构建
EcoRI酶切pSNAV2.0-CMV-EGFP载体(图1A所示)，回收大片段，即骨架载体。合成IGFⅡ-GAA编码序列(包含IGFⅡ第1位及8-67位氨基酸序列(SEQ ID NO：2)所对应的编码序列及GAA第70-952位氨基酸序列所对应的编码序列)来源于文献John A.Maga,JianghongZhou等，Glycosylation-independent Lysosomal Targeting of Acid-GlucosidaseEnhances Muscle Glycogen Clearance in Pompe Mice.JBC.2013,288(3):1428-1438)和无缝引物(F：AGCCTCCCCGGGCGGCCGCATATACACCAATGGGAATCCCAAT，R：GGCAGATCTGTCGACGAATTCCTAACACCAGCTGACGAGA，由北京诺赛基因组研究中心有限公司合成)，通过无缝克隆PCR方法将IGFⅡ-GAA编码序列插入到骨架载体CMV启动子与BGH多聚腺苷酸之间，构建成pSNAV2.0-CMV–IGFⅡ-GAA(图1C所示)质粒载体，其主体结构见图2B，其中CMV-IGFⅡ-GAA包含SEQ ID NO：4所示序列。
1.3 pSNAV2.0-CMV–vIGFⅡ-GAA质粒构建
EcoRI酶切pSNAV2.0-CMV-EGFP载体(图1A所示)，回收大片段，即骨架载体。合成vIGFⅡ-GAA编码序列(包含IGFⅡ第1位及8-67位氨基酸序列所对应的编码序列且其中12位的谷氨酸变成精氨酸，30位的精氨酸变成丙氨酸(SEQ ID NO：3)；及GAA第70-952位氨基酸序列对应的编码序列)和无缝引物(F：AGCCTCCCCGGGCGGCCGCATATACACCAATGGGAATCCCAAT，R：GGCAGATCTGTCGACGAATTCCTAACACCAGCTGACGAGA，由北京诺赛基因组研究中心有限公司合成)，通过无缝克隆PCR方法将vIGFⅡ-GAA片段插入到骨架载体CMV启动子与BGH多聚腺苷酸之间，构建成pSNAV2.0-CMV–vIGFⅡ-GAA(图1C所示)质粒载体，其主体结构见图2B，其中CMV-vIGFⅡ-GAA包含如SEQ ID NO：5所示序列。
我们对vIGFⅡ蛋白进行表达纯化，通过表面等离子共振技术测定vIGFⅡ蛋白对CI-MPR/IGFⅡ受体、IGFⅠ受体、胰岛素受体的亲和力，结果显示vIGFⅡ与CI-MPR/IGFⅡ受体的亲和力与未突变的IGFⅡ相比具有显著提高，vIGFⅡ与IGFⅠ受体及胰岛素受体未检测到明显的亲和力(数据未显示)。
1.4 pSNAV2.0-DES-GAA质粒构建
用XhoI和NotI双酶切pSNAV2.0-CMV-GAA载体(图1B所示)，回收大片段，即骨架载体。合成DES启动子序列片段(Genebank NG_046330.1)和无缝引物(F：AGGAGCTTGCCATTGCATACGCACCCATGCCTCCTCAGGTA，R：TGCCTCACGCCCATGGTGGCCGATGGTGACGGCGCGGGCGA，由北京诺赛基因组研究中心有限公司合成)，通过无缝克隆PCR方法将DES启动子序列片段插入到骨架载体缺口处，构建成pSNAV2.0-DES–GAA(图1D)质粒载体，其主体结构见图2A。
1.5 pSNAV2.0-DES-GAA-wpre质粒构建
EcoRI酶切pSNAV2.0-DES–GAA载体(图1D所示)，回收大片段，即骨架载体，合成wpre片段及无缝引物(F：AGTTTCTGGTGAGCTGGTGTTGAGAATTCCCGGTTAGTAATGA，R：TCGAGGCAGATCTGTCGACGAATTCAAGCTTCCAGGCGGGGAGGCG，由北京诺赛基因组研究中心有限公司合成)，通过无缝克隆PCR方法将wpre片段插入到骨架载体中GAA与BGH多聚腺苷酸之间，构建成pSNAV2.0-DES-GAA-wpre质粒载体(图1E所示)，其主体结构见图2C。
实施例2病毒的包装及基因组滴度检测
本发明采用HEK293细胞作为生产细胞系，常规三质粒包装系统生产AAV病毒载体。所使用实验方法均为本领域常规方法。(参见Xiao Xiao,Juan Li,and Richard JudeSamulski.Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectorsin the absence of helper adenovirus.J.Virol.1998,72(3):2224)
取适量纯化AAV样品，按下表(表1)配制DNase I消化反应混合液，37℃孵育30min,75℃孵育10min，失活DNase I。
表1
AAV sample 5ul
10×DnaseI buffer 5ul
DnaseI 1ul
Rnase-free water 39ul
Total 50ul
处理后的AAV纯化样品稀释适当的倍数后，参照下表(表2)配置Q-PCR反应体系，并按照下列程序进行检测
表2
Figure BDA0002724433410000231
引物探针序列列表如下(表3)：
表3
GAA-F CGAGCCTTCCAACTTCATCAG
GAA-R GGCACGTAGGGTGGGTTCT
GAA-probe CTGAGGACGGCTGCCCCAACA
包装产量结果见下表(表4)：
表4
质粒名称 病毒载体名称 基因组滴度(vg/ml)
pSNAV2.0-CMV-GAA ssAAV2/9-CMV-GAA 6.67X10<sup>12</sup>
pSNAV2.0-CMV-IGFⅡ-GAA ssAAV2/9-CMV-IGFⅡ-GAA 1.13X10<sup>13</sup>
pSNAV2.0-CMV-vIGFⅡ-GAA ssAAV2/9-CMV-vIGFⅡ-GAA 1.31X10<sup>13</sup>
pSNAV2.0-DES-GAA ssAAV2/9-DES-GAA 1.41X10<sup>13</sup>
pSNAV2.0-DES-GAA-wpre ssAAV2/9-DES-GAA-wpre 1.58X10<sup>13</sup>
实施例3候选药物及给药方式的选择
3.1启动子及给药方式的选择
选择正常C57小鼠为受体，设置四个给药组，所给药物名称分别为ssAAV2/9-CMV-GAA(胸腔给药)、ssAAV2/9-CMV-GAA(尾静脉给药)、ssAAV2/9-DES-GAA(尾静脉给药)、ssAAV2/9-DES-GAA-wpre(尾静脉给药)，给药剂量均为1E+13vg/只，并设置PBS给药对照组，每组共12只实验动物，雌雄各半。分别于给药后7d、28d随机挑选每个给药组半数动物处死，眼眶采血，并收集动物心脏组织和骨骼肌。
收集的组织经匀浆处理，BCA法测定蛋白浓度后进行GAA酶活检测，酶活检测采用底物催化法(4-甲基伞形酮(4-MU)Sigma M1381，4-甲基伞形酮-α-D-半乳糖苷(4MU-α-Gala)ACROS337162500)，蛋白与4-甲基伞形酮-β-D半乳糖苷共孵育，产生4-甲基伞形酮，测定荧光。根据标准曲线，计算样品酶解底物的产物4-甲基伞形酮的量，从而计算出底物被酶解的量，最终计算得出GAA酶活性。
检测结果如图3所示，在给药后7d时(图3A)，心脏组织及骨骼肌GAA酶活检测结果显示，相同给药组ssAAV2/9-CMV-GAA，不同给药方式结果不同，在相同的组织中，例如心脏或肌肉中，胸腔注射组GAA酶活水平急速上升，并高于静脉注射组的GAA酶活。但在给药后28d时(图3B)，胸腔注射组中心脏及骨骼肌中GAA酶活出现大幅度下降，静脉给药组各组织中GAA酶活水平维持稳定，考虑到药物半衰期及持续稳定表达情况，静脉注射方式更好。静脉给药时，不同启动子携带GAA表达，无论7d检测结果，还是28d检测结果，心脏组织及骨骼肌GAA酶活检测均显示各启动子均能产生相应的效果，但相较而言，CMV比DES更高效，更为优选。
3.2候选药物GAA酶活性检测
选取分化的C2C12细胞，用重组病毒ssAAV2/9-CMV-vIGFⅡ-GAA、ssAAV2/9-CMV-IGFⅡ-GAA、ssAAV2/9-CMV-GAA以MOI 2E+5进行感染。感染72h后，分别收获细胞培养上清及细胞沉淀，细胞沉淀反复冻融。用BCA试剂盒(Thermo,23225)检测蛋白浓度后，分别采用底物荧光法(4-甲基伞形酮(4-MU)Sigma M1381，4-甲基伞形酮-α-D-半乳糖苷(4MU-α-Gala)ACROS337162500)测定细胞内外GAA酶活性以及Western blot检测细胞内外蛋白表达。
GAA酶活检测结果如图4A所示，胞内GAA酶活性检测结果，与胞外GAA酶活性检测结果一致，显示为ssAAV2/9-CMV-vIGFⅡ-GAA＞ssAAV2/9-CMV-IGFⅡ-GAA＞ssAAV2/9-CMV-GAA。
Western Blot检测结果如图4B所示，WB检测检测显示，胞内GAA表达量与胞外GAA的表达量一致，胞内外GAA表达量高低依次为ssAAV2/9-CMV-vIGFⅡ-GAA＞ssAAV2/9-CMV-IGFⅡ-GAA＞ssAAV2/9-CMV-GAA。
综合上述结果可知，不管是胞内或胞外GAA酶活性，还是胞内或胞外GAA的表达，具有IGFⅡ靶向肽的GAA比不具有IGFⅡ靶向肽的GAA，都具有更高的GAA酶活性和蛋白表达量，并且在注射ssAAV2/9-CMV-vIGFⅡ-GAA药物的组别中比注射ssAAV2/9-CMV-IGFⅡ-GAA药物的组别中检测出来的GAA酶活性和蛋白表达量更高。
实施例4体外药效评价
分离GAA缺陷模型鼠(Raben N等，J Biol Chem(1998).273(30):19086-19092)骨骼肌，经肌肉剪碎与消化，分离与过滤制备模型鼠原代成肌细胞，然后进行分化培养：具体步骤如下：将模型鼠原代成肌细胞接种到DMEM+10％Matrigel包被6孔板，密度7E+5个/孔，2ml/孔，贴壁培养24小时，细胞汇合度为70-90％，加入分化培养基DMEM培养基+2％HS(灭活)+1％PS进行分化72h，细胞形态变得细长，呈平行排列分化为肌管细胞，用于病毒感染实验。重组病毒ssAAV2/9-CMV-vIGFⅡ-GAA、ssAAV2/9-CMV-IGFⅡ-GAA、ssAAV2/9-CMV-GAA以MOI 5E+5进行感染，同时设置野生型鼠原代成肌细胞(WT)对照组及模型鼠原代成肌细胞(NC)空白对照组，病毒感染48h后，分别收获细胞培养上清及细胞沉淀，细胞沉淀反复冻融。上述细胞沉淀反复冻融后，16000g离心取上清，离心收获液经BCA试剂盒(Thermo,23225)检测蛋白浓度后，稀释，备用。随后，利用底物荧光法(4-甲基伞形酮(4-MU)Sigma M1381，4-甲基伞形酮-α-D-半乳糖苷(4MU-α-Gala)ACROS 337162500)测定细胞内外GAA活性，利用Biovision糖原检测试剂盒(Biosivion,K646-100)检测糖原水平。
GAA酶活性检测结果如图5所示，胞内及胞外GAA酶活检测结果与应用C2C12细胞检测GAA酶活性结果基本一致，在相同MOI下，各组别中GAA酶活性检测结果由强到弱为ssAAV2/9-CMV-vIGFⅡ-GAA＞ssAAV2/9-CMV-IGFⅡ-GAA＞ssAAV2/9-CMV-GAA。由此可见，重组病毒ssAAV2/9-CMV-vIGFⅡ-GAA和ssAAV2/9-CMV-IGFⅡ-GAA具有明显优势。
糖原检测结果如图6所示，相对于模型动物原代成肌细胞(NC)对照组，ssAAV2/9-CMV-GAA给药组中糖原堆积水平有所下降，但仍高于野生型鼠原代成肌细胞(WT)中糖原的堆积水平；ssAAV2/9-CMV-vIGFⅡ-GAA与ssAAV2/9-CMV-IGFⅡ-GAA给药组中糖原堆积水平明显下降，并且远低于野生型鼠原代成肌细胞(WT)中糖原的堆积水平。
综上所述，采用更接近或模拟体内真实情况的模型鼠的原代成肌细胞，不管是检测GAA酶活性，还是检测糖原的堆积水平，给药组ssAAV2/9-CMV-vIGFⅡ-GAA和ssAAV2/9-CMV-IGFⅡ-GAA相对于ssAAV2/9-CMV-GAA而言，不仅可检测到更高的GAA酶活性，而且可检测到明显降低的糖原水平，而且给药组ssAAV2/9-CMV-vIGFⅡ-GAA比ssAAV2/9-CMV-IGFⅡ-GAA产生的效果更明显。
实施例5体内药效实验
GAA缺失模型鼠(Raben N等，J Biol Chem(1998).273(30):19086-19092)为受体，在模型鼠2个月时给药，设置三个给药组(ssAAV2/9-CMV-vIGFⅡ-GAA、ssAAV2/9-CMV-IGFⅡ-GAA、ssAAV2/9-CMV-GAA)、PBS模型鼠对照组及野生型鼠WT对照组，静脉注射，给药量为1E+11vg/只，分别于给药后7d处死，并收集实验动物心脏组织和膈肌。
将组织剪碎后放入研磨珠，加入pH4.2的0.2M乙酸盐缓冲液，置于预冷的组织破碎仪上匀浆，匀浆完全的组织悬液4℃离心取上清，BCA测定蛋白浓度，稀释，备用。取20ul组织蛋白稀释液，向其中加入2.2mM的4-甲基伞形酮-α-D-半乳糖苷，37℃避光孵育1h后，终止反应，365nm激发光测定GAA酶活检测结果。同时利用Biovision糖原检测试剂盒(Biosivion,K646-100)检测糖原水平。
GAA酶活性检测结果如图7所示，在心脏和膈肌组织中，相对于PBS对照组而言，给药组的GAA酶活明显高于PBS对照组；在心脏中，ssAAV2/9-CMV-GAA给药组GAA酶活性约为野生型的60％，ssAAV2/9-CMV-IGFⅡ-GAA给药组GAA酶活性约为野生型对照组GAA酶活性的80％，并且ssAAV2/9-CMV-vIGFⅡ-GAA给药组GAA酶活已超出或接近野生型对照组GAA酶活性(图7A)；在隔膜组织中，ssAAV2/9-CMV-GAA给药组GAA酶活约为野生型对照组GAA酶活性的30％，ssAAV2/9-CMV-IGFⅡ-GAA给药组GAA酶活约为野生型对照组GAA酶活性的60％，ssAAV2/9-CMV-vIGFⅡ-GAA给药组GAA酶活接近野生型对照组GAA酶活性(图7B)。综上，不管是在心脏还是膈肌组织种，GAA酶活由高到低依次为ssAAV2/9-CMV-vIGFⅡ-GAA＞ssAAV2/9-CMV-IGFⅡ-GAA＞ssAAV2/9-CMV-GAA。说明ssAAV2/9-CMV-vIGFⅡ-GAA和ssAAV2/9-CMV-IGFⅡ-GAA可以更明显提高GAA酶活。
糖原水平检测结果如图8所示，在心脏和膈肌中，相对于PBS对照组而言，给药组(ssAAV2/9-CMV-GAA、ssAAV2/9-CMV-vIGFⅡ-GAA和ssAAV2/9-CMV-IGFⅡ-GAA)中糖原堆积水平均有所降低，其中ssAAV2/9-CMV-GAA给药组中糖原水平虽有所下降，但仍高于野生型对照组，ssAAV2/9-CMV-vIGFⅡ-GAA和ssAAV2/9-CMV-IGFⅡ-GAA给药组中糖原水平已经降到野生型对照组糖原水平之下，并且ssAAV2/9-CMV-vIGFⅡ-GAA给药组中糖原水平比ssAAV2/9-CMV-IGFⅡ-GAA给药组中糖原水平降低得更明显。
序列表
<110> 舒泰神（北京）生物制药股份有限公司
<120> 一种溶酶体靶向肽及其融合蛋白、携带融合蛋白编码序列的腺相关病毒载体及其应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 67
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
Ala Tyr Arg Pro Ser Glu Thr Leu Cys Gly Gly Glu Leu Val Asp Thr
1 5 10 15
Leu Gln Phe Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Ser Arg Pro Ala
20 25 30
Ser Arg Val Ser Arg Arg Ser Arg Gly Ile Val Glu Glu Cys Cys Phe
35 40 45
Arg Ser Cys Asp Leu Ala Leu Leu Glu Thr Tyr Cys Ala Thr Pro Ala
50 55 60
Lys Ser Glu
65
<210> 2
<211> 61
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Ala Leu Cys Gly Gly Glu Leu Val Asp Thr Leu Gln Phe Val Cys Gly
1 5 10 15
Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Ser Arg Pro Ala Ser Arg Val Ser Arg Arg
20 25 30
Ser Arg Gly Ile Val Glu Glu Cys Cys Phe Arg Ser Cys Asp Leu Ala
35 40 45
Leu Leu Glu Thr Tyr Cys Ala Thr Pro Ala Lys Ser Glu
50 55 60
<210> 3
<211> 61
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Ala Leu Cys Gly Gly Arg Leu Val Asp Thr Leu Gln Phe Val Cys Gly
1 5 10 15
Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Ser Ala Pro Ala Ser Arg Val Ser Arg Arg
20 25 30
Ser Arg Gly Ile Val Glu Glu Cys Cys Phe Arg Ser Cys Asp Leu Ala
35 40 45
Leu Leu Glu Thr Tyr Cys Ala Thr Pro Ala Lys Ser Glu
50 55 60
<210> 4
<211> 3687
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gagcttgcca ttgcatacgt tgtatccata tcataatatg tacatttata ttggctcatg 60
tccaacatta ccgccatgtt gacattgatt attgactagt tattaatagt aatcaattac 120
ggggtcatta gttcatagcc catatatgga gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg 180
cccgcctggc tgaccgccca acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc 240
catagtaacg ccaataggga ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac 300
tgcccacttg gcagtacatc aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa 360
tgacggtaaa tggcccgcct ggcattatgc ccagtacatg accttatggg actttcctac 420
ttggcagtac atctacgtat tagtcatcgc tattaccatg gtgatgcggt tttggcagta 480
catcaatggg cgtggatagc ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc accccattga 540
cgtcaatggg agtttgtttt ggcaccaaaa tcaacgggac tttccaaaat gtcgtaacaa 600
ctccgcccca ttgacgcaaa tgggcggtag gcgtgtacgg tgggaggtct atataagcag 660
agctcgttta gtgaaccgtc agatcgcctg gagacgccat ccacgctgtt ttgacctcca 720
tagaagacac cgggaccgat ccagcctccc cgggcggccg catatacacc aatgggaatc 780
ccaatgggga agtcgatgct ggtgcttctc accttcttgg ccttcgcctc gtgctgcatt 840
gctgctctgt gcggcgggga gctggtggac accctccagt tcgtctgtgg ggaccgcggc 900
ttctacttca gcaggcccgc aagccgtgtg agccgtcgca gccgtggcat cgttgaggag 960
tgctgtttcc gcagctgtga cctggccctc ctggagacgt actgtgctac ccccgccaag 1020
tccgagggcg cgccggcaca ccccggccgt cccagagcag tgcccacaca gtgcgacgtc 1080
ccccccaaca gccgcttcga ttgcgcccct gacaaggcca tcacccagga acagtgcgag 1140
gcccgcggct gttgctacat ccctgcaaag caggggctgc agggagccca gatggggcag 1200
ccctggtgct tcttcccacc cagctacccc agctacaagc tggagaacct gagctcctct 1260
gaaatgggct acacggccac cctgacccgt accaccccca ccttcttccc caaggacatc 1320
ctgaccctgc ggctggacgt gatgatggag actgagaacc gcctccactt cacgatcaaa 1380
gatccagcta acaggcgcta cgaggtgccc ttggagaccc cgcatgtcca cagccgggca 1440
ccgtccccac tctacagcgt ggagttctcc gaggagccct tcggggtgat cgtgcgccgg 1500
cagctggacg gccgcgtgct gctgaacacg acggtggcgc ccctgttctt tgcggaccag 1560
ttccttcagc tgtccacctc gctgccctcg cagtatatca caggcctcgc cgagcacctc 1620
agtcccctga tgctcagcac cagctggacc aggatcaccc tgtggaaccg ggaccttgcg 1680
cccacgcccg gtgcgaacct ctacgggtct caccctttct acctggcgct ggaggacggc 1740
gggtcggcac acggggtgtt cctgctaaac agcaatgcca tggatgtggt cctgcagccg 1800
agccctgccc ttagctggag gtcgacaggt gggatcctgg atgtctacat cttcctgggc 1860
ccagagccca agagcgtggt gcagcagtac ctggacgttg tgggataccc gttcatgccg 1920
ccatactggg gcctgggctt ccacctgtgc cgctggggct actcctccac cgctatcacc 1980
cgccaggtgg tggagaacat gaccagggcc cacttccccc tggacgtcca gtggaacgac 2040
ctggactaca tggactcccg gagggacttc acgttcaaca aggatggctt ccgggacttc 2100
ccggccatgg tgcaggagct gcaccagggc ggccggcgct acatgatgat cgtggatcct 2160
gccatcagca gctcgggccc tgccgggagc tacaggccct acgacgaggg tctgcggagg 2220
ggggttttca tcaccaacga gaccggccag ccgctgattg ggaaggtatg gcccgggtcc 2280
actgccttcc ccgacttcac caaccccaca gccctggcct ggtgggagga catggtggct 2340
gagttccatg accaggtgcc cttcgacggc atgtggattg acatgaacga gccttccaac 2400
ttcatcaggg gctctgagga cggctgcccc aacaatgagc tggagaaccc accctacgtg 2460
cctggggtgg ttggggggac cctccaggcg gccaccatct gtgcctccag ccaccagttt 2520
ctctccacac actacaacct gcacaacctc tacggcctga ccgaagccat cgcctcccac 2580
agggcgctgg tgaaggctcg ggggacacgc ccatttgtga tctcccgctc gacctttgct 2640
ggccacggcc gatacgccgg ccactggacg ggggacgtgt ggagctcctg ggagcagctc 2700
gcctcctccg tgccagaaat cctgcagttt aacctgctgg gggtgcctct ggtcggggcc 2760
gacgtctgcg gcttcctggg caacacctca gaggagctgt gtgtgcgctg gacccagctg 2820
ggggccttct accccttcat gcggaaccac aacagcctgc tcagtctgcc ccaggagccg 2880
tacagcttca gcgagccggc ccagcaggcc atgaggaagg ccctcaccct gcgctacgca 2940
ctcctccccc acctctacac actgttccac caggcccacg tcgcggggga gaccgtggcc 3000
cggcccctct tcctggagtt ccccaaggac tctagcacct ggactgtgga ccaccagctc 3060
ctgtgggggg aggccctgct catcacccca gtgctccagg ccgggaaggc cgaagtgact 3120
ggctacttcc ccttgggcac atggtacgac ctgcagacgg tgccagtaga ggcccttggc 3180
agcctcccac ccccacctgc agctccccgt gagccagcca tccacagcga ggggcagtgg 3240
gtgacgctgc cggcccccct ggacaccatc aacgtccacc tccgggctgg gtacatcatc 3300
cccctgcagg gccctggcct cacaaccaca gagtcccgcc agcagcccat ggccctggct 3360
gtggccctga ccaagggtgg ggaggcccga ggggagctgt tctgggacga tggagagagc 3420
ctggaagtgc tggagcgagg ggcctacaca caggtcatct tcctggccag gaataacacg 3480
atcgtgaatg agctggtacg tgtgaccagt gagggagctg gcctgcagct gcagaaggtg 3540
actgtcctgg gcgtggccac ggcgccccag caggtcctct ccaacggtgt ccctgtctcc 3600
aacttcacct acagccccga caccaaggtc ctggacatct gtgtctcgct gttgatggga 3660
gagcagtttc tcgtcagctg gtgttag 3687
<210> 5
<211> 3687
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gagcttgcca ttgcatacgt tgtatccata tcataatatg tacatttata ttggctcatg 60
tccaacatta ccgccatgtt gacattgatt attgactagt tattaatagt aatcaattac 120
ggggtcatta gttcatagcc catatatgga gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg 180
cccgcctggc tgaccgccca acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc 240
catagtaacg ccaataggga ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac 300
tgcccacttg gcagtacatc aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa 360
tgacggtaaa tggcccgcct ggcattatgc ccagtacatg accttatggg actttcctac 420
ttggcagtac atctacgtat tagtcatcgc tattaccatg gtgatgcggt tttggcagta 480
catcaatggg cgtggatagc ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc accccattga 540
cgtcaatggg agtttgtttt ggcaccaaaa tcaacgggac tttccaaaat gtcgtaacaa 600
ctccgcccca ttgacgcaaa tgggcggtag gcgtgtacgg tgggaggtct atataagcag 660
agctcgttta gtgaaccgtc agatcgcctg gagacgccat ccacgctgtt ttgacctcca 720
tagaagacac cgggaccgat ccagcctccc cgggcggccg catatacacc aatgggaatc 780
ccaatgggga agtcgatgct ggtgcttctc accttcttgg ccttcgcctc gtgctgcatt 840
gctgctctgt gcggcgggag gctggtggac accctccagt tcgtctgtgg ggaccgcggc 900
ttctacttca gcgcgcccgc aagccgtgtg agccgtcgca gccgtggcat cgttgaggag 960
tgctgtttcc gcagctgtga cctggccctc ctggagacgt actgtgctac ccccgccaag 1020
tccgagggcg cgccggcaca ccccggccgt cccagagcag tgcccacaca gtgcgacgtc 1080
ccccccaaca gccgcttcga ttgcgcccct gacaaggcca tcacccagga acagtgcgag 1140
gcccgcggct gttgctacat ccctgcaaag caggggctgc agggagccca gatggggcag 1200
ccctggtgct tcttcccacc cagctacccc agctacaagc tggagaacct gagctcctct 1260
gaaatgggct acacggccac cctgacccgt accaccccca ccttcttccc caaggacatc 1320
ctgaccctgc ggctggacgt gatgatggag actgagaacc gcctccactt cacgatcaaa 1380
gatccagcta acaggcgcta cgaggtgccc ttggagaccc cgcatgtcca cagccgggca 1440
ccgtccccac tctacagcgt ggagttctcc gaggagccct tcggggtgat cgtgcgccgg 1500
cagctggacg gccgcgtgct gctgaacacg acggtggcgc ccctgttctt tgcggaccag 1560
ttccttcagc tgtccacctc gctgccctcg cagtatatca caggcctcgc cgagcacctc 1620
agtcccctga tgctcagcac cagctggacc aggatcaccc tgtggaaccg ggaccttgcg 1680
cccacgcccg gtgcgaacct ctacgggtct caccctttct acctggcgct ggaggacggc 1740
gggtcggcac acggggtgtt cctgctaaac agcaatgcca tggatgtggt cctgcagccg 1800
agccctgccc ttagctggag gtcgacaggt gggatcctgg atgtctacat cttcctgggc 1860
ccagagccca agagcgtggt gcagcagtac ctggacgttg tgggataccc gttcatgccg 1920
ccatactggg gcctgggctt ccacctgtgc cgctggggct actcctccac cgctatcacc 1980
cgccaggtgg tggagaacat gaccagggcc cacttccccc tggacgtcca gtggaacgac 2040
ctggactaca tggactcccg gagggacttc acgttcaaca aggatggctt ccgggacttc 2100
ccggccatgg tgcaggagct gcaccagggc ggccggcgct acatgatgat cgtggatcct 2160
gccatcagca gctcgggccc tgccgggagc tacaggccct acgacgaggg tctgcggagg 2220
ggggttttca tcaccaacga gaccggccag ccgctgattg ggaaggtatg gcccgggtcc 2280
actgccttcc ccgacttcac caaccccaca gccctggcct ggtgggagga catggtggct 2340
gagttccatg accaggtgcc cttcgacggc atgtggattg acatgaacga gccttccaac 2400
ttcatcaggg gctctgagga cggctgcccc aacaatgagc tggagaaccc accctacgtg 2460
cctggggtgg ttggggggac cctccaggcg gccaccatct gtgcctccag ccaccagttt 2520
ctctccacac actacaacct gcacaacctc tacggcctga ccgaagccat cgcctcccac 2580
agggcgctgg tgaaggctcg ggggacacgc ccatttgtga tctcccgctc gacctttgct 2640
ggccacggcc gatacgccgg ccactggacg ggggacgtgt ggagctcctg ggagcagctc 2700
gcctcctccg tgccagaaat cctgcagttt aacctgctgg gggtgcctct ggtcggggcc 2760
gacgtctgcg gcttcctggg caacacctca gaggagctgt gtgtgcgctg gacccagctg 2820
ggggccttct accccttcat gcggaaccac aacagcctgc tcagtctgcc ccaggagccg 2880
tacagcttca gcgagccggc ccagcaggcc atgaggaagg ccctcaccct gcgctacgca 2940
ctcctccccc acctctacac actgttccac caggcccacg tcgcggggga gaccgtggcc 3000
cggcccctct tcctggagtt ccccaaggac tctagcacct ggactgtgga ccaccagctc 3060
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ggctacttcc ccttgggcac atggtacgac ctgcagacgg tgccagtaga ggcccttggc 3180
agcctcccac ccccacctgc agctccccgt gagccagcca tccacagcga ggggcagtgg 3240
gtgacgctgc cggcccccct ggacaccatc aacgtccacc tccgggctgg gtacatcatc 3300
cccctgcagg gccctggcct cacaaccaca gagtcccgcc agcagcccat ggccctggct 3360
gtggccctga ccaagggtgg ggaggcccga ggggagctgt tctgggacga tggagagagc 3420
ctggaagtgc tggagcgagg ggcctacaca caggtcatct tcctggccag gaataacacg 3480
atcgtgaatg agctggtacg tgtgaccagt gagggagctg gcctgcagct gcagaaggtg 3540
actgtcctgg gcgtggccac ggcgccccag caggtcctct ccaacggtgt ccctgtctcc 3600
aacttcacct acagccccga caccaaggtc ctggacatct gtgtctcgct gttgatggga 3660
gagcagtttc tcgtcagctg gtgttag 3687

Claims (21)

1.一种人成熟的胰岛素样生长因子Ⅱ(IGFⅡ)突变体，其中，所述突变体与人成熟的全长胰岛素样生长因子Ⅱ(SEQ ID NO：1)具有至少70％的同源性，所述突变体以不依赖甘露糖-6-磷酸的方式与人的非阳离子依赖型甘露糖-6-磷酸受体结合，并且，相对于天然存在的人胰岛素样生长因子Ⅱ，所述胰岛素样生长因子Ⅱ突变体可以更有效地把治疗性溶酶体酶运输到溶酶体。
2.权利要求1所述的人成熟的胰岛素样生长因子Ⅱ突变体，其氨基酸序列包含：
(1)人成熟的全长胰岛素样生长因子Ⅱ的第1位和8-67位的氨基酸所组成的序列；或，
(2)人成熟的全长胰岛素样生长因子Ⅱ的第1位和8-67位的氨基酸所组成的序列，其中第12位谷氨酸突变为精氨酸，第30位精氨酸突变为丙氨酸。
3.权利要求1或2所述的人成熟的胰岛素样生长因子Ⅱ突变体，其氨基酸序列如SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：3所示。
4.一种融合蛋白，其包含权利要求1-3任一项所述的人成熟的胰岛素样生长因子Ⅱ突变体和需要运输到溶酶体的目的蛋白。
5.权利要求4所述的融合蛋白，其中所述目的蛋白为酸性α-葡糖苷酶。
6.权利要求5所述的融合蛋白，其中所述酸性α-葡糖苷酶选自野生型全长酸性α-葡糖苷酶或由野生型全长酸性α-葡糖苷酶第70-952位氨基酸形成的多肽。
7.一种重组核酸分子，其包含编码权利要求1-3任一项所述的人成熟的胰岛素样生长因子Ⅱ突变体或权利要求4-7任一项所述的融合蛋白。
8.一种重组核酸分子，其包含可操作连接的启动子和权利要求7所述的核酸序列。
9.权利要求8所述的重组核酸分子，其中所述启动子是巨细胞病毒(CMV)启动子、结蛋白(DES)启动子、突触蛋白Ⅰ(SYN)启动子或肌肉肌酸激酶(MCK)启动子；优选地，所述启动子是巨细胞病毒(CMV)启动子。
10.权利要求8或9所述的重组核酸分子，进一步其包含多聚腺苷酸、Kozak序列、WPRE和转录后调节元件中的一种或多种。
11.权利要求7-10任一项所述的重组核酸分子，所述重组核酸分子包含：
(1)SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5所示多核苷酸序列；或，
(2)SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5所示多核苷酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个核苷酸而得到的核苷酸序列；或，
(3)与SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5所示多核苷酸序列具有80％以上序列同一性的多核苷酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的多核苷酸序列；更优选地，具有98％或99％以上同一性的多核苷酸序列。
12.权利要求7-11任一项所述的重组核酸分子，其中，所述重组核酸分子还包含AAV反向末端重复序列；优选地，所述AAV反向末端重复序列选自不同血清型的AAV；优选地，所述AAV反向末端重复序列选自进化支A-F中的任意血清型的AAV或AAV1型、AAV2型、AAV3型、AAV4型、AAV5型、AAV6型、AAV7型、AAV8型、AAV9型或其杂交/嵌合型中的任意一个；更优选地，所述AAV反向末端重复序列来自AAV2型。
13.一种重组载体，其包含权利要求7-12任一所述的重组核酸分子；其中，所述载体选自质粒载体，噬菌体载体和病毒载体组；其中，病毒载体选自腺相关病毒载体、腺病毒载体、慢病毒载体和杂合病毒载体组。
14.一种重组腺相关病毒，其中，所述重组腺相关病毒包含AAV衣壳和载体基因组，所述载体基因组包含权利要求7-12任一所述的重组核酸分子；优选地，所述重组腺相关病毒的衣壳优选AAV9；更优选地，所述重组腺相关病毒为单链腺相关病毒。
15.一种分离的宿主细胞，其包含权利要求1-3任一项所述的人成熟的胰岛素样生长因子Ⅱ突变体、权利要求4-6任一项所述的融合蛋白、权利要求7-12任一项所述的重组核酸分子、权利要求13所述的重组载体或权利要求14所述的重组腺相关病毒。
16.一种药物组合物，其包含权利要求1-3任一项所述的人成熟的胰岛素样生长因子Ⅱ突变体、权利要求4-6任一项所述的融合蛋白、权利要求7-12任一所述的重组核酸分子、权利要求13所述的重组载体、权利要求14所述的重组腺相关病毒和/或权利要求15所述的宿主细胞以及药学上可接受的载体和/或其它常规药用成分。
17.权利要求16所述药物组合物，其中所述其它常规药用成分包括防腐剂和/或稳定剂。
18.权利要求16或17所述的药物组合物，其可配制为用于静脉注射、鞘内注射、脑室内注射、胸腔注射、口服、吸入、鼻内、气管内、动脉内、眼内、肌内、腹内和/或其它肠胃外途径给药。
19.权利要求1-3任一项所述的人成熟的胰岛素样生长因子Ⅱ突变体、权利要求4-6任一项所述的融合蛋白、权利要求7-12任一所述的重组核酸分子、权利要求13所述的重组载体、权利要求14所述的重组腺相关病毒、权利要求15所述的宿主细胞和/或权利要求16-18任一项所述的药物组合物在制备用于预防或治疗庞贝氏症的药物中的用途。
20.权利要求19所述的用途，其中所述人成熟的胰岛素样生长因子Ⅱ突变体、融合蛋白、重组核酸分子、重组载体、重组腺相关病毒、宿主细胞和/或药物组合物可以与另一疗法联合施用。
21.在受试者中治疗庞贝氏症的方法，所述方法包括向需要其的受试者施用权利要求1-3任一项所述的人成熟的胰岛素样生长因子Ⅱ突变体、权利要求4-6任一项所述的融合蛋白、7-12任一所述的重组核酸分子、权利要求13所述的重组载体、权利要求14所述的重组腺相关病毒、权利要求15所述的宿主细胞和/或权利要求16-18任一项所述的药物组合物；优选地，所述受试者是哺乳动物；更优选地，所述受试者是人。
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