KR20210076051A - 간-특이적 유전자 대체 요법에 의한 중증 pku 치료를 위한 개선된 인간 pah의 생성 - Google Patents

간-특이적 유전자 대체 요법에 의한 중증 pku 치료를 위한 개선된 인간 pah의 생성 Download PDF

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KR20210076051A
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시르카 쿄스티오-무어
파르타 마나발란
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젠자임 코포레이션
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Abstract

야생형 인간 페닐알라닌 하이드록실라제(PAH)보다 더 안정적이고 더 큰 활성을 갖는 변이 PAH 폴리펩티드가 본원에 제공된다. 또한, 페닐케톤뇨증(PKU)의 치료 및/또는 페닐알라닌 수치의 감소를 필요로 하는 개체에서 이를 치료하고/하거나 감소시키는 방법이 제공된다. 또한, 변이 PAH 폴리펩티드의 발현을 필요로 하는 개체에서 이를 발현시키기 위한 발현 카세트, 벡터(예컨대, rAAV 벡터), 바이러스 입자, 제약 조성물, 및 키트가 본원에 제공된다.

Description

간-특이적 유전자 대체 요법에 의한 중증 PKU 치료를 위한 개선된 인간 PAH의 생성
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 전문이 본원에 참조로 포함되는 2018년 10월 12일에 출원된 미국 가출원 62/744,944호의 우선권 이익을 주장한다.
ASCII 텍스트 파일 서열 목록의 제출
ASCII 텍스트 파일로 제출된 컴퓨터 판독 가능한 형태(CRF)의 서열목록(파일명:159792016640SEQLIST.TXT, 기록일: 2019년 10월 16일, 크기: 33 KB)의 내용은 전체가 본원에 참조로 포함된다
기술분야
본 발명은 변이 페닐알라닌 하이드록실라제 폴리펩티드에 관한 것이다. 일부 양태에서, 본 발명은 유전자 요법을 이용한 페닐케톤뇨증 치료용 조성물 및 방법에 관한 것이다.
페닐케톤뇨증(PKU)은 페닐알라닌(Phe)의 티로신(Tyr)으로의 하이드록실화에 촉매 작용을 하는 간 효소 페닐알라닌 하이드록실라제(PAH)의 유전자 결핍이다. 이 질병은 아미노산 대사의 가장 일반적인 선천적 이상으로서, 북미에서 전체 발병률은 1:10~15,000이며, 대부분의 선진국에서 신생아 선별 프로그램에 의해 검출된다. 중증 형태의 PKU는 치료하지 않을 경우, 신경 독성이며 중증 정신 지체와 관련된 매우 높은 혈중 Phe 수치로 이어진다(Kochhar 2012, Ho 2014, Blau 2015). 영향을 받는 단백질인 PAH는 N-말단 조절 도메인(1 내지 117), 중앙 촉매 도메인(118 내지 410), 및 C-말단 사량체화 도메인(411 내지 452)으로 이루어진 다중 도메인 단백질이다(Flydal 2013). 현재까지, 560개가 넘는 질병 유발 돌연변이가 각각의 도메인에 매핑되었으며, 촉매 영역이 가장 영향을 많이 받는 부위이다(Erlandsen 2003). 동종다량체 효소는 효소의 다양한 입체구조적 상태 및 다량체화 상태를 변경하여 PAH 효소 활성을 미세 조정하는 N-말단 도메인에 결합하는 기질 Phe에 의해 인산화 및 알로스테릭 활성화와 함께 복잡한 조절을 받는다(Knappskog 1996, Jaffe 2013, Arturo 2016).
PKU에 대한 현재의 치료법은 저단백식 및 액상 의약품을 사용하는 Phe의 평생 식이 제한이다(Kochhar 2012, Ho 2014, Blau 2015). 효과는 있지만, 의료용 식품의 맛이 좋지 않고 음식 선택에 대한 엄격한 제한으로 인해 식이요법을 준수하기 어렵고, 규정 미준수는 어린 시절에 꾸준히 증가하여, 10대 후반에는 거의 80%의 환자가 권장 혈중 Phe 수치보다 높다(Waisbren 2007, Thomas 2017). 또한, Phe 제한 식이요법을 잘 준수함에도 불구하고, 많은 환자가 다양한 신경인지 및 신경정신과적 기능의 결핍을 경험할 뿐만 아니라 주의력 결핍 과잉행동 장애(ADHD)의 발생률이 높다는 증거가 나타나고 있다. 이러한 이유는 불분명하지만, 가능한 설명에는 뇌의 아미노산 불균형, 특정 비타민 및 미량 원소의 영양 결핍, 뿐만 아니라 간 PAH 활성에 의해 정상적으로 안정적으로 유지되는 혈중 Phe 수치의 변동이 포함된다(Cleary 2013, Gonzales 2016, Vogel 2017). 흥미롭게도, 경미한 형태의 PKU가 있는 환자를 합성 형태의 보조인자 테트라하이드로비옵테린(BH4)(사프롭테린 디하이드로클로라이드)으로 치료하는 것이 혈중 Phe 수치를 낮추는 데 효과적인 것으로 나타났을 뿐만 아니라, ADHD 증상의 감소와 같이 신경학적 결과를 개선시키는 것으로 입증되었다(Burton 2015). 이 치료법은 약리학적 샤페론(pharmacological chaperone)으로 작용하여 잔류 PAH 효소 활성을 증가시키므로, 정상적인 Phe 조절 PAH 활성을 제공하여 유전자 결함을 부분적으로 교정할 수 있다(Blau 2015). 최근 승인된 다른 치료법은 Phe를 트랜스-신남산으로 물질대사시키는 PEG화된 형태의 박테리아 페닐알라닌 암모니아 리아제(PAL)를 사용하는 효소 대체 요법으로 구성된다. 이 치료법은 혈중 Phe 수치를 현저히 감소시키지만, 신경학적 평가변수에는 덜 효과적인 것으로 보인다(Longo 2014). PAH의 교정 없이 주로 혈중 Phe 수치를 낮추는 것에 기초한 이 치료법 또는 임의의 다른 치료법이 전신 Phe 수치의 조절인자로서 기능하는지, 및 Tyr의 생성원이 식이요법을 준수하는 PKU 환자에서도 관찰되는 인지 및 신경정신과적 문제를 해결할 수 있는지는 여전히 불분명하다.
특허 출원 및 공보를 포함하여 본원에 인용된 모든 참고문헌은 그 전문이 참조로 포함된다.
본 발명은 적어도 부분적으로, 개선된 hPAH 변이체, 특히 내인성 hPAH에 비해 단백질 안정성과 효소 활성을 향상시키는 4개의 아미노산 변경을 포함하는 변이체-1(V1)에 대한 본 발명자들의 발견에 기초한다. 이 hPAH-V1 변이체를 인코딩하는 cDNA를 임상적으로 관련된 용량의 rAAV를 사용하여 간에 전달함으로써 인간 PKU 모델인 PAHenu2 마우스에서 다양한 질병 평가변수가 개선되었고, 이러한 전달은 변형되지 않은 hPAH보다 더 효과적이었다. 따라서, 이 새로운 변이체를 인코딩하는 rAAV 벡터는 감소된 벡터 용량으로도 효능을 얻을 수 있도록 함으로써 PKU 유전자 요법을 위한 경로를 제공할 수 있다.
일부 양태에서, 본 발명은 야생형 인간 PAH 폴리펩티드의 M180, K199, S250, 및 G256으로부터 선택되는 부위에 2개의 아미노산 치환을 포함하는 변이 페닐알라닌 하이드록실라제(PAH) 폴리펩티드를 제공한다. 일부 양태에서, 본 발명은 야생형 인간 PAH 폴리펩티드의 M180, K199, S250, 및 G256으로부터 선택되는 부위에 3개의 아미노산 치환을 포함하는 변이 페닐알라닌 하이드록실라제(PAH) 폴리펩티드를 제공한다. 일부 양태에서, 본 발명은 야생형 인간 PAH 폴리펩티드의 M180, K199, S250, 및 G256 부위에 4개의 아미노산 치환을 포함하는 변이 페닐알라닌 하이드록실라제(PAH) 폴리펩티드를 제공한다. 일부 구현예에서, 아미노산 치환은 M180T, K199P, S250P, 및 G256A 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 아미노산 치환은 K199P, S250P, 및 G256A; M180T, S250P, 및 G256A; M180T, K199P, 및 G256A; 또는 M180T, K199P, 및 S250P를 포함한다. 일부 구현예에서, 아미노산 치환은 M180T, K199P, S250P, 및 G256A를 포함한다. 일부 구현예에서, 변이 PAH 폴리펩티드는 H264P, G272A, G272P, P275L, P279Q, G272P 및 P275L, 또는 T323R 및 F327T 아미노산 치환을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 야생형 인간 PAH 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이 PAH 폴리펩티드는 인간 PAH 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, 변이 PAH 폴리펩티드는 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 약 80% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이 PAH 폴리펩티드는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이 PAH 폴리펩티드는 야생형 인간 PAH 폴리펩티드의 G33A, G46A, G46P, G103A, G139A, G139P, G148A, G188A, G218A, G239A, G247A, G257A, G272A, G289A, G307A, G312A, G332A, G337A, G344A, G352A, 및 G442A로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 변이 PAH 폴리펩티드는 야생형 인간 PAH 폴리펩티드의 P9G, G10V, G12S, K184R, K192R, S196A, Y206H, H220R, Q336E, E360D, I374C, N376E, N401T, I421V, I441V, S446H, 및 453번 위치에서의 S의 추가로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 변이 PAH 폴리펩티드는 야생형 인간 PAH 폴리펩티드의 F240W, A246P, G247A, Y268W, C284F, T323R, F327Y, E319P, I306(Y,F), K113P, G188A, F191Y, T193R, Y206H, G337P, 및 N376P로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 변이 PAH 폴리펩티드는 야생형 인간 PAH 폴리펩티드의 G33A, G46A, G46P, G103A, G139A, G139P, G148A, G188A, G218A, G239A, G247A, G257A, G272A, G289A, G307A, G312A, G332A, G337A, G344A, G352A, 및 G442A로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명은 야생형 인간 PAH 폴리펩티드의 P9G, G10V, G12S, K184R, K192R, S196A, Y206H, H220R, Q336E, E360D, I374C, N376E, N401T, I421V, I441V, S446H, 및 453번 위치에서의 S의 추가로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 변이 PAH 폴리펩티드를 제공한다. 일부 양태에서, 본 발명은 야생형 인간 PAH 폴리펩티드의 F240W, A246P, G247A, Y268W, C284F, T323R, F327Y, E319P, I306(Y,F), K113P, G188A, F191Y, T193R, Y206H, G337P, 및 N376P로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 변이 PAH 폴리펩티드를 제공한다.
일부 구현예에서, 변이 PAH 폴리펩티드는 N-말단 절단을 포함한다. 일부 구현예에서, N-말단 절단은 N-말단 조절 도메인의 절단을 포함한다. 일부 구현예에서, N-말단 절단은 야생형 PAH 폴리펩티드의 아미노산 잔기 1 내지 102의 절단을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이 PAH 폴리펩티드는 C-말단 절단을 포함한다. 일부 구현예에서, C-말단 절단은 사량체화 도메인의 절단을 포함한다. 일부 구현예에서, C-말단 절단은 야생형 PAH 폴리펩티드의 아미노산 잔기 429 내지 452의 절단을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이 PAH 폴리펩티드는 야생형 PAH 폴리펩티드의 아미노산 잔기 103 내지 428에 상응하는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 변이 PAH 폴리펩티드는 잠재적인 프로테아제 절단 부위를 제거하기 위한 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 잠재적인 프로테아제 절단 부위를 제거하기 위한 하나 이상의 아미노산 치환은 야생형 PAH 폴리펩티드의 270 내지 295번 및/또는 380 내지 405번 위치에 위치한다.
일부 구현예에서, 변이 PAH 폴리펩티드는 간 표적화 폴리펩티드에 융합된다. 일부 구현예에서, 간 표적화 폴리펩티드는 HGF 또는 이의 단편이거나, 간세포 비시알로당단백질 수용체에 결합하는 당단백질이다. 일부 구현예에서, 변이 PAH 폴리펩티드는 PEG화 및/또는 니트로실화된다. 일부 구현예에서, 변이 PAH 폴리펩티드는 374번 위치의 cys 잔기가 니트로실화된 I374C 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구현예에서 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 변이 PAH 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 조성물은 제약상 허용되는 담체를 추가로 포함한다.
일부 양태에서 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩하는 단리된 핵산을 제공한다. 일부 구현예에서, 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산은 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 프로모터는 사이토메갈로바이러스(CMV) 조기 발현 프로모터, RSV LTR, MoMLV LTR, 포스포글리세레이트 키나제-1(PGK) 프로모터, 시미안 바이러스 40(SV40) 프로모터, CK6 프로모터, 트랜스티레틴 프로모터(TTR), mTTR482 프로모터, mA1MB2-mTTR482 프로모터, TK 프로모터, 테트라사이클린 반응성 프로모터(TRE), HBV 프로모터, hAAT 프로모터, LSP 프로모터, LP1 프로모터, 키메라 간-특이적 프로모터(LSP), E2F 프로모터, 텔로머라제(hTERT) 프로모터, 사이토메갈로바이러스 인핸서/닭 베타-액틴/토끼 β-글로빈 프로모터(CAG) 프로모터, 신장인자 1-알파 프로모터(EF1-알파) 프로모터, 인간 β-글루쿠로니다제 프로모터, 닭 β-액틴(CBA) 프로모터, 변형된 닭 β-액틴(CBA) 프로모터 또는 서열번호 17, 레트로바이러스성 라우스 육종 바이러스(RSV) LTR 프로모터, 디하이드로엽산 환원효소 프로모터, 및 13-액틴 프로모터로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 프로모터는 LP1 프로모터 또는 mA1MB2-mTTR482 프로모터이다. 일부 구현예에서, 핵산은 폴리아데닐화 신호를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리아데닐화 신호는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호, SV40 폴리아데닐화 신호, 또는 HSV TK 폴리아데닐화 신호이다. 일부 구현예에서, 핵산은 인트론을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 인트론은 닭 β-액틴(CBA)/토끼 β-글로빈 하이브리드 인트론이다. 일부 구현예에서, 인트론은 서열번호 15의 변형된 닭 β-액틴(CBA)/토끼 β-글로빈 하이브리드 인트론이다. 일부 구현예에서, 핵산은 하나 이상의 ITR을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산은 스터퍼 핵산을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 스터퍼 핵산은 ATG 서열을 제거하도록 최적화된다. 일부 구현예에서, 스터퍼 핵산은 서열번호 16의 A1AT 인트론 스터퍼 서열이다.
일부 양태에서, 본 발명은 인간 PAH 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산으로서, 코돈 최적화된 단리된 핵산을 제공한다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 서열번호 14의 핵산 서열과 적어도 80% 동일하다. 일부 구현예에서, 핵산은 서열번호 14의 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산은 mRNA이다. 일부 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 핵산을 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 조성물은 제약상 허용되는 담체를 추가로 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 단리된 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다. 일부 구현예에서, 벡터는 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 벡터이다. 일부 구현예에서, rAAV 벡터는 하나 이상의 AAV 역위 말단 반복(ITR) 서열에 의해 플랭킹된, 본원에 기재된 바와 같은 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산은 2개의 AAV ITR에 의해 플랭킹된다. 일부 구현예에서, AAV ITR은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV DJ, 염소 AAV, 소 AAV, 또는 마우스 AAV 혈청형 ITR이다. 일부 구현예에서, AAV ITR은 AAV2 ITR이다. 일부 구현예에서, rAAV 벡터는 5'에서 3'로 AAV2 ITR, 프로모터, 인트론, PAH 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산, 스터퍼 핵산, 폴리아데닐화 신호, 및 AAV2 ITR을 포함한다. 일부 구현예에서, 프로모터는 m1A1MB2-mTTR482 프로모터 또는 LP1 프로모터이다. 일부 구현예에서, 인트론은 닭 β-액틴(CBA)/토끼 β-글로빈 하이브리드 인트론이다. 일부 구현예에서, PAH 폴리펩티드는 본원에 기재된 바와 같은 변이 PAH 폴리펩티드이다. 일부 구혀예에서, PAH 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산은 코돈 최적화된 핵산이다. 일부 구현예에서, 스터퍼 핵산은 인간 알파 1 항트립신 유전자의 인트론으로부터의 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 인간 알파 1 항트립신 유전자의 인트론은 ATG 서열을 제거하도록 돌연변이된 것이다. 일부 구현예에서, 폴리아데닐화 신호는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호이다. 일부 구현예에서, 벡터는 자기-상보성 벡터이다. 일부 구현예에서, 벡터는 PAH 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 핵산 서열 및 PAH 폴리펩티드의 보체를 인코딩하는 제2 핵산 서열을 포함하며, 제1 핵산 서열은 길이의 대부분 또는 전부를 따라 제2 핵산 서열과 가닥내 염기쌍을 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 핵산 서열과 제2 핵산 서열은 돌연변이 AAV ITR에 의해 연결되고, 돌연변이 AAV ITR은 D 영역의 결실을 포함하고 말단 분해 서열의 돌연변이를 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 rAAV 벡터를 포함하는 rAAV 입자를 제공한다. 일부 구현예에서, AAV 바이러스 입자는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV2/2-7m8, AAV DJ, AAV2 N587A, AAV2 E548A, AAV2 N708A, AAV2 V708K, 염소 AAV, AAV1/AAV2 키메라, 소 AAV, 마우스 AAV, 또는 rAAV2/HBoV1 혈청형 캡시드를 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 바이러스 입자는 조작된 AAV 캡시드를 포함한다. 일부 구현예에서, 조작된 AAV 캡시드는 DJ 캡시드 또는 LK03 캡시드이다. 일부 구현예에서, rAAV 바이러스 입자의 ITR 및 캡시드는 동일한 AAV 혈청형으로부터 유래된다. 일부 구현예에서, rAAV 바이러스 입자의 ITR 및 캡시드는 상이한 AAV 혈청형으로부터 유래된다. 일부 구현예에서, rAAV 바이러스 입자는 AAV8 캡시드를 포함한다. 일부 구현예에서, rAAV 바이러스 입자는 AAV8 캡시드를 포함하고, 벡터는 AAV2 ITR을 포함한다.
일부 구현예에서, AAV 바이러스 입자는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV2/2-7m8, AAV DJ, AAV2 N587A, AAV2 E548A, AAV2 N708A, AAV2 V708K, 염소 AAV, AAV1/AAV2 키메라, 소 AAV, 마우스 AAV, 또는 rAAV2/HBoV1 혈청형 캡시드와 적어도 85%의 서열 동일성, 예컨대 적어도 87%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 캡시드를 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 바이러스 입자는 AAV1 혈청형 캡시드와 적어도 85%의 서열 동일성, 예컨대 적어도 87%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 캡시드를 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 바이러스 입자는 AAV2 혈청형 캡시드와 적어도 85%의 서열 동일성, 예컨대 적어도 87%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 캡시드를 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 바이러스 입자는 AAV3 혈청형 캡시드와 적어도 85%의 서열 동일성, 예컨대 적어도 87%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 캡시드를 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 바이러스 입자는 AAV4 혈청형 캡시드와 적어도 85%의 서열 동일성, 예컨대 적어도 87%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 캡시드를 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 바이러스 입자는 AAV5 혈청형 캡시드와 적어도 85%의 서열 동일성, 예컨대 적어도 87%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 캡시드를 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 바이러스 입자는 AAV6 혈청형 캡시드와 적어도 85%의 서열 동일성, 예컨대 적어도 87%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 캡시드를 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 바이러스 입자는 AAV7 혈청형 캡시드와 적어도 85%의 서열 동일성, 예컨대 적어도 87%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 캡시드를 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 바이러스 입자는 AAV8 혈청형 캡시드와 적어도 85%의 서열 동일성, 예컨대 적어도 87%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 캡시드를 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 바이러스 입자는 AAV9 혈청형 캡시드와 적어도 85%의 서열 동일성, 예컨대 적어도 87%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 캡시드를 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 바이러스 입자는 AAV11 혈청형 캡시드와 적어도 85%의 서열 동일성, 예컨대 적어도 87%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 캡시드를 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 바이러스 입자는 AAV12 혈청형 캡시드와 적어도 85%의 서열 동일성, 예컨대 적어도 87%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 캡시드를 포함한다.
일부 구현예에서, AAV 바이러스 입자는 하이브리드 캡시드를 포함한다. 일부 구현예에서, 하이브리드 캡시드는 AAV1/AAV6, AAV2/AAV6, AAV3/AAV6, AAV4/AAV6, AAV5/AAV6, AAV7/AAV6, AAV8/AAV6, AAV9/AAV6, AAV10/AAV6, AAV11/AAV6, AAV12/AAV6, AAV1/AAV8, AAV2/AAV8, AAV3/AAV8, AAV4/AAV8, AAV5/AAV8, AAV7/AAV8, AAV9/AAV8, AAV10/AAV8, AAV11/AAV8, AAV12/AAV8, 또는 AAV1/AAV6/AAV8 하이브리드 캡시드이다. 일부 구현예에서, 하이브리드 캡시드는 AAV8/AAV6 하이브리드 캡시드이다. 일부 구현예에서, 하이브리드 캡시드는 AAV1/AAV6/AAV8 하이브리드 캡시드이다.
일부 구현예에서, AAV 바이러스 입자는 하이브리드 캡시드를 포함한다. 일부 구현예에서, 하이브리드 캡시드는 AAV1/AAV6, AAV2/AAV6, AAV3/AAV6, AAV4/AAV6, AAV5/AAV6, AAV7/AAV6, AAV8/AAV6, AAV9/AAV6, AAV10/AAV6, AAV11/AAV6, AAV12/AAV6, AAV1/AAV8, AAV2/AAV8, AAV3/AAV8, AAV4/AAV8, AAV5/AAV8, AAV7/AAV8, AAV9/AAV8, AAV10/AAV8, AAV11/AAV8, AAV12/AAV8, 또는 AAV1/AAV6/AAV8 하이브리드 캡시드이다. 일부 구현예에서, 하이브리드 캡시드는 AAV8/AAV6 하이브리드 캡시드이다. 일부 구현예에서, 하이브리드 캡시드는 AAV1/AAV6/AAV8 하이브리드 캡시드이다.
일부 구현예에서, 하이브리드 캡시드는 AAV1 캡시드 서열의 일부와 적어도 95%의 서열 동일성, 예컨대 적어도 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 하이브리드 캡시드는 AAV2 캡시드 서열의 일부와 적어도 95%의 서열 동일성, 예컨대 적어도 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 하이브리드 캡시드는 AAV3 캡시드 서열의 일부와 적어도 95%의 서열 동일성, 예컨대 적어도 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 하이브리드 캡시드는 AAV4 캡시드 서열의 일부와 적어도 95%의 서열 동일성, 예컨대 적어도 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 하이브리드 캡시드는 AAV5 캡시드 서열의 일부와 적어도 95%의 서열 동일성, 예컨대 적어도 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 하이브리드 캡시드는 AAV6 캡시드 서열의 일부와 적어도 95%의 서열 동일성, 예컨대 적어도 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 하이브리드 캡시드는 AAV7 캡시드 서열의 일부와 적어도 95%의 서열 동일성, 예컨대 적어도 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 하이브리드 캡시드는 AAV8 캡시드 서열의 일부와 적어도 95%의 서열 동일성, 예컨대 적어도 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 하이브리드 캡시드는 AAV9 캡시드 서열의 일부와 적어도 95%의 서열 동일성, 예컨대 적어도 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 하이브리드 캡시드는 AAV10 캡시드 서열의 일부와 적어도 95%의 서열 동일성, 예컨대 적어도 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 하이브리드 캡시드는 AAV12 캡시드 서열의 일부와 적어도 95%의 서열 동일성, 예컨대 적어도 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 하이브리드 캡시드는 AAV8 캡시드 서열의 일부와 적어도 95%의 서열 동일성, 예컨대 적어도 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 일부는 적어도 100개의 아미노산, 예컨대 적어도 150개, 200개, 250개, 300개, 350개, 또는 400개의 아미노산을 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 rAAV 입자를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 조성물은 제약상 허용되는 담체를 추가로 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 단리된 핵산을 포함하는 세포를 제공한다. 일부 양태에서, 본 발명은 변이 PAH 폴리펩티드의 제조 방법으로서, 변이 PAH 폴리펩티드를 생성하는 조건에서 상기 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 변이 PAH 폴리펩티드를 정제하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명은 페닐케톤뇨증의 치료를 필요로 하는 개체에서 이를 치료하는 방법으로서, 본원에 기재된 바와 같은 변이 PAH 폴리펩티드 또는 본원에 기재된 바와 같은 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 본 발명은 페닐케톤뇨증의 치료를 필요로 하는 개체에서 이를 치료하는 방법으로서, 본원에 기재된 바와 같은 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 또는 본원에 기재된 바와 같은 핵산을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 본 발명은 페닐케톤뇨증의 치료를 필요로 하는 개체에서 이를 치료하는 방법으로서, 본원에 기재된 바와 같은 rAAV 벡터를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 본 발명은 페닐케톤뇨증의 치료를 필요로 하는 개체에서 이를 치료하는 방법으로서, 본원에 기재된 바와 같은 rAAV 입자를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 페닐케톤뇨증의 치료를 필요로 하는 개체에서 이를 치료하는 방법으로서, 본원에 기재된 바와 같은 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 페닐케톤뇨증의 치료를 필요로 하는 개체에서 이를 치료하는 방법으로서, 본원에 기재된 바와 같은 세포를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 개체는 PAH 활성이 부족하다.
일부 양태에서, 본 발명은 혈중 페닐알라닌 수치의 감소를 필요로 하는 개체에서 이를 감소시키는 방법으로서, 본원에 기재된 바와 같은 변이 PAH 폴리펩티드를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 본 발명은 혈중 페닐알라닌 수치의 감소를 필요로 하는 개체에서 이를 감소시키는 방법으로서, 본원에 기재된 바와 같은 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 또는 본원에 기재된 바와 같은 핵산을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 본 발명은 혈중 페닐알라닌 수치의 감소를 필요로 하는 개체에서 이를 감소시키는 방법으로서, 본원에 기재된 바와 같은 rAAV 벡터를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 본 발명은 혈중 페닐알라닌 수치의 감소를 필요로 하는 개체에서 이를 감소시키는 방법으로서, 본원에 기재된 바와 같은 rAAV 입자를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 본 발명은 혈중 페닐알라닌 수치의 감소를 필요로 하는 개체에서 이를 감소시키는 방법으로서, 본원에 기재된 바와 같은 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 치료 전 개체의 혈중 페닐알라닌 수치는 연령대가 유사한 대조군 개체의 혈중 페닐알라닌 수치에 비해 높다. 일부 양태에서, 본 발명은 혈중 페닐알라닌 수치의 감소를 필요로 하는 개체에서 이를 감소시키는 방법으로서, 본원에 기재된 바와 같은 세포를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 핵산, rAAV 벡터, rAAV 입자, 조성물, 또는 세포는 정맥내, 동맥내, 간내, 간문맥내, 복강내, 또는 피하 투여된다. 일부 구현예에서, 투여는 다른 요법과 병용된다. 일부 구현예에서, 다른 요법은 테트라하이드로비옵테린을 사용한 치료, 페닐알라닌 암모니아 리아제(PAL) 또는 PEG화 PAL을 사용한 치료, 또는 페닐알라닌 제한 식이요법이다.
일부 양태에서, 본 발명은 PAH 폴리펩티드의 제조 방법으로서, PAH 폴리펩티드를 생성하는 조건에서 본원에 기재된 바와 같은 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 PAH 폴리펩티드를 정제하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 양태에서 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 변이 PAH 폴리펩티드를 포함하는 키트를 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 핵산, 본원에 기재된 바와 같은 rAAV 벡터, 본원에 기재된 바와 같은 rAAV 입자, 또는 본원에 기재된 바와 같은 조성물을 포함하는 키트를 제공한다. 일부 구현예에서, 키트는 사용 설명서; 완충제 및/또는 제약상 허용되는 부형제; 및/또는 병, 바이알, 및/또는 주사기를 추가로 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명은 간세포에서 이식유전자를 발현하기 위한 발현 카세트로서, 프로모터 및 인핸서에 작동 가능하게 연결된 이식유전자를 포함하되, 상기 프로모터는 마우스 트랜스티레틴(mTTR) 프로모터를 포함하고, 상기 인핸서는 1개 또는 2개의 변형된 프로트롬빈 인핸서(pPrT2), 1개 또는 2개의 변형된 알파 1-마이크로비쿠닌 인핸서(mA1MB2), 변형된 마우스 알부민 인핸서(mEalb), B형 간염 바이러스 인핸서 II(HE11), 또는 CRM8 인핸서를 포함하는, 발현 카세트를 제공한다. 일부 구현예에서, mTTR 프로모터는 mTTR482 프로모터이다. 일부 구현예에서, 인핸서는 mTTR 프로모터에 대해 5'에 있다.
일부 양태에서, 본 발명은 간세포에서 이식유전자를 발현하기 위한 발현 카세트로서, 프로모터 및 3' 요소에 작동 가능하게 연결된 이식유전자를 포함하되, 상기 프로모터는 마우스 트랜스티레틴(mTTR) 프로모터를 포함하고, 상기 3' 요소는 알부민 3' 요소(3' Alb)이거나 인간 알파 1 항트립신 스캐폴드/매트릭스 부착 영역(SMAR)에 연결된 알부민 3' 요소(3' AlbSMAR)인, 발현 카세트를 제공한다. 일부 구현예에서, mTTR 프로모터는 mTTR482 프로모터이다. 일부 구현예에서, 3' 요소는 이식유전자에 대해 3'에 위치한다.
일부 양태에서, 본 발명은 간세포에서 이식유전자를 발현하기 위한 발현 카세트로서, 프로모터 및 인핸서 및 3' 요소에 작동 가능하게 연결된 이식유전자를 포함하되, 상기 프로모터는 마우스 트랜스티레틴(mTTR) 프로모터를 포함하고, 상기 인핸서는 1개 또는 2개의 변형된 프로트롬빈 인핸서(pPrT2), 1개 또는 2개의 변형된 알파 1-마이크로비쿠닌 인핸서(mA1MB2), 변형된 마우스 알부민 인핸서(mEalb), B형 간염 바이러스 인핸서 II(HE11), 또는 CRM8 인핸서를 포함하고, 상기 3' 요소는 알부민 3' 요소(3' Alb)이거나 인간 알파 1 항트립신 스캐폴드/매트릭스 부착 영역(SMAR)에 연결된 알부민 3' 요소(3' AlbSMAR)인, 발현 카세트를 제공한다. 일부 구현예에서, mTTR 프로모터는 mTTR482 프로모터이다. 일부 구현예에서, 인핸서는 mTTR 프로모터에 대해 5'에 있다. 일부 구현예에서, 3' 요소는 이식유전자에 대해 3'에 위치한다.
일부 구현예에서, 발현 카세트는 인트론을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 인트론은 닭 β-액틴/토끼 β-글로빈 하이브리드 인트론이다. 일부 구현예에서, 발현 카세트는 폴리아데닐화 신호를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리아데닐화 신호는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호이다.
일부 구현예에서, 이식유전자는 PAH 폴리펩티드 또는 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 발현 카세트를 포함하는 벡터를 제공한다. 일부 구현예에서, 벡터는 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 벡터이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 하나 이상의 AAV 역위 말단 반복(ITR) 서열에 의해 플랭킹된, 본원에 기재된 바와 같은 발현 카세트를 포함하는 rAAV 벡터를 제공한다. 일부 구현예에서, 발현 카세트는 2개의 AAV ITR에 의해 플랭킹된다. 일부 구현예에서, AAV ITR은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV DJ, 염소 AAV, 소 AAV, 또는 마우스 AAV 혈청형 ITR이다. 일부 구현예에서, AAV ITR은 AAV2 ITR이다.
일부 구현예에서, 벡터는 자기-상보성 벡터이다. 일부 구현예에서, 벡터는 PAH 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 핵산 서열 및 PAH 폴리펩티드의 보체를 인코딩하는 제2 핵산 서열을 포함하며, 제1 핵산 서열은 길이의 대부분 또는 전부를 따라 제2 핵산 서열과 가닥내 염기쌍을 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 핵산 서열과 제2 핵산 서열은 돌연변이 AAV ITR에 의해 연결되고, 돌연변이 AAV ITR은 D 영역의 결실을 포함하고 말단 분해 서열의 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 rAAV 벡터를 포함하는 rAAV 입자를 제공한다. 일부 구현예에서, AAV 바이러스 입자는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV2/2-7m8, AAV DJ, AAV2 N587A, AAV2 E548A, AAV2 N708A, AAV2 V708K, 염소 AAV, AAV1/AAV2 키메라, 소 AAV, 마우스 AAV, 또는 rAAV2/HBoV1 혈청형 캡시드를 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 바이러스 입자는 조작된 AAV 캡시드를 포함한다. 일부 구현예에서, 조작된 AAV 캡시드는 DJ 캡시드 또는 LK03 캡시드이다. 일부 구현예에서, rAAV 바이러스 입자의 ITR 및 캡시드는 동일한 AAV 혈청형으로부터 유래된다. 일부 구현예에서, rAAV 바이러스 입자의 ITR 및 캡시드는 상이한 AAV 혈청형으로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 rAAV 입자를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 조성물은 제약상 허용되는 담체를 추가로 포함한다.
도 1a 내지 도 1c는 간 프로모터의 최적화를 보여준다. 도 1a는 프리바이러스 플라스미드 작제물의 다이어그램을 도시한다. 작제물 mTTR482(#1)는 다양한 간 인핸서 요소(작제물 #2~6) 또는 3' 안정성 요소(작제물 #7~8)의 추가에 의해 변형되었다. CBA 프로모터 함유 작제물을 비교를 위해 사용하였다. 모든 작제물에는 플랭킹 ITF, 하이브리드 인트론, 및 SEAP 리포터가 포함되었다. 이어서, 작제물을 Huh7 세포(도 1b) 또는 HepG2 세포(도 1c)에 형질감염시켰다. 형질감염 72시간 후, 분비 SEAP 활성 수치를 측정하고, 공동 형질감염된 LacZ 플라스미드의 b-갈락토시다제 수치로 정규화하였다. 각각의 평가에는 n=3~4/플라스미드가 포함되었다.
도 2a 및 도 2b는 생체내 SEAP 생성에 의한 간 프로모터의 평가를 보여준다. 도 2a는 정상적인 C57BL/6 마우스의 SEAP 수치를 보여준다. 도 2b는 PAHenu2 마우스의 SEAP 수치를 보여준다. 두 실험 모두에서, 플라스미드 벡터는 고용량 주사에 의해 전달되었고, 다양한 시점에 혈장의 SEAP 활성을 측정하였다. 각 처치 그룹에는 n=3~6마리 동물이 포함되었다.
도 3a 내지 도 3d는 PAHenu2 마우스에서의 간 프로모터 성능 비교를 보여준다. sc-LP1 또는 ss-A1MB2-mTTR 프로모터(선도물질)로부터 mPAH를 발현하는 rAAV8 벡터를 4e10(L) 또는 1e11(M) VG/마우스로 수컷 PAHenu2 마우스에게 투여하였다. 도 3a는 56일 동안의 혈중 Phe 수치를 보여준다. n=2인 나이브 동물을 제외하고, 수치는 n=8/그룹의 평균이다. 도 3b는 56일차의 혈중 Phe 수치를 보여준다. 4e10 또는 1e11 VG/마우스로 투여된 두 작제물로 처치된 동물 또는 미처치 동물의 혈장 Phe 수치가 표시되어 있다. 도 3c는 혈중 Tyr 수치를 보여준다. 수치는 벡터 투여 전(사전채혈)과 벡터 투여 7일 및 56일 후에 측정되었다. 각각의 값은 n=8/그룹의 평균이다. 도 3d는 56일차의 간 벡터 게놈을 보여준다. 벡터 카피는 qPCR로 측정되었고, n=5/그룹의 평균이 표시되어 있다.
도 4a 내지 도 4d는 PAHenu2 마우스의 뇌 분석을 보여준다. 미처치 마우스, ss-mA1MB2-mTTR(선도물질) 작제물(4e10 및 1e11 vg/마우스) 및 sc-LP1(1e11 vg/마우스)로 처치된 PAHenu2 마우스로부터 5마리의 동물을 처치 56일 후 희생시키고, PBS로 관류시키고, 분석을 위해 뇌를 회수하였다. 야생형 대조군(WT)으로서 Balb/C 마우스를 사용하였다. 도 4a는 뇌 Phe 수치를 보여준다. 도 4b는 혈액과 뇌의 Phe 수치의 상관 관계를 보여준다. 도 4c는 뇌 도파민 수치를 보여준다. 도 4d는 뇌 세로토닌 수치를 보여준다. 모든 값은 n=5/그룹의 평균을 나타낸다(미처치 PAHenu2 마우스에 대한 n=2는 제외). 도 3a 내지 도 3c에서 설명한 바와 같이 연구를 수행하였다.
도 5a 및 도 5b는 인간 PAH cDNA의 코돈 최적화를 보여준다. FLAG-태그 hPAH를 인코딩하는 cDNA를 mTTR482-hPAH-BGHpA 발현 플라스미드에 클로닝하였다. 시험관내 및 생체내 모두에서 hPAH 생성을 시험하였다. 도 5a는 Huh7 세포의 FLAG-hPAH 수준을 보여준다. 플라스미드를 형질감염시키고 48시간 후에 세포 용해물을 제조하였다. 세포 용해물의 PAH 단백질 수치는 웨스턴 블롯에 의해 분석되었다. 도 5b는 C57BL/6 마우스의 간 FLAG-hPAH 수치를 보여준다. 플라스미드는 유체역학적 주사에 의해 투여되었고, 24시간 후에 간을 회수하였다. FLAG-ELISA를 사용하여 간 용해물에서의 FLAG-태그 hPAH 수치를 정량화하고 총 단백질로 정규화하였다. 값들은 n=4~5마리 동물/그룹에 대한 평균을 나타낸다. 약어: C: 음성 대조군 플라스미드; GS: Genscript, GA: GeneArt, GS CpG: CpG가 제거된 Genscript 서열; non: 원래의 hPAH DNA 서열; 나이브: 미처치 동물.
도 6a는 상이한 프로모터(mTTR482, CBA, 및 LP1)의 제어 하에서의 인간 페닐알라닌 하이드록실라제(hPAH) 및 마우스 페닐알라닌 하이드록실라제(mPAH)의 발현을 보여주는 웨스턴 블롯이다. 발현 플라스미드를 Huh7 세포에 형질감염시키고, 이틀 후 FLAG에 대한 항체를 사용하여 세포 용해물의 FLAG-PAH 수치를 분석하였다.
도 6b는 전장(FL) 및 이중 절단(DT) 인간 및 마우스 PAH의 시험관내 발현의 비교를 보여주는 웨스턴 블롯이다. 분석은 도 6a에서와 같다.
도 6c는 전장(FL) 및 이중 절단(DT) 형태 모두에 대한 hPAH 및 mPAH 단백질 수치의 비교이다. 발현 플라스미드에 의한 형질감염 후 Huh7 세포 용해물에서 ELISA에 의한 FLAG-태그 단백질의 정량화를 수행하였다.
도 6d는 hPAH 및 mPAH mRNA 수치의 비교이다. 도 6c에서 사용된 물질에 대해 qPCR에 의한 RNA 분석을 수행하였다.
도 6e는 정제된 hPAH 및 mPAH(둘 다 전장 및 이중 절단 형태로서 생성됨)의 분석을 보여주는 웨스턴 블롯이다. 단백질을 FLAG-친화성 컬럼으로 정제하고 SDS-PAGE 겔로 처리한 후 항-FLAG 항체로 검출하였다.
도 6f는 PKU 마우스 모델에 있어서 hPAH 또는 mPAH를 인코딩하는 rAAV8 벡터의 효능을 보여준다. hPAH 및 mPAH는 모두 LP1 프로모터를 포함하는 자기-상보성 벡터(sc-LP1)로부터 발현되었다. 효능은 PAHenu2 마우스에게 단회 IV 주사한 후의 혈중 Phe 수치의 감소로써 측정되었다.
도 7a 내지 도 7c는 마우스/인간 하이브리드 PAH 작제물의 생성을 보여준다. 도 7a는 마우스/인간 하이브리드 PAH 작제물의 다이어그램을 도시한다. 인간(녹색) 및 마우스(회색) PAH로부터 유래된 영역이 표시되어 있다. 도 7b는 단백질 발현 수준에 미치는 hPAH의 N-말단 영역 대체의 효과를 보여준다. 도 7c는 단백질 발현 수준에 미치는 hPAH의 C-말단 영역 변경의 효과를 보여준다. CBA-PAH 발현 카세트를 포함하는 플라스미드를 293T 세포에 형질감염시켜 실험을 수행하였다. 48시간 후, FLAG ELISA에 의한 FLAG-PAH의 정량화를 위해 세포를 회수하였다.
도 8a 및 도 8b는 이중 절단된 hPAH(hPAH-DT) 변이체의 시험관내 스크리닝을 보여준다. 도 8a는 플라스미드-발현 hPAH 단백질 변이체(#1 내지 #8)의 단백질 발현 수준을 보여준다. 도 8b는 플라스미드-발현 hPAH 단백질 변이체의 PAH 활성 수치를 보여준다. 모든 변이체를 293 세포에 형질감염시키고, CBA 프로모터를 포함하는 플라스미드로부터 발현시켰다. 변이 플라스미드의 결과는 인간 또는 마우스 PAH를 발현하는 유사 플라스미드와 비교된다.
도 9a 내지 도 9c는 시험관내 PAH 생성을 위한 hPAH-V1-DT 유도체의 특성화를 보여준다. 도 9a는 hPAH-V1-DT 유도체의 PAH 활성 수치를 보여준다. 도 9b는 hPAH-V1-DT 유도체의 PAH 단백질 수치를 보여준다. 도 9c는 hPAH-V1-DT 유도체의 고유 PAH 활성을 보여준다. 결과는 형질감염된 293 세포의 세포 용해물 분석에 기초한다.
도 10a 내지 도 10c는 시험관내 PAH 생성을 위한 hPAH-V1-DT 유도체의 반복 분석을 보여준다. 도 10a는 선택된 hPAH-V1-DT 유도체의 PAH 활성 수치를 보여준다. 도 10b는 hPAH-V1-DT 유도체의 PAH 단백질 수치를 보여준다. 도 10c는 hPAH-V1-DT 유도체의 고유 PAH 활성을 보여준다. 데이터는 도 8a 및 도 8b에서 설명한 바와 같이 생성되었다. 도 10d는 변이체-1의 세 가지 이중-돌연변이 버전의 PAH 활성을 보여준다. 데이터는 도 8a 및 도 8b에서 설명한 바와 같이 생성되었다.
도 11a 내지 도 11c는 마우스 PAH(mPAH) 및 인간 PAH(hPAH)에 대한 전장 hPAH-V1의 시험관내 비교를 보여준다. 도 11a는 단백질 발현의 웨스턴 블롯 분석이다. 도 11b는 FLAG-ELISA에 의한 PAH 단백질 수치를 보여준다. 도 11c는 PAH 활성 수치를 보여준다. 간 프로모터 A1MB2-mTTR482를 포함하고 전장 PAH 단백질을 인코딩하는 발현 플라스미드를 Huh7에 형질감염시킨 후 세포 용해물을 분석함으로써 데이터를 생성하였다. M은 마커 레인을 나타낸다.
도 12a 내지 도 12c는 전장 hPAH-V1을 발현하는 rAAV 벡터의 효능과 PAHenu2 마우스에서의 마우스 및 인간 PAH 효능의 비교를 보여준다. 도 12a는 혈중 페닐알라닌 수치를 보여준다. 도 12b는 혈중 티로신 수치를 보여준다. 도 12c는 혈중 페닐알라닌 대사산물 수치를 보여준다. P값은 *(P <0.05), **(P <0.01), 및 ***(P <0.001)로 표시되어 있다. 모든 처치 그룹은 간 프로모터로부터 FLAG-태그 PAH를 발현하는 AAV8 벡터로 구성되었다. 벡터는 0일차에 3e11(hPAH, hPAH-V1 및 mPAH) 또는 1e12 vg/마우스(hPAH 및 hPAH-V1)로 IV 경로를 통해 주사하였다. 음성 대조군 및 양성 대조군으로 나이브 PAHenu2 마우스 및 이형접합체(HET)를 각각 사용하였다.
도 13a 내지 도 13c는 간의 rAAV 벡터 게놈 및 3x-FLAG-PAH 수치 정량화를 보여준다. 도 13a는 PAH 단백질 수치를 보여준다. 도 13b는 PAH 활성 수치를 보여준다. 도 13c는 간의 벡터 게놈 카피를 보여준다. 도 12a 내지 도 12c에서 설명한 바와 같이 실험을 수행하였고, 벡터 투여 69일 후에 간을 회수하였다. 각 패널에, 3e11 VG/마우스 처치 그룹(hPAH, hPAH-V1, 및 mPAH) 및 1e12 vg/마우스 처치 그룹(hPAH, hPAH-V1)에 대한 데이터가 표시되어 있다. P값, ***는 0.001 미만이다.
도 14a 내지 도 14d는 뇌의 다양한 아미노산 수치의 정량화를 보여준다. 도 14a는 뇌 페닐알라닌 수치를 보여준다. 도 14b는 뇌 티로신 수치를 보여준다. 도 14c는 뇌와 혈액의 페닐알라닌 수치 사이의 상관 관계를 보여준다. 도 14d는 뇌 트립토판 수치를 보여준다. 도 12a 내지 도 12c에서 설명한 바와 같이 실험을 수행하였다. 표시된 데이터는 3e11 VG/마우스(n=5/그룹)로 투여된 처치 그룹의 데이터이다(69일차). P값, ***는 0.001 미만이다.
도 15a 내지 도 15d는 뇌의 신경전달물질 수치를 보여준다. 도 15a는 뇌 도파민 수치를 보여준다. 도 15b는 도파민 대사산물인 DOPAC의 뇌 수치를 보여준다. 도 15c는 뇌 세로토닌 수치를 보여준다. 도 15d는 세로토닌 대사산물인 HIAA의 뇌 수치를 보여준다. 도 12a 내지 도 12c에서 설명한 바와 같이 실험을 수행하였고, 값들은 3e11 VG/마우스 코호트에서의 값이다(69일차). P값, **는 P <0.01이고 ***는 P <0.001이다.
도 16a 및 도 16b는 3.8 및 4.6 kb의 A1MB2-mTTR-hPAV-V1 벡터 게놈의 효능 비교를 보여준다. 도 16a는 벡터의 다이어그램을 도시한다. 도 16b는 PAHenu2 마우스에서의 효능 시험을 보여준다. 간 프로모터(선도물질)로부터 hPAH-V1을 발현하는 AAV8 벡터를 1e11 vg/마우스로 1회 투여하고, 혈중 Phe 수치로써 효능을 측정하였다. 또한, 이들 벡터를 N-말단 태그 없이 hPAH-V1을 포함하는 4.6 kb 벡터(1e11 및 3e11 vg/마우스로 시험)와 비교하였다.
도 17a 내지 도 17c는 rAAV 벡터에 의한 전달 후 비인간 영장류 간에서의 hPAH-V1과 hPAH 생성을 생체내 비교한 것을 보여준다. 도 17a는 각 개체 동물의 간 rAAV 벡터 게놈 수치를 보여준다. 도 17b는 각 처치 동물의 간과 비장에서의 벡터-유래 mRNA 수치를 보여준다. mRNA 수치는 각 동물에서 벡터 게놈 카피로 정규화되었다. 도 17c는 간 호모지네이트에서의 FLAG-태그 PAH 단백질 검출을 보여준다. 하우스키핑 단백질 GAPDH의 검출을 통해 동일한 용해물 로딩이 확인되었다. A1MB2-mTTR 프로모터로부터 FLAG-태그 PAH 또는 PAH-V1을 발현하는 rAAV 벡터를 kg당 5e12 g IV 투여하여 실험을 수행하였다. 간의 벡터 게놈, 벡터 유래 mRNA 및 PAH 단백질 분석을 위해 2주 후에 조직을 수집하였다.
일부 양태에서, 본원에 기재된 발명은 야생형 hPAH에 비해 시험관내 및 생체내 더 높은 PAH 단백질 및/또는 활성 수치를 부여하는 적어도 2개 4개의 아미노산 변경을 포함하는 인간 PAH의 변이체(hPAH-V1) 폴리펩티드를 제공한다. 다른 양태에서, 본원에 기재된 발명은 야생형 hPAH에 비해 시험관내 및 생체내 더 높은 PAH 단백질 및/또는 활성 수치를 부여하는 적어도 2개, 3개, 또는 4개의 아미노산 변경을 포함하는 인간 PAH의 개선된 변이체(hPAH-V1)를 제공한다. 일부 양태에서, 본 발명은 인간 PAH의 상기 변이체를 인코딩하는 핵산을 제공한다. 일부 양태에서, 본 발명은 본 발명의 변이 PAH 폴리펩티드를 포함하는 발현 카세트, 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 벡터와 바이러스 입자, 및 제약 조성물을 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은, 예를 들어 PAH 활성을 증가시키고, 티로신 및 트립토판의 뇌 수송을 향상시키고, 도파민 및 세로토닌을 포함한 뇌 신경전달물질 수치를 정규화하여 페닐케톤뇨증(PKU)을 치료하는 방법을 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 변이 PAH를 사용하여 개체에서 PKU를 치료하기 위한 키트를 제공한다.
I. 일반 기술
본원에 기재되거나 참조된 기술 및 절차는 일반적으로 잘 이해되며, 통상적인 방법, 예를 들어 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook et al., 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2012); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al. eds., 2003); the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds., 1995); Antibodies, A Laboratory Manual (Harlow and Lane, eds., 1988); Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications (R.I. Freshney, 6th ed., J. Wiley and Sons, 2010); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., Academic Press, 1998); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, Plenum Press, 1998); Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., J. Wiley and Sons, 1993-8); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds., 1996); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., J. Wiley and Sons, 2002); Immunobiology (C.A. Janeway et al., 2004); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995); 및 Cancer: Principles and Practice of Oncology (V.T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 2011)]에 기재된 널리 이용되는 방법을 사용하여 당업자에 의해 통상적으로 사용된다.
II. 정의
본원에서 사용되는 "벡터"는 시험관내 또는 생체내에서 숙주 세포에 전달되는 핵산을 포함하는 재조합 플라스미드 또는 바이러스를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 임의의 길이의 중합체 형태의 뉴클레오티드(리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드)를 지칭한다. 따라서, 이 용어는 단일-, 이중-, 또는 여러-가닥의 DNA 또는 RNA, 게놈 DNA, cDNA, DNA-RNA 하이브리드, 또는 푸린 및 피리미딘 염기를 포함하는 중합체, 또는 기타 천연의, 화학적 또는 생화학적으로 변형된, 비천연적인, 또는 유도체화된 뉴클레오티드 염기를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 폴리뉴클레오티드의 백본은 당 및 포스페이트기(일반적으로 RNA 또는 DNA에서 발견될 수 있음), 또는 변형되거나 치환된 당 또는 포스페이트기를 포함할 수 있다. 대안적으로, 폴리뉴클레오티드의 백본은 포스포르아미데이트와 같은 합성 서브유닛의 중합체를 포함할 수 있고, 따라서 올리고데옥시뉴클레오시드 포스포르아미데이트(P-NH2) 또는 혼합된 포스포르아미데이트-포스포디에스테르 올리고머일 수 있다. 또한, 상보적 가닥을 합성하고 적절한 조건에서 가닥을 어닐링함으로써, 또는 적절한 프라이머와 함께 DNA 중합효소를 사용하여 새로운 상보적 가닥을 합성함으로써 화학적 합성의 단일 가닥 폴리뉴클레오티드 산물로부터 이중가닥 폴리뉴클레오티드가 수득될 수 있다.
용어 "폴리펩티드"와 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용되며, 최소 길이로 제한되지 않는다. 이러한 아미노산 잔기의 중합체는 천연 또는 비천연 아미노산 잔기를 포함할 수 있고, 펩티드, 올리고펩티드, 아미노산 잔기의 이량체, 삼량체, 및 다량체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 전장 단백질 및 이의 단편이 모두 상기 정의에 포함된다. 이 용어는 또한 폴리펩티드의 발현후 변형, 예를 들어, 글리코실화, 시알릴화, 아세틸화, 인산화 등을 포함한다. 또한, 본 발명의 목적상, "폴리펩티드"는 단백질이 원하는 활성을 유지하는 한, 천연 서열에 대한 결실, 부가, 및 치환(일반적으로는 사실상 보존적)과 같은 변형을 포함하는 단백질을 지칭한다. 이러한 변형은 부위-특이적 돌연변이유발을 통해서와 같이 계획적일 수 있거나, 단백질을 생성하는 숙주의 돌연변이 또는 PCR 증폭으로 인한 오류를 통해서와 같이 우연적일 수 있다.
"재조합 바이러스 벡터"는 하나 이상의 이종 서열(즉, 바이러스 기원이 아닌 핵산 서열)을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드 벡터를 지칭한다. 재조합 AAV 벡터의 경우, 재조합 핵산은 적어도 하나의, 구현예에 따라 2개의 역위 말단 반복 서열(ITR)에 의해 플랭킹되어 있다.
"재조합 AAV 벡터(rAAV 벡터)"는 적어도 하나의, 일부 구현예에 따라 2개의 AAV 역위 말단 반복 서열(ITR)에 의해 플랭킹된 하나 이상의 이종 서열(즉, AAV 기원이 아닌 핵산 서열)을 포함하는 폴리뉴클레오티드 벡터를 지칭한다. 이러한 rAAV 벡터는 적절한 헬퍼 바이러스로 감염되고(또는 적절한 헬퍼 기능을 발현하고), AAV rep 및 cap 유전자 산물(즉, AAV Rep 및 Cap 단백질)을 발현하는 숙주 세포에 존재할 때 복제될 수 있고, 감염성 바이러스 입자로 패키징될 수 있다. rAAV 벡터가 더 큰 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 염색체, 또는 클로닝이나 형질감염에 사용되는 플라스미드와 같은 다른 벡터)에 통합될 때, 이러한 rAAV 벡터는 AAV 패키징 기능 및 적절한 헬퍼 기능의 존재하에서 복제 및 캡시드화에 의해 "회수"될 수 있는 "프로-벡터(pro-vector)"로 지칭될 수 있다. rAAV 벡터는 플라스미드, 선형 인공 염색체, 지질과 복합체화된 형태, 리포솜 내에 캡슐화된 형태, 및 바이러스 입자, 예를 들어 AAV 입자에 캡시드화된 형태를 포함하지만 이에 한정되지 않는 다수의 형태 중 임의의 형태로 존재할 수 있다. rAAV 벡터는 AAV 바이러스 캡시드에 패키징되어 "재조합 아데노-관련 바이러스 입자(rAAV 입자)"를 생성할 수 있다.
"이종"은 비교 대상이 되거나 내부에 도입 또는 통합되는 개체의 나머지와는 유전자형으로 구분되는 개체로부터 유래된 것을 의미한다. 예를 들어, 유전 공학 기술에 의해 다양한 세포 유형에 도입된 폴리뉴클레오티드는 이종 폴리뉴클레오티드이다(발현되는 경우, 이종 폴리펩티드를 인코딩할 수 있음). 마찬가지로, 바이러스 벡터에 통합되는 세포 서열(예를 들어, 유전자 또는 이의 부분)은 벡터에 대해 이종 뉴클레오티드 서열이다.
용어 "이식유전자"는 세포에 도입되어 RNA로 전사될 수 있고, 필요에 따라, 적절한 조건에서 번역 및/또는 발현될 수 있는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 양태에 따라, 이는 도입된 세포에 요구되는 특성을 제공하거나, 요구되는 치료적 또는 진단적 결과를 유도한다.
"닭 β-액틴(CBA) 프로모터"는 닭 β-액틴 유전자(예를 들어, GenBank Entrez Gene ID 396526으로 표시되는 Gallus gallus 베타 액틴)로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 본원에서 사용되는 "닭 β-액틴 프로모터"는 사이토메갈로바이러스(CMV) 초기 인핸서 요소, 닭 β-액틴 유전자의 프로모터 및 첫 번째 엑손 및 인트론, 및 토끼 베타-글로빈 유전자의 스플라이스 수신체를 함유하는 프로모터, 예컨대, 문헌[Miyazaki, J. et al. (1989) Gene 79(2):269-77]에 기재된 서열을 나타낼 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "CAG 프로모터"는 상호교환적으로 사용될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "CMV 초기 인핸서/닭 베타 액틴(CAG) 프로모터"는 상호교환적으로 사용될 수 있다.
바이러스 역가와 관련하여 사용된 용어 "게놈 입자(gp)", "게놈 당량", 또는 "게놈 카피"는 감염성 또는 기능성과 무관하게, 재조합 AAV DNA 게놈을 포함하는 비리온의 수를 지칭한다. 특정 벡터 제조물 내의 게놈 입자의 수는 본원의 실시예, 또는 예를 들어 문헌[Clark et al. (1999) Hum. Gene Ther., 10:1031-1039; Veldwijk et al. (2002) Mol. Ther., 6:272-278]에 기재된 바와 같은 절차에 의해 측정될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "벡터 게놈(vg)"은 벡터, 예를 들어 바이러스 벡터의 한 세트의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 지칭할 수 있다. 벡터 게놈은 바이러스 입자에 캡시드화될 수 있다. 특정 바이러스 벡터에 따라, 벡터 게놈은 단일가닥 DNA, 이중가닥 DNA, 또는 단일가닥 RNA, 또는 이중가닥 RNA를 포함할 수 있다. 벡터 게놈은 특정 바이러스 벡터와 관련된 내인성 서열 및/또는 재조합 기술을 통해 특정 바이러스 벡터에 삽입되는 임의의 이종 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 재조합 AAV 벡터 게놈은 프로모터를 플랭킹하는 적어도 하나의 ITR 서열, 스터퍼, 관심 서열(예컨대, RNAi), 및 폴리아데닐화 서열을 포함할 수 있다. 완전한 벡터 게놈은 벡터의 폴리뉴클레오티드 서열의 완전한 세트를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터의 핵산 역가는 vg/ml 단위로 측정될 수 있다. 이러한 역가를 측정하는 데 적합한 방법은 당업계에 알려져 있다(예컨대, 정량적 PCR).
바이러스 역가와 관련하여 사용된 용어 "감염 단위(iu)", "감염성 입자", 또는 "복제 단위"는, 예를 들어 문헌[McLaughlin et al. (1988) J. Virol., 62:1963-1973]에 기재된 바와 같이, 복제 중심 검정으로도 알려져 있는, 감염 중심 검정으로 측정된, 감염성 및 복제 능력이 있는 재조합 AAV 벡터 입자의 수를 지칭한다.
바이러스 역가와 관련하여 사용된 용어 "형질도입 단위(tu)"는 본원의 실시예, 또는 예를 들어 문헌[Xiao et al. (1997) Exp. Neurobiol., 144:113-124]; 또는 [Fisher et al. (1996) J. Virol., 70:520-532 (LFU assay)](LFU 검정)에 기재된 것과 같은 기능성 검정으로 측정되는 기능성 이식유전자 산물을 생성케하는 감염성 재조합 AAV 벡터 입자의 수를 지칭한다.
"역위 말단 반복" 또는 "ITR" 서열은 당업계에서 널리 이해되는 용어로, 반대 방향의 바이러스 게놈의 말단에서 발견되는 상대적으로 짧은 서열을 지칭한다.
당업계에서 널리 이해되는 용어인 "AAV 역위 말단 반복(ITR)" 서열은 고유한 단일가닥의 AAV 게놈의 양 말단에 존재하는 대략 145-뉴클레오티드 서열이다. ITR의 가장 바깥쪽 125개 뉴클레오티드는 두 가지 대안적인 방향 중 하나로 존재할 수 있어, 상이한 AAV 게놈들 사이에, 그리고 단일 AAV 게놈의 양 말단 사이에 이질성을 초래한다. 가장 바깥쪽의 125개의 뉴클레오티드는 또한 자기-상보성의 여러 짧은 영역(A, A', B, B', C, C' 및 D 영역으로 명명됨)을 포함하며, 이는 가닥내 염기쌍 형성이 ITR의 상기 부분 내에서 발생하는 것을 가능케 한다.
"말단 분해 서열" 또는 "trs"는 바이러스 DNA 복제 중에 AAV rep 단백질에 의해 절단되는 AAV ITR의 D 영역 내의 서열이다. 돌연변이 말단 분해 서열은 AAV rep 단백질에 의한 절단에 불응한다.
"AAV 헬퍼 기능"은 AAV가 숙주 세포에 의해 복제되고 패키징될 수 있도록 하는 기능을 지칭한다. AAV 헬퍼 기능은 비제한적으로 AAV 복제 및 패키징을 보조하는 헬퍼 바이러스 또는 헬퍼 바이러스 유전자를 포함하는 임의의 여러 형태로 제공될 수 있다. 유전자독성제와 같은 다른 AAV 헬퍼 기능은 당업계에 알려져 있다.
AAV에 대한 "헬퍼 바이러스"는 (결함이 있는 파보바이러스인) AAV가 숙주 세포에 의해 복제되어 패키징될 수 있게 하는 바이러스를 지칭한다. 헬퍼 바이러스는 AAV의 복제를 가능하게 하는 "헬퍼 기능"을 제공한다. 아데노바이러스, 헤르페스바이러스 및 폭스바이러스, 예를 들어, 백시니아 및 배큘로바이러스를 비롯한 다수의 이러한 헬퍼 바이러스가 확인되었다. 아데노바이러스는 많은 상이한 서브그룹을 포함하지만, 서브그룹 C의 아데노바이러스 5형(Ad5)이 가장 흔히 사용된다. 인간, 비인간 포유류, 및 조류 기원의 여러 아데노바이러스가 알려져 있으며, ATCC와 같은 기탁기관으로부터 입수 가능하다. ATCC와 같은 기탁기관으로부터 또한 입수 가능한 헤르페스 패밀리의 바이러스는, 예를 들어 단순 헤르페스 바이러스(HSV), 엡스타인 바 바이러스(EBV), 사이토메갈로바이러스(CMV), 및 가성 광견병 바이러스(PRV)를 포함한다. AAV의 복제를 위한 아데노바이러스 헬퍼 기능의 예는 E1A 기능, E1B 기능, E2A 기능, VA 기능, 및 E4orf6 기능을 포함한다. 기탁기관으로부터 입수 가능한 배큘로바이러스는 Autographa californica 핵 다면체형성 바이러스를 포함한다.
rAAV의 조제물은 감염성 AAV 입자 대 감염성 헬퍼 바이러스 입자의 비가 적어도 약 102:l; 적어도 약 104:l, 적어도 약 106:l; 또는 적어도 약 108:l 이상인 경우, 헬퍼 바이러스가 "실질적으로 없는" 것으로 언급된다. 일부 구현예에서, 조제물은 등가량의 헬퍼 바이러스 단백질(즉, 상기 언급된 헬퍼 바이러스 입자 불순물이 손상된 형태로 존재하는 경우 그러한 수준의 헬퍼 바이러스의 결과로서 존재할 단백질)이 또한 없다. 바이러스 및/또는 세포 단백질 오염은 일반적으로 SDS 겔 상의 쿠마시 염색 밴드의 존재(예컨대, AAV 캡시드 단백질 VPl, VP2, 및 VP3에 상응하는 밴드가 아닌 밴드의 출현)로서 관찰될 수 있다.
참조 폴리펩티드 또는 핵산 서열과 관련된 "서열 동일성 백분율(%)"은 서열을 정렬하고, 최대 백분율의 서열 동일성을 달성하기 위해, 필요한 경우 갭을 도입한 후, 참조 폴리펩티드 또는 핵산 서열 내의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드와 동일한, 후보 서열 내의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 백분율로서 정의되며, 임의의 보존적 치환은 서열 동일성의 일부분으로 고려하지 않는다. 아미노산 또는 핵산 서열 동일성 백분율 결정의 목적을 위한 정렬은, 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어를 포함하여, 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 소프트웨어 프로그램, 예를 들어 문헌[Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1987), Supp. 30, section 7.7.18, Table 7.7.1]에 기재된 것들을 사용하여, 당업계의 기술 내에 있는 다양한 방식으로 달성될 수 있다. 바람직한 정렬 프로그램은 ALIGN 플러스(Scientific and Educational Software, Pennsylvania)이다. 당업자는 비교되는 서열의 전체 길이에 대해 최대 정렬을 달성하기 위해 필요한 임의의 알고리즘을 포함하는, 정렬 측정을 위한 적절한 매개변수를 결정할 수 있다. 본원의 목적상, 주어진 아미노산 서열 B에 대해, 이와, 또는 이에 대하여, 주어진 아미노산 서열 A의 아미노산 서열 동일성 %(이는 대안적으로는 주어진 아미노산 서열 B에 대해, 이와, 또는 이에 대하여, 특정 %의 아미노산 서열 동일성을 가지거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A라고 표현될 수 있음)는 다음과 같이 계산된다: 100 x 분율 X/Y(X는 A 및 B의 서열 정렬 프로그램에 의한 프로그램 정렬시, 동일한 매칭으로 스코어링된 아미노산 잔기의 수이며, Y는 B의 총 아미노산 잔기수임). 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우, A 대 B의 아미노산 서열 동일성%는 B 대 A의 아미노산 서열 동일성%와 동일하지 않을 것임이 이해될 것이다. 본원의 목적상, 주어진 핵산 서열 D에 대해, 이에 의해, 또는 이와 연관하여, 주어진 핵산 서열 C의 핵산 서열 동일성%(대안적으로는, 주어진 핵산 서열 D에 대해, 이에 의해, 또는 이와 연관하여, 특정 핵산 서열 동일성%를 가지거나 이를 포함하는 주어진 핵산 서열 C로서 표현될 수 있음)는 다음과 같이 계산된다: 100 x 분율 W/Z(W는 C 및 D의 서열 정렬 프로그램에 의한 프로그램 정렬시, 동일한 매칭으로 스코어링된 뉴클레오티드의 수이며, Z는 D의 총 뉴클레오티드 수임). 핵산 서열 C의 길이가 핵산 서열 D의 길이와 동일하지 않은 경우, C 대 D의 핵산 서열 동일성%는 D 대 C의 핵산 서열 동일성%와 동일하지 않을 것임이 이해될 것이다.
"단리된" 분자(예를 들어, 핵산 또는 단백질) 또는 세포는 천연 환경 성분으로부터 확인되고, 분리되고/분리되거나 회수되었음을 의미한다.
"유효량"은 임상 결과(예를 들어, 증상의 개선, 임상 평가변수의 달성 등)를 포함하여 유익하거나 요망되는 결과를 가져오기에 충분한 양이다. 유효량은 1회 이상 투여될 수 있다. 질병 상태의 측면에서, 유효량은 질병을 완화하거나, 안정화하거나, 또는 발생을 지연시키기에 충분한 양이다.
"개체" 또는 "대상체"는 포유류이다. 포유류는 가축(예컨대, 소, 양, 고양이, 개, 및 말), 영장류(예컨대, 인간 및 원숭이와 같은 비인간 영장류), 토끼, 및 설치류(예컨대, 마우스 및 래트)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 특정 구현예에서, 개체 또는 대상체는 인간이다.
본원에서 사용되는 "치료"는 유익하거나 요망되는 임상 결과를 얻기 위한 접근법이다. 본 발명의 목적상, 유익하거나 요망되는 임상 결과는 검출 가능하든 검출 불가능하든 증상의 경감, 질병 정도의 감소, 질병의 안정화된(예컨대, 악화되지 않은) 상태, 질병의 확산(예컨대, 전이) 방지, 질병 진행의 지연 또는 둔화, 질병 상태의 완화 또는 일시적 억제, 및 관해(부분적이든 전체적이든)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, "치료"는 치료를 받지 않을 경우 예상되는 생존에 비해 연장되는 생존을 의미할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "예방적 치료"는 개체가 장애를 갖거나 장애를 가질 위험이 있는 것으로 알려지거나 의심되지만 장애의 증상을 나타내지 않거나 최소 증상을 나타낸 치료를 의미한다. 예방적 치료를 받는 개체는 증상의 발생 전에 치료될 수 있다.
본원에서 사용되는 "페닐알라닌 하이드록실라제(PAH)"는 페닐알라닌의 방향족 측쇄의 하이드록실화에 촉매 작용을 하여 티로신을 생성하는 효소(EC 1.14.16.1)이다. PAH는 테트라하이드로비옵테린(BH4, 프테리딘 보조인자) 및 촉매작용을 위한 비헴철을 사용하는 모노옥시게나제이다. 반응 중에, 분자 산소는 하나의 산소 원자가 BH4 및 페닐알라닌 기질에 순차적으로 통합되면서 이종 분해된다. 페닐알라닌의 티로신으로의 하이드록실화는 페닐알라닌 이화작용에서 율속 단계이며, 이 효소 활성의 결핍은 상염색체 열성 장애인 페닐케톤뇨증을 유발한다. PAH는 PH, PKU, 또는 PKU1로 지칭될 수도 있다. PAH는 N-말단 조절 도메인(1 내지 117), 중앙 촉매 도메인(118 내지 410), 및 C-말단 사량체화 도메인(411 내지 452)으로 이루어진 다중 도메인 단백질이다. 인간 PAH는 GenBank에서 제공된다(예: NM_000277, NM_00877, NM_001354304, NP_000268, NP_032803, NP_001341233, AAA60082.1, AAH26251.1, AAC51772.1, 및 AAL78816.1(GI: 18765885)). 인간 PAH의 예는 서열번호 1로서 제공된다.
본원에서 사용되는 "페닐케톤뇨증(PKU)"은 간 효소 페닐알라닌 하이드록실라제(PAH)의 유전자 결핍을 지칭한다. 중증 형태의 PKU는 치료하지 않을 경우, 신경 독성이며 중증 정신 지체와 관련된 매우 높은 혈중 Phe 수치로 이어진다.
"mTTR 프로모터"는 뮤린 트랜스티레틴 유전자로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. mTTR 프로모터의 예(mTTR482)는 문헌[Kyostio-Moore (2016) 및 Nambiar (2017)]에서 제공된다.
"변형된 프로트롬빈 인핸서(mPrT2)"는 인간 프로트롬빈 유전자로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 서열의 2개의 카피를 지칭한다. mPrT2 인핸서의 예는 문헌[McEachern 2006, Jacobs 2008]에서 제공된다. mPrT2 서열의 예는 서열번호 7에 의해 제공된다.
"변형된 알파1-마이크로비쿠닌(mA1MB2)"은 인간 알파1-마이크로글로불린/비쿠닌 유전자로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 서열의 2개의 카피를 지칭한다. mA1MB2 인핸서의 예는 문헌[McEachern 2006, Jacobs 2008]에서 제공된다. mA1MB2 서열의 예는 서열번호 8에 의해 제공된다.
"변형된 마우스 알부민 인핸서(mEalb)"는 뮤린 알부민 유전자로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. mEalb 인핸서의 예는 문헌[Kramer 2003]에서 제공된다. mEalb 서열의 예는 서열번호 9에 의해 제공된다.
"B형 간염 바이러스 인핸서 II(HE11)"는 PreCore 프로모터의 상류에 위치한, B형 간염 바이러스로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. hEII 인핸서의 예는 문헌[Kramer 2003]에서 제공된다. HEII 서열의 예는 서열번호 10에 의해 제공된다.
"CRM8"은 인간 Serpina1 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열로부터 유래된 cis-작용 조절 모듈을 지칭한다(Chuah 2014). CRM8 서열의 예는 서열번호 11에 의해 제공된다.
"Alb 3"은 인간 알부민 유전자의 코딩 영역에 대해 3'의 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. Alb 3' 요소의 예는 문헌[Wooddell (2008)]에서 제공된다. Alb 3' 서열의 예는 서열번호 12에 의해 제공된다. "Alb3'/SMAR"은 인간 알파1-항트립신 유전자(AF156542)의 스캐폴드/매트릭스 부착 영역에 연결된 Alb3'을 지칭한다. Alb3'/SMAR 서열의 예는 서열번호 13에 의해 제공된다.
본원에서 값 또는 매개변수에 언급된 "약"은 그 값 또는 매개변수 자체에 관한 구현예를 포함(및 설명)한다. 예를 들어, "약 X"에 대한 설명은 "X"의 설명을 포함한다.
본원에 사용된 단수형은 달리 표시되지 않는 한, 복수의 지시대상을 포함한다.
본원에 기재된 본 발명의 양태 및 구현예는 양태 및 구현예를 "포함하는", 양태 및 구현예로 "이루어진", 및/또는 양태 및 구현예로 "본질적으로 이루어진" 것을 포함하는 것으로 이해된다.
III. PAH 변이체
일부 양태에서, 본 발명은 개체에서 발현시 더 높은 PAH 발현 및/또는 활성 수치를 부여하는 변이 PAH 폴리펩티드를 제공한다. 일부 구현예에서, 변이 PAH 폴리펩티드는 야생형 인간 PAH 폴리펩티드의 M180, K199, S250, S251, H264, G256, G272, G275, P279, T323, 및 F327로부터 선택되는 부위에 적어도 2개의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이 PAH 폴리펩티드는 H264 및 G275에 적어도 2개의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이 PAH 폴리펩티드는 야생형 인간 PAH 폴리펩티드의 M180, K199, S250, 및 G256으로부터 선택되는 부위에 적어도 3개의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이 PAH 폴리펩티드는 야생형 인간 PAH 폴리펩티드의 M180, K199, S250, 및 G256 부위에 4개의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이 PAH 폴리펩티드는 M180, K199, S250, S251, G256, G272, 및 P279에 5개의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이 PAH 폴리펩티드는 M180, K199, S250, G256, T323, 및 F327에 6개의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이 PAH 폴리펩티드는 H264P 및 G275H의 적어도 2개의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이 PAH 폴리펩티드는 M180T, K199P, S250P, 및 G256A로부터 선택되는 적어도 3개의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이 PAH 폴리펩티드는 K199P, S250P, 및 G256A; M180T, S250P, 및 G256A; M180T, K199P, 및 G256A; 또는 M180T, K199P, 및 S250P를 포함하는 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이 PAH 폴리펩티드는 아미노산 치환인 H264P, G272A, G272P, P275L, P279Q, G272P 및 P275L, 또는 T323R 및 F327T 아미노산 치환을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 변이 PAH 폴리펩티드는 표 1 내지 3에 제시된 변이 PAH 폴리펩티드 중 어느 하나이다. 일부 구현예에서, 변이 PAH 폴리펩티드는 M180T, K199P, S250P, 및 G256A 아미노산 치환을 포함하고, 야생형 PAH의 적어도 대략 페닐알라닌 하이드록실라제 활성을 유지하면서 추가적인 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 아미노산 치환의 위치는 야생형 인간 PAH 폴리펩티드, 예를 들어 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 인간 PAH 폴리펩티드에 기초한다.
일부 구현예에서, 변이 PAH 폴리펩티드는 인간 PAH 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, 변이 PAH 폴리펩티드는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이 PAH 폴리펩티드는 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 변이 PAH 폴리펩티드는 야생형 PAH의 페닐알라닌 하이드록실라제 활성의 적어도 약 25%, 50%, 75%, 100%, 또는 100% 초과의 활성을 갖는다. 일부 구현예에서, 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 변이 PAH 폴리펩티드는 서열번호 1의 야생형 PAH의 페닐알라닌 하이드록실라제 활성의 적어도 약 25%, 50%, 75%, 100%, 또는 100% 초과의 활성을 갖는다.
일부 구현예에서, 변이 PAH 폴리펩티드는 페닐알라닌 하이드록실라제 활성을 유지하는 절단된 PAH 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, 절단된 PAH 폴리펩티드는 N-말단 절단을 포함한다. 일부 구현예에서, N-말단 절단은 N-말단 조절 도메인의 일부 또는 전부의 절단이다. 일부 구현예에서, N-말단 절단은 야생형 인간 PAH 폴리펩티드(예컨대, 서열번호 1의 PAH 폴리펩티드)의 아미노산 잔기 1 내지 대략 아미노산 잔기 102의 결실이다. 일부 구현예에서, 절단된 PAH 폴리펩티드는 C-말단 절단을 포함한다. 일부 구현예에서, C-말단 절단은 사량체화 도메인의 일부 또는 전부의 절단이다. 일부 구현예에서, C-말단 절단은 야생형 인간 PAH 폴리펩티드(예컨대, 서열번호 1의 PAH 폴리펩티드)의 아미노산 잔기 약 429 내지 452의 결실이다. 일부 구현예에서, 변이 PAH 폴리펩티드는 N-말단 절단 및 C-말단 절단을 포함한다. 일부 구현예에서, 절단된 PAH 폴리펩티드는 N-말단 조절 서열의 일부 또는 전부 및 사량체화 도메인의 일부 또는 전부의 절단을 포함한다. 일부 구현예에서, 절단된 PAH 폴리펩티드는 야생형 인간 PAH 폴리펩티드(예컨대, 서열번호 1의 PAH 폴리펩티드)의 아미노산 잔기 1 내지 대략 아미노산 잔기 102 및 약 429 내지 약 452의 결실을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이 PAH 폴리펩티드는 야생형 PAH 폴리펩티드(예컨대, 서열번호 1의 PAH 폴리펩티드)의 아미노산 잔기 약 102 내지 약 428에 상응하는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이 PAH 폴리펩티드는 야생형 PAH 폴리펩티드(예컨대, 서열번호 1의 PAH 폴리펩티드)의 아미노산 잔기 102 내지 428에 상응하는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 절단된 PAH 폴리펩티드는 야생형 인간 PAH 폴리펩티드(예컨대, 서열번호 1의 PAH 폴리펩티드)의 M180, K199, S250, 및 G256 부위에 4개의 아미노산 치환을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 절단된 PAH 폴리펩티드는 M180T, K199P, S250P, 및 G256A로부터 선택되는 4개의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 절단된 변이 PAH 폴리펩티드는 표 1 내지 3에 제시된 아미노산 치환의 조합 중 어느 하나를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 절단된 PAH 폴리펩티드는 야생형 PAH(예컨대, 서열번호 1의 PAH 폴리펩티드)의 페닐알라닌 하이드록실라제 활성의 적어도 약 25%, 50%, 75%, 100%, 또는 100% 초과의 활성을 갖는다.
일부 구현예에서, 변이 PAH 폴리펩티드는 G33, G46, G103, G139, G148, G188, G218, G239, G247, G257, G272, G289, G307, G312, G332, G337, G344, G352, 또는 G442 부위 중 하나 이상에 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이 PAH 폴리펩티드는 G33A, G46(A,P), G103A, G139(A,P), G148A, G188A, G218A, G239A, G247A, G257A, G272A, G289A, G307A, G312A, G332A, G337A, G344A, G352A, 또는 G442A 아미노산 치환 중 하나를 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 #1 PAH 폴리펩티드는 G33, G46, G103, G139, G148, G188, G218, G239, G247, G257, G272, G289, G307, G312, G332, G337, G344, G352, 또는 G442 부위 중 하나 이상에 하나 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 #1 PAH 폴리펩티드는 G33A, G46(A,P), G103A, G139(A,P), G148A, G188A, G218A, G239A, G247A, G257A, G272A, G289A, G307A, G312A, G332A, G337A, G344A, G352A, 또는 G442A 아미노산 치환 중 하나 이상을 포함한다.
일부 구현예에서, 변이 PAH 폴리펩티드(예컨대, 변이체 #1 PAH 폴리펩티드)는 P9G, G10V, G12S, K184R, K192R, S196A, Y206H, H220R, Q336E, E360D, I374C, N376E, N401T, I421V, I441V, S446H 아미노산 치환 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이 PAH 폴리펩티드(예컨대, 변이체 #1)는 인간 PAH의 C-말단에 세린 잔기(Ser453)를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 변이 PAH 폴리펩티드(예컨대, 변이체 #1 PAH 폴리펩티드)는 F240W, A246P, G247A, Y268W, C284F, T323R, F327Y, E319P, I306(Y,F), K113P, G188A, F191Y, T193R, Y206H, G337P, N376P 아미노산 치환 중 하나 이상을 포함한다.
일부 구현예에서, 변이 PAH 폴리펩티드(예컨대, 변이체 #1 PAH 폴리펩티드)는 잠재적인 프로테아제 절단 부위를 제거하기 위한 임의의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 잠재적인 프로테아제 절단 부위를 제거하기 위한 아미노산 치환은 PAH 단편 270 내지 295 및 380 내지 405 내에 있다.
일부 구현예에서, 변이 PAH 폴리펩티드(예컨대, 변이체 #1 PAH 폴리펩티드)는 인간 PAH의 안정성을 향상시키기 위한 번역후 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이 PAH 폴리펩티드는 외부 니트로실화제에 의한 Cys 잔기, 특히 I374C의 PEG화 및 니트로실화와 같은 번역후 변형을 포함한다.
III. 핵산
일부 양태에서, 본 발명은 개체에서 발현시 더 높은 PAH 활성 수치를 부여하는 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 제공한다. 일부 구현예에서, 핵산은 야생형 인간 PAH 폴리펩티드의 M180, K199, S250, 및 G256으로부터 선택되는 부위에 적어도 3개의 아미노산 치환을 포함하는 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 핵산은 야생형 인간 PAH 폴리펩티드의 M180, K199, S250, 및 G256 부위에 4개의 아미노산 치환을 포함하는 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 핵산은 M180T, K199P, S250P, 및 G256A로부터 선택되는 적어도 3개의 아미노산 치환을 포함하는 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 핵산은 M180T, K199P, S250P, 및 G256A 아미노산 치환을 포함하는 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 핵산은 K199P, S250P, 및 G256A; M180T, S250P, 및 G256A; M180T, K199P, 및 G256A; 또는 M180T, K199P, 및 S250P를 포함하는 아미노산 치환을 포함하는 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 핵산은 M180T, K199P, S250P, 및 G256A 아미노산 치환을 포함하는 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 핵산은 아미노산 치환인 H264P, G272A, G272P, P275L, P279Q, G272P 및 P275L, 또는 T323R 및 F327T 아미노산 치환을 추가로 포함하는 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 핵산은 표 1 내지 3에 제시된 변이 PAH 폴리펩티드 중 어느 하나인 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 핵산은 M180T, K199P, S250P, 및 G256A 아미노산 치환을 포함하는, 그리고 야생형 PAH의 적어도 대략 페닐알라닌 하이드록실라제 활성을 유지하면서 추가적인 아미노산 치환을 포함하는 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 핵산에 의해 인코딩된 아미노산 치환의 위치는 야생형 인간 PAH 폴리펩티드, 예를 들어 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 인간 PAH 폴리펩티드에 기초한다.
일부 구현예에서, 핵산은 변이 인간 PAH 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 핵산은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 핵산은 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서 핵산은, 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고 야생형 PAH의 페닐알라닌 하이드록실라제 활성의 적어도 약 25%, 50%, 75%, 100%, 또는 100% 초과의 활성을 갖는 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서 핵산은, 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고 서열번호 1의 야생형 PAH의 페닐알라닌 하이드록실라제 활성의 적어도 약 25%, 50%, 75%, 100%, 또는 100% 초과의 활성을 갖는 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩한다.
일부 구현예에서, 핵산은 페닐알라닌 하이드록실라제 활성을 유지하는 절단된 PAH 폴리펩티드인 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 핵산은 N-말단 절단을 포함하는 절단된 PAH 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 핵산은 N-말단 조절 도메인의 일부 또는 전부의 절단인 N-말단 절단을 인코딩한다. 일부 구현예에서, 핵산은 야생형 인간 PAH 폴리펩티드(예컨대, 서열번호 1의 PAH 폴리펩티드)의 아미노산 잔기 1 내지 대략 아미노산 잔기 102의 결실을 포함하는 N-말단 절단을 인코딩한다. 일부 구현예에서, 핵산은 C-말단 절단을 포함하는 절단된 PAH 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 핵산은 사량체화 도메인의 일부 또는 전부의 절단인 C-말단 절단을 인코딩한다. 일부 구현예에서, 핵산은 야생형 인간 PAH 폴리펩티드(예컨대, 서열번호 1의 PAH 폴리펩티드)의 아미노산 잔기 약 429 내지 452의 결실을 포함하는 C-말단 절단을 인코딩한다. 일부 구현예에서, 핵산은 N-말단 절단 및 C-말단 절단을 포함하는 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 절단된 PAH 폴리펩티드는 N-말단 조절 서열의 일부 또는 전부 및 사량체화 도메인의 일부 또는 전부의 절단을 포함한다. 일부 구현예에서, 절단된 PAH 폴리펩티드는 야생형 인간 PAH 폴리펩티드(예컨대, 서열번호 1의 PAH 폴리펩티드)의 아미노산 잔기 1 내지 대략 아미노산 잔기 102 및 약 429 내지 약 452의 결실을 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산은 야생형 PAH 폴리펩티드(예컨대, 서열번호 1의 PAH 폴리펩티드)의 아미노산 잔기 약 102 내지 약 428에 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 핵산은 야생형 PAH 폴리펩티드(예컨대, 서열번호 1의 PAH 폴리펩티드)의 아미노산 잔기 102 내지 428에 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 핵산은 야생형 인간 PAH 폴리펩티드(예컨대, 서열번호 1의 PAH 폴리펩티드)의 M180, K199, S250, 및 G256 부위에 4개의 아미노산 치환을 추가로 포함하는 절단된 PAH 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 핵산은 M180T, K199P, S250P, 및 G256A로부터 선택되는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 절단된 PAH 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 절단된 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산은 표 1 내지 3에 제시된 아미노산 치환의 조합 중 어느 하나를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산은 야생형 PAH(예컨대, 서열번호 1의 PAH 폴리펩티드)의 페닐알라닌 하이드록실라제 활성의 적어도 약 25%, 50%, 75%, 100%, 또는 100% 초과의 활성을 갖는 절단된 PAH 폴리펩티드를 인코딩한다.
일부 구현예에서, 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산은 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 프로모터는 사이토메갈로바이러스(CMV) 조기 발현 프로모터, RSV LTR, MoMLV LTR, 포스포글리세레이트 키나제-1(PGK) 프로모터, 시미안 바이러스 40(SV40) 프로모터, CK6 프로모터, 마우스 트랜스티레틴 프로모터(mTTR), mTTR482 프로모터, mA1MB2-mTTR482 프로모터, TK 프로모터, 테트라사이클린 반응성 프로모터(TRE), HBV 프로모터, hAAT 프로모터, LSP 프로모터, LP1 프로모터, 키메라 간-특이적 프로모터(LSP), E2F 프로모터, 텔로머라제(hTERT) 프로모터, 사이토메갈로바이러스 인핸서/닭 베타-액틴/토끼 β-글로빈 프로모터(CAG) 프로모터, 신장인자 1-알파 프로모터(EF1-알파) 프로모터, 인간 β-글루쿠로니다제 프로모터, 닭 β-액틴(CBA) 프로모터, 레트로바이러스성 라우스 육종 바이러스(RSV) LTR 프로모터, 디하이드로엽산 환원효소 프로모터, 및 13-액틴 프로모터로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 프로모터는 LP1 프로모터 또는 mA1MB2-mTTR482 프로모터이다.
일부 구현예에서, 핵산은 폴리아데닐화 신호를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리아데닐화 신호는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호, SV40 폴리아데닐화 신호, 또는 HSV TK pA이다. 일부 구현예에서, 폴리아데닐화 신호는 문헌[Levitt, N et al. (1989), Genes Develop. 3:1019-1025]에 기재된 바와 같은 합성 폴리아데닐화 신호이다.
일부 구현예에서, 핵산은 인트론을 추가로 포함한다. 본 발명에서 사용하기 위한 다양한 인트론은 당업자에게 알려져 있고, MVM 인트론, F IX 절단 인트론 1, β-글로빈 SD/면역글로빈 중쇄 SA, 아데노바이러스 SD/면역글로빈 SA, SV40 후기 SD/SA(19S/16S), 및 하이브리드 아데노바이러스 SD/IgG SA를 포함한다(Wu et al. 2008, Kurachi et al., 1995, Choi et al. 2014, Wong et al., 1985, Yew et al. 1997, Huang and Gorman (1990)). 일부 구현예에서, 인트론은 닭 β-액틴(CBA)/토끼 β-글로빈 하이브리드 인트론이다. 일부 구현예에서, 인트론은 잘못된 번역 개시 부위를 최소화하기 위해 모든 ATG 부위가 제거된 닭 β-액틴(CBA)/토끼 β-글로빈 하이브리드 프로모터 및 인트론이다(서열번호 15).
일부 구현예에서, 핵산은 (하나 이상의) 스터퍼 핵산을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 스터퍼 핵산은 리포터 폴리펩티드를 인코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 스터퍼 핵산은 핵산 내의 다양한 영역에 위치할 수 있고, 핵산 내의 연속 서열(예를 들어, 단일 위치에서의 단일 스터퍼 핵산) 또는 여러 서열(예를 들어, 둘 이상의 위치(예컨대, 2개의 위치, 3개의 위치 등)에서의 2개 이상의 스터퍼 핵산)로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 스터퍼 핵산은 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열의 하류에 위치할 수 있다. 일부 구현예에서, 스터퍼 핵산은 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열의 상류(예를 들어, 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열과 프로모터 사이)에 위치할 수 있다. 당업자에 의해 또한 이해되는 바와 같이, 다양한 핵산이 스터퍼 핵산으로 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 스터퍼 핵산은 인간 알파-1-항트립신(AAT) 스터퍼 서열 또는 C16 P1 염색체 16 P1 클론(인간 C16) 스터퍼 서열의 전부 또는 일부를 포함한다. 일부 구현예에서, 스터퍼 서열은 유전자의 전부 또는 일부를 포함한다. 예를 들어, 스터퍼 서열은 인간 AAT 서열의 일부를 포함한다. 당업자는 유전자(예컨대, 인간 AAT 서열)의 상이한 부분이 스터퍼 단편으로 사용될 수 있음을 인식할 것이다. 예를 들어, 스터퍼 단편은 유전자의 5' 말단, 유전자의 3' 말단, 유전자의 중간, 유전자의 비코딩 부분(예컨대, 인트론), 유전자의 코딩 영역(예컨대, 엑손), 또는 유전자의 비코딩 및 코딩 부분의 혼합물로부터 유래될 수 있다. 또한, 당업자는 스터퍼 서열의 전부 또는 일부가 스터퍼 서열로 사용될 수 있음을 인식할 것이다. 일부 구현예에서, 스터퍼 서열은 내부 ATG 코돈을 제거하도록 변형된다. 일부 구현예에서, 스터퍼 서열은 서열번호 16의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 인간 PAH 폴리펩티드를 인코딩하는 단리된 핵산은 코돈 최적화된다. 일부 구현예에서, 인간 PAH 폴리펩티드를 인코딩하는 단리된 핵산은 진핵세포와 같은 특정 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된다. 진핵세포는 인간, 마우스, 랫트, 토끼, 개, 또는 비인간 영장류를 비제한적으로 포함하는 포유류와 같은 특정 유기체의 세포이거나 이러한 유기체로부터 유래된 세포일 수 있다. 일반적으로, 코돈 최적화는 천연 아미노산 서열을 유지하면서 천연 서열의 적어도 하나의 코돈을, 관심 숙주 세포의 유전자에서 보다 빈번하게 또는 가장 빈번하게 사용되는 코돈으로 대체함으로써 관심 숙주 세포에서의 발현을 향상시키기 위해 핵산 서열을 변형시키는 과정을 지칭한다. 다양한 종이 특정 아미노산의 소정 코돈에 대해 특정 편향을 나타낸다. 코돈 사용표는 예를 들어 "코돈 사용 데이터베이스"에서 용이하게 입수할 수 있으며, 이들 표는 여러 가지 방식으로 조정될 수 있다(예를 들어, 문헌[Nakamura, Y. et al. (2000) Nucleic Acids Res. 28:292] 참조). 특정 숙주 세포에서의 발현을 위해 특정 서열을 코돈 최적화하기 위한 컴퓨터 알고리즘, 예컨대 Gene Forge(Aptagen; Jacobus, Pa.), DNA2.0, GeneArt(GA) 또는 Genscript(GS), 및 CpG 함량의 감소와 결합된 GS 알고리즘도 이용 가능하다. 일부 구현예에서, PAH 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산은 GA 알고리즘을 사용하여 코돈 최적화된다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 서열번호 14의 핵산 서열과 적어도 80% 동일하다. 일부 구현예에서, 핵산은 서열번호 14의 핵산 서열을 포함한다.
IV. 간 특이적 발현 카세트
일부 양태에서, 본 발명은 간세포에서 이식유전자를 발현하기 위한 발현 카세트로서, 프로모터 및 인핸서에 작동 가능하게 연결된 이식유전자를 포함하되, 상기 프로모터는 마우스 트랜스티레틴(mTTR) 프로모터를 포함하고, 상기 인핸서는 1개 또는 2개의 변형된 프로트롬빈 인핸서(mPrT2), 1개 또는 2개의 변형된 알파 1-마이크로비쿠닌 인핸서(mA1MB2), 변형된 마우스 알부민 인핸서(mEalb), B형 간염 바이러스 인핸서 II(HE11), 또는 CRM8 인핸서를 포함하는, 발현 카세트를 제공한다. 일부 구현예에서, mTTR 프로모터는 mTTR482 프로모터이다. 일부 구현예에서, 인핸서는 mTTR 프로모터에 대해 5'에 있다. 일부 구현예에서, 이식유전자는 본원에 기재된 바와 같은 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 간세포에서 이식유전자를 발현하기 위한 발현 카세트로서, 프로모터 및 3' 요소에 작동 가능하게 연결된 이식유전자를 포함하되, 상기 프로모터는 마우스 트랜스티레틴(mTTR) 프로모터를 포함하고, 상기 3' 요소는 알부민 3' 요소(3' Alb)이거나 인간 알파 1 항트립신 스캐폴드/매트릭스 부착 영역(SMAR)에 연결된 알부민 3' 요소(3' AlbSMAR)인, 발현 카세트를 제공한다. 일부 구현예에서, mTTR 프로모터는 mTTR482 프로모터이다. 일부 구현예에서, 3' 요소는 이식유전자에 대해 3'에 위치한다. 일부 구현예에서, 이식유전자는 본원에 기재된 바와 같은 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 간세포에서 이식유전자를 발현하기 위한 발현 카세트로서, 프로모터 및 인핸서 및 3' 요소에 작동 가능하게 연결된 이식유전자를 포함하되, 상기 프로모터는 마우스 트랜스티레틴(mTTR) 프로모터를 포함하고, 상기 인핸서는 1개 또는 2개의 변형된 프로트롬빈 인핸서(mPrT2), 1개 또는 2개의 변형된 알파 1-마이크로비쿠닌 인핸서(mA1MB2), 변형된 마우스 알부민 인핸서(mEalb), B형 간염 바이러스 인핸서 II(HE11), 또는 CRM8 인핸서를 포함하고, 상기 3' 요소는 알부민 3' 요소(3' Alb)이거나 인간 알파 1 항트립신 스캐폴드/매트릭스 부착 영역(SMAR)에 연결된 알부민 3' 요소(3' AlbSMAR)인, 발현 카세트를 제공한다. 일부 구현예에서, mTTR 프로모터는 mTTR482 프로모터이다. 일부 구현예에서, 인핸서는 mTTR 프로모터에 대해 5'에 있다. 일부 구현예에서, 3' 요소는 이식유전자에 대해 3'에 위치한다. 일부 구현예에서, 이식유전자는 본원에 기재된 바와 같은 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩한다.
일부 구현예에서, 발현 카세트는 인트론을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 인트론은 MVM 인트론, F IX 절단 인트론 1, β-글로빈 SD/면역글로빈 중쇄 SA, 아데노바이러스 SD/면역글로빈 SA, SV40 후기 SD/SA(19S/16S), 또는 하이브리드 아데노바이러스 SD/IgG SA이다. 일부 구현예에서, 인트론은 닭 β-액틴(CBA)/토끼 β-글로빈 하이브리드 인트론이다.
일부 구현예에서, 발현 카세트는 폴리아데닐화 신호를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리아데닐화 신호는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호, SV40 폴리아데닐화 신호, 또는 HSV TK pA이다.
일부 구현예에서, 발현 카세트는 벡터에 통합된다. 일부 구현예에서, 발현 카세트는 바이러스 벡터에 통합된다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 본원에 기재된 바와 같은 rAAV 벡터이다.
V. 벡터 및 바이러스 입자
특정 양태에서, 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산은 벡터에 포함된다. 일부 구현예에서, 본 발명은 바이러스 입자, 예를 들어 하기의 바이러스 입자에 패키징하기 위해 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 도입하기 위한 재조합 바이러스 게놈의 사용을 고려한다. 재조합 바이러스 게놈은 변이 PAH 폴리펩티드의 발현을 확립하기 위한 임의의 요소, 예를 들어 프로모터, ITR, 리보솜 결합 요소, 종결인자, 인핸서, 선별 마커, 인트론, 폴리A 신호, 및/또는 복제 원점을 포함할 수 있다. 예시적인 바이러스 게놈 요소 및 바이러스 입자 전달 방법은 아래에 더 상세히 설명되어 있다.
비바이러스 전달 시스템
핵산을 세포 또는 표적 조직에 도입하기 위해 종래의 비바이러스 유전자 전달 방법이 사용될 수도 있다. 비바이러스 벡터 전달 시스템은 DNA 플라스미드, 조작되지 않은 핵산, 및 전달 시스템에 복합된 핵산을 포함한다. 예를 들어, 벡터는 지질(예컨대, 양이온성 또는 중성 지질), 리포솜, 다가양이온, 나노입자, 또는 핵산의 세포내 흡수 향상제와 복합체를 형성할 수 있다. 벡터는 본원에 기재된 임의의 전달 방법에 적합한 제제와 복합체를 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산은 하나 이상의 바이러스 ITR(예컨대, AAV ITR)을 포함한다.
바이러스 입자
일부 구현예에서, 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터는 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 벡터, 재조합 아데노바이러스 벡터, 재조합 렌티바이러스 벡터, 또는 재조합 단순 헤르페스 바이러스(HSV) 벡터이다.
rAAV 입자
일부 구현예에서, 벡터는 재조합 AAV(rAAV) 벡터이다. 일부 구현예에서, 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산은 하나 이상의 AAV 역위 말단 반복(ITR) 서열에 의해 플랭킹된다. 일부 구현예에서, 바이러스 입자는 1개 또는 2개의 ITR에 의해 플랭킹된 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 핵산 포함 재조합 AAV 입자이다. 일부 구현예에서, 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산은 2개의 AAV ITR에 의해 플랭킹된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산은 전사 방향으로 작동 가능하게 연결된 성분, 전사 개시 서열 및 종결 서열을 포함하는 조절 서열에 의해 발현 카세트를 형성한다. 발현 카세트는 5' 및 3' 말단에서 적어도 하나의 기능적 AAV ITR 서열에 의해 플랭킹된다. "기능적 AAV ITR 서열"은 ITR 서열이 AAV 비리온의 회수, 복제, 및 패키징을 위해 의도된 바와 같이 기능함을 의미한다. 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌[Davidson et al., PNAS, 2000, 97(7)3428-32; Passini et al., J. Virol., 2003, 77(12):7034-40; 및 Pechan et al., Gene Ther., 2009, 16:10-16] 참조. 본 발명의 일부 양태를 실시하기 위해, 재조합 벡터는 rAAV에 의한 감염을 위한 물리적 구조 및 캡시드화에 필수적인 AAV의 적어도 모든 서열을 포함한다. 본 발명의 벡터에 사용하기 위한 AAV ITR은 야생형 뉴클레오티드 서열을 가질 필요가 없고(예를 들어, 문헌[Kotin, Hum. Gene Ther., 1994, 5:793-801] 참조), 뉴클레오티드의 삽입, 결실, 또는 치환에 의해 변경될 수 있거나 여러 AAV 혈청형 중 임의의 혈청형으로부터 유래될 수 있다. 현재 40개가 넘는 AAV 혈청형이 알려져 있고, 새로운 혈청형 및 기존 혈청형의 변종이 계속 확인되고 있다. 문헌[Gao et al., PNAS, 2002, 99(18): 11854-6; Gao et al., PNAS, 2003, 100(10):6081-6; 및 Bossis et al., J. Virol., 2003, 77(12):6799-810] 참조.
임의의 AAV 혈청형의 사용은 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 간주된다. 일부 구현예에서, rAAV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, 염소 AAV, 소 AAV, 또는 마우스 AAV ITR 등의 AAV ITR을 제한없이 포함하는 AAV 혈청형으로부터 유래된 벡터이다. 일부 구현예에서, AAV의 핵산은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, 염소 AAV, 소 AAV, 또는 마우스 AAV 등의 AAV ITR의 ITR을 포함한다. 특정 구현예에서, AAV ITR은 AAV2 ITR이다.
일부 구현예에서, 벡터는 스터퍼 핵산을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 스터퍼 핵산은 녹색 형광 단백질을 인코딩할 수 있다. 일부 구현예에서, 스터퍼 핵산은 본 발명의 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산에 대해 3'에 위치할 수 있다.
일부 양태에서, 본 발명은 재조합 자기-상보성 게놈을 포함하는 바이러스 입자를 제공한다. 일부 구현예에서, 벡터는 자기-상보성 벡터이다. 자기-상보성 게놈을 갖는 AAV 바이러스 입자 및 자기-상보성 AAV 게놈의 사용 방법은 미국 특허 6,596,535호; 7,125,717호; 7,765,583호; 7,785,888호; 7,790,154호; 7,846,729호; 8,093,054호; 및 8,361,457호; 및 문헌[Wang Z., et al., (2003) Gene Ther 10:2105-2111]에 기재되어 있으며, 이들 각각의 전문은 본원에 참조로 포함된다. 자기-상보성 게놈을 포함하는 rAAV는 이의 부분적 상보성 서열(예컨대, 이식유전자의 상보성 코딩 및 비코딩 가닥)로 인해 이중가닥 DNA 분자를 빠르게 형성할 것이다. 일부 구현예에서, 본 발명은 AAV 게놈을 포함하는 AAV 바이러스 입자를 제공하며, 여기서 rAAV 게놈은 제1 이종 폴리뉴클레오티드 서열(예컨대, 본 발명의 변이 PAH 폴리펩티드의 코딩 가닥) 및 제2 이종 폴리뉴클레오티드 서열(예컨대, 본 발명의 변이 PAH 폴리펩티드의 비코딩 또는 안티센스 가닥)을 포함하고, 제1 이종 폴리뉴클레오티드 서열은 길이의 대부분 또는 전부를 따라 제2 폴리뉴클레오티드 서열과 가닥내 염기쌍을 형성할 수 있다.
일부 구현예에서, 제1 이종 폴리뉴클레오티드 서열과 제2 이종 폴리뉴클레오티드 서열은 가닥내 염기쌍 형성, 예컨대, 헤어핀 DNA 구조를 용이하게 하는 서열에 의해 연결된다. 예를 들어 siRNA 분자에서, 헤어핀 구조는 당업계에 알려져 있다. 일부 구현예에서, 제1 이종 폴리뉴클레오티드 서열과 제2 이종 폴리뉴클레오티드 서열은 돌연변이 ITR(예컨대, 우측 ITR)에 의해 연결된다. 돌연변이 ITR은 말단 분해 서열을 포함하는 D 영역의 결실을 포함한다. 결과적으로, AAV 바이러스 게놈의 복제시, rep 단백질은 돌연변이 ITR에서 바이러스 게놈을 절단하지 못할 것이고, 따라서, 5'에서 3'의 순서로 다음을 포함하는 재조합 바이러스 게놈이 바이러스 캡시드에 패키징될 것이다: AAV ITR, 조절 서열을 포함하는 제1 이종 폴리뉴클레오티드 서열, 돌연변이 AAV ITR, 제1 이종 폴리뉴클레오티드에 대해 역방향의 제2 이종 폴리뉴클레오티드, 및 제3 AAV ITR.
일부 구현예에서, 제1 이종 핵산 서열과 제2 이종 핵산 서열은 돌연변이 ITR(예컨대, 우측 ITR)에 의해 연결된다. 일부 구현예에서, ITR은 폴리뉴클레오티드 서열 5'-CACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCG-3'(서열번호 17)을 포함한다. 돌연변이 ITR은 말단 분해 서열을 포함하는 D 영역의 결실을 포함한다. 결과적으로, AAV 바이러스 게놈의 복제시, rep 단백질은 돌연변이 ITR에서 바이러스 게놈을 절단하지 못할 것이고, 따라서, 5'에서 3'의 순서로 다음을 포함하는 재조합 바이러스 게놈이 바이러스 캡시드에 패키징될 것이다: AAV ITR, 조절 서열을 포함하는 제1 이종 폴리뉴클레오티드 서열, 돌연변이 AAV ITR, 제1 이종 폴리뉴클레오티드에 대해 역방향의 제2 이종 폴리뉴클레오티드, 및 제3 AAV ITR.
일부 구현예에서, 벡터는 바이러스 입자 내에 캡시드화된다. 일부 구현예에서, 바이러스 입자는 재조합 AAV 벡터를 포함하는 재조합 AAV 바이러스 입자이다. 특정 표적 세포의 형질도입을 최적화하거나 특정 표적 조직(예컨대, 안구 조직) 내의 특정 세포 유형을 표적화하기 위해 다양한 AAV 혈청형이 사용된다. rAAV 입자는 동일 혈청형 또는 혼합 혈청형의 바이러스 단백질 및 바이러스 핵산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, rAAV 입자는 본 발명의 AAV2 캡시드 단백질 및 적어도 하나의 AAV2 ITR을 포함하거나 AAV2 캡시드 단백질 및 적어도 하나의 AAV1 ITR을 포함할 수 있다. rAAV 입자의 생성을 위한 AAV 혈청형의 임의의 조합은 각 조합이 본원에 명시적으로 언급된 것처럼 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 AAV2 캡시드를 포함하는 rAAV 입자를 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 AAVrh8R 캡시드를 포함하는 rAAV 입자를 제공한다.
일부 구현예에서, rAAV 입자는 AAV1 캡시드, AAV2 캡시드, AAV3 캡시드, AAV4 캡시드, AAV5 캡시드, AAV6 캡시드(예를 들어, 미국 등록전 공개 2012/0164106에 기재된 바와 같은, 야생형 AAV6 캡시드, 또는 변이 AAV6 캡시드, 예컨대 ShH10), AAV7 캡시드, AAV8 캡시드, AAVrh8 캡시드, AAVrh8R 캡시드, AAV9 캡시드(예를 들어, 미국 등록전 공개 2013/0323226에 기재된 바와 같은 야생형 AAV9 캡시드, 또는 변형된 AAV9 캡시드), AAV10 캡시드, AAVrh10 캡시드, AAV11 캡시드, AAV12 캡시드, 티로신 캡시드 돌연변이체, 헤파린 결합 캡시드 돌연변이체, AAV2R471A 캡시드, AAVAAV2/2-7m8 캡시드, AAV DJ 캡시드(예를 들어, 미국 등록전 공개 2012/0066783에 기재된 AAV-DJ/8 캡시드, AAV-DJ/9 캡시드, 또는 임의의 다른 캡시드), AAV2 N587A 캡시드, AAV2 E548A 캡시드, AAV2 N708A 캡시드, AAV V708K 캡시드, 염소 AAV 캡시드, AAV1/AAV2 키메라 캡시드, 소 AAV 캡시드, 마우스 AAV 캡시드, rAAV2/HBoV1 캡시드, 또는 미국 특허 8,283,151호 또는 국제 공개 WO/2003/042397호에 기재된 AAV 캡시드를 포함한다. 일부 구현예에서, 돌연변이 캡시드 단백질은 AAV 캡시드를 형성하는 능력을 유지한다. 일부 구현예에서, rAAV 입자는 AAV5 티로신 돌연변이 캡시드를 포함한다(Zhong L. et al., (2008) Proc Natl Acad Sci USA 105(22):7827-7832). 추가 구현예에서, rAAV 입자는 계통군 A 내지 F로부터의 AAV 혈청형의 캡시드 단백질을 포함한다(Gao, et al., J. Virol. 2004, 78(12):6381). 일부 구현예에서, rAAV 입자는 AAV1 캡시드 단백질 또는 이의 돌연변이체를 포함한다. 다른 구현예에서, rAAV 입자는 AAV2 캡시드 단백질 또는 이의 돌연변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 혈청형은 AAV1, AAV2, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, 또는 AAVrh10이다. 일부 구현예에서, rAAV 입자는 AAV 혈청형 1(AAV1) 캡시드를 포함한다. 일부 구현예에서, rAAV 입자는 AAV 혈청형 2(AAV2) 캡시드를 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 AAV 바이러스 입자는 AAV1, AAV2, AAV8, AAVrh8R, AAV9, 및/또는 AAVrh10 캡시드를 포함한다. 일부 구현예에서, AAV1, AAV2, AAV8, AAVrh8R, AAV9, 및/또는 AAVrh10 캡시드는, 예를 들어 하기 기재된 바와 같은 티로신 돌연변이 또는 헤파란 결합 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 캡시드는 간 표적화 캡시드이다(예를 들어, LK03 캡시드, HSC15 캡시드, 또는 17 캡시드, 단 이에 한정되지 않음). 일부 구현예에서, 캡시드는 조작된 AAV 캡시드(예를 들어, 셔플링된 캡시드)이다. 조작된 AAV 캡시드의 예는 DJ(Grimm D et al., J Virol. 2008, 82:5887-911), LK03(Lisowski L et al., Nature, 2014, 506:382-6), 및 HSC15 및 HSC17(Smith LJ et al., Mol Ther, 2014 Sep;22(9):1625-34)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
AAV의 캡시드(예컨대, AAV2, AAV8 등)는 3개의 캡시드 단백질, 즉 VP1, VP2, 및 VP3을 포함하는 것으로 알려져 있다. 이러한 단백질은 유의한 양의 중첩 아미노산 서열 및 고유의 N-말단 서열을 포함한다. AAV2 캡시드는 정이십면체 대칭에 의해 배열된 60개의 서브유닛을 포함한다(Xie, Q., et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99(16):10405-10). VP1, VP2, 및 VP3은 1:1:10의 비로 존재하는 것으로 밝혀졌다.
일부 구현예에서, rAAV 입자는 a) 헤파란 설페이트 프로테오글리칸과 상호작용하는 하나 이상의 위치에 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 rAAV 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 캡시드, 및 b) 이종 핵산과 적어도 하나의 AAV 역위 말단 반복을 포함하는 rAAV 벡터를 포함한다.
일부 구현예에서, rAAV 입자는 헤파란 설페이트 프로테오글리칸에 대한 rAAV 입자의 결합을 감소시키거나 제거하는 캡시드 단백질의 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하고/하거나, 하나 이상의 아미노산 치환은 AAV2의 VP1 넘버링에 기초하여 넘버링된 484, 487, 532, 585, 또는 588번 위치에 존재한다. 본원에 사용된 바와 같이, "AAV2의 VP1에 기초한 넘버링"은 AAV2의 VP1의 언급된 아미노산에 상응하는 언급된 캡시드 단백질의 아미노산을 지칭한다. 예를 들어, 하나 이상의 아미노산 치환이 AAV2의 VP1에 기초하여 넘버링된 347, 350, 390, 395, 448, 451, 484, 487, 527, 532, 585, 및/또는 588번 위치에 존재하는 경우, 하나 이상의 아미노산 치환은 AAV2의 VP1의 347, 350, 390, 395, 448, 451, 484, 487, 527, 532, 585, 및/또는 588번 아미노산에 상응하는 언급된 캡시드 단백질의 아미노산(들)에 존재한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 AAV2의 VP1의 484, 487, 532, 585, 또는 588번 위치에 존재한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 AAV2의 VP1에 기초하여 넘버링된, AAV3의 VP1의 484, 487, 532, 585, 또는 588번 위치에 존재한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 AAVrh8R의 VP1 넘버링에 기초하여 넘버링된 485, 488, 528, 533, 586, 또는 589번 위치에 존재한다. 일부 구현예에서, 585 및/또는 588번(AAV2의 VP1에 기초한 넘버링) 아미노산에 상응하는 위치(들)의 하나 이상의 아미노산은 아르기닌 잔기(예를 들어, AAV1 또는 AAV6의 경우 S586 및/또는 T589; AAV9의 경우 S586 및/또는 A589; AAVrh8R의 경우 A586 및/또는 T589; AAV8의 경우 Q588 및/또는 T591; 및 AAVrh10의 경우 Q588 및/또는 A591)로 대체된다. 다른 구현예에서, 484, 487, 527, 및/또는 532번(AAV2의 VP1에 기초한 넘버링) 아미노산에 상응하는 위치(들)의 하나 이상의 아미노산(예컨대, 아르기닌 또는 라이신)은 양전하를 띠지 않은 아미노산(들), 예컨대 알라닌(예를 들어, AAV1 또는 AAV6의 경우 R485, R488, K528, 및/또는 K533; AAV9 또는 AAVrh8R의 경우 R485, R488, K528, 및/또는 R533; 및 AAV8 또는 AAVrh10의 경우 R487, R490, K530, 및/또는 R535)으로 대체된다.
AAV 입자의 생성
형질감염, 안정적인 세포주 생성, 및 아데노바이러스-AAV 하이브리드, 헤르페스바이러스-AAV 하이브리드(Conway, JE et al., (1997) J. Virology 71(11):8780-8789), 및 배큘로바이러스-AAV 하이브리드(Urabe, M. et al., (2002) Human Gene Therapy 13(16):1935-1943; Kotin, R. (2011) Hum Mol Genet. 20(R1): R2-R6)를 포함한 감염성 하이브리드 바이러스 생성 시스템을 비롯해, rAAV 벡터 생성을 위한 다수의 방법이 당업계에 알려져 있다. rAAV 바이러스 입자 생성을 위한 rAAV 생성 배양은 1) 적합한 숙주 세포, 2) 적합한 헬퍼 바이러스 기능, 3) AAV rep 및 cap 유전자 및 유전자 산물, 4) 적어도 하나의 AAV ITR 서열(예를 들어, 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩하는 AAV 게놈)에 의해 플랭킹된 핵산(예컨대, 치료 핵산), 및 5) rAAV 생성을 유지시키기에 적합한 배지 및 배지 성분을 모두 필요로 한다. 일부 구현예에서, 적합한 숙주 세포는 영장류 숙주 세포이다. 일부 구현예에서, 적합한 숙주 세포는 인간 유래 세포주, 예컨대 HeLa, A549, 293, 또는 Perc.6 세포이다. 일부 구현예에서, 적합한 헬퍼 바이러스 기능은 야생형 또는 돌연변이 아데노바이러스(예컨대, 감온성 아데노바이러스), 헤르페스 바이러스(HSV), 배큘로바이러스, 또는 헬퍼 기능을 제공하는 플라스미드 작제물에 의해 제공된다. 일부 구현예에서, AAV rep 및 cap 유전자 산물은 임의의 AAV 혈청형으로부터 유래될 수 있다. 절대적이진 않지만, 일반적으로 AAV rep 유전자 산물은 rep 유전자 산물이 rAAV 게놈의 복제 및 패키징 기능을 할 수 있는 한, rAAV 벡터 게놈의 ITR과 동일한 혈청형을 갖는다. 당업계에 알려진 적합한 배지를 rAAV 벡터의 생성에 사용할 수 있다. 이러한 배지는 변형된 이글 배지(Modified Eagle Medium, MEM), 둘베코의 변형된 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium, DMEM), 미국 특허 6,566,118호에 기재된 것과 같은 주문제조형 제제, 및 미국 특허 6,723,551호에 기재된 것과 같은 Sf-900 II SFM 배지를 비롯해, Hyclone Laboratories 및 JRH에서 제조된 배지를 제한없이 포함한다(각각의 특허는, 특히 재조합 AAV 벡터의 생성에 사용하기 위한 주문제조형 배지 제제와 관련하여, 전문이 본원에 참조로 포함됨). 일부 구현예에서, AAV 헬퍼 기능은 아데노바이러스 또는 HSV에 의해 제공된다. 일부 구현예에서, AAV 헬퍼 기능은 배큘로바이러스에 의해 제공되며, 숙주 세포는 곤충 세포(예를 들어, Spodoptera frugiperda(Sf9) 세포)이다.
rAAV 입자를 생성하는 한 가지 방법은 삼중 형질감염 방법이다. 간략히 말하면, 헬퍼 아데노바이러스 플라스미드와 함께, rep 유전자 및 캡시드 유전자를 포함하는 플라스미드가 (예를 들어, 인산칼슘 방법을 사용하여) 세포주(예를 들어, HEK-293 세포)에 형질감염될 수 있고, 바이러스가 수집되고 필요에 따라 정제될 수 있다. 이와 같이, 일부 구현예에서, rAAV 입자는 rAAV 벡터를 인코딩하는 핵산, AAV rep 및 cap을 인코딩하는 핵산, 및 AAV 헬퍼 바이러스 기능을 인코딩하는 핵산을 숙주 세포에 삼중 형질감염시켜 생성되었으며, 핵산을 숙주 세포에 형질감염시키면 rAAV 입자를 생성할 수 있는 숙주 세포가 생성된다.
일부 구현예에서, rAAV 입자는 생산자 세포주(producer cell line) 방법에 의해 생성될 수 있다(문헌[Martin et al., (2013) Human Gene Therapy Methods 24:253-269; 미국 등록전 공개 US2004/0224411호; 및 Liu, X.L. et al. (1999) Gene Ther. 6:293-299] 참조). 간략히 말하면, 세포주(예를 들어, HeLa, 293, A549, 또는 Perc.6 세포주)는 rep 유전자, 캡시드 유전자, 및 프로모터-이종 핵산 서열(예를 들어, 변이 PAH 폴리펩티드)을 포함하는 벡터 게놈을 포함하는 플라스미드를 사용하여 안정적으로 형질감염될 수 있다. 세포주는 rAAV 생성을 위한 선도 클론을 선택하기 위해 스크리닝될 수 있고, 이어서 생산 생물반응기로 확장되고 헬퍼 바이러스(예를 들어, 아데노바이러스 또는 HSV)로 감염되어 rAAV 생성을 개시할 수 있다. 이후, 바이러스가 수거될 수 있고, 아데노바이러스가 비활성화(예를 들어, 열에 의해 비활성화)되고/되거나 제거될 수 있고, rAAV 입자가 정제될 수 있다. 이와 같이, 일부 구현예에서, rAAV 벡터를 인코딩하는 핵산, AAV rep 및 cap을 인코딩하는 핵산, 및 AAV 헬퍼 바이러스 기능을 인코딩하는 핵산 중 하나 이상을 포함하는 생산자 세포주에 의해 rAAV 입자를 생성하였다. 본원에 기재된 바와 같이, 생산자 세포주 방법은 삼중 형질감염 방법에 비해 거대 게놈을 갖는 rAAV 입자를 생성하는 데 유리할 수 있다.
일부 구현예에서, AAV rep 및 cap 유전자를 인코딩하는 핵산 및/또는 rAAV 게놈은 생산자 세포주에서 안정적으로 유지된다. 일부 구현예에서, AAV rep 및 cap 유전자를 인코딩하는 핵산 및/또는 rAAV 게놈은 하나 이상의 플라스미드 상에서 세포주에 도입되어 생산자 세포주를 생성한다. 일부 구현예에서, AAV rep, AAV cap, 및 rAAV 게놈은 동일한 플라스미드 상에서 세포에 도입된다. 다른 구현예에서, AAV rep, AAV cap, 및 rAAV 게놈은 상이한 플라스미드 상에서 세포에 도입된다. 일부 구현예에서, 플라스미드를 사용하여 안정적으로 형질감염된 세포주는 세포주의 다회 계대(예를 들어, 세포의 5, 10, 20, 30, 40, 50회, 또는 50회 초과 계대)를 위해 플라스미드를 유지한다. 예를 들어, 플라스미드(들)는 세포가 복제함에 따라 복제될 수 있거나, 플라스미드(들)는 세포 게놈에 통합될 수 있다. 플라스미드가 세포(예를 들어, 인간 세포)에서 독자적으로 복제할 수 있도록 하는 다양한 서열이 확인된 바 있다(예를 들어, 문헌[Krysan, P.J. et al. (1989) Mol. Cell Biol. 9:1026-1033] 참조). 일부 구현예에서, 플라스미드(들)는 플라스미드를 유지하는 세포의 선택을 가능하게 하는 선별 마커(예컨대, 항생제 내성 마커)를 포함할 수 있다. 포유류 세포에서 일반적으로 사용되는 선별 마커는 블라스티시딘, G418, 하이그로마이신 B, 제오신, 퓨로마이신, 및 이들의 유도체를 제한없이 포함한다. 세포에 핵산을 도입하는 방법은 당업계에 알려져 있으며, 바이러스 형질도입, 양이온성 형질감염(예를 들어, DEAE-덱스트란과 같은 양이온성 중합체, 또는 리포펙타민과 같은 양이온성 지질을 사용), 인산칼슘 형질감염, 미량주사, 입자 폭격, 전기천공, 및 나노입자 형질감염을 제한없이 포함한다(더 자세한 내용은, 예를 들어 문헌[Kim, T.K. and Eberwine, J.H. (2010) Anal. Bioanal. Chem. 397:3173-3178] 참조).
일부 구현예에서, AAV rep 및 cap 유전자를 인코딩하는 핵산 및/또는 rAAV 게놈은 생산자 세포주의 게놈에 안정적으로 통합된다. 일부 구현예에서, AAV rep 및 cap 유전자를 인코딩하는 핵산 및/또는 rAAV 게놈은 하나 이상의 플라스미드 상에서 세포주에 도입되어 생산자 세포주를 생성한다. 일부 구현예에서, AAV rep, AAV cap, 및 rAAV 게놈은 동일한 플라스미드 상에서 세포에 도입된다. 다른 구현예에서, AAV rep, AAV cap, 및 rAAV 게놈은 상이한 플라스미드 상에서 세포에 도입된다. 일부 구현예에서, 플라스미드(들)는 플라스미드를 유지하는 세포의 선택을 가능하게 하는 선별 마커(예컨대, 항생제 내성 마커)를 포함할 수 있다. 핵산을 다양한 숙주 세포에 안정적으로 통합하는 방법은 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, 선별 마커(및 AAV cap 및 rep 유전자 및/또는 rAAV 게놈)를 포함하는 핵산이 통합된 세포를 선택하기 위해 (예를 들어, 선별 마커의 사용을 통한) 반복 선택이 사용될 수 있다. 다른 구현예에서, 핵산은 부위-특이적 방식으로 세포주에 통합되어 생산자 세포주를 생성할 수 있다. FLP/FRT(예를 들어, O’Gorman, S. et al. (1991) Science 251:1351-1355 참조), Cre/loxP(예를 들어, Sauer, B. and Henderson, N. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5166-5170 참조), 및 phi C31-att(예를 들어, Groth, A.C. et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. 97:5995-6000 참조)와 같은 여러 부위-특이적 재조합 시스템이 당업계에 알려져 있다.
일부 구현예에서, 생산자 세포주는 영장류 세포주(예를 들어, Vero 또는 FRhL-2 세포주와 같은 비인간 영장류 세포주)로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 세포주는 인간 세포주로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 생산자 세포주는 HeLa, 293, A549, 또는 PERC.6®(Crucell) 세포로부터 유래된다. 예를 들어, 생산자 세포주를 생성하기 위해 AAV rep 및 cap 유전자를 인코딩하는 핵산 및/또는 거대 rAAV 게놈을 세포주에 도입하고/하거나 안정적으로 유지/통합하기 전에, 세포주는 HeLa, 293, A549, 또는 PERC.6®(Crucell) 세포주, 또는 이들의 유도체이다.
일부 구현예에서, 생산자 세포주는 현탁액에서의 성장에 적합하다. 당업계에 알려진 바와 같이, 부착-의존적 세포는 일반적으로 마이크로캐리어 비드와 같은 기질 없이는 현탁액에서 성장할 수 없다. 세포주가 현탁액에서 성장하도록 설계하는 것은, 예를 들어 교반 패들을 갖춘 회전 배양에서의 세포주 성장, 응집을 방지하기 위해 칼슘 및 마그네슘 이온이 없는 배양 배지(및 필요에 따라 소포제)의 사용, 실리콘화 화합물로 코팅된 배양 용기의 사용, 및 각 계대에서 (큰 덩어리나 용기 측면이 아닌) 배양물에서의 세포 선택을 포함할 수 있다. 추가적인 설명에 대해서는, 예를 들어 ATCC 자주 묻는 질문 문서(www.atcc.org/Global/FAQs/9/1/Adapting%20a%20monolayer%20cell%20line%20to%20suspension-40.aspx 에서 이용 가능) 및 거기에 인용된 참고문헌을 참조.
일부 양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 임의의 rAAV 입자를 생성하는 방법으로서, (a) (i) 하나 이상의 AAV 패키징 유전자(상기 AAV 패키징 유전자 각각은 AAV 복제 및/또는 캡시드화 단백질을 인코딩함), (ii) 적어도 하나의 AAV ITR에 의해 플랭킹된 본원에 기재된 바와 같은 이종 핵산을 인코딩하는 핵산을 포함하는 rAAV 프로-벡터, 및 (iii) AAV 헬퍼 기능을 포함하는 숙주 세포를, rAAV 입자가 생성되는 조건에서 배양하는 단계; 및 (b) 숙주 세포에 의해 생성된 rAAV 입자를 회수하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 상기 적어도 하나의 AAV ITR은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, 염소 AAV, 소 AAV, 또는 마우스 AAV 혈청형 ITR 등으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, AAV 혈청형은 AAV1, AAV2, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, 또는 AAVrh10이다. 특정 구현예에서, AAV의 핵산은 AAV2 ITR을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 캡시드화 단백질은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV2/2-7m8, AAV DJ, AAV2 N587A, AAV2 E548A, AAV2 N708A, AAV V708K, 염소 AAV, AAV1/AAV2 키메라, 소 AAV, 또는 마우스 AAV 캡시드 rAAV2/HBoV1 혈청형 캡시드 단백질 또는 이의 돌연변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 캡시드화 단백질은 AAV8 캡시드 단백질이다. 일부 구현예에서, rAAV 입자는 AAV2 ITR, 및 치료 이식유전자/핵산을 인코딩하는 핵산(예를 들어, 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산)을 포함하는 재조합 게놈 및 AAV8 캡시드를 포함한다.
본 발명의 적합한 rAAV 생성 배양 배지는 0.5% 내지 20%(v/v 또는 w/v) 수준의 혈청 또는 혈청-유래 재조합 단백질로 보충될 수 있다. 대안적으로, 당업계에 알려진 바와 같이, rAAV 벡터는 동물-유래 생성물이 없는 배지로 언급될 수도 있는 무혈청 조건에서 생성될 수 있다. 당업자는 생성 배양물에서 rAAV의 역가를 높이기 위해, rAAV 벡터의 생성을 유지하도록 설계된 상용 또는 주문제조형 배지에, 포도당, 비타민, 아미노산, 및/또는 성장인자를 제한없이 포함하는 당업계에 알려진 하나 이상의 세포 배양 성분을 보충할 수 있음을 이해할 수 있다.
rAAV 생성 배양물은 이용되는 특정 숙주 세포에 적합한 다양한 조건(넓은 온도 범위, 다양한 기간 등)에서 성장될 수 있다. 당업계에 알려진 바와 같이, rAAV 생성 배양물은 적합한 부착-의존성 용기, 예를 들어, 회전병, 중공 섬유 필터, 미세담체, 및 패킹된 베드(packed-bed) 또는 유체화된-베드 생물반응기에서 배양될 수 있는 부착-의존성 배양물을 포함한다. rAAV 벡터 생성 배양물은 또한, 예를 들어, 회전 플라스크, 교반 탱크 생물반응기, 및 일회용 시스템, 예를 들어, 웨이브 백(Wave bag) 시스템을 포함하는 다양한 방식으로 배양될 수 있는 현탁-적합화 숙주 세포, 예를 들어, HeLa, 293, 및 SF-9 세포를 포함할 수 있다.
본 발명의 rAAV 벡터 입자는 생성 배양물의 숙주 세포의 용해 또는 생성 배양물로부터 소모된 배지의 수거에 의해 rAAV 생성 배양물로부터 수거될 수 있으나, 단, 상기 세포는 미국 특허 번호 6,566,118호에 더욱 충분히 기재된 바와 같이 온전한 세포로부터 배지로 rAAV 입자를 방출시키는 당업계에 알려진 조건에서 배양되어야 한다. 또한, 세포를 용해하는 적합한 방법은 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어, 다수의 동결/해동 사이클, 초음파처리, 미세유체화, 및 세제 및/또는 프로테아제와 같은 화학물질에 의한 처리를 포함한다.
추가 구현예에서, rAAV 입자는 정제된다. 본원에 사용된 용어 "정제"는 rAAV 입자가 자연 발생하는 장소나 최초 제조된 장소에 존재할 수도 있는 다른 성분 중 적어도 일부가 없는 rAAV 입자의 제조를 포함한다. 따라서, 예를 들어, 단리된 rAAV 입자는 배양 용해물 또는 생성 배양 상청액과 같은 공급원 혼합물로부터 입자를 농축시키는 정제 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 농축은 예를 들어, 용액 내에 존재하는 DNase-저항성 입자(DRP) 또는 게놈 카피(gc)의 비율, 또는 감염력에 의해서와 같이 다양한 방법으로 측정될 수 있거나, 생성 배양 오염물 또는, 헬퍼 바이러스, 배지 성분 등을 비롯한 공정 중 오염물을 포함하는 오염물과 같은, 공급원 혼합물에 존재하는 제2의 잠재적 간섭 물질과 관련하여 측정될 수 있다.
일부 구현예에서, rAAV 생성 배양 수거물은 숙주 세포 조직파편을 제거하기 위해 정화된다. 일부 구현예에서, 생성 배양 수거물은, 예를 들어 등급 DOHC Millipore Millistak+ HC Pod 필터, 등급 A1HC Millipore Millistak+ HC Pod 필터, 및 0.2 μm Filter Opticap XL1O Millipore Express SHC 친수성 막 필터를 포함하는 일련의 심층 필터를 통한 여과에 의해 정화된다. 정화는 또한 당업계에 알려진 다양한 다른 표준 기술, 예를 들어, 원심분리 또는 당업계에 알려진 0.2 μm 이상의 포어 크기의 임의의 셀룰로스 아세테이트 필터를 통한 여과에 의해 달성될 수 있다.
일부 구현예에서, rAAV 생성 배양물 수거물은 생성 배양물에 존재하는 임의의 고분자량 DNA를 분해하기 위해 Benzonase®로 추가로 처리된다. 일부 구현예에서, Benzonase® 분해는, 예를 들어, 30분 내지 수시간의 기간 동안 주위 온도 내지 37℃의 온도에서 최종 농도 1~2.5 단위/ml의 Benzonase®을 포함하는 당업계에 알려진 표준 조건에서 수행된다.
rAAV 입자는 다음 정제 단계 중 하나 이상을 이용해 단리되거나 정제될 수 있다: 평형 원심분리; 플로우-쓰루 음이온 교환 여과; rAAV 입자의 농축을 위한 접선류 여과(TFF); 아파타이트 크로마토그래피에 의한 rAAV 포획; 헬퍼 바이러스의 열 불활성화; 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의한 rAAV 포획; 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의한 완충액 교환; 나노여과; 및 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 또는 친화성 크로마토그래피에 의한 rAAV 포획. 이들 단계는 단독으로, 다양한 조합으로, 또는 다양한 순서로 이용될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 하기 기재된 순서대로 모든 단계를 포함한다. rAAV 입자의 정제 방법은, 예를 들어 문헌[Xiao et al., (1998) Journal of Virology 72:2224-2232; 미국 특허 6,989,264호 및 8,137,948호; 및 WO 2010/148143]에 기재되어 있다.
VI. 치료 방법
본 발명의 특정 양태는 페닐케톤뇨증의 치료 및/또는 페닐알라닌 수치의 감소를 필요로 하는 개체에서 이를 치료하고/하거나 감소시키는 방법에 관한 것이다. 페닐케톤뇨증(PKU)은, 뇌에 독성이고 이후 치료하지 않으면 중증 정신 장애를 유발하는 높은 혈중 Phe 수치를 초래하는 페닐알라닌 하이드록실라제(PAH) 결핍으로 인해 발생한다. 현재의 식이 제한 요법은 효과가 있지만, 청소년과 성인에서의 규정 미준수가 주요 문제이다.
PKU를 치료하려는 시도는 유전자 치료 벡터로부터의 인간 PAH의 낮은 활성으로 인해 가로막혀있었다. 본 방법은 부분적으로, 내인성 인간 PAH 폴리펩티드에 비해 향상된 단백질 안정성 및 효소 활성을 갖는 변이 PAH 폴리펩티드의 발견에 기초한다. 본원에 기재된 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩하는 rAAV 벡터를 이용한 유전자 요법에 의한 PKU 치료는 내인성 인간 PAH를 인코딩하는 벡터에 비해 혈액 및 뇌 Phe 수치를 낮추는 데 더 효과적이다. 또한, hPAH와 hPAH-V1은 모두 Tyr 및 Trp의 뇌 수송을 향상시켰지만, 변이 PAH로 처치된 동물만이 도파민과 세로토닌을 포함한 뇌 신경전달물질 수치가 정상화되었고, 이는 Phe에 영향을 받는 기능에 대한 민감도가 서로 다름을 나타낸다.
일부 구현예에서, 본 발명은 PKU 치료 방법으로서, 이를 필요로 하는 개체에게 본원에 기재된 바와 같은 변이 PAH 폴리펩티드의 치료 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 변이 PAH 폴리펩티드는 야생형 인간 PAH 폴리펩티드의 M180, K199, S250, 및 G256으로부터 선택되는 부위에 적어도 3개의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이 PAH 폴리펩티드는 야생형 인간 PAH 폴리펩티드의 M180, K199, S250, 및 G256 부위에 4개의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이 PAH 폴리펩티드는 M180T, K199P, S250P, 및 G256A로부터 선택되는 적어도 3개의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이 PAH 폴리펩티드는 M180T, K199P, S250P, 및 G256A 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이 PAH 폴리펩티드는 K199P, S250P, 및 G256A; M180T, S250P, 및 G256A; M180T, K199P, 및 G256A; 또는 M180T, K199P, 및 S250P를 포함하는 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이 PAH 폴리펩티드는 M180T, K199P, S250P, 및 G256A 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이 PAH 폴리펩티드는 아미노산 치환인 H264P, G272A, G272P, P275L, P279Q, G272P 및 P275L, 또는 T323R 및 F327T 아미노산 치환을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 변이 PAH 폴리펩티드는 표 1 내지 3에 제시된 변이 PAH 폴리펩티드 중 어느 하나이다. 일부 구현예에서, 변이 PAH 폴리펩티드는 M180T, K199P, S250P, 및 G256A 아미노산 치환을 포함하고, 야생형 PAH의 적어도 대략 페닐알라닌 하이드록실라제 활성을 유지하면서 추가적인 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 아미노산 치환의 위치는 야생형 인간 PAH 폴리펩티드, 예를 들어 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 인간 PAH 폴리펩티드에 기초한다. 일부 구현예에서, 변이 PAH 폴리펩티드는 융합 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, 변이 PAH 폴리펩티드는 조직 표적화 펩티드에 융합된 융합 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, 변이 PAH 폴리펩티드는 간 표적화 폴리펩티드에 융합된 융합 폴리펩티드이다. 간 표적화 폴리펩티드의 예는 인간 간세포 성장인자의 단편(Eavri and Lorberboum-Galkski, J Biol Chem 2007, 282:23402-23409) 또는 간세포 비시알로당단백질 수용체에 결합하는 당단백질(Huang, et al., Bioconjugate Chemistry 2017, 28:283-295)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
일부 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 변이 PAH 폴리펩티드의 유효량을 투여하여 PKU를 치료하는 방법을 제공한다. 변이 PAH 폴리펩티드는 특정 관심 조직에 투여되거나 전신에 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 변이 PAH 폴리펩티드의 유효량은 비경구 투여될 수 있다. 비경구 투여 경로는 정맥내, 복강내, 골내, 동맥내, 뇌내, 근육내, 척수강내, 피하, 뇌실내, 간내 등을 제한없이 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 변이 PAH 폴리펩티드의 유효량은 하나의 투여 경로를 통해 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 변이 PAH 폴리펩티드의 유효량은 2개 이상의 투여 경로의 조합을 통해 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 변이 PAH 폴리펩티드의 유효량은 하나의 부위에 투여된다. 다른 구현예에서, 변이 PAH 폴리펩티드의 유효량은 2개 이상의 부위에 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명은 PKU 치료 방법으로서, 이를 필요로 하는 개체에게 본원에 기재된 바와 같은 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산(예컨대, DNA 또는 mRNA)의 치료 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 핵산은 야생형 인간 PAH 폴리펩티드의 M180, K199, S250, 및 G256으로부터 선택되는 부위에 적어도 3개의 아미노산 치환을 포함하는 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 핵산은 야생형 인간 PAH 폴리펩티드의 M180, K199, S250, 및 G256 부위에 4개의 아미노산 치환을 포함하는 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 핵산은 M180T, K199P, S250P, 및 G256A로부터 선택되는 적어도 3개의 아미노산 치환을 포함하는 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 핵산은 M180T, K199P, S250P, 및 G256A 아미노산 치환을 포함하는 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 핵산은 K199P, S250P, 및 G256A; M180T, S250P, 및 G256A; M180T, K199P, 및 G256A; 또는 M180T, K199P, 및 S250P를 포함하는 아미노산 치환을 포함하는 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 핵산은 M180T, K199P, S250P, 및 G256A 아미노산 치환을 포함하는 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 핵산은 아미노산 치환인 H264P, G272A, G272P, P275L, P279Q, G272P 및 P275L, 또는 T323R 및 F327T 아미노산 치환을 추가로 포함하는 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 핵산은 표 1 내지 3에 제시된 변이 PAH 폴리펩티드 중 어느 하나인 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 핵산은 M180T, K199P, S250P, 및 G256A 아미노산 치환을 포함하는, 그리고 야생형 PAH의 적어도 대략 페닐알라닌 하이드록실라제 활성을 유지하면서 추가적인 아미노산 치환을 포함하는 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 핵산에 의해 인코딩된 아미노산 치환의 위치는 야생형 인간 PAH 폴리펩티드, 예를 들어 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 인간 PAH 폴리펩티드에 기초한다.
일부 구현예에서, 핵산은 변이 인간 PAH 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 핵산은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 핵산은 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서 핵산은, 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고 야생형 PAH의 페닐알라닌 하이드록실라제 활성의 적어도 약 25%, 50%, 75%, 100%, 또는 100% 초과의 활성을 갖는 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서 핵산은, 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고 서열번호 1의 야생형 PAH의 페닐알라닌 하이드록실라제 활성의 적어도 약 25%, 50%, 75%, 100%, 또는 100% 초과의 활성을 갖는 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산은 DNA이다. 일부 구현예에서, 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산은 RNA(예컨대, mRNA)이다.
일부 구현예에서, 핵산은 페닐알라닌 하이드록실라제 활성을 유지하는 절단된 PAH 폴리펩티드인 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 핵산은 N-말단 절단을 포함하는 절단된 PAH 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 핵산은 N-말단 조절 도메인의 일부 또는 전부의 절단인 N-말단 절단을 인코딩한다. 일부 구현예에서, 핵산은 야생형 인간 PAH 폴리펩티드(예컨대, 서열번호 1의 PAH 폴리펩티드)의 아미노산 잔기 1 내지 대략 아미노산 잔기 102의 결실을 포함하는 N-말단 절단을 인코딩한다. 일부 구현예에서, 핵산은 C-말단 절단을 포함하는 절단된 PAH 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 핵산은 사량체화 도메인의 일부 또는 전부의 절단인 C-말단 절단을 인코딩한다. 일부 구현예에서, 핵산은 야생형 인간 PAH 폴리펩티드(예컨대, 서열번호 1의 PAH 폴리펩티드)의 아미노산 잔기 약 429 내지 452의 결실을 포함하는 C-말단 절단을 인코딩한다. 일부 구현예에서, 핵산은 N-말단 절단 및 C-말단 절단을 포함하는 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 절단된 PAH 폴리펩티드는 N-말단 조절 서열의 일부 또는 전부 및 사량체화 도메인의 일부 또는 전부의 절단을 포함한다. 일부 구현예에서, 절단된 PAH 폴리펩티드는 야생형 인간 PAH 폴리펩티드(예컨대, 서열번호 1의 PAH 폴리펩티드)의 아미노산 잔기 1 내지 대략 아미노산 잔기 102 및 약 429 내지 약 452의 결실을 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산은 야생형 PAH 폴리펩티드(예컨대, 서열번호 1의 PAH 폴리펩티드)의 아미노산 잔기 약 102 내지 약 428에 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 핵산은 야생형 PAH 폴리펩티드(예컨대, 서열번호 1의 PAH 폴리펩티드)의 아미노산 잔기 102 내지 428에 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 핵산은 야생형 인간 PAH 폴리펩티드(예컨대, 서열번호 1의 PAH 폴리펩티드)의 M180, K199, S250, 및 G256 부위에 4개의 아미노산 치환을 추가로 포함하는 절단된 PAH 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 핵산은 M180T, K199P, S250P, 및 G256A로부터 선택되는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 절단된 PAH 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 절단된 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산은 표 1 내지 3에 제시된 아미노산 치환의 조합 중 어느 하나를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산은 야생형 PAH(예컨대, 서열번호 1의 PAH 폴리펩티드)의 페닐알라닌 하이드록실라제 활성의 적어도 약 25%, 50%, 75%, 100%, 또는 100% 초과의 활성을 갖는 절단된 PAH 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산은 조직 표적화 펩티드에 융합된 융합 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 변이 PAH 폴리펩티드는 간 표적화 펩티드에 융합된 융합 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산은 DNA이다. 일부 구현예에서, 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산은 RNA(예컨대, mRNA)이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산의 유효량을 투여하여 PKU를 치료하는 방법을 제공한다. 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산은 특정 관심 조직에 투여되거나 전신에 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산의 유효량은 비경구 투여될 수 있다. 비경구 투여 경로는 정맥내, 복강내, 골내, 동맥내, 뇌내, 근육내, 척수강내, 피하, 뇌실내, 간내 등을 제한없이 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 간 이외의 조직에서 변이 PAH를 발현하려면, (예를 들어, 전신에 전달되거나 핵산에서 공동발현되는) 보조인자 BH4의 존재가 필요할 수 있다(Ding et al., Mol Ther 2008, 16:673-681). 일부 구현예에서, 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산의 유효량은 하나의 투여 경로를 통해 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산의 유효량은 2개 이상의 투여 경로의 조합을 통해 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산의 유효량은 하나의 부위에 투여된다. 다른 구현예에서, 변이 PAH 폴리펩티드의 유효량은 2개 이상의 부위에 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산은 DNA이다. 일부 구현예에서, 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산은 RNA(예컨대, mRNA)이다.
본 발명의 일부 양태에서, 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산은 바이러스 벡터를 통해 개체에게 전달된다. 유전자 요법을 위한 바이러스 벡터는 당업계에 알려져 있다. 일부 양태에서, 본 발명은 본 발명의 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩하는 렌티바이러스 입자의 유효량을 투여하여 PKU를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 본 발명은 본 발명의 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩하는 rAAV 입자의 유효량을 투여하여 PKU를 치료하는 방법을 제공한다. rAAV는 특정 관심 조직에 투여되거나 전신에 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, rAAV의 유효량은 비경구 투여될 수 있다. 비경구 투여 경로는 정맥내, 복강내, 골내, 동맥내, 뇌내, 근육내, 척수강내, 피하, 뇌실내, 간내 등을 제한없이 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, rAAV의 유효량은 하나의 투여 경로를 통해 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, rAAV의 유효량은 2개 이상의 투여 경로의 조합을 통해 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, rAAV의 유효량은 하나의 부위에 투여된다. 다른 구현예에서, rAAV의 유효량은 2개 이상의 부위에 투여될 수 있다.
rAAV(일부 구현예에서는 입자 형태)의 유효량은 치료 목적에 따라 투여된다. 예를 들어, 낮은 비율의 형질도입이 원하는 치료 효과를 달성할 수 있는 경우, 치료의 목적은 일반적으로 이러한 수준의 형질도입을 충족시키거나 초과하는 것이다. 일부 경우에, 이러한 수준의 형질도입은 원하는 조직 유형의 표적 세포의 약 1 내지 5%만을, 일부 구현예에서는 원하는 조직 유형의 세포의 약 20% 이상을, 일부 구현예에서는 약 50% 이상을, 일부 구현예에서는 약 80% 이상을, 일부 구현예에서는 약 95% 이상을, 일부 구현예에서는 원하는 조직 유형의 세포의 약 99% 이상을 형질도입하여 달성될 수 있다. rAAV 조성물은 동일한 절차 동안, 또는 수일, 수주, 수개월, 또는 수년의 간격으로, 1회 이상의 투여에 의해 투여될 수 있다. 본원에 기재된 임의의 투여 경로 중 하나 이상이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 인간을 치료하기 위해 다중 벡터가 사용될 수 있다.
AAV 바이러스 입자에 의해 형질도입된 세포를 식별하는 방법은 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, 바이러스 입자(예를 들어, 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 rAAV 캡시드를 포함하는 바이러스 입자)의 형질도입을 검출하기 위해 면역조직화학 또는 강화된 녹색 형광 단백질과 같은 마커가 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 유효량의 rAAV 입자는 2개 이상의 부위에 동시에 또는 순차적으로 투여된다. 다른 구현예에서, 유효량의 rAAV 입자는 단일 부위에 2회 이상(예를 들어, 반복하여) 투여된다. 일부 구현예에서, rAAV 바이러스 입자의 다회 주사 간격은 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 9시간, 12시간, 또는 24시간 이하이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩하는 재조합 바이러스 벡터를 포함하는 제약 조성물의 유효량을 투여하여 PKU가 있는 인간을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 제약 조성물은 제약상 허용되는 하나 이상의 부형제를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 본 발명의 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩하는 재조합 바이러스 벡터를 포함하는 제약 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에서 PKU를 치료하기 위해 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 바이러스 입자(예컨대, rAAV 입자)의 바이러스 역가는 적어도 약 5 × 1012개, 6 × 1012개, 7 × 1012개, 8 × 1012개, 9 × 1012개, 10 × 1012개, 11 × 1012개, 15 × 1012개, 20 × 1012개, 25 × 1012개, 30 × 1012개, 또는 50 × 1012개의 게놈 카피/mL이다. 일부 구현예에서, 바이러스 입자(예컨대, rAAV 입자)의 바이러스 역가는 약 5 × 1012개 내지 6 × 1012개, 6 × 1012개 내지 7 × 1012개, 7 × 1012개 내지 8 × 1012개, 8 × 1012개 내지 9 × 1012개, 9 × 1012개 내지 10 × 1012개, 10 × 1012개 내지 11 × 1012개, 11 × 1012개 내지 15 × 1012개, 15 × 1012개 내지 20 × 1012개, 20 × 1012개 내지 25 × 1012개, 25 × 1012개 내지 30 × 1012개, 30 × 1012개 내지 50 × 1012개, 또는 50 × 1012개 내지 100 × 1012개의 게놈 카피/mL이다. 일부 구현예에서, 바이러스 입자(예컨대, rAAV 입자)의 바이러스 역가는 약 5 × 1012개 내지 10 × 1012개, 10 × 1012개 내지 25 × 1012개, 또는 25 × 1012개 내지 50 × 1012개의 게놈 카피/mL이다. 일부 구현예에서, 바이러스 입자(예컨대, rAAV 입자)의 바이러스 역가는 적어도 약 5 × 109개, 6 × 109개, 7 × 109개, 8 × 109개, 9 × 109개, 10 × 109개, 11 × 109개, 15 × 109개, 20 × 109개, 25 × 109개, 30 × 109개, 또는 50 × 109개의 형질도입 단위/mL이다. 일부 구현예에서, 바이러스 입자(예컨대, rAAV 입자)의 바이러스 역가는 약 5 × 109개 내지 6 × 109개, 6 × 109개 내지 7 × 109개, 7 × 109개 내지 8 × 109개, 8 × 109개 내지 9 × 109개, 9 × 109개 내지 10 × 109개, 10 × 109개 내지 11 × 109개, 11 × 109개 내지 15 × 109개, 15 × 109개 내지 20 × 109개, 20 × 109개 내지 25 × 109개, 25 × 109개 내지 30 × 109개, 30 × 109 개 내지 50 × 109개 또는 50 × 109개 내지 100 × 109개의 형질도입 단위/mL이다. 일부 구현예에서, 바이러스 입자(예컨대, rAAV 입자)의 바이러스 역가는 약 5 × 109개 내지 10 × 109개, 10 × 109개 내지 15 × 109개, 15 × 109개 내지 25 × 109개, 또는 25 × 109개 내지 50 × 109개의 형질도입 단위/mL이다. 일부 구현예에서, 바이러스 입자(예컨대, rAAV 입자)의 바이러스 역가는 적어도 약 5 × 1010개, 6 × 1010개, 7 × 1010개, 8 × 1010개, 9 × 1010개, 10 × 1010개, 11 × 1010개, 15 × 1010개, 20 × 1010개, 25 × 1010개, 30 × 1010개, 40 × 1010개, 또는 50 × 1010개의 감염 단위/mL이다. 일부 구현예에서, 바이러스 입자(예컨대, rAAV 입자)의 바이러스 역가는 적어도 약 5 × 1010개 내지 6 × 1010개, 6 × 1010개 내지 7 × 1010개, 7 × 1010개 내지 8 × 1010개, 8 × 1010개 내지 9 × 1010개, 9 × 1010개 내지 10 × 1010개, 10 × 1010개 내지 11 × 1010개, 11 × 1010개 내지 15 × 1010개, 15 × 1010개 내지 20 × 1010개, 20 × 1010개 내지 25 × 1010개, 25 × 1010개 내지 30 × 1010개, 30 × 1010개 내지 40 × 1010개, 40 × 1010개 내지 50 × 1010개, 또는 50 × 1010개 내지 100 × 1010개의 감염 단위/mL이다. 일부 구현예에서, 바이러스 입자(예컨대, rAAV 입자)의 바이러스 역가는 적어도 약 5 × 1010개 내지 10 × 1010개, 10 × 1010개 내지 15 × 1010개, 15 × 1010개 내지 25 × 1010개, 또는 25 × 1010개 내지 50 × 1010개의 감염 단위/mL이다.
일부 구현예에서, 개체에 투여되는 바이러스 입자의 용량은 체중 1 kg당 적어도 약 1 × 108개 내지 약 6 × 1013개의 게놈 카피이다. 일부 구현예에서, 개체에 투여되는 바이러스 입자의 용량은 체중 1 kg당 약 1 × 108개 내지 약 6 × 1013개의 게놈 카피이다.
일부 구현예에서, 개체에 투여되는 바이러스 입자의 총량은 적어도 약 1 × 109개 내지 약 1 × 1014개의 게놈 카피이다. 일부 구현예에서, 개체에 투여되는 바이러스 입자의 총량은 약 1 × 109개 내지 약 1 × 1014개의 게놈 카피이다.
본 발명의 조성물(예를 들어, 본 발명의 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩하는 벡터를 포함하는 재조합 바이러스 입자)는 단독으로 사용되거나, PKU 치료용 하나 이상의 추가 치료제와 병용하여 사용될 수 있다. 순차적 투여의 간격은 수분, 수시간, 또는 수일 이상(또는 대안적으로, 미만)의 단위일 수 있다.
rAAV(일부 구현예에서는 입자 형태)의 유효량은 치료 목적에 따라 투여된다. 예를 들어, 낮은 비율의 형질도입이 원하는 치료 효과를 달성할 수 있는 경우, 치료의 목적은 일반적으로 이러한 수준의 형질도입을 충족시키거나 초과하는 것이다. 일부 경우에, 이러한 수준의 형질도입은 표적 세포의 약 1 내지 5%만을, 일부 구현예에서는 원하는 조직 유형의 세포의 약 20% 이상을, 일부 구현예에서는 약 50% 이상을, 일부 구현예에서는 약 80% 이상을, 일부 구현예에서는 약 95% 이상을, 일부 구현예에서는 원하는 조직 유형의 세포의 약 99% 이상을 형질도입하여 달성될 수 있다. rAAV 조성물은 동일한 절차 동안, 또는 수일, 수주, 수개월, 또는 수년의 간격으로, 1회 이상의 투여에 의해 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 포유류(예컨대, 인간)를 치료하기 위해 다중 벡터가 사용될 수 있다
일부 구현예에서, 본 발명의 rAAV 조성물은 인간에게 투여하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 rAAV 조성물은 소아 투여를 위해 사용될 수 있다. 이론에 얽매이지 않고, PKU의 많은 증상은 본질적으로 발달증상(예를 들어, 중증 정신 장애)이므로, 가능한 한 어릴 때 PKU를 치료하는 것이 특히 유리할 수 있다. 일부 구현예에서, rAAV(일부 구현예에서는 입자 형태)의 유효량은 1개월 미만, 2개월 미만, 3개월 미만, 4개월 미만, 5개월 미만, 6개월 미만, 7개월 미만, 8개월 미만, 9개월 미만, 10개월 미만, 11개월 미만, 1년 미만, 13개월 미만, 14개월 미만, 15개월 미만, 16개월 미만, 17개월 미만, 18개월 미만, 19개월 미만, 20개월 미만, 21개월 미만, 22개월 미만, 2세 미만, 또는 3세 미만 연령의 환자에 투여된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 rAAV 조성물은 청소년에게 투여하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, rAAV(일부 구현예에서는 입자 형태)의 유효량은 12세 미만, 13세 미만, 14세 미만, 15세 미만, 16세 미만, 17세 미만, 18세 미만, 19세 미만, 20세 미만, 21세 미만, 22세 미만, 23세 미만, 24세 미만, 또는 25세 미만 연령의 환자에게 투여된다.
일부 구현예에서, 본 발명은 PKU 치료 방법으로서, 이를 필요로 하는 개체에게 본원에 기재된 바와 같은 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 세포의 치료 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 세포는 야생형 인간 PAH 폴리펩티드의 M180, K199, S250, 및 G256으로부터 선택되는 부위에 적어도 3개의 아미노산 치환을 포함하는 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 내 핵산은 야생형 인간 PAH 폴리펩티드의 M180, K199, S250, 및 G256 부위에 4개의 아미노산 치환을 포함하는 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 세포 내 핵산은 M180T, K199P, S250P, 및 G256A로부터 선택되는 적어도 3개의 아미노산 치환을 포함하는 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 세포 내 핵산은 M180T, K199P, S250P, 및 G256A 아미노산 치환을 포함하는 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 세포 내 핵산은 K199P, S250P, 및 G256A; M180T, S250P, 및 G256A; M180T, K199P, 및 G256A; 또는 M180T, K199P, 및 S250P를 포함하는 아미노산 치환을 포함하는 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 세포 내 핵산은 M180T, K199P, S250P, 및 G256A 아미노산 치환을 포함하는 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 세포 내 핵산은 아미노산 치환인 H264P, G272A, G272P, P275L, P279Q, G272P 및 P275L, 또는 T323R 및 F327T 아미노산 치환을 추가로 포함하는 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 세포 내 핵산은 표 1 내지 3에 제시된 변이 PAH 폴리펩티드 중 어느 하나인 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 세포 내 핵산은 M180T, K199P, S250P, 및 G256A 아미노산 치환을 포함하는, 그리고 야생형 PAH의 적어도 대략 페닐알라닌 하이드록실라제 활성을 유지하면서 추가적인 아미노산 치환을 포함하는 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 세포 내 핵산에 의해 인코딩된 아미노산 치환의 위치는 야생형 인간 PAH 폴리펩티드, 예를 들어 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 인간 PAH 폴리펩티드에 기초한다.
일부 구현예에서, 세포 내 핵산은 변이 인간 PAH 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 세포 내 핵산은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 세포 내 핵산은 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서 세포 내 핵산은, 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고 야생형 PAH의 페닐알라닌 하이드록실라제 활성의 적어도 약 25%, 50%, 75%, 100%, 또는 100% 초과의 활성을 갖는 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서 세포 내 핵산은, 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고 서열번호 1의 야생형 PAH의 페닐알라닌 하이드록실라제 활성의 적어도 약 25%, 50%, 75%, 100%, 또는 100% 초과의 활성을 갖는 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩한다.
일부 구현예에서, 세포 내 핵산은 페닐알라닌 하이드록실라제 활성을 유지하는 절단된 PAH 폴리펩티드인 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 세포 내 핵산은 N-말단 절단을 포함하는 절단된 PAH 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 세포 내 핵산은 N-말단 조절 도메인의 일부 또는 전부의 절단인 N-말단 절단을 인코딩한다. 일부 구현예에서, 세포 내 핵산은 야생형 인간 PAH 폴리펩티드(예컨대, 서열번호 1의 PAH 폴리펩티드)의 아미노산 잔기 1 내지 대략 아미노산 잔기 102의 결실을 포함하는 N-말단 절단을 인코딩한다. 일부 구현예에서, 세포 내 핵산은 C-말단 절단을 포함하는 절단된 PAH 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 세포 내 핵산은 사량체화 도메인의 일부 또는 전부의 절단인 C-말단 절단을 인코딩한다. 일부 구현예에서, 세포 내 핵산은 야생형 인간 PAH 폴리펩티드(예컨대, 서열번호 1의 PAH 폴리펩티드)의 아미노산 잔기 약 429 내지 452의 결실을 포함하는 C-말단 절단을 인코딩한다. 일부 구현예에서, 세포 내 핵산은 N-말단 절단 및 C-말단 절단을 포함하는 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 절단된 PAH 폴리펩티드는 N-말단 조절 서열의 일부 또는 전부 및 사량체화 도메인의 일부 또는 전부의 절단을 포함한다. 일부 구현예에서, 절단된 PAH 폴리펩티드는 야생형 인간 PAH 폴리펩티드(예컨대, 서열번호 1의 PAH 폴리펩티드)의 아미노산 잔기 1 내지 대략 아미노산 잔기 102 및 약 429 내지 약 452의 결실을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 내 핵산은 야생형 PAH 폴리펩티드(예컨대, 서열번호 1의 PAH 폴리펩티드)의 아미노산 잔기 약 102 내지 약 428에 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 세포 내 핵산은 야생형 PAH 폴리펩티드(예컨대, 서열번호 1의 PAH 폴리펩티드)의 아미노산 잔기 102 내지 428에 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 세포 내 핵산은 야생형 인간 PAH 폴리펩티드(예컨대, 서열번호 1의 PAH 폴리펩티드)의 M180, K199, S250, 및 G256 부위에 4개의 아미노산 치환을 추가로 포함하는 절단된 PAH 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 세포 내 핵산은 M180T, K199P, S250P, 및 G256A로부터 선택되는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 절단된 PAH 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 절단된 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩하는 세포 내 핵산은 표 1 내지 3에 제시된 아미노산 치환의 조합 중 어느 하나를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 내 핵산은 야생형 PAH(예컨대, 서열번호 1의 PAH 폴리펩티드)의 페닐알라닌 하이드록실라제 활성의 적어도 약 25%, 50%, 75%, 100%, 또는 100% 초과의 활성을 갖는 절단된 PAH 폴리펩티드를 인코딩한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 세포의 유효량을 투여하여 PKU를 치료하는 방법을 제공한다. 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 세포는 특정 관심 조직에 투여되거나 전신에 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 세포의 유효량은 비경구 투여될 수 있다. 비경구 투여 경로는 정맥내, 복강내, 골내, 동맥내, 뇌내, 근육내, 척수강내, 피하, 뇌실내, 간내 등을 제한없이 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 캡슐화되거나 장치에 포함된다. 일부 구현예에서, 간 외부에서 세포를 발현하는 PAH는 외인성 추가 또는 공동발현 보조인자 BH4를 필요로 할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 캡슐화되거나, BH4를 추가로 포함하는 장치에 포함된다. 일부 구현예에서, 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 세포의 유효량은 하나의 투여 경로를 통해 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산의 유효량은 2개 이상의 투여 경로의 조합을 통해 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산의 유효량은 하나의 부위에 투여된다. 다른 구현예에서, 변이 PAH 폴리펩티드의 유효량은 2개 이상의 부위에 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 세포는 간세포, 근세포, 섬유아세포, 내피세포, 상피세포, 혈액세포, 골수세포, 줄기세포, 또는 유도만능 줄기세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 외인성 추가 보조인자 BH4 및/또는 공동발현 보조인자 BH4를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 세포는 세포주(예컨대, CHO 세포주, HeLa 세포주 등)이다. 일부 구현예에서, 본 발명은 변이 PAH 폴리펩티드를 생성하는 방법으로서, 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산(예를 들어, 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩하는 발현 벡터)을 포함하는 세포를, 변이 PAH 폴리펩티드를 생성하는 조건에서 배양하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 변이 PAH 폴리펩티드를 생성하는 방법은 변이 PAH 폴리펩티드를 정제하는 하나 이상의 단계를 추가로 포함한다.
VII. 키트 또는 제조 물품
본원에 기재된 바와 같은 변이 PAH 폴리펩티드, 핵산, rAAV 벡터, 입자, 및/또는 제약 조성물은, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 방법 중 하나에서의 사용을 위해 설계된 키트 또는 제조 물품 내에 포함될 수 있다.
일반적으로, 이러한 시스템은 본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 캐뉼라, 하나 이상(예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개 이상)의 주사기, 및 하나 이상(예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개 이상)의 유체를 포함한다.
주사기는 유체 전달용 캐뉼라에 연결될 수 있다면 임의의 적합한 주사기일 수 있다. 일부 구현예에서, 시스템은 하나의 주사기를 갖는다. 일부 구현예에서, 시스템은 2개의 주사기를 갖는다. 일부 구현예에서, 시스템은 3개의 주사기를 갖는다. 일부 구현예에서, 시스템은 4개 이상의 주사기를 갖는다. 본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 유체는 본원에 기재된 것들, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 벡터의 유효량을 각각 포함하는 하나 이상의 유체, 및 하나 이상의 치료제를 포함하는 하나 이상의 유체를 포함한다.
일부 구현예에서, 키트는 단일 유체(유효량의 벡터를 포함하는 제약상 허용되는 유체)를 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 2개의 유체를 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 3개의 유체를 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 4개 이상의 유체를 포함한다. 유체는 본 발명의 변이 PAH 폴리펩티드 또는 rAAV 벡터 조성물의 전달, 희석, 안정화, 완충, 또는 그 외 수송에 적합한 희석제, 완충제, 부형제, 또는 본원에 기재되거나 당업계에 알려진 임의의 다른 액체를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 키트는 하나 이상의 완충제, 예를 들어 수성 pH 완충 용액을 포함한다. 완충제의 예는 포스페이트, 시트레이트, Tris, HEPES, 및 기타 유기산 완충제를 제한없이 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 키트는 용기를 포함한다. 적합한 용기는 예를 들어 바이알, 백, 주사기, 및 병을 포함할 수 있다. 용기는 유리, 금속, 또는 플라스틱과 같은 하나 이상의 재질로 만들어질 수 있다. 일부 구현예에서, 용기는 본 발명의 rAAV 조성물을 수용하기 위해 사용된다. 일부 구현예에서, 용기는 유체 및/또는 다른 치료제를 수용할 수도 있다.
일부 구현예에서, 키트는 본 발명의 rAAV 조성물과 함께 추가 치료제를 포함한다. 일부 구현예에서, rAAV 조성물과 추가 치료제는 혼합될 수 있다. 일부 구현예에서, rAAV 조성물과 추가 치료제는 분리 보관될 수 있다. 일부 구현예에서, rAAV 조성물과 추가 치료제는 동일한 용기에 수용될 수 있다. 일부 구현예에서, rAAV 조성물과 추가 치료제는 서로 다른 용기에 수용될 수 있다. 일부 구현예에서, rAAV 조성물과 추가 치료제는 동시에 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, rAAV 조성물과 추가 치료제는 같은 날에 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, rAAV 조성물은 추가 치료제의 투여 후 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 2주, 3주, 4주, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 또는 6개월 내에 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 키트는 AAV 투여 전에 면역계를 일시적으로 억제하는 치료제를 포함한다. 일부 구현예에서, 환자는 AAV 입자에 대한 T세포 반응을 억제하기 위해 바이러스 주사 직전과 직후에 일시적으로 면역 억제된다(예를 들어, 문헌[Ferreira et al., Hum. Gene Ther. 25:180-188, 2014] 참조). 일부 구현예에서, 키트는 시클로스포린, 미코페놀레이트 모페틸, 및/또는 메틸프레드니솔론을 추가로 제공한다.
또한, 본 발명의 rAAV 입자 및/또는 조성물은 사용 설명서를 포함하는 키트로 패키징될 수 있다. 일부 구현예에서, 키트는 rAAV 입자 조성물의 전달(예를 들어, 본원에 기재된 임의의 유형의 비경구 투여)을 위한 장치를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 사용 설명서는 본원에 기재된 방법 중 하나에 따른 지침을 포함한다. 일부 구현예에서, 지침은 용기와 함께 제공되는(예를 들어, 용기에 부착되는) 라벨에 인쇄된다. 일부 구현예에서, 사용 설명서는, 예를 들어 개체에서 PKU를 치료하기 위한, rAAV 입자의 유효량을 개체(예컨대, 인간)에게 투여하기 위한 지침을 포함한다.
VIII. 예시적인 구현예
구현예 1. 야생형 인간 PAH 폴리펩티드의 M180, K199, S250, 및 G256으로부터 선택되는 부위에 2개의 아미노산 치환을 포함하는 변이 페닐알라닌 하이드록실라제(PAH) 폴리펩티드.
구현예 2. 야생형 인간 PAH 폴리펩티드의 M180, K199, S250, 및 G256으로부터 선택되는 부위에 3개의 아미노산 치환을 포함하는 변이 페닐알라닌 하이드록실라제(PAH) 폴리펩티드.
구현예 3. 야생형 인간 PAH 폴리펩티드의 M180, K199, S250, 및 G256 부위에 4개의 아미노산 치환을 포함하는 변이 페닐알라닌 하이드록실라제(PAH) 폴리펩티드.
구현예 4. 구현예 1 내지 3 중 어느 한 구현예에 있어서, 아미노산 치환이 M180T, K199P, S250P, 및 G256A 중 하나 이상을 포함하는, 변이 PAH 폴리펩티드.
구현예 5. 구현예 1 내지 4 중 어느 한 구현예에 있어서, 아미노산 치환이 K199P, S250P, 및 G256A; M180T, S250P, 및 G256A; M180T, K199P, 및 G256A; 또는 M180T, K199P, 및 S250P를 포함하는, 변이 PAH 폴리펩티드.
구현예 6. 구현예 1 내지 5 중 어느 한 구현예에 있어서, 아미노산 치환이 M180T, K199P, S250P, 및 G256A를 포함하는, 변이 PAH 폴리펩티드.
구현예 7. 구현예 1 내지 6 중 어느 한 구현예에 있어서, H264P, G272A, G272P, P275L, P279Q, G272P 및 P275L, 또는 T323R 및 F327T 아미노산 치환을 추가로 포함하는 변이 PAH 폴리펩티드.
구현예 8. 구현예 1 내지 7 중 어느 한 구현예에 있어서, 야생형 인간 PAH 폴리펩티드가 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는, 변이 PAH 폴리펩티드.
구현예 9. 구현예 1 내지 8 중 어느 한 구현예에 있어서, 인간 PAH 폴리펩티드인 변이 PAH 폴리펩티드.
구현예 10. 구현예 1 내지 9 중 어느 한 구현예에 있어서, 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 약 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 변이 PAH 폴리펩티드.
구현예 11. 구현예 1 내지 6 중 어느 한 구현예에 있어서, 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 변이 PAH 폴리펩티드.
구현예 12. 구현예 1 내지 11 중 어느 한 구현예에 있어서, 야생형 인간 PAH 폴리펩티드의 G33A, G46A, G46P, G103A, G139A, G139P, G148A, G188A, G218A, G239A, G247A, G257A, G272A, G289A, G307A, G312A, G332A, G337A, G344A, G352A, 및 G442A로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함하는 변이 PAH 폴리펩티드.
구현예 13. 구현예 1 내지 12 중 어느 한 구현예에 있어서, 야생형 인간 PAH 폴리펩티드의 P9G, G10V, G12S, K184R, K192R, S196A, Y206H, H220R, Q336E, E360D, I374C, N376E, N401T, I421V, I441V, S446H, 및 453번 위치에서의 S의 추가로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함하는 변이 PAH 폴리펩티드.
구현예 14. 구현예 1 내지 13 중 어느 한 구현예에 있어서, 야생형 인간 PAH 폴리펩티드의 F240W, A246P, G247A, Y268W, C284F, T323R, F327Y, E319P, I306(Y,F), K113P, G188A, F191Y, T193R, Y206H, G337P, 및 N376P로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함하는 변이 PAH 폴리펩티드.
구현예 15. 야생형 인간 PAH 폴리펩티드의 G33A, G46A, G46P, G103A, G139A, G139P, G148A, G188A, G218A, G239A, G247A, G257A, G272A, G289A, G307A, G312A, G332A, G337A, G344A, G352A, 및 G442A로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 변이 PAH 폴리펩티드.
구현예 16. 야생형 인간 PAH 폴리펩티드의 P9G, G10V, G12S, K184R, K192R, S196A, Y206H, H220R, Q336E, E360D, I374C, N376E, N401T, I421V, I441V, S446H, 및 453번 위치에서의 S의 추가로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 변이 PAH 폴리펩티드.
구현예 17. 야생형 인간 PAH 폴리펩티드의 F240W, A246P, G247A, Y268W, C284F, T323R, F327Y, E319P, I306(Y,F), K113P, G188A, F191Y, T193R, Y206H, G337P, 및 N376P로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 변이 PAH 폴리펩티드.
구현예 18. 구현예 1 내지 17 중 어느 한 구현예에 있어서, N-말단 절단을 포함하는 변이 PAH 폴리펩티드.
구현예 19. 구현예 18에 있어서, N-말단 절단이 N-말단 조절 도메인의 절단을 포함하는, 변이 PAH 폴리펩티드.
구현예 20. 구현예 18 또는 19에 있어서, N-말단 절단이 야생형 PAH 폴리펩티드의 아미노산 잔기 1 내지 102의 절단을 포함하는, 변이 PAH 폴리펩티드.
구현예 21. 구현예 1 내지 20 중 어느 한 구현예에 있어서, C-말단 절단을 포함하는 변이 PAH 폴리펩티드.
구현예 22. 구현예 21에 있어서, C-말단 절단이 사량체화 도메인의 절단을 포함하는, 변이 PAH 폴리펩티드.
구현예 23. 구현예 21 또는 22에 있어서, C-말단 절단이 야생형 PAH 폴리펩티드의 아미노산 잔기 429 내지 452의 절단을 포함하는, 변이 PAH 폴리펩티드.
구현예 24. 구현예 1 내지 23 중 어느 한 구현예에 있어서, 야생형 PAH 폴리펩티드의 아미노산 잔기 103 내지 428에 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 변이 PAH 폴리펩티드.
구현예 25. 구현예 1 내지 24 중 어느 한 구현예에 있어서, 잠재적인 프로테아제 절단 부위를 제거하기 위한 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 변이 PAH 폴리펩티드.
구현예 26. 구현예 25에 있어서, 잠재적인 프로테아제 절단 부위를 제거하기 위한 하나 이상의 아미노산 치환이 야생형 PAH 폴리펩티드의 270 내지 295번 및/또는 380 내지 405번 위치에 위치하는, 변이 PAH 폴리펩티드.
구현예 27. 구현예 1 내지 26 중 어느 한 구현예에 있어서, 간 표적화 폴리펩티드에 융합되는 변이 PAH 폴리펩티드.
구현예 28. 구현예 27에 있어서, 간 표적화 폴리펩티드가 HGF 또는 이의 단편이거나, 간세포 비시알로당단백질 수용체에 결합하는 당단백질인, 변이 PAH 폴리펩티드.
구현예 29. 구현예 1 내지 25 중 어느 한 구현예에 있어서, PEG화 및/또는 니트로실화된 변이 PAH 폴리펩티드.
구현예 30. 구현예 26에 있어서, 374번 위치의 cys 잔기가 니트로실화된 I374C 아미노산 치환을 포함하는 변이 PAH 폴리펩티드.
구현예 31. 구현예 1 내지 30 중 어느 한 구현예의 변이 PAH 폴리펩티드를 포함하는 조성물.
구현예 32. 구현예 31에 있어서, 제약상 허용되는 담체를 추가로 포함하는 조성물.
구현예 33. 구현예 1 내지 30 중 어느 한 구현예의 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩하는 단리된 핵산.
구현예 34. 구현예 33에 있어서, 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산이 프로모터에 작동 가능하게 연결된, 단리된 핵산.
구현예 35. 구현예 34에 있어서, 프로모터가 사이토메갈로바이러스(CMV) 조기 발현 프로모터, RSV LTR, MoMLV LTR, 포스포글리세레이트 키나제-1(PGK) 프로모터, 시미안 바이러스 40(SV40) 프로모터, CK6 프로모터, 트랜스티레틴 프로모터(TTR), mTTR482 프로모터, mA1MB2-mTTR482 프로모터, TK 프로모터, 테트라사이클린 반응성 프로모터(TRE), HBV 프로모터, hAAT 프로모터, LSP 프로모터, LP1 프로모터, 키메라 간-특이적 프로모터(LSP), E2F 프로모터, 텔로머라제(hTERT) 프로모터, 사이토메갈로바이러스 인핸서/닭 베타-액틴/토끼 β-글로빈 프로모터(CAG) 프로모터, 신장인자 1-알파 프로모터(EF1-알파) 프로모터, 인간 β-글루쿠로니다제 프로모터, 닭 β-액틴(CBA) 프로모터, 변형된 닭 β-액틴(CBA) 프로모터 또는 서열번호 17, 레트로바이러스성 라우스 육종 바이러스(RSV) LTR 프로모터, 디하이드로엽산 환원효소 프로모터, 및 13-액틴 프로모터로부터 선택되는, 단리된 핵산.
구현예 36. 구현예 34 또는 35에 있어서, 프로모터가 LP1 프로모터 또는 mA1MB2-mTTR482 프로모터인, 단리된 핵산.
구현예 37. 구현예 33 내지 36 중 어느 한 구현예에 있어서, 폴리아데닐화 신호를 추가로 포함하는 단리된 핵산.
구현예 38. 구현예 37에 있어서, 폴리아데닐화 신호가 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호, SV40 폴리아데닐화 신호, 또는 HSV TK pA인, 단리된 핵산.
구현예 39. 구현예 33 내지 38 중 어느 한 구현예에 있어서, 인트론을 추가로 포함하는 단리된 핵산.
구현예 40. 구현예 39에 있어서, 인트론이 닭 β-액틴(CBA)/토끼 β-글로빈 하이브리드 인트론인, 단리된 핵산.
구현예 41. 구현예 39에 있어서, 인트론이 서열번호 15의 변형된 닭 β-액틴(CBA)/토끼 β-글로빈 하이브리드 인트론인, 단리된 핵산.
구현예 42. 구현예 33 내지 41 중 어느 한 구현예에 있어서, 하나 이상의 ITR을 추가로 포함하는 단리된 핵산.
구현예 43. 구현예 33 내지 42 중 어느 한 구현예에 있어서, 스터퍼 핵산을 추가로 포함하는 단리된 핵산.
구현예 44. 구현예 43에 있어서, 스터퍼 핵산이 ATG 서열을 제거하도록 최적화된, 단리된 핵산.
구현예 45. 구현예 44에 있어서, 스터퍼 핵산이 서열번호 16의 A1AT 인트론 스터퍼 서열인, 단리된 핵산.
구현예 46. 인간 PAH 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산으로서, 코돈 최적화된 단리된 핵산.
구현예 47. 구현예 46에 있어서, 핵산 서열이 서열번호 14의 핵산 서열과 적어도 80% 동일한, 단리된 핵산.
구현예 48. 구현예 46에 있어서, 서열번호 14의 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산.
구현예 49. 구현예 33에 있어서, mRNA인 단리된 핵산.
구현예 50. 구현예 33 내지 49 중 어느 한 구현예의 핵산을 포함하는 조성물.
구현예 51. 구현예 50에 있어서, 제약상 허용되는 담체를 추가로 포함하는 조성물.
구현예 52. 구현예 33 내지 49 중 어느 한 구현예의 핵산을 포함하는 벡터.
구현예 53. 구현예 52에 있어서, 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 벡터인 벡터.
구현예 54. 하나 이상의 AAV 역위 말단 반복(ITR) 서열에 의해 플랭킹된 구현예 33 내지 41 또는 43 내지 49 중 어느 한 구현예의 핵산을 포함하는 rAAV 벡터.
구현예 55. 구현예 54에 있어서, 구현예 33 내지 48 중 어느 한 구현예의 핵산이 2개의 AAV ITR에 의해 플랭킹된, rAAV 벡터.
구현예 56. 구현예 54 또는 55에 있어서, AAV ITR이 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV DJ, 염소 AAV, 소 AAV, 또는 마우스 AAV 혈청형 ITR인, rAAV 벡터.
구현예 57. 구현예 54 내지 56 중 어느 한 구현예에 있어서, AAV ITR이 AAV2 ITR인, rAAV 벡터.
구현예 58. 구현예 57에 있어서, 5'에서 3'로 AAV2 ITR, 프로모터, 인트론, PAH 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산, 스터퍼 핵산, 폴리아데닐화 신호, 및 AAV2 ITR을 포함하는 rAAV 벡터.
구현예 59. 구현예 58에 있어서, 프로모터가 m1A1MB2-mTTR482 프로모터 또는 LP1 프로모터인, rAAV 벡터.
구현예 60. 구현예 58 또는 59에 있어서, 인트론이 닭 β-액틴(CBA)/토끼 β-글로빈 하이브리드 인트론인, rAAV 벡터.
구현예 61. 구현예 58 또는 59에 있어서, PAH 폴리펩티드가 구현예 1 내지 30 중 어느 한 구현예의 변이 PAH 폴리펩티드인, rAAV 벡터.
구현예 62. 구현예 58 내지 60 중 어느 한 구현예에 있어서, PAH 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산이 구현예 46 내지 48 중 어느 한 구현예의 코돈 최적화된 핵산인, rAAV 벡터.
구현예 63. 구현예 58 내지 62 중 어느 한 구현예에 있어서, 스터퍼 핵산이 인간 알파 1 항트립신 유전자의 인트론으로부터의 핵산을 포함하는, rAAV 벡터.
구현예 64. 구현예 63에 있어서, 인간 알파 1 항트립신 유전자의 인트론이 ATG 서열을 제거하도록 돌연변이된, rAAV 벡터.
구현예 65. 구현예 58 내지 64 중 어느 한 구현예에 있어서, 폴리아데닐화 신호가 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호인, rAAV 벡터.
구현예 66. 구현예 53 내지 65 중 어느 한 구현예에 있어서, 자기-상보성 벡터인 rAAV 벡터.
구현예 67. 구현예 66에 있어서, PAH 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 핵산 서열 및 PAH 폴리펩티드의 보체를 인코딩하는 제2 핵산 서열을 포함하고, 제1 핵산 서열은 길이의 대부분 또는 전부를 따라 제2 핵산 서열과 가닥내 염기쌍을 형성할 수 있는, rAAV 벡터.
구현예 68. 구현예 67에 있어서, 제1 핵산 서열과 제2 핵산 서열이 돌연변이 AAV ITR에 의해 연결되고, 돌연변이 AAV ITR은 D 영역의 결실을 포함하고 말단 분해 서열의 돌연변이를 포함하는, rAAV 벡터.
구현예 69. 구현예 53 내지 68 중 어느 한 구현예의 rAAV 벡터를 포함하는 rAAV 입자.
구현예 70. 구현예 69에 있어서, AAV 바이러스 입자가 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV2/2-7m8, AAV DJ, AAV2 N587A, AAV2 E548A, AAV2 N708A, AAV2 V708K, 염소 AAV, AAV1/AAV2 키메라, 소 AAV, 마우스 AAV, 또는 rAAV2/HBoV1 혈청형 캡시드를 포함하는, rAAV 입자.
구현예 71. 구현예 69에 있어서, AAV 바이러스 입자가 조작된 AAV 캡시드를 포함하는, rAAV 입자.
구현예 72. 구현예 71에 있어서, 조작된 AAV 캡시드가 DJ 캡시드 또는 LK03 캡시드인, rAAV 입자.
구현예 73. 구현예 69 또는 70에 있어서, rAAV 바이러스 입자의 ITR 및 캡시드가 동일한 AAV 혈청형으로부터 유래된, rAAV 입자.
구현예 74. 구현예 69 또는 70에 있어서, rAAV 바이러스 입자의 ITR 및 캡시드가 상이한 AAV 혈청형으로부터 유래된, rAAV 입자.
구현예 75. 구현예 69 내지 70 또는 73 내지 74 중 어느 한 구현예에 있어서, rAAV 바이러스 입자가 AAV8 캡시드를 포함하는, rAAV 입자.
구현예 76. 구현예 74에 있어서, rAAV 바이러스 입자가 AAV8 캡시드를 포함하고, 벡터가 AAV2 ITR을 포함하는, rAAV 입자.
구현예 77. 구현예 69 내지 76 중 어느 한 구현예의 rAAV 입자를 포함하는 조성물.
구현예 78. 구현예 77에 있어서, 제약상 허용되는 담체를 추가로 포함하는 조성물.
구현예 79. 구현예 33 내지 49 중 어느 한 구현예의 핵산, 또는 청구항 52 또는 53의 벡터, 또는 구현예 54 내지 68 중 어느 한 구현예의 rAAV 벡터를 포함하는 세포.
구현예 80. 변이 PAH 폴리펩티드의 제조 방법으로서, 변이 PAH 폴리펩티드를 생성하는 조건에서 구현예 79의 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법.
구현예 81. 구현예 80에 있어서, 변이 PAH 폴리펩티드를 정제하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
구현예 82. 페닐케톤뇨증의 치료를 필요로 하는 개체에서 이를 치료하는 방법으로서, 구현예 1 내지 30 중 어느 한 구현예의 변이 PAH 폴리펩티드, 또는 구현예 31 또는 32의 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
구현예 83. 페닐케톤뇨증의 치료를 필요로 하는 개체에서 이를 치료하는 방법으로서, 구현예 1 내지 30 중 어느 한 구현예의 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산, 또는 구현예 33, 34, 또는 49의 핵산을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
구현예 84. 페닐케톤뇨증의 치료를 필요로 하는 개체에서 이를 치료하는 방법으로서, 구현예 53 내지 68 중 어느 한 구현예의 rAAV 벡터를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
구현예 85. 페닐케톤뇨증의 치료를 필요로 하는 개체에서 이를 치료하는 방법으로서, 구현예 69 내지 76 중 어느 한 구현예의 rAAV 입자를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
구현예 86. 페닐케톤뇨증의 치료를 필요로 하는 개체에서 이를 치료하는 방법으로서, 구현예 31, 32, 50, 51, 77, 또는 78의 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
구현예 87. 페닐케톤뇨증의 치료를 필요로 하는 개체에서 이를 치료하는 방법으로서, 구현예 79의 세포를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
구현예 88. 구현예 82 내지 87 중 어느 한 구현예에 있어서, 개체는 PAH 활성이 부족한, 방법.
구현예 89. 혈중 페닐알라닌 수치의 감소를 필요로 하는 개체에서 이를 감소시키는 방법으로서, 구현예 1 내지 30 중 어느 한 구현예의 변이 PAH 폴리펩티드, 또는 청구항 31 또는 32의 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
구현예 90. 혈중 페닐알라닌 수치의 감소를 필요로 하는 개체에서 이를 감소시키는 방법으로서, 구현예 1 내지 30 중 어느 한 구현예의 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산, 또는 구현예 33, 34, 또는 49의 핵산을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
구현예 91. 혈중 페닐알라닌 수치의 감소를 필요로 하는 개체에서 이를 감소시키는 방법으로서, 구현예 53 내지 68 중 어느 한 구현예의 rAAV 벡터를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
구현예 92. 혈중 페닐알라닌 수치의 감소를 필요로 하는 개체에서 이를 감소시키는 방법으로서, 구현예 69 내지 76 중 어느 한 구현예의 rAAV 입자를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
구현예 93. 혈중 페닐알라닌 수치의 감소를 필요로 하는 개체에서 이를 감소시키는 방법으로서, 구현예 31, 32, 50, 51, 77, 또는 78의 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
구현예 94. 혈중 페닐알라닌 수치의 감소를 필요로 하는 개체에서 이를 감소시키는 방법으로서, 구현예 79의 세포를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
구현예 95. 구현예 89 내지 94 중 어느 한 구현예에 있어서, 치료 전 개체의 혈중 페닐알라닌 수치는 연령대가 유사한 대조군 개체의 혈중 페닐알라닌 수치에 비해 높은, 방법.
구현예 96. 구현예 82 내지 95 중 어느 한 구현예에 있어서, 변이 PAH 폴리펩티드, 핵산, rAAV 벡터, rAAV 입자, 조성물, 또는 세포는 정맥내, 동맥내, 간내, 간문맥내, 복강내, 또는 피하 투여되는, 방법.
구현예 97. 구현예 82 내지 96 중 어느 한 구현예에 있어서, 투여는 다른 요법과 병용되는, 방법.
구현예 98. 구현예 97에 있어서, 다른 요법은 테트라하이드로비옵테린을 사용한 치료, 페닐알라닌 암모니아 리아제(PAL) 또는 PEG화 PAL을 사용한 치료, 또는 페닐알라닌 제한 식이요법인, 방법.
구현예 99. PAH 폴리펩티드의 제조 방법으로서, PAH 폴리펩티드를 생성하는 조건에서 구현예 79의 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법.
구현예 100. 구현예 99에 있어서, PAH 폴리펩티드를 정제하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
구현예 101. 구현예 1 내지 24 중 어느 한 구현예의 변이 PAH 폴리펩티드를 포함하는 키트.
구현예 102. 구현예 33 내지 46 중 어느 한 구현예의 핵산, 구현예 53 내지 68 중 어느 한 구현예의 rAAV 벡터, 구현예 69 내지 76 중 어느 한 구현예의 rAAV 입자, 또는 구현예 77 또는 78의 조성물을 포함하는 키트.
구현예 103. 구현예 101 또는 102에 있어서, 사용 설명서; 완충제 및/또는 제약상 허용되는 부형제; 및/또는 병, 바이알, 및/또는 주사기를 추가로 포함하는 키트.
구현예 104. 간세포에서 이식유전자를 발현하기 위한 발현 카세트로서, 프로모터 및 인핸서에 작동 가능하게 연결된 이식유전자를 포함하되, 상기 프로모터는 마우스 트랜스티레틴(mTTR) 프로모터를 포함하고, 상기 인핸서는 1개 또는 2개의 변형된 프로트롬빈 인핸서(pPrT2), 1개 또는 2개의 변형된 알파 1-마이크로비쿠닌 인핸서(mA1MB2), 변형된 마우스 알부민 인핸서(mEalb), B형 간염 바이러스 인핸서 II(HE11), 또는 CRM8 인핸서를 포함하는, 발현 카세트.
구현예 105. 구현예 104에 있어서, mTTR 프로모터가 mTTR482 프로모터인, 발현 카세트.
구현예 106. 구현예 104 또는 105에 있어서, 인핸서가 mTTR 프로모터에 대해 5'에 있는, 발현 카세트.
구현예 107. 간세포에서 이식유전자를 발현하기 위한 발현 카세트로서, 프로모터 및 3' 요소에 작동 가능하게 연결된 이식유전자를 포함하되, 상기 프로모터는 마우스 트랜스티레틴(mTTR) 프로모터를 포함하고, 상기 3' 요소는 알부민 3' 요소(3' Alb)이거나 인간 알파 1 항트립신 스캐폴드/매트릭스 부착 영역(SMAR)에 연결된 알부민 3' 요소(3' AlbSMAR)인, 발현 카세트.
구현예 108. 구현예 107에 있어서, mTTR 프로모터가 mTTR482 프로모터인, 발현 카세트.
구현예 109. 구현예 107 또는 108에 있어서, 3' 요소가 이식유전자에 대해 3'에 위치하는, 발현 카세트.
구현예 110. 간세포에서 이식유전자를 발현하기 위한 발현 카세트로서, 프로모터 및 인핸서 및 3' 요소에 작동 가능하게 연결된 이식유전자를 포함하되, 상기 프로모터는 마우스 트랜스티레틴(mTTR) 프로모터를 포함하고, 상기 인핸서는 1개 또는 2개의 변형된 프로트롬빈 인핸서(pPrT2), 1개 또는 2개의 변형된 알파 1-마이크로비쿠닌 인핸서(mA1MB2), 변형된 마우스 알부민 인핸서(mEalb), B형 간염 바이러스 인핸서 II(HE11), 또는 CRM8 인핸서를 포함하고, 상기 3' 요소는 알부민 3' 요소(3' Alb)이거나 인간 알파 1 항트립신 스캐폴드/매트릭스 부착 영역(SMAR)에 연결된 알부민 3' 요소(3' AlbSMAR)인, 발현 카세트.
구현예 111. 구현예 110에 있어서, mTTR 프로모터가 mTTR482 프로모터인, 발현 카세트.
구현예 112. 구현예 110 또는 111에 있어서, 인핸서가 mTTR 프로모터에 대해 5'에 있는, 발현 카세트.
구현예 113. 구현예 110 내지 112 중 어느 한 구현예에 있어서, 3' 요소가 이식유전자에 대해 3'에 위치하는, 발현 카세트.
구현예 114. 구현예 104 내지 113 중 어느 한 구현예에 있어서, 인트론을 추가로 포함하는 발현 카세트.
구현예 115. 구현예 114에 있어서, 인트론이 닭 β-액틴/토끼 β-글로빈 하이브리드 인트론인, 발현 카세트.
구현예 116. 구현예 104 내지 115 중 어느 한 구현예에 있어서, 폴리아데닐화 신호를 추가로 포함하는 발현 카세트.
구현예 117. 구현예 116에 있어서, 폴리아데닐화 신호가 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호인, 발현 카세트.
구현예 118. 구현예 104 내지 117 중 어느 한 구현예에 있어서, 이식유전자가 PAH 폴리펩티드 또는 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩하는, 발현 카세트.
구현예 119. 구현예 118에 있어서, 변이 PAH 폴리펩티드가 구현예 1 내지 30 중 어느 한 구현예의 변이 PAH 폴리펩티드인, 발현 카세트.
구현예 120. 구현예 104 내지 119 중 어느 한 구현예의 발현 카세트를 포함하는 벡터.
구현예 121. 구현예 120에 있어서, 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 벡터인 벡터.
구현예 122. 하나 이상의 AAV 역위 말단 반복(ITR) 서열에 의해 플랭킹된 구현예 104 내지 119 중 어느 한 구현예의 발현 카세트를 포함하는 rAAV 벡터.
구현예 123. 구현예 122에 있어서, 구현예 104 내지 118 중 어느 한 구현예의 발현 카세트가 2개의 AAV ITR에 의해 플랭킹된, rAAV 벡터.
구현예 124. 구현예 122 또는 123에 있어서, AAV ITR이 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV DJ, 염소 AAV, 소 AAV, 또는 마우스 AAV 혈청형 ITR인, rAAV 벡터.
구현예 125. 구현예 122 내지 124 중 어느 한 구현예에 있어서, AAV ITR이 AAV2 ITR인, rAAV 벡터.
구현예 126. 구현예 122 내지 125 중 어느 한 구현예에 있어서, 자기-상보성 벡터인 rAAV 벡터.
구현예 127. 구현예 126에 있어서, PAH 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 핵산 서열 및 PAH 폴리펩티드의 보체를 인코딩하는 제2 핵산 서열을 포함하고, 제1 핵산 서열은 길이의 대부분 또는 전부를 따라 제2 핵산 서열과 가닥내 염기쌍을 형성할 수 있는, rAAV 벡터.
구현예 128. 구현예 127에 있어서, 제1 핵산 서열과 제2 핵산 서열이 돌연변이 AAV ITR에 의해 연결되고, 돌연변이 AAV ITR은 D 영역의 결실을 포함하고 말단 분해 서열의 돌연변이를 포함하는, rAAV 벡터.
구현예 129. 구현예 122 내지 127 중 어느 한 구현예의 rAAV 벡터를 포함하는 rAAV 입자.
구현예 130. 구현예 129에 있어서, AAV 바이러스 입자가 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV2/2-7m8, AAV DJ, AAV2 N587A, AAV2 E548A, AAV2 N708A, AAV2 V708K, 염소 AAV, AAV1/AAV2 키메라, 소 AAV, 마우스 AAV, 또는 rAAV2/HBoV1 혈청형 캡시드를 포함하는, rAAV 입자.
구현예 131. 구현예 130에 있어서, AAV 바이러스 입자가 조작된 AAV 캡시드를 포함하는, rAAV 입자.
구현예 132. 구현예 131에 있어서, 조작된 AAV 캡시드가 DJ 캡시드 또는 LK03 캡시드인, rAAV 입자.
구현예 133. 구현예 131 또는 132에 있어서, rAAV 바이러스 입자의 ITR 및 캡시드가 동일한 AAV 혈청형으로부터 유래된, rAAV 입자.
구현예 134. 구현예 131 또는 132에 있어서, rAAV 바이러스 입자의 ITR 및 캡시드가 상이한 AAV 혈청형으로부터 유래된, rAAV 입자.
구현예 135. 구현예 129 내지 134 중 어느 한 구현예의 rAAV 입자를 포함하는 조성물.
구현예 136. 구현예 135에 있어서, 제약상 허용되는 담체를 추가로 포함하는 조성물.
구현예 137. 구현예 104 내지 119 중 어느 한 구현예의 발현 카세트 또는 구현예 120 내지 128 중 어느 한 구현예의 벡터를 포함하는 세포.
구현예 138. 페닐케톤뇨증의 치료를 필요로 하는 개체에서 이를 치료하는 방법으로서, 구현예 104 내지 119 중 어느 한 구현예의 발현 카세트를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
구현예 139. 페닐케톤뇨증의 치료를 필요로 하는 개체에서 이를 치료하는 방법으로서, 구현예 122 내지 128 중 어느 한 구현예의 rAAV 벡터를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
구현예 140. 페닐케톤뇨증의 치료를 필요로 하는 개체에서 이를 치료하는 방법으로서, 구현예 129 내지 134 중 어느 한 구현예의 rAAV 입자를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
구현예 141. 페닐케톤뇨증의 치료를 필요로 하는 개체에서 이를 치료하는 방법으로서, 구현예 135 또는 136의 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
구현예 142. 페닐케톤뇨증의 치료를 필요로 하는 개체에서 이를 치료하는 방법으로서, 구현예 137의 세포를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
구현예 143. 구현예 138 내지 142 중 어느 한 구현예에 있어서, 개체는 PAH 활성이 부족한, 방법.
구현예 144. 혈중 페닐알라닌 수치의 감소를 필요로 하는 개체에서 이를 감소시키는 방법으로서, 구현예 104 내지 119 중 어느 한 구현예의 발현 카세트를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
구현예 145. 혈중 페닐알라닌 수치의 감소를 필요로 하는 개체에서 이를 감소시키는 방법으로서, 구현예 122 내지 128 중 어느 한 구현예의 rAAV 벡터를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
구현예 146. 혈중 페닐알라닌 수치의 감소를 필요로 하는 개체에서 이를 감소시키는 방법으로서, 구현예 129 내지 134 중 어느 한 구현예의 rAAV 입자를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
구현예 147. 혈중 페닐알라닌 수치의 감소를 필요로 하는 개체에서 이를 감소시키는 방법으로서, 구현예 135 또는 136의 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
구현예 148. 혈중 페닐알라닌 수치의 감소를 필요로 하는 개체에서 이를 감소시키는 방법으로서, 구현예 137의 세포를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
구현예 149. 구현예 144 내지 148 중 어느 한 구현예에 있어서, 치료 전 개체의 혈중 페닐알라닌 수치는 연령대가 유사한 대조군 개체의 혈중 페닐알라닌 수치에 비해 높은, 방법.
구현예 150. 구현예 138 내지 149 중 어느 한 구현예에 있어서, 핵산, rAAV 벡터, rAAV 입자, 조성물, 또는 세포는 정맥내, 동맥내, 간내, 간문맥내, 복강내, 또는 피하 투여되는, 방법.
구현예 151. 구현예 138 내지 150 중 어느 한 구현예에 있어서, 투여는 다른 요법과 병용되는, 방법.
구현예 152. 구현예 151에 있어서, 다른 요법은 테트라하이드로비옵테린을 사용한 치료, 페닐알라닌 암모니아 리아제(PAL) 또는 PEG화 PAL을 사용한 치료, 또는 페닐알라닌 제한 식이요법인, 방법.
구현예 153. 구현예 104 내지 119 중 어느 한 구현예의 발현 카세트, 구현예 122 내지 128 중 어느 한 구현예의 rAAV 벡터, 구현예 129 내지 134 중 어느 한 구현예의 rAAV 입자, 또는 구현예 135 또는 136의 조성물을 포함하는 키트.
구현예 154. 구현예 153에 있어서, 사용 설명서; 완충제 및/또는 제약상 허용되는 부형제; 및/또는 병, 바이알, 및/또는 주사기를 추가로 포함하는 키트.
실시예
본 발명은 하기 실시예를 참조하여 더욱 완전히 이해될 것이다. 그러나, 이들은 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본원에 기재된 실시예 및 구현예는 단지 예시를 위한 것이며, 이러한 관점에서 다양한 변형 또는 변경이 당업자에게 제안될 것이고 본 출원의 사상 및 범주와 첨부된 구현예의 범위 내에 포함되어야 하는 것으로 이해된다.
실시예 1. 간 특이적 발현 카세트의 생성
다음의 연구는 개체의 간에서 이식유전자를 발현하기 위한 강력한 발현 작제물을 개발하기 위해 수행되었다.
실시예 1 내지 3의 재료 및 방법
PAH 발현 카세트 및 rAAV 벡터의 작제
간 프로모터 강도를 높이기 위해, 마우스 트랜스티레틴(mTTR) 프로모터, 내인성 mTTR 인핸서, 및 소 성장 호르몬(BGH) 폴리아데닐화(pA) 부위를 포함하는 플라스미드 mTTR482-HI-hFVIII-BGHpA가 추가적 변형에 사용되었다(Kyostio-Moore 2016, Nambiar 2017). 이 플라스미드에서, FVIII cDNA는 분비 배아 알칼리 포스파타제(SEAP)를 인코딩하는 cDNA로 대체되었고, 기존 인트론은 1069 bp의 닭 b-액틴(CBA)/토끼 베타-글로빈 하이브리드 인트론으로 대체되었다. 다양한 간 인핸서 서열이 mTTR482 인핸서의 상류에 클로닝되었다. 이들은 변형된 프로트롬빈 인핸서(mPrT2, 2 카피), 변형된 알파1-마이크로비쿠닌(mA1MB2, 2 카피)(McEachern 2006, Jacobs 2008), 변형된 마우스 알부민 인핸서(mEalb)(Kramer 2003), B형 간염 바이러스 인핸서 II(E11)(Kramer 2003), 및 CRM8(Chuah 2014)을 포함하였다. 추가로, 2개의 3' 요소, 알부민(Alb 3')(Wooddell 2008) 및 알부민 + 인간 A1AT1 SMAR 요소(AF156542)(Alb3'/SMAR)를 시험하고 BGH pA의 하류에 클로닝하였다(도 1a). 일부 인핸서에서의 변형은 이전에 mTTR482에 대해 수행된 것(Nambiar 2017; Supplement 1)과 유사하게 간 핵인자(HNF) 3 및 4 결합 부위를 더 높은 친화성 서열로 변경하는 것으로 구성되었다.
인간 또는 마우스 PAH 플라스미드 발현 카세트를 생성하기 위해, 전장 PAH를 인코딩하는 해당 cDNA(아미노산 1 내지 452)를 3개의 발현 플라스미드에 클로닝하였다. 이들 플라스미드는 간-특이적(LP1; Nathwani 2011), A1MB2-mTTR482 또는 CBA 프로모터, 하이브리드 인트론, 및 pA 서열(BGH 또는 시미안 바이러스 40[SV40] pA)(Nathwani 2011, Kyostio-Moore 2016)을 포함하였다. 모든 발현 플라스미드는 플랭킹 AAV2 ITR을 포함하였다. hPAH를 인코딩하는 다양한 cDNA를 평가하기 위해 mTTR482(Nambiar 2017)를 백본으로 사용하였다. DNA2.0, GeneArt(GA) 또는 Genscript(GS)의 알고리즘, 및 CpG 함량의 감소와 결합된 GS 알고리즘을 사용하여 4개의 코돈 최적화 cDNA를 생성하였다. 각각의 발현 플라스미드에서, 검출 및 정량화 목적을 위해 PAH 단백질을 N-말단 22-아미노산 3xFLAG-펩티드(MDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK, 서열번호 18)로 태깅하였다.
간 프로모터, 하이브리드 인트론, PAH cDNA, 및 BGHpA를 포함하는 선별된 AAV2 ITR 함유 플라스미드를 rAAV 벡터 생성을 위해 사용하였다. 3중 형질감염 방법에 이어 CsCl2 정제를 사용하여 AAV8 혈청형 캡시드를 포함하는 rAAV 벡터를 생성하였다(Univ. Massachusetts Gene Therapy Core). BGHpA에 대한 qPCR(Nambiar 2017)로 벡터 로트를 정량화하였다.
시험관내 세포 배양
모든 조직 배양 시약은 Irvine Scientific(Santa Ana, CA) 또는 Invitrogen에서 입수하였다. 일시적 형질감염을 위해, 고농도 포도당, 10% 소태아 혈청(FBS), 및 10 ml/L의 Pen Strep(10 단위/ml의 페니실린 및 10 μg/ml의 스트렙토마이신)이 함유된 둘베코의 변형된 이글 배지(DMEM)의 6-웰 디시에 인간 293 또는 인간 간 암종 세포(Huh7 또는 HepG2)(8 × 105개 세포/웰)를 플레이팅하였다. 플라스미드(2 μg)를 Lipofectamine 2000(Invitrogen)으로 형질감염시켰다. PAH 분석 또는 SEAP 활성을 위해 각각 48시간 또는 72시간 후에 세포 용해물 또는 배양 배지를 채취하였다.
SEAP 활성의 정량화
컨디셔닝된 배지 또는 혈청을 회수하고, 샘플을 65℃로 30분 동안 가열하여 내인성 알칼리 포스파타제를 비활성화하였다. 알칼리 포스파타제(ALP)-SL 시약(Sekisui Diagnostics)을 사용하여 SEAP 활성을 측정하고, 샘플을 10분 내지 2시간 동안 인큐베이팅한 후 405 nm에서 흡광도를 판독하였다. 인간 알칼리 포스파타제 HPAP를 표준물질(Calbiochem)로 사용하였다. SEAP 활성은 샘플 값을 변환 계수 0.103 mU/ng으로 나누어 ug/ml로 표시하였다.
PAH 단백질 및 활성의 정량화
용해 완충액 또는 RIPA 완충액에 세포를 용해하여 48시간 후에 전체 세포 용해물을 생성하였다. 추가적으로, 일부 실험에서는 세포 용해를 향상시키기 위해 초음파 또는 전단 처리를 사용하였다. 해동 후, 분석 전에 용해물을 14,000 g로 30분 동안 원심분리하였다. 키트 표준 또는 자체 정제된 3xFLAG-mPAH-FL을 단백질 표준으로 사용하여 제조업체의 지침에 따라 FLAG ELISA(SE002-flag; ABSbio)에 의한 FLAG-융합 단백질 수치의 정량화 측정을 수행하였다. 생체내 샘플을 BCA 단백질 분석 키트(Pierce)로 측정된 총 단백질 함량으로 정규화하였다. 약간의 수정을 가하여 이전에 문헌[Yew et al. 2013]에 기재된 바와 같이 PAH 단백질의 효소 활성을 측정하였다. PAH 검출을 위한 웨스턴 블롯팅은 표준 프로토콜에 따라 항-hPAH 항체(LS-C344145; LSBio) 또는 항-FLAG 항체(F1804; Sigma)를 사용하여 수행되었다.
생체내 연구
BTBR-PAHenu2/J 마우스의 콜로니를 Taconic(McDonald 1996)에 유지하였다. 동형접합(HOM) 및 이형접합(HET) 수컷 마우스를 8~12주령에 수득하고, 동물 보호 및 사용에 관한 인도적 지침에 따라 수용하고 유지하였다. SEAP 발현 플라스미드 분석을 위해, 멸균 식염수 중의 플라스미드(10 μg/마우스)를 시험 검체당 최소 n=8로 C57BL/6 마우스의 꼬리 정맥에 유체역학적으로 고용량 주사하여 투여하였다. 꼬리 정맥을 통해 정맥내 경로로 재조합 AAV8 벡터를 투여하였다(6~10마리 동물/처치). 대부분의 연구에서, 동물은 이소플루란 마취로 8~10주 후에 희생되었다. 전혈을 안와채혈로 EDTA 수집 튜브에 수집하고, 원심분리하여 분석 전까지 냉동 보관하였다. 일부 동물은 조직 수집 전에 좌심실을 통해 PBS로 관류시켰다. 간 샘플을 수집하여 분석 전까지 냉동시켰다. 뇌 분석을 위해, 두개골에서 전체 뇌를 채취하여, 무게를 재고, 시상으로 절단하여 분석 전까지 -80℃에서 냉동시켰다.
혈액 및 조직 분석
혈장 Phe 및 Tyr 수치는 API 4000 삼중 사극자 질량 분석기(AB SCIEX, Framingham, MA USA)에 연결된 Dionex Ultimate 3000 HPLC(Thermo Fisher, Waltham, MA USA)가 장착된 Transcend II LX4 멀티플렉스 시스템을 사용하여 UHPLC-MS/MS로 분석되었다. L-Phe 및 L-Tyr(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO USA)을 사용하여 표준 용액을 제조하고, 표지된 L-Phe-13C9, 15N 및 표지된 L-Tyr-13C9, 15N(Sigma-Aldrich)을 내부 표준으로 사용하였다. MS/MS 검출은 양이온 모드에서 수행되었다. 98% 이동상 A(물 중의 0.1% 포름산)에서 10초간 유지 후 30초에 걸쳐 2~45% 이동상 B(아세토니트릴 중의 0.1% 포름산) 구배, 15초에 걸쳐 75% B로 증가, 75% B로 10초간 세척, 및 0.5 mL/분의 유속으로 1분 동안 98% A로 재평형화를 포함한 구배 분리를 갖는 Acquity BEH C18 컬럼(1.7 μm, 2.1 × 30 mm)을 사용하여 분석을 수행하였다. MS/MS 전이는 Phe에 대해 166.1/120.1, Tyr에 대해 182.1/136.1, 표지된 Phe에 대해 176.1/129.1, 및 표지된 Tyr에 대해 192.1/145.1이었다.
뇌 신경전달물질 정량화를 위해, 약간의 수정을 가하여 문헌[Kankaanpaa 2001]에 기재된 바와 같이 뇌를 처리하였다. 간략히 말하면, 시상 절단된 PBS-관류 뇌의 절반을 얼음처럼 차가운 용해 완충액(1 mM 옥살산, 3 mM 시스테인, 0.1 M 아세트산)에서 Bead Ruptor 24(Omni)를 사용하여 4℃에서 20초 동안 4.85 m/초로 균질화하였다. 샘플을 10분 동안 14K 원심분리하고 후속 상청액을 냉동시켰다. 이어서, API 5000 삼중 사극자 질량 분석기(AB SCIEX, Framingham, MA USA)에 연결된 Acquity UPLC(Waters Corporation, Milford, MA USA)를 사용하여 뇌 호모지네이트(200 mg/mL)를 UPLC-MS/MS로 L-도파, 도파민, 호모바닐린산(HVA), 세로토닌, 5-하이드록시트립토판(5-HTP), 5-하이드록시인돌아세트산(5-HIAA), 및 노르에피네프린 수치에 대해 정량화하였다. 신경전달물질 안정성을 높이기 위해, 0.1% 포름산(FA) 및 아세토니트릴 중의 시스테인(300 ng/mL)을 샘플 희석 완충액으로 사용하였다. 각 분석물에 대한 표준물질(Sigma-Aldrich) 및 표준 용액을 전술한 바와 같이 샘플과 유사하게 제조하였다. MS/MS 검출은 양이온 모드에서 수행되었다(HVA는 음이온 모드에서 검출되었음). 98% 이동상 A(물 중의 0.1% FA)에서 0.5분간 유지 후 3.5분에 걸쳐 2~40% 이동상 B(아세토니트릴 중의 0.1% FA) 구배, 0.1분에 걸쳐 95% B로 증가, 95% B로 0.5분간 세척, 및 0.5 mL/분의 유속으로 2.4분 동안 98% A로 재평형화를 포함한 구배 분리를 갖는 Acquity HSS C18 SB(1.7 μm, 2.1 x 100 mm)를 사용하여 분석을 수행하였다. 양이온 MS/MS 전이는 L-도파에 대해 198/152, 세로토닌에 대해 177/160.1, 도파민에 대해 154/137.1, 5-HIAA에 대해 192/146, 노르에피네프린에 대해 170.1/107, 5-HTP에 대해 221.1/201이었다. 구배의 초기 유지상을 제거한 것을 제외하고는 상기 방법과 유사하게 음이온 모드에서 HVA 검출을 수행하였다. 음이온 모드에서 HVA에 대한 MS/MS 전이는 181.1/137.1이었다. 수치는 μg/mL 호모지네이트 또는 uM로 표시하였다. 상기 섹션에 기재된 바와 같이 뇌 Phe 및 Tyr 수치를 정량화하였다.
간 샘플의 경우, 벡터 게놈, PAH 활성, 및 단백질 수치를 정량화하였다. qPCR(Martin 2013)로 벡터 게놈의 카피를 정량화하였다. FLAG-태그 단백질의 정량화는 다음과 같이 수행되었다. 1× 프로테아제 억제제 함유 1× PBS 또는 RIPA 완충액 내에 비드(15-340-153; Fisher Scientific)가 있는 튜브에서 균질화기(Bead Ruptor 24; Omni)를 사용하여 4℃에서 20~30초 동안 5.65 rpm으로 간 샘플을 균질화하였다. 샘플을 4℃에서 14,000 g로 30분 동안 원심분리하였다. 이어서, 상청액을 FLAG ELISA 분석에 의한 PAH 정량화를 위해 사용하고 총 단백질로 정규화하였다(BCA 단백질 분석 키트; Pierce). 간 호모지네이트에서의 PAH 단백질 활성은 전술한 바와 같이 수행되었다.
결과
마우스 트랜스티레틴 코어 프로모터 및 HNF-3 및 -4 결합 부위가 변형된 5' 인핸서 요소를 포함하는 간 mTTR482 프로모터는 문헌[Nambiar 2016]에서 이전에 설명되었다. 본 연구의 목표는 프로모터 강도를 더욱 높이는 것이었다. 이 프로모터 상류의 다양한 간 기반 인핸서 또는 BGH pA 하류의 3' 안정성 요소를 발현 카세트에 추가한 후, 시험관내 2개의 인간 간 라인의 리포터로서 분비 알칼리 포스파타제(SEAP) 수치를 측정하였다(도 1a). Huh7 및 HepG2 세포에 SEAP 플라스미드를 일시적 형질감염시킨 결과, mA1MB2 인핸서를 포함하는 발현 카세트(#3)가 배양 배지에서 SEAP 수치가 가장 높았고 두 세포주 모두에서 모체 mTTR482 작제물보다 약 2배 더 높은 것으로 나타났다(도 1b, 도 1c). 정상적인 C57BL/6 마우스에게 유체역학적 주사로 투여된 프리바이러스 플라스미드의 생체내 평가 또한 mA1MB2 인핸서를 포함하는 플라스미드에 의한 SEAP 발현이 가장 높고 가장 지속적인 것으로 나타났다. SEAP 수치는 1일, 7일, 14일, 및 28일차에 모체 mTTR482-SEAP 플라스미드로 처치된 동물에서 검출된 것보다 각각 2.8배, 4.4배, 4배, 및 3.6배 더 높았다(도 2a). PAHenu2 마우스에서 mA1MB2 인핸서를 포함하거나 포함하지 않는 mTTR482 프리바이러스 플라스미드를 평가하였다(도 2b). mA1MB2 인핸서를 포함하는 플라스미드는 모체 mTTR482 작제물로 얻은 것보다 일관되게 2배 더 높은 혈장 SEAP 수치를 발생시켰다. SEAP는 28일간의 연구 내내 안정적으로 분비되었지만, SEAP 수치는 C57Bl/6 마우스에서 이러한 플라스미드로 얻은 것보다 PKU 마우스에서 약 10배 더 낮았다. 이 데이터를 기반으로, mA1MB2-mTTR482 프로모터를 간 프로모터 후보로 선택하였다.
실시예 2. PAH enu2 마우스에서 최적화된 간 프로모터와 LP1 프로모터의 비교
PKU 질병 모델에서 본 발명자들의 최적화된 간 프로모터를 검증하기 위해, AAV8/mA1MB2-mPAH 벡터를 생성하고, 문헌[Yagi et al. (2011)]에서 사용된 벡터와 유사한 AAV8/scLP1-mPAH와 비교하였다. 두 벡터 모두를 2가지 다른 용량(4e10 및 1e11, VG/마우스)으로 정맥내 투여하고, 혈중 Phe 수치를 측정하였다. 2가지 용량 모두에서, mA1MB2-mTTR482 벡터가 혈중 Phe 수치를 낮추는 데 있어 sc-LP1 벡터에 비해 더 효과적이었다(도 3a, 도 3b). 두 벡터 모두 더 높은 용량(1e11 vg/마우스)을 사용하여 혈중 Tyr 수치를 증가시켰고, 상승은 7일차(투여 후 첫 번째 측정)에서 이미 감지되었으며, 56일차(연구 종료)까지 상승을 유지하였다(도 3c). 혈중 Tyr 증가는 더 낮은 용량으로 처치된 동물에서도 감지되었지만, 해당 동물의 전처리 값과 크게 다르지 않았다. 간의 바이러스 벡터 게놈을 정량화한 결과, 56일차에 자기-상보성 벡터에서 2배 내지 3배 더 높은 VG 카피를 나타냈다(도 3d).
뇌 Phe 수치는 병리의 주요 원인이므로, 뇌의 Phe 수치를 측정하였다. 1e11 용량의 경우, mA1MB2-mTTR482 작제물만이 야생형 뇌(HET)와 유사한 낮은 뇌 Phe 수치를 제공하였다(도 4a). 뇌 Phe 수치의 감소는 혈액에서 측정된 Phe 수치와 밀접한 상관 관계가 있었다(도 4b). 뇌 신경전달물질 수치의 분석 결과, 두 작제물 모두에서 비슷한 도파민 상승이 나타났다(도 4c). 더 낮은(4e10) 용량의 mA1MB2-mTTR482 작제물에서도 유사한 효능이 관찰되었다. 뇌 세로토닌의 정량화 결과, mA1MB2-mTTR482 작제물을 사용한 처치에서 sc-LP1 벡터에 비해 유의하게 더 많은 세로토닌이 생성된 것으로 나타났다(도 4d). 요약하면, mA1MB2-mTTR482 작제물을 사용한 혈중 Phe 수치의 효율적인 감소는 뇌 Phe 수치를 현저히 감소시키고 후속적으로 처치 동물의 뇌에서 도파민과 세로토닌 합성을 향상시키는 것으로 해석되었다.
실시예 3. 코돈 최적화된 hPAH cDNA로부터의 hPAH 생성의 평가
이전에 발표된 연구에서는 PAHenu2 마우스에서 hPAH를 인코딩하는 rAAV 벡터의 효능이 좋지 않은 것으로 나타났다. 더 잘 생성된 hPAH로 향상된 효능을 얻을 수 있는지 여부를 시험하기 위해, 다양한 코돈 사용의 효과를 시험하였다. 이를 위해, 서로 다른 알고리즘을 기반으로 hPAH에 대한 4개의 서로 다른 코돈 최적화 cDNA를 생성하였다. 생성된 서열을 mTTR482 프로모터로부터 하류에 클로닝하고, hPAH 단백질 수치를 시험관내 및 생체내 평가하였다. 인간 Huh7 세포에 플라스미드 형질감염을 시킨 결과, hPAH cDNA 사이에 거의 차이를 보이지 않았다(모두 2배 이내)(도 5a). 발현 플라스미드를 유체역학적 주사를 통해 정상적인 C57BL/6 마우스의 간에 전달한 경우, 작제물 사이에 훨씬 더 큰 차이가 관찰되었다(도 5b). 특히, GA 알고리즘에 의해 생성된 hPAH cDNA를 사용한 발현 플라스미드는 간 용해물에서의 FLAG-태그 단백질 검출이 내인성 비변형(non) 서열을 갖는 플라스미드에 비해 7배 더 높았다. 이를 바탕으로, GA 알고리즘으로 생성된 인간 cDNA를 후속 연구에 사용하였다.
실시예 4: 시험관내 및 생체내 인간 PAH와 마우스 PAH의 비교
방법
플라스미드 벡터 및 재조합 AAV 생성.
간-특이적 프로모터(LP1 및 mTTR482), 하이브리드 인트론, 폴리아데닐화 부위(소 성장 호르몬[BGH] 및 시미안 바이러스 40[SV40])의 생성은 당업계에 알려져 있으며 문헌[Nathwani (2012) 및 Nambiar (2017)]에 기재된 바 있다. 간-특이적 또는 닭 b-액틴(CBA) 프로모터, 하이브리드 인트론, 전장(FL) 인간(h) 또는 마우스(m) PAH를 인코딩하는 cDNA, 및 BGH polyA를 포함하는 다양한 플라스미드 벡터를 작제하였다. 또한, 이중 절단 형태의 mPAH 및 hPAH(DT; 아미노산 103 내지 428) 또는 다양한 하이브리드 작제물을 포함하는 발현 카세트를 생성하였다. hPAH-DT 및 mPAH에서의 아미노산 변형을 CBA 프로모터, 하이브리드 인트론, PAH-DT, 및 BGH polyA를 포함하는 플라스미드 벡터에서 평가하였다. 변경된 DNA 서열을 합성하거나 부위-특이적 돌연변이유발(Genscript)에 의해 변경을 도입하여 PAH-DT 아미노산 서열의 변이체(V)에서 아미노산 변경을 생성하였다. 대부분의 작제물은 검출 및 정량화 목적을 위해 PAH cDNA의 상류에 있는 N-말단 22-아미노산 3xFLAG-펩티드(MDYKDHDG DYKDHDI DYKDDDDK, 서열번호 18)를 인코딩하는 서열을 포함하였다.
간-특이적 프로모터(LP1 또는 mA1MB2-mTTR482), 1069 bp의 닭 β-액틴(CBA)/토끼 β-글로빈 하이브리드 인트론, hPAH cDNA(또는 변이체) cDNA, 및 BGHpA를 포함하는 선별된 PAH 플라스미드 벡터를 AAV2 ITR 함유 플라스미드에 서브클로닝하였다. 최종 hPAH-V1 벡터 작제물은 벡터 게놈 크기를 4.6 kb로 증가시키기 위해, ATG가 제거된 변형 인트론 및 알파 1 항트립신 인트론(감소된 ATG 포함)으로부터의 0.9 kb "필러" 서열을 추가로 포함하였다. 모든 rAAV 벡터는 삼중 형질감염 방법에 이어 CsCl2 정제를 사용하여 AAV8 혈청형 캡시드로 생성되었다. BGHpA에 대한 qPCR(Martin 2013)로 벡터 로트를 정량화하였다.
PAH 단백질의 정제.
제조업체의 지침에 따라 무혈청 현탁액 배양 환경에서 Expi293F 발현 시스템 키트(LifeTechnologies)를 사용하여 Expi293F 세포(LifeTechnologies)의 일시적 형질감염을 수행하였다. 3xFLAG-태그 hPAH, hPAH-V1, 및 FL 또는 DT 형태의 mPAH를 인코딩하는 pCBA-PAH-BGHpA 발현 플라스미드를 형질감염에 사용하였다. 세포를 원심분리하고, 용해 완충액(50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 및 1% Triton X-100)에서 전체 세포 용해물을 생성하였다. FLAG-친화성 컬럼(ANTI-FLAG M2 친화성 겔; Sigma-Aldrich)을 사용하여 FLAG-태그 PAH 단백질을 정제하였다. pH 3.5의 0.1 M 글리신-HCl 또는 TBS(Sigma-Aldrich) 중의 100 ug/ml FLAG-펩티드를 사용하여 단백질을 용출시켰다. 단백질을 pH 7.4의 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl에 재현탁시켰다(일부 로트에는 안정성 향상을 위해 10%의 만니톨이 추가로 함유됨, Nascimento 2010). 단백질을 SDS-PAGE 4~12% Tris-BIS-MES 겔에서 분석하고 쿠마시 블루 염색으로 염색하였다. 또한, FLAG 펩티드 또는 PAH 단백질에 대한 항체를 사용하여 웨스턴 블롯팅으로 단백질을 분석하였다.
PAH 단백질 및 활성 수치의 정량화.
FLAG-태그 PAH 발현 카세트를 포함하는 플라스미드에 의한 HEK293T 세포의 일시적 형질감염을 Lipofectamine 2000(LifeTechnologies)을 사용하여 수행하였다. 용해 완충액 또는 RIPA 완충액(Pierce/ThermoFisher)에 세포를 용해하여 48시간 후에 전체 세포 용해물을 생성하였다. 추가적으로, 일부 실험에서는 세포 용해를 향상시키기 위해 초음파 또는 전단 처리를 사용하였다. 해동 후, 분석 전에 용해물을 14,000 g로 30분 동안 원심분리하였다. 키트 표준 또는 자체 정제된 3xFLAG-mPAH-FL을 단백질 표준으로 사용하여 제조업체의 지침에 따라 FLAG ELISA(SE002-flag; ABSbio)에 의한 FLAG-융합 단백질 수치의 정량화 측정을 수행하였다. 약간의 수정을 가하여 이전에 문헌[Yew 2013]에 기재된 바와 같이 PAH 단백질의 효소 활성을 측정하였다. PAH 검출을 위한 웨스턴 블롯팅은 당업계에 알려진 표준 프로토콜에 따라 항-hPAH 항체(LSBio) 또는 항-FLAG 항체(Sigma)를 사용하여 수행되었다.
결과
인간 및 마우스 PAH 단백질의 생성을 시험관내 Huh7 및 293 세포에서 평가하였다. hPAH 및 mPAH 생성의 정량화를 위해, N-말단 3xFLAG-태그를 모든 발현 단백질에 포함시켰다. 데이터는 전체 Huh7 세포 용해물에서 mPAH에 비해 낮은 hPAH 수치를 나타냈으며 사용된 발현 카세트와 무관했다(도 6a). hPAH의 전장(FL, 1 내지 452) 및 이중 절단(DT) 버전의 경우 mPAH에 비해 더 낮은 hPAH 생성을 나타냈다(도 6b, 도 6c). DT 버전은 아미노산 103 내지 428로 이루어진 PAH의 짧아진 항시 활성 형태이므로, PAH의 N-말단 조절 도메인과 C-말단 사량체화 도메인이 모두 결여되어 있다.
각 작제물에 대한 mRNA의 정량화는 비슷한 메시지 수준을 나타냈으며, 이는 hPAH 및 mPAH 단백질 수치의 차이가 전사후 효과임을 나타낸다(도 6d). FLAG 친화성 컬럼을 사용하여 hPAH 및 mPAH(FL 및 DT 형태)를 정제한 경우, 인간 PAH(FL 및 DT 형태 모두)는 마우스 PAH에서 관찰되지 않은 매우 뚜렷한 분해 패턴을 나타냈다(도 6e).
인간 및 mPAH를 인코딩하는 rAAV8/sc-LP1 벡터를 PAHenu2 마우스에서 시험하였다. mPAH를 인코딩하는 벡터로 처치된 동물은 정상적인 혈중 Phe 수치를 나타냈지만, 비슷한 용량의 hPAH 벡터로 처치된 마우스에서는 혈중 Phe 수치의 감소가 거의 관찰되지 않았다(도 6f). mPAH를 인코딩하는 sc-LP1 벡터의 효능은 이전에 입증된 바 있다(Yagi 2011).
종합하면, 이 데이터는 내인성 형태의 hPAH가 mPAH보다 덜 강력하다는 것과 이것이 시험관 내에서 관찰된 hPAH 단백질의 낮은 생성/안정성과 상관 관계가 있음을 보여주었다.
실시예 5: 인간 PAH에 대한 개선된 변이체의 생성
mPAH로부터 유래된 다양한 길이의 N-말단 또는 C-말단 서열을 포함하는 하이브리드 hPAH 작제물을 생성하였다(도 7a). 이 작제물들을 시험관내 FLAG-태그 단백질 생성에 대해 시험하였고, hPAH의 N-말단 또는 C-말단을 상응하는 마우스 서열로 대체해도 단백질 수치가 향상되지 않은 것으로 나타났다(도 7b, 도 7c). 따라서, 촉매 코어를 포함하는 영역(103 내지 448, DT)이 mPAH의 안정성을 담당하였다.
hPAH 코어 영역의 안정성을 향상시키기 위해, hPAH-DT 백본에 다양한 변형을 도입하였다. hPAH-DT 백본을 사용하여 hPAH 서열에 다양한 아미노산 변형을 도입하였다. 아미노산 변경은 마우스, 닭, 및 박테리아를 포함한 다른 종의 PAH의 아미노산 서열로부터 모델링되었다(표 1). 또한, 모든 작제물은 유연한 N-말단에 3x-FLAG-태그를 포함하였다. 인간 변이체(V; V1 내지 V13)를 시험관내 293 세포에서 발현시키고, 전체 세포 용해물을 PAH 단백질 및 활성 수치에 대해 정량화하고 hPAH 및 mPAH의 DT 버전과 비교하였다(도 8a). 단백질 정량화 결과, V1, V5(V1에 비해 하나의 추가적 변경), 및 V8(V1과 다른 2개의 아미노산 변경)과 같은 일부 hPAH 변이체에서 단백질 수치가 변형되지 않은 hPAH에 비해 증가한 것으로 나타났다. 그러나, 이 변이체들을 PAH 효소 활성에 대해 시험한 경우, V1만이 유의하게 향상된 PAH 활성을 가졌다(도 8b). V1은 촉매 도메인의 3개의 다른 부분에 위치한 4개의 아미노산 변경 M180T, K199P, S250P, 및 G256A로 구성되었다. 작제물 V9 내지 V13에서는 변경이 관찰되지 않았다(데이터는 표시되지 않음).
Figure pct00001
V1의 추가 유도체를 생성하였다. 첫 번째 세트에는 아미노산 중 하나만 변경된 작제물이 포함되었다(V14 내지 V17, 표 1). PAH 활성 결과에서는 이들 모두 변형되지 않은 hPAH와 유사한 낮은 PAH 수치 및 활성을 갖는 것으로 나타났고, 따라서 이러한 변경만으로는 어떠한 개선도 제공하지 않음을 나타낸다(도 9a 내지 도 9c, 도 10a 내지 도 10c). 두 번째 작제물 세트는 4개의 아미노산 중 하나가 인간 야생형 아미노산으로 역전된 V1의 유도체였다.
Figure pct00002
이어서, 3개의 아미노산 변경이 충분한지(V18 내지 V21) 여부를 결정하였다. 이들 중 최고인, S250P 변경이 없는 V20은 V1 활성의 약 67%를 나타냈다(도 9a). 흥미롭게도, 이 변이체는 PAH 단백질 수치의 감소로 인해 전체 효소 활성이 더 낮음에도 불구하고 모체 V1에 비해 2배 향상된 고유 활성을 가졌다(도 9b, 도 9c).
인간 PAH 변이체-1의 이중돌연변이 유도체 세트를 또한 시험하였다. 단일 돌연변이 시리즈(V14 내지 V17)와 달리, 이중돌연변이 V29 및 V30에서는 활성이 약간 향상되었지만, V1에서만큼은 아니다(도 10d).
V1을 더욱 개선하기 위해, 추가적 변경을 도입하였고, 이들 중 일부는 고유 활성을 증가시키도록 설계되었다(V22 내지 V28, 표 2). 이러한 변경이 총 PAH 활성을 향상시키지는 않았지만, 일부 변형은 PAH 단백질 수치 또는 고유 활성을 향상시켰다. 예를 들어, V23은 PAH 단백질이 hPAH-V1보다 2배 더 높았다.
mPAH에 대한 "역" 돌연변이유발은 103 내지 428 영역 내의 hPAH에 존재하는 잔기에 대해 한 번에 2개 또는 3개의 잔기를 순차적으로 변경하여 수행되었다. 이 영역에 걸친 5개의 작제물에 대한 활성 시험 결과, 이러한 변경 중 어느 것도 hPAH에 대해 관찰된 수준까지 mPAH 생성을 감소시키지 못한 것으로 나타났다(데이터는 표시되지 않음).
Figure pct00003
전장 단백질로서 최고 성능의 변이체(V1)를 인코딩하고 A1MB2-mTTR 프로모터로부터 발현되는 발현 카세트를 작제하였다. 플라스미드를 Huh7 세포에 형질감염시킨 후, 이 작제물을 PAH 단백질 생성 및 활성에 대해 유사한 마우스 및 hPAH 발현 플라스미드와 비교하였다. 데이터는 hPAH-V1에 의해 내인성 hPAH에 비해 약 10배 향상된 PAH 단백질 생성 및 활성을 보여주었다(도 11a 내지 도 11c). 모든 PAH 단백질은 활성 대 단백질 비가 비슷했고, 이는 거의 유사한 고유 활성을 나타낸다.
종합하면, 데이터는 아미노산 변경(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 아미노산 변경)에 의해 인간 PAH의 특성을 개선할 수 있는 가능성을 보여주었고, 이들 모두는 관찰된 개선에 기여하였다.
실시예 6: PAH-V1에 의한 고페닐알라닌혈증의 교정
방법
혈액 및 조직 분석.
실시예 1 내지 3에 기재된 바와 같이 뇌 및 조직 분석을 수행하였다.
동물 실험.
실시예 1 내지 3에 기재된 바와 같이 동물 실험을 수행하였다.
결과
변형된 hPAH의 생체내 효능을 시험하기 위해, hPAH-V1을 인코딩하는 rAAV8 벡터뿐만 아니라, 마우스 또는 hPAH를 포함하는 유사한 벡터를 생성하였다(모두 FL 버전). hPAH-V1을 발현하는 벡터는 PKU의 PAHenu2 마우스 모델에서 혈중 Phe 수치의 빠른 감소뿐만 아니라 혈중 Tyr의 증가를 나타냈다(도 12a, 도 12b). 혈액에서 측정된 다양한 Phe 대사산물에서도 유사한 효과가 관찰되었다(도 12c). 전반적으로, 변형된 hPAH-V1이 이러한 모든 평가변수에 대해 내인성 hPAH에 비해 더 효과적이었다. hPAH-V1의 향상된 효능은 간의 PAH 단백질 수치 및 활성 향상과 직접적으로 상관 관계가 있었다(도 13a, 도 13b). 모든 처치 그룹은 간에서 비슷한 벡터 게놈 카피를 가졌다(도 13c).
(3e11 VG/마우스 처치 그룹에 대해 수행된) 다양한 뇌 평가변수를 분석하였다. 데이터는 처치된 마우스의 뇌에서 나이브 PAHenu2 마우스와 비교하여 Phe 수치의 유의한 감소 및 Tyr 수치의 증가를 보여주었다(도 14a, 도 14b). 뇌 Phe 수치의 변화는 혈중 Phe 수치의 감소와 밀접한 상관 관계가 있었고, 또한 hPAH-V1 처치 그룹에 의해 더 나은 Phe 제어를 나타냈다(도 14c). 아미노산 Phe, Tyr, 및 Trp는 모두 동일한 대형 중성 아미노산 수송체(LAT1)를 사용하므로, 뇌 Trp 수치에서 유사한 개선이 관찰되었다(도 14d). hPAH와 hPAH-V1은 모두 뇌에서 이러한 아미노산 수치의 비슷한 증가를 나타냈다.
처치된 마우스의 뇌에서의 뇌 신경전달물질인 도파민과 세로토닌의 수치 및 이들의 대사산물 수치를 측정하였다. 데이터는 hPAH-V1 처치된 동물에서 hPAH와 비교하여 이러한 신경전달물질의 유의하게 더 높은 증가를 나타냈다(도 15a 내지 도 15d).
요약하면, hPAH-V1 단백질의 개선된 특성은 혈액 및 뇌 Phe 수치를 낮추는 능력뿐만 아니라 뇌의 Tyr 및 신경전달물질 수치를 높이는 능력을 향상시키는 것으로 해석되었다. 비슷한 벡터 게놈 수치가 간에 존재했으므로, 데이터는 hPAH-V1 인코딩 벡터로 얻어지는 더 높은 효능을 나타냈다.
mA1MB2-mTTR482 프로모터/hPAH-V1 벡터에 대한 4.6 kb 게놈을 생성하였다. BGH pA로부터 하류에 도입된 스터퍼 서열 외에, 이 게놈은 인트론 서열에 "ATG" 서열을 포함하지 않았다(도 16a). 이 벡터를 PAHenu2 마우스에서 시험한 경우, 모체인 3.8 kb 벡터와 비교하면, 혈중 Phe 수치의 감소로서 측정된 훨씬 더 나은 효능이 관찰되었다(도 16b). 이 실험에는 PAH 단백질 수치를 측정하기 위해 사용된 N-말단 FLAG-태그가 결여된 4.6 kb 벡터도 포함되었다. 데이터는 이 태그의 제거가 벡터 게놈의 효능을 변경하지 않았음을 보여주었다. 종합하면, 변형된 hPAH-V1은 내인성 hPAH에 비해 향상된 효능을 제공하므로, hPAH 인코딩 벡터에 비해 더 낮은 벡터 용량으로 효능을 제공할 것으로 예상된다.
실시예 7. NHP 간에서의 향상된 hPAH-V1 단백질 수치
재료 및 방법:
재조합 AAV 벡터의 작제
A1MB2-HI-hPAH 및 A1MB2-HI-hPAH-V1의 벡터 생성은 하이브리드 캡시드를 사용한 것을 제외하고는, 실시예 4에 기재된 바와 같이 수행되었다.
동물 실험
2~3세(2~4 kg)의 수컷 사이노몰구스 원숭이(Macaca fascicularis)의 복재 정맥에 천천히 정맥내 주입하여(1 ml/분) 10 ml의 시험 검체를 투여하였다. 처치 그룹은 비히클 그룹(PBS, n=1), rAAV/hPAH(n=3), 및 rAAV/hPAH-V1(n=3)으로 구성되었다. 동물을 2주 후 인도적으로 안락사시키고, 다양한 조직을 수집하여 분석 전까지 -80℃에서 냉동시켰다.
벡터 게놈, mRNA, 및 PAH 단백질의 정량화
간 및 비장의 벡터 게놈 및 벡터 유래 mRNA 카피를 실시예 1 내지 3에 기재된 바와 같이 BGHpA에 대한 프라이머/프로브를 사용하여 qPCR로 정량화하였다. 간 호모지네이트에서의 인간 PAH 단백질 수치를 실시예 1 내지 3에 기재된 바와 같이 FLAG-태그에 대한 웨스턴 블롯으로 분석하였다.
결과:
NHP 간에서의 A1MB2-mTTR 프로모터의 기능을 시험하기 위해, 벡터 전달 후 mRNA와 PAH 생성 수준을 모두 평가하였다. 평균적으로, 벡터 처치된 모든 동물의 간에서 비슷한 벡터 및 벡터 유래 mRNA 수치가 검출되었다(벡터 게놈 카피로 정규화됨)(도 17a, 도 17b). 간과 비장의 벡터 mRNA(두 조직 모두에서 벡터 게놈 카피로 정규화된 mRNA 수치)를 비교하여 발현의 간-특이성을 분석하고, 비장에 비해 간에서 더 높은 전사체/VG 비를 입증하였다(도 17b). 또한, 간에서의 벡터 유래 FLAG-태그 PAH 단백질 검출을 시험하여 형질도입을 평가하였다. PAH-V1 인코딩 벡터로 처치된 모든 동물의 간에서 정확한 크기의 hPAH-V1이 존재하는 것으로 나타났다. 대조적으로, hPAH 인코딩 벡터로 처치된 동물에서는 hPAH 단백질이 거의 또는 전혀 검출되지 않았다(도 17c). 벡터 게놈과 mRNA 수치는 모두 두 처치 그룹에서 비슷했으므로, 이러한 결과는 NHP 간에서의 hPAH-V1 단백질의 더 나은 안정성을 나타낸다. 이러한 관찰은 마우스에서 수행된 연구뿐만 아니라 인간의 간 세포주를 사용한 시험관내 연구에서도 유사했으며, 이는 모든 시험 시스템에서 hPAH-V1의 우월성을 나타낸다.
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서열
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
SEQUENCE LISTING <110> GENZYME CORPORATION <120> GENERATION OF IMPROVED HUMAN PAH FOR TREATMENT OF SEVERE PKU BY LIVER-DIRECTED GENE REPLACEMENT THERAPY <130> 15979-20166.00 <140> Not Yet Assigned <141> Concurrently Herewith <150> US 62/744,944 <151> 2018-10-12 <160> 18 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 452 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ser Thr Ala Val Leu Glu Asn Pro Gly Leu Gly Arg Lys Leu Ser 1 5 10 15 Asp Phe Gly Gln Glu Thr Ser Tyr Ile Glu Asp Asn Cys Asn Gln Asn 20 25 30 Gly Ala Ile Ser Leu Ile Phe Ser Leu Lys Glu Glu Val Gly Ala Leu 35 40 45 Ala Lys Val Leu Arg Leu Phe Glu Glu Asn Asp Val Asn Leu Thr His 50 55 60 Ile Glu Ser Arg Pro Ser Arg Leu Lys Lys Asp Glu Tyr Glu Phe Phe 65 70 75 80 Thr His Leu Asp Lys Arg Ser Leu Pro Ala Leu Thr Asn Ile Ile Lys 85 90 95 Ile Leu Arg His Asp Ile Gly Ala Thr Val His Glu Leu Ser Arg Asp 100 105 110 Lys Lys Lys Asp Thr Val Pro Trp Phe Pro Arg Thr Ile Gln Glu Leu 115 120 125 Asp Arg Phe Ala Asn Gln Ile Leu Ser Tyr Gly Ala Glu Leu Asp Ala 130 135 140 Asp His Pro Gly Phe Lys Asp Pro Val Tyr Arg Ala Arg Arg Lys Gln 145 150 155 160 Phe Ala Asp Ile Ala Tyr Asn Tyr Arg His Gly Gln Pro Ile Pro Arg 165 170 175 Val Glu Tyr Met Glu Glu Glu Lys Lys Thr Trp Gly Thr Val Phe Lys 180 185 190 Thr Leu Lys Ser Leu Tyr Lys Thr His Ala Cys Tyr Glu Tyr Asn His 195 200 205 Ile Phe Pro Leu Leu Glu Lys Tyr Cys Gly Phe His Glu Asp Asn Ile 210 215 220 Pro Gln Leu Glu Asp Val Ser Gln Phe Leu Gln Thr Cys Thr Gly Phe 225 230 235 240 Arg Leu Arg Pro Val Ala Gly Leu Leu Ser Ser Arg Asp Phe Leu Gly 245 250 255 Gly Leu Ala Phe Arg Val Phe His Cys Thr Gln Tyr Ile Arg His Gly 260 265 270 Ser Lys Pro Met Tyr Thr Pro Glu Pro Asp Ile Cys His Glu Leu Leu 275 280 285 Gly His Val Pro Leu Phe Ser Asp Arg Ser Phe Ala Gln Phe Ser Gln 290 295 300 Glu Ile Gly Leu Ala Ser Leu Gly Ala Pro Asp Glu Tyr Ile Glu Lys 305 310 315 320 Leu Ala Thr Ile Tyr Trp Phe Thr Val Glu Phe Gly Leu Cys Lys Gln 325 330 335 Gly Asp Ser Ile Lys Ala Tyr Gly Ala Gly Leu Leu Ser Ser Phe Gly 340 345 350 Glu Leu Gln Tyr Cys Leu Ser Glu Lys Pro Lys Leu Leu Pro Leu Glu 355 360 365 Leu Glu Lys Thr Ala Ile Gln Asn Tyr Thr Val Thr Glu Phe Gln Pro 370 375 380 Leu Tyr Tyr Val Ala Glu Ser Phe Asn Asp Ala Lys Glu Lys Val Arg 385 390 395 400 Asn Phe Ala Ala Thr Ile Pro Arg Pro Phe Ser Val Arg Tyr Asp Pro 405 410 415 Tyr Thr Gln Arg Ile Glu Val Leu Asp Asn Thr Gln Gln Leu Lys Ile 420 425 430 Leu Ala Asp Ser Ile Asn Ser Glu Ile Gly Ile Leu Cys Ser Ala Leu 435 440 445 Gln Lys Ile Lys 450 <210> 2 <211> 452 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ser Thr Ala Val Leu Glu Asn Pro Gly Leu Gly Arg Lys Leu Ser 1 5 10 15 Asp Phe Gly Gln Glu Thr Ser Tyr Ile Glu Asp Asn Cys Asn Gln Asn 20 25 30 Gly Ala Ile Ser Leu Ile Phe Ser Leu Lys Glu Glu Val Gly Ala Leu 35 40 45 Ala Lys Val Leu Arg Leu Phe Glu Glu Asn Asp Val Asn Leu Thr His 50 55 60 Ile Glu Ser Arg Pro Ser Arg Leu Lys Lys Asp Glu Tyr Glu Phe Phe 65 70 75 80 Thr His Leu Asp Lys Arg Ser Leu Pro Ala Leu Thr Asn Ile Ile 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Phe Arg Val Phe His Cys Thr Gln Tyr Ile Arg His Gly 260 265 270 Ser Lys Pro Met Tyr Thr Pro Glu Pro Asp Ile Cys His Glu Leu Leu 275 280 285 Gly His Val Pro Leu Phe Ser Asp Arg Ser Phe Ala Gln Phe Ser Gln 290 295 300 Glu Ile Gly Leu Ala Ser Leu Gly Ala Pro Asp Glu Tyr Ile Glu Lys 305 310 315 320 Leu Ala Thr Ile Tyr Trp Phe Thr Val Glu Phe Gly Leu Cys Lys Gln 325 330 335 Gly Asp Ser Ile Lys Ala Tyr Gly Ala Gly Leu Leu Ser Ser Phe Gly 340 345 350 Glu Leu Gln Tyr Cys Leu Ser Glu Lys Pro Lys Leu Leu Pro Leu Glu 355 360 365 Leu Glu Lys Thr Ala Ile Gln Asn Tyr Thr Val Thr Glu Phe Gln Pro 370 375 380 Leu Tyr Tyr Val Ala Glu Ser Phe Asn Asp Ala Lys Glu Lys Val Arg 385 390 395 400 Asn Phe Ala Ala Thr Ile Pro Arg Pro Phe Ser Val Arg Tyr Asp Pro 405 410 415 Tyr Thr Gln Arg Ile Glu Val Leu Asp Asn Thr Gln Gln Leu Lys Ile 420 425 430 Leu Ala Asp Ser Ile Asn Ser Glu Ile Gly Ile Leu Cys Ser Ala Leu 435 440 445 Gln Lys Ile Lys 450 <210> 4 <211> 1359 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 atgagcacag 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atcaacatcc tggacttatc 300 ctctgggcct ctccccacct tcgatggccc caggttaatt tttaaaaagc agtcaaaggt 360 caaagtggcc cttggcagca tttactctct ctattgactt tggttaataa tctcaggagc 420 acaaacattc ctggaggcag gagaagaaat caacatcctg gacttatcct ctgggcctct 480 ccccaccgat atctacctgc tgatcgcccg gcccctgttc aaacatgtcc taatactctg 540 tcggggcaaa ggtcggcagt agttttccat cttactcaac atcctcccag tgtacgtagg 600 atcctgtctg tctgcacatt tcgtagagcg agtgttccga tactctaatc tcccggggca 660 aaggtcgtat tgacttaggt tacttattct ccttttgttg actaagtcaa taatcagaat 720 cagcaggttt ggagtcagct tggcagggat cagcagcctg ggttggaagg agggggtata 780 aaagcccctt caccaggaga agccgtcaca cagatccaca agctcctgct agcagtcgct 840 gcgcgctgcc ttcgccccgt gccccgctcc gccgccgcct cgcgccgccc gccccggctc 900 tgactgaccg cgttactccc acaggtgagc gggcgggacg gcccttctcc tccgggctgt 960 aattagcgct tggtttaatg acggcttgtt tcttttctgt ggctgcgtga aagccttgag 1020 gggctccggg aaggcccttt gtgcgggggg agcggctcgg ggggtgcgtg cgtgtgtgtg 1080 tgcgtgggga gcgccgcgtg cggctccgcg ctgcccggcg gctgtgagcg 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gatcggcatc ctgtgcagcg ccctgcagaa aatcaagtga actagtctgt gccttctagt 3300 tgccagccat ctgttgtttg cccctccccc gtgccttcct tgaccctgga aggtgccact 3360 cccactgtcc tttcctaata aaatgaggaa attgcatcgc attgtctgag taggtgtcat 3420 tctattctgg ggggtggggt ggggcaggac agcaaggggg aggattggga agacaatagc 3480 aggcatgctg gggatgcggt gggctctata ccggtccagg ggtgagtgaa ggtttggaag 3540 agtgtagcag aataagaaac catgagtccc ctccctgaga agccctgagc ccccttgacg 3600 acacacatcc ctcgaggctc agcttcatca tctgtaaaag gtgctgaaac tgaccatcca 3660 agctgccgaa aaagattgtg tggggataat tcaaaactag aggaagatgc agaatttcta 3720 catcgtggcg atgtcaggct aagagttgcc atcgtggctg tccatcgatt ttattggaat 3780 catatgttta tttgagggtg tcttggatat tacaaataaa ttgttggagc atcaggcata 3840 tttggtaatt ctgtctaagg ctccctgccc cttgttaatt ggcagctcag ttattcatcc 3900 agggcaaaca ttctgcttac tattcctgag agctttcctc atcctctaga ttggcagggg 3960 aattgcagtt gcctgagcag cctcccctct gccataccaa cagagcttca ccatcgaggc 4020 ttgcagagtg gacaggggcc tcagggaccc ctgatcccag ctttctcatt ggacagaagg 4080 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ttggtgtaaa gccaacaccc tgtctaaaaa 480 acataaattt ctttaatcat tttgcctctt ttctctgtgc ttcaattaat aaaaaatgga 540 aagaatctaa tagagtggta cagcactgtt atttttcaaa gatgtgttgc tatcctgaaa 600 attctgtagg ttctgtggaa gttccagtgt tctctcttat tccacttcgg tagaggattt 660 ctagtttctt gtgggctaat taaataaatc attaatactc ttctaagtta tggattataa 720 acattcaaaa taatattttg acattatgat aattctgaat aaaagaacaa aaaccatggt 780 ataggtaagg aatataaaac atggctttta ccttagaaaa aacaattcta aaattcatat 840 ggaatcaaaa aagagcctgc aggtaccct 869 <210> 13 <211> 1302 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 13 ctcaattgga tgacactagt catcacattt aaaagcatct caggtaacta tattttgaat 60 tttttaaaaa agtaactata atagttatta ttaaaatagc aaagattgac catttccaag 120 agccatatag accagcaccg accactattc taaactattt atgtatgtaa atattagctt 180 ttaaaattct caaaatagtt gctgagttgg gaaccactat tatttctatc tactgtttta 240 attaaaatta tctctaaggc atgtgaactg gctgtcttgg ttttcatctg tacttcatct 300 gctacctctg tgacctgaaa catatttata attccattaa gctgtgcata 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caaaaaccat ggtataggta aggaatataa aacatggctt ttaccttaga aaaaacaatt 1260 ctaaaattca tatggaatca aaaaagagcc tgcaggtacc ct 1302 <210> 14 <211> 1359 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 14 atgagcacag ccgtgctgga aaaccccggc ctgggcagaa agctgagcga cttcggccag 60 gaaaccagct acatcgagga caactgcaac cagaacggcg ccatcagcct gatcttcagc 120 ctgaaagaag aagtgggcgc cctggccaag gtgctgcggc tgttcgaaga gaacgacgtg 180 aacctgaccc acatcgagag ccggcccagc agactgaaga aggacgagta cgagttcttc 240 acccacctgg acaagcggag cctgcccgcc ctgaccaaca tcatcaagat cctgcggcac 300 gacatcggcg ccaccgtgca cgagctgagc cgggacaaga aaaaggacac cgtgccctgg 360 ttccccagaa ccatccagga actggacaga ttcgccaacc agatcctgtc ctacggcgcc 420 gagctggatg ccgaccaccc tggcttcaag gaccccgtgt accgggccag acggaagcag 480 ttcgccgata tcgcctacaa ctaccggcac ggccagccca tccccagagt cgagtacatg 540 gaagagggca agaaaacctg gggcaccgtg ttcaagaccc tgaagtccct gtacaagacc 600 cacgcctgct acgagtacaa ccacatcttc ccactgctcg agaagtactg cggcttccac 660 gaggacaata 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tactcccaca ggtgagcggg cgggacggcc cttctcctcc 120 gggctgtaat tagcgcttgg tttattgacg gcttgtttct tttctgtggc tgcgtgaaag 180 ccttgagggg ctccgggaag gccctttgtg cggggggagc ggctcggggg gtgcgtgcgt 240 gtgtgtgtgc gtggggagcg ccgcgtgcgg ctccgcgctg cccggcggct gtgagcgctg 300 cgggcgcggc gcggggcttt gtgcgctccg cagtgtgcgc gaggggagcg gggccggggg 360 cggtgccccg cggtgcgggg ggggctgcga ggggaacaaa ggctgcgtgc ggggtgtgtg 420 cgtggggggg tgagcagggg gtgtgggcgc gtcggtcggg ctgcaacccc ccctgcaccc 480 ccctccccga gttgctgagc acggcccggc ttcgggtgcg gggctccgta cggggcgtgg 540 cgcggggctc gccgtgccgg gcggggggtg gcggcaggtg ggggtgccgg gcggggcggg 600 gccgcctcgg gccggggagg gctcggggga ggggcgcggc ggcccccgga gcgccggcgg 660 ctgtcgaggc gcggcgagcc gcagccattg ccttttttgg taatcgtgcg agagggcgca 720 gggacttcct ttgtcccaaa tctgtgcgga gccgaaatct gggaggcgcc gccgcacccc 780 ctctagcggg cgcggggcga agcggtgcgg cgccggcagg aaggaattgg gcggggaggg 840 ccttcgtgcg tcgccgcgcc gccgtcccct tctccctctc cagcctcggg gctgtccgcg 900 gggggacggc tgccttcggg ggggacgggg cagggcgggg ttcggcttct ggcgtgtgac 960 cggcggctct agagcctctg ctaaccttgt tcttgccttc ttctttttcc tacagctcct 1020 gggcaacgtg ctggttattg tgctgtctca tcattttggc aaagaattc 1069 <210> 16 <211> 901 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 16 ccaggggtga gtgaaggttt ggaagagtgt agcagaataa gaaaccatga gtcccctccc 60 tgagaagccc tgagccccct tgacgacaca catccctcga ggctcagctt catcatctgt 120 aaaaggtgct gaaactgacc atccaagctg ccgaaaaaga ttgtgtgggg ataattcaaa 180 actagaggaa gatgcagaat ttctacatcg tggcgatgtc aggctaagag ttgccatcgt 240 ggctgtccat cgattttatt ggaatcatat gtttatttga gggtgtcttg gatattacaa 300 ataaattgtt ggagcatcag gcatatttgg taattctgtc taaggctccc tgccccttgt 360 taattggcag ctcagttatt catccagggc aaacattctg cttactattc ctgagagctt 420 tcctcatcct ctagattggc aggggaattg cagttgcctg agcagcctcc cctctgccat 480 accaacagag cttcaccatc gaggcttgca gagtggacag gggcctcagg gacccctgat 540 cccagctttc tcattggaca gaaggaggag actggggctg gagagggacc tgggccccca 600 ctaaggccac agcagagcca ggactttagc tgtgctgact gcagcctggc ttgcctccac 660 tgccctcctt tgcctcaaga gcaagggagc ctcagagtgg aggaagcagc ccctggcctt 720 gcctcccacc tcccctcccc tttgctgttt tcctgggaca gtgggagctg gcttagattg 780 ccctggggcc cccaggaccc tggcatttta acccctcagg ggcaggaagg cagcctgaga 840 tacagaagag tccatcacct gctgtatgcc acacaccatc cccacagtcg acatttaaat 900 t 901 <210> 17 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 17 cactccctct ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccggg cgaccaaagg tcgcccacgc 60 ccgggctttg cccgggcg 78 <210> 18 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 18 Met Asp Tyr Lys Asp His Asp Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp Ile Asp 1 5 10 15 Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 20

Claims (136)

  1. 야생형 인간 PAH 폴리펩티드의 M180, K199, S250, 및 G256으로부터 선택되는 부위에 2개의 아미노산 치환을 포함하는 변이 페닐알라닌 하이드록실라제(PAH) 폴리펩티드.
  2. 야생형 인간 PAH 폴리펩티드의 M180, K199, S250, 및 G256으로부터 선택되는 부위에 3개의 아미노산 치환을 포함하는 변이 페닐알라닌 하이드록실라제(PAH) 폴리펩티드.
  3. 야생형 인간 PAH 폴리펩티드의 M180, K199, S250, 및 G256 부위에 4개의 아미노산 치환을 포함하는 변이 페닐알라닌 하이드록실라제(PAH) 폴리펩티드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 치환이 M180T, K199P, S250P, 및 G256A 중 하나 이상을 포함하는, 변이 PAH 폴리펩티드.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 치환이 K199P, S250P, 및 G256A; M180T, S250P, 및 G256A; M180T, K199P, 및 G256A; 또는 M180T, K199P, 및 S250P를 포함하는, 변이 PAH 폴리펩티드.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 치환이 M180T, K199P, S250P, 및 G256A를 포함하는, 변이 PAH 폴리펩티드.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, H264P, G272A, G272P, P275L, P279Q, G272P 및 P275L, 또는 T323R 및 F327T 아미노산 치환을 추가로 포함하는 변이 PAH 폴리펩티드.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 야생형 인간 PAH 폴리펩티드가 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는, 변이 PAH 폴리펩티드.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 PAH 폴리펩티드인 변이 PAH 폴리펩티드.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 약 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 변이 PAH 폴리펩티드.
  11. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 변이 PAH 폴리펩티드.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 야생형 인간 PAH 폴리펩티드의 G33A, G46A, G46P, G103A, G139A, G139P, G148A, G188A, G218A, G239A, G247A, G257A, G272A, G289A, G307A, G312A, G332A, G337A, G344A, G352A, 및 G442A로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함하는 변이 PAH 폴리펩티드.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 야생형 인간 PAH 폴리펩티드의 P9G, G10V, G12S, K184R, K192R, S196A, Y206H, H220R, Q336E, E360D, I374C, N376E, N401T, I421V, I441V, S446H, 및 453번 위치에서의 S의 추가로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함하는 변이 PAH 폴리펩티드.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 야생형 인간 PAH 폴리펩티드의 F240W, A246P, G247A, Y268W, C284F, T323R, F327Y, E319P, I306(Y,F), K113P, G188A, F191Y, T193R, Y206H, G337P, 및 N376P로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함하는 변이 PAH 폴리펩티드.
  15. 야생형 인간 PAH 폴리펩티드의 G33A, G46A, G46P, G103A, G139A, G139P, G148A, G188A, G218A, G239A, G247A, G257A, G272A, G289A, G307A, G312A, G332A, G337A, G344A, G352A, 및 G442A로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 변이 PAH 폴리펩티드.
  16. 야생형 인간 PAH 폴리펩티드의 P9G, G10V, G12S, K184R, K192R, S196A, Y206H, H220R, Q336E, E360D, I374C, N376E, N401T, I421V, I441V, S446H, 및 453번 위치에서의 S의 추가로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 변이 PAH 폴리펩티드.
  17. 야생형 인간 PAH 폴리펩티드의 F240W, A246P, G247A, Y268W, C284F, T323R, F327Y, E319P, I306(Y,F), K113P, G188A, F191Y, T193R, Y206H, G337P, 및 N376P로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 변이 PAH 폴리펩티드.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, N-말단 절단을 포함하는 변이 PAH 폴리펩티드.
  19. 제18항에 있어서, N-말단 절단이 N-말단 조절 도메인의 절단을 포함하는, 변이 PAH 폴리펩티드.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, N-말단 절단이 야생형 PAH 폴리펩티드의 아미노산 잔기 1 내지 102의 절단을 포함하는, 변이 PAH 폴리펩티드.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, C-말단 절단을 포함하는 변이 PAH 폴리펩티드.
  22. 제21항에 있어서, C-말단 절단이 사량체화 도메인의 절단을 포함하는, 변이 PAH 폴리펩티드.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, C-말단 절단이 야생형 PAH 폴리펩티드의 아미노산 잔기 429 내지 452의 절단을 포함하는, 변이 PAH 폴리펩티드.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 야생형 PAH 폴리펩티드의 아미노산 잔기 103 내지 428에 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 변이 PAH 폴리펩티드.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 잠재적인 프로테아제 절단 부위를 제거하기 위한 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 변이 PAH 폴리펩티드.
  26. 제25항에 있어서, 잠재적인 프로테아제 절단 부위를 제거하기 위한 하나 이상의 아미노산 치환이 야생형 PAH 폴리펩티드의 270 내지 295번 및/또는 380 내지 405번 위치에 위치하는, 변이 PAH 폴리펩티드.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 간 표적화 폴리펩티드에 융합되는 변이 PAH 폴리펩티드.
  28. 제27항에 있어서, 간 표적화 폴리펩티드가 HGF 또는 이의 단편이거나, 간세포 비시알로당단백질 수용체에 결합하는 당단백질인, 변이 PAH 폴리펩티드.
  29. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, PEG화 및/또는 니트로실화된 변이 PAH 폴리펩티드.
  30. 제26항에 있어서, 374번 위치의 cys 잔기가 니트로실화된 I374C 아미노산 치환을 포함하는 변이 PAH 폴리펩티드.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항의 변이 PAH 폴리펩티드를 포함하는 조성물.
  32. 제31항에 있어서, 제약상 허용되는 담체를 추가로 포함하는 조성물.
  33. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항의 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩하는 단리된 핵산.
  34. 제33항에 있어서, 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산이 프로모터에 작동 가능하게 연결된, 단리된 핵산.
  35. 제34항에 있어서, 프로모터가 사이토메갈로바이러스(CMV) 조기 발현 프로모터, RSV LTR, MoMLV LTR, 포스포글리세레이트 키나제-1(PGK) 프로모터, 시미안 바이러스 40(SV40) 프로모터, CK6 프로모터, 트랜스티레틴 프로모터(TTR), mTTR482 프로모터, mA1MB2-mTTR482 프로모터, TK 프로모터, 테트라사이클린 반응성 프로모터(TRE), HBV 프로모터, hAAT 프로모터, LSP 프로모터, LP1 프로모터, 키메라 간-특이적 프로모터(LSP), E2F 프로모터, 텔로머라제(hTERT) 프로모터, 사이토메갈로바이러스 인핸서/닭 베타-액틴/토끼 β-글로빈 프로모터(CAG) 프로모터, 신장인자 1-알파 프로모터(EF1-알파) 프로모터, 인간 β-글루쿠로니다제 프로모터, 닭 β-액틴(CBA) 프로모터, 변형된 닭 β-액틴(CBA) 프로모터 또는 서열번호 17, 레트로바이러스성 라우스 육종 바이러스(RSV) LTR 프로모터, 디하이드로엽산 환원효소 프로모터, 및 13-액틴 프로모터로부터 선택되는, 단리된 핵산.
  36. 제34항 또는 제35항에 있어서, 프로모터가 LP1 프로모터 또는 mA1MB2-mTTR482 프로모터인, 단리된 핵산.
  37. 제33항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리아데닐화 신호를 추가로 포함하는 단리된 핵산.
  38. 제37항에 있어서, 폴리아데닐화 신호가 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호, SV40 폴리아데닐화 신호, 또는 HSV TK pA인, 단리된 핵산.
  39. 제33항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 인트론을 추가로 포함하는 단리된 핵산.
  40. 제39항에 있어서, 인트론이 닭 β-액틴(CBA)/토끼 β-글로빈 하이브리드 인트론인, 단리된 핵산.
  41. 제39항에 있어서, 인트론이 서열번호 15의 변형된 닭 β-액틴(CBA)/토끼 β-글로빈 하이브리드 인트론인, 단리된 핵산.
  42. 제33항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 ITR을 추가로 포함하는 단리된 핵산.
  43. 제33항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 스터퍼 핵산을 추가로 포함하는 단리된 핵산.
  44. 제43항에 있어서, 스터퍼 핵산이 ATG 서열을 제거하도록 최적화된, 단리된 핵산.
  45. 제44항에 있어서, 스터퍼 핵산이 서열번호 16의 A1AT 인트론 스터퍼 서열인, 단리된 핵산.
  46. 인간 PAH 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산으로서, 코돈 최적화된 단리된 핵산.
  47. 제46항에 있어서, 핵산 서열이 서열번호 14의 핵산 서열과 적어도 80% 동일한, 단리된 핵산.
  48. 제46항에 있어서, 서열번호 14의 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산.
  49. 제33항에 있어서, mRNA인 단리된 핵산.
  50. 제33항 내지 제49항 중 어느 한 항의 핵산을 포함하는 조성물.
  51. 제50항에 있어서, 제약상 허용되는 담체를 추가로 포함하는 조성물.
  52. 제33항 내지 제49항 중 어느 한 항의 핵산을 포함하는 벡터.
  53. 제52항에 있어서, 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 벡터인 벡터.
  54. 하나 이상의 AAV 역위 말단 반복(ITR) 서열에 의해 플랭킹된 제33항 내지 제41항 또는 제43항 내지 제49항 중 어느 한 항의 핵산을 포함하는 rAAV 벡터.
  55. 제54항에 있어서, 제33항 내지 제48항 중 어느 한 항의 핵산이 2개의 AAV ITR에 의해 플랭킹된, rAAV 벡터.
  56. 제54항 또는 제55항에 있어서, AAV ITR이 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV DJ, 염소 AAV, 소 AAV, 또는 마우스 AAV 혈청형 ITR인, rAAV 벡터.
  57. 제54항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, AAV ITR이 AAV2 ITR인, rAAV 벡터.
  58. 제57항에 있어서, 5'에서 3'로 AAV2 ITR, 프로모터, 인트론, PAH 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산, 스터퍼 핵산, 폴리아데닐화 신호, 및 AAV2 ITR을 포함하는 rAAV 벡터.
  59. 제58항에 있어서, 프로모터가 m1A1MB2-mTTR482 프로모터 또는 LP1 프로모터인, rAAV 벡터.
  60. 제58항 또는 제59항에 있어서, 인트론이 닭 β-액틴(CBA)/토끼 β-글로빈 하이브리드 인트론인, rAAV 벡터.
  61. 제58항 또는 제59항에 있어서, PAH 폴리펩티드가 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항의 변이 PAH 폴리펩티드인, rAAV 벡터.
  62. 제58항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, PAH 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산이 제46항 내지 제48항 중 어느 한 항의 코돈 최적화된 핵산인, rAAV 벡터.
  63. 제58항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 스터퍼 핵산이 인간 알파 1 항트립신 유전자의 인트론으로부터의 핵산을 포함하는, rAAV 벡터.
  64. 제63항에 있어서, 인간 알파 1 항트립신 유전자의 인트론이 ATG 서열을 제거하도록 돌연변이된, rAAV 벡터.
  65. 제58항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리아데닐화 신호가 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호인, rAAV 벡터.
  66. 제53항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 자기-상보성 벡터인 rAAV 벡터.
  67. 제66항에 있어서, PAH 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 핵산 서열 및 PAH 폴리펩티드의 보체를 인코딩하는 제2 핵산 서열을 포함하고, 제1 핵산 서열은 길이의 대부분 또는 전부를 따라 제2 핵산 서열과 가닥내 염기쌍을 형성할 수 있는, rAAV 벡터.
  68. 제67항에 있어서, 제1 핵산 서열과 제2 핵산 서열이 돌연변이 AAV ITR에 의해 연결되고, 돌연변이 AAV ITR은 D 영역의 결실을 포함하고 말단 분해 서열의 돌연변이를 포함하는, rAAV 벡터.
  69. 제53항 내지 제68항 중 어느 한 항의 rAAV 벡터를 포함하는 rAAV 입자.
  70. 제69항에 있어서, AAV 바이러스 입자가 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV2/2-7m8, AAV DJ, AAV2 N587A, AAV2 E548A, AAV2 N708A, AAV2 V708K, 염소 AAV, AAV1/AAV2 키메라, 소 AAV, 마우스 AAV, 또는 rAAV2/HBoV1 혈청형 캡시드를 포함하는, rAAV 입자.
  71. 제69항에 있어서, AAV 바이러스 입자가 조작된 AAV 캡시드를 포함하는, rAAV 입자.
  72. 제71항에 있어서, 조작된 AAV 캡시드가 DJ 캡시드 또는 LK03 캡시드인, rAAV 입자.
  73. 제69항 또는 제70항에 있어서, rAAV 바이러스 입자의 ITR 및 캡시드가 동일한 AAV 혈청형으로부터 유래된, rAAV 입자.
  74. 제69항 또는 제70항에 있어서, rAAV 바이러스 입자의 ITR 및 캡시드가 상이한 AAV 혈청형으로부터 유래된, rAAV 입자.
  75. 제69항 내지 제70항 또는 제73항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 바이러스 입자가 AAV8 캡시드를 포함하는, rAAV 입자.
  76. 제74항에 있어서, rAAV 바이러스 입자가 AAV8 캡시드를 포함하고, 벡터가 AAV2 ITR을 포함하는, rAAV 입자.
  77. 제69항 내지 제76항 중 어느 한 항의 rAAV 입자를 포함하는 조성물.
  78. 제77항에 있어서, 제약상 허용되는 담체를 추가로 포함하는 조성물.
  79. 제33항 내지 제49항 중 어느 한 항의 핵산, 또는 제52항 또는 제53항의 벡터, 또는 제54항 내지 제68항 중 어느 한 항의 rAAV 벡터를 포함하는 세포.
  80. 변이 PAH 폴리펩티드의 제조 방법으로서, 변이 PAH 폴리펩티드를 생성하는 조건에서 제79항의 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법.
  81. 제80항에 있어서, 변이 PAH 폴리펩티드를 정제하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  82. 페닐케톤뇨증의 치료를 필요로 하는 개체에서 이를 치료하는 방법으로서, 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항의 변이 PAH 폴리펩티드, 또는 제31항 또는 제32항의 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  83. 페닐케톤뇨증의 치료를 필요로 하는 개체에서 이를 치료하는 방법으로서, 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항의 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산, 또는 제33항, 제34항, 또는 제49항의 핵산을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  84. 페닐케톤뇨증의 치료를 필요로 하는 개체에서 이를 치료하는 방법으로서, 제53항 내지 제68항 중 어느 한 항의 rAAV 벡터를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  85. 페닐케톤뇨증의 치료를 필요로 하는 개체에서 이를 치료하는 방법으로서, 제69항 내지 제76항 중 어느 한 항의 rAAV 입자를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  86. 페닐케톤뇨증의 치료를 필요로 하는 개체에서 이를 치료하는 방법으로서, 제31항, 제32항, 제50항, 제51항, 제77항, 또는 제78항의 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  87. 페닐케톤뇨증의 치료를 필요로 하는 개체에서 이를 치료하는 방법으로서, 제79항의 세포를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  88. 제82항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 개체는 PAH 활성이 부족한, 방법.
  89. 혈중 페닐알라닌 수치의 감소를 필요로 하는 개체에서 이를 감소시키는 방법으로서, 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항의 변이 PAH 폴리펩티드, 또는 제31항 또는 제32항의 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  90. 혈중 페닐알라닌 수치의 감소를 필요로 하는 개체에서 이를 감소시키는 방법으로서, 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항의 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산, 또는 제33항, 제34항, 또는 제49항의 핵산을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  91. 혈중 페닐알라닌 수치의 감소를 필요로 하는 개체에서 이를 감소시키는 방법으로서, 제53항 내지 제68항 중 어느 한 항의 rAAV 벡터를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  92. 혈중 페닐알라닌 수치의 감소를 필요로 하는 개체에서 이를 감소시키는 방법으로서, 제69항 내지 제76항 중 어느 한 항의 rAAV 입자를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  93. 혈중 페닐알라닌 수치의 감소를 필요로 하는 개체에서 이를 감소시키는 방법으로서, 제31항, 제32항, 제50항, 제51항, 제77항, 또는 제78항의 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  94. 혈중 페닐알라닌 수치의 감소를 필요로 하는 개체에서 이를 감소시키는 방법으로서, 제79항의 세포를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  95. 제89항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 치료 전 개체의 혈중 페닐알라닌 수치는 연령대가 유사한 대조군 개체의 혈중 페닐알라닌 수치에 비해 높은, 방법.
  96. 제82항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, 변이 PAH 폴리펩티드, 핵산, rAAV 벡터, rAAV 입자, 조성물, 또는 세포는 정맥내, 동맥내, 간내, 간문맥내, 복강내, 또는 피하 투여되는, 방법.
  97. 제82항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 투여는 다른 요법과 병용되는, 방법.
  98. 제97항에 있어서, 다른 요법은 테트라하이드로비옵테린을 사용한 치료, 페닐알라닌 암모니아 리아제(PAL) 또는 PEG화 PAL을 사용한 치료, 또는 페닐알라닌 제한 식이요법인, 방법.
  99. PAH 폴리펩티드의 제조 방법으로서, PAH 폴리펩티드를 생성하는 조건에서 제79항의 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법.
  100. 제99항에 있어서, PAH 폴리펩티드를 정제하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  101. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 변이 PAH 폴리펩티드를 포함하는 키트.
  102. 제33항 내지 제46항 중 어느 한 항의 핵산, 제53항 내지 제68항 중 어느 한 항의 rAAV 벡터, 제69항 내지 제76항 중 어느 한 항의 rAAV 입자, 또는 제77항 또는 제78항의 조성물을 포함하는 키트.
  103. 제101항 또는 제102항에 있어서, 사용 설명서; 완충제 및/또는 제약상 허용되는 부형제; 및/또는 병, 바이알, 및/또는 주사기를 추가로 포함하는 키트.
  104. 간세포에서 이식유전자를 발현하기 위한 발현 카세트로서, 프로모터 및 인핸서에 작동 가능하게 연결된 이식유전자를 포함하되, 상기 프로모터는 마우스 트랜스티레틴(mTTR) 프로모터를 포함하고, 상기 인핸서는 1개 또는 2개의 변형된 프로트롬빈 인핸서(pPrT2), 1개 또는 2개의 변형된 알파 1-마이크로비쿠닌 인핸서(mA1MB2), 변형된 마우스 알부민 인핸서(mEalb), B형 간염 바이러스 인핸서 II(HE11), 또는 CRM8 인핸서를 포함하는, 발현 카세트.
  105. 제104항에 있어서, mTTR 프로모터가 mTTR482 프로모터인, 발현 카세트.
  106. 제104항 또는 제105항에 있어서, 인핸서가 mTTR 프로모터에 대해 5'에 있는, 발현 카세트.
  107. 간세포에서 이식유전자를 발현하기 위한 발현 카세트로서, 프로모터 및 3' 요소에 작동 가능하게 연결된 이식유전자를 포함하되, 상기 프로모터는 마우스 트랜스티레틴(mTTR) 프로모터를 포함하고, 상기 3' 요소는 알부민 3' 요소(3' Alb)이거나 인간 알파 1 항트립신 스캐폴드/매트릭스 부착 영역(SMAR)에 연결된 알부민 3' 요소(3' AlbSMAR)인, 발현 카세트.
  108. 제107항에 있어서, mTTR 프로모터가 mTTR482 프로모터인, 발현 카세트.
  109. 제107항 또는 제108항에 있어서, 3' 요소가 이식유전자에 대해 3'에 위치하는, 발현 카세트.
  110. 간세포에서 이식유전자를 발현하기 위한 발현 카세트로서, 프로모터 및 인핸서 및 3' 요소에 작동 가능하게 연결된 이식유전자를 포함하되, 상기 프로모터는 마우스 트랜스티레틴(mTTR) 프로모터를 포함하고, 상기 인핸서는 1개 또는 2개의 변형된 프로트롬빈 인핸서(pPrT2), 1개 또는 2개의 변형된 알파 1-마이크로비쿠닌 인핸서(mA1MB2), 변형된 마우스 알부민 인핸서(mEalb), B형 간염 바이러스 인핸서 II(HE11), 또는 CRM8 인핸서를 포함하고, 상기 3' 요소는 알부민 3' 요소(3' Alb)이거나 인간 알파 1 항트립신 스캐폴드/매트릭스 부착 영역(SMAR)에 연결된 알부민 3' 요소(3' AlbSMAR)인, 발현 카세트.
  111. 제110항에 있어서, mTTR 프로모터가 mTTR482 프로모터인, 발현 카세트.
  112. 제110항 또는 제111항에 있어서, 인핸서가 mTTR 프로모터에 대해 5'에 있는, 발현 카세트.
  113. 제110항 내지 제112항 중 어느 한 항에 있어서, 3' 요소가 이식유전자에 대해 3'에 위치하는, 발현 카세트.
  114. 제104항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, 인트론을 추가로 포함하는 발현 카세트.
  115. 제114항에 있어서, 인트론이 닭 β-액틴/토끼 β-글로빈 하이브리드 인트론인, 발현 카세트.
  116. 제104항 내지 제115항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리아데닐화 신호를 추가로 포함하는 발현 카세트.
  117. 제116항에 있어서, 폴리아데닐화 신호가 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호인, 발현 카세트.
  118. 제104항 내지 제117항 중 어느 한 항에 있어서, 이식유전자가 PAH 폴리펩티드 또는 변이 PAH 폴리펩티드를 인코딩하는, 발현 카세트.
  119. 제118항에 있어서, 변이 PAH 폴리펩티드가 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항의 변이 PAH 폴리펩티드인, 발현 카세트.
  120. 제104항 내지 제119항 중 어느 한 항의 발현 카세트를 포함하는 벡터.
  121. 제120항에 있어서, 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 벡터인 벡터.
  122. 하나 이상의 AAV 역위 말단 반복(ITR) 서열에 의해 플랭킹된 제104항 내지 제119항 중 어느 한 항의 발현 카세트를 포함하는 rAAV 벡터.
  123. 제122항에 있어서, 제104항 내지 제119항 중 어느 한 항의 발현 카세트가 2개의 AAV ITR에 의해 플랭킹된, rAAV 벡터.
  124. 제122항 또는 제123항에 있어서, AAV ITR이 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV DJ, 염소 AAV, 소 AAV, 또는 마우스 AAV 혈청형 ITR인, rAAV 벡터.
  125. 제122항 내지 제124항 중 어느 한 항에 있어서, AAV ITR이 AAV2 ITR인, rAAV 벡터.
  126. 제122항 내지 제125항 중 어느 한 항에 있어서, 자기-상보성 벡터인 rAAV 벡터.
  127. 제126항에 있어서, PAH 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 핵산 서열 및 PAH 폴리펩티드의 보체를 인코딩하는 제2 핵산 서열을 포함하고, 제1 핵산 서열은 길이의 대부분 또는 전부를 따라 제2 핵산 서열과 가닥내 염기쌍을 형성할 수 있는, rAAV 벡터.
  128. 제127항에 있어서, 제1 핵산 서열과 제2 핵산 서열이 돌연변이 AAV ITR에 의해 연결되고, 돌연변이 AAV ITR은 D 영역의 결실을 포함하고 말단 분해 서열의 돌연변이를 포함하는, rAAV 벡터.
  129. 제122항 내지 제127항 중 어느 한 항의 rAAV 벡터를 포함하는 rAAV 입자.
  130. 제128항에 있어서, AAV 바이러스 입자가 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV2/2-7m8, AAV DJ, AAV2 N587A, AAV2 E548A, AAV2 N708A, AAV2 V708K, 염소 AAV, AAV1/AAV2 키메라, 소 AAV, 마우스 AAV, 또는 rAAV2/HBoV1 혈청형 캡시드를 포함하는, rAAV 입자.
  131. 제130항에 있어서, AAV 바이러스 입자가 조작된 AAV 캡시드를 포함하는, rAAV 입자.
  132. 제131항에 있어서, 조작된 AAV 캡시드가 DJ 캡시드 또는 LK03 캡시드인, rAAV 입자.
  133. 제131항 또는 제132항에 있어서, rAAV 바이러스 입자의 ITR 및 캡시드가 동일한 AAV 혈청형으로부터 유래된, rAAV 입자.
  134. 제131항 또는 제132항에 있어서, rAAV 바이러스 입자의 ITR 및 캡시드가 상이한 AAV 혈청형으로부터 유래된, rAAV 입자.
  135. 제129항 내지 제134항 중 어느 한 항의 rAAV 입자를 포함하는 조성물.
  136. 제135항에 있어서, 제약상 허용되는 담체를 추가로 포함하는 조성물.
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