KR102423069B1 - 뇌 질환을 치료하기 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

Abstract

본 개시내용은 뇌척수액 (CSF)에 접근하는 세포가 치료제를 발현하고 특정 실시양태에서 이러한 치료제를 뇌로의 분포를 위해 CSF 내로 분비시키는 방식으로 한 쌍의 AAV 역전된 말단 반복부 사이에 삽입된 치료용 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 함유하는 rAAV 입자를, 포유류의 대수조 및/또는 뇌실에 투여하는 것을 포함하는, 질환을 치료하는 방법 또는 치료제를 상기 포유류에 전달하는 방법을 제공한다.

Description

뇌 질환을 치료하기 위한 방법 및 조성물 {METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATING BRAIN DISEASES}

관련 출원

본 출원은 2013년 7월 26일에 출원된 미국 가출원 번호 61/859,157을 우선권 주장하며, 이 가출원은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

유전자 전이((gene transfer)는 현재, 세포 수준과 분자 수준 둘 다에서 생물학적 현상과 질환 과정을 분석하기 위한 강력한 도구로서 광범위하게 인식되고 있다. 보다 최근에는, 유전성 인간 질환 (예를 들어, ADA 결핍증) 또는 후천성 인간 질환 (예를 들어, 암 또는 감염성 질환)을 치료하기 위하여 유전자 요법을 적용하는 것이 상당한 주목을 받고 있다. 개선된 유전자 전이 기술이 출현되고, 결함있는 유전자 관련 질환의 계속 확장되는 라이브러리가 확인됨에 따라, 유전자 요법은 치료 이론에서 실질적인 현실로 급격하게 진화되었다.

전통적으로, 유전자 요법은 선천성 유전적 오류를 교정하기 위하여 특정 외인성 유전자를 특정 환자의 세포 내로 도입하는 과정으로서 정의되었다. 현재 4,500가지 초과의 인간 질환이 유전성인 것으로 분류되고 있지만, 이들 질환 중 비교적 소수에 대해 인간 게놈 내에서의 특이적 돌연변이가 확인되었다. 최근까지도, 이들 희귀 유전 질환이 유전자 요법 노력의 독점적 표적을 나타내었다. 따라서, 지금까지 NIH 승인된 유전자 요법 프로토콜의 대부분은 결함있는 유전자의 기능적 카피(copy)를, 공지된 선천성 유전적 오류가 있는 개체의 체세포 내로 도입하는 것에 관한 것이었다. 대부분의 인간의 암, 특정 형태의 심혈관계 질환, 및 많은 퇴행성 질환이 또한 중요한 유전적 성분을 갖고 있고, 새로운 유전자 요법을 설계하기 위해서는, "유전 장애"를 고려해야 한다는 사실을 연구원과 임상의가 인지하기 시작한 것은 최근의 일이다. 따라서, 유전자 요법은 보다 최근에, 새로운 유전 정보를, 병에 걸린 유기체 내로 도입하는 것을 통하여 질환 표현형을 교정하는 것으로서 광범위하게 정의되었다.

생체내 유전자 요법에서는, 전이된 유전자를 계내에서, 즉 수용자 내에 있는 수용자 유기체의 세포 내로 도입한다. 생체내 유전자 요법은 몇 가지 동물 모델에서 검사되었다. 최근의 몇 가지 공개 문헌에는 기관 및 조직, 예컨대 근육, 조혈 줄기 세포, 동맥 벽, 신경계 및 폐 내로의 직접적인 계내 유전자 전이의 실행 가능성이 보고되었다. DNA를 골격근, 심근 내로 직접적으로 주사하고 DNA-지질 복합체를 혈관계 내로 주사하면, 생체 내에서 상기 삽입된 유전자 생성물(들)이 탐지 가능한 수준으로 발현될 수 있는 것으로 또한 보고되었다.

중추 신경계 질환, 예를 들어 뇌의 유전성 유전 질환을 치료하는 것은 여전히 어려운 문제로 남아있다. 이러한 질환의 예는 리소솜 축적 질환(lysosomal storage disease) 및 알츠하이머병(Alzheimer's disease)이다. 집합적으로, 리소솜 축적 질환 (LSD)의 발병률은 전 세계 신생아 10,000명당 1명이고, 증례의 65%에서는 상당한 중추 신경계 (CNS) 병변이 있다. 이들 장애에서 결핍된 단백질은, 정맥내 전달되는 경우에는 혈액-뇌 장벽을 통과하지 못하거나, 또는 뇌에 직접적으로 전달되는 경우에는 광범위하게 분포되지 못한다. 따라서, CNS 결함에 대한 치료법을 개발할 필요가 있다.

본 발명은 포유류의 뇌척수액 (CSF)과 접촉하는 세포를 감염시키기에 유효한 방식으로 한 쌍의 AAV 역전된 말단 반복부(AAV inverted terminal repeat) 사이에 삽입된 치료제를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터와 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 입자를, 상기 포유류의 대수조(cisterna magna)에 투여하는 것을 포함하는 (이로써 상기 세포는 포유류에서 상기 치료제를 발현한다), 치료제 (예를 들어, 단백질 또는 핵산)를 상기 포유류의 중추 신경계에 전달하는 방법을 제공한다.

본 발명은 포유류의 뇌척수액 (CSF)과 접촉하는 세포를 감염시키기에 유효한 방식으로 한 쌍의 AAV 역전된 말단 반복부 사이에 삽입된 치료제를 코딩하는 핵산 (예를 들어, 치료용 핵산, 또는 단백질을 코딩하는 핵산)을 포함하는 벡터와 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 입자를, 상기 포유류의 대수조에 투여하는 것을 포함하는 (여기서, 상기 세포는 특정 질환을 치료하도록 상기 치료제를 발현한다), 상기 포유류 내에서 상기 질환을 치료하는 방법을 제공한다.

특정 실시양태에서, AAV 입자는 rAAV2 입자이다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 AAV2/1은 AAV2 ITR과 AAV1 캡시드를 의미하기 위해 사용되고, 용어 AAV2/2는 AAV2 ITR과 AAV2 캡시드를 의미하기 위해 사용되며, 용어 AAV2/4는 AAV2 ITR과 AAV4 캡시드를 의미하기 위해 사용된다. 특정 실시양태에서, AAV 입자는 rAAV8 입자이다. 특정 실시양태에서, AAV 입자는 rAAV9 입자이다. 특정 실시양태에서, AAV 입자는 rAAVrh10 입자이다. 특정 실시양태에서, rAAV 캡시드는 AAV2 캡시드 단백질 VP1, VP2, 및/또는 VP3과 적어도 80% 상동성을 갖는다. 특정 실시양태에서, rAAV2 캡시드는 AAV2 캡시드 VP1, VP2, 및/또는 VP3과 100% 상동성을 갖는다. 특정 실시양태에서, rAAV 캡시드는 AAV4 캡시드 단백질 VP1, VP2, 및/또는 VP3과 적어도 80% 상동성을 갖는다. 특정 실시양태에서, rAAV4 캡시드는 AAV4 캡시드 VP1, VP2, 및/또는 VP3과 100% 상동성을 갖는다. 특정 실시양태에서, rAAV 캡시드는 AAV9 캡시드 단백질 VP1, VP2, 및/또는 VP3과 적어도 80% 상동성을 갖는다. 특정 실시양태에서, rAAV9 캡시드는 AAV9 캡시드 VP1, VP2, 및/또는 VP3과 100% 상동성을 갖는다.

특정 실시양태에서, rAAV 입자는 AAV4의 감염률보다 20% 초과 비율, 예컨대 AAV4의 감염률보다 50% 또는 100%, 1000% 또는 2000% 초과 비율로 비-설치류 뇌실막 세포를 감염시키는 rAAV2 입자이다.

특정 실시양태에서, 상기 세포는 상기 치료제를 발현하고 이러한 치료제를 CSF 내로 분비한다. 특정 실시양태에서, 상기 세포는 뇌실막, 연질막, 내피 또는 수막 세포이다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 rAAV를 비-인간 영장류의 뇌실, 지주막하 공간 및/또는 척추강내 공간에 부가적으로 투여하는 것을 추가로 포함한다.

본 발명은 한 쌍의 AAV 역전된 말단 반복부 사이에 삽입된 핵산을 포함하는 벡터를 함유하는 AAV 입자를 포유류의 뇌 세포에 투여함으로써, 상기 핵산을 상기 뇌 세포에 전달하는 것을 포함하는, 핵산을 포유류의 뇌 세포에 전달하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, rAAV는 AAV4의 감염률보다 20% 초과 비율, 예컨대 AAV4의 감염률보다 50% 또는 100%, 1000% 또는 2000% 초과 비율로 상기 뇌 세포를 감염시키는 rAAV2 입자이다.

특정 실시양태에서, 질환은 리소솜 축적 질환 (LSD)이다. 특정 실시양태에서, LSD는 유아 또는 유아 말기 세로이드 리포푸스신증(ceroid lipofuscinoses), 신경병증성 고셔병(Gaucher), 소아성 배튼병(Batten), 파브리병(Fabry), MLD, 산필리포(Sanfilippo) A 질환, 헌터병(Hunter), 크라베병(Krabbe), 모르키오병(Morquio), 폼페병(Pompe), 니만-피크(Niemann-Pick) C 질환, 테이-새크스병(Tay-Sachs), 헐러병(Hurler) (MPS-I H), 산필리포 B 질환, 마로토-라미병(Maroteaux-Lamy), 니만-피크 A 질환, 시스틴축적증(Cystinosis), 헐러-샤이에병(Hurler-Scheie) (MPS-I H/S), 슬라이 증후군(Sly Syndrome) (MPS VII), 샤이에병 (MPS-I S), 유아성 배튼병, GM1 강글리오시드증(Gangliosidosis), 뮤코리피드증(Mucolipidosis) 유형 II/III, 또는 샌드호프병(Sandhoff)이다. 특정 실시양태에서, 상기 질환은 LINCL이다. 특정 실시양태에서, 상기 질환은 신경변성 질환, 예컨대 알츠하이머병, 헌팅톤병(Huntington's disease), ALS, 유전성 강직성 편마비, 원발성 측삭 경화증, 척수성 근위축증, 케네디병(Kennedy's disease), 폴리글루타민 반복 질환, 또는 파킨슨병(Parkinson's disease)이다.

특정 실시양태에서, 포유류는 비-설치류 포유류, 예컨대 영장류, 말, 양, 염소, 돼지, 또는 개이다. 특정 실시양태에서, 영장류는 인간이다.

특정 실시양태에서, 치료제는 치료용 핵산이다. 특정 실시양태에서, 치료제는 단백질이다.

특정 실시양태에서, 핵산은 리소솜 히드롤라제를 코딩한다. 특정 실시양태에서, 핵산은 TPP1을 코딩한다.

특정 실시양태에서, 치료용 단백질은 보호성 ApoE 이소형 단백질이다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "보호성 ApoE 이소형"은 알츠하이머병에 걸릴 위험을 적어도 5%, 예컨대 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 또는 그 초과 정도 감소시키는 ApoE 이소형과 구별하기 위해 사용된다.

특정 실시양태에서, 보호성 ApoE 이소형은 ApoE ε2와 적어도 약 80% 상동성을 갖는다. 특정 실시양태에서, 보호성 ApoE 이소형은 ApoE ε2와 100% 상동성을 갖는다.

특정 실시양태에서, rAAV 입자는 뇌 내의 1개 내지 3개의 위치, 예컨대 뇌 내의 1개, 2개 또는 3개의 위치에 주사된다.

도 1a는 AAV2 단백질 (서열 1) 및 AAV4 단백질 (서열 2)의 정렬이고 도 1b는 AAV2 (NC_001401) 및 AAV4 (NC_001829)로부터의 서열에 근거한 AAV2 뉴클레오티드 (서열 3) 및 AAV4 뉴클레오티드 (서열 4)의 정렬이다.
도 2는 세포들 간의 "교차 보정"의 예시를 도시한 것이다 (Sands and Davidson, Mol Ther 13(5):839-849, 2006).
도 3. 상단: 개의 TPP1이 결핍된 LINCL 개 모델 내로의 AAV2 매개된 전달 후 인간 TPP1에 대한 면역조직화학적 염색. 좌측, 처리된 개. 우측, 처리되지 않은 결핍성 동물. 좌측 상의 강력한 양성 염색을 우측 패널 내의 배경 염색과 비교한다. 하단: 처리된 결핍성 (LINCL) 개에서 인간 TPP1의 존재를 보여주는 TPP1에 대한 웨스턴 블롯(Western blot). 정상 개와 결핍성 개 둘 다는 상기 밴드의 존재를 나타내지 않는데, 이는 그들이 인간 TPP1을 발현하지 않기 때문이다.
도 4a. 신경 세로이드 리포푸스신증에서 리포푸스신의 병리학적 축적을 묘사하는 대표적인 자가형광을 보여주는 현미경사진. 좌측 패널: AAV2.TPP1 처리된 LINCL 개에서의 자가형광. 우측 패널: 대조군, 처리되지 않은 LINCL 개에서의 자가형광. 치료함에 따라 자가형광이 감소한다는 것에 주목해야 한다.
도 4b. 처리되지 않은 LINCL 개 (상부 좌측), 처리되지 않은 정상 개 (상부 우측), 및 2마리의 AAV.TPP1 처리된 개 (하부 패널)의 MRI 스캔. 전달된 벡터의 용적이 하단 패널의 하부 좌측에 표시된다. 바이러스성 역가는 대략 1e13 게놈/mL이다.
도 4c. 4b에서 영상화된 개의 뇌실의 체적 재구성 (좌측 패널). 우측 패널 내의 그래프는 좌측 패널 내의 영상으로부터의 용적을 의미한다. 이들 저 용량의 벡터를 이용한 경우에도 뇌실 용적이 광범위하게 감소되었다는 것에 주목해야 한다 (도 4b 범례에 언급됨).
도 4d. 다양한 뇌 영역에서의 면역조직화학적 염색은 LINCL 개의 뇌실 시스템으로의 AAV.TPP1 유전자 전이 후 TPP1 단백질의 광범위한 분포를 나타낸다. 상단 패널은 개 뇌 환추로부터의 관상 절편이고; 하부 우측 삽입도는 관상 영상의 화살 모양의 뷰를 제시한다. 상기 환추로부터의 패널 아래 면역조직화학적으로 염색된 절편은 이들 영역으로부터의 절편 내에서의 염색 정도를 나타낸다. 취합해 보면, 상기 데이터는 효소의 광범위한 분포를 나타낸다.
도 5. 바이러스성 유전자 전이 직후에 감소된 AAV.TPP1 전달 후 CSF에서의 huTPP1 효소 활성. 좌측 패널: 처리된 동물 Co 및 S에서 CSF에서의 TPP1 활성은 AAV.TPP1 유전자 전이 바로 직후에 정상 활성 수준을 초과하고, 이어서 탐지 가능하지 않은 수준으로 급격하게 감소된다. 동물 N, Po 및 Pi는 정상이거나 이형접합성 개이고, 임상적으로 정상인 개에서 TPP1 활성 수준의 범위에 대해 단지 참조용으로 제시된다.
도 6은 지속적인 활성을 제공하는 것에 대한 미코페놀레이트로의 사전-처리 결과를 도시한 것이다.
도 7. 미코페놀레이트를 효소 활성 감소 시기에 도입하거나 또는 유전자 전이 이전에 도입하면, 뇌실막 내로의 AAV.TPP1 전달 후 개에게서 TPP1 발현의 지속성이 현저하게 개선된다. 좌측 및 우측 상부 그래프: 시간의 함수로서의 효소 활성. 또한, 미코페놀레이트가 투여된 시간이 표시된다. 동물 SR 및 B에서의 발현 상실로부터 회복 후 고 수준이 지속되고, 동물 F에서는 극도로 높은 수준이 지속된다는 것에 주목해야 한다. 따라서, 재조합 단백질에 대한 기능이 없는(null) 동물에서 미코페놀레이트 사전 처리하는 것이, 형질도입된 뇌 세포에서의 지속적인 유전자 발현을 제공하는 데 도움이 된다. 하부 그래프: 배경 수준을 넘어서고 그 위의 수준인 효소가 있고, 정상 수준에 근접하거나 그 위인 효소가 있다는 것을 (0.1-0.4 pmol/mg) 입증하기 위한 상부 우측 그래프로부터의 확장.
도 8. CSF에서의 지속적인 효소 발현은 효소의 간질 수준을 상승시킨다. 각종 뇌 영역에서의 효소 활성은 정상 수준 위이다.
도 9a 및 9b. 다양한 뇌 영역에서의 면역조직화학적 염색은 LINCL 개의 뇌실 시스템 내로의 AAV.TPP1 유전자 전이 후 TPP1 단백질의 광범위한 분포를 도시한 것이다. 개 뇌 환추로부터의 대표적인 패널은 평가되는 뇌 영역을 나타내는데, 이는 또한 선으로써 묘사된다. 취합해 보면, 데이터는 효소의 광범위한 분포를 보여준다.
도 10. AAV.TPP1 유전자 요법은 질환 표현형의 발병 (좌측 위의 첫 번째 적색 라인 대 좌측 위의 첫 번째 청색 라인의 출현) 및 질환의 진행 (적색 라인의 간격 대 청색 라인의 간격)을 지연시킨다. 동물 수명은 일부 개에서 거의 두배가 되었고, 다른 개는 여전히 평가 중이다.
도 11. 뇌실막으로부터 지속적인 TPP1 분비를 나타내는 동물은 말초 기관과 뇌 경뇌막에서의 효소 활성의 명백한 증거를 나타낸다. 두 동물 BG 및 SR의 경우에는, 뇌 경뇌막과 또한 간에서 주목할만한 효소 활성이 있었다.
도 12. LINCL 개에게 임상적 이득을 제공하기 위해 사용된 접근 방식은 영장류에게도 변환 가능하다. 레서스 원숭이(Rhesus macaques)에게 AAV2.TPP1 (1.5 mL의 1e13 벡터 게놈/mL)을 뇌실내 주사하였고, 유전자 전이 후 3개월째에 뇌간 (수질; 좌측 그래프) 및 CSF (우측 그래프)에서의 TPP1 활성을 측정하였다. 이들은 정상 수준의 TPP1 활성을 나타내는 정상적인 원숭이이다 (표기된 범위 - 대조군). 1마리 동물을 제외한 모든 동물에서, 상기 효소 활성은 정상적인 원숭이의 효소 활성을 초과한다. AAV 벡터로부터 발현된 재조합 인간 TPP1에 대항한 면역조직화학 염색을 이용한 유전자 전이 후 3개월째에 원숭이 뇌에서의 TPP1 활성의 명백한 증거.
도 13은 비-인간 영장류에서의 전정 신경영역 (뇌간)을 도시한 것이다.
도 14는 인간 TPP1 아미노산 서열을 제공한다.
도 15는 인간 TPP1 핵산 서열을 제공한다.
도 16은 히말라야 원숭이(Macaca mulatta) TPP1 아미노산 서열을 제공한다.
도 17은 필리핀 원숭이(Macaca fascicularis) TPP1 아미노산 서열을 제공한다.

아데노 관련 바이러스 (AAV)는 파르보비리다에(parvoviridae) 과의 소형 비병원성 바이러스이다. AAV는 복제를 위해 헬퍼(helper) 바이러스에 의존한다는 점에서 상기 과의 다른 구성원들과 완전히 다르다. 헬퍼 바이러스의 부재 하에서는, AAV가 염색체 19의 q 암(arm) 내로 유전자 자리 특이적 방식으로 통합될 수 있다. 대략 5 kb 게놈의 AAV는 플러스 또는 마이너스 극성의 단일 가닥 DNA의 1개 절편으로 이루어진다. 게놈의 말단은 헤어핀 구조물로 폴딩될 수 있고 바이러스성 DNA 복제 기점으로서 제공될 수 있는 짧은 역전된 말단 반복부이다. 물리적으로, 파르보바이러스 비리온은 외피를 보유하지 않고, 그의 이십면체 캡시드는 직경이 대략 20 nm이다.

현재까지 혈청학적으로 별개인 수많은 AAV가 확인되었고, 10가지가 넘는 것이 인간 또는 영장류로부터 단리되었다. AAV2의 게놈은 길이가 4680개 뉴클레오티드이고, 2개의 개방 판독 프레임 (ORF)을 함유한다. 좌측 ORF는 단일 가닥 자손 게놈을 생성시키는 것 이외에 복제와 전사를 조절하는 데 관여하는 비-구조적 Rep 단백질, Rep 40, Rep 52, Rep 68 및 Rep 78을 코딩한다. 더욱이, 이러한 Rep 단백질 중 2가지가 인간 염색체 19의 q 암의 특정 영역 내로의 AAV 게놈의 우선적인 통합과 연관이 있었다. Rep68/78은 또한, NTP 결합 활성 뿐만 아니라 DNA 및 RNA 헬리카제 활성을 보유하고 있는 것으로 밝혀졌다. 상기 Rep 단백질은 핵 국재화 신호 뿐만 아니라 몇 가지 잠재적인 인산화 부위를 보유하고 있다. 이들 키나제 부위 중 하나를 돌연변이시키면, 복제 활성이 상실된다.

상기 게놈의 말단은 바이러스성 DNA 복제 기점으로서 제공되는 T-모양의 헤어핀 구조로 폴딩될 수 있는 잠재력을 지닌 짧은 역전된 말단 반복부 (ITR)이다. 이러한 ITR 영역 내에는, ITR의 기능에 중심이 되는 2개 요소, 즉 GAGC 반복 서열 모티프 및 말단 분해능 부위 (trs)가 있는 것으로 보고되었다. 상기 반복 서열 모티프는 ITR이 선형이거나 또는 헤어핀 입체 형태인 경우에 Rep와 결합하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 결합은 부위 특이적 및 가닥 특이적 방식으로 일어나는, 상기 trs에서의 절단을 위해 Rep68/78을 배치시키는 작용을 한다. 복제에 있어서의 이들 두 요소의 역할 이외에도, 이들은 바이러스성 통합에 중심이 되는 것으로 여겨진다. 염색체 19 통합 유전자 자리 내에 함유된 것은 trs가 인접해 있는 Rep 결합 부위이다. 이들 요소는 유전자 자리 특이적 통합을 위해 필요하고 그에 기능적인 것으로 밝혀졌다.

AAV 비리온은 VP1, VP2 및 VP3으로서 지칭된 3가지 관련 단백질로 이루어진, 외피를 보유하지 않고 직경이 대략 25 nm인 이십면체 입자이다. 우측 ORF는 캡시드 단백질 VP1, VP2, 및 VP3을 코딩한다. 이들 단백질은 각각 1:1:10의 비로 발견되고, 모두 우측의 ORF로부터 유래된다. 상기 캡시드 단백질은 선택적 스플라이싱 및 특이한 출발 코돈을 사용한다는 점에서 서로 상이하다. 결실 분석 결과, 교대로 스플라이싱된 메시지로부터 해독되는 VP1을 제거하거나 변경시키면, 감염성 입자의 생성이 저하되는 것으로 밝혀졌다. VP3 코딩 영역 내에서 돌연변이시키면, 어떠한 단일 가닥 자손 DNA 또는 감염성 입자도 생성되지 못한다. AAV 입자는 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 바이러스성 입자이다. AAV 캡시드 폴리펩티드는 전체 VP1, VP2 및 VP3 폴리펩티드를 코딩할 수 있다. 상기 입자는 AAV2 캡시드 단백질과 기타 AAV 캡시드 단백질 (즉, 키메라 단백질, 예컨대 AAV4와 AAV2)을 포함하는 입자일 수 있다. AAV2 캡시드 단백질의 아미노산 서열 상의 변이가 본원에서 고려되는데, 단 이로써 생성되는 AAV2 캡시드를 포함하는 바이러스성 입자는 표준 방법에 의해 통상적으로 결정될 수 있는 바와 같이, 항원과 관련하여 또는 면역학적으로 여전히 AAV4와 완전히 달라야 한다. 구체적으로 언급하면, 예를 들어 ELISA 및 웨스턴 블롯을 이용하여, 특정 바이러스성 입자가 항원과 관련하여 또는 면역학적으로 AAV4와 완전히 다른지를 결정할 수 있다. 더욱이, AAV2 바이러스성 입자는 바람직하게, AAV4와 완전히 다른 조직 지향성을 보유하고 있다.

AAV2 입자는 AAV2 캡시드 단백질을 포함하는 바이러스성 입자이다. 전체 VP1, VP2, 및 VP3 폴리펩티드를 코딩하는 AAV2 캡시드 폴리펩티드는 전반적으로, 서열 1 (AAV2 캡시드 단백질)에 제시된 뉴클레오티드에 의해 코딩된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드와 적어도 약 63% 상동성 (또는 동일성)을 가질 수 있다. 이러한 캡시드 단백질은 서열 1에 제시된 단백질과 약 70% 상동성, 약 75% 상동성, 80% 상동성, 85% 상동성, 90% 상동성, 95% 상동성, 98% 상동성, 99% 상동성, 또는 심지어 100% 상동성을 가질 수 있다. 상기 캡시드 단백질은 서열 1에 제시된 단백질과 약 70% 동일성, 약 75% 동일성, 80% 동일성, 85% 동일성, 90% 동일성, 95% 동일성, 98% 동일성, 99% 동일성, 또는 심지어 100% 동일성을 가질 수 있다. 상기 입자는 또 다른 AAV 캡시드 단백질과 AAV2 캡시드 단백질, 즉 키메라 단백질을 포함하는 입자일 수 있다. AAV2 캡시드 단백질의 아미노산 서열 상의 변이가 본원에서 고려되는데, 단 이로써 생성되는 AAV2 캡시드를 포함하는 바이러스성 입자는 표준 방법에 의해 통상적으로 결정될 수 있는 바와 같이, 항원과 관련하여 또는 면역학적으로 여전히 AAV4와 완전히 달라야 한다. 구체적으로 언급하면, 예를 들어 ELISA 및 웨스턴 블롯을 이용하여, 특정 바이러스성 입자가 항원과 관련하여 또는 면역학적으로 AAV4와 완전히 다른지를 결정할 수 있다. 더욱이, 하나 이상의 AAV2 외피 단백질을 포함하는 AAV2 키메라 입자가 AAV2 외피 단백질로만 이루어진 AAV2 입자와는 상이한 조직 지향성을 가질 수 있긴 하지만, AAV2 바이러스성 입자는 바람직하게, AAV4, 예컨대 본원 실시예에 예시된 것과 완전히 다른 조직 지향성을 보유하고 있다.

도 1a 및 1b에 표시된 바와 같이, AAV2 캡시드 서열과 AAV4 캡시드 서열은 약 60% 상동성이다. 특정 실시양태에서, AAV2 캡시드는 서열 1에 제시된 아미노산 서열과 적어도 65% 상동성인 서열을 포함한다 (또는 이러한 서열로 이루어진다).

특정 실시양태에서, 본 발명은 추가로, 한 쌍의 AAV2 역전된 말단 반복부를 포함하는 벡터를 함유하는, 즉 캡시드로 싼 AAV2 입자를 제공한다. AAV2 ITR의 뉴클레오티드 서열은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 더욱이, 상기 입자는 AAV4 캡시드 단백질과 AAV2 캡시드 단백질 둘 다, 즉 키메라 단백질을 포함하는 입자일 수 있다. 더욱이, 상기 입자는 기타 AAV (예를 들어, AAV1 내지 AAV9 및 AAVrh10)로부터의 한 쌍의 AAV 역전된 말단 반복부를 포함하는 벡터를 캡시드로 싼 입자일 수 있다. 이러한 입자에서 캡시드에 싸인 벡터는 추가로, 상기 역전된 말단 반복부 사이에 삽입된 외인성 핵산을 포함할 수 있다.

AAV의 다음 특징은 그를 유전자 전이용으로 매력적인 벡터로 만들었다. AAV 벡터는 시험관 내에서 세포성 게놈 내로 안정적으로 통합되고; 광범위한 숙주 범위를 보유하고 있으며; 분할 세포와 비분할 세포 둘 다를 시험관내 및 생체 내에서 형질도입하고, 이와 같이 형질도입된 유전자의 고 수준 발현을 유지시키는 것으로 밝혀졌다. 바이러스성 입자는 열 안정적이고; 용매, 세정제, pH 상의 변화, 온도에 대해 저항성이며; CsCl 구배 상에서 또는 다른 수단에 의해 농축될 수 있다. 본 발명은 AAV 입자, 재조합 AAV 벡터, 및 재조합 AAV 비리온을 투여하는 방법을 제공한다. 예를 들어, AAV2 입자는 AAV2 캡시드 단백질을 포함하는 바이러스성 입자이거나, 또는 AAV4 입자는 AAV4 캡시드 단백질을 포함하는 바이러스성 입자이다. 재조합 AAV2 벡터는 AAV2의 적어도 하나의 독특한 핵산을 포함하는 핵산 구조물이다. 재조합 AAV2 비리온은 재조합 AAV2 벡터를 함유하는 입자이다. 용어 "AAV2 ITR" 내에서 고려되어야 하는 것은, 뉴클레오티드 서열이 AAV2 ITR을 AAV4 ITR과 구별하기 위해 본원에 기재된 특징들 중 하나 또는 둘 다를 보유하고 있어야만 한다는 것이다: (1) (AAV4에서와 같이 4개라기 보다는) 3개의 "GAGC" 반복 서열 및 (2) AAV2 ITR Rep 결합 부위 내에서, 첫 번째 2개의 "GAGC" 반복 서열 중 네 번째 뉴클레오티드는 T가 아니라 C이다.

전달하고자 하는 또 다른 작용제를 코딩하는 서열 또는 단백질의 발현을 구동시키는 프로모터는 공지된 고려 사항, 예컨대 이러한 프로모터와 기능적으로 연결된 핵산의 발현 수준, 및 벡터가 사용되어야 하는 세포 유형에 의해 선택된, 목적하는 어떠한 프로모터일 수도 있다. 프로모터는 외인성 또는 내인성 프로모터일 수 있다. 프로모터는, 예를 들어 공지된 강력한 프로모터, 예컨대 SV40 또는 유도성 메탈로티오네인 프로모터, 또는 AAV 프로모터, 예컨대 AAV p5 프로모터를 포함할 수 있다. 프로모터의 부가 예는 액틴 유전자, 면역글로불린 유전자, 시토메갈로바이러스 (CMV), 아데노바이러스, 소의 유두종 바이러스로부터 유래된 프로모터; 아데노바이러스성 프로모터, 예컨대 아데노바이러스성 주요 후기 프로모터, 유도성 열 쇼크 프로모터; 호흡기 합포체 바이러스, 라우스(Rous) 육종 바이러스 (RSV) 등으로부터 유래된 프로모터를 포함한다.

AAV 벡터는 추가로, 프로모터와 기능적으로 연결된 외인성 (이종) 핵산을 포함할 수 있다. "이종 핵산"이란, 어떠한 이종 또는 외인성 핵산도 특정 세포, 조직 또는 유기체 내로의 전이를 위해 벡터 내로 삽입될 수 있다는 것을 의미한다. 상기 핵산은, 예를 들어 폴리펩티드 또는 단백질 또는 안티센스 RNA를 코딩할 수 있다. "기능적으로 연결된"이란, 상기 프로모터가 관련 기술분야에 공지된 바와 같이, 이종 핵산의 발현을 증진시킬 수 있도록 하는 것을 의미하는데, 예컨대 이종 핵산과 비교하여 프로모터의 배향이 적당하도록 하는 것을 의미한다. 더욱이, 이종 핵산은 바람직하게, 관련 기술분야에 공지된 바와 같이, 기능적으로 코딩될 핵산의 발현에 적당한 모든 서열, 즉 상기 핵산이 발현될 수 있도록 하는 데 적당한 모든 서열을 갖는다. 이러한 핵산은, 예를 들어 발현 제어 서열, 예컨대 증강인자(enhancer), 및 필수 정보 처리 부위, 예컨대 리보솜 결합 부위, RNA 스플라이스 부위, 폴리아데닐화 부위, 및 전사 종결인자 서열을 포함할 수 있다. 상기 핵산은 패키징될 수 있는 핵산의 크기에 의해서만 제한된, 2개 이상의 유전자 생성물을 코딩할 수 있다.

이종 핵산은 그 내로 벡터가 전이되는 대상체에 의해 요구되는 결함있거나 누락된 단백질을 대체하는 유익한 단백질을 코딩할 수 있거나, 또는 예를 들어, 암 세포 또는 그의 사멸이 대상체에게 유리할 것인 기타 세포에 대해 지시될 수 있는 세포독성 폴리펩티드를 코딩할 수 있다. 이종 핵산은 또한, 해로운 단백질을 코딩하는 대상체에 의해 만들어진 mRNA와 결합함으로써 이를 불활성화시킬 수 있는 안티센스 RNA를 코딩할 수 있다. 한 실시양태에서, 안티센스 폴리뉴클레오티드는 AAV 바이러스성 구조물 내의 이종 발현 카세트로부터 생성될 수 있는데, 이러한 발현 카세트는 세포-유형 특이적 발현을 증진시키는 서열을 함유한다.

본 발명의 AAV 벡터의 일부로서 특정 세포 또는 대상체에게 투여될 수 있는 이종 핵산의 예는 치료제, 예컨대 리소솜 히드롤라제; 종양 괴사 인자 (TNF), 예컨대 TNF-알파; 인터페론, 예컨대 인터페론-알파, 인터페론-베타, 및 인터페론-감마; 인터루킨, 예컨대 IL-1, IL-1베타, 및 IL-2 내지 -14; GM-CSF; 아데노신 데아미나제; 분비된 인자, 예컨대 성장 인자; 이온 채널; 화학요법제; 리소솜 단백질; 항-아폽토시스성(anti-apoptotic) 유전자 생성물; 신경세포의 생존을 증진시키는 단백질, 예컨대 글루타메이트 수용체 및 성장 인자; 세포성 성장 인자, 예컨대 림포카인; 가용성 CD4; 인자 VIII; 인자 IX; T-세포 수용체; LDL 수용체; ApoE; ApoC; 알파-1 항트립신; 오르니틴 트랜스카르바밀라제 (OTC); 낭포성 섬유증 막관통 수용체 (CFTR); 인슐린; 항체, 예컨대 면역글로불린의 항원 결합성 도메인에 대한 Fc 수용체; 및 바이러스성 복제를 억제하는 안티센스 서열, 예컨대 B형 간염 바이러스 또는 비-A형, 비-B형 간염 바이러스의 복제를 억제하는 안티센스 서열을 코딩하는 핵산을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 더욱이, 상기 핵산은 패키징될 수 있는 핵산의 크기에 의해서만 제한된, 2개 이상의 유전자 생성물을 코딩할 수 있다.

AAV2 입자는 AAV2 캡시드 단백질을 포함하는 바이러스성 입자이다. AAV2 캡시드 단백질의 아미노산 서열 상의 변이가 본원에서 고려되는데, 단 이로써 생성되는 AAV2 캡시드를 포함하는 바이러스성 입자는 표준 방법에 의해 통상적으로 결정될 수 있는 바와 같이, 항원과 관련하여 또는 면역학적으로 여전히 AAV4와 완전히 달라야 한다. 구체적으로 언급하면, 예를 들어 ELISA 및 웨스턴 블롯을 이용하여, 특정 바이러스성 입자가 항원과 관련하여 또는 면역학적으로 기타 AAV 혈청형과 완전히 다른지를 결정할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "폴리펩티드"는 아미노산의 중합체를 지칭하고, 완전한 길이의 단백질 및 그의 단편을 포함한다. 따라서, "단백질" 및 "폴리펩티드"는 종종 본원에서 상호 교환적으로 사용된다. 치환은 공지된 파라미터에 의해 중성이 되도록 선택될 수 있다. 통상의 기술자에 의해 인지될 수 있는 바와 같이, 본 발명은 또한, 아미노산 서열 또는 기타 특성에 있어서 약간의 변이를 지닌 폴리펩티드를 포함한다. 이러한 변이는 대립 유전자성 변이 (예를 들어 유전적 다형증에 기인함)로서 자연적으로 발생될 수 있거나 또는 인간의 개입 (예를 들어, 클로닝된 DNA 서열의 돌연변이 유발에 의함), 예컨대 유도된 점, 결실, 삽입 및 치환 돌연변이체에 의해 생성될 수 있다. 아미노산 서열 상의 경미한 변화, 예컨대 보존적 아미노산 대체, 작은 내부 결실 또는 삽입, 및 분자의 말단에서의 부가 또는 결실이 일반적으로 바람직하다. 이들 변형은 아미노산 서열 상의 변화를 초래할 수 있거나, 침묵 돌연변이를 제공할 수 있거나, 제한 부위를 변형시킬 수 있거나, 또는 다른 특이적 돌연변이를 제공할 수 있다.

본 발명의 방법은 한 쌍의 AAV 역전된 말단 반복부 사이에 삽입된 핵산을 포함하는 벡터를 함유하는 AAV 입자를 특정 세포에 투여함으로써, 상기 핵산을 상기 세포에 전달하는 것을 포함하는, 상기 핵산을 세포에 전달하는 방법을 제공한다. 세포에 대한 투여는, 목적하는 액상물, 예컨대 조직 배양 배지 또는 완충 식염수 용액 내에 임의로 함유된 입자를 상기 세포와 단순히 접촉시키는 것을 포함한, 모든 수단에 의해 달성될 수 있다. 상기 입자는 목적하는 모든 기간 동안 상기 세포와 접촉된 채로 유지될 수 있고, 전형적으로 상기 입자는 투여되고 무기한으로 유지될 수 있다. 이러한 시험관내 방법의 경우에는, 상기 바이러스를 관련 기술분야에 공지된 바와 같고 본원에 예시된 바와 같은 표준 바이러스성 형질도입 방법에 의해 상기 세포에 투여할 수 있다. 투여되는 바이러스의 역가는 특히 세포 유형에 따라서 다양할 수 있지만, 일반적으로 AAV 형질도입에 사용되는 전형적인 것일 것이다. 부가적으로, 본 실시예에서 특별한 세포를 형질도입하는 데 사용되는 역가가 활용될 수 있다. 상기 세포는 인간 뿐만 아니라 기타 대형 (비-설치류) 포유류, 예컨대 영장류, 말, 양, 염소, 돼지, 및 개에서의 목적하는 모든 세포를 포함할 수 있다.

보다 구체적으로 언급하면, 본 발명은 한 쌍의 AAV 역전된 말단 반복부 사이에 삽입된 핵산을 포함하는 벡터를 함유하는 AAV 입자를, 순환성 CSF와 접촉하는 세포, 예컨대 뇌실막 세포, 연질막 세포, 수막 세포, 뇌 내피 세포에 투여함으로써, 상기 핵산을 상기 세포에 전달하는 것을 포함하는, 상기 핵산을 상기 세포에 전달하는 방법을 제공한다.

본 발명은 추가로, 한 쌍의 AAV 역전된 말단 반복부 사이에 삽입된 핵산을 포함하는 AAV 입자를 특정 대상체에 투여함으로써, 상기 핵산을 상기 대상체 내의 특정 세포에 전달하는 것을 포함하는, 상기 핵산을 상기 대상체 내의 세포에 전달하는 방법을 제공한다.

또한, 한 쌍의 AAV 역전된 말단 반복부 사이에 삽입된 핵산을 포함하는 AAV 입자를 특정 대상체에 투여함으로써, 상기 핵산을 상기 대상체 내의 뇌실막, 연질막 또는 기타 수막 세포에 전달하는 것을 포함하는, 상기 핵산을 상기 대상체 내의 뇌실막, 연질막 또는 기타 수막 세포에 전달하는 방법이 제공된다.

특정 실시양태에서, 뇌 혈관 내피를 표적으로 하는 아미노산 서열은 특정 질환, 예를 들어 리소솜 축적 질환이 있는 대상체 내의 뇌 혈관 내피를 표적으로 한다.

특정 실시양태에서, 뇌 혈관 내피를 표적으로 하는 아미노산 서열은 리소솜 축적 질환이 없는 대상체 내의 뇌 혈관 내피를 표적으로 한다.

특정 실시양태에서, 바이러스성 벡터는 치료제를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 이러한 치료제는 TPP1이다.

본 개시내용의 특정 실시양태는 본원에 기재된 바와 같은 바이러스성 벡터를 포함하는 세포를 제공한다.

본 개시내용의 특정 실시양태는 본원에 기재된 바와 같은 바이러스성 벡터 또는 세포를 특정 포유류에게 투여하는 것을 포함하는, 이러한 포유류에게서 특정 질환을 치료하는 방법을 제공한다.

특정 실시양태에서, 포유류는 인간이다.

특정 실시양태에서, 질환은 리소솜 축적 질환 (LSD)이다. 특정 실시양태에서, LSD는 유아 또는 유아 말기 세로이드 리포푸스신증, 고셔병, 소아성 배튼병, 파브리병, MLD, 산필리포 A 질환, 유아 말기 배튼병, 헌터병, 크라베병, 모르키오병, 폼페병, 니만-피크 C 질환, 테이-새크스병, 헐러병 (MPS-I H), 산필리포 B 질환, 마로토-라미병, 니만-피크 A 질환, 시스틴축적증, 헐러-샤이에병 (MPS-I H/S), 슬라이 증후군 (MPS VII), 샤이에병 (MPS-I S), 유아성 배튼병, GM1 강글리오시드증, 뮤코리피드증 유형 II/III, 또는 샌드호프병이다.

특정 실시양태에서, 질환은 신경변성 질환이다. 특정 실시양태에서, 신경변성 질환은 알츠하이머병, 헌팅톤병, ALS, 유전성 강직성 편마비, 원발성 측삭 경화증, 척수성 근위축증, 케네디병, 폴리글루타민 반복 질환, 또는 파킨슨병이다.

본 개시내용의 특정 실시양태는 본원에 기재된 바이러스성 벡터를 CSF에 투여하여, 이로써 형질도입된 뇌실막, 연질막, 내피 및/또는 기타 수막 세포가 치료제를 발현하고 이러한 치료제가 특정 대상체의 중추 신경계에 전달되도록 하는 것을 포함하는, 상기 대상체의 중추 신경계에 특정 작용제를 전달하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 상기 바이러스성 벡터는 뇌실막, 연질막, 내피 및/또는 기타 수막 세포를 형질도입한다.

본 개시내용의 특정 실시양태는 의학적 치료에 사용하기 위한, 본원에 기재된 바와 같은 바이러스성 벡터 또는 세포를 제공한다.

본 개시내용의 특정 실시양태는 포유류에서의 특정 질환, 예를 들어 리소솜 축적 질환을 치료하는 데 유용한 의약을 제조하기 위한, 본원에 기재된 바와 같은 바이러스성 벡터 또는 세포의 용도를 제공한다.

상기 벡터는 추가로, 리소솜 효소 (예를 들어, 리소솜 히드롤라제), 분비된 단백질, 핵 단백질, 또는 세포질 단백질을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "분비된 단백질"은 자연적으로 분비되든지 아니면 그것이 분비될 수 있도록 하는 신호 서열을 함유하도록 변형되든지 간에, 어떠한 분비된 단백질도 포함한다.

본 개시내용의 특정 실시양태는 포유류에서의 특정 질환, 예를 들어 알츠하이머병을 치료하는 데 유용한 의약을 제조하기 위한, 본원에 기재된 바와 같은 바이러스성 벡터 또는 세포의 용도를 제공한다.

상기 벡터는 추가로, 보호성 ApoE 이소형 단백질을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "분비된 단백질"은 자연적으로 분비되든지 아니면 그것이 분비될 수 있도록 하는 신호 서열을 함유하도록 변형되든지 간에, 어떠한 분비된 단백질도 포함한다. 핵산은 그것이 또 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치되는 경우에 "작동적으로 연결된"다. 일반적으로, "작동적으로 연결된"이란 연결되는 DNA 서열이 연속된다는 것을 의미한다. 그러나, 증강인자는 연속되지 않아도 된다. 연결은 편리한 제한 부위에서의 결찰(ligation)에 의해 달성된다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우에는, 합성 올리고뉴클레오티드 적응인자(adaptor) 또는 링커가 통상적인 실시에 따라서 사용된다. 부가적으로, 효소를 코딩하는 핵산의 다수 카피를 발현 벡터 내에서 함께 연결시킬 수 있다. 이러한 다수 핵산은 링커에 의해 분리될 수 있다.

본 개시내용은 또한, 본원에 기재된 벡터를 함유하는 포유류 세포를 제공한다. 이러한 세포는 인간일 수 있고, 뇌로부터 유래될 수 있다. 세포 유형은 줄기 또는 전구 세포 집단일 수 있다.

본 개시내용은 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 발현 벡터, 또는 세포를 투여함으로써, 특정 포유류에서 특정 질환, 예컨대 유전 질환 또는 암을 치료하는 방법을 제공한다. 이러한 유전 질환 또는 암은 리소솜 축적 질환 (LSD), 예컨대 유아 또는 유아 말기 세로이드 리포푸스신증, 고셔병, 소아성 배튼병, 파브리병, MLD, 산필리포 A 질환, 유아 말기 배튼병, 헌터병, 크라베병, 모르키오병, 폼페병, 니만-피크 C 질환, 테이-새크스병, 헐러병 (MPS-I H), 산필리포 B 질환, 마로토-라미병, 니만-피크 A 질환, 시스틴축적증, 헐러-샤이에병 (MPS-I H/S), 슬라이 증후군 (MPS VII), 샤이에병 (MPS-I S), 유아성 배튼병, GM1 강글리오시드증, 뮤코리피드증 유형 II/III, 또는 샌드호프병일 수 있다.

유전 질환은 신경변성 질환, 예컨대 헌팅톤병, ALS, 유전성 강직성 편마비, 원발성 측삭 경화증, 척수성 근위축증, 케네디병, 알츠하이머병, 폴리글루타민 반복 질환, 또는 병소 노출, 예컨대 파킨슨병일 수 있다.

본 개시내용의 특정 측면은 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 벡터, 및 유전적으로 조작된 세포 (생체 내에서 변형됨), 및 그들의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 개시내용은 치료상 유효 용량의 치료제를 전신 전달할 수 있는 유전자 또는 단백질 요법에 대한 방법에 관한 것이다.

한 측면에 따라서, 포유류 수용자에게서 특정 치료제를 발현하기 위한 세포 발현 시스템이 제공된다. 이러한 발현 시스템 (본원에서 "유전적으로 변형된 세포"로서 지칭되기도 함)은 치료제를 발현하기 위한 발현 벡터 및 세포를 포함한다. 발현 벡터는 이종 유전 물질을 세포에 전달하기 위한 바이러스, 플라스미드 및 기타 비히클을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 따라서, 본원에 사용된 바와 같은 용어 "발현 벡터"는 이종 유전 물질을 세포에 전달하기 위한 비히클을 지칭한다. 특히, 상기 발현 벡터는 재조합 아데노바이러스성, 아데노 관련 바이러스, 또는 렌티바이러스 또는 레트로바이러스 벡터이다.

발현 벡터는 추가로, 이종 유전자의 전사를 제어하기 위한 프로모터를 포함한다. 이러한 프로모터는 유도성 프로모터 (다음에 기재됨)일 수 있다. 발현 시스템은 포유류 수용자에게 투여하는 데 적합하다. 발현 시스템은 복수 개의 비-불멸화된 유전적으로 변형된 세포 (각각의 세포는 하나 이상의 치료제를 코딩하는 하나 이상의 재조합 유전자를 함유한다)를 포함할 수 있다.

세포 발현 시스템은 생체 내에서 형성된다. 또한 또 다른 측면에 따라서, 생체 내에서 포유류 수용자를 치료하는 방법이 제공된다. 이러한 방법은 이종 유전자 생성물을 발현하기 위한 발현 벡터를, 예컨대 정맥내 투여를 통하여 계내에서 환자 세포 내로 도입하는 것을 포함한다. 발현 시스템을 생체 내에서 형성하기 위해서는, 치료제를 발현하기 위한 발현 벡터를 생체 내에서 포유류 수용자 내로 정맥내 도입하는데, 이러한 벡터는 혈관계를 통하여 뇌로 이동한다.

또한 또 다른 측면에 따라서, 생체 내에서 포유류 수용자를 치료하는 방법이 제공된다. 이러한 방법은 표적 단백질을 생체 내에서 환자 내로 도입하는 것을 포함한다.

이종 유전자를 발현하기 위한 발현 벡터는 이종 유전자 생성물의 전사를 제어하기 위한 유도성 프로모터를 포함할 수 있다. 따라서, 치료제를 계내에서 전달하는 것은 세포를 계내에서, 이종 유전자의 전사를 유도시키는 조건에 노출시킴으로써 제어된다.

포유류 수용자는 유전자 대체 요법을 잘 받아들이는 병태를 지닐 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은, 유전자 "유전자 대체 요법"은 특정 치료제를 코딩하는 외인성 유전 물질을 상기 수용자에게 투여하고, 이와 같이 투여된 유전 물질이 계내에서 후속 발현되는 것을 지칭한다. 따라서, 어구 "유전자 대체 요법을 잘 받아들이는 병태"는 유전 질환 (즉, 한 가지 이상의 유전자 결함에 기인하는 질환 병태), 후천성 병리상태 (즉, 선천성 결함에 기인하지 않는 병리학적 상태), 암 및 예방적 과정 (즉, 특정 질환 또는 바람직하지 못한 의학적 병태의 예방)과 같은 병태를 포괄한다. 따라서, 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "치료제"는 포유류 수용자에 대해 유리한 효과를 나타내는 모든 작용제 또는 물질을 지칭한다. 따라서, "치료제"는 핵산 또는 단백질 성분을 갖는 치료적 분자와 예방적 분자 둘 다를 포괄한다.

한 실시양태에 따라서, 포유류 수용자는 유전 질환을 갖고 있고, 외인성 유전 물질은 이러한 질환을 치료하기 위한 치료제를 코딩하는 이종 유전자를 포함한다. 또한 또 다른 실시양태에서, 포유류 수용자는 후천성 병리 상태를 갖고 있고, 외인성 유전 물질은 이러한 병리 상태를 치료하기 위한 치료제를 코딩하는 이종 유전자를 포함한다. 또 다른 실시양태에 따라서, 환자는 암을 갖고 있고, 외인성 유전 물질은 항암제를 코딩하는 이종 유전자를 포함한다. 또한 또 다른 실시양태에서, 환자는 바람직하지 못한 의학적 병태를 갖고 있고, 외인성 유전 물질은 이러한 병태를 치료하기 위한 치료제를 코딩하는 이종 유전자를 포함한다.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "보호성 ApoE 이소형", "리소솜 효소", "분비된 단백질", "핵 단백질" 또는 "세포질 단백질"은 이들 폴리펩티드의 변이체 또는 생물학상 활성 또는 불활성 단편을 포함한다. 상기 폴리펩티드 중 하나의 "변이체"는 천연 단백질과 완전히 동일하지 않는 폴리펩티드이다. 이러한 변이체 단백질은 하나 이상의 아미노산을 삽입, 결실 또는 치환함으로써 그 아미노산 서열을 변경시킴으로써 수득될 수 있다. 상기 단백질의 아미노산 서열은, 예를 들어 치환에 의해 변형시켜, 천연 폴리펩티드와 비교해서 실질적으로 동일하거나 개선된 성질을 지닌 폴리펩티드를 창출시킨다. 이러한 치환은 보존된 치환일 수 있다. "보존된 치환"은 특정 아미노산을, 유사한 측쇄를 갖는 또 다른 아미노산으로 치환시키는 것이다. 보존된 치환은 전반적인 펩티드가 그의 공간적 입체 형태는 보유하고 있지만 변경된 생물학적 활성을 지니도록, 특정 아미노산의 전하 또는 이러한 아미노산의 측쇄의 크기에 있어서의 (또 다른 한편으론, 측쇄 내의 화학 기의 크기, 전하 또는 종류에 있어서의) 가능한 가장 작은 변화를 만드는 아미노산으로의 치환일 것이다. 예를 들어, 통상의 보존된 변화는 Asp가 Glu, Asn 또는 Gln로 치환되고; His가 Lys, Arg 또는 Phe로 치환되며; Asn이 Gln, Asp 또는 Glu로 치환되고; Ser이 Cys, Thr 또는 Gly로 치환되는 것이다. 다른 아미노산을 치환하는 데 알라닌이 흔히 사용된다. 20가지 필수 아미노산은 다음과 같이 분류될 수 있다: 비극성 측쇄를 갖는 알라닌, 발린, 루이신, 이소루이신, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌; 전하를 띠지 않는 극성 측쇄를 갖는 글리신, 세린, 트레오닌, 시스틴, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민; 산성 측쇄를 갖는 아스파르테이트 및 글루타메이트; 및 염기성 측쇄를 갖는 리신, 아르기닌 및 히스티딘.

이러한 아미노산 변화는 상응하는 핵산 서열의 코돈을 변화시킴으로써 달성된다. 상기 폴리펩티드는 생물학적 활성을 변형시키거나 개선시키기 위해 폴리펩티드 구조 내의 다른 아미노산을 특정 아미노산으로 치환시키는 것에 근거하여 수득될 수 있는 것으로 공지되어 있다. 예를 들어, 또 다른 아미노산의 치환을 통하여, 작은 입체 형태적 변화가 폴리펩티드 상에 부여되어 활성 증가를 초래할 수 있다. 또 다른 한편으론, 특정 폴리펩티드 내에서의 아미노산 치환을 이용하여 잔기를 제공할 수 있고, 이어서 이를 다른 분자에 연결시켜, 기타 목적을 위해 유용하게 사용되기에 충분한 출발 폴리펩티드의 특성을 보유하고 있는 펩티드-분자 접합체를 제공할 수 있다.

폴리펩티드에 대해 상호 작용성 생물학적 기능을 부여하는 데 있어서 아미노산의 수치료법 지수(hydropathic index)를 이용할 수 있는데, 여기서는 특정 아미노산이 유사한 수치료법 지수를 갖는 다른 아미노산을 대체할 수 있고, 여전히 유사한 생물학적 활성을 보유하고 있는 것으로 밝혀졌다. 또 다른 한편으론, 특히 생성될 폴리펩티드 내에서의 목적하는 생물학적 기능이 면역학적 실시양태에 사용하도록 의도된 경우에는, 친수성을 기준으로 하여 유사 아미노산의 치환이 이루어질 수 있다. 그의 인접한 아미노산의 친수성에 의해 좌우되는 바와 같이, 특정 "단백질"의 가장 큰 국소 평균 친수성은 그의 면역원성과 상관이 있다. 따라서, 치환은 각 아미노산에 할당된 친수성에 근거하에 이루어질 수 있다는 것에 주목해야 한다.

친수성 지수 또는 수치료법 지수 (이는 각 아미노산에 그 값을 할당한다)를 이용하는 데 있어서, 그들 값이 ±2인 아미노산의 치환을 수행하는 것이 바람직하고, ±1이 특히 바람직하며, ±0.5가 가장 바람직한 치환이다.

변이체 단백질은 상응하는 천연 단백질의 아미노산 서열과 적어도 50%, 적어도 약 80%, 또는 심지어 적어도 약 90% 내지 100% 미만의 연속되는 아미노산 서열 상동성 또는 동일성을 갖는다.

이러한 변이체 폴리펩티드의 아미노산 서열은 본질적으로, 천연 폴리펩티드의 아미노산 서열에 상응한다. 본원에 사용된 바와 같은 "본질적으로 상응하는"은 천연 단백질에 의해 생성된 생물학적 반응과 실질적으로 동일한 생물학적 반응을 유도시킬 폴리펩티드 서열을 지칭한다. 이러한 반응은 천연 단백질에 의해 생성된 수준의 적어도 60%일 수 있고, 심지어 천연 단백질에 의해 생성된 수준의 적어도 80%일 수 있다.

변이체는 상응하는 천연 단백질에 존재하지 않는 아미노산 잔기를 포함할 수 있거나 또는 상응하는 천연 단백질과 비교해서 결실을 포함할 수 있다. 변이체는 또한, 상응하는 천연 단백질과 비교해서 절단된 "단편", 즉 완전한 길이의 단백질의 단지 일부일 수 있다. 단백질 변이체는 또한, 적어도 하나의 D-아미노산을 갖는 펩티드를 포함한다.

변이체 단백질은 이러한 변이체 단백질을 코딩하는 단리된 DNA 서열로부터 발현될 수 있다. "재조합"은 유전 공학 과정에 의해 생성된 펩티드 또는 핵산으로서 정의된다. 유전 코드 내에서의 중복성으로 인해, 개개의 뉴클레오티드가 코돈 내에서 용이하게 교환될 수 있고, 여전히 동일한 아미노산 서열을 초래할 수 있다는 것이 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다는 것을 주목해야 한다.

본 개시내용은 발현 벡터를 특정 세포 또는 환자에게 투여함으로써 특정 포유류에게서 특정 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 유전자 요법 방법의 경우에는, 분자 생물학 분야와 유전자 요법 분야에서의 통상의 기술자가 과도한 실험없이, 본 개시내용의 신규 방법에 사용된 발현 벡터의 적당한 투여량 및 투여 경로를 결정할 수 있을 것이다.

한 실시양태에 따라서, 상기 세포는 생체 내에서 형질전환되거나 또는 달리 유전적으로 변형된다. 포유류 수용자로부터의 상기 세포는 치료제를 코딩하는 이종 (예를 들어, 재조합) 유전자를 발현시키기 위한 외인성 유전 물질을 함유하는 벡터로 생체 내에서 형질전환 (즉, 형질도입 또는 형질감염)시키고, 상기 치료제는 계내에서 전달된다.

본원에 사용된 바와 같은, "외인성 유전 물질"은 세포 내에서 자연적으로 발견되지 않거나; 또는 세포 내에서 자연적으로 발견되는 경우에도, 이러한 세포에 의해 생물학상 실질적 수준으로 전사되거나 발현되지 않는, 자연 또는 합성의 핵산 또는 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. 따라서, "외인성 유전 물질"은 예를 들어, 안티센스 RNA 뿐만 아니라 "이종 유전자" (즉, 동일한 유형의 자연 발생적 세포 내에서 발현되지 않거나 또는 이러한 세포 내에서 생물학상 무의미한 수준으로 발현되는 단백질을 코딩하는 유전자)로 전사될 수 있는 비-자연 발생적 핵산을 포함한다.

특정 실시양태에서, 포유류 수용자는 유전자 대체 요법을 잘 받아들이는 병태를 지닐 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은, "유전자 대체 요법"은 특정 치료제를 코딩하는 외인성 유전 물질을 상기 수용자에게 투여하고, 이와 같이 투여된 유전 물질이 계내에서 후속 발현되는 것을 지칭한다. 따라서, 어구 "유전자 대체 요법을 잘 받아들이는 병태"는 유전 질환 (즉, 한 가지 이상의 유전자 결함에 기인하는 질환 병태), 후천성 병리상태 (즉, 선천성 결함에 기인하지 않는 병리학적 상태), 암 및 예방적 과정 (즉, 특정 질환 또는 바람직하지 못한 의학적 병태의 예방)과 같은 병태를 포괄한다. 따라서, 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "치료제"는 포유류 수용자에 대해 유리한 효과를 나타내는 모든 작용제 또는 물질을 지칭한다. 따라서, "치료제"는 핵산 (예를 들어, 안티센스 RNA) 및/또는 단백질 성분을 갖는 치료적 분자와 예방적 분자 둘 다를 포괄한다.

또 다른 한편으론, 유전자 대체 요법을 잘 받아들이는 병태는 예방적 과정, 즉 질환 또는 바람직하지 못한 의학적 병태를 방지하기 위한 과정이다. 따라서, 본 개시내용은 예방적 기능을 지닌 치료제 (즉, 예방적 작용제)를 포유류 수용자에게 전달하기 위한 세포 발현 시스템을 포괄한다.

요약하면, 용어 "치료제"는 상기 열거된 병태와 연관된 작용제 뿐만 아니라 그들의 기능적 등가물을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "기능적 등가물"은 포유류 수용자에 대하여, 기능적 등가물인 것으로 간주되는 치료제와 동일하거나 개선된 유리한 효과를 나타내는 분자 (예를 들어, 펩티드 또는 단백질)를 지칭한다.

상기 개시된 치료제, 및 유전자 대체 요법을 잘 받아들이는 병태는 단지 예시적이고, 본 개시내용의 범위를 제한하지 않는다. 공지된 병태를 치료하는 데 적합한 치료제의 선택은 과도한 실험 없이도 통상의 기술자의 범위 내에 있는 것으로 간주된다.

AAV 벡터

한 실시양태에서, 본 개시내용의 바이러스성 벡터는 AAV 벡터이다. "AAV" 벡터는 아데노 관련 바이러스를 지칭하고, 자연 발생적 야생형 바이러스 그 자체 또는 그의 유도체를 지칭하기 위해 사용될 수 있다. 상기 용어는 달리 요구되는 경우를 제외하고는, 모든 아유형, 혈청형 및 유사형, 및 자연 발생적 형태와 재조합 형태 둘 다를 포괄한다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "혈청형"은 규정된 항혈청과의 캡시드 단백질 반응성에 근거하여 다른 AAV에 의해 확인되고 이러한 AAV와 구별되는 AAV를 지칭하는데, 예를 들어 8개의 공지된 영장류 AAV의 혈청형 AAV-1 내지 AAV-9, 및 AAVrh10이 있다. 예를 들어, 혈청형 AAV2는 동일한 AAV2 혈청형으로부터의 5' 및 3' ITR 서열을 함유하는 게놈 및 AAV2의 cap 유전자로부터 코딩된 캡시드 단백질을 함유하는 AAV를 지칭하기 위해 사용된다. 본원에 사용된 바와 같은, 예를 들어 rAAV1은 동일한 혈청형으로부터의 5'-3' ITR과 캡시드 단백질 둘 다를 갖는 AAV를 지칭하기 위해 사용될 수 있거나, 또는 하나의 혈청형으로부터의 캡시드 단백질과 상이한 AAV 혈청형으로부터의 5'-3' ITR를 갖는 AAV, 예를 들어, AAV 혈청형 2로부터의 캡시드와 AAV 혈청형 5로부터의 ITR을 갖는 AAV를 지칭할 수 있다. 본원에 예시된 각각의 예에 대하여, 벡터 설계 및 생성에 관한 설명은 캡시드 및 5'-3' ITR 서열의 혈청형에 관해 설명하고 있다. 약어 "rAAV"는 재조합 아데노 관련 바이러스를 지칭하고, 이는 또한 재조합 AAV 벡터 (또는 "rAAV 벡터")로서 지칭된다.

"AAV 바이러스" 또는 "AAV 바이러스성 입자"는 하나 이상의 AAV 캡시드 단백질 (바람직하게, 야생형 AAV의 캡시드 단백질 모두에 의함) 및 캡시드에 싸인 폴리뉴클레오티드로 구성된 바이러스성 입자를 지칭한다. 이러한 입자가 이종 폴리뉴클레오티드 (즉, 야생형 AAV 게놈 이외의 폴리뉴클레오티드, 예컨대 포유류 세포로 전달될 트랜스유전자)를 포함하는 경우, 이는 전형적으로 "rAAV"로서 지칭된다.

한 실시양태에서, AAV 발현 벡터는 제어 요소 (전사 개시 영역 포함), 관심 DNA 및 전사 종결 영역을, 전사의 방향으로 작동적으로 연결된 성분으로서 적어도 제공하는 것으로 공지된 기술을 이용하여 구축된다. 제어 요소는 포유류 세포에서 기능적이 되도록 선택된다. 이로써 생성되는, 작동적으로 연결된 성분을 함유하는 구조물은 기능적 AAV ITR 서열이 양옆에 위치하도록 한다 (5' 및 3').

"아데노 관련 바이러스 역전된 말단 반복부" 또는 "AAV ITR"이란, DNA 복제 기점으로서 및 상기 바이러스에 대한 패키징 신호로서 시스에서 함께 기능하는 AAV 게놈의 각 말단에서 발견된, 관련 기술분야에서 승인된 영역을 의미한다. AAV ITR은 AAV rep 코딩 영역과 함께, 그로부터의 효율적인 절제 및 구제를 제공하고, 양옆에 위치하고 있는 2개의 ITR 사이에 삽입된 뉴클레오티드 서열을 포유류 세포 게놈 내로 통합시켜 준다.

AAV ITR 영역의 뉴클레오티드 서열은 공지되어 있다. 본원에 사용된 바와 같은, "AAV ITR"은 묘사된 야생형 뉴클레오티드 서열을 가질 필요가 없지만, 예를 들어 뉴클레오티드의 삽입, 결실 또는 치환에 의해 변경될 수 있다. 부가적으로, AAV ITR은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV7 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 몇 가지 AAV 혈청형 중 어느 것으로부터도 유래될 수 있다. 더욱이, AAV 벡터 내의 선택된 뉴클레오티드 서열 양옆에 위치하고 있는 5' 및 3' ITR은 반드시 동일할 필요가 없거나 또는 동일한 AAV 혈청형 또는 단리물로부터 유래될 필요가 없는데, 단 이들은 의도된 바와 같이 기능해야 하는데, 즉 숙주 세포 게놈 또는 벡터로부터 관심 서열을 절제 및 구제할 수 있어야 하고; AAV Rep 유전자 생성물이 상기 세포에 존재하는 경우에는, 이종 서열을 수용자 세포 게놈 내로 통합시킬 수 있어야 한다.

한 실시양태에서, AAV ITR은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV7 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 몇 가지 AAV 혈청형 중 어느 것으로부터도 유래될 수 있다. 더욱이, AAV 발현 벡터 내의 선택된 뉴클레오티드 서열 양옆에 위치하고 있는 5' 및 3' ITR은 반드시 동일할 필요가 없거나 또는 동일한 AAV 혈청형 또는 단리물로부터 유래될 필요가 없는데, 단 이들은 의도된 바와 같이 기능해야 하는데, 즉 숙주 세포 게놈 또는 벡터로부터 관심 서열을 절제 및 구제할 수 있어야 하고; AAV Rep 유전자 생성물이 상기 세포에 존재하는 경우에는, DNA 분자를 수용자 세포 게놈 내로 통합시킬 수 있어야 한다.

한 실시양태에서, AAV 캡시드는 AAV2로부터 유래될 수 있다. AAV 벡터에 사용하기 적합한 DNA 분자는 그 크기가 약 5 킬로염기 (kb) 미만, 약 4.5 kb 미만, 약 4 kb 미만, 약 3.5 kb 미만, 약 3 kb 미만, 약 2.5 kb 미만이고, 관련 기술분야에 공지되어 있다.

한 실시양태에서, 상기 선택된 뉴클레오티드 서열은 대상체의 생체 내에서 그의 전사 또는 발현을 지시하는 제어 요소와 작동적으로 연결된다. 이러한 제어 요소는 선택된 유전자와 정상적으로 연합된 제어 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 한편으론, 이종 제어 서열을 이용할 수 있다. 유용한 이종 제어 서열은 일반적으로, 포유류 또는 바이러스성 유전자를 코딩하는 서열로부터 유래된 것을 포함한다. 그의 예는 SV40 초기 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스 LTR 프로모터; 아데노바이러스 주요 후기 프로모터 (Ad MLP); 단순 포진 바이러스 (HSV) 프로모터, 시토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터, 예컨대 CMV 즉발형 프로모터 영역 (CMVIE), 라우스 육종 바이러스 (RSV) 프로모터, pol II 프로모터, pol III 프로모터, 합성 프로모터, 혼성체 프로모터 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 또한, 비바이러스성 유전자, 예컨대 뮤린 메탈로티오네인 유전자로부터 유래된 서열이 또한, 본원에서 사용될 것이다. 이러한 프로모터 서열은, 예를 들어 스트라타젠 (Stratagene; 미국 캘리포니아주 샌 디에고)으로부터 시판되고 있다.

한 실시양태에서, 이종 프로모터와 기타 제어 요소, 예컨대 CNS-특이적 및 유도성 프로모터, 증강인자 등 둘 다가 특별히 사용될 것이다. 이종 프로모터의 예는 CMV 프로모터를 포함한다. CNS-특이적 프로모터의 예는 미엘린 염기성 단백질 (MBP), 신경교 섬유성 산 단백질 (GFAP), 및 뉴런 특이적 에놀라제 (NSE)로부터의 유전자로부터 단리된 것을 포함한다. 유도성 프로모터의 예는 엑디손, 테트라사이클린, 하이폭시아 및 아우핀에 대한 DNA 반응성 요소를 포함한다.

한 실시양태에서, AAV ITR에 의해 결합된 관심 DNA 분자가 정착된 AAV 발현 벡터는 상기 선택된 서열(들)을, 그로부터 절제된 주요 AAV 개방 판독 프레임 ("ORF")을 갖는 AAV 게놈 내로 직접 삽입함으로써 구축될 수 있다. AAV 게놈의 기타 부분을 또한 결실시킬 수 있는데, 단 복제와 패키징 기능을 허용하기에 충분한 부분의 ITR이 남아있어야 한다. 이러한 구조물은 관련 기술분야에 널리 공지된 기술을 이용하여 설계할 수 있다.

또 다른 한편으론, AAV ITR은 바이러스성 게놈으로부터 절제될 수 있거나 또는 표준 결찰 기술을 이용하여 또 다른 벡터에 존재하는 선택된 핵산 구조물의 동일하고 융합된 5' 및 3'를 함유하는 AAV 벡터로부터 절제될 수 있다. 예를 들어, 결찰은 20 mM 트리스(Tris)-Cl pH 7.5, 10 mM MgCl₂, 10 mM DTT, 33 ㎍/ml BSA, 10 mM-50 mM NaCl, 및 0℃ 하에 40 uM ATP, 0.01-0.02 [웨이스(Weiss)] 단위 T4 DNA 리가제 ("접착성 말단" 결찰의 경우) 또는 14℃ 하에 1 mM ATP, 0.3-0.6 (웨이스) 단위 T4 DNA 리가제 ("평활 말단" 결찰의 경우)에서 수행될 수 있다. 분자간 "접착성 말단" 결찰은 통상적으로, 30 내지 100 ㎍/ml 총 DNA 농도 (5 내지 100 nM 총 말단 농도)에서 수행된다. AAV 벡터는 ITR을 함유한다.

부가적으로, 키메라 유전자는 하나 이상의 선택된 핵산 서열의 5' 및 3'에 배열된 AAV ITR 서열을 포함하도록 합성적으로 생성될 수 있다. 포유류 CNS 세포에서 키메라 유전자 서열을 발현하는 데 바람직한 코돈을 사용할 수 있다. 완전한 키메라 서열은 표준 방법에 의해 제조된 중복되는 올리고뉴클레오티드로부터 어셈블리된다.

rAAV 비리온을 생성하기 위해, AAV 발현 벡터를 공지된 기술을 이용하여, 예컨대 형질감염에 의해 적합한 숙주 세포 내로 도입한다. 수많은 형질감염 기술이 일반적으로 관련 기술분야에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York] 참조). 특히 적합한 형질감염 방법은 인산칼슘 공-침전, 배양된 세포 내로의 직접적인 미세주사, 전기천공, 리포솜 매개된 유전자 전이, 지질 매개된 형질도입, 및 고속 미소발사체를 이용한 핵산 전달을 포함한다.

한 실시양태에서, rAAV 비리온을 생성시키는 데 적합한 숙주 세포는 이종 DNA 분자의 수용자로서 사용될 수 있거나 또는 사용되어 왔던 미생물, 효모 세포, 곤충 세포 및 포유류 세포를 포함한다. 상기 용어는 형질감염시켰던 본래의 세포의 자손을 포함한다. 따라서, 본원에 사용된 바와 같은 "숙주 세포"는 일반적으로, 외인성 DNA 서열로 형질감염시켰던 세포를 지칭한다. 안정적인 인간 세포주 293으로부터의 세포 [예를 들어, 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection)을 통하여 수탁 번호 ATCC CRL1573 하에 용이하게 입수 가능함]가 본 개시내용의 실시에 사용될 수 있다. 특히, 이러한 인간 세포주 293은 아데노바이러스 유형-5 DNA 단편으로 형질전환시켰던 인간 배아 신장 세포주이고, 아데노바이러스성 E1a 및 E1b 유전자를 발현한다. 상기 293 세포주는 용이하게 형질감염되고, rAAV 비리온을 생성시키는 데 특히 편리한 플랫폼을 제공한다.

"AAV rep 코딩 영역"이란, 복제 단백질 Rep 78, Rep 68, Rep 52 및 Rep 40을 코딩하는 AAV 게놈의 관련 기술분야에서 승인된 영역을 의미한다. 이들 Rep 발현 생성물은 AAV DNA 복제 기점의 인식, 결합 및 니킹(nicking), DNA 헬리카제 활성 및 AAV (또는 기타 이종) 프로모터로부터의 전사의 조정을 포함한 많은 기능을 보유하고 있는 것으로 밝혀졌다. 이러한 Rep 발현 생성물은 집합적으로, AAV 게놈을 복제하는 데 요구된다. AAV rep 코딩 영역의 적합한 동족체는 AAV-2 DNA 복제를 매개하는 것으로 공지되기도 한 인간 헤르페스바이러스 6 (HHV-6) rep 유전자를 포함한다.

"AAV cap 코딩 영역"이란, 캡시드 단백질 VP1, VP2, 및 VP3, 또는 그의 기능적 동족체를 코딩하는 AAV 게놈의 관련 기술분야에서 승인된 영역을 의미한다. 이들 Cap 발현 생성물은 상기 바이러스성 게놈을 패키징하는 데 집합적으로 요구되는 패키징 기능을 공급한다.

한 실시양태에서, AAV 발현 벡터의 형질감염 이전 또는 형질감염과 동시에 숙주 세포를 AAV 헬퍼 구조물로 형질감염시킴으로써 AAV 헬퍼 작용기를 숙주 세포 내로 도입한다. 따라서, AAV 헬퍼 구조물을 사용하여, 생산적 AAV 감염에 필요한 누락된 AAV 기능을 보충하기 위하여 AAV rep 및/또는 cap 유전자의 적어도 일시적 발현을 제공한다. AAV 헬퍼 구조물에는 AAV ITR이 결여되고, 이러한 구조물은 스스로 복제하거나 패키징될 수 없다. 이들 구조물은 플라스미드, 파지, 트랜스포손(transposon), 코스미드, 바이러스, 또는 비리온의 형태일 수 있다. 수많은 AAV 헬퍼 구조물, 예컨대 Rep 발현 생성물과 Cap 발현 생성물 둘 다를 코딩하는, 흔히 사용되고 있는 플라스미드 pAAV/Ad 및 pIM29+45가 보고되었다. Rep 및/또는 Cap 발현 생성물을 코딩하는 수많은 기타 벡터가 보고되었다.

바이러스성 벡터의 전달 방법은 AAV2를 CSF 내로 주사하는 것을 포함한다. 일반적으로, rAAV 비리온은 생체내 또는 시험관내 형질도입 기술을 이용하여 CNS의 세포 내로 도입할 수 있다. 시험관 내에서 형질도입된 경우에는, 목적하는 수용자 세포를 대상체로부터 제거하고, rAAV 비리온으로 형질도입한 다음, 이를 상기 대상체 내로 재도입할 것이다. 또 다른 한편으론, 동계 또는 이종 세포를 사용할 수 있는데, 이들 세포는 상기 대상체 내에서 부적절한 면역 반응을 발생시키지 않을 것이다.

형질도입된 세포를 특정 대상체 내로 전달 및 도입하는 데 적합한 방법이 보고되었다. 예를 들어, 재조합 AAV 비리온을, 예를 들어 적당한 배지에서 CNS 세포와 조합함으로써 세포를 시험관 내에서 형질도입할 수 있고, 관심 DNA를 정착시킨 세포에 관하여 스크리닝하는 것은 통상적인 기술, 예컨대 서던 블롯 및/또는 PCR을 이용하거나 또는 선별성 마커를 이용함으로써 스크리닝할 수 있다. 이어서, 형질도입된 세포를 다음에 보다 상세히 기재된 제약 조성물로 제제화할 수 있고, 이 조성물을 각종 기술, 예컨대 조직 이식, 근육내, 정맥내, 피하 및 복강내 주사함으로써 대상체 내로 도입할 수 있다.

한 실시양태에서, 제약 조성물은 관심 핵산의 치료상 유효량, 즉 해당 질환 상태의 증상을 저하 또는 완화시키기에 충분한 양 또는 목적하는 이득을 부여하는 데 충분한 양을 생성시키기에 충분한 유전 물질을 포함할 것이다. 제약 조성물은 또한, 제약상 허용되는 부형제를 함유할 것이다. 이러한 부형제는 그 자체로는 상기 조성물이 투여되는 개체에 해로운 항체의 생성을 유도시키지 않고 과도한 독성 없이 투여될 수 있는 모든 제약 작용제를 포함한다. 제약상 허용되는 부형제는 소르비톨, 트윈(Tween)80, 및 액상물, 예컨대 물, 식염수, 글리세롤 및 에탄올을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 제약상 허용되는 염, 예를 들어 무기산 염, 예컨대 히드로클로라이드, 히드로브로마이드, 포스페이트, 술페이트 등; 및 유기산 염, 예컨대 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트, 벤조에이트 등이 그에 포함될 수 있다. 부가적으로, 보조 물질, 예컨대 습윤제 또는 유화제, pH 완충 물질 등이 상기 비히클에 존재할 수 있다. 제약상 허용되는 부형제의 상세한 논의는 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., N.J. 1991)]에서 이용 가능하다.

2개 이상의 트랜스유전자가 상기 전달된 바이러스성 벡터에 의해 발현될 수 있었다는 것을 이해해야 한다. 또 다른 한편으론, 각각 하나 이상의 상이한 트랜스유전자를 발현하는 별개의 벡터가 또한, 본원에 기재된 바와 같이 CNS에 전달될 수 있다. 더욱이, 본 개시내용의 방법에 의해 전달된 바이러스성 벡터가 다른 적합한 조성물 및 요법과 조합되어야 하는 것으로 또한 의도된다.

본 명세서의 교시 관점에서 통상의 기술자에게 명백한 바와 같이, 부가되어야만 하는 바이러스성 벡터의 유효량은 실험적으로 결정될 수 있다. 투여는 치료 과정 내내 1회 용량으로 수행되거나, 지속적 또는 간헐적으로 수행될 수 있다. 가장 유효한 투여 수단 및 투여량을 결정하는 방법은 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있고, 바이러스성 벡터, 요법의 조성, 표적 세포, 및 치료받고자 하는 대상체에 따라 다양할 것이다. 단일 및 다수 투여가 수행될 수 있는데, 그 용량 수준과 패턴은 치료 의사에 의해 선택된다.

특정 실시양태에서, rAAV는 약 1 내지 5 ml의 1x10⁵ 내지 1x10¹⁶ vg/ml의 용량으로 투여된다. 특정 실시양태에서, rAAV는 약 1 내지 3 ml의 1x10⁷ 내지 1x10¹⁴ vg/ml의 용량으로 투여된다. 특정 실시양태에서, rAAV는 약 1 내지 2 ml의 1x10⁸ 내지 1x10¹³ vg/ml의 용량으로 투여된다.

rAAV 입자를 함유하는 제제는 비히클 내에 유효량의 rAAV 입자를 함유할 것인데, 이러한 유효량은 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정된다. rAAV 입자는 전형적으로, 조성물의 약 1% 내지 약 95% (w/w) 범위이거나, 또는 적절한 경우에는 그 보다 훨씬 더 높거나 낮을 수 있다. 투여되는 양은 치료하기 위해 고려된 동물 또는 인간 대상체의 연령, 체중 및 신체 상태와 같은 요인에 좌우된다. 유효 투여량은 용량 반응 곡선을 확립시키는 일상적인 시험을 통하여 통상의 기술자에 의해 확립될 수 있다. 대상체는 rAAV 입자를 1회 이상의 용량으로 투여함으로써 치료한다. 적당한 효소 활성을 유지하는 데 요구되는 바와 같은 수 회분 용량을 투여할 수 있다.

물, 수성 식염수, 인공 CSF, 또는 기타 공지된 물질을 포함한 비히클이 본 발명과 함께 이용될 수 있다. 제제를 제조하기 위하여, 정제된 조성물을 단리하고, 동결 건조시키며 안정화시킬 수 있다. 이어서, 이 조성물을 적당한 농도가 되도록 조정하고, 임의로 항염증제(anti-inflammatory agent)와 조합하며, 사용을 위해 패키징할 수 있다.

TPP1 단백질

특정 실시양태에서, 투여되는 핵산은 TPP1 (야생형 TPP1과 실질적 동일성을 갖는 TPP1), 및/또는 TPP1의 변이체, 돌연변이체 또는 단편을 코딩한다. 인간 TPP1 아미노산 서열은 도 14에 제공되고, 핵산 서열은 도 15에 제공된다. 도 16은 히말라야 원숭이 TPP1 아미노산 서열을 제공하고, 도 17은 필리핀 원숭이 TPP1 아미노산 서열을 제공한다. 특정 실시양태에서, TPP1 단백질은 도 14, 16 또는 17에 제시된 단백질과 약 70% 상동성, 약 75% 상동성, 80% 상동성, 85% 상동성, 90% 상동성, 95% 상동성, 98% 상동성, 99% 상동성, 또는 심지어 100% 상동성을 가질 수 있다. TPP1 단백질은 도 14, 16 또는 17에 제시된 단백질과 약 70% 동일성, 약 75% 동일성, 80% 동일성, 85% 동일성, 90% 동일성, 95% 동일성, 98% 동일성, 99% 동일성, 또는 심지어 100% 동일성을 가질 수 있다.

돌연변이체 단백질은 특정 돌연변이, 예를 들어 TPP1에서의 미스센스 또는 논센스 돌연변이를 갖는 유전자에 의해 코딩된 단백질을 지칭한다. 용어 "핵산"은 당, 포스페이트 및 염기 (이는 퓨린 또는 피리미딘이다)를 함유하는 단량체 (뉴클레오티드)로 구성된, 단일 가닥 형태 또는 이중 가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 및 그의 중합체를 지칭한다. 달리 구체적으로 제한되지 않는 한, 상기 용어는 참조 핵산과 유사한 결합 특성을 지니고 자연 발생적 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사되는 자연 뉴클레오티드의 공지된 유사체를 함유하는 핵산을 포괄한다. 달리 표시되지 않는 한, 특별한 핵산 서열은 또한, 그의 보존적으로 변형된 변이체 (예를 들어, 축중성 코돈 치환물) 및 상보적 서열 뿐만 아니라 명시적으로 표시된 서열을 포괄한다. 구체적으로 언급하면, 축중성 코돈 치환물은 하나 이상의 선택된 (또는 모든) 코돈의 세 번째 위치를 혼합된 염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환시킨 서열을 생성시킴으로써 달성될 수 있다.

"핵산 단편"은 소정의 핵산 분자의 일부이다. 대다수의 유기체 내에서의 데옥시리보핵산 (DNA)은 유전 물질인 반면, 리보핵산 (RNA)은 DNA 내에 함유된 정보를 단백질 내로 전이하는 데 관여한다. 본원에 개시된 뉴클레오티드 서열 및 단백질, 또는 이로써 코딩된 부분 길이의 단백질의 단편 및 변이체가 또한, 본 발명에 의해 포괄된다. "단편" 또는 "부분"이란, 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 또는 폴리펩티드 또는 단백질의 아미노산 서열의 완전한 길이 또는 완전한 길이 보다 작은 길이를 의미한다. 특정 실시양태에서, 이러한 단편 또는 부분은 생물학상 기능적이다 (즉, 야생형 TPP1의 효소 활성의 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100%를 보유하고 있다).

특정 분자의 "변이체"는 천연 분자의 서열과 실질적으로 유사한 서열이다. 뉴클레오티드 서열의 경우, 변이체는 유전 코드의 축중(degeneracy)으로 인해, 천연 단백질의 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 서열을 포함한다. 이들과 같은 자연 발생적 대립유전자성 변이체는 분자 생물학 기술을 이용하여, 예를 들어 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 및 혼성화 기술을 이용하여 확인될 수 있다. 변이체 뉴클레오티드 서열은 또한, 천연 단백질을 코딩하는 합성적으로 유래된 뉴클레오티드 서열, 예컨대 예를 들어 부위 지시된 돌연변이 유발을 이용함으로써 생성된 서열 뿐만 아니라 아미노산 치환을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 상기 서열을 포함한다. 일반적으로, 본 발명의 뉴클레오티드 서열 변이체는 천연 (내인성) 뉴클레오티드 서열과 적어도 40%, 50%, 60% 내지 70%, 예를 들어 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 내지 79%, 일반적으로 적어도 80%, 예를 들어 81% 내지 84%, 적어도 85%, 예를 들어 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% 내지 98%의 서열 동일성을 가질 것이다. 특정 실시양태에서, 상기 변이체는 생물학상 기능적이다 (즉, 야생형 TPP1의 효소 활성의 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100%를 보유하고 있다).

특별한 핵산 서열의 "보존적으로 변형된 변이"는 동일하거나 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 지칭한다. 유전 코드의 축중으로 인해, 다수의 기능상 동일한 핵산이 소정의 모든 폴리펩티드를 코딩한다. 예를 들어, 코돈 CGT, CGC, CGA, CGG, AGA 및 AGG는 모두 아미노산 아르기닌을 코딩한다. 따라서, 아르기닌이 특정 코돈에 의해 명시되는 모든 위치에서, 이러한 코돈은 코딩된 단백질을 변경시키지 않으면서 언급된 상응하는 코돈 중 어느 것으로도 변경될 수 있다. 이러한 핵산 변이는 "침묵 변이"인데, 이는 "보존적으로 변형된 변이"의 한 종류이다. 특정 폴리펩티드를 코딩하는 본원에 기재된 모든 핵산 서열은 또한, 달리 언급된 경우를 제외하고는 가능한 모든 침묵 변이를 설명하고 있다. 통상의 기술자는 핵산 내의 각 코돈 (통상적으로 메티오닌에 대한 유일한 코돈인 ATG는 제외된다)이 표준 기술에 의해 기능상 동일한 분자를 산출하도록 변형될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 따라서, 특정 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 각 "침묵 변이"는 각각의 언급된 서열에 내포되어 있다.

용어 폴리뉴클레오티드 서열의 "실질적 동일성"은 특정 폴리뉴클레오티드가, 표준 파라미터를 이용하여 언급된 정렬 프로그램 중 하나를 이용하여 참조 서열과 비교한 경우에, 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 또는 79%, 또는 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 또는 89%, 또는 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 또는 94%, 또는 심지어 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다는 것을 의미한다. 통상의 기술자는 이들 값이, 코돈 축중, 아미노산 유사성, 판독 프레임 위치 설정 등을 고려함으로써 두 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 단백질의 상응하는 동일성을 결정하기 위해 적절하게 조정될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 이들 목적상 아미노산 서열의 실질적 동일성은 정상적으로, 적어도 70%, 적어도 80%, 90%, 또는 심지어 적어도 95%의 서열 동일성을 의미한다.

펩티드의 맥락에서 용어 "실질적 동일성"은 펩티드가, 명시된 비교 윈도(window) 전반에 걸쳐 참조 서열과 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 또는 79%, 또는 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 또는 89%, 또는 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 또는 94%, 또는 심지어 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다는 것을 표시한다. 두 펩티드 서열이 실질적으로 동일하다는 지표는 하나의 펩티드가 두 번째 펩티드에 대항하여 생성된 항체와 면역학적으로 반응성인 것이다. 따라서, 예를 들어 두 펩티드가 보존적 치환에 의해서만 상이한 경우에, 한 펩티드는 두 번째 펩티드와 실질적으로 동일하다.

아포지질단백질 E ( ApoE )

몇 가지 상이한 인간 아포지질단백질 E (ApoE) 이소형이 있는데, 이들 이소형 중 일부가 뇌에 존재하면, 알츠하이머병 (AD)에 걸릴 위험이 증가하는 반면, 다른 이소형이 존재하면, AD에 걸릴 위험이 감소한다. ApoE ε4 이소형의 존재가 후기 발병, 산발적 AD에 대한 강력한 유전적 위험 인자이다 (Casellano et al., Sci Transl Med, 3(89):89ra57 (29 June 2011)). ApoE ε4 대립유전자는 AD 위험을 강력하게 증가시키고 발병 연령을 낮춘다. 다른 한편으로는, ApoE ε2 대립유전자의 존재는 AD 위험을 감소시키는 것으로 여겨진다. 인간 ApoE 이소형은 생체 내에서 아밀로이드-β (Aβ)의 청소율(clearance) 또는 합성에 차별적으로 영향을 미치는 것으로 제안되고 있다.

특정 실시양태에서, 투여되는 핵산은 ApoE (야생형 ApoE와 실질적 동일성을 갖는 ApoE), 또는 ApoE의 변이체, 돌연변이체 및/또는 단편을 코딩한다. 특정 실시양태에서, 상기 핵산은 ApoE ε2 (야생형 ApoE ε2와 실질적 동일성을 갖는 ApoE ε2), 및/또는 ApoE ε2의 변이체, 돌연변이체 또는 단편을 코딩한다.

면역억제제

특정 실시양태에서, 면역억제제가 또한 포유류에게 투여된다. 특정 실시양태에서, 이러한 면역억제제는 항염증제이다. 특정 실시양태에서, 항염증제는 미코페놀레이트이다. 특정 실시양태에서, 항염증제는 rAAV 입자의 투여 이전에 투여된다. 특정 실시양태에서, 항염증제는 rAAV 입자의 투여와 공동으로 투여된다. 특정 실시양태에서, 항염증제는 rAAV 입자의 투여 후에 투여된다.

특정 실시양태에서, 항염증제는 적당한 비히클 중에서 비경구적으로, 예컨대 근육내 또는 피하 주사에 의해 투여된다. 그러나, 다른 투여 방식, 예컨대 경구, 비내 또는 피내 전달이 또한 허용된다. 특정 실시양태에서, rAAV 입자와 항염증제를 포함하는 조성물을 제조하고, 이러한 항염증제와 rAAV 입자를 포유류의 대수조 및/또는 포유류의 뇌실, 지주막하 공간 및/또는 척추강내 공간에 동시에 투여한다.

유전 물질을 세포 내로 도입하는 방법

외인성 유전 물질 (예를 들어, 하나 이상의 치료용 단백질을 코딩하는 cDNA)을 유전적 전이 방법, 예컨대 형질감염 또는 형질도입에 의해 생체 내에서 세포 내로 도입하여, 유전적으로 변형된 세포를 제공한다. 각종 발현 벡터 (즉, 외인성 유전 물질을 표적 세포 내로 전달하는 것을 촉진시키기 위한 비히클)가 통상의 기술자에게 공지되어 있다.

본원에 사용된 바와 같은, "세포의 형질감염"은 부가된 DNA의 혼입에 의해 새로운 유전 물질의 세포에 의한 획득을 지칭한다. 따라서, 형질감염은 물리적 또는 화학적 방법을 이용하여 핵산을 세포 내로 삽입하는 것을 지칭한다. 인산칼슘 DNA 공-침전; DEAE-덱스트란; 전기천공; 양이온성 리포솜 매개된 형질감염; 및 텅스텐 입자-촉진된 미세입자 충격을 포함한 몇 가지 형질감염 기술이 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 인산스트론튬 DNA 공-침전이 또 다른 가능한 형질감염 방법이다.

이와는 달리, "세포의 형질도입"은 DNA 또는 RNA 바이러스를 이용하여 핵산을 세포 내로 전이시키는 과정을 지칭한다. 핵산을 세포 내로 전이시키기 위한 RNA 바이러스 (즉, 레트로바이러스)는 본원에서 형질도입 키메라 레트로바이러스로서 지칭된다. 이러한 레트로바이러스 내에 함유된 외인성 유전 물질은 상기 형질도입된 세포의 게놈 내로 혼입된다. 키메라 DNA 바이러스 (예를 들어, 치료제를 코딩하는 cDNA를 수반하는 아데노바이러스)로 형질도입시켰던 세포는 그의 게놈 내로 혼입된 외인성 유전 물질을 가지지 않을 것이지만, 상기 세포 내에 염색체외적으로 보유되는 외인성 유전 물질을 발현할 수 있을 것이다.

전형적으로, 외인성 유전 물질은 새로운 유전자의 전사를 제어하기 위한 프로모터와 함께 이종 유전자 (통상적으로, 치료용 단백질을 코딩하는 엑손을 포함하는 cDNA의 형태)를 포함한다. 상기 프로모터는 특징적으로, 전사를 개시하는 데 필요한 특이적 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 임의로, 외인성 유전 물질은 추가로, 목적하는 유전자 전사 활성을 수득하는 데 요구되는 부가 서열 (즉, 증강인자)을 포함한다. 이러한 논의를 위하여, "증강인자"는 단순히, 상기 프로모터에 의해 좌우되는 기저 전사 수준을 변화시키기 위해 코딩 서열과 연속해서 (시스로) 작동되는 모든 비-해독 DNA 서열이다. 외인성 유전 물질은 프로모터로부터 바로 하류에 있는 세포 게놈 내로 도입하여, 코딩 서열의 전사를 허용하도록 프로모터와 이러한 코딩 서열을 작동적으로 연결시킬 수 있다. 레트로바이러스성 발현 벡터는 삽입된 외인성 유전자의 전사를 제어하기 위한 외인성 프로모터 요소를 포함할 수있다. 이러한 외인성 프로모터는 구성성 프로모터와 유도성 프로모터 둘 다를 포함한다.

자연 발생적 구성성 프로모터는 필수 세포 기능의 발현을 제어한다. 그 결과로서, 구성성 프로모터의 제어 하의 유전자는 세포 성장의 모든 조건 하에 발현된다. 예시되는 구성성 프로모터는 특정의 구성성 또는 "하우스키핑" 기능을 코딩하는 다음 유전자에 대한 프로모터를 포함한다: 히포크산틴 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HPRT), 디히드로폴레이트 환원효소 (DHFR), 아데노신 데아미나제, 포스포글리세롤 키나제 (PGK), 피루베이트 키나제, 포스포글리세롤 뮤타제, 액틴 프로모터, 및 통상의 기술자에게 공지된 기타 구성성 프로모터. 또한, 많은 바이러스성 프로모터가 진핵 세포에서 구성적으로 기능한다. 이들은 특히, SV40의 초기 및 후기 프로모터; 몰로니(Moloney) 백혈병 바이러스 및 기타 레트로바이러스의 장 말단 반복부 (LTR); 및 단순 포진 바이러스의 티미딘 키나제 프로모터를 포함한다. 따라서, 상기 언급된 구성성 프로모터 중 어느 것을 사용해서도 이종 유전자 삽입체의 전사를 제어할 수 있다.

유도성 프로모터의 제어 하에 있는 유전자는 단지 일정 정도로만 발현되거나, 또는 유도성 작용제의 존재 하에서는 보다 큰 정도로 발현된다 (예를 들어, 메탈로티오네인 프로모터의 제어 하에서의 전사는 특정 금속 이온의 존재 하에 크게 증가된다). 유도성 프로모터는 그들의 유도성 인자가 결합된 경우에는 전사를 자극하는 반응성 요소 (RE)를 포함한다. 예를 들어, 혈청 인자, 스테로이드 호르몬, 레티노산 및 사이클릭 AMP에 대한 RE가 있다. 유도성 반응을 수득하기 위하여 특별한 RE를 함유하는 프로모터를 선택할 수 있고, 일부 경우에는 RE 그 자체를 상이한 프로모터에 부착시킴으로써, 재조합 유전자에 유도성을 부여할 수 있다. 따라서, 적당한 프로모터를 선택함으로써 (구성성 대 유도성; 강함 대 약함), 유전적으로 변형된 세포에서 특정 치료제의 발현 수준과 실존 둘 다를 제어하는 것이 가능하다. 이러한 치료제를 코딩하는 유전자가 유도성 프로모터의 제어 하에 있는 경우에는, 계내에서 유전적으로 변형된 세포를, 예를 들어 치료제의 전사를 제어하는 유도성 프로모터의 특이적 유도인자의 복강내 주사에 의해, 치료제의 전사를 허용해 주는 조건에 노출시킴으로써, 치료제를 계내에서 전달하는 것이 촉발된다. 예를 들어, 메탈로티오네인 프로모터의 제어 하에 있는 유전자에 의해 코딩된 치료제의 유전적으로 변형된 세포에 의한 계내 발현은, 이러한 유전적으로 변형된 세포를 계내에서 적당한 (즉, 유도시키는) 금속 이온을 함유하는 용액과 접촉시킴으로써 증강된다.

따라서, 계내에서 전달되는 치료제의 양은 (1) 삽입된 유전자의 전사를 지시하기 위해 사용된 프로모터의 성질 (즉, 이러한 프로모터가 구성성인지 유도성인지의 여부, 강한지 약한지의 여부); (2) 세포 내로 삽입되는 외인성 유전자의 카피 수; (3) 환자에게 투여되는 (예를 들어, 체내 이식되는) 형질도입된/형질감염된 세포의 수; (4) 체내 이식체 (예를 들어, 이식체 또는 피막화된 발현 시스템)의 크기; (5) 체내 이식체의 수; (6) 형질도입된/형질감염된 세포 또는 체내 이식체가 제자리에 남아있는 기간; 및 (7) 유전적으로 변형된 세포에 의한 치료제의 생산율과 같은 요인들을 제어함으로써 조절된다. 특별한 치료제의 치료상 유효 용량을 전달하기 위해 이들 요인을 선택하고 최적화하는 것은 상기 개시된 요인과 환자의 임상 프로파일을 고려하여, 과도한 실험 없이도 통상의 기술자의 범위 내에 있는 것으로 간주된다.

하나 이상의 프로모터와 치료제를 코딩하는 하나 이상의 이종 핵산 이외에도, 발현 벡터는 이러한 발현 벡터로 형질감염 또는 형질도입시킨 세포의 선별을 촉진시키기 위한 선별 유전자, 예를 들어 네오마이신 내성 유전자를 포함할 수 있다. 또 다른 한편으론, 세포를 2개 이상의 발현 벡터로 형질감염시키는데, 그 중 적어도 하나의 벡터는 치료제(들)를 코딩하는 유전자(들)를 함유하고, 다른 벡터는 선별 유전자를 함유한다. 적합한 프로모터, 증강인자, 선별 유전자 및/또는 신호 서열 (다음에 기재됨)의 선택은 과도한 실험 없이도 통상의 기술자의 범위 내에 있는 것으로 간주된다.

치료제는 세포외, 세포내 또는 막 위치로 전달하는 것을 목표로 할 수 있다. 유전자 생성물을 세포로부터 분비시키는 것이 요망되는 경우에는, 치료용 유전자 생성물을 상기 세포로부터 세포외 환경으로 분비시키는 데 적당한 분비 "신호" 서열을 포함하도록 발현 벡터를 설계한다. 유전자 생성물을 세포 내에 보유하는 것이 요망되는 경우에는, 이러한 분비 신호 서열이 생략된다. 유사한 방식으로, 치료제를 세포 혈장막 내에 정착시키기 위한 "잔류" 신호 서열을 포함하도록 발현 벡터를 구축할 수 있다. 예를 들어, 모든 막 단백질은 막 내에서의 단백질의 전위를 중지시키고 단백질이 분비되지 못하게 하는 소수성 막관통 영역을 갖는다. 유전자 생성물이 특별한 위치를 표적으로 하기 위한 신호 서열을 포함한 발현 벡터의 구축은 과도한 실험에 대한 필요성 없이도 통상의 기술자의 범위 내에 있는 것으로 간주된다.

실시예 1

대형 포유류에서의 유전자 전이 방법

리소솜 축적 장애 (LSD)는 큰 부류의 선천성 대사 장애를 구성한다. 대부분의 LSD는 기관 손상과 종종 중추 신경계 (CNS) 변성을 유발시키는 리소솜 효소 결핍증에 의해 야기된다. 유아 말기 신경 세로이드 리포푸스신증 (LINCL)은 리소솜 프로테아제 트리펩티딜 펩티다제 1 (TPP1)을 코딩하는 세로이드-리포푸스신증 (CLN), 신경 2 유전자 CLN2에서의 돌연변이에 의해 유발된 상염색체 열성 신경변성 질환이다. LINCL은 임상적으로, 정상적인 탄생과 조기 발병, 18 내지 24개월째 발작 개시, 점진적 운동 및 인지 기능 저하, 및 조기 사망을 특징으로 한다. 이러한 질환은 가용성인 M-6-P 장식된 리소솜 효소인 TPP1에 있어서의 결핍에 기인한다.

효소-대체 요법 (ERT)이 말초 조직에 침범되는 리소솜 축적 질환에 대해 현재 이용 가능하지만, 중추 신경계 (CNS) 병변 환자에게서는 사용되지 못하였다. 최근의 연구는 뇌척수액을 통한 효소 전달이 LINCL의 경우에 CNS에 대한 잠재적 대체 경로였는지를 조사하였다 (Chang et al., Molecular Therapy 16:649-656, 2008). 처리된 마우스는 비히클 처리된 마우스와 비교해서 약화된 신경 병리상태와 감소된 안정시 떨림(resting tremor)을 나타내었다.

본 연구에서는, 뇌에서의 주사를 통하여 뇌척수액 (CSF)에서의 효소의 정상 상태 수준을 달성하기 위하여 벡터의 포괄적인 전달이 효과적으로 수행될 수 있었는지를 연구 조사하였다. 연구는 LINCL의 개 모델에서 수행되었다. LINCL 개는 출산시 정상적이었지만, 약 7개월에 신경학적 징후가 발생하였고, 약 5 내지 6개월에는 검사 가능한 인지적 결함을 나타냈으며, 10 내지 11개월에 발작을 나타냈고 점진적 시력 상실을 나타냈다. LINCL 개에서의 CLN2 유전자 돌연변이는 TPP1 단백질을 비-기능적이 되도록 하였고, TPP1 단백질은 탐지 가능하지 않았다. 질환이 진행됨에 따라, 뇌 조직은 수축되어, 뇌에서의 뇌실 공간이 확대되었다. 신경학적 증상은 균형과 운동 기능의 저하, 시력 상실, 떨림을 포함한다.

병에 걸린 LINCL 강아지들에게 생후 3개월째에 유전자 요법을 제공하였다. 유전자 요법을 위해, AAV2-CLN2를 생성하였고 (WO 2012/135857 참조), 이를 뇌 내의 단일 부위 (측부 뇌실) 또는 2개의 부위 (측부 뇌실 + 대수조)에 주사하였다. 바늘을 상기 뇌실 내에 꽂아두거나 또는 뇌실과 대수조 내에 꽂아두고, 벡터를 수분에 걸쳐 서서히 주입하였다. 세포 내에서 만들어진 많은 양의 TPP1이 그 세포 내에 머물러있긴 하였지만, 그 중 일부가 분비되고 이웃 세포에 의해 흡수되었다. 이러한 분비 및 흡수 경향은 "교차-보정"으로 불리운다 (도 2). 교차-보정은 CLN2 유전자가 LINCL 뇌 내의 전략적으로 위치된 세포로 전이되는 경우에, 이것이 많은 주변 세포의 교차-보정을 허용할 수 있다는 점에서 유전자 요법과 관련하여 매우 중요하다.

본 연구에서, 치료용 벡터를 포괄적으로 전달하는 문제는, 뇌척수막을 구성하고 있는 세포 및 뇌실과 맞대고 있는 세포를 표적화함으로써 뇌 내에서의 CSF 흐름을 이용하였다. AAV2-CLN2를 뇌 내의 단일 부위 (측부 뇌실) 또는 2개의 부위 (측부 뇌실 + 대수조)에 주사하였다. TPP1 발현이 AAV 전달 후 Cln2 ^-/- 개에게서 관찰되었다 (도 3). 유의한 긍정적 영향이 뇌실 용적에 대해 관찰되었다. 자가형광에 대한 AAV.TPP1의 효과를 또한 평가하였다 (도 4a). 도 4b는 처리되지 않은 개와 처리된 개의 T1-MRI 영상을 도시한 것이다. 도 4c는 LINCL 개에서의 AAV.TPP1의 효과를 도시한 것이다. 도 4d는 AAV2/2-huCLN2 투여 후 huTPP1 분포를 도시한 것이다.

처리되지 않은 병에 걸린 개에서는, 뇌실 공간이 정상 개 크기의 10배 정도 확대된 반면, AAV2-CLN2 유전자 요법은 이러한 효과를 유의하게 저하시켰다. 추가로, 효소의 광범위한 분포가 관찰되었는데, 이느 마찬가지로 임상적 이득이었다 (수명 및 임상 검사). 처리하지 않을 경우, 병에 걸린 개는 30주령까지 22가지 모든 시험에서 질환 징후를 나타내었다. 이들은 말기 질환에 도달하므로, 생후 45주와 48주 사이에 안락사시켜야만 한다. AAV2-CLN2 유전자 요법이 제공된 개에서는, 이들 징후 모두의 발병이 지연되거나 방지되었다.

TPP1 활성의 증가는 복합 수조와 뇌실 전달 후 CSF에서 관찰되었다.

따라서, LINCL 개에서는, AAV2-CLN2 유전자 전이로 인해, TPP1 단백질이 뇌의 많은 부위로 보충되었고, 그 결과는 AAV2-CLN2 유전자 전이가 유의한 치료 효과를 제공하였고, 증상을 저하 또는 지연시켰으며, LINCL 개에 대한 삶의 질을 개선시켰다는 것을 표시하였다.

CSF에서의 huTPP1 활성은 주사 직후에 떨어졌다 (도 5). 효소의 광범위한 분포가 관찰되었지만, 유전자-요법 후 6 내지 8개월째의 희생시 그 수준은 낮았다. 활성 저하는 상기 개에서 인간 효소에 대한 면역 반응의 결과인 것으로 추정되었다. 활성 저하를 억제하기 위하여, 항염증제 (미코페놀레이트)를 도입하였다. 그 결과는 이러한 항염증제가 huTPP1의 효소 활성을 억제하지 않았고, 효소 활성이 존재하는 기간을 연장시키는 데 유효하였다는 것을 나타내었으며 (도 6), 지속적인 효소 활성 수준이 관찰되었다.

CSF에서의 높은 caTPP1 활성이 AAV2caCLN2 뇌실내 주사 및 조기 미코페놀레이트 처리 후에 시간을 따라 관찰되었다 (도 7).

TPP1 효소 활성의 증가는 투여 후 2개월째에 많은 조직에서 관찰되었다 (도 8, 9a 및 9b).

도 10은 LINCL 개에서의 임상 징후의 발병을 도시한 것이다. caTPP1 활성이 뇌척수막 및 말초 조직, 예컨대 간에서 관찰되었다 (도 11).

따라서, 본 발명자들은 AAV2/2에 의해 뇌실막 세포를 형질전환시키면, 개의 TPP1 효소가 생성되었고 CSF를 따라 유동하였다는 사실과, caCLN2 주사 이전에 미코페놀레이트로 처리하는 것이 개에게서 면역반응을 방지할 수 있었다는 사실을 밝혀내었다.

실시예 2

비-인간 영장류에서의 연구

상기 언급된 바와 유사한 기술을 이용하여, 본 발명자들은 AAVeGFP가 비인간 영장류 뇌에서의 뇌실막을 형질도입시켰다는 것을 관찰하였다. 레서스 원숭이 뇌에서의 AAV2/2.TPP1 전달의 생체내 평가는 AAV.TPP1을 뇌실 또는 대수조 내로 주사하고, 4 내지 12주 후에 조직을 채취하며, CSF 또는 조직 용해물에서 TPP1 활성을 평가함으로써 수행하였다 (도 12). 비-인간 영장류 내의 전정 신경영역 (뇌간)에서 활성을 관찰하였다 (도 13). 따라서, 뇌실 내면 세포는 광범위한 CNS 분포를 위한 재조합 효소의 공급원을 제공하였다.

모든 공보, 특허 및 특허 출원이 본원에 참조로 포함된다. 전술된 명세서에서 본 발명이 그의 특정의 바람직한 실시양태와 관련하여 기재되었고, 많은 세부 사항이 예시 목적으로 제시되긴 하였지만, 본 발명이 부가의 실시양태에 영향을 받기 쉽고 본원에 기재된 특정의 세부 사항이 본 발명의 기본 원리를 벗어나지 않고서도 상당히 변화될 수 있다는 것이 통상의 기술자에게 명백할 것이다.

본 발명을 설명하는 것과 관련해서 사용된 단수 형태의 용어 및 유사한 언급은 본원에서 달리 표시되지 않거나 또는 문맥상 명백하게 모순되지 않는 한은, 단수 형태와 복수 형태 둘 다를 포괄하는 것으로 간주되어야 한다. 용어 "포함하는", "갖는", "포함한" 및 "함유하는"은 달리 언급되지 않는 한, 제한을 두지 않는 용어 (즉, "포함하지만, 이에 제한되지 않는"을 의미함)로서 간주되어야 한다. 본원에서 수치 범위에 관한 열거는 본원에서 달리 표시되지 않는 한, 상기 범위 내에 속하는 각각의 별개 값을 개별적으로 지칭하는 약칭 방법으로서 단지 제공되기 위한 것이고, 각각의 별개 값은 마치 개별적으로 본원에 열거된 것 처럼 본 명세서 내로 포함된다. 본원에 기재된 모든 방법은 본원에서 달리 표시되지 않거나 또는 문맥상 달리 명백하게 모순되지 않는 한은, 적합한 어떠한 순서로도 수행될 수 있다. 본원에 제공된 모든 예, 또는 예시적 표현 (예를 들어, "예컨대")의 사용은 단지 본 발명을 보다 잘 분명히 보여주기 위한 것이고, 달리 청구되지 않는 한 본 발명의 범위를 제한하지 않는다. 본 명세서 내에서 표현되지 않은 것은 본 발명을 실시하는 데 필수적인 것으로서 모든 비-청구 요소를 표시하는 것으로 간주되어야 한다.

본 발명을 수행하기 위해 본 발명자들에게 공지된 가장 우수한 방식을 포함한 본 발명의 실시양태가 본원에 기재되어 있다. 이들 실시양태의 변화는 전술된 설명의 판독시 통상의 기술자에게 명백할 수 있다. 본 발명자들은 숙련인들이 이러한 변화를 적합하게 이용하기를 기대하며, 본 발명자들은 본원에 구체적으로 기재된 것 이외의 방법으로 본 발명을 실행하고자 한다. 따라서, 본 발명은 적용 가능한 법에 의해 허용되는 바와 같이 본원에 첨부된 청구범위에 열거된 주제의 모든 변형 및 등가물을 포함한다. 더욱이, 본원에서 달리 표시되거나 또는 문맥상 명백하게 달리 모순되지 않는 한은, 가능한 모든 변화의 상술된 요소들의 어떠한 조합도 본 발명에 의해 포괄된다.

SEQUENCE LISTING <110> UNIVERSITY OF IOWA RESEARCH FOUNDATION <120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATING BRAIN DISEASES <130> 17023.139WO1 <140> PCT/US14/47338 <141> 2014-07-20 <150> 61/859,157 <151> 2013-07-26 <160> 8 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 735 <212> PRT <213> Adeno-associated virus <400> 1 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser 1 5 10 15 Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro 20 25 30 Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60 Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80 Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala 85 90 95 Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110 Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro 115 120 125 Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 130 135 140 Pro Val Glu His 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catcgaccag 1320 tacctgtatt acttgagcag aacaaacact ccaagtggaa ccaccacgca gtcaaggctt 1380 cagttttctc aggccggagc gagtgacatt cgggaccagt ctaggaactg gcttcctgga 1440 ccctgttacc gccagcagcg agtatcaaag acatctgcgg ataacaacaa cagtgaatac 1500 tcgtggactg gagctaccaa gtaccacctc aatggcagag actctctggt gaatccgggc 1560 ccggccatgg caagccacaa ggacgatgaa gaaaagtttt ttcctcagag cggggttctc 1620 atctttggga agcaaggctc agagaaaaca aatgtggaca ttgaaaaggt catgattaca 1680 gacgaagagg aaatcaggac aaccaatccc gtggctacgg agcagtatgg ttctgtatct 1740 accaacctcc agagaggcaa cagacaagca gctaccgcag atgtcaacac acaaggcgtt 1800 cttccaggca tggtctggca ggacagagat gtgtaccttc aggggcccat ctgggcaaag 1860 attccacaca cggacggaca ttttcacccc tctcccctca tgggtggatt cggacttaaa 1920 caccctcctc cacagattct catcaagaac accccggtac ctgcgaatcc ttcgaccacc 1980 ttcagtgcgg caaagtttgc ttccttcatc acacagtact ccacgggaca ggtcagcgtg 2040 gagatcgagt gggagctgca gaaggaaaac agcaaacgct ggaatcccga aattcagtac 2100 acttccaact acaacaagtc tgttaatgtg gactttactg tggacactaa 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Pro Ile Pro Trp Val Ser Gly Thr Ser Ala Ser Thr Pro Val 465 470 475 480 Phe Gly Gly Ile Leu Ser Leu Ile Asn Glu His Arg Ile Leu Ser Gly 485 490 495 Arg Pro Pro Leu Gly Phe Leu Asn Pro Arg Leu Tyr Gln Gln His Gly 500 505 510 Ala Gly Leu Phe Asp Val Thr Arg Gly Cys His Glu Ser Cys Leu Asp 515 520 525 Glu Glu Val Glu Gly Gln Gly Phe Cys Ser Gly Pro Gly Trp Asp Pro 530 535 540 Val Thr Gly Trp Gly Thr Pro Asn Phe Pro Ala Leu Leu Lys Thr Leu 545 550 555 560 Leu Asn Pro <210> 6 <211> 3487 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 cgcggaaggg cagaatggga ctccaagcct gcctcctagg gctctttgcc ctcatcctct 60 ctggcaaatg cagttacagc ccggagcccg accagcggag gacgctgccc ccaggctggg 120 tgtccctggg ccgtgcggac cctgaggaag agctgagtct cacctttgcc ctgagacagc 180 agaatgtgga aagactctcg gagctggtgc aggctgtgtc ggatcccagc tctcctcaat 240 acggaaaata cctgacccta gagaatgtgg ctgatctggt gaggccatcc ccactgaccc 300 tccacacggt gcaaaaatgg ctcttggcag ccggagccca gaagtgccat tctgtgatca 360 cacaggactt tctgacttgc tggctgagca tccgacaagc agagctgctg ctccctgggg 420 ctgagtttca tcactatgtg ggaggaccta cggaaaccca tgttgtaagg tccccacatc 480 cctaccagct tccacaggcc ttggcccccc atgtggactt tgtgggggga ctgcaccatt 540 ttcccccaac atcatccctg aggcaacgtc ctgagccgca ggtgacaggg actgtaggcc 600 tgcatctggg ggtaaccccc tctgtgatcc gtaagcgata caacttgacc tcacaagacg 660 tgggctctgg caccagcaat aacagccaag cctgtgccca gttcctggag cagtatttcc 720 atgactcaga cctggctcag ttcatgcgcc tcttcggtgg caactttgca catcaggcat 780 cagtagcccg tgtggttgga caacagggcc ggggccgggc cgggattgag gccagtctag 840 atgtgcagta cctgatgagt gctggtgcca acatctccac ctgggtctac agtagccctg 900 gccggcatga gggacaggag cccttcctgc agtggctcat gctgctcagt aatgagtcag 960 ccctgccaca tgtgcatact gtgagctatg gagatgatga ggactccctc agcagcgcct 1020 acatccagcg ggtcaacact gagctcatga aggctgctgc tcggggtctc accctgctct 1080 tcgcctcagg tgacagtggg gccgggtgtt ggtctgtctc tggaagacac cagttccgcc 1140 ctaccttccc tgcctccagc ccctatgtca ccacagtggg aggcacatcc ttccaggaac 1200 ctttcctcat cacaaatgaa attgttgact atatcagtgg tggtggcttc agcaatgtgt 1260 tcccacggcc ttcataccag gaggaagctg taacgaagtt cctgagctct agcccccacc 1320 tgccaccatc cagttacttc aatgccagtg gccgtgccta cccagatgtg gctgcacttt 1380 ctgatggcta ctgggtggtc agcaacagag tgcccattcc atgggtgtcc ggaacctcgg 1440 cctctactcc agtgtttggg gggatcctat ccttgatcaa tgagcacagg atccttagtg 1500 gccgcccccc tcttggcttt ctcaacccaa ggctctacca gcagcatggg gcaggactct 1560 ttgatgtaac ccgtggctgc catgagtcct gtctggatga agaggtagag ggccagggtt 1620 tctgctctgg tcctggctgg gatcctgtaa caggctgggg aacacccaac ttcccagctt 1680 tgctgaagac tctactcaac ccctgaccct ttcctatcag gagagatggc ttgtcccctg 1740 ccctgaagct ggcagttcag tcccttattc tgccctgttg gaagccctgc tgaaccctca 1800 actattgact gctgcagaca gcttatctcc ctaaccctga aatgctgtga gcttgacttg 1860 actcccaacc ctaccatgct ccatcatact caggtctccc tactcctgcc ttagattcct 1920 caataagatg ctgtaactag cattttttga atgcctctcc ctccgcatct catctttctc 1980 ttttcaatca ggcttttcca aagggttgta tacagactct gtgcactatt tcacttgata 2040 ttcattcccc aattcactgc aaggagacct ctactgtcac cgtttactct ttcctaccct 2100 gacatccaga aacaatggcc tccagtgcat acttctcaat ctttgcttta tggcctttcc 2160 atcatagttg cccactccct ctccttactt agcttccagg tcttaacttc tctgactact 2220 cttgtcttcc tctctcatca atttctgctt cttcatggaa tgctgacctt cattgctcca 2280 tttgtagatt tttgctcttc tcagtttact cattgtcccc tggaacaaat cactgacatc 2340 tacaaccatt accatctcac taaataagac tttctatcca ataatgattg atacctcaaa 2400 tgtaagatgc gtgatactca acatttcatc gtccaccttc ccaaccccaa acaattccat 2460 ctcgtttctt cttggtaaat gatgctatgc tttttccaac caagccagaa acctgtgtca 2520 tcttttcacc ccaccttcaa tcaacaagtc ctcaatcaac aagtcctact gactgcacat 2580 cttaaatata tctttatcag tccacaagtc cttccaatta tatttcccaa gtatatctag 2640 aacttatcca cttatatccc cactgctact accttagttt agggctatat tctcttgaaa 2700 aaaagtgtcc ttacttcctg ccaatcccca agtcatcttc cagagtaaaa tgcaaatccc 2760 atcaggccac ttggatgaaa acccttcaag gattactgga tagaattcag gctttcccct 2820 ccagccccca atcatagctc acaaaccttc cttgctattt gttcttaagt aaaaaatcat 2880 ttttcctcct ccctccccaa accccaagga actctcactc ttgctcaagc tgttccgtcc 2940 ccttaccacc cctgatacaa ctgccaggtt aatttccaga attcttgcaa gactcagttc 3000 agaagtcacc ttctttcgtg aatgttttga ttccctgagg ctactttatt ttggtatggc 3060 tgaaaaatcc tagattttct aaacaaaacc tgtttgaatc ttggttctga tatggactag 3120 gagagagact gggtcaagta agcttatctc cctgaggctg tttcctcgtc tgttaagtgt 3180 gaatatcaat acctgccttt cataatcacc agggaataaa gtggaataat gttgataaca 3240 gtgcttggca cctggaagta ggtggcagat gttaacgccc ttcctccctt gcactgcgcc 3300 ccctgtgcct acctctagca ttgtaacgac cacatagtat tgaaatggcc agtttacttg 3360 tctgccttcc tttccaagac cgttggtgcc tagaggacta gaatcgtgtc ctatttaact 3420 ttgtgttccc aggtcctagc tcaggagttg gcaaataaga attaaatgtc tgctacaccg 3480 aaacaaa 3487 <210> 7 <211> 152 <212> PRT <213> Macaca mulatta <400> 7 Gln Ala Gly Phe Ala Thr Ala Asp His Ser Ser Gln Glu Thr Glu Thr 1 5 10 15 Glu Lys Ala Met Asp Arg Leu Ala Arg Gly Ala Gln Ser Val Pro Asn 20 25 30 Asp Ser Pro Ala Gln Gly Glu Gly Thr His Ser Glu Glu Glu Gly Phe 35 40 45 Ala Met Asp Glu Glu Asp Ser Asp Gly Glu Leu Asn Thr Trp Glu Leu 50 55 60 Ser Glu Gly Thr Asn Cys Pro Pro Lys Glu Gln Pro Gly Asp Ile Phe 65 70 75 80 Asn Glu Asp Trp Asp Leu Glu Leu Lys Ala Asp Gln Gly Asn Pro Tyr 85 90 95 Asp Ala Asp Asp Ile Gln Glu Ser Ile Ser Gln Glu Leu Lys Pro Trp 100 105 110 Val Cys Cys Ala Pro Gln Gly Asp Met Ile Tyr Asp Pro Ser Trp His 115 120 125 His Pro Pro Pro Leu Ile Pro His Tyr Ser Lys Met Val Phe Glu Thr 130 135 140 Gly Gln Phe Asp Asp Ala Glu Asp 145 150 <210> 8 <211> 152 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <400> 8 Gln Ala Gly Phe Ala Thr Ala Asp His Ser Ser Gln Glu Arg Glu Thr 1 5 10 15 Glu Lys Ala Met Asp Arg Leu Ala Arg Gly Ala Gln Ser Val Pro Asn 20 25 30 Asp Ser Pro Ala Arg Gly Glu Gly Thr His Ser Glu Glu Glu Gly Phe 35 40 45 Ala Met Asp Glu Glu Asp Ser Asp Gly Glu Leu Asn Thr Trp Glu Leu 50 55 60 Ser Glu Gly Thr Asn Cys Pro Pro Lys Glu Gln Pro Gly Asp Ile Phe 65 70 75 80 Asn Glu Asp Trp Asp Leu Glu Leu Lys Ala Asp Gln Gly Asn Pro Tyr 85 90 95 Asp Ala Asp Asp Ile Gln Glu Ser Ile Ser Gln Glu Leu Lys Pro Trp 100 105 110 Val Cys Cys Ala Pro Gln Gly Asp Met Ile Tyr Asp Pro Ser Trp His 115 120 125 His Pro Pro Pro Leu Ile Pro His Tyr Ser Lys Met Val Phe Glu Thr 130 135 140 Gly Gln Phe Asp Asp Ala Glu Asp 145 150

Claims (37)

1. 한 쌍의 AAV 역전된 말단 반복부 사이에 삽입된 치료제를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터와 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 입자를 포함하는, 치료제를 포유류의 중추 신경계에 전달하기 위한 조성물로서, 여기서 상기 조성물은 포유류의 뇌척수액 (CSF)과 접촉하는 세포를 감염시키기에 유효한 방식으로 포유류의 대수조, 뇌실, 지주막하 공간 또는 척추강내 공간에 투여되고 이로써 상기 세포가 포유류에서 치료제를 발현하고, 상기 포유류는 또한 면역억제제를 투여받았고, 상기 치료제는 트리펩티딜 펩티다제 1 (TPP1)이며, 상기 포유류는 영장류이고, 상기 rAAV 입자는 rAAV2 입자이고, 상기 면역억제제는 항염증제이고, 상기 세포는 뇌실막 세포인 조성물.
2. 한 쌍의 AAV 역전된 말단 반복부 사이에 삽입된 치료제를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터와 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 입자를 포함하는, 포유류에서 질환을 치료하기 위한 조성물로서, 여기서 상기 조성물은 포유류의 뇌척수액 (CSF)과 접촉하는 세포를 감염시키기에 유효한 방식으로 포유류의 대수조, 뇌실, 지주막하 공간 또는 척추강내 공간에 투여되고, 상기 세포는 질환을 치료하도록 치료제를 발현하고, 상기 포유류는 또한 면역억제제를 투여받았고, 상기 치료제는 치료용 핵산 또는 단백질이며, 상기 질환은 LINCL이고, 상기 치료제는 TPP1 또는 CLN2이고, 상기 포유류는 영장류이고, 상기 rAAV 입자는 rAAV2 입자이고, 상기 면역억제제는 항염증제이고, 상기 세포는 뇌실막 세포인 조성물.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 세포가 치료제를 발현하고, 치료제를 CSF 내로 분비하는 것인 조성물.
4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 영장류가 인간인 조성물.
5. 제1항 또는 제2항에 있어서, rAAV 입자가 뇌 내의 1개 내지 4개의 위치에 주사되는 것인 조성물.
6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 면역억제제가 rAAV 입자 이전에 또는 rAAV 입자와 함께 투여되는 것인 조성물.
7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 치료제를 포함하는 rAAV 입자가 포유류의 대수조에 단일 용량으로 투여되는 것인 조성물.
8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항염증제가 미코페놀레이트인 조성물.
9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 포유류의 대수조에 투여되는 조성물.
10. 제1항 또는 제2항에 있어서, 포유류의 뇌실에 투여되는 조성물.
11. 제1항 또는 제2항에 있어서, 포유류의 지주막하 공간에 투여되는 조성물.
12. 제1항 또는 제2항에 있어서, 포유류의 척추강내 공간에 투여되는 조성물.
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