CN105764532A - 治疗脑疾病的方法和组合物 - Google Patents

Abstract

本公开内容提供治疗疾病或传递治疗剂至哺乳动物的方法，其包括给予哺乳动物的枕大池和/或脑室含有载体的rAAV颗粒，所述载体包含插入在一对AAV反向末端重复序列之间的编码治疗性蛋白的核酸，给予的方式使得进入脑脊液(CSF)的细胞表达所述治疗剂并在某些实施方案中分泌所述治疗剂进入CSF以分布到脑中。

Description

治疗脑疾病的方法和组合物

相关申请

本申请要求2013年7月26日提交的美国临时专利申请号61/859,157的优先权，其全文通过引用结合到本文中。

背景

基因转移现在被广泛认为是一种在细胞和分子水平上分析生物学事件和疾病过程的强有力的工具。最近，应用基因疗法治疗人类疾病，无论是遗传的(如，ADA缺乏)或后天获得的(如，癌症或感染性疾病)，已受到相当的关注。随着改进的基因转移技术的出现和不断扩大的有缺陷的基因相关疾病库的鉴定，基因疗法已从治疗理论快速地发展到实践现实。

传统上，基因疗法已被定义为一个程序，其中外源基因被引入患者的细胞，以纠正先天遗传错误。虽然超过4500种人类疾病目前被归类为遗传的，但仅确定了相对较少的这些疾病的人类基因组中的特定突变。直到最近，这些罕见的遗传性疾病代表基因治疗努力的唯一目标。因此，到目前为止，大多数NIH批准的基因疗法方案已涉及将缺陷基因的功能拷贝引入具有已知先天遗传错误的个体的体细胞。仅仅在最近，研究者和临床医师已开始意识到，大多数人类癌症、某些形式的心血管疾病和许多退行性疾病也具有重要的遗传成分，并且为了设计新基因疗法的目的，应该被认为是“遗传性病症”。因此，基因疗法最近已被广泛地定义为通过将新的遗传信息引入受影响的生物体而纠正疾病表型。

在体内基因疗法中，转移的基因被原位(即在受体内)引入受体生物的细胞。体内基因疗法已在几种动物模型中进行了检查。几种最近的出版物已报道直接原位基因转移至器官和组织例如肌肉、造血干细胞、动脉壁、神经系统和肺的可行性。也有报道DNA直接注入骨骼肌、心肌和将DNA-脂质复合物注入脉管系统，体内产生插入基因产品的可检测的表达水平。

治疗中枢神经系统疾病，如脑的先天性遗传疾病，仍然是一个棘手的问题。这样的例子是溶酶体贮积病和阿尔茨海默氏病。总的来说，溶酶体贮积病(LSD)的发病率在世界范围是每10,000出生婴儿中有1例，和在65%的病例中，有显著的中枢神经系统(CNS)受累。这些病症中缺乏的蛋白，当静脉递药时，不穿过血脑屏障，或当直接传递给脑时，不能广泛分布。因此，需要开发用于CNS缺陷的疗法。

简述

本发明提供一种传递治疗剂(如，蛋白或核酸)至哺乳动物的中枢神经系统的方法，其包括以有效感染细胞的方式给予哺乳动物的枕大池包含AAV衣壳蛋白和载体的rAAV颗粒，所述载体包含插入在一对AAV反向末端重复序列之间的编码治疗剂的核酸，所述细胞与哺乳动物的脑脊液(CSF)接触，以致细胞在哺乳动物中表达治疗剂。

本发明提供一种治疗哺乳动物的疾病的方法，其包括以有效感染细胞的方式给予哺乳动物的枕大池包含AAV衣壳蛋白和载体的rAAV颗粒，所述载体包含插入在一对AAV反向末端重复序列之间的编码治疗剂的核酸(如，治疗性核酸或核酸编码蛋白质)，所述细胞与哺乳动物的脑脊液(CSF)接触，其中细胞表达治疗剂以治疗疾病。

在某些实施方案中，AAV颗粒是rAAV2颗粒。如本文所用的，术语AAV2/1被用来指AAV2ITR和AAV1衣壳，术语AAV2/2是AAV2ITR和AAV2衣壳，术语AAV2/4是AAV2ITR和AAV4衣壳等。在某些实施方案中，AAV颗粒是rAAV8颗粒。在某些实施方案中，AAV颗粒是rAAV9颗粒。在某些实施方案中，AAV颗粒是rAAVrh10颗粒。在某些实施方案中，rAAV衣壳与AAV2衣壳蛋白VP1、VP2和/或VP3具有至少80%的同源性。在某些实施方案中，rAAV2衣壳与AAV2衣壳VP1、VP2和/或VP3具有100%的同源性。在某些实施方案中，rAAV衣壳与AAV4衣壳蛋白VP1、VP2和/或VP3具有至少80%的同源性。在某些实施方案中，rAAV4衣壳与AAV4衣壳VP1、VP2和/或VP3具有100%的同源性。在某些实施方案中，rAAV衣壳与AAV9衣壳蛋白VP1、VP2和/或VP3具有至少80%的同源性。在某些实施方案中，rAAV9衣壳与AAV9衣壳VP1、VP2和/或VP3具有100%的同源性。

在某些实施方案中，rAAV颗粒是以比AAV4的感染率超过20%的比率，例如以比AAV4的感染率超过50%或100%、1000%或2000%的比率感染非-啮齿室管膜细胞的rAAV2颗粒。

在某些实施方案中，细胞表达治疗剂并分泌治疗剂进入CSF。在某些实施方案中，细胞是室管膜、软脑膜、内皮或脑膜细胞。在某些实施方案中，所述方法还包括另外给予rAAV至非人灵长类动物的脑室、蛛网膜下腔和/或鞘内空间。

本发明提供一种传递核酸至哺乳动物的脑细胞的方法，其包括给予脑细胞含有载体的AAV颗粒，所述载体包含插入在一对AAV反向末端重复序列之间的核酸，从而传递核酸至脑细胞。在某些实施方案中，rAAV是以比AAV4的感染率超过20%的比率，例如以比AAV4的感染率超过50%或100%、1000%或2000%的比率感染脑细胞的rAAV2颗粒。

在某些实施方案中，疾病是溶酶体贮积病(LSD)。在某些实施方案中，LSD是婴儿或晚期婴儿型蜡样色素脂褐质沉积症、神经病性戈谢病、青少年巴藤病(JuvenileBatten)、法布里病、MLD、山菲立普综合征A、亨特综合征(Hunter)、克拉伯病(Krabbe)、莫尔基奥病(Morquio)、庞帕病(Pompe)、C型尼曼-匹克病、家族黑蒙性痴呆(Tay-Sachs)、赫尔勒病(Hurler)(MPS-IH)、山菲立普综合征B、马-拉综合征(Maroteaux-Lamy)、A型尼曼-匹克病(Niemann-PickA)、胱氨酸过多症(Cystinosis)、赫尔勒-沙伊病(Hurler-Scheie)(MPS-IH/S)、Sly综合征(MPSVII)、沙伊病(Scheie)(MPS-IS)、婴儿巴藤病、GM1神经节苷脂贮积症、II/III型粘脂糖症或桑德霍夫病。在某些实施方案中，疾病是LINCL。在某些实施方案中，疾病是神经变性疾病，例如阿尔茨海默氏病、亨廷顿氏病、ALS、遗传性痉挛性偏瘫、原发性侧索硬化、脊髓性肌萎缩症、肯尼迪氏病、多谷氨酰胺重复病或帕金森氏病。

在某些实施方案中，哺乳动物是非-啮齿哺乳动物，例如灵长类动物、马、绵羊、山羊、猪或狗。在某些实施方案中，灵长类动物是人。

在某些实施方案中，治疗剂是治疗性核酸。在某些实施方案中，治疗剂是蛋白质。

在某些实施方案中，核酸编码溶酶体水解酶。在某些实施方案中，核酸编码TPP1。

在某些实施方案中，治疗性蛋白是一种保护性ApoE同工型蛋白。如本文所用的，术语“保护性ApoE同工型”被用来区分降低阿尔茨海默氏病的风险至少5%，例如10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%或更多的ApoE同工型。

在某些实施方案中，保护性ApoE同工型具有与ApoEε2至少约80%的同源性。在某些实施方案中，保护性ApoE同工型与ApoEε2具有100%的同源性。

在某些实施方案中，rAAV颗粒在脑的1-3个位置，例如在脑的1、2或3个位置被注入。

附图简述

图1A是AAV2(SEQIDNO:1)和AAV4(SEQIDNO:2)蛋白的比对，图1B是基于来自AAV2(NC_001401)和AAV4(NC_001829)的序列的AAV2(SEQIDNO:3)和AAV4(SEQIDNO:4)核苷酸的比对。

图2显示细胞之间“交叉纠正”的图示说明。Sands和Davidson,MolTher13(5):839-849,2006。

图3.上图：在AAV2介导的传递进入在犬科动物TPP1缺乏的LINCL狗模型后，人TPP1的免疫组织化学染色。左方，经治疗的狗。右方，未治疗的缺陷动物。比较在左方的强阳性染色与右小图的背景染色。底部，用于显示在经治疗的、缺陷(LINCL)狗中人TPP1存在的TPP1的蛋白质印迹法。正常和缺陷狗二者不显示条带的存在，因为它们不表达人TPP1。

图4A.显微图像显示描述神经元蜡样色素脂褐质沉积症中脂褐素病理性积聚的代表性自体荧光。左小图，在AAV2.TPP1治疗的LINCL狗中的自体荧光。右小图，在对照的未治疗的LINCL狗中的自体荧光。注意经治疗的自体荧光减少。

图4B.未治疗的LINCL狗(左上图)，未治疗的正常狗(右上图)，和两只AAV.TPP1治疗的狗(下小图)的MRI扫描。传递的载体的量在底部小图的左下方指明。病毒滴度为大约1e13基因组/mL。

图4C.4B中成像的狗的脑室的容积重建(左小图)。在右小图中的图像表示来自左小图中的图像的容积。注意：即使这些低剂量的载体也大幅度减少脑室容积(在图4B图例中所述)。

图4D.在不同脑区中的免疫组织化学染色显示在AAV.TPP1基因转移至LINCL狗的脑室系统后TPP1蛋白的广泛分布。上部小图是狗脑图谱的冠状切片；右下插图呈现冠状图像的矢状面视图。来自图谱的小图下面的免疫组织化学染色的切片显示来自那些区域的切片的染色程度。数据一起显示酶的广泛分布。

图5.AAV.TPP1传递后，在CSF中的huTPP1酶活性在病毒基因转移后不久即下降。左小图：在治疗的动物Co和S的CSF中的TPP1活性在AAV.TPP1基因转移后很快超过正常活性水平，然后快速地下降至不能检测的水平。动物N、Po和Pi是正常的或杂合狗并显示仅供参考的临床上正常狗中TPP1活性水平的范围。

图6显示用麦考酚酯预-治疗对提供持续活性的结果。

图7.在酶活性下降时，或在基因转移之前，引入麦考酚酯极大地改进了在AAV.TPP1传递至室管膜后TPP1在狗中表达的持久性。左和右上图：作为时间函数的酶活性。也指明麦考酚酯给予的时间。注意从动物SR和B中的表达丧失而恢复后的高和持续水平，和在动物F中的极其高的持续水平。因此，在对重组蛋白归零的动物中麦考酚酯预-治疗有助于提供在转导的脑细胞中的持续基因表达。下图：从右上图扩展，表明存在在背景水平和背景水平以上的酶，并接近正常水平或在正常水平以上(0.1-0.4pmol/mg)。

图8.在CSF中的持续酶表达升高酶的间质水平。在各个脑区域的酶活性是在正常以上。

图9A和9B.在AAV.TPP1基因转移至LINCL狗的脑室系统后，在不同的脑区域的免疫组织化学染色显示TPP1蛋白的广泛分布。来自狗脑图谱的代表性小图显示待评价的脑区，其也通过划线指示。数据一起显示酶的广泛分布。

图10AAV.TPP1基因疗法延迟疾病表型的发生(左方的第一红线对比左方的第一蓝线的表现)和疾病的进展(红线间距对比蓝线间距)。动物寿命在一些狗中几乎翻了一番，其它仍在评估中。

图11具有从室管膜持续分泌TPP1的动物显示外周器官和脑硬膜中的酶活性的证据。对于两个动物，BG和SR，在脑硬膜并且还在肝中存在着显著的酶活性。

图12用来提供临床益处给LINCL狗的途径可转译至灵长类动物。对恒河猴经脑室内注射给予AAV2.TPP1(1.5mL的1e13载体基因组/mL)并在基因转移后3个月测量脑干(髓质；左图)和CSF(右图)中的TPP1活性。存在具有正常水平的TPP1活性的正常猴(注明的范围–对照)。几乎只有一只动物，酶活性超过正常猴的酶活性。采用对从AAV载体表达的重组人TPP1的免疫组织化学染色证明在基因转移后3个月猴脑的TPP1活性。

图13显示非-人灵长类动物的前庭区(脑干)。

图14提供人TPP1氨基酸序列。

图15提供人TPP1核酸序列。

图16提供猕猴TPP1氨基酸序列。

图17提供食蟹猴TPP1氨基酸序列。

详细描述

腺相关病毒(AAV)是一种微小病毒科的小的非致病性病毒。AAV通过其对复制的辅助病毒的依赖，与这个科的其它成员区分开。在缺乏辅助病毒时，AAV可以位点特异性方式整合进入19号染色体的q臂中。AAV的大约5kb基因组由具有加极性或减极性的一段单链DNA组成。基因组的末端是短的反向末端重复序列，其可折叠成发夹结构并用作病毒DNA复制的起点。物理上，微小病毒病毒体是非-包膜的且其二十面体(icosohedral)衣壳直径为大约20nm。

到目前为止，许多血清学不同的AAV已被鉴定，且超过十几个AAV已从人或灵长类动物分离。AAV2的基因组的长度为4680个核苷酸并含有两个可读框(ORF)。左ORF编码非-结构Rep蛋白Rep40、Rep52、Rep68和Rep78，其除了单链子代基因组的生产外，还参与复制和转录的调节。而且，两个Rep蛋白已与AAV基因组优先整合进人染色体19的q臂区有关。Rep68/78也已显示具有NTP结合活性以及DNA和RNA解旋酶活性。Rep蛋白具有核定位信号，以及几个潜在的磷酸化位点。这些激酶位点之一的突变导致复制活性的丧失。

基因组的末端是短的反向末端重复序列(ITR)，其具有折叠成用作病毒DNA复制起点的T-形发夹结构的潜力。在ITR区域内，已描述了对ITR的功能是重要的两个元件，GAGC重复基序和末端解离位点(trs)。当ITR以线性构型或者发夹构型存在时，重复基序已显示结合Rep。这种结合起着定位Rep68/78的作用，用于以位点-和链-特异性方式发生在末端解离位点(trs)裂解。这两个元件，除了其在复制中的作用外，似乎对病毒整合也是重要的。与trs邻近的Rep结合位点被包含在染色体19整合位点内。这些元件已显示对于位点特异性整合是功能性的和必要的。

AAV病毒体是非-包膜的、直径大约25nm的二十面体颗粒，由3个称为VP1、VP2和VP3的相关蛋白组成。右ORF编码衣壳蛋白VP1、VP2和VP3。这些蛋白分别以1:1:10的比例存在并均衍生自右手ORF。衣壳蛋白通过使用选择性剪接和不寻常的起始密码子而彼此不同。缺失分析已显示，从选择性剪接信息翻译的VP1的除去或修改导致感染性颗粒的产生减少。VP3编码区域内的突变导致不能产生任何单链子代DNA或感染性颗粒。AAV颗粒是包含AAV衣壳蛋白的病毒颗粒。AAV衣壳多肽可编码完整的VP1、VP2和VP3多肽。所述颗粒可以是包含AAV2和其它AAV衣壳蛋白(即，嵌合蛋白，例如AAV4和AAV2)的颗粒。本文涵盖AAV2衣壳蛋白的氨基酸序列的变化，只要生成的病毒颗粒包含在抗原性或免疫性方面不同于AAV4的AAV2衣壳残体，如可按标准方法常规确定的。具体地，例如，ELISA和蛋白质印迹法可被用来确定病毒颗粒是否在抗原性或免疫性方面不同于AAV4。而且，AAV2病毒颗粒优选地保留不同于AAV4的组织向性。

AAV2颗粒是包含AAV2衣壳蛋白的病毒颗粒。编码完整的VP1、VP2和VP3多肽的AAV2衣壳多肽总体上可具有与具有由在SEQIDNO:1中提出的核苷酸编码的氨基酸序列的多肽(AAV2衣壳蛋白)至少约63%的同源性(或同一性)。衣壳蛋白可具有与SEQIDNO:1中提出的蛋白约70%的同源性、约75%的同源性、80%的同源性、85%的同源性、90%的同源性、95%的同源性、98%的同源性、99%的同源性，或甚至100%的同源性。衣壳蛋白可具有与SEQIDNO:1中提出的蛋白约70%的同一性、约75%的同一性、80%的同一性、85%的同一性、90%的同一性、95%的同一性、98%的同一性、99%的同一性，或甚至100%的同一性。颗粒可以是包含另一种AAV和AAV2衣壳蛋白，即嵌合蛋白的颗粒。本文涵盖AAV2衣壳蛋白的氨基酸序列中的变化，只要生成的病毒颗粒包含在抗原性或免疫性方面不同于AAV4的AAV2衣壳残体，如可按标准方法常规确定的。具体地，例如，ELISA和蛋白质印迹法可被用来确定病毒颗粒是否在抗原性或免疫性方面不同于AAV4。而且，AAV2病毒颗粒优选地保留与AAV4区分的组织向性，例如在本文实施例中所举例说明的，虽然包含至少一种AAV2外壳蛋白的AAV2嵌合颗粒可具有与仅由AAV2外壳蛋白组成的AAV2颗粒的组织向性不同的组织向性。

如图1A和1B中所指明的，AAV2衣壳序列和AAV4衣壳序列是约60%同源的。在某些实施方案中，AAV2衣壳包含与在SEQIDNO:1中提出的氨基酸序列至少65%同源的序列(或由所述序列组成)。

在某些实施方案中，本发明还提供含有(即包壳)包含一对AAV2反向末端重复序列的载体的AAV2颗粒。AAV2ITR的核苷酸序列是本领域已知的。而且，所述颗粒可以是包含AAV4和AAV2衣壳蛋白二者，即嵌合蛋白的颗粒。此外，所述颗粒可以是包含一对来自其它AAV(如，AAV1-AAV9和AAVrh10)的AAV反向末端重复序列的载体包壳化的颗粒。包壳在颗粒中的载体还可包含插入在反向末端重复序列之间的外源性核酸。

AAV的以下特征已经使它成为一个有吸引力的供基因转移的载体。AAV载体已显示在体外能稳定地整合到细胞基因组中；具有广泛的宿主范围；在体外和体内转导分裂细胞和非分裂细胞两者，并维持转导基因的高水平表达。病毒颗粒是热稳定的，耐溶剂、去垢剂、pH的变化、温度，并可在CsCl梯度液中或通过其它手段浓缩。本发明提供给予AAV颗粒、重组AAV载体和重组AAV病毒体的方法。例如，AAV2颗粒是包含AAV2衣壳蛋白的病毒颗粒，或AAV4颗粒是包含AAV4衣壳蛋白的病毒颗粒。重组AAV2载体是包含至少一种独特的AAV2核酸的核酸构建体。重组AAV2病毒体是含有重组AAV2载体的颗粒。在术语"AAV2ITR"内要考虑的是，核苷酸序列必须保留一种或两种在此描述的区分AAV2ITR与AAV4ITR的特征：(1)3个(而不是如在AAV4中的4个)"GAGC"重复序列和(2)在AAV2ITRRep结合位点中，在头两个"GAGC"重复序列中的第四核苷酸是C而不是T。

驱动编码要传递的另一种药物的蛋白或序列表达的启动子可以是任何所需启动子，通过已知的考虑，例如与启动子和其中使用载体的细胞类型功能相关的核酸的表达水平来选择。启动子可以是外源性或内源性启动子。启动子可包括，例如，已知的强启动子例如SV40或诱导型金属硫蛋白启动子，或AAV启动子，例如AAVp5启动子。启动子的另外的实例包括源自肌动蛋白基因、免疫球蛋白基因、细胞巨化病毒(CMV)、腺病毒、牛乳头状瘤病毒、腺病毒启动子的启动子，例如腺病毒主要晚期启动子、诱导型热休克启动子、呼吸道合胞病毒、Rous肉瘤病毒(RSV)等。

AAV载体还可包含功能性地连接于启动子的外源性(异源性)核酸。所谓"异源性核酸"意指任何异源性或外源性核酸可被插入到载体中，用于转移进入细胞、组织或有机体。核酸可例如编码多肽或蛋白或反义RNA。所谓"功能性地连接的"意指启动子可促进异源性核酸的表达，如同本领域已知的，例如相对于异源性核酸的启动子的适当取向。而且，异源性核酸优选地具有表达核酸的所有适当的序列，如本领域已知的，以功能性地编码，即允许核酸被表达。核酸可包括，例如，表达控制序列，例如增强子，和必要的信息处理位点，例如核糖体结合位点、RNA剪接位点、多聚腺苷酸化位点，和转录终止序列。核酸可编码超过一个基因产物，仅受可被包装的核酸大小的限制。

异源性核酸可编码替代载体要转移进入的受试者所需的缺失或有缺陷蛋白的有益蛋白，或可编码可例如导向癌细胞或其死亡将有益于受试者的其它细胞的细胞毒性多肽。异源性核酸也可编码反义RNA，其可结合于由受试者制备的编码有害蛋白的mRNA，从而使之失活。在一个实施方案中，反义多核苷酸可从AAV病毒构建体中的异源性表达盒产生，其中表达盒含有促进细胞-类型特异性表达的序列。

可作为本发明AAV载体的一部分给予细胞或受试者的异源性核酸的实例可包括但不限于编码治疗剂的核酸，所述治疗剂例如溶酶体水解酶；肿瘤坏死因子(TNF)，例如TNF-α；干扰素，例如干扰素-α、干扰素-β和干扰素-γ；白介素，例如IL-1、IL-1β和ILs-2至-14；GM-CSF；腺苷脱氨酶；分泌因子例如生长因子；离子通道；化疗剂；溶酶体蛋白；抗凋亡基因产品；促进神经生存的蛋白如谷氨酸受体和生长因子；细胞生长因子，例如淋巴因子；可溶性CD4；因子VIII；因子IX；T-细胞受体；LDL受体；ApoE；ApoC；α-1抗胰蛋白酶；鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)；囊性纤维化跨膜受体(CFTR)；胰岛素；用于抗体，例如免疫球蛋白的抗原结合域的Fc受体；和抑制病毒复制的反义序列，例如抑制乙型肝炎或非-甲、非-乙型肝炎病毒复制的反义序列。而且，核酸可编码一个以上的基因产品，仅受可被包装的核酸大小的限制。

AAV2颗粒是包含AAV2衣壳蛋白的病毒颗粒。本文涵盖AAV2衣壳蛋白的氨基酸序列的变化，只要生成的病毒颗粒包含在抗原性或免疫性方面不同于AAV4的AAV2衣壳残体，如可按标准方法常规确定的。具体地，例如，ELISA和蛋白质印迹法可被用来确定病毒颗粒是否在抗原性或免疫性方面不同于其它AAV血清型。

如本文所用的术语"多肽"指氨基酸的聚合物并包括全长蛋白及其片段。因此，"蛋白"和“多肽"在本文通常可互换使用。可通过已知的中间参数选择取代。如将为本领域技术人员理解的，本发明也包括在氨基酸序列或其它特性方面有稍微变化的那些多肽。这样的变化可能会作为等位基因变异自然产生(例如由于遗传多态性)或可能由人为干预产生(如，通过克隆的DNA序列的诱变)，例如诱导的点、缺失、插入和取代突变体。氨基酸序列的细微变化通常是优选的，例如保守的氨基酸替代、小的内部缺失或插入，和分子末端的添加或缺失。这些修饰可导致氨基酸序列的变化，提供沉默突变，修饰限制位点，或提供其它特异性突变。

本方法提供一种传递核酸至细胞的方法，其包括给予细胞含有载体的AAV颗粒，所述载体包含插入在一对AAV反向末端重复序列之间的核酸，从而传递核酸至细胞。给予至细胞可通过任何手段，包括简单地使任选地包含在所需液体例如组织培养基，或缓冲盐水溶液中的颗粒与细胞接触来实现。颗粒可被允许保持与细胞接触任何所需时间长度，通常颗粒被给予并允许无限期地保持。为了这样的体外方法，病毒可通过如本领域已知的和如本文所例举的标准病毒转导方法给予细胞。要给予的病毒的滴度可以变化，特别是取决于细胞类型，但一般来说是用于AAV转导的细胞类型所特有的。另外可使用用来转导本文实施例的特定细胞的滴度。细胞可包括人以及其它大型(非-啮齿动物)哺乳动物，例如灵长类动物、马、绵羊、山羊、猪和狗的任何所需细胞。

更特别地，本发明提供一种传递核酸至与循环的CSF接触的细胞，例如室管膜细胞、软脑膜细胞、脑膜细胞、脑内皮细胞的方法，其包括给予细胞含有载体的AAV颗粒，所述载体包含插入在一对AAV反向末端重复序列之间的核酸，从而传递核酸至细胞。

本发明还提供一种传递核酸至受试者的细胞的方法，其包括给予受试者包含插入在一对AAV反向末端重复序列之间的核酸的AAV颗粒，从而传递核酸至受试者的细胞。

还提供一种传递核酸至受试者的室管膜、软脑膜或其它脑膜细胞的方法，其包括给予受试者包含插入在一对AAV反向末端重复序列之间的核酸的AAV颗粒，从而传递核酸至受试者的室管膜、软脑膜或其它脑膜细胞。

在某些实施方案中，靶向脑血管内皮的氨基酸序列靶向患有疾病，如溶酶体贮积病的受试者的脑血管内皮。

在某些实施方案中，靶向脑血管内皮的氨基酸序列靶向未罹患溶酶体贮积病的受试者的脑血管内皮。.

在某些实施方案中，病毒载体包含编码治疗剂的核酸序列。在某些实施方案中，治疗剂是TPP1。

本公开内容的某些实施方案提供包含如本文描述的病毒载体的细胞。

本公开内容的某些实施方案提供一种治疗哺乳动物的疾病的方法，其包括给予哺乳动物如本文描述的病毒载体或细胞。

在某些实施方案中，哺乳动物是人。

在某些实施方案中，疾病是溶酶体贮积病(LSD)。在某些实施方案中，LSD是婴儿或晚期婴儿型蜡样色素脂褐质沉积症、戈谢病、青少年巴藤病、法布里病、MLD、山菲立普综合征A、晚期婴儿巴藤病、亨特综合征、克拉伯病、莫尔基奥病、庞帕病、C型尼曼-匹克病、家族黑蒙性痴呆、赫尔勒病(MPS-IH)、山菲立普综合征B、马-拉综合征、A型尼曼-匹克病、胱氨酸过多症、赫尔勒-沙伊病(MPS-IH/S)、Sly综合征(MPSVII)、沙伊病(MPS-IS)、青少年巴藤病、GM1神经节苷脂贮积症、II/III型粘脂糖症或桑德霍夫病。

在某些实施方案中，疾病是神经变性疾病。在某些实施方案中，神经变性疾病是阿尔茨海默氏病、亨廷顿氏病、ALS、遗传性痉挛性偏瘫、原发性侧索硬化、脊髓性肌萎缩症、肯尼迪氏病、多谷氨酰胺重复病或帕金森氏病。

本公开内容的某些实施方案提供一种传递药物至受试者的中枢神经系统的方法，其包括给予CSF本文描述的病毒载体，以致转导的室管膜、软脑膜、内皮和/或其它脑膜细胞表达治疗剂并传递所述治疗剂至受试者的中枢神经系统。在某些实施方案中，病毒载体转导室管膜、软脑膜、内皮和/或其它脑膜细胞。

本公开内容的某些实施方案提供如本文描述的病毒载体或细胞，供用于医学治疗。

本公开内容的某些实施方案提供如本文描述的病毒载体或细胞制备可用于治疗哺乳动物的疾病，如溶酶体贮积病的药物的用途。

所述载体还可包含溶酶体酶(如，溶酶体水解酶)、分泌蛋白，核蛋白或胞浆蛋白。如本文所用的，术语“分泌蛋白”包括任何分泌蛋白，无论是天然分泌的或是经修饰以含有信号序列，以致它可以被分泌。

本公开内容的某些实施方案提供如本文描述的病毒载体或细胞在制备可用于治疗哺乳动物的疾病，如阿尔茨海默氏病的药物中的用途。

所述载体还可包含一种保护性ApoE同工型蛋白。如本文所用的，术语“分泌蛋白”包括任何分泌蛋白，无论是天然分泌的或是经修饰以含有信号序列，以致它可以被分泌。当核酸处于与另一个核酸序列的功能关系中时，核酸是"可操作地连接的"。一般来说，"可操作地连接的"意指要连接的DNA序列是相邻的。然而，增强子不必是相邻的。连接是通过在方便的限制性位点的连接来实现的。如果这样的位点不存在，合成的寡核苷酸衔接子或接头则依据常规实践使用。另外，编码酶的核酸的多个拷贝可在表达载体中连接在一起。这样的多个核酸可通过接头隔开。

本公开内容还提供含有本文描述的载体的哺乳动物细胞。细胞可以是人的，并可来自脑。细胞类型可以是干细胞或祖细胞群。

本公开内容提供一种通过给予本文描述的多核苷酸、多肽、表达载体或细胞，治疗哺乳动物的疾病例如遗传疾病或癌症的方法。遗传疾病或癌症可以是溶酶体贮积病(LSD)，例如婴儿或晚期婴儿型蜡样色素脂褐质沉积症、戈谢病、青少年巴藤病、法布里病、MLD、山菲立普综合征A、晚期婴儿巴藤病、亨特综合征、克拉伯病、莫尔基奥病、庞帕病、C型尼曼-匹克病、家族黑蒙性痴呆、赫尔勒病(MPS-IH)、山菲立普综合征B、马-拉综合征、A型尼曼-匹克病、胱氨酸过多症、赫尔勒-沙伊病(MPS-IH/S)、Sly综合征(MPSVII)、沙伊病(MPS-IS)、青少年巴藤病、GM1神经节苷脂贮积症、II/III型粘脂糖症或桑德霍夫病。

遗传疾病可以是神经变性疾病，例如亨廷顿氏病、ALS、遗传性痉挛性偏瘫、原发性侧索硬化、脊髓性肌萎缩症、肯尼迪氏病、阿尔茨海默氏病、多谷氨酰胺重复病或病灶性暴露例如帕金森氏病。

本公开内容的某些方面涉及多核苷酸、多肽、载体和基因工程改造的细胞(体内修饰的)，和它们的用途。特别是，本公开内容涉及一种基因或蛋白治疗的方法，其能够系统传递治疗有效剂量的治疗剂。

根据一个方面，提供用于在哺乳动物受体中表达治疗剂的细胞表达系统。表达系统(在此也称为"基因修饰细胞")包含细胞和表达治疗剂的表达载体。表达载体包括，但不限于，病毒、质粒和用于传递异源性遗传物质至细胞的其它媒介物。因此，如本文所用的术语"表达载体"指用于传递异源性遗传物质至细胞的媒介物。特别是，表达载体是重组腺病毒、腺相关病毒或慢病毒或逆转录病毒载体。

表达载体还包括用于控制异源性基因的转录的启动子。启动子可以是诱导型启动子(下述)。表达系统适合于给予哺乳动物受体。表达系统可包含多个非-永生化基因修饰细胞，每个细胞含有至少一种编码至少一种治疗剂的重组基因。

细胞表达系统在体内形成。根据还一方面，提供一种体内治疗哺乳动物受体的方法。该方法包括将表达异源性基因产物的表达载体，例如经由静脉内给予，原位导入患者的细胞。为形成体内表达系统，表达治疗剂的表达载体被体内i.v.引入哺乳动物受体，其中载体经由血管系统迁移至脑。

根据又一方面，提供一种体内治疗哺乳动物受体的方法。该方法包括将靶蛋白体内引入患者。

表达异源性基因的表达载体可包括用于控制异源性基因产物转录的诱导型启动子。因此，治疗剂原位传递受将细胞原位暴露于条件的控制，所述条件诱导异源性基因的转录。

哺乳动物受体可患有易受基因替代疗法影响的病症。如本文所用的，"基因替代疗法"指给予受体编码治疗剂的外源性遗传物质和给予的遗传物质的随后原位表达。因此，短语"可受基因替代疗法影响的病症"包括这样的病症，例如遗传性疾病(即，归因于一个或多个基因缺陷的疾病状态)、获得性病变(即，不能归因于先天缺陷的病理状态)、癌症和预防性过程(即，疾病或不希望的医学病症的预防)。因此，如本文所用的，术语"治疗剂"指对哺乳动物受体具有有益作用的任何药物或物质。因此，"治疗剂"包括具有核酸或蛋白成分的治疗性和预防性分子二者。

根据一个实施方案，哺乳动物受体患有遗传疾病和外源性遗传物质包含编码用于治疗该疾病的治疗剂的异源性基因。在还一个实施方案中，哺乳动物受体患有获得性病变和外源性遗传物质包含编码用于治疗该病变的治疗剂的异源性基因。根据另一个实施方案，患者患有癌症和外源性遗传物质包含编码抗肿瘤剂的异源性基因。在还一个实施方案中，所述患者患有不希望的医学病症和外源性遗传物质包含编码用于治疗该病症的治疗剂的异源性基因。

如本文所用的，术语“保护性ApoE同工型”、“溶酶体酶”、“分泌蛋白”、“核蛋白”或“胞浆蛋白”包括这些多肽的变体或生物学活性或非活性片段。多肽之一的“变体”是与天然蛋白不完全相同的多肽。这样的变体蛋白可通过插入、缺失或取代一个或多个氨基酸改变氨基酸序列而获得。例如通过取代，修饰蛋白的氨基酸序列，以创建一个与天然多肽比较，具有基本上相同或改进质量的多肽。取代可以是保守的取代。“保守的取代”是用另一个具有类似的侧链的氨基酸取代氨基酸。保守的取代应是用在氨基酸的电荷或氨基酸的侧链大小方面(或者，在侧链内化学基团的大小、电荷或种类方面)造成的可能最小改变的氨基酸取代，以致整个肽保留其空间构型，但具有改变的生物学活性。例如，常见的保守改变可以是Asp至Glu、Asn或Gln；His至Lys、Arg或Phe；Asn至Gln、Asp或Glu和Ser至Cys、Thr或Gly。丙氨酸通常被用来取代其它氨基酸。20个必需氨基酸可分组如下：具有非极性侧链的丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；具有不带电荷的极性侧链的甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；具有酸性侧链的天冬氨酸和谷氨酸；和具有碱性侧链的赖氨酸、精氨酸和组氨酸。

氨基酸改变通过改变对应的核酸序列的密码子而获得。已知这样的多肽可根据用某些氨基酸取代多肽结构中的其它氨基酸，以修饰或改进生物学活性而获得。例如，通过可供选择的氨基酸的取代，可赋予多肽小的构型改变，导致活性增加。或者，在某些多肽中的氨基酸取代可被用来提供残基，其然后可连接于其它分子，以提供保留起始多肽的可用于其它目的的充分特性的肽-分子缀合物。

在赋予多肽的相互作用的生物功能方面可使用氨基酸的亲水指数，其中发现某些氨基酸可取代具有类似的亲水指数的其它氨基酸并仍保留类似的生物学活性。或者，类似的氨基酸的取代可在亲水性的基础上进行，特别是在待生成多肽所需的生物学功能意欲用于免疫学实施方案的情况下。“蛋白”的最大局部平均亲水性，如受其邻近氨基酸的亲水性所控制，与其免疫原性相关。因此，注意到取代可基于对每个氨基酸分配的亲水性进行。

在使用亲水性指数或者亲水指数(其为每个氨基酸分配某一值)中，进行其中这些值为±2的氨基酸取代是优选的，具有±1的氨基酸取代是特别优选的，和那些具有±0.5的氨基酸取代是最优选的取代。

变体蛋白具有与对应的天然蛋白的氨基酸序列至少50%、至少约80%，或甚至至少约90%，但少于100%的相邻的氨基酸序列同源性或同一性。

变体多肽的氨基酸序列基本上对应于天然多肽的氨基酸序列。如本文所用的“基本上对应于”指将引起与由天然蛋白产生的反应基本上相同的生物学反应的多肽序列。这样的反应可以是由天然蛋白产生的水平的至少60%，并且可以甚至是由天然蛋白产生的水平的至少80%。

变体可包括对应的天然蛋白中不存在的或相对于对应的天然蛋白缺失的氨基酸残基。与对应的天然蛋白比较，变体也可以是一个截短的“片段”，即仅仅是全长蛋白的一部分。蛋白变体也包括具有至少一个D-氨基酸的肽。

变体蛋白可从编码变体蛋白的分离的DNA序列表达。“重组”被定义为由基因工程过程产生的肽或核酸。应该注意到，本领域熟知的是，由于遗传密码中的冗余，单独的核苷酸可以很容易地在密码子中交换，并且仍导致相同的氨基酸序列。

本公开内容提供通过给予表达载体至细胞或患者，治疗哺乳动物的疾病的方法。对于基因治疗方法，具有分子生物学和基因疗法领域的普通技能的人员将能够确定适当的剂量和给予用于本公开内容的新方法的表达载体的途径，而无需过多的实验。

根据一个实施方案，细胞被转化或者以其它方式体内经基因修饰。来自哺乳动物受体的细胞用含有用于表达编码治疗剂的异源性(如，重组)基因的外源性遗传物质的载体体内转化(即，转导或转染)并原位传递治疗剂。

如本文所用的，"外源性遗传物质"指核酸或寡核苷酸，或者天然的或者合成的，其在细胞中不是天然存在的；或者如果它是天然存在于细胞中的，它不能由细胞以生物学显著水平转录或表达。因此，"外源性遗传物质"包括，例如，可转录成反义RNA的非-天然存在的核酸，以及"异源性基因"(即，编码在相同类型的天然存在的细胞中不表达或以生物学可忽略的水平表达的蛋白的基因)。

在某些实施方案中，哺乳动物受体患有可受基因替代疗法影响的病症。如本文所用的，"基因替代疗法"指给予受体编码治疗剂的外源性遗传物质和给予的遗传物质的随后原位表达。因此，短语"可受基因替代疗法影响的病症"包含这样的病症，例如遗传性疾病(即，归因于一个或多个基因缺陷的疾病状态)、获得性病变(即，不能归因于先天缺陷的病理状态)、癌症和预防性过程(即，疾病或不希望的医学病症的预防)。因此，如本文所用的，术语"治疗剂"指对哺乳动物受体具有有益作用的任何药物或物质。因此，"治疗剂"包括具有核酸(如，反义RNA)和/或蛋白成分的治疗性和预防性分子二者。

或者，可受基因替代疗法影响的病症是预防性过程，即预防疾病或不希望的医学病症的过程。因此，本公开内容包含用于传递具有预防性功能的治疗剂(即，预防药)至哺乳动物受体的细胞表达系统。

简言之，术语"治疗剂"包括，但不限于，与以上所列病症有关的药物，及其功能等同物。如本文所用的，术语"功能等同物"指对哺乳动物受体具有与认为是功能等同物的治疗剂相同或改进的有益作用的分子(如，肽或蛋白)。

上文公开的治疗剂和可受基因替代疗法影响的病症仅仅是示例性的并不打算限制本公开内容的范围。用于治疗已知病症的合适治疗剂的选择被认为是在本领域普通技术人员的专业范围内，无需过多的实验。

AAV载体

在一个实施方案中，本公开内容的病毒载体是AAV载体。"AAV"载体指腺相关病毒，并可用来指天然存在的野生型病毒本身或其衍生物。该术语涵盖所有亚型、血清型和假型，可天然存在的和重组形式二者，另有规定的除外。如本文所用的，术语"血清型"指基于衣壳蛋白与确定抗血清(例如存在8个已知血清型的灵长类动物AAV，AAV-1至AAV-9和AAVrh10)的反应性鉴定的并与其它AAV区分的AAV。例如，血清型AAV2被用来指含有从AAV2的cap基因编码的衣壳蛋白和含有来自相同的AAV2血清型的5'和3'ITR序列的基因组的AAV。如本文所用的，例如，rAAV1可被用来指具有来自相同血清型的衣壳蛋白和5'-3'ITR二者的AAV或它可指具有来自一种血清型的衣壳蛋白和来自不同的AAV血清型的5'-3'ITR，如来自AAV血清型2的衣壳和来自AAV血清型5的ITR的AAV。对于本文举例说明的每个实例，载体设计和生产的描述说明了衣壳和5'-3'ITR序列的血清型。缩写"rAAV"指重组腺相关病毒，也称为重组AAV载体(或"rAAV载体")。

"AAV病毒"或"AAV病毒颗粒"指至少一种AAV衣壳蛋白(优选地所有的野生型AAV的衣壳蛋白)和包壳多核苷酸组成的病毒颗粒。如果颗粒包含异源性多核苷酸(即，并非野生型AAV基因组的多核苷酸，例如待传递至哺乳动物细胞的转基因)，它通常称为"rAAV"。

在一个实施方案中，AAV表达载体使用已知的技术构建，以至少在转录的方向上提供包括转录起始区、感兴趣的DNA和转录终止区的控制元件，作为可操作连接的元件。选择在哺乳动物细胞中具有功能性的控制元件。生成的含有可操作连接的元件的构建体的两侧(5'和3')与功能性AAVITR序列连接。

所谓"腺相关病毒反向末端重复序列"或"AAVITR"意指在AAV基因组的每个末端发现的本领域公认的区域，其以顺式作为DNA复制起点和作为对病毒的包装信号而一起发挥作用。AAVITR，与AAVrep编码区一起，提供自在两个侧翼ITR之间插入的核苷酸序列有效的切除和拯救，并且将在两个侧翼ITR之间插入的核苷酸序列整合至哺乳动物细胞基因组中。

AAVITR区域的核苷酸序列是已知的。如本文所用的，"AAVITR"不必具有描述的野生型核苷酸序列，但可例如通过插入、缺失或取代核苷酸而改变。另外，AAVITR可源自几种AAV血清型的任一种，包括而不限于，AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV7等。而且，在AAV载体中侧接选定的核苷酸序列的5'和3'ITR不必一定是相同的或源自相同的AAV血清型或分离物，只要它们按照预定的发挥功能，即允许从宿主细胞基因组或载体切除和拯救感兴趣的序列，并在AAVRep基因产物存在于细胞中时，允许异源性序列整合进入受体细胞基因组。

在一个实施方案中，AAVITR可源自几种AAV血清型的任一种，包括而不限于，AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV7等。而且，在AAV表达载体中侧接选定的核苷酸序列的5'和3'ITR不必一定是相同的或源自相同的AAV血清型或分离物，只要它们按照预定的发挥功能，即从宿主细胞基因组或载体切除和拯救感兴趣的序列，并在AAVRep基因产物存在于细胞中时，允许DNA分子整合进入受体细胞基因组。

在一个实施方案中，AAV衣壳可源自AAV2。用于AAV载体的合适的DNA分子的大小将少于约5千碱基(kb)，少于约4.5kb，少于约4kb，少于约3.5kb，少于约3kb，少于约2.5kb并是本领域已知的。

在一个实施方案中，选择的核苷酸序列可操作地连接于控制元件，其在受试者中指导其体内的转录或表达。这样的控制元件可包含正常地与所选择的基因有关的控制序列。或者，可采用异源性控制序列。有用的异源性控制序列通常包括源自编码哺乳动物或病毒基因的序列的那些。实例包括，但不限于，SV40早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒LTR启动子；腺病毒主要晚期启动子(AdMLP)；单纯疱疹病毒(HSV)启动子、细胞巨化病毒(CMV)启动子例如CMV即刻早期启动子区域(CMVIE)，劳氏肉瘤(roussarcoma)病毒(RSV)启动子、polII启动子、polIII启动子、合成的启动子、杂合启动子等。此外，源自非病毒基因，例如小鼠金属硫蛋白基因的序列，也将在此找到用途。这样的启动子序列可从例如Stratagene(SanDiego,Calif.)经市售购得。

在一个实施方案中，异源性启动子和其它控制元件二者，例如CNS-特异性和诱导型启动子、增强子等，将具有特定的用途。异源性启动子的实例可CMV启动子。CNS-特异性启动子的实例包括从得自髓鞘碱性蛋白(MBP)、神经胶质酸性蛋白(GFAP)和神经元特异性烯醇酶(NSE)的基因分离的那些。诱导型启动子的实例包括对蜕皮激素、四环素、缺氧和aufin的DNA反应元件。

在一个实施方案中，带有由AAVITR限定的感兴趣的DNA分子的AAV表达载体，可通过将选定的序列直接插入AAV基因组中构建，所述基因组已具有主要的AAV可读框("ORF")从其中切除。AAV基因组的其它部分也可缺失，只要ITR的足够部分仍然允许复制和包装功能。这样的构建体可采用本领域熟知的技术设计。

或者，AAVITR可从病毒基因组或从含有所述AAVITR的AAV载体切离，并使用标准连接技术在存在于另一个载体中的选定的核酸构建体的5'和3'融合。例如，连接可在20mMTris-ClpH7.5、10mMMgCl₂、10mMDTT、33μg/mlBSA、10mM-50mMNaCl，和或者40uMATP、0.01-0.02(Weiss)单位T4DNA连接酶于0℃(用于"粘端"连接)或1mMATP、0.3-0.6(Weiss)单位T4DNA连接酶于14℃(用于"平端"连接)实现。分子间"粘端"连接通常以30-100μg/ml总DNA浓度(5-100nM总末端浓度)进行。AAV载体含有ITR。

另外，嵌合基因可经合成产生以包含一个或多个选定的核酸序列的5'和3'排列的AAVITR序列。用于在哺乳动物CNS细胞中表达嵌合基因序列的优选的密码子可被采用。完全嵌合序列从由标准方法制备的重叠寡核苷酸装配。

为产生rAAV病毒体，使用已知的技术，例如通过转染，将AAV表达载体引入合适的宿主细胞。许多转染技术通常是本领域已知的。见例如Sambrook等(1989)分子克隆，实验室手册(MolecularCloning,laboratorymanual),ColdSpringHarborLaboratories,NewYork。特别合适的转染方法包括磷酸钙共沉淀、直接微量注入培养的细胞、电穿孔、脂质体介导的基因转移、脂质-介导的转导和使用高速微弹发射的核酸传递。

在一个实施方案中，用于产生rAAV病毒体的合适的宿主细胞包括微生物、酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞，它们可用作，或已经用作异源性DNA分子的受体。该术语包括已经转染的原始细胞的子代。因此，如本文所用的"宿主细胞"通常指已用外源性DNA序列转染的细胞。来自稳定的人细胞系，293的细胞(可通过例如美国典型培养物保藏中心按索取号ATCCCRL1573容易地获得)可被用于实施本公开的内容。特别地，人细胞系293是已用腺病毒类型-5DNA片段转化，并表达腺病毒E1a和E1b基因的人类胚胎肾细胞系。293细胞系是容易转染的，并提供特别方便的在其中产生rAAV病毒体的平台。

所谓"AAVrep编码区域"意指本领域公认的AAV基因组区域，其编码复制蛋白Rep78、Rep68、Rep52和Rep40。这些Rep表达产物已显示具有许多功能，包括DNA复制的AAV起点的识别、结合和切口，DNA解旋酶活性和从AAV(或其它异源性)启动子转录的调节。Rep表达产物共同需要用于复制AAV基因组。AAVrep编码区域的合适的同源基因包括人疱疹病毒6(HHV-6)rep基因，其也已知介导AAV-2DNA复制。

所谓"AAVcap编码区域"意指本领域公认的AAV基因组区域，其编码衣壳蛋白VP1、VP2和VP3，或其功能性同源物。这些Cap表达产物提供包装功能，这些功能整体需要用于包装病毒基因组。

在一个实施方案中，通过用AAV辅助构建体在AAV表达载体的转染之前，或者同时转染宿主细胞，将AAV辅助功能引入宿主细胞。AAV辅助构建体因此被用来提供AAVrep和/或cap基因的至少瞬时表达，以补充缺失的AAV功能，其对产生AAV感染是必要的。AAV辅助构建体缺乏AAVITR，因而既不能复制，也不能包装它们本身。这些构建体可呈现为质粒、噬菌体、转座子、粘粒、病毒或病毒体的形式。已描述了许多AAV辅助构建体，例如通常所用的质粒pAAV/Ad和pIM29+45，其编码Rep和Cap两种表达产物。编码Rep和/或Cap表达产物的许多其它载体已有描述。

传递病毒载体的方法包括将AAV2注入CSF。一般来说，rAAV病毒体可使用体内或者体外转导技术引入CNS的细胞。如果体外转导，所需受体细胞将从受试者中除去，用rAAV病毒体转导并再次引入受试者。或者，可使用同种或异种细胞，其中那些细胞将在受试者中不产生不适当的免疫反应。

将转导的细胞传递和引入受试者的合适的方法已有描述。例如，细胞可通过使重组AAV病毒体与CNS细胞例如在适当的介质中合并而在体外转导，筛选带有感兴趣的DNA的那些细胞可使用常规技术例如DNA印迹和/或PCR，或通过使用可选择的标记筛选。然后转导的细胞可配制成下文更充分地描述的药用组合物，并将组合物通过各种技术引入受试者，例如通过移植、肌内、静脉内、皮下和腹膜内注入。

在一个实施方案中，药用组合物将包含足够的遗传物质以产生治疗有效量的感兴趣的核酸，即足以减轻或缓解所提及疾病状态的症状的量或足以赋予所需益处的量。药用组合物也将含有药学上可接受的赋形剂。这样的赋形剂包括自身不诱导产生对接受组合物的个体有害的抗体，并可给予而无过度毒性的任何药用试剂。药学上可接受的赋形剂包括，但不限于，山梨醇、吐温80，和液体例如水、盐水、甘油和乙醇。药学上可接受的盐可包括于其中，例如，无机酸盐例如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等；和有机酸的盐例如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等。另外，辅助物质，例如湿润剂或乳化剂、pH缓冲物质等，可存在于这样的媒介物中。药学上可接受的赋形剂的深入讨论可在Remington'sPharmaceuticalSciences(MackPub.Co.,N.J.1991)中获得。

应该理解，一个以上的转基因可通过传递病毒载体来表达。或者，独立的载体，每个表达一个或多个不同的转基因，也可传递至如本文描述的CNS。而且，也打算通过本公开内容的方法传递的病毒载体与其它合适的组合物和疗法组合。

正如本领域技术人员在考虑了本申请的教导后所显而易见的，必须加入的病毒载体的有效量可凭经验确定。给药可在整个治疗过程以一个剂量、连续地或间歇地进行。确定最有效的给药方式和剂量的方法是本领域技术人员熟知的并将随病毒载体、疗法的组成、靶细胞和待治疗的受试者而变化。单次和多次给药可按照由治疗主治医师选择的剂量水平和模式进行。

在某些实施方案中，rAAV以1x10⁵-1x10¹⁶vg/ml的约1-5ml的剂量给予。在某些实施方案中，rAAV以1x10⁷-1x10¹⁴vg/ml的约1-3ml的剂量给予。在某些实施方案中，rAAV以1x10⁸-1x10¹³vg/ml的约1-2ml的剂量给予。

含有rAAV颗粒的制剂将含有在媒介中的有效量的rAAV颗粒，有效量由本领域技术人员容易地确定。rAAV颗粒可典型地介于从约1%至约95%(w/w)的组合物的范围内，或如果适合时可甚至更高或更低。要给予的量取决于诸如为治疗考虑的动物或人类受试者的年龄、体重和身体状况等因素。有效的剂量可由本领域普通技术人员通过常规试验建立剂量反应曲线来确立。受试者通过给予一个或多个剂量的rAAV颗粒来治疗。当需要维持足够的酶活性时，可给予多个剂量。

媒介物，包括水、盐水溶液、人造CSF，或其它已知的物质，可用于本发明。为制备制剂，可分离、冻干和稳定纯化的组合物。然后可将组合物调节至适当的浓度，任选地与抗炎剂合并，并包装以供使用。

TPP1蛋白

在某些实施方案中，给予的核酸编码TPP1、具有与野生型TPP1基本上同一性的TPP1，和/或TPP1的变体、突变体或片段。图14提供人TPP1氨基酸序列，和图15提供核酸序列。图16提供猕猴TPP1氨基酸序列，和图17提供食蟹猴TPP1氨基酸序列。在某些实施方案中，TPP1蛋白可具有与图14、16或17描述的蛋白约70%的同源性、约75%的同源性、80%的同源性、85%的同源性、90%的同源性、95%的同源性、98%的同源性、99%的同源性，或甚至100%的同源性。TPP1蛋白可具有与图14,16或17描述的蛋白约70%的同一性、约75%的同一性、80%的同一性、85%的同一性、90%的同一性、95%的同一性、98%的同一性、99%的同一性，或甚至100%的同一性。

突变体蛋白指由具有突变，如在TPP1中的错义或无义突变的基因编码的蛋白。术语"核酸"指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其单链-或者双链-链形式的聚合物，由含有糖、磷酸盐和为嘌呤或者嘧啶的碱的单体(核苷酸)组成。除非特别限制，该术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述天然核苷酸具有与参考核酸类似的结合特性并以类似于天然存在的核苷酸的方式代谢。除非另外指明，特定的核酸序列也涵盖其保守修饰的变体(如，简并密码子取代)和互补序列，以及明确表示的序列。特别地，简并密码子取代可通过生成其中一个或多个选择的(或所有)密码子的第三位置用混合的-碱和/或脱氧肌苷残基取代的序列而实现。

"核酸片段"是给定核酸分子的部分。在大多数生物体中的脱氧核糖核酸(DNA)是遗传物质，而核糖核酸(RNA)参与将DNA中含有的信息转移到蛋白中。所公开的核苷酸序列和蛋白的片段和变体或由此编码的部分-长度蛋白也被本发明涵盖。所谓"片段"或"部分"意指全长或少于全长的编码多肽或蛋白的核苷酸序列，或其氨基酸序列。在某些实施方案中，片段或部分是有生物学功能的(即保留5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%的野生型TPP1的酶活性)。

分子的"变体"是基本上类似于天然分子的序列的序列。对于核苷酸序列，由于遗传密码的简并性，变体包括编码天然蛋白的相同氨基酸序列的那些序列。天然存在的等位基因变体例如这些可采用分子生物学技术，如例如用聚合酶链反应(PCR)和杂交技术鉴别。变体核苷酸序列也包括合成来源的核苷酸序列，例如通过使用位点-定向诱变产生的编码天然蛋白的那些，以及编码具有氨基酸取代的多肽的那些。一般来说，本发明的核苷酸序列变体将具有与天然(内源性)核苷酸序列至少40%、50%、60%、至70%，如71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、至79%、通常至少80%，如81%-84%、至少85%，如86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、至98%的序列同一性。在某些实施方案中，变体是有生物学功能的(即保留5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%的野生型TPP1的酶活性)。

特定核酸序列的“保守地修饰的变化”指编码相同的或基本相同的氨基酸序列的那些核酸序列。由于遗传编码的简并性，大量功能性相同的核酸编码任何给定的多肽。例如，密码子CGT、CGC、CGA、CGG、AGA和AGG全部编码氨基酸精氨酸。因此，在每一个由密码子指定精氨酸的位置，密码子可被更改为描述的对应的任何密码子，而不改变编码的蛋白。这样的核酸变异是"沉默变异"，其是一种"保守地修饰变异"。本文描述的编码多肽的每一核酸序列也描述每一种可能的沉默变化，除非另外注明。本领域技术人员应认识到，核酸中的每个密码子(除了ATG，其通常是用于甲硫氨酸的唯一密码子)可通过标准技术修饰以产生功能相同的分子。因此，编码多肽的核酸的每个“沉默变异”涉及每个描述的序列。

术语多核苷酸序列的"基本上同一性"意指使用采用标准参数描述的比对程序之一，与参考序列比较，多核苷酸包含具有至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%，或79%，或至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%，或89%，或至少90%、91%、92%、93%，或94%，或甚至至少95%、96%、97%、98%，或99%的序列同一性的序列。本领域技术人员应认识到，这些值可被适当地调节，以确定因考虑密码子简并性、氨基酸类似性、阅读框定位等，由两个核苷酸序列编码的蛋白的对应同一性。为了这些目的，氨基酸序列的基本上同一性通常意指至少70%、至少80%、90%，或甚至至少95%的序列同一性。

在肽的上下文中的术语"基本上同一性"指在指定的比较窗口包含与参考序列至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%，或79%，或80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%，或89%，或至少90%、91%、92%、93%，或94%，或甚至95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的序列的肽。两个肽序列是基本上相同的指示是，一个肽与针对第二个肽引起的抗体有免疫反应性。因此，肽与第二个肽是基本上相同的，例如，其中两个肽的不同之处仅在于保守的取代。

载脂蛋白E(ApoE)

有几种不同的人载脂蛋白E(ApoE)同工型，某些这样的同工型在脑中的存在增加阿尔茨海默氏病(AD)的风险，而其它同工型的存在降低AD的风险。ApoEε4同工型的存在是迟发型、散发性AD的强遗传风险因子(Casellano等,SciTranslMed,3(89):89ra57(29June2011))。ApoEε4等位基因强烈地增加AD风险和降低发病的年龄。另一方面，ApoEε2等位基因的存在似乎降低AD风险。提示人ApoE同工型有差别地影响体内淀粉样蛋白-β(Aβ)的清除或合成。

在某些实施方案中，给予的核酸编码ApoE、与野生型ApoE具有基本上同一性的ApoE，或ApoE变体、突变体和/或片段。在某些实施方案中，核酸编码ApoEε2、与野生型ApoEε2具有基本上同一性的ApoEε2，和/或ApoEε2的变体、突变体或片段。

免疫抑制剂

在某些实施方案中，免疫抑制剂也给予哺乳动物。在某些实施方案中，免疫抑制剂是抗炎剂。在某些实施方案中，抗炎剂是麦考酚酯。在某些实施方案中，抗炎剂在给予rAAV颗粒之前给予。在某些实施方案中，抗炎剂与给予rAAV颗粒同时给予。在某些实施方案中，抗炎剂在给予rAAV颗粒之后给予。

在某些实施方案中，抗炎剂经胃肠外给予，例如在适当的媒介物中经肌内或皮下注射。然而，其它给予方式，例如口服、鼻内或皮内传递，也是可接受的。在某些实施方案中，制备包含rAAV颗粒和抗炎剂的组合物，因而抗炎剂和rAAV颗粒被同时给予哺乳动物的枕大池和/或哺乳动物的脑室、蛛网膜下腔和/或鞘内空间。

用于将遗传物质引入细胞的方法

通过遗传转移方法，例如转染或转导，将外源性遗传物质(如，编码一个或多个治疗性蛋白的cDNA)引入细胞体内，以提供基因修饰细胞。各种表达载体(即，用于促使外源性遗传物质传递到靶细胞中的媒介物)是本领域普通技术人员已知的。

如本文所用的，"细胞的转染"指通过掺入加入的DNA，细胞获得新的遗传物质。因此，转染指使用物理或化学方法将核酸插入细胞中。几种转染技术是本领域普通技术人员已知的，包括：磷酸钙DNA共-沉淀；DEAE-葡聚糖；电穿孔；阳离子脂质体介导的转染；和钨颗粒-促进的微粒轰击。磷酸锶DNA共-沉淀是另一种可能的转染方法。

相反，"细胞的转导"指使用DNA或RNA病毒，将核酸转移到细胞中的过程。用于将核酸转移到细胞中的RNA病毒(即，逆转录病毒)在此被称为转导嵌合逆病毒。包含在逆转录病毒中的外源性遗传物质被结合到转导细胞的基因组。已用嵌合DNA病毒(如，携带编码治疗剂的cDNA的腺病毒)转导的细胞，将不具有掺入到其基因组中的外源性遗传物质，但将能够表达在细胞内染色体外保留的外源性遗传物质。

典型地，外源性遗传物质包括异源性基因(通常呈现一种包含编码治疗性蛋白的外显子的cDNA的形式)和启动子一起，以控制新基因的转录。启动子特征性地具有启动转录所必要的特定核苷酸序列。任选地，外源性遗传物质还包括获得所需基因转录活性所需要的另外的序列(即，增强子)。为了这样的讨论的目的，"增强子"仅仅是任何非翻译的DNA序列，其与相邻的编码序列一起工作(顺式)，以改变由启动子指示的基础转录水平。外源性遗传物质可从启动子的下游直接引入细胞基因组，以致启动子和编码序列可操作地连接，以允许转录编码序列。逆转录病毒表达载体可包括外源性启动子元件，以控制插入外源性基因的转录。这样的外源性启动子包括组成型和诱导型两种启动子。

天然存在的组成型启动子控制基本细胞功能的表达。结果，在组成型启动子的控制下的基因在细胞生长的所有情况下表达。示例性组成型启动子包括用于编码某些组成型或"持家"功能的以下基因的启动子：次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、腺苷脱氨酶、磷酸甘油激酶(PGK)、丙酮酸激酶、磷酸甘油变位酶、肌动蛋白启动子，和本领域技术人员已知的其它组成型启动子。此外，许多病毒启动子在真核细胞中组成型地发挥功能。这些包括：SV40的早期和晚期启动子；莫洛尼白血病病毒(MoloneyLeukemiaVirus)和其它逆转录病毒的长端重复序列(LTR)；和单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子，以及其它等等。因此，任何上面-提及的组成型启动子可用来控制异源性基因插入片段的转录。

在诱导型启动子控制下的基因仅仅或很大程度上在诱导剂的存在下表达(如，在金属硫蛋白启动子控制下的转录在某些金属离子的存在下有很大增加)。诱导型启动子包括反应元件(RE)，其在它们的诱导因子被结合时刺激转录。例如，有用于血清因子、甾体激素、维甲酸和环状AMP的RE。可选择含有特定RE的启动子以获得诱导型反应并在一些情况下，RE本身可附接于不同的启动子，从而将可诱导性赋予重组基因。因此，通过选择适当的启动子(组成型对比诱导型；强对比弱)，有可能控制治疗剂在基因修饰细胞中的存在和表达水平二者。如果编码治疗剂的基因是在诱导型启动子的控制下，治疗剂原位的传递通过使基因修饰细胞原位暴露于允许治疗剂转录的条件，如通过腹膜内注射控制药物转录的诱导型启动子的特异性诱导剂来引发。例如，在金属硫蛋白启动子的控制下，由基因编码的治疗剂的基因修饰细胞的原位表达，通过使基因修饰细胞与含有适当的(即，诱导性)金属离子的溶液原位接触来提高。

因此，原位传递的治疗剂的量通过控制这样的因素调节，这样的因素有例如：(1)用来指导插入基因的转录的启动子的性质(即，启动子是组成型的还是诱导型的，强或弱的)；(2)插入细胞中的外源性基因的拷贝数目；(3)给予(如，植入)患者的转导/转染细胞数目；(4)植入物(如，移植或包囊表达系统)的大小；(5)植入物的数目；(6)转导/转染细胞或植入物放置在部位的时间长度；和(7)由基因修饰细胞生产治疗剂的速率。在考虑了以上公开的因素和患者的临床性质后，用于传递治疗有效剂量的特定治疗剂的这些因素的选择和优化被认为是在本领域普通技术人员的范围内，而无需过多的实验。

除了至少一个启动子和至少一种编码治疗剂的异源性核酸外，表达载体还可包括选择基因，例如，新霉素抗性基因，用于促进已用表达载体转染或转导的细胞的选择。或者，细胞用两个或更多个表达载体转染，至少一个载体含有编码治疗剂的基因，其它载体含有选择基因。合适的启动子、增强子、选择基因和/或信号序列(下述)的选择被认为是在本领域普通技术人员的范围内，而无需过多的实验。

治疗剂可以被靶向而传递到细胞外、细胞内或膜位置。如果从细胞中分泌基因产物是理想的，则表达载体被设计以包括适宜的分泌"信号"序列，用于从细胞分泌治疗性基因产物至细胞外环境。如果基因产物被保留在细胞内是理想的，则这种分泌信号序列被省略。在类似的方式中，表达载体可被构建以包括"保留"信号序列，用于锚定治疗剂在细胞浆膜内。例如，所有膜蛋白具有疏水性跨膜区，其停止蛋白在膜中的易位且不允许蛋白分泌。包括将基因产物靶向特定位置的信号序列的表达载体的构建被认为是在本领域普通技术人员的范围内，而无需过多的实验。

实施例1

在大型哺乳动物中基因转移的方法

溶酶体贮积病(LSD)构成一大类遗传性代谢障碍。大多数LSD由溶酶体酶缺乏引起，其导致器官损害以及常见的中枢神经系统(CNS)退化。晚期婴儿型神经元蜡样色素脂褐质沉积症(LINCL)是一种由蜡样色素脂褐质沉积症(CLN),神经元2基因CLN2(其编码溶酶体蛋白酶三肽基肽酶1(TPP1))中突变引起的常染色体隐性神经变性疾病。LINCL以正常出生和早期发展、18-24月间的癫痫发作、进行性运动和认知能力下降，和过早死亡为临床特征。该疾病是由于缺乏TPP1，其是可溶性的、M-6-P装饰的溶酶体酶。

酶-替代疗法(ERT)目前可用于影响外周组织的溶酶体贮积病，但一直未用于患有中枢神经系统(CNS)受累的患者。最近的研究调查了对于LINCL，通过脑脊液的酶传递是否是一种对CNS有效的备选途径(Chang等,MolecularTherapy16:649-656,2008)。经治疗的小鼠显示相对于媒介物-处理的小鼠减轻的神经病变，和降低的静息震颤。

在目前的工作中，已研究载体的整体传递是否可有效地进行，以通过在脑中注射实现酶在脑脊液(CSF)中的稳态水平。在LINCL的狗模型中进行了研究。LINCL狗在出生时是正常的，但在约7月发生神经学体征，在约5-6月可检测认知缺陷，在10-11月的癫痫发作，和进行性视力丧失。LINCL狗中的CLN2基因突变使得TPP1蛋白为非-功能性的，且TPP1蛋白是不可检测的。随着疾病进展，脑组织萎缩，导致脑中的脑室空腔扩大。神经学症状包括平衡和运动功能下降、视力丧失、震颤。

受影响的LINCL小狗在3月龄时给予基因疗法。对于基因治疗，生成AAV2-CLN2(见WO2012/135857)，并在脑中的单一位点(侧脑室)或在两个位点(侧脑室加枕大池)注射。使针头放置在脑室内，或进入脑室和枕大池，并将载体经几分钟缓慢输入。虽然在细胞内制备的大量TPP1停留在该细胞中，但部分被分泌并由邻近的细胞吸收。这种分泌和吸收的特性被称为“交叉校正”(图2)。交叉校正在基因疗法背景中的价值在于，如果CLN2基因被转移到LINCL脑中战略定位的细胞时，则这可允许许多周围细胞的交叉校正。

在目前的研究中，整体传递治疗性载体的问题通过靶向成为脑室衬里的细胞和构成脑膜的细胞，利用脑中的CSF流动。在脑中的单一位点(侧脑室)或在两个位点(侧脑室加枕大池)注射AAV2-CLN2。AAV传递后，在Cln2^-/-狗中观察到TPP1表达(图3)。对脑室容积观察到显著的积极影响。也评价了AAV.TPP1对自体荧光的作用(图4A)。图4B显示未治疗和治疗的狗的T1-MRI图像。图4C显示AAV.TPP1在LINCL狗中的作用。图4D显示在AAV2/2-huCLN2给予后huTPP1的分布。

在未治疗的受影响的狗中，脑室空间扩大到正常狗的大小的10倍，而AAV2-CLN2基因疗法显著地减少这种作用。此外，观察到酶的广泛分布，正如是一种临床获益(存在时间和临床检测)。未治疗时，受影响的狗在所有22次试验中，在30周龄时，显示疾病体征。它们在45和48周龄之间达到晚期疾病并必需实施安乐死。在接受AAV2-CLN2基因疗法的狗中，这些体征的每一种的发生被延迟或防止。

在合并池和脑室传递后，在CSF中观察到TPP1活性增加。

因此，在LINCL狗中，AAV2-CLN2基因转移导致TPP1蛋白补充到脑的很多区域，且结果表示AAV2-CLN2基因转移提供了显著的治疗效果，减轻或延迟了症状并改进了LINCL狗的生活质量。

在CSF中的huTPP1活性在注射后不久即下降(图5)。观察到酶的广泛分布，但在基因疗法后6-8月处死时水平是低的。推测活性的下降是在狗中对人类酶的免疫反应的结果。为抑制活性下降，引入抗炎剂(麦考酚酯)。结果指示抗炎剂不抑制huTPP1的酶活性，和在酶活性存在的延长时间长度中是有效的(图6)，并观察到持续的酶活性水平。

在AAV2caCLN2脑室内注射和早期麦考酚酯治疗后，随着时间推移在CSF中观察到高的caTPP1活性(图7)。

在许多组织中在给药后两个月观察到TPP1酶活性的增加(图8、9A和9B)。

图10显示在LINCL狗中的临床体征的发生。在脑膜和外周组织，例如肝中观察到caTPP1活性(图11)。

因此，发明人已显示，经AAV2/2的室管膜(pendymal)细胞转化，产生犬科动物TPP1酶并随着CSF流动，以及麦考酚酯治疗prorotcaCLN2注射可防止狗中的免疫反应。

实施例2

在非-人灵长类动物中的研究

使用类似于以上描述的那些技术，本发明人观察到AAVeGFP转导在非人灵长类动物脑中的室管膜。AAV2/2.TPP1在恒河猴脑中传递的体内评价通过将AAV.TPP1注入脑室或枕大池中进行，在4-12周后收获组织，并评价在CSF或组织溶胞产物中的TPP1活性(图12)。在非-人灵长类动物中的前庭区(脑干)中观察到活性(图13)。因此，脑室衬里细胞为广泛的CNS分布提供一种重组酶的来源。

所有出版物、专利和专利申请通过引用结合到本文中。虽然在前述的说明书中已经关于其某些优选的实施方案描述了本发明，和许多细节都是为了说明目的而提出的，本领域技术人员显而易见的是，本发明易受到另外的实施方案的影响和本文描述的某些细节在不背离本发明的基本原则下可有相当的变化。

在描述本发明的上下文中使用的术语“一”、“一个”、“该”和类似的指代被认为覆盖单数和复数二者，除非本文另有指明或上下文明显矛盾。术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”被解释为开放性术语(即，意指“包括，但不限于”)，除非另外注明。本文叙述的值的范围仅仅打算用作分别地提及落入该范围内每个单独的值的缩写方法，除非本文另有指明，和每个单独的值结合到说明书中，如同它在本文被单独叙述一样。本文描述的所有方法可以任何合适的次序进行，除非本文另外指明或上下文另有明显矛盾。本文提供的任何和所有实施例，或示例性语言(如，“例如”)的使用，仅仅打算更好地阐明本发明并不构成对本发明范围的限制，除非另有要求。在本说明书中没有语言应被解释为指明任何非-要求的要素为实施本发明所必要的。

本文描述了本发明的实施方案，包括本发明人为实施本发明已知的最佳方式。那些实施方案的变化在本领域普通技术人员阅读前述说明书后可变得显而易见。本发明人期望技术人员在适宜时采用这样的变化，并且本发明人打算与本文特别描述的不同的方式实施本发明。因此，本发明包括在所附权利要求书中叙述的主题的所有适用法律允许的修饰和等价物。而且，本发明涵盖上述要素以其所有可能的变化的任何组合，除非本文另外指明或上下文另有明显矛盾。

Claims (37)

1.一种传递治疗剂至哺乳动物的中枢神经系统的方法，其包括以有效感染细胞的方式给予哺乳动物的枕大池包含AAV衣壳蛋白和载体的rAAV颗粒，所述载体包含插入在一对AAV反向末端重复序列之间的编码治疗剂的核酸，所述细胞接触哺乳动物的脑脊液(CSF)，以致所述细胞在哺乳动物中表达所述治疗剂。

2.一种治疗哺乳动物的疾病的方法，其包括以有效感染细胞的方式给予哺乳动物的枕大池包含AAV衣壳蛋白和载体的rAAV颗粒，所述载体包含插入在一对AAV反向末端重复序列之间的编码治疗剂的核酸，所述细胞接触哺乳动物的脑脊液(CSF)，其中所述细胞表达所述治疗剂以治疗所述疾病。

3.一种传递治疗剂至哺乳动物的中枢神经系统的方法，其包括以有效感染细胞的方式给予哺乳动物的脑室、蛛网膜下腔和/或鞘内空间包含AAV衣壳蛋白和载体的rAAV颗粒，所述载体包含插入在一对AAV反向末端重复序列之间的编码治疗剂的核酸，所述细胞接触哺乳动物的脑脊液(CSF)，以致所述细胞在哺乳动物中表达所述治疗剂。

4.一种治疗哺乳动物的疾病的方法，其包括以有效感染细胞的方式给予哺乳动物的脑室、蛛网膜下腔和/或鞘内空间包含AAV衣壳蛋白和载体的rAAV颗粒，所述载体包含插入在一对AAV反向末端重复序列之间的编码治疗剂的核酸，所述细胞接触哺乳动物的脑脊液(CSF)，其中所述细胞表达所述治疗剂以治疗所述疾病。

5.权利要求1-4的任一项的方法，其中所述细胞表达所述治疗剂并分泌所述治疗剂进入CSF。

6.权利要求1-4的任一项的方法，其中所述细胞是室管膜、软脑膜、内皮、脑室和/或脑膜细胞。

7.权利要求1-2和5-6的任一项的方法，其还包括另外给予rAAV至哺乳动物的脑室、蛛网膜下腔和/或鞘内空间。

8.权利要求1-7的任一项的方法，其中哺乳动物是非-啮齿哺乳动物。

9.权利要求8的方法，其中非-啮齿哺乳动物是灵长类动物、马、绵羊、山羊、猪或狗。

10.权利要求9的方法，其中哺乳动物是狗。

11.权利要求9的方法，其中非-啮齿哺乳动物是灵长类动物。

12.权利要求11的方法，其中灵长类动物是人。

13.权利要求1-12的任一项的方法，其中所述治疗剂是治疗性核酸。

14.权利要求1-12的任一项的方法，其中所述治疗剂是蛋白质。

15.权利要求14的方法，其中所述核酸编码溶酶体水解酶。

16.权利要求15的方法，其中所述蛋白质是TPP1。

17.权利要求1-16的任一项的方法，其中所述疾病是溶酶体贮积病(LSD)。

18.权利要求17的方法，其中LSD是婴儿或晚期婴儿型蜡样色素脂褐质沉积症(LINCL)、神经病性戈谢病(Gaucher)、青少年巴藤病(Batten)、法布里病(Fabry)、MLD、山菲立普综合征A(SanfilippoA)、亨特综合征(Hunter)、克拉伯病(Krabbe)、莫尔基奥病(Morquio)、庞帕病(Pompe)、C型尼曼-匹克病(Niemann-PickC)、家族黑蒙性痴呆(Tay-Sachs)、赫尔勒病(Hurler)(MPS-IH)、山菲立普综合征B(SanfilippoB)、马-拉综合征(Maroteaux-Lamy)、A型尼曼-匹克病、胱氨酸过多症、赫尔勒-沙伊病(Hurler-Scheie)(MPS-IH/S)、Sly综合征(MPSVII)、沙伊病(Scheie)(MPS-IS)、婴儿巴藤病、GM1神经节苷脂贮积症、II/III型粘脂糖症或桑德霍夫病(Sandhoff)。

19.权利要求18的方法，其中所述疾病是LINCL。

20.权利要求1-16的任一项的方法，其中所述疾病是神经变性疾病。

21.权利要求20的方法，其中所述神经变性疾病是阿尔茨海默氏病、亨廷顿氏病、ALS、遗传性痉挛性偏瘫、原发性侧索硬化、脊髓性肌萎缩症、肯尼迪氏病(Kennedy'sdisease)、多谷氨酰胺重复病或帕金森氏病。

22.权利要求21的方法，其中所述神经变性疾病是阿尔茨海默氏病。

23.权利要求22的方法，其中所述蛋白质是保护性ApoE同工型蛋白。

24.权利要求23的方法，其中所述保护性ApoE同工型与ApoEε2具有80%的同源性。

25.权利要求23的方法，其中所述保护性ApoE同工型与ApoEε2具有100%的同源性。

26.权利要求1-25的任一项的方法，其中rAAV颗粒被注射到脑部的1-5个位置。

27.权利要求26的方法，其中rAAV颗粒被注射到脑部的单一位置。

28.权利要求1-27的任一项的方法，其中rAAV颗粒是rAAV2、rAAV4、rAAV5和/或rAAV9颗粒。

29.权利要求28的方法，其中rAAV颗粒是rAAV2颗粒。

30.权利要求28的方法，其中rAAV颗粒是rAAV9颗粒。

31.权利要求1-30的任一项的方法，其中所述治疗剂以单一剂量给予哺乳动物的枕大池。

32.权利要求1-31的任一项的方法，其还包括给予免疫抑制剂。

33.权利要求32的方法，其中所述免疫抑制剂是抗炎剂。

34.权利要求33的方法，其中所述抗炎剂是麦考酚酯。

35.权利要求1-34的任一项的方法，其中rAAV以1x10⁵-1x10¹⁶vg/ml的约1-5ml的剂量给予。

36.权利要求1-34的任一项的方法，其中rAAV以1x10⁷-1x10¹⁴vg/ml的约1-3ml的剂量给予。

37.权利要求1-34的任一项的方法，其中rAAV以1x10⁸-1x10¹³vg/ml的约1-2ml的剂量给予。