ES2859605T3

ES2859605T3 - Procedimientos y composiciones para tratar enfermedades del cerebro

Info

Publication number: ES2859605T3
Application number: ES14829704T
Authority: ES
Inventors: Beverly L Davidson; Luis Tecedor; Yong Hong Chen
Original assignee: University of Iowa Research Foundation UIRF
Current assignee: University of Iowa Research Foundation UIRF
Priority date: 2013-07-26
Filing date: 2014-07-20
Publication date: 2021-10-04
Anticipated expiration: 2034-07-20
Also published as: AU2014293460B2; ZA201601024B; RU2016106652A; BR112016001592A2; PT3024497T; WO2015013148A2; IL243758B; JP2019163281A; EP3024497B1; JP2016530246A; CN105764532B; IL243758A0; WO2015013148A3; EP3024497A4; KR20220106852A; RU2018128780A; EP3024497A2; JP6872579B2; US10391184B2; KR102423069B1

Abstract

Partícula de rAAV que comprende una proteína de la cápside de AAV y un vector que comprende un ácido nucleico que codifica un agente terapéutico insertado entre un par de repeticiones terminales invertidas de AAV, y un agente de inmunosupresión, para su utilización en el tratamiento de una enfermedad en un mamífero, en la que la partícula de rAAV se administrará al ventrículo cerebral del mamífero de una manera eficaz para infectar células que están en contacto con el líquido cefalorraquídeo (LCR) del mamífero de modo que las células expresen el agente terapéutico, en la que la partícula de rAAV es una partícula de rAAV2, en la que el agente terapéutico es la proteasa tripeptidil peptidasa 1 (TPP1) lisosómica y la enfermedad es lipofuscinosis ceroide infantil tardía (LINCL), en la que las células son células ependimarias, y en la que el agente de inmunosupresión es un agente antiinflamatorio que se administrará al mamífero antes o después de la administración de la partícula de rAAV.

Description

DESCRIPCIÓN

Procedimientos y composiciones para tratar enfermedades del cerebro

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

Actualmente la transferencia de genes es reconocida ampliamente como una herramienta poderosa para el análisis de eventos biológicos y procesos de enfermedades, tanto a nivel celular como molecular. Más recientemente, la aplicación de terapias génicas para el tratamiento de enfermedades humanas, ya sean hereditarias (por ejemplo, deficiencia de ADA) o adquiridas (por ejemplo, un cáncer o una enfermedad infecciosa) ha recibido considerable atención. Con el advenimiento de técnicas mejoradas de transferencia de genes y la identificación de una biblioteca en crecimiento constante de enfermedades relacionadas con genes defectuosos, la terapia génica ha evolucionado rápidamente desde una teoría de tratamiento hasta una realidad concreta.

Tradicionalmente, la terapia génica se ha definido como un procedimiento mediante el cual se introduce un gen exógeno en las células de un paciente con el fin de corregir un error genético congénito. Si bien actualmente hay más de 4.500 enfermedades humanas que se clasifican como genéticas, se han identificado relativamente pocas mutaciones específicas para estas enfermedades en el genoma humano. Hasta hace poco, estas enfermedades genéticas raras representaban las dianas exclusivas de los esfuerzos para desarrollar una terapia génica. Por consiguiente, la mayoría de los protocolos de terapia génica aprobados por el NIH hasta la fecha estuvieron dirigidos a la introducción de una copia funcional de un gen defectuoso en las células somáticas de un individuo que tiene un error genético congénito conocido. Solo recientemente los investigadores y médicos han comenzado a apreciar que la mayoría de los cánceres humanos, determinadas formas de enfermedades cardiovasculares y muchas enfermedades degenerativas también tienen importantes componentes genéticos y, a los efectos de diseñar nuevas terapias génicas, deberían considerarse como "trastornos genéticos". Por lo tanto, más recientemente la terapia génica se ha definido en un sentido amplio como la corrección de un fenotipo de enfermedad por medio de la introducción de información genética nueva en el organismo afectado.

En una terapia génica in vivo, se introduce un gen transferido en las células del organismo receptor in situ es decir, dentro del receptor. La terapia génica in vivo se ha estudiado en varios modelos animales. En varias publicaciones recientes se ha informado de la posibilidad de dirigir la transferencia de genes in situ a órganos y tejidos tales como músculos, células madre hematopoyéticas, la pared arterial, el sistema nervioso y los pulmones. También se ha descrito que la inyección directa de ADN en la musculatura esquelética, el músculo cardíaco y la inyección de complejos de ADN-lípidos en la vasculatura permite obtener un nivel de expresión detectable de uno o más productos del gen insertado in vivo. El tratamiento de enfermedades del sistema nervioso central, por ejemplo, enfermedades genéticas hereditarias del cerebro, continúa siendo un problema intratable. Entre los ejemplos de las mismas se incluyen las enfermedades por almacenamiento lisosómico y la enfermedad de Alzheimer. Colectivamente, la incidencia de enfermedades por almacenamiento lisosómico (LSD, "Lysosomal Storage Diseases") es de 1 por cada 10.000 nacimientos en todo el mundo, y en el 65 % de los casos hay una implicación significativa del sistema nervioso central (SNC). En estos trastornos, las proteínas deficientes, cuando se administran por vía intravenosa, no atraviesan la barrera hematoencefálica o, cuando se administran directamente al cerebro, no se distribuyen de una manera amplia. Por tanto, es necesario desarrollar terapias para los déficits del SNC.

La Patente WO 2012/135857 A1 describe la utilización de partículas de rAAV2 para administrar una proteína terapéutica al cerebro de un mamífero. Más específicamente, la Patente WO 2012/135857 A1 describe la utilización de un vector rAAV2-TPP1 para el tratamiento de la enfermedad por almacenamiento lisosómico LINCL ("late infantile neuronal ceroid lipofucinosis", lipofuscinosis ceroide neuronal infantil tardía) en perros y primates no humanos, en el que el vector se administra mediante inyección intraventricular para transducir células ependimarias.

CARACTERÍSTICAS DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a una partícula de rAAV que comprende una proteína de la cápside de AAV y un vector que comprende un ácido nucleico que codifica un agente terapéutico insertado entre un par de repeticiones terminales invertidas de AAV y un agente de inmunosupresión, para su utilización en el tratamiento de una enfermedad en un mamífero, en la que la partícula de rAAV se administrará al ventrículo cerebral del mamífero de una manera eficaz para infectar células que están en contacto con el líquido cefalorraquídeo (LCR) del mamífero de modo que las células expresen el agente terapéutico, en la que la partícula de rAAV es una partícula de rAAV2, en la que el agente terapéutico es la proteasa tripeptidil peptidasa 1 (TPP1) lisosómica y la enfermedad es la lipofuscinosis ceroide infantil tardía (LINCL), en la que las células son células ependimarias y en la que el agente de inmunosupresión es un agente antiinflamatorio que se administrará al mamífero antes o después de la administración de la partícula de rAAV.

Realizaciones o aspectos que se encuentran fuera del alcance de las reivindicaciones se dan a conocer como divulgación.

Se da a conocer una partícula de rAAV que comprende una proteína de la cápside de AAV y un vector que comprende un ácido nucleico que codifica un agente terapéutico insertado entre un par de repeticiones terminales invertidas de AAV para su utilización en la administración de un agente terapéutico (por ejemplo, una proteína o un ácido nucleico) al sistema nervioso central de un mamífero, en la que la partícula de rAAV se administrará a la cisterna magna del mamífero de una manera eficaz para infectar células que están en contacto con el líquido cefalorraquídeo (LCR) del mamífero, de modo que las células expresen el agente terapéutico en el mamífero.

Se da a conocer una partícula de rAAV que comprende una proteína de la cápside de AAV y un vector que comprende un ácido nucleico que codifica un agente terapéutico (por ejemplo, un ácido nucleico terapéutico o un ácido nucleico que codifica una proteína) insertado entre un par de repeticiones terminales invertidas de AAV para su utilización en el tratamiento de una enfermedad en un mamífero, en la que la partícula de rAAV se administrará a la cisterna magna del mamífero de una manera eficaz para infectar células que están en contacto con el líquido cefalorraquídeo (LCR) en el mamífero, en la que la célula expresará el agente terapéuti

Según la presente invención, la partícula del AAV es una partícula de rAAV2. Tal como se utiliza en el presente documento, el término AAV2/1 se emplea para indicar una iTr de AAV2 y una cápside de AAV1, el término AAV2/2 es una ITR de AAV2 y una cápside de AAV², el término AAV2/4 es una ITR de AAV2 y una cápside de AAV4, etc. En determinadas realizaciones, la cápside de rAAV tiene, como mínimo, un 80 % de homología con la proteína VP1, VP2 y/o VP3 de la cápside de AAV2. En determinadas realizaciones, la cápside de rAAV2 tiene un 100 % de homología con VP1, VP2 y/o VP3 de la cápside de AAV2. En determinadas realizaciones, la cápside de rAAV tiene, como mínimo, un 80 % de homología con la proteína VP1, VP2 y/o VP3 de la cápside de AAV4. En determinadas realizaciones, la cápside de rAAV4 tiene un 100 % de homología con VP1, VP2 y/o VP3 de la cápside de AAV4. En determinadas realizaciones, la cápside de rAAV tiene, como mínimo, un 80 % de homología con la proteína VP1, VP2 y/o VP3 de la cápside de AAV9. En determinadas realizaciones, la cápside de rAAV9 tiene un 100 % de homología con VP1, VP2 y/o VP3 de la cápside de AAV9.

En determinadas realizaciones, la partícula de rAAV2 infecta la célula ependimaria no de roedor a razón de más de un 20 % que el índice de infectividad de AAV4, tal como a razón de más del 50 % o 100 %, 1.000 % o 2.000 % que el índice de infectividad de AAV4.

Según la presente invención, la célula expresa el agente terapéutico y secreta el agente terapéutico en el LCR. La célula es una célula ependimaria.

En determinadas realizaciones, el rAAV se administrará adicionalmente al ventrículo cerebral, al espacio subaracnoideo y/o al espacio intratecal del primate no humano.

Se da a conocer una partícula de AAV que contiene un vector que comprende un ácido nucleico insertado entre un par de repeticiones terminales invertidas de AAV para su utilización en la administración del ácido nucleico a una célula cerebral de un mamífero, en la que la partícula de rAAV se administrará a la célula cerebral, para de esa manera administrar el ácido nucleico a dicha célula cerebral. En determinadas realizaciones, el rAAV es una partícula de rAAV2 que infecta la célula cerebral a razón de más de un 20 % que el índice de infectividad de AAV4, tal como a razón de más del 50 % o 100 %, 1.000 % o 2.000 % que el índice de infectividad de AAV4.

Según la presente invención, la enfermedad es una enfermedad por almacenamiento lisosómico (LSD). La enfermedad es LINCL.

En determinadas realizaciones, el mamífero es un mamífero no roedor, tal como un primate, caballo, oveja, cabra, cerdo o perro. En determinadas realizaciones, el primate es un ser humano.

Según la presente invención, el agente terapéutico es una proteína.

El ácido nucleico codifica una hidrolasa lisosómica. El ácido nucleico codifica TPP1.

Según la presente invención, la partícula de rAAV2 se utiliza en combinación con un agente de inmunosupresión, en la que el agente de inmunosupresión es un agente antiinflamatorio que se administrará al mamífero antes o después de la administración de la partícula de rAAV.

En determinadas realizaciones, la partícula de rAAV se inyectará en 1-3 sitios en el cerebro, tal como en uno, dos o tres sitios en el cerebro.

DESCRIPCIÓN BREVE DE LAS FIGURAS

La figura 1A es una alineación de las proteínas AAV2 (SEQ ID NO: 1) y AAV4 (SEQ ID NO: 2) y la figura 1B es una alineación de los nucleótidos de AAV2 (SEQ ID NO: 3) y AAV4 (SEQ ID NO: 4) basada en las secuencias de AAV2 (NC_001401) y AAV4 (NC_001829).

La figura 2 muestra una ilustración de "corrección cruzada" entre células. Sands y Davidson, Mol Ther 13(5):839-849, 2006.

Figura 3. Arriba: tinción inmunohistoquímica para TPP1 humana después de la administración mediada por AAV2 en un modelo de LINCL en perros deficientes en TPP1 canina. Izquierda, perro tratado. Derecha, animal deficiente sin tratar. Compárese la tinción positiva fuerte de la izquierda con la tinción de fondo en el panel derecho. Abajo. Transferencia Western para TPP1 que muestra la presencia de la TPP1 humana en perros deficientes (LINCL) tratados. Ni los perros normales ni los deficientes muestran la presencia de la banda, ya que no expresan la TPP1 humana.

Figura 4A. Microfotografías que muestran la autofluorescencia representativa que ilustra la acumulación patológica de lipofuscina en las lipofuscinosis ceroides neuronales. Panel izquierdo, autofluorescencia en un perro con LINCL tratado con AAV2.TPP1. Panel derecho, autofluorescencia en un perro con LINCL de control sin tratar. Nótese la reducción de la autofluorescencia con la terapia.

Figura 4B. Imágenes de resonancia magnética de un perro con LINCL no tratado (arriba a la izquierda), un perro normal sin tratar (arriba a la derecha) y dos perros tratados con AAV.TPP1 (paneles inferiores). Los volúmenes de vector que se administraron se indican en la parte inferior izquierda de los paneles inferiores. El título viral fue de aproximadamente 1e13 genomas/ml.

Figura 4C. Reconstrucciones volumétricas de los ventrículos de los perros de las imágenes de 4B (paneles de la izquierda). El gráfico del panel de la derecha indica los volúmenes de las imágenes de los paneles de la izquierda. Nótese la gran reducción del volumen ventricular aún con estas bajas dosis de vector (se indica en la leyenda de la figura 4B).

Figura 4D. La tinción inmunohistoquímica en diversas regiones del cerebro muestra una amplia distribución de la proteína TPP1 después de la transferencia del gen AAV.TPP1 al sistema ventricular del perro con LINCL. Los paneles superiores son secciones coronales del atlas del cerebro del perro; los recuadros de la parte inferior derecha presentan la vista sagital de la imagen coronal. Las secciones teñidas inmunohistoquímicamente debajo de los paneles del atlas muestran la extensión de la tinción en secciones de esas regiones. En conjunto, los datos muestran una amplia distribución de la enzima.

Figura 5. La actividad de la enzima huTPP1 en el LCR después de administrar AAV.TPP1 disminuyó poco tiempo después de la transferencia del gen viral. Panel izquierdo: la actividad de la TPP1 en el LCR en los animales tratados Co y S supera los niveles de actividad normal muy poco tiempo después de la transferencia del gen AAV.TPP1 y luego desciende rápidamente a niveles indetectables. Los animales N, Po y Pi son perros normales o heterocigóticos y se muestran solo como referencia del intervalo de niveles de actividad de la TPP1 en perros clínicamente normales.

La figura 6 muestra los resultados del pretratamiento con micofenolato en la obtención de una actividad sostenida.

Figura 7. La introducción de micofenolato en el momento de la disminución de la actividad enzimática, o antes de la transferencia génica, mejora drásticamente la durabilidad de la expresión de la TPP1 en el perro luego de administrar AAV.TPP1 al epéndimo. Gráficos de arriba a la izquierda y derecha: actividad enzimática en función del tiempo. También se indica el momento en que se administró el micofenolato. Nótense los niveles altos y sostenidos después de la recuperación tras la pérdida de expresión en los animales SR y B, y los niveles extremadamente altos y sostenidos en el animal F. Por tanto, el pretratamiento con micofenolato en animales sin proteína recombinante contribuye a proporcionar una expresión génica sostenida en células cerebrales transducidas. Gráfico inferior: expansión del gráfico de arriba a la derecha para demostrar la presencia de enzima por encima de los niveles de fondo y cercana a los niveles normales o por encima de los mismos (0,1-0,4 pmol/mg).

Figura 8. La expresión enzimática sostenida en el LCR eleva los niveles intersticiales de la enzima. La actividad enzimática en diversas regiones del cerebro es mayor de lo normal.

Figuras 9A y 9B. La tinción inmunohistoquímica en diversas regiones del cerebro muestra una amplia distribución de la proteína TPP1 después de la transferencia del gen AAV.TPP1 al sistema ventricular del perro con LINCL. Los paneles representativos del atlas del cerebro del perro muestran la región del cerebro que se está evaluando, que también se representa mediante una línea. En conjunto, los datos muestran una amplia distribución de la enzima. Figura 10. La terapia génica con AAV.TPP1 retrasa la aparición de los fenotipos de la enfermedad (aparición de la primera línea roja a la izquierda frente a la primera línea azul a la izquierda) y la progresión de la enfermedad (la separación de las líneas rojas frente la separación de las líneas azules). En algunos perros casi se duplicó la esperanza de vida del animal, mientras que otros aún están en evaluación.

Figura 11. Los animales con secreción sostenida de la TPP1 ependimaria muestran evidencia de actividad enzimática en los órganos periféricos y la dura madre del cerebro. Para dos animales, BG y SR, hubo una actividad enzimática notable en la dura madre del cerebro y también en el hígado.

Figura 12. El enfoque que se utilizó para proporcionar un beneficio clínico al perro con LINCL se puede extrapolar a primates. Se administró una inyección intraventricular de AAV2.TPP1 (1,5 ml de 1e13 genomas de vector/ml) a macacos Rhesus y se midió la actividad de la TPP1 en el tronco encefálico (médula; gráfico de la izquierda) y el LCR (gráfico de la derecha) 3 meses después de la transferencia génica. Estos son monos normales con niveles normales de actividad de la TPP1 (intervalo indicado - Control). La actividad enzimática supera la de los monos normales en todos los animales excepto en uno. Evidencia de actividad de la TPP1 en los cerebros de mono 3 meses después de la transferencia génica utilizando tinción inmunohistoquímica contra la TPP1 humana recombinante expresada a partir del vector de AAV.

La figura 13 muestra el área vestibular (tronco encefálico) en los primates no humanos.

La figura 14 proporciona la secuencia de aminoácidos de la TPP1 humana.

La figura 15 proporciona la secuencia de ácido nucleico de la TPP1 humana.

La figura 16 proporciona la secuencia de aminoácidos de la TPP1 de Macaca mulatta.

La figura 17 proporciona la secuencia de aminoácidos de la TPP1 de Macaca fascicularis.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

La presente invención se refiere a una partícula de rAAV que comprende una proteína de la cápside de AAV y un vector que comprende un ácido nucleico que codifica un agente terapéutico insertado entre un par de repeticiones terminales invertidas de AAV y un agente de inmunosupresión, para su utilización en el tratamiento de una enfermedad en un mamífero, en la que la partícula de rAAV se administrará al ventrículo cerebral del mamífero de una manera eficaz para infectar células que están en contacto con el líquido cefalorraquídeo (LCR) del mamífero de modo que las células expresen al agente terapéutico, en la que la partícula de rAAV es una partícula de rAAV2, en la que el agente terapéutico es la proteasa tripeptidil peptidasa 1 (TPP1) lisosómica y la enfermedad es la lipofuscinosis ceroide infantil tardía (LINCL), en la que las células son células ependimarias y en la que el agente de inmunosupresión es un agente antiinflamatorio que se administrará al mamífero antes o después de la administración de la partícula de rAAV.

El virus adenoasociado (AAV, "adeno associated virus") es un virus no patógeno pequeño de la familia Parvoviridae. El AAV es distinto de los otros miembros de esta familia debido a su dependencia de un virus auxiliar para su replicación. En ausencia de un virus auxiliar, el AAV se puede integrar de una manera específica del locus en el brazo q del cromosoma 19. El genoma de aproximadamente 5 kb del AAV consiste en un segmento de ADN monocatenario de polaridad ya sea positiva o negativa. Los extremos del genoma son repeticiones terminales invertidas cortas que se pueden plegar como estructuras en horquilla y sirven como origen de replicación del ADN viral. Físicamente, el virión del parvovirus no tiene envoltura y su cápside icosaédrica es de aproximadamente 20 nm de diámetro.

Hasta la fecha, se han identificado numerosos AAV serológicamente distintos y se ha aislado más de una docena de humanos o primates. El genoma del AAV2 es de 4.680 nucleótidos de longitud y contiene dos marcos de lectura abiertos (ORF, "open reading frame"). El ORF izquierdo codifica las proteínas Rep no estructurales, Rep 40, Rep 52, Rep 68 y Rep 78, que están involucradas en la regulación de la replicación y transcripción además de la producción de genomas de progenie monocatenarios. Además, dos de las proteínas Rep se han asociado con la integración preferencial de los genomas de AAV en una región del brazo q del cromosoma 19 humano. También se ha demostrado que Rep68/78 posee actividad de unión a NTP, así como actividades de ADN y ARN helicasa. Las proteínas Rep poseen una señal de localización nuclear, así como varios sitios de fosforilación potenciales. Una mutación en uno de estos sitios cinasa dio como resultado la pérdida de la actividad de replicación.

Los extremos del genoma son repeticiones terminales invertidas (ITR, "inverted terminal repeats") cortas que tienen la posibilidad de plegarse como estructuras en horquilla con forma de T que sirven como origen de replicación del ADN viral. Se han descrito dos elementos dentro de la región de ITR que son fundamentales para la función de la ITR, un motivo de repetición GAGC y el sitio de resolución terminal (trs, "terminal resolution site"). Se ha demostrado que el motivo de repetición se une a Rep cuando la ITR se encuentra en una conformación ya sea lineal o en horquilla. Esta unión sirve para situar a Rep68/78 para escisión en el trs que tiene lugar de una manera específica del sitio y de la cadena. Además de su papel en la replicación, estos dos elementos parecen ser fundamentales para la integración viral. En el locus de integración del cromosoma 19 está contenido un sitio de unión a Rep con un trs adyacente. Se ha demostrado que estos elementos son funcionales y necesarios para una integración específica del locus.

El virión AAV es una partícula que no tiene envoltura, icosaédrica, de aproximadamente 25 nm de diámetro, y que consiste en tres proteínas relacionadas denominadas VP1, VP2 y VP3. El ORF derecho codifica las proteínas de la cápside VP1, VP2 y VP3. Estas proteínas se encuentran a una relación 1:1:10, respectivamente, y todas derivan del o Rf derecho. Las proteínas de la cápside difieren entre sí en la utilización de un corte y empalme alternativo y un codón de inicio poco común. El análisis de deleción ha mostrado que la eliminación o alteración de VP1 que se traduce a partir de un mensaje de corte y empalme alternativo da como resultado un rendimiento reducido de partículas infectantes. Las mutaciones en la región codificante de VP3 dan como resultado un fallo para producir cualquier ADN de progenie monocatenario o partículas infectantes. Una partícula de AAV es una partícula viral que comprende una proteína de la cápside de AAV. Un polipéptido de la cápside de AAV puede codificar los polipéptidos VP1, VP2 y VP3 completos. La partícula puede ser una partícula que comprende AAV2 y otras proteínas de la cápside de AAV (es decir, una proteína quimérica, tal como AAV4 y ^aAV2). En el presente documento se contemplan variaciones en la secuencia de aminoácidos de la proteína de la cápside de AAV2, siempre que la partícula viral resultante que comprende la cápside de AAV2 siga siendo antigénica o inmunológicamente distinta de AAV4, lo cual se puede determinar rutinariamente mediante procedimientos estándar. Específicamente, se pueden utilizar, por ejemplo, un ELISA y transferencias Western para determinar si una partícula viral es antigénica o inmunológicamente distinta de a AV4. Además, la partícula viral AAV2 preferentemente conserva un tropismo tisular distinto de AAV4.

Una partícula de AAV2 es una partícula viral que comprende una proteína de la cápside de AAV2. Un polipéptido de la cápside de AAV2 que codifica los polipéptidos VP1, VP2 y v P3 completos puede presentar, en general,, como mínimo, aproximadamente un 63 % de homología (o identidad) con el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos que se muestran en la SEQ ID NO: 1 (proteína de la cápside de AAV2). La proteína de la cápside puede tenert aproximadamente un 70 % de homología, aproximadamente un 75 % de homología, un 80 % de homología, un 85 % de homología, un 90 % de homología, un 95 % de homología, un 98 % de homología, un 99 % de homología o incluso un 100 % de homología con la proteína que se muestran en la SEQ ID NO: 1. La proteína de la cápside puede tener aproximadamente un 70 % de identidad, aproximadamente un 75 % de identidad, un 80 % de identidad, un 85 % de identidad, un 90 % de identidad, un 95 % de identidad, un 98 % de identidad, un 99 % de identidad o incluso un 100 % de identidad con la proteína que se muestra en la SEQ ID NO: 1. La partícula puede ser una partícula que comprende otra proteína de la cápside tanto de AAV4 como de AAV2, es decir, una proteína quimérica. En el presente documento se contemplan variaciones en la secuencia de aminoácidos de la proteína de la cápside de AAV2, siempre que la partícula viral resultante que comprende la cápside de AAV2 siga siendo antigénica o inmunológicamente distinta de AAV4, lo cual se puede determinar rutinariamente mediante procedimientos estándar. Específicamente, se pueden utilizar, por ejemplo, un ELISA y transferencias Western para determinar si una partícula viral es antigénica o inmunológicamente distinta de AAV4. Además, la partícula viral AAV2 preferentemente conserva un tropismo tisular distinto de AAV4, tal como se describe en los ejemplos en el presente documento, aunque una partícula quimérica de AAV2 que comprende, como mínimo, una proteína del recubrimiento de AAV2 puede tener un tropismo tisular diferente del de una partícula de AAV2 que solamente consiste en proteínas del recubrimiento de ^aA^v2.

Tal como se indica en las figuras 1A y 1B, la secuencia de la cápside de AAV2 y la secuencia de la cápside de AAV4 son aproximadamente un 60 % homólogas entre sí. En determinadas realizaciones, la cápside de AAV2 comprende (o consiste en) una secuencia que es, como mínimo, un 65 % homóloga a la secuencia de aminoácidos que se muestra en la S^eQ ID NO: 1.

Se da a conocer una partícula de AAV2 que contiene, es decir, que encapsula, un vector que comprende un par de repeticiones terminales invertidas de AAV2. La secuencia de nucleótidos de las ITR de AAV2 es conocida en la técnica. Además, la partícula puede ser una partícula que comprende una proteína de la cápside tanto de AAV4 como de AAV2, es decir, una proteína quimérica. Además, la partícula puede ser una partícula que encapsula un vector que comprende un par de repeticiones terminales invertidas de a Av de otros AAV (por ejemplo, AAV1-AAV9 y AAVrh10). El vector encapsulado en la partícula puede comprender además un ácido nucleico exógeno insertado entre las repeticiones terminales invertidas.

Las siguientes características de AAV lo convierten en un vector atractivo para la transferencia de genes. Se ha demostrado in vitro que los vectores de AAV se integran de manera estable en el genoma celular; poseen una amplia gama de huéspedes; transducen células que están en división y que no están en división in vitro e in vivo y mantienen niveles de expresión altos de los genes transducidos. Las partículas virales son estables al calor, resistentes a disolventes, detergentes, cambios en el pH, temperatura y se pueden concentrar sobre gradientes de CsCl o mediante otros medios. Se dan a conocer utilizaciones de partículas de AAV, de vectores de AAV recombinante y de viriones de AAV recombinante. Por ejemplo, una partícula de AAV2 es una partícula viral que comprende una proteína de la cápside de AAV2, o una partícula de AAV4 es una partícula viral que comprende una proteína de la cápside de AAV4. Un vector de AAV2 recombinante es una construcción de ácido nucleico que comprende, como mínimo, un ácido nucleico único de AAV2. Un virión de AAV2 recombinante es una partícula que contiene un vector de AAV2 recombinante. Para que se pueda considerar incluida en el término "ITR de AAV2", la secuencia de nucleótidos debe conservar una o ambas características descritas en el presente documento que diferencian a la ITR de AAV2 de la ITR de AAV4: (1) tres repeticiones "GAGC" (en lugar de cuatro como en AAV4) y (2) en el sitio de unión a Rep de la ITR de AAV2, el cuarto nucleótido en las primeras dos repeticiones "GAGC" es C en lugar de T.

El promotor que para impulsar la expresión de la proteína, o la secuencia que codifica otro agente que se administrará, puede ser cualquier promotor deseado, seleccionado teniendo en cuenta consideraciones conocidas, tales como el nivel de expresión de un ácido nucleico ligado funcionalmente al promotor y el tipo de célula en la cual se utilizará el vector. Los promotores pueden ser un promotor exógeno o endógeno. Los promotores pueden incluir, por ejemplo, promotores fuertes conocidos tales como SV40 o el promotor de metalotioneína inducible, o un promotor de AAV, tal como un promotor p5 de AAV. Otros ejemplos de promotores incluyen los promotores derivados de genes de actina, genes de inmunoglobulina, de citomegalovirus (CMV), adenovirus, virus del papiloma bovino, promotores adenovirales, tales como el promotor mayor tardío adenoviral, un promotor inducible por choque térmico, del virus respiratorio sincitial, del virus del sarcoma de Rous (RSV), etc.

El vector de AAV puede comprender además un ácido nucleico exógeno (heterólogo) ligado funcionalmente al promotor. Un "ácido nucleico heterólogo" significa que se puede insertar cualquier ácido nucleico heterólogo o exógeno en el vector para su transferencia a una célula, tejido u organismo. El ácido nucleico puede codificar, por ejemplo, un polipéptido o una proteína o un ARN antisentido. El término "ligado funcionalmente" significa que el promotor puede promover la expresión del ácido nucleico heterólogo, como es conocido en la técnica, tal como en una orientación apropiada del promotor con relación al ácido nucleico heterólogo. Además, el ácido nucleico heterólogo tiene, preferentemente, todas las secuencias apropiadas para la expresión del ácido nucleico, como es conocido en la técnica, para codificar funcionalmente, es decir, para permitir que el ácido nucleico se exprese. El ácido nucleico puede incluir, por ejemplo, secuencias de control de la expresión, tal como un potenciador y los sitios de procesamiento de información necesarios, tales como sitios de unión a ribosomas, sitios de corte y empalme de ARN, sitios de poliadenilación y secuencias terminadoras de la transcripción. El ácido nucleico puede codificar más de un producto génico, solo limitado por el tamaño del ácido nucleico que puede ser empaquetado.

El ácido nucleico heterólogo puede codificar proteínas beneficiosas que reemplazarán a las proteínas faltantes o defectuosas requeridas por el sujeto al cual será transferido el vector o puede codificar un polipéptido citotóxico que puede ser dirigido, por ejemplo, hacia células cancerosas u otras células cuya muerte sería beneficiosa para el sujeto. El ácido nucleico heterólogo también puede codificar ARN antisentido que se pueden unir a, y de esa manera inactivar, los ARNm producidos por el sujeto que codifican proteínas perjudiciales. En una realización, se pueden producir polinucleótidos antisentido a partir de un casete de expresión heterólogo en una construcción viral de AAV, donde el casete de expresión contiene una secuencia que promueve la expresión específica del tipo celular.

Entre los ejemplos de ácidos nucleicos heterólogos que se pueden administrar a una célula o sujeto como parte del vector de AAV de la presente invención se pueden incluir, pero sin limitarse a los mismos, los ácidos nucleicos que codifican agentes terapéuticos, tales como hidrolasas lisosómicas; factores de necrosis tumoral (TNF, "tumor necrosis factor"), tales como TNF-alfa; interferones, tales como interferón-alfa, interferón-beta e interferón-gamma; interleucinas, tales como IL-1, IL-1 beta e IL-2 a IL-14; GM-CSF; adenosina desaminasa; factores secretados tales como factores de crecimiento; canales iónicos; agentes quimioterapéuticos; proteínas lisosómicas; productos de genes antiapoptóticos; proteínas que promueven la supervivencia neural tales como receptores de glutamato y factores de crecimiento; factores de crecimiento celulares, tales como linfocinas; CD4 soluble; Factor VIII; Factor IX; receptores de linfocitos T; receptor de LDL; ApoE; ApoC; antitripsina alfa-1; ornitina transcarbamilasa (OTC); receptor transmembrana de fibrosis quística (CFTR); insulina; receptores Fc para los dominios de unión al antígeno de anticuerpos, tales como inmunoglobulinas; y secuencias antisentido que inhiben la replicación viral, tales como secuencias antisentido que inhiben la replicación del virus de la hepatitis B o de la hepatitis no A, no B. Además, el ácido nucleico puede codificar más de un producto génico, solo limitado por el tamaño del ácido nucleico que puede ser empaquetado.

Una partícula de AAV2 es una partícula viral que comprende una proteína de la cápside de AAV2. En el presente documento se contemplan variaciones en la secuencia de aminoácidos de la proteína de la cápside de AAV2, siempre que la partícula viral resultante que comprende la cápside de AAV2 siga siendo antigénica o inmunológicamente distinta de AAV4, como se puede determinar rutinariamente mediante procedimientos estándar. Específicamente, se puede utilizar, por ejemplo, un ELISA y transferencias Western para determinar si una partícula viral es antigénica o inmunológicamente distinta de otros serotipos de AAV.

El término "polipéptido", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un polímero de aminoácidos e incluye proteínas de longitud completa y fragmentos de las mismas. Por tanto, una "proteína" y un "polipéptido" a menudo se utilizan indistintamente en el presente documento. Las sustituciones se pueden seleccionar para que sean neutras mediante parámetros conocidos. Como podrán apreciar los expertos en la materia, la divulgación también incluye aquellos polipéptidos que tienen variaciones ligeras en las secuencias de aminoácidos u otras propiedades. Dichas variaciones pueden surgir de forma natural como variaciones alélicas (por ejemplo, debido a un polimorfismo genético) o se pueden producir mediante intervención humana (por ejemplo, mediante mutagénesis de secuencias de ADN clonadas), tales como mutantes inducidos puntuales, de deleción, e inserción y de sustitución. En general son preferentes cambios menores en la secuencia de aminoácidos, tales como reemplazos de aminoácidos conservadores, deleciones o inserciones internas pequeñas, y adiciones o deleciones en los extremos de las moléculas. Estas modificaciones pueden dar como resultado cambios en la secuencia de aminoácidos, proporcionar mutaciones silenciosas, modificar un sitio de restricción o proporcionar otras mutaciones específicas.

Se da a conocer una partícula de AAV que contiene un vector que comprende un ácido nucleico insertado entre un par de repeticiones terminales invertidas de AAV para su utilización en la administración del ácido nucleico a una célula, en la que la partícula de AAV se administrará a la célula, para de esa manera administrar el ácido nucleico a la célula. La administración a la célula se puede efectuar utilizando cualquier medio, incluyendo simplemente poner en contacto la partícula con las células, opcionalmente contenida en un líquido deseado, tal como un medio de cultivo tisular o una solución salina tamponada. Se puede dejar que la partícula permanezca en contacto con las células durante cualquier extensión de tiempo deseada, y típicamente la partícula se administra y se deja que permanezca indefinidamente. Para dichos procedimientos in vitro, el virus se puede administrar a la célula mediante procedimientos de transducción viral estándar, que son conocidos en la técnica y que se indican como ejemplo en el presente documento. Los títulos de virus a administrar pueden variar, en particular dependiendo del tipo de célula, pero típicamente serán los que se utilizan para la transducción de AAV en general. Adicionalmente, se pueden utilizar los títulos que se utilizan para transducir las células particulares en los presentes ejemplos. Las células pueden incluir cualquier célula deseada en seres humanos, así como otros mamíferos grandes (no roedores), tales como primates, caballos, ovejas, cabras, cerdos y perros.

Más específicamente, se da a conocer una partícula de AAV que contiene un vector que comprende un ácido nucleico insertado entre un par de repeticiones terminales invertidas de AAV para su utilización en la administración del ácido nucleico a una célula en contacto con el LCR circulante, tal como una célula ependimaria, una célula de la piamadre, una célula de las meninges, una célula del endotelio cerebral, en la que la partícula de AAV se administrará a la célula, para de esa manera administrar el ácido nucleico a la célula.

Se da a conocer además una partícula de AAV que comprende un ácido nucleico insertado entre un par de repeticiones terminales invertidas de AAV para su utilización en la administración del ácido nucleico a una célula en un sujeto, en la que la partícula de AAV se administrará al sujeto, para de esa manera administrar el ácido nucleico a una célula en el sujeto.

También se da a conocer una partícula de AAV que comprende un ácido nucleico insertado entre un par de repeticiones terminales invertidas de AAV para su utilización en la administración del ácido nucleico a una célula ependimaria, de la piamadre u otra célula de las meninges en un sujeto, en la que la partícula de AAV se administrará al sujeto, para de esa manera administrar el ácido nucleico a la célula ependimaria, de la piamadre u otra célula de las meninges en el sujeto.

Según la presente invención, se utiliza una partícula de rAAV2 que comprende una proteína de la cápside de AAV y un vector que comprende un ácido nucleico que codifica el agente terapéutico TPP1 insertado entre un par de repeticiones terminales invertidas de AAV, en combinación con un agente de inmunosupresión para tratar la enfermedad por almacenamiento lisosómico LINCL en un mamífero, en la que la partícula de rAAV se administrará al ventrículo cerebral del mamífero de una manera eficaz para infectar células ependimarias que están en contacto con el líquido cefalorraquídeo (LCR) del mamífero de modo que las células expresen TPP1, en la que el agente de inmunosupresión es un agente antiinflamatorio que se administrará al mamífero antes o después de la administración de la partícula de rAAV.

En determinadas realizaciones, la secuencia de aminoácidos dirigida al endotelio vascular del cerebro es dirigida al endotelio vascular del cerebro de un sujeto que padece una enfermedad, por ejemplo, una enfermedad por almacenamiento lisosómico.

En determinadas realizaciones, la secuencia de aminoácidos dirigida al endotelio vascular del cerebro es dirigida al endotelio vascular del cerebro de un sujeto que no padece una enfermedad por almacenamiento lisosómico.

En determinadas realizaciones, el vector viral comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un agente terapéutico. En determinadas realizaciones, el agente terapéutico es TPP1.

Se da a conocer una célula que comprende un vector viral tal como se describe en el presente documento.

Se da a conocer un vector viral o la célula tal como se describe en el presente documento para su utilización en el tratamiento de una enfermedad en un mamífero, en el que el vector viral o la célula se administrará al mamífero. En determinadas realizaciones, el mamífero es un ser humano.

En determinadas realizaciones, la enfermedad es una enfermedad por almacenamiento lisosómico (LSD). En determinadas realizaciones, la LSD es una lipofuscinosis ceroide infantil o infantil tardía, Gaucher, Batten juvenil, Fabry, MLD, Sanfilippo A, Batten infantil tardío, Hunter, Krabbe, Morquio, Pompe, Niemann-Pick C, Tay-Sachs, Hurler (MPS-I H), Sanfilippo B, Maroteaux-Lamy, Niemann-Pick A, cistinosis, Hurler-Scheie (MPS-1H/S), síndrome de Sly (MPS VII), Scheie (MPS-I S), Batten infantil, gangliosidosis GM1, mucolipidosis tipo M/MI o enfermedad de Sandhoff.

En determinadas realizaciones, la enfermedad es una enfermedad neurodegenerativa. En determinadas realizaciones, la enfermedad neurodegenerativa es la enfermedad de Alzheimer, ALS, hemiplejia espástica hereditaria, esclerosis lateral primaria, atrofia muscular espinal, enfermedad de Kennedy, una enfermedad por repeticiones de poliglutamina o la enfermedad de Parkinson.

Se da a conocer un vector viral descrito en el presente documento para su utilización en la administración de un agente al sistema nervioso central de un sujeto, en el que el vector viral se administrará al LCR de modo que las células ependimarias, de la piamadre, endoteliales y/u otras células de las meninges transducidas expresen el agente terapéutico y administren el agente al sistema nervioso central del sujeto. En determinadas realizaciones, el vector viral transduce células ependimarias, de la piamadre, endoteliales y/u otras células de las meninges.

Se da a conocer un vector o una célula viral descritos en el presente documento para su utilización en tratamientos médicos.

Se da a conocer una utilización de un vector viral o una célula, tal como se describen en el presente documento, para preparar un medicamento útil para tratar una enfermedad, por ejemplo, una enfermedad por almacenamiento lisosómico, en un mamífero.

El vector puede comprender además una enzima lisosómica (por ejemplo, una hidrolasa lisosómica), una proteína secretada, una proteína nuclear o una proteína citoplasmática. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "proteína secretada" incluye cualquier proteína secretada, ya sea secretada de forma natural o modificada para contener una secuencia señal, de modo que pueda ser secretada.

Se da a conocer una utilización de un vector viral o una célula, tal como se describen en el presente documento, para preparar un medicamento útil para tratar una enfermedad, por ejemplo, la enfermedad de Alzheimer, en un mamífero.

El vector puede comprender además una isoforma de la proteína ApoE protectora. Tal como se utiliza en el presente documento, el término “isoforma de ApoE protectora” se utiliza para distinguir las isoformas de ApoE que disminuyen el riesgo de enfermedad de Alzheimer en, como mínimo, un 5 %, tal como un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 % o más.

En determinadas realizaciones, la isoforma de ApoE protectora tiene, como mínimo, aproximadamente un 80 % de homología con ApoE e2. En determinadas realizaciones, la isoforma de ApoE protectora presenta un 100 % de homología con ApoE e2.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "proteína secretada" incluye cualquier proteína secretada, ya sea secretada de forma natural o modificada para contener una secuencia señal de modo que pueda ser secretada. Un ácido nucleico está “ligado operativamente” cuando se encuentra en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. En general, “ligado operativamente” significa que las secuencias de ADN que están siendo ligadas son contiguas. Sin embargo, no es necesario que los potenciadores sean contiguos. La unión se logra mediante ligación en sitios de restricción convenientes. Si dichos sitios no existen, se utilizan adaptadores o ligadores de oligonucleótidos sintéticos según la práctica convencional. Adicionalmente, se pueden unir entre sí múltiples copias del ácido nucleico que codifica las enzimas en el vector de expresión. Dichos múltiples ácidos nucleicos pueden estar separados por ligadores.

La presente divulgación también da a conocer una célula de mamífero que contiene un vector descrito en el presente documento. La célula puede ser humana y puede ser de cerebro. El tipo de célula puede comprender una población de células madre o progenitoras.

Se da a conocer un polinucleótido, un polipéptido, un vector de expresión o una célula descritos en el presente documento para su utilización en el tratamiento de una enfermedad, tal como una enfermedad genética o cáncer en un mamífero, en el que se administrará dicho polinucleótido, polipéptido, vector de expresión o célula. La enfermedad genética o el cáncer puede ser una enfermedad por almacenamiento lisosómico (LSD), tal como una lipofuscinosis ceroide infantil o infantil tardía, Gaucher, Batten juvenil, Fabry, MLD, Sanfilippo A, Batten infantil tardío, Hunter, Krabbe, Morquio, Pompe, Niemann-Pick C, Tay-Sachs, Hurler (MPS-I H), Sanfilippo B, Maroteaux-Lamy, Niemann-Pick A, cistinosis, Hurler-Scheie (MPS-I H/S), síndrome de Sly (MPS VII), Scheie (MpS-I S), Batten infantil, gangliosidosis GM1, mucolipidosis tipo II/III o la enfermedad de Sandhoff.

La enfermedad genética puede ser una enfermedad neurodegenerativa, tal como la enfermedad de Huntington, ALS, hemiplejia espástica hereditaria, esclerosis lateral primaria, atrofia muscular espinal, enfermedad de Kennedy, enfermedad de Alzheimer, una enfermedad por repeticiones de poliglutamina o exposición focal tal como la enfermedad de Parkinson.

Se dan a conocer polinucleótidos, polipéptidos, vectores y células modificadas genéticamente (modificadas in vivo), y la utilización de los mismos. En particular, la divulgación se refiere a su utilización en una terapia génica o de proteínas que permita una administración sistémica de una dosis terapéuticamente eficaz del agente terapéutico. Se da a conocer un sistema de expresión celular para expresar un agente terapéutico en un mamífero receptor. El sistema de expresión (también denominado "célula modificada genéticamente" en el presente documento) comprende una célula y un vector de expresión para expresar el agente terapéutico. Los vectores de expresión incluyen, pero sin limitarse a los mismos, virus, plásmidos y otros vehículos para administrar material genético heterólogo a células. Por consiguiente, el término "vector de expresión", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un vehículo para administrar material genético heterólogo a una célula. En particular, el vector de expresión es un vector adenoviral, un vector de un virus adenoasociado o de un lentivirus o de un retrovirus recombinante.

El vector de expresión incluye además un promotor para controlar la transcripción del gen heterólogo. El promotor puede ser un promotor inducible (descrito más adelante). El sistema de expresión es adecuado para su administración al mamífero receptor. El sistema de expresión puede comprender una pluralidad de células modificadas genéticamente no inmortalizadas, conteniendo cada célula, como mínimo, un gen recombinante que codifica, como mínimo, un agente terapéutico.

El sistema de expresión celular se forma in vivo. Se da a conocer un vector de expresión para expresar un producto génico heterólogo para su utilización en el tratamiento de un mamífero receptor in vivo, en el que dicho vector de expresión se introducirá en una célula del paciente in situ, tal como por medio de una administración intravenosa. Para formar el sistema de expresión in vivo, se introducirá un vector de expresión para expresar el agente terapéutico in vivo en el mamífero receptor por vía i.v., donde el vector migra a través de la vasculatura al cerebro. Se da a conocer una proteína diana para su utilización en el tratamiento de un mamífero receptor in vivo, en la que dicha proteína diana se introducirá en el paciente in vivo.

El vector de expresión para expresar el gen heterólogo puede incluir un promotor inducible para controlar la transcripción del producto génico heterólogo. Por consiguiente, la administración del agente terapéutico in situ está controlada por la exposición de la célula in situ a condiciones que inducen la transcripción del gen heterólogo.

El mamífero receptor puede padecer una afección que es susceptible a una terapia de reemplazo génico. Tal como se utiliza en el presente documento, una "terapia de reemplazo génico" se refiere a la administración al receptor del material genético exógeno que codifica un agente terapéutico y la subsiguiente expresión del material genético administrado in situ. Por tanto, la frase "afección susceptible a una terapia de reemplazo génico" abarca afecciones tales como enfermedades genéticas (es decir, una afección de enfermedad que sea atribuible a uno o más defectos génicos), patologías adquiridas (es decir, una afección patológica que no es atribuible a un defecto congénito), cánceres y procesos profilácticos (es decir, prevención de una enfermedad o de una afección médica no deseada). Por consiguiente, tal como se utiliza en el presente documento, el término "agente terapéutico" se refiere a cualquier agente o material, que tiene un efecto beneficioso en el mamífero receptor. Por tanto, un "agente terapéutico" abarca moléculas tanto terapéuticas como profilácticas que comprenden componentes de ácidos nucleicos o de proteínas. Según una realización, el mamífero receptor tiene una enfermedad genética y el material genético exógeno comprende un gen heterólogo que codifica un agente terapéuti

el mamífero receptor tiene una patología adquirida y el material genético exógeno comprende un gen heterólogo que codifica un agente terapéuti

material genético exógeno comprende un gen heterólogo que codifica un agente antineoplásico. En aún otra realización, el paciente padece una afección médica indeseada y el material genético exógeno comprende un gen heterólogo que codifica un agente terapéuti

Tal como se utilizan en el presente documento, los términos “una isoforma de ApoE protectora”, “enzima lisosómica”, una “proteína secretada”, una “proteína nuclear” o una “proteína citoplasmática” incluyen variantes o fragmentos biológicamente activos o inactivos de estos polipéptidos. Una "variante" de uno de los polipéptidos es un polipéptido que no es completamente idéntico a una proteína nativa. Dicha variante de proteína se puede obtener mediante alteración de la secuencia de aminoácidos por inserción, deleción o sustitución de uno o más aminoácidos. La secuencia de aminoácidos de la proteína se modifica, por ejemplo, mediante sustitución, para crear un polipéptido que tenga sustancialmente las mismas cualidades, o mejoradas, en comparación con el polipéptido nativo. La sustitución puede ser una sustitución conservada. Una "sustitución conservada” es una sustitución de un aminoácido por otro aminoácido que tenga una cadena lateral similar. Una sustitución conservada sería una sustitución por un aminoácido que provoque el menor cambio posible en la carga del aminoácido o en el tamaño de la cadena lateral del aminoácido (como alternativa, del tamaño, carga o tipo de grupo químico en la cadena lateral) de modo que el péptido en general conserve su conformación espacial, pero tenga una actividad biológica alterada. Por ejemplo, los cambios conservados comunes podrían ser Asp por Glu, Asn o Gln; His por Lys, Arg o Phe; Asn por Gln, Asp o Glu y Ser por Cys, Thr o Gly. Habitualmente se utiliza alanina para la sustitución por otros aminoácidos. Los 20 aminoácidos esenciales se pueden agrupar de la siguiente manera: alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, triptofano y metionina que tienen cadenas laterales no polares; glicina, serina, treonina, cistina, tirosina, asparagina y glutamina que tienen cadenas laterales polares sin carga; aspartato y glutamato que tienen cadenas laterales ácidas; y lisina, arginina e histidina que tienen cadenas laterales básicas.

Los cambios de aminoácidos se logran cambiando los codones de la secuencia de ácido nucleico correspondiente. Se sabe que dichos polipéptidos se pueden obtener basándose en la sustitución de determinados aminoácidos por otros aminoácidos en la estructura polipeptídica con el fin de modificar o mejorar la actividad biológica. Por ejemplo, la sustitución de aminoácidos alternativos permite conferir pequeños cambios conformacionales a un polipéptido, lo cual dará como resultado una mayor actividad. Como alternativa, se pueden utilizar sustituciones de aminoácidos de algunos polipéptidos para proporcionar residuos que luego se pueden unir a otras moléculas para proporcionar conjugados de péptido-molécula que conserven suficientes propiedades del polipéptido de partida como para que sean útiles para otros fines.

Se puede utilizar el índice hidropático de aminoácidos para conferir una función biológica interactiva a un polipéptido, en el que se descubrió que determinados aminoácidos pueden ser sustituidos por otros aminoácidos que tienen índices hidropáticos similares y aún conservar una actividad biológica similar. Como alternativa, la sustitución de aminoácidos similares se puede efectuar basándose en la hidrofilicidad, en particular cuando la función biológica deseada en el polipéptido a generar será para su utilización en realizaciones inmunológicas. La mayor hidrofilicidad promedio local de una "proteína", gobernada por la hidrofilicidad de sus aminoácidos adyacentes, se correlaciona con su inmunogenicidad. Por consiguiente, las sustituciones se pueden efectuar basándose en la hidrofilicidad asignada a cada aminoácido.

Ya sea si se utiliza el índice de hidrofilicidad o el índice hidropático, que asigna valores a cada aminoácido, se prefiere realizar sustituciones de aminoácidos donde estos valores sean de ±2, siendo particularmente preferente ±1 y siendo aquellos con ±0,5 las sustituciones los más preferentes.

La variante de proteína tiene, como mínimo, un 50 %, como mínimo, aproximadamente un 80 % o aún, como mínimo, aproximadamente un 90 % pero menos de un 100 %, de homología o identidad de secuencias de aminoácidos contiguas con la secuencia de aminoácidos de una proteína nativa correspondiente.

La secuencia de aminoácidos de la variante de polipéptido corresponde esencialmente a la secuencia de aminoácidos del polipéptido nativo. Tal como se utiliza en el presente documento, "corresponde esencialmente a" se refiere a una secuencia de polipéptido que generará una respuesta biológica que es sustancialmente la misma que la respuesta generada por la proteína nativa. Dicha respuesta puede ser, como mínimo, un 60 % del nivel generado por la proteína nativa, y puede ser incluso, como mínimo, un 80 % del nivel generado por la proteína nativa.

Una variante puede incluir residuos de aminoácidos que no están presentes en la correspondiente proteína nativa, o puede incluir deleciones con respecto a la correspondiente proteína nativa. Una variante también puede ser un "fragmento" que está truncado en comparación con la correspondiente proteína nativa, es decir, solamente una porción de una proteína de longitud completa. Las variantes de proteínas también incluyen péptidos que contengan, como mínimo, un D-aminoácido.

La variante de proteína se puede expresar a partir de una secuencia de ADN aislada que codifica la variante de proteína. El término "recombinante" se define como un péptido o ácido nucleico producido mediante procesos de ingeniería genética. Cabe destacar que es bien conocido en la técnica que, debido a la redundancia del código genético, se pueden intercambiar fácilmente nucleótidos individuales en un codón y aún obtener como resultado una secuencia de aminoácidos idéntica.

Se da a conocer un vector de expresión para su utilización en el tratamiento de una enfermedad en un mamífero, en el que dicho vector de expresión será administrado a una célula o a un paciente. Para la utilización en terapia génica, un experto en la materia de la biología molecular y la terapia génica podrá determinar, sin una experimentación excesiva, las dosificaciones y vías de administración apropiadas del vector de expresión que se utilizará.

Según una realización, las células serán transformadas o modificadas genéticamente de otra manera in vivo. Las células del mamífero receptor se transformarán (es decir, se transducirán o transfectarán) in vivo con un vector que contiene material genético exógeno para expresar un gen heterólogo (por ejemplo, recombinante) que codifica un agente terapéutico y el agente terapéutico se administra in situ.

Tal como se utiliza en el presente documento, "material genético exógeno" se refiere a un ácido nucleico o un oligonucleótido, ya sea natural o sintético, que no se encuentra de forma natural en las células; o, si se encuentra de forma natural en las células, no es transcrito o expresado a niveles biológicamente significativos por las células. Por tanto, "material genético exógeno" incluye, por ejemplo, un ácido nucleico no natural que se puede transcribir en ARN antisentido, así como un "gen heterólogo" (es decir, un gen que codifica una proteína que no se expresa o se expresa a niveles que no son biológicamente significativos en una célula natural del mismo tipo).

En determinadas realizaciones, el mamífero receptor padece una afección que es susceptible a terapia de reemplazo génico. Tal como se utiliza en el presente documento, una "terapia de reemplazo génico" se refiere a la administración al receptor de material genético exógeno que codifica un agente terapéutico y la subsiguiente expresión del material genético administrado in situ. Por tanto, la frase "afección susceptible a terapia de reemplazo génico" abarca afecciones tales como enfermedades genéticas (es decir, una afección de enfermedad que sea atribuible a uno o más defectos genéticos), patologías adquiridas (es decir, una afección patológica que no es atribuible a un defecto congénito), cánceres y procesos profilácticos (es decir, prevención de una enfermedad o de una afección médica no deseada). Por consiguiente, tal como se utiliza en el presente documento, el término "agente terapéutico" se refiere a cualquier agente o material, que tiene un efecto beneficioso en el mamífero receptor. Por tanto, un "agente terapéutico" abarca moléculas tanto terapéuticas como profilácticas que comprenden dicho ácido nucleico (por ejemplo, un ARN antisentido) y/o componentes proteicos.

Como alternativa, la afección susceptible a una terapia de reemplazo génico es un proceso profiláctico, es decir, un proceso para prevenir una enfermedad o una afección médica no deseada. Por tanto, la presente divulgación abarca un sistema de expresión celular para administrar un agente terapéutico que cumple una función profiláctica (es decir, un agente profiláctico) al mamífero receptor.

En resumen, el término "agente terapéutico" incluye, pero sin limitarse a los mismos, los agentes asociados con las afecciones enumeradas anteriormente, así como sus equivalentes funcionales. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "equivalente funcional" se refiere a una molécula (por ejemplo, un péptido o una proteína) que tiene el mismo efecto beneficioso, o uno mejorado, en el mamífero receptor que el agente terapéutico del que es considerado un equivalente funcional.

Los agentes terapéuticos y las afecciones susceptibles a terapia de reemplazo génico dados a conocer anteriormente son meramente ilustrativos y no pretenden limitar el alcance de la presente divulgación. La selección de un agente terapéutico adecuado para tratar una afección conocida se considera dentro del alcance de un experto en la materia sin una experimentación excesiva.

Vectores de AAV

En una realización, un vector viral de la divulgación es un vector de AAV. Un vector de "AAV" se refiere a un virus adenoasociado y se puede referir al propio virus de tipo silvestre natural o a derivados del mismo. El término abarca todos los subtipos, serotipos y pseudotipos, y formas tanto naturales como recombinantes, excepto cuando se requiera lo contrario. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "serotipo" se refiere a un AAV que se identifica y distingue de otros AAV basándose en la reactividad de la proteína de la cápside con antisueros definidos, por ejemplo, hay ocho serotipos conocidos de los AAV de primate, los AAV-1 a AAV-9 y AAVrh10. Por ejemplo, el serotipo AAV2 se utiliza para referirse a un AAV que contiene proteínas de la cápside codificados por el gen cap del ^aAV2 y un genoma que contiene secuencias ITR 5' y 3' del mismo serotipo de AAV2. Tal como se utiliza en el presente documento, por ejemplo, se puede utilizar rAAV1 para referirse a un AAV que comprende proteínas de la cápside e ITR 5'-3' del mismo serotipo o puede referirse a un AAV que tiene proteínas de la cápside de un serotipo e ITR 5'-3' de un serotipo de AAV diferente, por ejemplo, la cápside del serotipo 2 del AAV y las ITR del serotipo 5 del AAV. En cada ejemplo ilustrado en el presente documento, la descripción del diseño y la producción del vector describe el serotipo de la cápside y las secuencias ITR 5’-3’. La abreviatura "rAAV" se refiere a un virus adenoasociado recombinante, también conocido como vector de AAV recombinante (o "vector de rAAV").

Un "virus AAV" o una "partícula viral de AAV" se refiere a una partícula viral compuesta por, como mínimo, una proteína de la cápside de AAV (preferentemente por todas las proteínas de la cápside de un AAV de tipo silvestre) y un polinucleótido encapsulado. Si la partícula comprende un polinucleótido heterólogo (es decir, un polinucleótido distinto de un genoma de AAV de tipo silvestre, tal como un transgén, que será administrado a una célula de mamífero), típicamente se denomina "rAAV".

Según la presente invención, se utiliza una partícula de rAAV2 que comprende una proteína de la cápside de AAV y un vector que comprende un ácido nucleico que codifica TPP1 insertado entre un par de repeticiones terminales invertidas de AAV. La partícula de rAAV2 se utiliza en combinación con un agente de inmunosupresión, en el que dicho agente de inmunosupresión es un agente antiinflamatorio que será administrado al mamífero antes o después de la administración de la partícula de rAAV.

En una realización, los vectores de expresión de AAV se construyen utilizando técnicas conocidas para proporcionar, como mínimo, como componentes ligados operativamente en la dirección de la transcripción, elementos de control que incluyen una región de inicio de la transcripción, el ADN de interés y una región de terminación de la transcripción. Los elementos de control se seleccionan para ser funcionales en una célula de mamífero. La construcción resultante que contiene a los componentes ligados operativamente está flanqueada (5' y 3') por secuencias de ITR de AAV funcionales.

Las "repeticiones terminales invertidas de virus adenoasociado" o "ITR de AAV" son las regiones conocidas en la técnica que se encuentran en cada extremo del genoma del AAV que funcionan juntas en cis como orígenes de la replicación de ADN y como señales de empaquetamiento para el virus. Las ITR de AAV, junto con la región codificante de rep de AAV, proporcionan una escisión y un rescate eficientes y la integración de una secuencia de nucleótidos interpuesta entre dos ITR flanqueadoras en el genoma de una célula de mamífero.

Las secuencias de nucleótidos de las regiones ITR de AAV son conocidas. Tal como se utiliza en el presente documento, no es necesario que una "ITR de AAV" tenga la secuencia de nucleótidos de tipo silvestre que se muestra, sino que puede estar alterada, por ejemplo, por inserción, deleción o sustitución de nucleótidos. Adicionalmente, la ITR de AAV se puede derivar de cualquiera de varios serotipos de AAV, incluyendo, sin limitación, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV7, etc. Además, las ITR 5' y 3' que flanquean una secuencia de nucleótidos seleccionada en un vector de AAV no tienen por qué ser necesariamente idénticas ni derivadas del mismo serotipo o aislado de AAV, siempre que funcionen como se desea, es decir, que permitan la escisión y el rescate de la secuencia de interés de un genoma o vector de la célula huésped, y que permitan la integración de la secuencia heteróloga en el genoma de la célula receptora cuando están presentes en la célula los productos del gen Rep de AAV.

En una realización, las ITR de AAV se pueden derivar de cualquiera de varios serotipos de AAV, incluyendo, sin limitación, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV7, etc. Además, no es necesario que las ITR 5' y 3' que flanquean una determinada secuencia de nucleótidos en un vector de expresión de AAV sean idénticas o que se deriven del mismo serotipo o aislado de AAV, siempre que funcionen como se desea, es decir, que permitan la escisión y el rescate de la secuencia de interés de un genoma o vector de la célula huésped, y que permitan integración de la molécula de ADN en el genoma de la célula receptora cuando están presentes en la célula los productos del gen Rep de AAV.

En una realización, las cápsides de AAV pueden derivar de AAV2. El tamaño de las moléculas de ADN adecuadas para su utilización en los vectores A^aV será menor de aproximadamente 5 kilobases (kb), menor de aproximadamente 4,5 kb, menor de aproximadamente 4 kb, menor de aproximadamente 3,5 kb, menor de aproximadamente 3 kb, menor de aproximadamente 2,5 kb y son conocidas en la técnica.

En una realización, la secuencia de nucleótidos seleccionada está ligada operativamente a elementos de control que dirigen la transcripción o expresión de la misma en el sujeto in vivo. Dichos elementos de control pueden comprender secuencias de control normalmente asociadas con el gen seleccionado. Como alternativa, se pueden emplear secuencias de control heterólogas. Generalmente, las secuencias de control heterólogas útiles incluyen aquellas derivadas de secuencias que codifican genes de mamífero o virales. Entre los ejemplos se incluyen, pero sin limitarse a los mismos, el promotor SV40 temprano, el promotor LTR del virus de tumor mamario de ratón; el promotor tardío mayor de adenovirus (Ad MLP); un promotor del virus del herpes simple (HSV), un promotor de citomegalovirus (CMV) tal como la región del promotor temprano inmediato del CMV (CMVIE), un promotor del virus del sarcoma de Rous (RSV), promotores pol II, promotores pol III, promotores sintéticos, promotores híbridos y similares. Además, en el presente documento también son útiles las secuencias derivadas de genes no virales, tales como el gen de la metalotioneína murina. Dichas secuencias promotoras están disponibles en el mercado, por ejemplo, de Stratagene (San Diego, California).

En una realización, serán particularmente útiles tanto los promotores heterólogos como otros elementos de control, tales como los promotores del específicos del SNC e inducibles, potenciadores y similares. Entre los ejemplos de promotores heterólogos se incluyen el promotor de CMV. Entre los ejemplos de promotores específicos del SNC se incluyen aquellos aislados de los genes de la proteína básica de mielina (MBP), la proteína ácida fibrilar de la glía (GFAP) y la enolasa específica de neuronas (NSE). Algunos ejemplos de promotores inducibles incluyen elementos sensibles a ADN para ecdisona, tetraciclina, hipoxia y aufina.

En una realización, el vector de expresión de AAV que alberga la molécula de ADN de interés unida por las ITR de AAV, se puede construir por inserción directa de la o las secuencias seleccionadas en un genoma de AAV del que se escindieron los principales marcos de lectura abiertos ("ORF") del AAV. También se pueden suprimir otras porciones del genoma de AAV, siempre que quede una porción de las ITR suficiente para poder realizar las funciones de replicación y empaquetamiento. Dichas construcciones se pueden diseñar utilizando técnicas conocidas en la técnica.

Como alternativa, las ITR de AAV se pueden escindir del genoma viral o de un vector de AAV que las contenga y se pueden fusionar en 5' y 3' de una construcción de ácido nucleico seleccionada que está presente en otro vector utilizando técnicas estándar de ligación. Por ejemplo, las ligaciones se pueden llevar a cabo en Tris-Cl 20 mM a pH 7,5, MgCl²10 mM, DTT 10 mM, BSA 33 |xg/ml, NaCl 10 mM-50 mM y ya sea ATP 40 uM, 0,01-0,02 unidades (Weiss) de T4 ADN ligasa a 0 °C (para una ligación de "extremos adhesivos") o bien, ATP 1 mM, 0,3-0,6 unidades (Weiss) de T4 ADN ligasa a 14 °C (para una ligación de "extremos romos"). Las ligaciones intermoleculares de "extremos adhesivos" habitualmente se realizan a concentraciones de 30-100 |xg/ml de ADN total (concentración total final de 5-100 nM). Vectores de AAV que contienen ITR.

Adicionalmente, se pueden producir de forma sintética genes quiméricos para que incluyan secuencias de ITR de AAV dispuestas en 5' y 3' de una o más secuencias de ácido nucleico seleccionadas. Para la expresión de la secuencia del gen quimérico en células del SNC de mamífero se pueden utilizar codones preferentes. La secuencia quimérica completa se ensambla a partir de oligonucleótidos superpuestos que se preparan mediante procedimientos estándar.

Para producir viriones de rAAV, se introduce un vector de expresión de AAV en una célula huésped adecuada utilizando técnicas conocidas, tal como por transfección. Hay un gran número de técnicas de transfección conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York. Algunos procedimientos de transfección particularmente adecuados incluyen coprecipitación con fosfato de calcio, microinyección directa en las células cultivadas, electroporación, transferencia de genes mediada por liposomas, transducción mediada por lípidos y administración de ácidos nucleicos utilizando microproyectiles de alta velocidad.

En una realización, las células huésped adecuadas para producir viriones de rAAV incluyen microorganismos, células de levadura, células de insecto y células de mamífero, que se pueden utilizar o que se han utilizado como receptores de una molécula de ADN heteróloga. El término incluye la progenie de la célula original que ha sido transfectada. Por tanto, tal como se utiliza en el presente documento, una "célula huésped" por lo general se refiere a una célula que ha sido transfectada con una secuencia de ADN exógena. En la práctica de la presente divulgación se pueden utilizar células de la línea celular humana estable, 293 (que se puede obtener, por ejemplo, de la American Type Culture Collection con el N° de registro ATCC CRL1573). En particular, la línea celular humana 293 es una línea celular de riñón embrionario humano que ha sido transformada con fragmentos de ADN de adenovirus tipo 5 y expresa los genes adenovirales E1a y E1b. La línea celular 293 se puede transfectar fácilmente, y proporciona una plataforma particularmente conveniente en la que producir los viriones de rAAV.

Por "Región codificante de rep de AAV" se entiende la región reconocida en la técnica del genoma de AAV que codifica las proteínas de replicación Rep 78, Rep 68, Rep 52 y Rep 40. Se ha demostrado que estos productos de expresión de Rep poseen muchas funciones, que incluyen el reconocimiento, la unión y el corte de una cadena del origen de la replicación del ADN de AAV, actividad de ADN helicasa y modulación de la transcripción de los promotores de AAV (u otros heterólogos). Los productos de expresión de Rep son necesarios en conjunto para la replicación del genoma de AAV. Los homólogos adecuados de la región codificante de rep de AAV incluyen el gen rep del herpesvirus humano 6 (HHV-6) que también se sabe que interviene en la replicación del ADN de ^aA^v-2.

Por "región codificante de cap de AAV" se entiende la región reconocida en la técnica del genoma de AAV que codifica las proteínas de la cápside VP1, VP2 y VP3, u homólogos funcionales de las mismas. Estos productos de expresión de Cap proveen las funciones de empaquetamiento que, en conjunto, son necesarias para empaquetar el genoma viral.

En una realización, en la célula huésped se introducen funciones auxiliares de AAV por transfección de la célula huésped con una construcción auxiliar de AAV ya sea antes de la transfección del vector de expresión de AAV o de manera concurrente con la misma. Las construcciones auxiliares de AAV se utilizan entonces para proporcionar una expresión, como mínimo, transitoria de los genes rep y/o cap de AAV para complementar las funciones que le faltan al AAV y que son necesarias para una infección productiva por AAV. Las construcciones auxiliares de AAV carecen de las ⁱT^rde AAV y tampoco se pueden replicar ni empaquetar a sí mismas. Estas construcciones pueden estar en forma de un plásmido, fago, transposón, cósmido, virus o virión. Se han descrito numerosas construcciones auxiliares de AAV, tales como los plásmidos de utilización común, pAAV/Ad y pIM29+45, que codifican los productos de expresión tanto de Rep como de Cap. Se han descrito numerosos vectores adicionales que codifican los productos de expresión de Rep y/o Cap.

Los procedimientos de administración de los vectores virales incluyen la inyección del AAV2 en el LCR. En general, los viriones de rAAV se pueden introducir en las células del SNC utilizando técnicas de transducción ya sea in vivo o in vitro. Si se transducen in vitro, se retirará del sujeto la célula receptora deseada, se transducirá con los viriones de rAAV y se volverá a introducir en el sujeto. Como alternativa, se pueden utilizar células singénicas o xenogénicas porque dichas células no generarán en el sujeto una respuesta inmunológica inapropiada.

Se han descrito procedimientos adecuados para la administración e introducción de las células transducidas en un sujeto. Por ejemplo, las células se pueden transducir in vitro mediante combinación de los viriones de AAV recombinantes con células del SNC, por ejemplo, en un medio apropiado, y se pueden seleccionar aquellas células que alojen el ADN de interés utilizando técnicas convencionales, tales como transferencias Southern y/o PCR, o utilizando marcadores seleccionables. A continuación, las células transducidas se pueden formular como composiciones farmacéuticas, que se describen de manera más detallada más adelante, y la composición se puede introducir en el sujeto mediante diversas técnicas, tales como mediante injertos, inyección intramuscular, intravenosa, subcutánea e intraperitoneal.

En una realización, las composiciones farmacéuticas comprenderán suficiente material genético para producir una cantidad terapéuticamente eficaz del ácido nucleico de interés, es decir, una cantidad suficiente para reducir o aliviar los síntomas del estado de enfermedad en cuestión o una cantidad suficiente para conferir el beneficio deseado. Las composiciones farmacéuticas también contendrán un excipiente farmacéuticamente aceptable. Dichos excipientes incluyen cualquier agente farmacéutico que no induzca por sí mismo la producción de anticuerpos perjudiciales para el individuo que recibe la composición, y que se pueden administrar sin causar una toxicidad indebida. Los excipientes farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a los mismos, sorbitol, Tween80 y líquidos tales como agua, solución salina, glicerol y etanol. En los mismos se pueden incluir sales farmacéuticamente aceptables, por ejemplo, sales de ácidos minerales tales como clorhidratos, bromhidratos, fosfatos, sulfatos y similares; y sales de ácidos orgánicos tales como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos y similares.

Adicionalmente, en dichos vehículos también puede estar presentes sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, sustancias amortiguadoras del pH y similares. Un análisis detallado de los excipientes farmacéuticamente aceptables está disponible en Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., N.J. 1991).

Se entenderá que el vector viral administrado podría expresar más de un transgén. Como alternativa, también se pueden administrar al SNC vectores separados, donde cada uno expresa uno o más transgenes diferentes, tal como se describe en el presente documento. Además, también se pretende que los vectores virales administrados mediante los procedimientos de la presente divulgación se combinen con otras composiciones y terapias adecuadas.

En vista de las enseñanzas de la presente memoria descriptiva, para los expertos en la materia, será evidente que la cantidad eficaz del vector viral que se debe añadir se puede determinar empíricamente. La administración se puede realizar en una sola dosis, de manera continua o intermitente durante el transcurso del tratamiento. Los procedimientos para determinar la manera y las dosis de administración más efectivas son bien conocidos por los expertos en la materia y variarán dependiendo del vector viral, de la composición de la terapia, de las células diana y del sujeto sometido a tratamiento. Utilizando el nivel de dosis y el patrón que haya seleccionado el médico tratante se pueden llevar a cabo administraciones simples y múltiples.

En determinadas realizaciones, el rAAV se administra a una dosis de aproximadamente 1-5 ml de 1x105-1x1016 gv/ml. En determinadas realizaciones, el rAAV se administra a una dosis de aproximadamente 1-3 ml de 1x107-1x1014 gv/ml. En determinadas realizaciones, el rAAV se administra a una dosis de aproximadamente 1-2 ml de 1x108-1x1013 gv/ml.

Las formulaciones que contienen las partículas de rAAV contendrán una cantidad eficaz de partículas de rAAV en un vehículo, siendo la cantidad eficaz determinada fácilmente por un experto en la materia. Las partículas de rAAV típicamente pueden variar entre aproximadamente el 1 % y aproximadamente el 95 % (p/p) de la composición, o incluso más o menos de ser apropiado. La cantidad a administrar depende de factores tales como la edad, el peso y el estado físico del animal o del sujeto humano considerado para el tratamiento. Las dosis efectivas pueden ser establecidas por un experto en la materia mediante ensayos de rutina que establecen curvas de respuesta a la dosis. El sujeto se trata mediante la administración de partículas de rAAV en una o más dosis. De ser necesario para mantener una actividad enzimática apropiada, se pueden administrar múltiples dosis.

Con la presente invención se pueden emplear vehículos que incluyen agua, solución salina acuosa, LCR artificial u otras sustancias conocidas. Para preparar una formulación, se puede aislar, liofilizar y estabilizar la composición purificada. A continuación, la composición se puede ajustar a una concentración apropiada, opcionalmente se puede combinar con un agente antiinflamatorio y se puede envasar para su utilización.

Proteína TPP1

Según la presente invención, el ácido nucleico que está comprendido por el vector de la partícula de rAAV2 codifica TPP1.

En determinadas realizaciones, el ácido nucleico a administrar codifica TPP1, una TPP1 que tiene una identidad sustancial con la TPP1 de tipo silvestre y/o una variante, mutante o fragmento de TPP1. En la figura 14 se proporciona la secuencia de aminoácidos de TPP1 humana, y en la figura 15 se proporciona la secuencia de ácido nucleico. La figura 16 proporciona la secuencia de aminoácidos de TPP1 de Macaca mulatta y la figura 17 proporciona la secuencia de aminoácidos de TPP1 de Macaca fascicularis. En determinadas realizaciones, la proteína TPP1 puede tener aproximadamente un 70 % de homología, aproximadamente un 75 % de homología, un 80 % de homología, un 85 % de homología, un 90 % de homología, un 95 % de homología, un 98 % de homología, un 99 % de homología o incluso un 100 % de homología con la proteína que se expone en las figuras 14, 16 o 17. La proteína TPP1 puede tener aproximadamente un 70 % de identidad, aproximadamente un 75 % de identidad, un 80 % de identidad, un 85 % de identidad, un 90 % de identidad, un 95 % de identidad, un 98 % de identidad, un 99 % de identidad o incluso un 100 % de identidad con la proteína que se expone en las figuras 14, 16 o 17.

Una proteína mutante se refiere a la proteína codificada por un gen que tiene una mutación, por ejemplo, una mutación de sentido erróneo o sin sentido en TPP1. El término "ácido nucleico” se refiere a desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos y a polímeros de los mismos, ya sea en forma monocatenaria o bocatenaria, compuestos por monómeros (nucleótidos) que contienen un azúcar, fosfato y una base que puede ser una purina o pirimidina. A no ser que se lo limite específicamente, el término abarca ácidos nucleicos que contienen análogos conocidos de nucleótidos naturales, que tienen propiedades de unión similares a las del ácido nucleico de referencia y que son metabolizados de una manera similar a los nucleótidos naturales. A no ser que se indique otra cosa, una secuencia de ácido nucleico particular también abarca las variantes modificadas de manera conservadora (por ejemplo, sustituciones de codones degenerados) y secuencias complementarias, así como la secuencia que se indica explícitamente. Específicamente, las sustituciones de codones degenerados se pueden conseguir generando secuencias en las que la tercera posición de uno o más (o todos los) codones seleccionados se sustituye por residuos de bases mixtas y/o de desoxiinosina.

Un "fragmento de ácido nucleico” es una porción de una molécula de ácido nucleico dada. El ácido desoxirribonucleico (ADN) es el material genético en la mayoría de los organismos, mientras que el ácido ribonucleico (ARN) está implicado en la transferencia de la información contenida en el ADN a proteínas. La presente divulgación también abarca fragmentos y variantes de las secuencias de nucleótidos dadas a conocer y proteínas o proteínas de longitud parcial codificadas por las mismas. Por "fragmento" o "porción" se entiende una longitud completa o menos de la longitud completa de la secuencia de nucleótidos que codifica, o la secuencia de aminoácidos de, un polipéptido o una proteína. En determinadas realizaciones, el fragmento o porción es biológicamente funcional (es decir, conserva el 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % o 100 % de actividad enzimática de la TPP1 de tipo silvestre).

Una "variante" de una molécula es una secuencia que es sustancialmente similar a la secuencia de la molécula nativa. Para las secuencias de nucleótidos, las variantes incluyen a aquellas secuencias que, debido a la degeneración del código genético, codifican la secuencia de aminoácidos idéntica de la proteína nativa. Las variantes alélicas naturales tales como estas se pueden identificar utilizando técnicas de biología molecular, como, por ejemplo, con técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y de hibridación. Las secuencias de nucleótidos variantes también incluyen secuencias de nucleótidos derivadas por síntesis, tales como las que se generan, por ejemplo, utilizando mutagénesis dirigida al sitio, que codifican la proteína nativa, así como aquellas que codifican un polipéptido que tiene sustituciones de aminoácidos. Generalmente, las variantes de secuencia de nucleótidos de la divulgación tendrán, como mínimo, del 40 %, 50 %, 60 %, al 70 %, por ejemplo, del 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, al 79 %, generalmente, como mínimo, el 80 %, por ejemplo, el 81 %-84 %,, como mínimo, el 85 %, por ejemplo, del 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, al 98 % de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos nativa (endógena). En determinadas realizaciones, la variante es biológicamente funcional (es decir, conserva el 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % o 100 % de actividad enzimática de la TPP1 de tipo silvestre).

"Variaciones modificadas de manera conservadora" de una secuencia de ácido nucleico particular se refiere a aquellas secuencias de ácido nucleico que codifican secuencias de aminoácidos idénticas o esencialmente idénticas. Debido a la degeneración del código genético, una gran cantidad de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifican cualquier péptido dado. Por ejemplo, todos los codones, CGT, CGC, CGA, CGG, AGA y AGG codifican el aminoácido arginina. Por tanto, en cada posición donde un codón especifica una arginina, dicho codón se puede alterar a cualquiera de los correspondientes codones descritos sin alterar la proteína codificada. Dichas variaciones de ácido nucleico son “variaciones silenciosas” que son una especie de "variaciones modificadas de manera conservadora". Cada secuencia de ácido nucleico descrita en el presente documento que codifica un polipéptido también describe todas las posibles variaciones silenciosas, excepto donde se indique otra cosa. Un experto en la materia reconocerá que cada codón de un ácido nucleico (excepto ATG, que normalmente es el único codón para la metionina) se puede modificar mediante técnicas estándar para producir una molécula funcionalmente idéntica. Por lo tanto, cada "variación silenciosa" de un ácido nucleico que codifica un polipéptido está implícita en cada secuencia descrita.

El término "identidad sustancial" de secuencias de polinucleótidos significa que un polinucleótido comprende una secuencia que tiene, como mínimo, un 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 % o 79 %, o, como mínimo, un 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 % u 89 %, o, como mínimo, un 90 %, 91 %, 92 %, 93 % o 94 %, o incluso, como mínimo, un 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia, en comparación con una secuencia de referencia, utilizando uno de los programas de alineación descritos, con parámetros estándar. Un experto en la materia reconocerá que es posible ajustar apropiadamente estos valores para determinar la identidad correspondiente de proteínas codificadas por dos secuencias de nucleótidos tomando en consideración la degeneración de los codones, la similitud de los aminoácidos, la localización del marco de lectura, y similares. La identidad sustancial de las secuencias de aminoácidos para estos fines normalmente significa una identidad de secuencia de, como mínimo, un 70 %, como mínimo, un 80 %, 90 % o incluso, como mínimo, un 95 %.

En el contexto de un péptido, el término "identidad sustancial" indica que un péptido comprende una secuencia con, como mínimo, un 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 % o 79 %, o un 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 % u 89 %, o, como mínimo, un 90 %, 91 %, 92 %, 93 % o 94 %, o incluso un 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de referencia en una ventana de comparación específica. Una indicación de que dos secuencias de péptidos son sustancialmente idénticas es que un péptido es inmunológicamente rectivo con anticuerpos generados contra el segundo péptido. Por tanto, un péptido es sustancialmente idéntico a un segundo péptido, por ejemplo, cuando los dos péptidos difieren solamente en una sustitución conservadora.

Apolipoproteína E (ApoE)

Existen varias isoformas de apolipoproteína E humana (ApoE) diferentes, la presencia de algunas de estas isoformas en el cerebro aumenta el riesgo de padecer el enfermedad de Alzheimer (AD, "Alzheimer’s disease'), mientras que la presencia de otras isoformas disminuye el riesgo de padecer AD. La presencia de la isoforma e4 de ApoE es un factor de riesgo genético importante para AD esporádica de aparición tardía. (Casellano et al., Sci Transl Med, 3 (89): 89ra57 (29 de junio de 2011). El alelo e4 de ApoE aumenta fuertemente el riesgo de padecer AD y disminuye la edad de aparición. Por otro lado, la presencia del alelo e2 de ApoE parece reducir el riesgo de padecer AD. Se sugiere que las isoformas de ApoE humana afectan de manera diferencial la depuración o síntesis de amiloide-p (Ap) in vivo.

En determinadas realizaciones, el ácido nucleico que está siendo administrado codifica ApoE, una ApoE que tiene identidad sustancial con la ApoE de tipo silvestre, o una variante, mutante y/o fragmento de ApoE. En determinadas realizaciones, el ácido nucleico codifica e2 de ApoE, una e2 de ApoE que tiene identidad sustancial con e2 de ApoE de tipo silvestre, y/o una variante, mutante o fragmento de e2 de ApoE.

Agentes de inmunosupresión

Según la presente invención, al mamífero también se le administrará un agente de inmunosupresión. El agente de inmunosupresión es un agente antiinflamatorio. En determinadas realizaciones, el agente antiinflamatorio es micofenolato. Según la presente invención, el agente antiinflamatorio se debe administrar antes de la administración de las partículas de rAAV o después de la administración de las partículas de rAAV.

En determinadas realizaciones, el agente antiinflamatorio se debe administrar por vía parenteral, tal como mediante inyección intramuscular o subcutánea en un vehículo apropiado. Sin embargo, también son aceptables otros modos de administración, tales como administración oral, intranasal o intradérmica.

Procedimientos para introducir material genético en células

El material genético exógeno (por ejemplo, un ADNc que codifica una o más proteínas terapéuticas) se introduce in vivo en la célula utilizando procedimientos de transferencia génica, tales como transfección o transducción, para proporcionar una célula modificada genéticamente. Un experto en la materia conoce diversos vectores de expresión (es decir, vehículos para facilitar la administración de un material genético exógeno a una célula diana).

Tal como se utiliza en el presente documento, "transfección de células" se refiere a la adquisición de material genético nuevo por una célula, mediante la incorporación del ADN añadido. Por tanto, transfección se refiere a la inserción de ácido nucleico en una célula utilizando procedimientos físicos o químicos. Los expertos en la materia conocen varias técnicas de transfección que incluyen: coprecipitación de ADN con fosfato de calcio; DEAE-dextrano; electroporación; transfección mediada por liposomas catiónicos; y bombardeo de micropartículas facilitado por partículas de tungsteno. Otro procedimiento de transfección posible es la coprecipitación de ADN con fosfato de estroncio.

Por el contrario, la "transducción de células" se refiere al proceso de transferir ácido nucleico a una célula utilizando un virus de ADN o ARN. En el presente documento un virus de ARN (es decir, un retrovirus) para transferir un ácido nucleico a una célula se denomina retrovirus quimérico transductor. El material genético exógeno contenido dentro del retrovirus se incorpora al genoma de la célula transducida. Una célula que ha sido transducida con un virus de ADN quimérico (por ejemplo, un adenovirus que comprende ADNc que codifica un agente terapéutico), no tendrá el material genético exógeno incorporado en su genoma, pero será capaz de expresar el material genético exógeno que esté retenido extracromosómicamente dentro de la célula.

Típicamente, el material genético exógeno incluye el gen heterólogo (habitualmente en forma de un ADNc que comprende los exones que codifican la proteína terapéutica) junto con un promotor para controlar la transcripción del nuevo gen. De manera característica, el promotor tiene una secuencia de nucleótidos específica necesaria para iniciar la transcripción. Opcionalmente, el material genético exógeno incluye además secuencias adicionales (es decir, potenciadores) que son necesarias para obtener la actividad de transcripción génica deseada. Para los fines de la presente descripción, un "potenciador" es simplemente cualquier secuencia de ADN no traducida que funciona en una posición contigua a la de la secuencia codificante (en cis) para cambiar el nivel de transcripción basal regido por el promotor. El material genético exógeno se puede introducir en el genoma de la célula inmediatamente en 3’ con respecto al promotor, de modo que el promotor y la secuencia codificante queden ligados operativamente para permitir la transcripción de la secuencia codificante. Un vector de expresión retroviral puede incluir un elemento promotor exógeno para controlar la transcripción del gen exógeno insertado. Dichos promotores exógenos incluyen promotores tanto constitutivos como inducibles.

Los promotores constitutivos naturales controlan la expresión de las funciones celulares esenciales. Como resultado, un gen bajo el control de un promotor constitutivo se expresa en todas las condiciones del crecimiento celular. Los ejemplos de promotores constitutivos incluyen a los promotores para los siguientes genes que codifican determinadas funciones constitutivas o "de mantenimiento": hipoxantina fosforribosil transferasa (HPRT), dihidrofolato reductasa (DHFR), adenosina desaminasa, fosfoglicerol cinasa (PGK), piruvato cinasa, fosfoglicerato mutasa, el promotor de actina y otros promotores constitutivos conocidos por los expertos en la materia. Además, en las células eucariotas muchos promotores virales funcionan de manera constitutiva. Estos incluyen: los promotores de SV40 temprano y tardío; las repeticiones terminales largas (LTR, "long terminal repeat") del virus de la leucemia de Moloney y otros retrovirus; y el promotor de la timidina cinasa del virus del herpes simple, entre muchos otros. Por consiguiente, cualquiera de los promotores constitutivos mencionados anteriormente se puede utilizar para controlar la transcripción de un inserto de un gen heterólogo.

Los genes que están bajo el control de promotores inducibles se expresan solamente o lo hacen en mayor medida, en presencia de un agente inductor, (por ejemplo, la transcripción bajo el control del promotor de metalotioneína está muy aumentada en presencia de determinados iones de metales). Los promotores inducibles incluyen elementos sensibles (RE, "responsive element") que estimulan la transcripción cuando se unen a sus factores inductores. Por ejemplo, existen RE para factores séricos, hormonas esferoides, ácido retinoico y AMP cíclico. Se pueden seleccionar promotores que contienen un RE particular para obtener una respuesta inducible y, en algunos casos, el propio RE puede estar unido a un promotor diferente, lo que confiere inducibilidad al gen recombinante. Por tanto, al seleccionar el promotor apropiado (constitutivo frente a inducible; fuerte frente a débil), es posible controlar tanto la existencia como el nivel de expresión de un agente terapéutico en la célula modificada genéticamente. Si el gen que codifica el agente terapéutico está bajo el control de un promotor inducible, la administración in situ del agente terapéutico es desencadenada por la exposición de la célula modificada genéticamente in situ a condiciones que permitirán la transcripción del agente terapéutico, por ejemplo, por inyección intraperitoneal de inductores específicos de los promotores inducibles que controlan la transcripción del agente. Por ejemplo, la expresión in situ por células modificadas genéticamente de un agente terapéutico codificado por un gen bajo el control del promotor de metalotioneína, se potencia al poner en contacto in situ a las células modificadas genéticamente con una solución que contiene los iones de metal apropiados (es decir, inductores).

Por consiguiente, la cantidad de agente terapéutico que se administra in situ está regulada por el control de factores tales como: (1) la naturaleza del promotor que se utiliza para dirigir la transcripción del gen insertado, (es decir, si el promotor es constitutivo o inducible, fuerte o débil); (2) la cantidad de copias del gen exógeno que se inserta en la célula; (3) la cantidad de células transducidas/transfectadas que se deben administrar (por ejemplo, que se implantar) en el paciente; (4) el tamaño del implante (por ejemplo, si es un injerto o un sistema de expresión encapsulado); (5) la cantidad de implantes; (6) el lapso de tiempo que se dejarán en el lugar las células transducidass/transfectadas o los implantes; y (7) el índice de producción del agente terapéutico por la célula modificada genéticamente. Se considera que la selección y optimización de estos factores para la administración de una dosis terapéuticamente eficaz de un agente terapéutico particular están dentro del alcance de un experto en la materia sin demasiada experimentación, al tomar en consideración los factores dados a conocer anteriormente y el perfil clínico del paciente.

Además de, como mínimo, un promotor y, como mínimo, un ácido nucleico heterólogo que codifica el agente terapéutico, el vector de expresión puede incluir un gen de selección, por ejemplo, un gen de resistencia a neomicina, para facilitar la selección de células que hayan sido transfectadas o transducidas con el vector de expresión. Como alternativa, las células se transfectan con dos o más vectores de expresión, , como mínimo, un vector que contiene el o los genes que codifican el o los agentes terapéuticos, y el otro vector que contiene un gen de selección. La selección de un promotor, potenciador, gen de selección y/o secuencia señal (se describen más adelante) adecuados se considera dentro del alcance de un experto en la materia sin demasiada experimentación. El agente terapéutico se puede dirigir para administrarlo a una ubicación extracelular, intracelular o de membrana. Si es deseable secretar el producto génico de las células, el vector de expresión se diseña para incluir una secuencia "señal" de secreción apropiada para secretar el producto génico terapéutico desde la célula hacia el medio extracelular. Si es deseable retener el producto génico dentro de la célula, esta secuencia señal de secreción se omite. De forma similar, se puede construir el vector de expresión de manera para incluir secuencias señal de "retención” para anclar al agente terapéutico en el interior de la membrana plasmática. Por ejemplo, todas las proteínas de membrana tienen regiones transmembrana hidrófobas, que detienen la translocación de la proteína en la membrana y no permiten la secreción de la proteína. La construcción de un vector de expresión que incluya secuencias señal para dirigir un producto génico hacia una ubicación particular se considera dentro del alcance de un experto en la materia sin necesidad de demasiada experimentación.

Ejemplo 1

Procedimientos de transferencia de genes en grandes mamíferos

Los trastornos por almacenamiento lisosómico (LSD) constituyen una amplia clase de trastornos metabólicos hereditarios. La mayoría de los LSD son causados por deficiencias de enzimas lisosómicas que conducen a daños en órganos y frecuentemente a la degeneración del sistema nervioso central (SNC). La lipofuscinosis ceroide neuronal infantil tardía (LINCL) es una enfermedad neurodegenerativa autosómica recesiva causada por mutaciones en un gen 2 de lipofuscinosis ceroide neuronal (CLN “Ceroid-Lipofuscinosis Neuronal’), CLN2, que codifica la proteasa lisosómica tripeptidil peptidasa 1 (TPP1). La LINCL se caracteriza clínicamente por un nacimiento normal y un desarrollo temprano, la aparición de convulsiones a los 18-24 meses, deterioro motor y cognitivo progresivo y muerte prematura. La enfermedad se debe a una deficiencia de la TPP1, que es una enzima lisosómica soluble decorada con M-6-P.

Actualmente hay una terapia de reemplazo enzimático (ERT, “Enzyme-Replacement Therapy’) disponible para las enfermedades por almacenamiento lisosómico que afectan a los tejidos periféricos, pero no se han utilizado en pacientes con implicación del sistema nervioso central (SNC). En un estudio reciente se investigó si la administración de la enzima a través del líquido cefalorraquídeo era una vía alternativa potencial al SNC para la LINCL (Chang et al., Molecular Therapy 16: 649-656, 2008). Los ratones tratados mostraron una atenuación de la neuropatología y una reducción del temblor en reposo con relación a los ratones tratados con vehículo.

En el presente trabajo, se investigó si la administración global de un vector se podría realizar de manera efectiva para obtener niveles de enzima en estado de equilibrio en el líquido cefalorraquídeo (LCR) mediante inyección en el cerebro. Los estudios se realizaron en un modelo de LINCL en perro. Los perros con LIⁿC^lson normales al nacer, pero desarrollan signos neurológicos aproximadamente a los 7 meses, déficits cognitivos comprobables a los ~5-6 meses, convulsiones a los 10-11 meses y una pérdida visual progresiva. La mutación del gen CLN2 en el perro con LINCL hace que la proteína TPP1 no sea funcional y la proteína TPP1 es indetectable. Con la progresión de la enfermedad, los tejidos cerebrales se encogen, haciendo que se agranden los espacios ventriculares del cerebro. Los síntomas neurológicos incluyen deterioro del equilibrio y de las funciones motoras, pérdida de visión, temblores. Los cachorros con LINCL afectados recibieron terapia génica a los tres meses de edad. Para la terapia génica, se generó AAV2-CLN2 (véase la Patente WO 2012/135857) y se inyectó en el cerebro en un solo sitio (ventrículo lateral) o en dos sitios (ventrículo lateral más cisterna magna). Se colocaron agujas en el ventrículo, o en el ventrículo y en la cisterna magna, y se infundió el vector lentamente durante el transcurso de varios minutos. Si bien gran parte de la TPP1 producida en el interior de una célula permaneció en esa célula, una parte fue secretada y absorbida por las células vecinas. Esta propiedad de secreción y captación se denomina "corrección cruzada" (figura 2). La corrección cruzada es valiosa en el contexto de la terapia génica, ya que, si el gen CLN2 se transfiere a células situadas estratégicamente en el cerebro con LINCL, esto puede permitir la corrección cruzada de muchas células circundantes.

En el presente estudio, para el problema de administrar globalmente el vector terapéutico se aprovechó el flujo de LCR en el cerebro dirigiéndose hacia las células que recubren los ventrículos y las células que forman las meninges. Se inyectó AAV2-CLN2 en el cerebro en un solo sitio (ventrículo lateral) o en dos sitios (ventrículo lateral más cisterna magna). Después de la administración de AAV se observó expresión de la TPP1 en perros Cin2-/' (figura 3). Se observó un impacto positivo significativo sobre el volumen ventricular. También se evaluó el efecto de AAV.TPP1 sobre la autofluorescencia (figura 4A). La figura 4B muestra imágenes de T1-MRI de perros tratados y sin tratar. La figura 4C muestra los efectos de AAV.TPP1 en perros con LINCL. La figura 4D muestra la distribución de huTPP1 luego de la administración de AAV2/2-huCLN2.

En los perros afectados sin tratar, los espacios ventriculares se agrandan hasta diez veces el tamaño que tenían en los perros normales, mientras que la terapia génica con AAV2-CLN2 redujo significativamente este efecto. Además, se observó una amplia distribución de la enzima, al igual que un beneficio clínico (esperanza de vida y examen clínico). Sin tratamiento, los perros afectados muestran signos de enfermedad en las 22 pruebas a las 30 semanas de edad. Los perros alcanzan la etapa terminal de la enfermedad y deben ser sacrificados entre las 45 y 48 semanas de edad. En los perros que recibieron terapia génica con AAV2-CLN2 se retrasó o previno la aparición de cada uno de estos signos.

Se observó un aumento en la actividad de la TPP1 en el LCR después de la administración combinada en la cisterna y ventricular.

Por tanto, en el perro con LINCL, la transferencia del gen AAV2-CLN2 dio como resultado la restitución de la proteína TPP1 en muchas áreas del cerebro, y los resultados indicaron que la transferencia del gen AAV2-CLN2 proporcionó efectos terapéuticos significativos, redujo o retrasó los síntomas y mejoró la calidad de vida de los perros con LINCL.

La actividad de huTPP1 en el LCR se redujo poco tiempo después de la inyección (figura 5). Se observó una amplia distribución de la enzima, pero los niveles fueron bajos en el momento del sacrificio, 6-8 meses después de la terapia génica. Se postuló que la disminución de la actividad fue el resultado de una respuesta inmunológica a la enzima humana en los perros. Para inhibir la disminución de la actividad, se introdujo un agente antiinflamatorio (micofenolato). Los resultados indicaron que el agente antiinflamatorio no inhibió la actividad enzimática de la huTPP1 y fue eficaz para prolongar el tiempo que estuvo presente la actividad enzimática (figura 6), y se observaron niveles sostenidos de actividad enzimática.

Se observó una alta actividad de caTPP1 en el LCR durante el transcurso del tiempo después de la inyección intraventricular de AAV2caCLN2 y el tratamiento temprano con micofenolato (figura 7).

En muchos tejidos se observó un aumento en la actividad de la enzima TPP1, dos meses después de la administración (figura 8, 9A y 9B).

La figura 10 muestra la aparición de signos clínicos en perros con LINCL. Se observó actividad de caTPP1 en meninges y tejido periférico, por ejemplo, en el hígado (figura 11).

Por tanto, los inventores demostraron la transformación de células ependimarias por AAV2/2, que se produjo la enzima TPP1 canina y que esta fluyó con el LCR, y que el tratamiento con micofenolato mediante la inyección de caCLN2 pro rot puede prevenir la respuesta inmunológica en perros.

Ejemplo 2

Estudios en primates no humanos

Utilizando técnicas similares a las descritas anteriormente, los inventores observaron que AAVeGFP transdujo el epéndimo en los cerebros de primates no humanos. La evaluación in vivo de la administración de AAV2/2.TPP1 en el cerebro de monos Rhesus se realizó inyectando AAV.TPP1 en el ventrículo o la cisterna magna, recolectando el tejido 4-12 semanas después y evaluando la actividad de la TPP1 en el LCR o en lisados de tejidos (figura 12). En los primates no humanos se observó actividad en el área vestibular (tronco encefálico) (figura 13). Por tanto, las células del revestimiento ventricular suministraron una fuente de enzima recombinante para una amplia distribución en el SNC.

Se debe interpretar que la utilización de los términos “un” y “una” y “el”, “la”, “los” y “las” y de referentes similares en el contexto de descripción de la presente invención es para cubrir tanto el singular como el plural, a no ser que en el presente documento se indique otra cosa o que el contexto lo contradiga claramente. A no ser que se indique otra cosa, los términos, "que comprende", "que tiene", "que incluye" y "que contiene" se deben interpretar como términos abiertos (es decir, que significan "que incluye, pero sin limitarse a"). En el presente documento, la mención de intervalos de valores sirve solo como un procedimiento abreviado para hacer referencia individualmente a cada valor del interior del intervalo por separado, a no ser que en el presente documento se indique otra cosa, y cada valor separado se incorpora a la memoria descriptiva como si en el presente documento se lo mencionase individualmente. Todos los procedimientos que se describen en el presente documento se pueden realizar en cualquier orden apropiado a no ser que en el presente documento se indique otra cosa o bien que el contexto lo contradiga claramente. En el presente documento, la utilización de cualquiera de los ejemplos y de todos ellos o del lenguaje ejemplificativo (por ejemplo, “tal como”), tiene simplemente la intención de ilustrar mejor la presente invención y no plantea una limitación al alcance de la presente invención a no ser que se reivindique otra cosa. En la memoria descriptiva ninguna expresión se debe interpretar en un sentido que indique que algún elemento no reivindicado sea esencial para la práctica de la presente invención.

En el presente documento se describen realizaciones de la presente invención, incluyendo a las mejores maneras conocidas por los inventores para llevar a cabo la presente invención. Las variaciones de esas realizaciones serán evidentes para los expertos en la materia al leer la descripción anterior.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Partícula de rAAV que comprende una proteína de la cápside de AAV y un vector que comprende un ácido nucleico que codifica un agente terapéutico insertado entre un par de repeticiones terminales invertidas de AAV, y un agente de inmunosupresión, para su utilización en el tratamiento de una enfermedad en un mamífero, en la que la partícula de rAAV se administrará al ventrículo cerebral del mamífero de una manera eficaz para infectar células que están en contacto con el líquido cefalorraquídeo (LCR) del mamífero de modo que las células expresen el agente terapéutico,

en la que la partícula de rAAV es una partícula de rAAV2,

en la que el agente terapéutico es la proteasa tripeptidil peptidasa 1 (TPP1) lisosómica y la enfermedad es lipofuscinosis ceroide infantil tardía (LINCL),

en la que las células son células ependimarias, y

en la que el agente de inmunosupresión es un agente antiinflamatorio que se administrará al mamífero antes o después de la administración de la partícula de rAAV.

2. Partícula de rAAV para su utilización, según la reivindicación 1, en la que el mamífero es un mamífero no roedor, preferentemente un primate, caballo, oveja, cabra, cerdo o perro, más preferente un perro.

3. Partícula de rAAV para su utilización, según la reivindicación 2, en la que el mamífero no roedor es un primate.

4. Partícula de rAAV para su utilización, según la reivindicación 3, en la que el primate es un ser humano.

5. Partícula de rAAV para su utilización, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que el agente antiinflamatorio es micofenolato.

6. Partícula de rAAV para su utilización, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que el rAAV se administrará a una dosis de aproximadamente 1-5 ml de 1x105-1x1016 gv/ml (genomas virales/ml).

7. Partícula de rAAV para su utilización, según la reivindicación 6, en la que el rAAV se administrará a una dosis de aproximadamente 1-3 ml de 1x107-1 x1014 gv/ml.

8. Partícula de rAAV para su utilización, según la reivindicación 7, en la que el rAAV se administrará a una dosis de aproximadamente 1-2 ml de 1x108-1 x1013 gv/ml.