CN110198712A - 用于治疗神经退行性疾病的基因转移组合物、方法和用途 - Google Patents

Abstract

提供了治疗哺乳动物溶酶体贮积病的方法，该方法包括将编码多肽的AAV颗粒给予于哺乳动物的中枢神经系统。AAV颗粒可以通过直接注射到脑、脊髓、脑脊髓液或其一部分中来递送以进行表达。

Description

用于治疗神经退行性疾病的基因转移组合物、方法和用途

相关申请

本申请要求2016年11月4日提交的美国临时专利申请号64/418,033的优先权。上述申请的全部内容通过引用并入本文，包括所有文本、表格、序列表和附图。

介绍

现在，基因转移广泛认为是用于分析细胞和分子水平的生物学事件和疾病过程的有力工具。最近，基因疗法用于治疗遗传(例如，ADA缺乏(defficiency))或获得性(例如癌症或传染病)的人类疾病的应用已经受到相当大的关注。

传统上，基因疗法已经定义为将治疗基因引入哺乳动物细胞以纠正先天遗传错误的过程。虽然目前有超过4500种人类疾病归类为遗传，但这些疾病中，人类基因组中的特定突变已鉴定为相对较少。直到最近，这些罕见的遗传疾病代表了基因治疗努力的独有目标。因此，迄今为止，大多数NIH批准的基因治疗方案已经针对将缺陷基因的功能性拷贝引入具有已知先天遗传错误的个体的体细胞中。直到最近，研究人员和临床医生才开始意识到大多数人类癌症、某些形式的心血管疾病和许多退行性疾病也具有重要的遗传成分，并且为了设计新的基因疗法，应该认为是“遗传性疾病”。因此，最近基因疗法广泛地定义为通过将新的遗传信息引入受影响的生物体来纠正疾病表型。

在体内基因治疗中，将转移的基因原位(即在受体内)引入受体生物体的细胞中。已经在几种动物模型中检查了体内基因治疗。最近的一些出版物已经报道了直接基因原位转移到器官和组织如肌肉、造血干细胞、动脉壁、神经系统和肺中的可行性。据报道，将DNA直接注射到骨骼肌、心肌和将DNA-脂质复合物注射到脉管系统中也可以在体内产生可检测的插入基因产物的表达水平。

治疗中枢神经系统疾病，例如遗传性脑基因疾病，仍然是一个难以解决的问题。这样的示例是溶酶体贮积病和阿尔茨海默病。总的来说，溶酶体贮积病(LSD)的发病率在全世界为每10,000个新生儿中1个，并且在65％的病例中，存在显著的中枢神经系统(CNS)参与。当静脉内递送时，这些病症中缺乏的蛋白不会穿过血脑屏障，或者当直接递送到大脑时，这些病症中缺乏的蛋白不会广泛分布。因此，需要开发针对CNS缺陷的治疗方法。

发明内容

本发明提供了治疗患有溶酶体贮积病(LSD)的灵长类动物的方法和用途。在一个实施例中，方法或用途包括提供包含AAV衣壳蛋白的AAV颗粒；插入一对AAV反向末端重复序列(ITR)之间的核酸，该核酸编码具有溶酶体水解酶活性的多肽；和驱动所述核酸表达的表达控制元件；其中AAV颗粒能够转导所述哺乳动物的细胞并提供所述多肽的表达；并且将AAV颗粒给予或递送至哺乳动物的CNS。

在一个实施例中，多肽具有三肽基肽酶1(TPP1)活性。在其他实施例中，多肽包含TPP1、其前酶或其酶活性变体。在进一步的实施例中，核酸编码具有TPP1活性的蛋白，并且与SEQ ID NO：1所示的人TPP1具有80％或更高的同一性。在更进一步的实施例中，核酸编码哺乳动物(例如人)TPP1。

在另外的实施例中，一种或多种AAV ITR包含一种或多种AAV2ITR。

在某些实施例中，驱动所述核酸表达的表达控制元件包含CMV增强子。

在某些实施例中，驱动所述核酸表达的表达控制元件包含β肌动蛋白启动子。

在某些实施例中，驱动所述核酸表达的表达控制元件包含鸡β肌动蛋白启动子。

在某些实施例中，驱动所述核酸表达的表达控制元件包含CMV增强子和鸡β肌动蛋白启动子。

在某些实施例中，驱动所述核酸表达的表达控制元件包含与SEQ ID NO：3所示的CMV 增强子具有80％或更高同一性的序列和/或与SEQ ID NO：3所示的鸡β肌动蛋白启动子具有 80％或更高同一性的序列。

在某些实施例中，驱动所述核酸表达的表达控制元件包含与SEQ ID NO：3具有80％或更高同一性的序列。

在某些实施例中，驱动所述核酸表达的表达控制元件包含SEQ ID NO：3。

附图说明

图1A-1H示出了在脑实质、CSF和外周组织中给药研究的TPP1酶水平。在CLN2^-/^-小鼠中注射AAV4CAGhTPP1后的重组TPP1酶与CLN2⁺/^-动物的内源水平(红线)相比较。(统计分析：并非所有组都通过了常态检验。使用Krukal-Wallis检验进行非参数分析，然后进行Dunn的多重比较检验。*P<0.05，**P<0.01，****P<0.0001)

图2A示出了在嘴侧或尾侧注射后脑脊液(CSF)中的比较性TPP1表达。

图2B示出了在嘴侧或尾侧注射后纹状体中的TPP1表达。

图2C示出了在嘴侧或尾侧注射后丘脑中的TPP1表达。

图2D示出了在嘴侧或尾侧注射后延髓中的TPP1表达。

图2E示出了在嘴侧或尾侧注射后小脑中的TPP1表达。

图2F示出了在嘴侧或尾侧注射后枕叶皮质中的TPP1表达。

图2G示出了在嘴侧或尾侧注射后前额皮质中的TPP1表达。

图3A-3J示出了以三种剂量在注射后5周在CLN2^-/^-脑和外周组织中给药研究的AAV4.CAGhTPP1基因组拷贝。

图4A-4B示出了以三种剂量在注射AAV4.CAGhTPP1后5周，在12周龄CLN2^-/^-小鼠中给药研究的震颤表型定量。A)以赫兹(Hz)为单位的不同震颤频率下的deciBeltVolts(dBV)中的震颤幅度的频谱图形。(B)在震颤谱曲线下的面积(来自图A)，然后进行单向方差分析和Tukey多重比较检验。*p<0.05，***p<0.001)

图5A-图5G示出了在CLN2^-/^-小鼠中注射5e10vg AAV4.CAGhTPP1后来自稳定性研究的重组TPP1酶活性。

图6示出了单侧注射AAV2载体后非人灵长类动物的CSF中的TPP1水平(pmol TPP1/mg 蛋白)。CAGhTPP1在脑室中。数据表示TPP1水平随时间的变化。第0天代表注射前的TPP1内源性水平。N＝3只动物。

具体实施方式

本文提供了用于向需要本文所述方法的哺乳动物给予的方法和用途，该哺乳动物怀疑患有或有溶酶体贮积病(LSD)。在某些实施例中，本文描述的方法或用途用于治疗、预防、抑制、减少、降低或延迟LSD的一种或多种症状的数量、严重性、频率、进展或发作。

LSD的非限制性示例包括婴儿脂质细胞增多症或晚期婴儿神经元嗜酸性脂褐质沉积症 (LINCL)、Gaucher、青少年Batten、Fabry、MLD、Sanfilippo A、晚期婴儿Batten、Hunter、 Krabbe、Morquio、Pompe、Niemann-Pick C、Tay-Sachs、Hurler(MPS-I H)、Sanfilippo B、 Maroteaux-Lamy、Niemann-Pick A、胱氨酸贮积症、Hurler-Scheie(MPS-IH/S)、Sly综合征 (MPS VII)、Scheie(MPS-I S)、婴儿Batten、GM1神经节苷脂沉积症、粘脂沉积症II/III 型或Sandhoff病。

LSD通常由编码三肽基肽酶-1(TPP1)酶的基因中的遗传异常(例如，突变、缺失、插入)引起，从而导致功能性TPP1酶活性的缺乏。在人类中，TPP1由CLN2基因编码，有时称为TPP1基因(参见例如SEQ ID NO：2)。例如，晚期婴儿神经元嗜酸性脂褐质沉积症(LINCL) 是一种儿童神经退行性疾病，由于CLN2突变而最常由TPP1活性缺乏引起。发病是正常的，直至2-4岁，此后LINCL表现为运动和精神衰退、癫痫发作和视力缺陷。死亡通常发生在生命的最初十年内。LINCL的大多数病例是由于CLN2的突变，其诱导可溶性溶酶体酶三肽基肽酶-1(TPP1)的缺乏。TPP1合成为甘露糖-6-磷酸酶原酶，与其他可溶性溶酶体水解酶类似，前酶主要靶向溶酶体，但也可通过分泌途径从细胞中释放。因此，可以发生相同或相邻细胞的细胞摄取，以及随后的溶酶体递送和酶原活化为活性形式。

在某些实施例中，本文提供了通过直接向中枢神经系统的组织或液体给予指导具有TPP1 活性的多肽表达的AAV颗粒(在本文中称为AAV-TPP1颗粒)来治疗患有或怀疑患有LSD 的哺乳动物的方法。本文公开了显示在溶酶体贮积病的动物模型中向脑和/或脊髓递送/给予 AAV的数据。

在某些实施例中，将AAV-TPP1颗粒给予于所述哺乳动物的池状脑室、脑室内空间、脑室、蛛网膜下腔、鞘内空间和/或室管膜。在另外的实施例中，将AAV-TPP1颗粒给予于所述哺乳动物的脑脊髓液(CSF)。在进一步的实施例中，将AAV-TPP1颗粒给予于心室系统。在更进一步的实施例中，将AAV-TPP1颗粒给予于头端侧脑室；和/或给予于尾侧脑室；和/或给予于右侧脑室；和/或给予于左侧脑室；和/或给予于右侧嘴侧脑室；和/或给予于左侧侧脑室；和/或给予于右侧尾侧脑室；和/或给予于左侧尾侧脑室。

在另外的实施例中，给予AAV-TPP1颗粒使得AAV颗粒接触所述哺乳动物的室管膜细胞。这种室管膜表达编码的多肽，并且可选地，多肽由细胞表达。在特定的实施例中，多肽在侧脑室、CSF、脑(例如，纹状体、丘脑、延髓、小脑、枕叶皮质和/或前额皮质)和/或CNS 中表达和/或分布。

可通过本文所述的方法或用途治疗任何合适的哺乳动物。哺乳动物的非限制性示例包括人、非人灵长类动物(例如，猿、长臂猿、黑猩猩、猩猩、猴子、猕猴等)、家畜(例如狗和猫)、农场动物(例如，马、牛、山羊、绵羊、猪)和实验动物(例如，小鼠、大鼠、兔、豚鼠)。在某些实施例中，哺乳动物是人。在某些实施例中，哺乳动物是非啮齿哺乳动物(例如，人、猪、山羊、绵羊、马、狗等)。在某些实施例中，非啮齿哺乳动物是人。哺乳动物可以是任何年龄或任何发育阶段(例如，成人、青少年、儿童、婴儿或子宫内的哺乳动物)。哺乳动物可以是男性或女性。在某些实施例中，哺乳动物可以是动物疾病模型，例如，用于研究LSD 的动物模型，例如LINCL。

通过本文描述的方法或组合物治疗的受试者包括成人(18岁或更大)和儿童(小于18 岁)。儿童的年龄范围为1-2岁、或2-4岁、4-6岁、6-18岁、8-10岁、10-12岁、12-15岁和15-18岁。儿童还包括婴儿。婴儿通常在1-12个月大的范围内。

腺相关病毒(AAV)是细小病毒科的小的非致病性病毒。迄今为止，已经鉴定出许多血清学上不同的AAV，并且已经从人类或灵长类动物中分离出超过12种。AAV通过依赖辅助病毒进行复制而与该科的其他成员不同。

已显示AAV基因组稳定整合到宿主细胞基因组中；拥有广泛的宿主范围；在体外和体内转导分裂和非分裂细胞，并保持转导基因的高水平表达。AAV病毒颗粒是热稳定的，耐受溶剂、洗涤剂、pH、温度变化，并且可以在CsCl梯度上或通过其他方式浓缩。AAV基因组包含单链脱氧核糖核酸(ssDNA)，可被阳性或阴性感知。在没有辅助病毒的情况下，AAV可以以基因座特异性方式整合，例如整合到染色体19的q臂中。AAV的约5kb基因组由一段正或负极性的单链DNA组成。基因组的末端是短的反向末端重复，其可以折叠成发夹结构并且用作病毒DNA复制的起点。

AAV“基因组”是指最终包装或包封以形成AAV颗粒的重组核酸序列。AAV颗粒通常包含AAV基因组。在使用重组质粒构建或制造重组载体的情况下，载体基因组不包括与重组质粒的载体基因组序列不对应的“质粒”部分。该重组质粒的非载体基因组部分称为“质粒骨架”，这对于繁殖和重组病毒生产所需的质粒的克隆和扩增是重要的，但本身不包装或包封在病毒(例如AAV)颗粒中。因此，载体“基因组”是指由病毒(例如AAV)包装或包封的核酸。

AAV病毒粒子(颗粒)是直径约25nm的无包膜二十面体颗粒。AAV颗粒包含二十面体对称的衣壳，包括三种相关的衣壳蛋白VP1、VP2和VP3，它们一起相互作用形成衣壳。右 ORF通常编码衣壳蛋白VP1、VP2和VP3。这些蛋白通常分别以1：1：10的比例存在，但可以是不同的比例，并且都来自右侧ORF。衣壳蛋白通过使用可变剪接和不寻常的起始密码子而彼此不同。缺失分析已经表明，从可变剪接的信息中翻译的VP1的去除或改变导致感染性颗粒的产量降低。VP3编码区内的突变导致不能产生任何单链后代DNA或感染性颗粒。 AAV颗粒是包含AAV衣壳的病毒颗粒。在某些实施例中，AAV颗粒的基因组编码一种、两种或所有VP1、VP2和VP3多肽。

大多数天然AAV的基因组通常含有两个开放阅读框(ORF)，有时称为左ORF和右ORF。左ORF通常编码非结构Rep蛋白、Rep 40、Rep 52、Rep 68和Rep 78，除了产生单链后代基因组外，它们还参与复制和转录的调节。两种Rep蛋白与AAV基因组优先整合到人类19号染色体q臂的区域有关。已显示Rep 68/78具有NTP结合活性以及DNA和RNA解旋酶活性。一些Rep蛋白具有核定位信号以及几个潜在的磷酸化位点。在某些实施例中，AAV(例如rAAV) 的基因组编码一些或所有Rep蛋白。在某些实施例中，AAV(例如anrAAV)的基因组不编码Rep蛋白。在某些实施例中，一种或多种Rep蛋白可以反式递送，因此不包含在包含编码多肽的核酸的AAV颗粒中。

AAV基因组的末端包含短的反向末端重复(ITR)，其具有折叠成T形发夹结构的潜力，所述T形发夹结构用作病毒DNA复制的起源。因此，AAV的基因组包含位于其单链病毒DNA基因组侧翼的一个或多个(例如，一对)ITR序列。ITR序列通常每个包含约145个碱基。在ITR区域内，已经描述了两个元件，它们认为是ITR、GAGC重复基序和终端分辨率位点(terminalresolution site，trs)功能的核心。当ITR处于线性或发夹构象时，已显示重复基序结合Rep。认为该结合将Rep68/78置于trs处用于切割，其以位点和链特异性方式发生。除了它们在复制中的作用外，这两个元件似乎是病毒整合的核心。包含在19号染色体整合基因座内的是具有相邻trs的Rep结合位点。已经证明这些元件对于基因座特异性整合是功能性的和必需的。

在某些实施例中，AAV(例如rAAV)包括两个ITR。在某些实施例中，AAV(例如rAAV)包含一对ITR。在某些实施例中，AAV(例如rAAV)包含一对ITR，ITR位于多核苷酸的侧翼(即，在每个5'和3'末端)，多核苷酸至少编码具有TPP1酶活性的多肽。

术语“载体”是指小载体核酸分子、质粒、病毒(例如AAV载体)，或可以通过插入或掺入核酸来操作的其他载体。诸如AAV的载体可用于将多核苷酸引入/转移到细胞中，使得其中的多核苷酸被转录并随后由细胞翻译。

“表达载体”是含有基因或核酸序列的特异化载体，所述基因或核酸序列在宿主细胞中具有表达所需的必需调节区。载体核酸序列通常至少含有用于在细胞中繁殖的复制起点和任选的其他元件，例如异源多核苷酸序列、表达控制元件(例如，启动子、增强子)、内含子、 ITR、多腺苷酸化信号。

病毒载体衍生自或基于包含病毒基因组的一种或多种核酸元件。特定的病毒载体包括腺相关病毒(AAV)载体。还提供了载体(例如AAV)，其包含编码TPP1多肽、变体或亚序列的核酸序列(例如，具有TPP1酶活性的多肽片段)。

术语“重组”，作为载体的修饰物，例如重组病毒，例如慢病毒或细小病毒(例如AAV) 载体，以及序列的修饰物诸如重组多核苷酸和多肽，是指组合物已经以通常不在自然界中发生的方式被操作(即，工程化)。重组载体(例如AAV载体)的特定示例是其中通常不存在于野生型病毒(例如AAV)基因组中的多核苷酸插入病毒基因组内。重组多核苷酸的示例是将编码TPP1多肽的核酸(例如基因)克隆到载体中，有或没有5'、3'和/或内含子区域，该基因通常与病毒(例如AAV)基因组内相关。尽管本文并未总是使用术语“重组”来指代载体，例如病毒和AAV载体，以及诸如多核苷酸的序列，但包括多核苷酸的重组形式明确地包括在内，尽管有任何这样的省略。

通过使用分子方法从病毒(例如AAV)中除去野生型基因组并用非天然核酸(例如编码 TPP1的核酸序列)替换，从病毒(例如AAV)的野生型基因组衍生重组病毒“载体”或“AAV 载体”。通常，对于AAV，AAV基因组的一个或两个反向末端重复(ITR)序列保留在AAV载体中。“重组”病毒载体(例如rAAV)与病毒(例如AAV)基因组不同，因为病毒基因组的全部或部分已被相对于病毒(例如AAV)基因组核酸的非天然序列(例如编码TPP1的核酸序列)替换。因此，掺入非天然序列将病毒载体(例如AAV)定义为“重组”载体，其在 AAV的情况下可称为“rAAV载体”。

AAV载体(例如rAAV载体)可以被包装并且在本文中称为“AAV颗粒”，用于随后在体外(ex vivo,in vitro)或体内感染(转导)细胞。当重组AAV载体包封或包装到AAV颗粒中时，该颗粒也可称为“rAAV颗粒”。在某些实施例中，AAV颗粒是rAAV颗粒。rAAV颗粒通常包含AAV载体或其部分。rAAV颗粒可以是一种或多种AAV颗粒(例如多种AAV颗粒)。rAAV颗粒通常包含包封或包装rAAV载体基因组的蛋白(例如衣壳蛋白)。

任何合适的AAV颗粒(例如rAAV颗粒)可用于本文的方法或用途。其中包含的rAAV颗粒和/或基因组可以衍生自任何合适的AAV血清型或毒株。其中包含的rAAV颗粒和/或基因组可以衍生自两种或更多种AAV血清型或毒株。因此，rAAV可包含任何AAV血清型或毒株的蛋白和/或核酸或其部分，其中AAV颗粒适合于哺乳动物细胞的感染和/或转导。AAV 血清型的非限制性示例包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、 AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV-rh74、AAV-rh10或AAV-2i8。在某些实施例中，多个rAAV颗粒包含相同毒株或血清型(或亚组或变体)的颗粒或衍生自相同毒株或血清型(或亚组或变体)的颗粒。在某些实施例中，多个rAAV颗粒包含两种或更多种不同rAAV颗粒 (例如，不同血清型和/或毒株)的混合物。

如本文所用，术语“血清型”是用于指具有衣壳的AAV的区别，所述衣壳在血清学上不同于其他AAV血清型。血清学独特性是基于与另一种AAV相比缺乏针对一种AAV的抗体之间的交叉反应性来确定的。这种交叉反应性差异通常是由于衣壳蛋白序列/抗原决定簇的差异 (例如，由于AAV血清型的VP1、VP2和/或VP3序列差异)。尽管包括衣壳变体的AAV变体可能与参考AAV或其他AAV血清型在血清学上不同，但与参考或其他AAV血清型相比，它们相差至少一个核苷酸或氨基酸残基。

在某些实施例中，rAAV颗粒排除某些血清型。在一个实施例中，rAAV颗粒不是AAV4颗粒。在某些实施例中，rAAV颗粒在抗原性或免疫学上不同于AAV4。可以通过标准方法确定不同性。例如，ELISA和Western印迹可用于确定病毒颗粒是否在抗原性或免疫学上与AAV4不同。此外，在某些实施例中，rAAV2颗粒保留不同于AAV4的组织趋向性。

在某些实施例中，基于第一血清型基因组的rAAV载体与包装载体的一种或多种衣壳蛋白的血清型相同。在某些实施例中，rAAV载体基因组可以基于AAV(例如，AAV2)血清型基因组，其不同于包装载体的一种或多种AAV衣壳蛋白的血清型。例如，rAAV载体基因组可包含AAV2衍生的核酸(例如，ITR)，而三种衣壳蛋白中的至少一种或多种衍生自不同的血清型，例如，AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Rh10、Rh74或AAV-2i8血清型或其变体。

可以使用本领域已知的合适重组技术(例如，参见Sambrooket al.，1989)产生包含指导多肽表达的多核苷酸的重组AAV载体。通常将重组AAV载体包装到具有转导能力的AAV颗粒中，并使用AAV病毒包装系统繁殖。具有转导能力的AAV颗粒能够结合并进入哺乳动物细胞，随后将核酸货物(例如，异源基因)递送至细胞核。因此，具有转导能力的完整AAV颗粒配置为转导哺乳动物细胞。配置成转导哺乳动物细胞的AAV颗粒通常不具有复制能力，并且需要额外的蛋白机制来自我复制。因此，配置成转导哺乳动物细胞的AAV颗粒被工程化以结合并进入哺乳动物细胞并将核酸递送至细胞，其中用于递送的核酸通常位于AAV基因组中的一对AAV ITR之间。

用于产生具有转导能力的AAV颗粒的合适宿主细胞包括但不限于可以或已经用作异源 rAAV载体的受体的微生物、酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。可以使用来自稳定的人细胞系293的细胞(可通过例如美国典型培养物保藏中心容易获得，登录号为ATCCCRL1573)。在某些实施例中，用腺病毒5型DNA片段转化并表达腺病毒E1a和E1b基因的经修饰的人胚肾细胞系(例如HEK293)用于产生重组AAV颗粒。经修饰的HEK293细胞系易于转染，并提供特别方便的其中产生rAAV颗粒的平台。产生能够转导哺乳动物细胞的高滴度AAV颗粒的方法是本领域已知的。例如，AAV颗粒可以如Wright，2008和Wright，2009中所述制备。

在某些实施例中，在转染AAV表达载体之前或在同时，通过用AAV辅助构建体转染宿主细胞，将AAV辅助功能引入宿主细胞。因此，AAV辅助构建体有时用于提供AAV rep和/或cap基因的至少瞬时表达，以补充用于生产性AAV转导所必需的缺失AAV功能。AAV辅助构建体通常缺乏AAV ITR，既不能自我复制也不能包装自己。这些构建体可以是质粒、噬菌体、转座子、粘粒、病毒或病毒粒子的形式。已经描述了许多AAV辅助构建体，例如编码 Rep和Cap表达产物的常用质粒pAAV/Ad和pIM29+45。已知许多其他编码Rep和/或Cap 表达产物的载体。

在某些实施例中，与参考血清型相关的AAV颗粒或其载体基因组具有多核苷酸、多肽或其子序列，其包含或其组成是与AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、 AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Rh10、Rh74或AAV-2i8颗粒的多核苷酸、多肽或子序列至少60％或更多(例如65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、 99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％等)相同的序列。在特定实施例中，与参考血清型相关的AAV颗粒或其载体基因组具有衣壳或ITR序列，其包含或其组成是与AAV1、AAV2、 AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Rh10、Rh74或AAV-2i8血清型的衣壳或ITR序列至少60％或更多(例如65％、70％、75％、80％、 85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％等)相同的序列。

在某些实施例中，本文的方法包括使用AAV2颗粒。在一个特定方面，AAV2颗粒是重组AAV2颗粒。在某些实施例中，rAAV2颗粒包含AAV2衣壳。在某些实施例中，rAAV2颗粒包含一种或多种衣壳蛋白(例如，VP1、VP2和/或VP3)，其与天然或野生型AAV2颗粒的相应衣壳蛋白至少60％、65％、70％、75％或更多(例如80％、85％、85％、87％、88％、89％、 90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、 99.5％等)相同，最多100％相同。在某些实施例中，rAAV2颗粒包含VP1、VP2和VP3衣壳蛋白，其与天然或野生型AAV2颗粒的相应衣壳蛋白至少75％或更多(例如80％、85％、86％、 87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、 99.2％、99.3％、99.4％、99.5％等)相同，最多100％相同。在某些实施例中，rAAV2颗粒是天然或野生型AAV2颗粒的变体。在某些方面，与天然或野生型AAV2颗粒的衣壳蛋白相比较，AAV2变体的一种或多种衣壳蛋白具有1、2、3、4、5、5-10、10-15、15-20或更多个氨基酸取代。

在某些实施例中，rAAV2颗粒(例如，AAV2颗粒的衣壳)包含与野生型AAV2VP1衣壳具有至少60％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性或甚至100％同一性的VP1多肽。在某些实施例中，AAV2颗粒包含VP1多肽，其与具有AAV2VP1衣壳蛋白的氨基酸序列的多肽具有约63％或更高的同一性(例如，63％同一性)。AAV2衣壳序列和AAV4衣壳序列大约60％相同。在某些实施例中，AAV2VP1衣壳蛋白具有与野生型AAV2 VP1衣壳具有至少65％同一性的序列。在某些实施例中，AAV2VP1衣壳蛋白包含野生型 AAV2VP1衣壳。

在某些实施例中，rAAV2颗粒包含一种或两种ITR(例如，一对ITR)，其与天然或野生型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、 AAV12、Rh10、Rh74或AAV-2i8的相应ITR至少75％或更多(例如80％、85％、86％、87％、 88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、 99.3％、99.4％、99.5％等)相同，最多100％相同，只要它们保留一种或多种所需的ITR功能 (例如，形成允许DNA复制的发夹的能力；将AAV DNA掺入到宿主细胞基因组中；和/或包装，如果需要的话)。

在某些实施例中，rAAV2颗粒包含一种或两种ITR(例如，一对ITR)，其与天然或野生型AAV2颗粒的相应ITR至少75％或更多(例如80％、85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％等)相同，最多100％相同，只要它们保留一种或多种所需的ITR功能(例如，形成允许DNA复制的发夹的能力；将AAV DNA掺入到宿主细胞基因组中；和/或包装，如果需要的话)。

rAAV颗粒可包含具有任何合适数量的“GAGC”重复的ITR。在某些实施例中，AAV2颗粒的ITR包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个“GAGC”重复。在某些实施例中，rAAV2颗粒包含含有三个“GAGC”重复的ITR。在某些实施例中，rAAV2颗粒包含具有少于四个“GAGC”重复的ITR。在某些实施例中，rAAV2颗粒包含具有超过四个“GAGC”重复的ITR。在某些实施例中，rAAV2颗粒的ITR包含Rep结合位点，其中前两个“GAGC”重复中的第四个核苷酸是C而不是T。

可以将任何合适长度的DNA掺入AAV颗粒中。适用于rAAV载体的DNA分子可以是约5千碱基(kb)、小于约5kb、小于约4.5kb、小于约4kb、小于约3.5kb、小于约3kb或小于约2.5kb。

本文使用“转基因”以方便地指代预期或已经引入细胞或生物体的核酸。转基因包括任何核酸，例如编码多肽或蛋白的基因(例如TPP1)，并且对于天然存在的AAV基因组序列通常是异源的。

在具有转基因的细胞中，转基因通常通过载体(例如rAAV颗粒)引入/转移。通过rAAV 颗粒将转基因引入细胞通常称为细胞的“转导”。术语“转导”是指通过载体(例如AAV颗粒)将分子例如核酸引入细胞或宿主生物体中。转基因可以或可以不掺入到转导细胞的基因组核酸中。如果引入的核酸掺入到受体细胞或生物体的核酸(基因组DNA)中，则它可以稳定地保持在该细胞或生物体中，并进一步传递给受体细胞或生物体的子代细胞或生物体或由其遗传。最后，引入的核酸可以在染色体外或仅瞬时存在于受体细胞或宿主生物体中。“转导细胞”是通过转导引入转基因的细胞。因此，“转导的”细胞是其中引入了核酸的细胞或其后代。可以繁殖转导的细胞并可以表达引入的蛋白或可以转录核酸。对于基因治疗用途和方法，转导的细胞可以在哺乳动物中。

TPP1是由CLN2基因(TPP1基因)编码的溶酶体丝氨酸蛋白酶。人TPP1的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。人TPP1的核酸序列如SEQ ID NO：2所示。人TPP1包含三肽基肽酶I活性(TPP1酶活性)。TPP1活性包括非特异性溶酶体肽酶活性，其由溶酶体蛋白酶产生的分解产物产生三肽。底物特异性研究表明TPP1主要从肽和蛋白中未取代的氨基末端切割三肽。内源表达的TPP1合成为催化失活的酶。在靶向溶酶体后，由于酸性环境，TPP1自动催化加工成成熟的活性酶。可以使用已知方法在体外测量和/或定量TPP1的活性。例如，参见，Junaidet al.,1999。

包含TPP1活性的多肽是指哺乳动物的TPP1蛋白或其部分，其显示出SEQ ID NO：1的人TPP1的肽酶活性的至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或约100％，例如，如通过Junaid et al.,1999的方法或另一种类似方法测定的，使用合适的肽底物测定。在某些实施例中，包含TPP1活性的多肽是指哺乳动物的TPP1 蛋白或子序列或其变体，其显示出SEQ ID NO：1的人TPP1的肽酶活性的至少50％、至少 60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或约100％。

包含TPP1活性的多肽可包含保留至少部分TPP1活性的TPP1多肽的截短的、突变的、嵌合的或修饰形式。包含TPP1活性的多肽可包含从任何合适的生物体(例如，来自哺乳动物，来自人，来自非人哺乳动物，例如来自狗、猪、牛等)获得的TPP1蛋白或其部分。在某些实施例中，包含TPP1活性的多肽与SEQ ID NO：1中所示的TPP1蛋白具有至少60％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少98％同一性或100％同一性。

在某些实施例中，rAAV颗粒包含AAV衣壳蛋白和编码包含TPP1活性的多肽的核酸。在某些实施例中，rAAV颗粒包含AAV衣壳蛋白和指导包含TPP1活性的多肽的表达和/或分泌的核酸。

在某些实施例中，rAAV颗粒包含AAV衣壳蛋白和编码TPP1多肽的核酸，或其酶活性部分。在某些实施例中，rAAV颗粒包含AAV衣壳蛋白和指导TPP1多肽或其酶活性部分的表达和/或分泌的核酸。在某些实施例中，给予的核酸编码TPP1，与野生型TPP1具有实质同一性的TPP1，和/或TPP1的变体、突变体或片段。在某些实施例中，TPP1多肽与SEQ ID NO： 1中所示的蛋白具有至少60％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少98％同一性或100％同一性。

在某些实施例中，rAAV颗粒包含与SEQ ID NO：2中所示的核酸具有至少50％同一性、至少60％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少98％同一性或100％同一性的核酸。在某些实施例中，编码TPP1活性或编码或指导TPP1多肽表达的核酸是与SEQ ID NO：2所示核酸具有至少50％同一性、至少60％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少98％同一性或100％同一性的核酸。

代表性的人TPP1氨基酸序列描述于SEQ ID NO：1中。代表性的人TPP1核酸序列描述于SEQ ID NO：2中。

在某些实施例中，方法或用途包括向哺乳动物给予或递送AAV-TPP1颗粒，并任选地向哺乳动物给予一种或多种免疫抑制剂。在某些实施例中，方法或用途包括向哺乳动物给予或递送AAV-TPP1颗粒，并任选地向哺乳动物给予2、3、4或更多种免疫抑制剂。在某些实施例中，方法或用途包括向哺乳动物给予或递送AAV-TPP1颗粒，并任选地向哺乳动物给予两种免疫抑制剂。在一个代表性实施例中，治疗哺乳动物的方法或用途包括向哺乳动物给予或递送AAV-TPP1颗粒并向哺乳动物给予第一和第二免疫抑制剂。

当给予两种或更多种免疫抑制剂时，每种免疫抑制剂是有区别的和/或不同的(例如，每种药剂的结构和/或作用机制不同)。在某些实施例中，免疫抑制剂是抗炎剂。在某些实施例中，免疫抑制剂是霉酚酸酯或其衍生物。这种霉酚酸酯衍生物的示例是麦考酚酸酯(MMF)。在某些实施例中，免疫抑制剂是环孢菌素或其衍生物。在某些实施例中，第一免疫抑制剂包含环孢菌素，第二免疫抑制剂包含霉酚酸酯或其衍生物(例如MMF)。在某些实施例中，第一免疫抑制剂包含环孢菌素，第二免疫抑制剂包含MMF。

在某些实施例中，在将AAV-TPP1颗粒给予于哺乳动物之前、期间和/或之后给予免疫抑制剂。在某些实施例中，在将AAV-TPP1颗粒给予于哺乳动物的同时给予免疫抑制剂。在某些实施例中，在将AAV-TPP1颗粒给予于哺乳动物后给予免疫抑制剂。

在某些实施例中，在将AAV-TPP1颗粒给予于哺乳动物之前，在至少约1至约7天之前、或约1周、约2周、约3周、约4周或约5周给哺乳动物给予第一免疫抑制剂，以及在给哺乳动物给予AAV-TPP1颗粒之后，约1至约7天之前、约1周、约2周、约3周、约4周或约5周，在约10、约20、约30、约40、约50、约100、约200、约300、约350、约400或约500天期间和/或之内给予第二免疫抑制剂。在某些实施例中，在将AAV-TPP1颗粒给予于哺乳动物之前，至少约1至约7天之前、或约1周、约2周、约3周、约4周或约5周，给哺乳动物给予环孢菌素，以及在给哺乳动物给予AAV-TPP1颗粒之后，约1至约7天之前、约1、约2、约3、约4或约5周，在约10、约20、约30、约40、约50、约100、约200、约300、约350、约400或约500天期间和/或之内给予霉酚酸酯或其衍生物(如MMF)。在某些实施例中，在给予AAV-TPP1颗粒之前，约1至约7天之前、或约1周、约2周、约3 周、约4周或约5周给予环孢菌素，并且在治疗后以规则的间隔给予，以及在给哺乳动物给予AAV-TPP1颗粒后，在约1至约7天之前、约1周、约2周、约3周、约4周或约5周，在约10至约40天期间和/或之内，给予一次霉酚酸酯或其衍生物(例如MMF)。

免疫抑制剂可以任何合适的剂量给予。在某些实施例中，以约1至约50mg/kg、约1至约20mg/kg，或约5至约10mg/kg的剂量以每天一次、两次或三次至每隔一天一次的频率给予环孢菌素。在某些实施例中，以约10mg/kg每天两次给予环孢菌素。在某些实施例中，以约10mg/kg每天两次给予环孢菌素，持续至少约1、约2、约3、约4或约5个月的时间。在某些实施例中，在给哺乳动物给予或使用AAV-TPP1颗粒后约1至约2个月，环孢菌素的剂量逐渐减少至小于约5mg/kg，或小于约2mg/kg。

在某些实施例中，以约1至约100mg/kg、约1至约50mg/kg，或约1至约25mg/kg，或约5至约20mg/kg的剂量以每天一次、两次或三次至每隔一天一次的频率给予霉酚酸酯或其衍生物(如MMF)。在某些实施例中，以约10至约20mg/kg每天一次给予霉酚酸酯或其衍生物(例如MMF)。在某些实施例中，在给哺乳动物给予或使用AAV-TPP1颗粒后约1至约2 个月，霉酚酸酯或其衍生物(例如MMF)的剂量逐渐减少至小于约5mg/kg，或小于约2mg/kg。

可以将rAAV颗粒和/或免疫抑制剂配制成适合于特定给药途径的任何合适的制剂。各种药学上可接受的制剂可商购获得并且可由医师获得。

可以通过任何合适的途径给予rAAV颗粒。在某些实施例中，方法或用途包括将AAV-TPP1颗粒给予于哺乳动物(例如，患有LSD的哺乳动物)的中枢神经系统(CNS)。在某些实施例中，中枢神经系统包括脑、脊髓和脑脊髓液(CSF)。在某些实施例中，方法或用途包括将AAV-TPP1颗粒给予于哺乳动物的脑或脊髓或CSF。在某些实施例中，将AAV-TPP1 颗粒给予于脑或脊髓的一部分。

在某些实施例中，将AAV-TPP1颗粒给予于所述哺乳动物的小脑池、脑室内空间、脑室、蛛网膜下腔、鞘内空间和/或室管膜中的一个或多个。在某些实施例中，将AAV-TPP1颗粒给予于所述哺乳动物的脑脊髓液(CSF)。在进一步的实施例中，将AAV-TPP1颗粒给予于心室系统。在更进一步的实施例中，将AAV-TPP1颗粒给予于侧向侧脑室、尾侧脑室、右侧脑室、左侧脑室、右侧嘴侧脑室、左侧嘴侧脑室、右侧尾侧脑室和/或左侧尾侧脑室中的一个或多个。

免疫抑制剂可以通过任何合适的途径给予。在某些实施例中，口服给予免疫抑制剂。在某些实施例中，口服给予霉酚酸酯或其衍生物，例如麦考酚酸酯(MMF)。在某些实施例中，口服给予环孢菌素。还可以肠胃外(例如，肌肉内、静脉内、皮下)给予免疫抑制剂，或通过注射给予免疫抑制剂至脑、脊髓或其一部分(例如，注射到CSF中)。

在某些实施例中，将包含AAV-TPP1颗粒和可选的免疫抑制剂的组合物给予于哺乳动物的小脑延髓池和/或哺乳动物的脑室、蛛网膜下腔和/或鞘内空间和/或室管膜瘤中的一种或多种。例如，AAV-TPP1颗粒可以直接递送到小脑池、脑室内空间、脑室、蛛网膜下腔、鞘内空间和/或室管膜。在某些实施例中，方法或用途包括将AAV-TPP1颗粒给予于哺乳动物的室管膜瘤。

在某些实施例中，将AAV-TPP1颗粒给予于与哺乳动物中的CSF接触的一种或多种细胞，例如通过使细胞与AAV-TPP1颗粒接触。与CSF接触的细胞的非限制性示例包括室管膜细胞、软膜细胞、内皮细胞和/或脑膜细胞。在某些实施例中，将AAV-TPP1颗粒给予于室管膜细胞。在某些实施例中，将AAV-TPP1颗粒递送至室管膜细胞，例如通过使室管膜细胞与AAV-TPP1 颗粒接触。

在某些实施例中，局部递送AAV-TPP1颗粒。“局部递送”是指将活性剂直接递送至哺乳动物内的靶位点(例如，直接递送至组织或液体)。例如，可以通过直接注射到器官、组织或指定的解剖位置来局部递送药剂。在某些实施例中，通过直接注射到脑、脊髓或其组织或液体(例如，CSF，例如室管膜细胞、软膜细胞、内皮细胞和/或脑膜细胞)来递送或给予AAV-TPP1 颗粒。例如，可以通过直接注射将AAV-TPP1颗粒直接递送至CSF、小脑延髓池、脑室内空间、脑室、蛛网膜下腔和/或鞘内空间和/或室管膜。在某些实施例中，通过直接注射到脑或脊髓的组织或液体中，将AAV-TPP1颗粒递送至脑或脊髓的组织、液体或细胞。在某些实施例中，不通过例如静脉内、皮下或肌内注射或通过静脉内输注全身递送AAV-TPP1颗粒。在某些实施例中，通过立体定向注射将AAV-TPP1颗粒递送至脑或脊髓的组织或液体。

在某些实施例中，通过将AAV-TPP1颗粒直接注射到脑、脊髓或其组织或液体(例如， CSF，例如室管膜)来递送或给予一种或多种AAV-TPP1颗粒。在一个特定方面，AAV-TPP1颗粒转导室管膜细胞、软膜细胞、内皮细胞和/或脑膜细胞。

可以凭经验确定有效量的rAAV颗粒，例如AAV-TPP1颗粒。在整个治疗过程中，可以连续或间歇地以一个或多个剂量进行给药。有效的给药剂量可以由本领域技术人员确定，并且可以根据AAV血清型、病毒滴度和所治疗的哺乳动物的体重、病症和物种而变化。可以在治疗医师选择剂量水平、目标和时间的情况下进行单次和多次给药。例如，可以根据需要给予多剂量以维持足够的酶活性。

在某些实施例中，给予多个AAV-TPP1颗粒。如本文所用，多个AAV-TPP1颗粒指的是约1×10⁵至约1×10¹⁸个颗粒。

在某些实施例中，在约1至约5ml中以约1×10⁵至约1×10¹⁶vg/ml的剂量；以1×10⁷至约 1×10¹⁴vg/ml的约1至约3ml的剂量；或者以1×10⁸至约1×10¹³vg/ml的约1至约2ml的剂量给予rAAV颗粒，例如AAV-TPP1颗粒。在某些实施例中，以约1×10⁸至约1×10¹⁵vg/kg受治疗哺乳动物体重的剂量给予rAAV颗粒，例如AAV-TPP1颗粒。例如，以约1×10⁸vg/kg、约5×10⁸vg/kg、约1×10⁹vg/kg、约5×10⁹vg/kg、约1×10¹⁰vg/kg、约5×10¹⁰vg/kg、约1×10¹¹vg/kg、约5×10¹¹vg/kg、约1×10¹²vg/kg、约5×10¹²vg/kg、约1×10¹³vg/kg、约5×10¹³vg/kg、约1×10¹⁴ vg/kg、约5×10¹⁴vg/kg、或约1×10¹⁵vg/kg受治疗哺乳动物体重的剂量给予rAAV颗粒，例如 AAV-TPP1颗粒。

适于注射或输注rAAV颗粒(例如AAV-TPP1颗粒)的药物形式，可包括无菌水溶液或分散液，其适于临时制备无菌可注射或可输注溶液或分散液，可选地包封在脂质体中。在所有情况下，最终形式应该是无菌流体并且在制造、使用和储存的条件下是稳定的。液体载体或载体可以是溶剂或液体分散介质，包括例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、植物油、无毒甘油酯及其合适的混合物。例如，通过形成脂质体，通过在分散体的情况下保持所需的粒度或通过使用表面活性剂，可以保持适当的流动性。可以包括等渗剂，例如糖、缓冲剂或盐(例如氯化钠)。通过在组合物中使用延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可以实现可注射组合物的延长吸收。

rAAV颗粒(例如AAV-TPP1颗粒)的溶液或悬浮液可可选地包括以下组分：无菌稀释剂，如注射用水、盐水溶液、如磷酸盐缓冲盐水(PBS)，人工脑脊液、固定油、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、甘油或其他合成溶剂；抗菌剂和抗真菌剂如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸等；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸；缓冲剂如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐和调节渗透压的试剂如氯化钠或葡萄糖。

rAAV颗粒(例如AAV-TPP1颗粒)及其组合物可以以剂量单位形式配制，以便剂量的给予和均匀。本文所用的剂量单位形式是指适合作为待治疗个体的单位剂量的物理上离散的单位；每个单元含有预定量的活性化合物，经计算可与所需的药物载体一起产生所需的治疗效果。剂量单位形式取决于认为产生所需效果所必需的rAAV颗粒(例如，AAV-TPP1颗粒)的量。所需的量可以配制成单剂量，或者可以配制成多剂量单位。可以将剂量调节至合适的rAAV 颗粒浓度，任选地与抗炎剂组合，并包装使用。

在一个实施例中，药物组合物将包括足够的遗传物质(rAAV颗粒)以提供治疗有效量，即足以减轻或改善所述疾病状态症状的量或足以赋予所需益处的量。药物组合物通常含有药学上可接受的赋形剂。此类赋形剂包括任何本身不会诱导产生对接受组合物的个体有害的抗体的药剂，并且可以在没有过度毒性的情况下给予该药剂。药学上可接受的赋形剂包括但不限于山梨糖醇、吐温80和液体，例如水、盐水、甘油和乙醇。其中可以包括药学上可接受的盐，例如，无机酸盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等；和有机酸的盐，例如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等。另外，在这种载体中可以存在辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。关于药学上可接受的赋形剂的详尽讨论可参见Remington'sPharmaceutical Sciences，1991。

含有rAAV颗粒(例如AAV-TPP1颗粒)的制剂在载体中含有有效量的rAAV颗粒，有效量可由本领域技术人员容易地确定。rAAV颗粒(例如AAV-TPP1颗粒)通常可以为组合物的约1％至约95％(w/w)，或者如果合适的话甚至更高。给药量取决于诸如哺乳动物或考虑用于治疗的人类受试者的年龄、体重和身体状况等因素。本领域普通技术人员可通过建立剂量反应曲线的常规试验确定有效剂量。

在某些实施例中，一种方法包括向哺乳动物(例如患有LSD(诸如LINCL)的哺乳动物) 给予多种rAAV颗粒，例如AAV-TPP1颗粒，如本文所述，其中减小、减少、预防、抑制或延迟LSD的一种或多种症状的严重程度、频率、进展或发作时间。术语“发作时间”是指首次给予AAV-TPP1颗粒后首次观察或检测到LSD症状的时间点。LSD的非限制性症状，其中减小、减少、预防、抑制或延迟LSD的一种或多种症状的严重程度、频率、进展或发作时间，包括本体感觉反应、眼球震颤、威胁(menace)、瞳孔光反射、小脑性共济失调和意向性震颤。 LSD的一种或多种症状的严重程度、频率、进展或发作时间可以通过标准化的临床神经学检查主观确定(例如，参见Lorenz et al.,2011)。

可以通过比较用AAV-TPP1颗粒治疗的哺乳动物的症状的发作时间与没有AAV-TPP1颗粒治疗的一种或多种哺乳动物的症状的发作时间来确定与LSD相关的症状发作时间的延迟。在某些实施例中，一种方法包括将多个AAV-TPP1颗粒给予于哺乳动物(例如，患有LSD的哺乳动物)的中枢神经系统或其部分，并且减小、减少、预防、抑制或延迟LSD的一种或多种症状的发作的严重程度、频率、进展，或发作时间至少约5至约10、约10至约25、约25 至约50或约50至约100天。

在某些实施例中，一种方法或用途包括将rAAV颗粒给予于哺乳动物的脑或脊髓或其部分，其中rAAV颗粒配置成转导哺乳动物细胞并指导哺乳动物中具有TPP1活性的多肽的表达。在某些实施例中，在一个或多个外周器官中(例如，在脾和/或心脏中)表达和/或检测多肽。

在某些实施例中，一种方法或用途包括将rAAV颗粒给予于哺乳动物的脑或脊髓或其部分，其中rAAV颗粒配置为转导哺乳动物的脑或脊髓细胞并指导在哺乳动物的脑或脊髓中具有TPP1活性的多肽的表达。在某些实施例中，在给药部位远端的中枢神经组织(例如，脑，例如纹状体、丘脑、延髓、小脑、枕叶皮质、前额皮质)中表达和/或检测多肽。在某些实施例中，在中枢神经组织(例如，脑，例如纹状体、丘脑、延髓、小脑、枕叶皮质和/或前额皮质)中广泛存在或检测多肽，所述中枢神经组织反映远离给药部位和可选地贯穿中枢神经组织(例如，脑，例如纹状体、丘脑、延髓、小脑、枕叶皮质和/或前额皮质)的分布。

术语“多核苷酸”和“核酸”在本文中可互换使用，是指所有形式的核酸、寡核苷酸，包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)及其聚合物。多核苷酸包括基因组DNA、cDNA 和反义DNA，以及剪接或未剪接的mRNA、rRNA、tRNA和抑制性DNA或RNA(RNAi，例如小或短发夹(sh)RNA、微小RNA(miRNA)、小或短干扰(si)RNA、反式剪接RNA 或反义RNA)。多核苷酸可包括天然存在的、合成的和有意修饰的或改变的多核苷酸(例如，变体核酸)。多核苷酸可以是单链、双链或三链，线性或环状，并且可以是任何合适的长度。在讨论多核苷酸时，根据以5'至3'方向提供序列的惯例，本文可描述特定多核苷酸的序列或结构。

编码多肽的核酸通常包含编码多肽的开放阅读框。除非另有说明，否则特定核酸序列还包括简并密码子取代。

核酸可包括与开放阅读框可操作地连接的一种或多种表达调控或调节元件，其中一个或多个调节元件配置成指导在哺乳动物细胞中的由开放阅读框编码的多肽的转录和翻译。表达调控/调节元件的非限制性示例包括转录起始序列(例如，启动子、增强子、TATA盒等)、翻译起始序列、mRNA稳定序列、poly A序列、分泌序列等。表达调控/调节元件可以从任何合适的生物体的基因组中获得。非限制性示例包括SV40早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒LTR 启动子；腺病毒主要晚期启动子(Ad MLP)；单纯疱疹病毒(HSV)启动子、巨细胞病毒(CMV) 启动子(诸如CMV立即早期启动子区(CMVIE))、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子、pol II启动子、pol III启动子、合成启动子、杂合启动子等。此外，衍生自非病毒基因的序列，例如鼠金属硫蛋白基因，也可用于本文。示例性组成型启动子包括编码某些组成型或“管家”功能的用于以下基因的启动子：次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、腺苷脱氨酶、磷酸甘油激酶(PGK)、丙酮酸激酶、磷酸甘油变位酶、肌动蛋白启动子和本领域技术人员已知的其他组成型启动子。此外，许多病毒启动子在真核细胞中组成型地起作用。这些包括：SV40的早期和晚期启动子；Moloney白血病病毒和其他逆转录病毒的长末端重复(LTR)；和其他许多单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子。因此，任何上述组成型启动子可用于控制异源基因插入物的转录。

诱导型启动子控制下的基因仅在诱导剂存在下表达或更大程度地表达(例如，在某些金属离子存在下，金属硫蛋白启动子控制下的转录大大增加)。诱导型启动子包括应答元件(RE)，其在结合诱导因子时刺激转录。例如，存在针对血清因子、类固醇激素、视黄酸和环AMP 的RE。可以选择含有特定RE的启动子以获得诱导型应答，并且在一些情况下，RE本身可以连接到不同的启动子，从而赋予重组基因可诱导性。因此，通过选择合适的启动子(组成型与诱导型；强与弱型)，可以控制遗传修饰细胞中多肽的存在和表达水平。如果编码多肽的基因处于诱导型启动子的控制之下，则通过将遗传修饰的细胞原位暴露于允许多肽转录的条件，例如通过腹膜内注射控制该试剂转录的诱导型启动子的特异性诱导物，原位触发多肽的递送。例如，通过遗传修饰的细胞原位表达由金属硫蛋白启动子控制下的基因编码的多肽，是通过使遗传修饰的细胞与含有适当(即诱导)金属离子的溶液原位接触来增强。

当核酸与另一核酸序列处于功能关系时，它是“可操作地连接的”。编码多肽的核酸或指导TPP1多肽(例如，具有TPP1活性的多肽)表达的核酸可包括诱导型启动子或用于控制编码多肽转录的组织特异性启动子。

在某些实施例中，CNS特异性或诱导型启动子、增强子等用于本文所述的方法中。CNS 特异性启动子的非限制性示例包括从髓鞘碱性蛋白(MBP)、胶质原纤维酸蛋白(GFAP)和神经元特异性烯醇酶(NSE)的基因中分离的那些。诱导型启动子的非限制性示例包括用于蜕皮激素、四环素、缺氧和IFN的DNA应答元件。

在某些实施例中，表达控制元件包括CMV增强子。在某些实施例中，表达控制元件包含β肌动蛋白启动子。在某些实施例中，表达控制元件包含鸡β肌动蛋白启动子。在某些实施例中，表达控制元件包含CMV增强子和鸡β肌动蛋白启动子。

在某些实施例中，表达控制元件包含与SEQ ID NO：3所示的CMV增强子具有80％或更高同一性的序列和/或与SEQ ID NO：3所示的鸡β肌动蛋白启动子具有80％或更高同一性的序列。在某些实施例中，表达控制元件包含与SEQ ID NO：3具有80％或更高同一性的序列。在某些实施例中，表达控制元件包含SEQ ID NO：3。

可以靶向多肽以递送至细胞外、细胞内或膜位置。从细胞分泌的基因产物通常具有从细胞分泌到细胞外环境的分泌“信号”。还可以构建表达载体以包括分泌“信号”。基因产物也可以保留在细胞内。以类似的方式，基因产物可以包括或可以构建表达载体以包括用于将多肽锚定在细胞质膜内的“保留”信号序列。例如，膜蛋白具有疏水性跨膜区，其在膜中维持蛋白。

如本文所用，术语“修饰”或“变体”及其语法变体意指核酸、多肽或其子序列偏离参考序列。因此，修饰的和变体序列可以具有与参考序列基本相同、更大或更小的表达、活性或功能，但至少保留参考序列的部分活性或功能。变体的特定类型是突变蛋白，其是指由具有突变(例如TPP1中的错义或无义突变)的基因编码的蛋白。

“核酸”或“多核苷酸”变体是指与野生型相比已经基因改变的修饰序列。可以从基因上修饰序列而不改变编码的蛋白序列。或者，可以从基因上修饰序列以编码变体蛋白，例如变体TPP1蛋白。核酸或多核苷酸变体还可以指经过密码子修饰以编码仍然与参考序列(例如野生型蛋白序列)保持至少部分序列同一性的蛋白并且还经过密码子修饰以编码变体蛋白的组合序列。例如，这种核酸变体的一些密码子将被改变而不改变由其编码的TPP1蛋白的氨基酸，并且核酸变体的一些密码子将被改变，其又改变由其编码的TPP1蛋白的氨基酸。

如本文所用的术语“多肽”是指氨基酸的聚合物，包括全长蛋白及其片段。因此，“蛋白”和“多肽”在本文中通常可互换使用。由本文公开的“核酸”或“多核苷酸”序列编码的“多肽”包括部分或全长天然TPP1序列，如天然存在的野生型和功能性多态性蛋白、其功能性子序列(片段)，和修饰形式或其序列变体，只要该多肽保留一定程度的TPP1酶活性即可。因此，在本发明的方法中，由核酸序列编码的此类多肽可以但不必须与缺陷的或者其表达不足或在治疗的哺乳动物中缺乏的内源蛋白TPP1蛋白相同。

可以通过改变相应核酸序列的密码子来实现多肽中的氨基酸变化。基于将某些氨基酸取代多肽结构中的其他氨基酸以改变或改善生物活性，可以获得这样的多肽。例如，通过取代替代氨基酸，可以赋予多肽小的构象变化，其导致活性增加。或者，某些多肽中的氨基酸取代可用于提供残基，然后残基可与其他分子连接以提供肽-分子缀合物，其保留起始多肽的足够性质以用于其他目的。

可以使用氨基酸的亲水指数赋予多肽相互作用的生物学功能，其中发现某些氨基酸可以取代具有相似亲水指数的其他氨基酸并且仍然保留相似的生物活性。或者，可以基于亲水性进行相似氨基酸的取代，特别是在预期用于免疫学实施例的多肽中所需的生物学功能的情况下。“蛋白”的最大局部平均亲水性，由其相邻氨基酸的亲水性决定，与其免疫原性相关。因此，应注意，可以基于赋予每种氨基酸的亲水性进行取代。

在使用赋予每个氨基酸值的亲水性指数或亲水指数时，进行氨基酸的取代，其中这些值为±2，其中±1是典型的，而具有±0.5的那些是最典型的取代。

修饰的非限制性示例包括一个或多个核苷酸或氨基酸取代(例如约1至约3、约3至约5、约5至约10、约10至约15、约15至约20、约20至约25、约25至约30、约30至约40、约40至约50、约50至约100、约100至约150、约150至约200、约200至约250、约250 至约500、约500至约750、约750至约1000或更多核苷酸或残基)。核酸修饰的一个非限制性实例是密码子优化。

氨基酸修饰的示例是保守氨基酸取代或缺失。在特定的实施例中，修饰的或变体序列(例如TPP1)保留未修饰序列(例如野生型TPP1)的功能或活性的至少一部分。

“核酸片段”是给定核酸分子的一部分。大多数生物体中的脱氧核糖核酸(DNA)是遗传物质，而核糖核酸(RNA)涉及DNA中包含的信息到蛋白的转移。所公开的核苷酸序列和蛋白或由其编码的部分长度蛋白的片段和变体也包括在本发明中。“片段”或“部分”是指编码多肽或蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列的全长或小于全长，或多肽或蛋白的氨基酸序列的的全长或小于全长。在某些实施例中，片段或部分是生物学功能的(即保留野生型TPP1的酶活性的5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％)。

分子的“变体”是与天然分子的序列基本相似的序列。对于核苷酸序列，变体包括由于遗传密码的简并性而编码天然蛋白的相同氨基酸序列的那些序列。可以使用分子生物学技术 (例如，使用聚合酶链式反应(PCR)和杂交技术)鉴定天然存在的等位基因变体。变体核苷酸序列还包括合成衍生的核苷酸序列，例如通过使用编码天然蛋白的定点诱变产生的核苷酸序列，以及编码具有氨基酸取代的多肽的核苷酸序列。通常，本发明的核苷酸序列变体与天然(内源)核苷酸序列具有至少40％、50％、60％至70％，例如71％、72％、73％、74％、 75％、76％、77％、78％、至79％，通常至少80％，例如81％-84％，至少85％，例如86％、 87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％的序列同一性。在某些实施例中，变体是生物学功能的(即保留野生型TPP1的酶活性的5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、 90％、95％、99％或100％)。

特定核酸序列的“保守修饰的变体”是指那些编码相同或基本相同的氨基酸序列的核酸序列。由于遗传密码的简并性，大量功能相同的核酸编码任何给定的多肽。例如，密码子CGT、 CGC、CGA、CGG、AGA和AGG都编码氨基酸精氨酸。因此，在密码子指定精氨酸的每个位置，密码子可以改变为所述的任何相应密码子而不改变编码的蛋白。这种核酸变体是“沉默变体”，它是“保守修饰的变体”的一种。除非另有说明，否则本文所述的编码多肽的每个核酸序列也描述了每种可能的沉默变体。本领域技术人员将认识到，可以通过标准技术修饰核酸中的每个密码子(ATG除外，其通常是甲硫氨酸的唯一密码子)以产生功能相同的分子。因此，编码多肽的核酸的每个“沉默变体”隐含在每个所述序列中。

多核苷酸序列的术语“基本同一性”是指多核苷酸包含与使用标准参数描述的比对程序之一的参考序列相比具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％或79％，或至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％或89％，或至少90％、91％、 92％、93％或94％，或甚至至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。本领域技术人员将认识到，通过考虑密码子简并性、氨基酸相似性、阅读框定位等，可以适当调整这些值以确定由两个核苷酸序列编码的蛋白的相应同一性。用于这些目的的氨基酸序列的实质同一性通常意指至少70％、至少80％、90％或甚至至少95％的序列同一性。

在多肽的上下文中，术语“基本同一性”表示多肽包含在指定的比较窗口上与参考序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％或79％，或至少80％、81％、 82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％或89％，或至少90％、91％、92％、93％或94％，或甚至至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。两个多肽序列基本相同的指示是一种多肽与针对第二多肽产生的抗体具有免疫反应性。因此，多肽与第二多肽基本相同，例如，其中两种肽仅通过保守取代而不同。

本文使用的术语“约”是指在参考值的10％(正或负)内的值。

术语“治疗(treat)”和“治疗(treatment)”是指治疗性治疗和预防性(prophylactic)或预防性(preventative)措施，其中目的是预防或减少不希望的生理变化或病症，例如癌症的发展或扩散。出于本发明的目的，有益或期望的临床结果包括但不限于减轻症状、减轻疾病程度、稳定(即没有恶化或进展)症状或疾病状态、延缓或减缓疾病进展、改善或舒缓疾病状态、缓解(无论是部分还是全部)，无论是可检测的还是不可检测的。如果不接受治疗，“治疗”还意味着与预期存活相比延长存活。需要治疗的那些包括已经患有疾病或病症的那些以及易于患有疾病或病症的那些或者要预防疾病或病症的那些。

除非在本文中另有说明或与上下文明显矛盾，否则在描述本发明的上下文中的术语“一 (a)”和“一个(an)”和“该(the)”和类似的指示词应解释为涵盖单数和复数。因此，例如，提及“载体”包括多个这样的载体，提及“病毒”或“颗粒”包括多个这样的病毒体/颗粒并且提及“AAV或rAAV颗粒”包括多个这样的AAV或rAAV颗粒。

除非另有说明，否则术语“包含(comprising)”、“具有(having)”、“包括(including)”和“含有(containing)”应解释为开放式术语(即，意味着“包括但不限于”)。除非本文另有说明，否则本文中对数值范围的描述仅旨在用作单独指代落入该范围内的每个单独值的速记方法，并且每个单独的值并入本说明书中，如同其在本文中单独记述一样。

本文引用的所有申请、出版物、专利和其他参考文献、GenBank引文和ATCC引文均通过引用整体并入。如果发生冲突，将以说明书(包括定义)为准。

除非本文另有说明或上下文明显矛盾，否则本文所述的所有方法可以以任何合适的顺序进行。除非另外声明，否则本文提供的任何和所有示例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用仅旨在更好地说明本发明，而不是对本发明的范围进行限制。说明书中的任何语言都不应解释为表明任何未要求保护的要素对于本发明的实践是必不可少的。

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管与本文描述的那些类似或等同的方法和材料可用于本发明的实践或测试，但本文描述了合适的方法和材料。

本文公开的所有特征可以以任何组合结合。说明书中公开的每个特征可以由用于相同、等同或类似目的的替代特征代替。因此，除非另有明确说明，否则所公开的特征是等同或类似特征的属的示例。

除非上下文另有明确说明，否则所有数值或数值范围包括这些范围内的整数和值的分数或范围内的整数。因此，为了说明，对80％或更高的同一性的引用，包括81％、82％、83％、 84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％等、以及81.1％、81.2％、 81.3％、81.4％、81.5％等、82.1％、82.2％、82.3％、82.4％、82.5％等，等等。

对具有更多(更大)或更小的整数的引用分别包括大于或小于参考数的任何数。因此，例如，对小于100的引用，包括99、98、97等，一直到数值一(1)；并且对小于10的引用，包括9、8、7等，一直到数值一(1)。

如本文所用，除非上下文另有明确说明，否则所有数值或范围包括这些范围内的值的分数和整数以及这些范围内的整数的分数。因此，为了说明，对数值范围的引用，例如1-10包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10，以及1.1、1.2、1.3、1.4、1.5等等。因此，对1-50的范围的引用包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、 20等，直到并包括50，以及1.1、1.2、1.3、1.4、1.5等，2.1、2.2、2.3、2.4、2.5等，等等。

对一系列范围的引用包括组合系列内不同范围的边界的值的范围。因此，为了说明一系列范围的引用，例如，1-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-75、75-100、100-150、 150-200、200-250、250-300、300-400、400-500、500-750、750-1、000、1、000-1、500、1、500-2000，2000-2500、2500-3000、3000-3500、3500-4000、4000-4500、4500-5000、5500-6000、 6000-7000、7000-8000或8000-9000，包括10-50、50-100、100-1000、1000-3000、2000-4000 等的范围。

本文通常使用肯定语言来公开本发明以描述许多实施例和方面。本发明还具体包括其中全部或部分排除特定主题的实施例，例如物质或材料、方法步骤和条件、方案或程序。例如，在本发明的某些实施例或方面中，排除了材料和/或方法步骤。因此，即使本发明通常不以本发明不包括的内容表达，然而，本文公开了未在本发明中明确排除的方面。

本文描述了本发明的实施例。在阅读前面的描述后，这些实施例的变化对于本领域普通技术人员而言将变得显而易见。发明人期望熟练的技术人员适当地采用这些变化，并且发明人希望本发明以不同于本文具体描述的方式实施。因此，本发明包括适用法律所允许的所附权利要求中所述主题的所有修改和等同物。此外，除非本文另有说明或上下文明显矛盾，否则本发明包括其所有可能变型中的要素的任何组合。因此，以下实施例旨在说明但不限制所要求保护的本发明的范围。

示例1

人TPP1序列

人TPP1蛋白序列(SEQ ID NO：1)：

MGLQACLLGLFALILSGKCSYSPEPDQRRTLPPGWVSLGRADPEEELSLTFALRQQNVE RLSELVQAVSDPSSPQYGKYLTLENVADLVRPSPLTLHTVQKWLLAAGAQKCHSVITQDFLT CWLSIRQAELLLPGAEFHHYVGGPTETHVVRSPHPYQLPQALAPHVDFVGGLHHFPPTSSL RQRPEPQVTGTVGLHLGVTPSVIRKRYNLTSQDVGSGTSNNSQACAQFLEQYFHDSDLAQF MRLFGGNFAHQASVARVVGQQGRGRAGIEASLDVQYLMSAGANISTWVYSSPGRHEGQEP FLQWLMLLSNESALPHVHTVSYGDDEDSLSSAYIQRVNTELMKAAARGLTLLFASGDSGA GCWSVSGRHQFRPTFPASSPYVTTVGGTSFQEPFLITNEIVDYISGGGFSNVFPRPSYQEEAV TKFLSSSPHLPPSSYFNASGRAYPDVAALSDGYWVVSNRVPIPWVSGTSASTPVFGGILSLIN EHRILSGRPPLGFLNPRLYQQHGAGLFDYTRGCHESCLDEEVEGQGFCSGPGWDPVTGWG TPNFPALLKTLLNP

人TPP1核酸序列(SEQ ID NO：2)：

AAV载体生产：使用标准三重转染方法并通过CsCl梯度离心纯化产生在CMV早期增强子/鸡β-肌动蛋白(CAG)启动子控制下表达人TPP1的重组AAV4载体(Wright，2008；Wright， 2009)。凝胶电泳(SDS-PAGE)和PCR后，通过银染法定量滴度(Wright，2008；Wright， 2009)。

CAG启动子序列(SEQ ID NO：3)：

ATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCT GACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGC CAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGG CAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAAT GGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACA TCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCT CCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGC AGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCG AGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGC TCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGC GCGCGGCGGGCGGGGAGTCGCTGCGACGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGC CGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGC GGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTTGTTTCTT TTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGAG CGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCTCCGCG CTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCAGTG TGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGGCTGCGAGG GGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCG CGTCGGTCGGGCTGCAACCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCG GCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTACGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGG GGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCT CGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGAGCC GCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAA TCTGTGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGGC GAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCC GCGCCGCCGTCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTCGGGGCTGTCCGCGGGGGGACGGCTGCC TTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAG AGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCT GGTTATTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAA

示例2

组织样品中的TPP1活性。使用先前描述的改进方法测定TPP1活性(Sohar，I.，etal.2000. ClinChem，46：1005-8)。简言之，将样品用实验室匀浆器(P200；Pro Scientific，Oxford， CT)在200μl冰冷的匀浆缓冲液-0.1％Triton X-100的生理盐水中用完全蛋白酶抑制剂混合物 (Roche，Mannheim，Germany)匀浆。通过在21×10³rcf，4℃×15分钟离心从匀浆中除去不溶性物质，并通过DC蛋白测定法(Biorad，Hercules，CA)定量上清液中的蛋白含量。将蛋白(10μl)加入具有酶底物(250μmol/l Ala-Ala-Phe 7-酰氨基-4-甲基香豆素在柠檬酸钠缓冲液中，pH 4.0)的含有90μl的100mM柠檬酸钠缓冲液、150mM NaCl和0.1％triton X-100(pH4.0) 的96孔黑色壁板的孔中。使用SpectraMax M5酶标仪(MolecularDevices，Sunnyvale，CA) 在37℃下以355±9nm激发波长和460±15nm发射波长定量平板。使用纯化的重组人TPP1(来自新泽西州立大学P.Lobel的慷慨礼物)作为标准。

脑脊液(CSF)中的TPP1活性。如(Tian,Y.,et al.2006.J Biol Chem,281:6559-72)中所述活化TPP1酶原。汇集来自相同研究组中的动物的CSF，并在室温下与相同体积的100mM 乙酸盐缓冲液、150mM NaCl和0.1％triton X-100(pH4.0)一起温育过夜。如在组织样品中定量活化的TPP1。

心室内AAV载体给药。将动物完全麻醉。将注射部位剃毛并将小鼠安装到Kopf立体定位装置中并继续通过鼻锥接受2％异氟烷/氧气混合物。在皮下切口前给予镇痛药(美洛昔康， 1-10mg/kg)。局部给予眼科软膏以防止手术期间的眼睛干燥。通过吸取和排出测试物品20次，填装具有0.4”33GA Hamilton针的10或25μl Hamilton注射器；丢弃测试物品。将注射器装载新的测试物品，然后装入注入器(Stoelting Company)。切口部位被清理干净。注射部位由前囟(前部+0.3mm，侧面-1.0mm)计算，然后在颅骨中制作钻孔。然后将具有测试物品的针从脑表面下沉-2.0mm深，以200nl/min的速率输注测试物品，并且在输注之后，收回之前，使针停留5分钟。使用不可吸收的缝合线闭合切口。在麻醉前从局部给予镇痛剂(BupivicaineHCl，0.5％)，以减轻手术后的疼痛和不适。

震颤测定。已经观察到正常和CLN2^-/-小鼠之间震颤幅度的差异，这可以通过酶替代疗法来预防(Chang,M.,et al.2008.MolTher,16:649-56；Chen,Y.H.,et al.2009.NatMed,15: 1215-8)。对于目前的研究，在注射后5周在动物中进行震颤测定。研究中包括的野生型和未注射的CLN2^-/-小鼠作为对照。用震颤监测系统(San Diego Instruments，SanDiego，CA)进行震颤测定。震颤监测系统是一个机柜，其提供声音衰减和视觉隔离，配备有密围式气缸，该气缸位于带有压电传感器的平台上。该传感器将动物震颤转换为电流。信号在震颤监测设备托架中放大并发送到计算机进行记录。记录以每秒128个样本和200-206mV的增益进行。适应3分钟后，在5分钟内记录动物震颤。将震颤信号量化为相对于频率(Hz)的振幅(dBV)。统计分析包括双向方差分析，然后进行Sidak多重比较检验作为事后检验。

CSF收集。将动物置于异氟烷诱导室中并暴露于2.5％异氟烷/氧气混合物直至完全麻醉并且没有表现出踏板响应(pedal response)。将注射部位剃毛并将小鼠安装到RWD生命科学(中国深圳)立体定位装置中并继续通过鼻锥接收2％异氟烷/氧气混合物。通过沿着颈部的切口暴露在小脑延髓池上方的膜，并且分离皮肤和颈部肌肉。将玻璃毛细管插入小脑延髓池中，并通过毛细作用收集CSF 20分钟。

收集CSF后，在用20ml冰冷的PBS经心脏灌注安乐死之前和期间，用5％异氟烷/氧气混合物使动物镇静，直到肝脏变成浅咖啡色。收获组织用于死后分析。收集后立即快速冷冻所有组织样品，并储存在-80℃。

AAV载体生物分布。使用Qiagen DNA提取试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)从快速冷冻的脑和外周组织收集基因组DNA。通过每个样品的载体特异性序列的Q-PCR测定DNA的AAV4拷贝/mg，一式三份。正向引物探针序列 (5'-FAM/ATTGTCCAA/ZEN/GCTGGTACAGGCTGT/3IABkFQ)和反向引物探针序列 (CTTTCTCAACCCAAGGCTCTA)由Integrated DNATechnologies(Coralville，IA)合成。将10μl反应(5.5μl Mostermix+4.5μl样品)在CFX384实时系统(BioRad，Hercules，CA) 中在95℃下运行10分钟，然后进行95℃15秒和60℃1分钟的39个循环。使用由AAV4人 TPP1质粒DNA(10e3至10e10拷贝/ml)制备的标准曲线计算来自样品的AAV4基因组拷贝。通过下式计算样品中DNA的最终的AAV4基因组拷贝(vg)/mg：AAV4基因组拷贝(vg) /mg DNA＝2*(AAV4拷贝/ml)_样品/(mg DNA/ml)_样品

前式中的校正因子2用于校正从用于标准曲线的dsDNA质粒到AAV4载体中的ssDNA的转化。

示例3

使用CLN2敲除(CLN^-/-)小鼠模型(其不表达TPP1)进行剂量-反应和稳定性研究。剂量- 反应研究包括注射时5至8周龄的30只小鼠(16只雌性，14只雄性)。稳定性研究包括注射时6至8周龄的14只小鼠(7只雌性，7只雄性)。

表1：剂量-反应研究设计

表2：稳定性研究设计

如上所述，对小鼠用AAV4.CAGhTPP1以1e10、5e10或1e11的剂量注射到右侧脑室的嘴侧面。使用立体定位小鼠框架进行注射，并且使用G.Paxinos和K.B.J.Franklin的Thesterotaxic mouse brain atlas(第2版，学术出版社，2001年)，距前囟点的注射坐标固定为前部+0.3mm，侧面-1mm，距软脑膜深-2mm。该注射点称为“嘴侧注射”(图1A-1H和2A-2G)。

对于剂量研究，以10μl中1e10vg、10μl(RVC302)中5e10vg和15μl中1e11vg的升高剂量注射测试物品；注射后小鼠保持5周。对于稳定性研究，所有动物注射5e10vg并在注射后3、9或12周安乐死。

将测试物品解冻并在心室内注射之前立即用赋形剂稀释。赋形剂是PBS180-F69pH7.4 (0.01M Na₂HP0₄，0.18M NaCl，0.001％Pluronic F-68)。

在剂量研究中，在安乐死之前测定小鼠的震颤行为。对于这两项研究，在用冰冷的PBS 进行心内灌注之前，收集和汇集脑脊液(CSF)。收集脑组织(纹状体、丘脑、延髓、小脑、枕叶皮质和前额皮质)、心脏、脾脏、肝脏和肾脏用于分子分析。组织样品和CSF用于酶活性定量和/或生物分布测定。

对于这两项研究，注射后五周，将动物麻醉并从小脑延髓池收集脑脊髓液(CSF)。

在安乐死之后，通过冰冷的PBS心内灌注清除血液，并且收集来自两个半球的不同脑区域(CSF、纹状体、丘脑、延髓、小脑、枕叶和前额皮质，图1A-1H和2A-2G)，用于通过 TPP1活性测定进行TPP1定量，并且通过QPCR进行AAV4生物分布分析。

为了通过改变坐标来分析室管膜转导的改善，将5e10vg的AAV4.CAG hTPP1输注到更尾侧点(距离前囟；前部-2.18mm，侧面-2.9mm，骨深-3.5mm)的侧脑室。来自这些动物的样品标为“尾侧注射”。如上所述收集样品通过TPP1活性测定用于TPP1定量。

在图2A-2G中显示了TPP1在用于尾侧和嘴侧注射(CSF、纹状体、丘脑、延髓、小脑、枕叶和前额皮质)的不同脑区域中的表达。

示例4

剂量研究总结。对CSF、脑和外周样品进行人TPP1(hTPP1)酶活性测定。从每个治疗组的所有动物汇集CSF。结果显示相对于内源性鼠TPP1水平的明显剂量反应(0.34pmol/mg蛋白；图3)。对于1e10、5e10和1e11vg剂量，重组TPP1水平分别为0.83、12.66和63.70pmolTPP1/mg蛋白。

在分析的大多数脑区域中，重组TPP1水平高于内源性鼠TPP1，并且实质浓度以剂量依赖性方式增加。然而，前额皮质没有显示剂量依赖性增加。前额皮质代表离注射部位最远的脑区，缺乏室管膜细胞。除前额皮质外，所有高剂量动物的重组TPP1水平均显著高于内源性TPP1水平。

死后生物分布分析揭示了含有室管膜细胞的实质穿孔中的AAV4病毒基因组。四种高剂量动物在皮质区域具有病毒基因组。在第四脑室的室管膜细胞中也发现了病毒基因组。病毒载体在整个大脑中的广泛分布可能是由于注射体积与心室容积的高比例。就上下文而言，小鼠心室系统的体积为15μl(图1)，低剂量和中剂量的注射体积为10μl，高剂量组的注射体积为15μl。

在外周组织中的死后病毒生物分布分析显示AAV4基因组主要在低剂量组和高剂量组的脾中(图4)。在两组的肾脏和高剂量组的心脏中发现较低水平的病毒基因组。在中剂量组的外周组织中未发现AAV4病毒基因组。

CLN2^-/-小鼠在12周开始时具有升高的震颤活动并疾病进展(Chang,M.,J.D.Cooper,D.E. Sleat,S.H.Cheng,J.C.Dodge,M.A.Passini,P.Lobel,andB.L.Davidson.2008.MolTher,16: 649-56)。在AAV4CAGhTPP1治疗后5周(10-13周龄)，这种特征性震颤活动减少，在高剂量组中完全预防(图5)。

稳定性研究总结。在取样的所有脑区域中用5e10vg AAV4CAGhTPP1实现重组TPP1的稳定表达，直至研究终止(注射后12周)。值得注意的是，未经处理的CLN2^-/-小鼠的平均寿命为16周。注射后12周组中的所有小鼠比未治疗的CLN2^-/-小鼠存活更长时间，直到它们在19周龄时被安乐死。

结论：

剂量研究。CSF中的重组TPP1水平在AAV4CAGhTPP1注射后五周显示出剂量-反应模式。

在整个脑中检测到成熟的重组TPP1。在三个实验组中，以剂量-反应方式在脑室的脑区域中定量超内源性hTPP1水平。所有剂量在输注部位空间远端的脑区域中达到内源性水平。

AAV4CAGhTPP1载体主要定位于含有室管膜细胞的实质组织穿孔。然而，发现少量病毒颗粒转导心脏和脾脏。

行为测量揭示了高剂量注射动物中的震颤表型的完全预防，和低剂量和中剂量组中震颤表型的部分挽救。

稳定性研究。在接受5e10vg的CLN2^-/-小鼠中，在注射后长达12周维持hTPP1酶原的超内源水平。这些小鼠出乎意料但令人兴奋的结果是寿命延长。

总之，AAV4CAGhTPP1以剂量依赖性方式在CLN2^-/-小鼠的脑中广泛表达。良好耐受AAV4CAGhTPP1并且在注射后12周保持稳定的表达水平，此外，增加了CLN2^-/-小鼠的正常寿命。

示例6

死后分析

剂量研究。所有治疗组在CSF中表达hTPP1酶原水平高于CLN2^+/-动物中的内源水平(图 1)。三个治疗组之间存在显著的线性相关(r²＝0.91)，表明强烈的剂量反应。注射高剂量 AAV4CAGhTPP1(1e11vg)的CLN2^-/-小鼠的酶原表达增加～187倍。中剂量(5e10vg)相对于内源水平增加约37倍。最重要的是，低剂量(1e10vg)也使TPP1酶原水平高于内源水平 (增加约2.4倍)。

测定来自整个脑的不同区域的实质组织穿孔用于hTPP1表达。通常，来自与心室系统(纹状体、丘脑、小脑、延髓)直接相邻的组织的穿孔相对于来自枕骨和前额皮质的穿孔表达更高水平的hTPP1。显著地，从所有治疗组测定的所有脑区域具有至少等于CLN2^+/-小鼠中的内源水平的TPP1表达。这表明低剂量的1e10vg AAV4.CAGhTPP1足以在脑实质中提供足够水平的TPP1(图1)。这些区域中的每一个的线性回归产生支持剂量反应的统计学正斜率。小脑和延髓是最显著的区域，r²分别为＝0.82和0.58。这些数据显示hTPP1酶原在IV心室中的积累，在小脑实质中的渗透性比在延髓中更好。在高剂量(1e11vg)中，相对于纹状体、丘脑、小脑、延髓和枕叶皮质中的内源水平，hTPP1水平有统计学上显著的增加。中剂量(5e10 vg)在纹状体、小脑和延髓中的hTPP1水平也具有统计学上显著的增加。

针对重组TPP1的存在，分析包括心脏、肝脏、肾脏和脾脏的外周组织。所有治疗组在脾脏中具有低但可检测水平的TPP1(图1H)。该分析导致实验组之间的统计学正线性回归(r²＝0.54)，反映了阳性剂量反应。高剂量组的9只小鼠在心脏中具有低浓度的重组酶(小于 0.06pmol TPP1/mg蛋白)。

稳定性研究。在取样的所有脑区域中用5e10vg AAV4.CAGhTPP1实现重组TPP1的稳定表达，直至研究终止(注射后12周；图5)。值得注意的是，未经处理的CLN2^-/-小鼠的平均寿命为16周。然而，接受5e10vg的稳定性研究中的所有小鼠都存活直到19周龄时的安乐死。该数据显示AAV4.CAGhTPP1治疗显然也增加了LINCL小鼠的寿命。

生物分布的分析

剂量研究。使用AAV4CAGhTPP1特异性探针进行Q-PCR以分析病毒生物分布。高浓度的AAV4病毒基因组定位于含有室管膜细胞的实质穿孔。虽然在动物中发现了变异性，但是有一种趋势是在小脑和延髓中表达高水平的病毒颗粒。两个区域都与IV心室相关，IV心室位于注射点的远端。这些结果表明病毒基因组(vg)通过快速CSF流从注射部位转运到IV 心室(图3)。

当在实验组之间进行比较时，在脑中没有发现统计剂量-反应。令人惊讶的是，在中剂量组和高剂量组之间未检测到差异。相反，在中剂量组的外周组织中定量较少数量的病毒基因组，表明大多数病毒颗粒在该剂量下保留在脑中。脾脏具有最高数量的外周组织的病毒基因组。有趣的是，来自高剂量的所有心脏样品具有相似的可检测水平的AAV4.CAGhTPP1。

震颤测定

剂量研究。未治疗的12周龄CLN2^-/-小鼠表现出增强的震颤活动。接受1e10或5e10AAV4CAGhTPP1的年龄匹配的CLN2^-/-小鼠在14-48Hz之间的频率处具有震颤幅度的显著降低(图4)。高(5e10)剂量的AAV4CAGhTPP1完全阻止了疾病表型，因为与对照CLN2^+/-小鼠相比，高剂量组的震颤幅度没有差异。

示例7

在恒河猴中进行研究以评估在单剂量脑室内给予表达hTPP1的AAV载体后TPF1在CSF 中的表达谱随时间的变化。为此，将含有3e13vg AAV2.CAGhTPP1的4mL单侧注入三只恒河猴侧脑室的右枕角。在注射前(第0天)和每7天收集CSF样品。注射后6周处死动物。

通过酶测定法定量脑脊髓液(CSF)中的TPP1水平，并通过mg总蛋白标准化。在所有动物的试验结束时，TPP1浓度逐渐增加至基线水平的9-20倍。这些结果显示单次注射AAV2.CAGhTPP1在恒河猴CSF中产生TPP1水平的强烈增加。

Claims (67)

1.一种治疗患有溶酶体贮积病(LSD)的哺乳动物的方法，所述方法包括以下步骤：

给哺乳动物的大脑或脊柱给予多个AAV颗粒，

所述的AAV颗粒包含

(i)AAV衣壳蛋白；

(ii)插入一对AAV反向末端重复(ITR)之间的核酸，所述核酸编码具有溶酶体水解酶活性的多肽；

(iii)驱动所述核酸表达的表达控制元件；以及

所述AAV颗粒能够转导所述哺乳动物的细胞并提供所述多肽的表达。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述多肽具有三肽基肽酶1(TPP1)活性。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述多肽包含TPP1、其前酶或其酶活性变体。

4.根据权利要求1所述的方法，其中一种或多种AAV ITR包含一种或多种AAV2 ITR。

5.根据权利要求1所述的方法，其中核酸编码哺乳动物TPP1。

6.根据权利要求1所述的方法，其中核酸编码人TPP1。

7.根据权利要求1所述的方法，其中核酸编码具有TPP1活性并且与SEQ ID NO：1所示的人TPP1具有80％或更高同一性的蛋白。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中表达控制元件包含CMV增强子。

9.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中表达控制元件包含β肌动蛋白启动子。

10.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中表达控制元件包含鸡β肌动蛋白启动子。

11.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中表达控制元件包含CMV增强子和鸡β肌动蛋白启动子。

12.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中表达控制元件包含与SEQ ID NO：3所示的CMV增强子具有80％或更高同一性的序列和/或与SEQ ID NO：3所示的鸡β肌动蛋白启动子具有80％或更高同一性的序列。

13.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中表达控制元件包含与SEQ ID NO：3具有80％或更高同一性的序列。

14.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中表达控制元件包含SEQ ID NO：3。

15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中衣壳序列包含与AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、Rh10、Rh74或AAV-2i8 VP1、VP2和/或VP3序列具有70％或更高同一性的VP1、VP2和/或VP3衣壳序列。

16.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中衣壳序列包含与AAV2具有80％或更高同一性的VP1衣壳序列，其中衣壳序列在444、500和/或730位具有用非酪氨酸的氨基酸取代的酪氨酸。

17.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中衣壳序列包含与AAV2具有90％或更高同一性的VP1衣壳序列，其中衣壳序列在444、500和/或730位具有用苯丙氨酸取代的酪氨酸。

18.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中衣壳序列包含AAV2 VP1衣壳序列，其在444、500和/或730位具有用苯丙氨酸取代的酪氨酸。

19.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中衣壳序列包含选自以下任何一种的VP1、VP2或VP3衣壳序列：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、Rh10、Rh74或AAV-2i8 AAV血清型。

20.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，包括将多种AAV颗粒给予于所述哺乳动物的脑。

21.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，包括将多种AAV颗粒给予于所述哺乳动物的脑池、心室内空间、脑室、蛛网膜下腔、鞘内空间和/或室管膜。

22.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，包括将多种AAV颗粒给予于所述哺乳动物的脑脊髓液(CSF)。

23.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，包括将多个AAV颗粒给予于心室系统。

24.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，包括将多个AAV颗粒给予于嘴侧脑室。

25.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，包括将多个AAV颗粒给予于尾侧脑室。

26.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，包括将多个AAV颗粒给予于右侧和/或左侧脑室。

27.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，包括将多个AAV颗粒给予于右侧和/或左侧嘴侧脑室。

28.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，包括将多个AAV颗粒给予于右侧和/或左侧尾侧脑室。

29.根据权利要求1-28中任一项所述的方法，其中所述AAV颗粒接触所述哺乳动物的室管膜细胞。

30.根据权利要求1-29中任一项所述的方法，还包括向所述哺乳动物给予第一免疫抑制剂。

31.根据权利要求30所述的方法，还包括向所述哺乳动物给予第二免疫抑制剂。

32.根据权利要求30或31所述的方法，其中在给予所述AAV颗粒之前将所述第一免疫抑制剂和所述第二免疫抑制剂中的至少一种给予于所述哺乳动物。

33.根据权利要求30或31所述的方法，其中在给予所述AAV颗粒之前，给予所述第一免疫抑制剂，以及在给予所述AAV颗粒之前、同时或之后，给予所述第二免疫抑制剂。

34.根据权利要求30-33中任一项所述的方法，其中所述第一免疫抑制剂包含环孢菌素。

35.根据权利要求34所述的方法，其中以约5-20mg/kg的剂量一天两次给予所述环孢菌素，持续至少3个月的时间。

36.根据权利要求34所述的方法，其中在给予所述AAV颗粒1-2个月后，减少给予的所述环孢菌素的剂量。

37.根据权利要求30-36中任一项所述的方法，其中所述第二免疫抑制剂包含霉酚酸酯或其衍生物。

38.根据权利要求37所述的方法，其中所述霉酚酸酯衍生物是麦考酚酸酯(MMF)。

39.根据权利要求30-38中任一项所述的方法，其中(i)在给予所述AAV颗粒之前至少约两周给予所述第一免疫抑制剂，(ii)在给予所述AAV颗粒之后，约两周或60天内给予所述第二免疫抑制剂。

40.根据权利要求37-39中任一项所述的方法，其中以每天约5-20mg/kg的剂量给予所述霉酚酸酯或其衍生物。

41.根据权利要求1-40中任一项所述的方法，其中以约1×10⁸至约1×10¹⁵vg/kg的剂量给予所述AAV颗粒。

42.根据权利要求1-41中任一项所述的方法，其中包含所述哺乳动物的脑脊髓液(CSF)的细胞由所述AAV颗粒转导。

43.根据权利要求1-42中任一项所述的方法，其中所述AAV颗粒转导所述哺乳动物的室管膜细胞。

44.根据权利要求1-43中任一项所述的方法，其中用所述AAV颗粒转导的细胞表达并分泌所述多肽到所述哺乳动物的CSF中。

45.根据权利要求2-44中任一项所述的方法，其中，所述哺乳动物的脑脊液中的三肽基肽酶1(TPP1)活性可以检测到至少5pmol TPP1/mg蛋白的水平，可选地持续超过350天。

46.根据权利要求1-45中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物是非啮齿动物哺乳动物。

47.根据权利要求46所述的方法，其中所述非啮齿动物哺乳动物是灵长类动物。

48.根据权利要求46所述的方法，其中所述非啮齿哺乳动物是人。

49.根据权利要求48所述的方法，其中所述人是儿童。

50.根据权利要求49所述的方法，其中所述儿童的年龄为约1至约4岁。

51.根据权利要求1-50中任一项所述的方法，其中所述LSD是婴儿或晚期婴儿蜡状脂褐质病(LINCL)、神经病变Gaucher、青少年Batten、Fabry、MLD、Sanfilippo A、Hunter、Krabbe、Morquio、Pompe、Niemann-Pick C、Tay-Sachs、Hurler(MPS-I H)、Sanfilippo B、Maroteaux-Lamy、Niemann-Pick A、胱氨酸贮积症、Hurler-Scheie(MPS-I H/S)、Sly综合征(MPS VII)、Scheie(MPS-I S)、婴儿Batten、GM1神经节苷脂沉积症、粘脂沉积症II/III型或Sandhoff病。

52.根据权利要求1-51中任一项所述的方法，其中所述AAV颗粒的给予包括注射所述AAV颗粒。

53.根据权利要求1-52中任一项所述的方法，其中与所述LSD相关的症状的发作延迟5-10、10-25、25-50或50-100天。

54.根据权利要求53所述的方法，其中所述症状选自由放射性反应、眼球震颤、威胁、瞳孔光反射、小脑性共济失调和意向性震颤组成的组。

55.根据权利要求1-54中任一项所述的方法，其中与所述LSD相关的可测量的认知功能丧失延迟5-10、10-25、25-50或50-100天。

56.根据权利要求1-55中任一项所述的方法，其中患有所述LSD的哺乳动物的寿命延长5-10、10-25、25-50或50-100天。

57.根据权利要求1-56中任一项所述的方法，其中在给予所述AAV颗粒后至少30、60、90、120或更多天，在所述哺乳动物的CSF中未检测到中和抗体。

58.根据权利要求1-57中任一项所述的方法，其中在所述给予所述AAV颗粒后至少250天内，在所述哺乳动物的CSF中未检测到中和抗体。

59.根据权利要求1-58中任一项所述的方法，其中在所述哺乳动物的脾脏或心脏中表达所述多肽。

60.根据权利要求1-59中任一项所述的方法，其中在所述哺乳动物的纹状体、丘脑、延髓、小脑、大脑、枕叶皮质或前额皮质中表达所述多肽。

61.根据权利要求1-60中任一项所述的方法，其中所述表达控制元件在所述哺乳动物的纹状体、丘脑、延髓、小脑、大脑、枕叶皮质或前额皮质中的一个或多个中提供比所述CMV启动子更高的所述核酸或多肽表达。

62.根据权利要求1-61中任一项所述的方法，其中所述表达控制元件在所述哺乳动物的纹状体、丘脑、延髓、小脑、大脑、枕叶皮层或前额皮质中的一个或多个中提供比所述CMV启动子高约1-4倍的所述核酸或多肽表达。

63.根据权利要求1-62中任一项所述的方法，其中所述表达控制元件在所述哺乳动物的纹状体、丘脑、延髓、小脑、大脑、枕叶皮层或前额皮质中的一个或多个中提供比所述CMV启动子高约1-2倍的所述核酸或多肽表达。

64.根据权利要求1-63中任一项所述的方法，其中所述AAV颗粒选自由AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV-rh74、AAV-rh10和AAV-2i8颗粒组成的组。

65.根据权利要求1-64中任一项所述的方法，其中所述ITR的一个或多个选自由AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV-rh74、AAV-rh10和AAV-2i8组成的组。

66.根据权利要求1-65中任一项所述的方法，其中衣壳序列包含与AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、Rh10、Rh74或AAV-2i8 VP1、VP2和/或VP3序列具有90％或更高同一性的VP1、VP2和/或VP3衣壳序列。

67.根据权利要求1-66中任一项所述的方法，其中衣壳序列包含选自以下任何一种的VP1、VP2或VP3衣壳序列：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、Rh10、Rh74或AAV-2i8 AAV血清型。