CN114746556A - 用于治疗山菲立普病和其他障碍的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本公开提供对治疗遗传疾病、脑障碍及神经系统的疾病和障碍有用的新型载体和方法，包括基因疗法载体和施用此类载体至需要其的受试者的方法。

Description

用于治疗山菲立普病和其他障碍的组合物和方法
相关申请的交叉引用
此申请要求提交于2019年7月18日的美国临时申请号62/875,809的优先权权益，所述临时申请的全部内容特此通过引用并入。
序列表
与此申请相关的序列表以文本格式提供以代替纸质副本，并且特此通过引用并入本说明书内。含有序列表的文本文件的名称为LYSO-003_01WO_SeqList_ST25.txt。该文本文件为约86 KB，创建于2019年7月17日，并且正在经EFS-Web电子提交。
背景
领域
在一些实施方案中，本发明涉及基因疗法载体，以及单独地或者与一种或多种免疫抑制剂组合地使用此类基因疗法载体治疗遗传疾病的方法，所述遗传疾病包括溶酶体贮积障碍以及脑疾病和障碍。
相关领域的描述
黏多糖病III型(Mucopolysaccharidosis type III, MPSIII)，也被称为山菲立普综合征(Sanfilippo syndrome)，是属于黏多糖病(MPS)组的罕见的溶酶体贮积疾病(LSD)。这些溶酶体贮积疾病(LSD)由消化蛋白缺失或功能异常引起，致使随后细胞中底物的积累，导致细胞和器官非常严重的功能异常。黏多糖或糖胺聚糖(GAG)为对正常细胞功能至关重要的不断再循环的大分子。在MPS中，参与GAG逐步降解的其中一种溶酶体酶的缺陷导致它们的积累，并导致严重的细胞功能异常。MPS形成一组复杂的遗传疾病，这些疾病通过它们的遗传起源、生化和生理紊乱以及临床表现而有所区别。取决于突变的基因，一种或几种类型的GAG的分解代谢会被阻断，一些酶参与多种GAG种类的降解途径。
黏多糖病III型(MPSIII)为罕见的溶酶体贮积疾病，其影响每100,000活产中的0.7到1.8人(在法国为0.73和在英国为1.7)，且其中常染色体隐性遗传缺陷导致部分降解的硫酸乙酰肝素寡糖的积累。
山菲立普A型综合征或黏多糖病III型A型(MPSIIIA)由N-磺基葡糖胺磺基水解酶(N-sulfoglycosamine sulfohydrolase, SGSH)的常染色体隐性遗传缺陷引起。此酶在组织中遍在地表达并参与硫酸乙酰肝素(HS)的逐步降解。在不存在它的情况下，部分降解的寡糖积累至有毒水平。
山菲立普A型综合征为影响儿童的严重衰弱性和威胁生命的溶酶体贮积疾病。临床表现主要为神经系统的，通常在生命前5年期间观察到早期症状，导致认知能力的进行性退化。受影响的儿童在幼儿期需要特殊照顾，并进行性地发展出严重的智力迟滞，伴随最少的身体表现[1]。死亡通常发生在15岁前，尽管一些患者在20岁后仍然存活。目前对于患山菲立普A型综合征的患者尚无可用的治疗。
MPS治疗方法的基本原理基于观察到递送缺失的酶逆转遗传缺陷细胞中的表型异常。MPS酶替代治疗依赖于由缺陷细胞通过结合至甘露糖-6-磷酸酶受体内化细胞外酶。正在对酶代替疗法(ERT)进行探究，但其目前尚不可用于MPSIIIA。
MPS已被认为是基因疗法的主要候选疾病。使用离体或原位基因转移，缺失的酶可由一组遗传修饰的细胞产生并分配至生物体。在MPS的动物模型中的大量研究已描述包括骨髓、皮肤、肌肉、肝脏和脑在内的组织的遗传修饰的效果，其导致治疗活性酶的产生。然而当载体被施用于外周时，所产生的酶并不穿过血脑屏障。只有在循环中非常高剂量的酶可导致可检测的进入脑的运输。基因疗法方法的此缺点不限于MPS，还限制使用基因疗法治疗其他脑疾病和障碍。
相应地，在本领域中明显存在对基因疗法载体和方法的需要，所述基因疗法载体和方法提供直接进入脑的施用，用于治疗MPS和影响脑的其他疾病和障碍。本发明通过提供改善的基因疗法载体以及其他改善的方法满足这些需求，所述方法通常可应用于治疗遗传疾病以及神经系统和脑的疾病和障碍，以及更具体地可应用于治疗MPS，包括山菲立普A型。
简述
本公开提供对治疗遗传疾病、脑障碍以及神经系统的疾病和障碍有用的新型载体和方法，包括基因疗法载体。
在一个实施方案中，本公开包括包含表达盒的复制缺陷的腺相关病毒(AAV)衍生载体，所述表达盒按以下5’至3’顺序包含：启动子序列；编码人类N-磺基葡糖胺磺基水解酶(N-sulfoglucosamine sulfohydrolase, SGSH)多肽或其活性变体的多核苷酸序列；以及多腺苷酸化(多聚A)序列。在一些实施方案中，载体不包括编码人类硫酸酯酶修饰因子1(SUMF1)多肽或其任意活性变体的多核苷酸序列。在某些实施方案中，启动子序列可操作地连接至编码人类N-磺基葡糖胺磺基水解酶多肽或其活性变体的多核苷酸序列。在一些实施方案中，编码人类N-磺基葡糖胺磺基水解酶的多核苷酸序列包含根据SEQ ID NO: 13的序列。
在一些实施方案中，启动子序列为CMV早期增强子/鸡β肌动蛋白(CAG)启动子。在一些实施方案中，CAG启动子包含根据SEQ ID NO: 12的序列。在一些实施方案中，载体不包括IRES序列。在一些实施方案中，多聚A序列衍生自人类生长激素1多聚A序列。在一些实施方案中，多聚A序列包含根据SEQ ID NO: 17的序列。在特定实施方案中，载体为AAV血清型rh10。在一些实施方案中，载体包含根据SEQ ID NO: 9的序列。在一些实施方案中，SEQ IDNO: 9包含被衣壳化于LYS-SAF302颗粒中的DNA序列。
在该载体的某些实施方案中，表达盒按以下5’至3’顺序包含以下元件或由其组成：衍生自CAG启动子序列的启动子序列；编码人类N-磺基葡糖胺磺基水解酶(SGSH)多肽或其活性变体的多核苷酸序列；以及衍生自人类生长激素多聚A序列的多聚A序列。在该载体的特定实施方案中，表达盒侧翼为两个AAV2反向末端重复(inverted terminal repeat,ITR)序列，其中两个AAV2 ITR序列的其中一个位于表达盒的5’且两个AAV2 ITR序列的其中一个位于表达盒的3’。在一些实施方案中，两个ITR末端为基因组复制和包装所需的仅有的顺式作用元件。在一些实施方案中，每个ITR含有约100、约110、约120、约130、约140、约145、约150或约160个核苷酸。在一些实施方案中，位于表达盒5’末端的ITR序列包含根据SEQ IDNO: 10的核苷酸序列。在一些实施方案中，位于表达盒3’末端的ITR序列包含根据SEQ IDNO: 11的核苷酸序列。
在特定实施方案中，载体进一步包含AAVrh.10衣壳或血清型。
在一些实施方案中，载体的DNA包含4.07kb或由其组成，且序列的分子量为1257.4kDa。在一些实施方案中，SGSH序列包含1.35kb或由其组成，且SGSH DNA的分子量为471.3kDa。
相关实施方案包括本文所述的任意表达盒和包含本文所述表达盒的质粒。进一步相关的实施方案包括包含本文所述的质粒或载体的宿主细胞。在特定实施方案中，宿主细胞为离体的。在一个实施方案中，宿主细胞为293细胞，如293T细胞。
在另一个实施方案中，本公开包括用于产生根据本公开的载体的方法或过程，其包含引入包含本文所述的表达盒的质粒至宿主细胞内，其中表达盒的侧翼为两个AAV2内部末端重复(internal terminal repeat, ITR)序列，并且培养宿主细胞以产生本文所述的载体。在特定实施方案中，表达盒按以下5’至3’顺序包含以下元件或由其组成：启动子序列；编码人类N-磺基葡糖胺磺基水解酶(SGSH)多肽或其活性变体的多核苷酸序列；以及多腺苷酸化(多聚A)序列。在某些实施方案中，该方法或过程进一步包含引入辅助质粒至所述宿主细胞内。在特定实施方案中，所述辅助质粒包含编码以下的多核苷酸序列：衣壳蛋白，例如来自AAVrh.10；复制基因，例如来自AAV2；以及辅助功能，例如衍生自腺病毒血清型5。在一些实施方案中，本公开包括用于产生根据本公开的载体的方法或过程，其包含三种质粒的使用。在一些实施方案中，第一质粒包含表达盒，该表达盒按以下5’至3’顺序包含以下元件或由其组成：启动子序列、编码人类SGSH多肽或其活性变体的多核苷酸序列以及多腺苷酸化序列。在一些实施方案中，表达盒的侧翼为两个AAV ITR序列。在一些实施方案中，表达盒和侧翼序列一起包含根据SEQ ID NO: 9的序列或由其组成。在一些实施方案中，第一质粒包含根据SEQ ID NO: 14的多核苷酸或由其组成。在一些实施方案中，第二质粒包含编码衣壳蛋白(例如来自AAVrh10的衣壳蛋白)的多核苷酸序列。在一些实施方案中，第二质粒包含根据SEQ ID NO: 15的多核苷酸。在一些实施方案中，第三质粒提供辅助功能，例如衍生自腺病毒的辅助功能。在一些实施方案中，第三质粒包含根据SEQ ID NO: 16的多核苷酸。在一些实施方案中，本文提供的方法和过程包含将第一、第二和第三质粒引入至宿主细胞内。例如在一些实施方案中，本文提供的方法和过程包含将包含根据SEQ ID NO: 14、15和16的序列的质粒引入至宿主细胞内。在一些实施方案中，将质粒引入至宿主细胞内且培养宿主细胞以产生本文所述的载体。在一些实施方案中，所得载体被称为SAF302 (本文中也称为LYS-SAF302)。
进一步相关的实施方案包括包含本文所述的载体和药学上可接受运载体的组合物。在一些实施方案中，本公开提供包含本文提供的载体和没有赋形剂或防腐剂的PBS缓冲液的制剂。在一些实施方案中，PBS缓冲液包含KCl、KH2PO4和NaCl、Na2HPO4。在进一步的实施方案中，PBS缓冲液包含约2.67 mM KCl、约1.47 mM KH2PO4、约137.9 mM NaCl和约8.05 mMNa2HPO4。在一些实施方案中，制剂具有约6.8至约7.8的pH，或从约7.0至约7.6的pH，或从约7.2至约7.4的pH。在一些实施方案中，制剂适合于储存在-80℃ ± 10℃。在一些实施方案中，本文提供的制剂在施用至受试者前通过0.2微米内联过滤器进行过滤。
本公开的另一个相关实施方案包括治疗山菲立普A型综合征的方法，该方法包含将含有本文所述载体的组合物施用至需要其的受试者。在特定实施方案中，载体包含表达盒，该表达盒按以下5’至3’顺序包含以下元件或由其组成：AAV2 ITR序列；CAG启动子序列；编码人类N-磺基葡糖胺磺基水解酶(SGSH)多肽或其活性变体的多核苷酸序列；以及人类生长激素多聚A序列；其中CAG启动子序列可操作地连接至编码SGSH多肽的多核苷酸序列。在某些实施方案中，该表达盒不包括编码SUMF1多肽或其任意活性变体的多核苷酸序列。在一些实施方案中，表达盒的侧翼为两个AAV2内部末端重复(ITR)序列。
在此方法的特定实施方案中，组合物经脑内注射施用至受试者脑内的一个或多个位点。在某些实施方案中，组合物被施用至受试者脑中的二至二十个位点、四至十六个位点、八至十六个位点或六至十二个位点。例如在一些实施方案中，组合物经每个半球2-4次注射，总计每个受试者4-8次注射施用至受试者的脑。在一个实施方案中，组合物被施用至受试者脑中的六个位点。在一些实施方案中，组合物被施用至每个半球三个位点。在某些实施方案中，组合物通过在受试者头部的一个或多个钻孔(例如在受试者头部的六个钻孔)经注射而施用，其中组合物以单一深度通过每个钻孔或轨迹施用。每个注射位点可为深层或浅表的。例如，深层注射在距皮层表面约1.5 cm至约3.0 cm，或约1.7 cm至约2.5 cm，或约2cm的深度实施；以及浅表注射在距皮层表面约0.5 cm至约2.0 cm，或约0.7 cm至约1.5 cm，或约1 cm的深度实施。在某些实施方案中，位点选自以下的一种或多种：右前侧浅表、右前侧深层、左前侧浅表、左前侧深层、右中侧浅表、右中侧深层、左中侧浅表、左中侧深层、右后侧浅表、右后侧深层、左后侧浅表和左后侧深层。
在某些实施方案中，将总计约1.0x1010 gc至约1.0x1014 gc，约5.0x1010 gc至约5.0x1013 gc，约5.0x1010 gc至约1.0x1013 gc，约1.0x1011 gc至约1.0x1013 gc，约1.0x1011 gc至约5.0x1012 gc，约5.0x1011 gc至约5.0x1012 gc，或约5x1010至约5x1013 gc，或约7x1010至约7x1013 gc的病毒载体施用至受试者。在某些实施方案中，将总计约7.2 x 1012 gc的病毒载体施用至受试者。在某些实施方案中，将约0.8x109 gc至约0.8x1013 gc、约0.4x1010 gc至约0.4x1013 gc、约0.4x1010 gc至约0.8x1012 gc、约0.8x1010 gc至约0.8x1012 gc、约0.8x1010 gc至约0.4x1012 gc或约0.4x1011 gc至约0.4x1012 gc的病毒载体施用至受试者的各个位点。在特定实施方案中，将约1.2x1012gc的病毒载体施用至受试者的各个位点。在特定实施方案中，将约1.2x1012gc的病毒载体施用至受试者的脑或白质中六个位点的每一个，使得将约7.2x1012 gc的病毒载体施用受试者。在某些实施方案中，包含施用至各个位点的基因疗法载体的组合物的体积为约10 µl至约600 µl。在一些实施方案中，包含施用至各个位点的基因疗法载体的组合物的体积为约500 µl。在特定实施方案中，用于施用包含基因疗法载体的组合物的输注速率为约0.1 µl/min至约10 µl/min，约0.2 µl/min至约8 µl/min，约0.3 µl/min至约6 µl/min，或约0.4 µl/min至约4.0 µl/min，或约0.4 µl/min至约3.0 µl/min，或约5.0 µl/min。在一些实施方案中，该方法进一步包含将免疫抑制方案施用至受试者。在一些实施方案中，免疫抑制方案包含他克莫司(tacrolimus)、霉酚酸酯(mycophenolate mofetil)和泼尼松(prednisone)。
在相关实施方案中，本公开包括用作治疗山菲立普A型综合征的药剂的本文所述的载体。在特定实施方案中，用作治疗山菲立普A型综合征的药剂的载体按5’至3’顺序包含以下表达盒，其中CAG启动子序列可操作地连接至编码SGSH的多核苷酸序列：AAV2 ITR序列；CAG启动子序列；编码人类N-磺基葡糖胺磺基水解酶(SGSH)多肽或其活性变体的多核苷酸序列；人类生长激素多聚A序列；以及AAV2 ITR序列。用作药剂的载体用于经本文提供的方法施用。
在用作治疗山菲立普A型综合征的药剂的载体的特定实施方案中，该药剂进一步包含药学上可接受支持体、运载体、稀释剂或赋形剂。在某些实施方案中，药剂为乳浊液或水溶液。在某些实施方案中，药剂包含没有赋形剂或防腐剂的缓冲剂。在进一步的实施方案中，缓冲剂为PBS缓冲液。
在相关实施方案中，本公开包括产生本公开的载体的过程，其包含将含有本公开的表达盒的质粒引入至宿主细胞内；以及培养宿主细胞以产生载体。在特定实施方案中，质粒进一步包含在表达盒侧翼的AAV2 ITR。
在进一步相关的实施方案中，本公开包括包含本公开的表达盒的质粒。在特定实施方案中，质粒进一步包含在表达盒侧翼的AAV2 ITR。
在另一个相关实施方案中，本公开包括包含本公开的载体、质粒或表达盒的宿主细胞。在特定实施方案中，宿主细胞为人类胚肾细胞，例如293或293T细胞。
在一些实施方案中，本公开提供试剂盒，其包含(a)含有本文提供的质粒的载体和(b)其使用说明。在一些实施方案中，试剂盒包含含有质粒的载体，其中该质粒包含如本文提供的表达盒，并进一步包含AAV2 ITR。
另外，本文所述的任意方法和用途可用于增加需要其的受试者中SGSH多肽或其变体的表达。在一些实施方案中，本文所述的方法和用途增加和/或恢复需要其的受试者的脑中SGSH的活性。在一些实施方案中，该方法和用途恢复受试者脑中至少约10%、至少约15%、至少约20%、至少约25%、至少约30%或更多的正常SGSH活性。
附图简述
图1为腺相关病毒载体构建体即第一代LYS-SAF301基因疗法载体的示意图。在此图中，AAV2 ITR是指AAV2内部末端重复，muPGK是指鼠类磷酸甘油激酶启动子，SGSH是指人类N-磺基葡糖胺磺基水解酶，EMCV ires是指脑心肌炎病毒ires，SUMF1是指人类硫酸酯酶修饰因子1，以及BGHpA是指牛生长因子多聚A。
图2A为用于产生第一代LYS-SAF301基因疗法载体的pAVV-PGK-HMPS3A质粒的示意图。在此图中，ITR是指内部末端重复，PGK是指磷酸甘油激酶启动子，SGSH是指人类N-磺基葡糖胺磺基水解酶，SUMF1是指人类硫酸酯酶修饰因子1，IRES是指内部核糖体进入位点，以及KanR是指卡那霉素抗性。
图2B为pPAK-MARH10辅助质粒的示意图。在此图中，AAV2 rep 基因是指AAV2用于复制的基因，AAVrh10 cap基因是指编码AAV猕猴10衣壳的基因，MMTV启动子是指小鼠乳瘤病毒启动子，KanR为卡那霉素抗性，以及Ad5 E4基因是指腺病毒5 E4基因。
图3为LYS-SAF302表达盒和侧翼序列的示意图。
图4A和4B表示了被衣壳化于LYS-SAF302颗粒中的DNA的序列(SEQ ID NO: 9)。图4C-4D表示质粒p-LYS-SAF-T5的全部序列(SEQ ID NO: 14)。在图4C和4D中，显示了ITR、CAG启动子、SGSh的cDNA、多聚A位点和AmpR基因。图4E-4F表示含有rh10衣壳序列的质粒的序列(pAAV2-rh10；SEQ ID NO: 15)。在图4E和4F中显示了质粒的AAV2 REP、CAP1、Lac O、ColE1起点、AmpR、F1起点和Lac α组成部分。图4G-4K表示辅助质粒pHGTI，即具有腺病毒辅助功能的质粒的序列(SEQ ID NO: 16)。在图4G-4K中显示了质粒的VA、Rads、E4、L5、E2A、AmpR和ColE1起点组成部分。
图5显示在注射后4周LYS-SAF301和LYS-SAF302对MPSIIIA小鼠的所有脑区域中SGSH活性的影响。数据为相对于WT水平的平均SGSH活性% ± SEM；****p < 0.0001，**p <0.01以及ns=不显著，给出相对于WT的显著性，除用上方横杠表示外。
图6显示在注射后4周LYS-SAF301和LYS-SAF302对MPS IIIA小鼠的所有脑区域中总HS量的影响。根据AMAC标记二糖的RP-HPLC进行峰面积定量后所有脑区域中的HS的平均相对量(区域1-5的平均值)。数据为平均值± SEM；* p < 0.05 (相对于WT的显著性)。
图7A-E显示在注射后4周LYS-SAF301和LYS-SAF302对MPS IIIA小鼠的所有脑区域中炎性细胞因子的量的影响。MIP-1α (7A)、MCP-1 (7B)、IL-1α (7C)、RANTES (7D)和KC(7E)的蛋白水平如通过CBA flex sets对所有脑区测量的那样。每个数据点表示每个小鼠个体跨越5个脑区域的值。P值来自双因素方差分析和Tukey多重比较检验，* = P <0.05，** = P < 0.01，*** = P < 0.001，**** = P < 0.0001。
图8显示在所示MOI下来自LYS-SAF302的SGSH表达。
图9显示在所示MOI下产生自LYS-SAF302的SGSH的酶促活性。
图10显示在MPSIIIA小鼠中LYS-SAF302的实质内注射策略。注射位点(白色箭头)从带有半冠状脑切片定位的侧面透视显示。MPSIIIA小鼠在5周龄时接受使用汉密尔顿注射器的LYS-SAF302的立体定向注射(n=10/性别/组)。载体以8 μl中8.6E+08 vg (低剂量)、4.1E+10vg (中剂量)或9.0E+10 vg (高剂量)的剂量施用，经进入左侧和右侧纹状体各2 µl和进入左侧和右侧丘脑各2 μL以0.2 µl/min进行递送。显示了五个半冠状切片定位。
图11显示在注射后12和25周LYS-SAF302对MPS IIIA小鼠脑切片中SGSH活性的剂量依赖性影响(□雄性；•雌性)。P值来自单因素方差分析和Bonferroni事后检验，* = P <0.05，** = P < 0.01，*** = P < 0.001，**** = P < 0.0001。在各个测定中，小鼠#225(17周大的雄性MPS IIIA低剂量组)为离群值，其并未显示SGSH活性增加(相比于MPS IIIA载剂小鼠)。在30周队列中，雄性低剂量治疗的MPS IIIA小鼠#422、#383和#448为离群值，其并未显示SGSH活性增加(相比于MPS IIIA载剂小鼠)。
图12显示在注射后12和25周LYS-SAF302对MPS IIIA小鼠脑切片中HS的量的剂量依赖性影响(□雄性；•雌性)。P值来自单因素方差分析和Bonferroni事后检验，* = P <0.05，** = P < 0.01，*** = P < 0.001，**** = P < 0.0001。在各个测定中，小鼠#225(17周大的雄性MPS IIIA低剂量组)为离群值，其并未显示HS减少(相比于MPS IIIA载剂小鼠)。在30周队列中，雄性低剂量治疗的MPS IIIA小鼠#422、#383和#448为离群值，其并未显示HS减少(相比于MPS IIIA载剂小鼠)。这与这些小鼠样品所记录到的SGSH活性的量低是一致的。
图13显示在治疗后25周MPS IIIA小鼠的神经病理学分析。图13A和13B显示在根据图10中给出的图的脑切片3中，次级溶酶体贮积产物GM2 (A)和GM3 (B)神经节苷脂的定量。图13C显示通过LIMP2染色评价的下丘中内体/溶酶体系统的膨胀。图13D显示通过泛素染色评价的下丘中轴突球状体的数量。图13E显示通过GFAP染色评价的下丘中星形胶质细胞增生程度。图13F显示通过同工凝集素B4染色评价的齿状回中反应性变形虫形小胶质细胞的数目。****p < 0.0001和* p < 0.05计算自单因素方差分析和Bonferroni多重比较检验。
图14A-F显示在狗脑内的钆扩散。该图表示接受以10μL/min注射四次(每个半球两次) 500µl的LYS-SAF302和MRI造影剂钆(5mmol)至白质内(总剂量2.0E+12 vg)的狗。图14A为狗脑的左侧视图，带有包括注射位点的冠状切面定位。图14B-C为注射前冠状切面的MRI图像，用红点表示计划的注射位点。图14D-E为注射后冠状切面的MRI图像，钆信号可见于白质内。图14F为MRI图像3D重建的前视图，钆信号沿着白质吻尾轴(rostro-caudal axis)在两个半球内均可见。比例尺= 10 mm。
图15A-C显示接受以5μL/min注射四次(每个半球两次) 50µl的LYS-SAF302至白质内(总剂量7.2E+11 vg)的两个NHP的脑中SGSH活性的分布。图15A显示NHP脑的左侧视图，带有半冠状脑切片的定位。吻部注射在切片4至6之间，而尾部注射在切片8至10之间。在注射后6周，在对一个NHP分析的脑穿孔中的99% (图15B)和对另一个NHP分析的脑穿孔中的94%(图15C)中观察到，SGSH活性相对于载剂注射对照增加大于20%。
图16A-16E显示在注射后4个月在小鼠脑中SAF302GFP的表达。图16A为相对于5个不同脑区域的纹状体内注射位点的图示。MPSIIIA小鼠在8–14周龄接受使用汉密尔顿注射器的SAF302GFP立体定向注射(n = 6)。载体以3 µL中6.1 x 109基因组颗粒的剂量施用，经在两个半球3 mm的深度、中线外侧2 mm处双侧注射而递送。在注射后4个月处死动物，且取脑用于组织学分析。将从前囟点开始+1.7、+0.26、-1.18和-2.62 mm的冠状脑切面(图16B)和在中线外侧1.2 mm的矢状切面(图16C)用NeuN (红)、GFP (绿)和DAPI (蓝)进行共标记。比例尺= 1,000 µm。(16D和16E)图16C中虚线框所示区域的高倍放大图像显示了在海马体内(图16D)和纹状体内(图16E)的细胞转导。比例尺= 50 µm。
图17A-E显示用SAF302GFP治疗后在注射位点附近GFAP阳性星形细胞的转导。MPSIIIA小鼠用SAF302GFP在两个深度进行注射并在注射后4周收获(图17A)，或在一个深度进行注射并在注射后4个月收获(图17B)。在相对于前囟点+0.26的冠状切面用GFAP (红)、GFP (绿)和DAPI (蓝)进行染色。比例尺= 1,000µm。显示了扣带/皮层(1)、外囊/初级体感皮层/纹状体边界(2)和纹状体/注射位点(3)的高倍放大图像。比例尺= 20 µm。在所示前囟点的GFP阳性细胞百分比量化为总脑面积的比例(图17C-17E)。*p < 0.05使用学生t检验进行计算。显示了代表性的图像，其中每组五只小鼠在两个半球均进行注射并进行定量。
详述
在各种实施方案中，本公开提供对治疗各种疾病和障碍有用的新型组合物和方法，所述疾病或障碍包括但不限于遗传疾病(包括由导致所编码的基因产物减少表达或缺乏表达、改变形式的基因产物的表达或控制基因产物表达的调节元件的破坏的基因缺失或突变引起的那些疾病)、神经系统的疾病和障碍以及脑的疾病和障碍。如同本领域技术人员能领会的那样，尽管某些组合物和方法在本文中特别举例说明，然而本公开并非如此受限，而是包括另外的实施方案和用途，其包括但不限于本文特别描述的那些。另外，在以下描述中，为了提供本公开各种实施方案的透彻理解而阐述某些具体细节。然而本领域技术人员将理解，本公开可在没有这些细节的情况下实施。
定义
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。为了本公开的目的，以下术语在下文中进行定义。
除非特别注明，词语“一个(a)”和“一个(an)”表示一个或多个。
“约”意为数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度比参考数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度变化了多达30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1%。在数值与术语“约”一起使用的上下文中讨论的任意实施方案中，特别考虑到术语约可被省略。
术语“活性变体”表示和包含“生物学活性片段”和“生物学活性变体”两者。代表性的生物学活性片段和生物学活性变体通常参与相互作用，例如分子内或分子间相互作用。分子间相互作用可为特异性结合相互作用或酶促相互作用。酶促相互作用或活性的实例包括但不限于脱羟基化和本文所述的其他酶促活性。
术语“生物学活性片段”，在应用于参考多核苷酸或多肽序列的片段时，是指具有参考序列的至少一种活性(例如酶促活性)的至少约20、22、24、26、28、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99、100、110、120、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000%或更多的片段。术语“参考序列”通常是指另一个序列正与其进行比较的核酸编码序列或氨基酸序列。提供于序列表中的所有序列也作为参考序列包括在内。包括于本公开范围内的是长度为至少约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400、500、600或更多个连续核苷酸或氨基酸残基的生物学活性片段，所述长度包括介于中间的所有整数。
术语“生物学活性变体”，在应用于参考多核苷酸或多肽序列的变体时，是指具有参考序列的活性(例如酶促活性)的至少约20、22、24、26、28、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99、100、110、120、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000%或更多的变体。包括于本公开范围内的是与参考序列具有至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约95%、至少约98%或至少约99%同一性的生物学活性变体，所述百分比包括介于中间的所有整数。
“编码序列”意为对基因的多肽产物的编码有贡献的任意多核苷酸序列。相对地，术语“非编码序列”是指对基因的多肽产物的编码没有贡献的任意多核苷酸序列。
除非上下文另有要求，否则贯穿本说明书和权利要求，词语“包含(comprise)”和其变体，如“包含(comprises)”和“包含(comprising)”将被解释为开放的、包含性的含义，即作为“包括但不限于”。
“由……组成”意为包括并限于短语“由……组成”之间的任何内容。因此，短语“由……组成”表示所列要素是所需的或必需的，且不可存在其他要素。
“基本由……组成”意为包括列于该短语之间的任意要素，并限于不干扰或有助于本公开中对所列要素指明的活性或作用的其他要素。因此，短语“基本上由……组成”表示所列要素是所需的或必需的，但其他要素为任选的且可存在或可不存在，这取决于它们是否影响所列要素的活性或作用。
贯穿此说明书，提及“一个(one)实施方案”或“一个(an)实施方案”意为将与该实施方案相关描述的特定特征、结构或特点包括于本公开的至少一个实施方案中。因此，贯穿此说明书中各处出现的短语“在一个(one)实施方案中”或“在一个(an)实施方案中”并不一定全指相同的实施方案。此外，该特定特征、结构或特点可按任意适合的方式结合于一个或多个实施方案中。
如本文所使用的，术语“功能”和“功能性”等等是指生物、酶促或治疗功能。
“基因”意为占据染色体上特定基因座并由转录和/或翻译调节序列和/或编码区域和/或非翻译序列(即内含子、5’和3’非翻译序列)组成的遗传单位。
关于基因的描述“突变”或“缺失”通常是指基因中导致所编码的基因产物表达降低或不表达或使得基因产物无功能或相比于野生型基因产物功能降低的那些变化或改变。此类变化的实例包括对靶基因编码或调节序列全部或部分地进行核苷酸替换、缺失或添加，这破坏、消除、下调或显著地减少那个基因所编码多肽的表达，无论在转录还是翻译水平上，和/或这产生相对无活性(例如突变或截断的)或不稳定的多肽。在某些方面，可通过改变所编码多肽的氨基酸序列的核苷酸水平上的变化或突变而令所靶向的基因变得“无功能”，使得修饰的多肽虽然得到表达，但关于一种或多种酶促活性的功能或活性降低，无论是通过修饰那个多肽的活性位点、其细胞定位、其稳定性还是对本领域技术人员而言明显的其他功能性特征。
“增加的”或“提高的”量通常为“统计学显著的”量，并可包括是本文所述的量或水平的1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40或50或更多倍(例如100、500、1000倍) (包括介于中间并大于1的所有整数和小数点，例如2.1、2.2、2.3、2.4等等)的增加。
“降低的”或“减少的”或“更少的”量通常为“统计学显著的”量，并可包括是本文所述的量或水平的约1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40或50或更多分之一(例如、100、500、1000分之一) (包括介于中间并大于1的所有整数和小数点，例如1.5、1.6、1.7、1.8等等)的降低。
“获得自”意为样品(例如多核苷酸或多肽)分离自或衍生自特定来源，如所期望的生物体或所期望的生物体内的特定组织。
如本文所使用的，术语“可操作地连接”意为将基因置于启动子的调控下，所述启动子然后控制该基因转录和任选地控制其翻译。在构建异源启动子/结构基因组合时，通常优选将基因序列或启动子置于和基因转录起始位点的距离与介于那个基因序列或启动子和其在自然环境下控制的基因(即基因序列或启动子所衍生自的基因)之间的距离几乎相同的位置。如本领域已知的，在不丧失功能的情况下可容许此距离的一些变化。类似地，调节序列元件关于待置于其控制下的异源基因的优选定位由在其自然环境下的元件(即它所衍生自的基因)的定位而限定。“组成型启动子”通常为活跃的，即在绝大多数条件下促进转录。“诱导型启动子”通常只在某些条件下活跃，所述条件例如在存在给定分子因子(例如IPTG)或给定环境条件的情况下。在没有那种条件的情况下，诱导型启动子通常不允许显著或可测量水平的转录活性。众多标准诱导型启动子会是本领域技术人员已知的。
“药学上可接受运载体、稀释剂或赋形剂”包括但不限于已被美国食品和药物管理局批准为可用于人类或家畜的任意佐剂、运载体、赋形剂、助流剂、甜味剂、稀释剂、防腐剂、染料/着色剂、增味剂、表面活性剂、湿润剂、分散剂、助悬剂、稳定剂、等渗剂、溶剂或乳化剂。
如本文所使用的，描述“多核苷酸”或“核酸”指的是mRNA、RNA、cRNA、rRNA、cDNA或DNA。该术语通常是指聚合体形式的长度为至少10个碱基的核苷酸，其为核糖核苷酸或脱氧核苷酸或任一类型核苷酸的修饰形式。该术语包括单链和双链形式两者的DNA和RNA。
术语“多核苷酸变体”是指与参考多核苷酸序列显示基本序列同一性的多核苷酸，或与参考序列在严格条件(其在下文定义)下杂交的多核苷酸。此术语也包含因添加、缺失或替换至少一个核苷酸而与参考多核苷酸有所区别的多核苷酸。相应地，术语“多核苷酸变体”包括其中一个或多个核苷酸已被添加或缺失或替换为不同核苷酸的多核苷酸。在这一点上，在本领域中周知可对参考多核苷酸进行某些改变，包括突变、添加、缺失和替换，从而使得改变的多核苷酸保持参考多核苷酸的生物功能或活性，或具有相对于参考多核苷酸而言增加的活性(即优化)。多核苷酸变体包括例如与本文所述的参考多核苷酸序列具有至少50% (和至少51%到至少99%以及介于中间的所有整数百分比，例如90%、95%或98%)序列同一性的多核苷酸。术语“多核苷酸变体”和“变体”也包括编码这些酶的天然存在的等位基因变体和直向同源物。
关于多核苷酸和多肽，术语“外源的”是指并不天然地存在于野生型细胞或生物体中，但通常通过分子生物学技术引入细胞内的多核苷酸或多肽序列。外源多核苷酸的实例包括编码所期望蛋白的载体、质粒和/或人造核酸构建体。关于多核苷酸和多肽，术语“内源的”或“原生的”是指可在给定野生型细胞或生物体中发现的天然存在的多核苷酸或多肽序列。
“引入”的多核苷酸序列是指添加或引入至细胞或生物体内的多核苷酸序列。“引入”的多核苷酸序列可为对细胞或生物体为外源的多核苷酸序列，或者其可为已存在于细胞或生物体中的多核苷酸序列。例如，多核苷酸可通过分子生物学技术被“引入”至已含有此种多核苷酸序列的微生物内，例如，以产生本就天然存在的多核苷酸序列的一个或多个另外的拷贝，并从而促进所编码多肽的过表达。
“多肽”、“多肽片段”、“肽”和“蛋白”在本文中可互换使用，是指氨基残基的聚合体以及是指它们的变体和合成的类似物。因此，这些术语适用于氨基酸聚合体，其中一个或多个氨基酸残基为非天然存在的合成氨基酸，例如对应的天然存在氨基酸的化学类似物；以及天然存在的氨基酸聚合体。在某些方面，多肽可包括酶促多肽，或“酶”，其通常催化各种化学反应(即增加其速率)。
描述“多肽变体”是指通过添加、缺失或替换至少一个氨基酸残基而与参考多肽序列相区别的多肽。在某些实施方案中，多肽变体通过一个或多个替换与参考多肽相区别，所述替换可为保守的或非保守的。在某些实施方案中，多肽变体包含保守的替换，并且在这一点上，在本领域中充分理解，在不改变该多肽的活性性质的情况下，一些氨基酸可改变为具有大致相似的特性的其他氨基酸。多肽变体也包含其中一个或多个氨基酸已进行添加或缺失或用不同氨基酸残基替换的多肽。包括在内的是与本文所述的任意参考序列(参见例如序列表)具有至少约50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多肽。在特定实施方案中，该多肽变体保持参考多肽的至少一种生物活性。
如本文所使用的，描述“序列同一性”或例如包含“与…具有50%同一性的序列”是指在比较窗口中序列在逐个核苷酸的基础上或逐个氨基酸的基础上一致的程度。因此，可通过以下方式计算“序列同一性的百分比”：在比较窗口中比较两个最优对齐的序列，确定在此处一致的核酸碱基(例如A、T、C、G、I)或一致的氨基酸残基(例如Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)在两个序列中均出现的位置的数目，以得到匹配位置的数目，用匹配位置的数目除以在比较窗口中位置的总数(即窗口大小)，并将结果乘以100以得到序列同一性的百分比。
用于描述两个或更多个多核苷酸或多肽之间序列关系的术语包括“参考序列”、“比较窗口”、“序列同一性”、“序列同一性的百分比”和“基本同一性”。“参考序列”长度为至少12但往往为15到18并经常为至少25个单体单位，包括核苷酸和氨基酸残基。因为两个多核苷酸可各自包含(1)在两个多核苷酸之间相似的序列(即完整多核苷酸序列的仅一部分)，以及(2)在两个多核苷酸之间不同的序列，所以两个(或更多个)多核苷酸之间的序列比较通常通过在“比较窗口”中比较两个多核苷酸序列以确认和比较局部区域的序列相似性而实施。“比较窗口”是指至少6个连续位置，通常约50至约100，更通常约100至约150个连续位置的概念性分段，其中在将两个序列最优对齐后将该序列与具有相同数目的连续位置的参考序列相比较。为了两个序列的最优对齐，当与参考序列(其不包含添加或缺失)相比较时，比较窗口可包含约20%或更少的添加或缺失(即空位)。用于对齐比较窗口的序列的最优对齐可通过算法的计算机实现(在威斯康辛遗传学软件包发布版7.0 (遗传学计算机组，575 Science Drive Madison, WI, USA)中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)或通过由所选的各种方法中的任何一种产生的检查和最优对齐(即在比较窗口中产生最高百分比同源性)而实施。也可参考BLAST程序家族，像是例如由Altschul等人, 1997, Nucl. Acids Res. 25:3389所公开的那样。序列分析的详细讨论可在Ausubel等人, “CurrentProtocols in Molecular Biology”, John Wiley & Sons Inc, 1994-1998,第15章的19.3单元中找到。
“转化”是指细胞中永久的、可遗传的改变，由摄入和吸收外来DNA至宿主细胞基因组内或在宿主细胞内保持在染色体外引起；也指外源基因从一个生物体转移至另一个生物体的基因组内。
“如本文所使用的，术语“治疗(treatment)”、“治疗(treat)”、“治疗(treated)”或“治疗(treating)”是指预防和/或疗法，特别是其中的目的为防止或减缓(减轻)不期望的生理学改变或障碍，如由突变基因引起的脑障碍(例如溶酶体贮积疾病(LSD))的发展和/或进展。有益或所期望的临床结果包括但不限于症状的缓解、疾病程度的减弱、疾病状态的稳定(即不恶化)、疾病进展的延迟或减缓、疾病状态的改善或缓和以及减退(无论部分还是全部)，无论可检测还是不可检测。“治疗”也可意为，与如果不接受治疗的预期生存和/或生命质量相比较，延长生存和/或增加生命质量。需要治疗的那些对象包括已经具有病症或障碍(例如由突变基因引起的脑障碍，如LSD)的那些，以及倾向于具有病症或障碍的那些，或其中病症或障碍有待防止的那些。因此，“治疗”也包括施用本公开的化合物至由于家族史、遗传或染色体异常和/或由于存在该疾病的一种或多种生物学标志物而被认为易罹患该疾病的那些个体，例如为了抑制、防止或延迟疾病发作，或减少疾病发生的可能性。在特定实施方案中，治疗可包括以下任意一项：减少发育退化；减少语言损伤或改善语言发育；减少运动技能损伤；减少智力发育损伤；减少过度活跃(过度运动活动)；改善睡眠、注意力；减少身体和精神能力损伤(患者丧失完整运动能力(走路、说话、进食等等)、认知能力，严重的癫痫发作)；减少例如气道阻塞和心脏衰竭等损伤；或降低部分降解的硫酸乙酰肝素的积累。在某些实施方案中，“治疗”包括使细胞能够产生缺失的酶，所述酶治疗和/或逆转疾病的后果，例如恢复或提供SGSH基因的功能至受试者，或分解积累的硫酸乙酰肝素。
“受试者”包括哺乳动物（例如人类），包括需要治疗疾病或障碍的哺乳动物，如已被诊断患有疾病或障碍或确定处于发展疾病或障碍的风险下的哺乳动物。在特定实例中，受试者为哺乳动物，其被诊断具有遗传疾病、脑障碍或神经系统的疾病或障碍，如溶酶体贮积障碍，包括MPS(如MPSIIIA)。
“载体”意为多核苷酸可插入或克隆至其中的衍生自例如质粒、噬菌体、酵母或病毒的多核苷酸分子(例如DNA分子)。载体通常含有一种或多种独特的限制性位点并可在限定的宿主细胞中能够自主复制，或可与限定宿主的基因组整合从而使克隆的序列可复制。相应地，载体可为自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如线状或闭环状质粒、染色体外元件、微小染色体或人工染色体。载体可含有保证自复制的任意手段。或者，载体可为当被引入至宿主细胞内时被整合至基因组中并与所述载体已整合至其中的染色体一起复制的载体。此种载体可包含允许重组至宿主染色体的特定的、所期望的位点中的特定序列。载体系统可包含单一载体或质粒；两种或更多种载体或质粒，它们一起含有待引入至宿主细胞基因组内的全部DNA；或转座子。载体的选择通常将取决于载体与载体待引入其中的宿主细胞的相容性。“载体”也包括多核苷酸可插入或克隆至其中的病毒和病毒颗粒。此类载体可被称为“病毒载体”。“基因疗法载体”为用于递送治疗性多核苷酸或多肽序列至需要其的受试者的载体(包括病毒载体)，所述序列通常为例如由于受试者中的基因突变而在受试者中缺失、突变或具有失调表达的多核苷酸或多肽序列。
将感兴趣的DNA序列插入至DNA载体内的常见手段涉及使用叫做限制性酶的酶，其在叫做限制性位点的特定位点处裂解DNA。“盒”或“基因盒”或“表达盒”是指编码一种或多种表达产物并含有表达这些产物所必需的顺式作用元件的多核苷酸序列，其可在限定的限制性位点插入至载体内。
如本文所使用的，术语“野生型”是指当分离自天然存在的来源时，具有那种基因或基因产物特征的基因或基因产物。野生型基因或基因产物(例如多肽)为最常在群体中被观察到的那种基因或基因产物，并因此被任意地设计为基因的“普通”或“野生型”形式。
基因疗法载体
在某些实施方案中，本公开包括用于治疗MPSIIIA的基因疗法载体。此类基因疗法载体可被用于递送人类SGSH多肽或其活性变体至需要其的受试者中的细胞。如在所附实施例中描述的，研究已证实本公开的基因疗法载体对于治疗MPSIIIA既是有效的也是安全的。
不希望受理论的束缚，已了解在施用至脑实质内之后，基因疗法载体颗粒和酶将局部扩散，以及沿着轴突被运输至遥远的脑解剖结构以允许修正扩展的脑区域。在进入细胞内之后，编码SGSH多肽的基因疗法载体将被运输至核内，在核中所述载体会经历一系列分子转变，从而稳定地形成为双链脱氧核糖核酸(DNA)分子。此DNA会被转录为信使核糖核酸(mRNA)，接下来会被翻译为SGSH，即缺失的酶。转导的细胞将持续表达和递送SGSH酶，因此构成脑内永久的酶产生来源以补充缺乏内源的酶。本文所述的基因疗法载体为LYS-SAF302，在本文中也被称为SAF302或AAVrh10-SGSH。如在所附实施例中描述的，SAF302为建立于测试叫做LYS-SAF301或SAF301的第一代产品所得的信息之上的第二代产品。LYS-SAF301由包含缺陷AAV2基因组的复制缺陷的腺相关病毒血清型rh.10 (AAVrh.10)组成，所述基因组含有由PGK启动子驱动的SGSH和SUMF1基因，包装于AAVrh.10衣壳中。它也被称为AAVrh.10-hMPS3A。此第一代载体被用于本文所述的患MPS IIIA疾病儿童中的临床研究，并以7.2E+11病毒基因组(vg) /患者的剂量，在两个注射深度以12个预先计划的同时无框架立体定位注射(60μL/注射)被递送至脑白质中。剂量和手术介入耐受良好，且未报道相关的不良事件。
本公开提供改善的第二代产品LYS-SAF302，相比于第一代产品，在表达自转导细胞的方面其有效性为2.7倍高。另外，本公开提供改善的递送系统，其允许在没有回流的情况下以增加的流速注射更高剂量和更大体积。本文提供的递送系统和方法导致了广泛的脑分布和提高的功效。如在所附实施例中描述的，在MPSIIIA小鼠模型中LYS-SAF301和LYS-SAF302的功效研究显示了本公开的基因疗法载体转导MPSIIIA脑细胞以产生和分泌大量活性SGSH，这反过来介导了原发性、继发性和其他神经病理学的高度显著减少。在脑的一些区域中检测到大量的SGSH，并似乎和它们与注射位点的接近程度直接相关。数据显示此载体能够产生足够数量的SGSH，以介导初级和次级贮积病理学的高度显著改善，此外还有下游事件，如小胶质细胞增生。
发现了本公开的基因疗法载体相比于以前描述的那些载体提供意想不到的优势，包括在脑内注射后脑中高水平的SGSH表达。另外，本公开方法令人惊讶地导致免疫反应减少。这些优势与功效增加相关。此外，在某些实施方案中，手术时间和处于麻醉的时间被减至最低，因此减少对患者的相关风险。另外，本公开的组合物和方法通过改善治疗性产物的表达，使表达分布更广泛和经更高剂量、更大体积和增加的注射流速而更有效地递送来提供提高的功效。
细小病毒科的成员腺相关病毒(AAV)为小型非包膜二十面体病毒，具有4.7千碱基(kb)至6 kb的单链线状DNA基因组。AAV的生命周期包括潜伏期，在潜伏期中AAV基因组在感染后被位点特异性地整合至宿主染色体中；以及感染期，其中在腺病毒或单纯疱疹病毒感染后，整合基因组随后被拯救、复制和包装至感染性病毒中。非致病性、广泛的宿主范围(包括非分裂细胞)的感染和潜在的位点特异性染色体整合的特性使AAV成为有吸引力的基因转移工具。
迄今为止，已从人类或非人类灵长动物(NHP)中分离了其表面特性具有差别的至少十几种不同血清型的AAV并对它们表征。
术语“血清型”为关于AAV的区别，所述AAV具有血清学上区别于其他AAV血清型的衣壳。基于针对一种AAV血清型的抗体与针对其他AAV血清型的的抗体之间缺乏交叉反应性而确定血清学区别性。本公开的基因疗法载体，也叫做载体，可具有AVV的任意一种已知血清型(rh)，例如rh1、rh2、rh3、rh4、rh5、rh6、rh7、rh8、rh9或rh10中的任意一种，优选rh10。这些各种AAV血清型也可被称为AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9或AAV10 (AAVrh.10)。
在某些实施方案中，本公开的载体可具有人工AAV血清型。人工AAV血清型包括但不限于具有非天然存在的衣壳蛋白的AAV。此种人工衣壳可使用本公开的新的AAV序列(例如vp1衣壳蛋白片段)与异源序列结合通过任意适合的技术产生，所述异源序列可获得自另一种AAV血清型(已知或新的)、同种AAV血清型的非连续部分、来自非AAV病毒来源或来自非病毒来源。人工AAV血清型可为(但不限于)嵌合AAV衣壳、重组AAV衣壳或“人源化的”AAV衣壳。
AAV血清型rh.10 (AAVrh.10)在PCT专利申请公开号WO 2003/042397中进行描述。AAVrh.10载体已显示有效穿过血脑屏障并在新生小鼠的中枢神经系统中转导神经元和星形细胞(Zhang, H.等人, Molecular Therapy 19, 1440-1448 (2011年8月))。另外，AAVrh.10载体在注射至啮齿动物脑内之后具有优越的活性[10-12]，并且在人类群体中不存在AAV血清型10的天然疾病。
AAV基因组相对简单，含有侧翼为短反向末端重复(ITR)的两个开放阅读框(ORF)。ITR含有尤其是病毒复制、拯救、包装和整合所需的顺式作用序列。ITR的整合功能允许AAV基因组在感染后整合至细胞染色体内。
非结构或复制(Rep)蛋白和衣壳(Cap)蛋白分别由5’和3’开放阅读框(ORF)编码。四种相关蛋白表达自rep基因；Rep78和Rep68转录自p5启动子，而下游启动子p19指导Rep52和Rep40表达。Rep78和Rep68直接参与AAV复制以及病毒基因表达的调节。cap基因转录自第三病毒启动子p40。衣壳由具有重叠序列的三种蛋白组成；最小的(VP-3)是最丰富的。因为反向末端重复为复制、包装和整合顺式所需的仅有的AAV序列，所以大多数AAV载体无需编码Rep和Cap蛋白的病毒基因，并仅含有插入末端重复之间的外来基因，例如治疗性基因。
N-磺基葡糖胺磺基水解酶(SGSH；也叫做磺酰胺酶)为参与山菲立普A型综合征(MPSIIIA, OMIM #252900)的缺陷蛋白。N-磺基葡糖胺磺基水解酶(SGSH, EC 3.10.1.1,MIM 605270)属于逐步降解叫做硫酸乙酰肝素(HS)的糖胺聚糖家族所需的溶酶体水解酶家族。SGSH参与硫酸乙酰肝素(HS)降解的第三步。SGSH催化从HS的非还原末端氨基葡糖苷残基水解N-连接的硫酸酯。
在某些实施方案中，本公开的第一代基因疗法载体包含编码SGSH和SUMF1两者的多核苷酸序列。人类硫酸酯酶修饰因子1 cDNA (SUMF1, MIM 607939)编码通过翻译后修饰提高硫酸酯酶活性的蛋白。在第一代产品中使SGSH与SUMF1共表达的原因是双重的。尽管细胞中存在SUMF1，然而在辅助因子也被引入时在基因转移之后获得了更高的SGSH活性。当SUMF1与硫酸酯酶cDNA在野生型培养细胞中共转染时，以及当SUMF1与硫酸酯酶cDNA在来自由于硫酸酯酶缺陷而患不同疾病的个体的细胞中经AAV载体共递送时，SUMF1强烈地提高硫酸酯酶活性[15-17]。Fraldi等人显示使用AAV2/5载体共递送SUMF1和SGSH导致SGSH活性协同增加，与脑中溶酶体贮积和炎性标志物减少相关[13]。
据推测，SGSH过表达可大幅减少SUMF1对其他硫酸酯酶的可用性，并因此影响它们的功能。此毒性过程在由SUMF1突变引起的多发性硫酸酯酶缺乏症(Multiple sulfatasedeficiency)中得到说明[15]。据报道，人类内源SUMF1的水平在肾和肝中高，但在脑中很低[18-21]。相对地，内源SUMF1的表达在小鼠脑中为中等的[22]。内源SUMF1的量可成为细胞和组织中的限制因素。因此，据信将SUMF1包括在设计为过表达硫酸酯酶的基因疗法载体(如设计用于MPSIIIA的那些)中是有利的。
本发明人发现，当与包括表达SUMF1的多核苷酸的第一代产品比较时，不包括表达SUMF1的多核苷酸的本文所述的第二代载体SAF302能够提高SGSH的表达和增加降解HS的有效性。
在某些实施方案中，本公开的基因疗法载体为AAV血清型rh10载体，其包含编码人类SGSH多肽或其活性变体的多核苷酸序列。在某些实施方案中，这些基因疗法载体可呈复制缺陷的AAVrh.10载体而施用至需要其的受试者，所述AAVrh.10载体包含缺陷的AAV2基因组，该基因组包含编码人类SGSH多肽或其活性变体的多核苷酸序列，由启动子驱动并包装于AAVrh.10衣壳中。
在某些实施方案中，该基因疗法载体进一步包含另外的调节序列，如启动子序列、增强子序列和有助于准确或有效的转录或翻译的其他序列，如内部核糖体结合位点(IRES)或多腺苷酸化(多聚A)序列。在某些实施方案中，编码人类SGSH多肽或其活性变体的多核苷酸序列可操作地连接至启动子序列。在一些实施方案中，基因疗法载体包含多聚A序列，但不包含IRES序列。
在一些实施方案中，本公开包括包含多核苷酸序列(例如表达盒)的复制缺陷的腺相关病毒(AAV)衍生载体，所述序列按5’至3’顺序包含以下：
启动子序列；
编码人类N-磺基葡糖胺磺基水解酶(SGSH)多肽或其活性变体的多核苷酸序列；
内部核糖体进入位点(IRES)序列；
编码人类硫酸酯酶修饰因子1 (SUMF1)多肽或其活性变体的多核苷酸序列；和
多腺苷酸化(多聚A)序列。
在某些实施方案中，载体进一步包含AAV2 ITR和AAVrh.10衣壳或血清型。
本公开也包括使用本文所述的表达盒，但其中编码人类N-磺基葡糖胺磺基水解酶(SGSH)多肽或其活性变体的多核苷酸序列和编码人类硫酸酯酶修饰因子1 (SUMF1)多肽或其活性变体的多核苷酸序列的位置被交换。
在特定实施方案中，本公开包括包含多核苷酸序列(例如表达盒)的复制缺陷的腺相关病毒(AAV)衍生载体，所述序列按5’至3’顺序包含以下：
启动子序列；
编码人类N-磺基葡糖胺磺基水解酶(SGSH)多肽或其活性变体的多核苷酸序列；和
多腺苷酸化(多聚A)序列；
其中该载体不包含编码SUMF1的多核苷酸序列且不包含IRES序列。
在某些实施方案中，该载体进一步包含AAV2 ITR和AAVrh.10衣壳或血清型。
各种适合的启动子序列、IRES序列和多聚A序列在本领域中已知且可得，并可根据本公开使用任何这些序列。
在某些实施方案中，启动子为组成型启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子(例如脑特异性或神经组织或神经细胞特异性启动子)或对受试者为内源的启动子。组成型启动子的实例包括但不限于CMV早期增强子/鸡β肌动蛋白(CAG)启动子、逆转录病毒劳氏肉瘤病毒(RSV) LTR启动子(任选地与RSV增强子一起)、巨细胞病毒(CMV)启动子(任选地与CMV增强子一起)、SV40启动子、二氢叶酸还原酶启动子、β肌动蛋白启动子、磷酸甘油激酶(PGK)启动子和EFlα启动子[lnvitrogen]。在特定实施方案中，启动子为哺乳动物PGK启动子，例如鼠类PGK启动子。在一些实施方案中，启动子为CAG启动子，其中CAG启动子携带CMVIE增强子、CB启动子、CBA外显子1、CBA内含子、兔β内含子、和兔β珠蛋白外显子2。本公开提供包含编码SGSH或其活性片段的多核苷酸序列的改善的基因疗法载体，其中第一代产品的PGK启动子已被替换为CAG启动子。在一些实施方案中，CAG启动子可操作地连接至SGSH序列。在一些实施方案中，用CAG启动子替换PGK启动子令人惊讶地导致了SGSH表达的显著提高。
由外源补充的启动子调节的诱导型启动子的实例包括锌诱导型金属硫蛋白(MT)启动子、地塞米松(Dex)诱导型小鼠乳瘤病毒(MMTV)启动子、蜕皮素昆虫启动子、四环素抑制系统和四环素诱导系统。诱导型启动子和诱导系统可得自各种商业来源，包括但不限于lnvitrogen、Clontech和Ariad。许多其他系统已得到描述且可容易地由本领域技术人员进行选择。
IRES (内部核糖体进入位点)为结构性RNA元件，其允许翻译机器在mRNA内被招募，而翻译启动的主要途径则在mRNA加帽的5’末端上招募核糖体。
细胞使用多聚(A)信号用于在mRNA 3’添加多聚A尾。此尾对mRNA的出核、翻译和稳定性是重要的。在一些实施方案中，多聚A单元为人类生长激素1多聚A单元。
在本公开的载体的特定实施方案中，启动子序列衍生自CAG启动子序列；和/或多聚A序列衍生自人类生长激素1多聚A序列。
在一个实施方案中，表达盒按以下5’至3’顺序包含：
衍生自CAG启动子序列的启动子序列；
编码人类N-磺基葡糖胺磺基水解酶(SGSH)多肽或其活性变体的多核苷酸序列；
和
衍生自人类生长激素多聚A序列的多聚A序列。
在本公开的载体的特定实施方案中，表达盒的侧翼为两个AAV内部末端重复(ITR)序列，例如AAV2 ITR，其中两个AAV ITR序列的其中一个位于表达盒的5’且两个AAV ITR序列的其中一个位于表达盒的3’。ITR序列各包含约145个碱基。它们被这样命名是因为它们的对称性，其被显示是AAV基因组有效增殖所需的。这些序列的另一个特性为其形成发卡结构的能力，所述发卡结构有助于所谓的自引发和允许第二条DNA链不依赖引发酶的合成。AAV ITR为基因组复制和包装所需的仅有的顺式作用元件。
在一个特定实施方案中，本公开包括包含多核苷酸序列的载体，所述多核苷酸序列按5’至3’顺序包含以下：
AAV2 ITR序列；
CAG启动子序列；
编码人类N-磺基葡糖胺磺基水解酶(SGSH)多肽或其活性变体的多核苷酸序列；
人类生长激素多聚A序列；和
AAV2 ITR序列。
第一代SAF301载体的示意图在图1中提供。本公开的载体构建体(即第二代SAF302载体)的示意图在图3中提供。
本公开进一步包括组合物(包括药物组合物)，其包含本公开的基因疗法载体，以及其单位剂量。
在一个实施方案中，本公开包括组合物，其包含本文所述的基因疗法载体和药学上可接受运载体、稀释剂或赋形剂。此种组合物可被称为药物组合物。在一个特定实施方案中，药学上可接受运载体、稀释剂或赋形剂为磷酸盐缓冲盐水溶液，其可为无菌和/或GMP临床级的。在一个特定实施方案中，本公开组合物包含含有多核苷酸序列的载体，所述多核苷酸序列按5’至3’顺序包含以下：
AAV2 ITR序列；
CAG启动子序列；
编码人类N-磺基葡糖胺磺基水解酶(SGSH)多肽或其活性变体的多核苷酸序列；
人类生长激素1多聚A序列；和
AAV2 ITR序列，
其中所述载体悬浮于磷酸盐缓冲盐水溶液，其可为无菌和/或GMP临床级的。
在某些实施方案中，存在于本公开的组合物中的载体浓度为约1x1010 gc/ml至约1x1014 gc/ml、约1x1011 gc/ml至约1x1013 gc/ml或约5x1011 gc/ml至约5x1012 gc/ml。例如，在一些实施方案中，存在于组合物中的载体浓度为从约1.9x1012 gc/mL至约3.2x1012gc/mL，或约2.4x1012 gc/mL。
在特定实施方案中，本公开的单位剂型包含含有约100 µl至2 mL本公开的组合物的小瓶。在某些实施方案中，单位剂型包含含有约1.2 mL组合物的小瓶。在特定实施方案中，存在于单位剂型中的载体的量为约0.5x1012 gc至约3x1012 gc，或约0.1x1012 gc至约0.5x1012 gc，或约0.1x1012 gc至约2x1012 gc。
多核苷酸和多肽序列
在某些实施方案中，本公开包括包含本文所述的表达盒或由其组成的多核苷酸序列，以及包含本文所述的任意表达盒的质粒和载体。另外，本公开包括包含本公开的任意多核苷酸序列、载体或质粒的细胞。本领域技术人员可使用标准分子和细胞生物学技术以及本领域的知识容易地产生本公开的多核苷酸序列、载体和宿主细胞。
作为本公开的多核苷酸(例如表达盒)组成部分的多核苷酸和多肽序列为已知的。
鼠类PGK启动子序列在NCBI参考号MI8735的位置+419 - +924和在SEQ ID NO:1的+419 - +924提供。
IRES序列在NCBI参考号NC001479的位置+13 - +575和在SEQ ID NO:2的位置+13- +575提供。
牛生长激素多聚A序列在NCBI参考号M57764的位置+2326 - +2533和在SEQ IDNO:3的位置+2326 - +2533提供。
CAG启动子序列作为SEQ ID NO: 12和/或作为SEQ ID NO: 9的位置125-1862提供。
人类生长激素1多聚A序列作为SEQ ID NO: 17和/或作为SEQ ID NO: 9的位置3414-3923提供。
N-磺基葡糖胺磺基水解酶(SGSH；也叫做磺酰胺酶)为涉及山菲立普A型综合征(MPSIIIA, OMIM #252900)的缺陷蛋白。N-磺基葡糖胺磺基水解酶(SGSH, EC 3.10.1.1,MIM 605270)属于逐步降解叫做硫酸乙酰肝素(HS)的糖胺聚糖家族所需的溶酶体水解酶家族。SGSH参与硫酸乙酰肝素降解的第三步。SGSH催化从HS的非还原末端氨基葡糖苷残基水解N-连接的硫酸酯。野生型人类N-磺基葡糖胺磺基水解酶cDNA序列在NCBI参考号U30894的位置+12 - +1521和在SEQ ID NO:4的位置+12 - +1521提供。野生型人类N-磺基葡糖胺磺基水解酶多肽序列在NP_000190.1 (SEQ ID NO:5)提供。野生型人类硫酸酯酶修饰因子1cDNA序列在NCBI参考号AY208752的位置+1 - +1125和在SEQ ID NO:6的位置+1 - +1125提供。野生型人类硫酸酯酶修饰因子1多肽序列在NP_877437.2 (SEQ ID NO:7)提供。在特定实施方案中，SGSH和SUMF1多肽包括它们的信号序列，而在其他实施方案中，一种或两种多肽不包括信号序列。在一些实施方案中，SGSH序列作为SEQ ID NO: 13和/或作为SEQ IDNO: 9的氨基酸1867-3401提供。
AAV cap序列在本领域已知。示例性AAVrh.10 cap多核苷酸序列在PCT专利申请公开号WO2003/042397中作为SEQ ID NO:59提供，其中编码VP1的序列在核苷酸845-3061，编码VP2的序列在核苷酸1256-3061，以及编码VP3的序列在1454-3061。示例性AAVrh.10 cap多肽序列作为PCT专利申请公开号WO2003/042397的SEQ ID NO:81的氨基酸1-738提供，其中VP1序列在氨基酸1-738，VP2序列在氨基酸138-738，以及VP3序列在氨基酸203-738。
在一些实施方案中，如图1中举例说明的本公开的一种表达盒和侧翼ITR的多核苷酸序列作为SEQ ID NO:8提供。在一些实施方案中，如图3中举例说明的本公开的一种表达盒和侧翼ITR的多核苷酸序列在图4A-4B和SEQ ID NO: 9中提供。在一些实施方案中，含有SEQ ID NO: 9的完整质粒p-Lys-SAF-T-5的多核苷酸在图4C-4D和SEQ ID NO: 14中提供。
在某些实施方案中，包含表达盒的多核苷酸序列存在于载体或质粒(例如克隆载体或表达载体)中，以促进多核苷酸序列的复制或产生。本公开的多核苷酸序列可通过利用在ITR序列边界的相容的限制性位点或含有限制性位点DNA的连接序列，以及通过本领域技术人员已知的其他方法插入载体内。分子生物学中常规地使用的质粒可被用作骨架，例如pBR322 (New England Biolabs, Beverly, Mass.)、pRep9 (Invitrogen, San Diego,Calif.)、pBS (Stratagene, La Jolla, Calif.)，用于插入表达盒。
本公开的载体或质粒可存在于宿主细胞中，例如，以产生用于临床用途的基因疗法载体或病毒颗粒。在特定实施方案中，本公开包括包含载体或质粒的细胞，所述载体或质粒包含本公开的表达盒。在特定实施方案中，宿主细胞为293人类胚肾细胞，例如293T细胞，即含有SV40 T抗原的293细胞的高度可转染衍生物。产生病毒载体的其他载体、宿主细胞和方法的实例在Kotin RM, Hum Mol Genet, 2011年4月15日;20(R1):R2-6. Epub 2011年4月29日中描述。
在另外的实施方案中，本公开包括包含本公开的任意表达盒的基因疗法载体或病毒颗粒，其中所述基因疗法载体或病毒颗粒包含衣壳，例如AAVrh.10衣壳。在特定实施方案中，衣壳包含一种或多种AAVrh.10 衣壳多肽。
在某些实施方案中，本公开的多核苷酸、表达盒和载体可包括一种或多种活性多核苷酸或多肽序列的活性变体，如启动子序列、IRES序列或多聚A序列的活性变体，或SGSH多肽或SUMF1多肽的活性变体。活性变体包括本文提供的任何序列的生物学活性变体和生物学活性片段两者，所述序列可被称为参考序列。在特定实施方案中，参考多核苷酸或多肽序列的活性变体与参考多核苷酸或多肽序列具有至少40%、50%、60%、70%，一般至少75%、80%、85%，通常约90%至95%或更多，以及普遍地约97%或98%或99%或更多的序列相似性或同一性，如通过本文其他地方描述的使用默认参数的序列对齐程序所确定的那样。例如，在一些实施方案中，本公开提供与本文提供的任何序列，如SEQ ID NO: 9、10、11、12、13、14、15、16和/或17，具有至少约75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的多核苷酸。
在某些实施方案中，编码SGSH或SUMF1的多核苷酸序列的活性变体由于遗传密码的简并性而不同于野生型或天然存在的基因或cDNA序列。相应地，虽然多核苷酸序列不同于野生型，但是所编码的SGSH或SUMF1多肽保持野生型序列。因此，本公开考虑使用编码SGSH或SUMF1多肽的任意多核苷酸序列或其中的活性变体。
在其他实施方案中，其本身具有活性的多核苷酸序列的活性变体(例如IRES或多聚A序列)可在序列上不同于其对应的野生型参考序列，尽管它保持了它的原生活性。参考多核苷酸序列的活性变体可与该参考序列相差通常多达200、100、50或20个核苷酸残基，或适当地少至1-15个核苷酸残基，少至1-10，如6-10，少至5，少至4、3、2或甚至1个核苷酸残基。
在某些实施方案中，多肽的活性变体具有生物学活性，即它们继续拥有参考多肽的酶促活性。此类变体可产生自例如遗传多态性和/或人为操作。参考多肽的活性变体可与该参考多肽相差通常多达200、100、50或20个氨基酸残基，或适当地少至1-15个氨基酸残基，少至1-10，如6-10，少至5，少至4、3、2或甚至1个氨基酸残基。在一些实施方案中，变体多肽与本文提及的参考序列相差至少一个但少于15、10或5个氨基酸残基。在其他实施方案中，其与参考序列相差至少一个残基但少于20%、15%、10%或5%的残基。
可以各种方式(包括氨基酸替换、缺失、截断和插入)改变参考多肽以产生活性变体。用于此类操作的方法在本领域通常已知。例如，参考多肽的氨基酸序列变体可通过DNA中的突变制备。诱变和核苷酸序列改变的方法在本领域周知。参见例如Kunkel (1985,Proc.Natl. Acad. Sci. USA. 82: 488-492)、Kunkel等人(1987, Methods in Enzymol,154: 367-382)、美国专利号4,873,192、Watson, J. D.等人(“Molecular Biology of theGene”,第四版, Benjamin/Cummings, Menlo Park, Calif., 1987)和其中所引用的参考文献。关于不影响感兴趣蛋白的生物活性的适当氨基酸替换的指导可在Dayhoff等人(1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found.,Washington, D.C.)的模型中找到。
在某些实施方案中，相比于参考多肽序列，多肽变体在其序列的不同位置含有保守的氨基酸替换。“保守的氨基酸替换”为其中氨基酸残基替换为具有相似侧链的氨基酸残基的替换。具有相似侧链的氨基酸残基家族在本领域中已被定义，通常可分为以下子分类：
酸性：残基在生理pH下由于失去H离子而具有负电荷，且当肽在生理pH的水介质中时，残基被水溶液吸引，从而在残基包含于其中的肽的构象中寻找表面位置。具有酸性侧链的氨基酸包括谷氨酸和天冬氨酸；碱性：残基在生理pH下或在其一或两个pH单位内由于结合H离子而具有正电荷(例如组氨酸)，且当肽在生理pH的水介质中时，残基被水溶液吸引，从而在残基包含于其中的肽的构象中寻找表面位置。具有碱性侧链的氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸；
荷电：残基在生理pH下荷电，并且因此包括具有酸性或碱性侧链的氨基酸(即谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、赖氨酸和组氨酸)；
疏水的：残基在生理pH下不荷电，且当肽在水介质中时，残基被水溶液排斥，从而在残基包含于其中的肽的构象中寻找内部位置。具有疏水侧链的氨基酸包括酪氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和色氨酸；和
中性/极性：残基在生理pH下不荷电，但当肽在水介质中时，残基并不充分被水溶液排斥，因此残基可能在残基包含于其中的肽的构象中寻找内部位置。具有中性/极性侧链的氨基酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、组氨酸、丝氨酸和苏氨酸。
氨基酸残基可进一步细分为环状或非环状的以及芳香族或非芳香族的，即关于残基侧链取代基团的一目了然的分类，和细分为小的或大的。若残基在有额外的极性取代基的情况下，包括羧基碳在内含有总计四个碳原子或更少；在没有额外的极性取代基的情况下含有三个或更少，则认为残基是小的。当然，小的残基总是非芳香族。依赖于它们的结构特性，氨基酸残基可能落入两个或更多个分类。对于天然存在的蛋白氨基酸，根据此方案的子分类呈现于表1。
表1.氨基酸子分类
子类 氨基酸
酸性 天冬氨酸、谷氨酸
碱性 非环状：精氨酸、赖氨酸；环状：组氨酸
荷电 天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、赖氨酸、组氨酸
小 甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸、苏氨酸、脯氨酸
极性/中性 天冬酰胺、组氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸
极性/大 天冬酰胺、谷氨酰胺
疏水的 酪氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸
芳香族 色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸，
影响链取向的残基 甘氨酸和脯氨酸
保守的氨基酸替换也包括基于侧链的分组。例如，具有脂肪族侧链的氨基酸组为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂肪族-羟基侧链的氨基酸组为丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的氨基酸组为天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香族侧链的氨基酸组为苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的氨基酸组为赖氨酸、精氨酸和组氨酸；以及具有含硫侧链的氨基酸组为半胱氨酸和甲硫氨酸。例如，可以合理预期，将亮氨酸替换为异亮氨酸或缬氨酸，将天冬氨酸替换为谷氨酸，将苏氨酸替换为丝氨酸，或类似的将氨基酸替换为结构上相关的氨基酸不会对所得变体多肽的特性产生重大影响。氨基酸改变是否导致有功能的截断和/或变体多肽可通过测定其酶促活性而容易地确定，如本文所述。保守的替换在表2示例性替换的标题下显示。通常来说，落入本公开范围内的氨基酸替换通过选择其对保持(a)在替换区域中肽骨架的结构，(b)分子在靶位点的电荷或疏水性，或(c)侧链的大小的效果没有显著区别的替换来实现。在引入替换后，对变体的生物活性进行筛选。
表2.示例性氨基酸替换
原有残基 示例性替换 优选替换
Ala Val、Leu、Ile Val
Arg Lys、Gln、Asn Lys
Asn Gln、His、Lys、Arg Gln
Asp Glu Glu
Cys Ser Ser
Gln Asn、His、Lys Asn
Glu Asp、Lys Asp
Gly Pro Pro
His Asn、Gln、Lys、Arg Arg
Ile Leu、Val、Met、Ala、Phe、Norleu Leu
Leu Norleu、Ile、Val、Met、Ala、Phe Ile
Lys Arg、Gln、Asn Arg
Met Leu、Ile、Phe Leu
Phe Leu、Val、Ile、Ala Leu
Pro Gly Gly
Ser Thr Thr
Thr Ser Ser
Trp Tyr Tyr
Tyr Trp、Phe、Thr、Ser Phe
Val Ile、Leu、Met、Phe、Ala、Norleu Leu
因此，参考多肽中预测的非必需的氨基酸残基通常地被替换为来自相同侧链家族的另一种氨基酸残基。“非必需”氨基酸残基为在不破坏或大幅改变其一种或多种活性的情况下，可自实施方案多肽的野生型序列进行改变的残基。适当地，该改变并不不大幅破坏这些活性中的一种，例如，该活性为野生型的至少20%、40%、60%、70%或80%、100%、500%、1000%或更多。“必需”氨基酸残基为当自参考多肽的野生型序列改变时，导致破坏亲本分子活性，以致存在少于野生型20%的活性的残基。例如，此类必需氨基酸残基可包括在来自各种来源的参考多肽的酶促位点中保守的那些残基。
在某些实施方案中，本公开也考虑天然存在的参考多肽序列的活性变体，其中变体通过添加、缺失或替换一个或多个氨基酸残基而与天然存在的序列相区别。在某些实施方案中，多肽的活性变体包括与本文所述的对应的参考多肽序列具有至少约50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或更多序列同一性或相似性的氨基酸序列，并保持该参考多肽酶促活性。
序列间序列相似性或序列同一性(该术语在本文中可互换使用)的计算实施如下。为确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的同一性百分比，序列为最优比较目的而对齐(例如可为了最优对齐而将空位引入至第一和第二氨基酸或核酸序列之一或两者，以及可为了比较目的而忽略非同源序列)。在某些实施方案中，为了比较目的而对齐的参考序列的长度为参考序列长度的至少30%，优选至少40%，更优选至少50%、60%，和甚至更优选至少70%、80%、90%、100%。随后比较在对应氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置被与第二序列中的对应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据，则该分子在该位置为一致的。
两个序列之间的同一性百分比为序列共享的一致位置数目的函数，将空位的数目和各个空位的长度纳入考虑，所述空位用于两个序列的最优对齐而需要被引入。
序列比较和两个序列间同一性百分比的确定可使用数学算法实现。在一个实施方案中，两个氨基酸序列间的同一性百分比使用已并入GCG软件包中的GAP程序的Needleman和Wunsch (1970, J. Mol.Biol. 48: 444-453)算法确定，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵和16、14、12、10、8、6或4的空位权重和1、2、3、4、5或6的长度权重。在又另一个优选的实施方案中，两个核苷酸序列间的同一性百分比使用在GCG软件包中的GAP程序确定，使用NWSgapdna.CMP矩阵和40、50、60、70或80的空位权重和1、2、3、4、5或6的长度权重。特别优选的参数组(且除非另有说明，否则应该使用的参数组)为Blossum 62打分矩阵，空位罚分为12，空位延长罚分为4，以及移码空位罚分为5。
产生基因疗法载体的方法
本公开的基因疗法载体可通过在本领域中已知的和先前在例如PCT专利申请公开号WO03042397和美国专利号6,632,670中描述的方法产生。
AAV基因组为约4.7千碱基长的正义或反义的单链脱氧核糖核酸(ssDNA)。该基因组在DNA链的两端包含ITR并包含两个开放阅读框(ORF)：rep和cap。Rep包含四个重叠基因，其编码AAV生命周期所需的Rep蛋白，而cap包含重叠核苷酸序列，其编码衣壳蛋白：VP1、VP2和VP3，所述衣壳蛋白相互作用以形成二十面体对称的衣壳。
ITR据信是整合AAV DNA至宿主细胞基因组内和从宿主细胞中拯救AAV DNA都需要的，以及是AAV DNA的有效衣壳化和完全组装的AAV颗粒的产生所需的。关于基因疗法，ITR似乎是紧邻治疗基因顺式所需的仅有的序列，且结构(cap)和包装(rep)基因可被反式递送。相应地，为产生含有治疗基因的重组AAV (rAAV)载体而确立的某些方法涉及使用两种或三种质粒。在特定实施方案中，第一质粒包含含有编码治疗性多肽的多核苷酸序列的表达盒，所述表达盒含有侧翼ITR。在一些实施方案中，第二质粒包含rep和cap基因和侧翼ITR。在一些实施方案中，第三质粒提供辅助功能(例如来自腺病毒血清型5)。为了产生重组AAV载体储存物，标准方法在质粒上提供AAV rep和cap基因产物，所述质粒用于与编码治疗性多肽的AAV载体质粒一起共转染适合的细胞。在一些实施方案中，标准方法在质粒上提供AAV rep和cap基因产物，所述质粒与编码治疗性多肽的AAV载体质粒一起且与提供辅助功能的质粒一起共转染适合的细胞。
在特定实施方案中，AAV rep和cap基因在含有AAV ITR序列的复制质粒上提供。在一些实施方案中，rep蛋白激活ITR作为复制起点，引起质粒复制。复制起点可包括但不限于SV40复制起点、Epstein-Barr (EBV)复制起点、ColE1复制起点以及本领域技术人员已知的其他复制起点。例如，在复制起点需要激活蛋白的情况下，例如SV40起点需要T抗原、EBV起点需要EBNA蛋白，激活蛋白可由稳定转染以创造细胞系来源(例如293T细胞)而提供，或通过用含有适当基因的质粒进行瞬时转染而提供。
在其他实施方案中，AAV rep和cap基因可在不含复制起点的非复制质粒上提供。此类非复制质粒进一步确保细胞的复制机构针对于复制重组AAV基因组，以优化病毒产生。由此类非复制质粒编码的AAV蛋白的水平可通过使用特定启动子驱动这些基因表达而进行调节。此类启动子尤其是包括AAV启动子，以及来自外源来源的启动子，例如CMV、RSV、MMTV、E1A、EF1a、肌动蛋白、细胞角蛋白14、细胞角蛋白18、PGK以及其他本领域技术人员已知的那些。由这些辅助质粒产生的rep和cap蛋白的水平可通过为每个基因选择最适合于所期望的蛋白水平的启动子而分别调节。
可使用标准重组DNA技术以构建用于产生本公开的病毒载体的辅助质粒(参见例如Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel., F.等人编, Wiley and Sons,New York 1995)，包括利用在基因和AAV ITR序列(如果使用的话)边界处的相容限制性位点或含有限制性位点的DNA连接序列，以及本领域技术人员已知的其他方法。
在一个实施方案中，本公开的基因疗法载体通过转染两种或三种质粒至293或293T人类胚肾细胞系中而产生。在一些实施方案中，编码治疗基因的DNA由一种质粒提供，且衣壳蛋白(来自AAVrh.10)、复制基因(来自AAV2)和辅助功能(来自腺病毒血清型5)均由第二质粒反式提供。在一些实施方案中，编码治疗基因的DNA由一种质粒提供，衣壳蛋白(来自AAVrh.10)和复制基因(来自AAV2)由第二质粒反式提供，且辅助功能(来自腺病毒血清型5)由第三质粒提供。在特定实施方案中，第一质粒包含包括侧翼ITR的本公开的表达盒。
在细胞培养后，基因疗法载体通过冻融循环从细胞中释放，通过碘克沙醇分级梯度然后是在Hi-Trap QHP柱的离子交换色谱进行纯化。所得基因疗法载体可通过旋转柱进行浓缩。纯化的载体可冷冻储存(在-60℃或低于-60℃)例如在磷酸盐缓冲盐水中。
最终配制的载体的表征可通过以下而实现：对衣壳蛋白的SDS-PAGE和Western印迹，对转基因DNA的实时PCR，对功能基因转移的Western分析、体内和体外一般和特定外来病毒以及酶学测定。
治疗方法
本公开包括治疗脑疾病和障碍、神经系统的疾病和障碍以及遗传疾病和障碍的方法，所述疾病包括但不限于溶酶体贮积疾病，如MPS。
在某些实施方案中，本公开提供治疗MPSIIIA (山菲立普综合征)的方法，该方法包含提供包含基因疗法载体的组合物至需要其的受试者，所述载体被设计为当被受试者细胞吸收时表达SGSH。在特定实施方案中，组合物进一步包含药学上可接受运载体、赋形剂或稀释剂，例如磷酸盐缓冲盐水。在某些实施方案中，受试者为哺乳动物，如人类。在特定实施方案中，受试者例如通过基因测试确认在受试者的N-磺基葡糖胺磺基水解酶(sgsh)基因的突变或通过从获得自受试者的生物样品中测量SGSH活性而已被诊断患有MPSIIIA。在一些实施方案中，本文提供的方法在受试者整个脑中恢复正常SGSH活性的至少约5%、至少约10%、至少约15%、至少约20%、至少约25%、至少约30%或更多。
在特定实施方案中，基因疗法载体包含本公开的任意表达盒。相应地，在特定实施方案中，本公开包括通过施用包含含有表达盒的基因疗法载体的组合物至需要其的受试者而治疗MPSIIIA的方法，所述表达盒按5’至3’顺序包含以下：
启动子序列；
编码人类N-磺基葡糖胺磺基水解酶(SGSH)多肽或其活性变体的多核苷酸序列；
和
多腺苷酸化(多聚A)序列。
在一些实施方案中，基因疗法载体不包含编码SUMF1的多核苷酸序列，且不包含IRES序列。
在一个实施方案中，表达盒的侧翼为ITR，且因此该载体按以下5’至3’顺序包含：
AAV2 ITR序列；
CAG启动子序列；
编码人类N-磺基葡糖胺磺基水解酶(SGSH)多肽或其活性变体的多核苷酸序列；
人类生长激素多聚A序列；和
AAV2 ITR序列。
在特定实施方案中，SGSH多肽包含野生型人类SGSH多肽或由其组成，且在特定实施方案中，表达盒和侧翼ITR包含SEQ ID NO:9中所述的多核苷酸序列。
在某些实施方案中，包含基因疗法载体的组合物被施用至受试者的脑。例如，在一些实施方案中，包含基因疗法载体的组合物经直接注射至脑实质内而施用。在某些实施方案中，它被脑内施用。在一个实施方案中，它通过脑内注射被直接施用至脑内。此技术允许靶向选择性神经解剖位点以控制载体递送。
不希望受任意特定理论的束缚，据信在注射至脑实质内后，AAV载体颗粒将局部扩散且也可沿轴突被运输至遥远的解剖脑结构。载体颗粒被神经元、神经胶质或小胶质细胞内在化。这些细胞类型的每一种都在MPSIIIA患者中缺乏SGSH酶，且遭受未降解的硫酸乙酰肝素分解代谢物的毒性积累。在进入细胞内之后，编码SGSH蛋白的重组基因组被运输至核内，在核中所述重组基因组经历导致其稳定形成为双链脱氧核糖核酸(DNA)分子的一系列分子转化，此DNA被细胞机器积极转录为信使核糖核酸(mRNA)。该mRNA被翻译为将补充细胞缺陷的SGSH。
溶酶体贮积的酶补充和修正被认为通过两个不同机制发生：(1)酶可到达含有和表达AAV所携带转基因的细胞的溶酶体并降解积累的分解代谢物；或(2)酶可被释放到这些细胞外，被远处的细胞再捕获并被导向它们的溶酶体。因此，有限的遗传修饰的细胞组允许修正扩展的脑区域。转导细胞将持续表达和递送酶，因此构成脑内永久的酶产生来源。
在特定实施方案中，脑内施用在受试者脑中一个或多个，例如二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一或十二个位点处实施。施用可实施于脑的一侧或双侧。例如，当基因疗法载体被施用至脑的两个或更多个位点的时候，其可被施用至双侧脑，例如在每一侧的相似或相同位置。在特定实施方案中，基因疗法载体被施用至受试者脑的一个或多个位点，所述位点选自：右前侧、左前侧、右中侧、左中侧、右后侧和左后侧。
在某些实施方案中，脑内施用通过一个或多个钻孔实施，所述钻孔可在邻近壳核的白质中。在特定实施方案中，基因疗法载体通过单个钻孔施用至脑或白质内的两个或更多个位点。比如，基因疗法载体的两个或更多个沉积物可通过单个钻孔或轨迹施用，其中一个为深层的且另一个为浅表的，这可提高实质的扩散。在某些实施方案中，深层注射在距皮层表面约1.5 cm至约3.0 cm，或约1.7 cm至约2.5 cm，或约2 cm的深度实施。在某些实施方案中，浅表注射在距皮层表面约0.5 cm至约2.0 cm，或约0.7 cm至约1.5 cm，或约1 cm的深度实施。
在某些实施方案中，基因疗法载体经脑内注射施用，其中该注射在单一深度实施。在一些实施方案中，基因疗法载体经在单一深度的双侧注射而施用。例如，在一些实施方案中，基因疗法载体经由通过白质中的2、4、6、8、10、12、14或16个钻孔，脑内注射至受试者脑内的2、4、6、8、10、12、14、16或更多个位点而施用，其中基因疗法载体的单个沉积物通过每个钻孔或轨迹施用。在一些实施方案中，在单一深度施用基因疗法载体令人惊讶地优于在多于一个深度(如在两个深度)施用基因疗法载体。不希望受理论的束缚，相较于两个或更多个深度，当基因疗法载体在单一深度施用时载体传播更有效。
在一个特定实施方案中，基因疗法载体经由通过白质中的六个钻孔，脑内注射至受试者脑中的六个位点而施用，其中基因疗法载体的单个沉积物通过各个钻孔或轨迹施用。因此，基因疗法载体在单一深度施用于各个注射钻孔中。在每个钻孔内施用的位置可选自：右前侧、左前侧、右中侧、左中侧、右后侧和左后侧。在一些实施方案中，在各个钻孔内施用的位置可选自：右前侧浅表、右前侧深层、左前侧浅表、左前侧深层、右中侧浅表、右中侧深层、左中侧浅表、左中侧深层、右后侧浅表、右后侧深层、左后侧浅表和左后侧深层。在一些实施方案中，深层注射在距皮层表面约1.5 cm至约3.0 cm，或约1.7 cm至约2.5 cm，或约2 cm的深度实施；且浅表注射在距皮层表面约0.5 cm至约2.0 cm，或约0.7 cm至约1.5 cm，或约1 cm的深度实施。在一些实施方案中，深层和/或浅表注射可基于MRI图像进行选择。在一些实施方案中，深层和浅表注射可结合施用，从而在单一深度施用每次注射，且每次注射为深层或浅表注射。在一些实施方案中，施用至受试者的所有注射均为深层注射。在一些实施方案中，施用至受试者的所有注射均为浅表注射。
注射可在单次神经外科手术中实现。脑内注射可使用输注泵实施。
在此公开的各种实施方案中，术语即单位基因组拷贝(gc)与术语即单位病毒基因组(vg)可互换使用。
在某些实施方案中，总计约1.0x1010 gc至约1.0x1014 gc、约5.0x1010 gc至约5.0x1013 gc、约5.0x1010 gc至约1.0x1013 gc、约1.0x1011 gc至约1.0x1013 gc、约1.0x1011 gc至约5.0x1012 gc、约5.0x1011 gc至约5.0x1012 gc、约8.0x1011 gc至约8.0x1012或约7.0x1012 gc至约7.4x1012gc的病毒载体被施用至受试者。在特定实施方案中，约7.2x1012gc的病毒载体被施用至受试者。在某些实施方案中，约0.8x109 gc至约0.8x1013 gc、约0.4x1010 gc至约0.4x1013 gc、约0.4x1010 gc至约0.8x1012 gc、约0.8x1010 gc至约0.8x1012gc、约0.8x1010 gc至约0.4x1012 gc或约0.4x1011 gc至约0.4x1012 gc的病毒载体被施用至受试者的各个位点。在特定实施方案中，约0.6x1011gc的病毒载体被施用至受试者的各个位点。在特定实施方案中，约0.6x1011gc的病毒载体被施用受试者脑或白质中十二个位点的每一个，从而约7.2x1011 gc的病毒载体被施用至受试者。在特定实施方案中，约1.2x1012gc的病毒载体被施用至受试者的各个位点。在特定实施方案中，约1.2x1012gc的病毒载体被施用至受试者脑或白质中六个位点的每一个，从而约7.2x1012 gc的总病毒载体被施用至受试者。在一些实施方案中，递送至受试者的病毒载体的量为从约6.0x109至约8.0x109 gc每克脑组织(gc/gr)。在一些实施方案中，递送至受试者的病毒载体的量为从约7.0x109gc/gr至约7.4x109gc/gr。在一些实施方案中，递送至受试者的病毒载体的量为约7.2x109gc/gr。
在一些实施方案中，基因疗法载体在包含PBS缓冲液的制剂中施用。在一些实施方案中，PBS缓冲液不含任何赋形剂或防腐剂。在一些实施方案中，PBS缓冲液的组合物包含KCl、KH2PO4、NaCl和/或Na2HPO4。在一些实施方案中，PBS缓冲液的组合物包含约2.67mMKCl、约1.47mM KH2PO4、约137.9mM NaCl和约8.06mM Na2HPO4。在一些实施方案中，制剂的pH为约6.8至约7.8，或约7.2-7.4。
在某些实施方案中，施用至各个位点的包含基因疗法载体的组合物体积为约10 µl至约600 µl、约20 µl至约550 µl、约30 µl至约200 µl、约50 µl、约100 µl或约150 µl。在一些实施方案中，在每次注射中施用至各个位点的包含基因疗法载体的组合物体积为约200 µl、约300 µl、约400 µl、约500 µl、约600 µl。在某些实施方案中，每次注射的体积为约500 µl。在特定实施方案中，施用包含基因疗法载体的组合物的输注速率为约0.1 µl/min至约10 µl/min，约0.2 µl/min至约8 µl/min，约0.3 µl/min至约6 µl/min，或约0.5 µl/min至约5 µl/min，或约0.4 µl/min至约4.0 µl/min，或约0.4 µl/min至约3.0 µl/min或约2.0 µl/min。在一些实施方案中，施用组合物的输注速率为约5 µl/min。在一些实施方案中，包含基因疗法载体的组合物经约500 µl的多次注射以约5 µl/min流速施用。
在哺乳动物(包括人类)中的剂量选择可基于以下功效和安全标准：(1)递送至整个脑中的载体颗粒的总量应当足够在相当大的脑体积中诱导SGSH产生，以及应当防止脑中贮积损伤的进展；和(2)在各个沉积物的载体颗粒的量不得诱导局部毒性。
先前在其他MPS模型上的临床前研究提供了一些关于功效的信息。AAV载体的剂量已在立体定位注射至脑内后在MPS (MPSI和MPSIIIB)的犬类模型中进行评估。这些研究已得出结论，40 µl x 1.5x1012 vg/ml的8个沉积物(代表在每个沉积物中6x1010 vg)足以在整个狗脑中有效地递送载体。4倍高的剂量是安全的，尽管它不一定对脑组织中的载体递送更有效。这表征6x1010 vg/沉积物的剂量为安全和有效的。
在一个特定实施方案中，本公开提供治疗MPSIIIA的方法，所述方法包含施用包含含有表达盒的病毒载体的组合物至需要其的受试者(例如诊断为患有MPSIIIA的人类)，所述表达盒按5’至3’顺序包含以下序列，其中CAG启动子序列可操作地连接至编码SGSH的多核苷酸序列：
AAV2 ITR序列；
CAG启动子序列；
编码人类N-磺基葡糖胺磺基水解酶(SGSH)多肽或其活性变体的多核苷酸序列；
人类生长激素多聚A序列；和
AAV2 ITR序列，
其中所述组合物通过在受试者头部的六个钻孔经脑内注射至受试者脑内的六个位点而施用，
其中组合物通过各个钻孔或轨迹向单个位点并在单一深度施用，
其中所述六个位点为右前侧、左前侧、右中侧、左中侧、右后侧、和左后侧，
其中约0.8x109至0.8x1013 gc或约1.2x1012gc的病毒载体被施用至十二个位点中的每一个，
其中施用至十二个位点的每一个的组合物体积为约10 µl至约600 µl或约500 µl，和
其中施用组合物的输注速率为约0.1 µl/min至约10 µl/min，约0.2 µl/min至约8µl/min，约0.3 µl/min至约6 µl/min，或约0.4 µl/min至约4.0 µl/min，约0.4 µl/min至约3.0 µl/min，或约2.0 µl/min，或约5.0 µl/min。
在某些实施方案中，使用输注泵实施施用。
治疗MPSIIIA的方法对递送治疗剂至脑和神经系统是有利的，且它们可通过使用不同的治疗剂进行修饰以治疗其他脑疾病或障碍或神经系统的疾病或障碍。
如在所附实施例中进一步描述的，相对于如LYS-SAF301的基因疗法载体，本文提供的基因疗法载体LYS-SAF302提供显著的改善。例如，在一些实施方案中，LYS-SAF302在产生SGSH和降低脑中HS的量方面导致优越的表达和效力。LYS-SAF302可安全和有效地以7.2x 1012 vg的总剂量在约5.0 µl/min的输注速率下给药。例如，以在单一深度每注射和5.0 µl/min的500 µL体积注射的6次施用进行给药的LYS-SAF302提供对涉及SGSH基因突变的神经系统疾病的高效、安全的治疗。
相应地，在某些实施方案中，本公开包括治疗需要其的受试者中由突变的基因引起的脑或神经系统的疾病或障碍的方法，其包含脑内施用包含表达盒的基因疗法载体至受试者，该表达盒包含编码由野生型或非突变形式的基因编码的多肽或其活性变体的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列可操作地连接至启动子序列，且其中所述脑内施用包含以约六至约十二个剂量，每个剂量总计约5.0x109 gc至约5.0x1012 gc，或约1.0x1010 gc至约1.0x1012 gc，或约6x1010 gc，以约10 µl至约500 µl的体积，施用约5x1010 gc至约5x1013 gc或约1.0x1011 gc至约1.0x1013 gc。在某些实施方案中，多核苷酸序列可操作地连接至CAG启动子。在某些实施方案中，每个剂量以约0.1 µl/min至约10 µl/min，约0.2 µl/min至约8µl/min，约0.3 µl/min至约6 µl/min，或约0.4 µl/min至约4.0 µl/min，约0.5 µl/min至约5.0 µl/min，约2.0 µl/min，或约5 µL/min的速率施用。在特定实施方案中，脑内施用使用递送设备实施，所述设备任选地包含导管。在某些实施方案中，脑内施用包含通过在邻近壳核的白质中的六个孔施用载体至受试者的脑或白质。在特定实施方案中，十二个剂量中的两个通过六个孔的每一个施用，其中两个剂量的其中一个为深层施用且两个剂量的其中一个为浅表施用。在某些实施方案中，十二个剂量的每一个均经导管施用。在一个实施方案中，脑内施用使用输注泵实施。在一些实施方案中，脑内施用包含以六个剂量施用载体至受试者的脑或白质，其中每个剂量在单一深度施用。
本公开进一步包括治疗需要其的受试者中脑或神经系统疾病或障碍的方法，或提供治疗剂至需要其的受试者的脑的方法，所述方法包含施用包含治疗剂的组合物至需要其的受试者(例如人类)，其中所述组合物通过在受试者头部的六个钻孔经脑内注射至受试者脑内的六或十二个位点而施用。在一些实施方案中，组合物通过每个钻孔或轨迹施用至两个位点，其中两个位点的其中一个为深层的且两个位点的另一个为浅表的，其中所述十二个位点为右前侧浅表、右前侧深层、左前侧浅表、左前侧深层、右中侧浅表、右中侧深层、左中侧浅表、左中侧深层、右后侧浅表、右后侧深层、左后侧浅表和左后侧深层，其中施用至十二个位点的每一个的组合物体积为约10 µl至约300 µl，且其中施用组合物的输注速率为约0.1 µl/min至约10 µl/min，约0.2 µl/min至约8 µl/min，约0.3 µl/min至约6 µl/min，或约0.4 µl/min至约4.0 µl/min，约0.5 µL至约5.0 µL，约0.4 µl/min至约3.0 µl/min，或约2.0 µl/min，或约5.0 µ/min。在某些实施方案中，施用使用输注泵实施。在一些实施方案中，组合物施用至受试者头部的钻孔，其中组合物通过每个钻孔或轨迹施用至单个位点。在一些实施方案中，单个钻孔选自深层或浅表位点。例如，在一些实施方案中，每次施用均为深层位点。在一些实施方案中，每次施用均为浅表位点。在一些实施方案中，多次施用为深层和浅表位点的混合，即施用的各个位点独立地选择深层或浅表施用。
本公开考虑使用任何类型的治疗剂，包括但不限于小分子、多肽、抗体和其片段、多核苷酸(例如siRNA、反义RNA、miRNA和病毒载体)。在特定实施方案中，治疗剂为病毒载体，例如AAV载体(如AAVrh.10载体)。
在特定实施方案中，此方法用于治疗由遗传缺陷引起的溶酶体贮积障碍，包括但不限于MPS (包括但不限于山菲立普C、山菲立普D、Sl、贺勒-施艾氏(Hurler-Scheie)、山菲立普A、亨特(Hunter)、莫奎欧(Morquio)、山菲立普B、马洛托-拉米氏(Maroteaux-Lamy))、戈谢(Gaucher)、异染性脑白质营养不良(Metachromatic Leukodystrophy)、法布里(Fabry)、克雷比(Krabbe)、庞贝(Pompe)、胱氨酸贮积症(Cystinosis)、泰-萨氏(Tay-Sachs)、尼曼-匹克氏(Niemann Pick) C、尼曼-匹克氏A/B、黏脂质贮积症(Mucolipidosis)II/III、Gm1神经节苷脂贮积症(Gangliosidosis)、桑德霍夫(Sandhoff)或本文所述的任意其他疾病，其中治疗剂为提供与特定疾病相关的缺失或突变的酶的功能性或野生型版本的病毒载体。该酶可在AAV病毒载体(如本文所述的任意载体)中提供，但编码SGSH的多核苷酸序列(和任选地IRES)被替换为编码所期望的酶的多核苷酸序列。这些疾病的遗传基础是已知的，并且此类酶和多核苷酸序列在本领域中已知且可得。例如，与MPSII相关的酶为艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶；与MPS1相关的酶为α-L-艾杜糖醛酸酶，与MPSIIID相关的酶为葡糖胺-6-硫酸酯酶，与MPSIIIC相关的酶为N-乙酰转移酶；与MPSIIIB相关的酶为α-N-乙酰氨基葡糖苷酶或葡萄糖醛酸-2-硫酸酯酶，以及与MPSVII相关的酶为β-D-葡糖醛酸糖苷酶或葡糖胺-3-硫酸酯酶。
其他脑或神经系统的疾病和障碍也可根据本文所述的方法(包括但不限于本文所述的任意方法)通过将治疗剂递送至脑而进行治疗。
使用基因疗法和免疫抑制剂组合的治疗方法
本公开也包括使用基因疗法载体与一种或多种免疫抑制剂组合治疗遗传障碍的方法。本公开令人惊讶和意想不到的发现是，在施用基因疗法载体后用免疫抑制剂长期治疗通过减少对基因疗法载体的炎症或免疫反应提高基因疗法治疗的功效。
在某些实施方案中，本公开包括治疗MPSIIIA的方法，其包含施用以下至需要其的受试者：
(1) 包含表达盒的基因疗法载体，所述表达盒包含编码SGSH多肽或其活性变体的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列可操作地连接至启动子序列；和
(2) 一种或多种免疫抑制剂，
其中，紧随施用基因疗法载体后，将一种或多种免疫抑制剂中的至少一种提供至受试者，持续时间为至少两个月、至少三个月、至少四个月、至少五个月、至少六个月、至少八个月、至少十个月或至少十二个月。在某些实施方案中，在受试者剩余的生命中，或只要受试者正在从表达盒产生可检测水平的SGSH多肽，就将一种或多种免疫抑制剂的至少一种提供至受试者。
在特定实施方案中，本文所述的本公开的任意基因疗法载体可被用于实践该方法。
在一个特定实施方案中，本公开包括治疗需要其的受试者中MPSIIIA的方法，所述方法包含：施用以下至需要其的受试者(例如被诊断患有MPSIIIA的人类)：
(1)包含含有表达盒的病毒载体的组合物，所述表达盒按5’至3’顺序包含以下序列，其中CAG启动子序列可操作地连接至编码SGSH的多核苷酸序列：
a.AAV2 ITR序列；
b.CAG启动子序列；
编码人类N-磺基葡糖胺磺基水解酶(SGSH)多肽或其活性变体的多核苷酸序列；
c. 人类生长激素多聚A序列；和
d. AAV2 ITR序列；和
(2) 一种或多种免疫抑制剂，
其中，紧随施用基因疗法载体后将一种或多种免疫抑制剂中的至少一种提供至受试者，持续时间为至少两个月、至少三个月、至少四个月、至少五个月、至少六个月、至少八个月、至少十个月或至少十二个月。在某些实施方案中，在受试者剩余的生命中，或只要受试者正在从表达盒产生可检测水平的SGSH多肽，就将一种或多种免疫抑制剂的至少一种提供至受试者。
在这些方法的特定实施方案中，这些方法包括以下特征的一种或多种：所述组合物通过受试者头部的钻孔经脑内注射施用至受试者的脑；组合物经四至八个钻孔施用；组合物通过各个钻孔或轨迹施用至一或两个位点，其中该位点独立地为深层和/或浅表的；位点选自右前侧浅表、右前侧深层、左前侧浅表、左前侧深层、右中侧浅表、右中侧深层、左中侧浅表、左中侧深层、右后侧浅表、右后侧深层、左后侧浅表和左后侧深层，约0.8x109 gc至约0.8x1013 gc、约1.0x1010 gc至约1.0x1013或约1.0x1010 gc至约1.0x1012 gc或约6x1010gc或约1.2x1012gc的剂量的病毒载体被施用至六或十二个位点的每一个，
其中施用至十二个位点的每一个的组合物的体积为约10 µl至约600 µl，和/或其中施用载体的输注速率为约0.1 µl/min至约10 µl/min，约0.2 µl/min至约8 µl/min，约0.3 µl/min至约6 µl/min，或约0.4 µl/min至约4.0 µl/min，约0.4 µl/min至约3.0 µl/min或约2.0 µl/min，或约5.0 µl/min。在某些实施方案中，施用使用输注泵实施。在某些实施方案中，组合物被施用至上述全部十二个位点。在一个实施方案中，该方法包括上述所有特征。
在包括提供一种或多种免疫抑制剂的方法的特定实施方案中，该一种或多种免疫抑制剂包含钙依赖磷酸酶抑制剂(例如他克莫司)、大环内酯(例如西罗莫司(sirolimus)或雷帕霉素(rapamicyn))和/或霉酚酸酯。在某些实施方案中，紧随施用基因疗法载体后将一种或多种免疫抑制剂的至少一种提供至受试者，持续时间为至少三个月、至少四个月、至少五个月、至少六个月、至少八个月、至少十个月或至少十二个月。在某些实施方案中，在施用基因疗法载体前将一种或多种免疫抑制剂的至少一种提供至受试者持续一段时间。
在一个特定实施方案中，一种或多种免疫抑制剂包含钙依赖磷酸酶抑制剂(例如他克莫司)，其紧随施用基因疗法载体后被提供至受试者，持续时间为至少十二个月。在一个特定实施方案中，一种或多种免疫抑制剂包含大环内酯(例如西罗莫司)，其紧随施用基因疗法载体后被提供至受试者，持续时间为至少十二个月。在某些实施方案中，一种或多种免疫抑制剂包含钙依赖磷酸酶抑制剂(例如他克莫司)和霉酚酸酯。在某些实施方案中，一种或多种免疫抑制剂包含大环内酯(例如西罗莫司)和霉酚酸酯。在特定实施方案中，紧随施用基因疗法载体后提供钙依赖磷酸酶抑制剂或大环内酯至受试者，持续时间为至少十二个月，以及在施用基因疗法载体前约两周开始提供霉酚酸酯至患者，持续约两个月。
在另一个特定实施方案中，钙依赖磷酸酶抑制剂为他克莫司，其以0.05 mg/kg/天– 1.0 mg/kg/天或约0.2 mg/kg/天的剂量在紧随施用基因疗法载体后提供至受试者，持续至少两个月或至少三个月。在另一个特定实施方案中，钙依赖磷酸酶抑制剂为他克莫司，其以他克莫司的血液浓度达到10 ng/ml – 15 ng/ml的剂量在紧随施用基因疗法载体后提供至受试者，持续时间为三个月的期间。在进一步特定实施方案中，钙依赖磷酸酶抑制剂为他克莫司，其以他克莫司的血液浓度达到7 ng/ml – 10 ng/ml的剂量在紧随施用基因疗法载体后提供至受试者，持续时间为第四个月至第十二个月的期间。在特定实施方案中，钙依赖磷酸酶抑制剂(例如他克莫司)在施用基因疗法载体后被提供至受试者，持续长达一年、长达两年、长达三年、长达四年、长达五年或持续时间为受试者的生命期内。
在另一个实施方案中，大环内酯为西罗莫司，其以3 mg/kg/天或约1.5 mg/kg/每天两次的剂量在紧随施用基因疗法载体后提供至受试者，持续至少两个月或至少三个月。在另一个特定实施方案中，大环内酯为西罗莫司，其以西罗莫司的血液水平达到10 ng/ml– 25 ng/ml的剂量在紧随施用基因疗法载体后提供至受试者，持续时间为三个月的期间。在进一步特定实施方案中，一种或多种免疫抑制剂为西罗莫司，其以西罗莫司的血液水平达到20 ng/ml的剂量在紧随施用基因疗法载体后提供至受试者，持续时间为第二个月至第六个月的期间。在进一步特定实施方案中，一种或多种免疫抑制剂为西罗莫司，其以西罗莫司的血液水平达到10 ng/ml至15 ng/ml的剂量在紧随施用基因疗法载体后提供至受试者，持续时间为六个月内。
在另一个实施方案中，一种或多种免疫抑制剂包含霉酚酸酯，其在紧随施用基因疗法载体后被提供至受试者，持续长达两个月或约两个月。在某些实施方案中，霉酚酸酯以200 mg/m2/天 – 1200 mg/m2/天或约600 mg/m2/天的剂量提供至受试者。
在另一个实施方案中，该方法进一步包含在紧随施用基因疗法载体后提供泼尼松龙至受试者，持续时间为三至十天之间、约五天、约六天或约七天。在特定实施方案中，泼尼松龙以约0.2 mg/kg/天至约5 mg/kg/天或约1 mg/kg/天的剂量提供至受试者。
在特定方法中，向受试者提供：(1)泼尼松龙，以约1 mg/kg/天的剂量在施用基因疗法载体之前或之后十二小时内开始并持续约10天；(2)他克莫司，在施用基因疗法载体前14天以约0.2 mg/kg/天(例如分两次给药)的开始剂量开始，并在七天的治疗后进行调整，使目标为在施用基因疗法载体后在头三个月期间为10 – 15 ng/ml和从第四个月起且长达至少一年为7-10 ng/ml的残留剂量；和(3)霉酚酸酯，以600 mg/m2 (最大为2)每天两次的剂量在施用基因疗法载体前14天开始并在施用基因疗法载体后保持两个月或八周。
在特定方法中，向受试者提供：(1)泼尼松龙，以约1 mg/kg/天的剂量在施用基因疗法载体之前或之后十二小时内开始并持续约10天；(2)西罗莫司，以西罗莫司的血液水平达到10 ng/ml– 15 ng/ml的剂量，持续时间为紧随施用基因疗法载体后六个月内；和(3)霉酚酸酯，以600 mg/m2 (最大为2)每天两次的剂量在施用基因疗法载体前14天开始并在施用基因疗法载体后保持两个月或八周。
在另一个特定实施方案中，本公开包括治疗MPSIIIA的方法，所述方法包含施用以下至需要其的受试者(例如诊断为患有MPSIIIA的人类)：
(1)包含含有表达盒和侧翼序列的病毒载体的组合物，所述表达盒和侧翼序列按5’至3’顺序包含以下，其中CAG启动子序列可操作地连接至编码SGSH的多核苷酸序列：
a.AAV2 ITR序列；
b.CAG启动子序列；
编码人类N-磺基葡糖胺磺基水解酶(SGSH)多肽或其活性变体的多核苷酸序列
c. 人类生长激素多聚A序列；和
d. AAV2 ITR序列，
其中所述组合物通过受试者头部的六个钻孔经脑内注射至受试者脑内的十二个位点而施用，
其中组合物通过各个钻孔或轨迹施用至一或两个位点。
在一些实施方案中，注射位点选自由右前侧浅表、右前侧深层、左前侧浅表、左前侧深层、右中侧浅表、右中侧深层、左中侧浅表、左中侧深层、右后侧浅表、右后侧深层、左后侧浅表和左后侧深层组成的组，
其中施用至所述受试者的组合物的总量为约5x1010 gc至约5x1013 gc、约1.0x1011gc至约1.0x1013 gc、约1.0x1010 gc至约1.0x1014 gc、约5.0x1010 gc至约5.0x1013 gc、约5.0x1010 gc至约1.0x1013 gc、约1.0x1011 gc至约1.0x1013 gc、约1.0x1011 gc至约5.0x1012gc或约5.0x1011 gc至约5.0x1012 gc，其中约5.0x109 gc至约5.0x1012 gc、约1.0x1010 gc至约1.0x1012 gc、约0.8x109 gc至约0.8x1013 gc、约0.4x1010 gc至约0.4x1013 gc、约0.4x1010 gc至约0.8x1012 gc、约0.8x1010 gc至约0.8x1012 gc、约0.8x1010 gc至约0.4x1012 gc或约0.4x1011 gc至约0.4x1012 gc或约6x1010 gc或约1.0x1012gc或约1.2x1012gc或约1.4x1012gc的病毒载体被施用至十二个位点中的每一个，其中施用至十二个位点中每一个的组合物体积为约10 µl至约600 µl，其中施用载体的输注速率为约0.1 µl/min至约10 µl/min，约0.2µl/min至约8 µl/min，约0.3 µl/min至约6 µl/min，或约0.4 µl/min至约4.0 µl/min，约0.4 µl/min至约3.0 µl/min或约2.0 µl/min或约5.0µl/min；和
(2) 一种或多种免疫抑制剂，
其中所述一种或多种免疫抑制剂包含以下或由以下组成：泼尼松龙，以约1 mg/kg/天的剂量在施用基因疗法载体之前或之后十二个小时内开始并持续约10天；他克莫司，在施用基因疗法载体前14天以约0.2 mg/kg/天(例如分两次给药)的开始剂量开始，并在七天的治疗后进行调整，使目标为在施用基因疗法载体后在头三个月期间为10-15 ng/ml和从第四个月起且长达至少一年为7-10 ng/ml的残留剂量；和霉酚酸酯，以600 mg/m2 (最大为2)每天两次的剂量在施用基因疗法载体前14天开始并在施用基因疗法载体后保持两个月或八周。
技术人员将领会以上有关于一种或多种免疫抑制剂共施用的方法和优势可被调整用于通过使用载体的基因疗法治疗其他遗传疾病或障碍，所述载体施用突变或缺失的基因产物的发挥功能的拷贝。
因此，本公开进一步包含治疗需要其的受试者中由突变或缺失的基因引起的疾病或障碍的方法，所述方法包含：
(1) 施用包含表达盒的基因疗法载体至受试者，该表达盒包含编码由野生型或非突变形式的基因编码的多肽或其活性变体的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列可操作地连接至启动子序列；和
(2)提供一种或多种免疫抑制剂至受试者，其中至少一种免疫抑制剂紧随施用基因疗法载体后被提供至受试者，持续时间为至少两个月、至少三个月、至少四个月、至少五个月、至少六个月、至少七个月、至少八个月、至少十个月或至少十二个月。
在特定实施方案中，一种或多种免疫抑制剂包含钙依赖磷酸酶抑制剂(任选地为他克莫司)，或霉酚酸酯，和/或大环内酯(例如西罗莫司或雷帕霉素)。
在进一步相关的实施方案中，本公开包括治疗需要其的受试者中由突变基因引起的脑障碍的方法，其包含：施用包含表达盒的基因疗法载体至受试者，该表达盒包含编码由野生型或非突变形式的基因编码的多肽或其活性变体的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列可操作地连接至启动子序列；以及提供一种或多种免疫抑制剂至受试者，其中至少一种免疫抑制剂紧随施用基因疗法载体后被提供至受试者，持续时间为至少两个月。
在特定实施方案中，一种或多种免疫抑制剂包含本文所述的任意免疫抑制剂或免疫抑制剂的任意组合，包括在本文在免疫抑制剂与递送SGSH多肽的基因疗法载体组合施用的上下文中所述的任意给药方案。在一个实施方案中，一种或多种免疫抑制剂包含钙依赖磷酸酶抑制剂(任选地为他克莫司)和霉酚酸酯。在另一个实施方案中，一种或多种免疫抑制剂包含大环内酯(任选地为西罗莫司)和霉酚酸酯。在特定实施方案中，紧随施用基因疗法载体后将钙依赖磷酸酶抑制剂或大环内酯提供至受试者，持续时间为至少三个月、至少六个月或至少十二个月。
在其中钙依赖磷酸酶抑制剂为他克莫司的某些实施方案中，在紧随施用基因疗法载体后他克莫司以0.05 mg/kg/天 – 1.0 mg/kg/天或约0.2 mg/kg/天的剂量提供至受试者，持续至少两个月或至少三个月。在其中钙依赖磷酸酶抑制剂为他克莫司的某些实施方案中，紧随施用基因疗法载体后他克莫司以他克莫司的血液浓度达到10 ng/ml – 15 ng/ml的剂量提供至受试者，持续时间为三个月的期间。在其中钙依赖磷酸酶抑制剂为他克莫司的某些实施方案中，紧随施用基因疗法载体后他克莫司以他克莫司的血液浓度达到7ng/ml – 10 ng/ml的剂量提供至受试者，持续时间为第四个月至第十二个月的期间。
在其中大环内酯为西罗莫司的某些实施方案中，在紧随施用基因疗法载体后西罗莫司以3 mg/kg/天或约1.5 mg/kg/每天两次的剂量提供至受试者，持续至少两个月或至少三个月。在其中大环内酯为西罗莫司的特定实施方案中，紧随施用基因疗法载体后西罗莫司以西罗莫司的血液水平达到10 ng/ml – 25 ng/ml的剂量提供至受试者，持续时间为三个月内。在其中大环内酯为西罗莫司的某些实施方案中，紧随施用基因疗法载体后西罗莫司以西罗莫司的血液水平达到20 ng/ml的剂量提供至受试者，持续时间为第二个月至第六个月的期间。在其中大环内酯为西罗莫司的进一步特定实施方案中，紧随施用基因疗法载体后西罗莫司以西罗莫司的血液水平达到10 ng/ml– 15 ng/ml的剂量提供至受试者，持续时间为六个月内。
在其中一种或多种免疫抑制剂包含霉酚酸酯的某些实施方案中，在紧随施用基因疗法载体后霉酚酸酯被提供至受试者，持续长达两个月或约两个月。在特定实施方案中，霉酚酸酯以200 mg/m2/天 – 1200 mg/m2/天或约600 mg/m2/天的剂量提供至受试者。
在特定实施方案中，该方法进一步包含紧随施用基因疗法载体后提供泼尼松龙至受试者，持续时间为三至十天之间、约五天、约六天或约七天。
另外，上文所述关于治疗MPSIIIA的方法的任意具体特征可存在于更通常与任意基因疗法载体的使用相关的方法中，所述特征包括但不限于特定的免疫抑制剂或其组合以及特定的剂量。
本公开的这些方法可用于使用基因疗法载体与一种或多种免疫抑制剂相结合而治疗任意遗传疾病或障碍，包括由一个或多个基因的缺陷(例如基因突变或缺失)引起的那些。大量障碍和疾病的遗传基础是已知的。在某些实施方案中，本公开的方法用于治疗溶酶体贮积疾病或障碍，包括上文所述的那些中的任意一种。可根据本公开的方法治疗的溶酶体贮积疾病和障碍包括但不限于：激活剂缺乏(Activator Deficiency)/GM2神经节苷脂贮积症；α-甘露糖苷贮积症(mannosidosis)；天冬氨酰葡糖胺尿症(Aspartylglucosaminuria)；胆固醇酯贮积症(Cholesteryl ester storage disease)；慢性己糖胺酶A缺乏(Hexosaminidase A Deficiency)；胱氨酸贮积症；达农病(Danondisease)；法布里病；法伯病(Farber disease)；岩藻糖苷贮积症(Fucosidosis)；半乳糖唾液酸贮积症(Galactosialidosis)；戈谢病(I型、II型、III型)；GM1神经节苷脂贮积症(婴儿型、晚期婴儿型/青少年型。成年/慢性)；I-细胞病(Cell disease)/黏脂质贮积症(Mucolipidosis)II；婴儿型游离唾液酸贮积症(Free Sialic Acid Storage Disease)/ISSD；青少年型己糖胺酶A缺乏；克雷比病(婴儿发作型、迟发型)；异染性脑白质营养不良；粘多糖贮积障碍(Mucopolysaccharidoses disorders)(假贺勒氏多营养不良(Pseudo-Hurler polydystrophy)/黏脂质贮积症IIIA；MPSI；MPSI施艾综合征；MPS I贺勒-施艾氏综合征；MPS II亨特综合征；山菲立普综合征A型/MPS III A；山菲立普综合征B型/MPS IIIB；山菲立普综合征C型/MPS III C；山菲立普综合征D型/MPS III D；莫奎欧A型/MPS IVA；莫奎欧B型/MPS IVB；MPS IX透明质酸酶缺乏(Hyaluronidase Deficiency)；MPS VI马洛托-拉米氏；MPS VII斯赖综合征(Sly Syndrome)；黏脂质贮积症I/唾液酸贮积症(Sialidosis)；黏脂质贮积症IIIC；黏脂质贮积症IV型)；多发性硫酸酯酶缺乏症；尼曼-匹克氏病(A型、B型、C型)；神经元蜡样质脂褐质沉积病(Neuronal Ceroid Lipofuscinoses)(CLN6病(非典型晚期婴儿型、迟发型变体、早期青少年型)、贝敦-施皮耳麦耶-沃格特(Batten-Spielmeyer-Vogt)/青少年型NCL/CLN3病、芬兰变体晚期婴儿型CLN5、詹-比二氏病(Jansky-Bielschowsky disease)/晚期婴儿型CLN2/TPP1病、库夫斯(Kufs)/成年发作型NCL/CLN4病、北方癫痫(Northern Epilepsy)/变体晚期婴儿型CLN8、桑-哈二氏(Santavuori-Haltia)/婴儿型CLN1/PPT病、β-甘露糖苷贮积症)；庞贝病/糖原贮积症(Glycogen storage disease) II型；致密性成骨不全症(Pycnodysostosis)；桑德霍夫病/成年发作/GM2神经节苷脂贮积症；桑德霍夫病/GM2神经节苷脂贮积症-婴儿型；桑德霍夫病/GM2神经节苷脂贮积症-青少年型；辛德勒病(Schindler disease)；萨拉病(Salladisease)/唾液酸贮积症；泰-萨氏/GM2神经节苷脂贮积症；和沃尔曼病(Wolman disease)。
在其他实施方案中，本公开包括以下的联合：
(1) 包含表达盒的基因疗法载体，该表达盒包含编码由野生型或非突变形式的基因编码的多肽或其活性变体的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列可操作地连接至启动子序列；和
(2) 一种或多种免疫抑制剂化合物，用作由突变基因引起的脑障碍的药剂。
在该联合的特定实施方案中，基因疗法载体和免疫抑制剂同时或相继施用。在某些实施方案中，基因疗法载体通过脑内注射施用。
在该联合的某些实施方案中，紧随施用基因疗法载体后至少一种免疫抑制剂化合物被提供至受试者，持续时间为至少两个月。
在该联合的某些实施方案中，一种或多种免疫抑制剂化合物选自包含钙依赖磷酸酶抑制剂、大环内酯和霉酚酸酯的组。在特定实施方案中，钙依赖磷酸酶抑制剂为他克莫司。在其他实施方案中，大环内酯为西罗莫司。在某些实施方案中，紧随施用基因疗法载体后至少一种免疫抑制剂化合物被提供至受试者，持续时间为至少三个月、至少六个月或至少十二个月。在特定实施方案中，此化合物为钙依赖磷酸酶抑制剂或大环内酯。
在其他实施方案中，一种或多种免疫抑制剂化合物也在施用基因疗法载体前被提供至受试者持续一段时间。
在示例性实施方案中，钙依赖磷酸酶抑制剂为他克莫司，其以0.05 mg/kg/天 –1.0 mg/kg/天或约0.2 mg/kg/天的剂量在紧随施用基因疗法载体后提供，持续至少两个月或至少三个月。在相关实施方案中，钙依赖磷酸酶抑制剂为他克莫司，其以他克莫司的血清水平达到10 ng/ml – 15 ng/ml的剂量在紧随施用基因疗法载体后提供至受试者，持续时间为三个月的期间。在进一步相关的实施方案中，钙依赖磷酸酶抑制剂为他克莫司，其以他克莫司的血清水平达到7 ng/ml – 10 ng/ml的剂量在紧随施用基因疗法载体后提供至受试者，持续时间为第四个月至第十二个月的期间。
在联合的特定实施方案中，一种或多种免疫抑制剂包含霉酚酸酯，其在紧随施用基因疗法载体后被提供至受试者，持续长达两个月或约两个月。在特定实施方案中，霉酚酸酯以200 mg/m2/天 – 1200 mg/m2/天的剂量提供。
在联合的其他实施方案中，该联合进一步包含泼尼松龙。
在联合的特定实施方案中，由突变基因引起的脑障碍为山菲立普A型综合征。
在联合的各种实施方案中，基因疗法载体为包含表达盒的复制缺陷的腺相关病毒(AAV)衍生载体，所述表达盒按以下5’至3’顺序包含：
启动子序列；
编码人类N-磺基葡糖胺磺基水解酶(SGSH)多肽或其活性变体的多核苷酸序列；
和
多腺苷酸化(多聚A)序列。
在特定实施方案中，启动子序列衍生自CAG启动子序列；和/或
多聚A序列衍生自人类生长激素多聚A序列。
在联合的某些实施方案中，表达盒按以下5’至3’顺序包含：
衍生自CAG启动子序列的启动子序列；
编码人类N-磺基葡糖胺磺基水解酶(SGSH)多肽或其活性变体的多核苷酸序列；和
衍生自人类生长激素多聚A序列的多聚A序列。
在这些联合的任意一种的特定实施方案中，表达盒的侧翼为两个AAV2内部末端重复(ITR)序列，其中两个AAV2 ITR序列的其中一个位于表达盒的5’且两个AAV2 ITR序列的其中一个位于表达盒的3’。在这些联合的任意一种的特定实施方案中，载体进一步涵括AAVrh.10 衣壳、衣壳蛋白或血清型。
在有关施用基因疗法载体(包括本文具体描述的那些载体的任意一种)和一种或多种免疫抑制剂两者的某些实施方案中，基因疗法载体以本文所述的任意剂量施用。
本公开的基因疗法载体和组合物可通过本领域中已知的任意适合的递送系统递送至受试者的脑。在某些实施方案中，其可为允许临床医生通过针头组件以精确精度递送病毒载体至脑中各个深度的靶位点(例如通过脑内注射)的任意递送系统。在某些实施方案中，递送系统被设计为能够到达脑组织内一个或多个预先确定的深度，这些深度可例如通过改变针头组件连接至其的头架弧的位置而精确和持续地进行调整，例如如同[55]中所描述的。
在某些实施方案中，本公开的方法使用如在Souweidane等人“Gene therapy forlate infantile neuronal ceroid lipofuscinosis: neurosurgical considerations”,J Neurosurg Pediatr. 2010年8月; 6 (2):115-22中所描述的递送设备和步骤实施，所述文献的完整内容特此通过引用并入。如其中所述，基因疗法载体输入至大脑的12个不同位置内(2个深度/钻孔，75分钟/输注和2µl/分钟)。使用六个进入位点，每个位点具有2个注射深度。第一注射或施用可经递送系统的六个导管在6个选择的位置同时实施，从而在该第一组的6个脑位置递送本公开的组合物。然后可移动6个导管的每一个，从而六个插管的近端分别到达其他6个选择的位置。然后，第二注射或施用可经递送系统六个导管在6个选择的位置同时实施，从而在该第二组的6个另外的脑位置递送本公开的组合物。
如在Souweidane等人中描述的，在特定实施方案中，在全麻下对受试者实施术前成像和靶标规划，且实施受试者脑的术前MR成像用于立体定向规划。进入位点可在BrainLAB工作站(BrainLAB USA)上选择，且在每个大脑半球上选择3个进入位点。孔可置于如下位置：在额极、额中部区域和顶枕区域每处各1个。实施无框架导航和进入位点定位。可使用最少5个基准标记将患者配准至术前MR图像。将预先规划的进入位点标记在头皮上，并在各个进入位点施用局部麻醉。实施导管和基因疗法载体输注。使用20号脊椎针作为刚性导向器，用于插入柔性熔融石英聚酰亚胺涂层导管(内径150µm和外径362µm (polymicrotechnology))。各导管均连接至单独的注射器，且导管被插入直至其尖端与针尖齐平。在更深层的插入前，将导管在针的顶部标记为导管和脑之间的接合点。将脊椎针附于头架的柔性牵引器臂上，且将其定向以匹配预先确定的立体定向轨迹。在打开皮肤前，牵引器臂和针都被设置到规划的方向。然后将针插入至刚好在软膜表面之下，且将牵引器臂用刚性固定进行固定。通过运行输注系统将死空间冲洗出来。取出导引针，且将导管推进至初始目标深度，其通常为距皮层表面2cm，在1.7–2.5cm的范围内。在离初始零标记的会将尖端置于距皮层表面所期望的深度的距离用Steri-strip折叠各导管。插管五分钟后，基因疗法载体以2µl/分钟通过微量灌注泵并行注射至6个位点的每一个。完成后五分钟，将导管收回1 cm，并类似于第一注射那样实施第二注射。在完成第二输注后，取出导管。
在另一个实施方案中，递送系统可根据US 2011/0060285的教导，所述专利的完整内容特此通过引用并入。
在一些实施方案中，本公开的基因疗法载体和组合物可通过插管递送至受试者的脑。例如，在一些实施方案中，基因疗法载体和组合物经MRI Interventions SMARTFLOW®插管递送。使用流量控制插管提供在控制的流速下精确、急速的输注。在一些实施方案中，该递送方法包含使用带导管的插管。
实施例
实施例1
产生AAVrh.10-hMPS3A (SAF-301)基因疗法载体
临床级SAF-301基因疗法载体通过转染两种质粒进入合格的293T人类胚肾细胞系中在GMP控制下产生。编码治疗基因的DNA由一种质粒(pAAV-PGK-hMPS3A)提供，且衣壳蛋白(来自AAVrh.10)、复制基因(来自AAV2)和辅助功能(来自腺病毒血清型5)均由第二质粒反式提供。
pAAV-PGK-hMPS3A质粒构建如下。市售pAAV2-lacZ (7270 bp)获得自Stratagene(La Jolla, CA USA)。通过亚克隆市售卡那霉素抗性转座子，将pAAV2-lacZ质粒中的氨苄青霉素抗性基因删除并替换为卡那霉素抗性基因(KanR, 1119 bp)，产生pAAV2-lacZ(KanR)。从由Alliance Sanfilippo提供的pAAV-SGSH-IRES-SUMF1中将表达盒亚克隆到pAAV2-lacZ (KanR)的反向末端重复之间。所得质粒的图示在图2A中提供。
辅助质粒(pPAK-MArh.10)基于卡那霉素抗性复制子，且含有Ad血清型5的VA(Genbank M73260的核苷酸9,856至11,548)、E2A和E4 (nt 21,438 - 35,935)。AAV2 rep基因的表达由小鼠乳瘤病毒(MMTV)启动子(GenBank AF228552，核苷酸583至1325)驱动，而AAVrh.10 cap基因的表达由AAV2内源的p40启动子驱动。此质粒的图示在图2B中提供。
在培养转染细胞后，病毒载体通过冻融循环从细胞中释放，通过碘克沙醇分级梯度然后是在Hi-Trap QHP柱的离子交换色谱进行纯化。使用通过旋转柱的浓缩，将所得AAVrh.10-hMPS3A载体转移至临床制剂中。将纯化的载体冷冻储存(在-60℃或低于-60℃)于磷酸盐缓冲盐水中。
最终配制的载体的完整表征通过以下而实现：对衣壳蛋白的SDS-PAGE和Western印迹，对转基因DNA的实时PCR，对功能基因转移的Western分析、体内和体外一般和特定外来病毒以及酶促测定。提供批次放行标准以确保一致性、纯度和功能。
实施例2
小鼠中SAF-301的体内功效
用SAF-301实施了体内研究，以证实转基因在脑中的表达。该研究设计允许评估在注射SAF-301后该基因的表达持续时间和持续性，且被总结于表3并在下文中进一步被描述。
表3：功效研究总结
Figure 87979DEST_PATH_IMAGE001
Figure 660911DEST_PATH_IMAGE002
体内功效研究
五周大的雄性和雌性MPSIIIA小鼠或未感染的同窝小鼠接受SAF-301或编码GFP的对照AAV载体。各组(n=25)接受7.5X109的载体基因组拷贝，共5µl。该剂量分布于纹状体内两个注射位点[29]。动物在12、23和30周龄时被处死。
转染和产生所期望酶的功效通过评估进入脑切片的SGSH的数量和测量SGSH的活性进行评价。
注射SAF-301的功能活性通过分析以下疾病参数进行评估：
(1) 脑/脊髓中HS衍生寡糖的相对水平使用串联质谱进行确定；和
(2) 盲法定量免疫组织学评价确定了疗法在固定的MPSIIIA/未感染的脑组织中对已证实的疾病标志物(LIMP-II、GFAP、同工凝集素B4、泛素、GM3神经节苷脂、未酯化胆固醇)的效果。
递送SAF-301至5周龄MPS IIIA小鼠的左侧纹状体导致在此脑区域产生非常大量(正常的65倍)的(活性) SGSH。尽管在已注射半球的尾部区域和在对侧半球(特别是在离注射位点较近的R2)也检测到SGSH蛋白(和活性)，但其水平要低得多，且随着与注射区域的距离增加而降低。在此研究中并未在小鼠中检测到对SGSH的体液免疫反应。
到23周龄时，用AAVrh.10-hMPS3A的治疗介导了初级贮积物质(HS衍生寡糖)和次级贮积产物(GM3和未酯化胆固醇)二者大幅但区域性的减少。脑切片L2含有纹状体(注射区域)和上覆(吻部)皮层两者，此外还有我们检查的其他脑区域，如杏仁核和无名质。考虑到来自检查左侧半球切片2内含有的病理学标志物的结果，明显地，此脑区域接受了足够的SGSH以介导GlcNS-UA显著的(86%)减少以及GM3和胆固醇大大减少(或正常化)。进一步地，在此切片的结构(纹状体和吻部皮层)中也观察到LIMP-II的正常化，且在那些区域中小胶质细胞增生不存在/已正常化。泛素阳性染色大大减少，可能是因为防止了损伤形成。由于在脑左侧半球切片2区域的载体递送(AAV-GFP或者AAVrh.10-MPS3A)而导致的星形胶质细胞增生妨碍了在这些区域中检查治疗对此标志物的效果。在右侧半球的切片2，我们观察到GlcNS-UA 41%的减少以及GM3和胆固醇水平大幅降低，但这些并未正常化。类似地，LIMP-II的表达大大减少，小胶质细胞和星形胶质细胞增生以及泛素阳性染色也是如此，但并未达到正常化。
向尾部移动，AAVrh.10-MPS3A治疗导致了左侧半球和右侧半球切片4中GlcNS-UA分别减少50%和21%。此切片含有压后皮层、下丘和水管周灰质，以及其他未评价的区域。我们的数据揭示了在此更遥远的脑区域中该疗法稍微混合的效果，伴随在脑的左侧半球(而非右侧半球)观察到GM3和胆固醇两者都减少，然而在左侧或右侧半球的下丘中未观察到LIMP-II、小胶质细胞或星形胶质细胞增生的改善。
该数据表示此载体能够产生足够数量的SGSH以介导初级和次级贮积病理学高度显著的改善，此外还介导下游事件(如小胶质细胞增生)的改善。这在注射区域和邻近区域特别明显。然而如在SGSH免疫定量测定、SGSH活性测定和作为结果的初级底物测定(GlcNS-UA)中观察到的，由转导的脑细胞产生的SGSH似乎保持相对局限于注射区域，且当测试离注射位点更远的区域时，其对病理学的影响变得更不明显。显而易见，脑的一些区域接受的SGSH/SUMF1不足或没有接受到SGSH/SUMF1，并且因此显示出病理学标志物几乎没有或完全没有改善。这些区域包括据信对认知功能至关重要的位点，例如海马体的齿状回和压后皮层。缺乏向这些脑区域的双侧递送据信是未能在MPS IIIA小鼠中改善疾病临床参数的原因。
这些发现与Cearley和Wolfe [10]的发现一致，他们报道了经两个注射轨迹(一个包含吻部皮层和纹状体而另一个穿过海马体至丘脑)将AAVrh.10载体单侧注射至正常小鼠脑内后区域性的酶表达。在那个研究中使用的载体表达β–葡糖醛酸糖苷酶，且在连续脑切片中酶的染色说明了尽管在注射半球内可检测到显著量的β–葡糖醛酸糖苷酶，然而酶向对侧的“扩散”远没有那么令人印象深刻，例如在注射侧~55%的大脑皮层被染色，但在未注射半球只有9%被染色。接受β–葡糖醛酸糖苷酶的量最大的对侧脑区域为丘脑(35%的区域被染色，相较于在注射侧83%被染色)。
然而，我们的观察与由Cressant等人[29]作出的观察形成鲜明对比，他们单侧施用AAV5载体至纹状体内，且也描述了有限的载体基因组检测，但报道了MPS IIIB小鼠“整个脑中”的神经病理学的随后修正和行为改善。实验结果不一致的原因未知，但可能与所使用的载体血清型(AAVrh.10相对于AAV5)有关，尽管如果考虑到Sondhi等人[11]的发现的话这是不太可能的。此小组测试了在递送各种不同AAV血清型至大鼠纹状体后，三肽基肽酶I(TPP-I)蛋白的分布程度。相较于AAV2、AAV5和AAV8，AAVrh.10导致了优越的TPP1分布。为了实现在晚期婴儿型神经元蜡样质脂褐质沉积病模型中TPP1的广泛分布，Sondhi等人随后在患病的小鼠的每个半球进行四次注射。在整个小鼠脑中为正常水平1-27倍的TPP-I表达允许了LINCL模型中神经病理学的减少和临床的疾病参数的改善(但并非正常化)。
总而言之，MPS IIIA小鼠研究的结果显示，AAVrh.10血清型载体使得转导的MPSIIIA脑细胞(据推断为神经元；[10, 11])能够产生和分泌大量活性SGSH，这反过来介导原发性、继发性和其他神经病理学高度显著的减少。在脑的一些区域检测到大量的SGSH，且似乎与它们和注射位点接近程度直接相关。
实施例3
使用LYS-SAF301的人类临床研究
人类临床试验作为I/II期开放标签、单臂、单中心的安全评价研究而实施，所述研究也提供功效的信息。简而言之，SAF-301基因疗法载体(AAVrh.10-hMPS3A，编码人类SGSH和人类SUMF1基因产物的AAV载体)在单次神经外科手术中通过图像引导的六个轨迹被递送至双侧脑，其中每个轨迹两个沉积物。患者在诊断和早期神经系统症状发作后的早期但在严重表现之前接受注射。临床试验的更详细的描述在下文中提供。
基因疗法载体
SAF-301基因疗法载体如实施例1中所述进行制备。试验药剂所有生产、配制和包装均符合适用的现行良好生产规范，并达到用于人类的适用标准。试验产物在使用前储存于-80℃。
每名患者在12次施用中接受7.2x1011 gc，每次总计60 µl (0.6x1011 gc)。建议临床剂量的依据部分基于对具有其他病理学类型的患者所实施的临床试验，其中已施用了总剂量范围在5.0x109至3.2x1012 vg的AAV载体而无毒性报告，以及基于本文所述的动物研究，其确认了0.6x1011 vg/沉积物为安全的。所使用的体积在50和150 µl之间，且载体浓度在0.5和1.5x109 vg/µl之间。使用AAV注射至脑实质内的三项人类基因疗法试验在参考文献[32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40]中描述。
患者标准
对四名患者进行治疗。
患者的主要纳入标准包括：
(1) 年龄介于18个月和六岁结束之间；
(2) MPSIIIA临床症状的发作在生命前五年内；
(3) 外周血细胞和/或培养的成纤维细胞提取物中SGSH活性少于对照的10%；
(4) 家属对程序和知情同意的理解；和
(5) 重要的实验参数在正常范围内。
患者的排除标准包括：
(1)基于排除性MRI对皮质-硬脑膜距离大于1 cm的判断而存在脑萎缩；
(2) 无法独立行走(无需帮助而行走的能力)；
(3) 会永久禁止麻醉的任意病症；
(4) 与MPSIIIA无关的任意其他永久性病症；
(5) 试验药物施用前1个月任意的疫苗接种；
(6) 一个月内服用阿司匹林；
(7) 载体注射前6个月期间给予的以改变MPSIIIA自然病程为目的的任意药物治疗；和
(8) 会禁止用Prograf®、Cellcept®和Solupred®治疗的任意病症。
施用方案
在单次神经外科手术中，载体通过图像引导的六个轨迹，一个深层的和一个浅表的，通过直接脑内注射至双侧脑而进行递送。所有注射均在单次手术期间实施。临床前研究和已发表文献显示，在单次手术中递送AAV载体足够在所有保留的位点进行有效基因转移。该12个位点如下：
表4.载体递送位点
右前侧浅表 右前侧深层 左前侧浅表 左前侧深层
右中侧浅表 右中侧深层 左中侧浅表 左中侧深层
右后侧浅表 右后侧深层 左后侧浅表 左后侧深层
联合免疫疗法
该治疗包括上文所述的基因疗法和以下免疫抑制治疗的联合。
除了所注射的载体外，在试验期间使用的药物治疗包括：
(1) 他克莫司(Prograf®)在手术前14天开始，并在整个研究过程中保持。开始剂量为0.2mg/kg/天(分2次给药)，并在治疗后7天进行调整，使目标为在头三个月期间为10至15 ng/ml和从第四个月起且长达至少1年为7至10ng/ml的残留剂量；
(2) 霉酚酸酯(Cellcept®)在手术前14天开始，并以600mg/m2 (最大为2g)每天两次，口服溶液1g/5ml保持两个月；和
(3) 从手术前一天起10天的期间，使免疫抑制治疗与泼尼松龙(Solupred®)联合。
在治疗后一周实施4小时的简短药物动力学研究(H0、H0.75和H4)，以确定给药的调整规则。
在手术当日，患者禁食。
免疫抑制治疗的使用基于在狗模型MPSIIIB和MPSI中的研究结果，其中显示了基因疗法必须与有效的免疫抑制剂治疗联合以防止对治疗性蛋白和载体病毒抗原的脑内和脑外免疫反应。
治疗后对患者进行监测。在施用SAF-301后一个月和三个月收集尿液样品并测量SAF-301基因组效价。通过对SAF-301载体转基因特异的DNA的qPCR定量而实施GMO检测。
在研究的初始部分，总共四名患者接受了SAF-301。基于对临床试验方案中规定的安全参数的评估，该药物耐受良好，且没有发生严重不良反应或可疑的意想不到的严重不良反应。
总体来说，来自SAF-301临床研究的安全性经验并未确认任何在患山菲立普A型综合征的儿童患者中可归因于SAF-301的显著安全风险。缺乏显著的安全性发现和信号为可接受SAF-301的安全性情况用于治疗患山菲立普A型综合征的患者提供支持。
四名患者显示出在2至4天内完全消除了尿液中载体。
术后临床评价未显示任何原因不明和持续的发热、癫痫或意想不到的神经系统的症状。
未观察到不良反应。
前三名患者显示出以下：
- 过度活跃显著降低
- 睡眠模式显著改善
- 专注力和社交能力显著改善。
这些结果证实在人类受试者中治疗的有效性。
实施例4
LYS-SAF302基因疗法载体
LYS-SAF302为携带缺陷的AAV2基因组的AAVrh.10载体，所述基因组含有由融合至鸡β-肌动蛋白启动子/兔β珠蛋白内含子的巨细胞病毒增强子(CAG启动子)驱动的人类SGSH基因。简而言之，载体经贴壁人类胚肾(HEK293)细胞的三次瞬时转染而被制作。例如，将HEK293细胞用p-LYS-SAF-T5、pAAV-rh10和pHGTI进行共转染且将细胞进行培养以产生基因疗法载体。在细胞收获和裂解步骤后，rAAV的粗制病毒裂解物经历了几个纯化步骤，包括通过深度过滤的澄清化、使用AVB树脂的亲和色谱和切向流过滤。LYS-SAF302在磷酸盐缓冲盐水(PBS)缓冲液中稀释至目标载体浓度，并用0.2 µm过滤进行灭菌。
使用已证实的Taqman qPCR方法使用正向引物(CCA GCC CCT CCA CAA TGA)、反向引物(CAC TGG AGT GGC AAC TTC CA)和探针(CAT CCC TGT GAC CCC)测量LYS-SAF302的效价。
LYS-SAF2质粒上的启动子、hSGSH转基因、多聚A序列和侧翼序列的示意图提供如图3。特征和各个特征在SEQ ID NO: 9中的位置的表在下文表5中提供。图4A和4B提供侧翼序列和在LYS-SAF302颗粒中被衣壳化的DNA序列(SEQ ID NO: 9)。图4C-4D表示质粒p-LYS-SAF-T5的完整序列(SEQ ID NO: 14)，其含有包含hSGSH转基因的表达盒。图4E-4F表示含有衣壳rh10序列的质粒序列(pAAV2-rh10；SEQ ID NO: 15)。图4G-4K表示辅助质粒pHGTI(即具有腺病毒辅助功能的质粒)的序列(SEQ ID NO: 16)。
表5. LYS-SAF302组成部分表
特征 描述 在SEQ ID NO: 9中的位置 SEQ ID NO
L-ITR 来自AAV血清型2的左侧反向末端重复序列 1-130 10
启动子 CAG启动子，其携带CMV IE增强子、CB启动子、CBA外显子1、CBA内含子、兔β-内含子、兔β-珠蛋白外显子2 145-1865 12
感兴趣的基因 人类SGSH 1896-3404 13
多聚A 人类GH1多聚A 3417-3926 17
R-ITR 来自AAV血清型2的右侧反向末端重复序列 3935-4075 11
表达盒按顺序包含CMV早期增强子/鸡β肌动蛋白(CAG)启动子、人类N-磺基葡糖胺磺基水解酶cDNA (hSGSH)和人类生长激素1多聚A单元(hGH1多聚A)。含有145个核苷酸的第一AAV2反向重复(ITR)和含有145个核苷酸的第二AAV2 ITR任一侧侧接表达盒。这两个ITR末端为基因组复制和包装所需的仅有的顺式作用元件。hGH1多聚A单元参与向mRNA翻译的mRNA稳定性和出核。值得注意的是，不像SAF301，SAF302不包括SUMF 1基因或IRES序列。相对于SAF301，SAF302还具有不同的启动子(CAG启动子)。相较于第一代SAF301载体，SAF302显示更高的酶表达。
LYS-SAF302 DNA由4.07 kb组成，序列分子量为1257.4 kDa。SGSH序列由1.53kb组成，且SGSH DNA序列的分子量为471.3 kDa。
实施例5
LYS-SAF301和LYS-SAF302的可比性研究
用LYS-SAF302和LYS-SAF301实施研究以证实和比较转基因在脑中的表达和产生以及功能活性的实现。在8-14周龄时，MPS IIIA小鼠(每组6只)以4E+09 vg/动物的剂量接受双侧脑内注射载剂(PBS)、LYS-SAF301或LYS-SAF302至尾状壳核/纹状体内。
结果显示，相较于LYS-SAF301，LYS-SAF302提供优越的表达。注射后四周，LYS-SAF302导致了已注射小鼠的脑中SGSH酶的增加，其为注射LYS-SAF301的小鼠的2.7倍高(图5)。使用LYS-SAF301观察到总体硫酸乙酰肝素(HS)轻微减少。相对地，在LYS-SAF302治疗后，LYS-SAF302导致了MPS IIIA中HS水平显著下跌，注射后仅4周内从WT水平的9.2倍下跌到4.7倍(图6)。因此，相较于LYS-SAF301，LYS-SAF302导致酶表达显著更高和HS水平显著下跌。
还实施了研究以评价LYS-SAF302的免疫原性以及将其免疫原性与LYS-SAF301的免疫原性进行比较。结果在图7A-7E中提供，并显示在LYS-SAF301和LYS-SAF302治疗的小鼠中观察到趋化因子和细胞因子显著减少。相较于WT，在未治疗的MPS IIIA小鼠中MIP-1ɑ、MCP-1和IL-1ɑ蛋白(分别为图7A、7B和7C)显著上升。各个治疗组都存在MIP-1ɑ减少的趋势，然而相较于未治疗的小鼠，水平仅在LYS-SAF302治疗的小鼠中显著降低。所有治疗组均观察到MCP-1显著减少。所有治疗均降低IL-1ɑ水平，然而仅在用LYS-SAF302的治疗中观察到显著降低。未观察到RANTES和KC (图7D和7E)的显著差异。在皮层内注射后，没有一种载体引起了抗体反应。总之，该结果显示，通过施用LYS-SAF301或LYS-SAF302，减少炎性细胞因子，但LYS-SAF302在某些细胞因子上显示出更显著的减少。
综上，将LYS-SAF301与LYS-SAF302相比较的药效动力学研究证实了相较于第一代产品LYS-SAF301，第二代产品LYS-SAF302显示出更高的酶表达和致病底物和炎性标志物更好的减少，二者间具有相当的免疫原性情况。
实施例6
LYS-SAF302的药理学
开发了基于半定量western印迹和酶促测定的表达/效力(功能)双重测定，以评价LYS-SAF302载体的体外表达和效力。首先将HeLa细胞(以12孔板形式接种)用rAAV2/rh10载体LYS-SAF302以50,000、100,000和500,000 MOI (感染复数)进行转导。用于细胞感染的载体的量基于以下公式进行计算；
以µL为单位的载体体积(V) =
(MOI x每孔细胞数x 1000) /
(以vg/mL为单位的载体效价)
转导后约72小时，从培养板中收集Hela细胞并离心。将细胞团块用裂解缓冲液处理，并实施冻融循环以从细胞中提取蛋白。将细胞悬浮液离心并将上清液转移至新管。
然后将这些样品转移至-80℃并随后将其用于通过Western印迹测定检测SGSH表达和通过效力测定确定酶促活性。在Western印迹分析前，细胞裂解物的总蛋白含量通过BCA测定(二喹啉甲酸测定)确定，因为此总蛋白定量被用于将规定量的蛋白上样于电泳凝胶(SDS-Page)上。使用已知量的hSGSH的标准曲线也被包括在内，以允许蛋白表达的定量。在允许蛋白根据其分子量进行分离的电泳迁移后，它们被转移至硝酸纤维素膜上。然后使用抗肌动蛋白和抗SGSH抗体以及荧光染料偶联的二抗来揭示感兴趣的蛋白。hSGSH蛋白的表达通过在大约57 kDa的分子量处的荧光信号进行测量，并通过在大约42 kDa处观察到的肌动蛋白的荧光信号进行归一化。表达的结果以μg表示。
效力通过由Karpova等人(1996)开发的酶促测定进行确定。简而言之，SGSH裂解2-磺氨基-2-脱氧-D-吡喃葡萄糖基残基的N-硫酸酯以产生4MU-αGlcNH2。然后，由于在葡糖胺残基上的α-氨基葡糖苷酶活性，4MU部分通过用α-糖苷酶消化而被释放。效力的结果以nmol/h/mg表示。
两项测定的结果在图8和9中提供。在阴性对照和感染的细胞之间观察到增加。另外，随着MOI增加，观察到表达和轻微的效力增加。
实施例7
使用LYS-SAF302的动物研究
LYS-SAF302的功效、剂量范围和毒理学研究在MPS IIIA小鼠、狗和非人类灵长动物(NHP)中实施。
小鼠研究
在5周龄MPS IIIA小鼠中实施LYS-SAF302的功效/毒理学和剂量范围研究。在5周龄时，MPS IIIA小鼠(每组每性别5只)接受双侧脑内注射载剂(PBS)或三种不同剂量(8.6E+08、4.1E+10和9.0E+10 vg/动物)之一的LYS-SAF302至尾状壳核/纹状体和丘脑的每一个中。小鼠通过经聚乙烯管连接至汉密尔顿注射器的27G针以0.2 μl/min的速率接受总计8 μL的LYS-SAF302或载剂(每位点2 µl)。双侧靶位点(关于前囟点)为：试图包括白纤维束的纹状体的后侧方位- A 0.75 mm、L 1.5 mm、V 3 mm，和丘脑- P 2 mm、L 1.5 mm、V 3 mm。在手术期间，小鼠接受用于止痛的0.05 mg/kg的丁丙诺啡(buprenorphine)和用于补液的4%葡萄糖的生理盐水。注射位点和5个半冠状切片的定位在图10中显示。
在15周龄时，所有小鼠均经历旷场(行为上的)试验。在17周龄时(手术后12周)将预先确定的小鼠队列安乐死，且实施完整的尸检分析。剩余的小鼠在28周龄时经历旷场试验，并在30周龄时(手术后25周)被安乐死。在三个脑切片中评价SGSH活性和HS积累：位于脑最前部的切片1；位于注射位点附近的切片3；和含有小脑的切片5。
脑匀浆中的SGSH活性使用荧光底物4-甲基伞形酮基-β-D-N-氨基葡糖苷(4MU-αGlcNS)进行测量。将结果与4MU标准曲线进行比较，表示为pmol/min/mg总蛋白。
在施用LYS-SAF302后12周的时间段内，注意到SGSH活性的剂量依赖性增加(图11)和初级硫酸乙酰肝素(HS)积累的剂量依赖性减少(图12)，持续到30周龄(治疗后25周)。整体上，相较于脑的最前部(切片1)或含有小脑的切片(切片5)，在注射位点附近(切片3)观察到更高的治疗效果。
另外，如图13A-F所示，在施用LYS-SAF302后12周的时间段内，注意到GM2/GM3的次级积累、内体/溶酶体系统的膨胀、星形胶质细胞和小胶质细胞增生和轴突球状体的消除，持续到30周龄(治疗后25周)。神经节苷脂的次级积累已在几种MPS疾病(包括MPS IIIA 21)中被报道。在治疗后12周和25周，在脑切片1、3和5 (如图10中所提供)中测量GM2和GM3(在注射后25周切片3的数据呈现于图13A和13B)。所有载剂治疗的MPS IIIA小鼠在全部三个脑切片中GM2/3都显示了显著增加，在两个安乐死年龄的每一个中均可观察到该结果。在载剂治疗或LYS-SAF302治疗的队列中的任意一个中，性别对神经节苷脂水平似乎没有影响。在脑切片1和3 (图13A、13B)中，三种剂量中每一种剂量的LYS-SAF302都导致GM2和GM3神经节苷脂水平的正常化。在切片5中尽管神经节苷脂水平并未正常化，但治疗后GM2和GM3水平有所降低，在较高的两种剂量下尤其明显。
在治疗后12周和25周，在几个脑区域中评估了与MPS IIIA相关的特征性神经元形态异常，其由内体/溶酶体膨胀和球状病变组成。在17和30周采集组两者中，由溶酶体整合膜蛋白-2 (LIMP2)免疫组化反映的内体/溶酶体膨胀在所测试的绝大部分MPS IIIA载剂治疗的小鼠的脑区域中显著地增加(注射后25周时下丘的代表性数据呈现于图13C)。跨越脑的吻尾轴，观察到LIMP2染色的剂量依赖性减少，并保持至治疗后25周，特别是在用中剂量和高剂量LYS-SAF302治疗的小鼠中。
评估了泛素阳性的球状病变>5 μm的数目，相较于年龄匹配的未患病的载剂治疗小鼠，在载剂治疗的MPS IIIA小鼠的脑中，在两个采集时间中所有区域都显示泛素反应性损伤显著增加(注射后25周时下丘的代表性数据呈现于图13D)。在测试的所有脑区域(除了胼胝体)中，所有LYS-SAF302剂量都显著地减少了损伤的数目。
使用神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的免疫组化检测通过星形胶质细胞激活的存在，以及使用同工凝集素B4-反应性变形虫样小胶质细胞的组织化学染色通过已激活小胶质细胞的存在，来评估与MPS IIIA相关的神经炎症。相较于年龄匹配的未患病的载剂治疗小鼠，在载剂治疗的MPS IIIA小鼠的脑区域中，在两个时间点都观察到指示星形细胞激活的显著增加的GFAP表达，除了齿状回和小脑。注射后25周时下丘的代表性数据呈现于图13E。在17周龄时，治疗效果难以察觉，由于在尾核、丘脑和下丘中未记录到GFAP表达减少。进一步远离注射区域，在早期采集时间点时，在脑干和吻部皮层和下丘中存在GFAP染色的减少。到30周龄时，下丘的两个水平都显示GFAP显著减少，特别是在更高的两种剂量下(图13E)。然而在此时间点，相较于低剂量治疗的MPS IIIA小鼠，在中剂量和高剂量治疗的MPSIIIA小鼠的吻部皮层(中线)和尾核注射水平上观察到显著更多的GFAP。
相较于载剂治疗的未患病的小鼠的脑，在载剂治疗的MPS IIIA小鼠的脑中明显存在大量的激活的小胶质细胞。跨越脑的更吻端/中央方位，全部三种剂量基本上都导致小胶质细胞形态的正常化，这被解释为去活化。此结果保持至30周龄。注射后25周时齿状回的代表性数据呈现于图13F。在脑干和小脑中注意到剂量依赖性的结果，其中在任一时间点低剂量都不能使后者中的小胶质细胞去活化。
来自在15和28周龄的雌性小鼠的旷场数据显示，相较于未患病的载剂治疗的雌性小鼠，雌性载剂治疗的MPS IIIA小鼠显示出特征性的较低的旷场活动，尽管该数据未达到统计学显著，这可能是由于功效不足。观察到LYS-SAF302治疗的小鼠表现的改善，特别是接受中剂量和高剂量的那些队列。
在15和28周龄时，雄性载剂治疗的MPS IIIA小鼠在此试验中都未显示出特征性的较低的旷场活动。然而在15周龄时，雄性高剂量治疗的MPS IIIA小鼠比它们未患病的和MPSIIIA载剂治疗的配对物显著地更不活跃。到28周龄时，仅高剂量治疗的MPS IIIA雄性的饲养活动被证明相较于未患病的年龄匹配的雄性统计学显著地存在差异。雄性小鼠存在异常行为的原因是未知的。在组织病理学分析期间，未发现雄性和雌性之间的可以支持这些行为上差异的差异。
综上，来自小鼠研究的数据显示，在此实验的时间范围内(即施用后25周)，LYS-SAF302能够介导对MPS IIIA相关的脑病理学的剂量依赖的效果。在某些情况下，这被解释为减少事先存在的疾病损伤(HS积累、溶酶体膨胀和小胶质细胞增生，在给药的时候它们会以显著的水平存在)。在其他情况下，它也被解释为防止损伤形成(例如星形胶质细胞增生和轴突球状体形成)的发作，因为这些类型的损伤发展较慢，且在治疗开始的时候会已经以更低水平存在或仅在某些脑区域中存在。LYS-SAF302显著减少MPS IIIA小鼠脑中小胶质细胞增生的能力特别有价值，因为由激活的小胶质细胞介导的神经炎症被认为在MPS发病机制和疾病进展中起关键作用。LYS-SAF302引起小胶质细胞的神经炎性表型(其被认为导致和加重MPS IIIA的神经元损伤23)长期持续的逆转的能力可对其治疗潜力具有深远影响。
狗研究
实施了非GLP狗的生物分布研究，其中评估了各种注射参数。这些研究的目的是评估使用MRI Interventions SmartFlow插管的各种输注体积和速率对在成年和青少年的脑中的分布的影响。
在一项实施于成年比格犬的研究中，将LYS-SAF302以1.0E+12vg/mL和10μL/min的注射速度与MRI造影剂钆(2-5mmol)共同输注至白质中。使四只动物接受每个半球一次500μL的注射(总剂量1.0E+12vg/mL)，并使一只动物接受每个半球两次500μL的注射(总剂量2.0E+12vg/mL)。使用10 µL/min的输注流速实施注射。分析注射后拍摄的MRI图像以量化示踪剂的分布。所有动物存活至预定的尸检时间，没有体重变化，没有临床发现且不存在肉眼可见的测试物相关的发现。在注射后1周或4周，动物被人道地安乐死。将脑的右侧和左侧半球切成4mm厚的切片。将偶数厚片置于无菌皮氏培养皿中，且立即取出8mm活检穿孔(每只动物40个)并切成两半，一半用于qPCR而另一半用于SGSH酶分析(4周终点组)。
在手术后立即实施MRI且使用Osirix软件分析收集的图像以量化钆信号。图14A为狗脑的左侧视图，具有包括注射位点的冠状切面定位。然后将每个半球的钆信号的体积归一化至对应的注射体积，并表达为钆分布体积/注射体积的比率。图14B-C为注射前冠状切面的MRI图像，计划的注射位点用红点表示。图14D-E为注射后冠状切面的MRI图像，白质内可见钆信号。图14F为MRI图像的3D重建前视图，钆信号沿着白质吻尾轴在两个半球都可见。结果显示SmartFlow®插管实施良好，未检测到回流。发现施用500 μL每轨的测试物在吻部和尾部注射轨迹两者中都与泄露至侧脑室中相关。钆分布体积/注射体积的平均比率为3.1+/- 0.2 (表6)。
用对转基因特异的引物和探针通过TaqMan qPCR实施载体拷贝分析。每细胞0.1载体拷贝的阈值基于观察到这个(或更高的)水平总与SGSH活性增加相关而设定。LYS-SAF302注射后4周，在37% (+/-4)的所测试脑穿孔中发现了多于每细胞0.1的载体拷贝(表6)。
使用荧光底物4-甲基伞形酮基-β-D-N-氨基葡糖苷(4MU-αGlcNS)测量脑匀浆中的SGSH活性。将结果表达为内源活性的%，内源活性被确定为来自两个不同动物的载剂注射的两个半球的80个脑穿孔的平均值。在78% (+/-6)的所测试脑穿孔中发现了大于20%的SGSH活性增加(表6)。
表6：注射后4周狗脑中生物分布的数据。数据来自用LYS-SAF302注射的来自3只狗的6个半球，终点为注射后4周。
Figure DEST_PATH_IMAGE003
综上，该结果显示在10μL/min注射速度下MRI Intervention插管实施良好，未检测到回流。在每个半球一次注射的动物和每个半球两次注射的动物之间未发现重大差异。这反映了从两个注射位点扩散的重叠，以及由于大约75cm3的脑的白纤维束非常狭窄，使得潜在的部分注射体积泄露至侧脑室内。尽管由于狗脑中大约75 cm3的白纤维束非常狭窄，使得部分注射体积泄露至侧脑室内，但此研究显示以1.0E+12载体浓度进行每个半球三次500 μL的注射应当足够覆盖儿童的脑的大部分，具有至少20%的酶活性增加的治疗水平。
在12周大的狗中使用较低体积(至多300μL)以5μL/min的降低的注射速度实施另外的试点研究。使三(3)只动物接受每个半球一次LYS-SAF302或PBS的注射(200μL或300μL)，并使1只动物接受每个半球两次LYS-SAF302在右侧半球或PBS在左侧半球的注射(2x200μL) (总剂量为6E+11vg至1.8E+12vg)。钆分布体积/注射体积的平均比率为2.9 (+/-0.5)，在37% (+/-9)的所测试脑穿孔中发现了多于每细胞0.1的载体拷贝，并且在53% (+/-8)的所测试脑穿孔中发现了多于20%的SGSH活性增加。
非人类灵长动物(NHP)研究
非人类灵长动物(NHP)也是用于评估毒性的动物模型，且脑解剖结构比狗的解剖结构更接近人类。因此专门选择NHP用于GLP毒理学/生物分布/剂量范围研究，以提供人类中脑分布和毒理学结果的更好的预测。同时，在NHP中实施非GLP研究，以向神经外科医生提供该设备的实践经验，以及确定注射体积和总剂量的生物分布(相对于脑体积)。
这些研究的目的为获取在NHP中施用LYS-SAF302的安全性和生物分布数据，所述施用以与关键临床试验中所测试的相似的注射速率、总体积(与脑体积相关)和总剂量(与脑体积相关)，使用MRI Interventions SmartFlow插管，通过直接注射进入白纤维质内而进行。这些研究也向神经外科医生提供了使用临床手术背景利用这种新设备的实践经验。
三(3)只雄性食蟹猴(食蟹猕猴，Macaca fascicularis) (4.2至4.5岁)用LYS-SAF302 (n=2)或PBS (n=1)进行给药。LYS-SAF302以3E+12vg/mL与MR造影剂钆(0.125mmol/mL)共同输注。在每只动物中进行四次50μL的输注(每个半球2次)至白质内(总剂量为7.2E+11vg)。载体拷贝数以及溶酶体酶活性(SGSH)分布在注射后6周测量。
用对转基因特异的引物和探针使用Taqman qPCR实施载体拷贝分析。每细胞0.1载体拷贝的阈值如在狗研究中那样设置。施用LYS-SAF302后六周，在11% (+/-1)的所测试脑穿孔中发现了多于每细胞0.1的载体拷贝(表6)。
使用4MU-αGlcNS测量脑匀浆中的SGSH活性。将结果表达为内源活性的%，内源活性被确定为来自一只PBS注射的动物2个半球的85个穿孔的平均值。还实施了SGSH酶活性分析，且将结果表达为内源活性的%。注射后六周，在97% (+/-2)的所测试脑穿孔中发现了大于20%的SGSH活性增加(表6&图15)。
表6.注射后6周NHP脑中生物分布的数据。数据来自用LYS-SAF302注射的来自2个NHP的4个半球，终点为注射后6周。
Figure 971807DEST_PATH_IMAGE004
当归一化至注射的体积时，相较于狗的研究(注射500 µL或1 mL覆盖37%)，在NHP研究中载体扩散更广泛(注射100 µL覆盖11%的脑)，反映了由于NHP脑中更大的白纤维束和更低的注射体积，使得注射体积泄露至侧脑室内有所减少。尽管相较于狗，NHP中载体扩散的绝对水平更低，但SGSH活性在NHP整个脑中分布更广泛(在97%的脑中活性增加至少20%，相对于在狗中为78%)。在两个研究之间观察到的差异可由于可能的物种差异，或者可反映相较于在狗中4周的时间段，在6周的时间段后在NHP脑中更好的酶分泌和广泛的扩散。结果显示在5μL/min的注射速度下MRI Intervention插管实施良好，未检测到回流。虽然11%(±1)的所测试脑穿孔具有多于每细胞0.1的载体拷贝，但97% (±2)的所测试脑穿孔表现多于20%的SGSH活性增加，反映了在6周的时间段内在整个脑中酶的分泌和扩散。
总而言之，动物研究的结果证实了LYS-SAF302作为MPS IIIA的基因疗法的有希望的新候选物。在用第一代载体LYS-SAF301以7.2E+08 vg/g脑的剂量在患MPS IIIA的4名儿童中实施的1/2期试验中，注意到令人鼓舞的改善迹象。本公开提供其效力为第一代载体的约3倍的本文所述的第二代载体，以及10倍高的临床剂量(7.2E+09 vg/g脑)，并使用优化的递送技术。不希望受理论的束缚，本研究的结果显示相对低剂量的LYS-SAF302应当能够在MPS IIIA患者的整个脑中恢复至少20%的正常SGSH活性。在一些实施方案中，此酶活性恢复水平对疾病进展具有显著的正向影响。
实施例8
单一深度注射
为了调查与如在LYS-SAF301的临床研究中那样在两个深度递送相对，在单一深度使用更大注射体积是否可以提高分布，并评估LYS-SAF302载体的长期表达，产生了其中绿色荧光蛋白(GFP)取代了转基因的LYS-SAF302变体。该载体SAF302GFP除hSGSH基因被替换为GFP基因外与LYS-SAF302一致。在SAF302GFP注射后4个月，实施GFP分布研究以评价小鼠。
在8–14周龄时，MPSIIIA小鼠经双侧注射在单一纹状体内深度接受AAV-SAF302GFP立体定向注射，其中该载体以3 µL中6.1 x 109基因组颗粒的剂量施用，在双侧半球3 mm的单一深度、中线外侧2 mm处递送(图16A；n=5)。然后在大约6月龄时(注射后大约4个月)处死动物。为了比较，两个深度组的MPSIIIA小鼠在8-14周龄时接受AAV-SAF302GFP的立体定向注射，其中载体以4 µL中4.1 x 109基因组颗粒的剂量施用，在双侧半球的两种纹状体内深度(2和3 mm)、各自为中线外侧2 mm处经1 µL沉积物递送。两个深度组中的小鼠在手术后大约4周被处死。将冠状和矢状切面用NeuN、GFP和DAPI进行共标记以给出在整个脑中载体分布的全面概况。
脑切片的成像证实了，相较于在两个深度接受注射的动物，在单一深度接受注射的动物中载体的分布增强。图16B-24E显示了在单一深度组收集的数据。最大GFP表达存在于注射位点的区域，该表达的范围和强度随着距此区域的距离增加而减少。冠状切面2显示在整个纹状体中GFP阳性细胞从注射位点向外辐射。沿着纹状体和接触外囊白质束的皮层以及在胼胝体内也可见GFP阳性细胞。在冠状切面3中的表达相较于在两个深度研究中的小鼠要大得多，以及在海马体内GFP阳性细胞的扩散更为广泛，显示出载体扩散的增加。内囊染色也是明显的，以及在冠状切面4的内囊产生的大脑脚中载体扩散是明显的(图16B)。
海马体和纹状体的高倍放大图像(由显示于图16C的矢状切面中的虚线框表示)用GFP与神经元核标志物NeuN强烈的共定位确认了SAF302GFP载体的神经元特异性(分别为图16D和16E)，其中GFP沿着神经元突起延伸。
在两个深度和单一深度的动物两者中，GFP与星形细胞标志物GFAP的共染色表明在神经元旁边一部分星形细胞也被转导(图17A (两个深度)和17B (单一深度))。然而相较于神经元，靶向的星形细胞的比例减少。
纹状体内注射SAF302GFP后，在单一深度动物中小脑内没有细胞被转导，这类似于在两个深度研究臂中取得的结果。使用两种注射策略后，跨越前囟点的GFP表达被量化为相对于总脑区域的GFP阳性细胞的百分比(图17C–17E；n =每组5只动物)。在注射位点附近(前囟点+0.26)，相较于两个深度策略，单一注射策略导致整体GFP增加(图17D)。单次团注时，注射位点远端的细胞的转导增加也是明显的，而在远端位点从双重高度注射中几乎观察不到转导(图17C和17E)。
该研究的结果表明，意想不到地，尽管单一深度策略的施用体积减少，但在两个深度注射LYS-SAF302不如在单一深度注射有效。在两个深度注射中该载体更多地沿着注射轨迹分布，而不是从注射位点末端侧向扩散，这有利地出现在单一注射深度研究中。不希望受理论的束缚，这可反映针头抽出时载体的回流，而不是创造更大的侧向压力，这在单一深度递送病毒团块时可以实现。
实施例9
SAF-302的人类临床研究
实施了2/3期单臂开放标签多中心介入性研究以评价脑内施用LYS-SAF302至患有山菲立普A型综合征的受试者的安全性和功效。该研究包括3年的长期随访。将7.2E+12vg(6个注射位点(每个半球3个)，每次注射500µL)的单一剂量施用至受试者脑双侧的幕上区域。LYS-SAF302在单次神经外科手术中通过图像引导的6个幕上轨迹进行注射，以靶向邻近壳核的白质。
主要功效分析在治疗后24个月实施。在手术后一年实施中期分析以确认潜在的早期功效信号。预期的治疗效果为，基于他们的年龄和基线处的DQ，在所选择的具有可预测病程的研究群体中至少疾病的进展停止。通过比较所观察的(手术后)DQ的演变与预期的比率来评价功效，该演变由基线和24个月之间的比率(DQ24/DQ0)表达，并且通过应用回归系数计算预期的比率，该系数基于来自2项自然历史研究(Shapiro等人，2016年和来自SAF301的1/2期研究的临床完成患者)的符合本研究资格标准的12名患者的数据。它们将被用于计算在没有治疗的情况下在12和24个月时预期的认知结果。
对于2/3期临床研究，临床级SAF302基因疗法载体在GMP控制下产生。将成品配制于不含任何赋形剂或防腐剂的PBS缓冲液中。溶液澄清至稍带乳白色，并可含有白色至半透明的小颗粒。在对药物产品LYS-SAF302的强度或效力没有可检测的影响的情况下，在药物施用过程期间，经置于注射器和Smartflow插管之间的0.2微米内联过滤器减轻颗粒的存在。
PBS缓冲液的组成如下：
• 2.67mM KCl
• 1.47mM KH2PO4
• 137.9mM NaCl
• 8.06mM Na2HPO4
• pH 7.2-7.4
LYS-SAF302的产品主要包装由以下组成：
• 来自Ompi的即用型无菌3mL (2R)玻璃小瓶；
• 来自West Pharmaceuticals的随时可消毒的13mm FluroTec瓶塞(由Novasep蒸汽灭菌)；
• 来自West Pharmaceuticals的13mm即用型辐照翻盖。
小瓶中装入1.2mL的LYS-SAF302，目标载体浓度为2.4E+12vg/mL (放行规格：1.9E+12至3.2E+12 vg/mL)。
治疗的载体以大约7.2E+12vg/患者的剂量(以大约2.4E+12vg/mL的浓度)在6次预先确定(通过MRI)的同时的无框架立体定位脑注射(各500μL，即1.2E+12vg)中，在大约100分钟内(5µL/min)在基底神经节前侧、中部和后侧的白质内(每个半球3个注射位点)进行双侧递送。手术由受过训练的神经外科医生实施。
患者将同时接受免疫抑制方案(他克莫司、霉酚酸酯和短期的泼尼松龙)以避免转导细胞的消除。研究显示经本文提供的给药策略递送的LYS-SAF302导致了对与SGSH缺陷相关的疾病(如山菲立普A型综合征)临床上高度有效的治疗。
此说明书中提及的所有美国专利、美国专利申请公开、美国专利申请、国外专利、国外专利申请和非专利公开在与本说明不抵触的范围内通过引用以它们的整体并入本文。
从上述内容中将领会到，尽管本发明具体实施方案已在本文中为说明目的而进行描述，但是在不背离本发明精神和范围的情况下可作出各种修改。
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Claims (28)

1.包含表达盒的复制缺陷的腺相关病毒血清型rh.10 (AAVrh.10)衍生载体，所述表达盒按以下5’至3’顺序包含：
a. 启动子序列；
b. 编码人类N-磺基葡糖胺磺基水解酶多肽或其活性变体的多核苷酸序列；
和
c. 多腺苷酸化(多聚A)序列；
其中所述载体不包括编码人类硫酸酯酶修饰因子1或其任意活性变体的多核苷酸序列。
2.权利要求1的载体，其中
所述启动子序列衍生自CMV早期增强子/鸡β肌动蛋白(CAG)启动子序列。
3.权利要求1的载体，其中所述多聚A序列衍生自人类生长激素1序列。
4.权利要求1的载体，其中所述载体不包括内部核糖体进入位点(IRES)序列。
5.权利要求1至4中任意一项的载体，其中所述表达盒按以下5’至3’顺序由以下组成：
a. 衍生自CAG启动子序列的启动子序列；
b. 编码人类N-磺基葡糖胺磺基水解酶多肽或其活性变体的多核苷酸序列；和
c. 衍生自人类生长激素1多聚A序列的多聚A序列。
6.权利要求1-5中任意一项的载体，其中所述表达盒的侧翼为两个AAV2内部末端重复(ITR)序列，其中所述两个AAV2 ITR序列的其中一个位于所述表达盒的5’且所述两个AAV2ITR序列的其中一个位于所述表达盒的3’。
7.权利要求6的载体，其中位于所述表达盒5’末端的所述ITR序列包含根据SEQ ID NO:10的核苷酸序列且位于所述表达盒3’末端的所述ITR序列包含根据SEQ ID NO: 11的核苷酸序列。
8.权利要求2的载体，其中所述CAG启动子序列包含根据SEQ ID NO: 12的序列。
9.权利要求1-8中任意一项的载体，其中编码人类N-磺基葡糖胺磺基水解酶的多核苷酸序列包含根据SEQ ID NO: 13的序列。
10.权利要求1-9中任意一项的载体，其中所述多腺苷酸化(多聚A)序列包含根据SEQID NO: 17的序列。
11.权利要求1-10中任意一项的载体，其中所述载体进一步包含AAVrh.10衣壳或AAVrh.10衣壳蛋白。
12.权利要求1-11中任意一项的载体，按以下5’至3’顺序包含以下：
a. AAV2 ITR序列；
b. 衍生自CAG启动子序列的启动子序列；
c. 编码人类N-磺基葡糖胺磺基水解酶多肽或其活性变体的多核苷酸序列；
d. 衍生自人类生长激素1多聚A序列的多聚A序列；和
e. AAV ITR序列。
13.权利要求1-12中任意一项的载体，包含根据SEQ ID NO: 9的序列。
14.权利要求1-13中任意一项的载体，包含根据SEQ ID NO: 14的序列。
15.治疗山菲立普A型综合征的方法，包含施用权利要求1-14中任意一项的载体至需要其的受试者。
16.权利要求15的方法，其中所述载体经脑内注射施用至所述受试者。
17.权利要求15或16的方法，其中所述载体经脑内注射施用至所述受试者，其中每次注射以单一注射深度施用。
18.权利要求15-17中任意一项的方法，其中所述载体经每个半球2-4次注射施用至所述受试者。
19.权利要求18的方法，其中所述载体经每个半球3次注射施用至所述受试者。
20.权利要求15-19中任意一项的方法，其中每次注射以约500µL的体积施用。
21.权利要求15-20中任意一项的方法，其中施用至所述受试者的载体总剂量在约5 x1010至约5 x 1013 vg之间。
22.权利要求21的方法，其中施用至所述受试者的载体总剂量为约7.2 x 1012 vg。
23.权利要求15-22中任意一项的方法，其中所述方法进一步包含施用免疫抑制方案至所述受试者。
24.权利要求23的方法，其中所述免疫抑制方案包含他克莫司、霉酚酸酯和泼尼松。
25.根据权利要求1至14的用作治疗山菲立普A型综合征的药剂的载体。
26.根据权利要求25的用作治疗山菲立普A型综合征的药剂的载体，其中所述药剂进一步包含药学上可接受支持体、运载体、赋形剂或稀释剂。
27.根据权利要求25或权利要求26的用作治疗山菲立普A型综合征的药剂的载体，其中所述药剂为乳浊液或水溶液。
28.包含根据权利要求1至14中任意一项的载体和其使用说明的试剂盒。
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