JP2022551792A - サンフィリポ疾患およびその他の障害の処置のための組成物および方法 - Google Patents

サンフィリポ疾患およびその他の障害の処置のための組成物および方法 Download PDF

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Abstract

本開示は、遺伝子治療ベクターおよび遺伝子治療ベクターを必要とする対象にこのようなベクターを投与する方法を含む、遺伝性疾患、脳障害ならびに神経学的疾患および障害を処置するのに有用な新規ベクターおよび方法を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、遺伝子治療ベクターならびにリソソーム蓄積障害を含む遺伝性疾患、および脳疾患および障害の処置において、単独でまたは１もしくはそれを超える免疫抑制剤と組み合わせて、このような遺伝子治療ベクターを使用する方法に関する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年７月１８日に出願された米国仮出願第６２／８７５，８０９号の優先権の恩典を主張し、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
配列表
本出願に関連する配列表は、紙の写しの代わりにテキスト形式で提供され、参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名称はＬＹＳＯ－００３＿０１ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。テキストファイルは約８６ＫＢで、２０１９年７月１７日に作成され、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出されている。
背景
分野
いくつかの実施形態において、本発明は、遺伝子治療ベクターならびにリソソーム蓄積障害を含む遺伝性疾患、および脳疾患および障害の処置において、単独でまたは１もしくはそれを超える免疫抑制剤と組み合わせて、このような遺伝子治療ベクターを使用する方法に関する。
関連分野の説明
ムコ多糖症ＩＩＩ型（ＭＰＳＩＩＩ）は、サンフィリポ症候群とも呼ばれ、ムコ多糖症（ＭＰＳ）の群に属するまれなリソソーム蓄積症（ＬＳＤ）である。これらのリソソーム蓄積症（ＬＳＤ）は、消化タンパク質の欠損または機能不全によって引き起こされ、細胞中での基質のその後の蓄積をもたらし、極めて重度の細胞および器官の機能不全をもたらす。ムコ多糖またはグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）は、正常な細胞機能にとって本質的に重要な、絶えず再利用されている巨大分子である。ＭＰＳでは、ＧＡＧの段階的分解に関与するリソソーム酵素の１つの欠損がＧＡＧの蓄積をもたらし、重度の細胞機能不全をもたらす。ＭＰＳは、その遺伝的起源、生化学的および生理学的な異常ならびに臨床症状が異なる遺伝性疾患の複雑な群を形成する。変異した遺伝子に応じて、１または数個の型のＧＡＧの異化が遮断され、いくつかの酵素が複数のＧＡＧ種の分解経路に関与している。
ムコ多糖症ＩＩＩ型（ＭＰＳＩＩＩ）は、出生１０万人当たり０．７人～１．８人（フランスでは０．７３人、英国では１．７人）が罹患し、常染色体劣性遺伝子欠陥がヘパラン硫酸の部分的に分解されたオリゴ糖の蓄積をもたらす、まれなリソソーム蓄積症である。
サンフィリポＡ型症候群またはムコ多糖症ＩＩＩ型Ａ型（ＭＰＳＩＩＩＡ）は、Ｎ－スルホグリコサミンスルホヒドロラーゼ（ＳＧＳＨ）の常染色体劣性遺伝子欠陥によって引き起こされる。この酵素は組織中に遍在的に発現され、ヘパラン硫酸（ＨＳ）の段階的分解に関与している。この酵素の非存在下では、部分的に分解されたオリゴ糖が毒性レベルで蓄積する。
サンフィリポＡ型症候群は、小児が罹患する重度の衰弱性かつ生命を脅かすリソソーム蓄積症である。臨床症状は主に神経性であり、通常は生後５年の間に早期症候が観察され、認知能力の進行性低下をもたらす。罹患した小児は、小児期初期に特別なケアを必要とし、深刻な精神遅滞を徐々に発症するが、身体症状は最小限に留まる［１］。一部の患者は２０歳以降もなお生存するが、通常は１５歳より前に死亡する。現在、サンフィリポＡ型症候群の患者に対して利用可能な処置は存在しない。
ＭＰＳにおける治療アプローチの理論的根拠は、欠損した酵素の送達が遺伝的に欠損した細胞における表現型異常を元に戻すという観察に基づいている。ＭＰＳ酵素置換処置は、マンノース－６－リン酸（ｍａｎｎｏｓｅ－６－ｐｈｏｓｐｈａｓｅ）受容体への結合を介した、欠損細胞による細胞外酵素の内部移行に依存する。酵素補充療法（ＥＲＴ）が調査されているが、ＭＰＳＩＩＩＡに対しては現在利用できない。
ＭＰＳは、遺伝子治療の主要な候補疾患として認識されてきた。エクスビボまたはインサイチュでの遺伝子導入を使用して、遺伝子改変された細胞の群によって、欠損した酵素が産生され、生物に分配され得る。ＭＰＳの動物モデルにおける多数の研究は、骨髄、皮膚、筋肉、肝臓および脳を含む組織の遺伝子改変の効果を記載しており、治療活性を有する酵素の産生をもたらす。しかしながら、ベクターが末梢に投与されると、産生された酵素は血液脳関門を通過しない。循環中の極めて高用量の酵素のみが、脳内への検出可能な輸送をもたらし得る。遺伝子治療方法に対するこの欠点は、ＭＰＳに限定されず、他の脳疾患および障害を処置するための遺伝子治療の使用も制限する。
したがって、当該技術分野では、ＭＰＳならびに脳に影響を及ぼす他の疾患および障害の処置のための、脳内への直接投与を提供する遺伝子治療ベクターおよび方法が明らかに必要とされている。本発明は、改良された遺伝子治療ベクター、ならびに一般的に遺伝性疾患および神経学的および脳の疾患および障害、より具体的にはサンフィリポＡ型を含むＭＰＳの処置に適用可能な他の改良された方法を提供することによってこれらの要求に対処する。
簡単な概要
本開示は、遺伝子治療ベクターを含む、遺伝性疾患、脳障害、ならびに神経学的疾患および障害を処置する上で有用な新規ベクターおよび方法を提供する。
一実施形態において、本開示は、以下の５’から３’の順序で、プロモーター配列と、ヒトＮ－スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ（ＳＧＳＨ）ポリペプチドまたはその活性改変体をコードするポリヌクレオチド配列と、ポリアデニル化（ポリＡ）配列とを含む発現カセットを含む複製欠損アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）由来ベクターを含む。いくつかの実施形態において、ベクターは、ヒトスルファターゼ修飾因子１（ＳＵＭＦ１）ポリペプチドまたはその任意の活性改変体をコードするポリヌクレオチド配列を含まない。ある特定の実施形態において、プロモーター配列は、ヒトＮ－スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼポリペプチドまたはその活性改変体をコードするポリヌクレオチド配列に機能的に連結されている。いくつかの実施形態において、ヒトＮ－スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１３による配列を含む。
いくつかの実施形態において、プロモーター配列は、ＣＭＶ初期エンハンサー／ニワトリβアクチン（ＣＡＧ）プロモーターである。いくつかの実施形態において、ＣＡＧプロモーターは、配列番号１２による配列を含む。いくつかの実施形態において、ベクターはＩＲＥＳ配列を含まない。いくつかの実施形態において、ポリＡ配列は、ヒト成長ホルモン１ポリＡ配列に由来する。いくつかの実施形態において、ポリＡ配列は、配列番号１７による配列を含む。特定の実施形態において、ベクターは、ＡＡＶ血清型ｒｈ１０である。いくつかの実施形態において、ベクターは、配列番号９による配列を含む。いくつかの実施形態において、配列番号９は、ＬＹＳ－ＳＡＦ３０２粒子中にキャプシド化されたＤＮＡの配列を含む。
ベクターのある特定の実施形態において、発現カセットは、以下の５’から３’の順序で、ＣＡＧプロモーター配列由来のプロモーター配列と、ヒトＮ－スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ（ＳＧＳＨ）ポリペプチドまたはその活性改変体をコードするポリヌクレオチド配列と、ヒト成長ホルモンポリＡ配列由来のポリＡ配列とを含むまたはこれらからなる。ベクターの特定の実施形態において、発現カセットは２つのＡＡＶ２逆位末端反復（ＩＴＲ）配列に隣接し、２つのＡＡＶ２ ＩＴＲ配列の一方は発現カセットの５’に位置し、２つのＡＡＶ２ ＩＴＲ配列の一方は発現カセットの３’に位置する。いくつかの実施形態において、２つのＩＴＲ末端は、ゲノム複製およびパッケージングのために必要とされる唯一のシス作用性エレメントである。いくつかの実施形態において、各ＩＴＲは、約１００個、約１１０個、約１２０個、約１３０個、約１４０個、約１４５個、約１５０個または約１６０個のヌクレオチドを含有する。いくつかの実施形態において、発現カセットの５’末端に位置するＩＴＲ配列は、配列番号１０によるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、発現カセットの３’末端に位置するＩＴＲ配列は、配列番号１１によるヌクレオチド配列を含む。
特定の実施形態において、ベクターは、ＡＡＶｒｈ．１０キャプシドまたは血清型をさらに含む。
いくつかの実施形態において、ベクターのＤＮＡは４．０７ｋｂを含むまたは４．０７ｋｂからなり、配列分子量は１２５７．４ｋＤａである。いくつかの実施形態において、ＳＧＳＨ配列は１．３５ｋｂを含むまたは１．３５ｋｂからなり、ＳＧＳＨ ＤＮＡの分子量は４７１．３ｋＤａである。
関連する実施形態は、本明細書中に記載されている発現カセットのいずれか、および本明細書中に記載されている発現カセットを含むプラスミドを含む。さらなる関連する実施形態は、本明細書に記載されているプラスミドまたはベクターを含む宿主細胞を含む。特定の実施形態において、宿主細胞はエクスビボである。一実施形態において、宿主細胞は、２９３Ｔ細胞などの２９３細胞である。
別の実施形態において、本開示は、本開示によるベクターを作製するための方法または過程であって、本明細書に記載されている発現カセットを含むプラスミドを宿主細胞中に導入することであって、前記発現カセットは２つのＡＡＶ２内部末端反復（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）（ＩＴＲ）配列に隣接している、導入することと、前記宿主細胞を培養して本明細書に記載されているベクターを作製することと、を含む、方法または過程を含む。特定の実施形態において、発現カセットは、以下の５’から３’の順序で、プロモーター配列と、ヒトＮ－スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ（ＳＧＳＨ）ポリペプチドまたはその活性改変体をコードするポリヌクレオチド配列と、ポリアデニル化（ポリＡ）配列とを含むまたはこれらからなる。ある特定の実施形態において、前記方法または過程は、ヘルパープラスミドを前記宿主細胞中に導入することをさらに含む。特定の実施形態において、前記ヘルパープラスミドは、例えばＡＡＶｒｈ．１０由来のキャプシドタンパク質と、例えばＡＡＶ２由来の複製遺伝子と、例えばアデノウイルス血清型５に由来するヘルパー機能とをコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本開示は、３つのプラスミドの使用を含む、本開示によるベクターを作製するための方法または過程を含む。いくつかの実施形態において、第１のプラスミドは、以下の５’から３’の順序で、プロモーター配列と、ヒトＳＧＳＨポリペプチドまたはその活性改変体をコードするポリヌクレオチド配列と、ポリアデニル化配列とを含むまたはこれらからなる発現カセットを含む。いくつかの実施形態において、発現カセットは、２つのＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接している。いくつかの実施形態において、発現カセットと隣接配列は一緒に、配列番号９による配列を含むまたは配列番号９による配列からなる。いくつかの実施形態において、第１のプラスミドは、配列番号１４によるポリヌクレオチドを含むまたは配列番号１４によるポリヌクレオチドからなる。いくつかの実施形態において、第２のプラスミドは、キャプシドタンパク質、例えばＡＡＶｒｈ１０由来のキャプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のプラスミドは、配列番号１５によるポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、第３のプラスミドは、ヘルパー機能、例えば、アデノウイルスに由来するヘルパー機能を提供する。いくつかの実施形態において、第３のプラスミドは、配列番号１６によるポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、本明細書において提供される方法および過程は、第１、第２および第３のプラスミドを宿主細胞中に導入することを含む。例えば、いくつかの実施形態において、本明細書において提供される方法および過程は、配列番号１４、１５および１６による配列を含むプラスミドを宿主細胞中に導入することを含む。いくつかの実施形態において、宿主細胞中にプラスミドを導入し、宿主細胞を培養して、本明細書に記載されているベクターを作製する。いくつかの実施形態において、得られたベクターはＳＡＦ３０２と呼ばれる（本明細書ではＬＹＳ－ＳＡＦ３０２とも呼ばれる）。
さらなる関連する実施形態は、本明細書に記載されているベクターと薬学的に許容され得る担体とを含む組成物を含む。いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書で提供されるベクターと、賦形剤または防腐剤を含まないＰＢＳ緩衝剤とを含む製剤を提供する。いくつかの実施形態において、ＰＢＳ緩衝剤は、ＫＣｌ、ＫＨ２ＰＯ４、およびＮａＣｌ、Ｎａ２ＨＰＯ４を含む。さらなる実施形態において、ＰＢＳ緩衝剤は、約２．６７ｍＭ ＫＣｌ、約１．４７ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、約１３７．９ｍＭ ＮａＣｌおよび約８．０５ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４を含む。いくつかの実施形態において、製剤は、約６．８～約７．８、または約７．０～約７．６、または約７．２～約７．４のｐＨを有する。いくつかの実施形態において、製剤は、－８０℃±１０℃での貯蔵に適している。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される製剤は、対象への投与前に、０．２ミクロンインラインフィルタを通して濾過される。
本開示の別の関連する実施形態は、サンフィリポＡ型症候群を処置する方法であって、本明細書に記載されているベクターを含む組成物を、サンフィリポＡ型症候群を処置することを必要とする対象に投与することを含む、方法を含む。特定の実施形態において、ベクターは、以下の５’から３’の順序で、ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列と、ＣＡＧプロモーター配列と、ヒトＮ－スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ（ＳＧＳＨ）ポリペプチドまたはその活性改変体をコードするポリヌクレオチド配列と、ヒト成長ホルモンポリＡ配列とを含むまたはこれらからなる発現カセットを含み、前記ＣＡＧプロモーター配列は、ＳＧＳＨポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に機能的に連結されている。ある特定の実施形態において、発現カセットは、ＳＵＭＦ１ポリペプチドまたはその任意の活性改変体をコードするポリヌクレオチド配列を含まない。いくつかの実施形態において、発現カセットは、２つのＡＡＶ２内部末端反復（ＩＴＲ）配列に隣接している。
この方法の特定の実施形態において、組成物は、脳内注射を介して対象の脳内の１またはそれを超える部位に投与される。ある特定の実施形態において、組成物は、対象の脳内の２～２０個の部位、４～１６個の部位、８～１６個の部位、または６～１２個の部位に投与される。例えば、いくつかの実施形態において、組成物は、半球当たり２～４の注射、対象当たり合計４～８の注射によって対象の脳に投与される。一実施形態において、組成物は、対象の脳内の６つの部位に投与される。いくつかの実施形態において、組成物は、半球当たり３つの部位に投与される。ある特定の実施形態において、組成物は、対象の頭部中の１またはそれを超える穿頭孔、例えば対象の頭部中の６つの穿頭孔を通して注射によって投与され、組成物は各穿頭孔または穿頭路を通して単一の深さで投与される。各注射部位は、深部または表層であり得る。例えば、深部注射は、皮質表面から約１．５ｃｍ～約３．０ｃｍまたは約１．７ｃｍ～約２．５ｃｍまたは約２ｃｍの深さで行われ、表層注射は、皮質表面から約０．５ｃｍ～約２．０ｃｍまたは約０．７ｃｍ～約１．５ｃｍまたは約１ｃｍの深さで行われる。ある特定の実施形態において、部位は、右前側表層、右前側深部、左前側表層、左前側深部、右内側表層、右内側深部、左内側表層、左内側深部、右後側表層、右後側深部、左後側表層および左後側深部の１またはそれより多くから選択される。
ある特定の実施形態において、合計約１．０×１０１０ｇｃ～約１．０×１０１４ｇｃ、約５．０×１０１０ｇｃ～約５．０×１０１３ｇｃ、約５．０×１０１０ｇｃ～約１．０×１０１３ｇｃ、約１．０×１０１１ｇｃ～約１．０×１０１３ｇｃ、約１．０×１０１１ｇｃ～約５．０×１０１２ｇｃ、約５．０×１０１１ｇｃ～約５．０×１０１２ｇｃ、または約５×１０１０～約５×１０１３ｇｃ、または約７×１０１０～約７×１０１３ｇｃのウイルスベクターが対象に投与される。ある特定の実施形態において、合計約７．２×１０１２ｇｃのウイルスベクターが対象に投与される。ある特定の実施形態において、約０．８×１０９ｇｃ～約０．８×１０１３ｇｃ、約０．４×１０１０ｇｃ～約０．４×１０１３ｇｃ、約０．４×１０１０ｇｃ～約０．８×１０１２ｇｃ、約０．８×１０１０ｇｃ～約０．８×１０１２ｇｃ、約０．８×１０１０ｇｃ～約０．４×１０１２ｇｃ、または約０．４×１０１１ｇｃ～約０．４×１０１２ｇｃのウイルスベクターが対象の各部位に投与される。特定の実施形態において、約１．２×１０１２ｇｃのウイルスベクターが対象の各部位に投与される。特定の実施形態において、約７．２×１０１２ｇｃのウイルスベクターが対象に投与されるように、約１．２×１０１２ｇｃのウイルスベクターが対象の脳または白質内の６つの部位のそれぞれに投与される。ある特定の実施形態において、各部位に投与される遺伝子治療ベクターを含む組成物の体積は、約１０μｌ～約６００μｌである。いくつかの実施形態において、各部位に投与される遺伝子治療ベクターを含む組成物の体積は、約５００μｌである。特定の実施形態において、遺伝子治療ベクターを含む組成物の投与のための注入速度は、約０．１μｌ／分～約１０μｌ／分、約０．２μｌ／分～約８μｌ／分、約０．３μｌ／分～約６μｌ／分、または約０．４μｌ／分～約４．０μｌ／分、または約０．４μｌ／分～約３．０μｌ／分、または約５．０μｌ／分である。いくつかの実施形態において、方法は、免疫抑制レジメンを対象に投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、免疫抑制レジメンは、タクロリムス、ミコフェノール酸モフェチルおよびプレドニゾンを含む。
関連する実施形態において、本開示は、サンフィリポＡ型症候群の処置において医薬として使用するための本明細書に記載されているベクターを含む。特定の実施形態において、サンフィリポＡ型症候群の処置において医薬として使用するためのベクターは、５’から３’の順序で以下の発現カセットを含み、ＣＡＧプロモーター配列は、ＳＧＳＨをコードするポリヌクレオチド配列に機能的に連結されている：ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列；ＣＡＧプロモーター配列；ヒトＮ－スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ（ＳＧＳＨ）ポリペプチドまたはその活性改変体をコードするポリヌクレオチド配列；ヒト成長ホルモンポリＡ配列；およびＡＡＶ２ ＩＴＲ配列。医薬として使用するためのベクターは、本明細書で提供される方法による投与のためのものである。
サンフィリポＡ型症候群の処置において医薬として使用するためのベクターの特定の実施形態において、医薬は、薬学的に許容され得る支持体、担体、希釈剤または賦形剤をさらに含む。ある特定の実施形態において、医薬は、エマルジョンまたは水溶液である。ある特定の実施形態において、医薬は、賦形剤または防腐剤を含まない緩衝剤を含む。さらなる実施形態において、緩衝剤はＰＢＳ緩衝剤である。
関連する実施形態において、本開示は、本開示のベクターを作製するための過程であって、本開示の発現カセットを含むプラスミドを宿主細胞中に導入することと、前記宿主細胞を培養して、前記ベクターを作製することと、を含む、過程を含む。特定の実施形態において、プラスミドは、発現カセットに隣接するＡＡＶ２ ＩＴＲをさらに含む。
さらなる関連する実施形態において、本開示は、本開示の発現カセットを含むプラスミドを含む。特定の実施形態において、プラスミドは、発現カセットに隣接するＡＡＶ２ ＩＴＲをさらに含む。
別の関連する実施形態において、本開示は、本開示のベクター、プラスミドまたは発現カセットを含む宿主細胞を含む。特定の実施形態において、宿主細胞は、ヒト胎児腎細胞、例えば２９３または２９３Ｔ細胞である。
いくつかの実施形態において、本開示は、（ａ）本明細書に提供されるプラスミドを含むベクターと、（ｂ）その使用のための指示とを含むキットを提供する。いくつかの実施形態において、キットは、プラスミドを含むベクターを含み、プラスミドは本明細書で提供される発現カセットを含み、ＡＡＶ２ ＩＴＲをさらに含む。
さらに、本明細書に記載される方法および使用のいずれもが、ＳＧＳＨポリペプチドまたはその改変体の発現を増加させることを必要とする対象においてＳＧＳＨポリペプチドまたはその改変体の発現を増加させるために使用され得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法および使用は、脳内のＳＧＳＨ活性を増加および／または回復させることを必要とする対象の脳内のＳＧＳＨ活性を増加および／または回復させる。いくつかの実施形態において、方法および使用は、対象の脳内の正常なＳＧＳＨ活性の少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、またはそれより多くを回復させる。
図１は、第一世代のＬＹＳ－ＳＡＦ３０１遺伝子治療ベクターであるアデノ随伴ウイルスベクター構築物の概略図である。この図において、ＡＡＶ２ ＩＴＲはＡＡＶ２内部末端反復を指し、ｍｕＰＧＫはマウスホスホグリセロールキナーゼプロモーターを指し、ＳＧＳＨはヒトＮ－スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼを指し、ＥＭＣＶｉｒｅｓは脳心筋炎ウイルスｉｒｅｓを指し、ＳＵＭＦ１はヒトスルファターゼ修飾因子１を指し、ＢＧＨｐＡはウシ成長因子ポリＡを指す。
図２Ａは、第一世代ＬＹＳ－ＳＡＦ３０１遺伝子治療ベクターの作製のために使用されるｐＡＶＶ－ＰＧＫ－ＨＭＰＳ３Ａプラスミドの概略図である。この図において、ＩＴＲは内部末端反復を指し、ＰＧＫはホスホグリセロールキナーゼプロモーターを指し、ＳＧＳＨはヒトＮ－スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼを指し、ＳＵＭＦ１はヒトスルファターゼ修飾因子１を指し、ＩＲＥＳは配列内リボソーム進入部位を指し、ＫａｎＲはカナマイシン耐性を指す。
図２Ｂは、ｐＰＡＫ－ＭＡＲＨ１０ヘルパープラスミドの概略図である。この図において、ＡＡＶ２ｒｅｐ遺伝子はＡＡＶ２の複製のための遺伝子を指し、ＡＡＶｒｈ１０ｃａｐ遺伝子はＡＡＶアカゲザル１０キャプシドをコードする遺伝子を指し、ＭＭＴＶプロモーターはマウス乳癌ウイルスプロモーターを指し、ＫａｎＲはカナマイシン耐性を指し、Ａｄ５ Ｅ４遺伝子はアデノウイルス５ Ｅ４遺伝子を指す。
図３は、ＬＹＳ－ＳＡＦ３０２発現カセットおよび隣接配列の概略図である。
図４Ａおよび図４Ｂは、ＬＹＳ－ＳＡＦ３０２粒子（配列番号９）中にキャプシド化されたＤＮＡの配列を表す。図４Ｃ～図４Ｄは、プラスミドｐ－ＬＹＳ－ＳＡＦ－Ｔ５（配列番号１４）の全配列を表す。図４Ｃおよび図４Ｄでは、ＩＴＲ、ＣＡＧプロモーター、ＳＧＳｈに対するｃＤＮＡ、ポリＡ部位およびＡｍｐＲ遺伝子が示されている。図４Ｅ～図４Ｆは、キャプシドｒｈ１０を含有するプラスミド（ｐＡＡＶ２－ｒｈ１０；配列番号１５）配列の配列を表す。図４Ｅおよび図４Ｆでは、プラスミドのＡＡＶ２ ＲＥＰ、ＣＡＰ１、ＬａｃＯ、ＣｏｌＥ１起点、ＡｍｐＲ、Ｆ１起点およびＬａｃα成分が示されている。図４Ｇ～図４Ｋは、ヘルパープラスミドｐＨＧＴＩ、すなわちアデノウイルスのヘルパー機能を有するプラスミド（配列番号１６）の配列を表す。図４Ｇ～図４Ｋでは、プラスミドのＶＡ、Ｒａｄｓ、Ｅ４、Ｌ５、Ｅ２Ａ、ＡｍｐＲおよびＣｏｌＥ１起点成分が示されている。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。
図５は、注射後４週でのＭＰＳＩＩＩＡマウスの全ての脳領域にわたるＳＧＳＨ活性に対するＬＹＳ－ＳＡＦ３０１およびＬＹＳ－ＳＡＦ３０２の効果を示す。データは、ＷＴレベルに対する平均％ＳＧＳＨ活性±ＳＥＭである；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊ｐ＜０．０１、ｎｓ＝非有意、頭上のバーで示されていなければ、ＷＴに対する有意性を与える。
図６は、注射後４週でのＭＰＳＩＩＩＡマウスの全ての脳領域にわたる全ＨＳの量に対するＬＹＳ－ＳＡＦ３０１およびＬＹＳ－ＳＡＦ３０２の効果を示す。ＡＭＡＣ標識された二糖のＲＰ－ＨＰＬＣからのピーク面積定量後における全脳領域中のＨＳの平均相対量（領域１～５の平均）。データは平均±ＳＥＭである；＊ＷＴに対してｐ＜０．０５の有意性。
図７Ａ～Ｅは、注射後４週でのＭＰＳＩＩＩＡマウスの全ての脳領域にわたる炎症性サイトカインの量に対するＬＹＳ－ＳＡＦ３０１およびＬＹＳ－ＳＡＦ３０２の効果を示す。全ての脳領域に対してＣＢＡフレックスセットによって測定した場合のＭＩＰ－１α（７Ａ）、ＭＣＰ－１（７Ｂ）、ＩＬ－１α（７Ｃ）、ＲＡＮＴＥＳ（７Ｄ）およびＫＣ（７Ｅ）のタンパク質レベル。各データ点は、５つ全ての脳領域にわたるそれぞれの個々のマウスに対する値を表す。Ｐ値は、チューキーの多重比較検定による二元配置分散分析からのものである、＊＝Ｐ＜０．０５、＊＊＝Ｐ＜０．０１、＊＊＊＝Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊＝Ｐ＜０．０００１。
図８は、示されたＭＯＩでのＬＹＳ－ＳＡＦ３０２からのＳＧＳＨ発現を示す。
図９は、示されたＭＯＩでＬＹＳ－ＳＡＦ３０２から産生されたＳＧＳＨの酵素活性を示す。
図１０は、ＭＰＳＩＩＩＡマウスにおけるＬＹＳ－ＳＡＦ３０２の実質内注射戦略を示す。注射部位（白い矢印）が、片側冠状脳切片の位置とともに、側方から示されている。ハミルトンシリンジを用いて、ＭＰＳＩＩＩＡマウスに、５週齢でＬＹＳ－ＳＡＦ３０２の定位注射を行った（ｎ＝１０／性別／群）。ベクターは、８μｌ中に８．６Ｅ＋０８ｖｇ（低用量）、４．１Ｅ＋１０ｖｇ（中用量）または９．０Ｅ＋１０ｖｇ（高用量）の用量で投与され、０．２μｌ／分で、左右の線条体のそれぞれに２μＬおよび左右の視床のそれぞれに２μＬを介して送達された。５つの片側冠状切片の位置が示されている。
図１１は、注射後１２週および２５週でのＭＰＳＩＩＩＡマウスの脳切片におけるＳＧＳＨ活性に対するＬＹＳ－ＳＡＦ３０２の用量依存的効果を示す。（□雄；●雌）。Ｐ値は、事後ボンフェローニ検定による一元配置分散分析からのものであり、＊＝Ｐ＜０．０５、＊＊＝Ｐ＜０．０１、＊＊＊＝Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊＝Ｐ＜０．０００１である。マウス＃２２５（１７週齢の雄ＭＰＳＩＩＩＡ低用量群）は、各アッセイにおいて外れ値であり、ＳＧＳＨ活性の増加を示さなかった（ＭＰＳＩＩＩＡビヒクルマウス参照）。３０週コホートでは、雄の低用量処置ＭＰＳＩＩＩＡマウス＃４２２、＃３８３および＃４４８は外れ値であり、ＳＧＳＨ活性の増加を示さなかった（ＭＰＳＩＩＩＡビヒクルマウス参照）。
図１２は、注射後１２週および２５週でのＭＰＳＩＩＩＡマウスの脳切片におけるＨＳの量に対するＬＹＳ－ＳＡＦ３０２の用量依存的効果を示す。（□雄；●雌）。Ｐ値は、事後ボンフェローニ検定による一元配置分散分析からのものであり、＊＝Ｐ＜０．０５、＊＊＝Ｐ＜０．０１、＊＊＊＝Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊＝Ｐ＜０．０００１である。マウス＃２２５（１７週齢の雄ＭＰＳＩＩＩＡ低用量群）は、各アッセイにおいて外れ値であり、ＨＳの低下を示さなかった（ＭＰＳＩＩＩＡビヒクルマウス参照）。３０週コホートでは、雄の低用量処置ＭＰＳＩＩＩＡマウス＃４２２、＃３８３および＃４４８は外れ値であり、ＨＳの低下を示さなかった（ＭＰＳＩＩＩＡビヒクルマウス参照）。これは、これらのマウス試料について記録された少量のＳＧＳＨ活性と一致している。
図１３は、処置後２５週でのＭＰＳＩＩＩＡマウスの神経病理学的分析を示す。図１３Ａおよび図１３Ｂは、図１０に示されるマップによる脳切片３における二次リソソーム蓄積産物ＧＭ２（Ａ）およびＧＭ３（Ｂ）ガングリオシド定量化を示す。図１３Ｃは、下丘（ｉｎｆｅｒｉｏｒ ｃｏｌｌｉｃｕｓ）中でのＬＩＭＰ２染色によって評価されたエンド／リソソーム系の拡大を示す。図１３Ｄは、下丘中でのユビキチン染色によって評価された軸索スフェロイドの数を示す。図１３Ｅは、下丘中でのＧＦＡＰ染色によって評価されたアストログリオーシスの程度を示す。図１３Ｆは、歯状回中でのイソレクチンＢ４染色によって評価された反応性のアメーバ様形状のミクログリアの数を示す。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１および＊ｐ＜０．０５ ボンフェローニの多重比較検定による一元配置分散分析から計算した。
図１４Ａ～図１４Ｆは、イヌの脳におけるガドリニウム拡散を示す。図は、ＭＲＩ造影剤ガドリニウム（５ｍｍｏｌ）とともに５００μのＬＹＳ－ＳＡＦ３０２を１０μＬ／分で白質中に４回注射（半球当たり２回）を受けた（総用量２．０Ｅ＋１２ｖｇ）イヌを表す。図１４Ａは、注射部位を含む冠状切片の位置を伴ったイヌ脳の左側面図である。図１４Ｂ～図１４Ｃは、注射前の冠状切片のＭＲＩ画像であり、予定された注射部位が赤色のドットスポットで表されている。図１４Ｄ～図１４Ｅは、白質中への可視的ガドリニウム信号を注入した後の冠状切片のＭＲＩ画像である。図１４Ｆは、ＭＲＩ画像の３Ｄ再構成の前面図であり、白質の吻側－尾側軸に沿って両半球中にガドリニウム信号が見える。スケールバー＝１０ｍｍ。
図１５Ａ～図１５Ｃは、５０μｌのＬＹＳ－ＳＡＦ３０２を５μＬ／分で白質中に４回注射（半球あたり２回）を受けた（総用量７．２Ｅ＋１１ｖｇ）２つのＮＨＰの脳におけるＳＧＳＨ活性分布を示す。図１５Ａは、片側冠状脳切片の位置とともにＮＨＰ脳の左側面図を示す。吻側注射はスライス４から６の間であり、尾側注射はスライス８から１０の間であった。ビヒクル注射された対照と比較してＳＧＳＨ活性の２０％超の増加が、１匹のＮＨＰについて分析された脳パンチの９９％で注射の６週後に観察され（図１５Ｂ）、別のＮＨＰについて分析された脳パンチの９４％で観察された（図１５Ｃ）。
図１６Ａ～図１６Ｅは、注射の４ヶ月後でのマウス脳におけるＳＡＦ３０２ＧＦＰの発現を示す。図１６Ａは、５つの異なる脳領域に対する線条体内注射部位の図である。ＭＰＳＩＩＩＡマウスは、ハミルトンシリンジを用いて、８～１４週齢でＳＡＦ３０２ＧＦＰの定位注射を受けた（ｎ＝６）。ベクターは、３μＬ中６．１×１０９ゲノム粒子の用量で投与され、両半球において、３ｍｍの深さ、正中線に対して２ｍｍ側方での両側注射を介して送達された。注射の４ヶ月後に動物を屠殺し、組織学的分析のために脳を採取した。ブレグマ＋１．７、＋０．２６、－１．１８および－２．６２ｍｍからの冠状脳切片（図１６Ｂ）、ならびに正中線に対して１．２ｍｍ側方の矢状切片（図１６Ｃ）を、ＮｅｕＮ（赤色）、ＧＦＰ（緑色）およびＤＡＰＩ（青色）で共標識した。スケールバー＝１，０００μｍ。（図１６Ｄおよび図１６Ｅ）（図１６Ｃ）中の破線の枠によって示される領域の高倍率画像は、海馬（図１６Ｄ）および線条体（図１６Ｅ）内の細胞の形質導入を示す。スケールバー＝５０μｍ。 同上。 同上。
図１７Ａ～図１７Ｅは、ＳＡＦ３０２ＧＦＰによる処置後の注射部位付近のＧＦＡＰ陽性星状膠細胞の形質導入を示す。ＭＰＳＩＩＩＡマウスに２つの深さでＳＡＦ３０２ＧＦＰを注射し、注射の４週後に採取し（図１７Ａ）、または１つの深さで注射し、注射の４ヶ月後に採取した（図１７Ｂ）。ブレグマに対して＋０．２６の冠状切片を、ＧＦＡＰ（赤色）、ＧＦＰ（緑色）およびＤＡＰＩ（青色）で染色した。スケールバー＝１，０００μｍ。帯状束／皮質（１）、外包／一次体性感覚皮質／線条体境界（２）、および線条体／注射部位（３）の高倍率画像を示す。スケールバー＝２０μｍ。全脳面積の割合としての、表記ブレグマでのＧＦＰ陽性細胞の百分率の定量化（図１７Ｃ～１７Ｅ）。＊ｐ＜０．０５ スチューデントのｔ検定を用いて計算した。代表的な画像が示されており、５匹のマウスの両半球に注射し、群ごとに定量化した。
詳細な説明
様々な実施形態において、本開示は、遺伝性疾患（コードされた遺伝子産物の低下した発現もしくは発現の欠如、遺伝子産物の変化した形態の発現、または遺伝子産物の発現を制御する調節エレメントの破壊をもたらす遺伝子欠失または変異から生じる疾患を含む）、神経学的疾患および障害、ならびに脳の疾患および障害を含むがこれらに限定されない様々な疾患および障害を処置する上で有用な新規組成物および方法を提供する。当業者によって理解されるように、特定の組成物および方法が本明細書に具体的に例示されているが、本開示はそのようには限定されず、本明細書に具体的に記載されたものを含むがこれらに限定されない追加の実施形態および使用を含む。さらに、以下の記述では、本開示の様々な実施形態の完全な理解を提供するために、ある具体的な詳細が記載されている。しかしながら、当業者は、本開示がこれらの詳細なしに実施され得ることを理解するであろう。
定義
別段の定義がなければ、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術の当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本開示において、以下の用語が以下で定義されている。
「ａ」および「ａｎ」という語は、特に明記しない限り、１またはそれを超えるを意味する。
「約」によって、基準の数量（ｑｕａｎｔｉｔｙ）、レベル、値、数、頻度、百分率、大きさ、サイズ、量（ａｍｏｕｎｔ）、重量または長さに対して最大３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１％変動する数量、レベル、値、数、頻度、百分率、大きさ、サイズ、量、重量または長さを意味する。「約、」という用語と組み合わせて使用される数値の文脈で論述される任意の実施形態では、約という用語を省略することができることが特に企図されている。
「活性改変体」という用語は、「生物学的に活性な断片」と「生物学的に活性な改変体」の両方を示し、包含する。代表的な生物学的に活性な断片および生物学的に活性な改変体は、一般に、相互作用、例えば、分子内または分子間相互作用に関与する。分子間相互作用は、特異的結合相互作用または酵素的相互作用であり得る。酵素的相互作用または活性の例としては、限定されないが、脱ヒドロキシル化および本明細書に記載されている他の酵素活性が挙げられる。
「生物学的に活性な断片」という用語は、参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の断片に適用される場合、参照配列の少なくとも１つの活性（例えば、酵素活性）の少なくとも約２０、２２、２４、２６、２８、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１１０、１２０、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００％またはそれより多くを有する断片を指す。「参照配列」という用語は、一般に、それに対して別の配列が比較されている核酸コード配列またはアミノ酸配列を指す。配列表に提供されている全ての配列も参照配列として含まれる。長さが少なくとも約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００、５００、６００またはそれを超える連続するヌクレオチドまたはアミノ酸残基の生物学的に活性な断片が本開示の範囲内に含まれ、その間の全ての整数が含まれる。
「生物学的に活性な改変体」という用語は、参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の改変体に適用される場合、参照配列の活性（例えば、酵素活性）の少なくとも約２０、２２、２４、２６、２８、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１１０、１２０、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００％またはそれより多くを有する改変体を指す。参照配列と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する生物学的に活性な改変体が本開示の範囲内に含まれ、その間の全ての整数が含まれる。
「コード配列」とは、遺伝子のポリペプチド産物に対するコードに寄与する任意のポリヌクレオチド配列を意味する。対照的に、「非コード配列」という用語は、遺伝子のポリペプチド産物に対するコードに寄与しない任意のポリヌクレオチド配列を指す。
文脈上他の意味に解釈すべき場合を除き、本明細書および特許請求の範囲を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語およびその変形、例えば「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、非限定的な包括的意味、すなわち「含むが、限定されない」と解釈されるべきである。
「からなる」という用語に続くものが何であれ、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」によって、含み、それに限定されることが意味される。従って、「からなる」という用語は、列記された要素が必要とされるまたは必須であること、他の要素は存在し得ないことを示す。
「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」によって、その用語の後に列記された全ての要素を含み、列記された要素に対して本開示中で指定された活性または作用を妨害せずまたは寄与しない他の要素に限定されることを意味する。従って、「から本質的になる」という用語は、列記された要素が必要とされるまたは必須であること、但し、他の要素は任意であり、他の要素が列記された要素の活性または作用に影響を及ぼすか否かに応じて、存在してもよく、または存在しなくてもよいことを示す。
本明細書を通じて「１つの実施形態」または「一実施形態」への言及は、当該実施形態に関連して記載されている特定の特徴、構造または特性が本開示の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。従って、本明細書を通じた様々な場所での「１つの実施形態において」または「一実施形態において」という用語の出現は、必ずしも全て同じ実施形態を参照するわけではない。さらに、特定の特徴、構造または特性は、１またはそれを超える実施形態において、任意の適切な様式で組み合わされ得る。
本明細書で使用される場合、「機能」および「機能的」などの用語は、生物学的、酵素的または治療的機能を指す。
「遺伝子」とは、染色体上の特定の遺伝子座を占有し、転写および／もしくは翻訳調節配列ならびに／またはコード領域ならびに／または非翻訳配列（すなわち、イントロン、５’および３’非翻訳配列）からなる遺伝の単位を意味する。
遺伝子に関する「変異」または「欠失」という記載は、一般に、コードされた遺伝子産物の減少した発現もしくは無発現をもたらす、または野生型遺伝子産物と比較して遺伝子の産物を非機能性にするもしくは低下した機能を有するようにする遺伝子の変化または変更を指す。このような変化の例としては、転写もしくは翻訳などのレベルで、その遺伝子によってコードされるポリペプチドの発現を妨害し、排除し、下方制御し、もしくは著しく低下させる、および／または相対的に不活性な（例えば、変異したまたは切断された）もしくは不安定なポリペプチドを産生する、標的遺伝子のコード配列または調節配列の全体または一部へのヌクレオチド置換、欠失または付加が挙げられる。ある特定の態様では、そのポリペプチドの活性部位、その細胞局在、その安定性、または当業者に明らかな他の機能的特徴を改変することなどによって、改変されたポリペプチドが発現されるが、１またはそれを超える酵素活性に関して低下した機能または活性を有するように、標的とされる遺伝子は、コードされたポリペプチドのアミノ酸配列を変化させるヌクレオチドレベルでの変化または変異によって「非機能的」にされ得る。
「増加された」または「増強された」量は、典型的には、「統計的に有意な」量であり、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０または５０またはそれを超える倍数（例えば、１００、５００、１０００倍）（その間のおよび１より大きい全ての整数および小数点、例えば、２．１、２．２、２．３、２．４などを含む）である本明細書に記載されている量またはレベルの増加を含み得る。
「減少された」または「低下された」または「より少ない」量は、典型的には、「統計的に有意な」量であり、約１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０または５０またはそれを超える倍数（例えば、１００、５００、１０００倍）（その間のおよび１より大きい全ての整数および小数点、例えば、１．５、１．６、１．７、１．８などを含む）である本明細書に記載されている量またはレベルの減少を含み得る。
「から得られた」とは、例えばポリヌクレオチドまたはポリペプチドなどの試料が、所望の生物または所望の生物内の特定の組織などの特定の供給源から単離され、またはこれに由来することを意味する。
本明細書で使用される「機能的に連結された」という用語は、遺伝子をプロモーターの調節的制御下に置くことを意味し、次いでプロモーターは遺伝子の転写および必要に応じて翻訳を制御する。異種プロモーター／構造遺伝子の組み合わせの構築においては、その遺伝子配列またはプロモーターとその天然環境においてその遺伝子配列またはプロモーターが制御する遺伝子、すなわち、その遺伝子配列またはプロモーターが由来する遺伝子との間の距離と概ね同じである遺伝子転写開始部位からの距離に遺伝子配列またはプロモーターを配置することが一般に好ましい。当技術分野において公知であるように、この距離のいくらかの変動は、機能を失うことなく受け入れられ得る。同様に、調節配列エレメントの制御下に置かれるべき異種遺伝子に対する調節配列エレメントの好ましい配置は、その天然環境、すなわち、そのエレメントが由来する遺伝子中での当該エレメントの配置によって規定される。「構成的プロモーター」は、典型的には、ほとんどの条件下で活性である、すなわち転写を促進する。「誘導性プロモーター」は、典型的には、ある特定の条件下、例えば所定の分子因子（例えば、ＩＰＴＧ）の存在下または所定の環境条件下でのみ活性である。その条件の非存在下では、誘導性プロモーターは、典型的には、有意なまたは測定可能なレベルの転写活性を許容しない。多数の標準的な誘導性プロモーターが当業者に公知であろう。
「薬学的に許容され得る担体、希釈剤または賦形剤」は、ヒトまたは家畜における使用に対して許容され得るとして米国食品医薬品局によって承認されている、任意の佐剤、担体、賦形剤、流動促進剤、甘味剤、希釈剤、防腐剤、色素／着色剤、着香剤、界面活性剤、湿潤剤、分散剤、懸濁剤、安定化剤、等張剤、溶媒または乳化剤を含むが、これらに限定されない。
本明細書で使用される「ポリヌクレオチド」または「核酸」という表記は、ｍＲＮＡ、ＲＮＡ、ｃＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはＤＮＡを示す。この用語は、典型的には、リボヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチド、またはいずれかのタイプのヌクレオチドの修飾された形態の、少なくとも１０塩基長のヌクレオチドのポリマー形態を指す。この用語は、ＤＮＡおよびＲＮＡの一本鎖形態および二本鎖形態の両方を含む。
「ポリヌクレオチド改変体」という用語は、参照ポリヌクレオチド配列または以下で定義されている厳格な条件下で参照配列とハイブリッドを形成するポリヌクレオチドと実質的な配列同一性を示すポリヌクレオチドを表す。この用語は、少なくとも１つのヌクレオチドの付加、欠失または置換によって参照ポリヌクレオチドから区別されるポリヌクレオチドも包含する。従って、「ポリヌクレオチド改変体」という用語には、１またはそれを超えるヌクレオチドが付加されまたは欠失され、または異なるヌクレオチドで置換されているポリヌクレオチドが含まれる。これに関して、変異、付加、欠失および置換を含むある種の変化を参照ポリヌクレオチドに施すことができ、それにより、改変されたポリヌクレオチドが参照ポリヌクレオチドの生物学的機能もしくは活性を保持し、または参照ポリヌクレオチドに関して増加した活性を有する（すなわち、最適化されている）ことが本分野において十分に理解されている。ポリヌクレオチド改変体には、例えば、本明細書に記載されている参照ポリヌクレオチド配列と少なくとも５０％（ならびに少なくとも５１％～少なくとも９９％およびその間の全ての整数百分率、例えば９０％、９５％または９８％）の配列同一性を有するポリヌクレオチドが含まれる。「ポリヌクレオチド改変体」および「改変体」という用語には、天然に存在する対立遺伝子改変体およびこれらの酵素をコードするオルソログも含まれる。
ポリヌクレオチドおよびポリペプチドに関して、「外因性」という用語は、野生型細胞または生物中には天然に存在しないが、典型的には分子生物学的技術によって細胞内に導入されるポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を指す。外因性ポリヌクレオチドの例としては、所望のタンパク質をコードするベクター、プラスミドおよび／または人工核酸構築物が挙げられる。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドに関して、「内因性」または「天然」という用語は、所与の野生型細胞または生物中に見出され得る天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を指す。
「導入された」ポリヌクレオチド配列は、細胞または生物中に加えられるまたは導入されるポリヌクレオチド配列を指す。「導入された」ポリヌクレオチド配列は、細胞もしくは生物にとって外因性のポリヌクレオチド配列であり得、または細胞もしくは生物内に既に存在するポリヌクレオチド配列であり得る。例えば、ポリヌクレオチドは、例えば、本来天然に存在するポリヌクレオチド配列の１またはそれを超えるさらなるコピーを作製し、それによってコードされたポリペプチドの過剰発現を促進するために、そのようなポリヌクレオチド配列を既に含有する微生物中に分子生物学的技術によって「導入」され得る。
「ポリペプチド」、「ポリペプチド断片」、「ペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーならびにその改変体および合成類似体を指すために本明細書で互換的に使用される。したがって、これらの用語は、天然に存在するアミノ酸ポリマーのみならず、１またはそれを超えるアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の化学的類似体などの天然に存在しない合成アミノ酸であるアミノ酸ポリマーにも適用される。ある特定の態様において、ポリペプチドは、典型的には様々な化学反応を触媒する（すなわち、その速度を増加させる）酵素ポリペプチドまたは「酵素」を含み得る。
「ポリペプチド改変体」という記載は、少なくとも１つのアミノ酸残基の付加、欠失または置換によって参照ポリペプチド配列から区別されるポリペプチドを指す。ある特定の実施形態において、ポリペプチド改変体は、保存的または非保存的であり得る１またはそれを超える置換によって参照ポリペプチドから区別される。ある特定の実施形態において、ポリペプチド改変体は保存的置換を含み、これに関して、一部のアミノ酸は、ポリペプチドの活性の性質を変化させることなく、広く同様の特性を有する他のアミノ酸に変更され得ることが当技術分野で十分に理解されている。ポリペプチド改変体は、１またはそれを超えるアミノ酸が付加もしくは欠失されている、または異なるアミノ酸残基で置換されているポリペプチドも包含する。本明細書に記載されている任意の参照配列（例えば、配列表を参照）と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチドが含まれる。特定の実施形態において、ポリペプチド改変体は、参照ポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性を維持する。
本明細書において使用される「配列同一性」または、例えば、「５０％同一な配列」を含むという表記は、比較のウィンドウにわたって、ヌクレオチド対ヌクレオチドベースまたはアミノ酸対アミノ酸ベースで配列が同一である程度を表す。従って、「配列同一性の百分率」は、比較のウィンドウにわたって２つの最適に並列された配列を比較すること、合致した位置の数を得るために、両配列中で同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｉ）または同一のアミノ酸残基（例えば、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、ＣｙｓおよびＭｅｔ）が生じる位置の数を決定すること、合致した位置の数を比較のウィンドウ中の位置の総数（すなわち、ウィンドウサイズ）によって除すること、および配列同一性の百分率を得るために結果に１００を乗じることによって計算され得る。
２またはそれを超えるポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の配列関係性を記載するために使用される用語には、「参照配列」、「比較ウィンドウ」、「配列同一性」、「配列同一性の百分率」および「実質的な同一性」が含まれる。「参照配列」は、長さが少なくとも１２単量体単位であるが、しばしば１５～１８単量体単位、多くの場合少なくとも２５単量体単位であり、ヌクレオチドおよびアミノ酸残基を包含する。２つのポリヌクレオチドは、それぞれ、（１）２つのポリヌクレオチド間で類似する配列（すなわち、完全なポリヌクレオチド配列の一部のみ）、および（２）２つのポリヌクレオチド間で相違する配列を含み得るので、２つの（またはそれを超える）ポリヌクレオチド間の配列比較は、典型的には、配列が類似する局所領域を同定および比較するために、「比較ウィンドウ」にわたって２つのポリヌクレオチドの配列を比較することによって行われる。「比較ウィンドウ」は、２つの配列が最適に並列された後に、配列が同じ数の連続する位置の参照配列と比較される少なくとも６つの連続する位置、通常は、約５０～約１００、より通常は、約１００～約１５０の連続する位置の概念的セグメントを表す。比較ウィンドウは、２つの配列の最適な並列のために、（付加または欠失を含まない）参照配列と比較して約２０％またはそれ未満の付加または欠失（すなわち、間隙）を含み得る。比較ウィンドウを並列させるための配列の最適な並列は、アルゴリズムのコンピュータ化された実行によって（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ Ｒｅｌｅａｓｅ ７．０，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉ，ＵＳＡ中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）によって、または検査および選択された様々な方法のいずれかによって生成された最良の並列（すなわち、比較ウィンドウにわたって最高の百分率相同性をもたらす）によって実施され得る。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９によって開示されているプログラムのＢＬＡＳＴファミリーも参照され得る。配列分析の詳細な論述は、Ａｕｓｕｂｅｌら、’’Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ’’、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．，１９９４－１９９８，１５章のユニット１９．３に見出すことができる。
「形質転換」は、宿主細胞ゲノム中への外来ＤＮＡの取り込みおよび組み込み、または宿主細胞内で染色体外に維持された外来ＤＮＡの取り込みおよび組み込みから生じる細胞における永続的な遺伝的変化を指し、ある生物から別の生物のゲノム中への外因性遺伝子の移動も指す。
「本明細書で使用される場合、「処置」、「処置する」、「処置された」または「処置している」という用語は、予防および／または治療を指し、特に、目的は、例えばリソソーム蓄積症（ＬＳＤ）などの変異した遺伝子に起因する脳障害の発症および／または進行などの望ましくない生理学的変化または障害を予防または減速（軽減）することである。有益なまたは所望の臨床的結果としては、検出可能かまたは検出不能かを問わない、症候の緩和、疾患の程度の縮小、疾患の安定化された（すなわち、悪化しない）状態、疾患進行の遅延または減速、疾患状態の軽減または寛解、および緩解（部分的であるか、または完全であるかを問わない）が含まれるが、これらに限定されない。「処置」は、処置を受けていない場合の予想される生存および／または生活の質と比較して、生存を延長することおよび／または生活の質を増加させることも意味し得る。処置を必要とする者には、既に症状もしくは障害（例えば、ＬＳＤなどの変異した遺伝子に起因する脳障害）を有する者の他、症状もしくは障害を有する傾向がある者、または症状もしくは障害を予防すべき者が含まれる。したがって、「処置」は、例えば、疾患の発症を阻害、予防もしくは遅延させるためにまたは疾患の発生の可能性を低減させるために、家族歴、遺伝子もしくは染色体異常の故におよび／または疾患に対する１もしくはそれを超える生物学的マーカーの存在の故に疾患に罹患しやすいと考えられる個体に、本開示の化合物を投与することも含む。特定の実施形態において、処置は、以下のいずれをも含み得る：発達の退行の減少、言語障害の減少もしくは言語発達の改善、運動技能障害の減少、知的発達障害の減少、多動性（過剰運動活性）の減少、睡眠の改善、注意、身体および精神能力障害（患者は、完全な運動活性（歩行、発話、摂食など）を失う）の減少、認知能力、重度の発作、気道閉塞および心不全などの障害の減少、または部分的に分解されたヘパラン硫酸塩の蓄積の減少。ある特定の実施形態において、「処置」は、細胞が疾患を処置するおよび／または疾患の結果を逆転させる欠損酵素を産生できるようにすること、例えば、対象にＳＧＳＨ遺伝子の機能を回復させもしくは提供すること、または蓄積したヘパラン硫酸を分解することを含む。
「対象」には、疾患もしくは障害を有すると診断された、または疾患もしくは障害を発症するリスクがあると判定された哺乳動物などの、疾患または障害に対する処置を必要とする哺乳動物を含む哺乳動物、例えばヒトが含まれる。特定の例では、対象は、遺伝性疾患、脳障害、または神経学的疾患もしくは障害、例えばＭＰＳＩＩＩＡなどのＭＰＳを含むリソソーム蓄積障害と診断された哺乳動物である。
「ベクター」とは、ポリヌクレオチド分子、例えば、ポリヌクレオチドをその中に挿入するまたはクローン化することができる、例えば、プラスミド、バクテリオファージ、酵母またはウイルスに由来するＤＮＡ分子を意味する。ベクターは、典型的には、１またはそれを超えるユニークな制限部位を含有し、所定の宿主細胞中で自律的複製が可能であり得るか、またはクローン化された配列が再生可能であるように所定の宿主のゲノムと一体化可能であり得る。したがって、ベクターは、自律的に複製するベクター、すなわち、その複製が染色体の複製とは独立している染色体外実体として存在するベクター、例えば、直鎖もしくは閉環状プラスミド、染色体外要素、ミニ染色体または人工染色体であり得る。ベクターは、自己複製を確保するための任意の手段を含有することができる。あるいは、ベクターは、宿主細胞中に導入されたときに、ゲノム中に組み込まれ、ベクターがその中に組み込まれた染色体と一緒に複製されるものであり得る。このようなベクターは、宿主染色体の特定の所望の部位への組換えを可能にする特異的配列を含み得る。ベクター系は、単一のベクターもしくはプラスミド、宿主細胞のゲノム中に導入されるべき全ＤＮＡを一緒に含有する２もしくはそれを超えるベクターもしくはプラスミド、またはトランスポゾンを含むことができる。ベクターの選択は、典型的には、ベクターがその中に導入されるべき宿主細胞との、ベクターの適合性に依存する。「ベクター」には、ポリヌクレオチドをその中に挿入またはクローン化することができるウイルスおよびウイルス粒子も含まれる。このようなものは「ウイルスベクター」と呼ばれることがある。「遺伝子治療ベクター」は、治療用ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を、これを必要とする対象に送達するために使用される、ウイルスベクターを含むベクターであり、これは典型的には、例えば対象における遺伝的変異の故に、対象において欠損している、変異されている、または発現が調節解除されているポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列である。
目的のＤＮＡ配列をＤＮＡベクター中に挿入するための一般的な手段は、制限部位と呼ばれる特定の部位でＤＮＡを切断する制限酵素と呼ばれる酵素の使用を含む。「カセット」または「遺伝子カセット」または「発現カセット」は、１またはそれを超える発現産物をコードし、これらの産物の発現のために必要なシス作用性エレメントを含有するポリヌクレオチド配列であって、規定の制限部位においてベクター中に挿入することができるポリヌクレオチド配列を指す。
「野生型」という用語は、本明細書において使用される場合、天然に存在する供給源から単離されたときにその遺伝子または遺伝子産物の特徴を有する遺伝子または遺伝子産物を指す。野生型遺伝子または遺伝子産物（例えば、ポリペプチド）は、集団で最も頻繁に観察される遺伝子または遺伝子産物であり、したがって、遺伝子の「正常」または「野生型」形態と任意に設計される。
遺伝子治療ベクター
ある特定の実施形態において、本開示は、ＭＰＳＩＩＩＡの処置のための遺伝子治療ベクターを含む。このような遺伝子治療ベクターは、ヒトＳＧＳＨポリペプチドまたはその活性改変体を、これを必要とする対象内の細胞に送達するために使用され得る。添付の実施例に記載されているように、本開示の遺伝子治療ベクターは、ＭＰＳＩＩＩＡの処置に有効かつ安全であることが研究により確立された。
理論に束縛されることを望むものではないが、脳実質中に投与すると、遺伝子治療ベクター粒子および酵素は局所的に拡散するとともに、軸索に沿って遠隔の解剖学的脳構造に輸送されて、広範囲の脳領域の矯正を可能にすることが理解される。細胞内に入ると、ＳＧＳＨポリペプチドをコードする遺伝子治療ベクターは核の中に輸送され、そこで一連の分子的変換を受けて、二本鎖デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子として安定な確立をもたらす。このＤＮＡは、メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）に転写され、次いで、欠損酵素であるＳＧＳＨに翻訳される。形質導入された細胞は、ＳＧＳＨ酵素を継続的に発現および送達し、したがって、欠如した内因性酵素を補完するための酵素産生の脳内永久供給源を構成する。本明細書に記載されている遺伝子治療ベクターは、本明細書ではＳＡＦ３０２またはＡＡＶｒｈ１０－ＳＧＳＨとも呼ばれるＬＹＳ－ＳＡＦ３０２である。添付の実施例に記載されているように、ＳＡＦ３０２は、ＬＹＳ－ＳＡＦ３０１またはＳＡＦ３０１と呼ばれる第１世代製品を試験して得られた情報に基づいて構築された第２世代製品である。ＬＹＳ－ＳＡＦ３０１は、ＡＡＶｒｈ．１０のキャプシド中にパッケージングされたＰＧＫプロモーターによって駆動されるＳＧＳＨおよびＳＵＭＦ１遺伝子を含有する欠陥ＡＡＶ２ゲノムから構成される複製欠損アデノ随伴ウイルス血清型ｒｈ．１０（ＡＡＶｒｈ．１０）からなった。ＬＹＳ－ＳＡＦ３０１は、ＡＡＶｒｈ．１０－ｈＭＰＳ３Ａとも称される。この第一世代ベクターは、ＭＰＳＩＩＩＡ疾患を有する小児において、本明細書に記載されている臨床研究で使用され、２つの注射深度での１２の予め計画された同時フレームレス定位置注射（６０μＬ／注入）で、７．２Ｅ＋１１ウイルスゲノム（ｖｇ）／患者の用量で脳白質中に送達された。用量および外科的介入は十分に忍容され、関連する有害事象は報告されなかった。
本開示は、形質導入された細胞からの発現に関して第一世代製品と比較して２．７倍強力な改良された第二世代製品であるＬＹＳ－ＳＡＦ３０２を提供する。さらに、本開示は、還流なしに増加した流速でより高い用量およびより高い体積の注入を可能にする改善された送達系を提供する。本明細書で提供される送達系および方法は、広範な脳分布および増強された有効性をもたらす。添付の実施例に記載されているように、ＭＰＳＩＩＩＡマウスモデルにおけるＬＹＳ－ＳＡＦ３０１およびＬＹＳ－ＳＡＦ３０２の有効性研究は、本開示の遺伝子治療ベクターがＭＰＳＩＩＩＡ脳細胞を形質導入して大量の活性なＳＧＳＨを産生および分泌し、次いで、これが一次、二次およびその他の神経病理の極めて著しい低下を媒介することを示した。大量のＳＧＳＨが脳のいくつかの領域内で検出され、注射部位への近接と直接相関するようであった。データは、このベクターが、ミクログリオーシスなどの下流の事象に加えて、一次および二次の蓄積病理の非常に著しい改善を媒介するために十分な量のＳＧＳＨを産生することができることを示している。
本開示の遺伝子治療ベクターは、脳内注射後の脳内での高レベルのＳＧＳＨ発現を含む、前述のものを超える予想外の利点を提供することが発見された。さらに、本開示の方法は、驚くべきことに、低下した免疫応答をもたらした。これらの利点は、増加した有効性と相関していた。さらに、ある特定の実施形態において、手術時間および麻酔下での時間が最小限に抑えられ、したがって、患者に対する関連するリスクが低減される。さらに、本開示の組成物および方法は、治療用製品の改善された発現、発現のより広い分布、ならびにより高い用量、より大きな体積、および増加した注射流速を通じたより効率的な送達を介して、増強された有効性を提供する。
パルボウイルス科のメンバーであるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、４．７キロベース（ｋｂ）～６ｋｂの一本鎖線状ＤＮＡゲノムを有する小さなエンベロープのない正二十面体ウイルスである。ＡＡＶのライフサイクルは、感染後にＡＡＶゲノムが宿主染色体中に部位特異的に組み込まれる潜伏期と、アデノウイルスまたは単純ヘルペスウイルス感染のいずれかの後に、組み込まれたゲノムが続いて救出され、複製され、感染性ウイルス中にパッケージングされる感染期とを含む。非病原性、非分裂細胞を含む広い宿主範囲の感染性、および潜在的な部位特異的染色体組み込みという特性は、ＡＡＶを遺伝子導入のための魅力的なツールにする。
これまでに、表面特性の変動を有するＡＡＶの少なくとも１２種類の異なる血清型がヒトまたは非ヒト霊長類（ＮＨＰ）から単離され、特徴付けられている。
「血清型」という用語は、他のＡＡＶ血清型と血清学的に異なるキャプシドを有するＡＡＶに関する区別である。血清学的な独自性は、他のＡＡＶ血清型と比較した、１つのＡＡＶ血清型に対する抗体間の交差反応性の欠如に基づいて決定される。ベクターとも呼ばれる本開示の遺伝子治療ベクターは、ＡＶＶの公知の血清型（ｒｈ）の任意の１つ、例えば、ｒｈ１、ｒｈ２、ｒｈ３、ｒｈ４、ｒｈ５、ｒｈ６、ｒｈ７、ｒｈ８、ｒｈ９またはｒｈ１０の任意の１つ、好ましくはｒｈ１０を有し得る。これらの様々なＡＡＶ血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９またはＡＡＶ１０（ＡＡＶｒｈ．１０）とも称され得る。
ある特定の実施形態において、本開示のベクターは、人工ＡＡＶ血清型を有し得る。人工ＡＡＶ血清型としては、限定されないが、天然に存在しないキャプシドタンパク質を有するＡＡＶが挙げられる。このような人工キャプシドは、本開示の新規ＡＡＶ配列（例えば、ｖｐ１キャプシドタンパク質の断片）を、別のＡＡＶ血清型（公知または新規）、同じＡＡＶ血清型の不連続部分、非ＡＡＶウイルス源から、または非ウイルス源から得られ得る異種配列と組み合わせて使用する任意の適切な技術によって生成され得る。人工ＡＡＶ血清型は、限定されないが、キメラＡＡＶキャプシド、組換えＡＡＶキャプシドまたは「ヒト化」ＡＡＶキャプシドであり得る。
ＡＡＶ血清型ｒｈ．１０（ＡＡＶｒｈ．１０）は、国際公開第２００３／０４２３９７号に記載されている。ＡＡＶｒｈ．１０ベクターは血液脳関門を効率的に通過し、新生仔マウス中枢神経系中の神経細胞および星状膠細胞を形質導入することが示されている（Ｚｈａｎｇ，Ｈ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １９，１４４０－１４４８（Ａｕｇｕｓｔ ２０１１））。さらに、ＡＡＶｒｈ．１０ベクターは、げっ歯類の脳内への注射時に優れた活性を有し［１０～１２］、ヒト集団にはＡＡＶ血清型１０の自然疾患は存在しない。
ＡＡＶゲノムは比較的単純であり、短い逆位末端反復（ＩＴＲ）に隣接する２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有する。ＩＴＲは、とりわけ、ウイルス複製、救出、パッケージングおよび組込みのために必要とされるシス作用配列を含有する。ＩＴＲの組み込み機能は、感染後にＡＡＶゲノムが細胞の染色体中に組み込まれることを可能にする。
非構造的または複製（Ｒｅｐ）およびキャプシド（Ｃａｐ）タンパク質は、それぞれ５’および３’オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）によってコードされる。４つの関連タンパク質がｒｅｐ遺伝子から発現される；Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ６８はｐ５プロモーターから転写されるのに対して、下流プロモーターｐ１９はＲｅｐ５２およびＲｅｐ４０の発現を指令する。Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ６８は、ＡＡＶ複製およびウイルス遺伝子発現の調節に直接関与している。ｃａｐ遺伝子は、第３のウイルスプロモーターｐ４０から転写される。キャプシドは、重複配列の３つのタンパク質から構成され、最小のもの（ＶＰ－３）が最も豊富である。逆位末端反復は、複製、パッケージングおよび組み込みのためにシスに必要とされる唯一のＡＡＶ配列であるので、ほとんどのＡＡＶベクターは、ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質をコードするウイルス遺伝子を省略し、末端反復の間に挿入された外来遺伝子、例えば治療遺伝子のみを含有する。
Ｎ－スルホグリコサミンスルホヒドロラーゼ（ＳＧＳＨ；スルファミダーゼとも呼ばれる。）は、サンフィリポＡ型症候群（ＭＰＳＩＩＩＡ、ＯＭＩＭ＃２５２９００）に関与する欠損したタンパク質である。Ｎ－スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ（ＳＧＳＨ、ＥＣ３．１０．１．１、ＭＩＭ６０５２７０）は、ヘパラン硫酸（ＨＳ）と呼ばれるグリコサミノグリカンのファミリーの段階的分解のために必要なリソソーム加水分解酵素のファミリーに属する。ＳＧＳＨは、ヘパラン硫酸（ＨＳ）分解の第３の工程に関与する。ＳＧＳＨは、ＨＳの非還元末端グルコサミニド残基からのＮ結合型サルファートの加水分解を触媒する。
ある特定の実施形態において、本開示の第一世代遺伝子治療ベクターは、ＳＧＳＨおよびＳＵＭＦ１の両方をコードするポリヌクレオチド配列を含む。ヒトスルファターゼ修飾因子１ｃＤＮＡ（ＳＵＭＦ１、ＭＩＭ６０７９３９）は、翻訳後修飾によってスルファターゼ活性を増強するタンパク質をコードする。第一世代製品においてＳＧＳＨをＳＵＭＦ１とともに共発現させる理由は２つの要素から成った。ＳＵＭＦ１は細胞内に存在するが、補因子も導入されると、遺伝子導入後により高いＳＧＳＨ活性が得られる。ＳＵＭＦ１が野生型培養細胞中にスルファターゼｃＤＮＡとともに同時形質移入されると、およびスルファターゼ欠乏のために様々な疾患に罹患した個体からの細胞中にＡＡＶベクターを介してスルファターゼｃＤＮＡとともに同時送達されると、ＳＵＭＦ１はスルファターゼ活性を強く増強する［１５～１７］。Ｆｒａｌｄｉらは、ＳＵＭＦ１とＳＧＳＨの同時送達が、ＡＡＶ２／５ベクターを使用して、リソソーム蓄積および脳内の炎症マーカーの低下を伴って、ＳＧＳＨ活性の相乗的増加をもたらすことを示した［１３］。
ＳＧＳＨの過剰発現は、他のスルファターゼに対するＳＵＭＦ１の利用可能性を劇的に低下させ、したがって他のスルファターゼの機能に影響を及ぼし得ると仮定された。この有毒な過程は、ＳＵＭＦ１中の変異によって引き起こされる多重スルファターゼ欠損症において例示される［１５］。ヒト内因性ＳＵＭＦ１のレベルは、腎臓および肝臓では高いが、脳では極めて低いことが報告されている［１８～２１］。対照的に、内因性ＳＵＭＦ１の発現は、マウスの脳では中程度である［２２］。内因性ＳＵＭＦ１の量は、細胞および組織における制限因子となり得る。したがって、ＭＰＳＩＩＩＡのために設計されたベクターなどの、スルファターゼを過剰発現するように設計された遺伝子治療ベクター中にＳＵＭＦ１を含めることが有利であると考えられた。
本発明者らは、ＳＵＭＦ１を発現するポリヌクレオチドを含まない本明細書に記載の第二世代ベクターであるＳＡＦ３０２が、ＳＵＭＦ１を発現するポリヌクレオチドを含む第一世代製品と比較した場合に、ＳＧＳＨの発現を増強し、ＨＳを分解する上での有効性を増大することが可能であることを見出した。
ある特定の実施形態において、本開示の遺伝子治療ベクターは、ヒトＳＧＳＨポリペプチドまたはその活性改変体をコードするポリヌクレオチド配列を含むＡＡＶ血清型ｒｈ１０ベクターである。ある特定の実施形態において、これらの遺伝子治療ベクターは、これを必要とする対象に、プロモーターによって駆動され、ＡＡＶｒｈ．１０のキャプシド中にパッケージングされる、ヒトＳＧＳＨポリペプチドまたはその活性改変体をコードするポリヌクレオチド配列を含む欠陥ＡＡＶ２ゲノムを含む複製欠損ＡＡＶｒｈ．１０ベクターで投与され得る。
ある特定の実施形態において、遺伝子治療ベクターは、プロモーター配列、エンハンサー配列、および配列内リボソーム結合部位（ＩＲＥＳ）またはポリアデニル化（ポリＡ）配列などの、正確なまたは効率的な転写または翻訳に寄与する他の配列などの追加の調節配列をさらに含む。ある特定の実施形態において、ヒトＳＧＳＨポリペプチドまたはその活性改変体をコードするポリヌクレオチド配列は、プロモーター配列に機能的に連結されている。いくつかの実施形態において、遺伝子治療ベクターはポリＡ配列を含むが、ＩＲＥＳ配列を含まない。
いくつかの実施形態において、本開示は、以下のものを５’から３’の順序で含むポリヌクレオチド配列、例えば発現カセットを含む複製欠損アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）由来ベクターを含む：
プロモーター配列；
ヒトＮ－スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ（ＳＧＳＨ）ポリペプチドまたはその活性改変体をコードするポリヌクレオチド配列；
配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列；
ヒトスルファターゼ修飾因子１（ＳＵＭＦ１）ポリペプチドまたはその活性改変体をコードするポリヌクレオチド配列；および
ポリアデニル化（ポリＡ）配列。
ある特定の実施形態において、ベクターは、ＡＡＶ２ ＩＴＲおよびＡＡＶｒｈ．１０キャプシドまたは血清型をさらに含む。
本開示は、本明細書中に記載されているが、ヒトＮ－スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ（ＳＧＳＨ）ポリペプチドまたはその活性改変体をコードするポリヌクレオチド配列とヒトスルファターゼ修飾因子１（ＳＵＭＦ１）ポリペプチドまたはその活性改変体をコードするポリヌクレオチド配列の位置が入れ替わっている発現カセットの使用も含む。
特定の実施形態において、本開示は、以下のものを５’から３’の順序で含むポリヌクレオチド配列、例えば発現カセットを含む複製欠損アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）由来ベクターを含む：
プロモーター配列；
ヒトＮ－スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ（ＳＧＳＨ）ポリペプチドまたはその活性改変体をコードするポリヌクレオチド配列；および
ポリアデニル化（ポリＡ）配列；
前記ベクターはＳＵＭＦ１をコードするポリヌクレオチド配列を含まず、ＩＲＥＳ配列を含まない。
ある特定の実施形態において、ベクターは、ＡＡＶ２ ＩＴＲおよびＡＡＶｒｈ．１０キャプシドまたは血清型をさらに含む。
様々な適切なプロモーター配列、ＩＲＥＳ配列、およびポリＡ配列が当技術分野で公知および利用可能であり、本開示に従っていずれを使用してもよい。
ある特定の実施形態において、プロモーターは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーター（例えば、脳特異的または神経組織特異的または神経細胞特異的プロモーター）、または対象にとって内因性のプロモーターである。構成的プロモーターの例としては、ＣＭＶ初期エンハンサー／ニワトリβアクチン（ＣＡＧ）プロモーター、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（必要に応じて、ＲＳＶエンハンサーを有する）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（必要に応じて、ＣＭＶエンハンサーを有する）、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸還元酵素プロモーター、β－アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターおよびＥＦ１αプロモーター［ｌｎｖｉｔｒｏｇｅｎ］が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、プロモーターは、例えばマウスＰＧＫプロモーターなどの哺乳動物ＰＧＫプロモーターである。いくつかの実施形態において、プロモーターはＣＡＧプロモーターであり、ＣＡＧプロモーターは、ＣＭＶ ＩＥエンハンサー、ＣＢプロモーター、ＣＢＡエクソン１、ＣＢＡイントロン、ウサギβイントロンおよびウサギβグロビンエクソン２を有する。本開示は、ＳＧＳＨまたはその活性断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む改良された遺伝子治療ベクターを提供し、ここで第一世代製品のＰＧＫプロモーターはＣＡＧプロモーターで置き換えられている。いくつかの実施形態において、ＣＡＧプロモーターは、ＳＧＳＨ配列に機能的に連結されている。いくつかの実施形態において、ＰＧＫプロモーターをＣＡＧプロモーターで置換すると、驚くべきことに、ＳＧＳＨの著しく増強された発現がもたらされる。
外因的に供給されるプロモーターによって調節される誘導性プロモーターの例としては、亜鉛誘導性メタロチオニン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｉｎｅ）（ＭＴ）プロモーター、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）誘導性マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、エクジソン昆虫プロモーター、テトラサイクリン抑制系およびテトラサイクリン誘導系が挙げられる。誘導性プロモーターおよび誘導系は、限定されないが、ｌｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣｌｏｎｔｅｃｈおよびＡｒｉａｄを含む様々な商業的供給源から入手可能である。多くの他の系が記載されており、当業者によって容易に選択され得る。
ＩＲＥＳ（配列内リボソーム進入部位）は、翻訳機構がｍＲＮＡ内に動員されることを可能にする構造的ＲＮＡ要素であり、一方、翻訳開始の主要経路は、５’末端がキャップされたｍＲＮＡ上にリボソームを動員する。
ポリ（Ａ）シグナルは、ポリＡテールをｍＲＮＡ上に３’付加するために細胞によって使用される。このテールは、ｍＲＮＡの核外輸送、翻訳および安定性にとって重要である。いくつかの実施形態において、ポリＡ単位はヒト成長ホルモン１ポリＡ単位である。
本開示のベクターの特定の実施形態において、プロモーター配列はＣＡＧプロモーター配列に由来し、および／またはポリＡ配列はヒト成長ホルモン１ポリＡ配列に由来する。
一実施形態において、発現カセットは、以下の５’から３’の順序で、
ＣＡＧプロモーター配列に由来するプロモーター配列；
ヒトＮ－スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ（ＳＧＳＨ）ポリペプチドまたはその活性改変体をコードするポリヌクレオチド配列；および
ヒト成長ホルモンポリＡ配列に由来するポリＡ配列と、を含む。
本開示のベクターの特定の実施形態において、発現カセットは２つのＡＡＶ内部末端反復（ＩＴＲ）配列、例えば、ＡＡＶ２ ＩＴＲに隣接し、２つのＡＡＶ ＩＴＲ配列の１つは発現カセットの５’に位置し、２つのＡＡＶ ＩＴＲ配列の１つは発現カセットの３’に位置する。ＩＴＲ配列は、それぞれ約１４５塩基を含む。ＩＴＲ配列は、その対称性のためにこのように命名され、対照性がＡＡＶゲノムの効率的な増殖のために必要であることが示された。これらの配列の別の特性は、いわゆるセルフプライミングに寄与し、第２のＤＮＡ鎖のプライマーゼ非依存性合成を可能にするヘアピンを形成する能力である。ＡＡＶ ＩＴＲは、ゲノム複製およびパッケージングのために必要とされる唯一のシス作用性エレメントである。
特定の一実施形態において、本開示は、以下のものを５’から３’の順序で含むポリヌクレオチド配列を含むベクターを含む：
ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列；
ＣＡＧプロモーター配列；
ヒトＮ－スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ（ＳＧＳＨ）ポリペプチドまたはその活性改変体をコードするポリヌクレオチド配列；
ヒト成長ホルモンポリＡ配列；および
ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列。
第１世代のＳＡＦ３０１ベクターの概略図が図１に示されている。第２世代のＳＡＦ３０２ベクターである本開示のベクター構築物の概略図が図３に示されている。
本開示は、本開示の遺伝子治療ベクターを含む、薬学的組成物を含む組成物、およびその単位投与量をさらに含む。
一実施形態において、本開示は、本明細書に記載されている遺伝子治療ベクターと、薬学的に許容され得る、担体、希釈剤または賦形剤とを含む組成物を含む。このような組成物は、薬学的組成物と呼ばれることがある。特定の一実施形態において、薬学的に許容され得る、担体、希釈剤または賦形剤は、無菌および／またはＧＭＰ臨床グレードであり得るリン酸緩衝生理食塩水溶液である。特定の一実施形態において、本開示の組成物は、以下のものを５’から３’の順序で含むポリヌクレオチド配列を含むベクターを含む：
ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列；
ＣＡＧプロモーター配列；
ヒトＮ－スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ（ＳＧＳＨ）ポリペプチドまたはその活性改変体をコードするポリヌクレオチド配列；
ヒト成長ホルモン１ポリＡ配列；および
ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列、
前記ベクターは、無菌および／またはＧＭＰ臨床グレードであり得るリン酸緩衝生理食塩水溶液中に懸濁される。
ある特定の実施形態において、本開示の組成物中に存在するベクターの濃度は、約１×１０１０ｇｃ／ｍｌ～約１×１０１４ｇｃ／ｍｌ、約１×１０１１ｇｃ／ｍｌ～約１×１０１３ｇｃ／ｍｌまたは約５×１０１１ｇｃ／ｍｌ～約５および１０１２ｇｃ／ｍｌである。例えば、いくつかの実施形態において、組成物中に存在するベクターの濃度は、約１．９×１０１２ｇｃ／ｍＬ～約３．２×１０１２ｇｃ／ｍＬまたは約２．４×１０１２ｇｃ／ｍＬである。
特定の実施形態において、本開示の単位剤形は、約１００μｌ～２ｍＬの本開示の組成物を含有するバイアルを含む。ある特定の実施形態において、単位剤形は、約１．２ｍＬの組成物を含有するバイアルを含む。特定の実施形態において、単位剤形中に存在するベクターの量は、約０．０５×１０１２ｇｃ～約３×１０１２ｇｃ、または約０．１×１０１２ｇｃ～約０．５×１０１２ｇｃ、または約０．１×１０１２ｇｃ～約２×１０１２ｇｃである。
ポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列
ある特定の実施形態において、本開示は、本明細書に記載されている発現カセットを含むまたはこれからなるポリヌクレオチド配列、ならびに本明細書に記載されている発現カセットのいずれかを含むプラスミドおよびベクターを含む。さらに、本開示は、本開示のポリヌクレオチド配列、ベクターまたはプラスミドのいずれかを含む細胞を含む。当業者は、当技術分野における標準的な分子生物学技術および知識を使用して、本開示のポリヌクレオチド配列、ベクターおよび宿主細胞を容易に作製することができる。
本開示のポリヌクレオチドの成分、例えば発現カセットのポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列は公知である。
マウスＰＧＫプロモーター配列は、ＮＣＢＩ参照番号ＭＩ８７３５位置＋４１９～＋９２４に、および配列番号１の位置＋４１９～＋９２４に提供される。
ＩＲＥＳ配列は、ＮＣＢＩ参照番号ＮＣ００１４７９位置＋１３～＋５７５に、および配列番号２の位置＋１３～＋５７５に提供される。
ウシ成長ホルモンポリＡ配列は、ＮＣＢＩ参照番号Ｍ５７７６４位置＋２３２６～＋２５３３に、および配列番号３の位置＋２３２６～＋２５３３に提供される。
ＣＡＧプロモーター配列は、配列番号１２として、および／または配列番号９の位置１２５～１８６２として提供される。
ヒト成長ホルモン１ポリＡ配列は、配列番号１７として、および／または配列番号９の位置３４１４～３９２３として提供される。
Ｎ－スルホグリコサミンスルホヒドロラーゼ（ＳＧＳＨ；スルファミダーゼとも呼ばれる。）は、サンフィリポＡ型症候群（ＭＰＳＩＩＩＡ、ＯＭＩＭ＃２５２９００）に関与する欠損したタンパク質である。Ｎ－スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ（ＳＧＳＨ、ＥＣ３．１０．１．１、ＭＩＭ６０５２７０）は、ヘパラン硫酸（ＨＳ）と呼ばれるグリコサミノグリカンのファミリーの段階的分解のために必要なリソソーム加水分解酵素のファミリーに属する。ＳＧＳＨは、ヘパラン硫酸分解の第３の工程に関与する。ＳＧＳＨは、ＨＳの非還元末端グルコサミニド残基からのＮ結合型サルファートの加水分解を触媒する。野生型ヒトＮ－スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼｃＤＮＡ配列は、ＮＣＢＩ参照番号Ｕ３０８９４位置＋１２～＋１５２１に、および配列番号４の位置＋１２～＋１５２１に提供される。野生型ヒトＮ－スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼポリペプチド配列は、ＮＰ＿０００１９０．１（配列番号５）に提供される。野生型ヒトスルファターゼ修飾因子１のｃＤＮＡ配列は、ＮＣＢＩ参照番号ＡＹ２０８７５２位置＋１～＋１１２５に、および配列番号６の位置＋１～＋１１２５に提供される。野生型ヒトスルファターゼ修飾因子１ポリペプチド配列は、ＮＰ＿８７７４３７．２（配列番号７）に提供される。特定の実施形態において、ＳＧＳＨおよびＳＵＭＦ１ポリペプチドはそれらのシグナル配列を含むが、他の実施形態において、一方または両方はシグナル配列を含まない。いくつかの実施形態において、ＳＧＳＨ配列は、配列番号１３としておよび／または配列番号９のアミノ酸１８６７～３４０１として提供される。
ＡＡＶｃａｐ配列は当技術分野で公知である。例示的なＡＡＶｒｈ．１０ｃａｐポリヌクレオチド配列が、国際公開第２００３／０４２３９７号において配列番号５９として提供されており、この配列は、ヌクレオチド８４５～３０６１におけるＶＰ１、ヌクレオチド１２５６～３０６１におけるＶＰ２および１４５４～３０６１におけるＶＰ３をコードする。例示的なＡＡＶｒｈ．１０ｃａｐポリペプチド配列が、国際公開第２００３／０４２３９７号の配列番号８１のアミノ酸１～７３８として提供されており、ＶＰ１配列はアミノ酸１～７３８にあり、ＶＰ２はアミノ酸１３８～７３８にあり、ＶＰ３はアミノ酸２０３～７３８にある。
いくつかの実施形態において、図１に例示される本開示の１つの発現カセットおよび隣接するＩＴＲのポリヌクレオチド配列は、配列番号８として提供されている。いくつかの実施形態において、図３に例示される本開示の１つの発現カセットおよび隣接するＩＴＲのポリヌクレオチド配列は、図４Ａ～４Ｂおよび配列番号９に提供されている。いくつかの実施形態において、配列番号９を含有する完全プラスミドｐ－Ｌｙｓ－ＳＡＦ－Ｔ－５のポリヌクレオチドは、図４Ｃ～４Ｄおよび配列番号１４に提供される。
ある特定の実施形態において、発現カセットを含むポリヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチド配列の複製または産生を促進するために、ベクターまたはプラスミド、例えばクローニングベクターまたは発現ベクター中に存在する。本開示のポリヌクレオチド配列は、ＩＴＲ配列の境界にある適合性制限部位または制限部位を含有するＤＮＡリンカー配列、および当業者に公知の他の方法の利用を通じてベクター中に挿入され得る。発現カセットの挿入のために、分子生物学で日常的に使用されるプラスミド、例えば、ｐＢＲ３２２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．）、ｐＲｅｐ９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、ｐＢＳ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）などが骨格として使用され得る。
本開示のベクターまたはプラスミドは、例えば、臨床使用のための遺伝子治療ベクターまたはウイルス粒子を産生するために宿主細胞中に存在し得る。特定の実施形態において、本開示は、本開示の発現カセットを含むベクターまたはプラスミドを含む細胞を含む。特定の実施形態において、宿主細胞は、例えば、ＳＶ４０Ｔ抗原を含有する２９３細胞の高度に形質移入可能な誘導体である２９３Ｔ細胞などの２９３ヒト胎児腎臓細胞である。他のベクター、宿主細胞およびウイルスベクターを作製する方法の例は、Ｋｏｔｉｎ ＲＭ，Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ，２０１１ Ａｐｒ １５；２０（Ｒ１）：Ｒ２－６．Ｅｐｕｂ ２０１１ Ａｐｒ ２９）に記載されている。
さらなる実施形態において、本開示は、本開示の発現カセットのいずれかを含む遺伝子治療ベクターまたはウイルス粒子であって、前記遺伝子治療ベクターまたはウイルス粒子は、キャプシド、例えばＡＡＶｒｈ．１０キャプシドを含む、遺伝子治療ベクターまたはウイルス粒子を含む。特定の実施形態において、キャプシドは、１またはそれを超えるＡＡＶｒｈ．１０キャプシドポリペプチドを含む。
ある特定の実施形態において、本開示のポリヌクレオチド、発現カセットおよびベクターは、１またはそれを超える活性ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の活性改変体、例えばプロモーター配列、ＩＲＥＳ配列もしくはポリＡ配列の活性改変体、またはＳＧＳＨポリペプチドもしくはＳＵＭＦ１ポリペプチドの活性改変体を含み得る。活性改変体は、生物学的に活性な改変体と、参照配列と呼ばれ得る本明細書で提供される配列のいずれかの生物学的に活性な断片の両方を含む。特定の実施形態において、参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の活性改変体は、初期設定パラメータを使用して本明細書の他の箇所に記載されている配列アラインメントプログラムによって決定される場合、参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に対して少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、一般に少なくとも７５％、８０％、８５％、通常は約９０％～９５％またはそれを超える、典型的には約９７％または９８％または９９％またはそれを超える配列類似性または同一性を有する。例えば、いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書に提供される任意の配列、例えば配列番号９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６および／または１７と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを提供する。
ある特定の実施形態において、ＳＧＳＨまたはＳＵＭＦ１をコードするポリヌクレオチド配列の活性改変体は、遺伝暗号の縮重のために野生型または天然に存在する遺伝子またはｃＤＮＡ配列とは異なる。したがって、ポリヌクレオチド配列は野生型とは異なるが、コードされるＳＧＳＨまたはＳＵＭＦ１ポリペプチドは野生型配列を保持する。したがって、本開示は、ＳＧＳＨもしくはＳＵＭＦ１ポリペプチドまたはその中の活性改変体をコードする任意のポリヌクレオチド配列の使用を企図する。
他の実施形態において、それ自体が活性であるポリヌクレオチド配列、例えばＩＲＥＳまたはポリＡ配列の活性改変体は、その対応する野生型参照配列と配列が異なり得るが、その天然の活性を保持している。参照ポリヌクレオチド配列の活性改変体は、一般に２００、１００、５０または２０ヌクレオチド残基、または適切にはわずか１～１５ヌクレオチド残基、わずか１～１０、例えば６～１０、わずか５、わずか４、３、２、またはさらには１ヌクレオチド残基だけその配列と異なり得る。
ある特定の実施形態において、ポリペプチドの活性改変体は生物学的に活性である、すなわち、参照ポリペプチドの酵素活性を保持し続ける。このような改変体は、例えば、遺伝子多型および／またはヒトの操作から生じ得る。参照ポリペプチドの活性改変体は、一般に２００、１００、５０または２０ものアミノ酸残基、または適切にはわずか１～１５アミノ酸残基、わずか１～１０、例えば６～１０、わずか５、わずか４、３、２、または１アミノ酸残基だけそのポリペプチドと異なり得る。いくつかの実施形態において、改変体ポリペプチドは、少なくとも１つだけ、但し１５、１０または５未満のアミノ酸残基だけ本明細書で言及される参照配列と異なる。他の実施形態において、改変体ポリペプチドは、少なくとも１つの残基だけ、但し残基の２０％、１５％、１０％または５％未満参照配列と異なる。
参照ポリペプチドは、活性改変体を作製するために、アミノ酸置換、欠失、切断および挿入を含む様々な方法で改変され得る。このような操作方法は、本分野において一般に公知である。例えば、参照ポリペプチドのアミノ酸配列改変体は、ＤＮＡ中の変異によって調製することができる。突然変異導入およびヌクレオチド配列改変のための方法は、本分野において周知である。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８２：４８８－４９２）、Ｋｕｎｋｅｌら、（１９８７，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ，１５４：３６７－３８２）、米国特許第４，８７３，１９２号、Ｗａｔｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ら、（’’Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ’’，Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ，Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，Ｃａｌｉｆ．，１９８７）およびこれらの中に引用されている参考文献を参照。目的のタンパク質の生物学的活性に影響を与えない適切なアミノ酸置換についての指針は、Ｄａｙｈｏｆｆら、（１９７８）Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）のモデル中に見出され得る。
ある特定の実施形態において、ポリペプチド改変体は、参照ポリペプチド配列と比較して、その配列に沿った様々な位置に保存的アミノ酸置換を含有する。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されたものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当技術分野において定義されており、一般に以下のように下位分類することができる。
酸性：残基は生理学的ｐＨでのＨイオンの喪失に起因して負電荷を有し、残基は水溶液によって引きつけられて、ペプチドが生理学的ｐＨで水性媒体中に存在するときに、残基がその中に含有されるペプチドの立体構造中で表面位置を求める。酸性側鎖を有するアミノ酸には、グルタミン酸およびアスパラギン酸が含まれる。塩基性：残基は、生理学的ｐＨまたはその１もしくは２ｐＨ単位内でのＨイオンとの会合に起因して（例えば、ヒスチジン）正電荷を有し、残基は水溶液によって引きつけられて、ペプチドが生理学的ｐＨで水性媒体中に存在するときに、残基がその中に含有されるペプチドの立体構造中で表面位置を求める。塩基性側鎖を有するアミノ酸には、アルギニン、リジンおよびヒスチジンが含まれる。
荷電：残基は生理学的ｐＨで帯電しており、したがって酸性または塩基性側鎖を有するアミノ酸（すなわち、グルタミン酸、アスパラギン酸、アルギニン、リジンおよびヒスチジン）が含まれる；
疎水性：残基は生理学的ｐＨで帯電しておらず、残基は水溶液によってはじかれて、ペプチドが水性媒体中に存在するときに、残基がその中に含有されるペプチドの立体構造中で内側の位置を求める。疎水性側鎖を有するアミノ酸としては、チロシン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニンおよびトリプトファンが挙げられ；
中性／極性：残基は生理学的ｐＨで帯電していないが、残基は水溶液によって十分にははじかれず、ペプチドが水性媒体中に存在するときに、残基がその中に含有されるペプチドの立体構造中で内側の位置を求めるであろう。中性／極性側鎖を有するアミノ酸には、アスパラギン、グルタミン、システイン、ヒスチジン、セリンおよびトレオニンが含まれる。
アミノ酸残基は、さらに、その残基の側鎖置換基に関して、環状または非環状、および芳香族または非芳香族の一目瞭然の分類として、および小さいまたは大きいとして下位分類することができる。追加の極性置換基が存在するならば、残基がカルボキシル炭素を含めて合計４個またはそれ未満、存在しなければ３個またはそれ未満の炭素原子を含有すれば、残基は小さいとみなされる。小さな残基は、もちろん、常に非芳香族である。それらの構造特性に応じて、アミノ酸残基は２またはそれを超えるクラスに分類され得る。天然に存在するタンパク質アミノ酸について、このスキームによる下位分類を表１に示す。
表１．アミノ酸下位分類
Figure 2022551792000002
保存的アミノ酸置換には、側鎖に基づく群分けも含まれる。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンである；脂肪族－ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群は、セリンおよびトレオニンである；アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群は、アスパラギンおよびグルタミンである；芳香族側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンである；塩基性側鎖を有するアミノ酸の群は、リジン、アルギニンおよびヒスチジンである；硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の群は、システインおよびメチオニンである。例えば、ロイシンをイソロイシンもしくはバリンで置換すること、アスパラギン酸をグルタミン酸で置換すること、トレオニンをセリンで置換すること、またはアミノ酸を構造的に関連するアミノ酸で同様に置換することは、得られる改変体ポリペプチドの特性に大きな影響を及ぼさないと予想することが合理的である。アミノ酸変化が機能的な切断型ポリペプチドおよび／または改変体ポリペプチドをもたらすかどうかは、本明細書に記載されるように、その酵素活性をアッセイすることによって容易に決定することができる。例示的置換という見出しの表２中に、保存的置換を示す。本開示の範囲内に属するアミノ酸置換は、一般に、（ａ）置換の領域中のペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩を維持することに対する効果が著しく異ならない置換を選択することによって達成される。置換が導入された後、生物学的活性について改変体をスクリーニングする。
表２．例示的なアミノ酸置換
Figure 2022551792000003
したがって、参照ポリペプチド中の予測される非必須アミノ酸残基は、典型的には、同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基で置換される。「非必須」アミノ酸残基は、実施形態ポリペプチドの活性の１つまたはそれより多くを消失させるまたは実質的に変更することなく、実施形態ポリペプチドの野生型配列から変更することができる残基である。適切には、改変は、これらの活性の１つを実質的に消失させない、例えば、活性は野生型の少なくとも２０％、４０％、６０％、７０％または８０％、１００％、５００％、１０００％またはそれを超える。「必須」アミノ酸残基は、参照ポリペプチドの野生型配列から変更された場合に、野生型活性の２０％未満が存在するように親分子の活性の消滅をもたらす残基である。例えば、このような必須アミノ酸残基には、様々な供給源由来の参照ポリペプチドの酵素部位において保存されているものが含まれ得る。
ある特定の実施形態において、本開示は、天然に存在する参照ポリペプチド配列の活性改変体であって、前記改変体が、１またはそれを超えるアミノ酸残基の付加、欠失または置換によって天然に存在する配列と区別される、天然に存在する参照ポリペプチド配列の活性改変体も企図する。ある特定の実施形態において、ポリペプチドの活性改変体は、本明細書に記載されている参照ポリペプチドの対応する配列と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％ ９５％、９６％、９７％、９８％またはそれを超える配列同一性または類似性を有するアミノ酸配列を含み、その参照ポリペプチドの酵素活性を保持する。
配列間の配列類似性または配列同一性（これらの用語は、本明細書では交換可能に使用される）の計算は、以下のように行われる。２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列のパーセント同一性を決定するために、最適な比較目的のために配列を並列する（例えば、最適な並列のために第１および第２のアミノ酸または核酸配列の一方または両方にギャップを導入することができ、比較目的のために非相同配列を無視することができる。）。ある特定の実施形態において、比較目的のために並列される参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、６０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、８０％、９０％、１００％である。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置にあるアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列中の位置が、第２の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占められている場合、分子はその位置において同一である。
２つの配列間のパーセント同一性は、これらの配列によって共有される同一の位置の数の関数であり、２つの配列の最適な並列のために導入する必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮する。
配列の比較および２つの配列間のパーセント同一性の決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。一実施形態において、２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、Ｂｌｏｓｓｕｍ ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、および１６、１４、１２、１０、８、６または４のギャップ重みおよび１、２、３、４、５または６の長さ重みを使用し、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラム中に組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ．（１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４－４５３）アルゴリズムを使用して決定される。さらに別の好ましい実施形態において、２つのヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスおよび４０、５０、６０、７０または８０のギャップ重みおよび１、２、３、４、５または６の長さ重みを使用し、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムを使用して決定される。特に好ましいパラメータのセット（および特に明記しない限り使用されるべきパラメータのセット）は、１２のギャップペナルティ、４のギャップ拡張ペナルティおよび５のフレームシフトギャップペナルティでのＢｌｏｓｓｕｍ ６２スコアリングマトリックスである。
遺伝子治療ベクターを製造する方法
本開示の遺伝子治療ベクターは、当技術分野で公知であり、例えば国際公開第０３０４２３９７号および米国特許第６，６３２，６７０号に以前に記載された方法によって作製され得る。
ＡＡＶゲノムは、一本鎖デオキシリボ核酸（ｓｓＤＮＡ）であり、ポジティブセンスまたはネガティブセンスのいずれかであり、約４．７キロベース長である。ゲノムは、ＤＮＡ鎖の両端にあるＩＴＲと、２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）：ｒｅｐおよびｃａｐとを含む。Ｒｅｐは、ＡＡＶライフサイクルに必要とされるＲｅｐタンパク質をコードする４つの重複遺伝子を含み、ｃａｐは、相互作用して正二十面体対称性のキャプシドを形成するキャプシドタンパク質：ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３をコードする重複ヌクレオチド配列を含む。
ＩＴＲは、ＡＡＶ ＤＮＡの宿主細胞ゲノム中への組み込みおよび宿主細胞ゲノムからの救出の両方、ならびにＡＡＶ ＤＮＡの効率的なキャプシド形成および完全に組み立てられたＡＡＶ粒子の生成のために必要とされると考えられる。遺伝子治療に関して、ＩＴＲは、治療遺伝子の隣にシスで必要とされる唯一の配列であると思われ、構造（ｃａｐ）およびパッケージング（ｒｅｐ）遺伝子はトランスで送達することができる。したがって、治療遺伝子を含有する組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターの作製のために確立された特定の方法は、２つまたは３つのプラスミドの使用を伴う。特定の実施形態において、第１のプラスミドは、隣接するＩＴＲを含有する治療用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現カセットを含む。いくつかの実施形態において、第２のプラスミドは、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子と、隣接するＩＴＲとを含む。いくつかの実施形態において、第３のプラスミドは、ヘルパー機能（例えば、アデノウイルス血清型５から）を提供する。組換えＡＡＶベクターストックを作製するために、標準的なアプローチは、治療用ポリペプチドをコードするＡＡＶベクタープラスミドとともに、適切な細胞を同時形質移入するために使用されるプラスミド上のＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子産物を提供する。いくつかの実施形態において、標準的なアプローチは、治療用ポリペプチドをコードするＡＡＶベクタープラスミドとともにおよびヘルパー機能を提供するプラスミドとともに、適切な細胞を同時形質移入するために使用されるプラスミド上のＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子産物を提供する。
特定の実施形態において、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子は、ＡＡＶ ＩＴＲ配列を含有する複製プラスミド上に提供される。いくつかの実施形態において、ｒｅｐタンパク質は、複製起点としてＩＴＲを活性化し、プラスミドの複製をもたらす。複製起点には、ＳＶ４０複製起点、エプスタイン・バー（ＥＢＶ）複製起点、ＣｏｌＥ１複製起点の他、当業者に公知の他のものが含まれ得るが、これらに限定されない。例えば、複製起点が活性化タンパク質を必要とする場合、例えばＴ抗原を必要とするＳＶ４０起点、ＥＢＮＡタンパク質を必要とするＥＢＶ起点、活性化タンパク質は、細胞株源、例えば２９３Ｔ細胞を作製するための安定な形質移入によって、または適切な遺伝子を含有するプラスミドでの一過性形質移入によって提供され得る。
他の実施形態において、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子は、複製起点を含有しない非複製プラスミド上に提供され得る。このような非複製プラスミドは、ウイルスの産生を最適化するために、細胞の複製装置が組換えＡＡＶゲノムを複製することに向けられることをさらに確実にする。このような非複製プラスミドによってコードされるＡＡＶタンパク質のレベルは、これらの遺伝子の発現を駆動するための特定のプロモーターの使用によって調節され得る。このようなプロモーターには、とりわけ、ＡＡＶプロモーターの他、外因性供給源、例えばＣＭＶ、ＲＳＶ、ＭＭＴＶ、Ｅ１Ａ、ＥＦ１ａ、アクチン、サイトケラチ１４、サイトケラチン１８、ＰＧＫ、当業者に公知の他のものからのプロモーターが含まれる。これらのヘルパープラスミドによって産生されるｒｅｐおよびｃａｐタンパク質のレベルは、所望のタンパク質のレベルに最も適した各遺伝子に対するプロモーターを選択することによって個別に調節され得る。
本開示のウイルスベクターを作製するために使用されるヘルパープラスミドを構築するために、遺伝子およびＡＡＶ ＩＴＲ配列（使用される場合）の境界にある適合性制限部位または制限部位を含有するＤＮＡリンカー配列の利用ならびに当業者に公知の他の方法など、標準的な組換えＤＮＡ技術が使用され得る（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．ら、ｅｄｓ．，Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９９５参照）。
一実施形態において、本開示の遺伝子治療ベクターは、２９３または２９３Ｔヒト胎児腎臓細胞株中への２つまたは３つのプラスミドの形質移入によって作製される。いくつかの実施形態において、治療遺伝子をコードするＤＮＡは、１つのプラスミドによって提供され、キャプシドタンパク質（ＡＡＶｒｈ．１０）、複製遺伝子（ＡＡＶ２由来）およびヘルパー機能（アデノウイルス血清型５由来）は全て、第２のプラスミドによってトランスで提供される。いくつかの実施形態において、治療遺伝子をコードするＤＮＡは１つのプラスミドによって提供され、キャプシドタンパク質（ＡＡＶｒｈ．１０由来）および複製遺伝子（ＡＡＶ２由来）は第２のプラスミドによってトランスで提供され、ヘルパー機能（アデノウイルス血清型５由来）は第３のプラスミドによって提供される。特定の実施形態において、第１のプラスミドは、隣接するＩＴＲを含む本開示の発現カセットを含む。
細胞培養後、遺伝子治療ベクターは、凍結融解サイクルによって細胞から放出され、イオジキサノールステップグラジエント、続いてＨｉ－Ｔｒａｐ ＱＨＰカラムでのイオン交換クロマトグラフィーによって精製される。得られた遺伝子治療ベクターは、スピンカラムによって濃縮され得る。精製されたベクターは、例えばリン酸緩衝生理食塩水中で凍結（－６０℃またはそれ未満で）保存され得る。
最終的な調合されたベクターの特徴付けは、キャプシドタンパク質に対するＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット、導入遺伝子ＤＮＡに対するリアルタイムＰＣＲ、機能的遺伝子導入に対するウエスタン分析、インビボおよびインビトロの一般的および特異的な外来性ウイルスならびに酵素アッセイを通じて達成され得る。
処置の方法
本開示は、脳の疾患および障害、神経学的疾患および障害、ならびにＭＰＳなどのリソソーム蓄積症を含むがこれらに限定されない遺伝性疾患および障害を処置する方法を含む。
ある特定の実施形態において、本開示は、ＭＰＳＩＩＩＡ（サンフィリポ症候群）を処置する方法であって、ＭＰＳＩＩＩＡ（サンフィリポ症候群）を処置することを必要とする対象に、対象の細胞によって取り込まれた場合にＳＧＳＨを発現するように設計された遺伝子治療ベクターを含む組成物を提供することを含む方法を提供する。特定の実施形態において、組成物は、薬学的に許容され得る、担体、賦形剤または希釈剤、例えばリン酸緩衝生理食塩水をさらに含む。ある特定の実施形態において、対象は、ヒトなどの哺乳動物である。特定の実施形態において、例えば、対象のＮ－スルホグリコサミンスルホヒドロラーゼ（ｓｇｓｈ）遺伝子中の変異を同定するための遺伝子検査を通じて、または対象から得られた生物学的試料からＳＧＳＨ活性を測定することによって、対象はＭＰＳＩＩＩＡと診断されている。いくつかの実施形態において、本明細書に提供される方法は、対象の脳全体にわたって、正常なＳＧＳＨ活性の少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％またはそれより多くを回復させる。
特定の実施形態において、遺伝子治療ベクターは、本開示の任意の発現カセットを含む。したがって、特定の実施形態において、本開示は、ＭＰＳＩＩＩＡを処置することを必要とする対象に、以下のものを５’から３’の順序で含む発現カセットを含む遺伝子治療ベクターを含む組成物を投与することによって、ＭＰＳＩＩＩＡを処置する方法を含む：
プロモーター配列；
ヒトＮ－スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ（ＳＧＳＨ）ポリペプチドまたはその活性改変体をコードするポリヌクレオチド配列；および
ポリアデニル化（ポリＡ）配列。
いくつかの実施形態において、遺伝子治療ベクターはＳＵＭＦ１をコードするポリヌクレオチド配列を含まず、ＩＲＥＳ配列を含まない。
一実施形態において、発現カセットはＩＴＲに隣接しており、したがってベクターは以下のものを５’から３’の順序で含む：
ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列；
ＣＡＧプロモーター配列；
ヒトＮ－スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ（ＳＧＳＨ）ポリペプチドまたはその活性改変体をコードするポリヌクレオチド配列；
ヒト成長ホルモンポリＡ配列；および
ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列。
特定の実施形態において、ＳＧＳＨポリペプチドは、野生型ヒトＳＧＳＨポリペプチドを含むかまたはこれからなり、特定の実施形態において、発現カセットおよび隣接ＩＴＲは、配列番号９に示されるポリヌクレオチド配列を含む。
ある特定の実施形態において、遺伝子治療ベクターを含む組成物は、対象の脳に投与される。例えば、いくつかの実施形態において、遺伝子治療ベクターを含む組成物は、脳実質中への直接注射によって投与される。ある特定の実施形態において、遺伝子治療ベクターを含む組成物は脳内に投与される。一実施形態において、遺伝子治療ベクターを含む組成物は脳内注射によって脳内に直接投与される。この技術は、ベクター送達を制御するために、選択的な神経解剖学的部位を標的とすることを可能にする。
いかなる特定の理論にも束縛されることを望むものではないが、脳実質中に注射すると、ＡＡＶベクター粒子は局所的に拡散し、軸索に沿って遠隔の解剖学的脳構造にも輸送され得ると考えられる。ベクター粒子は、神経細胞、膠細胞またはミクログリア細胞によって内部に取り込まれる。これらの細胞型の各々は、ＭＰＳＩＩＩＡ患者においてＳＧＳＨ酵素を欠損しており、未分解のヘパラン硫酸異化産物の有毒な蓄積に見舞われる。細胞内に入ると、ＳＧＳＨタンパク質をコードする組換えゲノムは核の中に輸送され、そこで二本鎖デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子としてその安定な確立をもたらす一連の分子的変換を受ける。このＤＮＡは、細胞機構によってメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）へと活発に転写される。ｍＲＮＡはＳＧＳＨへと翻訳され、ＳＧＳＨは細胞欠乏を補完する。
酵素補完およびリソソーム蓄積の矯正は、２つの異なる機構によって起こると考えられている。（１）酵素は、ＡＡＶによって運ばれる導入遺伝子を含有および発現し、蓄積した異化産物を分解する細胞のリソソームに到達し得る；または（２）酵素は、これらの細胞の外側に放出され、離れた細胞によって再捕捉され、離れた細胞のリソソームに送られ得る。したがって、遺伝子改変された細胞の限られた群が、広範囲の脳領域の矯正を可能にする。形質導入された細胞は、酵素を継続的に発現および送達し、したがって、酵素産生の脳内永久供給源を構成する。
特定の実施形態において、脳内投与は、対象の脳内の１またはそれを超える部位、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２の部位において行われる。投与は、脳の一方または両方の側に実施され得る。例えば、遺伝子治療ベクターが脳の２またはそれを超える部位に投与される場合には、遺伝子治療ベクターは脳の両側に、例えばそれぞれの側の類似または同一の位置に投与され得る。特定の実施形態において、遺伝子治療ベクターは、右前側、左前側、右内側、左内側、右後側および左後側から選択される対象の脳内の１またはそれを超える部位に投与される。
ある特定の実施形態において、脳内投与は、被殻に隣接する白質中に存在し得る１またはそれを超える穿頭孔を通して行われる。特定の実施形態において、遺伝子治療ベクターは、単一の穿頭孔を通して脳または白質内の２またはそれを超える部位に投与される。例えば、遺伝子治療ベクターの２またはそれを超える沈着物（ｄｅｐｏｓｉｔｓ）は、単一の穿頭孔または穿頭路を通して投与され得、一方は深部であり、他方は表層であり、これは実質の（ｐａｒｅｎｃｈｙｍａｌ）拡散を増強し得る。ある特定の実施形態において、深部注射は、皮質表面から約１．５ｃｍ～約３．０ｃｍ、または約１．７ｃｍ～約２．５ｃｍ、または約２ｃｍの深さで行われる。ある特定の実施形態において、表層注射は、皮質表面から約０．５ｃｍ～約２．０ｃｍ、または約０．７ｃｍ～約１．５ｃｍ、または約１ｃｍの深さで行われる。
ある特定の実施形態において、遺伝子治療ベクターは脳内注射を介して投与され、注射は単一の深さで行われる。いくつかの実施形態において、遺伝子治療ベクターは、単一の深さでの両側注射を介して投与される。例えば、いくつかの実施形態において、遺伝子治療ベクターは、脳内注射を介して、対象の脳内の２、４、６、８、１０、１２、１４、１６またはそれを超える部位に、白質中の２、４、６、８、１０、１２、１４、または１６の穿頭孔を通して投与され、遺伝子治療ベクターの単一の沈着物は各穿頭孔または穿頭路を通して投与される。いくつかの実施形態において、単一の深さでの遺伝子治療ベクターの投与は、２つの深さなどの１を超える深さでの遺伝子治療ベクターの投与よりも驚くほど優れている。理論に拘束されることを望むものではないが、遺伝子治療ベクターが単一の深度で投与される場合、２またはそれを超える深度と比較して、ベクターの拡散はより効率的である。
１つの特定の実施形態において、遺伝子治療ベクターは、脳内注射を介して、対象の脳内の６つの部位に、白質中の６つの穿頭孔を通して投与され、遺伝子治療ベクターの単一の沈着物は各穿頭孔または穿頭路を通して投与される。したがって、遺伝子治療ベクターは、各注入穿頭孔内の単一の深さで投与される。各穿頭孔内の投与の位置は、右前側、左前側、右内側、左内側、右後側および左後側から選択され得る。いくつかの実施形態において、各穿頭孔内の投与の位置は、右前側表層、右前側深部、左前側表層、左前側深部、右内側表層、右内側深部、左内側表層、左内側深部、右後側表層、右後側深部、左後側表層および左後側深部から選択され得る。いくつかの実施形態において、深部注射は、皮質表面から約１．５ｃｍ～約３．０ｃｍまたは約１．７ｃｍ～約２．５ｃｍまたは約２ｃｍの深さで行われ、表層注射は、皮質表面から約０．５ｃｍ～約２．０ｃｍまたは約０．７ｃｍ～約１．５ｃｍまたは約１ｃｍの深さで行われる。いくつかの実施形態において、深部および／または表層注射は、ＭＲＩ画像に基づいて選択され得る。いくつかの実施形態において、各注射が単一の深さで投与され、各注射が深部注射または表層注射のいずれかであるように、深部注射と表層注射の組み合わせが投与され得る。いくつかの実施形態において、対象に投与される全ての注射は深部注射である。いくつかの実施形態において、対象に投与される全ての注射は表層注射である。
注射は、単一の神経外科的セッションで達成され得る。脳内注射は、注入ポンプを使用して実施され得る。
本開示における様々な実施形態において、ゲノムコピー（ｇｃ）という用語または単位は、ウイルスゲノム（ｖｇ）という用語または単位と互換的に使用される。
ある特定の実施形態において、合計約１．０×１０１０ｇｃ～約１．０×１０１４ｇｃ、約５．０×１０１０ｇｃ～約５．０×１０１３ｇｃ、約５．０×１０１０ｇｃ～約１．０×１０１３ｇｃ、約１．０×１０１１ｇｃ～約１．０×１０１３ｇｃ、約１．０×１０１１ｇｃ～約５．０×１０１２ｇｃ、約５．０×１０１１ｇｃ～約５．０×１０１２ｇｃ、約８．０×１０１１ｇｃ～約８．０×１０１２ｇｃ、または約７．０×１０１２ｇｃ～約７．４×１０１２ｇｃのウイルスベクターが対象に投与される。特定の実施形態において、約７．２×１０１２ｇｃのウイルスベクターが対象に投与される。ある特定の実施形態において、約０．８×１０９ｇｃ～約０．８×１０１３ｇｃ、約０．４×１０１０ｇｃ～約０．４×１０１３ｇｃ、約０．４×１０１０ｇｃ～約０．８×１０１２ｇｃ、約０．８×１０１０ｇｃ～約０．８×１０１２ｇｃ、約０．８×１０１０ｇｃ～約０．４×１０１２ｇｃ、または約０．４×１０１１ｇｃ～約０．４×１０１２ｇｃのウイルスベクターが対象の各部位に投与される。特定の実施形態において、約０．６×１０１１ｇｃのウイルスベクターが対象の各部位に投与される。特定の実施形態において、約７．２×１０１１ｇｃのウイルスベクターが対象に投与されるように、約０．６×１０１１ｇｃのウイルスベクターが対象の脳または白質内の１２の部位のそれぞれに投与される。特定の実施形態において、約１．２×１０１２ｇｃのウイルスベクターが対象の各部位に投与される。特定の実施形態において、約７．２×１０１２ｇｃの総ウイルスベクターが対象に投与されるように、約１．２×１０１２ｇｃのウイルスベクターが対象の脳または白質内の６つの部位のそれぞれに投与される。いくつかの実施形態において、対象に送達されるウイルスベクターの量は、脳組織１グラム当たり約６．０×１０９～約８．０×１０９ｇｃ（ｇｃ／ｇｒ）である。いくつかの実施形態において、対象に送達されるウイルスベクターの量は、約７．０×１０９ｇｃ／ｇｒ～約７．４×１０９ｇｃ／ｇｒである。いくつかの実施形態において、対象に送達されるウイルスベクターの量は、約７．２×１０９ｇｃ／ｇｒである。
いくつかの実施形態において、遺伝子治療ベクターは、ＰＢＳ緩衝剤を含む製剤で投与される。いくつかの実施形態において、ＰＢＳ緩衝剤は、賦形剤または防腐剤を含まない。いくつかの実施形態において、ＰＢＳ緩衝剤の組成は、ＫＣｌ、ＫＨ２ＰＯ４、ＮａＣｌおよび／またはＮａ２ＨＰＯ４を含む。いくつかの実施形態において、ＰＢＳ緩衝剤の組成は、約２．６７ｍＭ ＫＣｌ、約１．４７ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、約１３７．９ｍＭ ＮａＣｌおよび約８．０６ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４を含む。いくつかの実施形態において、製剤のｐＨは、約６．８～約７．８または約７．２～７．４である。
ある特定の実施形態において、各部位に投与される遺伝子治療ベクターを含む組成物の体積は、約１０μｌ～約６００μｌ、約２０μｌ～約５５０μｌ、約３０μｌ～約２００μｌ、約５０μｌ、約１００μｌまたは約１５０μｌである。いくつかの実施形態において、各注射で各部位に投与される遺伝子治療ベクターを含む組成物の体積は、約２００μｌ、約３００μｌ、約４００μｌ、約５００μｌ、約６００μｌである。ある特定の実施形態において、各注射の体積は約５００μｌである。特定の実施形態において、遺伝子治療ベクターを含む組成物の投与のための注入速度は、約０．１μｌ／分～約１０μｌ／分、約０．２μｌ／分～約８μｌ／分、約０．３μｌ／分～約６μｌ／分、または約０．５μｌ／分～約５μｌ／分、または約０．４μｌ／分～約４．０μｌ／分、または約０．４μｌ／分～約３．０μｌ／分、または約２．０μｌ／分である。いくつかの実施形態において、組成物の投与のための注入速度は約５μｌ／分である。いくつかの実施形態において、遺伝子治療ベクターを含む組成物は、約５μｌ／分の流量で、約５００μｌの複数回注射を介して投与される。
ヒトを含む哺乳動物における用量選択は、以下の有効性および安全性基準に基づき得る。（１）脳全体に送達されるベクター粒子の総量は、脳のかなりの体積でＳＧＳＨ産生を誘導するのに十分であるべきであり、脳内での蓄積病変の発生を防ぐべきである；（２）各沈着物におけるベクター粒子の量は、局所毒性を誘導してはならない。
他のＭＰＳモデルに関する以前の前臨床研究は、有効性に関するいくつかの情報を提供した。ＡＡＶベクターの用量は、脳内への定位注射後にＭＰＳ（ＭＰＳＩおよびＭＰＳＩＩＩＢ）のイヌモデルで評価されている。これらの研究は、各沈着物で６×１０１０ｖｇに相当する４０μｌ×１．５×１０１２ｖｇ／ｍｌの８つの沈着物が、イヌの脳全体における効率的なベクター送達に十分であると結論付けた。４倍高い投薬は安全であったが、脳組織におけるベクター送達に関してはより効率的ではないことがあり得る。これは、沈着物あたり６×１０１０ｖｇの用量を安全かつ効率的であると特徴付ける。
特定の一実施形態において、本開示は、ＭＰＳＩＩＩＡを処置する方法を提供し、前記方法は、ＭＰＳＩＩＩＡを処置することを必要とする対象（例えば、ＭＰＳＩＩＩＡと診断されたヒト）に、以下の配列を５’から３’の順序で含む発現カセットを含むウイルスベクターを含む組成物を投与することを含み、ＣＡＧプロモーター配列は、ＳＧＳＨをコードするポリヌクレオチド配列に機能的に連結されており：
ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列；
ＣＡＧプロモーター配列；
ヒトＮ－スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ（ＳＧＳＨ）ポリペプチドまたはその活性改変体をコードするポリヌクレオチド配列；
ヒト成長ホルモンポリＡ配列；および
ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列、
前記組成物は、脳内注射を介して、対象の頭部の６つの穿頭孔を通して対象の脳内の６つの部位に投与され、
前記組成物は、各穿頭孔または穿頭路を通して単一の部位に、単一の深さで投与され、
前記６つの部位は、右前側、左前側、右内側、左内側、右後側および左後側であり、
約０．８×１０９～０．８×１０１３ｇｃまたは約１．２×１０１２ｇｃのウイルスベクターが１２個の部位の各々に投与され、
１２個の部位の各々に投与される組成物の体積が、約１０μｌ～約６００μｌまたは約５００μｌであり、
組成物の投与のための注入速度は、約０．１μｌ／分～約１０μｌ／分、約０．２μｌ／分～約８μｌ／分、約０．３μｌ／分～約６μｌ／分、または約０．４μｌ／分～約４．０μｌ／分、約０．４μｌ／分～約３．０μｌ／分、または約２．０μｌ／分、または約５．０μｌ／分である。
ある特定の実施形態において、投与は、注入ポンプを使用して行われる。
ＭＰＳＩＩＩＡを処置するための方法は、脳および神経系への治療薬の送達に有利であり、異なる治療薬を使用することによって他の脳疾患もしくは障害または神経疾患もしくは障害を処置するように改変され得る。
添付の実施例においてさらに記載されているように、本明細書で提供される遺伝子治療ベクターＬＹＳ－ＳＡＦ３０２は、ＬＹＳ－ＳＡＦ３０１などの遺伝子治療ベクターより顕著な改善を提供した。例えば、いくつかの実施形態において、ＬＹＳ－ＳＡＦ３０２は、ＳＧＳＨを産生することにおいて優れた発現および効力をもたらし、脳内のＨＳの量を減少させた。ＬＹＳ－ＳＡＦ３０２は、約５．０μｌ／分の注入速度で、７．２×１０１２ｖｇの総用量で安全かつ効果的に投与することができた。例えば、注射あたり単一の深さおよび５．０μｌ／分での５００μＬ体積の注射の６回投与で投与されたＬＹＳ－ＳＡＦ３０２は、ＳＧＳＨ遺伝子中に変異を伴う神経疾患に対する非常に有効で安全な処置を提供する。
したがって、ある特定の実施形態において、本開示は、変異した遺伝子に起因する脳または神経の疾患または障害を処置することを必要とする対象における前記疾患または障害を処置する方法であって、その野生型もしくは非変異型で前記遺伝子によってコードされるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、またはその活性改変体を含む発現カセットを含む遺伝子治療ベクターの対象への脳内投与を含み、前記ポリヌクレオチド配列はプロモーター配列に機能的に連結されており、前記脳内投与は、約５×１０１０ｇｃ～約５×１０１３ｇｃまたは約１．０×１０１１ｇｃ～約１．０×１０１３ｇｃを約６～約１２の投薬（ｄｏｓａｇｅｓ）で投与することを含み、各投薬は、約１０μｌ～約５００μｌの体積中、合計約５．０×１０９ｇｃ～約５．０×１０１２ｇｃまたは約１．０×１０１０ｇｃ～約１．０×１０１２ｇｃまたは約６×１０１０ｇｃである、方法を含む。ある特定の実施形態において、ポリヌクレオチド配列は、ＣＡＧプロモーターに機能的に連結されている。ある特定の実施形態において、各投薬は、約０．１μｌ／分～約１０μｌ／分、約０．２μｌ／分～約８μｌ／分、約０．３μｌ／分～約６μｌ／分、または約０．４μｌ／分～約４．０μｌ／分、約０．５μｌ／分～約５．０μｌ／分、約２．０μｌ／分、または約５μＬ／分の速度で投与される。特定の実施形態において、脳内投与は、必要に応じてカテーテルを含む送達装置を使用して行われる。ある特定の実施形態において、脳内投与は、被殻に隣接する白質中の６つの穴を通して対象の脳または白質にベクターを投与することを含む。特定の実施形態において、１２の投薬のうちの２つは、６つの穴の各々を通して投与され、２つの投薬のうちの１つは深部投与であり、２つの投薬のうちの１つは表層投与である。ある特定の実施形態において、１２の投薬のそれぞれは、カテーテルを介して投与される。一実施形態において、脳内投与は、注入ポンプを使用して行われる。いくつかの実施形態において、脳内投与は、６つの投薬での対象の脳または白質へのベクターの投与を含み、投薬の各々は単一の深さでの投与である。
本開示は、脳もしくは神経系の疾患もしくは障害を処置することを必要とする対象において脳もしくは神経系の疾患もしくは障害を処置する方法、または治療薬を必要とする対象の脳に治療薬を提供する方法をさらに含み、前記方法は、治療薬を含む組成物を必要とする対象（例えば、ヒト）に治療薬を含む組成物を投与することを含み、前記組成物は、脳内注射を介して、対象の頭部の６つの穿頭孔を通して対象の脳内の６または１２の部位に投与される。いくつかの実施形態において、組成物は、各穿頭孔または穿頭路を通じて２つの部位に投与され、２つの部位の一方は深部であり、２つの部位の他方は表層であり、１２個の部位は、右前側表層、右前側深部、左前側表層、左前側深部、右内側表層、右内側深部、左内側表層、左内側深部、右後側表層、右後側深部、左後側表層および左後側深部であり、１２個の部位の各々に投与される組成物の体積は、約１０μｌ～約３００μｌであり、組成物の投与のための注入速度は、約０．１μｌ／分～約１０μｌ／分、約０．２μｌ／分～約８μｌ／分、約０．３μｌ／分～約６μｌ／分、または約０．４μｌ／分～約４．０μｌ／分、約０．５μＬ～約５．０μＬ、約０．４μｌ／分～約３．０μｌ／分または約２．０μｌ／分または約５．０μ／分である。ある特定の実施形態において、投与は、注入ポンプを使用して行われる。いくつかの実施形態において、組成物は、対象の頭部の穿頭孔に投与され、組成物は、各穿頭孔または穿頭路を通して単一の部位に投与される。いくつかの実施形態において、単一の穿頭孔は、深部または表層部位から選択される。例えば、いくつかの実施形態において、投与の各々は深部部位である。いくつかの実施形態において、投与の各々は表層部位である。いくつかの実施形態において、複数回投与は、深部および表層部位の混合である、すなわち、投与の各部位は、深部または表層投与のために独立して選択される。
本開示は、小分子、ポリペプチド、抗体およびその断片、ポリヌクレオチド、例えばｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびウイルスベクターを含むがこれらに限定されない任意の種類の治療薬の使用を企図する。特定の実施形態において、治療薬はウイルスベクター、例えばＡＡＶベクター、例えばＡＡＶｒｈ．１０ベクターである。
特定の実施形態において、この方法は、ＭＰＳ（サンフィリポＣ、サンフィリポＤ、Ｓｌ、ハーラー・シャイエ、サンフィリポＡ、ハンター、モルキオ、サンフィリポＢ、マロトー・ラミーを含むが、これらに限定されない）、ゴーシェ、異染性白質ジストロフィー、ファブリー、クラッベ、ポンペ、シスチン症、テイ・サックス、ニーマン・ピックＣ、ニーマン・ピックＡ／Ｂ、ムコリピドーシスＩＩ／ＩＩＩ、Ｇｍ１ガングリオシドーシス、サンドホフ、または本明細書に記載される任意の他のものを含むがこれらに限定されない遺伝子欠陥によって引き起こされるリソソーム蓄積障害を処置するために使用され、治療薬は、特定の疾患に関連する欠損または変異した酵素の機能的または野生型バージョンを提供するウイルスベクターである。酵素は、本明細書に記載されるもののいずれかなどのＡＡＶウイルスベクターで提供され得るが、ＳＧＳＨをコードするポリヌクレオチド配列（および必要に応じてＩＲＥＳ）は、所望の酵素をコードするポリヌクレオチド配列によって置き換えられる。これらの疾患の遺伝的基礎は公知であり、そのような酵素およびポリヌクレオチド配列は公知であり、当技術分野で利用可能である。例えば、ＭＰＳＩＩに関連する酵素はイズロネート－２－スルファターゼであり、ＭＰＳ１に関連する酵素はα－Ｌ－イズロニダーゼであり、ＭＰＳＩＩＩＤに関連する酵素はグルコサミン－６－スルファターゼであり、ＭＰＳＩＩＩＣに関連する酵素はＮ－アセチルトランスフェラーゼであり、ＭＰＳＩＩＩＢに関連する酵素はα－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼまたはグルクロン酸－２－スルファターゼであり、ＭＰＳＶＩＩに関連する酵素はβ－Ｄ－グルクロニダーゼまたはグルコサミン－３－スルファターゼである。
他の脳または神経の疾患および障害も、本明細書に記載されている方法に従って脳に治療薬を送達することによって処置することができ、本明細書に記載のいずれもが含まれるが、これらに限定されない。
遺伝子治療と免疫抑制剤の組み合わせを使用する処置のための方法
本開示は、１またはそれを超える免疫抑制剤と組み合わせた遺伝子治療ベクターを用いて遺伝性障害を処置する方法も含む。遺伝子治療ベクターの投与後の免疫抑制剤による長期処置が、遺伝子治療ベクターに対する炎症応答または免疫応答を低下させることによって遺伝子治療処置の有効性を増強することは、本開示の驚くべき予想外の知見である。
ある特定の実施形態において、本開示は、ＭＰＳＩＩＩＡを処置する方法であって、ＭＰＳＩＩＩＡを処置することを必要とする対象に、
（１）ＳＧＳＨポリペプチドまたはその活性改変体をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現カセットを含む遺伝子治療ベクターであって、前記ポリヌクレオチド配列がプロモーター配列に機能的に連結されている、遺伝子治療ベクター、および
（２）１またはそれを超える免疫抑制剤、
を投与することを含み、
前記１またはそれを超える免疫抑制剤の少なくとも１つが、前記遺伝子治療ベクターの投与直後の少なくとも２ヶ月、少なくとも３ヶ月、少なくとも４ヶ月、少なくとも５ヶ月、少なくとも６ヶ月、少なくとも８ヶ月、少なくとも１０ヶ月または少なくとも１２ヶ月の期間にわたって前記対象に提供される、方法を含む。ある特定の実施形態において、１またはそれを超える免疫抑制剤の少なくとも１つは、対象の余命の間、または対象が発現カセットから検出可能なレベルのＳＧＳＨポリペプチドを産生している限り、対象に提供される。
特定の実施形態において、本方法を実施するために、本明細書に記載されている本開示の遺伝子治療ベクターのいずれもが使用され得る。
特定の一実施形態において、本開示は、ＭＰＳＩＩＩＡを処置することを必要とする対象においてＭＰＳＩＩＩＡを処置する方法であって、前記方法は、ＭＰＳＩＩＩＡを処置することを必要とする対象（例えば、ＭＰＳＩＩＩＡと診断されたヒト）に、
（１）以下の配列を５’から３’の順序で含む発現カセットを含むウイルスベクターを含む組成物であって、ＣＡＧプロモーター配列がＳＧＳＨをコードするポリヌクレオチド配列に機能的に連結されている、組成物：
ａ．ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列；
ｂ．ＣＡＧプロモーター配列；
ヒトＮ－スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ（ＳＧＳＨ）ポリペプチドまたはその活性改変体をコードするポリヌクレオチド配列；
ｃ．ヒト成長ホルモンポリＡ配列；および
ｄ．ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列；ならびに
（２）１またはそれを超える免疫抑制剤、
を投与することを含み、
前記１またはそれを超える免疫抑制剤の少なくとも１つが、前記遺伝子治療ベクターの投与直後の少なくとも２ヶ月、少なくとも３ヶ月、少なくとも４ヶ月、少なくとも５ヶ月、少なくとも６ヶ月、少なくとも８ヶ月、少なくとも１０ヶ月または少なくとも１２ヶ月の期間にわたって前記対象に提供される、方法を含む。ある特定の実施形態において、１またはそれを超える免疫抑制剤の少なくとも１つは、対象の余命の間、または対象が発現カセットから検出可能なレベルのＳＧＳＨポリペプチドを産生している限り、対象に提供される。
これらの方法の特定の実施形態において、これらの方法は、以下の特徴の１またはそれより多くを含む：前記組成物は、脳内注射を介して、対象の頭部の穿頭孔を通して対象の脳に投与される；組成物は、４～８個の穿頭孔を介して投与される；前記組成物は、各穿頭孔または穿頭路を通して１つまたは２つの部位に投与され、前記部位は、独立して、深部および／または表層のいずれかである；前記部位は、右前側表層、右前側深部、左前側表層、左前側深部、右内側表層、右内側深部、左内側表層、左内側深部、右後側表層、右後側深部、左後側表層および左後側深部から選択され、約０．８×１０９ｇｃ～約０．８×１０１３ｇｃ、約１．０×１０１０ｇｃ～約１．０×１０１３、または約１．０×１０１０ｇｃ～約１．０×１０１２ｇｃまたは約６×１０１０ｇｃまたは約１．２×１０１２ｇｃの投与量のウイルスベクターが６または１２の部位のそれぞれに投与され、
１２の部位の各々に投与される組成物の体積は、約１０μｌ～約６００μｌであり、および／またはベクターの投与のための注入速度は、約０．１μｌ／分～約１０μｌ／分、約０．２μｌ／分～約８μｌ／分、約０．３μｌ／分～約６μｌ／分、または約０．４μｌ／分～約４．０μｌ／分、約０．４μｌ／分～約３．０μｌ／分、または約２．０μｌ／分、または約５．０μｌ／分である。ある特定の実施形態において、投与は、注入ポンプを使用して行われる。ある特定の実施形態において、組成物は、上に列挙された部位の１２全てに投与される。一実施形態において、本方法は、上記の特徴の全てを含む。
１またはそれを超える免疫抑制剤を提供することを含む方法の特定の実施形態において、１またはそれを超える免疫抑制剤は、カルシニューリン阻害剤（例えば、タクロリムス）、マクロライド（例えば、シロリムスまたはラパミシン（ｒａｐａｍｉｃｙｎ））、および／またはミコフェノール酸モフェチルを含む。ある特定の実施形態において、１またはそれを超える免疫抑制剤の少なくとも１つは、遺伝子治療ベクターの投与直後の少なくとも３ヶ月、少なくとも４ヶ月、少なくとも５ヶ月、少なくとも６ヶ月、少なくとも８ヶ月、少なくとも１０ヶ月または少なくとも１２ヶ月の期間にわたって対象に提供される。ある特定の実施形態において、１またはそれを超える免疫抑制剤の少なくとも１つは、遺伝子治療ベクターの投与より前の期間にわたって対象に提供される。
特定の一実施形態において、１またはそれを超える免疫抑制剤は、遺伝子治療ベクターの投与直後の少なくとも１２ヶ月の期間にわたって対象に提供されるカルシニューリン阻害剤、例えばタクロリムスを含む。特定の一実施形態において、１またはそれを超える免疫抑制剤は、遺伝子治療ベクターの投与直後の少なくとも１２ヶ月の期間にわたって対象に提供されるマクロライド、例えばシロリムスを含む。ある特定の実施形態において、１またはそれを超える免疫抑制剤は、カルシニューリン阻害剤（例えば、タクロリムス）およびミコフェノール酸モフェチルを含む。ある特定の実施形態において、１またはそれを超える免疫抑制剤は、マクロライド（例えば、シロリムス）およびミコフェノール酸モフェチルを含む。特定の実施形態において、カルシニューリン阻害剤またはマクロライドは、遺伝子治療ベクターの投与直後の少なくとも１２ヶ月の期間にわたって対象に提供され、シコフェノール酸（ｃｙｃｏｐｈｅｎｏｌａｔｅ）モフェチルは、遺伝子治療ベクターの投与の約２週間前から始まって約２ヶ月間患者に提供される。
別の特定の実施形態において、カルシニューリン阻害剤はタクロリムスであり、遺伝子治療ベクターの投与直後の少なくとも２ヶ月間または少なくとも３ヶ月間、０．０５ｍｇ／ｋｇ／日～１．０ｍｇ／ｋｇ／日または約０．２ｍｇ／ｋｇ／日の投与量で対象に提供される。別の特定の実施形態において、カルシニューリン阻害剤はタクロリムスであり、遺伝子治療ベクターの投与直後の３ヶ月間の期間にわたって１０ｎｇ／ｍｌ～１５ｎｇ／ｍｌのタクロリムスの血中濃度を達成する投与量で対象に提供される。さらなる特定の実施形態において、カルシニューリン阻害剤はタクロリムスであり、遺伝子治療ベクターの投与直後の４ヶ月～１２ヶ月間の期間にわたって７ｎｇ／ｍｌ～１０ｎｇ／ｍｌのタクロリムスの血中濃度を達成する投与量で対象に提供される。特定の実施形態において、カルシニューリン阻害剤、例えばタクロリムスは、遺伝子治療ベクターの投与後に、最長１年間、最長２年間、最長３年間、最長４年間、最長５年間、または対象の寿命の間、対象に提供される。
別の実施形態において、マクロライドはシロリムスであり、遺伝子治療ベクターの投与直後の少なくとも２ヶ月間または少なくとも３ヶ月間、３ｍｇ／ｋｇ／日または１日当たり約１．５ｍｇ／ｋｇ／２回の投与量で対象に提供される。別の特定の実施形態において、マクロライドはシロリムスであり、遺伝子治療ベクターの投与直後の３ヶ月間の期間にわたって１０ｎｇ／ｍｌ～２５ｎｇ／ｍｌのシロリムスの血中レベルを達成する投与量で対象に提供される。さらなる特定の実施形態において、１またはそれを超える免疫抑制剤はシロリムスであり、遺伝子治療ベクターの投与直後の２ヶ月～６ヶ月の期間にわたって２０ｎｇ／ｍｌのシロリムスの血中レベルを達成する投与量で対象に提供される。さらなる特定の実施形態において、１またはそれを超える免疫抑制剤はシロリムスであり、遺伝子治療ベクターの投与直後の６ヶ月にわたる期間１０ｎｇ／ｍｌ～１５ｎｇ／ｍｌのシロリムスの血中レベルを達成する投与量で対象に提供される。
別の実施形態において、１またはそれを超える免疫抑制剤は、ミコフェノール酸モフェチルを含み、遺伝子治療ベクターの投与直後の最長２ヶ月間または約２ヶ月間対象に提供される。ある特定の実施形態において、ミコフェノール酸モフェチルは、２００ｍｇ／ｍ２／日～１２００ｍｇ／ｍ２／日または約６００ｍｇ／ｍ２／日の投与量で対象に提供される。
別の実施形態において、本方法は、遺伝子治療ベクターの投与直後の３～１０日、約５日、約６日または約７日の期間にわたってプレドニゾロンを対象に提供することをさらに含む。特定の実施形態において、プレジンゾロン（ｐｒｅｄｉｎｓｏｌｏｎｅ）は、約０．２ｍｇ／ｋｇ／日～約５ｍｇ／ｋｇ／日または約１ｍｇ／ｋｇ／日の投与量で対象に提供される。
特定の方法において、対象には、（１）遺伝子治療ベクターの投与前または投与後１２時間以内に開始し、約１０日間継続する約１ｍｇ／ｋｇ／日の用量のプレドニゾロン；（２）遺伝子治療ベクターの投与の１４日前に開始し、処置の７日後に、遺伝子治療ベクターの投与後最初の３ヶ月間は１０～１５ｎｇ／ｍｌ、および４ヶ月から少なくとも１年まで７～１０ｎｇ／ｍｌの残存用量を目標とするように適合される、約０．２ｍｇ／ｋｇ／日（例えば、２つの分割用量で与えられる）の開始用量のタクロリムス；（３）遺伝子治療ベクターの投与の１４日前に開始し、遺伝子治療ベクターの投与後２ヶ月間または８週間維持される、１日２回の６００ｍｇ／ｍ２（最大２）の投与量のミコフェノール酸モフェチル、が提供される。
特定の方法において、対象には、（１）遺伝子治療ベクターの投与前または投与後１２時間以内に開始し、約１０日間継続する約１ｍｇ／ｋｇ／日の用量のプレドニゾロン；（２）遺伝子治療ベクターの投与直後の６ヶ月にわたる期間、１０ｎｇ／ｍｌ～１５ｎｇ／ｍｌのシロリムスの血中レベルを達成する投与量のシロリムス；（３）遺伝子治療ベクターの投与の１４日前に開始し、遺伝子治療ベクターの投与後２ヶ月間または８週間維持される、１日２回の６００ｍｇ／ｍ２（最大２）の投与量のミコフェノール酸モフェチル、が提供される。
別の特定の実施形態において、本開示は、ＭＰＳＩＩＩＡを処置する方法であって、前記方法は、ＭＰＳＩＩＩＡを処置することを必要とする対象（例えば、ＭＰＳＩＩＩＡと診断されたヒト）に、
（１）発現カセットと以下のものを５’から３’の順序で含む隣接配列とを含むウイルスベクターを含む組成物であって、ＣＡＧプロモーター配列がＳＧＳＨをコードするポリヌクレオチド配列に機能的に連結されている、組成物：
ａ．ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列；
ｂ．ＣＡＧプロモーター配列；
ヒトＮ－スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ（ＳＧＳＨ）ポリペプチドまたはその活性改変体をコードするポリヌクレオチド配列
ｃ．ヒト成長ホルモンポリＡ配列；および
ｄ．ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列、
前記組成物は、脳内注射を介して、対象の頭部の６つの穿頭孔を通して対象の脳内の１２の部位に投与され、
前記組成物は、各穿頭孔または穿頭路を通して１つまたは２つの部位に投与される、方法を含む。
いくつかの実施形態において、注射部位は、右前側表層、右前側深部、左前側表層、左前側深部、右内側表層、右内側深部、左内側表層、左内側深部、右後側表層、右後側深部、左後側表層および左後側深部からなる群から選択され、
前記対象に投与される組成物の総量は、約５×１０１０ｇｃ～約５×１０１３ｇｃ、約１．０×１０１１ｇｃ～約１．０×１０１３ｇｃ、約１．０×１０１０ｇｃ～約１．０×１０１４ｇｃ、約５．０×１０１０ｇｃ～約５．０×１０１３ｇｃ、約５．０×１０１０ｇｃ～約１．０×１０１３ｇｃ、約１．０×１０１１ｇｃ～約１．０×１０１３ｇｃ、約１．０×１０１１ｇｃ～約５．０×１０１２ｇｃ、または約５．０×１０１１ｇｃ～約５．０×１０１２ｇｃであり、約５．０×１０９ｇｃ～約５．０×１０１２ｇｃ、約１．０×１０１０ｇｃ～約１．０×１０１２ｇｃ、約０．８×１０９ｇｃ～約０．８×１０１３ｇｃ、約０．４×１０１０ｇｃ～約０．４×１０１３ｇｃ、約０．４×１０１０ｇｃ～約０．８×１０１２ｇｃ、約０．８×１０１０ｇｃ～約０．８×１０１２ｇｃ、約０．８×１０１０ｇｃ～約０．４×１０１２ｇｃ、または約０．４×１０１１ｇｃ～約０．４×１０１２ｇｃまたは約６×１０１０ｇｃまたは約１．０×１０１２ｇｃまたは約１．２×１０１２ｇｃまたは約１．４×１０１２ｇｃのウイルスベクターが１２の部位のそれぞれに投与され、１２の部位のそれぞれに投与される組成物の体積は約１０μｌ～約６００μｌであり、ベクターの投与のための注入速度は、約０．１μｌ／分～約１０μｌ／分、約０．２μｌ／分～約８μｌ／分、約０．３μｌ／分～約６μｌ／分、または約０．４μｌ／分～約４．０μｌ／分、約０．４μｌ／分～約３．０μｌ／分、または約２．０μｌ／分または約５．０μｌ／分であり；および
（２）１またはそれを超える免疫抑制剤、
を投与することを含み、
前記１またはそれを超える免疫抑制剤は、遺伝子治療ベクターの投与前または投与後１２時間以内に開始し、約１０日間継続する約１ｍｇ／ｋｇ／日の用量のプレドニゾロン；遺伝子治療ベクターの投与の１４日前に開始し、処置の７日後に、遺伝子治療ベクターの投与後最初の３ヶ月間は１０～１５ｎｇ／ｍｌ、および４ヶ月から少なくとも１年まで７～１０ｎｇ／ｍｌの残存用量を目標とするように適合される、約０．２ｍｇ／ｋｇ／日（例えば、２つの分割用量で与えられる）の開始用量のタクロリムス；遺伝子治療ベクターの投与の１４日前に開始し、遺伝子治療ベクターの投与後２ヶ月間または８週間維持される、１日２回の６００ｍｇ／ｍ２（最大２）の投与量のミコフェノール酸モフェチルを含む、またはこれらからなる。
当業者は、１またはそれを超える免疫抑制剤の同時投与に関連する上記の方法および利点が、変異したまたは存在しない遺伝子産物の機能性コピーを投与するベクターを使用する遺伝子治療による他の遺伝性疾患または障害の処置に対して適合され得ることを理解するであろう。
したがって、本開示は、変異または欠失した遺伝子によって引き起こされる疾患または障害を処置することを必要とする対象において、変異または欠失した遺伝子によって引き起こされる疾患または障害を処置する方法をさらに含み、前記方法は、
（１）前記遺伝子によってその野生型もしくは非変異型でコードされるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列またはその活性改変体を含む発現カセットを含む遺伝子治療ベクターを前記対象に投与することであって、前記ポリヌクレオチド配列がプロモーター配列に機能的に連結されている、投与することと、
（２）１またはそれを超える免疫抑制剤を前記対象に提供することであって、前記免疫抑制剤の少なくとも１つが、前記遺伝子治療ベクターの投与直後の少なくとも２ヶ月、少なくとも３ヶ月、少なくとも４ヶ月、少なくとも５ヶ月、少なくとも６ヶ月、少なくとも７ヶ月、少なくとも８ヶ月、少なくとも１０ヶ月または少なくとも１２ヶ月の期間にわたって前記対象に提供される、提供することと、を含む。
特定の実施形態において、１またはそれを超える免疫抑制剤は、カルシニューリン阻害剤、必要に応じてタクロリムス、またはミコフェノール酸モフェチル、および／またはマクロライド、例えばシロリムスまたはラパミシン（ｒａｐａｍｉｃｙｎ）を含む。
さらなる関連する実施形態では、本開示は、変異した遺伝子に起因する脳障害を処置することを必要とする対象において変異した遺伝子に起因する脳障害を処置する方法であって、前記遺伝子によってその野生型もしくは非変異型でコードされるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列またはその活性改変体を含む発現カセットを含む遺伝子治療ベクターを前記対象に投与することであって、前記ポリヌクレオチド配列がプロモーター配列に機能的に連結されている、投与することと、１またはそれを超える免疫抑制剤を前記対象に提供することであって、前記免疫抑制剤の少なくとも１つが、前記遺伝子治療ベクターの投与直後の少なくとも２ヶ月の期間にわたって前記対象に提供される、提供することと、を含む方法を含む。
特定の実施形態において、１またはそれを超える免疫抑制剤は、ＳＧＳＨポリペプチドの送達のための遺伝子治療ベクターと組み合わせた免疫抑制剤の投与に関連して本明細書に記載されている任意の投薬レジメンを含む、本明細書に記載されていう免疫抑制剤のいずれかまたはそれらの任意の組み合わせを含む。一実施形態において、１またはそれを超える免疫抑制剤は、カルシニューリン阻害剤、必要に応じてタクロリムスおよびミコフェノール酸モフェチルを含む。別の実施形態において、１またはそれを超える免疫抑制剤は、マクロライド、必要に応じてシロリムス、およびミコフェノール酸モフェチルを含む。特定の実施形態において、カルシニューリン阻害剤またはマクロライドは、遺伝子治療ベクターの投与直後の少なくとも３ヶ月、少なくとも６ヶ月、または少なくとも１２ヶ月の期間にわたって対象に提供される。
カルシニューリン阻害剤がタクロリムスである特定の実施形態において、カルシニューリン阻害剤は遺伝子治療ベクターの投与直後の少なくとも２ヶ月間または少なくとも３ヶ月間、０．０５ｍｇ／ｋｇ／日～１．０ｍｇ／ｋｇ／日または約０．２ｍｇ／ｋｇ／日の投与量で対象に提供される。カルシニューリン阻害剤がタクロリムスである特定の実施形態において、カルシニューリン阻害剤は遺伝子治療ベクターの投与直後の３ヶ月間の期間にわたって１０ｎｇ／ｍｌ～１５ｎｇ／ｍｌのタクロリムスの血中濃度を達成する投与量で対象に提供される。カルシニューリン阻害剤がタクロリムスである特定の実施形態において、カルシニューリン阻害剤は遺伝子治療ベクターの投与直後の４ヶ月～１２ヶ月間の期間にわたって７ｎｇ／ｍｌ～１０ｎｇ／ｍｌのタクロリムスの血中濃度を達成する投与量で対象に提供される。
マクロライドがシロリムスである特定の実施形態において、マクロライドは遺伝子治療ベクターの投与直後の少なくとも２ヶ月間または少なくとも３ヶ月間、３ｍｇ／ｋｇ／日または１日当たり約１．５ｍｇ／ｋｇ／２回の投与量で対象に提供される。マクロライドがシロリムスである特定の実施形態において、マクロライドは遺伝子治療ベクターの投与直後の３ヶ月間の期間にわたって１０ｎｇ／ｍｌ～２５ｎｇ／ｍｌのシロリムスの血中レベルを達成する投与量で対象に提供される。マクロライドがシロリムスである特定の実施形態において、マクロライドは遺伝子治療ベクターの投与直後の２ヶ月～６ヶ月間の期間にわたって２０ｎｇ／ｍｌのシロリムスの血中レベルを達成する投与量で対象に提供される。マクロライドがシロリムスでさらなる特定の実施形態において、マクロライドは遺伝子治療ベクターの投与直後の６ヶ月間の期間にわたって１０ｎｇ／ｍｌ～１５ｎｇ／ｍｌのシロリムスの血中レベルを達成する投与量で対象に提供される。
１またはそれを超える免疫抑制剤がミコフェノール酸モフェチルを含むある特定の実施形態において、免疫抑制剤は遺伝子治療ベクターの投与直後の最長２ヶ月間または約２ヶ月間対象に提供される。特定の実施形態において、ミコフェノール酸モフェチルは、２００ｍｇ／ｍ２／日～１２００ｍｇ／ｍ２／日または約６００ｍｇ／ｍ２／日の投与量で対象に提供される。
特定の実施形態において、本方法は、遺伝子治療ベクターの投与直後の３～１０日、約５日、約６日または約７日の期間にわたってプレドニゾロンを対象に提供することをさらに含む。
さらに、具体的な免疫抑制剤またはその組合せおよび具体的な投与量を含むがこれに限定されない、ＭＰＳＩＩＩＡの処置に関して上述した方法の具体的な特徴のいずれもが、任意の遺伝子治療ベクターの使用に関連する方法に存在し得る。
本開示のこれらの方法は、１またはそれを超える免疫抑制剤と組み合わせて遺伝子治療ベクターを使用して、例えば遺伝子変異または欠失などの１またはそれを超える遺伝子の欠陥によって引き起こされるものを含む任意の遺伝性疾患または障害を処置するために使用され得る。多数の障害および疾患の遺伝的基礎は公知である。ある特定の実施形態において、本開示の方法は、上記のもののいずれをも含むリソソーム蓄積症または障害を処置するために使用される。本開示の方法に従って処置され得るリソソーム蓄積症および障害としては、限定されないが、以下が挙げられる：活性化因子欠損症／ＧＭ２ガングリオシドーシス；α－マンノース症；アスパルチルグルコサミン尿症；コレステリルエステル蓄積症；慢性ヘキソサミニダーゼＡ欠損症；シスチン症；ダノン病；ファブリー病；ファーバー病；フコシドーシス；ガラクトシアリドーシス；ゴーシェ病（Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型）；ＧＭ１ガングリオシドーシス（乳児、遅発乳児／若年．成人／慢性）；Ｉ細胞病／ムコリピドーシスＩＩ；乳児遊離シアル酸蓄積症／ＩＳＳＤ；若年性ヘキソサミニダーゼＡ欠損症；クラッベ病（乳児発症型、晩発型）；異染性白質ジストロフィー；ムコ多糖症障害（偽性ハーラー・ポリジストロフィー／ムコリピトーシスＩＩＩＡ；ＭＰＳＩ；ＭＰＳＩシャイエ症候群；ＭＰＳ Ｉハーラー・シャイエ症候群；ＭＰＳ ＩＩハンター症候群；サンフィリポ症候群Ａ型／ＭＰＳ ＩＩＩ Ａ型；サンフィリポ症候群Ｂ型／ＭＰＳ ＩＩＩ Ｂ；サンフィリポ症候群Ｃ型／ＭＰＳ ＩＩＩ Ｃ型；サンフィリポ症候群Ｄ型／ＭＰＳ ＩＩＩ Ｄ型；モルキオＡ型／ＭＰＳ ＩＶＡ；モルキオＢ型／ＭＰＳ ＩＶＢ；ＭＰＳ ＩＸヒアルロニダーゼ欠損症；ＭＰＳ ＶＩマロトー・ラミー；ＭＰＳ ＶＩＩ スライ症候群；ムコリピドーシスＩ／シアリドーシス；ムコリピドーシスＩＩＩＣ；ムコリピドーシスＩＶ型）；多重スルファターゼ欠損症；ニーマン・ピック病（Ａ型、Ｂ型、Ｃ型）；神経セロイドリポフスチン症（ＣＬＮ６疾患（非典型遅発乳児、晩発型異型、早発若年）、バッテン－シュピールマイヤー－フォークト／若年性ＮＣＬ／ＣＬＮ３疾患、フィンランド異型遅発乳児型ＣＬＮ５、ジャンスキー－ビールショウスキー疾患／遅発乳児型ＣＬＮ２／ＴＰＰ１病、クフス／成人発症ＮＣＬ／ＣＬＮ４疾患、ノーザンてんかん／異型遅発乳児型ＣＬＮ８、サンタブオリ－ハルティア／乳児型ＣＬＮ１／ＰＰＴ疾患、β－マンノース症）；ポンペ病／糖原病ＩＩ型；濃化異骨症；サンドホフ病／成人発症／ＧＭ２ガングリオシドーシス；サンドホフ病／ＧＭ２ガングリオシドーシス－乳児；サンドホフ病／ＧＭ２ガングリオシドーシス－若年性；シンドラー病；サラ病／シアル酸蓄積症；テイ・サックス／ＧＭ２ガングリオシドーシス；およびウォルマン病。
他の実施形態において、本開示は、
（１）遺伝子によってその野生型もしくは非変異型でコードされるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列またはその活性改変体を含む発現カセットを含む遺伝子治療ベクターあって、前記ポリヌクレオチド配列がプロモーター配列に機能的に連結されている、遺伝子治療ベクターと、
（２）変異した遺伝子に起因する脳障害の医薬として使用するための、１またはそれを超える免疫抑制化合物の組み合わせ（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）を含む。
組み合わせの特定の実施形態において、遺伝子治療ベクターおよび免疫抑制剤は、同時にまたは続いて投与される。ある特定の実施形態において、遺伝子治療ベクターは脳内注射によって投与される。
組み合わせのある特定の実施形態において、免疫抑制化合物の少なくとも１つは、遺伝子治療ベクターの投与直後の少なくとも２ヶ月の期間にわたって対象に提供される。
組み合わせのある特定の実施形態において、１またはそれを超える免疫抑制化合物は、カルシニューリン阻害剤、マクロライドおよびミコフェノール酸モフェチルを含む群から選択される。特定の実施形態において、カルシニューリン阻害剤はタクロリムスである。他の実施形態において、マクロライドはシロリムスである。ある特定の実施形態において、免疫抑制剤化合物の少なくとも１つは、遺伝子治療ベクターの投与直後の少なくとも３ヶ月、少なくとも６ヶ月、または少なくとも１２ヶ月の期間にわたって対象に提供される。特定の実施形態において、この化合物はカルシニューリン阻害剤またはマクロライドである。
他の実施形態において、１またはそれを超える免疫抑制剤化合物はまた、遺伝子治療ベクターの投与より前の期間にわたって対象に提供される。
例示的な実施形態において、カルシニューリン阻害剤はタクロリムスであり、遺伝子治療ベクターの投与直後の少なくとも２ヶ月間または少なくとも３ヶ月間、０．０５ｍｇ／ｋｇ／日～１．０ｍｇ／ｋｇ／日または約０．２ｍｇ／ｋｇ／日の投与量で提供される。関連する実施形態において、カルシニューリン阻害剤はタクロリムスであり、遺伝子治療ベクターの投与直後の３ヶ月間の期間にわたって１０ｎｇ／ｍｌ～１５ｎｇ／ｍｌのタクロリムスの血清レベルを達成する投与量で対象に提供される。さらなる関連する実施形態において、カルシニューリン阻害剤はタクロリムスであり、遺伝子治療ベクターの投与直後の４ヶ月～１２ヶ月間の期間にわたって７ｎｇ／ｍｌ～１０ｎｇ／ｍｌのタクロリムスの血清レベルを達成する投与量で対象に提供される。
組み合わせの特定の実施形態において、１またはそれを超える免疫抑制剤は、ミコフェノール酸モフェチルを含み、遺伝子治療ベクターの投与直後の最長２ヶ月間または約２ヶ月間対象に提供される。特定の実施形態において、ミコフェノール酸モフェチルは、２００ｍｇ／ｍ２／日～１２００ｍｇ／ｍ２／日の投与量で提供される。
組み合わせの他の実施形態において、組み合わせはプレドニゾロンをさらに含む。
組み合わせの特定の実施形態において、変異した遺伝子に起因する脳障害は、サンフィリポＡ型症候群である。
組み合わせの様々な実施形態において、遺伝子治療ベクターは、以下の５’から３’の順序で、
プロモーター配列；
ヒトＮ－スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ（ＳＧＳＨ）ポリペプチドまたはその活性改変体をコードするポリヌクレオチド配列；および
ポリアデニル化（ポリＡ）配列；を含む発現カセットを含む複製欠損アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）由来ベクターである。
特定の実施形態において、プロモーター配列は、ＣＡＧプロモーター配列に由来し、および／または
ポリＡ配列は、ヒト成長ホルモンポリＡ配列に由来する。
組み合わせのある特定の実施形態において、発現カセットは、以下の５’から３’の順序で：
ＣＡＧプロモーター配列に由来するプロモーター配列；
ヒトＮ－スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ（ＳＧＳＨ）ポリペプチドまたはその活性改変体をコードするポリヌクレオチド配列；および
ヒト成長ホルモンポリＡ配列に由来するポリＡ配列と、を含む。
これらの組み合わせのいずれかの特定の実施形態において、発現カセットは２つのＡＡＶ２内部末端反復（ＩＴＲ）配列に隣接し、２つのＡＡＶ２ ＩＴＲ配列の一方は発現カセットの５’に位置し、２つのＡＡＶ２ ＩＴＲ配列の一方は発現カセットの３’に位置する。これらの組み合わせのいずれかの特定の実施形態において、ベクターは、ＡＡＶｒｈ．１０キャプシド、キャプシドタンパク質、または血清型をさらに含む（ｃｏｍｐｒｅｓｓ）。
本明細書に具体的に記載されるもののいずれかを含む遺伝子治療ベクターおよび１またはそれを超える免疫抑制剤の両方の投与に関するある特定の実施形態において、遺伝子治療ベクターは、本明細書に記載される投与量のいずれでも投与される。
本開示の遺伝子治療ベクターおよび組成物は、当技術分野で公知の任意の適切な送達系を通じて対象の脳に送達され得る。ある特定の実施形態において、送達系は、臨床医が針アセンブリを通じて、例えば脳内注射によって、ピンポイント精度で脳内の深部の標的部位にウイルスベクターを送達することを可能にする任意の送達系であり得る。ある特定の実施形態において、送達系は、脳組織内の１またはそれを超える所定の深さに到達することができるように設計され、その深さは、例えば、［５５］に記載されているように、針アセンブリが取り付けられるヘッドフレームの弧の位置の変更を通じて、正確にかつ一貫して調整され得る。
ある特定の実施形態において、本開示の方法は、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＳｏｕｗｅｉｄａｎｅら、’’Ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｌａｔｅ ｉｎｆａｎｔｉｌｅ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｃｅｒｏｉｄ ｌｉｐｏｆｕｓｃｉｎｏｓｉｓ：ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｉｃａｌ ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ’’，Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ Ｐｅｄｉａｔｒ．２０１０ Ａｕｇ；６（２）：１１５－２２）に記載されている送達装置および手順を使用して実施される。そこに記載されているように、遺伝子治療ベクターは、１２個の異なる脳位置（２つの深さ／穿頭孔（ｂｕｒ ｈｏｌｅ）、７５分／注入および２μｌ／分）に注入される。それぞれ２つの注射深さを有する６つの入口部位が使用される。第１の注射または投与は、送達系の６つのカテーテルを介して、選択された位置の６つにおいて同時に行うことができ、それにより、本開示の組成物を６つの脳位置のこの第１の組において送達する。次いで、６つのカニューレの近位端がそれぞれ６つの他の選択された位置に到達するように、６つのカテーテルのそれぞれを移動させ得る。次いで、第２の注射または投与は、送達系の６つのカテーテルを介して、選択された位置の６つにおいて同時に行うことができ、それにより、本開示の組成物を６つのさらなる脳位置のこの第２の組において送達する。
Ｓｏｕｗｅｉｄａｎｅらに記載されているように、特定の実施形態において、術前の撮像および目標の計画作成は対象の全身麻酔下で実行され、定位固定の計画作成のために、対象の脳の術前ＭＲ撮像が実行される。入口部位は、ＢｒａｉｎＬＡＢワークステーション（ＢｒａｉｎＬＡＢ ＵＳＡ）上で選択することができ、各大脳半球にわたる３つの入口部位が選択される。穴は、以下のように配置され得る：前頭極、中前頭領域および頭頂後頭領域のそれぞれに１つ。フレームレスナビゲーションおよび入口部位の位置特定が実行される。最小５つの位置合わせマーカーを使用して、患者を術前ＭＲ画像に位置合わせすることができる。事前に計画された入口部位を頭皮上にマークし、局所麻酔薬を各入口部位に投与する。カテーテルおよび遺伝子治療ベクター注入を行う。柔軟な溶融石英ポリイミドコーティングカテーテル（内径１５０μｍおよび外径３６２μｍ（ｐｏｌｙｍｉｃｒｏ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））を挿入するための剛性ガイドとして、２０ゲージのくも膜下穿刺針が使用される。各カテーテルは、別個のシリンジに接続され、カテーテルは、カテーテルの先端が針の先端と揃うまで挿入される。カテーテルは、より深く挿入する前にカテーテルと脳の間の境界面の点として針の上部にマークされる。くも膜下穿刺針は、ヘッドフレームの柔軟なリトラクタアームに固定され、所定の定位固定の軌道に一致するように配向される。リトラクタアームおよび針は全て、皮膚を開く前に、計画された方向に設定される。次いで、針を軟膜表面の真下に挿入し、リトラクタアームを剛性固定で固定する。デッドスペースは、注入システムを作動させることによって洗い流される。ガイド針を取り外し、カテーテルを最初の目標深度まで前進させ、最初の目標深度は一般に皮質表面から２ｃｍであり、１．７～２．５ｃｍの範囲である。各カテーテルは、先端部を皮質表面から所望の深さに配置する最初のゼロマークからの距離で、ステリストリップによって折り畳まれる。カニューレ挿入の５分後、微小灌流ポンプによって、２μｌ／分で６つの部位のそれぞれに並行して遺伝子治療ベクターを注射する。完了の５分後、カテーテルを１ｃｍ後退させ、１回目と同様に、２回目の注射を行う。２回目の注入の完了後、カテーテルを取り外す。
別の実施形態において、送達系は、米国特許出願公開第２０１１／００６０２８５号の教示によるものであり得、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態において、本開示の遺伝子治療ベクターおよび組成物は、カニューレを通して対象の脳に送達され得る。例えば、いくつかの実施形態において、遺伝子治療ベクターおよび組成物（ｃｏｍｏｐｓｉｔｉｏｎｓ）は、ＭＲＩ Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎｓ ＳＭＡＲＴＦＬＯＷ（登録商標）カニューレを介して送達される。制御された流れのカニューレの使用は、制御された流量での正確な急性注入を提供する。いくつかの実施形態において、送達方法は、ガイドチューブを有するカニューレの使用を含む。
実施例
実施例１
ＡＡＶｒｈ．１０－ｈＭＰＳ３Ａの作製
（ＳＡＦ－３０１）遺伝子治療ベクター
認定された２９３Ｔヒト胎児腎臓細胞株内への２つのプラスミドの形質移入によって、ＧＭＰ管理下で、臨床グレードのＳＡＦ－３０１遺伝子治療ベクターを作製した。治療遺伝子をコードするＤＮＡは、１つのプラスミド（ｐＡＡＶ－ＰＧＫ－ｈＭＰＳ３Ａ）によって提供され、キャプシドタンパク質（ＡＡＶｒｈ．１０由来）、複製遺伝子（ＡＡＶ２由来）およびヘルパー機能（アデノウイルス血清型５由来）は全て、第２のプラスミドによってトランスで提供された。
ｐＡＡＶ－ＰＧＫ－ｈＭＰＳ３Ａプラスミドは、以下のように構築した。市販のｐＡＡＶ２－ｌａｃＺ（７２７０ｂｐ）は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ ＵＳＡ）から入手した。ｐＡＡＶ２－ｌａｃＺプラスミド中のアンピシリン耐性遺伝子を欠失させ、市販のカナマイシン耐性トランスポゾンをサブクローニングすることによってカナマイシン耐性遺伝子（ＫａｎＲ、１１１９ｂｐ）によって置換し、ｐＡＡＶ２－ｌａｃＺ（ＫａｎＲ）を作製した。Ａｌｌｉａｎｃｅ Ｓａｎｆｉｌｉｐｐｏによって供給されたｐＡＡＶ－ＳＧＳＨ－ＩＲＥＳ－ＳＵＭＦ１から、ｐＡＡＶ２－ｌａｃＺ（ＫａｎＲ）の逆位末端反復配列の間に発現カセットをサブクローニングした。得られたプラスミドの概略図を図２Ａに示す。
ヘルパープラスミド（ｐＰＡＫ－ＭＡｒｈ．１０）は、カナマイシン耐性レプリコンに基づいており、Ａｄ血清型５のＶＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｍ７３２６０のヌクレオチド９，８５６～１１，５４８）、Ｅ２ＡおよびＥ４（ｎｔ２１，４３８～３５，９３５）を含有する。ＡＡＶ２ｒｅｐ遺伝子の発現はマウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター（ヌクレオチド５８３～１３２５、ＧｅｎＢａｎｋＡＦ２２８５５２）によって駆動され、ＡＡＶｒｈ．１０ｃａｐ遺伝子の発現はＡＡＶ２の内因性ｐ４０プロモーターによって駆動された。このプラスミドの概略図を図２Ｂに示す。
形質移入された細胞の培養後、凍結解凍サイクルによってウイルスベクターを細胞から放出させ、イオジキサノールステップグラジエント、続いてＨｉ－Ｔｒａｐ ＱＨＰカラムでのイオン交換クロマトグラフィーによって精製した。スピンカラムによる濃縮を使用して、得られたＡＡＶｒｈ．１０－ｈＭＰＳ３Ａベクターを臨床製剤に変換した。精製されたベクターは、リン酸緩衝生理食塩水中で凍結（－６０℃またはそれ未満で）保存される。
最終的な調合されたベクターの完全な特徴付けは、キャプシドタンパク質に対するＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット、導入遺伝子ＤＮＡに対するリアルタイムＰＣＲ、機能的遺伝子導入に対するウエスタン分析、インビボおよびインビトロの一般的および特異的な外来性ウイルスならびに酵素アッセイを通じて達成した。同一性、純度および機能を保証するために、ロットの引き渡し基準を設けた。
実施例２
マウスにおけるＳＡＦ－３０１のインビボ有効性
脳中での導入遺伝子の発現を実証するために、ＳＡＦ－３０１を用いてインビボ研究を行った。この研究デザインは、ＳＡＦ－３０１注射後の遺伝子の発現の期間および持続性の評価を可能にし、表３に要約されており、以下でさらに記載される。
表３：有効性研究の概要
Figure 2022551792000004
 インビボ有効性研究
５週齢の雄および雌のＭＰＳＩＩＩＡマウスまたは非罹患同腹子に、ＳＡＦ－３０１またはＧＦＰをコードする対照ＡＡＶベクターを与えた。各群（ｎ＝２５）には、７．５×１０９ベクターゲノムコピーを合計５μｌで与えた。この用量を２つの線条体内注射部位に分配した［２９］。動物を１２、２３および３０週齢で屠殺した。
形質移入の有効性および所望の酵素の産生を、脳スライド中へのＳＧＳＨの量の評価およびＳＧＳＨ活性の測定によって評価した。
ＳＡＦ－３０１の注射の機能的活性を、以下の疾患パラメータの分析によって評価した：
（１）脳／脊髄中のＨＳ由来オリゴ糖の相対的レベルを、タンデム質量分析を使用して決定した；および
（２）盲検定量的免疫組織学的評価により、固定されたＭＰＳＩＩＩＡ／非罹患脳組織における有効な疾患マーカーに対する治療の効果を決定した（ＬＩＭＰ－ＩＩ、ＧＦＡＰ、イソレクチンＢ４、ユビキチン、ＧＭ３ガングリオシド、エステル化されていないコレステロール）。
５週齢のＭＰＳＩＩＩＡマウスの左線条体へのＳＡＦ－３０１の送達は、この脳領域において極めて大量（正常の６５倍）の（活性な）ＳＧＳＨの産生をもたらした。ＳＧＳＨタンパク質（および活性）は、注射された半球の尾側領域および反対側の半球、特に注射部位により近いＲ２でも検出されたが、レベルははるかに低く、注射領域からの距離が増加するにつれて減少した。本研究では、ＳＧＳＨに対する液性免疫応答はマウスに検出されなかった。
ＡＡＶｒｈ．１０－ｈＭＰＳ３Ａによる処置は、２３週齢までに、一次保存材料（ＨＳ由来オリゴ糖）および二次保存生成物（ＧＭ３および非エステル化コレステロール）の両方の大きい、但し限局的な低下を媒介した。脳切片Ｌ２は、本発明者らが調べた扁桃体および無名質などの他の脳領域に加えて、線条体（注射領域）およびその上にある（吻側）皮質の両方を含有する。左半球切片２内に含有される病理学的マーカーの検査からの結果を考慮すると、この脳領域は、ＧｌｃＮＳ－ＵＡの著しい（８６％）低下ならびにＧＭ３およびコレステロールの極めて大きな低下（または正常化）を媒介するのに十分なＳＧＳＨを受けたことが明らかであった。さらに、この切片中の構造（線条体および吻側皮質）においてもＬＩＭＰ－ＩＩの正常化が観察され、これらの領域ではミクログリオーシスは存在しなかった／正常化された。ユビキチン陽性染色が大幅に低下したが、病変の形成が妨げられたためである可能性がある。切片２（ＡＡＶ－ＧＦＰまたはＡＡＶｒｈ．１０－ＭＰＳ３Ａのいずれか）の領域中の脳の左半球におけるベクター送達によるアストログリオーシスにより、これらの領域中でのこのマーカーに対する処置の効果の検査は不可能である。本発明者らは、右半球の切片２では、ＧｌｃＮＳ－ＵＡの４１％の低下ならびにＧＭ３およびコレステロールレベルの大きな低下を観察したが、これらは正常化されなかった。同様に、ＬＩＭＰ－ＩＩ発現は、ミクログリオーシスおよびアストログリオーシスならびにユビキチン陽性染色と同様に大幅に低下したが、正常化は達成されなかった。
尾側に移動すると、ＡＡＶｒｈ．１０－ＭＰＳ３Ａ処置は、左半球および右半球切片４において、それぞれＧｌｃＮＳ－ＵＡの５０％および２１％の低下をもたらした。この切片は、評価されなかった他の領域とともに、脳梁膨大後部皮質、下丘および中脳水道周囲灰白質を含有する。本発明者らのデータは、脳のこのより遠い領域中で治療の幾分混合した効果を明らかにし、ＧＭ３およびコレステロールの両方の低下が脳の左半球で観察されたが（但し、右半球では観察されなかった）、ＬＩＭＰ－ＩＩ、ミクログリオーシスまたはアストログリオーシスの改善は下丘中の左半球または右半球のいずれにおいても見られなかった。
データは、このベクターが、ミクログリオーシスなどの下流の事象に加えて、一次および二次の蓄積病理の非常に著しい改善を媒介するために十分な量のＳＧＳＨを産生することができることを示している。これは、注射領域および隣接領域において特に明らかである。しかしながら、ＳＧＳＨ免疫定量アッセイ、ＳＧＳＨ活性アッセイ、およびその結果として一次基質アッセイ（ＧｌｃＮＳ－ＵＡ）で観察されるように、形質導入された脳細胞によるＳＧＳＨ産生は注射領域に比較的限定されたままであるように見受けられ、注射部位からより離れた領域を検査すると、病理への影響はより明白でないものとなる。脳のいくつかの領域は、不十分なＳＧＳＨ／ＳＵＭＦ１を受けたかまたは全く受けず、したがって病理学的マーカーの改善をほとんどまたは全く示さないことは容易に分かる。これらの領域には、認知機能に重要であると考えられる部位、例えば海馬の歯状回および脳梁膨大後部皮質が含まれる。これらの脳領域に両側性に送達されないことが、ＭＰＳＩＩＩＡマウスにおいて疾患の臨床パラメータを改善することができないことの基礎にあると考えられる。
これらの知見は、二つの注射路（一方は吻側皮質および線条体を包含し、他方は海馬を通って視床に至る）を介した正常マウスの脳内への片側ＡＡＶｒｈ．１０ベクター注射後の局所的酵素発現を報告したＣｅａｒｌｅｙおよびＷｏｌｆｅ［１０］の知見と一致している。その研究で使用されたベクターは、β－グルクロニダーゼを発現し、連続した脳切片における酵素の染色は、かなりの量のβ－グルクロニダーゼが注射半球内で検出可能であるが、反対側への酵素の「広がり」ははるかに目立つものではないことを示し、例えば、注射側では大脳皮質の約５５％が染色されたが、非注射半球では９％しか染色されなかった。最大量のβ－グルクロニダーゼを受ける反対側の脳の領域は、視床であった（注射された側で染色された８３％と比較して、染色された領域の３５％）。
しかしながら、本発明者らの観察は、ＡＡＶ５ベクターを線条体中に片側性に投与し、限局的なベクターゲノム検出も記載したが、「脳全体にでの」神経病理のその後の矯正およびＭＰＳＩＩＩＢマウスにおける行動の改善を報告したＣｒｅｓｓａｎｔら［２９］によってなされた観察とは正反対である。実験結果の相違の理由は不明であるが、利用されたベクター血清型（ＡＡＶｒｈ．１０対ＡＡＶ５）に関連し得るが、Ｓｏｎｄｈｉら［１１］の知見を考慮すれば、これは可能性が低い。このグループは、ラット線条体への様々な異なるＡＡＶ血清型の送達後にトリペプチジルペプチダーゼＩ（ＴＰＰ－Ｉ）タンパク質の分布の程度を調べた。ＡＡＶｒｈ．１０は、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５およびＡＡＶ８と比較して、優れたＴＰＰ１分布をもたらした。遅発乳児神経セロイドリポフスチン症モデルにおいてＴＰＰ１の広範な分布を達成するために、Ｓｏｎｄｈｉらはその後、罹患マウスにおいて半球当たり４回の注射を行った。マウス脳にわたる１～２７倍の正常レベルのＴＰＰ－Ｉの発現は、ＬＩＮＣＬモデルにおける神経病理の低下および臨床疾患パラメータの改善（但し、正常化ではない）を可能にした。
結論として、ＭＰＳＩＩＩＡマウス研究の結果は、ＡＡＶｒｈ．１０血清型ベクターは、形質導入されたＭＰＳＩＩＩＡ脳細胞（おそらくは、神経細胞；［１０，１１］）が大量の活性なＳＧＳＨを産生および分泌することを可能にし、これは、次いで一次、二次およびその他の神経病理の極めて著しい低下を媒介することを示した。大量のＳＧＳＨが脳のいくつかの領域内で検出され、注射部位への近接と直接相関するようであった。
実施例３
ＬＹＳ－ＳＡＦ３０１を用いたヒト臨床研究
ヒト臨床試験は、安全性評価の第Ｉ／ＩＩ相非盲検、単一群、単施設研究として実施され、有効性に関する情報も提供した。簡単に記載すると、ＳＡＦ－３０１遺伝子治療ベクター（ＡＡＶｒｈ．１０－ｈＭＰＳ３Ａ、ヒトＳＧＳＨおよびヒトＳＵＭＦ１遺伝子産物をコードするＡＡＶベクター）を、単一の神経外科セッションで、画像で誘導された６つの路を通して、路あたり２つの沈着物を用いて脳の両側に送達した。患者は、診断および初期の神経学的症候の発症後、但し重篤な症状発現の前に、早期に注射を受けた。臨床試験のより詳細な説明を以下に提供する。
遺伝子治療ベクター
ＳＡＦ－３０１遺伝子治療ベクターを実施例１に記載のように調製した。治験薬の全ての製造、製剤化および包装は、適用可能な現在の優良製造規範に従っており、ヒトにおける使用に適用可能な基準を満たしていた。治験薬は使用前に－８０℃で保存した。
各患者は１２回の投与で７．２×１０１１ｇｃを受け、各投与は合計６０μｌ（０．６×１０１１ｇｃ）であった。提案された臨床用量の理論的根拠は、１つには、５．０×１０９～３．２×１０１２ｖｇの範囲のＡＡＶベクターの総用量が報告された毒性なしに投与された他の種類の病状を有する患者に対して行われた臨床試験の他に、安全であるとして０．６×１０１１ｖｇ／沈着物を確立した本明細書に記載された動物試験に基づいた。使用した体積は５０～１５０μｌであり、ベクター濃度は０．５～１．５×１０９ｖｇ／μｌであった 脳実質中へのＡＡＶ注射を使用する３つのヒト遺伝子治療試験が、参考文献［３２，３３，３４，３５，３６，３７，３８，３９，４０］に記載されている。
患者基準
４名の患者を処置した。
患者の主な選択基準には以下が含まれた：
（１）１８ヶ月～６歳；
（２）生後５年以内にＭＰＳＩＩＩＡの臨床症候を発症；
（３）対照の１０％未満の末梢血細胞および／または培養された線維芽細胞抽出物におけるＳＧＳＨ活性；
（４）家族による本手技の理解およびインフォームドコンセント；および
（５）正常な範囲内の重要な実験室パラメータ。
患者の除外基準には以下が含まれた：
（１）１ｃｍを超える皮質－硬膜距離で、ｐｒ－ｃｌｕｓｉｏｎ ＭＲＩ判定で脳萎縮の存在；
（２）独立歩行なし（補助なしで歩行する能力）；
（３）持続的な麻酔を禁忌とする任意の症状；
（４）ＭＰＳＩＩＩＡに関連しない任意の他の持続的な医学的症状；
（５）治験薬投与の前１ヶ月の任意のワクチン接種；
（６）１ヶ月以内のアスピリンの服用；
（７）ベクター注射前の６ヶ月間に与えられたＭＰＳＩＩＩＡの自然経過を修正することを目的とする任意の薬剤；および
（８）Ｐｒｏｇｒａｆ（登録商標）、Ｃｅｌｌｃｅｐｔ（登録商標）およびＳｏｌｕｐｒｅｄ（登録商標）での処置を禁忌とする任意の症状。
投与プロトコル
ベクターは、単一の神経外科セッションで、１つは深部、１つは表層に、画像で誘導された６つの路を通して脳の両側への直接脳内注射によって送達された。全ての注射は、単一の手術セッション中に行われる。前臨床研究および公表された文献は、単一の外科的セッションでのＡＡＶベクターの送達が、全ての保持された部位での効率的な遺伝子導入に十分であることを示している。１２の部位は以下のとおりであった。
表４．ベクター送達部位
Figure 2022551792000005
 併用免疫療法
処置は、上記遺伝子治療と以下の免疫抑制処置の組み合わせを含んでいた。
注射されたベクターとは別に、治験中に使用された薬剤には以下が含まれた：
（１）タクロリムス（Ｐｒｏｇｒａｆ（登録商標））を手術の１４日前に開始し、研究全体を通して維持した。開始用量は０．２ｍｇ／ｋｇ／日（２つの用量に分割して投与）であり、処置の７日後に、最初の３ヶ月間は１０～１５ｎｇ／ｍｌの残留用量を目標とし、４ヶ月目から少なくとも１年までは７～１０ｎｇ／ｍｌの残留用量を目標とするように適合させた；
（２）ミコフェノール酸モフェチル（Ｃｅｌｌｃｅｐｔ（登録商標））を手術の１４日前に開始し、経口溶液１ｇ／５ｍｌ中、１日２回、６００ｍｇ／ｍ２（最大２ｇ）で２ヶ月間維持した；
（３）免疫抑制処置は、手術前日から１０日間、プレドニゾロン（Ｓｏｌｕｐｒｅｄ（登録商標））を伴った
投薬のための適応規則を定めるために、１週間の処置後に４時間の短い薬物動態研究（Ｈ０、Ｈ０．７５およびＨ４）を行った。
手術の当日、患者は絶食した。
免疫抑制処置の使用は、イヌモデルＭＰＳＩＩＩＢおよびＭＰＳＩにおける研究の結果に基づいており、これらの研究において、遺伝子治療は、治療用タンパク質およびベクターウイルス抗原に対する脳内および脳外の免疫応答を予防するために効率的な免疫抑制処置の組み合わせを必要とすることが示された。
処置後、患者をモニターした。ＳＡＦ－３０１投与の１ヶ月および３ヶ月後、尿試料を採取し、ＳＡＦ－３０１ゲノム力価を測定した。ＳＡＦ－３０１ベクターの導入遺伝子に特異的なＤＮＡのｑＰＣＲ定量によりＧＭＯ検出を行った。
研究の最初の部分では、合計４人の患者がＳＡＦ－３０１を受けた。臨床試験プロトコルで定められた安全性パラメータの評価に基づいて、薬物は十分に忍容され、重篤な有害反応または疑われる予想外の重篤な有害反応は発生しなかった。
全体として、ＳＡＦ－３０１臨床試験からの安全性経験は、サンフィリポＡ型症候群の小児患者においてＳＡＦ－３０１に起因する重大な安全性リスクを特定しなかった。重大な安全性所見およびシグナルの欠如は、ＳＡＦ－３０１の安全性プロファイルがサンフィリポＡ型症候群患者の処置において使用するのに許容され得ることの裏付けを与える。
４名の患者は、２～４日以内に尿中のベクターの完全な消失を示した。
術後の臨床評価では、原因不明の持続的な発熱、発作または予想外の神経学的症候は示されなかった。
有害作用は観察されなかった。
最初の３名の患者は以下を示した：
－ 多動の著しい減少
－ 睡眠パターンの有意な改善
－ 集中力および社会化スキルの著しい向上。
これらの結果は、ヒト対象における処置の有効性を実証する。
実施例４
ＬＹＳ－ＳＡＦ３０２遺伝子治療ベクター
ＬＹＳ－ＳＡＦ３０２は、ニワトリβ－アクチンプロモーター／ウサギβグロビンイントロン（ＣＡＧプロモーター）に融合されたサイトメガロウイルスエンハンサーによって駆動されるヒトＳＧＳＨ遺伝子を含有する欠損ＡＡＶ２ゲノムを保有するＡＡＶｒｈ．１０ベクターである。簡潔には、接着性ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ２９３）細胞の三重一過性形質移入によってベクターを製造した。例えば、ＨＥＫ２９３細胞にｐ－ＬＹＳ－ＳＡＦ－Ｔ５、ｐＡＡＶ－ｒｈ１０およびｐＨＧＴＩを共形質移入し、細胞を培養して遺伝子治療ベクターを作製した。細胞採集および溶解工程の後、ｒＡＡＶの未精製ウイルス可溶化液は、深層濾過による清澄化、ＡＶＢ樹脂を用いたアフィニティークロマトグラフィーおよび接線流濾過を含むいくつかの精製工程を経た。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）緩衝液中でＬＹＳ－ＳＡＦ３０２を標的ベクター濃度に希釈し、０．２μｍ濾過によって滅菌した。
フォワードプライマー（ＣＣＡ ＧＣＣ ＣＣＴ ＣＣＡ ＣＡＡ ＴＧＡ）、リバースプライマー（ＣＡＣ ＴＧＧ ＡＧＴ ＧＧＣ ＡＡＣ ＴＴＣ ＣＡ）およびプローブ（ＣＡＴ ＣＣＣ ＴＧＴ ＧＡＣ ＣＣＣ）を使用し、検証されたＴａｑｍａｎ ｑＰＣＲ法を用いてＬＹＳ－ＳＡＦ３０２力価を測定した。
ＬＹＳ－ＳＡＦ ２プラスミド上のプロモーター、ｈＳＧＳＨ導入遺伝子、ポリＡ配列および隣接配列の概略図を図３に示す。特徴および各特徴についての配列番号９における位置の表が、以下の表５に提供されている。図４Ａおよび４Ｂは、ＬＹＳ－ＳＡＦ３０２粒子（配列番号９）中にキャプシド化された隣接配列およびＤＮＡの配列を提供する。図４Ｃ～図４Ｄは、ｈＳＧＳＨ導入遺伝子を含む発現カセットを含有するプラスミドｐ－ＬＹＳ－ＳＡＦ－Ｔ５（配列番号１４）の全配列を表す。図４Ｅ～図４Ｆは、キャプシドｒｈ１０を含有するプラスミド（ｐＡＡＶ２－ｒｈ１０；配列番号１５）配列の配列を表す。図４Ｇ～図４Ｋは、ヘルパープラスミドｐＨＧＴＩ、すなわちアデノウイルスのヘルパー機能を有するプラスミド（配列番号１６）の配列を表す。
表５．ＬＹＳ－ＳＡＦ３０２成分の表
Figure 2022551792000006
発現カセットは、ＣＭＶ初期エンハンサー／ニワトリβアクチン（ＣＡＧ）プロモーター、ヒトＮ－スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼｃＤＮＡ（ｈＳＧＳＨ）およびヒト成長ホルモン１ポリＡ単位（ｈＧＨ１ポリＡ）を順に含む。１４５ヌクレオチドを含有する第１のＡＡＶ２逆位反復（ＩＴＲ）および１４５ヌクレオチドを含有する第２のＡＡＶ２ＩＴＲは、発現カセットの両側に隣接している。２つのＩＴＲ末端は、ゲノム複製およびパッケージングのために必要とされる唯一のシス作用性エレメントである。ｈＧＨ１ポリＡ単位は、ｍＲＮＡ安定性およびｍＲＮＡ翻訳への核外輸送に関与する。なお、ＳＡＦ３０１と異なり、ＳＡＦ３０２はＳＵＭＦ１遺伝子またはＩＲＥＳ配列を含まない。ＳＡＦ３０２は、ＳＡＦ３０１とは異なるプロモーター（ＣＡＧプロモーター）も有する。ＳＡＦ３０２は、第１世代のＳＡＦ３０１ベクターと比較してより高い酵素発現を示す。
ＬＹＳ－ＳＡＦ３０２ＤＮＡは４．０７ｋｂからなり、配列分子量は１２５７．４ｋＤａである。ＳＧＳＨ配列は１．５３ｋｂからなり、ＳＧＳＨ ＤＮＡ配列の分子量は４７１．３ｋＤａである。
実施例５
ＬＹＳ－ＳＡＦ３０１とＬＹＳ－ＳＡＦ３０２の比較研究
脳における導入遺伝子の発現および産生、ならびに機能的活性の達成を実証および比較するために、ＬＹＳ－ＳＡＦ３０２およびＬＹＳ－ＳＡＦ３０１を用いて研究を行った。８～１４週齢で、ＭＰＳＩＩＩＡマウス（群あたり６匹）に、動物あたり４Ｅ＋０９ｖｇの用量で尾状核被殻／線条体中へのビヒクル（ＰＢＳ）、ＬＹＳ－ＳＡＦ３０１またはＬＹＳ－ＳＡＦ３０２のいずれかの両側脳内注射を行った。
結果は、ＬＹＳ－ＳＡＦ３０２がＬＹＳ－ＳＡＦ３０１と比較して優れた発現を与えることを示した。注射の４週間後、ＬＹＳ－ＳＡＦ３０２は、注射されたマウスの脳内で、ＬＹＳ－ＳＡＦ３０１を注射されたマウスよりも２．７倍高いＳＧＳＨ酵素の増加をもたらした（図５）。ＬＹＳ－ＳＡＦ３０１では、全体的なヘパラン硫酸（ＨＳ）のわずかな低下が見られた。対照的に、ＬＹＳ－ＳＡＦ３０２は、ＬＹＳ－ＳＡＦ３０２処置後、注射後のわずか４週間で、ＭＰＳＩＩＩＡにおける９．２倍のＷＴレベルから４．７倍へのＨＳレベルの有意な低下をもたらした（図６）。このように、ＬＹＳ－ＳＡＦ３０２は、ＬＹＳ－ＳＡＦ３０１と比較して、有意に高い酵素発現およびＨＳレベルの有意な低下をもたらした。
研究は、ＬＹＳ－ＳＡＦ３０２の免疫原性を評価し、その免疫原性をＬＹＳ－ＳＡＦ３０１の免疫原性と比較するためにも行われた。結果は図７Ａ～７Ｅに提供されており、ケモカインおよびサイトカインの有意な低下がＬＹＳ－ＳＡＦ３０１およびＬＹＳ－ＳＡＦ３０２処置されたマウスにおいて観察されたことを示す。ＭＩＰ－１α、ＭＣＰ－１およびＩＬ－１αタンパク質（それぞれ、図７Ａ、図７Ｂおよび図７Ｃ）は、ＷＴと比較して非処置ＭＰＳＩＩＩＡマウスにおいて有意に上昇した。各処置群でＭＩＰ－１αが低下する傾向が存在したが、レベルは非処置と比較してＬＹＳ－ＳＡＦ３０２処置されたマウスにおいてのみ有意に低下した。全ての処置群で、ＭＣＰ－１の有意な低下が観察された。ＩＬ－１αのレベルは全ての処置で低下したが、有意な低下は、ＬＹＳ－ＳＡＦ３０２による処置でのみ観察された。ＲＡＮＴＥＳおよびＫＣでは有意差は観察されなかった（図７Ｄおよび７Ｅ）。いずれのベクターも、皮質内注射後に抗体応答を誘発しなかった。要約すると、結果は、炎症性サイトカインがＬＹＳ－ＳＡＦ３０１またはＬＹＳ－ＳＡＦ３０２の投与によって低下したが、ＬＹＳ－ＳＡＦ３０２は特定のサイトカインのより有意な低下を示したことを示した。
まとめると、ＬＹＳ－ＳＡＦ３０１をＬＹＳ－ＳＡＦ３０２と比較する薬力学研究により、第二世代製品ＬＹＳ－ＳＡＦ３０２は、第一世代製品ＬＹＳ－ＳＡＦ３０１と比較して、より高い酵素発現ならびに病原性基質および炎症マーカーのより良好な低下を示し、両者の間で同等の免疫原性プロファイルを有することが確認された。
実施例６
ＬＹＳ－ＳＡＦ３０２の薬理学
ＬＹＳ－ＳＡＦ３０２ベクターのインビトロ発現および効力を評価するために、半定量的ウエスタンブロットおよび酵素アッセイに基づく二重発現／効力（機能）アッセイを開発しした。最初に、ＨｅＬａ細胞（１２ウェルプレート形式で播種）に、５０，０００；１００，０００；および５００，０００ＭＯＩ（感染効率）で、ｒＡＡＶ２／ｒｈ１０ベクターＬＹＳ－ＳＡＦ３０２を形質導入した。細胞感染用ベクターの量は、下記式に基づいて算出した。
μＬでのベクター体積（Ｖ）＝
（ＭＯＩ×ウェル当たりの細胞数×１０００）／
（ｖｇ／ｍＬでのベクター力価）
形質導入の約７２時間後、ＨｅＬａ細胞を培養プレートから収集し、遠心分離した。細胞ペレットを溶解緩衝液で処理し、凍結融解サイクルを適用して細胞からタンパク質を抽出した。細胞懸濁液を遠心分離し、上清を新しいチューブに移した。
次いで、これらの試料を－８０℃に移し、その後、ウエスタンブロットアッセイによってＳＧＳＨの発現を検出し、効力アッセイによって酵素活性を決定するために使用した。電気泳動ゲル（ＳＤＳ－Ｐａｇｅ）に規定量のタンパク質を搭載するために総タンパク質定量を使用したので、ウエスタンブロット分析の前に、ＢＣＡアッセイ（ビシンコニン酸アッセイ）によって細胞可溶化液の総タンパク質含有量を決定した。タンパク質発現の定量を可能にするために、既知量のｈＳＧＳＨを使用した標準曲線も含めた。タンパク質をそれらの分子量に応じて分離することを可能にする電気泳動後、タンパク質をニトロセルロース膜に転写した。次いで、抗アクチンおよび抗ＳＧＳＨ抗体ならびに蛍光色素結合二次抗体を使用して、目的のタンパク質を明らかにした。およそ５７ｋＤａの分子量での蛍光シグナルを通じてｈＳＧＳＨタンパク質発現を測定し、およそ４２ｋＤａで観察されたアクチンタンパク質の蛍光シグナルによって正規化した。発現結果をμｇとして表した。
Ｋａｒｐｏｖａら（１９９６）によって開発された酵素アッセイによって効力を決定した。簡潔には、ＳＧＳＨは、２－スルファミノ－２－デオキシ－ｄグルコピラノシル残基のＮ－サルファートを切断して、４ＭＵ－αＧｌｃＮＨ２を生成する。次いで、グルコサミン残基に対するα－グルコサミニダーゼ活性のために、α－グリコシダーゼによる消化によって４ＭＵ部分が遊離される。効力の結果をｎｍｏｌ／時間／ｍｇで表した。
２つのアッセイの結果を図８および図９に示す。陰性対照と感染した細胞の間で増加が観察された。さらに、ＭＯＩの増加に伴って発現およびわずかな効力の増加が観察された。
実施例７
ＬＹＳ－ＳＡＦ３０２を用いた動物研究
ＬＹＳ－ＳＡＦ３０２の有効性、投与量決定および毒性研究をＭＰＳＩＩＩＡマウス、イヌおよび非ヒト霊長類（ＮＨＰ）で行った。
マウス研究
５週齢のＭＰＳＩＩＩＡマウスにおいて、ＬＹＳ－ＳＡＦ３０２の有効性／毒性学および投与量決定研究を行った。５週齢で、ＭＰＳＩＩＩＡマウス（１群あたり性別あたり５匹）は、尾状核被殻／線条体および視床の各々の中への、ビヒクル（ＰＢＳ）またはＬＹＳ－ＳＡＦ３０２の３つの異なる用量（８．６Ｅ＋０８、４．１Ｅ＋１０および９．０Ｅ＋１０ｖｇ／動物）の１つのいずれかの両側脳内注射を受けた。マウスは、ハミルトンシリンジへのポリエチレンチューブを介して接続された２７Ｇ針を介して、０．２μｌ／分の速度で合計８μＬのＬＹＳ－ＳＡＦ３０２またはビヒクル（部位当たり２μｌ）を受けた。白色線維束を含めることを試みて、（ブレグマに対する）両側標的部位は、線条体の後面－Ａ０．７５ｍｍ、Ｌ１．５ｍｍ、Ｖ３ｍｍおよび視床－Ｐ２ｍｍ、Ｌ１．５ｍｍ、Ｖ３ｍｍであった。マウスには、疼痛緩和のために０．０５ｍｇ／ｋｇのブプレノルフィンを与え、手技の間の体液補充のために生理食塩水中４％デキストロースを与えた。５つの半冠状切片の注射部位および位置を図１０に示す。
全てのマウスを１５週齢でオープンフィールド（行動）試験に供した。１７週齢（術後１２週）で、所定のコホートのマウスを安楽死させ、完全な死後分析を行った。残りのマウスは、２８週齢でオープンフィールド試験を受け、３０週齢（術後２５週）で安楽死させた。ＳＧＳＨ活性およびＨＳ蓄積を３つの脳切片で評価した：脳の最前部に位置する切片１；注射部位の近くに位置する切片３；小脳を含有する切片５。
蛍光発生基質４－メチルウンベリフェリル－β－Ｄ－Ｎ－グルコサミニド（４ＭＵ－αＧｌｃＮＳ）を用いて、脳ホモジネート中のＳＧＳＨ活性を測定した。結果は、４ＭＵ標準曲線と比較してｐｍｏｌ／分／ｍｇ総タンパク質として表した。
３０週齢（処置後２５週）まで持続したＬＹＳ－ＳＡＦ３０２投与後１２週の期間で、ＳＧＳＨ活性の用量依存的増加（図１１）および一次ヘパラン硫酸（ＨＳ）蓄積の用量依存的低下（図１２）が認められた。全体的には、脳の最前部（切片１）または小脳を含有する切片（切片５）と比較して、注射部位（切片３）の近くで処置のより高い効果が観察された。
さらに、図１３Ａ～図１３Ｆに示されているように、ＧＭ２／ＧＭ３の二次蓄積、エンド／リソソーム系の拡大、アストログリオーシスおよびミクログリオーシス、ならびに軸索スフェロイドの解消が、３０週齢（処置後２５週）まで持続したＬＹＳ－ＳＡＦ３０２投与後１２週の期間で認められた。ガングリオシドの二次蓄積は、ＭＰＳＩＩＩＡ２１を含むいくつかのＭＰＳ疾患で報告されている。処置の１２週後および２５週後に脳切片１、３および５において（図１０に示されているように）、ＧＭ２およびＧＭ３を測定した（注射後２５週間の切片３のデータを図１３Ａおよび図１３Ｂに示す）。全てのビヒクル処置ＭＰＳＩＩＩＡマウスは、３つ全ての脳切片においてＧＭ２／３の有意な増加を示し、２つの安楽死年齢のそれぞれで観察可能な結果であったビヒクル処置コホートまたはＬＹＳ－ＳＡＦ３０２処置コホートのいずれにおいても、ガングリオシドレベルに対する性別の影響は存在しないようであった。３つの用量のＬＹＳ－ＳＡＦ３０２の各々は、脳切片１および３中のＧＭ２およびＧＭ３ガングリオシドレベルの正常化をもたらした（図１３Ａ、１３Ｂ）。切片５ではガングリオシドレベルは正常化されなかったが、処置後にＧＭ２およびＧＭ３レベルの低下が存在し、特により高い２つの用量で顕著であった。
エンドソーム／リソソームの拡大およびスフェロイドの病変からなる、ＭＰＳＩＩＩＡに関連する特徴的な神経細胞の形態学的異常を、処置後１２週間および２５週間でいくつかの脳領域において評価した。リソソーム内在性膜タンパク質－２（ＬＩＭＰ２）免疫組織化学によって反映されたエンドソーム／リソソームの拡大が、１７週および３０週の選別群の両方で、調べた大部分のＭＰＳＩＩＩＡビヒクル処置マウス脳領域において有意に増加した（図１３Ｃに示される注射２５週後での下丘の代表的なデータ）ＬＩＭＰ２染色の用量依存的低下が脳の吻側－尾側軸にわたって観察され、特に中用量および高用量のＬＹＳ－ＳＡＦ３０２で処置したマウスにおいて、処置後２５週間まで維持された。
５μｍを超えるユビキチン陽性スフェロイドの病変の数が評価され、両選別時点において、年齢が一致する非罹患ビヒクル処置マウスと比較して、ビヒクル処置ＭＰＳＩＩＩＡマウスの脳において全ての領域がユビキチン反応性病変の有意な増加を示した（図１３Ｄに示される注射後２５週での下丘の代表的なデータ）。全てのＬＹＳ－ＳＡＦ３０２用量は、脳梁を除いて、検査した全ての脳領域の病変数を有意に減少させた。
グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）の免疫組織化学的検出を使用してアストログリアの活性化の存在によって、およびイソレクチンＢ４反応性アメーバ様ミクログリアの組織化学染色を使用して活性化されたミクログリアの存在によって、ＭＰＳＩＩＩＡに関連する神経炎症を評価した。歯状回および小脳を除いて、星状膠細胞活性化を示す有意に増加したＧＦＡＰ発現が、年齢が一致した非罹患ビヒクル処置マウスと比較して、両時点でビヒクル処置ＭＰＳＩＩＩＡマウスの脳領域中に観察された。注射の２５週後の下丘の代表的なデータを図１３Ｅに示す。処置効果を１７週齢で識別することは困難であり、尾状核、視床および下丘でＧＦＡＰ発現の低下は認められなかった。注射領域からさらに離れて、初期の選別時点で、脳幹および吻側皮質および下丘にＧＦＡＰ染色の低下が存在した。３０週齢までに、下丘の両レベルは、特により高い２つの用量でＧＦＡＰの有意な低下を示した（図１３Ｅ）。しかしながら、この時点で、低用量処置ＭＰＳＩＩＩＡマウスと比較して、中用量および高用量処置ＭＰＳＩＩＩＡマウスの吻側皮質（正中線）および尾状核注射レベルで有意により多くのＧＦＡＰが観察された。
ビヒクルで処置された非罹患マウス脳と比較して、多数の活性化されたミクログリアが、ビヒクルで処置されたＭＰＳＩＩＩＡマウス脳において明白であった。３つの投与は全て、本質的に、脳のより吻側／中心側の態様にわたって、不活性化と解釈されるミクログリアの形態の正常化をもたらした。この結果は３０週齢まで維持された。注射後２５週での歯状回の代表的なデータを図１３Ｆに示す。用量依存的な結果が脳幹および小脳において認められ、低用量は、いずれの時点においても、小脳でミクログリアを不活性化することができなかった。
１５週齢および２８週齢の両方の雌マウスからのオープンフィールドデータは、雌のビヒクル処置ＭＰＳＩＩＩＡマウスが、非罹患ビヒクル処置雌マウスと比較して特徴的なより低いオープンフィールド活性を示すことを示したが、おそらくは検出力不足のために、データは統計学的有意性に達することができなかった。ＬＹＳ－ＳＡＦ３０２処置マウス、特に中用量および高用量を投与されたコホートの成績の改善が観察された。
１５週齢および２８週齢の両方において、雄ビヒクル処置ＭＰＳＩＩＩＡマウスは、この試験において特徴的なより低いオープンフィールド活性を示すことができなかった。しかしながら、雄の高用量処置ＭＰＳＩＩＩＡマウスは、１５週齢において、それらの非罹患およびＭＰＳＩＩＩＡビヒクル処置対応物よりも有意に活性が低かった。２８週齢までに、高用量処置ＭＰＳＩＩＩＡ雄における立ち上がり運動のみが、非罹患の同齢雄と比較して統計学的に有意に異なることが証明された。
雄マウスにおける異常な行動の理由は不明である。これらの行動の相違を裏付けることができる組織病理学的分析中に、雄と雌の間に相違は見出されなかった。
まとめると、マウス研究からのデータは、ＬＹＳ－ＳＡＦ３０２が、この実験の時間枠（すなわち、投与後２５週間）においてＭＰＳＩＩＩＡ関連脳病理に対する用量依存的効果を媒介することができることを示した。これは、いくつかの事例では、既存の疾患病変（投薬時に著しいレベルで存在するであろうＨＳ蓄積、リソソーム拡大およびミクログリオーシス）を軽減すると解釈される。これらのタイプの病変は発症するのがより遅く、処置開始の時点でより低いレベルで存在していたか、または一部の脳領域にのみ存在していたはずなので、他の事例では、病変形成、例えば、アストログリオーシスおよび軸索スフェロイド形成の発症を予防するとも解釈される。活性化されたミクログリアによって媒介される神経炎症はＭＰＳの発病および疾患進行において重要な役割を果たすと考えられているので、ＬＹＳ－ＳＡＦ３０２がＭＰＳＩＩＩＡマウスの脳におけるミクログリオーシスを有意に減少させる能力は特に適切であった。ＭＰＳＩＩＩＡ２３において神経細胞の損傷を引き起こし、悪化させると考えられているミクログリアの神経炎症性表現型の長期にわたる反転を引き起こすＬＹＳ－ＳＡＦ３０２の能力は、その治療的可能性に大きな意味を有し得る。
イヌ研究
様々な注射パラメータを評価する非ＧＬＰイヌ体内分布研究を行った。これらの研究の目的は、ＭＲＩ Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎｓ ＳｍａｒｔＦｌｏｗカニューレを使用して、成体および若年個体の脳における分布に対する様々な注入体積および注入速度の影響を評価することであった。
成体ビーグル犬で行われた１つの研究では、１．０Ｅ＋１２ｖｇ／ｍＬおよび１０μＬ／分の注射速度で、ＭＲＩ造影剤ガドリニウム（２～５ｍｍｏｌ）とともにＬＹＳ－ＳＡＦ３０２を白質中に共注入した。４匹の動物に半球当たり５００μＬの注射を１回行い（総用量１．０Ｅ＋１２ｖｇ／ｍＬ）、１匹の動物に半球当たり５００μＬの注射を２回行った（総用量２．０Ｅ＋１２ｖｇ／ｍＬ）。注射は１０μＬ／分の注入流速を用いて行った。注射後に撮影したＭＲＩ画像を分析して、トレーサーの分布を定量化した。全ての動物は予定された剖検時まで生存し、体重に変化はなく、臨床所見もなく、肉眼的な試験品関連所見も存在しなかった。注射後１週間または４週間で動物を人道的に安楽死させた。脳の右および左半球を４ｍｍ厚の切片に切断した。偶数のスラブを無菌ペトリ皿に入れ、直ちに８ｍｍ生検パンチ（４０個／動物）を採取し、半分に切断して、半分をｑＰＣＲ用に、半分をＳＧＳＨ酵素分析用とした（４週終点群）。
ＭＲＩを手術直後に実施し、Ｏｓｉｒｉｘソフトウェアを用いて、収集した画像を分析してガドリニウム信号を定量化した。図１４Ａは、注射部位を含む冠状切片の位置を伴ったイヌ脳の左側面図である。次いで、半球当たりのガドリニウムシグナルの体積を対応する注射体積に対して正規化し、ガドリニウム分布体積／注射された体積の比として表した。図１４Ｂ～図１４Ｃは、注射前の冠状切片のＭＲＩ画像であり、予定された注射部位が赤色のドットスポットで表されている。図１４Ｄ～図１４Ｅは、白質中への可視的ガドリニウム信号を注入した後の冠状切片のＭＲＩ画像である。図１４Ｆは、ＭＲＩ画像の３Ｄ再構成の前面図であり、白質の吻側－尾側軸に沿って両半球中にガドリニウム信号が見える。結果は、ＳｍａｒｔＦｌｏｗ（登録商標）カニューレが良好に機能し、逆流は検出されなかったことを示している。試験物の１つの路当たり５００μＬの投与は、吻側および尾側注射路の両方で側脳室への漏出を伴うことが明らかとなった。ガドリニウム分布体積／注入された体積の平均比は、３．１＋／－０．２であった（表６）。
導入遺伝子に特異的なプライマーおよびプローブを用いたＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲによってベクターコピー分析を行った。この（またはより高い）レベルには常にＳＧＳＨ活性の増加が伴ったという観察に基づいて、細胞あたり０．１ベクターコピーの閾値を設定した。ＬＹＳ－ＳＡＦ３０２の注射の４週間後、細胞あたり０．１を超えるベクターコピーが、試験した脳パンチの３７％（＋／－４）で見られた（表６）。
蛍光発生基質４－メチルウンベリフェリル－β－Ｄ－Ｎ－グルコサミニド（４ＭＵ－αＧｌｃＮＳ）を用いて、脳ホモジネート中のＳＧＳＨ活性を測定した。結果は、２匹の異なる動物の２つのビヒクル注射された半球からの８０個の脳パンチの平均値として決定された内因性活性の％として表した。２０％を超えるＳＧＳＨ活性の増加が、試験した脳パンチの７８％（＋／－６）で見られた（表６）。
表６：注射後４週のイヌ脳における体内分布データ。注射後４週の終点で、３匹のイヌからのＬＹＳ－ＳＡＦ３０２を注射された６つの半球から得たデータ。
Figure 2022551792000007
Figure 2022551792000008
まとめると、結果は、ＭＲＩ介入カニューレが１０μＬ／分の注射速度で逆流が検出されることなく良好に機能したことを示した。半球あたり１回の注射を行った動物と、半球あたり２回の注射を行った動物との間に大きな差は見られなかった。これは、２つの注射部位からの拡散の重複、および約７５ｃｍ３の脳の極めて狭い白色線維束に起因する注射された体積の一部の側脳室中への漏出の可能性を反映する。イヌ脳中の約７５ｃｍ３の白色線維束が極めて狭いために、注射された体積の一部が側脳室中に漏出するにもかかわらず、本研究は、１．０Ｅ＋１２のベクター濃度での半球当たり５００μＬの３回の注射が、少なくとも２０％の酵素活性増加の治療レベルで子供の脳の大部分をカバーするのに十分であるはずであることを示す。
５μＬ／分の低下した注射速度でより低い体積（３００μＬまで）を使用して、１２週齢のイヌにおいてさらなるパイロット研究を行った。３匹の動物に、半球あたり１回のＬＹＳ－ＳＡＦ３０２またはＰＢＳの注射（２００μＬまたは３００μＬ）を行い、１匹の動物には、半球あたり２回の右半球へのＬＹＳ－ＳＡＦ３０２または左半球へのＰＢＳの注射（２×２００μＬ）を行った（６Ｅ＋１１ｖｇ～１．８Ｅ＋１２ｖｇの総用量）。ガドリニウム分布体積／注射された体積の平均比は２．９（＋／－０．５）であり、細胞あたり０．１を超えるベクターコピーが試験された脳パンチの３７％（＋／－９）で見出され、２０％を超えるＳＧＳＨ活性増加が試験された脳パンチの５３％（＋／－８）で見出された。
非ヒト霊長類（ＮＨＰ）研究
非ヒト霊長類（ＮＨＰ）も毒性を評価するために使用される動物モデルであり、脳の解剖学的形態はイヌの解剖学的形態よりもヒトに似ている。したがって、ヒトにおける脳分布および毒性学の結果のより優れた予測を提供するために、ＧＬＰ毒性学／体内分布／投与量決定研究で使用するためにＮＨＰが特に選択された。並行して、装置を実際に操作する経験を神経外科医に提供し、注射体積の体内分布および（脳体積に対する）総用量を決定するために、ＮＨＰにおける非ＧＬＰ研究を実施した。
これらの研究の目的は、ＭＲＩ Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎｓ ＳｍａｒｔＦｌｏｗカニューレを使用して、中心的な臨床試験で試験されるものと同様の注射速度、（脳体積に関連する）総体積および（脳体積に関連する）総用量で、白質繊維（ｗｈｉｔｅ ｆｉｂｅｒ ｍａｔｔｅｒ）への直接注射によって投与されるＬＹＳ－ＳＡＦ３０２のＮＨＰ安全性および体内分布データを取得することであった。これらの研究は、臨床手術状況を使用して、この新しい装置を実際に操作する経験も神経外科医に提供した。
３匹の雄カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）（４．２歳～４．５歳）に、ＬＹＳ－ＳＡＦ３０２（ｎ＝２）またはＰＢＳ（ｎ＝１）を投与した。３Ｅ＋１２ｖｇ／ｍＬで、ＬＹＳ－ＳＡＦ３０２をＭＲ造影剤ガドリニウム（０．１２５ｍｍｏｌ／ｍＬ）と共注入した。５０μＬの４回の注入を各動物（半球あたり２回）において白質中に行った（７．２Ｅ＋１１ｖｇの総用量）。ベクターコピー数およびリソソーム酵素活性（ＳＧＳＨ）分布を注射後６週に測定した。
導入遺伝子に対して特異的なプライマーおよびプローブを用いたＴａｑｍａｎ ｑＰＣＲを使用してベクターコピー分析を行った。イヌ研究と同様に、細胞あたり０．１ベクターコピーの閾値を設定した。ＬＹＳ－ＳＡＦ３０２の投与の６週間後、細胞あたり０．１を超えるベクターコピーが、試験した脳パンチの１１％（＋／－１）において見出された（表６）。
４ＭＵ－αＧｌｃＮＳを用いて、脳ホモジネート中のＳＧＳＨ活性を測定した。結果は、１匹のＰＢＳ注射された動物の２つの半球からの８５のパンチの平均値として決定された内因性活性の％として表した。ＳＧＳＨ酵素活性分析も行い、結果を内因性活性の％として表した。注射の６週間後、２０％を超えるＳＧＳＨ活性の増加が、試験した脳パンチの９７％（＋／－２）で見られた（表６および図１５）。
表６．注射後６週のＮＨＰ脳における体内分布データ。注射後６週の終点で、２匹のＮＨＰからのＬＹＳ－ＳＡＦ３０２を注射された４つの半球から得たデータ。
Figure 2022551792000009
注射された体積に対して正規化すると、ベクター拡散は、イヌ研究（５００μＬまたは１ｍＬの注射で３７％をカバー）と比較してＮＨＰ研究（１００μＬの注射で脳の１１％をカバー）においてより広く、ＮＨＰ脳のより大きな白色線維束およびより低い注射された体積の故に側脳室中への注射された体積の漏出が低下したことを反映している。イヌと比較してＮＨＰにおけるベクター拡散の絶対レベルはより低いにもかかわらず、ＳＧＳＨ活性はＮＨＰ脳全体により広く分布していた（脳の９７％で少なくとも２０％の活性増加に対してイヌでは７８％）。２つの研究間で観察された差は、あり得る種差によるものであり得、またはイヌにおける４週間の期間と比較して６週間の期間後でのＮＨＰ脳におけるより良好な酵素分泌および広範な拡散を反映し得る。結果は、ＭＲＩ介入カニューレが５μＬ／分の注射速度で逆流が検出されることなく良好に機能したことを示した。試験した脳パンチの１１％（±１）が細胞あたり０．１を超えるベクターコピーを有するが、試験した脳パンチの９７％（±２）は、６週間の期間中の全脳での酵素分泌および拡散を反映して２０％を超えるＳＧＳＨ活性増加を発現する。
結論として、動物研究の結果は、ＭＰＳＩＩＩＡの遺伝子治療のための有望な新しい候補としてＬＹＳ－ＳＡＦ３０２を検証した。７．２Ｅ＋０８ｖｇ／ｇ脳の用量で、ＭＰＳＩＩＩＡを有する４人の子供において第一世代ベクターＬＹＳ－ＳＡＦ３０１を用いて行われた第１／２相試験では、改善の有望な徴候が認められた。本開示は、第一世代ベクターより約３倍強力であるのみならず、１０倍高い臨床用量（７．２Ｅ＋０９ｖｇ／ｇ脳）であり、最適化された送達技術を使用する、本明細書に記載の第二世代ベクターを提供する。理論に拘束されることを望むものではないが、本研究の結果は、比較的低用量のＬＹＳ－ＳＡＦ３０２が、ＭＰＳＩＩＩＡ患者の脳全体にわたって正常なＳＧＳＨ活性の少なくとも２０％を回復させることができるはずであることを示している。いくつかの実施形態において、酵素活性のこのレベルの回復は、疾患進行に対して著しい良い影響を有する。
実施例８
単一深さ注射
ＬＹＳ－ＳＡＦ３０１の臨床研究のように２つの深さにわたる送達ではなく、単一の深さでより大きな注射体積を使用して分布を増強できるかどうかを調査するために、およびＬＹＳ－ＳＡＦ３０２ベクターの長期発現を評価するために、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）が導入遺伝子を置き換えたＬＹＳ－ＳＡＦ３０２改変体を作製した。ベクターＳＡＦ３０２ＧＦＰは、ｈＳＧＳＨ遺伝子をＧＦＰ遺伝子で置き換えた以外は、ＬＹＳ－ＳＡＦ３０２と同一であった。ＳＡＦ３０２ＧＦＰの注射の４ヶ月後にマウスを評価するためにＧＦＰ分布研究を行った。
単一の線条体内深さでの両側注射によって、ＭＰＳＩＩＩＡマウスに、８～１４週齢でＡＡＶ－ＳＡＦ３０２ＧＦＰの定位注射を行い、ベクターは、両半球中、正中線に対して２ｍｍ外側、３ｍｍの単一の深さで送達された３μＬ中の６．１×１０９個のゲノム粒子の用量で投与された（図１６Ａ；ｎ＝５）。次いで、注射後約４ヶ月であった約６ヶ月齢で動物を屠殺した。比較のために、ＭＰＳＩＩＩＡマウスの２つの深さ群に、８～１４週齢でＡＡＶ－ＳＡＦ３０２ＧＦＰの定位注射を行い、４μＬ中４．１×１０９ゲノム粒子の用量でベクターを投与し、それぞれ両半球中、正中線に対して２ｍｍ外側にある２つの線条体内（ｉｎｔｒａｓｔｒａｔｉａｌ）深さ（２および３ｍｍ）で１μＬの沈着物を介して送達した。２つの深さ群のマウスを手術後約４週間で屠殺した。脳全体にわたるベクター分布の包括的概観を与えるために、冠状切片および矢状切片をＮｅｕＮ、ＧＦＰおよびＤＡＰＩで共標識した。
脳切片の画像化は、２つの深さで注射を受けた動物と比較して、単一の深さで注射を受けた動物におけるベクター分布の増強を実証した。図１６Ｂ～図２４Ｅは、単一の深さ群において収集されたデータを示す。最大ＧＦＰ発現は注射部位の局所に存在し、この領域からの距離が増加するにつれて範囲および強度が低下した。冠状切片２は、注射部位から放射状に広がる線条体全体のＧＦＰ陽性細胞を示す。ＧＦＰ陽性細胞は、外包の白質路に接触している線条体および皮質に沿って、および脳梁内にも見られた。発現は、２つの深さ研究におけるマウスと比較して冠状切片３においてかなり大きく、海馬内のＧＦＰ陽性細胞のより広範な広がりを有し、ベクターの増加した広がりを示した。内包の染色も明らかであり、冠状切片４中の内包から生じ、脳脚中でベクターの広がりが明らかであった（図１６Ｂ）。
海馬および線条体の高倍率画像（図１６Ｃに示される矢状断片において破線の枠によって示される）により、ＳＡＦ３０２ＧＦＰベクターの神経細胞特異性が確認され（それぞれ、図１６Ｄおよび図１６Ｅ）、神経細胞核マーカーであるＮｅｕＮとのＧＦＰの強い共局在を伴い、ＧＦＰは神経細胞の突起に沿って伸びていた。
２つの深さ動物と単一の深さ動物の両方におけるＧＦＰと星状膠細胞マーカーＧＦＡＰの共染色は、星状膠細胞の一部も神経細胞と一緒に形質導入されたことを示した（図１７Ａ（２つの深さ）および図１７Ｂ（単一の深さ））。しかしながら、標的とされた星状膠細胞の割合は、神経細胞と比較して低下した。
単一の深さ動物におけるＳＡＦ３０２ＧＦＰの線条体内注射後に、小脳内の細胞は形質導入されず、２つの深さの試験群で達成された結果と同様であった。２つの注射戦略の使用後でのブレグマを横切るＧＦＰの発現を、総脳領域に対するＧＦＰ陽性細胞の百分率として定量した（図１７Ｃ～１７Ｅ；ｎ＝５動物／群）。注射部位（ブレグマ＋０．２６）の近傍では、単一注射戦略は、２つの深さ戦略と比較して全体的なＧＦＰの増加をもたらした（図１７Ｄ）。単回ボーラス注射では、注射部位の遠位の細胞の形質導入の増加も明らかであったが、遠位部位での二重高さ注射からの形質導入はほとんど見られなかった（図１７Ｃおよび図１７Ｅ）。
研究の結果は、予想外にも、単一深さ戦略で投与された体積の低下にもかかわらず、２つの深さでのＬＹＳ－ＳＡＦ３０２の注射が単一の深度での注射よりも効率的でなかったことを示した。ベクターは、単一の注射深さ研究では有利に起こったように注射部位の末端から側方に拡散するのではなく、２つの深さでの注射では、より注射路に沿って分布した。理論に束縛されることを望むものではないが、これは、単一の深さでウイルスのボーラスを送達するときに達成され得るより大きな側方圧力を作出することよりむしろ、針が引き抜かれるときのベクターの逆流を反映するものであり得る。
実施例９
ＳＡＦ－３０２のヒト臨床試験
サンフィリポＡ型症候群に罹患している対象へのＬＹＳ－ＳＡＦ３０２の脳内投与の安全性および有効性を評価するために、第２／３相単一群非盲検多施設介入試験を行う。この研究は、３年間の長期追跡調査を含む。７．２Ｅ＋１２ｖｇ（６つの注射部位（半球あたり３つ）、注射あたり５００μＬ）の単回用量を脳の両側のテント上領域において対象に投与する。ＬＹＳ－ＳＡＦ３０２は、被殻に隣接する白質を標的とするために、単一の神経外科セッションで、画像によって誘導される６つのテント上の路を通して注射される。
一次有効性分析は、処置後２４ヶ月で行う。術後１年目に中間解析を実施して、有効性の潜在的な早期シグナルを同定する。予想される処置効果は、ベースラインでの年齢およびＤＱに基づいて、予測可能な疾患経過を有するように選択された研究集団における疾患進行の少なくとも停止である。ベースラインと２４ヶ月の間の比（ＤＱ２４／ＤＱ０）によって表されるＤＱの観察された（術後の）進化と、本研究の適格基準を満たした２つの自然史研究（Ｓｈａｐｉｒｏら、２０１６およびＳＡＦ３０１の第１／２相試験から臨床的に終了した患者）中の１２人の患者からのデータに基づいて回帰係数を適用することによって計算された予想比とを比較することによって、有効性を評価する。１２ヶ月および２４ヶ月での処置の非存在下での予測される認知結果を計算するために、それらを使用する。
第２／３相臨床試験のために、臨床グレードのＳＡＦ３０２遺伝子治療ベクターをＧＭＰ管理下で作製した。賦形剤または防腐剤を含まないＰＢＳ緩衝剤中で最終生成物を製剤化した。溶液は透明からわずかに乳白状であり、白っぽいないし半透明の小さな粒子を含有し得る。粒子の存在は、薬物製品ＬＹＳ－ＳＡＦ３０２の強度または効力に対する検出可能な影響なしに、薬物投与手順中にシリンジとＳｍａｒｔｆｌｏｗカニューレの間に配置された０．２ミクロンのインラインフィルタを介して軽減された。
ＰＢＳ緩衝剤の組成は以下のとおりであった。
・ ２．６７ｍＭ ＫＣｌ
・ １．４７ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４
・ １３７．９ｍＭ ＮａＣｌ
・ ８．０６ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４
・ ｐＨ７．２～７．４
ＬＹＳ－ＳＡＦ３０２のための製品一次包装は、以下からなる：
・ Ｏｍｐｉからの直ちに使用可能な無菌３ｍＬ（２Ｒ）ガラスバイアル；
・ （Ｎｏｖａｓｅｐによって蒸気滅菌された）Ｗｅｓｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓからの滅菌済み１３ｍｍ ＦｌｕｒｏＴｅｃストッパ；
・ Ｗｅｓｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓからの１３ｍｍの直ちに使用可能な放射線照射されたフリップオフキャップ。
２．４Ｅ＋１２ｖｇ／ｍＬの標的ベクター濃度（出荷時規格：１．９Ｅ＋１２～３．２Ｅ＋１２ｖｇ／ｍＬ）で、バイアルに１．２ｍＬのＬＹＳ－ＳＡＦ３０２を充填する。
治療用ベクターは、基底核に対して前側、内側および後側の白質内に両側性で（半球当たり３つの注射部位）、約１００分（５μＬ／分）で、（ＭＲＩによって）事前に定められた６つの同時フレームレス定位脳注射（それぞれ５００μＬ、すなわち１．２Ｅ＋１２ｖｇ）において、約７．２Ｅ＋１２ｖｇ／患者の用量で（約２．４Ｅ＋１２ｖｇ／ｍＬの濃度で）送達される。手術は訓練された神経外科医によって行われる。
患者は、形質導入された細胞の排除を回避するために、併用免疫抑制レジメン（タクロリムス、ミコフェノール酸モフェチルおよび短期プレドニゾロン）を受けるであろう。本研究は、本明細書で提供される投与戦略を介して送達されるＬＹＳ－ＳＡＦ３０２が、サンフィリポＡ型症候群などのＳＧＳＨの欠乏に関連する疾患の非常に臨床的に有効な処置をもたらすことを示す。
本明細書で言及される全ての米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許刊行物は、本明細書と矛盾しない範囲で、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
上記から、本発明の特定の実施形態が例示の目的で本明細書に記載されているが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく様々な修正を行うことができることが理解されよう。
参考文献
Figure 2022551792000010
Figure 2022551792000011
Figure 2022551792000012

Claims (28)

  1. 複製欠損アデノ随伴ウイルス血清型ｒｈ．１０（ＡＡＶｒｈ．１０）由来ベクターであって、以下の５’から３’の順序で、
    ａ．プロモーター配列と、
    ｂ．ヒトＮ－スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼポリペプチドまたはその活性改変体をコードするポリヌクレオチド配列と、
    ｃ．ポリアデニル化（ポリＡ）配列と、
    を含む発現カセットを含み、
    前記ベクターは、ヒトスルファターゼ修飾因子１またはその任意の活性改変体をコードするポリヌクレオチド配列を含まない、ベクター。
  2. 前記プロモーター配列が、ＣＭＶ初期エンハンサー／ニワトリβアクチン（ＣＡＧ）プロモーター配列に由来する、請求項１に記載のベクター。
  3. 前記ポリＡ配列がヒト成長ホルモン１配列に由来する、請求項１に記載のベクター。
  4. 前記ベクターが配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列を含まない、請求項１に記載のベクター。
  5. 前記発現カセットは、以下の５’から３’の順序で、
    ａ．ＣＡＧプロモーター配列由来のプロモーター配列と、
    ｂ．ヒトＮ－スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼポリペプチドまたはその活性改変体をコードするポリヌクレオチド配列と、
    ｃ．ヒト成長ホルモン１ポリＡ配列由来のポリＡ配列と、
    からなる、請求項１～４のいずれか一項に記載のベクター。
  6. 前記発現カセットが、２つのＡＡＶ２内部末端反復（ＩＴＲ）配列に隣接し、前記２つのＡＡＶ２ ＩＴＲ配列の一方は前記発現カセットの５’に位置し、前記２つのＡＡＶ２ ＩＴＲ配列の一方は前記発現カセットの３’に位置する、請求項１～５のいずれか一項に記載のベクター。
  7. 前記発現カセットの５’末端に位置する前記ＩＴＲ配列が、配列番号１０に記載のヌクレオチド配列を含み、前記発現カセットの３’末端に位置する前記ＩＴＲ配列が、配列番号１１に記載のヌクレオチド配列を含む、請求項６に記載のベクター。
  8. 前記ＣＡＧプロモーター配列が、配列番号１２に記載の配列を含む、請求項２に記載のベクター。
  9. ヒトＮ－スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼをコードする前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号１３に記載の配列を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載のベクター。
  10. 前記ポリアデニル化（ポリＡ）配列が配列番号１７に記載の配列を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載のベクター。
  11. 前記ベクターが、ＡＡＶｒｈ．１０キャプシドまたはＡＡＶｒｈ．１０キャプシドタンパク質をさらに含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載のベクター。
  12. 以下の５’から３’の順序で、
    ａ．ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列と、
    ｂ．ＣＡＧプロモーター配列由来のプロモーター配列と、
    ｃ．ヒトＮ－スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼポリペプチドまたはその活性改変体をコードするポリヌクレオチド配列と、
    ｄ．ヒト成長ホルモン１ポリＡ配列由来のポリＡ配列と、
    ｅ．ＡＡＶ ＩＴＲ配列と、
    を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載のベクター。
  13. 配列番号９に記載の配列を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載のベクター。
  14. 配列番号１４に記載の配列を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載のベクター。
  15. サンフィリポＡ型症候群を処置する方法であって、請求項１～１４のいずれか一項に記載のベクターを、サンフィリポＡ型症候群を処置することを必要とする対象に投与することを含む、方法。
  16. 前記ベクターが脳内注射を介して前記対象に投与される、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記ベクターが脳内注射を介して前記対象に投与され、各注射が単一の注射深度で投与される、請求項１５または１６に記載の方法。
  18. 前記ベクターが半球当たり２～４の注射によって前記対象に投与される、請求項１５～１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 前記ベクターが半球当たり３つの注射によって前記対象に投与される、請求項１８に記載の方法。
  20. 各注射が約５００μＬの体積で投与される、請求項１５～１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記対象に投与されるベクターの総用量が約５×１０１０ｖｇ～約５×１０１３ｖｇである、請求項１５～２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 前記対象に投与されるベクターの総用量が約７．２×１０１２ｖｇである、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記方法が免疫抑制レジメンを前記対象に投与することをさらに含む、請求項１５～２２のいずれか一項に記載の方法。
  24. 前記免疫抑制レジメンが、タクロリムス、ミコフェノール酸モフェチルおよびプレドニゾンを含む、請求項２３に記載の方法。
  25. サンフィリポＡ型症候群の処置において医薬として使用するための、請求項１～１４に記載のベクター。
  26. 前記医薬が、薬学的に許容され得る支持体、担体、賦形剤または希釈剤をさらに含む、サンフィリポＡ型症候群の処置において医薬として使用するための請求項２５に記載のベクター。
  27. 前記医薬がエマルジョンまたは水溶液である、サンフィリポＡ型症候群の処置において医薬として使用するための請求項２５または請求項２６に記載のベクター。
  28. 請求項１～１４のいずれか一項に記載のベクターとその使用のための指示とを含むキット。
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