ES2946512T3 - Terapia génica para el tratamiento de una enfermedad degenerativa de la retina - Google Patents
Terapia génica para el tratamiento de una enfermedad degenerativa de la retina Download PDFInfo
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Abstract
La presente invención se refiere a un polinucleótido configurado para el tratamiento de una enfermedad degenerativa de la retina, como la retinosis pigmentaria (RP), un vector de ácido nucleico que comprende dicho polinucleótido, una composición farmacéutica que comprende dicho vector de ácido nucleico, un kit que comprende dicho polinucleótido o dicho ácido nucleico vector de ácido, un método para producir dicho vector de ácido nucleico y un método para tratar una enfermedad degenerativa de la retina. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Terapia génica para el tratamiento de una enfermedad degenerativa de la retina
La presente invención se refiere a un vector del virus adenoasociado (VAA, por sus siglas en inglés AAV) que com prende un polinucleótido configurado para el tratamiento de una enfermedad degenerativa de la retina, tal como la retinitis pigmentosa (RP), a una composición farmacéutica que comprende dicho vector de ácido nucleico y a un kit que comprende dicho vector de ácido nucleico o una composición farmacéutica.
La degeneración retiniana es el deterioro de la retina causado por la muerte progresiva y eventual de las células de la retina. Existen diversas razones para la degeneración de la retina, incluida la oclusión de arterias o venas, la retinopatía diabética, R.L.F./R.O.P. (fibroplasia retrolental/retinopatía del prematuro) o una enfermedad (generalmente heredita ria). Se pueden presentar de muchas maneras diferentes, como problemas de visión, ceguera nocturna, desprendi miento de retina, fotosensibilidad, visión de túnel y pérdida de la visión periférica hasta una pérdida total de la visión.
Entre las enfermedades degenerativas de la retina, la retinitis pigmentosa (RP) es un ejemplo muy importante. La RP indica uno de los tipos más importantes de enfermedades oculares hereditarias que causan ceguera. La RP es un grupo de trastornos, clínicamente bastante homogéneo, pero genéticamente heterogéneo que se caracteriza por una muerte celular primaria de los fotorreceptores de los bastones y una pérdida secundaria posterior de los fotorreceptores de los conos. La enfermedad comienza en la periferia media de la retina, y la destrucción progresa continuamente hasta que alcanza el centro de la retina y provoca una "visión de túnel" debido a una grave restricción circular del campo visual, hasta la ceguera legal. Otras características clínicas clave son los depósitos pigmentarios de forma característica ("espículas óseas") y una atenuación progresiva de los vasos retinianos. El curso temporal varía desde las formas de inicio temprano que alcanzan la etapa final de la enfermedad en la niñez, hasta las formas de inicio tardío que pueden conservar alguna visión útil hasta la edad adulta avanzada.
La prevalencia de la RP es de aproximadamente 1:4000. La RP es genéticamente muy heterogénea con más de 50 genes de RP actualmente conocidos. El 10-25% de los casos de RP muestran un patrón de herencia autosómico dominante (adRP), el 6-18% están ligados al cromosoma X (xRP) y el 20-30% son de herencia autosómica recesiva (arRP). Otro 40-50% son esporádicos y probablemente representan una gran fracción de los casos de arRP sin ante cedentes familiares. arRP es el subgrupo de RP genéticamente más heterogéneo con genes únicos que contribuyen normalmente solo con una pequeña fracción al total general. Los genes más frecuentes mutados en la arRP son EYS (5-12%), USH2A (5-15%), CRB1 (~ 5%) y PDE6B (4-10%), pero esas proporciones dependen en gran medida de la población estudiada.
PDE6A codifica la subunidad alfa de la fosfodiesterasa de GMPc del fotorreceptor de los bastones (locus RP43). Las mutaciones en el locus RP43 que causan la llamada RP ligada a PDE6A o RP de tipo 43, respectivamente, se en cuentran en el 2-4% de los casos de arRP. Por lo tanto, el número absoluto de pacientes con arRP ligada a PDE6A es de aproximadamente 900 en Alemania y 5000 en la UE.
Las distrofias retinianas hereditarias como la RP son enfermedades oculares causadas por mutaciones génicas. De bido a la naturaleza genética de la enfermedad, no se han encontrado tratamientos curativos convencionales ni sinto máticos. La carga de la enfermedad es tan grave que los expertos clínicos sitúan actualmente a la RP en la parte superior de su lista de candidatos para esa terapia.
Wert et al., Gene therapy provides long-term visual function in a pre-clinical model of retinitis pigmentosa, Human Molecular Genetics 22(3), págs. 558-567 (2013), también Advance Access publicado el 29 de octubre de 2012, des criben un vector de VAA2/8 recombinante que comprende el gen PDE6A de ratón bajo el control del promotor de rodopsina (RHO) de ratón específico de tipo celular: AAV2/8(Y733F)-Rho-Pde6a. Las retinas de ratones con mutacio nes en el gen que codifica la subunidad a de PDE6, Pde6anmf3®3, se transdujeron con el vector. Los autores afirman que la inyección mejoraba la supervivencia de los fotorreceptores y mejoraba la función de la retina. Sin embargo, según los inventores en ese enfoque, el rendimiento del reemplazo de genes no es satisfactorio, lo que sugiere que esa estrategia podría ser menos prometedora para el tratamiento de seres humanos que padecen degeneraciones retinianas como en la RP de tipo 43.
En este contexto, un objeto de la presente invención es proporcionar un vector de polipéptido y de ácido nucleico que se dirija a esas limitaciones y, por lo tanto, sea una herramienta valiosa en el tratamiento de una enfermedad degene rativa de la retina, como la RP, en particular la RP de tipo 43.
Este objeto se cumple con un vector de virus adenoasociado (VAA) que comprende un polinucleótido, que comprende un casete de expresión transgénica, que comprende (a) un ácido nucleico que codifica el promotor del gen de la rodopsina humana (hRHO); (b) un ácido nucleico que codifica la subunidad alfa de los bastones específica de la fosfodiesterasa 6A humana de GMPc (hPDE6A) de los bastones o fragmentos de la misma que muestran actividad de hPDE6A, y (c) un ácido nucleico que codifica elementos reguladores, en donde dicho vector de VAA es un plásmido circular que comprende además una estructura principal que tiene una longitud de > 5.000 pb y en donde dicho vector de VAA comprende además un ácido nucleico que codifica repeticiones terminales invertidas (ITRs, por sus siglas en inglés) que flanquean dicho casete de expresión transgénica.
Los inventores han sido capaces de observar que el polinucleótido de la invención incorpora los componentes esen ciales de una herramienta genética que permite una terapia exitosa de una enfermedad degenerativa de la retina, como la RP, que se puede aplicar a un paciente humano.
Los inventores demostraron experimentalmente que los ratones carentes de PDE6A que habían recibido una inyección subretiniana del polinucleótido según la invención en forma de un componente de un plásmido vector, expresan el transgén hPDE6A de manera eficiente y específica en las células fotorreceptoras de bastones. Además, se demostró que se conterta una visión mediada por los bastones a esos ratones que carecían de la función de los bastones desde el nacimiento.
Este hallazgo era sorprendente. La técnica no mostraba evidencias de que un polinucleótido que tuviera una estructura como la sugerida por la invención fuera a dar como resultado una expresión transgénica dirigida de hPDE6A en la retina. Por lo tanto, la especificidad y la selectividad elevadas observadas, así como la significativa eficacia biológica del polinucleótido de la invención para restaurar la función visual, no eran evidentes para un experto en la materia.
Como habían demostrado los inventores en experimentos preliminares, después de inyectar el polinucleótido de la in vención en la retina, éste se expresaba específicamente en los fotorreceptores de los bastones de una manera funcio nalmente activa. Experimentos adicionales indican que el polinucleótido permanecerá in situ con solo una transducción mínima a órganos que no son diana. Otros experimentos también indican que después de la inyección en la retina del polinucleótido de la invención, no se producirá una inducción de anticuerpos antifármaco contra el polinucleótido admi nistrado. Esto permite concluir que el polinucleótido de la invención es muy adecuado como agente activo de una composición farmacéutica para el tratamiento de una enfermedad degenerativa de la retina, como la RP.
De acuerdo con la descripción, un "polinucleótido" es una molécula de biopolímero compuesta por 13 o más monómeros de nucleótidos unidos covalentemente en una cadena. Un ejemplo de un polinucleótido preferido es una molé cula de ADN. Aunque el polinucleótido puede ser monocatenario o bicatenario, en una realización preferida el polinucleótido es monocatenario.
Un "promotor" es una región de ADN que facilita la transcripción de un gen en particular. Como parte del proceso de transcripción, la enzima que sintetiza el ARN, conocida como ARN polimerasa, se fija al ADN cerca de un gen. Los promotores contienen secuencias de ADN específicas y elementos de respuesta que proporcionan un sitio de unión inicial para la ARN polimerasa y para los factores de transcripción que reclutan la ARN polimerasa.
El promotor del gen de la rodopsina humana (hRHO) se refiere a la región de ADN que facilita la transcripción de la rodopsina humana. La secuencia de nucleótidos completa del promotor de hRHO se describe en Allocca et al., Novel adeno-associated virus serotypes efficiently transduce murine photoreceptors, Journal of Virology, 81 (2007) 11372 11380. En una realización, se emplea la secuencia de nucleótidos completa del promotor. En otra realización de la invención, solo se usan partes funcionales del promotor que se requieren para una expresión dirigida de la hPDE6A.
Un "casete de expresión transgénica" o "casete de expresión" comprende las secuencias génicas que un vector de ácido nucleico va a entregar a las células diana. Esas secuencias incluyen el gen de interés (p. ej., el ácido nucleico de hPDE6A), uno o más promotores y elementos reguladores.
Los "elementos reguladores" son elementos reguladores que son necesarios para una expresión eficaz de un gen en una célula diana (p. ej., el ácido nucleico de hPDE6A) y, por lo tanto, deben incluirse en un casete de expresión transgénica. Esas secuencias podrían incluir, por ejemplo, secuencias potenciadoras, secuencias polienlazadoras que facilitan la inserción de un fragmento de ADN dentro de un vector plasmídico, o secuencias responsables del corte y empalme de intrones y poliadenilación de transcritos de ARNm.
Un "ácido nucleico" o una "molécula de ácido nucleico" es una molécula compuesta por cadenas de nucleótidos monoméricos, como, por ejemplo, moléculas de ADN (por ejemplo, ADNc o ADN genómico). Un ácido nucleico puede codificar, por ejemplo, un promotor, el gen hPDE6A o un fragmento del mismo, o elementos reguladores. Una molécula de ácido nucleico puede ser monocatenaria o bicatenaria.
Un "ácido nucleico que codifica hPDE6A" se refiere a un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la PDE6A humana o, en una realización de la invención, un fragmento o una variante funcional de la PDE6A humana. Un "fragmento" de la hPDE6A se refiere a un segmento o una parte de la hPDE6A que aún muestra actividad de hPDE6A. Una "variante funcional" de la hPDE6A incluye una variante de la proteína con variaciones menores como, por ejemplo, mutaciones silenciosas, polimorfismos de un solo nucleótido, mutaciones sin sentido y otras mutaciones o deleciones, que no impiden ni alteran significativamente la función de la hPDE6A de tipo silvestre.
La secuencia de aminoácidos de hPDE6A que es codificada, al menos parcialmente, por el "ácido nucleico que codifica hPDE6A" de acuerdo con la invención, se presenta bajo SEQ ID No. 3.
El polinucleótido de la invención incluye un polinucleótido "aislado" o una molécula de ácido nucleico, respectivamente, que está separada de otras moléculas de ácido nucleico que están presentes en la fuente natural del ácido nucleico. Por ejemplo, con respecto al ADN genómico, el término "aislado" incluye moléculas de ácido nucleico que están se paradas del cromosoma con el que se asocia naturalmente el ADN genómico. Preferiblemente, una molécula de ácido
nucleico "aislada" está libre de secuencias que naturalmente flanquean la molécula de ácido nucleico en el ADN genómico del organismo a partir del cual se obtiene la molécula de ácido nucleico.
En una realización preferida de la invención, dichos elementos reguladores comprenden c1) un ácido nucleico que codifica el elemento regulador postranscripcional del virus de la estomatitis de la marmota (WPRE).
Este desarrollo adicional del polinucleótido según la invención tiene la ventaja de que se potencia significativamente la expresión de la hPDE6A en las células fotorreceptoras. La expresión a largo plazo que se logra mediante la inclusión de WPRE, capacita al polinucleótido para su uso en terapia génica. El WPRE contiene el promotor génico del marco de lectura abierto del virus de la hepatitis X de la marmota (WHX ORF) y un marco de lectura abierto que codifica los primeros 61 AA de WHX en su región 30; véase Zanta-Boussif et al., Validation of a mutated PRE sequence allowing high and sustained transgene expression while abrogating WHV-X protein synthesis: application to the gene therapy of WAS, Gene Ther., 16(5), 605-619 (2009)).
En otra realización de la invención en el polinucleótido según la invención, dicho WPRE es un WPRE mutado (WPREm), que comprende un WHX OR de una proteína WHX no expresable.
Este aspecto tiene la ventaja de que impide la expresión no deseada de la proteína WHX desde el casete de expresión.
En otra realización de la invención, dichos elementos reguladores comprenden (c2) un ácido nucleico que codifica una señal de poliadenilación (pA).
Este aspecto tiene la ventaja de que el polinucleótido se proporciona con este elemento regulador que es importante para la exportación nuclear, la traducción y la estabilidad del ARNm que codifica hPDE6A, mejorando así la eficacia de la expresión.
En otra realización de la invención, dicha señal de poliadenilación es una pA de la hormona de crecimiento bovina (BGH pA).
Los inventores han descubierto que esa señal de poliadenilación específica asegura resultados especialmente buenos cuando se usa junto con los elementos genéticos restantes del polinucleótido de la invención.
El polinucleótido de la invención comprende además un ácido nucleico que codifica repeticiones terminales invertidas (ITRs) que flanquean dicho casete de expresión del transgén, preferiblemente comprende al menos una ITR que es adyacente a dicho promotor hRHO (L-ITR) en el primer extremo del casete de expresión, y al menos una ITR que es adyacente a dicha pA (R-ITR) en el segundo extremo del casete de expresión, opuesto al primer extremo.
Este aspecto tiene la ventaja de que permite una replicación y un empaquetamiento eficientes durante la preparación. "Flanqueando" significa que las ITRs están ubicadas a ambos lados del casete de expresión del transgén, es decir, en los extremos 5' y 3'. Por lo tanto, las ITRs delimitan el casete de expresión del transgén.
En una realización de la invención, dichas ITRs se obtienen a partir del serotipo 2 del virus adenoasociado (VAA) (ITR AAV2).
Como se ha podido hallar, esas ITRs específicas son particularmente adecuadas para el polinucleótido de la invención.
En otra realización de la invención, el polinucleótido comprende el siguiente orden de colocación: (a) -(b) -(c), prefe riblemente (a) -(b) -(c1) -(c2), más preferiblemente (L-iT r ) -(a) -(b) -(c1) -(c2) -(R-ITR).
Se ha mostrado que el orden indicado de los elementos genéticos es beneficioso para la eficacia de la expresión del polinucleótido según la invención.
En otra realización de la invención, dicho promotor hRHO comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1, en donde dicho ácido nucleico que codifica hPDE6A comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2, en donde dicho ácido nucleico que codifica hPDE6A comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 3,en donde dicho ácido nucleico que codifica WPREm comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 4, en donde dicho ácido nucleico que codifica BGH pA comprende la secuencia de nucleó tidos de SEQ ID No. 5, en donde dicho ácido nucleico que codifica L-ITR comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 6 y/o en donde dicho ácido nucleico que codifica R-ITR comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 7.
Este aspecto tiene la ventaja de que, con las secuencias de nucleótidos específicas de los respectivos elementos genéticos del polinucleótido según la invención, se proporciona un manual de construcción preciso. Esto permite una síntesis fácil y rápida del polinucleótido, p. ej., mediante un sintetizador de ácidos nucleicos.
El objeto de la invención es un vector de ácido nucleico que comprende el polinucleótido mencionado anteriormente según la invención. Por lo tanto, las particularidades, ventajas y características del polinucleótido se aplican igualmente al vector de ácido nucleico de la invención.
El vector de ácido nucleico según la invención es un vector de virus adenoasociado (VAA) (véase más adelante).
En la invención, el vector de ácido nucleico es un plásmido circular que comprende además una estructura principal que tiene una longitud de > 5000 pb, preferiblemente > 5500 pb.
De acuerdo con la invención, la expresión "estructura principal" se refiere a la sección de la molécula del vector aparte del casete de expresión o, si están presente, las repeticiones terminales invertidas (ITRs). En otras palabras, la es tructura principal del vector es adyacente a los extremos 5' y 3' del casete de expresión o las ITRs, respectivamente, y forma el resto de los ácidos nucleicos del vector además del polinucleótido según la invención.
Los inventores han observado que una estructura principal de ese tamaño preferido minimizará que ocurra un empa quetamiento falso o inverso de la estructura principal en una partícula vírica, en lugar de un empaquetamiento del casete de expresión. Por lo tanto, este aspecto asegura que esencialmente solo la hPDE6A estará disponible para una expresión en la célula diana.
En otra realización de la invención, dicha estructura principal comprende < 5 marcos de lectura abierta (ORFs), prefe riblemente < 4 ORFs, más preferiblemente < 3 ORFs, más preferiblemente < 2 ORFs, más preferiblemente < 1 ORF, muy preferiblemente 0 ORFs.
Los inventores han observado que la estructura principal debe tener un bajo contenido en ORFs, preferiblemente estar exenta de ORFs, además de cualquier marcador de selección u origen de replicación (ORI), si es aplicable. Este aspecto tiene la ventaja de que minimizará aún más la posibilidad de una expresión de productos secundarios en caso de un empaquetamiento inverso. Además, minimiza la posibilidad de una expresión de productos secundarios durante la preparación de vectores rVAA.
En aún otra realización del vector de ácido nucleico según la invención, dicha estructura principal comprende un mar cador de selección, preferiblemente un ácido nucleico que codifica la resistencia a antibióticos, más preferiblemente un ácido nucleico que codifica la resistencia a kanamicina (KanR).
Este aspecto establece las condiciones previas útiles que permiten la selección de células in vitro que incorporan el vector de ácido nucleico. Tales células pueden usarse para amplificar el vector.
En otra realización de la invención, dicho marcador de selección de la estructura principal del vector de ácido nucleico está en sus extremos 5' y 3', separado a una distancia del polinucleótido, preferiblemente separado a una distancia máxima del polinucleótido o de la casete de expresión, más preferiblemente separado a una distancia de > 1000 pb, más preferiblemente > 1500 pb, lo más preferiblemente > 1900 pb del polinucleótido o de la casete de expresión según la invención.
Como han observado los inventores, este aspecto tiene la ventaja de que el ácido nucleico que codifica la resistencia (KanR) está separado a una distancia máxima de las ITRs y de los elementos reguladores del casete de expresión, p. ej., del promotor
En un desarrollo adicional del vector de ácido nucleico, la estructura principal comprende < 10 sitios de reconocimiento de enzimas de restricción (RERSs, por sus siglas en inglés), preferiblemente < 5 RERSs, más preferiblemente < 3 RERSs, más preferiblemente < 2 RERSs, más preferiblemente < 1 RERS, muy preferiblemente 0 RERSs.
Este aspecto tiene la ventaja de que la estabilidad del vector de ácido nucleico en las bacterias utilizadas para la amplificación de ADN aumenta significativamente.
En un desarrollo adicional del vector de ácido nucleico según la invención, la estructura principal comprende < 5 promotores, preferentemente < 4 promotores, más preferentemente < 3 promotores, más preferentemente < 2 promo tores, más preferentemente < 1 promotor, muy preferentemente 0 promotores.
Este aspecto minimiza aún más la posibilidad de una expresión de productos secundarios en caso de un empaqueta miento inverso que pueda causar efectos adversos o interferencias con el transgén. En esta realización, debe enten derse que los "promotores" excluyen el promotor necesario para expresar el marcador de selección, p. ej., KanR, que normalmente estará representado por un promotor procariota apropiado.
En otra realización del vector de ácido nucleico según la invención, dicha estructura principal comprende además un origen de replicación (ORI), preferiblemente un ORI de pUC18.
Este aspecto proporciona las condiciones previas estructurales para que el vector sea replicable.
La estructura principal comprende preferentemente como únicas secuencias codificantes o portadoras de información el marcador de selección y el ORI, y para el resto secuencias aleatorias, pero no ORFs, promotores o RERSs.
La secuencia de nucleótidos comprendida por la estructura principal del vector se describe en la lista de secuencias adjunta bajo SEQ ID No. 8.
El vector de ácido nucleico de la invención es un vector de virus adenoasociado (VAA).
Múltiples serotipos de virus adenoasociados (VAA), incluidos 12 serotipos humanos (VAA1, VAA2, VAA3, VAA4, VAA5, VAA6, VAA7, VAA8, VAA9, VAA10, v Aa 11 y VAA12) y más de 100 serotipos procedentes de primates no humanos, se han identificado hasta ahora. Howarth et al., Using viral vectors as gene transfer tools. Cell Biol. Toxicol.
26: 1-10 (2010). El serotipo de las repeticiones terminales invertidas (ITRs) o de la secuencia de la cápside del vector de VAA se puede seleccionar a partir de cualquier serotipo de VAA humano o no humano conocido. En algunas realizaciones, se emplea un enfoque de seudotipado, en el que el genoma de un serotipo de ITR se empaqueta en una cápside de un serotipo diferente. Véase, por ejemplo, Zolutuhkin et al. Production and purification of serotype 1, 2, and 5 recombinant adeno-associated viral vectors, Methods 28(2): 158-67 (2002).
Si bien podría usarse cualquier tipo de VAA, se prefiere además si el serotipo de la secuencia de la cápside de VAA y/o de las repeticiones terminales invertidas (ITRs) de dicho vector de VAA, se selecciona a partir del grupo que consiste en VAA2, VAA5, VAA8 o combinaciones de los mismos.
Los inventores han observado que los subtipos VAA2, VAA5, VAA8 son particularmente adecuados para la creación del vector de ácido nucleico según la invención.
La producción, la purificación y la caracterización de los vectores de VAA recombinantes de la presente invención se pueden llevar a cabo utilizando cualquiera entre los muchos métodos conocidos en la técnica. Para revisiones de métodos de producción a escala de laboratorio, véase, por ejemplo, Clark, Recent advances in recombinant adenoassociated virus vector production. Kidney Int. 61s:9-15 (2002); Choi et al., Production of recombinant adeno-associ ated viral vectors for in vitro and in vivo use. Current Protocols in Molecular Biology 16.25.1-16.25.24 (2007); Grieger and Samulski, Adeno-associated virus as a gene therapy vector: Vector development, production, and clinical applications. Adv. Biochem. Engin/Biotechnol 99: 119-145 (2005); Heilbronn and Weger, Viral Vectors for Gene Transfer: Current Status of Gene Therapeutics, in M. Schafer-Korting (Ed.), Drug Delivery, Handbook of Experimental Pharmacology, 197: 143-170 (2010); Howarth et al. (supra). Los métodos de producción descritos a continuación se entiende que son ejemplos no limitantes.
Otro objeto de la invención se refiere a una preparación farmacéutica que comprende el vector de ácido nucleico tal y como se ha descrito en detalle anteriormente y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Por lo tanto, las particulari dades, ventajas y características del polinucleótido y del vector de ácido nucleico se aplican igualmente a la prepara ción farmacéutica de la invención.
Los vehículos farmacéuticamente aceptables son bien conocidos en la técnica. A modo de ejemplo, se hace referencia a Rowe (Ed.) (2012), Handbook of Pharmaceutical Excipients, 6a edición, Pharmaceutical Press. La preparación far macéutica puede contener además aditivos. Éstos incluyen cualquier compuesto o composición que sea ventajoso para la eficacia del vector de ácido nucleico según la invención, como sales, aglutinantes, disolventes, dispersantes, adyuvantes y otras sustancias comúnmente utilizadas en relación con enfoques terapéuticos génicos.
En una realización de la preparación farmacéutica, dicho vehículo farmacéuticamente aceptable comprende una so lución salina, preferiblemente una solución salina estéril equilibrada, y opcionalmente un tensioactivo, preferiblemente un poloxámero micronizado (Kolliphor® P 188 micro).
Los inventores han observado que con esa formulación específica se minimizan los efectos adversos inducidos por el fármaco y la pérdida de partículas de rVAA en las superficies.
En una realización preferida, la preparación farmacéutica según la invención es para uso en el tratamiento de una enfermedad asociada con una mutación, sustitución o deleción genética que afecta a la degeneración de la retina, preferiblemente para el tratamiento de una distrofia retiniana hereditaria, más preferiblemente de la retinitis pigmentosa (RP) y muy preferiblemente la RP de tipo 43 (RP43).
Con el polinucleótido y el vector de ácido nucleico descritos en detalle anteriormente, los inventores proporcionan una herramienta terapéutica que, por primera vez, permite un tratamiento causal de la RP ligada a PDE6A.
Otro objeto de la presente invención se refiere a un kit que comprende (a) el vector de ácido nucleico según la invención y/o la preparación farmacéutica según la invención, y (b) sus instrucciones de uso.
Otro objeto de la descripción es un método para tratar una enfermedad asociada con una mutación, sustitución o deleción genética que afecta a la degeneración de la retina, en donde el método comprende administrar a un sujeto que necesita ese tratamiento el vector de ácido nucleico según la invención y/o la preparación farmacéutica según la invención, tratando así al sujeto. Preferiblemente, la enfermedad es distrofia retiniana hereditaria, más preferiblemente retinitis pigmentosa (RP) y muy preferiblemente RP de tipo 43 (RP43). Preferiblemente, el vector se administra por vía subretiniana y/o intravítrea.
Las particularidades, ventajas y características del polinucleótido y del vector de ácido nucleico se aplican igualmente al kit, al método de elaboración y al método de tratamiento según la descripción.
La invención se explica ahora con más detalle por medio de realizaciones que dan como resultado particularidades, características y ventajas adicionales de la invención. Las realizaciones son de naturaleza puramente ilustrativa y no limitan el alcance o el campo de la invención.
La invención se describe y explica ahora con mayor detalle haciendo referencia a las siguientes figuras y ejemplos no limitativos.
Fig. 1 muestra la estructura del genoma del vector rAAV.hPDE6A;
Fig. 2 muestra dos realizaciones del mapa plasmídico del vector cis phRHO.hPDE6A.WPREm;
Fig. 3 muestra mediciones representativas de ERG procedentes de ratones mutantes PDE6A D670G tratados en un ojo con el vector según la invención; y
Fig. 4 representa imágenes confocales representativas procedentes de tinciones inmunohistológicas de hPDE6A en ratones mutantes PDE6A D670G tratados con el vector según la invención.
Ejemplos
1. Vector de ácido nucleico de la invención
En esta realización ejemplar, el vector rAAV.hPDE6A es un vector híbrido basado en VAA que es portador del ADNc de la subunidad hPDE6A humana de la fosfodiesterasa de GMPc del fotorreceptor de los bastones. La expresión del ADNc de hPDE6A está bajo el control del promotor de rodopsina específico de los bastones (hRHO) y se mejora utilizando una secuencia mutada del elemento regulador postranscripcional del virus de la estomatitis de la marmota (WPRE). El casete de expresión está flanqueado por las repeticiones terminales invertidas (ITRs) del serotipo 2 de VAA y el genoma recom binante está empaquetado en la cápside del serotipo 8 de VAA. El casete de expresión comprende los siguientes ele mentos:
• Promotor del gen de la rodopsina humana: 0,8 Kb
• ADNc de la subunidad PDE6A humana de la fosfodiesterasa de GMPc del fotorreceptor de bastones: 2,58 Kb
• Elemento regulador postranscripcional del virus de la estomatitis marmota (WPRE) con una mutación puntual en el codón ATG del marco de lectura abierto WHV-X: 0,54 Kb
• Señal de poliadenilación de la Hormona de Crecimiento Bovino (BGH, por sus siglas en inglés): 0,2 Kb
• Repeticiones terminales invertidas (ITRs) del serotipo 2 de VAA: 0,13 Kb
La estructura del genoma del vector rAAV.hPDE6A se representa en la Fig. 1.
2. Plásmido del vector cis phRHO.hPDE6A.WPREm
En una realización ejemplar, se usa la estructura principal del plásmido del vector cis phRHO.hPDE6A.WPREm que contiene un casete de expresión que comprende un promotor de rodopsina humana (hRHO) específico del fotorrecep tor de los bastones de 806 pb [véase, Allocca et al., Novel adeno-associated virus serotypes efficiently transduce murine photoreceptors, Journal of Virology, 81 (2007) 11372-11380] y el ADNc de PDE6A humana de longitud com pleta (2579 pb). El casete de expresión también contiene un elemento regulador postranscripcional del virus de la hepatitis de la marmota (WPRE) de 543 pb con el marco de lectura abierto WXF mutado [Zanta-Boussifet al., Validation of a mutated PRE sequence allowing high and sustained transgene expression while abrogating WHV-X protein synthesis: application to the gene therapy of WAS, Gene therapy, 16 (2009), 605-619] y una señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina (BGHpA) de 207 pb. La estructura principal del vector de 5591 pb con la secuencia de nucleótidos representada en SEQ ID No. 8, contiene una resistencia a la kanamicina (KanR) posicionada a 1943 pb de L-ITR y a 2853 pb de R-ITR y a 2024 pb de pUC18 ori.
El vector rAAV.hPDE6A se produce usando una transfección doble transitoria del plásmido del vector cis y un plásmido auxiliar trans pDP8-KanR en células 293 de riñón embrionario humano (HEK293). El lisado celular se clarifica mediante una centrifugación a baja velocidad y luego el vector se purifica mediante 2 rondas consecutivas de ultracentrifugación con gradientes de cloruro de cesio seguidas de una etapa de filtración con flujo tangencial para la concentración y el intercambio de tampón. A continuación, la suspensión del vector rAAV.hPDE6A resultante se esteriliza por filtración y se envasa en viales como un producto farmacológico.
En las Fig. 2A,B se muestran dos realizaciones del mapa plasmídico del vector cis phRHO.hPDE6A.WPREm.
3. Actividad biológica y expresión transgénica conferida por el rAAV.hPDE6A
Para verificar la actividad biológica y la expresión transgénica, los inventores administraron el vector rAAV.hPDE6A en el espacio subretiniano de ratones mutantes PDE6A D670G de 2 semanas de edad [véase, Sakamoto et al., New mouse models for recessive retinitis pigmentosa caused by mutations in the Pde6a gene, Hum Mol Genet, 18 (2009) 178-192]. El procedimiento de entrega era similar al descrito en Michalakis et al., Restoration of cone vision in the CNGA3-/- mouse model of congenital complete lack of cone photoreceptor function, Molecular therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy, 182057-2063 (2010). Los ratones recibieron una inyección subretiniana en el ojo tratado (TE), mientras que el otro ojo sin tratar (UE) sirvió como control. La eficacia del vector se evaluó 3 semanas después de la inyección mediante electrorretinografía (ERG), un ensayo funcional objetivo in vivo. Los ratones mutan tes PDE6A D670G carecen de una función fotorreceptora normal de los bastones. De forma secundaria a los bastones, los fotorreceptores del cono no afectados también se degeneran, lo que da como resultado la pérdida de la función de los conos en etapas posteriores de la enfermedad. Por lo tanto, los protocolos de ERG que someten a ensayo espe cíficamente la función de los bastones y los conos son adecuados como una medida indirecta de la función de PDE6A y para la evaluación de la actividad biológica (BAA) del vector rAAV.hPDE6A.
Para los resultados representativos, véase la Figura 3. El tratamiento con el vector rAAV.hPDE6A daba como resultado un claro efecto terapéutico en el ojo tratado, reflejado por una clara diferencia lateral de las amplitudes del componente específico de ERG entre los ojos tratados y sin tratar. Después de completar las mediciones de ERG, se sacrificaron los ratones, se enuclearon los ojos y se procesaron para el análisis inmunohistológico de una expresión transgénica de hPDE6A (ensayo de expresión transgénica, TEA). Para ello, el tejido se fijó y se crioincrustó. Las criosecciones verticales se tiñeron con un anticuerpo policlonal de conejo (anti-PDE6A, #NBP1 -87312, Novus, Littleton, CO) dirigido contra la proteína PDE6A humana. La inmunoseñal se detectó con un anticuerpo secundario de burro anti-IgG de conejo marcado con Alexa 488. Las imágenes confocales de las criosecciones inmunoteñidas se recogieron usando un microscopio de barrido láser confocal Leica SP8 SMD. El anticuerpo anti-PDE6A también detecta la proteína PDE6A de ratón y proporciona una señal específica en los segmentos externos de los fotorreceptores de los bastones de la retina de ratón de tipo silvestre y ninguna señal en la retina que carece de PDE6A (mutante PDE6A D670G). Después del tratamiento con el vector rAAV.hPDE6A, se observó una señal clara y específica para PDE6A en los fotorreceptores de los bastones en el ojo tratado, que estaba ausente en el ojo sin tratar; véase la Figura 4. La tinción de las criosecciones retinales con el colorante nuclear Hoechst 3442 también revelaba un efecto beneficioso del tra tamiento sobre la degeneración de la retina, que era evidente como una conservación sustancial de la capa nuclear externa de la retina en el ojo tratado, en comparación con el ojo sin tratar.
Para los resultados representativos, véase la Figura 4: imágenes confocales representativas de tinciones inmunohistológicas de hPDE6A (gris claro) en ratones mutantes PDE6A D670G tratados con el vector rAAV.hPDE6A. El anti cuerpo (anti-PDE6A, dilución de trabajo en todos los experimentos de 1:500) también detecta la proteína PDE6A de ratón y proporciona una señal específica en los segmentos externos de los fotorreceptores de los bastones (estructuras fuertemente teñidas en la parte superior de la imagen) de la retina de ratones de tipo silvestre (A, panel superior) y ninguna señal específica en la retina de los ratones mutantes PDE6A D670G sin tratar (B, panel inferior). La señal específica para la proteína hPDE6A codificada por el vector rAAV.hPDE6A se muestra en (B, panel superior). El panel inferior en (A) muestra una tinción de control solamente con anticuerpo secundario. Las secciones transversales de la retina también se tiñeron con colorante Hoechst 3442 para visualizar los núcleos de las células de la retina (señal gris). La expresión de hPDE6A mediada por rAAV.hPDE6A retrasaba claramente la degeneración de los fotorreceptores de los bastones en la retina mutante PDE6A D670G: comparar el grosor de la capa nuclear externa (ONL) entre la parte superior (ojo tratado) y la inferior (ojo sin tratar) en (B).
En conclusión, el vector rAAV.hPDE6A expresa el transgén hPDE6A de forma eficiente y específica en los fotorrecep tores de los bastones de los ratones mutantes PDE6A D670G, lo que retrasa sustancialmente la degeneración de los fotorreceptores en las áreas tratadas. Es importante destacar que la supervivencia prolongada de los bastones con trarresta el "efecto espectador", que conduce a la pérdida de conos, independientemente de la enfermedad subya cente, en todas las áreas en donde se pierden los bastones. Los datos de la actividad biológica ilustran una conser vación extendida de la visión mediada por conos en esos ratones, lo que es de particular importancia para las aplica ciones del tratamiento en las formas respectivas de retinosis pigmentaria humana.
4. Biodistribución y excreción de VAA8 después de una inyección subretiniana en primates no humanos
En otro estudio, 21 monos macacos cangrejeros recibieron inyecciones subretinianas en tres cohortes (dosis alta: 1 x 1012 genomas vectoriales [vg, por sus siglas en inglés], dosis baja: 1x10” vg o solo vehículo). La distribución y la excreción del virus se analizó después de una única administración subretiniana de virus adenoasociado recombinante de grado clínico (rVAA) en primates no humanos. Esto es importante para una evaluación de los riesgos ambientales del método de terapia génica descrito en el presente documento.
Se recogieron muestras de tejido en la necropsia (día 91) del ojo tratado, ganglios linfáticos de drenaje, glándula salivar y bazo, nervio óptico, cerebro y médula espinal, corazón, pulmón, hígado, glándulas suprarrenales y gónadas. Se recogieron muestras con hisopo de sangre, orina, fluido lacrimal y nasal de cada animal antes de la dosificación y 1, 2 y 3 días y 1,4 y 13 semanas después de la aplicación del vector para la extracción de ADN y la cuantificación de los genomas del vector mediante qPCR.
Se encontró ADN de rVAA dependiente de la dosis en la retina tratada. También se detectaron niveles cuantificables de ADN de rVAA en el nervio óptico de 2 animales del grupo de dosis baja y de 3 animales del grupo de dosis alta. Se encontró una excreción transitoria de ADN de rVAA en los fluidos nasales y lagrimales y en la orina. No se detectó ADN de rVAA en los tejidos de la línea germinal y, aparte de las señales esporádicas detectadas en un pequeño número de animales en los ganglios linfáticos y el bazo, todos los tejidos restantes eran negativos o mostraban niveles por debajo del límite de cuantificación. Las muestras de sangre eran negativas o mostraban niveles no cuantificables en todos los puntos de tiempo analizados.
Estos datos son relevantes para la implementación clínica de la invención, en donde los sujetos del ensayo, los inves tigadores y los reguladores están interesados en identificar los riesgos ambientales asociados con la aplicación de organismos modificados genéticamente. Si bien la excreción en los biofluidos parece ocurrir de manera dependiente de la dosis, la transducción a órganos que no son diana parece mínima.
5. Respuesta inmune humoral frente a VAA8 subretiniano en primates no humanos
Conocer la respuesta inmune humoral frente a una administración subretiniana única de virus adenoasociado recom binante (rVAA) de grado clínico en primates no humanos, es un factor clave para el desarrollo de protocolos de ensa yos clínicos seguros y eficientes para la terapia génica retiniana según la invención. Por esta razón, los inventores exploraron los títulos de anticuerpos antifármaco (ADA) en primates no humanos (Macaca fascicularis) después de una administración subretiniana única de un virus pseudotipado rVAA8.
21 monos recibieron inyecciones subretinianas en tres cohortes (dosis alta: 1x1012 genomas vectoriales [vg], dosis baja: 1x10” vg o solo vehículo) y una terapia inmunosupresora concomitante equivalente a una situación hipotética de ensayo clínico. Las muestras iniciales se compararon con las tomadas 1,2 y 3 días y 1,4 y 13 semanas después de la aplicación del vector.
Este estudio proporciona datos relevantes para una aplicación clínica de la invención, en donde rVAA8 podría usarse para una administración subretiniana del transgén hPDE6A. Cuando se simula el escenario clínico con vector de grado clínico, cirugía e inmunosupresión concomitantes, no se producía ninguna inducción de los anticuerpos antifármaco en los primates no humanos.
6. Toxicidad
La evaluación de la toxicidad se basaba en la evaluación de observaciones clínicas, pesos corporales, exámenes del fondo oftálmico y con lámpara de hendidura (SLO), exámenes macroscópicos, fotografía del fondo del ojo, tomografía de coherencia óptica (OCT) -(incluyendo angiografía con verde de indocianina y angiografía por fluorescencia [FA]), presión intraocular (PIO), electrorretinografía (ERG), pesos de órganos y evaluaciones macroscópicas y microscópi cas.
No se registraron mortalidades relacionadas con el elemento del ensayo ni observaciones clínicas.
No se observaron hallazgos adversos o relacionados con el elemento del ensayo en los pesos corporales, ECGs, presión arterial, patología clínica, análisis de orina o evaluación de inmunoglobulinas.
No se observaron cambios relacionados con el ítem del ensayo durante las evaluaciones oftálmicas. PIO (aumentos transitorios), ERG (tiempos implícitos aumentados), OCT (acortamiento de los segmentos externos de los fotorreceptores), SLO (agrupamiento del epitelio pigmentario de la retina [RPE], atrofia del RPE o coroides, fuga en FLA) y fondo de ojo (hiperpigmentación e hipopigmentación) estaban relacionados con el procedimiento porque también tenían lugar en los monos de control.
Se produjeron cambios muy sutiles relacionados con el procedimiento estructural (es decir, causados por la inyección subretiniana) en la retina externa (segmentos externos de los fotorreceptores [POS]). Estos cambios consistían en un acortamiento del POS, estructura que está en constante reciclaje/renovación (10% cada día). Se sabe que el POS se acorta hasta 6 meses después de una cirugía subretiniana (Schaffer et al., 1993).
No se observaron hallazgos en el peso de los órganos ni en las observaciones macroscópicas.
En conclusión, una administración subretiniana de rAAV.hPDE6A estaba bien tolerada hasta la dosis más alta de 1 x 10E12 vg en los macacos machos y hembras. El único cambio relacionado con el elemento del ensayo era una mínima inflamación perivascular transitoria de la retina, que probablemente estaba asociada con el vector rVAA. Se encontra ron alteraciones mínimas en el RPE en todos los grupos, incluidos los controles, y estaban relacionadas con el proce dimiento.
7. Secuencias de ácidos nucleicos
Las siguientes secuencias de nucleótidos y aminoácidos se identifican en la lista de secuencias.
Secuencia de nucleótidos del promotor hRHO: SEQ ID No. 1
Secuencia de nucleótidos de hPDE6A: SEQ ID No. 2 Secuencia de aminoácidos de hPDE6A: SEQ ID No. 3 Secuencia de nucleótidos de WPREm: SEQ ID No. 4 Secuencia de nucleótidos de pA de BGH: SEQ ID No. 5 Secuencia de nucleótidos de L-ITR: SEQ ID No. 6 Secuencia de nucleótidos de R-ITR: SEQ ID No. 7 Secuencia de nucleótidos de la estructura principal del vector pGL2.KanR: SEQ ID No. 8
Claims (1)
- REIVINDICACIONES1. Un vector de virus adenoasociado (VAA) que comprende un polinucleótido, comprendiendo dicho polinucleótido un casete de expresión transgénica, que comprende(a) un ácido nucleico que codifica el promotor del gen de la rodopsina humana (hRHO);(b) un ácido nucleico que codifica la subunidad alfa específica de la fosfodiesterasa 6A humana de GMPc (hPDE6A) de los bastones o fragmentos de la misma que presentan actividad hPDE6A, y(c) un ácido nucleico que codifica elementos reguladores,en donde dicho vector de VAA es un plásmido circular que comprende además una estructura principal que tiene una longitud de > 5000 pb y en donde dicho vector de VAA comprende además un ácido nucleico que codifica repeticiones terminales invertidas (ITRs) que flanquean dicho casete de expresión transgénica. 2. El vector según la reivindicación 1, en el que dichos elementos reguladores comprenden(c1) un ácido nucleico que codifica un elemento regulador postranscripcional del virus de la estomatitis de la marmota (WPRE), preferiblemente un WPRE mutado (WPREm), comprendiendo dicho WPREm un marco de lectura abierto (WHX OR) de la proteína X del virus de la hepatitis de la marmota (WHX) no expresable. 3. El vector según la reivindicación 1 o 2, en el que dichos elementos reguladores comprenden(c2) un ácido nucleico que codifica una señal de poliadenilación (pA), preferiblemente una pA de la hormona de crecimiento bovina (BGH pA).4. El vector según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que al menos una ITR es adyacente a dicho promotor hRHO (L-ITR) y al menos una ITR es adyacente a una señal de poliadenilación pA (R-ITR), más preferible mente dichas ITRs se obtienen a partir del serotipo 2 de VAA (ITR VAA2).5. El vector según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende el siguiente orden de colocación:(a) -(b) -(c),preferiblemente (a) -(b) -(c1) -(c2),más preferiblemente (L-ITR) -(a) -(b) -(c1) -(c2) -(R-ITR).6. El vector según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que independientemente unos de otros - dicho promotor hRHO comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1, y/o- dicha hPDE6A comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2, y/o- dicho WPREm comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 3, y/o- dicha BGH pA comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 4, y/o- dicha L-ITR comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 5 y/o dicha R-ITR comprende la secuen cia de nucleótidos de SEQ ID No. 6.7. El vector según la reivindicación 1, en el que dicha estructura principal tiene una longitud de > 5.500 pb.8. El vector según la reivindicación 1 o 7, en el que dicha estructura principal comprende independientemente unos de otros- < 5 marcos abiertos de lectura (ORFs), preferiblemente < 4 ORFs, más preferiblemente < 3 ORFs, más preferiblemente < 2 ORFs, más preferiblemente < 1 ORF, muy preferiblemente 0 ORFs, y/o- un marcador de selección, preferiblemente un ácido nucleico que codifica la resistencia a un antibiótico, más preferiblemente un ácido nucleico que codifica la resistencia a kanamicina (KanR), más preferiblemente dicho marcador de selección está en sus extremos 5' y 3', separado a una distancia del polinucleótido, prefe riblemente separado a una distancia máxima del polinucleótido, más preferiblemente separado a una distan cia de > 1000 pb, más preferiblemente de > 1500 pb, lo más preferiblemente de > 1900 pb del polinucleótido, y/o- < 10 sitios de reconocimiento de enzimas de restricción (RERSs), preferiblemente < 5 RERSs, más preferi blemente < 3 RERSs, más preferiblemente < 2 RERSs, más preferiblemente < 1 RERS, muy preferiblemente 0 RERSs, y/o- < 5 promotores, preferentemente < 4 promotores, más preferentemente < 3 promotores, más preferente mente < 2 promotores, más preferentemente < 1 promotor, muy preferentemente 0 promotores, y/o - un origen de replicación (ORI), preferiblemente un ORI de pUC18.9. El vector según cualquiera de las reivindicaciones 1, 7 u 8, en el que dicha estructura principal comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 8.10. Una preparación farmacéutica que comprende el vector según una cualquiera de las reivindicaciones 1-9 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.11. Un kit que comprende(a) el vector según cualquiera de las reivindicaciones 1-9, y/o la preparación farmacéutica según la reivindicación 10, y(b) sus instrucciones de uso.
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