BR112019009834B1 - Vetor viral adeno-associado recombinante (raav), vírus, composição farmacêutica e uso de um vetor raav - Google Patents

Abstract

Métodos e materiais para a liberação intratecal de vírus adeno-associado recombinante 9 (rAAV9) que codifica a proteína de ligação Metil-CpG 2 (MECP2) são fornecidos. O uso dos métodos e materiais é contemplado, por exemplo, para o tratamento da síndrome de Rett.

Description

[001] O presente pedido reivindica o benefício da prioridade do Pedido de Patente Provisório U.S. No. 62/423.618 depositado em 17 de novembro de 2016. Incorporação por Referência de Material Submetido Eletronicamente

[002] É incorporada por referência em sua totalidade uma listagem de sequências na forma legível por computador submetida ao mesmo tempo com a presente e identificada como se segue: arquivo de texto ASCII designado “50215PCT_SeqListing.txt”, 24.148 bytes, criado em 17 de novembro de 2017.

Campo da Invenção

[003] A presente invenção refere-se a métodos e materiais para a liberação intratecal de vírus adeno-associado recombinante 9 (rAAV9) que codifica a proteína de ligação metil-CpG 2 (MECP2). O uso dos métodos e materiais é contemplado, por exemplo, para o tratamento da síndrome de Rett.

Antecedentes

[004] A síndrome de Rett é um distúrbio dominante ligado a X de neurodesenvolvimento que afeta ~1 em 10.000 meninas. Machos hemizigotos habitualmente morrem de encefalopatia neonatal. As fêmeas heterozigóticas sobreviveram na maioridade, mas apresentam sintomas graves incluindo a microcefaleia, a perda de movimentos intencionais da mão e a fala, e anormalidades do motor que aparecem após um período de desenvolvimento aparentemente normal. A idade do início é ao redor de 6 a 18 meses.

[005] A síndrome de Rett é classificada como Rett Típica (ou Clássica) ou Rett Atípica. As mutações espontâneas do gene que codificam a proteína de ligação Metil-CpG 2 (MECP2) do fator de transcrição provocam a maioria (~90%) dos casos em ambas as classificações, embora a Rett Atípica possa ser provocada por mutações nos genes diferentes de MECP2. A natureza da mutação de MECP2 (por exemplo, supressão versus mutação pontual) e a inativação do cromossomo X distorcida afetam a gravidade da doença. O fator de transcrição de MECP2 modula a transcrição de milhares de genes. Esforços terapêuticos têm focalizado em alvos a jusante da MECP2 Incluindo neurotransmissores, fatores de crescimento e vias metabólicas. Pelo menos nove testes clínicos direcionados para a síndrome de Rett relataram resultados positivos através de diferentes medidas, mas as descobertas não foram independentemente validadas ou resultaram em novos tratamentos [Katz et al, Trends in Neurosciences, 39: 100-113 (2016)]. Não existem atualmente nenhuma terapia aprovada para a síndrome de Rett.

[006] Existem modelos de camundongo machos e fêmeas nos quais os camundongos apresentam comportamentos semelhantes a RTT [Guy et al., Nature Genetics, 27: 322-326 (2001); Chen et al., Nature Genetics 27: 327-331 (2001); and Katz et al., 5: 733-745 (2012)].

[007] A MECP2 é uma proteína nuclear de 52 kD que é expressa em uma variedade de tecidos, mas é enriquecida nos neurônios e foi estudada mais no sistema nervoso. Existem duas isoformas de MECP2 em seres humanos conhecidas como MECP2A e B (Figura 1) [Weaving et al., Journal of Medical Genetics, 42: 1-7 (2005)]. As duas isoformas derivam de transcritos de mRNA alternativamente combinados e possuem sítios de início da translação diferentes. A MECP2B inclui éxons 1, 3 e 4 e é a isoforma predominante no cérebro. A MECP2 se liga reversivelmente ao DNA metilado e modula a expressão do gene [Guy et al., Annual Review of Cell and Developmental Biology, 27: 631-652 (2011)]. Estas funções mapeiam para o domínio de ligação de metila (MBD) e para o domínio repressor transcricional (TRD), respectivamente [Nan & Bird, Brain & Development, 23, Suppl 1: S32-37 (2001)]. Originalmente considerado como um repressor da transcrição, a MECP2 pode tanto induzir quanto suprimir a expressão do gene alvo [Chahrour et al., Science, 320: 1224-1229 (2008)]. A MECP2 é suposta de sustentar o desenvolvimento e manutenção neuronais apropriados. Nos neurônios, a MECP2 facilita a translação da atividade sináptica na expressão do gene através da ligação de DNA e interação com diferentes parceiros de ligação [Ebert et al., Nature, 499: 341-345 (2013) e Lyst et al., Nature Neuroscience, 16: 898-902 (2013)]. Nos astrócitos, a deficiência de MECP2 está ligada a eventos apnéicos em camundongos [Lioy et al., Nature, 475: 497-500 (2011)]. A deficiência de MECP2 pode provocar tamanho de cérebro reduzido, densidade de acondicionamento neuronal aumentada e complexidade dendrítica reduzida [Armstrong et al., Journal of Neuropathology and Experimental Neurology, 54: 195-201 (1995)]. Com importância, a morte de neurônios não está associada com a deficiência de MECP2 [Leonard et al., Nature Reviews, Neurology, 13: 37-51 (2017)]. A MECP2 também é encontrada fora do sistema nervoso, embora os níveis variem através dos tecidos (Figura 2). Um estudo recente examinou a dependência dos sintomas de Rett em camundongos sobre a expressão periférica de Mecp2 [Ross et al., Human Molecular Genetics, 25: 4389-4404 (2016)]. A deficiência periférica foi associada com hipoatividade, fadiga em exercício e anormalidades ósseas. A maior parte do comportamento associado ao RTT, fenótipos sensoriais, andadura e autonômico (respiratório e cardíaco), estava ausente em camundongos com MECP2 periférica neutralizada.

[008] Visto que a MECP2 é um gene ligado a X, uma cópia de MECP2 é silenciada devido à inativação do cromossomo X (Xci) em fêmeas. Em uma base por célula, acredita-se que a Xci seja aleatória que leva ao quimerismo da MECP2 em fêmeas com Rett. A gravidade da doença é afetada se a maioria dos cromossomos X ativos contiver o gene MECP2 intacto ou submetido à mutação. Isto é chamado de Xci distorcida. Os machos não sofrem de Xci, portanto, a deficiência de MECP2 é mais grave já que nenhuma célula terá uma cópia funcional de MECP2. A natureza da mutação de MECP2 também afeta a gravidade da doença. Acima de 600 mutações diferentes do gene de MECP2 são descritas no banco de dados RettBASE (http://mecp2.chw.edu.au/) incluindo supressões, mutações não sentido e pontuais. A mutação mais comum (~9% de pacientes) é o alelo T185M que afeta o domínio de ligação de metila. Outras mutações comuns são mostradas na Figura 3 [Leonard, supra]. Em conjunto, estes são responsáveis por mais de 40% dos casos listados no RettBASE. Supressões em grande escala envolvendo a MECP2 foram observadas em 8 a 10% dos casos [Li et al., Journal of Human Genetics, 52: 38-47 (2007) e Hardwick et al., European Journal of Human Genetics, 15: 1218-1229 (2007)]. Existe uma correlação de fenótipo para fenótipo com mutações e supressões de R133C, R294X e C-terminais (a jusante do TRD) que provoca uma doença mais branda. Grandes supressões e mutações de truncagem precoce (R270X, R255X e R168X) estão associadas com a síndrome de Rett grave. A Tabela 1 descreve critérios de diagnóstico de consenso de Rett recentemente compilados por um grupo de clínicos de Rett Internacionais [Neul et al., Annals of Neurology, 68: 944-950 (2010)].

[009] O vírus adeno-associado (AAV) é um parvovírus deficiente de replicação, o genoma de DNA de fita simples do qual é de cerca de 4,7 kb no comprimento que inclui 145 repetições terminais invertidas de nucleotídeo (ITRs). A sequência de nucleotídeo do genoma sorotipo 2 de AAV (AAV2) é apresentado em Srivastava et al., J Virol, 45: 555-564 (1983) conforme corrigido por Ruffing et al., J Gen Virol, 75: 3385-3392 (1994). As sequências de atuação Cis que direcionam a replicação de DNA viral (rep), encapsulamento/acondicionamento e integração do cromossoma da célula hospedeira estão contidas dentro das ITRs. Três promotores de AAV (nomeados p5, p19 e p40 para as suas localizações relativas do mapa) acionam a expressão das duas estruturas de leitura abertas internas do AAV que codificam os genes rep e cap. Os dois promotores de rep (p5 e p19), acoplados com a união diferencial do íntron de AAV isolado (em nucleotídeos 2107 e 2227), resultam na produção de quatro proteínas de rep (rep 78, rep 68, rep 52, e rep 40) do gene rep. As proteínas de rep possuem múltiplas propriedades enzimáticas que são em última análise responsáveis pela replicação do genoma viral. O gene cap é expresso a partir do promotor p40 e codifica as três proteínas capsídicas VP1, VP2 e VP3. A união alternativa e os sítios de partida translacionais não consenso são responsáveis pela produção das três proteínas capsídicas relacionadas. Um único sítio de poliadenilação de consenso está localizado na posição de mapa 95 do genoma de AAV. O ciclo de vida e a genética do AAV são revisados em Muzyczka, Current Topics in Microbiology and Immunology, 158: 97-129 (1992).

[0010] O AAV possui características únicas que o torna atrativo como um vetor para a liberação de DNA externo nas células, por exemplo, na terapia genética. A infecção por AAV de células em cultura é não citopática, e a infecção natural de seres humanos e outros animais é silenciosa e assintomática. Além do mais, o AAV infecta muitas células mamíferas que permitem a apoptose possibilidade de direcionamento de muitos tecidos diferentes in vivo. Além disso, o AAV transfere lentamente as células de divisão e não divisão, e pode persistir essencialmente pelo tempo de vida das células como um episomo nuclear transcricionalmente ativo (elemento extracromossômico). O genoma pró-viral do AAV é infeccioso como o DNA clonado em plasmídeos que torna possível a construção de genomas recombinantes. Além disso, por causa dos sinais que direcionam a replicação de AAV, a encapsidação e a integração do genoma estão contidas dentro das ITRs do genoma de AAV, alguns ou todos os internos de aproximadamente 4,3 kb do genoma (codificação das proteínas capsídicas de replicação e estruturais, rep-cap) podem ser substituídos com o DNA externo tal como um cassete de gene contendo um promotor, um DNA de interesse e um sinal de poliadenilação. As proteínas rep e cap podem ser fornecidas in trans. Outra característica significativa do AAV é que ele é um vírus extremamente estável e vigoroso. Ele facilmente resiste as condições utilizadas para inativar adenovírus (56° a 65 °C durante várias horas), tornando a conservação a frio de AAV menos crítica. O AAV pode ainda ser liofilizado. Finalmente, as células infectadas com AAV não são resistentes à superinfecção. Vários sorotipos de AAV existem e oferecem um tropismo de tecido variado. Os sorotipos conhecidos incluem, por exemplo, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13 e AAVrh74. O AAV9 é descrito na Patente U.S. No. 7.198.951 e em Gao et al., J. Virol., 78: 6381-6388 (2004).

[0011] Permanece uma necessidade na técnica com relação aos métodos e produtos para a liberação de polinucleotídeos de MECP2, e para a expressão dos polinucleotídeos no sistema nervoso central.

Sumário

[0012] A presente descrição fornece métodos e materiais úteis para o tratamento da síndrome de Rett em um paciente com sua necessidade.

[0013] Métodos de tratamento de síndrome de Rett em um paciente que compreende a etapa de administração intratecal de um vírus adeno-associado recombinante 9 (rAAV9) que codifica a proteína de ligação Metil-CpG 2 (MECP2) a um paciente com sua necessidade, em que o rAAV9 compreende um genoma autocomplementar que codifica a MECP2B e em que a sequência do genoma autocomplementar é estabelecida na SEQ ID NO: 1. Um rAAV9 exemplar fornecido é o scAAV denominado AVXS-201.

[0014] Métodos são fornecidos que ainda compreendem a etapa de administração intratecal de iohexol, iobitridol, iomeprol, iopamidol, iopentol, iopromide, ioversol ou ioxilan, ou misturas de dois ou mais destes, ao paciente, e/ou que ainda compreendem a colocação do paciente na posição de Trendelenberg.

Breve Descrição dos Desenhos

[0015] Figura 1: Diagrama da posição de MECP2 humana. A imagem mostra os sítios de início da transcrição alternativos (setas), éxons (caixas) e padrão de junção dos mRNAs maduros. A MECP2B é a isoforma mais abundante no cérebro e é codificada por AVXS-201.

[0016] Figura 2: Gráfico que representa níveis relativos de expressão de proteína MECP2 em vários tecidos humanos como detectado por imunoistoquímica. Modificado a partir do The Human Protein Atlas (www.proteinatlas.org).

[0017] Figura 3: Domínios funcionais essenciais da proteína MECP2 e mutações comuns observadas em pacientes com Rett. MBD = domínio de ligação a metil-CpG, TRD = domínio de repressão da transcrição, NID = Domínio de interação NCOR-SMRT (NID), e o sinal de localização nuclear (NLS).

[0018] Figura 4: Prova de conceito com restauração mediada por AAV9 da expressão de Mecp2 em camundongos com Rett machos. A) Desenho do genoma de AAV recombinante. B) Projeto experimental. C) Curva de sobrevivência Kaplan-Meier que mostra a sobrevivência aumentada de camundongos com Rett tratados com scAAV9.738.Mecp2 em Comparação com animais tratados com o vetor de controle. D) A restauração Mecp2 mediada por vetor melhora o fenótipo comportamental quando medido pela pontuação Bird (Caixa 1).

[0019] Figura 5: Tratamento com scAAV9.738.Mecp2 de camundongos com Rett fêmeas compõe os níveis fisiológicos de Mecp2 e melhora o comportamento aberrante. A) Projeto experimental. B) Medições da intensidade de fluorescência de cortes cerebrais que foram imunomarcados para Mecp2 de camundongos tipo silvestre e tratados com scAAV9.738.Mecp2. A distribuição das medições de intensidade é semelhante entre os dois grupos. C) A pontuação Bird do fenótipo mostra uma redução nos sintomas em animais que recebem scAAV9.738.Mecp2. D a G) Rotarod, Inverted Grid, Platform e avaliações comportamentais de ninhada, respectivamente, todas mostram melhora nos animais tratados com scAAV9.738.Mecp2 versus controle.

[0020] Figura 6: Um desenho que representa os genomas de AAV recombinantes de primeira geração (A) e revisados (B, AVXS-201) descritos nesta invenção. As cores refletem similaridades e diferenças entre as construções. Entre scAAV9.738.Mecp2 e AVXS-201, o promotor foi encurtado, as sequências intervenientes entre os elementos essenciais foram encurtadas, o cDNA de mecp2 alfa de murino foi substituído por um cDNA de MECP2B humano, e o sinal de poliadenilação do hormônio do crescimento bovino foi alterado para um elemento sintético mais curto. O objetivo geral das mudanças foi melhorar a eficiência de acondicionamento enquanto mantém os níveis fisiológicos de expressão de um cDNA de MECP2 clinicamente relevante.

[0021] Figura 7: Resposta de dose de AVXS-201 em camundongos Mecp2-/y. A) Um gráfico Kaplan-Meier das diferentes doses utilizadas para tratar camundongos Mecp2-/y. A sobrevivência mediana para os grupos de dose é codificada por cores e indicada pelas linhas tracejadas. Cada grupo que recebeu AVXS-201 teve um aumento na sobrevivência sobre os camundongos nulos tratados com controle. B) Os dados de sobrevivência mediana de cada grupo foram marcados em gráfico para mostrar a curva de resposta de dose. A linha tracejada representa a sobrevivência mediana de Mecp2-/y tratada com PBS. Estes dados são consistentes com os efeitos conhecidos de deficiência e abundância de MECP2.

[0022] Figura 8: Pontuação comportamental Bird para camundongos Mecp2-/y tratados com AVXS-201. A) Camundongos afetados tratados com controle acumulam déficits com o aumento da idade. Déficits comportamentais são atenuados com o tratamento com AVXS-201 independente da dose. B) Os mesmos dados como em (A) são representados por meio de gráfico novamente mostrando apenas o controle tratado e o grupo AVXS-201 1,44 x 1010 vg.

[0023] Figura 9: Camundongos nulos Mecp2 tratados com AVXS- 201 recuperam a perambulação espontânea. A análise de campo aberto mostra que os camundongos nulos tratados com AVXS-201 atravessam (A) maiores distâncias e em velocidade média aumentada (B) em comparação com os nulos tratados com controle. C) O desempenho Rotarod em 3 meses de idade também foi melhorado com doses moderadas de AVXS-201. + = p < 0,001; * = p < 0,05; = p < 0,0001.

[0024] Figura 10: O AVXS-201 cria uma quantidade moderada de MECP2 em doses terapêuticas. A) Western blots anti-MeCP2 a partir de homogenatos de hemisfério cerebral produzidos de camundongos tipo silvestre (PBS) ou Mecp2-/y. Os nulos de Mecp2 não foram injetados (KO) ou receberam as doses indicadas de AVXS-201. B) Quantificação do painel A. A dose terapêutica direcionada de 1,44 x 1010 vg produziu 11% de níveis do tipo silvestre de proteína.

[0025] Figura 11: O AVXS-201 é bem tolerado em camundongos do tipo silvestre. A) Gráfico de sobrevivência Kaplan-Meier de camundongos machos do tipo silvestre que receberam a administração de P1 ICV de AVXS-201. B) A pontuação fenotípica Bird dos camundongos tratados e do tipo silvestre mostra que uma ampla faixa de doses é bem tolerada. A dose mais elevada (1,13 x 1011, linha azul) produziu deteriorações brandas de comportamento.

[0026] Figura 12: O tratamento com AVXS-201 em animais do tipo silvestre não prejudica a preambulação. A análise de campo aberto de camundongos machos do tipo silvestre tratados com AVXS-201 mostra (A) distâncias similares percorridas e (B) velocidades médias como os camundongos do tipo silvestre tratados com controle. C) O desempenho de Rotarod foi diminuído nos animais do tipo silvestre que receberam a dose elevada de AVXS-201. + = p < 0,001, * = p < 0,05

[0027] Figura 13: AVXS-201 produz aumentos dependentes da dose na proteína MECP2 em cérebros do tipo silvestre. A) Western blots anti-MeCP2 mostram uma elevação dependente da dose da proteína MeCP2 total em várias regiões do cérebro 3 semanas após a injeção de P1 ICV. (Cb = cerebelo, Med = medula, Hipp = hipocampo, Ctx = córtex, Mid = mesencéfalo). TG3 indica amostras obtidas a partir de um modelo de camundongo grave de Síndrome de Duplicação de MeCP21. B) Quantificação do painel A. Doses elevadas, mas não moderadas, de expressão de MECP2 dupla de AVXS-201 nas regiões seletivas do cérebro.

[0028] Figura 14: Infusão intratecal de AVXS-201 em primatas não humanos não prejudica o aumento do peso corporal. Os três animais tratados com AVXS-201 são mostrados em vermelho, e o peso corporal para um indivíduo de controle é mostrado em azul.

[0029] Figura 15: Infusão intratecal de AVXS-201 em primatas não humanos não impactam os valores hematológicos por 18 meses após a injeção. Os valores para os três animais tratados com AVXS-201 são mostrados em vermelho e os indivíduos de controle são mostrados em azul.

[0030] Figura 16: Infusão intratecal de AVXS-201 em primatas não humanos não afeta a química do soro por 12 a 18 meses após a injeção. Os valores hepáticos e de eletrólitos são similares entre os indivíduos tratados com AVXS-201 e controle. Os valores para os três animais tratados com AVXS-201 são mostrados em vermelho e os indivíduos de controle são mostrados em azul.

[0031] Figura 17: A infusão intratecal de AVXS-201 em primatas não humanos não afeta a química do soro por 12 a 18 meses após a injeção. Valores cardíacos e renais são similares entre os indivíduos tratados com AVXS-201 e controle. Os valores para os três animais tratados com AVXS-201 são mostrados em vermelho e os indivíduos de controle são mostrados em azul.

[0032] Figura 18: Níveis similares de expressão de MeCP2 por todos os cérebros de primatas não humanos tratados com AVXS-201 e de controle. A imunoistoquímica anti-MeCP2 não revelou nenhuma anormalidade estrutural macroscópica ou diferenças óbvias na expressão de MeCP2. OC = Córtex Occipital, TC = Córtex Temporal, LSc = medula espinhal lombar, Thal = tálamo, Hipp = Hipocampo, Cb = cerebelo.

[0033] Figura 19: Western blots das regiões cerebrais de animais de controle e injetados com AVXS-201 mostram níveis similares de MeCP2. Os níveis totais de MeCP2 são mostrados em verde e os controles de carga de GAPDH são mostrados em vermelho. As quantificações dos painéis A e B são mostradas abaixo de suas respectivas manchas. Linhas tracejadas nos gráficos indicam os valores normalizados médios detectados através dos controles. OC = Córtex Occipital, TC = Córtex Temporal, LSc = medula espinhal lombar, Thai = Tálamo, Hipp = Hipocampo, Cb = cerebelo. Os valores são mostrados como média ± SEM.

[0034] Figura 20: A hibridização in situ mostra o transcrito derivado do vetor em todas as regiões examinadas dos cérebros de animais tratados com AVXS-201, mas não controles. A figura mostra as sondas contra Gapdh (vermelho) e MCP2 mRNA derivado do vetor (verde) junto com a marcação nuclear (Dapi, azul). OC = Córtex Occipital, TC = Córtex Temporal, LSc = Medula espinal lombar, Hipp = Hipocampo, Cb = Cerebelo. Barras em escala = 20 μm.

[0035] Figura 21: A hibridização in situ mostra o transcrito derivado do vetor em todas as regiões examinadas dos cérebros de animais tratados com AVXS-201, mas não controles, 18 meses após a injeção. A figura mostra as sondas contra Gapdh (vermelho) e MCP2 mRNA derivado do vetor (verde) junto com a marcação nuclear (Dapi, azul). OC = Córtex Occipital, TC = córtex Temporal, CA1 e CA3 = Regiões do hipocampo, CC = Corpo Caloso, Thai = Tálamo, Cau = Caudado, Put = Putâmen, SColl = Colículo Superior, Med = Medula, Cb = cerebelo, Cerv = medula espinhal cervical, Thor = medula espinhal torácica, Lumb = medula espinhal lombar. Barras em escala = 20 μm.

[0036] Figura 22: fragmento de DNA sintetizado.

[0037] Figura 23: síndrome de Rett - patologia clínica - distúrbio de espectro do autismo de neurodesenvolvimento ligado a X que afeta ~1 em 10.000 meninas - idade de início: 6 a 18 meses de idade - * perda da função motora, fala e função manual - 90% dos casos resultam de mutações na proteína de ligação a metil CpG 2 (MeCP2) - * fator de transcrição, regula milhares de genes - Brookline, 6 anos de idade - subexpressão de MeCP2 - superexpressão de MeCP2 - síndrome de Rett - função normal - síndrome de duplicação.

[0038] Figura 24: síndrome de Rett é reversível! - o modelo expressa fenótipos semelhantes a síndrome de Rett: - sobrevivência reduzida - fraqueza muscular - ansiedade aumentada - animais (%) - livre de sintomas - sobrevivência - fêmea - macho - a reexpressão de MeCP2 em camundongos nulos melhora os fenótipos de sobrevivência e comportamento.

[0039] Figura 25: liberação mediada por sorotipo do vírus adeno- associado 9 (AAV9) de MeCP2 ao CNS - promotor endógeno - não patogênico - direcionamento eficiente dos neurônios e astrócitos - ITR submetida à mutação - promotor de mMecp2 - poli(A) sintético - parâmetros de tratamento - e - dia 2 pós-natal (P2) - injeção intracerebroventricular (ICV), diretamente ao CNS - local da injeção - de (Lee et al. 2007 Faseb) - genomas virais totais (vg) injetados.

[0040] Figura 26: regulação de MeCP2 em camundongos do tipo silvestre injetados com AAV9-P546-MeCP2 - expressão da proteína MeCP2 na metade do cérebro de camundongos MeCP2y/+ tratados com ICV - expressão da proteína MeCP2 na metade do cérebro de camundongo.

[0041] Figura 27: expressão relativa de MECP2 em camundongos nulos de MECP2 após a injeção ICV de AAV9-P546-MECP2 - expressão da proteína MeCP2 na metade do cérebro de camundongos MeCP2y/+ tratados com ICV.

[0042] Figura 28: efeito de P546-MeCP2 liberada diretamente no CNS de camundongos MeCP2y/- sobre as pontuações comportamentais - pontuação comportamental qualitativa - tremor - andadura - respiração anormal - mobilidade - condição geral - pata traseira presa - pontuações (KO, ICV, efeito de dose P546) - patologia - pontuação média de comportamento agregado - idade (dias) - camundongo.

[0043] Figura 29: efeito de P546-MeCP2 liberada diretamente no CNS de camundongos MeCP2y/- sobre as pontuações comportamentais - pontuação comportamental qualitativa - tremor - andadura - respiração anormal - mobilidade - condição geral - pata traseira presa - pontuações (efeito de dose de KO, ICV, P546) - patologia - pontuação média de comportamento agregado - idade (dias) - camundongo.

[0044] Figura 30: P546-MeCP2 liberada diretamente no CNS de camundongos MeCP2y/- auxilia a atividade motora - campo aberto (distância) - distância total percorrida (mm) - (7 a 9 semanas após a injeção) - latência para cair (seg) - (12 semanas após a injeção).

[0045] Figura 31: sobrevivência de camundongos MeCP2y/+ vs. MeCP2y/- - intracerebroventricular, recém-nascido - sobrevivência (%) - dias - oclusão defeituosa - lesão da cauda - infecção urogênica.

[0046] Figura 32: sobrevivência de camundongos MeCP2y/+ vs. MeCP2y/- - intracerebroventricular, recém-nascido - sobrevivência (%) - dias - oclusão defeituosa - lesão da cauda - infecção urogênica.

[0047] Figura 33: sobrevivência de camundongos MeCP2y/+ vs. MeCP2y/- - intracerebroventricular, recém-nascido - sobrevivência (%) - dias - oclusão defeituosa - lesão da cauda - infecção urogênica.

[0048] Figura 34: sobrevivência de camundongos MeCP2y/+ vs. MeCP2y/- - intracerebroventricular, recém-nascido - sobrevivência (%) - dias - oclusão defeituosa - lesão da cauda - infecção urogênica.

[0049] Figura 35: sobrevivência de camundongos MeCP2y/+ vs. MeCP2y/- - intracerebroventricular, recém-nascido - sobrevivência (%) - dias - oclusão defeituosa - lesão da cauda - infecção urogênica.

[0050] Figura 36: sobrevivência de camundongos MeCP2y/+ vs. MeCP2y/- - intracerebroventricular, recém-nascido - sobrevivência (%) - dias - oclusão defeituosa - lesão da cauda - infecção urogênica.

[0051] Figura 37: estudo de segurança de primata não humano (NHP) em Macaca Fascicularis - 12 meses NHP - sacrifício em 5 semanas para análise - macacos injetados em 12 meses por via intratecal com 2,0e13 de genomas virais/injeção - expressão de proteína MeCP2 em (tecido do CNS de NHP) 5 semanas após a injeção - medula espinhal torácica - medula espinhal cervical - estriado - córtex temporal - cerebelo - injeção intratecal de AAV9=P546-MeCP2 - expressão relativa de MeCP2.

[0052] Figura 38: estudo de segurança de primata não humano (NHP) em Macaca Fascicularis - M. Fascicularis injetados em 6 a 12 meses - monitoramento contínuo: - peso - parâmetros sanguíneos - enzimas hepáticas - macacos injetados em 6 e 12 meses por via intratecal com 1,0 a 2,413 de genomas virais/injeção - peso - níveis de enzimas hepáticas - parâmetros sanguíneos - permanecem em níveis normais até 11 meses após a injeção.

[0053] Figura 39: levar mensagem para casa - a síndrome de Rett é reversível - o vetor de AAV9-P546-MeCP2 leva em conta a expressão controlada de MeCP2 no CNS de camundongo e primata não humano - forte melhora no fenótipo comportamental e sobrevivência em camundongos nulos de MeCP2 - os dados iniciais de primata não humano mostram que as doses utilizadas em ensaios clínicos anteriores são provavelmente seguros.

[0054] Figura 40: expressão relativa de MeCP2 em M. fascicularis 5 semanas após a injeção intratecal de AAV9-P546-MeCP2 - mesencéfalo - caudado - cerebelo - globus pallidus - medula - ponte - intensidade de fluorescência de MeCP2 em primatas não humanos tratados com AAV9-P546-MeCP2 intratecal - intensidade de pixel de MeCP2.

[0055] Figura 41: P546-MeCP2 liberada diretamente ao CNS de camundongos do tipo silvestre não afeta a sobrevivência - intracerebroventricular, recém-nascido - sobrevivência (%) - dias.

[0056] Figura 42: imunocoloração de MeCP2 no córtex de camundongo (mover para o fim) - expressão de MeCP2 no córtex de camundongos MeCP2-y/+ tratados com ICV - intensidade de pixel de MeCP2.

[0057] Figura 43: efeito de P546-MeCP2 liberada diretamente no CNS de camundongos MECP2-y/+ sobre as pontuações comportamentais - pontuações (efeito de dose de WT, ICV, P545) - machos, WT - pontuação média de comportamento agregado - idade (dias).

[0058] Figura 44: efeito de AAV9-P546-MeCP2 sobre a atividade de campo aberto de camundongo do tipo silvestre - velocidade de campo aberto - distância de campo aberto - distância total percorrida (mm) - velocidade (mm/s) - (7 a 9 semanas).

[0059] Figura 45: efeito de AAV9-P546-MeCP2 sobre o desempenho rotarod de camundongo do tipo silvestre - liberação de ICV tipo silvestre - desempenho rotarod - latência para a cauda (seg) - idade 3 meses - desempenho médio sobre três ensaios.

[0060] Figura 46: vetor viral da Kaspar lab New para a terapia genética RTT - ITR submetida à mutação - promotor de mMecp2 - poli(A) de BGH - po-li(A) sintético - início de ATG.

[0061] Figura 47: P545-MeCP2 resulta na expressão robusta em astrócitos - novo.

[0062] Figura 48: P545-MeCP2 resulta na expressão robusta nos neurônios - novo.

[0063] Figura 49: avaliação in vivo do vetor de terapia genética de P545-MeCP2 (AAV9-P545-hMeCP2).

[0064] Figura 50: AAV9-P545-MECP2 permite o direcionamento tanto de neurônios quanto de astrócitos no cérebro de camundongo.

[0065] Figura 51: injeção ICV de AAV9-P545_MeCP2 em camundongos MeCP2y/- recém-nascidos resulta na transdução elevada dos neurônios e astrócitos - estriado - córtex - área do hipocampo - injeção ICV de AAV9-P545_MeCP2, 88 dias de idade - MeCP2y/- - recém-nascido, ICV - % de células MeCP2+ - estriado - córtex.

[0066] Figura 52: injeção ICV de AAV9-P545-MeCP2 grandemente aumenta a expectativa de vida de camundongos MeCP2y/- - injeções ICV (recém-nascido) - porcentagem de sobrevivência - 59 dias - dias.

[0067] Figura 53: AAV9-P545-MeCP2 melhora as pontuações de comportamento de camundongos MeCP2y/- e não altera o comportamento nos camundongos WT tratados - critérios de pontuação: - 0 o mesmo como no animal WT - 1 onde o sintoma estava presente - 2 quando o sintoma foi grave - mobilidade - andadura - pata traseira presa - tremor - respiração - condição geral - pontuações_KO_não tratado vs tratado com ICV - pontuação média de comportamento agregado - idade (dias).

[0068] Figura 54: AAV9-P545-MeCP2 melhora o desempenho de camundongos MeCP2y/- - análise de campo aberto - distância total (20 min) - velocidade média - distância total percorrida - velocidade.

[0069] Figura 55: injeção ICV de AAV9-P545_MeCP2 em camundongos do tipo silvestre recém-nascidos não resulta em toxicidade hepática - camundongos do tipo silvestre - idade 12 semanas.

[0070] Figura 56: resumo dos resultados - liberação CSF de AAV9-P545-MeCP2 em camundongos recém-nascidos - em camundongos KO Ed MeCP2 - prolonga a sobrevivência, duplica a expectativa de vida de MeCP2y/- - melhora as pontuações de comportamento - melhora do desempenho motor - em camundongos WT - mínimo a nenhum impacto na sobrevivência - nenhum sintoma semelhante a duplicação de “MeCP2” - nenhuma evidência de toxicidade hepática até esta data. Descrição Detalhada

[0071] Em um aspecto, a invenção fornece métodos para a administração intratecal (isto é, administração no espaço sob a membrana aracnóide do cérebro ou medula espinhal) de um polinucleotídeo que codifica a MECP2 a um paciente que compreende a administração de um rAAV9 com um genoma que inclui o polinucleotídeo. Em algumas modalidades, o genoma rAAV9 é um genoma autocomplementar. Em outras modalidades, o genoma do rAAV9 é um genoma de fita simples.

[0072] Os métodos liberam o polinucleotídeo que codifica a MECP2 no cérebro e na medula espinhal do paciente (isto é, o sistema nervoso central do paciente). Algumas áreas alvo do cérebro contempladas para a liberação incluem, mas não são limitadas a estas, o córtex motor e tronco cerebral. Algumas células alvo do sistema nervoso central contempladas para a liberação incluem, mas não são limitadas a estas, células nervosas e células gliais. Exemplos de células gliais são células microgliais, oligodendrócitos e astrócitos.

[0073] A liberação de polinucleotídeos que codificam a MECP2 é Indicada, por exemplo, para o tratamento da síndrome de Rett.

[0074] "Tratamento" compreende a etapa de administração através da via intratecal de uma dose eficaz, ou doses múltiplas efetivas, de uma composição compreendendo um rAAV da invenção a um animal em questão (incluindo um paciente humano) com sua necessidade. Se a dose for administrada antes do desenvolvimento de um distúrbio/doença, a administração é profilática. Se a dose for administrada após o desenvolvimento de um distúrbio/doença, a administração é terapêutica. Nas modalidades da invenção, uma dose eficaz é uma dose que alivia (elimina ou reduz) pelo menos um sintoma associado com o distúrbio/ estado doentio que está sendo tratado, melhora de pelo menos um sintoma associado com o distúrbio/ estado doentio que está sendo tratado, que retarda ou impede a progressão para um distúrbio/estado doentio, que diminui a extensão da doença, que resulta em remissão (parcial ou total) da doença e/ou que prolonga a sobrevivência.

[0075] No tratamento da síndrome de Rett, os métodos resultam em um efeito no indivíduo incluindo, mas não limitado a estes, recuperação dos movimentos da mão intencionais, melhora da fala, redução de apneias, redução de ataques, redução da ansiedade, socialização aumentada, aumento no IQ, normalização dos padrões de sono e/ou mobilidade aumentada.

[0076] Tratamentos de combinação também são contemplados pela invenção. Combinação como utilizada nesta invenção inclui tanto tratamento simultâneo quanto o tratamento sequencial. As combinações de métodos da invenção com tratamentos médicos padrão para a síndrome de Rett são especificamente contempladas, como são as combinações com novas terapias.

[0077] Embora a liberação a um indivíduo com sua necessidade após o nascimento seja contemplada, a liberação intrauteral a um feto também é contemplada.

[0078] Em outro aspecto, a invenção fornece genomas de rAAV. Os genomas de rAAV compreendem uma ou mais ITRs de AAV que flanqueiam um polinucleotídeo que codifica a MECP2. O polinucleotídeo é ligado de maneira operável aos DNAs de controle de transcrição, especificamente o DNA promotor e o DNA de sequência de sinal de poliadenilação que são funcionais nas células alvo para formar um "cassete de genes". O cassete de genes pode incluir promotores que permitem a expressão especificamente dentro dos neurônios ou especificamente dentro das células gliais. Exemplos incluem enolase específica do neurônio e promotores de proteína acídica fibrilares da glia. Promotores induzíveis sob o controle de um fármaco ingerido também podem ser utilizados. Exemplos incluem, mas não são limitados a estes, sistemas tais como o sistema de tetraciclina (TET ativada/desativada) [Urlinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(14):7963-7968 (2000)] e o sistema regulável do receptor de Ecdysone [Palli et al., Eur J. Biochem 270: 1308-1315 (2003)]. O cassete de genes pode ainda incluir sequências de íntron para facilitar o processamento de uma transcrição de RNA quando o polinucleotídeo for expresso nas células de mamífero.

[0079] Os genomas de rAAV da invenção carecem de DNA rep e cap de AAV. O DNA de AAV nos genomas de rAAV (por exemplo, ITRs) pode ser de qualquer sorotipo de AAV para o qual um vírus recombinante pode ser derivado, mas não limitado aos sorotipos de AAV AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13 e AAVrh74. As sequências de nucleotídeo dos genomas dos sorotipos de AAV são conhecidas na técnica. Por exemplo, o genoma de AAV9 é fornecido em Gao et al., J. Virol., 78: 6381-6388 (2004).

[0080] Em outro aspecto, a invenção fornece plasmídeos de DNA que compreendem genomas de rAAV da invenção. Os plasmídeos de DNA são transferidos para células permissíveis com relação à infecção com um vírus auxiliar de AAV (por exemplo, adenovírus, adenovírus deletado por E1 ou herpes vírus) para montagem do genoma de rAAV em partículas virais infecciosas com proteínas capsídicas de AAV9. Técnicas para produzir partículas de rAAV, em que um genoma de AAV a ser acondicionado, genes rep e cap, e as funções do vírus auxiliar são fornecidas a uma célula, são padrões na técnica. A produção de rAAV requer que os seguintes componentes estejam presentes dentro de uma única célula (indicada aqui como uma célula de acondicionamento): um gene de rAAV, genes rep e cap de AAV separados do (isto é, não no) genoma de rAAV e funções de vírus auxiliar. A produção de rAAV pseudotipado é divulgada, por exemplo, na WO 01/83692 que é aqui incorporada por referência na sua totalidade. Nas várias modalidades, as proteínas capsídicas de AAV podem ser modificadas para aumentar a liberação do vetor recombinante. Modificações de proteínas capsídicas são geralmente conhecidas na técnica. Ver, por exemplo, a US 2005/0053922 e a US 2009/0202490, cujas divulgações são aqui incorporadas por referência na sua totalidade.

[0081] Um método para a geração de uma célula de acondicionamento é criar uma linhagem celular que expressa estavelmente todos os componentes necessários para a produção de partículas de AAV. Por exemplo, um plasmídeo (ou múltiplos plasmídeos) compreendendo um genoma de rAAV sem genes rep e cap de AAV, genes rep e cap de AAV separados do genoma de rAAV, e um marcador selecionável, tal como um gene de resistência à neomicina, é integrado no genoma de uma célula. Os genomas de AAV foram introduzidos em plasmídeos bacterianos através de procedimentos tais como resíduo GC (Samulski et al., 1982, Proc. Natl. Acad. S6. USA, 79:2077-2081), adição de conectores sintéticos contendo sítios de clivagem de endonuclease de restrição (Laughlin et al., 1983, Gene, 23:65-73) ou por ligação direta de extremidade embotada (Senapathy & Carter, 1984, J. Biol. Chem., 259:4661-4666). A linhagem celular de acondicionamento é então infectada com um vírus auxiliar tal como adenovírus. As vantagens deste método são que as células são selecionáveis e são adequadas para produção em grande escala de rAAV. Outros exemplos de métodos adequados empregam adenovírus ou baculovírus em vez de plasmídeos para introduzir genomas de rAAV e/ou genes rep e cap nas células de acondicionamento.

[0082] Princípios gerais de produção de rAAV são revisados em, por exemplo, Carter, 1992, Current Opinions in Biotechnology, 1533539; e Muzyczka, 1992, Curr. Topics in Microbial. and Immunol., 158:97-129. Várias abordagens são descritas em Ratschin et al., Mol. Cell. Biol. 4:2072 (1984); Hermonat et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6466 (1984); Tratschin et al., Mo1. Cell. Biol. 5:3251 (1985); McLaughlin et al., J. Virol., 62:1963 (1988); e Lebkowski et al., 1988 Mol. Cell. Biol., 7:349 (1988). Samulski et al. (1989, J. Virol., 63:38223828); Patente U.S. No. 5.173.414; WO 95/13365 e Patente U.S. No. 5.658.776 correspondente; WO 95/13392; WO 96/17947; PCT/US98/18600; WO 97/09441 (PCT/US96/14423); WO 97/08298 (PCT/US96/13872); WO 97/21825 (PCT/US96/20777); WO 97/06243 (PCT/FR96/01064); WO 99/11764; Perrin et al. (1995) Vaccine 13:1244-1250; Paul et al. (1993) Human Gene Therapy 4:609-615; Clark et al. (1996) Gene Therapy 3:1124-1132; Patente U.S. No. 5.786.211; Patente U.S. No. 5.871.982; e Patente U.S. No. 6,258,595. Os documentos acima são aqui incorporados por referência na sua totalidade, com ênfase específica naquelas seções dos documentos relacionados à produção de rAAV.

[0083] A invenção fornece assim células de acondicionamento que produzem rAAV infeccioso deficiente de replicação. Em uma modalidade, as células de acondicionamento podem ser células de câncer estavelmente transformadas tais como células HeLa, células 293 e células PerC.6 (uma linhagem 293 cognata). Em outra modalidade, as células de acondicionamento são células que não são células cancerosas transformadas, tais como as células 293 de passagem baixa (células renais de feto humano transformadas com E1 de adenovírus), células MRC -5 (fibroblastos fetais humanos), células WI-38 (fibroblastos fetais humanos), células Vero (células renais de macaco) e células FRhL-2 (células pulmonares do feto de macaco da Índia).

[0084] Assim, em outro aspecto, a invenção fornece rAAV tal como rAAV9 (isto é, partículas de rAAV9 cercadas por capsídeo infecciosas deficientes de replicação) compreendendo um genoma de rAAV da invenção. Os genomas do rAAV carecem de DNA rep e cap de AAV, isto é, não existe nenhum DNA rep ou cap de AAV entre as ITRs dos genomas. Em algumas modalidades, o genoma de rAAV é um genoma autocomplementar. Em algumas modalidades, o genoma de rAAV é um genoma de fita simples.

[0085] Os rAAV são fornecidos como um AAV9 autocomplementar (scAAV9) denominado "AVXS-201." Seu cassete de gene (nucleotídeos 151 a 2558 do genoma de AVXS-201 apresentado na SEQ ID NO: 1) possui, em sequência, um fragmento de promotor de 546 bp (SEQ ID NO: 2) (nucleotídeos 74085586-74086323 de NC_000086.7 na orientação inversa) do gene de MECP2 de camundongo, um íntron SV40, um cDNA de MECP2B humano (SEQ ID NO: 3) (Banco de dados CCDS #CCDS48193.1), e uma sequência de sinal de poliadenilação sintética (SEQ ID NO: 4). O cassete de gene é flanqueado por uma repetição terminal invertida de AAV2 mutante (ITR) e uma repetição terminal invertida de AAV2 do tipo silvestre que juntas permitem o acondicionamento de genomas de AAV autocomplementares. O genoma carece de DNA rep e cap de AAV, isto é, não existe nenhum DNA rep e cap de AAV entre as ITRs do genoma.

[0086] Os rAAV são fornecidos tais como um sAAV9 denominado "scAAV9.738.Mecp2". Seu cassete de gene (nucleotídeos 198 a 2890 do genoma scAAV9.738.Mecp2 apresentados na SEQ ID NO: 5) possui, em sequência, um fragmento de promotor de 738 bp (SEQ ID NO: 6) (nucleotídeos 74085586-74086323 de NC_000086.7 na orientação inversa) do gene de MECP2 de camundongo, um íntron de SV40, cDNA de MECP2a de camundongo (SEQ ID NO: 7) (banco de dados CCDS #CCDS41016.1), e uma sequência de sinal de poliadenilação do gene do hormônio de crescimento bovino. O cassete de gene é flanqueado por uma repetição terminal invertida de AAV2 mutante (ITR) e uma repetição terminal invertida de AAV2 do tipo silvestre que juntas permitem o acondicionamento de genomas de AAV autocomplementares. O genoma carece de DNA rep e cap de AAV, isto é, não existe nenhum DNA rep e cap de AAV entre as ITRs do genoma.

[0087] Substituições conservativas de nucleotídeo no genoma de rAAV9 incluindo, mas não limitado a este, no cassete de gene no genoma de rAAV9, são contempladas. Por exemplo, um cDNA de MECP2 em um cassete de gene pode ter 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com o cDNA de MECP2α em scAAV9.738.Mecp2 ou com o cDNA de MECP2B em AVXS-201.

[0088] Em algumas modalidades, o polipeptídeo de MECP2 codificado por um rAAV9 da invenção pode ser um polipeptídeo de MECP2 variante. Um polipeptídeo variante retém a atividade de MECP2 e possui uma sequência de aminoácido de pelo menos cerca de 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99 ou 99.5% idêntica à sequência de aminoácido do polipeptídeo de MECP2 codificado pelo cDNA de MECP2α em scAAV9.738.Mecp2 ou pelo cDNA de MECP2B em AVXS-201.

[0089] O rAAV pode ser purificado por métodos padrão na técnica tais como por cromatografia de coluna ou gradientes de cloreto de césio. Métodos para a purificação de vetores de rAAV a partir do vírus auxiliar são conhecidos na técnica e incluem métodos descritos em, por exemplo, Clark et al., Hum. Gene Ther., 10(6): 1031-1039 (1999); Schenpp and Clark, Methods Mol. Med., 69: 427-443 (2002); Patente U.S. No. 6.566.118 e WO 98/09657.

[0090] Em outro aspecto, a invenção contempla composições que compreendem um rAAV, tal como um rAAV9, que codifica um polipeptídeo de MECP2.

[0091] As composições da invenção compreendem rAAV em um veículo farmaceuticamente aceitável. As composições também podem compreender outros ingredientes tais como diluentes e adjuvantes. Os veículos, diluentes e adjuvantes aceitáveis não são tóxicos para os receptores e são preferivelmente inertes nas dosagens e concentrações empregadas, e incluem tampões tais como fosfato, citrato ou outros ácidos orgânicos; antioxidantes tais como ácido ascórbico; polipeptídeos de baixo peso molecular; proteínas, tais como albumina de soro, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrófilos tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes tais como EDTA; álcoois de açúcar tais como manitol ou sorbitol; contraíons formadores de sais tais como sódio; e/ou surfactantes não iônicos tais como Tween, pluronics ou polietileno glicol (PEG).

[0092] Soluções injetáveis estéreis são preparadas mediante a incorporação de rAAV na quantidade necessária no solvente apropriado com vários outros ingredientes enumerados acima, conforme requerido, seguido pela esterilização por filtro. Geralmente, as dispersões são preparadas através da incorporação do ingrediente ativo esterilizado em um veículo estéril o qual contém o meio de dispersão básico e os outros ingredientes requeridos daqueles enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos preferidos de preparação são a secagem a vácuo e a técnica de secagem por congelamento que produzem um pó do ingrediente ativo acrescido de qualquer ingrediente desejado adicional da solução previamente filtrada estéril do mesmo.

[0093] Títulos e dosagens de rAAV a serem administrados nos métodos da invenção irão variar dependendo, por exemplo, do rAAV particular, do modo de administração, do objetivo de tratamento, do indivíduo, do tempo de administração e do tipo de célula que é direcionada, e podem ser determinados por métodos padrão na técnica. Os títulos de rAAV podem variar de cerca de 1 x 106, cerca de 1 x 107, cerca de 1 x 108, cerca de 1 x 109, cerca de 1 x 1010, cerca de 1 x 1011, cerca de 1 x 1012, cerca de 1 x 1013 a cerca de 1 x 1014 ou mais de partículas resistentes de DNase (DRP) por ml. As dosagens também podem ser expressas em unidades de genomas virais (vg). Estas dosagens de rAAV podem variar de cerca de 1 x 109 vg ou mais, cerca de 1 x 1010 vg ou mais, cerca de 1 x 1011 vg ou mais, cerca de 1 x 1012 vg ou mais, cerca de 6 x 1012 ou mais, cerca de 1 x 1013 vg ou mais, cerca de 1,3 x 1013 vg ou mais, cerca de 1,4 x 1013 vg ou mais, cerca de 2 x 1013 vg ou mais, cerca de 3 x 1013 vg ou mais, cerca de 6 x 1013 vg ou mais, cerca de 1 x 1014 vg ou mais, cerca de 3 x 1014 ou mais, cerca de 6 x 1014 ou mais, cerca de 1 x 1015 vg ou mais, cerca de 3 x 1015 ou mais, cerca de 6 x 1015 ou mais, cerca de 1 x 1016 ou mais, cerca de 3 x 1016 ou mais, ou cerca de 6 x 1016 ou mais. Para um neonato, as dosagens de rAAV podem variar de cerca de 1 x 109 vg ou mais, cerca de 1 x 1010 vg ou mais, cerca de 1 x 1011 vg ou mais, cerca de 1 x 1012 vg ou mais, cerca de 6 x 1012 ou mais, cerca de 1 x 1013 vg ou mais, cerca de 1,3 x 1013 vg ou mais, cerca de 1,4 x 1013 vg ou mais, cerca de 2 x 1013 vg ou mais, cerca de 3 x 1013 vg ou mais, cerca de 6 x 1013 vg ou mais, cerca de 1 x 1014 vg ou mais, cerca de 3 x 1014 ou mais, cerca de 6 x 1014 ou mais, cerca de 1 x 1015 vg ou mais, cerca de 3 x 1015 ou mais, cerca de 6 x 1015 ou mais, cerca de 1 x 1016 ou mais, cerca de 3 x 1016 ou mais, ou cerca de 6 x 1016 ou mais.

[0094] Os métodos da invenção resultam na transdução de células alvo (incluindo, mas não limitadas a estas, células nervosas ou gliais). O termo "transdução" é utilizado para se referir à administração/liberação de um polinucleotídeo a uma célula alvo in vivo ou in vitro, através de um rAAV infeccioso deficiente de replicação da invenção, o que resulta na expressão de um polipeptídeo de MECP2 funcional pela célula receptora.

[0095] A transdução de células utilizando rAAV da invenção resulta na expressão controlada do polipeptídeo de MECP2 codificado pelo rAAV. Em algumas modalidades, o nível de expressão alvo é considerado de ser de cerca de 75% a cerca de 125% do nível de expressão fisiológica normal (ou tipo silvestre) em um indivíduo que não possui síndrome de Rett. O nível de expressão alvo pode ser ao redor de 75%, ao redor de 80%, ao redor de 85%, ao redor de 90%, ao redor de 95%, ao redor de 100%, ao redor de 105%, ao redor de 110%, ao redor de 115%, ao redor de 120% ou ao redor de 125% do nível normal de expressão.

[0096] Em algumas modalidades dos métodos de tratamento da invenção, um agente de contraste não iônico de osmolaridade baixa também é administrado ao paciente. Tais agentes de contraste incluem, mas não são limitados a estes, iobitridol, iohexol, iomeprol, iopamidol, iopentol, iopromide, ioversol, ioxilan, e misturas de dois ou mais dos agentes de contraste. Em algumas modalidades, os métodos de tratamento desse modo ainda compreendem a administração de iohexol ao paciente. O agente de contraste não iônico de baixa osmolaridade é contemplado de aumentar a transdução de células alvo no sistema nervoso central do paciente. Contempla-se que a transdução de células é aumentada quando um rAAV da descrição é utilizado em combinação com um agente de contraste como aqui descrito em relação à transdução de células quando um rAAV da descrição é utilizado isoladamente. Em várias modalidades, a transdução de células é aumentada em pelo menos cerca de 1%, ou pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 100%, pelo menos cerca de 120%, pelo menos cerca de 150%, pelo menos cerca de 180%, pelo menos cerca de 200%, pelo menos cerca de 250%, pelo menos cerca de 300%, pelo menos cerca de 350%, pelo menos cerca de 400%, pelo menos cerca de 450%, pelo menos cerca de 500% ou mais quando um vetor da descrição é utilizado em combinação com um agente de contraste conforme aqui descrito, em relação à transdução de um vetor da descrição quando não utilizado em combinação com um agente de contraste. Em outras modalidades, a transdução de células é aumentada em cerca de 10% a cerca de 50%, ou em cerca de 10% a cerca de 100%, ou em cerca de 5% a cerca de 10%, ou em cerca de 5% a cerca de 50%, ou em cerca de 1% a cerca de 500%, ou em cerca de 10% a cerca de 200%, ou em cerca de 10% a cerca de 300%, ou em cerca de 10% a cerca de 400%, ou em cerca de 100% a cerca de 500%, ou em cerca de 150% a cerca de 300%, ou em cerca de 200% a cerca de 500% quando um vetor da descrição é utilizado em combinação com um agente de contraste conforme aqui descrito, em relação à transdução de um vetor da descrição quando não utilizado em combinação com um agente de contraste.

[0097] Em algumas modalidades, contempla-se que a transdução de células é aumentada quando o paciente é colocado na posição de Trendelenberg (posição de cabeça para baixo). Em algumas modalidades, por exemplo, os pacientes são inclinados na posição de cabeça para baixo em cerca de 1 grau a cerca de 30 graus, cerca de 15 a cerca de 30 graus, cerca de 30 a cerca de 60 graus, cerca de 60 a cerca de 90 graus, ou cerca de 90 até cerca de 180 graus durante ou após a infusão de vetor intratecal. Em várias modalidades, a transdução de células é aumentada em pelo menos cerca de 1%, ou pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 100%, pelo menos cerca de 120%, pelo menos cerca de 150%, pelo menos cerca de 180%, pelo menos cerca de 200%, pelo menos cerca de 250%, pelo menos cerca de 300%, pelo menos cerca de 350%, pelo menos cerca de 400%, pelo menos cerca de 450%, pelo menos cerca de 500% ou mais quando uma posição de Ramdelenberg é utilizada como descrito nesta invenção, em relação de quando a posição de Trendelenberg não é utilizada.

[0098] Em outras modalidades, a transdução de células é aumentada em cerca de 10% a cerca de 50%, ou em cerca de 10% a cerca de 100%, ou em cerca de 5% a cerca de 10%, ou em cerca de 5% a cerca de 50%, ou em cerca de 1% a cerca de 500%, ou em cerca de 10% a cerca de 200%, ou em cerca de 10% a cerca de 300%, ou em cerca de 10% a cerca de 400%, ou em cerca de 100% a cerca de 500%, ou em cerca de 150% a cerca de 300%, ou em cerca de 200% a cerca de 500% quando um vetor da descrição é utilizado em combinação com um agente de contraste e a posição de Trendelenberg como aqui descrita, em relação à transdução de um vetor da descrição quando não é utilizado em combinação com um agente de contraste e posição de Trendelenberg.

[0099] A descrição também fornece modalidades do método de tratamento em que a administração intratecal de um vetor da descrição e um agente de contraste ao sistema nervoso central de um paciente com sua necessidade resulta em um aumento na sobrevivência do paciente em relação à sobrevivência do paciente quando um vetor da descrição é administrado na ausência do agente de contraste. Em várias modalidades, a administração de um vetor da descrição e um agente de contraste ao sistema nervoso central de um paciente com sua necessidade resulta em um aumento da sobrevivência do paciente de pelo menos cerca de 1%, pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 100%, pelo menos cerca de 150%, pelo menos cerca de 200% ou mais em relação à sobrevivência do paciente quando um vetor da descrição é administrado na ausência do agente de contraste.

[00100] A descrição também fornece modalidades do método de tratamento em que a administração intratecal de um vetor da descrição e um agente de contraste ao sistema nervoso central de um paciente com sua necessidade que é colocado na posição de Trendelenberg resulta em um aumento adicional na sobrevivência do paciente em relação à sobrevivência do paciente quando um vetor da divulgação é administrado na ausência do agente de contraste e da posição de Trendelenberg. Em várias modalidades, a administração de um vetor da descrição e um agente de contraste ao sistema nervoso central de um paciente com sua necessidade que colocado na posição de Trendelberg resulta em um aumento da sobrevivência do paciente de pelo menos cerca de 1%, pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 100%, pelo menos cerca de 150%, pelo menos cerca de 200% ou mais em relação à sobrevivência do paciente quando um vetor da descrição é administrado na ausência do agente de contraste e da posição de Trendelenberg.

Exemplos

[00101] A descrição é ilustrada pelos que se segue. • Prova de estudos de conceito em modelos de camundongo fêmeas e machos com Rett mostra eficácia terapêutica após a injeção intravenosa de scAAV9.738.Mecp2. (Exemplo 1) • Um vetor de terapia de gene de segunda geração, AVXS-201, mostra a extensão de sobrevivência sobre uma ampla faixa de doses após o tratamento intracerebroventricular (ICV) de camundongos Mecp2-/y. O aumento máximo na sobrevivência mediana foi de 477% após o tratamento com AVXS-201. (Exemplo 2) • Camundongos Mecp2-/y machos tratados com AVXS-201 apresentam uma melhora durável no comportamento como medido por uma avaliação compósita desenvolvida para camundongos com Rett. (Exemplo 3) • O benefício fenotípico em camundongos Mecp2-/y tratados com AVXS-201 é obtido com níveis moderados de expressão de proteína. (Exemplo 4) • Tratamento de camundongos do tipo silvestre com AVXS-201 foi bem tolerado em todas as doses testadas com mudanças consistentes na pontuação comportamental apenas observada no grupo de alta dose. (Exemplo 5 e Exemplo 6) • Dosagem intratecal em primatas não humanos indica que o AVXS- 201 é seguro e bem tolerado nos 18 meses após a injeção. (Exemplo 7) • AVXS-201 expressa transgene em níveis fisiológicos amplamente no cérebro e medula espinal de primatas não humanos após uma única injeção intratecal. (Exemplo 8)

Exemplo 1 Terapia de genes para a Prova de Estudos de Conceito da Síndrome de Rett em camundongos com Rett Fêmeas

[00102] Como prova de conceito, camundongos com Rett sintomáticos machos e fêmeas foram tratados por via intravenosa com scAAV9.738.Mecp2 [Garg et al., The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience, 33: 13612-13620 (2013)]. O genoma viral recombinante de scAAV9.738.Mecp2 (SEQ ID NO: 5) inclui um fragmento de promotor de 738 bp do gene Mecp2 de camundongo [Adachi et al., Human Molecular Genetics, 14: 3709-3722 (2005)] que aciona a expressão de cDNA de Mecp2a de camundongo (Banco de Dados # CCDS41016.1) e um sinal de poliadenilação do hormônio de crescimento bovino. O cassete de gene (nucleotídeos 198 a 2890 da SEQ ID NO: 5) é flanqueado por uma repetição terminal invertida de AAV2 mutante (ITR) e uma ITR de AAV2 do tipo silvestre que permite o acondicionamento de genomas de AAV autocomplementares.

[00103] O AAV9 autocomplementar (sAAV9) foi produzido por procedimentos de transfecção transitórios utilizando um vetor à base de ITR de AAV2 de fita dupla, com um plasmídeo que codifica a sequência Rep2Cap9 como descrito anteriormente [Gao et al., J. Virol., 78: 6381-6388 (2004)] juntamente com um plasmídeo auxiliar adenoviral pHelper (Stratagene, Santa Clara, CA) nas células 293. O vírus foi produzido em três bateladas separadas para os experimentos e purificado por duas etapas de purificação de gradiente de densidade de cloreto de césio, submetido à diálise contra PBS e formulado com Pluronic-F68 0,001% para prevenir a agregação de vírus e armazenado a 4 °C. Todas as preparações de vetor foram tituladas por PCR quantitativa utilizando a tecnologia Taq-Man. A pureza dos vetores foi avaliada por eletroforese em gel de dodecil sulfato de sódio-acrilamida 4 a 12% e coloração de prata (Invitrogen, Carlsbad, CA).

[00104] Camundongos machos com um alelo nulo de Mecp2 foram tratados por via intravenosa com 3 x 1012 vg de scAAV9.738.Mecp2 ou um vetor de controle de scAAV9 entre 4 a 6 semanas de idade. Os animais foram seguidos com relação à sobrevivência e avaliados semanalmente com relação à uma pontuação fenotípica [Guy et al., Science, 315: 1143-1147 (2007)]. Componentes da pontuação fenotípica de Guy et al. 2007. A. Mobilidade: O camundongo é observado quando colocado em bancada, depois quando manipulado de forma suave. 0 = como tipo silvestre. 1 = movimento reduzido quando comparado com o tipo silvestre: período de congelamento prolongado quando primeiro colocado na bancada e períodos mais longos gastos sem movimento. 2 = nenhum movimento espontâneo quando colocado sobre a bancada; o camundongo pode se mover em resposta a um empurrão suave ou um grânulo de ração colocado do lado. (Nota: os camundongos podem se tornar mais ativos quando em seu próprio ambiente de gaiola.) B. Andadura: 0 = como tipo silvestre. 1 = as patas traseiras são estendidas mais largamente do que o tipo silvestre quando se caminha ou corre com elevação pélvica reduzida, resultando em uma andadura "bamboleante". 2 = anormalidades mais severas: tremor quando os pés são elevados, caminha para trás ou "pula como coelho", erguendo-se em ambos os pés traseiros de uma vez. C. Membros traseiros presos: camundongo observado quando colocado suspenso pela base de retenção da cauda. 0 = pernas estendidas para fora. 1 = os membros são puxados uma em direção a outra (sem tocar) ou uma perna é atraída para o corpo. 2 = ambas as pernas são puxadas com força, se tocando entre si ou tocando o corpo. D. Tremor: Camundongo observado enquanto em repouso sobre a palma plana da mão. 0 = nenhum tremor. 1 = tremor brando intermitente. 2* = tremor contínuo ou tremor violento intermitente. E. Respiração: movimento dos flancos observados enquanto o animal ainda está em repouso. 0 = respiração normal. 1 = períodos de respiração regular entremeados com períodos curtos de respiração mais rápida ou com pausas na respiração. 2* = respiração muito irregular - respiração profunda ou ofegante. F. Condição geral: Camundongo observado por indicadores de bem estar geral tais como condição da pelagem, olhos, postura corporal. 0 = pelagem brilhante limpa, olhos claros, postura normal. 1 = olhos sem brilho, pelagem fosca/não tratada, postura um pouco corcunda. 2* = olhos incrustados ou apertados, piloereção, postura corcunda.

[00105] A Figura 4 mostra que o grupo tratado com scAAV9.738.Mecp2 não atingiu a sobrevivência mediana durante o tempo do experimento, mas ultrapassou os animais tratados com controle por mais de 10 semanas no momento da publicação. Os animais tratados com scAAV9.738.Mecp2 também tiveram pontuação comportamental mais baixa em comparação com animais tratados com controle. O experimento foi repetido com camundongos fêmeas afetadas (Figura 5). Os animais foram tratados IV com scAAV9.738.Mecp2 ou controle como anteriormente com os machos. As fêmeas foram tratadas entre 10 a 12 meses de idade quando os camundongos com Rett são sintomáticos. Os animais foram acompanhados por aproximadamente 6 meses após a injeção e testados quanto a sua pontuação fenotípica. Com importância, os camundongos com Rett fêmeas não possuem letalidade precoce como os machos mais graves [Guy et al., Nature Genetics, 27: 322-326 (2001)]. Tratamento com scAAV9.738.Mecp2 interrompeu a progressão da doença e indicou uma reversão da gravidade da doença com pontuações que recuam para próximo de 1. Isto estava em contraste absoluto para controlar animais tratados que finalizaram o experimento com pontuações fenotípicas próximas de 6 indicando uma piora dos sintomas (Figura 5C). Dados de teste de écran invertido rotarod, teste de plataforma e capacidade de ninhada todos sustentam a melhora comportamental em animais tratados com scAAV9.738.Mecp2 em comparação com animais tratados com controle. A análise após a morte dos cérebros de fêmeas tratadas com scAAV9.738.Mecp2 mostrou que as medições de intensidade de fluorescência da expressão de MECP2 refletiram aquela dos cérebros do tipo silvestre indicando que a expressão do transgene da terapia de genes estava em níveis aproximadamente fisiológicos.

Exemplo 2 Estudos da Eficácia Pré-Clínica de AVXS-201

[00106] Para melhorar a eficiência de acondicionamento e incorporar um cDNA de MECP2 humano clinicamente relevante enquanto mantém os níveis fisiológicos de expressão de genes, a scAAV9.738.Mecp2 foi projetada novamente com um promotor mais curto, um cDNA de MECP2B humano, e um sinal sintético de poliadenilação. O genoma projetado novamente foi acondicionado em capsídeos de AAV9 como descrito abaixo e o scAAV resultante foi subsequentemente denominado "AVXS-201" (Figura 6). O AVXS-201 foi originalmente denominado "AAV9-P545-MeCP2". Sequência da região promotora (fragmento de promotor de MeCP2 de camundongo) (SEQ ID NO: 2) GTGAACAACGCCAGGCTCCTCAACAGGCAACTTTGCTACTTCTAC AGAAAATGATAATAAAGAAATGCTGGTGAAGTCAAATGCTTATCAC AATGGTGAACTACTCAGCAGGGAGGCTCTAATAGGCGCCAAGAG CCTAGACTTCCTTAAGCGCCAGAGTCCACAAGGGCCCAGTTAATC CTCAACATTCAAATGCTGCCCACAAAACCAGCCCCTCTGTGCCCT AGCCGCCTCTTTTTTCCAAGTGACAGTAGAACTCCACCAATCCGC AGCTGAATGGGGTCCGCCTCTTTTCCCTGCCTAAACAGACAGGAA CTCCTGCCAATTGAGGGCGTCACCGCTAAGGCTCCGCCCCAGCC TGGGCTCCACAACCAATGAAGGGTAATCTCGACAAAGAGCAAGG GGTGGGGCGCGGGCGCGCAGGTGCAGCAGCACACAGGCTGGTC GGGAGGGCGGGGCGCGACGTCTGCCGTGCGGGGTCCCGGCATC GGTTGCGCGCGCGCTCCCTCCTCTCGGAGAGAGGGCTGTGGTAA AACCCGTCCGGAAAAC Sequência da região de codificação (cds de MeCP2B humano) (SEQ ID NO: 3) ATGGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCGCCGAGCGGAGGAGGAGGA GGAGGCGAGGAGGAGAGACTGGAAGAAAAGTCAGAAGACCAGG ACCTCCAGGGCCTCAAGGACAAACCCCTCAAGTTTAAAAAGGTGA AGAAAGATAAGAAAGAAGAGAAAGAGGGCAAGCATGAGCCCGTG CAGCCATCAGCCCACCACTCTGCTGAGCCCGCAGAGGCAGGCAA AGCAGAGACATCAGAAGGGTCAGGCTCCGCCCCGGCTGTGCCGG AAGCTTCTGCCTCCCCCAAACAGCGGCGCTCCATCATCCGTGACC GGGGACCCATGTATGATGACCCCACCCTGCCTGAAGGCTGGACA CGGAAGCTTAAGCAAAGGAAATCTGGCCGCTCTGCTGGGAAGTAT GATGTGTATTTGATCAATCCCCAGGGAAAAGCCTTTCGCTCTAAAG TGGAGTTGATTGCGTACTTCGAAAAGGTAGGCGACACATCCCTGG ACCCTAATGATTTTGACTTCACGGTAACTGGGAGAGGGAGCCCCT CCCGGCGAGAGCAGAAACCACCTAAGAAGCCCAAATCTCCCAAA GCTCCAGGAACTGGCAGAGGCCGGGGACGCCCCAAAGGGAGCG GCACCACGAGACCCAAGGCGGCCACGTCAGAGGGTGTGCAGGT GAAAAGGGTCCTGGAGAAAAGTCCTGGGAAGCTCCTTGTCAAGAT GCCTTTTCAAACTTCGCCAGGGGGCAAGGCTGAGGGGGGTGGGG CCACCACATCCACCCAGGTCATGGTGATCAAACGCCCCGGCAGG AAGCGAAAAGCTGAGGCCGACCCTCAGGCCATTCCCAAGAAACG GGGCCGAAAGCCGGGGAGTGTGGTGGCAGCCGCTGCCGCCGAG GCCAAAAAGAAAGCCGTGAAGGAGTCTTCTATCCGATCTGTGCAG GAGACCGTACTCCCCATCAAGAAGCGCAAGACCCGGGAGACGGT CAGCATCGAGGTCAAGGAAGTGGTGAAGCCCCTGCTGGTGTCCA CCCTCGGTGAGAAGAGCGGGAAAGGACTGAAGACCTGTAAGAGC CCTGGGCGGAAAAGCAAGGAGAGCAGCCCCAAGGGGCGCAGCA GCAGCGCCTCCTCACCCCCCAAGAAGGAGCACCACCACCATCAC CACCACTCAGAGTCCCCAAAGGCCCCCGTGCCACTGCTCCCACC CCTGCCCCCACCTCCACCTGAGCCCGAGAGCTCCGAGGACCCCA CCAGCCCCCCTGAGCCCCAGGACTTGAGCAGCAGCGTCTGCAAA GAGGAGAAGATGCCCAGAGGAGGCTCACTGGAGAGCGACGGCT GCCCCAAGGAGCCAGCTAAGACTCAGCCCGCGGTTGCCACCGCC GCCACGGCCGCAGAAAAGTACAAACACCGAGGGGAGGGAGAGC GCAAAGACATTGTTTCATCCTCCATGCCAAGGCCAAACAGAGAGG AGCCTGTGGACAGCCGGACGCCCGTGACCGAGAGAGTTAGCTGA Sequência poliA (sintética) (SEQ ID NO: 4) AATAAAAGATCTTTATTTTCATTAGATCTGTGTGTTGGTTTTTTGTG TG

[00107] scAAV9 foi produzido por procedimentos de transfecção transitória utilizando um vetor à base de ITR de AAV2 de fita dupla, com um plasmídeo que codifica a sequência Re2Cap9 como anteriormente descrito [Gao et al., supra] junto com um plasmídeo auxiliar adenoviral pHelper (Stratagene, Santa Clara, CA) em células 293. O vírus foi produzido em três bateladas separadas para os experimentos e purificado por duas etapas de purificação de gradiente de densidade de cloreto de césio, submetido à diálise contra PBS e formulado com Pluronic-F68 0,001% para prevenir a agregação de vírus e armazenado a 4°C. todas as preparações de vetor foram tituladas pela PCR quantitativa utilizando a tecnologia Taq-Man. A pureza dos vetores foi avaliada por eletroforese em gel de dodecil sulfato de sódio-acrilamida 4 a 12% e coloração prata (Invitrogen, Carlsbad, CA).

[00108] Estudos de eficácia e dosagem foram executados na mesma cepa de camundongos com Rett como na Figura 4. As doses entre o Exemplo 1 e o Exemplo 2 não são comparadas devido à melhora nos métodos de titulação. Os experimentos no Exemplo 1 utilizaram titulação ótica de preparações virais enquanto que os estudos no Exemplo 2 e abaixo utilizam o título de PCR de gotícula digital mais preciso. Para imitar a via de liberação clínica proposta da administração intratecal, estas injeções foram executadas como intracerebroventricular (ICV) em filhotes de 1 dia pós-natal. A liberação intratecal foi escolhida para liberar AVXS-201 diretamente no sistema nervoso que é o local chave de ação para a síndrome de Rett. Os filhotes foram acompanhados com relação à suas vidas naturais e avaliados quanto à sobrevivência, pontuação fenotípica compósita, teste de comportamento em campo aberto e de rotarod. Dados de sobrevivência sobre uma faixa de dose de dois log são mostrados na Figura 7. Os resultados mostrados na Figura 7 demonstram que a combinação de vetores e técnicas utilizados nos métodos de tratamento da invenção alcança um resultado melhorado. Todas as doses testaram prolongaram a sobrevivência mediana sobre os camundongos Mecp2-/y tratados com controle com sobrevivência individual máxima observada atingindo 500 dias (em andamento) em comparação com 93 dias para camundongos com Rett tratados com o controle. A expectativa de vida mediana mais elevada (315d) foi obtida com uma dose moderada de 1,44 x 1010 vg por animal. Os dados mostram uma curva de resposta de dose na forma de sino (Figura 7B) que distingue os resultados aqui alcançados a partir dos efeitos da dosagem de MECP2 imprópria (número de cópias do gene) observados anteriormente [ver, por exemplo, Lombardi et al., The Journal of Clinical Investigation, 125: 2914-2923 (2015)]. Com importância, mesmo na dose mais elevada testada, o tratamento com AVXS-201 não reduziu a sobrevivência de camundongos Mecp2-/y com relação ao tratamento de controle.

[00109] Além da sobrevivência, os camundongos tratados e de controle foram pontuados semanalmente com relação aos fenótipos de Rett (fenótipos especificados no Exemplo anterior). Os machos não tratados progridem rapidamente a partir de uma pontuação de 0 para uma máxima média de 5,25 em 10 semanas de idade (Figura 8). Em contraste, as pontuações fenotípicas de todos os grupos tratados alcançaram apenas uma pontuação de cerca de 2 em 17 semanas de idade e com a exceção do grupo de 5,56 x 1010 vg que atingiu uma pontuação de 5 em 18 semanas. Os animais tratados e de controle também foram avaliados nos testes de campo aberto e rotarod (Figura 9). O movimento espontâneo reduzido é um sintoma de camundongos machos com Rett. A análise de campo aberto para avaliar o movimento espontâneo e a velocidade foi executada quando os grupos estavam com 2 a 3 meses de idade. Os animais afetados tiveram uma redução de aproximadamente 43% na distância total percorrida em comparação com os camundongos do tipo silvestre. Aumentos significativos na distância percorrida foram observados em todos, mas dois dos grupos tratados com AVXS-201 sobre os machos neutralizados por Mecp2 tratados com controle. A velocidade comparada com os neutralizados tratados com controle também foi significativamente melhorada. Isto mostra que o tratamento com AVXS-201 de um modelo de camundongo com Rett macho melhora o comportamento exploratório e a perambulação. Os animais tratados e de controle foram testados em 3 meses de idade com relação ao desempenho sobre rotarod que é uma medida da coordenação motora. Os animais foram testados em três dias consecutivos e as pontuações foram calculadas a média através de dias e dose. Os dados resultantes são mostrados na Figura 9C. Os camundongos Mecp2-/y tratados com controle tiveram um desempenho significativamente pior sobre rotarod em comparação com a ninhada do tipo silvestre tratada com controle. O desempenho de Rotarod foi significativamente melhorado em relação ao tratamento de controle nos grupos de 7,00 x 109 e 1,44 x 1010 vg.

Exemplo 3 Expressão do AVXS-201 da Proteína MECP2 no Cérebro de Camundongo com Rett Tratado

[00110] Em 3 semanas após a injeção, os animais do tipo silvestre machos tratados com PBS, com Rett não tratados e tratados com vetor foram submetidos à eutanásia para examinar os níveis de proteína MECP2 no cérebro após a injeção ICV 1 dia pós-natal de AVXS-201. Um hemisfério do cérebro foi homogeneizado e analisado por western blot para monitorar a expressão de MECP2. Uma mancha representativa e quantificação são mostradas na Figura 10. Após a normalização para os cérebros do tipo silvestre tratados com PBS, a neutralização e o grupo de dose de AVXS-201 1,75 x 109 vg não tiveram nenhum nível detectável de MECP2. Tratamento com 3,50 x 109 vg e 7,00 x 109 vg produziu níveis de MECP2 detectáveis que alcançaram ~1% e 3,6% de níveis do tipo silvestre, respectivamente. A dose mais eficaz quando medida por aumento na sobrevivência mediana (1,44 x 1010 vg) produziu ~11% de níveis de MeCP2 do tipo silvestre. A dose de 5,56 x 1010 vg examinada por western blot produziu níveis de MECP2 de ~54% do tipo silvestre enquanto que 1,13 x 1011 alcançou mais do que 2x os níveis do tipo silvestre. Estes dados mostram que o nível de expressão de proteína e a distribuição por todo o cérebro são a chave para prever a eficácia de uma terapia de gene com MECP2.

Exemplo 4 Tratamento de Camundongos do Tipo Silvestre com AVXS-201 é Seguro e Bem Tolerado

[00111] Uma preocupação importante para a terapia de substituição de MECP2 é avaliar o impacto sobre as células que expressam uma cópia intacta de MECP2. O AVXS-201 foi projetado com esta consideração em mente através da incorporação de um fragmento do promotor de Mecp2 de murino para sustentar a regulação fisiológica do transgene de MECP2. Para testar a segurança do AVXS-201, a análise de sobrevivência e comportamento foi executada nos grupos de camundongos do tipo silvestre que receberam injeções P1 ICV de AVXS-201 exatamente como nos camundongos machos com Rett.

[00112] Um total de 131 camundongos machos do tipo silvestre foram tratados com várias doses ICV de AVXS-201 e acompanhados com relação à sobrevivência (Figura 11). Nenhuma morte foi registrada na dose terapêutica direcionada (1,44 x 1010 vg) com 21 animais tratados vivos através de P342. Não foram registradas mortes no grupo tratado com PBS e uma morte de cada foi registrada em 3,50 x 109, 2,78 x 1010 e 1,13 x 1011 vg de grupos tratados. A pontuação comportamental que utiliza os critérios da Caixa 1, mostra que os grupos tratados com vetor amplamente tiveram pontuações fenotípicas médias < 1. As pontuações médias agregadas >1 foram apenas observadas nos dois grupos dosados mais elevados (5,56 x 1010 (1,13 c 1011 vg). O teste de campo aberto em 2 a 3 meses de idade não mostrou nenhuma diferença estatística entre os machos do tipo silvestre tratados com vetor e PBS (Figura 12). De forma interessante, uma diminuição significativa no desempenho de rotarod foi detectada no grupo de 1,13 x 1011 vg em comparação com camundongos do tipo silvestre tratados com controle em três meses de idade. Estes dados são sugestivos de um efeito tóxico da superexpressão de MECP2 na dose de AVXS-201 mais elevada. Juntos estes dados indicam que em um "cenário pior" de tratamento com AVXS-201 que apenas transfere as células do tipo silvestre, existe impacto mínimo sobre sobrevivência e comportamento animal na dose terapêutica direcionada.

Exemplo 5 Níveis Fisiológicos de MECP2 são Mantidos em Cérebros de Camundongos do tipo Silvestre Tratados Com Doses Terapêuticas De AVXS-201

[00113] Para investigar ainda mais os níveis associados com a superexpressão sintomático de MECP2, camundongos machos do tipo silvestre receberam injeções P1 ICV de PBS ou AVXS-201 no alvo terapêutico de 1,44 x 1010 vg ou a dose mais elevada testada de 1,13 x 1011 vg. Os animais foram submetidos à eutanásia 3 semanas após a injeção, e os cérebros foram colhidos para western blot. Para comparação, os tecidos foram manchados ao longo dos cérebros de um modelo de camundongo de superexpressão de MECP2 denominado Tg3. Os cérebros foram dissecados em regiões separadas (Cb = cerebelo, Med = medula, Hipp = hipocampo, Ctx = córtex e Mid = mesencéfalo; Figura 13) e as regiões individuais foram homogeneizadas para coloração. Os dados foram normalizados para níveis de MECP2 nos cérebros do tipo silvestre tratados com PBS. Tratamento com a dose terapêutica alvo (1,44 x 1010 vg) teve níveis de MECP2 entre tecidos do tipo silvestre de 1 e 1,5 x através de todas as regiões examinadas. A dose elevada (1,13 x 1011 vg) variou de 1,31 a 2,56 x os níveis do tipo silvestre, mas não atingiu os níveis de 2,31 a 3,93 x de tecidos Tg3. Estes dados, junto com os dados de comportamento e sobrevivência mostrados anteriormente, fornecem confiança de que o AVXS-201 expressa a proteína em níveis fisiológicos próximos quando administrados na dose direcionada. Com importância, a dose de dosagem terapêutica não se aproxima dos níveis de proteína 2x associados com a síndrome da duplicação de MECP2. Isto mostra a segurança de uma abordagem de substituição de MECP2 utilizando a terapia de genes.

Exemplo 6 Peso corporal, Hematologia e Química de Soro Não São Notáveis em primatas não humanos através De 18 meses Após A Injeção Intratecal de AVXS-201

[00114] Para investigar a segurança e a tolerabilidade de AVXS-201 e o procedimento de injeção intratecal associado, três macacos cinomolgos machos tratados foram acompanhados durante 18 meses após a injeção. Os parâmetros de dosagem são mostrados na Tabela 2.

[00115] Dois animais foram tratados na dose terapêutica planejada (1,44 x 109 vg equivalente em uma base de peso corporal por kg), e um recebeu uma dose mais baixa ~2 vezes (~7,00 x 108 vg equivalente em uma base de peso corporal por kg). O procedimento de injeção intratecal foi descrito anteriormente em Meyer et al., Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy, 23: 477-487 (2015). Resumidamente, o vetor foi misturado com o agente de contraste para verificar a dispersão do vetor. O indivíduo anestesiado foi colocado na posição de decúbito lateral e o local de injeção de linha mediana posterior no nível ~L4/5 (abaixo do cone da medula espinhal) foi preparado. Sob condições estéreis, uma agulha espinhal com estilete foi inserida e a canulação subaracnóide foi confirmada com o fluxo de CSF limpo da agulha. 0,8 ml de CSF foram drenados a fim de diminuir a pressão no espaço subaracnóide e imediatamente após a solução do vetor ter sido injetada. Após a injeção, os animais foram mantidos na posição de Trendelenburg e seus corpos foram inclinados de cabeça para baixo durante 10 minutos. Os animais tratados foram dosados em 6 ou 12 meses de idade, peso corporal, hemogramas e químicas de soro foram coletados mensalmente durante os primeiros 6 meses após a injeção, e a cada dois meses daí em diante. O peso corporal é mostrado na Figura 14, os hemogramas são mostrados na Figura 15 e as químicas de soro são mostradas nas Figuras 16 e 21 17 em gráfico com valores dos animais tratados com controle da mesma colônia na Mannheimer Foundation (Homestead, FL). Geralmente, o peso corporal, as contagens de células e os valores de soro de animais tratados com vetor eram consistentes com os animais tratados com controle. Nenhum valor substancialmente desviou dos controles em mais do que 2 observações consecutivas em um dado animal, com a exceção de amilase, que foi mais elevada em dois animais tratados com vetor no valor de referência. Estes dados mostram que o AVXS-201 e o procedimento de injeção intratecal são seguros e bem tolerados.

Exemplo 7 Análise Histopatológica de Tecidos de Primatas Não Humanos após a Injeção intratecal de AVXS-201

[00116] Além das análises in vivo (Exemplo 6) e após a morte (Exemplo 8), amostras de tecidos viscerais e do sistema nervoso de animais 15C38, 15C49 e 15C34 (Tabela 1) foram enviados para GEMpath Inc. (Longmont, CO) para incorporação de parafina, dividindo em pedaços e coloração com hematoxilina e eosina. Os animais remanescentes (Tabela 8.2) estão ainda com vida e serão enviadas para análise na conclusão do estudo. As lâminas foram lidas e os relatórios foram preparados por um GEMpath Board Certified Veterinary Pathologist. Os tecidos experimentados e examinados são mostrados na Tabela 3. Os relatórios de patologia observam que o tratamento com AVXS-201 não induz lesões em quaisquer tecidos especificados por protocolo no ponto de tempo de 6 semanas ou 18 meses.

Exemplo 8 Níveis Fisiológicos de MeCP2 no Cérebro de Primatas Não Humanos Após a Injeção Intratecal de AVXS-201

[00117] Macacos cinomolgos machos de 12 meses de idade receberam injeções intratecais de 7,7 x 1012 vg/kg de AVXS-201 conforme descrito acima. Os animais persistiram durante seis semanas após a injeção e foram submetidos à eutanásia para análise da expressão de MeCP2. As regiões do cérebro selecionadas foram analisadas com relação à expressão total de MeCP2 por imunoistoquímica (Figura 18). Nenhuma elevação óbvia de MeCP2 foi detectada nas regiões corticais e subcorticais nem próxima ao local da injeção (medula espinhal lombar). Com importância, estes dados também falham em mostrar quaisquer anormalidades gritantes nos tecidos de animais que receberam injeção de AVXS-201. Para examinar ainda mais a expressão do transgene, as regiões cerebrais foram homogeneizadas e comparadas contra o tecido de controle histórico a partir de animais da mesma colônia (Figura 19). As amostras de córtices occipitais e temporais, hipotálamo, medula espinal lombar, tálamo, amígdala, hipocampo e cerebelo foram analisadas por western blot com relação à expressão total de MeCP2. Através de todas as regiões examinadas nenhuma região apresentou um nível > 2x de expressão de MeCP2 acima dos controles. A MeCP2 elevada foi detectada no hipotálamo e amígdala que são regiões proximais ao 3o ventrículo e ventrículo lateral, respectivamente, mas não no cerebelo. Além disso, a medula espinhal lombar que é próxima ao local de injeção não apresentou níveis elevados de MeCP2. Estes dados sugerem que a combinação de dose viral e construção de expressão é a regulação da expressão de MECP2. Também, a hibridização in situ (ISH) foi executada para detectar a transcrição derivada do vetor e determinar a distribuição no cérebro em 6 semanas e 18 meses após a injeção (Figuras 20 e 21). Todas as regiões examinadas no cérebro e medula espinhal (córtex occipital, córtex temporal, hipocampo, corpo caloso, tálamo, caudato, putâmen, colículo superior, ponte, medula, cerebelo, medula espinhal cervical, torácica e lombar) mostraram expressão de transcrição derivada de vetor que não estava presente nos tecidos de animais tratados com controle. Estes dados mostram uma especificidade da sonda de ISH para a transcrição de MECP2 derivada do vetor e mostram que a construção de promotor de AVXS-201 é funcional no tecido do sistema nervoso NHP. Estes dados mostram que o AVXS-201 se distribui amplamente por todo o CNS quando administrado por meio de perfuração lombar e se expressa em níveis fisiológicos. Divulgação do Pedido de Patente Provisório No. 62/423.618 Terapia de Gene para a Síndrome de Rhett

[00118] A terapia de gene para restaurar o fator de transcrição MeCP2 parece ser uma estratégia viável para o tratamento da síndrome de Rett, um distúrbio neurodesenvolvente progressivo que leva a um comportamento autístico aparente, perda de função motora, e morte precoce. Desenvolvemos um sorotipo de vírus adeno- associado 9 (AAV9) que expressa a MECP2 humana sob o controle de um promotor endógeno truncado. O propósito deste trabalho é avaliar a eficácia e segurança deste vetor em camundongos (MeCP2 nulo e tipo silvestre) e primatas não humanos. Através de pesquisa contínua, nosso objetivo é trazer este tratamento da bancada para a cabeceira do doente. AAV9-P545-MeCP2 Sequência da região promotora (fragmento de promotor de MeCP2 de camundongo) GTGAACAACGCCAGGCTCCTCAACAGGCAACTTTGCTACTTCTAC AGAAAATGATAATAAAGAAATGCTGGTGAAGTCAAATGCTTATCAC AATGGTGAACTACTCAGCAGGGAGGCTCTAATAGGCGCCAAGAG CCTAGACTTCCTTAAGCGCCAGAGTCCACAAGGGCCCAGTTAATC CTCAACATTCAAATGCTGCCCACAAAACCAGCCCCTCTGTGCCCT AGCCGCCTCTTTTTTCCAAGTGACAGTAGAACTCCACCAATCCGC AGCTGAATGGGGTCCGCCTCTTTTCCCTGCCTAAACAGACAGGAA CTCCTGCCAATTGAGGGCGTCACCGCTAAGGCTCCGCCCCAGCC TGGGCTCCACAACCAATGAAGGGTAATCTCGACAAAGAGCAAGG GGTGGGGCGCGGGCGCGCAGGTGCAGCAGCACACAGGCTGGTC GGGAGGGCGGGGCGCGACGTCTGCCGTGCGGGGTCCCGGCATC GGTTGCGCGCGCGCTCCCTCCTCTCGGAGAGAGGGCTGTGGTAA AACCCGTCCGGAAAAC Sequência da região de codificação (cds de MeCP2B humano) ATGGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCGCCGAGCGGAGGAGGAGGA GGAGGCGAGGAGGAGAGACTGGAAGAAAAGTCAGAAGACCAGG ACCTCCAGGGCCTCAAGGACAAACCCCTCAAGTTTAAAAAGGTGA AGAAAGATAAGAAAGAAGAGAAAGAGGGCAAGCATGAGCCCGTG CAGCCATCAGCCCACCACTCTGCTGAGCCCGCAGAGGCAGGCAA AGCAGAGACATCAGAAGGGTCAGGCTCCGCCCCGGCTGTGCCGG AAGCTTCTGCCTCCCCCAAACAGCGGCGCTCCATCATCCGTGACC GGGGACCCATGTATGATGACCCCACCCTGCCTGAAGGCTGGACA CGGAAGCTTAAGCAAAGGAAATCTGGCCGCTCTGCTGGGAAGTAT GATGTGTATTTGATCAATCCCCAGGGAAAAGCCTTTCGCTCTAAAG TGGAGTTGATTGCGTACTTCGAAAAGGTAGGCGACACATCCCTGG ACCCTAATGATTTTGACTTCACGGTAACTGGGAGAGGGAGCCCCT CCCGGCGAGAGCAGAAACCACCTAAGAAGCCCAAATCTCCCAAA GCTCCAGGAACTGGCAGAGGCCGGGGACGCCCCAAAGGGAGCG GCACCACGAGACCCAAGGCGGCCACGTCAGAGGGTGTGCAGGT GAAAAGGGTCCTGGAGAAAAGTCCTGGGAAGCTCCTTGTCAAGAT GCCTTTTCAAACTTCGCCAGGGGGCAAGGCTGAGGGGGGTGGGG CCACCACATCCACCCAGGTCATGGTGATCAAACGCCCCGGCAGG AAGCGAAAAGCTGAGGCCGACCCTCAGGCCATTCCCAAGAAACG GGGCCGAAAGCCGGGGAGTGTGGTGGCAGCCGCTGCCGCCGAG GCCAAAAAGAAAGCCGTGAAGGAGTCTTCTATCCGATCTGTGCAG GAGACCGTACTCCCCATCAAGAAGCGCAAGACCCGGGAGACGGT CAGCATCGAGGTCAAGGAAGTGGTGAAGCCCCTGCTGGTGTCCA CCCTCGGTGAGAAGAGCGGGAAAGGACTGAAGACCTGTAAGAGC CCTGGGCGGAAAAGCAAGGAGAGCAGCCCCAAGGGGCGCAGCA GCAGCGCCTCCTCACCCCCCAAGAAGGAGCACCACCACCATCAC CACCACTCAGAGTCCCCAAAGGCCCCCGTGCCACTGCTCCCACC CCTGCCCCCACCTCCACCTGAGCCCGAGAGCTCCGAGGACCCCA CCAGCCCCCCTGAGCCCCAGGACTTGAGCAGCAGCGTCTGCAAA GAGGAGAAGATGCCCAGAGGAGGCTCACTGGAGAGCGACGGCT GCCCCAAGGAGCCAGCTAAGACTCAGCCCGCGGTTGCCACCGCC GCCACGGCCGCAGAAAAGTACAAACACCGAGGGGAGGGAGAGC GCAAAGACATTGTTTCATCCTCCATGCCAAGGCCAAACAGAGAGG AGCCTGTGGACAGCCGGACGCCCGTGACCGAGAGAGTTAGCTGA Sequência poliA (sintética) AATAAAAGATCTTTATTTTCATTAGATCTGTGTGTTGGTTTTTTGTG TG

[00119] Embora a presente invenção tenha sido descrita em termos de várias modalidades e exemplos, entende-se que variações e melhorias ocorrerão para aqueles versados na técnica. Portanto, apenas as limitações como aparecem nas reivindicações devem ser colocadas na invenção.

[00120] Todos os documentos referidos nesta invenção são incorporados por referência na sua totalidade.

Claims (14)

1. Vetor viral adeno-associado recombinante (rAAV), caracterizado pelo fato de que compreende um cassete de gene que compreende um promotor que consiste em SEQ ID NO: 2, um íntron de SV40, uma sequência de polinucleotídeo que codifica uma proteína de ligação metil-CpG 2 (MECP2) que compreende a SEQ ID NO: 3 e um sinal de poliadenilação sintético, em que o cassete de gene é flanqueado por uma repetição terminal invertida de AAV2 mutante e uma repetição terminal invertida de AAV2 do tipo silvestre.

2. Vetor rAAV, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o vetor de AAV é autocomplementar (scAAV).

3. Vetor rAAV, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o rAAV é rAAV9.

4. Vetor viral, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a sequência de sinal de poliadenilação compreende a SEQ ID NO: 4.

5. Vetor rAAV, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o rAAV compreende nucleotídeo 151-2558 da SEQ ID NO: 1.

6. Vírus, caracterizado pelo fato de que compreende o vetor viral, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5.

7. Vírus, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma ou mais proteínas de capsídeo.

8. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o vetor rAAV, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, ou o vírus, como definido em qualquer uma das reivindicações 6 a 7 e um veículo farmaceuticamente aceitável.

9. Composição farmacêutica, de acordo com a reivin- dicação 8, caracterizada pelo fato de que a composição é formulada para administração intratecal (IT) e um veículo farmaceuticamente aceitável.

10. Uso de um vetor rAAV como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, vírus como definido em qualquer uma das reivindicações 6 a 7, ou composição farmacêutica como definida em qualquer uma das reivindicações 8 a 9, caracterizado pelo fato de que é na preparação de um medicamento para o tratamento da síndrome de Rett.

11. Uso, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o medicamento é formulado para administração intratecal (IT).

12. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 ou 11, caracterizado pelo fato de que o medicamento compreende ainda um agente de contraste não iônico de baixa osmolaridade para o paciente.

13. Uso, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o agente de contraste não iônico de baixa osmolaridade compreende um ou mais de iobitridol, iohexol, iomeprol, iopamidol, iopentol, iopromide, ioversol e ioxilan.

14. Uso, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o agente de contraste não iônico de baixa osmolaridade compreende iohexol.

Images