JP2020503265A - メチル−ｃｐｇ結合タンパク質２をコードする組換えアデノ随伴ウイルスの髄腔内送達 - Google Patents

Abstract

メチル−ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）をコードする組換えアデノ随伴ウイルス９（ｒＡＡＶ９）の髄腔内送達のための方法および材料が提供される。この方法および材料の使用は、例えば、レット症候群の処置のために企図されている。

Description

本出願は、２０１６年１１月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／４２３，６１８号明細書の優先権の利益を主張する。

電子的に提出された資料の参照による組込み
全体が参照により組み込まれるのは、本明細書と同時に提出されたコンピュータ可読形式の配列表であり、下記のように特定される：２０１７年１１月１７日に作成された「５０２１５ＰＣＴ＿ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」という名称のＡＳＣＩＩテキストファイル（２４，１４８バイト）。

本発明は、メチル−ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）をコードする組換えアデノ随伴ウイルス９（ｒＡＡＶ９）の髄腔内送達のための方法および材料に関する。この方法および材料の使用は、例えば、レット症候群の処置のために企図されている。

レット症候群は、１０，０００人の少女のうちの約１人に影響を及ぼす神経発達学的なＸ連鎖優性障害である。ヘミ接合男性は、通常、新生児脳症で死亡する。ヘテロ接合女性は、成人期まで生存するが、重度の症状（例えば、小頭症、意図した手の動きおよび言語能力の喪失）ならびに見かけ上は正常な発達の期間後に現れる運動異常を示す。発症年齢は、約６〜１８ヶ月である。

レット症候群は、典型的な（もしくは古典的な）レットまたは非定型的なレットに分類される。転写因子メチル−ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）をコードする自然変異遺伝子は、両方の分類において症例の大部分（約９０％）を引き起こすが、非定型的なレットは、ＭＥＣＰ２以外の遺伝子の変異により引き起こされる可能性がある。ＭＥＣＰ２変異（例えば、欠失対点変異）および歪んだＸ染色体不活性化の性質は、疾患の重症度に影響を及ぼす。ＭＥＣＰ２転写因子は、数千もの遺伝子の転写を調節する。治療努力は、神経伝達物質、成長因子および代謝経路等のＭＥＣＰ２の下流の標的に焦点を当てている。レット症候群に対して行われた少なくとも９件の臨床試験は、様々な尺度にわたって肯定的な結果を報告しているが、これらの発見は、独立して検証されていないか、または新規の処置をもたらしていない［Ｋａｔｚ ｅｔ ａｌ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，３９：１００−１１３（２０１６）］。現在、レット症候群に対する承認された治療法は存在しない。

ＲＴＴ様の挙動を示す雄および雌のマウスモデルが存在する［Ｇｕｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２７：３２２−３２６（２００１）；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２７：３２７−３３１（２００１）；およびＫａｔｚ ｅｔ ａｌ．，５：７３３−７４５（２０１２）］。

ＭＥＣＰ２は、５２ｋＤの核タンパク質であって、様々な組織中で発現されるが、ニューロン中で豊富であり、神経系で最も研究されている核タンパク質である。ヒトでは、ＭＥＣＰ２ＡおよびＭＥＣＰ２Ｂとして既知であるＭＥＣＰ２の２種のアイソフォームが存在する（図１）［Ｗｅａｖｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，４２：１−７（２００５）］。これらの２種のアイソフォームは、選択的にスプライスされたｍＲＮＡ転写産物に由来し、様々な翻訳開始部位を有する。ＭＥＣＰ２Ｂは、エクソン１、３および４を含み、脳中での主なアイソフォームである。ＭＥＣＰ２は、メチル化ＤＮＡに可逆的に結合し、遺伝子発現を調節する［Ｇｕｙ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２７：６３１−６５２（２０１１）］。これらの機能は、それぞれメチル結合ドメイン（ＭＢＤ）および転写抑制ドメイン（ＴＲＤ）に位置する［Ｎａｎ＆Ｂｉｒｄ，Ｂｒａｉｎ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２３，Ｓｕｐｐｌ １：Ｓ３２−３７（２００１）］。最初に転写抑制因子と考えられていたが、ＭＥＣＰ２は、標的遺伝子発現の誘導および抑制の両方が可能である［Ｃｈａｈｒｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２０：１２２４−１２２９（２００８）］。ＭＥＣＰ２は、適切なニューロンの発達および維持を支持すると仮定されている。ニューロン中では、ＭＥＣＰ２は、ＤＮＡ結合と様々な結合パートナーとの相互作用とを通してシナプス活性の遺伝子発現への翻訳を促進する［Ｅｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４９９：３４１−３４５（２０１３）およびＬｙｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，１６：８９８−９０２（２０１３）］。アストロサイト中では、ＭＥＣＰ２欠乏は、マウスでの無呼吸事象と関係している［Ｌｉｏｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４７５：４９７−５００（２０１１）］。ＭＥＣＰ２欠乏により、脳サイズの縮小、ニューロンのパッキング密度の増加、樹状突起の複雑さの減少が引き起こされ得る［Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，５４：１９５−２０１（１９９５）］。重要なことに、ニューロンの死滅は、ＭＥＣＰ２欠乏とは関係がない［Ｌｅｏｎａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，１３：３７−５１（２０１７）］。ＭＥＣＰ２は、組織によってもレベルが異なるが神経系の外側でも見られる（図２）。最近の研究では、マウスでのレット症候群の末梢のＭｅｃｐ２発現への依存が調べられた［Ｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２５：４３８９−４４０４（２０１６）］。末梢欠乏は、活動性低下、運動疲労および骨異常と関係していた。ＲＴＴに関連する行動、感覚運動、歩行および自律神経（呼吸器および心臓）の表現型の大部分は、末梢ＭＥＣＰ２がノックアウトされたマウスでは見られなかった。

ＭＥＣＰ２は、Ｘ連鎖遺伝子であることから、１コピーのＭＥＣＰ２は、女性ではＸ染色体不活性化（Ｘｃｉ）に起因して発現が停止されている。細胞ベースでは、Ｘｃｉは、レット女性中でＭＥＣＰ２キメラ現象を引き起こすランダムであると考えられる。疾患の重症度は、活性なＸ染色体の大部分がインタクトなまたは変異したＭＥＣＰ２遺伝子を含むかどうかによって左右される。これは、歪んだＸｃｉと称される。男性は、Ｘｃｉを受けず、従って、細胞は、機能的コピーのＭＥＣＰ２を有しないことから、ＭＥＣＰ２欠乏は、より深刻である。ＭＥＣＰ２変異の性質も疾患の重症度に影響を及ぼす。ＭＥＣＰ２遺伝子の６００を超える様々な変異（例えば、欠失、非センス変異および点変異）が、ＲｅｔｔＢＡＳＥデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｍｅｃｐ２．ｃｈｗ．ｅｄｕ．ａｕ／）で説明されている。最も一般的な変異（患者の約９％）は、メチル結合ドメインに影響を及ぼすＴ１８５Ｍ対立遺伝子である。他の一般的な変異を図３に示す［Ｌｅｏｎａｒｄ、上記を参照されたい］。まとめると、これらは、ＲｅｔｔＢＡＳＥに列挙されている症例の４０％超を占めている。ＭＥＣＰ２を含む大規模な欠失が症例の８〜１０％で見られた［Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，５２：３８−４７（２００７）およびＨａｒｄｗｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１５：１２１８−１２２９（２００７）］。Ｒ１３３Ｃ、Ｒ２９４ＸおよびＣ末端変異ならびにより軽度の疾患を引き起こす欠失（ＴＲＤの下流）との遺伝子型−表現型相関が存在する。大きい欠失および早期トランケーティング変異（Ｒ２７０Ｘ、Ｒ２５５ＸおよびＲ１６８Ｘ）は、重度のレット症候群と関係している。表１は、国際レット臨床医のグループにより最近まとめられた、合意されたレット診断基準を説明する［Ｎｅｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，６８：９４４−９５０（２０１０）］。

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、複製欠損パルボウイルスであり、この一本鎖ＤＮＡゲノムは、１４５個のヌクレオチドの逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含む約４．７ｋｂの長さである。ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）ゲノムのヌクレオチド配列が、Ｒｕｆｆｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ，７５：３３８５−３３９２（１９９４）で訂正されたＳｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，４５：５５５−５６４（１９８３）に示されている。このＩＴＲには、ウイルスＤＮＡ複製（ｒｅｐ）、キャプシド形成／パッケージングおよび宿主細胞染色体組込みを指示するｃｉｓ作用配列が含まれている。３種のＡＡＶプロモーター（これらの相対的なマップ位置のためにｐ５、ｐ１９およびｐ４０と命名されている）は、ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子をコードする２つのＡＡＶ内部オープンリーディングフレームの発現を駆動する。２種のｒｅｐプロモーター（ｐ５およびｐ１９）は、単一のＡＡＶイントロン（ヌクレオチド２１０７および２２２７）の差次的なスプライシングと相まって、ｒｅｐ遺伝子から４種のｒｅｐタンパク質（ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２およびｒｅｐ４０）を産生させる。ｒｅｐタンパク質は、最終的にウイルスゲノムの複製に関与する複数の酵素的特性を有する。ｃａｐ遺伝子は、ｐ４０プロモーターから発現され、３種のカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３をコードする。選択的スプライシングおよび非コンセンサス翻訳開始部位は、３種の関連するカプシドタンパク質の産生に関与する。単一のコンセンサスポリアデニル化部位は、ＡＡＶゲノムのマップ位置９５に位置する。ＡＡＶのライフサイクルおよび遺伝的特徴がＭｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５８：９７−１２９（１９９２）で概説されている。

ＡＡＶは、例えば、遺伝子治療において外来性ＤＮＡを細胞に送達するためのベクターとしてＡＡＶを魅力的にする独特の特徴を有する。培養での細胞のＡＡＶ感染は、非細胞変性であり、ヒトおよび他の動物の自然感染は、無症状でありかつ無症候性である。さらに、ＡＡＶは、多くの哺乳動物細胞に感染し、インビボでの多くの異なる組織を標的とする可能性が可能になる。さらに、ＡＡＶは、緩やかに分裂している細胞および分裂していない細胞に形質導入し、転写的に活性な核エピソーム（染色体外要素）として細胞の寿命にわたり本質的に持続し得る。ＡＡＶプロウイルスゲノムは、プラスミド中ではクローン化ＤＮＡとして感染性であり、これにより組換えゲノムの構築が実行可能である。さらに、ＡＡＶ複製、ゲノムキャプシド形成および組込みを指示するシグナルがＡＡＶゲノムのＩＴＲに含まれることから、（複製および構造キャプシドタンパク質、ｒｅｐ−ｃａｐをコードする）ゲノムの内部の約４．３ｋｂの一部または全てを外来性ＤＮＡ（例えば、プロモーター、目的のＤＮＡおよびポリアデニル化シグナルを含む遺伝子カセット）に置き換え得る。ｒｅｐタンパク質およびｃａｐタンパク質は、トランスで生成され得る。ＡＡＶの別の重要な特徴は、非常に安定していて力強いウイルスであることである。ＡＡＶは、アデノウイスルを不活性化させるために使用される条件（数時間にわたり５６〜６５℃）に容易に耐えるため、ＡＡＶの低温保存は、あまり重要ではない。ＡＡＶは、凍結乾燥され得る。最後に、ＡＡＶ感染細胞は、重複感染に耐性を示さない。ＡＡＶの複数の血清型が存在し、多様な組織指向性がもたらされる。既知の血清型として、例えばＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３およびＡＡＶｒｈ７４が挙げられる。ＡＡＶ９は、米国特許第７，１９８，９５１号明細書およびＧａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：６３８１−６３８８（２００４）で説明されている。

当技術分野では、ＭＥＣＰ２ポリヌクレオチドを中枢神経系に送達し、この中枢神経系中でこのポリヌクレオチドを発現させるための方法および製品が依然として必要とされている。

本開示は、レット症候群の処置を、それを必要とする患者において行うのに有用な方法および材料を提供する。

患者のレット症候群を処置する方法であって、メチル−ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）をコードする組換えアデノ随伴ウイルス９（ｒＡＡＶ９）の、それを必要とする患者への髄腔内投与の工程を含み、ｒＡＡＶ９は、ＭＥＣＰ２Ｂをコードする自己相補的ゲノムを含み、自己相補的ゲノムの配列は、配列番号１に記載されている、方法が提供される。提供される例示的なｒＡＡＶ９は、ＡＶＸＳ−２０１と命名されたｓｃＡＡＶである。

この患者へのイオヘキソール、イオビトリドール、イオメプロール、イオパミドール、イオペントール、イオプロミド、イオベルソールもしくはイオキシランまたはそれらの２つ以上の混合物の髄腔内投与の工程をさらに含み、かつ／またはこの患者をトレンデレンブルグ体位に置くことをさらに含む方法が提供される。

ヒトＭＥＣＰ２遺伝子座の図である。この写真は、成熟ｍＲＮＡの選択的転写開始部位（矢印）、エクソン（四角形）およびスプラシングパターンを示す。ＭＥＣＰ２Ｂは、脳中で最も豊富なアイソフォームであり、ＡＶＸＳ−２０１によりコードされる。 グラフは、免疫組織化学により検出された場合の、様々なヒト組織中での相対的なＭＥＣＰ２タンパク質発現レベルを示す。Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｔｌａｓ（ｗｗｗ．ｐｒｏｔｅｉｎａｔｌａｓ．ｏｒｇ）から修正されている。 ＭＥＣＰ２タンパク質の重要な機能ドメインおよびレット患者で見られる一般的な変異である。ＭＢＤ＝メチル−ＣｐＧ−結合、ＴＲＤ＝転写抑制ドメイン、ＮＩＤ＝ＮＣＯＲ−ＳＭＲＴ相互作用ドメイン（ＮＩＤ）および核局在化シグナル（ＮＬＳ）。 雄レットマウスでのＡＡＶ９により媒介されるＭｅｃｐ２発現の回復によるコンセプトの証明である。図４Ａ）組換えＡＡＶゲノムの描写。図４Ｂ）実験設計。図４Ｃ）コントロールベクターで処置された動物と比較して、ｓｃＡＡＶ９．７３８．Ｍｅｃｐ２で処置されたレットマウスの生存の増加を示すＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存曲線。図４Ｄ）ベクターにより媒介されるＭｅｃｐ２回復により、Ｂｉｒｄスコアリングにより測定された場合に行動表現型が改善される（ボックス１）。 雌レットマウスのｓｃＡＡＶ９．７３８．Ｍｅｃｐ２処置により、生理学的レベルのＭｅｃｐ２が作られて異常な行動が改善される。図５Ａ）実験設計。図５Ｂ）野生型およびｓｃＡＡＶ９．７３８．Ｍｅｃｐ２で処置されたレットマウスからのＭｅｃｐ２に関する、免疫標識した脳切片からの蛍光強度測定。強度測定値の分布は、２つのグループ間で類似している。図５Ｃ）Ｂｉｒｄ表現型スコアリングは、ｓｃＡＡＶ９．７３８．Ｍｅｃｐ２を受けている動物での症状の軽減を示す。図５Ｄ〜図５Ｇ）ロータロッド、倒立格子、プラットフォームおよびネスティング行動評価は、それぞれ全てｓｃＡＡＶ９．７３８．Ｍｅｃｐ２処置対コントール処置動物で改善を示す。 本明細書で説明された第１世代（図６Ａ）および改訂版（図６Ｂ、ＡＶＸＳ−２０１）の組換えＡＡＶゲノムを示す描写である。色は、構築物間の類似点および相違点を反映している。ｓｃＡＡＶ９．７３８．Ｍｅｃｐ２とＡＶＸＳ−２０１との間では、プロモーターが短縮されており、重要な要素間の介在配列が短縮されており、マウスＭｅｃｐ２アルファｃＤＮＡがヒトＭＥＣＰ２Ｂ ｃＤＮＡに置き換えられており、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルがより短い合成要素に変更されていた。これらの変更の全体的な目的は、臨床的に関連するＭＥＣＰ２ ｃＤＮＡの生理学的発現レベルを維持しつつパッケージング効率を改善することであった。 Ｍｅｃｐ２^−／ｙマウスでのＡＶＸＳ−２０１の用量反応である。図７Ａ）Ｍｅｃｐ２^−／ｙマウスを処置するために使用される様々な用量のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒプロット。用量群の生存期間の中央値は、色分けされており、かつ破線で示されている。ＡＶＸＳ−２０１が投与された全てのコホートは、コントロ−ルで処置されたヌルマウスよりも生存期間が延びた。図７Ｂ）各群からの生存期間の中央値データをプロットして、用量反応曲線を示した。破線は、ＰＢＳで処置されたＭｅｃｐ２^−／ｙの生存期間の中央値を表す。これらのデータは、ＭＥＣＰ２欠損および過剰の既知の効果と一致する。 ＡＶＸＳ−２０１で処置されたＭｅｃｐ２^−／ｙマウスに関するＢｉｒｄ行動スコアリングである。図８Ａ）コントロールで処置された罹患マウスは、加齢と共に欠損を蓄積する。行動の欠損は、用量にかかわらずＡＶＸＳ−２０１処置により軽減される。図８Ｂ）（図８Ａ）と同一のデータを再グラフ化して、処置されたコントロールおよびＡＶＸＳ−２０１ １．４４×１０^１０ｖｇ群のみを示す。 ＡＶＸＳ−２０１で処置されたＭｅｃｐ２ヌルマウスは、自発的な歩行運動を回復する。オープンフィールド分析は、ＡＶＸＳ−２０１で処置されたヌルマウスが、コントールで処置されたヌルと比較して（図９Ａ）長い距離および高い（図９Ｂ）平均速度で横切ることを示す。図９Ｃ）３ヶ月齢でのロータロッド能力も中程度の用量のＡＶＸＳ−２０１により改善された。＋＝ｐ≦０．００１；^＊＝ｐ≦０．０５；
＝ｐ≦０．０００１。
ＡＶＸＳ−２０１は、治療用量で中程度の量のＭＥＣＰ２を作る。図１０Ａ）雄野生型（ＰＢＳ）マウスおよびＭｅｃｐ２^−／ｙマウスから作成した脳半球ホモジネートからの抗ＭｅＣＰ２ウエスタンブロット。Ｍｅｃｐ２ヌルには注射せず（ＫＯ）、または示した用量のＡＶＸＳ−２０１を投与した。図１０Ｂ）パネルＡの定量化。１．４４×１０^１０ｖｇの標的治療用量により、タンパク質の野生型レベルの１１％が産生された。 ＡＶＸＳ−２０１は、野生型マウスで十分に許容される。図１１Ａ）ＡＶＸＳ−２０１をＰ１ ＩＣＶ投与した雄野生型マウスのＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存プロット。図１１Ｂ）処置されたマウスおよび野生型マウスのＢｉｒｄ表現型スコアリングは、広範囲の用量が十分に許容されることを示す。最高用量（１．１３×１０^１１、青い線）は、軽度の行動障害を引き起こした。 野生型動物でのＡＶＸＳ−２０１処置は、歩行運動を損なわない。ＡＶＸＳ−２０１で処置された野生型雄マウスのオープンフィールド分析は、コントロールで処置された野生型マウスと同様の（図１２Ａ）移動距離および（図１２Ｂ）平均速度を示す。図１２Ｃ）高用量のＡＶＸＳ−２０１を投与した野生型動物では、ロータロッド能力が低下した。＋＝ｐ≦０．００１、^＊＝ｐ≦０．０５。 ＡＶＸＳ−２０１は、野生型脳中でＭＥＣＰ２タンパク質の用量依存的増加を生じる。図１３Ａ）抗ＭｅＣＰ２ウエスタンブロットは、Ｐ１ ＩＣＶ注射から３週間後での様々な脳領域における総ＭｅＣＰ２タンパク質の用量依存的上昇を示す。（Ｃｂ＝小脳、Ｍｅｄ＝髄質、Ｈｉｐｐ＝海馬、Ｃｔｘ＝皮質、Ｍｉｄ＝中脳）。ＴＧ３は、ＭｅＣＰ２重複症候群の重症マウスモデルから採取したサンプルを示す^１。図１３Ｂ）パネルＡの定量化。選択された脳領域中での、中程度ではなく高用量のＡＶＸＳ−２０１二重ＭＥＣＰ２発現。 非ヒト霊長類でのＡＶＸＳ−２０１の髄腔内注射により、体重増加は損なわれない。３匹のＡＶＸＳ−２０１で処置された動物を赤色で示し、コントロール対象の体重を青色で示す。 非ヒト霊長類でのＡＶＸＳ−２０１の髄腔内注入は、注射後１８ヶ月にわたり血液学的値に影響を及ぼさない。ＡＶＸＳ−２０１で処置された３匹の動物に関する値を赤色で示し、コントロール対象を青色で示す。 図１５−１と同様である。 非ヒト霊長類でのＡＶＸＳ−２０１の髄腔内注入は、注射後１２〜１８ヶ月にわたり血清化学に影響を及ぼさない。肝臓および電解質の値は、ＡＶＸＳ−２０１で処置された対象とコントロールで処置された対象との間で類似している。ＡＶＸＳ−２０１で処置された３匹の動物に関する値を赤色で示し、コントロール対象を青色で示す。 図１６−１と同様である。 非ヒト霊長類でのＡＶＸＳ−２０１の髄腔内注入は、注射後１２〜１８ヶ月にわたり血清化学に影響を及ぼさない。心臓および腎臓の値は、ＡＶＸＳ−２０１で処置された対象とコントロールで処置された対象との間で類似している。ＡＶＸＳ−２０１で処置された３匹の動物に関する値を赤色で示し、コントロール対象を青色で示す。 図１７−１と同様である。 ＡＶＸＳ−２０１で処置された非ヒト霊長類およびコントール非ヒト霊長類の脳全体にわたる類似のレベルのＭｅＣＰ２発現である。抗ＭｅＣＰ２免疫組織化学では、ＭｅＣＰ２発現における肉眼での構造的異常および明らかな差異が明らかにならなかった。ＯＣ＝後頭皮質、ＴＣ＝側頭皮質、ＬＳｃ＝腰髄，Ｔｈａｌ＝視床、Ｈｉｐｐ＝海馬、Ｃｂ＝小脳。 コントロールおよびＡＶＸＳ−２０１注射動物からの脳領域のウエスタンブロットは、類似のレベルのＭｅＣＰ２を示す。総ＭｅＣＰ２レベルを緑色で示し、ＧＡＰＤＨローディングコントロールを赤色で示す。パネルＡおよびＢの定量をそれぞれのブロットの下に示す。グラフ中の破線は、コントロールで検出された平均正規化値を示す。ＯＣ＝後頭皮質、ＴＣ＝側頭皮質、ＬＳｃ＝腰髄，Ｔｈａｌ＝視床、Ｈｉｐｐ＝海馬、Ｃｂ＝小脳。値を平均±ＳＥＭとして示す。 インサイチュでのハイブリダイゼーションは、ＡＶＸＳ−２０１で処置された動物の脳から調べた全ての領域でベクター由来の転写産物を示すが、コントロールでは示さない。この図は、核標識（Ｄａｐｉ、青色）と共に、Ｇａｐｄｈ（赤色）およびベクター由来のＭＥＣＰ２ ｍＲＮＡ（緑色）に対するプローブを示す。ＯＣ＝後頭皮質、ＴＣ＝側頭皮質、ＬＳｃ＝腰髄，Ｈｉｐｐ＝海馬、Ｃｂ＝小脳。スケールバー＝２０μｍ。 インサイチュでのハイブリダイゼーションは、注射後１８ヶ月において、ＡＶＸＳ−２０１で処置された動物の脳から調べた全ての領域でベクター由来の転写産物を示すが、コントロールでは示さない。この図は、核標識（Ｄａｐｉ、青色）と共に、Ｇａｐｄｈ（赤色）およびベクター由来のＭＥＣＰ２ ｍＲＮＡ（緑色）に対するプローブを示す。ＯＣ＝後頭皮質、ＴＣ＝側頭皮質、ＣＡ１およびＣＡ３＝海馬の領域、ＣＣ＝脳梁、Ｔｈａｌ＝視床、Ｃａｕ＝尾状核、Ｐｕｔ＝被殻、ＳＣｏｌｌ＝上丘、Ｍｅｄ＝髄質、Ｃｂ＝小脳、Ｃｅｒｖ＝頸髄、Ｔｈｏｒ＝胸髄、Ｌｕｍｂ＝腰髄。スケールバー＝２０μｍ。 図２１−１と同様である。

一態様では、本発明は、患者への、ＭＥＣＰ２をコードするポリヌクレオチドの髄腔内投与（即ち脳または脊髄のくも膜下の空間への投与）の方法であって、このポリヌクレオチドを含むゲノムを有するｒＡＡＶ９を投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、このｒＡＡＶ９ゲノムは、自己相補的ゲノムである。他の実施形態では、このｒＡＡＶ９ゲノムは、一本鎖ゲノムである。

この方法により、患者の脳および脊髄（即ちこの患者の中枢神経系）に、ＭＥＣＰ２をコードするポリヌクレオチドが送達される。送達が企図される脳のいくつかの標的領域として、運動皮質および脳幹が挙げられるが、これらに限定されない。送達が企図される中枢神経系のいくつかの標的細胞として、神経細胞およびグリア細胞が挙げられるが、これらに限定されない。グリア細胞の例は、ミクログリア細胞、乏突起膠細胞およびアストロサイトである。

ＭＥＣＰ２をコードするポリヌクレオチドの送達は、例えば、レット症候群の処置に適応される。

「処置」は、本発明のｒＡＡＶを含む組成物の有効な用量または有効な複数の用量を、それを必要とする対象動物（ヒト患者を含む）に髄腔内経路を介して投与する工程を含む。この用量が障害／疾患の発症前に投与される場合、この投与は、予防的である。この用量が障害／疾患の発症後に投与される場合、この投与は、治療的である。本発明の実施形態では、有効な用量とは、処置される障害／疾患の状態に関連する少なくとも１つの症状を軽減する（取り除くもしくは低減させる）用量、処置される障害／疾患の状態に関連する少なくとも１つの症状を改善する用量、障害／疾患の状態への進行を遅延させるもしくは予防する用量、疾患の程度を下げる用量、疾患の（部分的なもしくは完全な）寛解をもたらす用量および／または生存期間を延ばす用量である。

レット症候群の処置では、本方法は、対象に効果をもたらし、この効果として下記が挙げられるが、これらに限定されない：意図的な手の動きの回復、発声の改善、無呼吸の減少、発作の減少、不安の減少、社会化の増加、ＩＱの増加、睡眠パターンの正常化および／または運動性の増加。

本発明では併用処置も企図される。本明細書で使用される組合せとして、同時処置または逐次処置の両方が挙げられる。本発明の方法と、レット症候群のための標準的な医療処置との組合せは、新規の治療との組合せであるかのように具体的に企図される。

出生後にそれを必要とする個体への送達が企図されるが、胎児への子宮内送達も企図される。

別の態様では、本発明は、ｒＡＡＶゲノムを提供する。このｒＡＡＶゲノムは、ＭＥＣＰ２をコードするポリヌクレオチドに隣接する１つまたは複数のＡＡＶ ＩＴＲを含む。このポリヌクレオチドは、転写制御ＤＮＡ（具体的にはプロモーターＤＮＡ）および「遺伝子カセット」を形成するために標的細胞中で機能するポリアデニル化シグナル配列ＤＮＡに作動可能に連結されている。この遺伝子カセットは、ニューロンまたはグリア細胞内での特異的な発現を可能にするプロモーターを含み得る。例として、ニューロン特異的エノラーゼプロモーターおよびグリア線維性酸性タンパク質プロモーターが挙げられる。摂取された薬物の制御下の誘発性プロモーターも使用され得る。例として、テトラサイクリン（ＴＥＴオン／オフ）系［Ｕｒｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７（１４）：７９６３−７９６８（２０００）］およびＥｃｄｙｓｏｎｅレセプター調節可能系［Ｐａｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ ２７０：１３０８−１３１５（２００３］等の系が挙げられるが、これらに限定されない。この遺伝子カセットは、このポリヌクレオチドが哺乳動物細胞中で発現される場合にＲＮＡ転写産物のプロセシングを容易にするためのイントロン配列をさらに含み得る。

本発明のｒＡＡＶゲノムは、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ ＤＮＡを欠く。このｒＡＡＶゲノム中のＡＡＶ ＤＮＡ（例えば、ＩＴＲ）は、組換えウイルスが由来し得るあらゆるＡＡＶ血清型に由来し得、このＡＡＶ血清型として下記が挙げられるが、これらに限定されない：ＡＡＶ血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３およびＡＡＶｒｈ７４。これらのＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は、当技術分野で既知である。例えば、ＡＡＶ９ゲノムは、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：６３８１−６３８８（２００４）に記載されている。

別の態様では、本発明は、本発明のｒＡＡＶゲノムを含むＤＮＡプラスミドを提供する。このＤＡＮプラスミドは、このｒＡＡＶゲノムの、ＡＡＶ９キャプシドタンパク質を有する感染性ウイルス粒子への構築のためのＡＡＶのヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、Ｅ１欠失アデノウイルスまたはヘルペスウイルス）による感染が許容される細胞に導入される。パッケージングされるＡＡＶゲノム、ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子、ならびにヘルパーウイルス機能が細胞に付与されるｒＡＡＶ粒子を産生させるための技術は、当技術分野で標準的である。ｒＡＡＶの生成には、下記の構成要素が単一細胞（本明細書ではパッケージング細胞と示される）内に存在することが必要である：ｒＡＡＶゲノム、このｒＡＡＶゲノムから独立した（即ちこのｒＡＡＶ中ではない）ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子、ならびにヘルパーウイルス機能。偽型ｒＡＡＶの産生は、例えば、国際公開第０１／８３６９２号パンフレットで開示されており、このパンフレットは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。様々な実施形態では、ＡＡＶキャプシドタンパク質は、組換えベクターの送達を増強するように改変され得る。キャプシドタンパク質への改変は、当技術分野で概して既知である。例えば、米国特許出願公開第２００５／００５３９２２号明細書および同第２００９／０２０２４９０号明細書（これらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。

パッケージング細胞を生成する方法は、ＡＡＶ粒子産生に必須の全ての成分を安定して発現する細胞株を作製することである。例えば、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子を欠くｒＡＡＶゲノム、このｒＡＡＶゲノムから独立したＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子、ならびに選択マーカー（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子）を含むプラスミド（または複数のプラスミド）を細胞のゲノムに組み込む。ＡＡＶゲノムは、ＧＣテーリング（Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ６．ＵＳＡ，７９：２０７７−２０８１）、制限エンドヌクレアーゼ開裂部位を含む合成リンカーの付加（Ｌａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｇｅｎｅ，２３：６５−７３）または直接的な平滑末端ライゲーション（Ｓｅｎａｐａｔｈｙ＆Ｃａｒｔｅｒ，１９８４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９：４６６１−４６６６）等の手順により細菌プラスミドに導入されている。次いで、このパッケージング細胞株にアデノウイルス等のヘルパーウイルスを感染させる。この方法の利点は、細胞が選択可能でありかつｒＡＡＶの大規模産生に適していることである。適切な方法の他の例は、パッケージング細胞にｒＡＡＶゲノムならびに／またはｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子を導入するために、プラスミドではなくアデノウイルスまたはバキュロウイルスを用いる。

ｒＡＡＶ産生の一般原理は、例えば、Ｃａｒｔｅｒ，１９９２，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５３３−５３９；およびＭｕｚｙｃｚｋａ，１９９２，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：９７−１２９）で概説されている。様々なアプローチが下記で説明されている：Ｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２（１９８４）；Ｈｅｒｍｏｎａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６４６６（１９８４）；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏ１．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１（１９８５）；ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２：１９６３（１９８８）；およびＬｅｂｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８８ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：３４９（１９８８）。Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９８９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３：３８２２−３８２８）；米国特許第５，１７３，４１４号明細書；国際公開第９５／１３３６５号パンフレットおよび対応する米国特許第５，６５８．７７６合明細書；国際公開第９５／１３３９２号号パンフレット；同第９６／１７９４７号パンフレット；ＰＣＴ／米国特許出願公開第９８／１８６００号明細書；国際公開第９７／０９４４１号パンフレット（ＰＣＴ／米国特許出願公開第９６／１４４２３号明細書）；同第９７／０８２９８号パンフレット（ＰＣＴ／米国特許出願公開第９６／１３８７２号明細書）；同第９７／２１８２５号パンフレット（ＰＣＴ／米国特許出願公開第９６／２０７７７号明細書）；同第９７／０６２４３号パンフレット（ＰＣＴ／仏国特許出願公開第ＦＲ９６／０１０６４号明細書）；同第９９／１１７６４号パンフレット；Ｐｅｒｒｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｖａｃｃｉｎｅ １３：１２４４−１２５０；Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：６０９−６１５；Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：１１２４−１１３２；米国特許第５，７８６，２１１号明細書；同第５，８７１，９８２号明細書；ならびに同第６，２５８，５９５号明細書。上述の文献は、これらの文献におけるｒＡＡＶ産生に関するセクションを特に強調して、これらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

そのため、本発明は、複製欠損性の感染性ｒＡＡＶを産生するパッケージング細胞を提供する。一実施形態では、パッケージング細胞は、安定して形質転換されたがん細胞（例えば、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞およびＰｅｒＣ．６細胞株（同族２９３株））であり得る。別の実施形態では、パッケージング細胞は、形質転換されたがん細胞ではない細胞（例えば、低継代２９３細胞（アデノウイルスのＥ１で形質転換されたヒト胎児腎臓細胞）、ＭＲＣ−５細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、ＷＩ−３８細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、Ｖｅｒｏ細胞（サル腎臓細胞）およびＦＲｈＬ−２細胞（アカゲザル胎仔肺細胞））である。

そのため、別の態様では、本発明は、本発明のｒＡＡＶゲノムを含むｒＡＡＶ９（即ち複製欠損性の感染性キャプシド化ｒＡＡＶ９粒子）等のｒＡＡＶを提供する。ｒＡＡＶのゲノムは、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ ＤＮＡを欠いており、即ちゲノムのＩＴＲ間にＡＡＶ ｒｅｐまたはｃａｐ ＤＮＡが存在しない。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶゲノムは、自己相補的ゲノムである。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶゲノムは、一本鎖ゲノムである。

「ＡＶＸＳ−２０１」と命名された自己相補的ＡＡＶ９（ｓｃＡＡＶ９）等のｒＡＡＶが提供される。このｒＡＡＶの遺伝子カセット（配列番号１に記載されているＡＶＸＳ−２０１ゲノムのヌクレオチド１５１〜２５５８）は、配列中にマウスＭＥＣＰ２遺伝子由来の５４６ｂｐのプロモーター断片（配列番号２）（逆方向でのＮＣ＿００００８６．７のヌクレオチド７４０８５５８６〜７４０８６３２３）、ＳＶ４０イントロン、ヒトＭＥＣＰ２Ｂ ｃＤＮＡ（配列番号３）（ＣＣＤＳ Ｄａｔａｂａｓｅ ＃ＣＣＤＳ４８１９３．１）および合成ポリアデニル化シグナル配列（配列番号４）を有する。この遺伝子カセットは、自己相補的ＡＡＶゲノムのパッケージングを共に可能にする変異体ＡＡＶ２逆位末端反復（ＩＴＲ）および野生型ＡＡＶ２逆位末端反復に隣接している。このゲノムは、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ ＤＮＡを欠いており、即ちこのゲノムのＩＴＲ間にＡＡＶ ｒｅｐまたはｃａｐ ＤＮＡが存在しない。

「ｓｃＡＡＶ９．７３８．Ｍｅｃｐ２」と命名されたｓｃＡＡＶ９等のｒＡＡＶが提供される。このｒＡＡＶの遺伝子カセット（配列番号５に記載されているｓｃＡＡＶ９．７３８．Ｍｅｃｐ２ゲノムのヌクレオチド１９８〜２８９０）は、配列中にマウスＭＥＣＰ２遺伝子由来の７３８ｂｐのプロモーター断片（配列番号６）（逆方向でのＮＣ＿００００８６．７のヌクレオチド７４０８５５８６〜７４０８６３２３）、ＳＶ４０イントロン、マウスＭＥＣＰ２α ｃＤＮＡ（配列番号７）（ＣＣＤＳ Ｄａｔａｂａｓｅ ＃ＣＣＤＳ４１０１６．１）およびウシ成長ホルモン遺伝子由来のポリアデニル化シグナル配列を有する。この遺伝子カセットは、自己相補的ＡＡＶゲノムのパッケージングを共に可能にする変異体ＡＡＶ２逆位末端反復（ＩＴＲ）および野生型ＡＡＶ２逆位末端反復に隣接している。このゲノムは、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ ＤＮＡを欠いており、即ちこのゲノムのＩＴＲ間にＡＡＶ ｒｅｐまたはｃａｐ ＤＮＡが存在しない。

ｒＡＡＶ９ゲノム（例えば、限定されないが、ｒＡＡＶ９ゲノム中の遺伝子カセット）中の保存的ヌクレオチド置換が企図される。例えば、遺伝子カセット中のＭＥＣＰ２ ｃＤＮＡは、ｓｃＡＡＶ９．７３８．Ｍｅｃｐ２中のＭＥＣＰ２α ｃＤＮＡまたはＡＶＸＳ−２０１中のＭＥＣＰ２Ｂ ｃＤＮＡに対する８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し得る。

いくつかの実施形態では、本発明のｒＡＡＶ９によりコードされるＭＥＣＰ２ポリペプチドは、バリアントＭＥＣＰ２ポリペプチドであり得る。バリアントポリペプチドは、ＭＥＣＰ２活性を保持し、かつｓｃＡＡＶ９．７３８．Ｍｅｃｐ２中のＭＥＣＰ２α ｃＤＮＡまたはＡＶＸＳ−２０１中のＭＥＣＰ２Ｂ ｃＤＮＡによりコードされるＭＥＣＰ２ポリペプチドのアミノ酸配列に対して少なくとも約６０、７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８、９９または９９．５％同一なアミノ酸配列を有する。

このｒＡＡＶをカラムクロマトグラフィーまたは塩化セシウム勾配等の当技術分野で標準的な方法により精製し得る。ヘルパーウイルスからｒＡＡＶベクターを精製する方法は、当技術分野で既知であり、例えばＣｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１０（６）：１０３１−１０３９（１９９９）；Ｓｃｈｅｎｐｐ ａｎｄ Ｃｌａｒｋ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，６９：４２７−４４３（２００２）；米国特許第６，５６６，１１８号明細書および国際公開第９８／０９６５７号パンフレットで開示されている方法が挙げられる。

別の態様では、本発明は、ＭＥＣＰ２ポリペプチドをコードするｒＡＡＶ（例えば、ｒＡＡＶ９）を含む組成物を企図する。

本発明の組成物は、薬学的に許容される担体中にｒＡＡＶを含む。この組成物は、希釈剤およびアジュバント等の他の成分も含み得る。許容される担体、希釈剤およびアジュバントは、レシピエントに対して無毒であり、好ましくは用いられる投与量および濃度で不活性であり、下記が挙げられる：緩衝液、例えばリン酸塩、クエン酸塩もしくは他の有機酸；酸化防止剤、例えばアスコルビン酸；低分子量ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンもしくはリシン；単糖、二糖および他の炭水化物、例えばグルコース、マンノースもしくはデキストリン；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；糖アルコール、例えばマンニトールもしくはソルビトール；塩形成対イオン、例えばナトリウム；ならびに／または非イオン性界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎ、プルロニックもしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）。

必要に応じて、上記に列挙した様々な他の成分と共に適切な溶媒に必要な量でｒＡＡＶを組み入れ、続いてろ過滅菌することにより、滅菌注射用溶液を調製する。一般に、基礎分散媒体および上記に列挙したものからの必要な他の成分を含む滅菌ビヒクル中に滅菌活性成分を組み入れることにより、分散液を調製する。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、予め滅菌ろ過した溶液から活性成分および任意の追加の所望成分の粉末を得る真空乾燥および凍結乾燥技術である。

本発明の方法で投与されるｒＡＡＶの力価および投与量は、例えば、特定のｒＡＡＶ、投与様式、処置目標、個体、投与のタイミングおよび標的とする細胞の種類に応じて異なり、当技術分野で標準的な方法により決定され得る。ｒＡＡＶの力価は、１ｍｌ当たり約１×１０^６、約１×１０^７、約１×１０^８、約１×１０^９、約１×１０^１０、約１×１０^１１、約１×１０^１２、約１×１０^１３〜約１×１０^１４またはより多くのＤＮアーゼ耐性粒子（ＤＲＰ）の範囲であり得る。投与量は、ウイルスゲノムの単位（ｖｇ）でも表され得る。このｒＡＡＶの投与量は、約１×１０^９ｖｇ以上、約１×１０^１０ｖｇ以上、約１×１０^１１ｖｇ以上、約１×１０^１２ｖｇ以上、約６×１０^１２以上、約１×１０^１３ｖｇ以上、約１．３×１０^１３ｖｇ以上、約１．４×１０^１３ｖｇ以上、約２×１０^１３ｖｇ以上、約３×１０^１３ｖｇ以上、約６×１０^１３ｖｇ以上、約１×１０^１４ｖｇ以上、約３×１０^１４以上、約６×１０^１４以上、約１×１０^１５ｖｇ以上、約３×１０^１５以上、約６×１０^１５以上、約１×１０^１６以上、約３×１０^１６以上または約６×１０^１６以上の範囲であり得る。新生児の場合、ｒＡＡＶの投与量は、約１×１０^９ｖｇ以上、約１×１０^１０ｖｇ以上、約１×１０^１１ｖｇ以上、約１×１０^１２ｖｇ以上、約６×１０^１２以上、約１×１０^１３ｖｇ以上、約１．３×１０^１３ｖｇ以上、約１．４×１０^１３ｖｇ以上、約２×１０^１３ｖｇ以上、約３×１０^１３ｖｇ以上、約６×１０^１３ｖｇ以上、約１×１０^１４ｖｇ以上、約３×１０^１４以上、約６×１０^１４以上、約１×１０^１５ｖｇ以上、約３×１０^１５以上、約６×１０^１５以上、約１×１０^１６以上、約３×１０^１６以上または約６×１０^１６以上の範囲であり得る。

本発明の方法により、標的細胞（例えば、限定されないが、神経細胞またはグリア細胞）が形質導入される。用語「形質導入」は、レシピエント細胞による機能的ＭＥＣＰ２ポリペプチドの発現をもたらす、本発明の複製欠損性の感染性ｒＡＡＶを介した、インビボまたはインビトロのいずれかでの標的細胞へのポリヌクレオチドの投与／送達を指すために使用される。

本発明のｒＡＡＶを使用する細胞の形質導入により、このｒＡＡＶによりコードされるＭＥＣＰ２ポリペプチドが持続的に発現される。いくつかの実施形態では、標的発現レベルは、レット症候群を患っていない対象での正常な（または野生型の）生理学的発現レベルの約７５％〜約１２５％であることが企図される。この標的発現レベルは、正常な発現レベルの約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約１００％、約１０５％、約１１０％、約１１５％、約１２０％または約１２５％であり得る。

本発明の処置方法のいくつかの実施形態では、非イオン性の低浸透圧造影剤も患者に投与する。そのような造影剤として、イオビトリドール、イオヘキソール、イオメプロール、イオパミドール、イオペントール、イオプロミド、イオベルソール、イオキシランおよびこれらの造影剤の２種以上の混合物が挙げられるが、これらに限定されない。そのため、いくつかの実施形態では、この処置方法は、患者へのイオヘキソールの投与をさらに含む。この非イオン性の低浸透圧造影剤は、患者の中枢神経系中の標的細胞の形質導入を増加させると考えられる。本開示のｒＡＡＶが単独で使用される場合の細胞の形質導入と比較して、本開示のｒＡＡＶが本明細書で説明された造影剤と組み合わせて使用される場合、細胞の形質導入が増加すると考えられる。様々な実施形態では、細胞の形質導入は、造影剤と組み合わせて使用されない場合の本開示のベクターの形質導入と比較して、本開示のベクターが本明細書で説明された造影剤と組み合わせて使用される場合、少なくとも約１％または少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１２０％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１８０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、少なくとも約３００％、少なくとも約３５０％、少なくとも約４００％、少なくとも約４５０％、少なくとも約５００％またはより多くまで増加する。さらなる実施形態では、細胞の形質導入は、造影剤と組み合わせて使用されない場合の本開示のベクターの形質導入と比較して、本開示のベクターが本明細書で説明された造影剤と組み合わせて使用される場合、約１０％〜約５０％まで、または約１０％〜約１００％まで、または約５％〜約１０％まで、または約５％〜約５０％まで、または約１％〜約５００％まで、または約１０％〜約２００％まで、または約１０％〜約３００％まで、または約１０％〜約４００％まで、または約１００％〜約５００％まで、または約１５０％〜約３００％まで、または約２００％〜約５００％まで増加する。

いくつかの実施形態では、患者をトレンデレンブルグ体位（頭を下にした体位）に置く場合に細胞の形質導入が増加すると考えられる。いくつかの実施形態では、例えば、髄腔内ベクター注入中にまたはその後に患者を約１度〜約３０度、約１５〜約３０度、約３０〜約６０度、約６０〜約９０度または約９０〜約１８０度）で頭を下にした体位において傾ける。様々な実施形態では、細胞の形質導入は、トレンデレンブルグ体位が使用されない場合と比較して、本明細書で説明されたようにトレンデレンブルグ体位を使用する場合、少なくとも約１％または少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１２０％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１８０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、少なくとも約３００％、少なくとも約３５０％、少なくとも約４００％、少なくとも約４５０％、少なくとも約５００％またはより多くまで増加する。

さらなる実施形態では、細胞の形質導入は、造影剤およびトレンデレンブルグ体位と組み合わせて使用されない場合の本開示のベクターの形質導入と比較して、本開示のベクターが本明細書で説明された造影剤およびトレンデレンブルグ体位と組み合わせて使用される場合、約１０％〜約５０％まで、または約１０％〜約１００％まで、または約５％〜約１０％まで、または約５％〜約５０％まで、または約１％〜約５００％まで、または約１０％〜約２００％まで、または約１０％〜約３００％まで、または約１０％〜約４００％まで、または約１００％〜約５００％まで、または約１５０％〜約３００％まで、または約２００％〜約５００％まで増加する。

本開示は、処置方法の実施形態であって、本開示のベクターおよび造影剤の、それを必要とする患者の中枢神経系への髄腔内投与により、本開示のベクターを造影剤の非存在下で投与する場合の患者の生存と比較して患者の生存が増加する、実施形態も提供する。様々な実施形態では、本開示のベクターおよび造影剤の、それを必要とする患者の中枢神経系への投与により、本開示のベクターを造影剤の非存在下で投与する場合の患者の生存と比較して、患者の生存が少なくとも約１％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％またはより多く増加する。

本開示は、処置方法の実施形態であって、本開示のベクターおよび造影剤の、トレンデレンブルグ体位に置かれたそれを必要とする患者の中枢神経系への髄腔内投与により、本開示のベクターを造影剤およびトレンデレンブルグ体位の非存在下で投与する場合の患者の生存と比較して患者の生存がさらに増加する、実施形態も提供する。様々な実施形態では、本開示のベクターおよび造影剤の、トレンデレンブルグ体位に置かれたそれを必要とする患者の中枢神経系への投与により、本開示のベクターを造影剤およびトレンデレンブルグ体位の非存在下で投与する場合の患者の生存と比較して、患者の生存が少なくとも約１％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％またはより多く増加する。

本発明を下記により説明する。
・雌および雄のレットマウスモデルでの概念実証研究は、ｓｃＡＡＶ９．７３８．Ｍｅｃｐ２の静脈内注射後に治療効果を示す（実施例１）。
・第二世代の遺伝子治療用ベクターＡＶＸＳ−２０１は、Ｍｅｃ２^−／ｙマウスの脳室内（ＩＣＶ）処置後、広範囲の用量にわたって生存期間の延長を示す。生存期間の中央値の最大増加は、ＡＶＸＳ−２０１処置後の４７７％であった（実施例２）。
・ＡＶＸＳ−２０１で処置した雄Ｍｅｃｐ２^−／ｙマウスは、レットマウスのために開発された総合評価により測定した場合に行動の永続的な改善を示す（実施例３）。
・ＡＶＸＳ−２０１で処置したＭｅｃｐ２^−／ｙマウスでの表現型の利点は、中程度のタンパク質発現で得られる（実施例４）。
・ＡＶＸＳ−２０１による野生型マウスの処置は、高用量群でのみ認められた行動スコアリングの一貫した変化を伴って、試験した全ての用量にわたり良好な耐容性を示した（実施例５および実施例６）。
・非ヒト霊長類での髄腔内投与は、ＡＶＸＳ−２０１が注射後１８ヶ月にわたり安全でありかつ良好な耐容性を示すことを示す（実施例７）。
・ＡＶＸＳ−２０１は、１回の髄腔内注射後、非ヒト霊長類の脳および脊髄において広く導入遺伝子を生理学的レベルで発現する（実施例８）。

実施例１
雌のレットマウスにおけるレット症候群のための遺伝子治療の概念実証研究
概念実証として、症候性の雄および雌のレットマウスをｓｃＡＡＶ９．７３８．Ｍｅｃｐ２で静脈内処置した［Ｇａｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ：Ｔｈｅ Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，３３：１３６１２−１３６２０ （２０１３）］。ｓｃＡＡＶ９．７３８．Ｍｅｃｐ２の組換えウイルスゲノム（配列番号５）は、マウスＭｅｃｐ２α ｃＤＮＡ（ＣＣＤＳ Ｄａｔａｂａｓｅ ＃ＣＣＤＳ４１０１６．１）の発現を駆動するマウスＭｅｃｐ２遺伝子由来の７３８ｂｐのプロモーター断片［Ａｄａｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１４：３７０９−３７２２（２００５）］と、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルとを含む。遺伝子カセット（配列番号５のヌクレオチド１９８〜２８９０）は、自己相補的ＡＡＶゲノムのパッケージングを可能にする変異体ＡＡＶ２逆位末端反復（ＩＴＲ）および野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲに隣接している。

自己相補的ＡＡＶ９（ｓｃＡＡＶ９）を、２９３細胞中において、アデノウイルスヘルパープラスミドｐＨｅｌｐｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）と共に、既に説明されているＲｅｐ２Ｃａｐ９配列をコードするプラスミド［Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：６３８１−６３８８（２００４）］により、二本鎖ＡＡＶ２−ＩＴＲベースのベクターを使用する一過性形質移入手順によって産生させた。実験のためにウイルスを３つの別々のバッチで産生させ、２回の塩化セシウム密度勾配精製工程により精製し、ＰＢＳに対して透析し、ウイルス凝集を防ぐために０．００１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ−Ｆ６８で製剤化し、４℃で貯蔵した。全てのベクター調製物を、Ｔａｑ−Ｍａｎ技術を使用する定量的ＰＣＲにより滴定した。ベクターの純度を４〜１２％ドデシル硫酸ナトリウム−アクリアルアミドゲル電気泳動および銀染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）により評価した。

Ｍｅｃｐ２ヌル対立遺伝子を有する雄マウスを４〜６週齢でｓｃＡＡＶ９．７３８．Ｍｅｃｐ２またはｓｃＡＡＶ９コントロールベクターのいずれか３×１０^１２ｖｇで静脈内処置した。この動物を生存に関して追跡し、表現型スコア［Ｇｕｙ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１５：１１４３−１１４７（２００７）］に関して毎週評価した。

Ｇｕｙ ｅｔ ａｌ．２００７からの表現型スコアリングの構成要素
Ａ．移動性：マウスをベンチに置いて観察し、次いで優しく扱って観察する。０＝野生型の場合。１＝野生型と比較した場合に移動が低下した：最初にベンチに置いた際にすくむ期間が長くなり、より長い期間にわたり不動であった。２＝ベンチに置いた場合に自発的な移動がない：マウスは、優しい刺激または近くに置いた餌ペレットに反応して移動し得る（注：マウスは、自分のケージ環境中である場合ではより活発になる場合がある）。
Ｂ．歩行：０＝野生型の場合。１＝骨盤の高さが低い状態で歩いたり走ったりする場合に野生型と比べて後肢が広がり、「よたつく」歩行になる。２＝より重度の異常：足を上げた際の震え、後方に歩く、または一度に両方の後ろ脚を上げることによる「バニーホップ」。
Ｃ．後肢把持：マウスを、尾の付け根を持って吊して観察した。０＝脚は外側に広がった。１＝後肢が（接触することなく）互いに向かって引き寄せられるか、片方の脚が身体に引き寄せられる。２＝両方の脚がしっかりと引き込まれ、互いに接触するか、または身体に接触する。
Ｄ．震え：マウスを手のひらに立たせて観察した。０＝震えなし。１＝断続的な軽度の震え。２^＊＝継続的な震え、または断続的な激しい震え。
Ｅ．呼吸：動物が静止している間に脇腹の動きを観察した。０＝通常の呼吸。１＝規則的な呼吸期間に、短時間のより速い呼吸または呼吸の中断が散在している。２^＊＝非常に不規則な呼吸−あえぎまたは浅速呼吸。
Ｆ．全身状態：マウスを毛の状態、目、体の姿勢等の一般的な健康状態の指標に関して観察した。０＝きれいで光沢のある毛、きれいな目、通常の姿勢。１＝うつろな目、光沢のない／小汚い毛、若干猫背の姿勢。２^＊＝目が痂皮で覆われている、または狭くなっている、立毛、猫背の姿勢。

図４は、ｓｃＡＡＶ９．７３８．Ｍｅｃｐ２で処置された群が実験期間中に生存の中央値に達しなかったが、公表時にコントロール処置動物を１０週超で上回ったことを示す。ｓｃＡＡＶ９．７３８．Ｍｅｃｐ２で処置された動物は、コントロール処置動物と比較して行動スコアも低かった。この実験を、罹患した雌マウスにより繰り返した（図５）。動物を、雄による以前のようにｓｃＡＡＶ９．７３８．Ｍｅｃｐ２またはコントロールのいずれかでＩＶ処置した。レットマウスが症候性である場合、雌を１０〜１２ヶ月齢に処置した。動物を注射後約６ヶ月にわたり追跡し、表現型スコアに関して試験した。重要なことに、雌レットマウスは、より重度な雄のような早期致死を有しない［Ｇｕｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２７：３２２−３２６（２００１）］。ｓｃＡＡＶ９．７３８．Ｍｅｃｐ２による処置は、疾患の進行を停止させ、スコアが１付近に後退して疾患の重症度の逆転を示した。これは、症状の悪化を示す６付近の表現型スコアで実験を終えたコントロール処置動物とは著しく対照的であった（図５Ｃ）。ロータロッド、倒立スクリーン試験、プラットフォーム試験およびネスティング能力からのデータの全ては、コントロール処置動物と比較して、ｓｃＡＡＶ９．７３８．Ｍｅｃｐ２で処置された動物において行動の改善を裏付ける。ｓｃＡＡＶ９．７３８．Ｍｅｃｐ２で処置された雌からの脳の死後分析は、ＭＥＣＰ２発現の蛍光強度測定値が、遺伝子治療導入遺伝子発現がほぼ生理学的レベルであったことを示す野生型脳の測定値を反映していることを示した。

実施例２
ＡＶＸＳ−２０１前臨床有効性研究
パッケージング効率を改善し、かつ生理学的レベルの遺伝子発現を維持しつつ臨床的に関係があるヒトＭＥＣＰ２ ｃＤＮＡを組み込むために、ｓｃＡＡＶ９．７３８．Ｍｅｃｐ２をより短いプロモーター、ヒトＭＥＣＰ２Ｂ ｃＤＮＡおよび合成ポリアデニル化シグナルで再設計した。この再設計したゲノムを、下記で説明するようにＡＡＶ９キャプシドにパッケージングし、続いて得られたｓｃＡＡＶを「ＡＶＸＳ−２０１」と命名した（図６）。ＡＶＸＳ−２０１は、元々「ＡＡＶ９−Ｐ５４５−ＭｅＣＰ２」という名称であった。
プロモーター領域配列（マウスＭｅＣＰ２プロモーター断片） （配列番号２）

コーディング領域配列（ヒトＭｅＣＰ２Ｂ ｃｄｓ） （配列番号３）

ポリＡ配列（合成） （配列番号４）
ＡＡＴＡＡＡＡＧＡＴＣＴＴＴＡＴＴＴＴＣＡＴＴＡＧＡＴＣＴＧＴＧＴＧＴＴＧＧＴＴＴＴＴＴＧＴＧＴＧ

ｓｃＡＡＶ９を、２９３細胞中において、アデノウイルスヘルパープラスミドｐＨｅｌｐｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）と共に、既に説明されているＲｅｐ２Ｃａｐ９配列をコードするプラスミド［Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．、上記を参照されたい］により、二本鎖ＡＡＶ２−ＩＴＲベースのベクターを使用する一過性形質移入手順により産生させた。実験のためにウイルスを３つの別々のバッチで産生させ、２回の塩化セシウム密度勾配精製工程により精製し、ＰＢＳに対して透析し、ウイルス凝集を防ぐために０．００１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ−Ｆ６８で製剤化し、４℃で貯蔵した。全てのベクター調製物を、Ｔａｑ−Ｍａｎ技術を使用する定量的ＰＣＲにより滴定した。ベクターの純度を４〜１２％ドデシル硫酸ナトリウム−アクリアルアミドゲル電気泳動および銀染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）により評価した。

図４と同じ株のレットマウスにおいて、有効性および投与研究を実施した。実施例１と実施例２との間の用量は、滴定方法の改善に起因して比較されていない。実施例１での実験は、ウイルス調製物の光学滴定を使用したが、実施例２および下記での研究は、より正確なデジタル液滴ＰＣＲ滴定を使用する。提案した髄腔内投与の臨床送達経路を模倣するために、これらの注射は、生後１日の仔において脳室内（ＩＣＶ）として実施した。レット症候群の重要な作用部位である神経系にＡＶＸＳ−２０１を直接送達するために、髄腔内送達を選択した。仔をその自然な生活に関して追跡し、生存、複合表現型スコア、オープンフィールドおよびロータロッド行動に関して評価した。２対数用量範囲にわたる生存データを図７に示す。図７に示す結果は、本発明の処置方法で使用されるベクターおよび技術の組合せが、改善された結果を達成することを実証する。試験した全ての用量は、コントロール処置Ｍｅｃｐ２^ｙ／−マウスよりも生存期間の中央値が延びており、観察した最大個体生存期間がコントロール処置レットマウスの９３日と比較して５００日（継続中）に達した。寿命の最高中央値（３１５日）は、動物１匹当たり１．４４×１０^１０ｖｇの中程度の用量で達成された。このデータは、既に観測された不適切なＭＥＣＰ２投与量（遺伝子コピー数）の効果［例えば、Ｌｏｍｂａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，１２５：２９１４−２９２３（２０１５）を参照されたい］から、本明細書で達成された結果を区別する釣鐘状の用量反応（図７Ｂ）を示す。重要なことに、試験した最高用量でも、ＡＶＸＳ−２０１処置は、コントール処置と比較してＭｅｃｐ^−／ｙマウスの生存期間を短縮しなかった。

生存に加えて、処置マウスおよびコントロールマウスをレット表現型（前の実施例で記載した表現型）に関して毎週採点した。未処置の雄は、０スコアから１０週齢までの５．２５の平均ピークまで急速に進行する（図８）。対照的に、全ての処置群の表現型スコアは、１８週で５のスコアに達した５．５６×１０^１０ｖｇ群を除いて、１７週齢まで約２のスコアにのみ達した。処置動物およびコントロール動物をオープンフィールド試験およびロータロッド試験でも評価した（図９）。自発的運動の減少は、レット雄マウスの症状である。自発的運動および速度を評価するためのオープンフィールド分析を群が２〜３ヶ月齢であった場合に実施した。罹患した動物は、野生型マウスと比較して総移動距離がほぼ４３％減少した。移動距離の有意な増加が全てで認められたが、ＡＶＸＳ−２０１で処置された群の２つは、コントール処置Ｍｅｃｐ２ノックアウト雄を超えていた。コントロール処置ノックアウトと比較して速度も有意に改善された。これは、雄のレットマウスモデルのＡＶＸＳ−２０１処置が探索的行動および歩行を改善することを示す。処置動物およびコントロール動物を、運動協調の尺度であるロータロッドでの能力に関して３ヶ月齢で試験した。動物を３日連続で試験し、スコアを日数および用量にわたり平均化した。得られた結果を図９Ｃに示す。実施したコントロール処置Ｍｅｃｐ^−／ｙマウスは、コントロール処置野生型同腹仔と比較してロータロッドで有意に悪化した。７．００×１０^９ｖｇコホートおよび１．４４×１０^１０ｖｇコホートでは、ロータロッド能力は、コントロール処置よりも有意に改善された。

実施例３
処置されたレットマウスの脳中でのＭＥＣＰ２タンパク質のＡＶＸＳ−２０１発現
注射の３週間後、ＰＢＳで処置された雄の野生型、未処置のレットおよびベクターで処置されたレット動物を安楽死させ、ＡＶＸＳ−２０１の生後１日のＩＣＶ注射後の脳中でのＭＥＣＰ２タンパク質レベルを調べた。一方の脳半球をホモジナイズし、ウエスタンブロットにより分析してＭＥＣＰ２発現をモニタリングした。代表的なブロットおよび定量を図１０に示す。ＰＢＳで処置された野生型脳に対する正規化後、ノックアウトおよび１．７５×１０^９ｖｇ ＡＶＸＳ−２０１用量群は、検出可能なレベルのＭＥＣＰ２を有しなかった。３．５０×１０^９ｖｇおよび７．００×１０^９ｖｇによる処置は、それぞれ野生型レベルの約１％および３．６％に達する検出可能なＭＥＣＰ２レベルを生じた。生存の中央値の増加で測定した場合の最も有効な用量（１．４４×１０^１０ｖｇ）は、野生型ＭｅＣＰ２レベルの約１１％を得た。ウエスタンブロットで調べた５．５６×１０^１０ｖｇ用量は、野生型の約５４％のＭＥＣＰ２レベルを生じ、１．１３×１０^１１は、野生型レベルの２倍超に達した。これらのデータは、ＭＥＣＰ２遺伝子治療の有効性の予測では脳全体にわたるタンパク質発現レベルおよび分布が重要であることを示す。

実施例４
ＡＶＸＳ−２０１による野生型マウスの処置は、安全でありかつ良好な耐容性を示す
ＭＥＣＰ２補充療法に関する重要な関心事は、ＭＥＣＰ２のインタクトなコピーを発現する細胞への影響を評価することである。ＭＥＣＰ２導入遺伝子の生理学的調節を支持するためにマウスＭｅｃｐ２プロモーターの断片を組み込むことにより、この点を考慮してＡＶＸＳ−２０１を設計した。ＡＶＸＳ−２０１の安全性を試験するために、雄のレットマウスと全く同じようにＡＶＸＳ−２０１をＰ１ ＩＣＶ注射した野生型マウスのコホートに対して生存および行動の分析を実施した。

合計１３１匹の野生型の雄マウスをＡＶＸＳ−２０１の様々なＩＣＶ投与で処置し、生存に関して追跡した（図１１）。目標とする治療用量（１．４４×１０^１０ｖｇ）では死亡が記録されず、２１匹の処置動物がＰ３４２にわたり生存した。ＰＢＳ処置群では死亡が記録されず、３．５０×１０^９、２．７８×１０^１０および１．１３×１０^１１ｖｇ処置群ではそれぞれ１例の死亡を記録した。ボックス１からの基準を使用する行動スコアリングは、ベクター処置群が平均表現型スコア＜１を主に有したことを示す。平均総スコア＞１は、２つの最高投与群（５．５６×１０^１０および１．１３×１０^１１ｖｇ）でのみ認められた。２〜３ヶ月齢でのオープンフィールド試験は、ベクターで処置された野生型雄とＰＢＳで処置された野生型雄との間で統計的な差異を示さなかった（図１２）。興味深いことに、３ヶ月齢でのコントロール処置野生型マウスと比較して、１．１３×１０^１１ｖｇコホートでは、ロータロッド能力の有意な低下を検出した。これらのデータは、最高ＡＶＸＳ−２０１用量でのＭＥＣＰ２過剰発現の毒性効果を示唆する。これらのデータをまとめると、野生型細胞に形質導入するのみのＡＶＸＳ−２０１処置の「最悪のシナリオ」では、目標とする治療用量において動物の生存および行動へ影響が最小であることを示す。

実施例５
ＭＥＣＰ２生理学的レベルは、治療用量のＡＶＸＳ−２０１で処置された野生型マウスの脳中で維持される
症候性ＭＥＣＰ２過剰発現に関連するレベルをさらに調べるために、野生型雄マウスに治療目標１．４４×１０^１０ｖｇまたは試験した最高用量１．１３×１０^１１ｖｇでＰＢＳまたはＡＶＸＳ−２０１をＰ１ ＩＣＶ注射した。動物を注射後３週で安楽死させ、ウエスタンブロットのために脳を採取した。比較のために、Ｔｇ３と称されるＭＥＣＰ２過剰発現のマウスモデルから脳と一緒に組織をブロットした。脳を別々の領域（Ｃｂ＝小脳、Ｍｅｄ＝髄質、Ｈｉｐｐ＝海馬、Ｃｔｘ＝皮質およびＭｉｄ＝中脳、図１３）に解剖し、個々の領域をブロッティングのためにホモジナイズした。データを、ＰＢＳで処置した野生型脳中のＭＥＣＰ２レベルに対して正規化した。目標治療用量（１．４４×１０^１０ｖｇ）による処置は、調べた全ての領域にわたり野生型組織の１〜１．５倍のＭＥＣＰ２レベルを有した。高用量（１．１３×１０^１１ｖｇ）は、野生型レベルの１．３１〜２．５６倍の範囲であったが、Ｔｇ３組織のレベルの２．３１〜３．９３倍に達しなかった。これらのデータは、先に示した行動および生存のデータと共に、目標用量で投与した場合にＡＶＸＳ−２０１がほぼ生理学的レベルでタンパク質を発現するという確信を与える。重要なことに、治療投与量は、ＭＥＣＰ２重複症候群に関連する２倍タンパク質レベルに近づかない。これは、遺伝子治療を使用するＭＥＣＰ２補充アプローチの安全性を示す。

実施例６
ＡＶＸＳ−２０１の髄腔内注射後１８ヶ月にわたり、体重、血液学および血清化学は、非ヒト霊長類で目立たない
ＡＶＸＳ−２０１および関連する髄腔内注射手順の安全性および耐容性を調べるために、３匹の処置された雄のカニクイザルを注射後１８ヶ月にわたり追跡した。投与パラメータを表２に示す。

２匹の動物を意図した治療用量（体重１ｋｇ当たり約１．４４×１０^９ｖｇ当量）で処置し、１匹に約２倍低い用量（体重１ｋｇ当たり約７．００×１０^８ｖｇ当量）を投与した。髄腔内注射手順は、Ｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，２３：４７７−４８７（２０１５）で既に説明された。簡潔に説明すると、ベクターの拡散を検証するためにベクターを造影剤と混合した。麻酔した対象を側臥位に置き、約Ｌ４／５レベル（脊髄の円錐体下）で後正中線注射部位を用意した。無菌条件下において、スタイレットを備えたくも膜下穿刺針を挿入し、この針から透明なＣＳＦの流れにより、くも膜下カニューレ挿入を確認した。くも膜下腔中の圧力を低下させるために、ベクター溶液を注射した直後にＣＳＦ ０．８ｍｌを排出した。注射後、動物をトレンデレンブルグ体位に保ち、この身体を１０分にわたり頭を下にして傾けた。処置した動物に６または１２ヶ月齢で投与し、注射後最初の６ヶ月にわたり毎月およびその後の２ヶ月毎に体重、血球数および血清化学を集めた。体重を図１４に示し、血球数を図１５に示し、血清化学を図１６および図１７に示し、Ｍａｎｎｈｅｉｍｅｒ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（Ｈｏｍｅｓｔｅａｄ，ＦＬ）での同一のコロニーからのコントロール処置動物の値と共にグラフにした。全体として、ベクター処置動物からの体重、細胞数および血清値は、コントロール処置動物と一致した。ベースライン時に２匹のベクター処置動物においてより高かったアミラーゼを除いて、所与の動物での２回を超える連続観察に関してコントロールから実質的に逸脱する値はなかった。これらのデータは、ＡＶＸＳ−２０１および髄腔内注射手順が安全でありかつ良好な耐容性を示すことを示す。

実施例７
ＡＶＸＳ−２０１の髄腔内注射後の非ヒト霊長類由来の組織の病理学的分析
インビボ（実施例６）および死後分析（実施例８）に加えて、動物１５Ｃ３８、１５Ｃ４９および１５Ｃ３４（表１）からの内臓および中枢神経組織のサンプルをパラフィン包埋、切片化ならびにヘマトキシリンおよびエオシン染色のためにＧＥＭｐａｔｈ Ｉｎｃ．（Ｌｏｎｇｍｏｎｔ，ＣＯ）に送った。残りの動物（表８．２）は、依然として生存しており、研究終了時に分析のために送られるであろう。ＧＥＭｐａｔｈ Ｂｏａｒｄ公認の獣医病理学者がスライドを読み取ってレポートを作成した。サンプリングして調べた組織を表３に示す。病理学レポートは、ＡＶＸＳ−２０１処置が６週または１８ヶ月の時点でいかなるプロトコル特異的組織においても病変を誘発しなかったことを指摘する。

実施例８
ＡＶＸＳ−２０１の髄腔内注射後の非ヒト霊長類の脳中でのＭｅＣＰ２の生理学的レベル
２匹の１２ヶ月齢の雄のカニクイザルに上記で説明したようにＡＶＸＳ−２０１ ７．７×１０^１２ｖｇ／ｋｇを髄腔内注射した。動物は、注射後６週間にわたり生き残り、ＭｅＣＰ２発現の分析のために安楽死させた。選択された脳領域を免疫組織化学により総ＭｅＣＰ２発現に関して分析した（図１８）。ＭｅＣＰ２の明らかな上昇は、皮質領域および皮質下領域において検出されず、注射部位（腰髄）の付近でも検出されなかった。重要なことに、これらのデータは、ＡＶＸＳ−２０１注射した動物由来の組織においていかなる全体的な異常も示さない。導入遺伝子発現をさらに調べるために、脳領域をホモジナイズし、同一コロニーからの動物由来の歴史的コントロール組織と比較した（図１９）。後頭部および側頭部の皮質、視床下部、腰髄、視床、扁桃体、海馬および小脳のサンプルを総ＭｅＣＰ２発現に関してウエスタンブロットにより分析した。調べた領域の全てにわたり、ＭｅＣＰ２発現のレベルがコトンロールの２倍以上である領域はなかった。上昇したＭｅＣＰ２を、それぞれ第３の心室および側部の心室に近い領域である視床下部および扁桃体で検出したが、小脳では検出しなかった。さらに、注射部位の近位である腰髄は、上昇したＭｅＣＰ２レベルを示さなかった。これらのデータは、ウイルス用量および発現構築物の組合せがＭｅＣＰ２発現を調節していることを示唆する。さらに、インサイチュでのハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）を実施して、ベクター由来の転写産物を検出し、注射後６週および１８ヶ月で脳中の分布を決定した（図２０および図２１）。脳および脊髄で調べた全ての領域（後頭部皮質、側頭部皮質、海馬、脳梁、視床、尾状核、被殻、上丘、脳橋、髄質、小脳、頸髄、胸髄および腰髄）は、コントロール処置動物由来の組織中には存在しないベクター由来の転写産物の発現を示した。これらのデータは、ベクター由来のＭＥＣＰ２転写産物に関するＩＳＨプローブの特異性を示し、かつＡＶＸＳ−２０１プロモーター構築物がＮＨＰ神経系組織中で機能することを示す。これらのデータは、腰椎穿刺を介して投与した場合にＡＶＸＳ−２０１がＣＮＳ全体にわたり広く分布し、かつ生理学的レベルで発現することを示す。

仮特許出願第６２／４２３，６１８号明細書からの開示

レット症候群のための遺伝子治療
転写因子ＭｅＣＰ２を回復させるための遺伝子治療は、明らかな自閉症の行動、運動機能の喪失および早期死を引き起こす進行性の神経発達障害であるレット症候群を処置するための実行可能な戦略であると思われる。本発明者らは、トランケート型内在性プロモーターの制御下でヒトＭＥＣＰ２を発現するアデノ随伴ウイルス血清型９（ＡＡＶ９）を開発している。この研究の目的は、マウス（ＭｅＣＰ２ヌルおよび野生型）ならびに非ヒト霊長類でのこのベクターの有効性および安全性を評価することである。継続的な研究を通して、本発明者らの目標は、この処置をベンチからベッドサイドへと動かすことである。
ＡＡＶ９−Ｐ５４５−ＭｅＣＰ２
プロモーター領域配列（マウスＭｅＣＰ２プロモーター断片）

コーディング領域配列（ヒトＭｅＣＰ２ ｃｄｓ）

ポリＡ配列（合成）
ＡＡＴＡＡＡＡＧＡＴＣＴＴＴＡＴＴＴＴＣＡＴＴＡＧＡＴＣＴＧＴＧＴＧＴＴＧＧＴＴＴＴＴＴＧＴＧＴＧ

本発明を様々な実施形態および実施例の観点から説明したが、当業者は、変形形態および改善形態を想到するであろうことが理解される。従って、特許請求の範囲で現れるような限定のみが本発明に課されるべきである。

本明細書で言及された全ての文献は、その全体が参照により組み込まれる。

Claims (4)

1. 患者のレット症候群を処置する方法であって、メチル−ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）をコードする組換えアデノ随伴ウイルス９（ｒＡＡＶ９）の、それを必要とする患者への髄腔内投与の工程を含み、前記ｒＡＡＶ９は、ＭＥＣＰ２Ｂをコードする自己相補的ゲノムを含み、前記自己相補的ゲノムの配列は、配列番号１に記載されている、方法。
2. 前記ｒＡＡＶ９は、ｒＡＡＶ９ ＡＶＸＳ−２０１である、請求項１に記載の方法。
3. イオヘキソール、イオビトリドール、イオメプロール、イオパミドール、イオペントール、イオプロミド、イオベルソールもしくはイオキシランまたはそれらの２つ以上の混合物の髄腔内投与をさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記患者をトレンデレンブルグ体位に置くことをさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。