TWI815856B - 用於肢帶型肌肉失養症2c型之基因療法 - Google Patents

Abstract

本發明係關於包括編碼γ-肌聚醣(SGCG)之多核苷酸之基因療法載體，例如AAV載體，及使用該等基因療法載體治療患有肌肉失養症、例如肢帶型失養症2C型(LGMD2C)之個體的方法。

Description

用於肢帶型肌肉失養症2C型之基因療法

本發明係關於基因療法。更具體而言，本發明提供用於治療肌肉失養症、例如肢帶型失養症2C型(LGMD2C)之基因療法載體，例如腺相關病毒(AAV)載體。

肌肉失養症(MD)係基因疾病群組。該群組之特徵在於控制運動之骨骼肌之進展性衰弱及退化。一些形式之MD發生於嬰兒期或兒童期，而其他形式直至中年或更晚才出現。該等病症在以下方面有所不同：肌肉衰弱之分佈及程度(一些形式之MD亦影響心肌)、發作年齡、進展速率及遺傳模式。

MD之一個群組係MD之肢帶型群組(LGMD)。LGMD係罕見病狀，其關於發作年齡、肌肉衰弱區域、心臟及呼吸累及、進展速率及嚴重程度以不同方式存在於不同人中。LGMD可開始於兒童期、青春期、年輕成人或甚至更晚。兩種性別同等受影響。LGMD引起肩及骨盆帶之衰弱，且大腿及手臂之附近肌肉有時亦隨時間衰弱。腿虛弱通常出現於手臂虛弱之前。面部肌肉通常不受影響。隨著病狀發生進展，受影響個體可出現步行問題且可需要隨時間使用輪椅。肩肌肉及手臂肌肉之累及可使得難以將手臂舉過頭部及提起物體。在一些類型之LGMD中，可累及心肌及呼吸肌。

LGMD2C (肢帶型失養症2C型)係由伽馬(γ)-肌聚醣(SGCG)缺乏所引起。類似於其他肌聚醣病，其呈現為進展性肌肉失養症，且始於帶肌肉中，然後擴展至下肢肌肉及最後上肢肌肉中。呈現通常發生於青少年中後期。在治療LGMD2C之嘗試中，尚無藥物療法形式(甚至包含皮質類固醇)可改變疾病過程。

患有LGMD2C及其他肌肉失養症之患者之功能改良需要基因恢復及纖維化減少。業內需要用於治療LGMD2C及其他肌肉失養症之組合物及方法。

本文闡述編碼γ-肌聚醣之基因療法載體(例如重組腺相關病毒(AAV)載體)及將該等編碼γ-肌聚醣之載體遞送至患有肌肉失養症之哺乳動物個體之肌肉以用於以下用途的方法：減少或預防纖維化；維持或改良肌肉功能；增加肌力；增加肌耐力；或治療γ-肌聚醣病。

另外，本發明提供使用基因療法載體遞送γ-肌聚醣以解決LGMD2C (肢帶型失養症2C型)中所觀察之基因缺陷之療法及方式。在一態樣中，本文提供用於患有肌肉失養症之個體中之以下用途中之一或多者的方法：治療γ-肌聚醣病；增加肌力、肌耐力及/或肌肉質量；減少纖維化；減少收縮誘導性損傷；降低脂肪浸潤；及/或降低有需要之個體中之中心成核；及/或治療肌肉失養症；減少退化纖維或壞死纖維；減少發炎；升高肌酸激酶含量；治療肌纖維萎縮及肥大；及/或降低失養型鈣化，該等方法包括向個體投與治療有效量之重組腺相關病毒(AAV)載體或基本上由其組成或又另外由其組成，其中該rAAV載體包括基因表現盒或基本上由其組成或又另外由其組成，該基因表現盒包括在啟動子之轉錄控制下編碼γ-肌聚醣之多核苷酸序列或基本上由其組成或又另外由其組成，該盒側接有一或多個AAV反向末端重複。

在一態樣中，本文闡述一種重組AAV (rAAV)載體，其包括在啟動子之轉錄控制下編碼γ-肌聚醣之多核苷酸序列或基本上由其組成或又另外由其組成。在一些實施例中，編碼γ-肌聚醣之多核苷酸序列包括(例如)與SEQ ID NO: 1中所述之核苷酸序列至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%或89%、更通常90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高程度一致之序列或基本上由其組成或又另外由其組成，且編碼保留γ-肌聚醣活性之蛋白質。在一些實施例中，編碼γ-肌聚醣之多核苷酸序列包括SEQ ID NO: 1中所述之核苷酸序列或基本上由其組成或又另外由其組成。在一些實施例中，編碼γ-肌聚醣之多核苷酸序列由SEQ ID NO: 1中所述之核苷酸序列或(例如)與SEQ ID NO: 1中所述之核苷酸序列至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%或89%、更通常90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高程度一致之序列組成，且編碼與編碼γ-肌聚醣之野生型人類多核苷酸中之相應核苷酸相比保留γ-肌聚醣活性(在一態樣中，保留SEQ ID NO: 1之核苷酸變化)之蛋白質。

在另一態樣中，本文所闡述之rAAV載體包括與SEQ ID NO: 2之胺基酸序列具有至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%或89%、更通常至少90%、91%、92%、93%或94%及甚至更通常至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之編碼γ-肌聚醣的多核苷酸序列或基本上由其組成或又另外由其組成，且該蛋白質保留γ-肌聚醣活性。

γ-肌聚醣活性對於肌肉功能至關重要。γ-肌聚醣係若干與肌肉萎縮蛋白(dystrophin)相互作用並形成肌肉萎縮蛋白-醣蛋白複合物之肌膜跨膜醣蛋白之一，該肌肉萎縮蛋白-醣蛋白複合物跨越肌膜且包括肌肉萎縮蛋白、互養蛋白、α-營養不良聚醣及β-營養不良聚醣及肌聚醣(包含γ-肌聚醣)。肌肉萎縮蛋白-醣蛋白複合物在肌膜下細胞骨架與肌細胞之細胞外基質之間提供結構連接。肌細胞之非限制性實例包含心臟、橫膈膜、腿、骨盆帶、肩及手臂之肌細胞。γ-肌聚醣活性及γ-肌聚醣病之後果之其他非限制性實例闡述於Blake等人(2002) Physiol Rev.;82(2):291-329及Tarakci等人(2016) Front Biosci (Landmark Ed);21:744-56中。

在另一態樣中，本文所闡述之rAAV載體可能可操作地連接至啟動子及/或肌肉特異性控制元件以限制肌肉表現。舉例而言，肌肉特異性控制元件係人類骨骼肌動蛋白基因元件(基因庫登錄號NG_006672.1)、心肌動蛋白基因元件(基因庫登錄號NG_007553.1)、肌細胞特異性增強子結合因子MEF (基因庫登錄號NG_016443.2)、肌肉肌酸激酶(MCK) (基因庫登錄號AF188002.1)、tMCK (截短MCK)、肌球蛋白重鏈(MHC)、MHCK7 (MHC及MCK之雜合形式)、C5-12 (合成啟動子)、鼠類肌酸激酶增強子元件、骨骼快縮肌鈣蛋白C基因元件、慢縮心臟肌鈣蛋白C基因元件、慢縮肌鈣蛋白I基因元件、低氧可誘導核因子、類固醇可誘導元件或糖皮質激素反應元件(GRE)。

在一些實施例中，肌肉特異性啟動子係MHCK7 (SEQ ID NO: 4)或其等效物。本文所闡述之一實例性rAAV載體係包括SEQ ID NO: 3之核苷酸序列或其等效物或基本上由其組成或又另外由其組成之pAAV.MHCK7.hSCGC；其中MHCK7啟動子跨越核苷酸136-927，CMV內含子跨越核苷酸937-1084，γ-肌聚醣序列跨越核苷酸1094-1968且聚A跨越核苷酸1976-2028。在某些情形下，pAAV.MHCK7.hSCGC包裝於AAV rh74衣殼中。

AAV可為任一血清型，例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV-10、AAV-11、AAV-12、AAV-13或AAV rh74。在一些實施例中，rAAV載體包括AAV2之反向末端重複(ITR)序列。

假型rAAV之產生揭示於(例如) WO 01/83692中。亦涵蓋其他類型之rAAV變體，例如具有衣殼突變之rAAV。例如參見Marsic等人，Molecular Therapy, 22(11): 1900-1909 (2014)。

亦涵蓋包括本文所闡述之任一rAAV載體或基本上由其組成之組合物。

亦提供產生重組AAV載體顆粒之方法，其包括培養已經本文所闡述之任一重組AAV載體轉染之細胞且自轉染細胞之上清液回收重組AAV顆粒。亦涵蓋包括本文所闡述之任一重組AAV載體或基本上由其組成之病毒顆粒。

亦提供減少有需要之哺乳動物個體之纖維化之方法。就此而言，該方法包括向哺乳動物個體投與治療有效量之本文所闡述之AAV載體(或包括本文所闡述之AAV載體或基本上由其組成之組合物)或基本上由其組成或又另外由其組成。在一些實施例中，哺乳動物個體患有肌肉失養症。在一些實施例中，投與本文所闡述之AAV載體(或包括本文所闡述之AAV載體或基本上由其組成之組合物)可減少個體之骨骼肌或心肌中之纖維化。

在另一態樣中，本文闡述增加哺乳動物個體中之肌力或肌肉質量或肌耐力之方法，其包括向哺乳動物個體投與治療有效量之本文所闡述之AAV載體(或包括本文所闡述之AAV載體或基本上由其組成之組合物)或基本上由其組成或又另外由其組成。

在本發明之任一方法中，個體可患有肌肉失養症，例如肢帶型肌肉失養症或任一其他肌肉萎縮蛋白相關肌肉失養症。

亦提供治療哺乳動物個體之肌肉失養症之方法，其包括向哺乳動物個體投與治療有效量之本文所闡述之AAV載體(或包括本文所闡述之AAV載體或基本上由其組成之組合物)或基本上由其組成或又另外由其組成。在一些實施例中，肌肉失養症係肢帶型肌肉失養症。

在本發明之任一方法中，藉由任一適當投與方式(例如肌內注射或靜脈內注射)來投與rAAV。另外，在本發明之任一方法中，全身性投與rAAV，例如藉由注射、輸注或植入來非經腸投與。

本發明組合物經調配以用於肌內注射或靜脈內注射。另外，本發明組合物經調配以用於全身性投與，例如藉由注射、輸注或植入非經腸投與。

另外，任一組合物可經調配以用於投與患有肌肉失養症(例如肢帶型肌肉失養症或任一其他肌肉萎縮蛋白相關肌肉失養症)之個體。本文亦闡述包括本文所揭示之一或多種組合物及皮質類固醇或基本上由其組成之組合療法。本文提供包括本發明rAAV載體之宿主細胞。本文進一步提供包括本文所揭示之一或多個實施例中之任一者及使用說明書之套組。該等套組可包括本文所揭示之一或多種組合物及皮質類固醇或本文所提供之一或多種組合療法或基本上由其組成。在本發明之任一用途中，調配藥劑以用於投與(例如肌內注射或靜脈內注射)。另外，在本發明之任一用途中，調配藥劑以用於全身性投與，例如藉由注射、輸注或植入非經腸投與。另外，可製備任一藥劑以用於投與患有肌肉失養症(例如肢帶型肌肉失養症或任一其他肌肉萎縮蛋白相關肌肉失養症)之個體。

前述段落並不意欲定義本發明之每一態樣，且其他態樣闡述於其他部分(例如實施方式)中。整個文件意欲敘述為統一揭示內容，且應理解，涵蓋本文所闡述特徵之所有組合，即使該特徵組合並未一起發現於本文件之相同句子或段落或部分中。作為其他態樣，本發明包含在範圍上以任一方式窄於由上文具體段落定義之變化形式之本發明所有實施例。舉例而言，在將本發明之某些態樣闡述為群屬之情形下，應理解，每一群屬成員個別地係本發明之一態樣。

相關專利申請案之交叉參考

本申請案在35 U.S.C. § 119(e)下主張2018年1月31日提出申請之美國臨時專利申請案第62/624,616號之優先權，該申請案之內容之全部內容以引用方式併入本文中。序列表

本申請案含有以ASCII格式以電子形式呈送且其全部內容以引用方式併入本文中之序列表。該ASCII拷貝於2019年1月25日創建，命名為106887-7141_SL.txt且大小為18,760個字節。

本發明係關於投與包括表現γ-肌聚醣之多核苷酸之重組腺相關病毒(rAAV)載體以用於減少或完全逆轉患有肢帶型肌肉失養症之個體中的肌肉纖維化。如實例中所證實，本文所闡述之投與rAAV載體使得可恢復剔除小鼠中之γ-肌聚醣表現。投與本文所闡述之rAAV載體使得可逆轉失養型特徵，包含減少退化纖維、減少發炎及藉由利用增加之力生成防止離心收縮來改良功能恢復。本發明涵蓋藉由投與本文所闡述之rAAV載體來治療個體(例如人類個體)之肢帶型肌肉失養症。

在本說明中，除非另外指示，否則任一濃度範圍、百分比範圍、比率範圍或整數範圍應理解為包含在所列舉範圍及(在適當時)其分數部分(例如整數之十分之一及百分之一)內之任一整數值。應理解，除非另外指示，否則本文所用之術語「一種(a及an)」係指「一或多種」所列舉組分。所用替代詞(例如「或(or)」)應理解為意指一種、兩種或替代物之其任一組合。如本文中所使用，術語「包含」及「包括」同義使用。如本文中所使用，「複數個」可係指一或多種組分(例如一或多種miRNA靶序列)。在本申請案中，除非另外陳述，否則使用「或」意指「及/或」。

如本申請案中所使用，術語「約」及「大約」等效使用。本申請案中所用之含有或不含約/大約之任何數值意欲涵蓋熟習相關技術者所瞭解之任何正常波動。在某些實施例中，除非另外陳述或另外自上下文明了，否則術語「大約」或「約」係指在所述參考值任一方向(大於或小於) 25%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更小內之值範圍(該數值超過可能值之100%除外)。

「降低」或「減小」係指特定值與參考值相比降低或減小至少5%，例如5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%。特定值有所降低或減小亦可表示為該值與參考值相比之倍數變化，例如與參考值相比降低至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或更多。

「增加」係指特定值與參考值相比增加至少5%，例如5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、100%、200%、300%、400%、500%或更多。特定值有所增加亦可表示為該值與參考值相比之倍數變化，例如與參考值之等級相比至少增加1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或更多。

「互補性」係指經由鹼基堆疊及特定氫鍵結在兩個包括天然或非天然(例如如上文所闡述進行修飾)鹼基(核苷)或其類似物之序列之間進行配對之能力。舉例而言，若一個核酸位置之鹼基能夠與靶相應位置之鹼基進行氫鍵結，則該等鹼基視為在該位置彼此互補。核酸可包括通用鹼或不向氫鍵結提供正面或負面貢獻之惰性無鹼基間隔體。鹼基配對可包含規範沃森-克裡克鹼基配對(Watson-Crick base pairing)及非沃森-克裡克鹼基配對(例如搖擺鹼基配對(Wobble base pairing)及霍氏鹼基配對(Hoogsteen base pairing))。應理解，對於互補鹼基配對而言，腺苷型鹼基(A)與胸苷型鹼基(T)或尿嘧啶型鹼基(U)互補，嘧啶型鹼基(C)與鳥苷型鹼基(G)互補，且通用鹼基(例如3-硝基吡咯或5-硝基吲哚)可雜交於且視為互補於任一A、C、U或T。Nichols等人，Nature, 1994;369:492-493及Loakes等人，Nucleic Acids Res., 1994;22:4039-4043。肌苷(I)亦在業內視為通用鹼基且視為互補於任一A、C、U或T。參見Watkins及SantaLucia, Nucl. Acids Research, 2005；33 (19): 6258-6267。

術語「個體」包含動物，例如哺乳動物。在一些實施例中，哺乳動物係靈長類動物。在一些實施例中，哺乳動物係人類。在一些實施例中，個體係家畜，例如牛、綿羊、山羊、母牛、豬及諸如此類；或家養動物，例如狗及貓。在一些實施例中(例如尤其在研究背景中)，個體係齧齒類動物(例如小鼠、大鼠、倉鼠)、兔、靈長類動物或豬(例如近交豬)及諸如此類。術語「個體」及「患者」在本文中可互換使用。

「投與」在本文中係指將藥劑或組合物引入個體中。

本文所用之「治療」係指向個體遞送藥劑或組合物以影響生理學結果。在一些實施例中，治療係指治療個體、例如人類之疾病，包含(a)抑制疾病，例如阻止疾病發生或預防疾病進展；(b)減輕疾病，例如使疾病狀態消退；(c)治癒疾病；及(d)預防疾病發作，例如阻止鑑別為基因缺陷載體之無症狀個體中之疾病發生。在一態樣中，治療不包含預防(prophylaxis或prevention)。

在疾病係肌肉失養症時，下列臨床終點係治療之非限制性實例：降低比力，增加抗損傷性，增加肌力，增加肌耐力，增加肌肉質量，減少收縮誘導性損傷，降低脂肪浸潤，降低中心成核，減少退化纖維或壞死纖維，減少發炎，升高肌酸激酶含量，降低肌纖維萎縮及肥大及/或降低失養型鈣化。

在疾病係纖維化時，下列臨床終點係治療之非限制性實例：減少纖維化組織，減少發炎，減少纖維母細胞病灶，減小活化纖維母細胞增殖，減小肌纖維母細胞生成，減小用力肺活量(FVC)之下降速率(其中FVC係在肺功能測試期間呼出之空氣總量)，FVC自基線絕對及相對增加，FVC (預測%)自基線絕對增加，增加無進展存活時間；聖喬治呼吸問卷(St George's Respiratory Questionnaire，SGRQ)總評分自基線降低，其中SGRQ係分成3個分量：症狀、活動及影響之健康相關生活品質問卷且總評分(加權總和)可介於0至100之間，其中較低評分表示較佳健康狀態；及高解析度電腦化斷層攝影術(HRCT)定量肺纖維化(QLF)評分自基線相對降低，其中QLF評分介於0%至100%之間且較大值代表較大量肺纖維化並視為較差健康狀態。纖維化治療之臨床終點及可經實施以量測該等臨床終點之測試之非限制性實例闡述於下列臨床試驗中：NCT03733444 (clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03733444) (最後一次訪問於2019年1月9日)、NCT00287729 (clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00287729) (最後一次訪問於2019年1月9日)、NCT00287716 (clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00287716) (最後一次訪問於2019年1月9日)、NCT02503657(clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02503657) (最後一次訪問於2019年1月9日)、NCT00047645 (clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00047645) (最後一次訪問於2019年1月9日)、NCT02802345 (clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02802345) (最後一次訪問於2019年1月9日)、NCT01979952 (clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01979952) (最後一次訪問於2019年1月9日)、NCT00650091 (clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00650091) (最後一次訪問於2019年1月9日)、NCT01335464 (clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01335464) (最後一次訪問於2019年1月9日)、NCT01335477 (clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01335477) (最後一次訪問於2019年1月9日)、NCT01366209 (clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01366209) (最後一次訪問於2019年1月9日)。纖維化治療之臨床終點及可經實施以量測該等臨床終點之測試之其他非限制性實例闡述於以下文獻中：King等人(2014) N Engl J Med. 5月29日；370(22):2083-92及Richeldi等人(2014) N Engl J Med. 5月29日；370(22):2071-82。

術語「有效量」或「治療有效量」係指產生特定生理學效應所需之藥劑或組合物之最小量(例如增加、活化或增強特定生理學效應所需之量)。特定藥劑之有效量或治療有效量可基於藥劑性質以各種方式來表示，例如質量/體積、細胞數/體積、顆粒/體積、(藥劑質量)/(個體質量)、細胞數/(個體質量)或顆粒/(個體質量)。特定藥劑之有效量或治療有效量亦可表示為半最大有效濃度(EC₅₀ )，其係指產生參考反差程度與最大反應程度之間之中間等級之特定生理學反應的藥劑濃度。

細胞「群體」係指大於1之任一數量細胞，但較佳係至少1×10³ 個細胞、至少1×10⁴ 個細胞、至少1×10⁵ 個細胞、至少1×10⁶ 個細胞、至少1×10⁷ 個細胞、至少1×10⁸ 個細胞、至少1×10⁹ 個細胞、至少1×10¹⁰ 個細胞或更多細胞。細胞群體可係指活體外群體(例如培養物中之細胞群體)或活體內群體(例如存在於特定組織中之細胞群體)。

本文所用之片語「醫藥上可接受」係指彼等在合理藥學判斷範圍內適於與人類及動物組織接觸使用且無過度毒性、刺激性、過敏反應或其他問題或併發症且與合理益處/風險比相稱之化合物、材料、組合物及/或劑型。

如本文中所使用，「醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑」包含(但不限於)已由美國食品藥物監督管理局(United States Food and Drug Administration)批准可接受用於人類及/或家養動物之任何佐劑、載劑、賦形劑、助流劑、甜味劑、稀釋劑、防腐劑、染料/著色劑、增味劑、表面活性劑、潤濕劑、分散劑、懸浮劑、穩定劑、等滲劑、溶劑、表面活性劑或乳化劑。

如本文中所使用，「載體」係指能夠將核酸分子轉移或轉運至細胞中之核酸分子以及病毒載體中之一或多種病毒蛋白(例如對於包膜病毒，病毒之衣殼)。經轉移核酸通常連接至(例如插入)載體核酸分子。載體可包含引導細胞中之自主複製或逆轉錄之序列，或可包含足以容許整合至宿主細胞DNA中之序列。「載體」包含基因療法載體。如本文中所使用，術語「基因療法載體」係指能夠用於實施基因療法(例如將編碼治療多肽之多核苷酸序列遞送至個體)之載體。基因療法載體可包括編碼蛋白質(例如γ-肌聚醣)之多核苷酸(「轉基因」)。

如本文中所使用，術語「表現盒」係指能夠在適當環境中驅動表現編碼納入該表現盒中之蛋白質(例如γ-肌聚醣)之多核苷酸(例如轉基因)之DNA區段。在引入宿主細胞中時，表現盒尤其能夠引導之細胞機器將轉基因轉錄至RNA中，然後通常進一步處理該轉基因且最後轉譯成治療活性多肽。基因療法載體可包括表現盒或基本上由其組成。術語表現盒不包含多核苷酸序列5’至5’ ITR及3’至3’ ITR。本文提供包括本發明rAAV載體或基本上由其組成或又另外由其組成之宿主細胞。細胞可為任一適當種類，例如哺乳動物細胞。

如本文中所使用，關於多核苷酸之片語「可操作地連接」或「在轉錄控制下」可互換地係指啟動子或肌肉特異性控制元件及多核苷酸經構形以使得多核苷酸能夠由能夠結合至啟動子之聚合酶轉錄。在一態樣中，肌肉特異性控制元件係用以限制肌肉表現。肌肉特異性控制元件之非限制性實例係人類骨骼肌動蛋白基因元件(基因庫登錄號NG_006672.1)、心肌動蛋白基因元件(基因庫登錄號NG_007553.1)、肌細胞特異性增強子結合因子MEF (基因庫登錄號NG_016443.2)、肌肉肌酸激酶(MCK) (基因庫登錄號AF188002.1)、tMCK (截短MCK)、肌球蛋白重鏈(MHC)、MHCK7 (MHC及MCK之雜合形式)、C5-12 (合成啟動子)、鼠類肌酸激酶增強子元件、骨骼快縮肌鈣蛋白C基因元件、慢縮心臟肌鈣蛋白C基因元件、慢縮肌鈣蛋白I基因元件、低氧可誘導核因子、類固醇可誘導元件或糖皮質激素反應元件(GRE)。

分子及細胞生物化學中之一般方法可參見諸如以下等標準教科書：Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第3版(Sambrook等人，HaRBor Laboratory Press 2001 )；Short Protocols in Molecular Biology，第4版(Ausubel等人編輯，John Wiley & Sons 1999)；Protein Methods (Bollag等人，John Wiley & Sons 1996)；Nonviral Vectors for Gene Therapy (Wagner等人編輯，Academic Press 1999)；Viral Vectors (Kaplift & Loewy編輯，Academic Press 1995)；Immunology Methods Manual (I. Lefkovits編輯，Academic Press 1997)；及Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology (Doyle & Griffiths, John Wiley & Sons 1998)，其揭示內容皆以引用方式併入本文中。

如本文中所使用，術語「AAV」係腺相關病毒之標準縮寫。腺相關病毒係單鏈DNA細小病毒，其僅生長於其中某些功能係由共感染輔助病毒提供之細胞中。AAV之一般資訊及綜述可例如參見Carter, 1989, Handbook of Parvoviruses，第1卷，pp. 169- 228及Berns, 1990, Virology, pp. 1743-1764, Raven Press, (New York)。完全可預計到，該等綜述中所闡述之相同原理將適用於在該等綜述之公開日期之後所描述之其他AAV血清型，此乃因眾所周知各種血清型在結構及功能上皆極為密切相關，即使在基因層面下。(例如參見Blacklowe, 1988，Parvoviruses and Human Disease, J. R. Pattison編輯，pp. 165-174；及Rose, Comprehensive Virology 3: 1-61 (1974))。舉例而言，所有AAV血清型皆明顯展現藉由同源rep基因調介之極類似之複製性質；且皆具有三種相關衣殼蛋白(例如表現於AAV2中者)。藉由以下各項來進一步證實相關程度：異源雙鏈體分析，其揭示各血清型之間沿基因體長度發生廣泛交叉雜交；及在末端存在對應於「反向末端重複序列」 (ITR)之類似自複性區段。類似感染性模式亦表明，每一血清型中之複製功能係在類似調控控制下。

本文所用之「AAV載體」係指包括一或多個側接有AAV末端重複序列(ITR)之所關注多核苷酸(或轉基因)之載體。在存在於經編碼且表現rep及cap基因產物之載體轉染之宿主細胞中時，該等AAV載體可複製且包裝至感染性病毒顆粒中。

「AAV病毒體」或「AAV病毒顆粒」或「AAV載體顆粒」係指由至少一種AAV衣殼蛋白及衣殼化多核苷酸AAV載體構成之病毒顆粒。若該顆粒包括異源性多核苷酸(亦即除野生型AAV基因體外之多核苷酸，例如擬遞送至哺乳動物細胞中之轉基因)，則其通常稱為「AAV載體顆粒」或簡稱為「AAV載體」。因此，AAV載體顆粒之產生需要包含AAV載體之產生，此乃因此一載體含於AAV載體顆粒內。

腺相關病毒(AAV)係複製缺陷型細小病毒，其單鏈DNA基因體約長4.7 kb，包含兩個145核苷酸反向末端重複(ITR)。存在多個AAV血清型。AAV血清型之基因體之核苷酸序列係已知的。舉例而言，AAV-1之完整基因體提供於基因庫登錄號NC_002077中； AAV-2之完整基因體提供於基因庫登錄號NC_001401及Srivastava等人，J. Virol., 45: 555-564 { 1983)中； AAV-3之完整基因體提供於基因庫登錄號NC_1829中； AAV-4之完整基因體提供於基因庫登錄號NC_001829中；AAV-5基因體提供於基因庫登錄號AF085716中； AAV-6之完整基因體提供於基因庫登錄號NC_00 1862中；AAV-7及AAV-8基因體之至少一部分分別提供於基因庫登錄號AX753246及AX753249中；AAV-9基因體提供於Gao等人，J. Virol., 78: 6381-6388 (2004)中；AAV-10基因體提供於Mol. Ther., 13(1): 67-76 (2006)中；且AAV-11基因體提供於Virology, 330(2): 375-383 (2004)中。AAV rh.74基因體之序列提供於美國專利9,434,928中，該專利以引用方式併入本文中。引導病毒DNA複製(rep)、衣殼化/包裝及宿主細胞染色體整合之順式作用序列含於AAV ITR內。三個AAV啟動子(根據其相對圖位置命名為p5、pl9及p40)驅動表現兩個編碼rep及cap基因之AAV內部開放讀取框。聯合單一AAV內含子之差異性剪接(在核苷酸2107及2227處)，兩個rep啟動子(p5及pi 9)使得自rep基因產生4種rep蛋白(rep 78、rep 68、rep 52及rep 40)。Rep蛋白擁有多種最終負責複製病毒基因體之酶促性質。cap基因係自p40啟動子表現且其編碼三種衣殼蛋白VP1、VP2及VP3。選擇式剪接及非一致轉譯起始位點負責三種相關衣殼蛋白之產生。單一共有多聚腺苷酸化位點位於AAV基因體之圖位置95。AAV之生命循環及基因學綜述於Muzyczka, Current Topics in Microbiology and Immunology, 158: 97-129 (1992)中。

AAV擁有使其(例如)在基因療法中作為向細胞遞送外來DNA之載體較有吸引力之獨特特徵。培養物中之細胞AAV感染係非細胞病變性，且人類及其他動物之天然感染係沉默性且無症狀。此外，AAV感染許多哺乳動物細胞，從而使得可靶向許多不同活體內組織。此外，AAV緩慢轉導分裂細胞及非分裂細胞，且可基本上在彼等細胞終生持續作為轉錄活性核游離基因體(染色體外元件)。將AAV前病毒基因體作為選殖DNA插入質體中，此使得可構築重組基因體。另外，因引導AAV複製及基因體衣殼化之信號含於AAV基因體之ITR內，故內部大約4.3 kb基因體(編碼複製及結構衣殼蛋白rep-cap)中之一些或全部可經外來DNA代替。為生成AAV載體，可以反式提供rep蛋白及cap蛋白。AAV之另一顯著特徵在於其係極其穩定及旺盛之病毒。其易於承受用於不活化腺病毒之條件(56℃至65℃數小時)，從而使得AAV之冷貯藏較不重要。可甚至凍乾AAV。最後，AAV感染細胞並不抵抗重複感染。

多個研究已證實肌肉中之重組AAV調介之長期(＞ 1.5年)蛋白質表現。參見Clark等人，Hum Gene Ther, 8: 659-669 (1997)；Kessler等人，Proc Nat. Acad Sc. USA, 93: 14082-14087 (1996)；及Xiao等人，J Virol, 70: 8098-8108 (1996)。亦參見Chao等人，Mol Ther, 2:619-623 (2000)及Chao等人，Mol Ther, 4:217-222 (2001)。此外，因肌肉高度血管化，故重組AAV轉導使得在肌內注射後於全身性循環中出現轉基因產物，如Herzog等人，Proc Natl Acad Sci USA, 94: 5804-5809 (1997)及Murphy等人，Proc Natl Acad Sci USA, 94: 13921- 13926 (1997)中所闡述。此外，Lewis等人，J Virol, 76: 8769-8775 (2002)證實，骨骼肌纖維擁有用於校正抗體醣基化、摺疊及分泌所需之細胞因子，從而指示肌肉能夠穩定表現所分泌蛋白質治療劑。本發明之重組AAV (rAAV)基因體包括編碼γ-肌聚醣之核酸分子(例如SEQ ID NO: 1)及一或多個側接於核酸分子之AAV ITR或基本上由其組成或又另外由其組成。rAAV基因體中之AAV DNA可來自可衍生重組病毒之任一AAV血清型，包含(但不限於) AAV血清型AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-11、AAV-12、AAV-13及AAV rh74。假型rAAV之產生揭示於(例如) WO 01/83692中。亦涵蓋其他類型之rAAV變體，例如具有衣殼突變之rAAV。例如參見Marsic等人，Molecular Therapy, 22(11): 1900-1909 (2014)。業內已知各種AAV血清型之基因體之核苷酸序列。為促進骨骼肌特異性表現，可使用AAV1、AAV5、AAV6、AAV8或AAV9。因此，在一態樣中，本文闡述包括在啟動子及/或肌肉特異性控制元件之轉錄控制下編碼γ-肌聚醣之多核苷酸序列或基本上由其組成之重組AAV載體。在一些實施例中，編碼γ-肌聚醣之多核苷酸序列包括(例如)與SEQ ID NO: 1 (參見表 1 )中所述密碼子最佳化人類γ-肌聚醣之核苷酸序列至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%或89%、更通常90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高程度一致之序列或基本上由其組成或又另外由其組成，且編碼保留γ-肌聚醣活性之蛋白質。在一些實施例中，編碼γ-肌聚醣之多核苷酸序列包括SEQ ID NO: 1中所述之核苷酸序列或(例如)與SEQ ID NO. 1至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%或89%、更通常90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%一致且編碼保留γ-肌聚醣活性之蛋白質之序列。

術語「序列一致性」係指兩個多核苷酸或多肽序列之間鹼基或胺基酸相同且在相同相對位置之百分比。因此，一個多核苷酸或多肽序列與另一多核苷酸或多肽序列相比具有某一序列一致性百分比。就序列對比而言，一個序列通常將作為參考序列與測試序列進行比較。術語「參考序列」係指與測試序列進行比較之分子。多核苷酸或多核苷酸區域(或多肽或多肽區域)與參考序列具有某一百分比(例如60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%)之「序列一致性」意指，在比對時，測試序列中每一位置之該百分比之鹼基(或胺基酸)與參考序列中相同位置之鹼基(或胺基酸)一致。此比對及同源性或序列一致性百分比可使用業內已知之軟體程式(例如闡述於Ausubel等人編輯，(2007) Current Protocols in Molecular Biology中者)來測定。較佳地，使用預設參數進行比對。一種比對程式係使用預設參數之BLAST。特定而言，程式係BLASTN及BLASTP，使用下列預設參數：基因代碼=標準；篩選=無；鏈=兩條；截止值= 60；預期= 10；矩陣= BLOSUM62；說明=50個序列；分類依據=高評分；資料庫=非冗餘，基因庫+ EMBL + DDBJ + PDB +基因庫CDS轉譯+ SwissProtein + SPupdate + PIR。該等程式之細節可參見網際網路網址：ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi。多肽或蛋白質之「等效物」係與該參考多肽或蛋白質具有一定序列一致性(例如與參考具有60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%一致性)且與參考多肽或蛋白質相比保留類似活性或功能者。

「包括(comprising或comprises)」欲指組合物(例如介質)及方法包含所列舉元素，但不排除其他元素。在使用「基本上由……組成」來定義組合物及方法時，其應意指出於所述目的排除對組合有任何實質意義之其他元素。因此，基本上由如本文所定義元素組成之組合物將不排除實質上不影響所主張發明之基本及新穎特性之其他材料或步驟。「由……組成」應意指排除超過痕量元素之其他成分及實質方法步驟。該等過渡術語中之每一者定義之實施例皆在本發明範圍內。

在一態樣中，本發明rAAV載體之基因表現盒側接有一或多個AAV反向末端重複。在另一態樣中，rAAV載體之編碼γ-肌聚醣之多核苷酸序列包括與SEQ ID NO: 1及/或SEQ ID NO: 1中所述之核苷酸序列至少95%一致之核苷酸序列，或基本上由其組成，或另外由其組成，且編碼保留γ-肌聚醣活性之蛋白質。在另一態樣中，rAAV載體之編碼γ-肌聚醣之多核苷酸序列編碼與SEQ ID NO: 2至少95%一致、至少99%一致或100%一致之胺基酸序列且編碼保留γ-肌聚醣活性之蛋白質。

在一些實施例中，本文所揭示之rAAV載體為血清型AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13或AAV rh74。在其他實施例中，rAAV載體之基因體包括肌肉特異性控制元件，或基本上由其組成，且其中肌肉特異性控制元件可操作地連接至多核苷酸序列。肌肉特異性控制元件之非限制性實例係人類骨骼肌動蛋白基因元件、心肌動蛋白基因元件、肌細胞特異性增強子結合因子mef、肌肉肌酸激酶(MCK)、截短MCK (tMCK)、肌球蛋白重鏈(MHC)、MHCK7、C5-12、鼠類肌酸激酶增強子元件、骨骼快縮肌鈣蛋白c基因元件、慢縮心臟肌鈣蛋白c基因元件、慢縮肌鈣蛋白I基因元件、低氧可誘導核因子、類固醇可誘導元件及糖皮質激素反應元件(gre)。在一態樣中，rAAV載體之肌肉特異性控制元件係截短MCK (tMCK)。在另一態樣中，rAAV載體之啟動子及/或肌肉特異性控制元件係MHCK7啟動子。在另一態樣中，MHCK啟動子包括SEQ ID NO: 3中所述之核苷酸序列或其等效物，或基本上由其組成，或另外由其組成，且提供啟動子功能。在一個實施例中，本文所揭示 rAAV載體之基因體包括含有SEQ ID NO: 5中所述之核苷酸序列之內含子，或基本上由其組成，或另外由其組成。

在一些實施例中，編碼γ-肌聚醣之多核苷酸序列由SEQ ID NO: 1中所述之核苷酸序列或與SEQ ID NO: 1具有至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%或89%、更通常至少90%、91%、92%、93%或94%及甚至更通常至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之編碼γ-肌聚醣之多核苷酸序列組成，且保留γ-肌聚醣活性。

在另一態樣中，本文所闡述之重組AAV載體包括與SEQ ID NO: 2 (參見表 1 )中所述人類γ-肌聚醣之胺基酸序列具有至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%或89%、更通常至少90%、91%、92%、93%或94%及甚至更通常至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之編碼γ-肌聚醣的多核苷酸序列或基本上由其組成，且該蛋白質保留γ-肌聚醣活性。表 1 ：蛋白質及核苷酸序列之非限制性實例

在另一態樣中，本文闡述重組AAV載體，其包括編碼功能 γ-肌聚醣且包括在嚴格條件下雜交至SEQ ID NO: 1之核酸序列或其補體之核苷酸序列或基本上由其組成或又另外由其組成之多核苷酸序列。功能γ-肌聚醣意欲係保留γ-肌聚醣活性之γ-肌聚醣多肽。γ-肌聚醣活性對於肌肉功能至關重要。γ-肌聚醣係若干與肌肉萎縮蛋白相互作用並形成肌肉萎縮蛋白-醣蛋白複合物之肌膜跨膜醣蛋白之一，該肌肉萎縮蛋白-醣蛋白複合物跨越肌膜且包括肌肉萎縮蛋白、互養蛋白、α-營養不良聚醣及β-營養不良聚醣及肌聚醣(包含γ-肌聚醣)。肌肉萎縮蛋白-醣蛋白複合物在肌膜下細胞骨架與肌細胞之細胞外基質之間提供結構連接。肌細胞之非限制性實例包含心臟、橫膈膜、腿、骨盆帶、肩及手臂之肌細胞。γ-肌聚醣活性及γ-肌聚醣病之後果之其他非限制性實例闡述於Blake等人(2002) Physiol Rev.; 82(2):291-329及Tarakci等人(2016) Front Biosci (Landmark Ed);21:744-56中。

術語「嚴格」用於係指通常在業內理解為嚴格之條件。雜交嚴格度係藉由溫度、離子強度及變性劑(例如甲醯胺)之濃度來確定。雜交及洗滌之嚴格條件之實例係在65-68℃下使用0.015 M氯化鈉、0.0015 M檸檬酸鈉或在42℃下0.015 M氯化鈉、0.0015M檸檬酸鈉及50%甲醯胺。參見Sambrook等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory, (Cold Spring Harbor, N.Y. 1989)。亦可使用更嚴格條件(例如較高溫度、較低離子強度、較高甲醯胺或其他變性劑)，然而，雜交速率將受到影響。在其中設計去氧寡核苷酸之雜交之情況下，其他實例性嚴格雜交條件包含在37℃(對於14-鹼基寡聚物)、48℃ (對於17-鹼基寡聚物)、55℃ (對於20-鹼基寡聚物)及60℃ (對於23-鹼基寡聚物)下於6× SSC/0.05%焦磷酸鈉中進行洗滌。

可在雜交中包含其他試劑及洗滌緩衝液以用於減小非特異性及/或背景雜交之目的。實例係0.1%牛血清白蛋白、0.1%聚乙烯基-吡咯啶酮、0.1%焦磷酸鈉、0.1%十二烷基硫酸鈉(NaDodS04、SDS)、蔗聚糖、鄧哈特溶液(Denhardt's solution)、經超音波處理之鮭魚精DNA (或其他非互補DNA)及硫酸右旋糖酐，但亦可使用其他適宜試劑。可改變該等添加劑之濃度及類型且並不實質上影響雜交條件之嚴格度。雜交實驗通常係在pH 6.8-7.4下實施，然而，在典型離子強度條件下，雜交速率幾乎獨立於pH。參見Anderson等人，Nucleic Acid Hybridisation: A Practical Approach, Ch. 4, IRL Press Limited (Oxford, England)。可由熟習此項技術者調節雜交條件以適應該等變量且容許具有不同序列相關性之DNA形成雜合體。

在另一態樣中，本文所闡述之重組AAV載體可包括可操作地連接至啟動子及/或肌肉特異性控制元件之編碼γ-肌聚醣之多核苷酸序列或基本上由其組成或又另外由其組成。舉例而言，肌肉特異性控制元件係人類骨骼肌動蛋白基因元件、心肌動蛋白基因元件、肌細胞特異性增強子結合因子MEF、肌肉肌酸激酶(MCK)、tMCK (截短MCK)、肌球蛋白重鏈(MHC)、MHCK7 (MHC及MCK之雜合形式)、C5-12 (合成啟動子)、鼠類肌酸激酶增強子元件、骨骼快縮肌鈣蛋白C基因元件、慢縮心臟肌鈣蛋白C基因元件、慢縮肌鈣蛋白I基因元件、低於可誘導核因子、類固醇可誘導元件或糖皮質激素反應元件(GRE)。在一實施例中，rAAV載體包括MHCK7啟動子(SEQ ID NO: 4)。

本文所闡述之一實例性rAAV載體係pAAV.MHCK7.hSCGC，其包括SEQ ID NO: 3之核苷酸序列；其中MCHK7啟動子跨越核苷酸136-927 (SEQ ID NO: 4)，內含子跨越核苷酸937-1084 (SEQ ID NO: 5)，γ-肌聚醣序列跨越核苷酸1094-1969 (SEQ ID NO: 1)且聚A跨越核苷酸1976-2028 (SEQ ID NO: 6)。參見圖 1 。在一些情形下，包含於rAAV載體中之唯一病毒序列係病毒DNA複製及包裝所需之反向末端重複。在一些情形下，跨越核苷酸7-116之內含子(SEQ ID NO: 5)及跨越核苷酸2128-2231之5’ UTR (SEQ ID NO: 7)係衍生自質體pCMVβ (Clontech)。在某些情形下，3’ UTR包括SEQ ID NO: 8中所述之序列。在某些情形下，pAAV.MHCK7.hSCGC包裝於AAV rh.74衣殼中。

本發明DNA質體包括rAAV基因體。將DNA質體轉移至允許感染AAV輔助病毒(例如腺病毒、El缺失性腺病毒或疱疹病毒)之細胞中以用於將rAAV基因體組裝成感染性病毒顆粒。產生rAAV顆粒之技術係業內標準技術，其中向細胞中提供擬包裝AAV基因體、rep及cap基因及輔助病毒功能物。rAAV之產生需要下列組分存在於單一細胞(在本文中表示為包裝細胞)內：rAAV基因體、與rAAV基因體分離(亦即不在其中)之AAV rep及cap基因及輔助病毒功能物。AAV rep及cap基因可來自任一可衍生重組病毒之AAV血清型且可來自不同於rAAV基因體ITR之AAV血清型(包含(但不限於) AAV血清型AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-11、AAV-12、AAV-13及AAV rh.74)。在一些實施例中，rAAV載體包括AAV2之反向末端重複(ITR)序列。假型rAAV之產生揭示於(例如) WO 01/83692中，該案件之全部內容以引用方式併入本文中。在某些態樣中，rAAV載體包括AAV2之反向ITR序列且衣殼化於AAV rh.74之衣殼中。在某些情形下，rAAV載體之基因體包括SEQ ID NO: 11中所述之多核苷酸序列。在某些情形下，AAV rh.74衣殼包括SEQ ID NO: 10中所述之胺基酸序列。在一些實施例中，rAAV載體包括含有(例如)與SEQ ID NO: 11中所述之核苷酸序列至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%或89%、更通常90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高程度一致之序列或基本上由其組成或又另外由其組成之多核苷酸，且編碼rAAV之衣殼蛋白VP1、VP2及VP3。在一些實施例中，rAAV載體包括含有(例如)與SEQ ID NO: 10中所述AAV rh.74 VP3之胺基酸序列至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%或89%、更通常90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高程度一致之序列或基本上由其組成或又另外由其組成之多肽。

生成包裝細胞系之方法係產生穩定表現用於AAV顆粒產生之所有需要組分之細胞系。舉例而言，將包括缺乏AAV rep及cap基因之rAAV基因體之質體(或多個質體)、與rAAV基因體分離之AAV rep及cap基因及可選標記物(例如新黴素(neomycin)抗性基因)整合至細胞基因體中。已藉由諸如以下等程序將AAV基因體引入細菌質體中：GC加尾(Samulski等人，1982, Proc. Natl. Acad. S6. USA, 79:2077-2081)、添加含有限制性內核酸酶裂解位點之合成連接體(Laughlin等人，1983, Gene, 23:65-73)或直接、鈍端連接(Senapathy & Carter, 1984, J. Biol. Chem., 259:4661-4666)。然後使用輔助病毒(例如腺病毒)感染包裝細胞系。此方法之優點在於，細胞係可選的且適於大規模產生rAAV。適宜方法之其他實例採用腺病毒或桿狀病毒而非質體來將rAAV基因體及/或rep及cap基因引入包裝細胞中。在某些情形下，rAAV載體之基因體包括SEQ ID NO: 11中所述之多核苷酸序列。在某些情形下，AAV rh.74衣殼包括SEQ ID NO: 10中所述之胺基酸序列。在一些實施例中，rAAV載體包括含有(例如)與SEQ ID NO: 11中所述之核苷酸序列至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%或89%、更通常90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高程度一致之序列或基本上由其組成或又另外由其組成之多核苷酸，且編碼rAAV之衣殼蛋白VP1、VP2及VP3。在一些實施例中，rAAV載體包括含有(例如)與SEQ ID NO: 10中所述AAV rh.74 VP3之胺基酸序列至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%或89%、更通常90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高程度一致之序列或基本上由其組成或又另外由其組成之多肽。

rAAV產生之一般原理綜述於(例如)以下文獻中：Carter, 1992, Current Opinions in Biotechnology, 1533-539；及Muzyczka, 1992, Curr. Topics in Microbial, and Immunol., 158:97-129)。各種方式闡述於以下文獻中：Ratschin等人，Mol. Cell. Biol. 4:2072 (1984)；Hermonat等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6466 (1984)；Tratschin等人，Mol. Cell. Biol. 5:3251 (1985)；McLaughlin等人，J. Virol., 62: 1963 (1988)；及Lebkowski等人，1988 Mol. Cell. Biol., 7:349 (1988)。Samulski等人(1989, J. Virol., 63:3822-3828)；美國專利第5,173,414號；WO 95/13365及相應美國專利第5,658.776號；WO 95/13392；WO 96/17947；PCT/US98/18600；WO 97/09441 (PCT/US96/14423)；WO 97/08298 (PCT/US96/13872)；WO 97/21825 (PCT/US96/20777)；WO 97/06243 (PCT/FR96/01064)；WO 99/11764；Perrin等人(1995) Vaccine 13: 1244-1250；Paul等人(1993) Human Gene Therapy 4:609-615；Clark等人(1996) Gene Therapy 3: 1124-1132；美國專利第5,786,211號；美國專利第5,871,982號；及美國專利第6,258,595號。前述文件之全部內容以引用方式併入本文中，尤其強調關於rAAV產生之彼等文件部分。

本發明由此提供產生感染性rAAV之包裝細胞。在一實施例中，包裝細胞可為穩定轉變之癌細胞，例如HeLa細胞、293細胞及PerC.6細胞(同族293細胞系)。在另一實施例中，包裝細胞係並非經轉變癌細胞之細胞，例如低傳代293細胞(經腺病毒El轉變之人類胎兒腎細胞)、MRC-5細胞(人類胎兒纖維母細胞)、WI-38細胞(人類胎兒纖維母細胞)、Vero細胞(猴腎細胞)及FRhL-2細胞(恒河猴胎兒肺細胞)。

本發明之重組AAV (亦即感染性衣殼化rAAV顆粒)包括rAAV基因體。實施例包含(但不限於)命名為pAAV.MHCK7.hSCGC之rAAV，其包括SEQ ID NO: 3中所述之多核苷酸序列。

可藉由業內標準方法(例如藉由管柱層析或氯化銫梯度)來純化rAAV。業內已知自輔助病毒純化rAAV載體之方法且包含揭示於(例如)以下文獻中之方法：Clark等人，Hum. Gene Ther., 10(6): 1031-1039 (1999)；Schenpp及Clark, Methods Mol. Med., 69 427- 443 (2002)；美國專利第6,566,118號及WO 98/09657。

在另一實施例中，本發明涵蓋包括本發明rAAV或基本上由其組成之組合物。本文所闡述之組合物包括於醫藥上可接受之載劑中之rAAV或基本上由其組成。在一特定實施例中，本發明組合物包括乳酸化林格氏溶液(Lactated Ringer’s Solution，LRS)或基本上由其組成。該等組合物亦可包括其他成分，例如稀釋劑及佐劑。可接受之載劑、稀釋劑及佐劑對接受者無毒且較佳地在所採用劑量及濃度下為惰性，且包含緩衝劑，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽或其他有機酸；抗氧化劑，例如抗壞血酸；低分子量多肽；蛋白質，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，例如聚乙烯基吡咯啶酮；胺基酸，例如甘胺酸、麩醯胺酸、天門冬醯胺、精胺酸或離胺酸；單醣、二醣及其他碳水化合物，包含葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，例如EDTA；糖醇，例如甘露醇或山梨醇；成鹽相對離子，例如鈉離子；及/或非離子型表面活性劑，例如Tween、普流尼克(pluronic)或聚乙二醇(PEG)。所揭示組合物可在患有肌肉失養症之個體中用於以下用途中之一或多者：治療γ-肌聚醣病；增加肌力、肌耐力及/或肌肉質量；減少纖維化；減少收縮誘導性損傷；降低脂肪浸潤；及/或降低有需要之個體中之中心成核；及/或治療肌肉失養症；減少退化纖維或壞死纖維；減少發炎；升高肌酸激酶含量；治療肌纖維萎縮及肥大；及/或降低失養型鈣化。

本發明方法中之擬投與rAAV之效價將端視(例如)特定rAAV、投與模式、治療目標、個體及所靶向細胞類型而有所變化，且可藉由業內標準方法來測定。rAAV之效價範圍可為約1×10⁶ 、約1×10⁷ 、約1×10⁸ 、約1×10⁹ 、約1×10¹⁰ 、約1×10¹¹ 、約1×10¹² 、約1×10¹³ 至約1×10¹⁴ 或更多個DNase抗性顆粒(DRP)/ml。劑量亦可以單位病毒基因體(vg)來表示。

本發明涵蓋使用rAAV在活體內或在活體外轉導靶細胞之方法。術語「轉導」用於係指在活體內或在活體外經由所闡述複製缺陷型rAAV將所關注多核苷酸(例如編碼γ-肌聚醣之多核苷酸序列)投與/遞送至接受細胞，從而使得藉由接受細胞表現γ-肌聚醣。

在一態樣中，本文提供在患有肌肉失養症之個體中用於以下用途中之一或多者之方法：治療γ-肌聚醣病；增加肌力、肌耐力及/或肌肉質量；減少纖維化；減少收縮誘導性損傷；降低脂肪浸潤；及/或降低有需要之個體中之中心成核；及/或治療肌肉失養症；減少退化纖維或壞死纖維；減少發炎；升高肌酸激酶含量；治療肌纖維萎縮及肥大；及/或降低失養型鈣化，其包括向個體投與治療有效量之重組腺相關病毒(AAV)載體或基本上由其組成或又另外由其組成，其中rAAV載體包括基因表現盒或基本上由其組成或又另外由其組成，該基因表現盒包括在啟動子之轉錄控制下編碼γ-肌聚醣之多核苷酸序列或基本上由其組成或又另外由其組成，該盒側接有一或多個AAV反向末端重複。在一些實施例中，該啟動子係肌肉特異性控制元件。在一實施例中，本文所揭示之方法可增加個體之一或多種肌肉之肌力、肌耐力及/或肌肉質量。肌肉之非限制性實例包含心臟、橫膈膜、大腿、小腿、骨盆帶、肩及手臂之肌肉。在一具體實施例中，與未治療對照個體相比，肌力、肌耐力及/或肌肉質量增加至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約50%或至少約80%。

在一特定態樣中，個體患有肢帶型肌肉失養症。在另一態樣中，個體患有肢帶型肌肉失養症(肢帶型肌肉失養症2C型)。

在提及向個體遞送多核苷酸時，術語「投與(administering」或「administration)」包含向個體引入或遞送多核苷酸以實施預期功能之任一途徑。可藉由任一適宜途徑實施投與，包含經口、經鼻內、非經腸(經靜脈內、經肌內、經腹膜腔內或經皮下)、經顱內或經局部。其他投與途徑包含眶內、輸注、動脈內、莢膜內、心臟內、真皮內、肺內、脊柱內、胸骨內、鞘內、子宮內、靜脈內、蛛網膜下、囊下、皮下、經黏膜或經氣管。投與包含自投與及藉由另一人投與。

在一態樣中，本文所揭示之方法包括投與包括rAAV載體及醫藥上可接受之載劑或基本上由其組成或又另外由其組成之組合物或基本上由其組成或又另外由其組成。在另一態樣中，本文所揭示之方法包括藉由肌內注射或靜脈內注射投與rAAV載體或包括rAAV載體及醫藥上可接受之載劑或基本上由其組成或又另外由其組成之組合物或基本上由其組成或又另外由其組成。在又一態樣中，本文所揭示之方法包括全身性投與rAAV載體或包括rAAV載體及醫藥上可接受之載劑或基本上由其組成或又另外由其組成之組合物或基本上由其組成或又另外由其組成。在一特定態樣中，本文所揭示之方法包括藉由注射、輸注或植入非經腸投與rAAV載體或包括rAAV載體及醫藥上可接受之載劑或基本上由其組成或又另外由其組成之組合物或基本上由其組成或又另外由其組成。

在一態樣中，用於本文所闡述方法中之rAAV載體之編碼γ-肌聚醣之多核苷酸序列包括SEQ ID NO: 1中所述之核苷酸序列或基本上由其組成或又另外由其組成。在另一態樣中，rAAV載體之編碼γ-肌聚醣之多核苷酸序列編碼SEQ ID NO: 2之胺基酸序列。在又一態樣中，本文所揭示之方法中所使用之rAAV載體包括自我互補性AAV載體基因體或基本上由其組成或又另外由其組成。在一特定實施例中，rAAV載體包括缺乏AAV rep及cap DNA之基因體或基本上由其組成或又另外由其組成。在另一實施例中，rAAV載體具有血清型AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13或AAV rh74。在另一態樣中，rAAV載體具有血清型AAV rh74且rAAV載體包括AAV rh.74衣殼或基本上由其組成或又另外由其組成。在又一態樣中，rAAV載體之AAV rh.74衣殼包括SEQ ID NO: 10中所述之胺基酸序列或其等效物或基本上由其組成或又另外由其組成。

本文所揭示之方法中所使用之rAAV載體可進一步包括啟動子及/或肌肉特異性控制元件或基本上由其組成且其中肌肉特異性控制元件操作性連接至編碼γ-肌聚醣之多核苷酸。一些肌肉特異性控制元件之非限制性實例係人類骨骼肌動蛋白基因元件、心肌動蛋白基因元件、肌細胞特異性增強子結合因子mef、肌肉肌酸激酶(MCK)、截短MCK (tMCK)、肌球蛋白重鏈(MHC)、MHCK7、C5-12、鼠類肌酸激酶增強子元件、骨骼快縮肌鈣蛋白c基因元件、慢縮心臟肌鈣蛋白c基因元件、慢縮肌鈣蛋白I基因元件、低氧可誘導核因子、類固醇可誘導元件及糖皮質激素反應元件(gre)。在一態樣中，rAAV載體之肌肉特異性控制元件係截短MCK (tMCK)。在另一態樣中，rAAV載體之啟動子及/或肌肉特異性控制元件係MHCK7啟動子。在另一態樣中，MHCK啟動子包括SEQ ID NO: 3中所述之核苷酸序列或其等效物或基本上由其組成或又另外由其組成。

在一實施例中，本文所揭示rAAV載體之基因體包括含有SEQ ID NO: 5中所述之核苷酸序列之內含子。

活體內方法包括向有需要之動物(包含人類)投與有效劑量或多個有效劑量之包括本發明rAAV或基本上由其組成或又另外由其組成之組合物的步驟或基本上由其組成或又另外由其組成。若在發生病症/疾病之前投與劑量，則該投與係預防性。若在發生病症/疾病之後投與劑量，則該投與係治療性。在本發明實施例中，有效劑量係達成以下效應之劑量：緩解(消除或減少)至少一種與所治療病症/疾病狀態有關之症狀，減緩或預防病症/疾病狀態之進展，減緩或預防病症/疾病狀態之進展，減弱疾病程度，緩解(部分或完全)疾病，及/或延長存活。意欲使用本發明方法預防或治療之一疾病實例係肌肉失養症，例如肢帶型肌肉失養症。在一些實施例中，意欲使用本發明方法預防或治療之疾病係肢帶型肌肉失養症2C型(LGMD2C)。

本文所用之術語「肌肉失養症」係指其中強度及肌肉體積逐漸降低之病症。肌肉失養症疾病之非限制性實例可包含貝克肌肉失養症(Becker muscular dystrophy)、脛骨肌肉失養症、迪謝內肌肉失養症(Duchenne muscular dystrophy)、埃-德二氏肌肉失養症(Emery-Dreifuss muscular dystrophy)、面肩胛臂肌肉失養症、肌聚醣病、先天性肌肉失養症(例如由部分LAMA2缺陷所致之先天性肌肉失養症、分層蛋白缺陷型先天性肌肉失養症、ID型先天性肌肉失養症、福山型先天性肌肉失養症(Fukuyama congenital muscular dystrophy))、肢帶型1A型肌肉失養症、肢帶型2A型肌肉失養症、肢帶型2B型肌肉失養症、肢帶型2C型肌肉失養症、肢帶型2D型肌肉失養症、肢帶型2E型肌肉失養症、肢帶型2F型肌肉失養症、肢帶型2G型肌肉失養症、肢帶型2H型肌肉失養症、肢帶型21型肌肉失養症、肢帶型21型肌肉失養症、肢帶型2J型肌肉失養症、肢帶型2K型肌肉失養症、肢帶型IC型肌肉失養症、強直性脊柱肌肉失養症伴單純大皰性表皮松解、眼咽肌肉失養症、烏爾裡希先天性肌肉失養症(Ullrich congenital muscular dystrophy)及烏爾裡希無張力性硬化性肌肉失養症(Ullrich scleroatonic muscular dystrophy)。在一些實施例中，個體患有肢帶型肌肉失養症。在一些實施例中，個體患有肢帶型肌肉失養症2C型(LGMD2C)。

存在至少19種形式之LGMD，且該等係藉由其相關基因缺陷進行分類。

在一些態樣中，本發明係關於治療個體之肌肉失養症(例如LGMD2C)之方法，該方法包括向個體投與治療有效量之如本文所闡述編碼γ-肌聚醣之rAAV載體或包括此一rAAV載體或基本上由其組成之組合物或基本上由其組成或又另外由其組成。

在一些實施例中，本發明提供增加患有肌肉失養症(例如LGMD2C)之個體之肌力、肌耐力及/或肌肉質量之方法，該方法包括向個體投與治療有效量之如本文所闡述編碼γ-肌聚醣之rAAV載體或包括此一rAAV載體或基本上由其組成之組合物或基本上由其組成或又另外由其組成。

在某些態樣中，本發明涵蓋減少患有肌肉失養症(例如LGMD2C)之個體之收縮誘導性損傷之方法，該方法包括向個體投與治療有效量之如本文所闡述編碼γ-肌聚醣之rAAV載體或包括此一rAAV載體或基本上由其組成之組合物或基本上由其組成或又另外由其組成。

在某些態樣中，本發明涵蓋治療個體之γ-肌聚醣病之方法，該方法包括向個體投與治療有效量之如本文所闡述編碼γ-肌聚醣之rAAV載體或包括此一rAAV載體或基本上由其組成之組合物或基本上由其組成或又另外由其組成。

本發明亦涵蓋減少患有肌肉失養症(例如LGMD2C)之個體之纖維化之方法，該方法包括向個體投與治療有效量之如本文所闡述編碼γ-肌聚醣之rAAV載體或包括此一rAAV載體或基本上由其組成之組合物或基本上由其組成或又另外由其組成。本文所用之術語「纖維化」係指細胞外基質(ECM)組分之過度或失調沈積及損傷組織(包含骨骼肌、心肌、肝、肺、腎及胰臟)之異常修復過程。所沈積ECM組分包含膠原(例如膠原1、膠原2或膠原3)及纖連蛋白。

在某些實施例中，藉由本文所闡述之方法治療之個體可為哺乳動物。在一些情形下，個體係人類、非人類靈長類動物、豬、馬、牛、狗、貓、兔、小鼠或大鼠。個體可為女人或男人。在一些情形下，個體係年齡介於1-7、7-15、16-25、26-50、50-70歲之間或大於70歲之人類個體。涵蓋其他年齡範圍且包含(但不限於) 5-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-40、40-50、60-70歲或大於70歲之年齡以及由前述範圍包括之任一範圍。

如本文中所使用，術語「有需要之患者」或「有需要之個體」係指具有以下特徵之患者或個體：處於適於使用包括編碼γ-肌聚醣之核酸序列之rAAV或包括本文所提供此一rAAV或基本上由其組成之組合物治療或改善之疾病、病症或病狀的風險下，或患有該疾病、病症或病狀。有需要之患者或個體可(例如)為經診斷患有與γ-肌聚醣故障有關之疾病(例如LGMD2C)之患者或個體。個體可具有γ-肌聚醣基因或蛋白質之突變或故障。「個體」及「患者」可在本文中互換使用。

本發明亦涵蓋組合療法，其包括本文所揭示之一或多種組合物及皮質類固醇或基本上由其組成或又另外由其組成。本文所用之組合包含同時治療或依序治療。特定涵蓋本發明方法與標準醫學治療(例如皮質類固醇)之組合，如與新穎療法之組合。在一些實施例中，可使用類固醇(例如普賴松(prednisone)、普賴蘇濃(prednisolone)、地夫可特(deflazacort))治療個體以預防或減小投與本文所闡述之rAAV之免疫反應。在某些情形下，若個體表現關於本文所闡述之rAAV之抗體，則個體可接受血球分離或另一免疫調節劑。

在一些實施例中，rAAV載體之治療有效量係在一或多個投與中於以下範圍內之rAAV劑量：約1e13 vg/kg至約5e14 vg/kg或約1e13 vg/kg至約2e13 vg/kg或約1e13 vg/kg至約3e13 vg/kg或約1e13 vg/kg至約4e13 vg/kg或約1e13 vg/kg至約5e13 vg/kg或約1e13 vg/kg至約6e13 vg/kg或約1e13 vg/kg至約7e13 vg/kg或約1e13 vg/kg至約8e13 vg/kg或約1e13 vg/kg至約9e13 vg/kg或約1e13 vg/kg至約1e14 vg/kg或約1e13 vg/kg至約2e14 vg/kg或1ei 3 vg/kg至約3e14 vg/kg或約1x13至約4e14 vg/kg或約3e13 vg/kg至約4e13 vg/kg或約3e13 vg/kg至約5e13 vg/kg或約3e13 vg/kg至約6e13 vg/kg或約3e13 vg/kg至約7e13 vg/kg或約3e13 vg/kg至約8e13 vg/kg或約3e13 vg/kg至約9e13 vg/kg或約3e13 vg/kg至約1e14 vg/kg或約3e13 vg/kg至約2e14 vg/kg或3e13 vg/kg至約3e14 vg/kg或約3e13至約4e14 vg/kg或約3e13 vg/kg至約5e14 vg/kg或約5e13 vg/kg至約6e13 vg/kg或約5e13 vg/kg至約7e13 vg/kg或約5e13 vg/kg至約8e13 vg/kg或約5e13 vg/kg至約9e13 vg/kg或約5e13 vg/kg至約1e14 vg/kg或約5e13 vg/kg至約2e14 vg/kg或5e13 vg/kg至約3e14 vg/kg或約5e13至約4e14 vg/kg或約5e13 vg/kg至約5e14 vg/kg或約1e14 vg/kg至約2e14 vg/kg或1e14 vg/kg至約3e14 vg/kg或約1e14至約4e14 vg/kg或約1e14 vg/kg至約5e14 vg/kg。本發明亦包括含有該等範圍之rAAV載體或基本上由其組成或又另外由其組成之組合物或基本上由其組成或又另外由其組成。

舉例而言，rAAV載體之治療有效量係1e13 vg/kg、約2e13 vg/kg、約3e13 vg/kg、約4e13 vg/kg、約5e13 vg/kg、約6e13 vg/kg、約7e13 vg/kg、約8e13 vg/kg、約9e13 vg/kg、約1e14 vg/kg、約2e14 vg/kg、約3e14 vg/kg、約4e14 vg/kg及5e14 vg/kg之劑量。本發明亦包括含有該等劑量之rAAV載體或基本上由其組成或又另外由其組成之組合物或基本上由其組成或又另外由其組成。

在一些實施例中，rAAV之治療有效量係介於約1e14 vg/kg至約1e15 vg/kg或約1e15 vg/kg至約1e16 vg/kg之間之rAAV劑量。在一些實施例中，本發明提供以以下劑量向個體投與本發明rAAV載體之方法：約1e14 vg/kg、約1.5e14 vg/kg、約2e14 vg/kg、約2.5e14 vg/kg、約3e14 vg/kg、約3.5e14 vg/kg、約4e14 vg/kg、約4.5e14 vg/kg、約5e14 vg/kg、約5.5e14 vg/kg、約6e14 vg/kg、約6.5e14 vg/kg、約7e14 vg/kg、約7.5e14 vg/kg、約8e14 vg/kg、約8.5e14 vg/kg¸約9e14 vg/kg、約9.5e14 vg/kg、約1e15 vg/kg、約1.5e15 vg/kg、約2e15 vg/kg、約2.5e15 vg/kg、約3e15 vg/kg、約3.5e15 vg/kg、約4e15 vg/kg、約4.5e15 vg/kg或約5e15 vg/kg。在一些實施例中，本發明提供以以下總劑量向個體投與本發明rAAV載體之方法：約4.0e14 vg/kg、約4.1e14 vg/kg、約4.2e14 vg/kg、約4.3e14 vg/kg、約4.4e14 vg/kg、約4.5e14 vg/kg、約4.6e14 vg/kg、約4.7e14 vg/kg、約4.8e14 vg/kg、約4.9e14 vg/kg、約5.0e14 vg/kg、約5.1e14 vg/kg、約5.2e14 vg/kg、約5.3e14 vg/kg、約5.4e14 vg/kg、約5.5e14 vg/kg、約5.6e14 vg/kg、約5.7e14 vg/kg、約5.8e14 vg/kg、約5.9e14 vg/kg或約6e14 vg/kg。

在各個實施例中，投與步驟可包括以1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個分開劑量來投與總劑量。舉例而言，可藉由注射至個體上之多個部位或間隔數分鐘、數小時或數天注射至個體來遞送總劑量。

可藉由業內標準途徑來投與有效劑量之組合物，包含(但不限於)肌內、非經腸、靜脈內、口服、經頰、鼻、肺、顱內、骨內、眼內、直腸或陰道途徑。可由熟習此項技術者考慮到所治療感染及/或疾病狀態及擬表現γ-肌聚醣之靶細胞/組織來選擇及/或匹配投與途徑及本發明rAAV之AAV組分(特定而言，AAV ITR及衣殼蛋白)之血清型。

本發明局部投與及全身性投與有效劑量之本發明之rAAV及組合物。舉例而言，全身性投與係投與至循環系統中，從而整個身體皆受到影響。全身性投與包含經腸投與(例如經由胃腸道吸收)及非經腸投與(經由注射、輸注或植入)。

特定而言，可藉由使用任一將rAAV重組載體傳輸至動物靶組織中之物理方法來實際投與本發明rAAV。本發明投與包含(但不限於)注射至肌肉、血流中及/或直接注射至肝中。已證實，將rAAV簡單再懸浮於磷酸鹽緩衝鹽水中即足以提供可用於肌肉組織表現之媒劑，且對可與rAAV共投與之載劑或其他組分並無已知限制(但在使用rAAV之正常方式中應避免降解DNA之組合物)。

可修飾rAAV之衣殼蛋白，從而rAAV靶向所關注特定靶組織(例如肌肉)。例如參見WO 02/053703，其揭示內容以引用方式併入本文中。醫藥組合物可製備為可注射調配物或擬藉由經皮傳輸遞送至肌肉之局部調配物。先前已研發用於肌內注射及經皮傳輸之諸多調配物且可用於本發明實踐中。rAAV可與任一醫藥上可接受之載劑一起使用以便於投與及處置。

出於肌內注射目的，可採用於佐劑(例如芝麻或花生油)或水性丙二醇中之溶液以及無菌水溶液。可視需要緩衝該等水溶液，且首先使液體稀釋劑與鹽水或葡萄糖等滲。呈游離酸(DNA含有酸性磷酸鹽基團)或藥理學可接受之鹽形式之rAAV之溶液可製備於適宜地與表面活性劑(例如羥丙基纖維素)混合之水中。rAAV分散液亦可在甘油、液體聚乙二醇及其混合物中及在油中製備。在普通儲存及使用條件下，該等製劑含有防腐劑以防止微生物生長。就此而言，所採用無菌水性介質皆易於藉由熟習此項技術者所熟知之標準技術獲得。

適用於可注射應用之醫藥形式包含無菌水溶液或分散液及用於臨時製備無菌可注射溶液或分散液之無菌粉末。在所有情形下，該形式必須無菌且必須為存在容易可注射性之流體程度。其在製造及儲存條件下必須穩定且必須針對諸如細菌及真菌等微生物之污染作用進行防腐。載劑可為溶劑或分散介質，其含有(例如)水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液體聚乙二醇及諸如此類)、其適宜混合物及植物油。可(例如)藉由使用塗層(例如卵磷脂)、藉由在分散液情形下維持所需粒徑及藉由使用表面活性劑來維持適當流動性。可藉由各種抗細菌劑或抗真菌劑(例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞(thimerosal)及諸如此類)來防止微生物作用。在許多情形下，較佳地應包含等滲劑，例如糖或氯化鈉。可藉由使用延遲吸收劑(例如單硬脂酸鋁及明膠)來延長可注射組合物之吸收。

無菌可注射溶液係藉由將所需量之rAAV納入視需要具有上文所列舉各種其他成分之適當溶劑中，隨後過濾滅菌製備。通常，藉由將滅菌活性成分納入含有基本分散介質及上文所列舉之所需其他成分之無菌媒劑中來製備分散液。在使用無菌粉末製備無菌可注射溶液之情形下，較佳製備方法係真空乾燥及冷凍乾燥技術，其可自預先經無菌過濾之溶液產生活性成分加任一其他期望成分之粉末。

亦可在活體外使用rAAV進行轉導。在一個實施例中，自個體取出期望靶肌細胞，使用rAAV轉導並再引入個體中。或者，可使用同基因或異基因肌細胞，其中彼等細胞不在個體中產生不適當免疫反應。

業內已知轉導並將轉導細胞再引入個體中之適宜方法。在一個實施例中，在活體外可藉由以下轉導細胞：rAAV與肌細胞在例如適當介質中組合，並使用習用技術(例如南方印漬(Southern blot)及/或PCR)或藉由使用可選標記物來篩選含有所關注DNA之彼等細胞。然後可將經轉導細胞調配成醫藥組合物，及藉由各種技術，例如藉由肌內、靜脈內、皮下及腹膜內注射，或藉由使用例如導管注射至平滑肌及心肌中，將該組合物引入個體中。

使用本發明rAAV轉導細胞造成持續表現γ-肌聚醣。本發明由此提供向哺乳動物個體、較佳人類投與/遞送表現γ-肌聚醣之rAAV之方法。該等方法包含使用一或多種本發明rAAV轉導組織(包含(但不限於)諸如以下組織：肌肉；器官，例如肝及腦；及腺，例如唾液腺)。可使用包括組織特異性控制元件之基因盒來實施轉導。舉例而言，本發明之一個實施例提供轉導由肌肉特異性控制元件引導之肌細胞及肌肉組織之方法，該等肌肉特異性控制元件包含(但不限於)衍生自肌動蛋白及肌球蛋白基因家族者，例如衍生自myoD基因家族者[參見Weintraub等人，Science, 251 : 761-766 (1991)]、肌細胞特異性增強子結合因子MEF-2 [Cserjesi及Olson, Mol Cell Biol 11: 4854-4862 (1991)]、衍生自人類骨骼肌動蛋白基因之控制元件[Muscat等人，Mol Cell Biol, 7: 4089-4099 (1987)]、心肌動蛋白基因元件、肌肉肌酸激酶序列元件[參見Johnson等人，Mol Cell Biol, 9:3393-3399 (1989)]及鼠類肌酸激酶增強子(mCK)元件、衍生自骨骼快縮肌鈣蛋白C基因、慢縮心臟肌鈣蛋白C基因及慢縮肌鈣蛋白I基因之控制元件、低氧可誘導核因子(Semenza等人，Proc Natl Acad Sci USA, 88: 5680-5684 (1991))、類固醇可誘導元件，及包含糖皮質激素反應元件(GRE)之啟動子(參見Mader及White, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5603-5607 (1993))，及其他控制元件。

肌肉組織係用於活體內DNA遞送之有吸引力靶，此乃因其並非生命器官且易於到達。本發明涵蓋轉基因(例如γ-肌聚醣)自經轉導肌纖維之持續表現。

「肌細胞」或「肌肉組織」意指衍生自任一種類肌肉(例如來自(例如)消化道、膀胱、血管或心臟組織之骨骼肌及平滑肌)之細胞或細胞群組。該等肌細胞可分化或未分化，例如肌母細胞、肌細胞、肌管、心肌細胞及心肌母細胞。

因此，本文亦闡述向有需要之哺乳動物個體投與有效劑量(或基本上同時投與之劑量或間隔給予之劑量)之編碼γ-肌聚醣之rAAV的方法。

本文進一步提供包括本文所揭示一或多個實施例中之任一者及可選使用說明書或基本上由其組成或又另外由其組成之套組。該等套組可包括本文所揭示之一或多種組合物及皮質類固醇或本文所提供之一或多種組合療法及可選使用說明書或基本上由其組成或又另外由其組成。

應理解，本閥門並不限於所闡述特定態樣，此乃因其當然可有所變化。亦應理解，本文所用之術語僅出於闡述特定實施例之目的，且並不意欲加以限制，此乃因本發明範圍將僅受限於隨附申請專利範圍。

已闡述本發明之諸多實施例。然而，應理解，可在不背離本發明之精神及範圍之情況下作出各種修改。因此，下列實例意欲闡釋而非限制申請專利範圍中所闡述揭示內容之範圍。

未經明確敘述即可推斷且除非另外預計，在本發明技術係關於多肽、蛋白質、多核苷酸或抗體時，該等物質之等效物或生物等效物意欲在本發明技術之範圍內。

任一專利、專利申請案、公開案或任一其他文檔之引用既非對前述文獻中之任一者係相關先前技術之承認，其亦不構成關於該等公開案或文檔之內容或日期之任何承認。

本文所揭示之所有特徵皆可以任何組合進行組合。本說明書中所揭示之每一特徵皆可由適應於相同、等效或類似目的之替代特徵所代替。因此，除非另外明確陳述，否則所揭示特徵(例如抗體)係等效物或類似特徵之屬之一實例。

如本文中所使用，除非上下文另外明確指示，否則所有數值或數值範圍皆包含該等範圍內之整數及該等值之分數部分或該等範圍內之整數。另外，在本文闡述值清單時(例如約50%、60%、70%、80%、85%或86%)，該清單包含所有其中間值及分數值(例如54%、85.4%)。因此，為加以闡釋，所提及80%或更高程度之一致性包含81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%等以及81.1%、81.2%、81.3%、81.4%、81.5%等、82.1%、82.2%、82.3%、82.4%、82.5%等等。

以高於(大於)或小於提及之整數分別包含大於或小於參考數字之任一數字。因此，舉例而言，在提及小於100時包含99、98、97等直至數字一(1)；且小於10包含9、8、7等直至數字一(1)。

如本文中所使用，除非上下文另外明確指示，否則所有數值或範圍皆包含該等範圍內之該等值及整數之分數以及該等範圍內之整數之分數。因此，為加以闡釋，所提及之數值範圍(例如1-10)包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10以及1.1、1.2、1.3、1.4、1.5等等。所提及之範圍1-50由此包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20等直至50 (且包含其)以及1.1、1.2、1.3、1.4、1.5等、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5等等。

所提及之一系列範圍包含組合該系列內之不同範圍之邊界值之範圍。因此，為加以闡釋，所提及之一系列範圍(例如1-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-75、75-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-400、400-500、500-750、750-1,000、1,000-1,500、1,500-2,000、2,000-2,500、2,500-3,000、3,000-3,500、3,500-4,000、4,000-4,500、4,500-5,000、5,500-6,000、6,000-7,000、7,000-8,000或8,000-9,000)包含範圍10-50、50-100、100-1,000、1,000-3,000、2,000-4,000等。

可對前文作出修改，此並不背離該技術之基礎態樣。儘管已參照一或多個具體實施例極其詳細地闡述該技術，但熟習此項技術者將認識到，可對本申請案中具體揭示之實施例作出改變，且該等修改及改良仍屬該技術之範圍及精神內。

本文中闡釋性地闡述之技術可適宜地在不存在本文中未具體揭示之任何元件的情況下實踐。因此，舉例而言，在本文中之每一情況下，術語「包括(comprising)」、「基本上由……組成(consisting essentially of)」及「由……組成(consisting of)」中之任一者皆可由其他兩種術語代替。已採用之術語及表達用作描述而非限制之術語，且此類術語及表達之使用並不排除所展示及所闡述之特徵或其部分之任何等效物，且在所主張技術之範圍內，各種修改係可能的。

本文所提及之所有出版物及專利之全部內容皆以引用方式併入本文中，如同將每一個別出版物或專利特定且個別地指示以引用方式併入本文中一般。倘若出現衝突，則以本申請案(包含本文之任何定義)為準。然而，在提及本文所引用之任何參考文獻、文章、公開案、專利、專利公開案及專利申請案時並不且不應視為承認或以任何形式表明，其在世界上任何國家構成有效先前技術或形成一般通常知識之一部分。

在本申請案中，除非另外指示，否則任一濃度範圍、百分比範圍、比率範圍或整數範圍應理解為包含在所列舉範圍內之任一整數值及(在適當時)其分數部分(例如整數之十分之一及百分之一)。術語「約」在緊接於數字或數值前面時意指，數量或數值範圍加上或減去10%。應理解，除非另外指示，否則本文所用之術語「一種(a及an)」係指「一或多種」所列舉組分。所用替代詞(例如「或(or)」)應理解為意指一種、兩種或替代物之其任一組合。術語「及/或」應理解為意指一種或兩種替代物。如本文中所使用，術語「包含」及「包括」同義使用。

本文所用之各部分標題僅出於組織性目的，且不應視為限制所闡述標的物。

下列實例進一步闡述本發明，該等實例並非限制申請專利範圍中所闡述之本發明範圍。實例 實例 1 ： scAAVrh74 .tMCK .hSGCB 構築及載體功效

構築如圖 1 中所展示含有密碼子最佳化之全長人類γ-肌聚醣(SCGB) cDNA (SEQ ID NO: 1)之SGCG AAV構築體。SGCG AAV構築體經構形以使用自我互補性AAV主鏈進行包裝，從而獲得更有效轉導效率。SGCG cDNA (969)經構形以藉由MHCK7啟動子(792 bp)驅動。內含子及5’ UTR係衍生自質體pCMVß (Clontech)。SGCG AAV構築體具有共有Kozak (緊接於ATG起點前面)及小53 bp合成聚A信號(用於mRNA終止)。將cDNA密碼子最佳化以用於人類應用並藉由GenScript (Piscataway, NJ)合成。包含於此載體中之唯一病毒序列係AAV2之反向末端重複，其係病毒DNA複製及包裝所需。

利用HEK293細胞之三重轉染方法在研究級條件下來產生用於此研究之載體。產生後之載體表徵包含藉由qPCR使用超螺旋標準物進行之效價測定、內毒素含量測定(EU/mL)及無菌性評價。藉由SDS-PAGE分析所產生載體以驗證與預計rAAV之帶型一致性。使用線性質體標準物滴定載體製劑並使用超螺旋質體標準物再滴定。使用含有全長人類γ-肌聚醣cDNA (NC_000013.11)、肌肉特異性MHCK7啟動子(用以驅動表現)、共有Kozak序列(CCACC)、SV40嵌合內含子、合成多聚腺苷酸化位點(53 bp) (圖1)之質體產生載體。將SGCG表現盒選殖於包裝至自我互補性AAVrh.74載體中之AAV2 ITR之間以用於增強心臟組織之轉導。

研究設計之概述提供於表 2 中。藉由載體基因體(vg)總數之qPCR估計來測定劑量值。在載體製劑中包含至少一些部分完整之AAV衣殼可使得藉由qPCR方法高估劑量。因此，在給定劑量(例如5E+13)下測定效能表明，在純化載體以去除部分完整之AAV衣殼時，可在較低qPCR量測之載體劑量下觀察到效能。列示於表2及通篇實例中之以載體基因體/公斤個體(vg/kg)表示之總劑量(vg)及劑量並不考慮部分完整之AAV衣殼。表 2 ： scAAVrh74.MHCK7.hSGCG 研究設計之概述 N/A：不適用 IF：免疫螢光；H&E：蘇木素及伊紅染色；TA Phys：TA肌肉中之比力量測及ECC損傷抗性；Dia Phys：橫膈膜肌肉中之比力量測；組織病理學：正式組織病理學綜述；「-」：未注射。

在4-8週齡時治療所有效能動物並在注射後3個月驗屍。在4個月齡時對SGCG-/- 陰性對照小鼠驗屍。

藉由向SGCG-/- 小鼠中經肌內及全身性注射載體來測定scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG測試物品之功效。注射乳酸化林格氏溶液(LRS)之野生型小鼠用作陽性對照且未注射SGCG-/- 小鼠用作陰性對照。

提取來自8週齡BL6野生型(WT)小鼠及γ-肌聚醣剔除(γ-SG KO)小鼠之脛骨前(TA)肌肉且使用蘇木素及伊紅(H&E)將組織切片染色以觀察每一肌肉之組織學。即使在此極早期年齡，γ-SG KO小鼠亦在具有壞死肌肉纖維、發炎性浸潤物且存在纖維化組織之肌肉中顯示疾病表型。(圖2 )。

將SGCG AAV構築體包裝至rh.74血清型AAV中以產生重組AAV (rAAV)，稱為scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG。注射總共3小鼠以測定scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG之功效。一隻注射LRS之C57BL/6 WT小鼠及一隻未注射SGCG-/- 小鼠分別用作陽性對照及陰性對照。剩餘3隻小鼠係SGCG-/- 且經由肌內在LTA (n=2)中或經由靜脈內在尾部靜脈(n=1)中注射scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG以測定該載體組是否強力。研究設計匯總於表 3 中。 表3：scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG功效分析

在4週齡時，以3e10 vg總劑量之劑量經由肌內(IM)注射向γ-SG KO小鼠之TA肌肉中注射scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG。在注射後4週(8週齡)對小鼠實施安樂死且提取TA肌肉並新鮮冷凍於液氮冷卻之甲基丁烷中。γ-肌聚醣之免疫螢光(IF)染色展示在未注射右TA (RTA)肌肉中不存在γ-肌聚醣且展示經注射左TA (LTA)肌肉中之膜γ-肌聚醣蛋白表現幾乎完全恢復(圖3A )。γ-肌聚醣之西方印漬(圖3B )展示兩種BL6 WT TA肌肉中之γ-肌聚醣表現；在γ-SG KO TA肌肉中不存在該蛋白質；且在來自經注射794號及795號小鼠之TA肌肉中恢復γ-肌聚醣蛋白表現。

以3×10¹¹ vg總劑量之指定劑量經由靜脈內向SGCG-/- 小鼠遞送scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG使得在經注射LTA肌肉中表現93.03%之hSGCG，此類似於先前所研究β-肌聚醣(scAAVrh.74.MHCK7.hSGCB)載體之程度。載體投用小鼠(動物編號：794、795)之免疫螢光成像證實了hSGCG轉基因之表現(圖3A )。包含20×影像以觀察經注射肌肉中之表現量。據預計，C57BL/6 WT小鼠展示100% γ-肌聚醣蛋白表現且SGCG-/- 小鼠完全不存在γ-肌聚醣表現(圖3C )。

經由尾部靜脈向一隻SGCG-/- 小鼠(797號)全身性注射產生hSGCG轉基因之高表現程度。申請者能夠在經1×10¹³ vg總劑量(5×10¹⁴ vg/kg) scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG治療之此功效小鼠之所有骨骼肌中達成≥94.00%之轉導。在所分析之所有骨骼肌中，AAV遞送之hSGCG轉基因之平均表現百分比為95.98%。申請者亦能夠在全身性遞送後於心臟中達成極高轉導程度。所有骨骼肌以及橫膈膜及心臟之闡釋hSGCG廣泛表現之代表性20×免疫螢光影像展示於圖 7 中。實例 2 ： scAAVrh74 .tMCK .hSGCB 載體 在 BL6 WT 小鼠中之功效及毒性

在4週齡時，以3e10 vg總劑量之劑量經由肌內(IM)注射向BL6 WT小鼠之TA肌肉中注射scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG。在注射後4週(8週齡)對小鼠實施安樂死且提取TA肌肉並新鮮冷凍於液氮冷卻之甲基丁烷中。γ-肌聚醣之免疫螢光(IF)染色展示未注射右TA (RTA)肌肉中之γ-肌聚醣膜染色且展示指示γ-肌聚醣蛋白過度表現於經注射左TA (LTA)肌肉中之細胞內染色(圖4A )。γ-肌聚醣之西方印漬(圖4B )展示γ-肌聚醣蛋白過度表現於經注射LTA肌肉中。TA肌肉之H&E染色展示在未注射RTA或經注射LTA中並無毒性且完全不存在任何中心核、壞死纖維、發炎性浸潤或纖維化組織。(圖 5 )。實例 3 ： 在全身性遞送 scAAVrh.74 .tMCK .hSGCB 之後之基因表現

在4-5週齡時，經靜脈內向γ-SG KO小鼠之尾部靜脈注射1e12 vg總劑量(5e13 vg/kg)。在治療6週之後對小鼠實施安樂死。TA、腓腸肌(GAS)、四頭肌(QUAD)、臀肌(GLUT)、腰肌、三頭肌、橫膈膜及心肌之免疫螢光染色證實廣泛表現γ-肌聚醣(圖6 )。

藉由使用單一劑量(1×10¹³ vg總劑量，5×10¹⁴ vg/kg)對SGCG-/- 小鼠(基因型：sgcgC57)實施全身性注射來測定scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG測試物品之效能。以臨床劑量(1×10¹² vg總劑量(5×10¹³ vg/kg))、中等劑量(4×10¹² vg總劑量(2×10¹⁴ vg/kg))及高劑量(1×10¹³ vg總劑量(5×10¹⁴ vg/kg))向SGCG-/- 小鼠之尾部靜脈全身性注射scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG且在注射後3個月實施安樂死。

遵循scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG功效分析之結果，申請者經由尾部靜脈注射以1×10¹³ vg總劑量(5×10¹⁴ vg/kg)之功效劑量向5隻SGCG-/- 小鼠遞送載體以評價轉基因表現及在以3個月之延長時間點全身性遞送時之載體效能。在4週齡時向小鼠注射且在注射後3個月實施全面驗屍。提取功效分析中之上述所有骨骼肌以及橫膈膜及心臟以用於分析。亦取出包含肺、腎、肝、脾及生殖腺在內之器官以用於毒理學及生物分佈研究。簡言之，3個月治療後之hSGCG轉基因表現保持較高且來自經治療小鼠之所有肌肉同樣高度轉導。此結果伴有改良之肌肉組織病理學及改良之TA及橫膈膜肌肉功能。全身性遞送scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG載體並不在肌肉或器官中誘導任何毒性。γ - 肌聚醣表現

除經全身性注射scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG載體之所有SGCG-/- 小鼠之橫膈膜及心臟外，亦使用人類γ-肌聚醣之免疫螢光染色來測定其6種骨骼肌(左及右二者)中之hSGCG轉基因表現。該等肌肉包含TA、GAS、QUAD、GLUT、腰肌、TRI。出於表現分析及轉導效率之目的，利用來自5隻經治療小鼠之左肌肉及右肌肉之影像進行量化。自每一肌肉獲取4個20×影像且測定每一影像之hSGCG陽性纖維之百分比(陽性表現纖維數量/總纖維數量)，從而產生來自每一小鼠之每一肌肉之平均轉導百分比。圖 8A 展示來自經治療小鼠之代表性影像且在所有量化肌肉(包含橫膈膜)中皆顯示高表現程度(平均92.26%)。申請者同樣亦在所有載體治療小鼠中之心肌中看到高轉導程度。圖 8B 展示證實來自經靜脈內遞送scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG載體之小鼠之所有骨骼肌及心臟中之hSGCG轉基因表現的西方印漬。表 4 列示來自每一小鼠之每一肌肉中4個20×影像之平均表現百分比以及所有5隻小鼠之每一肌肉的平均值。 表4. γ-肌聚醣轉基因表現之平均百分比 經處理肌肉之組織病理學

來自SGCG-/- 小鼠之肌肉(骨骼肌及心臟肌肉二者)皆展現廣泛肌病變，包含伴有多個局灶性壞死區之明顯肌纖維萎縮及肥大。亦存在增加數量之單核細胞發炎(淋巴球及巨噬球以及分散之嗜中性球)及增加之失養型鈣化、脂肪浸潤、中心成核及纖維化。圖 9A 中之蘇木素及伊紅染色圖解說明SGCG-/- 小鼠與正常WT小鼠相比具有此失養型表型且在治療後可改良肌肉病況。組織學參數量化展示，SGCG-/- 小鼠之骨骼肌中之中心成核纖維數顯著升高，隨後諸多不同骨骼肌中之中心成核因γ-肌聚醣基因轉移而減小(圖9B )。肌肉組織病理學之更深入分析揭示，在經載體治療之患病SGCG-/- 小鼠之所有三種檢驗肌肉(GAS、腰肌及TRI)中，纖維大小分佈皆得以正規化且伴有平均纖維直徑增加(圖10A-10F )。分析來自每一小鼠之各種肌肉之個別中心核計數及平均纖維直徑。實例 4 ： γ -SG KO 小鼠之生理學缺陷

實施天狼星紅染色(Sirius red stain)以量化纖維化組織之量。在4個月齡時測試γ-SG KO小鼠及BL6 WT小鼠以評價在骨骼肌中是否存在力缺陷。測試脛骨前(TA)肌肉中比力及抗損傷性與對照相比之顯著降低。亦以類似方式測試橫膈膜肌肉以檢測任何顯著降低。此可量測降低將提供確立AAV.hSGCB療法之效能之功能結果量度。實例 5 ： scAAVrh74 .tMCK .hSGCB 治療後之功能結果

在三個月研究中，以滾動方式向各小組之γ-SG KO小鼠注射以量化效能及毒性(表5 )。對小鼠實施籠活動分析，然後實施安樂死以測定經治療小鼠與γ-SG KO對照相比之整體活動。對TA及橫膈膜肌肉實施生理學分析以測定比力輸出及抗損傷/疲勞性。比較γ-SG KO肌肉與BL6 WT對照以確立用於測定經治療小鼠中之治療效能之功能結果量度。對所有骨骼肌實施IF (免疫螢光)染色以分析γ-肌聚醣表現，實施H&E染色以分析組織病理學。對來自經注射小鼠之肌肉及器官實施定量聚合酶鏈反應(qPCR)以測定載體基因體生物分佈。表 5 實例 6 ：全身性遞送之功能評價

為測定hSGCG基因轉移是否向患病肌肉提供功能益處，申請者評價來自經scAAVrh.74.MHCK7.hSCGG治療之SGCG-/- 小鼠之TA及橫膈膜肌肉之功能性質。如實例1至5中所概述，申請者首次證實小鼠中之肢體骨骼肌及橫膈膜在γ-肌聚醣不存在下之組織病理學。未治療SGCG-/- 小鼠之TA肌肉之原位分析揭示，與BL6 WT TA肌肉相比，正規化比力產生在統計學上顯著降低37.68% (BL6 WT: 291.65 mN/mm² 對SGCG-/- : 181.77 mN/mm² )。與SGCG-/- 肌肉相比，在治療後比力輸出顯著增加至正常WT值(SGCG-/- : 181.77 mN/mm² 對治療：266.02 mN/mm² ) (圖11A 及圖 11C )。測定hSGCG基因轉移之功能益處之一種其他功能結果量度係在重複離心收縮後評價TA肌肉中之收縮誘導性損傷抗性。正常BL6 WT小鼠之TA肌肉在10回合離心收縮後僅損失18%之力產生，與之相比，在未治療SGCG-/- TA肌肉中則損失37%之力。經載體治療之SGCG-/- 肌肉具有高於WT程度之改良，其中其僅看到在離心收縮(ECC)方案後損失10%之力(圖11B )。

為進一步測試源自全身性遞送治療hSGCG轉基因且最終改良SGCG-/- 小鼠之疾病表型之潛在功能益處，對所有組小鼠實施開放式籠活動之雷射監測。圖12中之圖形繪示，與正常BL6 WT相比，SGCG-/- 小鼠在x及y平面之總移動降低23.64% (BL6 WT: 7655.42雷射束中斷/hr對SGCG-/- : 5846.00雷射束中斷/hr)。藉由定性觀察發現，scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG治療小鼠之活動整體而言大於SGCG-/- 小鼠，且開放式籠活動之定量量測展示，移動增加24.90% (SGCG-/- : 5846.00雷射束中斷/hr對治療：7301.80雷射束中斷/hr)。亦量測個別小鼠中之每一參數之詳述值。實例 7 ： 毒理學及載體生物分佈

此研究之目的係利用上述相同動物評價在遞送測試物品scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG之後3個月 hSGCG基因療法在SGCG-/- 小鼠中之任何潛在毒性或安全性問題。在上文及下午，藉由靜脈內(IV)途徑將測試物品以1.0×10¹³ vg總劑量(5×10¹⁴ vg/kg)及460μL體積(分成兩個單獨230 μL注射)給予5隻4週齡SGCG-/- 。6隻未注射SGCG-/- 小鼠用作未治療患病對照，且5隻C57BL/6 WT小鼠用作正常健康對照(表6 )。對所有小鼠實施全面驗屍以提取6種左側及右側骨骼肌(TA、GAS、QUAD、GLUT、腰肌及TRI)以及橫膈膜及心臟以及內部器官(包含肺、腎、肝、脾及生殖腺)。為評價載體安全性，對肌肉組織之冷凍切片實施蘇木素及伊紅染色且對所有收穫器官進行福馬林(formalin)固定，且亦使用蘇木素及伊紅染色。然後由獨立獸醫病理學家正式評審該等切片之毒性且經檢測並無不良效應，且結果匯總於下表 7 中且亦製作詳述組織病理學報告。實施定量PCR以評價載體生物分佈且彼等結果展示於下文之表 7 及圖 13 中。載體轉導組織之組織病理學綜述

為使用全身性遞送測定scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG之安全性及毒理學特徵，使用H&E將來自投用載體之SGCG-/- 小鼠組及來自此臨床前研究之對照收穫之所有骨骼肌(包含橫膈膜)以及心臟及5種其他器官染色且由獨立獸醫病理學家正式評審每一組織之切片。組細節及研究設計展示於表 6 中。表 6. 用於 scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG 基因轉移組織病理學綜述之小組匯總

總而言之，經靜脈內注射scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG並不誘發所檢驗任何骨骼肌之肌纖維之任何微觀變化(表7 )。另外，在任一組織學評估組織中看到並無治療相關病灶，從而指示測試物品充分耐受，完整報告可參見附錄J (報告號AAVrh74-SGCG-MOUSE-001.1)。在經治療小鼠及對照小鼠中皆看到任何所述變化且視為偶然發現。另外，獨立綜述指示，相對於來自對照小鼠之參考樣品，投與測試物品scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG實質上減少肌纖維萎縮、退化及破壞，從而表明該載體可改善患病小鼠中之與不存在SGCG有關之肌病變之程度。表 7.SGCG-/- 小鼠中之 scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG 安全性研究之組織病理學結果 載體基因體生物分佈

使用實時、定量PCR分析(qPCR)檢驗測試物品特異性DNA序列之存在。對自兩隻投用載體之SGCG-/- 動物收集之組織試樣實施生物分佈分析。正信號係任一等於或大於100個單鏈DNA拷貝/µg所檢測基因體DNA者。在驗屍時收穫組織且利用MHCK7啟動子序列之特異性載體特異性引子探針。表 8 及圖 13 繪示在來自scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG注射小鼠之每一組織試樣中所檢測之載體基因體拷貝。

在所有收集組織中檢測不同含量之scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG轉錄物。如所預計，儘管因靜脈內遞送途徑之性質而在肝中檢測到高含量載體，但最高含量可見於骨骼肌及心臟中。在肺、腎及脾中檢測到最低含量。該等數據指示，將測試物品有效遞送至載體投用小鼠之所有探究組織中。表 8. 在 SGCG-/- 小鼠中全身性遞送高劑量 scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG 後之定量 PCR 結果 血清化學分析

為進一步評估肝功能，申請者評價作為正常血清化學參數之兩種肝酶：鹼性胺基轉移酶(ALT)及天門冬胺酸胺基轉移酶(AST)之含量。該等酶中之任一者之升高可指示肝細胞損害及肝功能損傷。申請者分析來自所有6隻C57BL/6 WT小鼠、所有6隻未治療SGCG-/- 小鼠及所有5隻scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG投用小鼠之血清。圖 14A 展示未治療SGCG-/- 小鼠中之ALT升高至兩倍於可見於健康BL6 WT小鼠中之含量(BL6 WT: 44.20 U/L對SGCG-/- : 89.00 U/L)。向SGCG-/- 小鼠經靜脈內遞送scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG使得ALT含量降低32.02% (SGCG-/- : 89.00 U/L對治療：60.50 U/L)。圖 14B 展示所有三組小鼠中之AST含量，其指示在未治療SGCG-/- 小鼠中顯著升高113.27% (BL6 WT: 326.00 U/L對SGCG-/- : 695.25 U/L)。在全身性遞送scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG後，該等AST含量減小41.10% (圖14B)。總而言之，儘管視為肝損害生物標記物之肝酶在患病SGCG-/- 小鼠中有所升高，但SGCG-/- 患病小鼠中之全身性hSGCG基因轉移可正規化ALT及AST之含量。測定所有小鼠中之每一酶之個別值。

總而言之，全身性遞送兩個不同劑量之攜載hSGCB轉基因之AAV病毒可展示較為安全且無毒。測試劑量包含1.2×10¹³ vg總劑量(6.0×10¹⁴ vg/kg)及1.0×10¹³ vg總劑量(5.0×10¹⁴ vg/kg)。特定而言，經由SGCG-/- 之尾部靜脈全身性遞送高劑量(1.0×10¹³ vg總劑量 - 5.0×10¹⁴ vg/kg)之scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG較為安全且可在患病肌肉中有效恢復γ-肌聚醣表現並逆轉失養型組織病況。

圖1繪示包括密碼子最佳化之全長人類γ-肌聚醣(hSCGB) cDNA (SEQ ID NO: 1)之AAV載體(scAAVrh74.MHCK7.hSGCG)。該構築體側接有兩個約100bp AAV反向末端重複(ITR)，包含密碼子最佳化之人類γ-肌聚醣cDNA (hSGCG)、嵌合內含子(內含子)、合成多聚腺苷酸化信號(pA)，且由骨骼肌及心肌特異性MHCK7啟動子驅動。

圖2繪示來自8週齡BL6 WT小鼠及γ-肌聚醣剔除(γ-SG KO)小鼠(在患病小鼠中展示失養型表型)之脛骨前(TA)肌肉之蘇木素(Hematoxylin)及伊紅(Eosin) (H&E)染色。

圖3A-3C繪示活體內載體功效。將scAAVrh74.MHCK7. hSGCG以3e10 vg總劑量注射至γ-SG KO小鼠之脛骨前(TA)肌肉中。圖3A展示γ-SG KO小鼠中之TA肌肉之免疫螢光染色。自載體遞送在肌膜處產生幾乎100%之γ-肌聚醣蛋白表現。圖3B展示來自794、795號經治療小鼠之經注射TA肌肉中之γ-肌聚醣表現之西方印漬(Western blot)。圖3C展示對照野生型小鼠(「BL6 WT TA」)或未注射對照γ-SG KO小鼠(「GSG KO TA」)以及未染色試樣(「GSG KO，無一級抗體」)中之TA肌肉之免疫螢光染色。

圖4A-4B繪示BL6野生型(WT)小鼠中之活體內載體功效及毒性。圖4A展示指示膜過度表現γ-肌聚醣之免疫螢光染色及細胞內染色。圖4B展示指示經注射LTA肌肉中之γ-肌聚醣之過度表現之西方印漬。

圖5繪示BL6野生型(WT)小鼠中之活體內載體功效及毒性。未注射及經注射BL6 WT TA肌肉之H&E染色展示並無毒性且完全不存在任一中心核、壞死纖維、發炎性浸潤或纖維化組織。

圖6繪示TA、腓腸肌(GAS)、四頭肌(QUAD)、臀肌(GLUT)、腰肌、三頭肌、橫膈膜及心肌上關於γ-肌聚醣之免疫螢光染色，其顯示γ-肌聚醣之廣泛表現。

圖7繪示IV功效組織之免疫螢光染色。各種骨骼肌、橫膈膜及心臟中關於γ-肌聚醣之IF染色顯示在全身性遞送scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG後6週罕見負離子纖維之穩健表現。

圖8A-8B展示IV治療動物中之SGCG表現。來自經靜脈內注射1e13 vg總劑量scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG之SGCG-/- 小鼠之骨骼肌、橫膈膜及心臟之免疫螢光成像展示於代表性20×影像中(圖8A)。西方印漬展示來自經靜脈內遞送scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG之小鼠之所有骨骼肌及心臟之hSGCG表現(圖8B)。

圖9A-9B展示在全身性治療後組織之組織學評估。BL6 WT、未治療SGCG-/- 及經AAV.MHCK7.hSGCG治療之SGCG-/- 小鼠中之TRI及DIA骨骼肌之蘇木素及伊紅染色展示在治療後逆轉失養型病況(圖9A)。具有中心成核之纖維之百分比量化展示在經處理肌肉中有所降低。BL6 WT (n=5)、未治療SGCG-/- (n=6)、AAV.MHCK7.hSGCG治療(n=5) (圖9B)。***=p＜0.001，****=p＜0.0001。

圖10A-10F展示纖維直徑量化。在BL6 WT (n=5)、未治療SGCG-/- (n=6)及經AAV.MHCK7.hSGCG治療之SGCG-/- (n=5)小鼠中之GAS (圖10A)、腰肌(圖10B)及TRI (圖10C)中實施纖維直徑量化並在治療後將纖維直徑分佈正規化。未治療SGCG-/- 小鼠之GAS (圖10D)、腰肌(圖10E)及TRI (圖10F)肌肉中之平均纖維直徑有所降低，且在經AAV.MHCK7.hSGCG治療後SGCG-/- 小鼠中之每一肌肉中之平均纖維直徑增加至WT程度。****=p＜0.0001。

圖11A-11C展示TA及橫膈膜生理學。量測BL6 WT (n=5)、未治療SGCG-/- (n=6)及AAV.MHCK7.hSGCG治療(n=5)小鼠之TA及DIA肌肉中之正規化比力產生。對TA肌肉實施離心收縮損傷方案(圖11A)。據觀察，經治療SGCG-/- 小鼠中之TA比力輸出及收縮誘導性損傷抗性有所改良(圖11B)。經治療SGCG-/- 小鼠中之DIA比力輸出恢復至WT程度(圖11C)。*=p＜0.05，****=p＜0.0001。

圖12展示開放式籠活動之雷射監測。SGCG-/- 小鼠中之x及y平面中之整體移動有所降低且在經AAV.MCHK7.hSGCG治療之小鼠中則有所改良。BL6 WT (n=6)、未治療SGCG-/- (n=6)及AAV.MHCK7.hSGCG治療(n=5)。

圖13展示載體基因體之生物分佈。在經靜脈內遞送1e13 vg總劑量之scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG之後3個月，在來自兩隻SGCG-/- 小鼠之各個組織中量測平均vg拷貝數/微克基因體DNA (gDNA)之載體基因體分佈。

圖14A-14B展示血清ALT及AST之對比。分析來自BL6 WT小鼠(n=6)、未治療SGCG-/- 小鼠(n=6)及經AAV.MHCK7.hSGCG IV治療之SGCG-/- 小鼠(n=5) (1e13vg總劑量)之血清之生物化學組分含量。患病SGCG-/- 小鼠中之肝酶鹼性胺基轉移酶(ALT，圖14A)及天門冬胺酸胺基轉移酶(AST，圖14B)有所升高且在治療後返回接近WT程度。*=p＜0.05。虛線代表正常範圍之下限及上限。

<110> 美國全美兒童醫院之研究學會(Research Institute at Nationwide Children's Hospital)

<120> 用於肢帶型肌肉失養症2C型之基因療法

<140> TW 108103617

<141> 2019-01-30

<150> 62/624,616

<151> 2018-01-31

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 876

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之說明：合成多核苷酸

<400> 1

<210> 2

<211> 291

<212> PRT

<213> 智人

<400> 2

<210> 3

<211> 2225

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之說明：合成多核苷酸

<400> 3

<210> 4

<211> 792

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之說明：合成多核苷酸

<400> 4

<210> 5

<211> 148

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之說明：合成多核苷酸

<400> 5

<210> 6

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之說明：合成寡核苷酸

<400> 6

<210> 7

<211> 110

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之說明：合成多核苷酸

<400> 7

<210> 8

<211> 104

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之說明：合成多核苷酸

<400> 8

<210> 9

<211> 876

<212> DNA

<213> 智人

<400> 9

<210> 10

<211> 535

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之說明：合成多肽

<400> 10

<210> 11

<211> 2217

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之說明：合成多核苷酸

<400> 11

Claims (43)

1. 一種重組腺相關病毒(AAV)載體之用途，其係用於製備治療個體之γ-肌聚醣病之醫藥品，其中該rAAV載體包括含有編碼γ-肌聚醣之多核苷酸序列在啟動子之轉錄控制下之基因表現盒，該盒側接有一或多個AAV反向末端重複，且該多核苷酸序列包括SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所載之核苷酸序列。
2. 一種重組腺相關病毒(AAV)載體之用途，其係用於製備增加患有肌肉失養症之個體之肌力、肌耐力及/或肌肉質量、或治療肌肉失養症、或減少退化纖維或壞死纖維、或減少發炎、或減少肌酸激酶含量、治療肌纖維萎縮及肥大、降低失養型鈣化、降低脂肪浸潤、降低中心成核(central nucleation)之醫藥品，其中該rAAV載體包括含有編碼γ-肌聚醣之多核苷酸序列在啟動子之轉錄控制下之基因表現盒，該盒側接有一或多個AAV反向末端重複，且該多核苷酸序列包括SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所載之核苷酸序列。
3. 如請求項1或2之用途，其中該rAAV載體包括自我互補AAV載體基因體。
4. 如請求項1或2之用途，其中該rAAV載體包括缺乏AAV rep及cap DNA之基因體。
5. 如請求項1或2之用途，其中該rAAV載體為血清型AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13或AAV rh74，或其任何變體。
6. 如請求項5之用途，其中該rAAV載體為血清型AAV rh74且其中該rAAV載體包括AAV rh.74衣殼。
7. 如請求項6之用途，其中該AAV rh.74衣殼包括SEQ ID NO：10中所述之胺基酸序列。
8. 如請求項1或2之用途，其中該rAAV載體之基因體包括肌肉特異性控制元件且其中該編碼γ-肌聚醣之多核苷酸可操作地連接至該肌肉特異性控制元件。
9. 如請求項8之用途，其中該肌肉特異性控制元件係選自由以下組成之群：人類骨骼肌動蛋白基因元件、心肌動蛋白基因元件、肌細胞特異性增強子結合因子mef元件、肌肉肌酸激酶(MCK)啟動子、截短MCK(tMCK)啟動子、肌球蛋白重鏈(MHC)元件、MHCK7啟動子、C5-12、鼠類肌酸激酶增強子元件、骨骼快縮肌鈣蛋白c基因元件、慢縮心臟肌鈣蛋白c基因元件、慢縮肌鈣蛋白I基因元件、低氧可誘導核因子、類固醇可誘導元件及糖皮質激素反應元件(gre)。
10. 如請求項9之用途，其中該肌肉特異性控制元件係截短MCK(tMCK) 啟動子。
11. 如請求項1或2之用途，其中該啟動子係MHCK7啟動子。
12. 如請求項11之用途，其中該MHCK7啟動子包括SEQ ID NO：4中所述之核苷酸序列。
13. 如請求項1或2之用途，其中該rAAV載體包括含有SEQ ID NO：5中所述之核苷酸序列之內含子。
14. 如請求項1或2之用途，其中該編碼γ-肌聚醣之多核苷酸序列編碼SEQ ID NO：2之胺基酸序列。
15. 如請求項1或2之用途，其中該醫藥品包括含有該rAAV載體及醫藥上可接受之載劑之組合物。
16. 如請求項1或2之用途，其中該個體患有肢帶型肌肉失養症。
17. 如請求項16之用途，其中該肢帶型肌肉失養症係肢帶型肌肉失養症2C型。
18. 如請求項15之用途，其中該醫藥品係用於藉由肌內注射或靜脈內注射投與。
19. 如請求項15之用途，其中該醫藥品係用於全身性投與。
20. 如請求項15之用途，其中該醫藥品係用於藉由注射、輸注或植入來非經腸投與。
21. 如請求項1或2之用途，其中該醫藥品係用於增加該個體之一或多種肌肉之肌力、肌耐力及/或肌肉質量。
22. 如請求項21之用途，其中該一或多種肌肉係選自由以下組成之群：心臟、橫膈膜、大腿、小腿、骨盆帶、肩及臂。
23. 如請求項21之用途，其中與未治療對照個體相比，肌力、肌耐力及/或肌肉質量增加至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約50%或至少約80%。
24. 一種重組AAV(rAAV)載體，其包括AAV衣殼及包括編碼γ-肌聚醣之多核苷酸序列在啟動子之轉錄控制下之基因表現盒，其中該多核苷酸序列包括SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所載之核苷酸序列。
25. 如請求項24之rAAV載體，其中該基因表現盒側接有一或多個AAV反向末端重複。
26. 如請求項24或25之rAAV載體，其中該載體為血清型AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13或AAV rh74，或其任何變體。
27. 如請求項24或25之rAAV載體，其中該rAAV載體之基因體包括肌肉特異性控制元件且其中該多核苷酸序列可操作地連接至該肌肉特異性控制元件。
28. 如請求項27之rAAV載體，其中該肌肉特異性控制元件係選自由以下組成之群：人類骨骼肌動蛋白基因元件、心肌動蛋白基因元件、肌細胞特異性增強子結合因子mef元件、肌肉肌酸激酶(MCK)啟動子、截短MCK(tMCK)啟動子、肌球蛋白重鏈(MHC)元件、MHCK7啟動子、C5-12、鼠類肌酸激酶增強子元件、骨骼快縮肌鈣蛋白c基因元件、慢縮心臟肌鈣蛋白c基因元件、慢縮肌鈣蛋白i基因元件、低氧可誘導核因子、類固醇可誘導元件及糖皮質激素反應元件(gre)。
29. 如請求項28之rAAV載體，其中該肌肉特異性控制元件係截短MCK(tMCK)啟動子。
30. 如請求項24或25之rAAV載體，其中該啟動子係MHCK7啟動子。
31. 如請求項30之rAAV載體，其中該MHCK7啟動子包括SEQ ID NO：4中所述之核苷酸序列。
32. 如請求項24或25之rAAV載體，其中該rAAV載體包括SEQ ID NO：5中所述之核苷酸序列。
33. 如請求項24或25之rAAV載體，其中該編碼γ-肌聚醣之多核苷酸序列編碼SEQ ID NO：2所載之胺基酸序列。
34. 一種組合物，其包括如請求項24至33中任一項之rAAV載體。
35. 如請求項34之組合物，其中該組合物包括醫藥上可接受之載劑。
36. 如請求項34或35之組合物，其用於治療個體之γ-肌聚醣病。
37. 如請求項34或35之組合物，其用於增加個體之肌力、肌耐力及/或肌肉質量、減少纖維化、減少收縮誘導性損傷、減少退化纖維或壞死纖維、減少發炎、減少肌酸激酶含量、減少肌纖維萎縮及肥大、或降低失養型鈣化、降低脂肪浸潤、或降低中心成核。
38. 如請求項34或35之組合物，其用於患有肌肉失養症之個體之肌肉失養症。
39. 如請求項34或35之組合物，其包括乳酸化林格氏溶液(Ringer's Solution，LRS)。
40. 一種宿主細胞，其包括如請求項24至33中任一項之rAAV載體。
41. 一種組合，其包括如請求項34至39中任一項之組合物及皮質類固醇。
42. 一種套組，其包括如請求項34至39中任一項之組合物及皮質類固醇或如請求項41之組合。
43. 如請求項42之套組，其包括皮質類固醇。