KR20190126047A - 메틸-CpG 결합 단백질 2를 암호화하는 재조합 아데노-관련 바이러스의 경막 내 전달 - Google Patents
메틸-CpG 결합 단백질 2를 암호화하는 재조합 아데노-관련 바이러스의 경막 내 전달 Download PDFInfo
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Abstract
메틸-CpG 결합 단백질 2(MECP2)를 암호화하는 재조합 아데노-관련 바이러스 9(rAAV9)의 경막 내 전달 방법 및 물질이 제공된다. 방법 및 물질의 용도, 예를 들어, 레트 증후군 치료를 위한 용도가 고려된다.
Description
본 출원은 2016년 11월 17일 출원된 미국 가출원 제62/423,618호의 우선권의 이익을 주장한다.
전자적으로 제출된 자료의 참조에 의한 포함
본 설명과 동시에 제출되고 다음과 같이 확인된 컴퓨터 판독 가능한 형태의 서열 목록은 그 전체가 참조로서 포함된다: 2017년 11월 17일에 생성된 24,148바이트의 "50215PCT_SeqListing.txt"라는 명칭의 ASCII 텍스트 파일.
[기술분야]
본 발명은 메틸-CpG 결합 단백질 2(MECP2)를 암호화하는 재조합 아데노-관련 바이러스 9(rAAV9)의 경막 내 전달 방법 및 물질에 관한 것이다. 방법 및 물질의 용도, 예를 들어, 레트 증후군 치료를 위한 용도가 고려된다.
레트 증후군은 10,000명 중 약 1명의 여아에 영향을 미치는 신경발달 X 연관 우성 장애이다. 반접합 남성은 보통 신생아 뇌병증으로 사망한다. 이형접합 여성은 성인기까지 살아남지만, 소두증, 목적이 있는 손 동작 및 언어능력 상실, 그리고 겉보기에 정상적인 발달 기간 이후에 나타나는 운동이상을 포함한 중증의 증상을 나타낸다. 발병 연령은 대략 6 내지 18개월이다.
레트 증후군은 전형적(또는 고전적) 레트 또는 비정형 레트로 분류된다. 비정형 레트는 MECP2 이외의 유전자의 돌연변이에 의해 유발될 수 있지만, 전사 인자 메틸-CpG 결합 단백질 2(MECP2)를 암호화하는 유전자의 자발적인 돌연변이가 두 가지 유형의 사례 대부분(약 90%)을 초래한다. MECP2 돌연변이의 속성(예컨대, 결실 대 점 돌연변이) 및 편향된 X 염색체 불활성화는 질병 중증도에 영향을 미친다. MECP2 전사 인자는 수천 가지 유전자의 전사를 조절한다. 치료상의 노력은 신경전달물질, 성장 인자 및 대사 경로를 포함한 MECP2의 하류의 표적에 집중되었다. 레트 증후군을 대상으로 한 적어도 9건의 임상 시험은 상이한 측정법에 걸쳐 긍정적인 결과를 보고하였으나, 그 결론은 독립적으로 검증된 적이 없었거나 새로운 치료로 이어지지는 않았다[Katz et al, Trends in Neurosciences, 39: 100-113 (2016)]. 현재 레트 증후군에 대한 승인된 치료법은 없다.
마우스가 RTT 유사 행동을 나타내는 수컷 및 암컷 마우스 모델이 있다[Guy et al., Nature Genetics, 27: 322-326 (2001); Chen et al., Nature Genetics 27: 327-331 (2001); 및 Katz et al., 5: 733-745 (2012)].
MECP2는 다양한 조직에서 발현되지만 뉴런에 풍부하며 신경계에서 가장 많이 연구된 52kD 핵 단백질이다. 인간에는 MECP2A 및 B로 알려져 있는 MECP2의 두 가지 이소형이 있다(도 1)[Weaving et al., Journal of Medical Genetics, 42: 1-7 (2005)]. 이 두 가지 이소형은 선택적으로 스플라이싱된 mRNA 전사체로부터 유래되며 상이한 번역 개시 부위를 갖는다. MECP2B는 엑손 1, 3 및 4를 포함하며, 뇌에서 두드러진 이소형이다. MECP2는 메틸화된 DNA에 가역적으로 결합하여 유전자 발현을 조절한다[Guy et al., Annual Review of Cell and Developmental Biology, 27: 631-652 (2011)]. 이러한 기능들은 각각 메틸 결합 도메인(MBD) 및 전사 억제인자 도메인(TRD)으로 맵핑된다[Nan & Bird, Brain & Development, 23, Suppl 1: S32-37 (2001)]. 본래는 전사 억제인자로 여겨졌던 MECP2는 표적 유전자 발현을 유도하는 한편, 억제할 수도 있다[Chahrour et al., Science, 320: 1224-1229 (2008)]. MECP2는 적절한 뉴런 발달 및 유지를 뒷받침한다고 가정된다. 뉴런에서, MECP2는 상이한 결합 파트너와의 DNA 결합 및 상호 작용을 통해 유전자 발현으로의 시냅스 활성의 번역을 촉진한다[Ebert et al., Nature, 499: 341-345 (2013) 및 Lyst et al., Nature Neuroscience, 16: 898-902 (2013)]. 별아교세포에서, MECP2 결핍은 마우스의 무호흡 이벤트와 관련이 있다[Lioy et al., Nature, 475: 497-500 (2011)]. MECP2 결핍은 감소된 뇌 크기, 증가된 뉴런 충전 밀도 및 감소된 수상돌기의 복잡성을 유발할 수 있다[Armstrong et al., Journal of Neuropathology and Experimental Neurology, 54: 195-201 (1995)]. 중요하게도, 뉴런 사망은 MECP2 결핍과 관련이 없다[Leonard et al., Nature Reviews, Neurology, 13: 37-51 (2017)]. MECP2는 신경계 외부에서도 발견되나, 그 수준은 조직에 걸쳐서 다양하다(도 2). 최근의 연구는 말초 Mecp2 발현에 대한 마우스의 레트 증후군의 의존성을 조사하였다[Ross et al., Human Molecular Genetics, 25: 4389-4404 (2016)]. 말초 결핍은 활동 저하, 운동 피로 및 뼈 이상과 관련이 있었다. 대부분의 RTT 관련 행동, 감각운동, 보행 및 자율신경계의 (호흡 및 심장) 표현형은 말초 MECP2가 녹아웃된 마우스에서 없었다.
MECP2는 X 연관 유전자이기 때문에, MECP2의 한 카피는 암컷에서 X 염색체 불활성화(Xci)로 인해 침묵당한다. 세포당 기준으로, 레트 암컷에서 MECP2 키메리즘을 유도하는 Xci는 무작위인 것으로 여겨진다. 질병 중증도는 대부분의 활성 X 염색체가 온전한 또는 돌연변이된 MECP2 유전자를 함유하는지에 영향을 받는다. 이를 편향된 Xci라 한다. 수컷은 Xci를 겪지 않으므로, 세포에 전혀 MECP2의 기능적 카피가 없을 것이므로 MECP2 결핍은 더욱 심각하다. MECP2 돌연변이의 속성 또한, 질병 중증도에 영향을 미친다. MECP2 유전자의 결실, 넌센스 및 점 돌연변이를 포함한 600종을 초과하는 상이한 돌연변이가 RettBASE 데이터베이스(http://mecp2.chw.edu.au/)에 기술되어 있다. 가장 흔한 돌연변이(환자의 약 9%)는 메틸 결합 도메인에 영향을 미치는 T185M 대립 유전자이다. 기타 흔한 돌연변이는 도 3에 나타내었다[Leonard, 위 참조]. 이들은 전체적으로 RettBASE에 열거된 사례의 40% 이상을 차지한다. MECP2 관련 대규모 결실은 사례 중 8 내지 10%에서 발견되었다[Li et al., Journal of Human Genetics, 52: 38-47 (2007) 및 Hardwick et al., European Journal of Human Genetics, 15: 1218-1229 (2007)]. R133C, R294X 및 (TRD 하류의) C-말단 돌연변이 및 결실과 유전자형-표현형 사이에는 상관관계가 있는데, 이는 좀 더 중등도의 질병을 유발한다. 대규모 결실 및 조기 절단 돌연변이(R270X, R255X 및 R168X)는 중증 레트 증후군과 관련이 있다. 표 1은 국제적인 레트 임상의 단체가 최근에 수집한 일치된 레트 진단 기준을 기술한 것이다[Neul et al., Annals of Neurology, 68: 944-950 (2010)].
| RTT 진단 기준 2010 -출생 후 머리 성장 둔화가 관찰될 때 진단을 고려한다. |
| 전형적 또는 고전적 RTT에 필수적 1. 퇴행 기간 후 회복 또는 안정화.* 2. 모든 주요 기준 및 모든 제외 기준 3. 전형적 RTT에서 지지 기준이 자주 존재하지만 필수적인 것은 아님. |
| 비정형 또는 이형 RTT에 필수적 1. 퇴행 기간 후 회복 또는 안정화 2. 4개 주요 기준 중 적어도 2개 이상 3. 11개 지지 기준 중 5개 |
| 주요 기준 1. 후천적인 의도적인 손 기술의 부분 또는 완전 상실. 2. 후천적인 구어의 부분 또는 완전 상실** 3. 보행 이상: 장애(행동곤란) 또는 능력 부재 4. 부들부들 손 떨기/손 쥐어짜기, 박수/두드리기, 입짓 및 무의식적인 씻기/문지르기와 같은 정형화된 손 동작. |
| RTT 제외 기준 1. (출산 전후 또는 출산 후) 외상에 뒤따르는 뇌 손상, 신경대사성 질환, 또는 신경학적 문제를 유발하는 중증 감염*** 2. 생후 첫 6개월 이내 총체적으로 비정상적인 정신운동성 발달# |
| 비정형 RTT 지지 기준## 깨어 있을 때 호흡 장애 깨어 있을 때 이갈기 수면 패턴 장애 비정상적인 근육 긴장 말초 혈관운동 장애 척추측만증/척추후만증 성장 지연 작고 차가운 손발 부적절한 웃음/비명 발작 통증에 대한 반응 감소 강렬한 눈 소통 - "눈 가리킴" |
| * = MECP2 돌연변이는 현재 임의의 뚜렷한 퇴행 증거에 앞서 일부 개인에서 확인되므로, "가능한" RTT의 진단은 임의의 기술을 상실하지는 않았으나 그 외 RTT를 시사하는 임상적 특징을 갖는 3세 미만의 개인에게 제공되어야 한다. 이러한 개인은 퇴행 증거를 위해 6 내지 12개월마다 재평가하여야 한다. 퇴행이 분명하다면, 진단은 확실한 RTT로 변경되어야 한다. 그러나 아동이 5세까지 임의의 퇴행 증거를 보이지 않는다면, RTT 진단에 의문의 가져야 한다. |
| ** = 후천적 언어의 상실은 가장 잘 습득된 구어 기술을 기초로 하며, 확실한 단어 또는 고급 언어 기술의 습득에 엄격하게 기초하지 않는다. 따라서, 옹알이를 배웠으나 이 능력을 상실한 개인은 후천적 언어 상실을 앓는 것으로 간주된다. |
| *** = 당연한 것으로 여겨지는 손상이 직접적으로 신경 장애를 유발했다는 명백한 증거(신경학적 또는 안과학적 검사 및 MRI/CT)가 있어야 한다. |
| # = 정상적인 중대 시점(머리 가누기 획득, 삼키기, 사회적 미소 개발)이 충족되지 않는 지점까지 총체적으로 비정상임. 생후 첫 6개월 동안 중간 정도의 일반화된 긴장 저하 또는 기타 이전에 보고된 미묘한 발달 변화는 RTT에서 흔하며, 제외 기준을 구성하지 않는다. |
| ## = 개인이 열거된 임상적 특징을 가지고 있거나 가진 적이 있다면, 지지 기준으로 계산된다. 이러한 특징 중 상당수는 연령 의존성을 가지며, 특정 연령대에서 분명해지고 더욱 두드러진다. 따라서, 비정형 RTT의 진단은 어린 사람보다 나이든 사람의 경우 더 용이할 수 있다. 퇴행 기간 및 2개 이상의 주요 기준을 가지나 11개 중 5개의 지지 기준의 요건을 충족하지 않는 어린 사람(5세 미만)의 경우, "준 비정형 RTT"의 진단이 제공될 수 있다. 이 범주에 해당하는 사람은 나이가 들면 재평가하여야 하며, 그에 따라 진단이 수정되어야 한다. |
아데노 관련 바이러스(AAV)는 복제 결핍성 파보바이러스로, 이의 단일 가닥 DNA 게놈은 145개 뉴클레오티드 반전 말단 반복부(ITR)를 포함하여 길이가 약 4.7 kb이다. AAV 혈청형 2(AAV2) 게놈의 뉴클레오티드 서열은 문헌[Srivastava et al., J Virol, 45: 555-564 (1983)]에 문헌[Ruffing et al., J Gen Virol, 75: 3385-3392 (1994)]에서 수정된 바와 같이 제시되어 있다. 바이러스 DNA 복제(rep), 캡시드화/패키징 및 숙주 세포 염색체 통합을 지시하는 시스(cis) 작용 서열은 ITR 내에 포함된다. (상대적인 지도 위치에 대해 p5, p19 및 p40으로 명명된) 세 개의 AAV 프로모터는 rep 및 cap 유전자를 암호화하는 두 개의 AAV 내부 오픈 리딩 프레임의 발현을 추진한다. (뉴클레오티드 2107 및 2227에 있는) 단일 AAV 인트론의 차등 스플라이싱과 짝지어진 두개의 rep 프로모터(p5 및 p19)는 rep 유전자로부터 네 개의 rep 단백질(rep 78, rep 68, rep 52 및 rep 40)의 생성을 초래한다. rep 단백질은 궁극적으로 바이러스 게놈 복제를 담당하는 여러 가지 효소적 성질을 보유한다. cap 유전자는 p40 프로모터로부터 발현되며, 세 개의 캡시드 단백질 VP1, VP2 및 VP3을 암호화한다. 선택적인 스플라이싱 및 비공통 번역 개시 부위는 이 세 개의 관련된 캡시드 단백질의 생성을 담당한다. 단일 공통 폴리아데닐화 부위는 AAV 게놈의 지도 위치 95번에 위치한다. AAV의 생애주기 및 유전학은 문헌[Muzyczka, Current Topics in Microbiology and Immunology, 158: 97-129 (1992)]에 검토되어 있다.
AAV는 예를 들어, 유전자요법에서, 외래 DNA를 세포로 전달하는 벡터로서 매력있게 하는 고유한 특징을 보유한다. 배양 중인 세포의 AAV 감염은 세포 비변성이며, 인간 및 기타 동물의 자연 감염은 잠복성 및 무증상적이다. 더구나, AAV는 많은 포유동물 세포를 감염시켜 생체 내에서 여러 상이한 조직을 표적화할 수 있다. 나아가, AAV는 서서히 분열하는 세포와 비분열 세포를 형질전환시키며, 전사적 활성 핵 에피솜(염색체 외 요소)으로서 본질적으로 이러한 세포의 생애 동안 지속될 수 있다. AAV 프로바이러스 게놈은 재조합 게놈의 구축을 실현 가능하게 만드는 플라스미드 내의 클로닝된 DNA처럼 전염성이 있다. 게다가, AAV 복제, 게놈 캡시드화 및 통합을 지시하는 신호는 AAV 게놈의 ITR 내에 포함되므로, (복제 및 구조적 캡시드 단백질 rep-cap을 암호화하는) 내부의 대략 4.3 kb 게놈의 일부 또는 전부는 프로모터, 관심 DNA 및 폴리아데닐화 신호를 함유하는 유전자 카세트와 같은 외래 DNA로 교체될 수 있다. rep 및 cap 단백질은 트랜스로(in trans) 제공될 수 있다. AAV의 또 다른 의미있는 특징은 AAV가 극도로 안정적이며 강력한 바이러스라는 점이다. AAV는 아데노바이러스를 불활성화시키는 데 사용되는 조건(몇 시간 동안 56 내지 65℃)을 용이하게 견뎌, AAV의 저온보존을 덜 중요하게 만든다. AAV는 심지어 동결 건조될 수 있다. 마지막으로, AAV 감염 세포는 중복 감염에 내성이 없다. 여러 혈청형의 AAV가 존재하며 다양한 조직 친화성을 제공한다. 공지된 혈청형에는 예를 들어, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13 및 AAVrh74가 포함된다. AAV9는 미국 특허 제7,198,951호 및 문헌[Gao et al., J. Virol., 78: 6381-6388 (2004)]에 기술되어 있다.
당해 분야에서 중추 신경계로의 MECP2 폴리뉴클레오티드의 전달 방법 및 이를 위한 생성물 및 중추 신경계에서의 이 폴리뉴클레오티드의 발현 방법 및 이를 위한 생성물에 대한 필요성은 여전히 남아 있다.
본 개시는 필요로 하는 환자의 레트 증후군 치료에 유용한 방법 및 물질을 제공한다.
필요로 하는 환자에 대한 메틸-CpG 결합 단백질 2(MECP2)를 암호화하는 재조합 아데노-관련 바이러스 9(rAAV9)의 경막 내 투여 단계를 포함하는 환자의 레트 증후군 치료 방법이 제공되며, 이때, rAAV9는 MECP2B를 암호화하는 자기 상보적(self-complementary) 게놈을 포함하고, 이 자기 상보적 게놈의 서열은 서열번호 1에 기재되어 있다. 제공되는 예시적인 rAAV9는 AVXS-201이라는 scAAV이다.
환자에 대한 이오헥솔, 이오비트리돌, 이오메프롤, 이오파미돌, 이오펜톨, 이오프로마이드, 이오버솔 또는 이옥실란, 또는 이의 2종 이상의 혼합물의 경막 내 투여 단계를 더 포함하고/포함하거나, 환자를 트렌델렌버그 자세로 두는 단계를 더 포함하는 방법이 제공된다.
도 1: 인간 MECP2 유전자좌의 도해. 이 그림은 성숙한 mRNA의 선택적인 전사 개시 부위(화살표), 엑손(박스) 및 스플라이싱 패턴을 보여준다. MECP2B는 뇌에서 가장 풍부한 이소형으로, AVXS-201에 의해 암호화된다.
도 2: 도표는 면역조직화학으로 검출한, 다양한 인간 조직에서의 상대적인 MECP2 단백질 발현 수준을 도시한 것이다. The Human Protein Atlas(www.proteinatlas.org)로부터 수정함.
도 3: MECP2 단백질의 핵심 기능 도메인 및 레트 환자에서 발견된 공통적인 돌연변이. MBD = 메틸-CpG-결합, TRD = 전사 억제 도메인, NID = NCOR-SMRT 상호 작용 도메인(NID) 및 핵 국재화 신호(NLS)
도 4: 수컷 레트 마우스의 Mecp2 발현의 AAV9 매개성 복원을 통한 개념 증명. A) 재조합 AAV 게놈의 카툰. B) 실험 설계. C) 대조군 벡터 처리한 동물과 비교한 scAAV9.738.Mecp2 처리 레트 마우스의 증가된 생존을 보여주는 카플란-마이어 생존 곡선. D) Bird 점수법으로 측정 시 벡터 매개성 Mecp2 복원은 행동 표현형을 개선한다(박스 1).
도 5: 암컷 레트 마우스의 scAAV9.738.Mecp2 치료는 생리적 수준의 Mecp2를 만들고 이상 행동을 개선한다. A) 실험 설계 B) 야생형 및 scAAV9.738.Mecp2 치료된 레트 마우스로부터 Mecp2에 대해 면역표지를 붙인 뇌 절편으로부터의 형광 강도 측정치. 강도 측정치의 분포는 두 군 간에 비슷하다. C) Bird 표현형 점수법은 scAAV9.738.Mecp2를 받는 동물에서 증상 감소를 보여준다. D 내지 G)는 각각 로타로드, 반전 그리드, 플랫폼 및 네스팅 행동 평가로, 전부 대조군 처리 동물에 대한 scAAV9.738.Mecp2 치료 동물에서의 개선을 보여준다.
도 6: 본 설명에 기술된 제1 세대(A) 및 수정된(B, AVXS-201) 재조합 AAV 게놈을 도시한 카툰. 색깔은 구성체 사이의 유사점과 차이점을 반영한다. scAAV9.738.Mecp2 및 AVXS-201 사이에서, 프로모터가 짧아졌고, 핵심 요소 사이의 개재 서열이 짧아졌으며, 뮤린 Mecp2 알파 cDNA는 인간 MECP2B cDNA로 교체되었고, 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호는 더 짧은 합성 요소로 바뀌었다. 이러한 변화의 전반적인 목적은 임상적으로 관련된 MECP2 cDNA의 생리적 발현 수준을 유지하면서 패키징 효율을 향상시키는 것이었다.
도 7: Mecp2 -/y 마우스에서 AVXS-201의 용량 반응. A) Mecp2 -/y 마우스 치료에 사용된 상이한 용량의 카플란-마이어 도표. 용량군에 대한 생존 중앙값을 색깔로 부호화하고, 파선으로 표시하였다. AVXS-201를 받은 모든 코호트는 대조군 처리된 널(null) 마우스에 비해 생존 증가를 나타냈다. B) 각 군으로부터의 생존 중앙값 데이터를 도표화하여 용량 반응 곡선을 보여주었다. 파선은 PBS 처리 Mecp2 -/y 의 생존 중앙값을 나타낸다. 이러한 데이터는 MECP2 결핍 및 과다의 공지된 효과와 일치한다.
도 8: AVXS-201 처리 Mecp2 -/y 마우스에 대한 Bird 행동 점수법. A) 대조군 처리의 이환된 마우스는 연령 증가에 따라 결손이 누적된다. 행동 결손은 용량에 관계 없이 AVXS-201 치료로 약화된다. B) (A)에서의 동일한 데이터를 다시 그래프화하여 대조 처리군과 AVXS-201 1.44x1010 vg 군만을 보여준 것이다.
도 9: AVXS-201 처리된 Mecp2 널 마우스는 자발적인 보행을 되찾는다. 개방 현장 분석은 AVXS-201 처리된 널 마우스가 대조군 처리된 널 마우스와 비교하여 더 먼 거리를 횡단하며(A), 증가된 평균 속도로 횡단함(B)을 보여준다. C) 3개월령에서의 로타로드 수행 또한, 중간 정도 용량의 AVXS-201로 개선되었다. + = p≤0.001; * = p≤0.05;
= p≤0.0001 .
도 10: AVXS-201은 치료적 용량에서 중간 정도 양의 MECP2를 만든다. A) 수컷 야생형(PBS) 또는 Mecp2 -/y 마우스로부터 제조된 뇌 반구 균질물로부터의 항-MeCP2 웨스턴 블롯. Mecp2 널 마우스는 주입되지 않거나(KO) 표시된 용량의 AVXS-201을 받았다. B) 패널 A의 정량화. 표적화된 치료적 용량의 1.44x1010vg는 11%의 야생형 수준의 단백질을 생성하였다.
도 11: AVXS-201는 야생형 마우스에서 내약성이 좋다. A) AVXS-201의 P1 ICV 투여를 받은 수컷 야생형 마우스의 카플란-마이어 생존 도표. B) 처리된 마우스와 야생형 마우스의 Bird 표현형 점수법은 광범위한 용량에서 내약성이 좋음을 보여준다. 최고 용량(1.13x1011, 파란색 선)은 중등도의 행동 장애를 가져왔다.
도 12: 야생형 동물에서 AVXS-201 처리는 보행을 손상시키지 않는다. AVXS-201로 처리한 야생형 수컷 마우스의 개방 현장 분석은 대조군 처리 야생형 마우스와 비슷한 (A) 이동 거리 및 (B) 평균 속도를 보여준다. C) 로타로드 수행은 고용량의 AVXS-201을 받은 야생형 동물에서 감소되었다. + = p≤0.001, * = p≤0.05
도 13: AVXS-201은 야생형 뇌에서 MECP2 단백질의 용량 의존적인 증가를 가져온다. A) 항-MeCP2 웨스턴 블롯은 P1 ICV 주사 3주 후에 다양한 뇌 영역에서 총 MeCP2 단백질의 용량 의존적인 상승을 보여준다. (Cb = 소뇌, Med = 연수, Hipp = 해마, Ctx = 피질, Mid = 중뇌). TG3은 MeCP2 중복 증후군1의 중증 마우스 모델로부터 취한 샘플을 나타낸다. B) 패널 A의 정량화. 고용량의 AVXS-201은 선택 뇌 영역에서 MECP2 발현을 두 배가 되게 하나, 중간 용량의 AVXS-201은 그렇지 않다.
도 14: 비인간 영장류에서의 AVXS-201의 경막 내 주입은 체중 증가를 손상시키지 않는다. 세 마리의 AVXS-201 처리 동물을 빨간색으로 나타내었고, 대조군 대상체의 체중은 파란색으로 나타내었다.
도 15: 비인간 영장류에서의 AVXS-201의 경막 내 주입은 주사 후 18개월까지 혈액학 값을 손상시키지 않는다. 세 마리의 AVXS-201 처리 동물에 대한 값을 빨간색으로 나타내었고, 대조군 대상체에 대한 값은 파란색으로 나타내었다.
도 16: 비인간 영장류에서의 AVXS-201의 경막 내 주입은 주사 후 12 내지 18개월까지 혈청 화학을 손상시키지 않는다. 간 및 전해질 값은 AVXS-201 처리 대상체와 대조군 처리 대상체 간에 비슷하다. 세 마리의 AVXS-201 처리 동물에 대한 값을 빨간색으로 나타내었고, 대조군 대상체에 대한 값은 파란색으로 나타내었다.
도 17: 비인간 영장류에서의 AVXS-201의 경막 내 주입은 주사 후 12 내지 18개월까지 혈청 화학을 손상시키지 않는다. 심장 및 신장 값은 AVXS-201 처리 대상체와 대조군 처리 대상체 간에 비슷하다. 세 마리의 AVXS-201 처리 동물에 대한 값을 빨간색으로 나타내었고, 대조군 대상체에 대한 값은 파란색으로 나타내었다.
도 18: AVXS-201 처리 및 대조군 비인간 영장류의 뇌 전체에 걸쳐 비슷한 수준의 MeCP2 발현. 항-MeCP2 면역조직화학은 중대한 구조적 이상이나 MeCP2 발현의 명백한 차이를 드러내지 않았다. OC = 후두 피질, TC = 측두 피질, LSc = 허리 척수, Thal = 시상, Hipp = 해마, Cb = 소뇌.
도 19: 대조군 및 AVXS-201 주사 동물로부터의 뇌 영역의 웨스턴 블롯은 비슷한 수준의 MeCP2를 보여준다. 총 MeCP2 수준을 녹색으로 나타내었고, GAPDH 부하 대조군은 빨간색으로 나타내었다. 패널 A와 B의 정량화를 각각의 블롯 아래에 나타내었다. 그래프 안의 파선은 대조군에서 검출된 평균 정규화 값을 나타낸다. OC = 후두 피질, TC = 측두 피질, LSc = 허리 척수, Thal = 시상, Hipp = 해마, Cb = 소뇌. 값을 평균 ± SEM으로 나타내었다.
도 20: 현장 혼성화는 AVXS-201 처리 동물의 뇌에서 검사한 모든 영역 내의 벡터 유래 전사체를 보여주지만, 대조군에서는 그렇지 않다. 도면은 핵 라벨링(Dapi, 파란색)과 함께 Gapdh(빨간색) 및 벡터 유래 MECP2 mRNA(녹색)에 대한 프로브를 보여준다. OC = 후두 피질, TC = 측두 피질, LSc = 허리 척수, Hipp = 해마, Cb = 소뇌. 축척 막대 = 20 μm.
도 21: 현장 혼성화는 주사 후 18개월의 AVXS-201 처리 동물의 뇌에서 검사한 모든 영역 내의 벡터 유래 전사체를 보여주지만, 대조군에서는 그렇지 않다. 도면은 핵 라벨링(Dapi, 파란색)과 함께 Gapdh(빨간색) 및 벡터 유래 MECP2 mRNA(녹색)에 대한 프로브를 보여준다. OC = 후두 피질, TC = 측두 피질, CA1 및 CA3 = 해마 영역, CC = 뇌들보, Thal = 시상, Cau = 미상, Put = 조가비핵, SColl = 위 둔덕, Med = 연수, Cb = 소뇌, Cerv = 경부 척수, Thor = 흉부 척수, Lumb = 허리 척수. 축척 막대 = 20 μm.
도 2: 도표는 면역조직화학으로 검출한, 다양한 인간 조직에서의 상대적인 MECP2 단백질 발현 수준을 도시한 것이다. The Human Protein Atlas(www.proteinatlas.org)로부터 수정함.
도 3: MECP2 단백질의 핵심 기능 도메인 및 레트 환자에서 발견된 공통적인 돌연변이. MBD = 메틸-CpG-결합, TRD = 전사 억제 도메인, NID = NCOR-SMRT 상호 작용 도메인(NID) 및 핵 국재화 신호(NLS)
도 4: 수컷 레트 마우스의 Mecp2 발현의 AAV9 매개성 복원을 통한 개념 증명. A) 재조합 AAV 게놈의 카툰. B) 실험 설계. C) 대조군 벡터 처리한 동물과 비교한 scAAV9.738.Mecp2 처리 레트 마우스의 증가된 생존을 보여주는 카플란-마이어 생존 곡선. D) Bird 점수법으로 측정 시 벡터 매개성 Mecp2 복원은 행동 표현형을 개선한다(박스 1).
도 5: 암컷 레트 마우스의 scAAV9.738.Mecp2 치료는 생리적 수준의 Mecp2를 만들고 이상 행동을 개선한다. A) 실험 설계 B) 야생형 및 scAAV9.738.Mecp2 치료된 레트 마우스로부터 Mecp2에 대해 면역표지를 붙인 뇌 절편으로부터의 형광 강도 측정치. 강도 측정치의 분포는 두 군 간에 비슷하다. C) Bird 표현형 점수법은 scAAV9.738.Mecp2를 받는 동물에서 증상 감소를 보여준다. D 내지 G)는 각각 로타로드, 반전 그리드, 플랫폼 및 네스팅 행동 평가로, 전부 대조군 처리 동물에 대한 scAAV9.738.Mecp2 치료 동물에서의 개선을 보여준다.
도 6: 본 설명에 기술된 제1 세대(A) 및 수정된(B, AVXS-201) 재조합 AAV 게놈을 도시한 카툰. 색깔은 구성체 사이의 유사점과 차이점을 반영한다. scAAV9.738.Mecp2 및 AVXS-201 사이에서, 프로모터가 짧아졌고, 핵심 요소 사이의 개재 서열이 짧아졌으며, 뮤린 Mecp2 알파 cDNA는 인간 MECP2B cDNA로 교체되었고, 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호는 더 짧은 합성 요소로 바뀌었다. 이러한 변화의 전반적인 목적은 임상적으로 관련된 MECP2 cDNA의 생리적 발현 수준을 유지하면서 패키징 효율을 향상시키는 것이었다.
도 7: Mecp2 -/y 마우스에서 AVXS-201의 용량 반응. A) Mecp2 -/y 마우스 치료에 사용된 상이한 용량의 카플란-마이어 도표. 용량군에 대한 생존 중앙값을 색깔로 부호화하고, 파선으로 표시하였다. AVXS-201를 받은 모든 코호트는 대조군 처리된 널(null) 마우스에 비해 생존 증가를 나타냈다. B) 각 군으로부터의 생존 중앙값 데이터를 도표화하여 용량 반응 곡선을 보여주었다. 파선은 PBS 처리 Mecp2 -/y 의 생존 중앙값을 나타낸다. 이러한 데이터는 MECP2 결핍 및 과다의 공지된 효과와 일치한다.
도 8: AVXS-201 처리 Mecp2 -/y 마우스에 대한 Bird 행동 점수법. A) 대조군 처리의 이환된 마우스는 연령 증가에 따라 결손이 누적된다. 행동 결손은 용량에 관계 없이 AVXS-201 치료로 약화된다. B) (A)에서의 동일한 데이터를 다시 그래프화하여 대조 처리군과 AVXS-201 1.44x1010 vg 군만을 보여준 것이다.
도 9: AVXS-201 처리된 Mecp2 널 마우스는 자발적인 보행을 되찾는다. 개방 현장 분석은 AVXS-201 처리된 널 마우스가 대조군 처리된 널 마우스와 비교하여 더 먼 거리를 횡단하며(A), 증가된 평균 속도로 횡단함(B)을 보여준다. C) 3개월령에서의 로타로드 수행 또한, 중간 정도 용량의 AVXS-201로 개선되었다. + = p≤0.001; * = p≤0.05;
도 10: AVXS-201은 치료적 용량에서 중간 정도 양의 MECP2를 만든다. A) 수컷 야생형(PBS) 또는 Mecp2 -/y 마우스로부터 제조된 뇌 반구 균질물로부터의 항-MeCP2 웨스턴 블롯. Mecp2 널 마우스는 주입되지 않거나(KO) 표시된 용량의 AVXS-201을 받았다. B) 패널 A의 정량화. 표적화된 치료적 용량의 1.44x1010vg는 11%의 야생형 수준의 단백질을 생성하였다.
도 11: AVXS-201는 야생형 마우스에서 내약성이 좋다. A) AVXS-201의 P1 ICV 투여를 받은 수컷 야생형 마우스의 카플란-마이어 생존 도표. B) 처리된 마우스와 야생형 마우스의 Bird 표현형 점수법은 광범위한 용량에서 내약성이 좋음을 보여준다. 최고 용량(1.13x1011, 파란색 선)은 중등도의 행동 장애를 가져왔다.
도 12: 야생형 동물에서 AVXS-201 처리는 보행을 손상시키지 않는다. AVXS-201로 처리한 야생형 수컷 마우스의 개방 현장 분석은 대조군 처리 야생형 마우스와 비슷한 (A) 이동 거리 및 (B) 평균 속도를 보여준다. C) 로타로드 수행은 고용량의 AVXS-201을 받은 야생형 동물에서 감소되었다. + = p≤0.001, * = p≤0.05
도 13: AVXS-201은 야생형 뇌에서 MECP2 단백질의 용량 의존적인 증가를 가져온다. A) 항-MeCP2 웨스턴 블롯은 P1 ICV 주사 3주 후에 다양한 뇌 영역에서 총 MeCP2 단백질의 용량 의존적인 상승을 보여준다. (Cb = 소뇌, Med = 연수, Hipp = 해마, Ctx = 피질, Mid = 중뇌). TG3은 MeCP2 중복 증후군1의 중증 마우스 모델로부터 취한 샘플을 나타낸다. B) 패널 A의 정량화. 고용량의 AVXS-201은 선택 뇌 영역에서 MECP2 발현을 두 배가 되게 하나, 중간 용량의 AVXS-201은 그렇지 않다.
도 14: 비인간 영장류에서의 AVXS-201의 경막 내 주입은 체중 증가를 손상시키지 않는다. 세 마리의 AVXS-201 처리 동물을 빨간색으로 나타내었고, 대조군 대상체의 체중은 파란색으로 나타내었다.
도 15: 비인간 영장류에서의 AVXS-201의 경막 내 주입은 주사 후 18개월까지 혈액학 값을 손상시키지 않는다. 세 마리의 AVXS-201 처리 동물에 대한 값을 빨간색으로 나타내었고, 대조군 대상체에 대한 값은 파란색으로 나타내었다.
도 16: 비인간 영장류에서의 AVXS-201의 경막 내 주입은 주사 후 12 내지 18개월까지 혈청 화학을 손상시키지 않는다. 간 및 전해질 값은 AVXS-201 처리 대상체와 대조군 처리 대상체 간에 비슷하다. 세 마리의 AVXS-201 처리 동물에 대한 값을 빨간색으로 나타내었고, 대조군 대상체에 대한 값은 파란색으로 나타내었다.
도 17: 비인간 영장류에서의 AVXS-201의 경막 내 주입은 주사 후 12 내지 18개월까지 혈청 화학을 손상시키지 않는다. 심장 및 신장 값은 AVXS-201 처리 대상체와 대조군 처리 대상체 간에 비슷하다. 세 마리의 AVXS-201 처리 동물에 대한 값을 빨간색으로 나타내었고, 대조군 대상체에 대한 값은 파란색으로 나타내었다.
도 18: AVXS-201 처리 및 대조군 비인간 영장류의 뇌 전체에 걸쳐 비슷한 수준의 MeCP2 발현. 항-MeCP2 면역조직화학은 중대한 구조적 이상이나 MeCP2 발현의 명백한 차이를 드러내지 않았다. OC = 후두 피질, TC = 측두 피질, LSc = 허리 척수, Thal = 시상, Hipp = 해마, Cb = 소뇌.
도 19: 대조군 및 AVXS-201 주사 동물로부터의 뇌 영역의 웨스턴 블롯은 비슷한 수준의 MeCP2를 보여준다. 총 MeCP2 수준을 녹색으로 나타내었고, GAPDH 부하 대조군은 빨간색으로 나타내었다. 패널 A와 B의 정량화를 각각의 블롯 아래에 나타내었다. 그래프 안의 파선은 대조군에서 검출된 평균 정규화 값을 나타낸다. OC = 후두 피질, TC = 측두 피질, LSc = 허리 척수, Thal = 시상, Hipp = 해마, Cb = 소뇌. 값을 평균 ± SEM으로 나타내었다.
도 20: 현장 혼성화는 AVXS-201 처리 동물의 뇌에서 검사한 모든 영역 내의 벡터 유래 전사체를 보여주지만, 대조군에서는 그렇지 않다. 도면은 핵 라벨링(Dapi, 파란색)과 함께 Gapdh(빨간색) 및 벡터 유래 MECP2 mRNA(녹색)에 대한 프로브를 보여준다. OC = 후두 피질, TC = 측두 피질, LSc = 허리 척수, Hipp = 해마, Cb = 소뇌. 축척 막대 = 20 μm.
도 21: 현장 혼성화는 주사 후 18개월의 AVXS-201 처리 동물의 뇌에서 검사한 모든 영역 내의 벡터 유래 전사체를 보여주지만, 대조군에서는 그렇지 않다. 도면은 핵 라벨링(Dapi, 파란색)과 함께 Gapdh(빨간색) 및 벡터 유래 MECP2 mRNA(녹색)에 대한 프로브를 보여준다. OC = 후두 피질, TC = 측두 피질, CA1 및 CA3 = 해마 영역, CC = 뇌들보, Thal = 시상, Cau = 미상, Put = 조가비핵, SColl = 위 둔덕, Med = 연수, Cb = 소뇌, Cerv = 경부 척수, Thor = 흉부 척수, Lumb = 허리 척수. 축척 막대 = 20 μm.
일 양태에서, 본 발명은 환자에 대한 MECP2를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 경막 내 투여(즉, 뇌 또는 척수의 거미막 아래의 공간 내로의 투여) 방법으로, 이 폴리뉴클레오티드를 포함한 게놈과 함께 rAAV9를 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, rAAV9 게놈은 자기 상보적 게놈이다. 다른 구현예에서, rAAV9 게놈은 단일 가닥 게놈이다.
이 방법은 MECP2를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 환자의 뇌 및 척수(즉, 환자의 중추 신경계)에 전달한다. 전달에 고려된 뇌의 일부 표적 영역에는 운동 피질 및 뇌줄기가 포함되나, 이에 한정되지 않는다. 전달에 고려된 중추 신경계의 일부 표적 세포에는 신경 세포 및 아교 세포가 포함되나, 이에 한정되지 않는다. 아교 세포의 예는 미세아교 세포, 희소돌기아교세포 및 별아교세포이다.
MECP2를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 전달은 예를 들어, 레트 증후군 치료를 위해 권고된다.
"치료"는 필요로 하는 (인간 환자를 포함한) 대상 동물에 유효 용량 또는 유효한 여러 용량의 본 발명의 rAAV를 포함하는 조성물을 경막 내 경로를 통해 투여하는 단계를 포함한다. 이 용량이 장애/질병의 발달 전에 투여될 경우, 투여는 예방적이다. 이 용량이 장애/질병의 발달 후에 투여될 경우, 투여는 치료적이다. 본 발명의 구현예에서, 유효 용량은 치료되는 장애/질병 상태와 관련된 1종 이상의 증상을 경감(제거 또는 감소)시키는, 치료되는 장애/질병 상태와 관련된 1종 이상의 증상을 개선하는, 장애/질병 상태로의 진행을 늦추거나 방지하는, 질병의 규모를 감소시키는, 질병의 (부분 또는 완전) 관해를 가져오는, 및/또는 생존을 연장하는 용량이다.
레트 증후군의 치료에서, 이 방법은 의도적인 손 동작 회복, 언어능력 향상, 무호흡 감소, 발작 감소, 불안 감소, 증가된 사회화, IQ 증가, 수면 패턴의 정규화 및/또는 증가된 이동성을 포함하나 이에 한정되지 않는, 대상체에서의 효과를 가져온다.
조합 치료 또한, 본 발명에 의해 고려된다. 본 설명에 사용된 조합은 동시 치료 또는 순차 치료 둘 다를 포함한다. 레트 증후군을 위한 표준적인 의학적 치료와 본 발명의 방법의 조합은 신규한 치료법과의 조합이므로 구체적으로 고려된다.
출생 이후 필요로 하는 개인에 대한 전달이 고려되나, 태아로의 자궁 내 전달 또한, 고려된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 rAAV 게놈을 제공한다. rAAV 게놈은 MECP2를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 측면에 배치되는 1개 이상의 AAV ITR을 포함한다. 이 폴리뉴클레오티드는 표적 세포에서 기능적인 전사 제어 DNA들, 구체적으로는 프로모터 DNA 및 폴리아데닐화 신호 서열 DNA에 작동 가능하게 연결되어 "유전자 카세트"를 형성한다. 유전자 카세트는 구체적으로 뉴런 내에서 또는 구체적으로 아교 세포 내에서 발현을 가능하게 하는 프로모터를 포함할 수 있다. 예로는 뉴런 특이적 에놀라제 및 아교 원섬유 산성 단백질 프로모터가 포함된다. 섭취된 약 제어 하의 유도성 프로모터도 사용될 수 있다. 예로는 테트라사이클린(TET 온/오프) 시스템[Urlinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(14):7963-7968 (2000)] 및 엑디손 수용체 조절성 시스템[Palli et al., Eur J. Biochem 270: 1308-1315 (2003]과 같은 시스템이 포함되나, 이에 한정되지 않는다. 유전자 카세트는 폴리뉴클레오티드가 포유동물 세포에서 발현될 때 RNA 전사체의 프로세싱을 촉진하기 위하여 인트론 서열을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 rAAV 게놈은 AAV rep 및 cap DNA가 없다. rAAV 게놈의 AAV DNA(예컨대, ITR)은, AAV 혈청형 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13 및 AAVrh74를 포함하나 이에 한정되지 않는, 재조합 바이러스가 유래될 수 있는 임의의 AAV 혈청형으로부터 유래할 수 있다. AAV 혈청형의 게놈의 뉴클레오티드 서열은 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, AAV9 게놈은 문헌[Gao et al., J. Virol., 78: 6381-6388 (2004)]에 제공되어 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 rAAV 게놈을 포함하는 DNA 플라스미드를 제공한다. 이 DNA 플라스미드는 AAV9 캡시드 단백질이 있는 감염성 바이러스 입자 내로 rAAV 게놈을 조립하기 위하여 AAV의 헬퍼 바이러스(예컨대, 아데노바이러스, E1-결실 아데노바이러스 또는 헤르페스 바이러스) 감염이 허용되는 세포로 전달된다. 패키징될 AAV 게놈, rep 및 cap 유전자, 그리고 헬퍼 바이러스 기능이 세포로 제공되는 rAAV 입자를 생산하는 기술은 당해 분야에서 표준적이다. rAAV의 생산은 다음의 성분이 단일 세포(본 설명에서 패키징 세포라 표시됨) 내에 존재할 것을 요구한다: rAAV 게놈, rAAV 게놈과 분리된(즉, rAAV 게놈 내에 있지 않은) AAV rep 및 cap 유전자, 그리고 헬퍼 바이러스 기능. 위형(pseudotyped) rAAV의 생산은 예를 들어, WO 01/83692에 개시되어 있으며, WO 01/83692는 그 전체가 본 설명에 참조로 포함된다. 다양한 구현예에서, AAV 캡시드 단백질은 개질되어 재조합 벡터의 전달을 증진시킬 수 있다. 캡시드 단백질의 개질은 일반적으로 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, US 2005/0053922 및 US 2009/0202490(이들의 개시 내용은 그 전체가 본 설명에 참조로 포함됨) 참조.
패키징 세포의 생성 방법은 AAV 입자 생산에 필수적인 모든 성분들을 안정적으로 발현하는 세포주를 생성하는 것이다. 예를 들어, AAV rep 및 cap 유전자가 없는 rAAV 게놈을 포함하는 플라스미드(또는 다수의 플라스미드), rAAV 게놈과 분리된 AAV rep 및 cap 유전자, 및 네오마이신 저항성 유전자와 같은 선택 가능한 마커가 세포의 게놈 내로 통합된다. AAV 게놈은 GC 테일링(Samulski et al., 1982, Proc. Natl. Acad. S6. USA, 79:2077-2081), 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위를 함유하는 합성 링커 첨가(Laughlin et al., 1983, Gene, 23:65-73)와 같은 절차에 의해, 또는 직접적인, 둔단 연결(Senapathy & Carter, 1984, J. Biol. Chem., 259:4661-4666)에 의해 박테리아 플라스미드 내로 도입되었다. 그런 다음, 패키징 세포주를 아데노바이러스 같은 헬퍼 바이러스로 감염시킨다. 이 방법의 장점은 이 세포가 선택 가능하며 rAAV의 대규모 생산에 적합하다는 점이다. 적합한 방법의 다른 예는 rAAV 게놈 및/또는 rep 및 cap 유전자를 패키징 세포 내로 도입하기 위하여 플라스미드보다는 아데노바이러스 또는 바큘로바이러스를 이용한다.
rAAV 생산의 일반적인 원리는 예를 들어, 문헌[Carter, 1992, Current Opinions in Biotechnology, 1533-539]; 및 [Muzyczka, 1992, Curr. Topics in Microbial. and Immunol., 158:97-129]에서 검토되어 있다. 다양한 접근법이 다음 문헌에 기술되어 있다: Ratschin et al., Mol. Cell. Biol. 4:2072 (1984); Hermonat et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6466 (1984); Tratschin et al., Mo1. Cell. Biol. 5:3251 (1985); McLaughlin et al., J. Virol., 62:1963 (1988); 및 Lebkowski et al., 1988 Mol. Cell. Biol., 7:349 (1988). Samulski et al. (1989, J. Virol., 63:3822-3828); 미국 특허 제5,173,414호; WO 95/13365 및 상응하는 미국 특허 제5,658,776호; WO 95/13392; WO 96/17947; PCT/US98/18600; WO 97/09441 (PCT/US96/14423); WO 97/08298 (PCT/US96/13872); WO 97/21825 (PCT/US96/20777); WO 97/06243 (PCT/FR96/01064); WO 99/11764; Perrin et al. (1995) Vaccine 13:1244-1250; Paul et al. (1993) Human Gene Therapy 4:609-615; Clark et al. (1996) Gene Therapy 3:1124-1132; 미국 특허 제5,786,211호; 미국 특허 제5,871,982호; 및 미국 특허 제6,258,595호. 위의 문헌은 rAAV 생산과 관련된 문헌의 해당 부분을 특히 강조하여 본 설명에서 그 전체가 참조로 포함된다.
따라서, 본 발명은 복제 결핍성, 감염성 rAAV를 생산하는 패키징 세포를 제공한다. 일 구현예에서, 패키징 세포는 HeLa 세포, 293 세포 및 PerC.6 세포(동원 293 계통)와 같은 안정적으로 형질전환된 암 세포일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 패키징 세포는 저계대 293 세포(아데노바이러스의 E1로 형질전환된 인간 태아 신장 세포), MRC-5 세포(인간 태아 섬유모세포), WI-38 세포(인간 태아 섬유모세포), Vero 세포(원숭이 신장 세포) 및 FRhL-2 세포(붉은털 원숭이 태아 폐 세포)와 같은, 형질전환된 암 세포가 아닌 세포이다.
따라서, 또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 rAAV 게놈을 포함하는 rAAV9(즉, 복제 결핍성, 감염성 캡시드화 rAAV9 입자)와 같은 rAAV를 제공한다. 이 rAAV의 게놈은 AAV rep 및 cap DNA가 없다. 즉, 게놈의 ITR 사이에 AAV rep 또는 cap DNA가 없다. 일부 구현예에서, rAAV 게놈은 자기 상보적 게놈이다. 일부 구현예에서, rAAV 게놈은 단일 가닥 게놈이다.
"AVXS-201"로 명명된 자기 상보적 AAV9(scAAV9)와 같은 rAAV가 제공된다. 이의 유전자 카세트(서열번호 1에 기재된 AVXS-201 게놈의 뉴클레오티드 151-2558)는, 서열에, 마우스 MECP2 유전자로부터의 546bp 프로모터 단편(서열번호 2)(역배향의 NC_000086.7의 뉴클레오티드 74085586-74086323), SV40 인트론, 인간 MECP2B cDNA(서열번호 3)(CCDS 데이터베이스 #CCDS48193.1) 및 합성 폴리아데닐화 신호 서열(서열번호 4)을 갖는다. 이 유전자 카세트의 양 측면에는, 함께 자기 상보적 AAV 게놈의 패키징을 할 수 있게 하는 돌연변이체 AAV2 반전 말단 반복부(ITR)와 야생형 AAV2 반전 말단 반복부가 있다. 이 게놈은 AAV rep 및 cap DNA가 없다. 즉, 이 게놈의 ITR들 사이에는 AAV rep 또는 cap DNA가 없다.
"scAAV9.738.Mecp2"로 명명된 scAAV9와 같은 rAAV가 제공된다. 이의 유전자 카세트(서열번호 5에 기재된 scAAV9.738.Mecp2 게놈의 뉴클레오티드 198-2890)는, 서열에, 마우스 MECP2 유전자로부터의 738bp 프로모터 단편(서열번호 6)(역배향의 NC_000086.7의 뉴클레오티드 74085586-74086323), SV40 인트론, 마우스 MECP2α cDNA(서열번호 7)(CCDS 데이터베이스 #CCDS41016.1) 및 소 성장 호르몬 유전자로부터의 폴리아데닐화 신호 서열을 갖는다. 이 유전자 카세트의 양 측면에는, 함께 자기 상보적 AAV 게놈의 패키징을 할 수 있게 하는 돌연변이체 AAV2 반전 말단 반복부(ITR)와 야생형 AAV2 반전 말단 반복부가 있다. 이 게놈은 AAV rep 및 cap DNA가 없다. 즉, 이 게놈의 ITR들 사이에는 AAV rep 또는 cap DNA가 없다.
rAAV9 게놈의 유전자 카세트를 포함하나 이에 한정되지 않는, rAAV9 게놈의 보존적 뉴클레오티드 치환이 고려된다. 예를 들어, 유전자 카세트의 MECP2 cDNA는 scAAV9.738.Mecp2의 MECP2α cDNA 또는 AVXS-201의 MECP2B cDNA에 대해 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 나타낼 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 rAAV9에 의해 암호화된 MECP2 폴리펩티드는 변이형 MECP2 폴리펩티드일 수 있다. 변이형 폴리펩티드는 MECP2 활성을 보유하고, scAAV9.738.Mecp2의 MECP2α cDNA 또는 AVXS-201의 MECP2B cDNA에 의해 암호화된 MECP2 폴리펩티드의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99 또는 99.5% 동일한 아미노산 서열을 갖는다.
rAAV는 컬럼 크로마토그래피 또는 염화세슘 구배와 같은 당해 분야에 표준적인 방법에 의해 정제될 수 있다. 헬퍼 바이러스로부터 rAAV 벡터를 정제하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, Clark et al., Hum. Gene Ther., 10(6): 1031-1039 (1999); Schenpp and Clark, Methods Mol. Med., 69: 427-443 (2002); 미국 특허 제6,566,118호 및 WO 98/09657에 개시된 방법을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 MECP2 폴리펩티드를 암호화하는, rAAV9와 같은, rAAV를 포함하는 조성물을 고려한다.
본 발명의 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체 중에 rAAV를 포함한다. 또한, 조성물은 희석제 및 보강제 같은 다른 성분을 포함할 수 있다. 허용 가능한 담체, 희석제 및 보강제는 수용자에게 무독하며, 사용되는 투여량 및 농도에서 바람직하게는 불활성이고, 인산, 시트르산 또는 기타 유기산과 같은 완충제; 아스코르브산과 같은 항산화제; 저분자량 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 폴리머; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신과 같은 아미노산; 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함한, 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트화제; 만니톨 또는 소르비톨과 같은 당 알코올; 나트륨과 같은 염 형성 반대 이온; 및/또는 트윈, 플루로닉 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)와 같은 비이온성 계면활성제를 포함한다.
멸균 주사 용액은, 필요에 따라 위에 열거된 다양한 다른 성분들과 함께 적절한 용매에 필요한 양의 rAAV를 혼입한 다음, 필터 멸균화로 제조된다. 일반적으로, 분산물은 기본적인 분산 매질 및 위에 열거된 것들으로부터의 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클 내로 멸균화된 활성 성분을 혼입하여 제조된다. 멸균 주사 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 미리 멸균-여과시킨 용액으로부터 활성 성분 더하기 임의의 추가적인 원하는 성분의 분말을 수득하는 진공 건조 및 냉동 건조 기술이다.
본 발명의 방법에서 투여되는 rAAV의 역가 및 투여량은 예를 들어, 특정 rAAV, 투여 방식, 치료 목표, 개인, 투여 시기 및 표적 대상 세포 유형(들)에 따라 다를 것이며, 당해 분야에서 표준적인 방법에 의해 결정될 수 있다. rAAV의 역가는 ml당 약 1x106, 약 1x107, 약 1x108, 약 1x109, 약 1x1010, 약 1x1011, 약 1x1012, 약 1x1013 내지 약 1x1014 이상의 DNA 분해효소 저항성 입자(DRP) 범위일 수 있다. 투여량은 또한, 바이러스 게놈 단위(vg)로 표현될 수 있다. rAAV의 이러한 투여량은 약 1x109 vg 이상, 약 1x1010 vg 이상, 약 1x1011 vg 이상, 약 1x1012 vg 이상, 약 6x1012 이상, 약 1x1013 vg 이상, 약 1.3x1013 vg 이상, 약 1.4x1013 vg 이상, 약 2x1013 vg 이상, 약 3x1013 vg 이상, 약 6x1013 vg 이상, 약 1x1014 vg 이상, 약 3x1014 이상, 약 6x1014 이상, 약 1x1015 vg 이상, 약 3x1015 이상, 약 6x1015 이상, 약 1x1016 이상, 약 3x1016 이상, 또는 약 6x1016 이상 범위일 수 있다. 신생아의 경우, rAAV의 투여량은 약 1x109 vg 이상, 약 1x1010 vg 이상, 약 1x1011 vg 이상, 약 1x1012 vg 이상, 약 6x1012 이상, 약 1x1013 vg 이상, 약 1.3 x1013 vg 이상, 약 1.4x1013 vg 이상, 약 2x1013 vg 이상, 약 3x1013 vg 이상, 약 6x1013 vg 이상, 약 1x1014 vg 이상, 약 3x1014 이상, 약 6x1014 이상, 약 1x1015 vg 이상, 약 3x1015 이상, 약 6x1015 이상, 약 1x1016 이상, 약 3x1016 이상, 또는 약 6x1016 이상 범위일 수 있다.
본 발명의 방법은 (신경 세포 또는 아교 세포를 포함하나 이에 한정되지 않는) 표적 세포의 형질 도입으로 이어진다. 용어 "형질 도입"은 수용 세포에 의한 기능적 MECP2 폴리펩티드의 발현을 초래하는 본 발명의 복제 결핍 감염성 rAAV를 통한 생체 내 또는 시험관 내에서의 표적 세포 내로의 폴리뉴클레오티드의 투여/전달을 지칭하는 데 사용된다.
본 발명의 rAAV를 이용한 세포의 형질 도입은 rAAV에 의해 암호화된 MECP2 폴리펩티드의 지속적인 발현을 초래한다. 일부 구현예에서, 목표 발현 수준은 레트 증후군을 앓지 않는 대상체에서의 정상적인(또는 야생형의) 생리적인 발현 수준의 약 75% 내지 약 125%인 것으로 예상된다. 목표 발현 수준은 정상 발현 수준의 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 100%, 약 105%, 약 110%, 약 115%, 약 120% 또는 약 125%일 수 있다.
본 발명의 치료 방법의 일부 구현예에서, 비이온성, 저삼투성 조영제도 환자에 투여된다. 이러한 조영제에는 이오비트리돌, 이오헥솔, 이오메프롤, 이오파미돌, 이오펜톨, 이오프로마이드, 이오버솔, 이옥실란, 및 2종 이상의 조영제의 혼합물을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 따라서, 일부 구현예에서 치료 방법은 환자에 대한 이오헥솔의 투여를 더 포함한다. 비이온성, 저삼투성 조영제는 환자의 중추 신경계의 표적 세포의 형질 도입을 증가시키는 것으로 생각된다. 본 개시의 rAAV가 단독으로 사용될 때의 세포의 형질 도입과 비교하여, 본 개시의 rAAV가 본 설명에 기술된 조영제와 조합하여 사용될 때 세포의 형질 도입이 증가된다고 예상된다. 다양한 구현예에서, 조영제와 조합하여 사용되지 않을 때의 본 개시의 벡터의 형질 도입과 비교하여, 본 개시의 벡터가 본 설명에 기술된 조영제와 조합하여 사용될 때 세포의 형질 도입은 적어도 약 1%, 또는 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 100%, 적어도 약 120%, 적어도 약 150%, 적어도 약 180%, 적어도 약 200%, 적어도 약 250%, 적어도 약 300%, 적어도 약 350%, 적어도 약 400%, 적어도 약 450%, 적어도 약 500% 이상 증가된다. 추가적인 구현예에서, 조영제와 조합하여 사용되지 않을 때의 본 개시의 벡터의 형질 도입과 비교하여, 본 개시의 벡터가 본 설명에 기술된 조영제와 조합하여 사용될 때 세포의 형질 도입은 약 10% 내지 약 50%, 또는 약 10% 내지 약 100%, 또는 약 5% 내지 약 10%, 또는 약 5% 내지 약 50%, 또는 약 1% 내지 약 500%, 또는 약 10% 내지 약 200%, 또는 약 10% 내지 약 300%, 또는 약 10% 내지 약 400%, 또는 약 100% 내지 약 500%, 또는 약 150% 내지 약 300%, 또는 약 200% 내지 약 500% 증가된다.
일부 구현예에서, 환자가 트렌델렌버그 자세(머리를 아래로 한 자세)를 취할 때 세포의 형질 도입이 증가된다고 예상된다. 일부 구현예에서, 예를 들어, 환자는 경막 내 벡터 주입 도중 또는 이후에 약 1도 내지 약 30도, 약 15도 내지 약 30도, 약 30도 내지 약 60도, 약 60도 내지 약 90도, 또는 약 90 내지 약 180도로 머리를 아래로 한 자세로 기울여진다. 다양한 구현예에서, 트렌델렌버그 자세가 사용되지 않을 때와 비교하여, 트렌델렌버그 자세가 본 설명에 기술된 바와 같이 사용될 때 세포의 형질 도입은 적어도 약 1%, 또는 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 100%, 적어도 약 120%, 적어도 약 150%, 적어도 약 180%, 적어도 약 200%, 적어도 약 250%, 적어도 약 300%, 적어도 약 350%, 적어도 약 400%, 적어도 약 450%, 적어도 약 500% 이상 증가된다.
추가적인 구현예에서, 조영제 및 트렌델렌버그 자세와 조합하여 사용되지 않을 때의 본 개시의 벡터의 형질 도입과 비교하여, 본 개시의 벡터가 본 설명에 기술된 바와 같이 조영제 및 트렌델렌버그 자세와 조합하여 사용될 때 세포의 형질 도입은 약 10% 내지 약 50%, 또는 약 10% 내지 약 100%, 또는 약 5% 내지 약 10%, 또는 약 5% 내지 약 50%, 또는 약 1% 내지 약 500%, 또는 약 10% 내지 약 200%, 또는 약 10% 내지 약 300%,또는 약 10% 내지 약 400%, 또는 약 100% 내지 약 500%, 또는 약 150% 내지 약 300%, 또는 약 200% 내지 약 500% 증가된다.
또한, 본 개시는 치료 방법 구현예를 제공하는데, 이때, 본 개시의 벡터 및 조영제의, 이를 필요로 하는 환자의 중추 신경계로의 경막 내 투여는, 조영제 부존재 하에서 본 개시의 벡터가 투여될 때의 환자의 생존과 비교하여, 환자의 생존 증가를 가져온다. 다양한 구현예에서, 본 개시의 벡터 및 조영제의, 이를 필요로 하는 환자의 중추 신경계로의 투여는, 조영제 부존재 하에서 본 개시의 벡터가 투여될 때의 환자의 생존과 비교하여, 적어도 약 1%, 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 100%, 적어도 약 150%, 적어도 약 200% 이상의 환자의 생존 증가를 가져온다.
또한, 본 개시는 치료 방법 구현예를 제공하는데, 이때, 본 개시의 벡터 및 조영제의, 트렌델렌버그 자세를 취한, 이를 필요로 하는 환자의 중추 신경계로의 경막 내 투여는, 조영제 및 트렌델렌버그 자세의 부존재 하에서 본 개시의 벡터가 투여될 때의 환자의 생존과 비교하여, 환자의 생존의 추가적인 증가를 가져온다. 다양한 구현예에서, 본 개시의 벡터 및 조영제의, 트렌델렌버그 자세를 취한, 이를 필요로 하는 환자의 중추 신경계로의 투여는, 조영제 및 트렌델렌버그 자세의 부존재 하에서 본 개시의 벡터가 투여될 때의 환자의 생존과 비교하여, 적어도 약 1%, 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 100%, 적어도 약 150%, 적어도 약 200% 이상의 환자의 생존 증가를 가져온다.
실시예
본 발명은 다음에 의해 예시된다.
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암컷 및 수컷 레트 마우스 모델의 개념 증명 연구는 scAAV9.738.Mecp2의 정맥 내 주사 후의 치료 효능을 보여준다. (실시예 1)
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제2 세대 유전자요법 벡터인 AVXS-201은 Mecp2 -/y 마우스의 뇌실 내(ICV) 치료 후에 광범위한 용량에 걸쳐 생존 연장을 보여준다. AVXS-201 치료 후 생존 중앙값의 최대 증가는 477%였다. (실시예 2)
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AVXS-201로 치료한 수컷 Mecp2 -/y 마우스는 레트 마우스를 위해 개발된 종합 평가법으로 측정한 바에 따르면 오래 지속되는 행동 개선을 보여준다. (실시예 3)
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AVXS-201로 치료한 Mecp2 -/y 마우스에서의 표현형 이점은 중간 정도 수준의 단백질 발현으로 얻어진다. (실시예 4)
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AVXS-201을 이용한 야생형 마우스의 치료는 시험한 모든 용량에 걸쳐 내약성이 좋았는데, 행동 평점의 일관된 변화는 고용량군에서만 나타났다. (실시예 5 및 실시예 6)
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비인간 영량류에서의 경막 내 투약은 주사 후 18개월까지 AVXS-201이 안전하며 내약성이 좋음을 나타낸다. (실시예 7)
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AVXS-201은 1회의 경막 내 주사 후에 비인간 영량류 뇌와 척수에서 광범위하게 생리적인 수준으로 이식유전자를 발현시킨다. (실시예 8)
실시예 1
암컷 레트 마우스에서의 레트 증후군 개념 증명 연구를 위한 유전자요법
개념 증명으로서, 증상을 보이는 수컷 및 암컷 레트 마우스를 정맥 내로 scAAV9.738.Mecp2로 처리하였다[Garg et al., The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience, 33: 13612-13620 (2013)]. scAAV9.738.Mecp2의 재조합 바이러스 게놈(서열번호 5)은 마우스 Mecp2α cDNA(CCDS Database # CCDS41016.1)의 발현을 추진하는 마우스 Mecp2 유전자로부터의 738bp 프로모터 단편[Adachi et al., Human Molecular Genetics, 14: 3709-3722 (2005)] 및 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호를 포함한다. 이 유전자 카세트(서열번호 5의 뉴클레오티드 198-2890)의 양 측면에는, 자기 상보적 AAV 게놈의 패키징을 할 수 있게 하는 돌연변이체 AAV2 반전 말단 반복부(ITR)와 야생형 AAV2 ITR이 있다.
자기 상보적 AAV9(scAAV9)는 293 세포에서 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드 pHelper(Stratagene, 미국 캘리포니아 주 산타 클라라 소재)와 함께 이전에 기술한 바와 같이 Rep2Cap9 서열을 암호화하는 플라스미드[Gao et al., J. Virol., 78: 6381-6388 (2004)]로, 이중 가닥 AAV2-ITR 기반 벡터를 이용한 일시적인 형질감염 절차에 의해 생산하였다. 바이러스를 실험을 위해 세 개의 별도의 배치에서 생산하였고, 두 단계의 염화세슘 밀도 구배 정제로 정제하고, PBS에 대해 투석하고, 0.001% 플루로닉-F68로 제형화하여 바이러스 응집을 막고, 4℃에 보관하였다. 모든 벡터 제제는 Taq-Man 기술을 이용한 정량적 PCR에 의해 적정하였다. 벡터의 순도는 4 내지 12% 도데실황산나트륨-아크릴아미드 겔 전기영동 및 은 염색(Invitrogen, 미국 캘리포니아 주 칼스배드 소재)으로 평가하였다.
Mecp2 널 대립 유전자를 가진 수컷 마우스에 4 내지 6주령 사이에 scAAV9.738.Mecp2 또는 scAAV9 대조군 벡터 3x1012vg를 정맥 내 처리하였다. 동물의 생존을 지켜보았고, 표현형 점수에 대해 매주 평가하였다[Guy et al., Science, 315: 1143-1147 (2007)].
Guy et al. 2007로부터의 표현형 점수법의 성분
A. 이동성: 벤치 위에 올려놓았을 때, 그런 다음 부드럽게 다뤄질 때 마우스를 관찰한다. 0 = 야생형과 동일. 1 = 야생형과 비교 시 감소된 움직임: 처음 벤치 위에 올려놓을 때 연장된 동결 기간 및 더 오랜 기간을 무운동에 썼다. 2 = 벤치 위에 올려놓을 때 자발적인 움직임 없음; 마우스는 가벼운 찌르기 또는 근처에 놓인 먹이에 반응하여 움직일 수 있다. (비고: 마우스는 자신들의 케이지 환경에 있을 때 더욱 활발해질 수 있다.)
B. 보행: 0 = 야생형과 동일. 1 = 감소된 골반 올림으로 걷거나 뛸 때 야생형보다 뒷다리가 더 넓게 퍼져 "동요성" 보행을 초래한다. 2 = 더 중증의 이상: 발을 들 때 떨림, 뒤로 걷거나 양 뒷발을 한꺼번에 들어올림으로써 '토끼뜀'을 뛴다.
C. 뒷다리 움켜쥠: 꼬리의 맨 아랫 부분을 잡아서 들어올렸을 때 마우스 관찰. 0 = 다리를 바깥으로 벌림. 1 = 뒷다리가 서로를 향해 (닿지는 않고) 당겨지거나 한쪽 다리가 몸 쪽으로 당겨진다. 2 = 양 다리가 바싹 끌어당겨져 서로 닿거나 몸에 닿는다.
D. 떨림: 평평한 손바닥 위에 서 있는 동안 마우스 관찰. 0 = 떨림 없음. 1 = 간헐적인 가벼운 떨림. 2* = 연속적 떨림 또는 간헐적인 격렬한 떨림
E. 호흡: 동물이 가만히 있는 동안 옆구리 움직임 관찰. 0 = 정상 호흡. 1 = 더욱 빠른 호흡의 짧은 기간 또는 호흡 중단의 짧은 기간이 산재된 규칙적 호흡 기간. 2* = 매우 불규칙한 호흡 - 가쁜 호흡 또는 헐떡임.
F. 일반적인 상태: 외피 상태, 눈, 몸의 자세와 같은 일반적인 건강 지표에 대해 마우스 관찰. 0 = 깨끗하고 윤기나는 외피, 맑은 눈, 정상적인 자세. 1 = 흐릿한 눈, 윤기없는/단정치 못한 외피, 다소 웅크린 자세. 2* = 굳어지거나 가늘게 뜬 눈, 털세움, 웅크린 자세.
도 4는 scAAV9.738.Mecp2 처리군이 실험기간 동안에는 생존 중앙값에 이르지 못했으나, 발표 시에는 대조군 처리된 동물보다 10주를 초과하여 능가하였음을 보여준다. 또한, scAAV9.738.Mecp2 처리된 동물은 대조군 처리된 동물과 비교하여 더 낮은 행동 점수를 나타냈다. 이환된 암컷 마우스로 실험을 반복하였다(도 5). 수컷을 대상으로 한 이전과 마찬가지로, 동물에 scAAV9.738.Mecp2 또는 대조군을 IV 처리하였다. 레트 마우스가 증상을 보이는 시기인 10 내지 12월령 사이에 암컷을 처리하였다. 주사 후 대략 6개월간 동물을 지켜보았고, 표현형 점수를 시험하였다. 중요한 것은, 암컷 레트 마우스는 더욱 중증의 수컷처럼 조기 치사를 나타내지 않는다는 점이다[Guy et al., Nature Genetics, 27: 322-326 (2001)]. scAAV9.738.Mecp2 처리는 질병의 진행을 중단시켰고, 점수가 거의 1로 떨어져 질병 중증도의 역전을 나타내었다. 이는 거의 6의 표현형 점수로 실험을 마쳐 증상 악화를 나타내는 대조군 처리 동물과는 극명하게 대조적이었다(도 5의 C). 로타로드, 반전 스크린 시험, 플랫폼 시험 및 네스팅 능력으로부터의 데이터 모두는 대조군 처리 동물과 비교하여 scAAV9.738.Mecp2 처리 동물에서의 행동 개선을 뒷받침한다. scAAV9.738.Mecp2 처리 암컷의 뇌 사후 분석은 MECP2 발현의 형광 강도 측정치가 야생형 뇌를 반영함을 보여주어, 유전자요법 이식 유전자 발현이 대략 생리적 수준이었음을 나타낸다.
실시예 2
AVXS-201 전임상 효능 연구
유전자 발현의 생리적 수준을 유지하면서 패키징 효율을 개선하고 임상적으로 관련 있는 인간 MECP2 cDNA를 혼입하기 위하여, scAAV9.738.Mecp2를 더 짧은 프로모터, 인간 MECP2B cDNA 및 합성 폴리아데닐화 신호로 다시 유전자 조작하였다. 다시 유전자 조작된 게놈을 아래에 기술된 바와 같이 AAV9 캡시드 내로 패키징하고, 이후 생성된 scAAV를 "AVXS-201"이라 명명하였다(도 6). AVXS-201의 본래 명칭은 "AAV9-P545-MeCP2"이다.
프로모터 영역 서열(마우스 MeCP2 프로모터 단편)(서열번호 2)
암호화 영역 서열(인간 MeCP2B cds)(서열번호 3)
폴리A 서열(합성)(서열번호 4)
scAAV9는 293 세포에서 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드 pHelper(Stratagene, 미국 캘리포니아 주 산타 클라라 소재)와 함께 이전에 기술한 바와 같이 Rep2Cap9 서열을 암호화하는 플라스미드[Gao et al., 위 참조]로, 이중 가닥 AAV2-ITR 기반 벡터를 이용한 일시적인 형질감염 절차에 의해 생산하였다. 바이러스를 실험을 위해 세 개의 별도의 배치에서 생산하였고, 두 단계의 염화세슘 밀도 구배 정제로 정제하고, PBS에 대해 투석하고, 0.001% 플루로닉-F68로 제형화하여 바이러스 응집을 막고, 4℃에 보관하였다. 모든 벡터 제제는 Taq-Man 기술을 이용한 정량적 PCR에 의해 적정하였다. 벡터의 순도는 4 내지 12% 도데실황산나트륨-아크릴아미드 겔 전기영동 및 은 염색(Invitrogen, 미국 캘리포니아 주 칼스배드 소재)으로 평가하였다.
도 4에서와 같이 동일한 계통의 레트 마우스에서 효능 및 투약 연구를 수행하였다. 실시예 1과 실시예 2 사이의 용량은 적정 방법의 개선으로 인하여 비교하지 않았다. 실시예 1의 실험은 바이러스 제제의 광학적 적정을 이용하였으나, 실시예 2 이하의 연구는 더욱 정확한 디지털 액적 PCR 적정을 이용한다. 경막 내 투여의 제안된 임상적 전달 경로를 모방하기 위하여, 생후 1일 새끼들에게 뇌실 내(ICV)로 주사하였다. 경막 내 전달은 AVXS-201을 레트 증후군의 핵심 작용 부위인 중추 신경계에 직접적으로 전달하고자 선택하였다. 새끼들의 자연스러운 생활을 지켜보았고, 생존, 종합 표현형 점수, 개방 현장 및 로타로드 행동을 평가하였다. 두 로그 용량 범위에 걸친 생존 데이터를 도 7에 나타내었다. 도 7에 나타낸 결과는 벡터 및 본 발명의 치료 방법에 사용된 기술의 조합이 개선된 결과를 달성함을 증명한다. 시험한 모든 용량이 대조군 처리 Mecp2 y/- 마우스에 비해 생존 중앙값을 연장시켰고, 관찰된 최대 개체 생존은 대조군 처리 레트 마우스의 93일과 비교하여 500일(진행 중)에 달했다. 최장 수명 중앙값(315일)은 동물당 1.44x1010vg의 중간 용량으로 달성되었다. 이 데이터는 이전에 관찰된 부적절한 MECP2 투여량(유전자 카피 수)의 효과와 본 설명에서 달성된 결과를 구별짓는 종 모양의 용량 반응(도 7의 B)을 보여준다[예를 들어, Lombardi et al., The Journal of Clinical Investigation, 125: 2914-2923 (2015) 참조]. 중요한 것은, 시험한 최고 용량에서조차, AVXS-201 처리는 대조군 처리와 비교하여 Mecp -/y 마우스의 생존을 단축시키지 않았다는 점이다.
생존 이외에도, 치료된 마우스와 대조군 마우스를 대상으로 레트 표현형(이전 실시예에 기재된 표현형)에 대해 매주 점수를 매겼다. 치료되지 않은 수컷은 0점으로부터 10주령에는 평균 피크 5.25까지 급격히 진행되었다(도 8). 대조적으로, 모든 처리군의 표현형 점수는 17주령에 겨우 약 2점에 이르렀고, 예외적으로 5.56x1010vg 군은 18주차에 5점에 이르렀다. 또한, 처리된 동물 및 대조군 동물을 개방 현장 및 로타로드 시험에서 평가하였다(도 9). 감소된 자발적인 움직임은 수컷 레트 마우스의 증상이다. 자발적인 움직임 및 속도를 평가하는 개방 현장 분석을 그룹이 2 내지 3개월령일 때 수행하였다. 이환된 동물들은 야생형 마우스와 비교하여 총 이동 거리에 거의 43%의 감소가 있었다. 대조군 처리된 Mecp2 녹아웃 수컷에 비해 AVXS-201 처리군 중 둘을 제외한 모든 군에서 이동 거리의 상당한 증가가 관찰되었다. 또한, 대조군 처리된 녹아웃과 비교하여 속도가 유의미하게 개선되었다. 이는 수컷 레트 마우스 모델의 AVXS-201 처리가 탐색 행동 및 보행을 개선함을 보여준다. 처리된 동물 및 대조군 동물을 대상으로 3개월령에 운동 협응의 척도인 로타로드에서의 수행을 시험하였다. 동물들을 3일 연속하여 시험하고, 일수 및 용량에 걸쳐 점수의 평균을 냈다. 그에 따른 데이터를 도 9의 C에 나타내었다. 대조군 처리된 Mecp -/y 마우스는 대조군 처리된 야생형 한배 새끼들과 비교하여 로타로드에서 유의미하게 나빴다. 7.00x109 및 1.44x1010vg 코호트에서 대조군 처리에 비해 로타로드 수행이 유의미하게 개선되었다.
실시예 3
처리된 레트 마우스 뇌에서의 MECP2 단백질의 AVXS-201 발현
주사 후 3주차에 PBS 처리된 수컷 야생형, 비처리된 레트 및 벡터 처리된 레트 동물들을 안락사시켜, 생후 1일 AVXS-201의 ICV 주사 후 뇌에서의 MECP2 단백질 수준을 조사하였다. 한쪽 뇌 반구를 균질화하고, 웨스턴 블롯으로 분석하여 MECP2 발현을 모니터링하였다. 대표적인 블롯 및 정량화를 도 10에 나타내었다. PBS 처리 야생형 뇌에 대해 정규화한 후, 녹아웃 및 1.75x109vg AVXS-201 용량군은 검출 가능한 수준의 MECP2를 나타내지 않았다. 3.50x109vg 및 7.00x109vg 처리는 각각 야생형 수준의 약 1% 및 3.6%에 이르는 검출 가능한 MECP2 수준을 생성하였다. 생존 중앙값의 증가로 측정하였을 때 가장 효과적인 용량(1.44x1010vg)은 야생형 MeCP2 수준의 약 11%를 산출하였다. 웨스턴 블롯으로 조사한 5.56x1010vg 용량은 야생형의 약 54%의 MECP2 수준을 생성한 반면, 1.13x1011은 야생형 수준의 2x를 초과하여 달성하였다. 이러한 데이터는 단백질 발현 수준 및 뇌 전체에서의 분포가 MECP2 유전자요법의 효능을 예측하는 데 핵심적임을 보여준다.
실시예 4
AVXS-201로의 야생형 마우스 치료는 안전하고 내약성이 좋다
MECP2 치환요법의 중요한 관심사는 온전한 카피의 MECP2를 발현하는 세포에 대한 영향을 평가하는 것이다. 이를 염두에 두고 MECP2 이식 유전자의 생리적인 조절을 지지하고자 뮤린 Mecp2 프로모터의 단편을 혼입하여 AVXS-201이 설계되었다. AVXS-201의 안전성을 시험하기 위하여, 수컷 레트 마우스에서처럼 AVXS-201의 P1 ICV 주사를 받은 야생형 마우스 코호트에 대해 생존 및 행동 분석을 수행하였다.
총 131마리의 야생형 수컷 마우스를 다양한 ICV 용량의 AVXS-201로 처리하고, 생존을 지켜보았다(도 11). 목표가 된 치료 용량(1.44x1010vg)에서 어떠한 사망도 보고되지 않았고, 21마리의 처리 동물은 P342 내내 생존해 있었다. PBS 처리군에서는 어떠한 사망도 보고되지 않았고, 3.50x109, 2.78x1010 및 1.13x1011vg 처리군에서는 각각 한 마리의 사망이 보고되었다. 박스 1의 기준을 이용한 행동 점수법은 벡터 처리군이 대개 1 미만의 평균 표현형 점수를 나타냄을 보여준다. 1 초과의 평균 종합 점수는 두 개의 최고 용량군(5.56x1010 및 1.13x1011vg)에서만 관찰되었다. 2 내지 3개월령에서의 개방 현장 시험은 벡터 및 PBS 처리 야생형 수컷 사이에 어떠한 통계적 차이도 없음을 보여주었다(도 12). 흥미롭게도, 3개월령의 대조군 처리된 야생형 마우스와 비교하여 1.13x1011vg 코호트에서 로타로드 수행의 유의미한 감소가 검출되었다. 이러한 데이터는 가장 높은 AVXS-201 용량에서 MECP2 과발현의 독성 효과를 시사한다. 이러한 데이터를 종합하면, 야생형 세포만을 형질도입시키는 AVXS-201 처리의 "최악의 시나리오"에서, 목표가 된 치료 용량에서는 동물 생존 및 행동에 최소한의 영향이 있음을 나타낸다.
실시예 5
생리학적 수준의 MECP2는 치료적 용량의 AVXS-201을 처리한 야생형 마우스의 뇌에서 유지된다
증상을 보이는 MECP2 과발현과 관련된 수준을 추가적으로 조사하기 위하여, 야생형 수컷 마우스에 PBS 또는 치료 목표인 1.44x1010vg 또는 시험한 최고 용량인 1.13x1011vg로 AVXS-201을 P1 ICV 주사로 제공하였다. 동물들을 주사 후 3주차에 안락사시켰고, 웨스턴 블롯을 위해 뇌를 채취하였다. 비교를 위하여, Tg3이라 지칭되는 MECP2 과발현의 마우스 모델로부터 뇌를 따라 조직을 블롯팅하였다. 뇌를 별개의 영역(Cb = 소뇌, Med = 연수, Hipp = 해마, Ctx = 피질 및 Mid = 중뇌; 도 13)으로 나누고, 개별 영역을 블롯팅을 위해 균질화하였다. PBS 처리된 야생형 뇌의 MECP2 수준에 대해 데이터를 정규화하였다. 목표 치료 용량(1.44x1010vg)으로의 치료는 검사한 모든 영역에 걸쳐 야생형 조직의 1 내지 1.5배의 MECP2 수준을 나타냈다. 고용량(1.13x1011vg)은 야생형 수준의 1.31 내지 2.56배 범위였으나, Tg3 조직의 2.31 내지 3.93배 수준에 이르지 못했다. 앞서 제시된 행동 및 생존 데이터와 함께 이러한 데이터는 AVXS-201이 목표가 된 용량으로 투여될 때 거의 생리학적 수준으로 단백질을 발현한다는 확신을 준다. 중요한 것은, 치료적 투약 용량은 MECP2 중복 증후군과 관련된 단백질 수준의 2배에 이르지 않는다는 점이다. 이는 유전자요법을 이용한 MECP2 치환 접근법의 안전성을 보여준다.
실시예 6
체중, 혈액학 및 혈청 화학은 AVXS-201의 경막 내 주사 후 18개월 내내 비인간 영장류에서 평범하다
AVXS-201 및 관련된 경막 내 주사 절차의 안전성 및 내약성을 조사하기 위하여, 세 마리의 처리된 수컷 시노몰구스 마카크를 주사 후 18개월 동안 지켜보았다. 투약 파라미터를 표 2에 나타내었다.
동물 두 마리를 의도했던 치료 용량(체중 기준 kg당 약 1.44x109vg 당량)으로 치료하였고, 한 마리는 약 2배 더 낮은 용량(체중 기준 kg당 약 7.00x108vg 당량)을 제공하였다. 경막 내 주사 절차는 사전에 문헌[Meyer et al., Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy, 23: 477-487 (2015)]에 기술되었다. 간략하게는, 벡터를 벡터가 확산되었음을 확인하기 위한 조영제와 혼합하였다. 마취시킨 대상체를 모로 누운 자세로 놓고, 약 L4/5 수준(척수의 원추 아래)의 후방 정중선 주사 부위를 준비하였다. 멸균 조건 하에서, 스타일릿이 구비된 척수 주사 바늘을 삽입하고, 지주막 하 관 삽입을 바늘로부터 투명한 CSF의 흐름으로 확인하였다. 지주막 하 공간의 압력을 감소시키기 위하여 0.8 ml의 CSF를 빼낸 다음, 곧이어 벡터 용액을 주사하였다. 주사 후, 동물들을 트렌델렌버그 자세를 취하게 하고, 10분 동안 머리를 아래로 한 채 몸을 기울였다. 처리된 동물들에 6개월령 또는 12개월령에 투약하고, 체중, 혈구 수 및 혈청 화학을 주사 후 첫 6개월 동안 매월, 그 이후에는 2개월마다 수집하였다. 체중은 도 14에 나타내었고, 혈구 수는 도 15에 나타내었으며, 혈청 화학은 만하이머 재단(미국 플로리다 주 홈스테드 소재)의 동일한 콜로니로부터의 대조군 처리된 동물로부터의 값을 그래프로 나타낸 도 16 및 도 17에 나타내었다. 종합하면, 벡터 처리된 동물로부터의 체중, 세포 수 및 혈청 값은 대조군 처리된 동물과 일치하였다. 기준선에서 벡터 처리된 두 마리의 동물에서 더 높았던 아밀라아제를 제외하고 주어진 동물에서 2회 넘게 연속된 관찰을 하는 동안 어떠한 값도 대조군으로부터 실질적으로 벗어나지 않았다. 이러한 데이터는 AVXS-201 및 경막 내 주사 절차가 안전하고 내약성이 좋음을 보여준다.
실시예 7
AVXS-201 경막 내 주사 후 비인간 영장류 조직의 조직병리학적 분석
생체 내(실시예 6) 및 사후 분석(실시예 8) 이외에도, 동물 15C38, 15C49 및 15C34(표 1)의 내장 및 신경계 조직 샘플을 파라핀 포매, 박편화 및 헤마톡실린 및 에오신 염색을 위해 GEMpath Inc.(미국 콜로라도 주 롱몬트)로 보냈다. 남아 있는 동물(표 8.2)은 여전히 살아 있으며, 연구 마무리 시 분석을 위해 보낼 예정이다. GEMpath 위원회 공인 수의병리학자가 슬라이드를 판독하고, 보고서를 작성하였다. 채취 및 조사된 조직은 표 3에 나타내었다. 병리학 보고서는 AVXS-201 처리가 6주 또는 18개월 시점에 임의의 프로토콜 규정 조직에서 병변을 유도하지 않았다고 언급한다.
실시예 8
AVXS-201의 경막 내 주사 후 비인간 영장류 뇌에서의 생리학적 수준의 MeCP2
12개월령, 수컷 시노몰구스 마카크 두 마리에게 위에 기술된 바와 같이 7.7x1012vg/kg의 AVXS-201을 경막 내로 주사하였다. 동물들은 주사 후 6주 동안 생존했고, MeCP2 발현 분석을 위해 안락사시켰다. 선택된 뇌 영역을 대상으로 면역조직화학에 의해 전체 MeCP2 발현을 분석하였다(도 18). 피질 및 피질 하 영역뿐만 아니라, 주사 부위(허리 척수) 근처에서도 명백한 MeCP2의 증가가 검출되지 않았다. 중요한 것은, 이들 데이터 또한, AVXS-201 주사를 받은 동물들의 조직의 임의의 중대한 이상을 보여주는 데 실패했다는 점이다. 이식 유전자 발현을 추가적으로 조사하기 위하여, 뇌 영역을 균질화하고, 동일한 콜로니의 동물로부터의 역사적 대조군 조직과 비교하였다(도 19). 후두 및 측두 피질, 시상하부, 허리 척수, 시상, 편도, 해마 및 소뇌의 샘플을 대상으로 전체 MeCP2 발현을 웨스턴 블롯으로 분석하였다. 조사한 영역 전체에 걸쳐, 어떠한 영역도 대조군보다 2배 이상의 MeCP2 발현 수준을 보여주지 않았다. 상승된 MeCP2는 각각 제3 뇌실 및 측뇌실에 인접한 영역인 시상하부와 편도에서 검출되었으나, 소뇌에서는 그렇지 않았다. 나아가, 주사 부위에 인접한 허리 척수는 상승된 MeCP2 수준을 보여주지 않았다. 이러한 데이터는 바이러스 용량 및 발현 구성체의 조합이 MECP2 발현을 조절함을 시사한다. 나아가, 현장 혼성화(ISH)를 수행하여 주사 후 6주 및 18개월에 벡터 유래 전사체를 검출하고 뇌에서의 분포를 결정하였다(도 20 및 21). 뇌 및 척수(후두 피질, 측두 피질, 해마, 뇌들보, 시상, 미상, 조가비핵, 위 둔덕, 교뇌, 연수, 소뇌, 경부, 흉부 및 허리 척수)에서 조사된 모든 영역은 대조군 처리된 동물의 조직에는 존재하지 않았던 벡터 유래 전사체의 발현을 보여주었다. 이러한 데이터는 벡터 유래 MECP2 전사체에 대한 ISH 프로브의 특이성을 보여주며, AVXS-201 프로모터 구성체가 NHP 신경계 조직에서 기능적임을 보여준다. 이러한 데이터는 AVXS-201이 요추 천자를 통해 투여될 때 CNS 전반에 걸쳐 광범위하게 분포하며 생리학적 수준으로 발현됨을 보여준다.
가출원 제62/423,618호로부터의 개시 내용
레트 증후군의 유전자요법
전사 인자 MeCP2를 복구하는 유전자요법은 외견상 자폐증 행동, 운동 기능 상실 및 조기 사망으로 이어지는 점진적인 신경발달 장애인 레트 증후군 치료를 위한 실현 가능한 전략으로 보인다. 본 발명자들은 절단된 내인성 프로모터의 제어 하에 인간 MECP2를 발현하는 아데노 관련 바이러스 혈청형 9(AAV9)를 개발하였다. 이 연구의 목적은 마우스(MeCP2 널 및 야생형) 및 비인간 영장류에서의 이 벡터의 효능 및 안전성을 평가하는 것이다. 계속된 연구를 통해, 우리의 목표는 이 치료를 작업대에서 병상으로 가져오는 것이다.
본 발명을 다양한 구현예 및 실시예의 측면에서 설명하였지만, 변형 및 개선이 당업자에게 일어날 것임은 이해된다. 따라서, 본 발명에는 청구범위에 나타나는 것과 같은 이러한 제한만 두어야 한다.
본 설명에 인용된 모든 문헌은 그 전체가 참조로 포함된다.
SEQUENCE LISTING
<110> Kaspar, Brian et al.
<120> INTRATHECAL DELIVERY OF RECOMBINANT ADENO-ASSOCIATED VIRUS
ENCODING METHYL-CPG BINDING PROTEIN 2
<130> 28335/50215PCT
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
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<211> 2558
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic Polynucleotide
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<221> misc_feature
<223> AVXS-201 genome
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<221> misc_feature
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<223> SV40 intron
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<221> misc_feature
<222> (2345)..(2393)
<223> synthetic pA
<220>
<221> misc_feature
<222> (2418)..(2558)
<223> ITR
<400> 1
ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60
ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggaatt cacgcgtgga 120
tctgaattca attcacgcgt ggtaccacgc gtgaacaacg ccaggctcct caacaggcaa 180
ctttgctact tctacagaaa atgataataa agaaatgctg gtgaagtcaa atgcttatca 240
caatggtgaa ctactcagca gggaggctct aataggcgcc aagagcctag acttccttaa 300
gcgccagagt ccacaagggc ccagttaatc ctcaacattc aaatgctgcc cacaaaacca 360
gcccctctgt gccctagccg cctctttttt ccaagtgaca gtagaactcc accaatccgc 420
agctgaatgg ggtccgcctc ttttccctgc ctaaacagac aggaactcct gccaattgag 480
ggcgtcaccg ctaaggctcc gccccagcct gggctccaca accaatgaag ggtaatctcg 540
acaaagagca aggggtgggg cgcgggcgcg caggtgcagc agcacacagg ctggtcggga 600
gggcggggcg cgacgtctgc cgtgcggggt cccggcatcg gttgcgcgcg cgctccctcc 660
tctcggagag agggctgtgg taaaacccgt ccggaaaacg cgtcgaaggg cgaattctgc 720
agataactgg taagtttagt cttttttgtc ttttatttca ggtcccggat ccggtggtgg 780
tgcaaatcaa agaactgctc ctcagtcgat gttgccttta cttctaggcc tgtacggaag 840
tgttactatg gccgccgccg ccgccgccgc gccgagcgga ggaggaggag gaggcgagga 900
ggagagactg gaagaaaagt cagaagacca ggacctccag ggcctcaagg acaaacccct 960
caagtttaaa aaggtgaaga aagataagaa agaagagaaa gagggcaagc atgagcccgt 1020
gcagccatca gcccaccact ctgctgagcc cgcagaggca ggcaaagcag agacatcaga 1080
agggtcaggc tccgccccgg ctgtgccgga agcttctgcc tcccccaaac agcggcgctc 1140
catcatccgt gaccggggac ccatgtatga tgaccccacc ctgcctgaag gctggacacg 1200
gaagcttaag caaaggaaat ctggccgctc tgctgggaag tatgatgtgt atttgatcaa 1260
tccccaggga aaagcctttc gctctaaagt ggagttgatt gcgtacttcg aaaaggtagg 1320
cgacacatcc ctggacccta atgattttga cttcacggta actgggagag ggagcccctc 1380
ccggcgagag cagaaaccac ctaagaagcc caaatctccc aaagctccag gaactggcag 1440
aggccgggga cgccccaaag ggagcggcac cacgagaccc aaggcggcca cgtcagaggg 1500
tgtgcaggtg aaaagggtcc tggagaaaag tcctgggaag ctccttgtca agatgccttt 1560
tcaaacttcg ccagggggca aggctgaggg gggtggggcc accacatcca cccaggtcat 1620
ggtgatcaaa cgccccggca ggaagcgaaa agctgaggcc gaccctcagg ccattcccaa 1680
gaaacggggc cgaaagccgg ggagtgtggt ggcagccgct gccgccgagg ccaaaaagaa 1740
agccgtgaag gagtcttcta tccgatctgt gcaggagacc gtactcccca tcaagaagcg 1800
caagacccgg gagacggtca gcatcgaggt caaggaagtg gtgaagcccc tgctggtgtc 1860
caccctcggt gagaagagcg ggaaaggact gaagacctgt aagagccctg ggcggaaaag 1920
caaggagagc agccccaagg ggcgcagcag cagcgcctcc tcacccccca agaaggagca 1980
ccaccaccat caccaccact cagagtcccc aaaggccccc gtgccactgc tcccacccct 2040
gcccccacct ccacctgagc ccgagagctc cgaggacccc accagccccc ctgagcccca 2100
ggacttgagc agcagcgtct gcaaagagga gaagatgccc agaggaggct cactggagag 2160
cgacggctgc cccaaggagc cagctaagac tcagcccgcg gttgccaccg ccgccacggc 2220
cgcagaaaag tacaaacacc gaggggaggg agagcgcaaa gacattgttt catcctccat 2280
gccaaggcca aacagagagg agcctgtgga cagccggacg cccgtgaccg agagagttag 2340
ctgaaataaa agatctttat tttcattaga tctgtgtgtt ggttttttgt gtggcatgct 2400
ggggagagat cgatctgagg aacccctagt gatggagttg gccactccct ctctgcgcgc 2460
tcgctcgctc actgaggccg ggcgaccaaa ggtcgcccga cgcccgggct ttgcccgggc 2520
ggcctcagtg agcgagcgag cgcgcagaga gggagtgg 2558
<210> 2
<211> 549
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 2
gtgaacaacg ccaggctcct caacaggcaa ctttgctact tctacagaaa atgataataa 60
agaaatgctg gtgaagtcaa atgcttatca caatggtgaa ctactcagca gggaggctct 120
aataggcgcc aagagcctag acttccttaa gcgccagagt ccacaagggc ccagttaatc 180
ctcaacattc aaatgctgcc cacaaaacca gcccctctgt gccctagccg cctctttttt 240
ccaagtgaca gtagaactcc accaatccgc agctgaatgg ggtccgcctc ttttccctgc 300
ctaaacagac aggaactcct gccaattgag ggcgtcaccg ctaaggctcc gccccagcct 360
gggctccaca accaatgaag ggtaatctcg acaaagagca aggggtgggg cgcgggcgcg 420
caggtgcagc agcacacagg ctggtcggga gggcggggcg cgacgtctgc cgtgcggggt 480
cccggcatcg gttgcgcgcg cgctccctcc tctcggagag agggctgtgg taaaacccgt 540
ccggaaaac 549
<210> 3
<211> 1497
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<223> MeCP2B cds
<400> 3
atggccgccg ccgccgccgc cgcgccgagc ggaggaggag gaggaggcga ggaggagaga 60
ctggaagaaa agtcagaaga ccaggacctc cagggcctca aggacaaacc cctcaagttt 120
aaaaaggtga agaaagataa gaaagaagag aaagagggca agcatgagcc cgtgcagcca 180
tcagcccacc actctgctga gcccgcagag gcaggcaaag cagagacatc agaagggtca 240
ggctccgccc cggctgtgcc ggaagcttct gcctccccca aacagcggcg ctccatcatc 300
cgtgaccggg gacccatgta tgatgacccc accctgcctg aaggctggac acggaagctt 360
aagcaaagga aatctggccg ctctgctggg aagtatgatg tgtatttgat caatccccag 420
ggaaaagcct ttcgctctaa agtggagttg attgcgtact tcgaaaaggt aggcgacaca 480
tccctggacc ctaatgattt tgacttcacg gtaactggga gagggagccc ctcccggcga 540
gagcagaaac cacctaagaa gcccaaatct cccaaagctc caggaactgg cagaggccgg 600
ggacgcccca aagggagcgg caccacgaga cccaaggcgg ccacgtcaga gggtgtgcag 660
gtgaaaaggg tcctggagaa aagtcctggg aagctccttg tcaagatgcc ttttcaaact 720
tcgccagggg gcaaggctga ggggggtggg gccaccacat ccacccaggt catggtgatc 780
aaacgccccg gcaggaagcg aaaagctgag gccgaccctc aggccattcc caagaaacgg 840
ggccgaaagc cggggagtgt ggtggcagcc gctgccgccg aggccaaaaa gaaagccgtg 900
aaggagtctt ctatccgatc tgtgcaggag accgtactcc ccatcaagaa gcgcaagacc 960
cgggagacgg tcagcatcga ggtcaaggaa gtggtgaagc ccctgctggt gtccaccctc 1020
ggtgagaaga gcgggaaagg actgaagacc tgtaagagcc ctgggcggaa aagcaaggag 1080
agcagcccca aggggcgcag cagcagcgcc tcctcacccc ccaagaagga gcaccaccac 1140
catcaccacc actcagagtc cccaaaggcc cccgtgccac tgctcccacc cctgccccca 1200
cctccacctg agcccgagag ctccgaggac cccaccagcc cccctgagcc ccaggacttg 1260
agcagcagcg tctgcaaaga ggagaagatg cccagaggag gctcactgga gagcgacggc 1320
tgccccaagg agccagctaa gactcagccc gcggttgcca ccgccgccac ggccgcagaa 1380
aagtacaaac accgagggga gggagagcgc aaagacattg tttcatcctc catgccaagg 1440
ccaaacagag aggagcctgt ggacagccgg acgcccgtga ccgagagagt tagctga 1497
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<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<223> Poly A sequence
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aataaaagat ctttattttc attagatctg tgtgttggtt ttttgtgtg 49
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<211> 3093
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<223> scAAV9.738.Mecp1 genome
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(106)
<223> mutated ITR
<220>
<221> misc_feature
<222> (198)..(936)
<223> 738 promoter fragment
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<221> misc_feature
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<223> SV40 intron
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<221> misc_feature
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<223> MeCP2 cds
<220>
<221> misc_feature
<222> (2709)..(2890)
<223> BGHpA
<220>
<221> misc_feature
<222> (2953)..(3093)
<223> ITR
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ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60
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tctgaattca attcacgcgt ggtaccgagc tcggatccac tagtaacggc cgccagtgtg 180
ctggaattcg cccttaatat caaaccatct gattcaacaa tgacagaccg atctcttatg 240
ggcttggcac acaccatctg cccattataa acgtctgcaa agaccaaggt ttgatatgtt 300
gattttactg tcagccttaa gagtgcgaca tctgctaatt tagtgtaata atacaatcag 360
tagacccttt aaaacaagtc ccttggcttg gaacaacgcc aggctcctca acaggcaact 420
ttgctacttc tacagaaaat gataataaag aaatgctggt gaagtcaaat gcttatcaca 480
atggtgaact actcagcagg gaggctctaa taggcgccaa gagcctagac ttccttaagc 540
gccagagtcc acaagggccc agttaatcct caacattcaa atgctgccca caaaaccagc 600
ccctctgtgc cctagccgcc tcttttttcc aagtgacagt agaactccac caatccgcag 660
ctgaatgggg tccgcctctt ttccctgcct aaacagacag gaactcctgc caattgaggg 720
cgtcaccgct aaggctccgc cccagcctgg gctccacaac caatgaaggg taatctcgac 780
aaagagcaag gggtggggcg cgggcgcgca ggtgcagcag cacacaggct ggtcgggagg 840
gcggggcgcg acgtctgccg tgcggggtcc cggcatcggt tgcgcgcgcg ctccctcctc 900
tcggagagag ggctgtggta aaacccgtcc ggaaaaactg gtaagtttag tctttttgtc 960
ttttatttca ggtcccggat ccggtggtgg tgcaaatcaa agaactgctc ctcagtggat 1020
gttgccttta cttctaggcc tgtacggaag tgttacttct gctctaaaag ctgcggaatt 1080
gtacccgcgg ccgatccacc ggttttaagg gccgaggcgg ccagatcttt cgaagatatg 1140
gccgccgctg ccgccaccgc cgccgccgcc gccgcgccga gcggaggagg aggaggaggc 1200
gaggaggaga gactggagga aaagtcagaa gaccaggatc tccagggcct cagagacaag 1260
ccactgaagt ttaagaaggc gaagaaagac aagaaggagg acaaagaagg caagcatgag 1320
ccactacaac cttcagccca ccattctgca gagccagcag aggcaggcaa agcagaaaca 1380
tcagaaagct caggctctgc cccagcagtg ccagaagcct cggcttcccc caaacagcgg 1440
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atcaatcccc agggaaaagc ttttcgctct aaagtagaat tgattgcata ctttgaaaag 1620
gtgggagaca cctccttgga ccctaatgat tttgacttca cggtaactgg gagagggagc 1680
ccctccagga gagagcagaa accacctaag aagcccaaat ctcccaaagc tccaggaact 1740
ggcaggggtc ggggacgccc caaagggagc ggcactggga gaccaaaggc agcagcatca 1800
gaaggtgttc aggtgaaaag ggtcctggag aagagccctg ggaaacttgt tgtcaagatg 1860
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tgaatcggcg ccgctagcgc ggccgcgttt aaaccctgca ggtctagaaa gcttatcgat 2700
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ctaataaaat gaggaaattg catcgcattg tctgagtagg tgtcattcta ttctgggggg 2880
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<210> 6
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<212> DNA
<213> Mus musculus
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<221> misc_feature
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cgccccagcc tgggctccac aaccaatgaa gggtaatctc gacaaagagc aaggggtggg 600
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ccgtgcgggg tcccggcatc ggttgcgcgc gcgctccctc ctctcggaga gagggctgtg 720
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<212> DNA
<213> Mus musculus
<220>
<221> misc_feature
<223> MECP2alpha
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cgctccatta tccgtgaccg gggacctatg tatgatgacc ccaccttgcc tgaaggttgg 420
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ccctccagga gagagcagaa accacctaag aagcccaaat ctcccaaagc tccaggaact 660
ggcaggggtc ggggacgccc caaagggagc ggcactggga gaccaaaggc agcagcatca 720
gaaggtgttc aggtgaaaag ggtcctggag aagagccctg ggaaacttgt tgtcaagatg 780
cctttccaag catcgcctgg gggtaagggt gagggaggtg gggctaccac atctgcccag 840
gtcatggtga tcaaacgccc tggcagaaag cgaaaagctg aagctgaccc ccaggccatt 900
cctaagaaac ggggtagaaa gcctgggagt gtggtggcag ctgctgcagc tgaggccaaa 960
aagaaagccg tgaaggagtc ttccatacgg tctgtgcatg agactgtgct ccccatcaag 1020
aagcgcaaga cccgggagac ggtcagcatc gaggtcaagg aagtggtgaa gcccctgctg 1080
gtgtccaccc ttggtgagaa aagcgggaag ggactgaaga cctgcaagag ccctgggcgt 1140
aaaagcaagg agagcagccc caaggggcgc agcagcagtg cctcctcccc acctaagaag 1200
gagcaccatc atcaccacca tcactcagag tccacaaagg cccccatgcc actgctccca 1260
tccccacccc cacctgagcc tgagagctct gaggacccca tcagcccccc tgagcctcag 1320
gacttgagca gcagcatctg caaagaagag aagatgcccc gaggaggctc actggaaagc 1380
gatggctgcc ccaaggagcc agctaagact cagcctatgg tcgccaccac taccacagtt 1440
gcagaaaagt acaaacaccg aggggaggga gagcgcaaag acattgtttc atcttccatg 1500
ccaaggccaa acagagagga gcctgtggac agccggacgc ccgtgaccga gagagttagc 1560
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<223> Plasmid for AVXS-201 production
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ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60
ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggaatt cacgcgtgga 120
tctgaattca attcacgcgt ggtaccacgc gtgaacaacg ccaggctcct caacaggcaa 180
ctttgctact tctacagaaa atgataataa agaaatgctg gtgaagtcaa atgcttatca 240
caatggtgaa ctactcagca gggaggctct aataggcgcc aagagcctag acttccttaa 300
gcgccagagt ccacaagggc ccagttaatc ctcaacattc aaatgctgcc cacaaaacca 360
gcccctctgt gccctagccg cctctttttt ccaagtgaca gtagaactcc accaatccgc 420
agctgaatgg ggtccgcctc ttttccctgc ctaaacagac aggaactcct gccaattgag 480
ggcgtcaccg ctaaggctcc gccccagcct gggctccaca accaatgaag ggtaatctcg 540
acaaagagca aggggtgggg cgcgggcgcg caggtgcagc agcacacagg ctggtcggga 600
gggcggggcg cgacgtctgc cgtgcggggt cccggcatcg gttgcgcgcg cgctccctcc 660
tctcggagag agggctgtgg taaaacccgt ccggaaaacg cgtcgaaggg cgaattctgc 720
agataactgg taagtttagt cttttttgtc ttttatttca ggtcccggat ccggtggtgg 780
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tgttactatg gccgccgccg ccgccgccgc gccgagcgga ggaggaggag gaggcgagga 900
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caagtttaaa aaggtgaaga aagataagaa agaagagaaa gagggcaagc atgagcccgt 1020
gcagccatca gcccaccact ctgctgagcc cgcagaggca ggcaaagcag agacatcaga 1080
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catcatccgt gaccggggac ccatgtatga tgaccccacc ctgcctgaag gctggacacg 1200
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tccccaggga aaagcctttc gctctaaagt ggagttgatt gcgtacttcg aaaaggtagg 1320
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gattctcttg tttgctccag actctcaggc aatgacctga tagcctttgt agagacctct 2640
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tacgcgatcg ctgttaaaag gacaattaca aacaggaatc gagtgcaacc ggcgcaggaa 3840
cactgccagc gcatcaacaa tattttcacc tgaatcagga tattcttcta atacctggaa 3900
cgctgttttt ccggggatcg cagtggtgag taaccatgca tcatcaggag tacggataaa 3960
atgcttgatg gtcggaagtg gcataaattc cgtcagccag tttagtctga ccatctcatc 4020
tgtaacatca ttggcaacgc tacctttgcc atgtttcaga aacaactctg gcgcatcggg 4080
cttcccatac aagcgataga ttgtcgcacc tgattgcccg acattatcgc gagcccattt 4140
atacccatat aaatcagcat ccatgttgga atttaatcgc ggcctcgacg tttcccgttg 4200
aatatggctc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg gttattgtct 4260
catgaccaaa atcccttaac gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc ccgtagaaaa 4320
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gaaggtaact ggcttcagca gagcgcagat accaaatact gttcttctag tgtagccgta 4500
gttaggccac cacttcaaga actctgtagc accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct 4560
gttaccagtg gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg 4620
atagttaccg gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag 4680
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agagcgcacg agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt 4860
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gaaaaacgcc agcaacgcgg cctttttacg gttcctggcc ttttgctggc cttttgctca 4980
catgttcttt cctgcgttat cccctgattc tgtggataac cgtattaccg cctttgagtg 5040
agctgatacc gctcgccgca gccgaacgac cgagcgcagc gagtcagtga gcgaggaagc 5100
ggaagagcgc ccaatacgca aaccgcctct ccccgcgcgt tggccgattc attaatgcag 5160
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aggccgatag tttgagttct tctactcagg caagtgatgt tattactaat caaagaagta 5340
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tttctcgcca cgttcgccgg ctttccccgt caagctctaa atcgggggct ccctttaggg 5700
ttccgattta gtgctttacg gcacctcgac cccaaaaaac ttgattaggg tgatggttca 5760
cgtagtgggc catcgccctg atagacggtt tttcgccctt tgacgttgga gtccacgttc 5820
tttaatagtg gactcttgtt ccaaactgga acaacactca accctatctc ggtctattct 5880
tttgatttat aagggatttt gccgatttcg gcctattggt taaaaaatga gctgatttaa 5940
caaaaattta acgcgaattt taacaaaata ttaacgctta caatttaaat atttgcttat 6000
acaatcttcc tgtttttggg gcttttctga ttatcaaccg gggtacatat gattgacatg 6060
ctagttttac gattaccgtt catcgcc 6087
Claims (4)
- 필요로 하는 환자에 대한 메틸-CpG 결합 단백질 2(MECP2)를 암호화하는 재조합 아데노-관련 바이러스 9(rAAV9)의 경막 내 투여 단계를 포함하는 환자의 레트 증후군 치료 방법으로, rAAV9는 MECP2B를 암호화하는 자기 상보적(self-complementary) 게놈을 포함하고, 이 자기 상보적 게놈의 서열은 서열번호 1에 기재되어 있는 것인, 방법.
- 제1항에 있어서, rAAV9는 rAAV9 AVXS-201인, 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 이오헥솔, 이오비트리돌, 이오메프롤, 이오파미돌, 이오펜톨, 이오프로마이드, 이오버솔 또는 이옥실란, 또는 이의 2종 이상의 혼합물의 경막 내 투여 단계를 더 포함하는 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 환자를 트렌델렌버그 자세로 두는 단계를 더 포함하는 방법.
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