PT1879623E - Terapia génica para distúrbios da medula espinal - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "TERAPIA GENICA PARA DISTÚRBIOS DA MEDULA ESPINAL" sobre o 35 IJ.S.C. § 119 (e) 213, apresentado em 2 de N° 60/790217, apresentado

Este pedido reivindica prioridade do Pedido Provisório U.S. N° 60/677 Maio de 2005, e Pedido Provisório U.S em 8 de Abril de 2006.

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a composições e métodos para o tratamento de distúrbios que afectam uma função motora do indivíduo e em particular, a função motora afectada por doença ou lesão no cérebro e/ou medula espinal.

NVENÇAC

ANTECEDENTES DA A terapia génica é uma modalidade emergente de tratamento para distúrbios que afectam o sistema nervoso central (SNC). A terapia génica do SNC foi facilitada pelo desenvolvimento de vectores virais capazes de infectar efic.azm.ente neurónios pós-mitóticos. O sistema nervoso central é constituído pela medula espinal e o cérebro. A medula espinal conduz informação sensorial do sistema nervoso periférico para o cérebro e conduz informação motora desde o cérebro até vários efectores. Para uma revisão de vectores virais para distribuição génica no sistema 1 (2003) Na t u re Re v. nervoso central, ver Daviclson et ai 4:353-364. ados (AAV) são c onsiderados porque possuem um períii] enicidade, são capazes qe ão capazes de mediar a

Os vectores de vírus adeno-assc úteis para terapia génica no SN favorável de toxicidade e de imur transduzir células neuronais, e expressão a longo-prazo no SNC (Kaplrtt et ai. (1394) Nat. Gene t. 8:148-154 ; Bartlett et al- (1998) Hum. Gene Ther 9:1181-1186; e Passini et al. (2002) J· Neurosci. 22:6437-6446). o vector AAV e go do axónio para o adenovirus, HSV, e .ri buir gene s para 3.1. (2001) FASEB J. ' Biol. 3:203 -218; e

Uma propriedade útil de vectores AAV consiste na capacidade de alguns vectores AAV sofrerem transporte retrogrado e/ou anterógrado em células neuronais. Os neurónios numa região do cérebro sáo interligados por axónios às regiões distais do cérebro proporcionando desse modo ura sistema de transporte para distribuição de vector. Por exemplo, um vector AAV pode ser administrado a, ou próximo de, 03 terminais axonais aos neurónios. Os neurónios internalizam o transportam-no de um modo retrógrado ao longo do axoni corpo celular. Propriedades semelhantes de adenovirus, vírus de pseudo-raiva demonstraram d: estruturas distais no cérebro (Soudas et 15:2283-2285: Breakefield et ai. (1991) I deFalco et ai. (2001) Science. 291:26Us—26i3). ção do cérebro peno local de injecçao . Genet. 8:148-154; 446; e Chamberlin et recentes sugerem que Vários grupos relataram que a transdu serotipo AAV/ 2 (AAV2) é limitada ao intracranial (Keplitt et al. (1994) Nat. Passini et ai. (2002) J. Neurosci. 22:6437-6 ai . (19 9 8) Bra in .Res. / 9 o : 16 9 — 1 / 5) * Re 1 ar. o s também possa ocorrer o transporte 2 axonal retrógrado de vectores

neurotrópicos virais em circuitos seleccionacios do cérebro de rato normal (Kaspar et ai. (2002) Mol. Ther. 5: 5 0- 56 vector): Kasp er et ai. (2003) Sc ience 301:839-8 /j O (v· lentiviral) e Azzouz et . al. (2004) Natur e 429:413-' 417 (v. lentiviral). Koaul et ai. (2005) Nat. Me d. 11(4):423- 4 2 8 Θ et ai. (2 005) Nat. Me d. 1 .1(4):429-43 3 rei ataram, que 3. in j intramuscular cie lentivír us que expi :essa RNA de in terfer silenciando a superóxido dismutase de Cu/Zn humana / V S0D1) retardou o inicio da doença de esclerose lateral amiotrófica ÍALS) num modelo de roedor terapeuticamente relevante de ALS.

As células transduzidas por vectores AAV podem expressar um produto transgénico terapêutico, tal como uma enzima ou um factor neurotrófico, para mediar os efeitos benéficos intracelularmente. Estas células podem também secretar o produto transgénico terapêutico, que pode ser subsequentemente incorporado pelas células distais onde pode mediar os seus efeitos benéficos. Este processo foi descrito como correcção cruzada (Neufeld et ai. (1970) Science 169:141-146).

Todavia, existe ainda umí a. necessidade para c o mp o s i ç õ e s e métodos para o tratamento de disfunção da medu 1 a espinal que resultam na per da de funç ão motora em doe mites humanos. Esta divulgação s atisfaz esta ne cessidade e proporciona também vantagens bem relacionadas. 3

SUMARIO DA INVENÇÃO A presente invenção é como descrito nas reivindicações cLnBXcLS ·

Esta divulgação proporciona métodos e composições para distribuir um transgene na medula espinal e/ou na região do tronco cerebral de ura indivíduo por administração de um vector virai neurotrópico recombinante contendo o transgene para pelo menos uma região da região do núcleo cerebelar profundo (DCN) dos cérebros dos indivíduos. A distribuição virai é realizada em condições que favorecem a expressão do transgene na medula espirrai e/ou a região do tronco cerebral.

Noutro aspecto, a divulgação proporciona métodos e composições para distribuir um transgene à medula espinal de um indivíduo por administração de um vector virai neurotrópico recombinante contendo o transgene à região do córtex motor do céreoro do indivíduo. A distribuição do vector virai é realizada em condiçoes que favorecem a expressão do transgene na medula espinal. Os vectores virais administrados à região do córtex motor sao internaiizados pelos neurónios motores através da sua região do corpo celular e o transgene é expresso, o transgene expresso pode encão sofrer transporte anterógrado para a Parte terminal ao axónio ao neurónio motor, que está presente na meauia esplnai. Devido à natureza, do córtex motor, os vectores virais administrados a esta região do cérebro podem também ser mternalizadas pelos terminais do axónio dos neurónios motores 0 vector virai também pode sofrer transporte retrógrado ao longo do axónio do neurónio motor e ser expresso no corpo celular do neurónio motor. 4 métodos São ainda proporcionadas composições e métodos para distribuir um transgene a um neurónio motor num indivíduo por administração de um vector neurotrópico recombinante virai contendo o transgene a pelo menos uma região da reaião do núcleo cerebelar profundo da região do cérebro do indivíduo, A distribuição do vector é realizada em condições que favorecera a expressão do transgene num neurónio motor distai em relação ao sítio da administração. São também proporcionados métodos e composições para distribuir um transgene a um neurónio motor num indivíduo por administração de um vector neurotrópico virai que contém o transgene à região do córtex motor do cérebro do indivíduo e em que a administração é realizada em. condições que favorecem a expressão do transgene num neurónio motor distai para o sítio de admi ni s t r a ç ã o.

Num aspecto alternativo, a descrição proporciona composições e métodos para tratar um distúrbio de neurónio motor num indivíduo por administração de um vector neurotrÓDiCo recombinante virai que contém um transgene terapêutico a „

•L i. -1, O menos uma região da região do nucieo cerebel cérebr o do indivíduo. A. admi nistração é realiza< que favorecem a expressão de uma quantidade terap^euticament-e eficaz do transgene em pelo menos uma subdivisão da medula espinal e/ou a região do tronco cerebral.

Ainda noutro aspecto , a divulgação pr cporciona compiosições o método para melhorar os sintomas de um distúrbio do neurónio motor num indivíduo por a dm i n is t r a çáo de um vector n e u rotrópic0 recombinante virai que contém o transgene terapêutico da regi§0 do córtex motor do cérebro do indivíduo e em condições οπ0 5 favorecera a expressão do transgene numa quantidade terapeuticamente eficaz em. pelo menos uma subdivisão da medula espinal e/ou a região do tronco cerebral.

Deve ser entendido que tanto a descrição geral acima mencionada e a seguinte descrição detalhada são apenas exemplificativas e explicativas e não estão restritas à invenção como reivindicada.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 é uma representação esquemática sobre como o DCN pode ser utilizado para transportar o vírus terapêutico à medula espinal. As linhas que têm origem na caixa preta que limita o DCN representam os axónios terminais que têm origem em corpos celulares (pontas de setas) localizados na medula espinal. A Figura 2 é uma reprodução de uma secção transversal histológica através da junção ponto-medular e cerebelo, apresentando as três regiões do DCN. A Figura 3 é uma vista esquemática do cerebelo que foi cortado ao longo da linha do vermis (secção sagital) e depois achatado, assim como uma secção horizontal através da medula espinal e uma representação da musculatura esquelética.

Representa as vias aferentes principais (entrada). Ά Figura 4 é um diagrama apresentando as principais vias eferentes (saída) do DCM. 6 circuitos neurais Saídas. As fibras °r, que recebe ele A Figura 5 representa esquematicamente os no córtex cerebral, ligando as entradas às ascendentes têm origem no núcleo olivar inferi adas do córtex cerebral, medula proprio er espinal e sentidos especiais (visual e auditivo). As entradas da*

Λ ^ I. J. D .1. cl b ITIU o Cf O S 3. S têm origem em todos os outros aferentes, tai o -L· o COUl'·^ d .77 d-C feri i_ 0 g vestibulares, aferentes espinais, fusos musculares, órgãos de golgi-tendão, receptores da articulação, receptores da pele e 0 córtex cerebral. Existem também três tipos de interneurónj inibidores no sistema intrínseco, incluindo células cesta céiUidS de gorgi e células estreiadas. Estas estão envolvidas na j.mb±ydO lateral e na sintonização f jLna da função motora d^ neurónio.

As Figuras 2 até 5 são reproduzidas a partir de Williams et al. (2005) The Human Brain: Capitulo 3: The Cerebellum, disponível no sítio da internet: www.vh.org/adult/provider /anatomy/BrainAnatomy,/'Ch3Text/SectionO7.html.

As Figuras 6A até 6E ap sentam a coloraçao imunopositiva da secções do cerebelo :.ores co ser o tipo AAV codificando para ASM murganhos ASMKO. esiingomieiina ácida humana ("hASM") em sagitais após injecção de diferentes vec [(A)2/1, (B)2/2, (C)2/5, (D)2/7 e (E)2/8] humana para o núcleo cerebelar profundo de

As Figuras 7A até 7E demonstram o transporte proteína esfingomielina ác ida . humana ("h iASM" ) para a medu núcleo cerebelar j Profundo. Este efeito foi murganhos tratados com AAV2/2- -ASM, AAV2/5-ASM, AAV2/8-ASM (A) hASM ampliação de 10 X; (B) hASM amp: (C) hASM confocal; (D) ChAT c o n f o c a 1; e (E) confocal.

a espinal do Abservado em AAV2/7-ASM & iação de 40X; h.ASM & ChAT 7 A Figura 8 apresenta graf icamente os níveis cie bomogenato de tecido cio cerebelo após injecção de diferentes serotipos de AAV (2/1, 2/2, 2/5, 2/7 e 2/8} codificando para ASM humana para o núcleo cerebelar profundo (n=5/grupo)· Os grupos não ligados pela mesma letra são significativamente diferentes (p<0,0001) .

As Figuras 9A até 9G apresentam, a. coloração imunopositiva cia calbindina em secções do cerebelo sagitais após injecção de diferentes vectores do s e ro t ip o AAV [(A)2/1, (B)2/2, (C) 2 / 5, (D)2/7 e (E)2/8] que codificam ASM humana Ρ3.2Γ 3 O núcleo cerebelar profundo de murganhos ASMKO.

As Figuras 10Ά e 10B apresentam desempenhos de aceleração e de balanço em rotarod (às 14 semanas de idade) em murganhos ASMKO (injectados com AAV-pgal), WT e murganhos ASMKO tratados com AAV-ASM (n=8/grupo). Os grupos não ligados pela mesma letra s â o s i gn i f i c a. t i v ame n t e d i f e r e n tes. Os murganhos 2_r^-j p C t ^ d O S com AAV2/1-ASM e AAV2/8-ASM demo n s t. raram uma latência significativamente mais longa (p< 0,0009) para cair do que os murganhos A S MK 0 i n j e c t a do s com AAV2/l-3gal no teste de aceleração em rotarod. Para o tes te de balanço em rotarod, os murganhos injectados com. AA2/1-ASM demonstraram uma latência significativamente maior (p<0,001) para cair do que os murganhos injectados com AAV2/1-!qal.

As Figuras 11A e 11B apresentaram o desempenho em rotarod em murganhos ASMKO (n=8), WT (n=8), e o grupo de murganhos tratados bilateralmente AAV-ASM (n=5/grupo) (às 20 semanas de idade}. Para os testes de aceleração e de balanço, os murganhos tratados com AAV-ASM tiveram um desempenho significativamente melhor íp <0,001) do que os murganhos tratacios com ASMKO AAVz/l-pgal. O in jectados com AAV 2 / .1 - ASM foi de tipo selvagem em ambos os testes desempenho cios murganhos indistinguível dos murganhos de aceleraçao e balanço. A Figura 12A ilustra as ligações entre as regiões do núcleo cerebelar profundo (medial, interposta e lateral) e as regiões da medula espinal (cervical, torácica, lombar e sacra). A Figura 12B ilustra as ligações entre as regiões do núcleo cerebelar profundo (mediai, interposta e lateral) e as regiões do tronco encefálico (mesencéfalo, ponte e medula). As ligações são representadas por setas, que começam na região do corpo celular de um neurónio e terminam na região terminal do axónio do neurónio. P°r exemplo, as três regiões do DCN possuem, cada uma, neurónios com corpos celulares que enviam axónios que terminam na reaião cervical da medula espinal enquanto a região cervical nviam axónios que ou interposta, do da medula espinal possui corpos celulares que terminam em qualquer uma das regiões medial DCN. A Figura 13 fluorescente ilustra tronco superiores, apos a distrito a proteína verde fiuorescen a distribuição da proteína verde encefálico ou neurónios motores ição de AAV no DCN que codifica para e (GFP). A Figura 14 ilustra a distribuição da proteína verde fluorescente nas regiões da medula espinal após a distribuição de AAV no DCN que codifica a proteína fluorescente verde (GFP). A Figura 15 ilustra a redução na coloração da proteína acídica f ibrilhar da. glia (GFAP) no tronco encefálico após a distribuição de AAV no DCN que codifica para. IGF---1 em comparação com a distribuição de AAV no DCN que codifica para GFP. 9 A Figura 16 ilustra a redução da coloração da proteína acídica fibrilhar da glia (GFAP) nos núcleos promotores (núcleo trigémino, núcleo hipoglosso e núcleo facial) apó 3 gí 1 3 tribuição de AAV no DCN que codifica para IGF-1 em comparação com a distribuição de AAV no DCN que codifica para. GFP. A Figura 17 ilustra a redução da coloração da proteína pinai após comparação medula, e. IGF-1 em ara GFP. acrdica f -L.br ii.ii ar o a gr ia. (gFAP} através da distribuição de AAV no DCN que codifica para com distribuição de AAV no DCN que codifica p A Figura 18 ilustra a distribuição de ARNm de IGF-1 no sistema nervoso central (SNC) após distribuição de AAV no DCN que codifica para IGF-1 em comparação com a distribuição de AAV no DCN que codifica para GFP. É utilizada beta-actina como um controlo positivo para comparar os níveis de ARNm total. A Figura 19 X-iUStlTS OU0 3. CU. StlTlOU J_ÇclO de AAV-IGF-1 no DCN promoveu a sobrevivência dos neurónios motores. A diferença entre murganhos tratados com AAV que codifica para IGF-1 em comparação com a distribuição de AAV no DCN que codifica para GFP e estatisticamente significativa para um valor de p = 0,01, como indicado pelo asterisco. A Figura 20 ilustra os melhoramentos funcionais no •0l-arod, força de preensão do membro inferior e força de ργρΡΓο~ . co membro anterior em murganhos tratados cora a Gistriouj.ção de ' ‘clv no DCN que codifica para IGF-1 em comparaçao com a distribu-ί ~-~ -vdo ,ie AAV em DCN que codifica para GFP. desempenho em 10 A Figura 21 ilustrei o aumento na sobrevivência mediada por distribuição de AAV no DCN que codifica para IGF-1 em comparação com a distribuição de AAV no DCN que codifica para GFP. A Figura 22 apresenta a distribuição de GFP no cérebro de murganho após a distribuição bilateral de um GFP que expressam um vector AAV1 para o núcleo cerebelar profundo (DCN) . Além do DCN, a coloração positiva para GFP f0i também observada nos bolbos olfatórios, córtex cerebral, tálamo, tronco encefálico, córtex cerebelar e medula espinal. Todas estas áreas receberam projecções de e/ou enviam projecções para o DCN.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

De modo a que a presente invenção possa ser entendida mais rapidamente, são primeiro definidos certos termos. São apresentadas definições adicionais ao longo da descrição detalhada. A prática da presente invenção irá empregar, salvo indicação em contrário, técnicas convencionais de imunologia, biologia molecular, microbiologia, biologia celular e ADN recombinante, que estão dentro da especialidade na técnica. Ver, e. g., Sambrook, Fritsch e Maniatis, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2a edição (1989); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel, et ai, ed., (1987)); a série METHODS IN ENZYMOLOCY (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M.J. MacPherson, B.D. Hames e G.R. Taylor eds. (1995)), Harlow e Lane, ed. (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, AND ANIMAL CELL CULTURE (R.I. Freshney, ed. (1987))· 11 , ...... e reivindicações, a forma

Como utilizado na descriçc.^ , „ . „^.1 nem referências plurais salvo singular "um", "uma" e "o/ a . n contrário. Por exemplo, o se o contexto refira claramente -i,,ralidade de células, incluindo termo "uma célula" inclui um" P1 1 misturas destas.

Como aqui utilizado, significar que as composiÇ°es e mo "compreendendo" pretende métodos incluem os elementos "Consistindo essencialmente composições e métodos, irão mposi referidos, mas não excluindo outro-em" quando utilizado para aenni. , _jTrt-os de qualquer significância significar excluindo outros eieme»1- ^ uma c omposição que c o nsis t e essencial à combinação. Ass^m, essencialmente nos e exc1u i r c ontaminante s ’iementos como aqui definidos não iria vestiqiais a partir do método de isolamento e purificação veículos : armaceuti camente ., , . , fu-^uóairo tamponado com fosfato, aceitáveis, tais como soio conservantes e semelhantes. "Consistindo em" significa excluir mais do que elementos vestigiais de outros ingredientes e passos de método substancial para administrar as composições desta invenção. As formas de realização definidas por cada um destes termos de transição estão dentro o âmbito desta invenção.

As designações numéricas, e. cj., pH, temperatura, tempo, concentração e peso molecular, incluindo intervaios, sao aproximações que são variados ( + ) ou (-) Por incrementos ae 0,i. Deve ser entendido, embora nem sempre explicitamente referiao que todas as designações numéricas são precedidas peio termo "cerca de". Deve ser entendido, embora nem sempre explicitamente referido, que os reagentes aqui descritos são meramente exemplificativos e os seus equivalentes são conhecidos na técnica. 12 0 termo "t.t introduzido numa

ansgene" refere-se a um polinucleótido que é célula de, e é capaz de ser transcrito para ARN e opcionalmente, traduzido e/ou expresso em condições apropriadas. Num aspecto uma célula na qual foi i resu11 ado t erapêuti c o aspecto, pode ser transe , confere-se uma propriedade desejada a ntroduzido, ou de outra, forma conduz ao ou de diagnóstico desejado. Noutro :rito numa molécula que medeia o ARN de interferência, tal como ARNsi.

Os termos "partículas de genoma (gp) ," ou "equivaler ‘tes de genoma", c orno utilizado em referência a um título virai, refere-s e ao número de viriões que contêm o genoma de ADN de AAV recombinante, independentemente da infectivida.de ou funcionalidade. 0 número de partículas de genoma numa preparação de vector particular pode ser medido através de processos tais como descrito nos Exemplos aqui referidos, ou por exemplo, em Clark et al. (1999) Hum. Gene Ther., 10:1031-1039; Veldwijk et ai. (2002) Mol. Ther., 6:272-278.

Os termos "unidade de infecção (iu)," "partícula infeccioSa„ ou "unidade de replicacão", como utilizados em referência a título virai, referem-se ao número de partículas infecciosag .. de vector AAV recombinantes competentes para a replicação, c

J '-.O medido pelo ensaio do centro infeccioso, também conhecido c0^ ensaio do centro de rej Mc La ugh1in e t a 1. (19 8 8) .ícação, como descrito, por exemp J. Vi rol., 62:1963-19 73. O termo "unidade de transduçac

V u ;omo utiliz;

‘‘-‘•O referência a um título virai, refere-se ao número de partícuia de vector AAV recombinante infeccioso que resulta na produção ^ '-4 (¾ um produto transgene funcional como medido em ensaios funcional tal como aqui descrito nos Exemplos, ou por exemplo, em Xia0 13 a 1. (19 9 7) Exp (19 96) J. Vi rol

Neurobiol., 70:520-532 (ensaio de 144 :113-124; ou em Fisher et al. LFU)

Os termos "terapêutico", "quantidade terapeuticamente eficaz", e seus cognatos referem-se à quantidade de um ARN, ADIM ou produto de expressão de ADN e/ou ARN que resulta na prevenção ou retardamento do inicio ou no melhoramento dos sintomas de, num indivíduo, ou uma realização de um resultado biológico desejado, tal como correcção de neuropatoiogia, e. g., patologia celular associada a. urna doença neuronal motora, tal como AL termo " correcção terapêi itica" refere-se ao grau de correcção resulta na prever íção ou atraso no iníci o ou no me1horamen t o sintomas num indivíduo. A quantidade eficaz pode ser determinada através de métodos empíricos conhecidos.

Uma "composição" também pretende englobar uma combinação de agente activo e outro veículo, e. g., composto ou composição, inerte (por exemplo, um agente ou marcador detectável) ou activo, tal como um adjuvante, diluente, ligante, estabilizador, tampões, sais, solventes lipofilicos, conservante, adjuvante ou semelhantes. Os veículos também incluem excipientes farmacêuticos e aditivos de proteínas, péptidos, adições ainino, 1ípidos e hidratos de carbono (e. g., açucares, inc1uindo monossacárídos, di-, tri-, tetra-, e oligossacárídos; açúcares derivados, tais como alditóis, ácidos aldónicos, açúcares esterifiçados e semelhantes; e polissacáridos ou polímeros de açúcar), que podem estar presentes isoladamente ou em c omb inação, c om em peso ou vo reendendo isoladamente ou em combinação umes. Excipientes de proteína exemplif 99,99% O ci i.» -i. \7 ci o i n e 1 u e rn a .1 bumi n (HSA), albumina semelhantes. de soro, tars como albumina tíe soro humano humana recombinante (rHA.) , gelatina, caseína e Componentes de aminoácido/anticorpo 14 representativos, que podem também funcionar numa capacidade tamponante, incluem alanina, glicina, arglnina, betaírá histidina, ácido glutâmico, ácido aspártico, cisteina, lisina leucina, isoleucina, valina, metionina, fenilalanina, aspartamo, e semelhantes. Também se pretende que os eXcipientes de hidrat^ de carbono estejam dentro do âmbito desta divulgação, exemp]J dos quais incluem, mas não estão limitados a monossacáridos tais como fruxose, mal tose, galactose, alucose, D-manosp sorbose, e semelhantes; dissacáridos, tais como lactose f sacarose, trealose, celobiose, e semelhantes; polissacárido* tars como raxxnose, melezitose, maltoaextrinas, dextranos amidos, e semelhantes; e alditóis, tais como manitol, xilitol iia 11 x x o 1, -u a c x i t o 1, x i o i t o x s o r b 11 o 1 (q 1. u c i t o "i ) e mi c ~i r o s i t o 1 0 termo veículo inclui ainda um tampão ou um agente de acerto de ρΗ; tipicamente, o tampao é um sal preparado a partir o.e um acido ou base orgânicos. Tampões representativos incluem sais de adiçao orgânicos, tais como sais de ácido cítrico, ácido ascorbico, ácido g^uconico, ácido carbónico, á.cido tartárino ácido succmico, ácxdo acéuico, ou ácido ftálico; tampões Tris, cloridrato ae trometamina, ou fosfato. Veículos adicionais i n c 1 u e rn e x c i p i e n t e s / a d 111 v o s p o 1 i m éri c o s, t a. i s c o m o poliviniipirroxiaonas, fico.is (um açúcar polimérico) , dext.ratos (e. g., ciciodextrxnas, tais como 2-hidroxipropil-.quadratura.- queiantes cielodextrina), polretilenoglicóis, agentes aromatizantes, agentes antimicrobxanos, adoçantes, antioxidantes, agente antiestatico, tensioacxivos (e. g., polisorbatos, tais como "TWEEN 20" e "TWE&jNí 8u"), lípidos (e. g., fosfolípidos, ácidos gordos), esteroides (e. g., colesterol) e agente (e. g., EDTA). 15

Como ac?ui utilizado, o termo "veículo f armaceut icamente aceitável" compreende qualquer um dos veículos farmacêuticos convencionais, tais como uma solução salina tamponada com fosfato, água e emulsões, tais como uma emulsão óleo/água ou água/óleo, e vários tipos de agentes humidificantes. As composições também podem incluir estabilizadores e conservantes ô QtidlQtiGr UU1 CIOS V0ÍC-U.-LOS 3.0110.3. refGrÍOOS CCílTl 3 CO^CM Ç30 para utilização in vivo. adicional de que possam ser aceitável >-..omo exempj.os de veículos, estabilizadores e adjuvantes, ver Martin REMINGTON’S PHARM. SCI., 15a Ed. (Mack Publ. Co., Easton (1975) e Williams & Williams, (1995), e em "PHYSICIAN'5 DESK REFERENCE", 52a ed., Medicai Economics, Montvale, N.J. (1998).

Um "indivíduo," "individual" ou "doente" é aqui utilizado indistintamente, referindo-se a um vertebrado, de um modo preferido, um mamífero, de um modo mais preferido, um humano. Mamíferos incluem, mas não estão limitados a, murinos, ratos, símios, humanos, an.im.ais de quinta, animais de desporto e animais de estimação.

Um "controlo" é um indivíduo ou amostra alternativa utilizado numa experiência para efeitos de comparação. Um controlo pode ser "positivo" ou "negativo". Por exemplo, quando o objectivo da experiência é determinar a correlação de um nível de expressão alterado de um gene com um tipo particular de patologia, (ver ALS, por exemplo, infra), é geralmente preferido utilizar um controlo positivo (um indivíduo ou uma amostra de um. indivíduo, contendo essa aitsração e apresentando sintomas característico dessa doença), e um controlo negativo (um indivíduo ou uma amostra de um indivíduo que não tem a expressão alterada e sintoma clínico dessa doença). 16 'Expresso diferencialmente", como aplicado a um gem refere--se à produção di ferencial do ARNm transcrito a parti r do gene ou o produto proteico codificado Pelo gene. Um gene expresso diferenc i a1mente pode ser s o b r e - e x p r e s s o ou sub-expresso em comparação com o nível de expressão de uma célula normal ou de controlo. Num aspecto, refere-se a um diferencial que é pelo menos 1,5 vezes ou pelo menos 2,5 vezes ou, alternativamente pelo menos 5 vezes ou, alternativamente peio menos 10 vezes superior ou inferior ao nível de expressão oetectado numa amostra de controlo. O termo "exoresso diierenciaimente" também se refere a sequências nucleotídicas nume. Cciuia ou tecido que são expressas quando silenciadas numa célula de controlo ou não expressas quando expressas numa célula de controlo. variar a g., para

Como aqui utilizado, o termo "modulado ft signif ice C[U cl.Π L 1. CÍ d GΘ O U Í Γ11,0 Π S 1. d3 dΘ dΘ Um. 0 í 0 j_ t O OU Γ' 0 S U Ί 0 do 0 intensificar, aumentar, diminuir ou reduzir.

Come

ii - CL iviar ff aqui urilizado, o termo "melhorar" é sinónimo de e significa reduzir ou mitigar. Por exemplo pode mais suportáveis. aspectos em que a transferência génica é vector de ADN virai, tal como um saenovirus ade η o a s s o c i ad o p o 1 i n u c 1 e ó t i d o (A.AV ) , uma ^ v-· uDli Uya O que compreende 0 oenom; de vector virai ou mediada por um (Ad) ou vírus refere-se ao parte deste, e um transge relativamen serotipos. Os Ads são oem oorac^e.i.i2a(j0f homogéneo, incluindo miais de 50

Ver, e. 9-, Pedido PCT Internacional N° WO 95/27071. aeiCer e não necessitam de integração no fáceis 17 élul ~"α nospedeira. Vectores derivados de Ad recombinante, particularmente aqueles qu par aenoiric reduzem o potencial recomoinacao e ,,,υ,, c ^ - c. ^açao ul Uj-US de tipo selvagem, também f°ram construídos. Ver, Pedido PCX Internacional N» WO 95/00655 e WO 3b/ii9B4. o AAV de tipo selvagem possuí elevada infecr.ividade e espop-j f 0 ρί η-οΗο ί ntodrord^ 1 i: -Liiiciuade iuoegiarido-se no genoma da célula

Acad. al. (1988) Mol. Cell nospedeira. vTer, Hermonat e Muzyczka (1S84) Proc. Natl

Sei. (ISA 81:6488-6470 e Lebkowski, e BígI. 8: 3988-3996. À divulgação propor transgene para ; indivíduo por administração de ona um método para distribuir um medula espinal e/ou tronco encefálico n„m um vector neurotróo ί recombinante virai contendo um. r a n s gene a menos uras regis

a O da região do núcleo cerebelar profundo do cérebro, em distribuição é realizada em condições que favorecem a expreo do transgene para um sítio distai ao sítio de administrar·-- - --1 ct í ') úue a «ac listribuiçao pode também resultar n< sítio de administração. expressão 'j f—v t -i* 2 ^ o ..... '-t v.· v_. e 10 a expresc-s °<ao polipéptido transcriçg0 do ou do

Salvo especificamente indicado em contrário, transgene não está limitada à tradução para um proteína, mas também inclui replicação e/ou polinucleótido transgene.

Noutro aspecto, a divulgação proporciona um métoc de distribuir um. produto transgénico terapêutico a uma célu.1» a.l do SNC, oue é um neurónro ou uma .ura da odia, num m âltí fr -‘-reto afectado com um distúrbio motor neuronal, e. g., ALS ou ί traumática na medula espinal. O transgene pode codificar

Pa; a 18 Ν ο u t r ο a s p e c t o, a d i v u 1 g a ç a transgene para a medula espinal o é uni método para num indivíduo por distribuir Urn 3011! i n o. s t r a ç ,s q le um vecto neurotrópico recombmante virai c< )ntendo o referic transgene à região do córtex motor do cérebro, em que a referida distribuição é realizada em condições que favorecem a expressão do referido transgene para um sítio distai ao referido sítio de administração.

Ainda. noutro aspecto da descrição, o vector virai 4 administrado a pelo menos uma região da região do núcleo cerebelar profundo do cérebro onde o produto de transgene é expresso e distribuído à medula espinal e/ou à região do tronco encefálico do indivíduo.

Noutra forma de realização, o vector virai é administrado a pelo menos uma região da região do núcleo cerebelar profundo do cérebro que está interligada com o tronco encefálico e os neurónios motores da espinal. Estas regiões alvo possuem ligações directas com células (e. g., interneurónios e astrócitos) que compõem o ambiente celular do neurónio motor. A administração distribui o produto do transgene ao ambiente celular do neurónio motor, onde o produto media um efeito benéfico nas células que o compõem. um método para e xp r es são, n um cie um vector a° córtex motor

Numa forma oe realização, a divulgação é distribuir um transgene para, ou modular, ti S U 6. neuronio motor rrum indivíduo por administração neurotropico virai contendo o transgene à região do cérebro região do do indrviduo, em n e u r6 n i o mot or que o transgene é exoresso numa distai ao referido sítio de admi ni s t r a ção. 19

Numa forma cie rea Irzaçao alternativa, 3. divulgação é um método para tratar um. distúrbio de neurónio motor num. .indivíduo por administração de um vector neurotrópico recombinante virai contendo um transgene terapêutico a pelo menos uma região da região do núcleo cerebelar profundo do cérebro do indivíduo, ern que o transgene é expresso numa quantidade terapeutieamente eficaz eru pexo menos uma. suodivisão da medula espinal do -Ι-Π^χίs7íauo. instas suodivxS06o inCiuem uma ou mals de cervica^ torácica, lombar ou sacra (ver UXc 1, F i gu r a 12 A) transgene pode também ser expresso numa quantidade terapeutieamente eficaz em peio menos uma região do tronco encefálico, tal como, por exemplo, o mesencéfalo, ponte ou msciUia (ver Figura rztí) . Pode também ser exoresso numa quantidade terapeutieamente eficaz em ambos pelo menos uma região do tronco encefálico e em pelo menos uma subdivisão da medula espinal do indivíduo. ferido t ransgene é ΘXpΓ0 8 S 0 numa eficaz eir 1 pelo menos uma s ubdivi sã 0 uo. Estas subdivisões incluem uma ou , lombar ou sacra (ver Fic jura 1, em

Fsta divulgação é também um método para melhorar os sintomas de um distúrbio do neurónio motor num indivíduo para administração de um vector neurotrópico recombinante virai contendo um transgene terapêutico para a região do córtex motor do cérebro, ma 1 s ci e c e r v i c a 1, t o r á c i c a Figura 12A). os para a prática desta

Vectores neurotrópicos virais adequac divulgação incluem, mas não estão limitados a vectores virais adeno-associados (AAV), vectores virais de herpes simolex (Patente U.S. N° 5672344) e vectores lentivir^is. 20

Na invenção, pode ser utilizado υ AAV de qualquer serotipo. AA.v de -ci"P3.z0S cie Sofirsir transporte axonal retrógrado num cérebro afectado por doença, ou transporte axonal num cérebro não afectado por doença. o serotipo do vector virai utilizado

Em certas formas de realização, pode ser nt-ii-i Tad0 0 qualquer serotipo desde que os vectores se^am em certas formas de realização da invenção é seleccionac do grupo consistindo em AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7 e AAV8 (ver, e. g. , Gao et ai. (2002) PNAS, 99:11854-11859; e Virai Vectors for Gene

Therapy: Methods and Protocol ed. Machida, Humana Press, 2003). Pode ser utilizado outro serotipo além daaueles aqui listados Além disso, os vectores pseudotipados AAV também podem ser utilizados nos métodos aqui descritos. qs vectores pseudotipados AAV são aqueles que contêm o genoma de um serotipo AAV na cápside de um segundo serotipo AAV; por exemplo, um vector AAV que contém a cápside AAV2 e o genoma AAV1 ou um vector AAV que contém a cápside AAV5 e o genoma AAV 2 (Auricchio et ai. (2001) Huni. Mol. Ge.net, 10 (26):3075-81).

Os vectores AAV são derivados de parvovírus de ADN de cadeia simples (ss) que não são patogénicos para mamíferos (revisto em Muzyscka (1992) Curr. Top. Microb. Immunol., 158:97-129).

Resumidamente, os vectores baseados em AAV possuem, os genes virais rep e cap que são responsáveis por 96% do genoma virai removido, deixando as duas repetições terminais invertidas (TTR) de 145-pares de bases (pb) flanqueadoras, que são utilizadas para iniciar a replicação, empacotamento e integração do ADN virai. Na ausência do vírus auxiliar, o AAV o’e tipo selvagem integra-se no genoma da célula hospedeira humana com especificidade preferencial para um sítio no cromossoma 19q ou pode permanecer a ser expresso epissomicamente. Uma. única partícula de AAV pode acomodar até 5 kb de ADNss, deixando desse 21 modo cerca de 4,5 kb para um transgene e elementos de regulação, que é tipicamente suficiente. Contudo, os sistemas de excisao trans como descrito, por exemplo, na Patente dos Estados Unidos da América I\T° 6544785, podem quase duplicar este limite.

Numa forma de realização ilustrativa, AAV é AAV 2 ou AAV1. 0 vírus adeno-associado de muitos serotipos, especialmente AAV 2, foram estudados extensívarnente e caracterizados como vectores de terapia génica. Os especialistas na técnica estarão familiarizados com a preparação de vectores de terapia genica à base de AAV funcionais. Podem ser encontradas numerosas referências a vários métodos de produção, purificação e preparação de AAV para administração a indivíduos humanos no corpo extensivo da literatura publicada {ver, e. g., Virai Vectors for Gene Therapy: Methods and Protocols, ed. Machida, .Humana Press, 2 0 03) . Adicionalmente, a terapia génica baseada em AAV direccionada a células do SNC foi descrita nas Patentes dos Estados Unidos N° 6180613 e 6 503888. Vectores AAV exemplares adicionais são vectores de serotipos AAV-2/1, AAV2/2, AAV2/5, AAV2/7 e AAV2/8 recombinantes que codificam a proteína humana.

Em certas formas de realização da invenção, o veetor compreende um. transgene ligado operacionalmente a um promotor. O transgene codifica uma molécula biologicamente activa, cuia expressão no SNC resulta numa correcção pelo menos parcial d° genómicas e funcionais de g., Patente dos Estados do factor de crescimento neuropatologia. As sequências de ADNc ASM humana foram publicadas (ver, e. Unidos N°. 5773278 e 6541218). O gene de tipo insulina (IGF-1) possui uma estrutura complexa, que é bem conhecida na técnica. Tem pelo menos dois produtos ARNm excisados alternativamente que surgem do transcrito do gene Há um péptrdo de 153 ammoacidos, conhecido por vários nomeC! 22 incluindo IGF- -IA O · · '.J K.A IGF ’-lEa e um péptido de 195 a m i η o á c i d o s, conhecido por vá ri .os nom.es, incluindo IGF-1B 011 IGF- -lEb. ΐ l forma madura de Γ-y · J- vU. F-l é um polipéptido de 70 aminoá eidos. Tanto IGF-lEa como IGF-lEb contêm o péptido maduro de 70 aminoácidos, mas diferem na sequência e no comprimento das suas extensões dos terminais carboxilo. As sequências peptídicas de IGF-lEa e IGF-lEb são representadas pelas SEQ ID N° : 1 e 2, respectivamente. Os ADNc genómicos e funcionais de IGF-1 humana, assim, como a informação adicional < sm reiaçao ao gene IGF-1 e seus produtos, estão disponíveis no A .cesso Unige n.e 1 5 o NM_' 00618. O nível de expressão de transgene em células eucarióticas é largamente determinado pelo promotor de transcrição na cassete de expressão do transgene. Os promotores que apresentam actividade a longo prazo e são específicos para o tecido e as células são utilizados em algumas formas de realizaç cl O . Exemplos não limitantes de promotores incluem, mas não estão limitados a, o promotor de citoraegalovirus (CMV) (Kaplitt et al, (1994) Nat. Genet, 8:148-154), promotor da 33-gIobina de CMV/humana (Mandei et al. (1998) <7. Neurosci. 18:4271-4284), promotor de GFAP (Xu et al. (2001) Gene Ther. 8:1323-1332), o promotor da enolase específico para o neurónio de 1,8 Jcb (NSE) (Klein et aí. (1998) Exp, Neurol. 150:183-194), promotor da actina beta de galinha (CBA) (Miyazaki (1989) Gene 79:269-277), o promotor da )-aluc ronidase (GUS B} (s η ίp1e y e t al (19 9:

Genet1cs 10:1009-1018) e promotores da ubiquitina., tais como aqueles isolados da ubiquitina a. humana, ubiquitina B humana, e ubiquitina C humana, como descrito na Patente US N° 6667174. Para prolongar a expressão, podem estar adicionalmente ligados operacionalmente ao transgene outros elementos reguladores, tais como, e. g., o Elemento Pós-Regulador do Vírus da Hepatite Woodchuck (WPRE) (Donello et aí. (1998) J. virol. 72:5085-5092) 23 sítio ormona do c r e s c i me nt o bo v i η o ou ο de poiiadenilação da h (BGH).

Para algumas aplicações de terapia génica ao SNC, pode ser necessário controlar a actividade de transcrição. Com este fim, a regulação farmacológica da expressão génica com vectores virais pode ser obtida incluindo vários elementos de regulação e promotores de resposta ao fármaco como descrito, por exemplo, em Haberma et al. (1998) Gene Ther. 6:1604-16011; e Ye et ai. (19 9 5) Seience 28 3:8 8-91.

Nos métodos desta divulgação, o veetor virai pode ser administrado colocando em contacto uma extremidade axonal terminal de um. neurónio com uma composição contendo um. veetor virai transportando o transgene, permitindo que a partícula virai seja endocitosada e transportada intracelularmente (retrogradamente) ao longo do axónio ao corpo celular do neurónio; permitindo que o produto do transgene terapêutico a ser expresso, em que o produto do transgene terapêutico alivia desse modo a patologia no indivíduo. 0 efeito pode ser um neuróni .o motor, en i células que compõem o ambiente do neurónio motor (tal como i nterneurónios e astrócit os) ou en η ar nbos. Em certas formas de realização, a concentração do veetor na. composi ção é pelo menos: (a) 5, 6, 7, 8, 8,4, 9, 9 ,3, 10, 15, 20, 25 ou 50 (xlO^ gp/mL) ; (b) 5, ( 5, 7, 8, 8,4, 9, S ), 3, 10, 15, 20, 25 ou 50 (xl0s tu/rnL); ou (c) 5, 6, 7, 8 1 f 8,4, 9, 9,3 v 10, 1.5, 20, 25 ou 50 (x10^0 lu/mL).

Nos métodos adicionais desta descrição, o veetor virai pode ser administrado colocando em contacto o corpo celular de um ueurónio com. uma composição contendo um. veetor virai que transporta o transgene, permitindo que a partícula virai seja 24 enaocitosaaa, permitindo que o produto do transgene terapêutico seja expresso e transportado anterogradamente intracelularmente ao longo do axónio para o axónio terminal do neurónio, em que o produto do transgene terapêutico alivia desse modo a patologia no indivíduo. 0 efeito pode ser em neurónios motores, em células que compõem o ambiente do neurónio motor (tal como mterneurónios e astrócitos) ou em ambos. Em certas formas de realização, a concentração do vector na composição é pelo menos (a) 5, 6, 7, 8, 8.4, 9, 9,3, 10, 15, 20, 25, de 50 (xlOl2 gp/mL) ; (b) 5, 6, 7, 8, 8.4, 9, 9,3, 10, 15, 20, 25 ou 50 (xlO8 tu/mL) ; ou íc) iu/mL) 8, 8, 4, 9, 9,3, 10, 15, 20, 25 ou 50 (xl0‘

Num. aspecto, o transgene codifica moléculas biologicamente activas, cuja expressão nos resultados do SNC na correcção pelo menos parcial de neuropatologia. Em algumas formas de realização, o produto do transgene terapêutico é uma molécula de ARN que inibe a expressão de SOD num indivíduo aliviando desse modo e prevenindo os s intornas de ALS. Ver Roaul et al. (2005) Not Me d. 11 (4):423-42 8 e Ralph et _ 1 / Λ· A Λ !Γ X a±. ( íuUj; Nat. Me d. 11 (4) :429-433 . Num aspecto, quando se realizam es tes métodos, o transgene expressa uma quantidade terapêutica de uma proteína ; seleccionada do grupo que consiste η o f a c t o r -1 d o crescimento da insulina (IGF-1), calbindina D28 :, p a r v a 1 b u m 1 n a, HIFl-alfa, SI pT-9 VFCíP . Γ\ J. ¢.. f V í.j vjiX1 f EPO (eritropoietina), CBP (proteína de ligação da proteína de ligação do elemento de resposta a cAMP [CREB]), SMN -1, SMN-2 e CNTF (Factor neurotrófií 20 ciliar) . 25

Alternativamente, o transgene inibe a expressão de uma forrpa mutante de uma proteína, e. g., o mutante de SOD eme resuit-a - -l J- ^ -*- L. Q. ALS. Roauí et ai. (2005) supra e Ralph et ai. (2005) suOra.

Pafa a identificação de estruturas no cérebro humano, VlQv. v" l- r e. g., The Human Brain: Surface, Three-Dimensional Sectional Anatomy with MRI, and Blood Supply, 2a ed., eds. Deuteron et a7 Springer Vela, 19 99; Atlas of the Human Brain, eds. Mai et ai Academic Press; 1997; e Co-Planar Sterotaxic Atlas of the Human Brain: 3-Dimensional Proportional System: An Approach

Cerebral Imaging, ecis. Tamarack et ai. Thyme Medicai Pub., 198R Para a identificação de estruturas no cérebro de murganho, ver e. g., The Mouse Brain In Sterotaxic Coordinates, 2a ed. Academic Press, 2000. A Figura 1 apresenta esquematicamente a medula espinal e as suas quatro subdivisões: cervical, torácica, lombar e sacra. A divulgação referida proporciona métodos para modular, corrigir ou aumentar a função motora num indivíduo que sofre com lesão motora neuronal. Apenas para objectivo de ilustração, o indivíduo pode sofrer de um ou mais de entre a esclerose lateral amiotrófica (ALS), atrofia molecular buloar espinal, atrofia muscular espinal, ataxia cerebelar espinal, esclerose lateral primária (PLS) ou lesão traumática da medula espinal.

Sem estar limitado pela teoria, a patologia associada com a lesão motora neuronal pode incluir a degeneração motora neuronal, gliose, anormalidades no neurorilamento, perda de fibras mielinadas nos tractos corticospmais e raízes ventrais. Por e x e iup io, f o r a m r e c o n h e c 1 d o s d o i s t ipos cte iulcio: imcio Pu 1 bar, crue afecta os neurónios motores supen^-O-t-—s (os neuronios motores do córtex e do tronco encefálico), afecta os músculos 26 e ο faciais, o discurso e a capacidade de engolir: e o início do membro, que afecta os neurónios motores inferiores (neurónios motores da medula espinal), é reflectido por espasticidade, fraqueza generalizada, atrofia muscular, paralisia, 0 falência respiratória. Em ALS, os indivíduos possuem o início bulbar e do membro. Em PLS, os indivíduos possuem o início bulbar. nina ou péptid; 3) a cada ser con seguido através da Além disso, pode ser

Sem estar limitado pela teoria, uma forma de realização da divulgação reside na. capacidade para proporcionar uma molécula terapeurica {por exemplo, uma pr< aivisao da medula espinal. Isto poc mjecçao de um vector AAV no E importante aireccionar a lâmina individual, em cada. divisão da meduxa espinal. Lâminas são subregiões especificas nas regiões do cerebro e medula espinal. Pode ser desejável em certas formas de realizaçao direccionar lâmina específica numa certa divisão da medula, espinal. Uma vez que a lesão do motor neuronal pode também ocorrer nos neurónios motores superiores, pode também ser desejável proporcionar uma molécula terapêutica (por exemplo, unia proteína ou péptido) às divisões do tronco encefálico. Numa forma ae realização, pode ser desejável proporcionar a molécula terapêutica para a medula espinal, incluindo algumas ou todas as suodxvisões assim como ao tronco encefálico, incluindo algumas ou todas as subdivisões. A presente divulgação utiliza a introdução de um vector AAV no DCN para conseguir a distribuição acima descrita de uma molécula terapêutica para a região(ões) da medula espinal e ou tronco ence fálico. A Fi gura 12A ilustra as ligações entre a(s) região (ces) dos núc leos cerebrais profundos e a medula espinal enquanto a Figura 12B ilustra as ligações entre as regiões dos núcleos do eerebelo profundo e o tronco encefálico. 27 A capacidade para organizar e executar os actos motores complexos depende de sinais das áreas motoras no córtex cerebral, i. e.f o córtex motor. Os comandos motores corticais descendem em dois tractos. As fibras corticobulares controlam os núcleos motores no tronco cerebral que movem os músculos faciais e as fibras corticospinais controlam os neurónios motores espinais que enervam os músculos do tronco e do membro. 0 córtex .otora erebral também influencia indirectamente a actividade mot espinal através da actuação nas vias do tronco encefálico descendente. 0 córtex motor primário situ a—se ao longo do gyrus pré-centrai na área c ie Broadmann (4) . Os axónios dos neurónios corticais que se pr ojectam para a m e du1a e sp ina1 correm em conjunto no tracto corticospinal, um feixe de fibras massivo que contém cerca de 1 milhão de axónios. Cerca de um terço destes têm origem no gyrus pré-central do lobo frontal. Outro terco tem origem na área 6. 0 restante tem. origem nas áreas 3, 2 e 1 no córtex sensorial somático e regula a transmissão da entrada aferente através do corno dorsal.

As fibras corticospinais correm em conjunto com as fibras corticobulbares através do membro posterior da cápsula interna para atingir a parte ventral do mesencéfalo. Elas separam-se na ponte em pequenos feixes de fibras que correm entre os núcleos pontinos. Elas reagrupam-se na medula para formar a pirâmide medular. Cerca de três quartos das fibras corticospinais cruzam a linha média na intersecção piramidal na junção da medula e meduia espinai. As fibras cruzadas descendem na parte dorsal das coxunas laterais (coluna dorsolateral) da medula espinal, formando o tracto corticospinal lateral. As fibras não cruzadas 28 o c o rt i c o spinai descendem nas colunas ventrais como o tract ventrai.

As divisões laterais e ventrais do tracto corticospinal terminam em volta das mesmas regiões da matéria cinzenta espinal como os sistemas laterais e medianos do tronco encefálico. 0 tracto corticospinal lateral projecta-se principalmente para os núcleos motores na parte lateral do corno ventrai e para interneurónios na zona intermédia. 0 tracto corticospinal ventrai projecta-se bilateralmente para a coluna celular ventromediana e para juntar porções da zona intermédia que contem os neuronios motores que enervam os músculos axiais. A Figura 3 apresenta esquematicamente as principais vias aferentes (entrada).

Ijci iOua profunda ao cerebelo está a matéria cinzenta denominada o núcleo cerebelar profundo denominado o núcleo mediano (fastigial), o núcleo de interposta (interposito) e o núcleo lateral (dentado). Como aqui utilizado, o termo "núcleo cerebelar profundo" refere-se colectivamente a estas três regiões. A Figura 2 representa esquematicamente as três regiões do DCN. A Figura 4 representa esquematicamente as principais vias eferent.es (saída) do DCN. A Figura 5 representa esquematicamente os circuitos neurais no córtex cerebral. As Figuras 12A e 12B representam esquematicamente as ligações entre

o DCN me d u1a e s p i na1 ou o tronco encefálico, : e s p e c t i v ame n t. e

Se desejado, a estrutura do cérebro humano pode ser correlacionada com estruturas semelhantes no cérebro de outro mamífero. Por exemplo, a maioria dos mamíferos, incluindo humanos e roedores, representam uma organização topográfica 29 semelhante das projecções hipocampo entorrinal, com neurónios na parte lateral de ambos os córtex entorrinais lateral e mediano projectando para a parte dorsal ou polo septal do hipocampo, enquanto a projecção para o hipocampo ventral origina-se principalmente dos neurónios nas partes medianas do córtex entorrinal (Principies of Neural Science, 4a ed.eds Kandei et al. McGraw-Kiil, 1991; The Rat Nervous System, 2a ed., ed. Paxinos, Academic Press, 1995) . Além disso, as células da camada II do projecto do córtex entorrinal para o gyrus dentado, e elas terminam nos dois terços exteriores da camada molecular do gyrus dentado. Os axónios das células da camada III projectam-se bilateralmente para as áreas de corrru ammonis CAI e CA3 do hipocampo, terminando na camada molecular do stratum lacunose. ta: como

Num aspecto, os métodos oivurgados incluem administrar ao SNC de um indivíduo afectado um vector neurotrópico virai transportando um transgene que codifica um produto terapêutico e permitindo que o transgene seja expresso no SNC distalmente em relaçao ao sitio oe administraçao a uni nível terapêutico. Além disso, o vector pode compreender ura polinucleótido que codifica para uma molécula biologicamente activa eficaz paira tratar o distúrbio de SNC. Essas moléculas biologicamente activas podem compreender péptidos incluindo mas não limitados a versões nativas ou mutadas das proteínas de comprimento total, versões nativas ou mutadas de fragmentos de proteína, polioéptidos sintéticos, anticorpos e fragmentos de anticorp

moléculas de Fab'. As moléculas biologicamente activas também podem compreender nucleótidos incluindo polinucleótidos de ADN de cadeia simples ou de cadeia dupla e polinucleótidos cie cadeia simples ou de cadeia dupla. Para uma revisa0 de tecnologias de nucleótidos exempi i í icat ivas que podem utilizadas na prática dos métodos aqui divulgados, ----- 30 ARN de ser ver

Kurreck (2003) j,f Eur, j, Biochem. 2 70, 1628-1644 [tecnologias anti-sentido]; Yu et al. (2002) PNAS 99(9), 6047-6052 [tecnologias de interferência de ARN]; e Elbashir et al. (2001) Genes Deva, 15(2):188-200 [tecnologia de ARNsi].

Numa forna de realização ilustrativa, a administração é conseguida através de injecção directa de uma solução de vector de títu1o eleva do no DCN de um indivíduo ou doente. Por exemplo, a a d in i n i s t r a ç ã o é re alizada através de i njecção dir ecta numa ou mais regiões do núcleo cerebelar profundo do cérebro s e 1 e c c i o n a d a s do grupo consistindo na região mediana (fastigial), na região interposta (interposito) e na região lateral (dentada) . O DCN é um sítio atraente para injecção devido às suas ligações eferentes e aferentes extensivas com o tronco encefálico e medula espinal. Estas células proporcionam um meio eficiente e minimamente invasivo paira distribuir o vector virai e o transgene expresso às regiões da medula espinal e das regiões do tronco encefálico. Sem. estar limitado pela teoria, o vector virai pode ser recuperado pelos terminais do axónio e transportado retrogradamente ao longo do axónio para o corpo celular destes neurónios que se projectam ao longo das regiões da medula espinal e/ou do tronco encefálico. Os corpos celulares dos neurónios estão também presentes no DCN que possuem extremidades terminais do axónio que terminam, por exemplo, na região cervical da medula espinal. O vector virai recuperado por estes corpos celulares, transgene expresso resultando do vector virai ou ambos, pode ser transportado anterogradamente para as extremidades terminais do axónio na região cervical espinal. Por isso, utilizando o DCN como um sitio de injecção, apenas um pequeno volume do vector virai é injectado mas este medeia a expressão significativa do transgene 31 ao longo de uma ou mais encefálico. regiões na me dula espinal e/ou no tronco

Em algumas formas de realizaçãc administração de um vector neurotq ' os métodos compreendem a

"°Pico de titulo elevado que transporta um transgene terapêutico H transgene seja expresso a um nível to modo a que o produto do ^-apéutico num segundo no SNC distai para o primeiro sita aç ão, 0 títu. 8, 4, ^ ! Q 0 J r — r c w , 4, 9, 9,3, 8, 8, 4, 9, 9 , 10, 15, 20, 25 10, 15, 20, 25 ou .10 10 * Em algumas formas de xÇao é dç > menos: (a) 5, 6, gp/mL); (b) o f 6, tu/mL); ou (c) 5, 10 iu/mL) . K loutras f o r m a. s d e r e a 1 i z a ç ã o, administra Ça° ó conseguida através da uma solução do vector Para o cérebro doente, express o d i s ta1me nt e, para o sítio da w Pelo rn.en.os de 2, 3, 5, 8, 4 0 4 s "' " °u 50 mm do sítio de injecção intraparênquima directa .u neurotrópico de título elevado posteriorrnente o transgene é contraiateralmente ou ipsilateralment administração a um nível terapêutic 10, 15, 20, 25, 30, 35, administração. A distância entre o primeiro e o s como a região da distância mínima entre egundo sítios é definida o sitio de administração (primeiro sitio) e a fronteira da transd--- = ^ ηγ

UuÇdo aetectavel ao silíO aiau-al (segunao uítio,1 como meaiao utilizando processos conhecidos na técnica ou como descrito nos Exempios, e. g., nibridação in s±tu. Alguns neurónios no SNc de mamíferos maiores podem estenaer-se por grandes dxstânciag em virtude das suas atunanos, alguns axomos podem, estender-se ao longo de uma distância de 1000 mm ou superior. Assim, em vários métodos da invençã0f Q veCtor pode ser transportado axonalmente ao longo da -f . . . u- ^ónu ' torça inteira αο οχοη^ο projecções axonais. Por exemplo, em 32 a uma distancia para alcançai parental. transduzir o corpo celular

Um sítio da administraçãc do vector

SNC escolhido com oase na região alvo desejada de neuropatologia e a topologia dos circuitos cerebrais envolvidos desde que o sitio de adminisuraçao e a região alvo possuam ligações axonais. A região alvo pode ser definida, por exemplo, utilizando coordenados estereotáxxcos 3-D. Em algumas formas de realização, o sítio de administração é seleccionado de modo a que pelo menos 0,1, 0,5, 1/ 5 ou 10% da quantidade total de vector injectado é distribuída distalmente na região alvo de pelo menos 1, 200, 5qq ou 1000 mmJ, Pode ser localizado um sítio de administração numa região enervada pela projecçâo de neurónios que ligam as regiões distais do cérebro. Por exemplo, a área da substância nigr-a segmentai ventral substancial e enviam projecções densas para 0 caudado e putâmen (colectivamente conhecido como o striatum). q neurónios no tegmento migra e ventral substanciais podem. s direccionados para a transdução através de transporte retrógr^ de AAV após injecção para o striatum. Como outro exempl< hipocampo recebe proiecções axonais previsíveis bem definidas ^ outras reaiões do cérebro. Podem ser localizados outros sít-m υ § de administração, por exemplo, na medula espinal, tronc encefálico (medula, mesencéfalo e ponte), mesencéfalo, cereb^i mc. um, córtex cerebral, C\ , . -U; j- / parietal OU ΐλ'ΓΟΠ tai v J· > , localizado ern qua ; a medula espinal, Cr-i - d. O. (¾ pa ra o primeiro siU0 (incluindo o núcleo cerebelar profundo), diencéfalo (tálQ nipotálamo), telencéfalo (corpus stri no córtex, os lobos occipital, tempc ou combinações destes. O segundo sítio (alvo) pode sei região do SNC, incluindo o cérebro e contém um neurónio que se projeci 33 v^^TT>.;.n^otj-d.çdo) . Em algumas formas de realização, o segundo sítio e^wá numa região do SNC selecionada da. substantia nigra, da medulla obiongata, do tronco encetai ílico ou da medula espinal. “r<* ^xSt-ribuir o vector especif icamente numa região pai '-‘•^«la- do sistema nervoso central, especialmente numa região ΡαΓ'-“Ia- cérebro, este pode ser administrado por microinjecçao estereotaxica. Por exemplo, no dia da cirurgia, os aoente» t-erao a estrutura estereotáxica com a base fixa no lugar uparaiusaaa ao crânio) . 0 cérebro com a base d.a estrutura estereotáxica (compatível com MRI com marcas fiduciárias} será registado utilizando MRI de elevada resolução. As imagens de MRI serdO então transferidas para um computador que corre um programa de computador estereotáxico. Uma série de imagens coronais, sagitais e axiais serão utilizadas parai determinar o sitio cilvo da injecção do vector e trajectória. 0 programa de computador traduz directamente a trajectória nas coordenadas 3-dimens i onais apropriadas para a estrutura estereotáxica. São feitos furos de rebarba acima do sítio de entrada e o disposit ivo estereotáxico localizado com a agulha implantada a uma determinada -profundidade. o vector num veículo farmaceuticamente aceitável será então injectado. 0 vector é então administrado através de injecção directa no sítio alvo primário e retrogradualmente transportado para sítios distais alvo através de axónios. As vias adicionais de administração podem ser utilizadas, e. g., aplicação superficial cortical sob visualização directa ou. outra aplicação não estereotáxica.

Adicionalmente, porque cada região das regiões específicas dos alvos de DCN do SNC (ver Figura 1 e Figuras 12A e 12B) , um pode alcançar especif icamente a. região do SNC na qual o transgene é distribuído pré-seleccionando a região do DCN para 34 administração. Corão é óbvio para os especialistas na técnica, uma multitude de dosagens e distribuições dirigidas podem ser conseguidas variando a localização, sequência e número de de material a ser de vector a serem e s p e c i a 1 i s t. a s n a terapia génica. A sstadas num modelo de modelos animais administrações de transgenes. 0 volume total administrado e o número total de partículas administrados, será determinado por estes técnica com base em aspectos conhecidos da eficácia e segurança terapêuticas podem ser t animal apropriado. Por exemplo, uma. variedade bem. caracterizados existem para LSD, e. g., como aqui descrito ou em Watson et al. (2001) Methods Mol. Med. 76:383-403; ou Jeyakumar et al, . (2002) Neuropath. Appl. Neurobiol., 28: 343-357 e ALS (see Tu et ai. (1996) P.N.A.S. 93:3155-316 0; Roaul et ai. (2005) Nat. Med. 11 (4):423-428 e Ralpb et ai. (2005) Nat. Med. 11 (4):429-433).

Em murganhos experimentais, o volume total de solução de AAV injectada é, por exemplo, entre 1 a 5 pL. Para outros mamíferos, incluindo o cérebro humano, os volumes e taxas de distribuição sao apropriadamente dimensionados. Por exemplo, foi demonstrado cjue volumes de 150 uL podem ser seguraunente ínjectados no cérebro de primatas (Janson et al. (2002) Hum. Gene Ther. 13:1391-1412). 0 tratamento pode consistir num única injecção por sítio alvo, ou pode ser repetido ao longo do tracto de injecção, se necessário. Os sítios múltiplos de injecç;ão podem ser utilizados. Por exemplo, em algumas formas de realização, além do ao primeiro sitio de administração, é administrada uma composição contendo um vector virai portador de um transgene noutro sítio que pode ser contralateral ou ipsilateral ao primeiro sítio de administração. As injecções podem ser únicas ou múltiplas, unilaterais ou bilaterais. 35

As preparações de título elevado de AAV podem ser produzidas utilizando técnicas conhecidas na técnica, e. g., como aescrito na Patente dos Estados Unidos N° o6587/6 e Arai 7eci_ors ror Gene Therapy: Methods and Protocols, ed. Macnida, Humana Press, 2 00 3 .

Os seguintes exemplos proporcionam rormas de realização ilustrativas da invenção. Um normal especialista da técnica reconhecerá as numerosas modificações e variações que poaem ser efectuadas sem. alterar o espírito ou âmbito da presente invenção. Estas modificações e variações estão incluídas no âmbito da invenção. Os exemplos não limitam de forma alguma a invenção.

EXEMPLOS

Titulaçao de Vectores Recombinantes

Os títulos de vector AAV foram medidos de acordo cora o número de cópias do genoma (partículas de genoma por mililitro). As concentrações de partículas de genoma foram baseadas na ia.qman©-PCu do ADh do vector como previamente reportado (Clark et ãl , . (199 9) Hum. Gene 2 'her., 10: 1031-1 039 ; Veldwij k et ãl , (20 02) Mol • Ther. /- . , o: 272-278) Resum: Ldamente, o AAV- ASM pur ifi cado í :oi trata do coi n tampão de diges tão da cápsic 5 (50 mM de 7rA· .s-HCl pH 8,0, 1,0 mM H (Ci X7- r. ' i:j íj TA, 0,5% de SDS, 1,0 mg/mi. Ó °· pro tei nase K) a 5 0 °C di ar ante χ hc ira pa ra libertar o ADN do vec tor . As amostras de ADK f0r, am colocadas numa re :3- CÇãO Ci0 promotor

em cadeia (PCR) com íi aiciadores qi ae emparelham com específicas o Ό h: P f=d o g vector, tal como a região do ransgene ou a sequêpiCia poli A, Os resultados de PCR 36 foram então quantificados Pei0 P^ogicima de computador do pvea]_ time Taqman®, tal como o proporcionado pela Perkin Elmer-Appned Biosystems (Foster City, CA} Prism 7700 Sequence Detector System. :tam um marcador detectável, tal comc

Os vectores que compor β-galactosidase ou gene da proteína verde fluorescente (GFP) podem ser titulados utilizando um ensaio de infectividade. As células susceptíveis (e. g., células HeLa ou COS) são transluzidas com o AAV e é efectuado um ensaio para determinar a expressão do gene, tal como a coloração de células transduzidas com o vectoi da p—gaj_a.ctosidase com X—gal (5—bromo—4—cloro—3— 1 η o o 1 i 1 — β—D—g a r a c o o p 11. a n ó s i d o) o u m i c roscopia de f: "i u o rescênci a 8 as células transduzidas com GFP. Por exemplo, 0 ensaio é ctuado como se segue: 4 x 104 célul as HeLa são plaqueadas em a poço de uma placa de cu ltura de 24 poços utilizando meios CI : e s c i m e n 10 n 0 r m a i s . Ao ó e ligaçao, i. e,, cerca de 2 4 horas oi s, as células são íectadas com Ad tipo 5 com uma. multiplicidade de infecc-s-. ° d40I) de 10 e transduzidas com diluições seriadas do vect-n empacotado e incubadas a 3 7 °C. Um a três dias mais tarde, wllues dos efeitos citopáticos extensos serem observados, o ensa-m. apropriado é efectuado nas células (e. g. , coloração com x-qa1 ^ ou microscopia de fluorescência.) . Se é utilizado um gene rena-v as de se ^^rter, tal como β-galactosidase, células são fixas em 0o de paraf ormaldeído, 0,5% g lutar a Ide ido e coradas ...

Fara a actividade de β-galactosidas utilizando X-qal. As dillv: - - -‘-Çoes ao vector que dão células bem separadas são contadas. n -ada célula positiva representa 1 unidade de transdução (tu) v de vector. 37

Expressão da Proteína Funcional Detêm a Diminuição Motora num Modelo de Murganho Terapeuticamente Relevante

Os murgai oh os ASMK do ença Niemann-Pi .ck i 10 :288-293,° J i n e t al. Ot terbach (19 95) Ce 11 (NPD) é cl assi r rcad 1 i sossómico e € 3 UÍÍ ca racteri zado por uma ac ida (ASM; /*-» r V. >lino: o ..j * 1.3.12). A f a Ita 0 são um modelo aceite dos tipos A e B da (Horinouchi et ai. (1995) Nat. Genetics . (2002) J. Clin. Invest. 109:1183-1191; e 81:1053-1061). A doença de Niemann-Pick .a como uma doença de armazenamento í distúrbio neurometabólico hereditário deficiência genética na esfingomielinase fosfo-hidrolase da esfingomielina, EC da proteína ASM funcional resulta na acumulação de substrato de esfingomielina nos lisossomas de neurónios e da glia no cérebro. Isto leva à formação de grandes números de lisossomas distendidos no pericario, que são uma marca característica e o fenótipo celular primário de NPD do tipo A. A presença dos lisossomas distendidos correlaciona com a perda da função celular normal e um rumo neurodegenerativo progressivo que leva a morte do indivíduo afectado na primeira infância (The Metaboiic: and Molecular Bases of lnh< Diseases, eds. Scriver et ai. McGr aw-Hi11, Nova Iorque, pp. 3 5 8 9 -3610), Os fenótipos secundários celul ares (e 9- f anormalidades metabólicas adicionais) são também associados com esta doença, nomeadamente o elevado nível de acumulação do colesterol no compartimento lisossómico. A esfingomielina possui uma forte afinidade para o colesterol, que resulta no sequestro de grandes quantidades de colesterol nos lisossomas de murganhos ASMKO e doentes humanos (Leventhal et aí. (2001) J. Biol. Chem. 276:44976-44983; Slotte (1997) Subcell. Biochem. 28:277-293; e Viana et al. (1990) J. Med. Genet. 27:499-504.) 38 A experiência, que se segue, avaliou a capacidade relativa de vectores do serotipo AAV2/1, AAV2/2, AAV2/5, A..AV2/7 e AAV2/8 recombinantes que codificam a ASM humana (hASM) para expressar a proteína hASM, corrigir a patologia de armazenamento de e colesterol, sofrer transporte, salvar células de Purkinie iniciar a recuperação funcional no murganho ASMKO após injecção unilateral no núcleo cerebelar profundo. Um grupo adicional de murganhos ASMKO recebeu injecções bilaterais no DCN de modo a avaliar se a proteína transgene aumentada que se espalhou/expressou melhorou a recuperação funcional. PCR segu indo o procedimento 77 Engl J Me d: 2.93 : :632-636. Os ram retro- -cruzados na estirpe s sob um i ciclo de 12:12 horas

Sessenta e seis murganhos machos homozigóticos (-/-) anulados para a esfingomielinase ácida (ASMKO) e dezasseis machos do tipo selvagem da mesma ninhada de controlo foram criados a partir de cruzamentos heterozigóticos (+/-). Os murganhos foram genotipados por PCR descrito em Gal et ai, (19 75) N E. murganhos da colónia original C5//BI6. Os animais foram alojados sob de luz:escuro e proporcionou-se-lhes comida e água ad libitum. Todos os procedimentos foram efectuados sob um protocolo aprovado pelo Institutional Animal Care and Use Committee.

Após serem anestesiados com isoflurano, os murganhos (~1 semanas de idade) foram unilateralmente injectados no núcleo cerebelar profundo (A-P: -5,75 a partir da bregma, M-L: -1,8 a partir da bregma, D-V: -2.6 a. partir da dura, barra incisora: 0,0) com um dos seguintes vectores do serotipo de A.AV (n=8/vector): AAVl-CMV-Bgal, AAV1-CMV-ASM, AAV2-CMV-ASM, AAV5-CMV-ASM. AAV7-CMV-ASM e AAV8-CMV-ASM. Os vectores foram existi, ibuxdos com uma seringa Hamilton de 10 yL montada numa bomba de seringa a uma taxa de 0,5 yL /minuto para um total de 39 1,86 x IO10 partículas de genoraa por cérebro. 0 volume £indi ae injecção para cada vector foi de 4 pL. Uma hora antes e vxn^e e quatro horas após cirurgia, foi dado aos murganhos (5 mg/kg; SC) para analgesia. ✓ ~ A Q orn d η P q

Os murganhos foram mortos 7 semanas pos-rngecçao (x*

Purkirrje com coloraÇdu C0ITI

Na altura do sacrifício os murganhos foram sobre-doseados com euthasol (150 mg/kg; IP) e rapidamente decapitados (n=5/grupo) ou transcardialmente per fusionados (n=3/grOp^' · ~,fc cérebros, dos murganhos decapitados foram rapidamente re^'· lv''jS' rapidamente congelados em azoto liquido, dissecados em 3 secções (hemisfério cerebral direito, hemisfério cerebral esquerdo' cerebelo) homogeneizados, e analisados quanto a hASM poi Os cérebros e medulas espinais de murganhos perfusionados -oram processados para a expressão de proteína ASM humana, ac^mulavao de colesterol conforme detectado por coloração com fiiiPllia' e sobrevivência das células de calbindina em secções por vibratome de 50 pm. Os murgani que receberam as injecções bilaterais (-7 semanas de ia os ASMKO ade) de foram f a·. AAV 2/β ga1 (n=8 ), AAV2/1-ASM (n=5) e s a c r i f í c a d o s à s 2 0 semanas de idade r o tar od. 0 s mur ganhos foram testados por rotarod para a função motora no Smartr métodos conheci .dos na técnica . Os métO1 reproduzidos em Sleat et al. (2004) J. As Figuras 10 e 11 mos stram grs i.f icamente de rotarod como uma medição de .C C- U-p O T 9 •y' < apos cão da função motora. *· -f- v- λ. V' r (c! Io t d tit, vJ J_ J_ Cl L· ·>" - ição e balanço de i (AccuScan) utilizando exemplificativos são rosei. 24:91i7—9i26. 0 ADNc de comprimento total da ASM humana sob o controlo do promotor do citomegalovírus imediato-precoce (CMV) numano, com uma sequência de poliadenilação de SV40, e um intrão híbrido foi clonado num plasmídeo contendo ITRs do serotipo 2 de AAV (AAV2 40 ITR). Jin et al. (2002) J Clin invest. 109:1183-1191. Os vectores híbridos foram produzidos por transfecção tripla utilizando uma série de plasmídeos auxiliares contendo os domínios que codificam a cápside específica do serotÍDo além dos genes de replicação do tipo 2 de AAV. Esta estratégia permite o empacotamento dos vectores de ITR de AAV 2 era cada virião específico do serotipo, Rabinowitz et al. (2002) j Virol. 76:791-801. vom esta abordagem o qenoraa recombinante de hASM foi utilizado para proauzir uma série de vectores rAAV-hASM de vários serotipos incluindo AAV2/1, AAV2/2, AAV2/5, AAV2/7 e AAV2/8. Os vectores recombinantes de AAV foram purificados por cromatografia de O'P.iordan et ai . (2 0 0 0 ) troca iónica (Serotipos 2/1, 2/2 e 2/5). J Gene Me cl 2 : 4 4 4... 54 ou ce n t r 4 f u g a ç § o e rn

CsCl (serotipos 2/8 e 2/~>\ ri +. , .. ’> Rabinowitz et ai, (2002) J. Virol. 76:791-801. O título finai h=,o n?rfír n , . _

aas paiticulas o.e viroes de AAV-ASM (partículas resistentes .

a ADNase), foi determinada por PCR

TaqMan da sequência de PMW Ciam et al. (1999) Hum. Gene

Therapy 10:10 31-1039.

Os anticorpos para a , -noui Humana sao específicos para humanos e nao reagem de forma p,. -ruzada com ASM de murganhos. Placas

Coster (Corning, ny) 901 o revestidas (100 pL/poço) com anticorpo -i inana 5 carbonato de sódio (pi-i 9,6) foram 0 outro a 2-8 °C. Q excesso de oi removido e foi adicionado diluente MD) durante 1 h a 3 7 °c. As placas iclor de microplacas (Molecular Devices, Os padrões, controlos e amostras diluição convencional (PBS, 0,05% de monocional para a ASM κ umana recombinante (rhASM) (2 pg/mL) :amp^o de Pat-r, diluído em 5 0 mM de t mcuoaaas um dia "aiti pipetados em duplicado e deixados a °C. As placas fc 41 anticorpo de revestimento -p de bloqueamento (KPL, Ir,0 foram lavadas com um lav CA) durante dois ciclo diluídas no tampão de Tween, 1% de HP-BSA) for incubar durante 1 h :am lavadas como o! te o cri to acima. Cem mi cr ^-i t ro-itr0s de anti coroo · Λ sçu h-man-s , . icor^o oi^tinuacto para a humana recomamante íM-hmoTvn /u·, (i ru-iSM) (ailufdo 1:2\ diluição convencional) foram adi

)K o de em tampão >oço, deixados a um lavador de 0. . - -· - HRP (Pierce Biotecnnology, inc tt v ., , . jy r li; anuído 1:1 ok ίΐΛη r-,τ , . H mh/poço) e roi -^texxado a incubar durante on -rin - - . η a cemperatura ambiente. As jclaças foram lavadas como dosrH t-n m do o cr ito anma e aepois incubadas com £>ureBlue TMb (kpt,, Tnc j — r lID) ourance 15 minutos a 36-38 °C. A reacçao foi interrompida com +. c ra de interrupção (KPL, Inc., Íb) e°S valores de absorvência foram depois lidos a 450 nm um leitor de placas Spectra Max 340 (Molecular Devices, CA). análise de dados foi completada utilizando o programa d -uiupuuador Softmax Pr o 4.3 (Molecular Devices,. CA) f oram adicionados a O o e então remov ad i. c i o n ad o e s t r ep t. com ae a couxentiaçao de proteína para cada amostra foi determinada com urn kit BC A protein assay (Pierce Biotechnology, inc., iL) utilizando albumina do soro bovino como padrão.

Os murganhos foram rranscardxaimente perfusionados com fixador contendo 2% de paraformaldeído, 0,03% de glutaraldeído, 0, 002% de CaCl2 em 0,1 M de tampão acetato de sódio a pH 6,5 seguidos por perfusão com o mesmo fixador a pH 8,5. Os cérebros e medulas espinais de murganhos foram dissecados e pós-fixados ae um dia para o ouv.ro a 4 °C em fixador pH 8,5 Sem glutaraldeído. Os tecidos foram lavados em 0,1 M de tampão fosfato de potáss lo, pH 7,4, embebidos em 3,5% de agar Q cornados em secções sagitais de 5( J μη com ui n vibratome. Os cérebros e medulas espinais foram sagitalmente seccionadas por vibrátomo a intervalos de 50 mm. foram processadas para imunofluorescência com 42 «.s secções Pos antico-*- primários contra a ASM humana (1:200). As secções for-, incubadas em 10% de soro de burro, 0,3% de Triton X-100 em ppQ durante 1 hora, seguido por incubação com anti-ASM humana murganhos biotinilado em 2% de soro de burro, 0,2% de Trit ue on X-100 em PBS durante 72 horas. Após lavagem, o sinal f0.j amplificado utilizando um kit Tyramide Signal Amplificatiog (PerkinElmer, Boston MA) . A proteína ASM humana foi visualizada com um microscopio de fluorescência Nikon, e as imagens foram capturadas com uma c amar a SPOT e o programa de computador Adobe Photoshop. O Complexo de Filipina (Sigma, St. Louis, MC) foi primeiro diluído em 100% de metanol para uma concentração Qe armazenamento de 1 mg/mL. A solução é estável durante 4 semanas a -2 0 °C. Após lavagem com PBS, as secc ões foram incubadas πι ο escuro durante três horas numa solução feita de fresco de 10 pg/mL de filipina em PBS. As secções foram então lavadas três vezes com PBS. Os depósitos de colesterol foram visualizados sob um filtro de ultravioleta num microscópio de fluorescência.

Os cérebros foram processados oor imunofluorescência utilizando anticorpos primários dirigidos contra a proteína de ligação a cálcio, calbindina. &s secções foram lavadas com tampão fosfato de potássio (KPB) e depois passadas por soro fisiológico tamponado com fosfato de potássio (KPBS). As secções foram então bloaueadas em soro a 0,25% de Triton χ~ 100 em KPBS a.té 3 horas e depois incubadas em soro de burro a 5%, 0,2% de Triton X-100 e anti-caibindina de murganho (1:2500,

Sigma, St. Louis, MO) em KPBS.

Ac os 72 horas a

8.S secções foram passadas por KPBS com 0,1% de Triton X-ly0 três vezes, o anticorpo secundário, anti-CY3 de murganhos de burro (1:333, Jackson Immunoresearch Laboratories West Grove, PA) foi 43 adicionado em KPBS + 0,1% de Triton X-100 durante 90 minutos à temperatura ambiente. As secções foram lavadas com KPB e depois montadas em lâminas revestidas com gel. As células positivas para calbindina foram visualizadas sob epifluorescência. De modo a quantificar as células de Purkinje do cerebelo, quatro secções f acei lompletas, do cerebelo mediano foram sele partir de cada animal. As células de Purkinje imunopositivas para a Calbindina foram visualizadas sob um microscópio de fluorescência e os corpos celulares foram contados com uma amplificação de 20X. Cada lóbulo foi contado separadamente. Foram contados dois planos focais separados por lóbulo. Apenas foram contadas as células no foco para assegurar que as células não foram contadas duas vezes.

Secções de vibrátomo de cinquenta (50) μηι foram primeiro processadas por imunofluorescência com anticorpos dirigidos contra ASM humana, como descrito acima. As secções foram então lavadas em PBS e coradas para a acetiItransferase de colina (ChAT; políclonal de coelho, 1:500, Chemicon International, Temecula, CA) com o protocolo delineado acima para a calbindina. Em vez de utilizar um anticorpo secundário CY3, foi, no entanto, utilizado, o anti-coelho de burro FITC (1:200, Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA) . a coloração foi rimeirs visualizada )iflr orescencia e as imagens posteriores foram adqu idas com um microscópio confocal. A coloração com filipina foi quantificada como se segue. As imagens sobrepostas da exposição foram capturadas utilizando um microscópio de epifluorescência Nikon E600 de campo vertical amplo equipado com uma câmara digitai SPOT. O grupo AAVC/l-p-gal foi capturado adquirir toda •rimeiro, e essa exposição foi utilizada para as imagens adicionais. Cada imagem analisada 44 representei. um plano sagi.tal mediano o longo do compr iinento de cacia metade do cérebro. A análise o programa Metamorph (Universal I AAV2/|3-gal foram limiarizadas; u limiar foi utilizado em todas as foram manualmente selecionadas separadamente: cerebelo, ponte, morfométrica foi efectuada com maging Corporation). As imagens ma vez estabelecidas, o mesmo imagens. As regiões seguintes peio urilizador e analisadas meouid, mesencéfalo, córtex cerebral, hipocampo, tálamo, hipotálamo intensidade integrada foi medida em cada j-egiao, e todas as medições (n= 3/grupo) de um. determinado οτ.11η . .... m-upo de animais foram utilizadas para produzir médias. A redução e striatum.

A em colesterc nos Iculada Como 0 decréscimo de comparada coma. de murganhos A coloração de i muη o coloração :vada ao -xongo do cerebelo pos injecçao knockout injectados com β-gal positiva para hASM foi observad (Tabela 1), ponte, medula e medula e?rs -u^nal apos

unilateral, de AAV-ASM no núcleo cerebelar Pr f .. — X U undo.

Tabela 1 Areas com coloração positiva para hASM como funo=u--- CJC indica positivo para hASM foi abaixo do 1 irrt 11- - Ltí dé correcção da patologia do colesterol ainda ocorreu serotipo de AAV. s detecção, mas a Estrutura AAV1 AAV2 AAV 7 AAV 8 núcleo cerebelar profundo + + + + 4-4- -- + + 4- + 4-4- + + + + lóbulos do cerebelo 4- 4- 4- 4- 4- 4- 4 4 + 4 4 4- + 4 4- 4· ponte 4- 4- 4- 4- 4 + + medula + >+ —. + + + + medula espinal 4· + + '—--- ++ tálamo k * k * hipotálamo k k * * hipocampo k * .*· 1——- k * striatum k * * — k k córtex cerebral. k * o- ----- k k 45

No cerebelo de murganhos tratados com AAV2/1-ASM existia o nível mais disseminado (i. e., espalhado entre os lóbulos na mesma secção sagital) de expressão de hASM, enquanto os murganhos tratados com AAV2/2-ASM possuíam o nível mais restrito de expressão de proteína ASM Humana.. A expressão de proteína ASM humana em murganhos tratados com AAV2/5-ASM, AAV2/7-ASM e AAV2/8-ASM foi intermediado entre estes dois grupos. Mediano -espalhamento lateral entre secções sagitais foi máximo em murganhos tratados com os serotipos 1 & 8 e mínimo nos murganhos injectados com o serotipo 2. Os serotipos 5 & 7 iniciaram os padrões de espalhamento mediano-lateral intermediado entre os serotipos 1 e 2. Cada camada do cerebelo (i. e., molecular, Purkinje e granular) foi transduzida por cada. serotipo de AAV; no entanto, foi aparente uma afinidade aumentada para a camada molecular para todos os serotipos. A transdução de células de Purkinje foi máxima em murganhos tratados com os serotipos 1 e 5. Os murganhos injectados com o serotipo 7 tinham o menor número de células de Purkinje transduzidas. Os murganhos tratados com 0' seroti po 8 também tinham poucas cél U13. S de Purkinje t r ansduzida s, mas tinha menos expressão de AòI^í na camada gr; anular quando comparada com os serotipos 1, o f O A 7, A S C Θ .1U -1.3. s de I 'urkin j e transduzidas com ASM pareciam ter uma citoestrutura saudável. A análise quantitativa da expressão da proteína hASM mediada por AAV por ELISA em homogenatos de tecido do cerebelo apoia estas observações imuno-histoquímicas. Os murganhos injectados com os serotipos 1 e 8 dem.onstra.ram níveis significativamente superiores (p < .0001) de proteína hASM no cerebelo quando comparado com todos os outros murganhos. Os níveis de hASM no cerebelo de murganhos injectados com os serotipos 2, 5, & 7 não estavam acima dos níveis dos WT (i. e. ruído de fundo). Como esperado a ASM humana não foi detectada em 46 murganhos do tipo selvagem - os anticorpos para na ELISA são específicos de humanos. hASM.

Tti.lizad.os

Uma ausência de proteína ASM funcional resulta na acumulação defeitos subsequentes 1 i s o s s óm i ca de esf ing o.m i e 1 i n a metabólicos secundários, tais c colesterol. Sarna et al. Eur. J. Neurosci. 13:1873-1880 e Leventhal et al. (2001) j. Biol. Chem. 276:44976-4498. 0 e um tráfego a: normal d«

ASMKO colesterol livre sintetizado no cérebro de murganho visualizado utilizando filipina, uma molécula autofluores^ente isolada de Streptomyces filipinensis. 0 cérebro de murganhos do tipo selvagem não cora positivamente para a fil ipina. Em toaos os murganhos tratados com AAV (com excepção 06 AAV2/1-Pgal) a eliminação da coloração de filipinu (Tabela 2) sobrepôs-se com áreas que foram positivas para a imunocoloração de hASM indicando que cada vector de serotipo é capaz de produzir um produto do transgene funcional.

Tabela 2 R©d.UÇãO G.3. ΡθΓΌ·ΘΓ^3.0?ΘΓΓι na elim: .nação de Filipina (i. e., colesterol) em comparação com. murganhos ASMKO t rata dos cc >m AAV-pgal era regiõe 3 do cérebro selecclonada 3 após injecçâo intracerebela r de diferentes serot .ipos de AAV (n=3/serotipo; 2/1, 2/2 2/5, 2 / / 8 2/8) que codificam para a ASM humana no núcleo cerebelar profundo de murganhos ASMKO. 2/i 2/2 2/5 2/7 2/8 Cerebelo 96,54 ,t 93,85 ± 86, 75 ±9,58 96,47 ± 1,93 99,12 ± ,66 2, .14 1, 257 Mesencéfalo 96,72 ± 53,08 ± 65, 88 ± 73,39 ± 91,10 ± ,10 5 1, 73 22,89 24, 53 22,3 9 Ponte 91,31 i 50,07 ± 70, 96 ± 93,15 ± 96,72 ± 1,20 5, 30 21,26 25, 60 31,20 Medula 93,29 ± 8 S, 4 6 ± 81, 55 ± 80,73 ± 97, 40 ± 1,60 6,22 3, 04 17, 31 14, 99 47 (continuação) 2/1 2/2 E. / D 9/7 2/8 Tálamo 48,88 ± 41,21 ± 34,86 ± 48,44 ± 77,03 ± 25, 25 27,35 16, 67 28, 65 12, 08 Hipotálamo 82,81 ± 10, 14 80,96 ± 12,93 88,46 ± 5,90 82,95 ± 11,46 99,68 ± ,31 Córtex 2 7,60 ± 24, 75 73,62 ± 14,9 55,65 ± 28, 89 76,97 ± 14,27 9 8, 30 ± ,34

Como previamente demonstrado por (Passini et al. (2003) em "Society for Neuroscience" Nova Orleães, LA) , a eliminação de filipina também ocorreu em áreas anatomicamente ligadas com o sítio de injecção, mas estas não coraram positivamente para hASM. A análise MetaMorph indicou que ai redução da coloração de filipina ocorreu ao longo de todo o eixo rostral caudal. No cerebelo e tronco encefálico a filipina foi maximamente reduzida em murganhos tratados com AAV2/1-ASM e AAV2/8-ASM, enquanto no diencéfalo e córtex cerebral os murganhos injectados com AAV2/8-ASM tiveram o melhor nível geral de eliminação de filipina (Tabela 2). No entanto, estes resultados indicam que o nível de hASM necessário para corrigir a patologia de armazenamer :o de c olesterol no SNC de murganho ASMKO é mínima (i abaixo do limite de detecção da imunofluorescência de hASM).

Os estudos histológicos indicam que o cerebelo dos murganhos ASMKO sofre uma rápida deterioração. Ma is especif icarnente, as células Purkinje morrem progressivamente entre as 8 e 20 semanas de idade (Sarna et al. (2001) Eur. J. Neurosci. 13: 1813-1880 e Stewart et al. (2002) em "Society for Neuroscience" Orland, FL). Calbrndina é um marcador de células de Purkinje amplamente aceite. A coloração de calbindina positiva em murganhos tratados com AAV-ASM sugere que a expressão de hASM mediada por AAV é 48 ;os murganhos os murganhos terapêutica. No geral, os resultados da requerente indicam que expressão de hASM mediada por AAV no cerebelo evira a morte das células Purkinje no murganho ASMKO (Tabela 3). Como esperado a sobrevivência das células de Purkinje nao ocorreu nos lóbulos I-III; os murganhos foram injectados às 7 semanas de idade e pelas 8 semanas a maioria destas células já tinha morrido. A sobrevivência das células de Purkinje nos lóbulos IVN foi máxima em murganhos tratados com o serotipo 1. No lóbulo VI não foi observada sobrevivência significativa das células de Purkinje em murganhos tratados com AAV. No lóbulo VII apenas murganhos tratados com o serotipo 5 apresentaram uma significativa sobrevivência das células de Purkinje. No lóbulo VIII de novo os murganhos tratados com o serotipo 5, assim como com o serotico 2 apresentaram uma sobrevivência significativa, das células de Purkinje. Nos lóbulos IX © X ná_o existiram diferenças significativas entre os murganhos WT e KO (ou entre os murganhos tratados com AAV) nas contagens de células de Purkinje. Isto era esperado, porque às 14 semanas de idade (i. e., idade do sacrifício) as células de Purkinje nestes lóbulos são ainda viáveis em murganhos ASMKO. Ao longo de todos os lóbulos a sobrevivência das células de Purkinje f0j_ máxima rtc e minirn; tratados com os serotipos 1, 2, tratados com os serotipos 7 & 8. 49

Tabela 3 contagens de céf^U^ de p, i r k i n j e η o s 1 ó b u 1 o s cerebrais I-X em rnur ganhos wx e ASMKO após J-njecção intr acerebelar de diferentes serotipos de AAV (n=3/s erotipo; 2/χ, 2/2, 2/5, 2/7 e 2/8) que codificam para a ASM humana no núcleo cerebç ;lar profundo de mure janhos ASMKO. Os números que a parecem a itálic o negrito sáo significativamente diferentes dos murganhos KO (i, e.. murgar hos tratados com AAV2/pgal) p < 0,01. 2/1 2/2 2/5 2 / 7 2/8 KO WT I/II 7, 42 ± 4, 5 ± 9,4 0 ± 12,33 ± 1 ± 9,16 c; p + 113 ± 9,8 0 10,58 11, 59 i f 3 Ó 11,59 10,58 III 12,42 ± 11,33 ± 26,80 ± 15,33 ± 91 0 +. 2 1 9,65 147,50 + 10,32 11, 14 12,21 11,14 12,21 11,14 IV/V 60,57 ± 36,5 ± 27,80 ± 29,66 ± 6,8 ± 8 ± 220,66 ± 17,28 18, 67 20,45 18,67 20, 45 16,16 18,67 VI 61,14 ± 27,5 ± 72,20 ± 31,16 ± 3,8 ± 6 8,5 ± 121,16 ± 11,21 12, 11 13,26 12,11 13,26 10,48 12,11 VII 17,42 ± 37,66 + 40,60 ± 5,33 ± ,2 ± 17 ^7 j. ' r —> ' -L. 37,16 ± 4,15 4, 49 4,91 4, 49 4, 95 3, 88 4, 49 VIII 44,14 ± 48,66 ± 82,80 ± 11,33 + 18,40 ± 35,12 ± 103,33 ± 10,75 11,62 12, 73 11,62 12,73 10,06 11,62 IX 126,28 ± 102,66 ± 136,40 ± 60,16 ± 84,40 ± 108,0 ± 144 ± 19, 17 20, 71 22,68 20,71 22,68 17,93 20, 71 X 89,85 ± 76,83 1 93,80 ± 48,16 + 64,80 ± 87 ± 86,66 ± 12,54 13,55 14, 84 13,55 14,84 11,73 13,55 bo oeste de rotarod acelerado os murganhos unilateralmente infectados com AAV2/1-ASM e AAV2/8-ASM demonstraram uma latência sigmf xcativamente (p< 0, 0009) maior para cair do que os murganhoo ASMKo injectados com AAV2/l-pgal. Os murganhos injectados diferentes AAV2, com o serotipo AA 2/1-ASM não t o r a m. s i g n i f i c a t i v a me n t e dos ; murganho s do tipo ; selvagem. Os murganhos com AAV 2/2-ASM AAV2/5- -ASM mostraram uma tendência ma i o r latência pa. ra cair ci 0 que os murganhos ASMKO com AAV2/3gal; 0Γ iquanto, o s murganhos injectados com não o fizeram. P ara o t este de ioalanço de rotarod, 50 apenas os murganhos injectados coin-AA2/ 1-ASM demonstraram uma latência significativamente maior (p< 0,0001) para cair do que os murganhos injectados com AA2/l-f3gal. Neste caso os murganhos de tipo selvagem tiveram um desempenho significativamente melhor do que os murganhos injectados com AA2/1-ASM. Os murganhos ASMKO que receberam injecção bilateral de AAV2/1-ASM ou AAV2/2-ASM tiveram um desempenho significativamente melhor (p < 0,001) do que os murganhos tratados de aceleração e balanço, com. AAV2/1-ASM tiveram um com ASMKO AAV2/1 Pgai para os testes Os murganhos injectados bilateralmente desempenho comparável com os murganhos de tipo selvagem para ambos os testes.

Uma forma de determinar se o AAV produzido hASM é funcionalmente active no SNC de ASMKO é avaliar a sua influência na patologia de armazenamento de colesterol - Um defeito metabólico secundário da doença de NP A. Em todos os murganhos tratados com AAV (com a excepção de AAV2/l~3gal) a correcção da patologia de armazenamento de colesterol sobrepôs-se com áreas que foram positivas para a imunocoloração de hASM indicando que cada vector de serotipo é capaz de produzir um produto funcional do transgene. Como previamente demonstrado, a correcção do metabolismo anormal de colesterol também ocorreu em áreas anatomicamente ligadas com o sitio da injecção, mas também nas que não coraram positivamente para hASM, sugerindo que o nível de hASM requerido para correcção da patologia de armazenamento de colesterol é mínima. Consistente com estes resultados histoquímicos e bioquímicos para hASM, os murganhos tratados com os serotipos 1 e 8 demonstraram uma marcada redução na patologia de armazenamento de colesterol. Os muraanhos tratados com os serotipos 2, 5, & 7 também mostraram uma redução na patologia de armazenamento de colesterol, mas com a mesma extensão dos murganhos & 8 . tratados com os serotipos 1 51

Modelo

Terapeuticamente Relevante de Esclerose Lateral Amiotrófica (ALS). A esclerose lateral amiotrófica (ALS) é uma doença neurodegenerativa fatal que é caracterizada por uma perda seiectiva de neurónios motores no córtex, tronco encefálico e medula espinal. A progressão da doença pode levar a atrofia do aos muscuios do limbo, axiais e respiratórios. A morte da célula, neuronal motora é acompanhada por gliose reactiva, anormalidades do neuror1lamento e uma perda significativa de grandes fibras m i e1r nada s ηo s t r a c t o s c o r t ic o e sp in a i s e raízes ve n t r a i s1 “6. Embora a etiologia de ALS seja fracamente entendida, as evidências acumuladas indicam que a ALS esporádica (SALS) e familiar (FALS) partilham muitas características patológicas semelhantes; deste modo, proporcionando uma esperança de que o estudo de qualquer forma, levará a um tratamento comum7, a FALS contribui com aproximadamente 10% de casos diagnosticados, dos quais 20% estão associados com mutações dominantemente herdadas na dismutase do superóxido Cu/Zn (SOD1)8. Os murganhos transgénicos que expressam a proteína S0D1 humana mutante (e. g., murganhos SOD1G9ja) recapitulam muitas características patológicas de ALS e são um estudar a ALS9 Para a SALS patológicos foi. implicada como

Cl são um modelo animal disponível pa a SALS, uma miríade de mecanismos a como a. causa subjacente, incluindo excitotoxicidaae induzida pelo glutamato, exposição a. toxina, disfunção do proteassoma, danos mitocondriais, desorganização de neurofilamentos e perda de suporte neurotrófico10,11.

Até à data não existe uma terapia eficaz para o tratamento

ie ALS. Os factores neurotróficos, tais como factor I 52 crescimento de insulina v IG t? -1) to r a in. i n v e s t i g a d o s extensivamente quanto à sua potencial utilidade no tratamento de ALS. A distribuição intracraniana de vectores virais (que são capazes de transporte axonal) nas regiões do SNC que são interligadas coia o ^ron^o encefálico e neurónios motores espinais proporciona um meio de uma potencial administração terapêutica, tal como IGF-1, em áreas que podem de outra forma ser difíceis de atingir através dos meios da técnica anterior.

Sem estar limitado pela teoria, pode ser que estas regiões alvo não tenham necessariamente necessidade de ter ligações directas com neurónios motores; ou seja, pode ser suficiente para estas regiões alvo terem ligações directas com células (e. g,, interneurónios e astrócitos) que meramente compoem o ambiente celular dos neurónios motores. Esta suposição é suportada por estudos em murganhos quiméricos que sao misturas de células que expressam S0D1 normal e mutante. Estas experiências mostram que as células não neuronais que nao expressam S0D1 mutante atrasaram a degeneraÇão e estenderam significativamente a sobrevivência de neurónios motores que expressam mutantes1'. Além disso, experiências adicionais demonstraram que as células que constituem o amoiente celular: de um neurónio motor (e. g., astrócitos e microglia; sao importantes fontes de factores neurotróficost e sugeriao que os danos destcis células (uma vez (que ocorrem patologicamente na ALS) eram um dos factores subjacentes que contriouem para a degeneração de neurónio motor11.

Uma região do SNC que provavelmente sup°rl-a ° transporte ae um vector virai terapêutico e/ou proteína expressa no ambiente celular dos neurónios motores é o núcleo cerebelar profundo (DCN) cio cerebelo. 0 DCN possui extensas liguções aferenL.es e 53 eferentes figura 1) ambas com o tronco encefálico e a medula espinal (ver 4 " · Alcançar o DCN num modelo de murganho de doença ηβαιometabólica vectores virais capazes de transporte axonal resultou na detecção de proteína do transgene no tronco ã medula espinal^0. De uru modo interessante, a proteína do transgene foi detectada em células que foram positivas e negativas para a acetiltransferase de colina (ChAT), um marcador do neurónio motor. A sobre-expressão de mutações do gene da superóxido dismutase-1 (S0D1) em murganhos e ratos recapitula as características clínicas e patológicas de ALS em humanos. Os compostos activos em retardar os sintomas neste modelo mostraram ser preditivos da eficácia clínica em doentes com ALS e, deste modo, são um modelo terapeuticamente relevante desta doença. Estes modelos de murganho foram previamente descritos em Tu et ai. (1996) P.N.A.S. 93:3155-3160; Raspar et al. (2003) Science 301:839-842; Roaul et al. (2005) Nat. Med. 11(4):423-428 e Ralph et al. (2005) Nat. Med. 11(4): 429-433.

As presentes experiencias procuram, deste modo, investigar a influência da distribuição bilateral no DCN de AAV-IGF-1 na progressão da doença em murganhos SODlGy,A sintomáticos (i. e., 90 dias de idade). Especificamente, os objectives primários foram a determinação de se a distribuição de AAV-IGF-1 resultou em (1) distribuição do vector e/ou proteína no tronco encefálico e medula espinal; (2) uma redução na neuropatologia no tronco encefálico e medula espinal; (3) melhoria na função do comportamento motor; e (4) uma extensão significativa do temoo de vida. Os resultados indicam que a injecção de vectores virais nas regiões do SNC que são interconectadas com o tronco encefálico e medula espinal é uma abordagem viável para a 54 potencial distribuição de transgenes terapêuticos no tronco encefálico e medula espinal. Além disso, os resultados da requerente apoiam o desenvolvimento de terapias que são concebidas para tratar a degeneração do neurónio motor através da modificação do seu ambiente celular.

Foram efectuados dois estudos no G93A S0D1 (murganho mutante SOD1g93a, referido aqui como murganho S0D1) . Este modelo mima de forma próxima, a ALS humana. Existe uma degeneração progressiva do neurónio motor com os défices motores do membro inferior a aparecer por volta dos 90 dias de idade no murganho. A morte ocorre por volta dos dias 120- 122 Cada estudo tinha quatro grupos de t.r ratamento: 1) murganho S .ΊΓ eceberam o sero tipo 1 de AAV que c o d i fica a IGF-1 (AAV1-IGF- -D ; 2) murganhos receberam o serotipo 1 de 1 1A V que codifica a proteína verde fluorescente (AAV1-GFP); 3) mu r g a n h o s r e c e b e r a m o serotipo 2 de AAV q^e codifica a IGF -1 (AAV2-IGF-I); e 4) murganhos receberam o serotipo 2 de J- \A V que c o d i f i c a a proteína verde fluorescente (AAV2-GFP). Sem es1 tar limitado pela te ori a, a é uma proteína terapêutica paro a o tratamento c ie ALS de v i d o à s suas muitas acções em diferentes níveis de neuraxis (ver Dore et al. Trends Neurosci, 1997, 20:326-331). No cérebro; Pensa-se reduzir a apoptose neuronal e glial, proteger os neurónios contra a toxicidade induzida por ferro, colchicina, destabilizadores de cálcio, peróxidos e citocinas. Pensa-se também que modula a libertação dos neurotransmissores acetiicoj_ j_na e olumamato. Pensa-se também que induz a expressão de neurofilamento, tublina, e proteína mielina básica. Na medula espinal; pensa-se que a IGF -1 modula a actividade de ChAT e atenua a perda de fenótipo colinérgico, melhora o surgimento de neuróni0s moto^s 55 fesi-iitii] i a a cie células aumenta, a mielinização, inibe a desmielinizaçao, proliferação de neurónios motores e diferenciação "iwdnn; induz mção precursoras, e promove a divisão de células de S raaturaçao, e crescimento. No músculo: pensai-se que a IGF-a formação do conjunto de receptores de acetilcolina na neuromuscular e aumenta a função neuromuscular e força muscular Nesta experiência, foi utilizada a forma IGF-lEa da proteína. A proteína verde fluorescente foi utilizada. como uma proteína de controlo, que também permitiu a visualização da expressão mediada pela injecção dos vedores AAV.

Noventa dias após nascimento, os murganhos S0D1 foram injectados bilateralmente nos DCN com os vectores AAV re combinantes. Num estudo, a dose foi aproximadamente 2,0 e 10 g c / mL i n j e c t a d o s p o r s í t i 0 . Certos murganhos foram S ci crifiçados cerca de 110 dic is após nascimento e o seu céi rebro e medula espinal. foram analisados para coloração com GFP, expressão de IGF-1 via imuno-histc >quí mica, expr essão de IGF-1 via ELISA, expressão de IGF-l via RT- -PCR, local .ização de ChAT via imuno- —hi stoquimi ca, expressão da proteína glial ac ídica fibrilhar acidica (GFAP), contagens de neurónios τγ; o t' O r* ci c IS·.’·»' '..Λ/x. s.- ·.»» f teste funcional (balanço e aceleração) no rotarod como descrito acima, força de preensão de membro anterior e membro inferior utilizando um medidor de força de preensão e sobrevivência. • & ” foi i. n i c i ado quando c • s animais nao ολ" o ti Por si em 3 0 segundos após o animal

Um "evento de mor podiam mais "endireitar-ter sido colocado de costas ou os anuviais terem sido encontrados mortos por técnicos de cuidados animais, a classificação de "evento de morte" foi efectuada por 2 indivíduos com o grupo de animais (sendo cegos GFP vs. IGF-1) na altura da verificarão. 56 A GFP foi detectada no tronco encefálico durante cada. divisão da medula espinal após distribuição bilateral de um vector AAV que expressa GFP no núcleo cerebelar profundo (DCN) (ver Figuras 13 e 14) . A Figura 22 apresenta a distribuição de GFP no cérebro de murganho. Além do DCN, a coloração positiva para GFP foi também observada nos bulbos olfactivos, córtex cerebral, tálamo, tronco encefálico, córtex cerebral e medula espinal. Toaas estas áreas ou receberam projecções de e/ou enviaram projecções para DCN. Além disso, as fibras positivas para GFP e/ou células foram observadas na proximidade de células positivas para ChAT. 0 ARNrri de IGF---1 foi detectado no tronco encefálico e em cada divisão da medula espinal em murganhos tratados com AAV1-IGF-1 ou AAV2-IGF-1 demonstrando que o vector sofreu transporte retrógrado (ver Figura 18). A proteína IGF---1 foi detectada no tronco encefálico e a medula espinal em murganhos tratados com AAV1-IGF-1 ou AAV2-IGF-1. Uma redução na coloração GFAP no núcleo promotor (por exemplo, o núcleo motor trigémino, núcleo facial e núcleo hipoglosso) e em cada divisão da medula espinal foi observada, em murganhos tratados com AAV1-IGF-1 ou AAV2-IGF-1 (ver Figuras 15-17). A GFAP é um marcador de gliose, que é uma marca patológica de ALS. A distribuição de AAVl-iGF-1 ou AAV2-IGF1 leva a uma melhoria funcional significativa funcional nos objectivos de rotarod e força de preensão (ver Figura. 20). A aistriburçáo de AAV—IGF—1 AAV2—IGF1 também estendeu significativamente o tempo de vida do murganho SOD1 (ver Figura 21 em que a sobrevivência média aumentou para 133,5 ou 134 dias em murganhos tratados com AAV-IGF-1 em comparação com 121 ou 120 dias em murganhos tratados com AAV-GFP) . A Figura. 19 ilustra, que a distribuição de DCN de AAV-IGF-1 promoveu a sobrevivência 57 de neurónios motores. A diferença entre murganhos tratados com AAV que codificam. IGF-1 em comparação com a distribuição de DCM de AAV que codificam GE1? é estatisticamente significativa para um valor de p = 0,01 como indicado 'pelo asterisco.

No que respeita ao serotipo, o tratamento com. AAV-IGF-1 promoveu significativamente a sobrevivência de neurónios motores, desempenho motor melhorado em ambos os testes de rotarod e força de preensão, e estendeu significativamente o tempo de vida. A expressão de IGF-1 foi detectada no tronco encefálico e medula espinal utilizando PCR e ELISA. A descrição é im c omp1e t ame n t e c ompr e e nd i d í •uz doj ensinamentos das refí rei :ia.s citadas descricao.

As :ormas realização na descrição proporciona uma ilustração de formas de realização da invenção e não devem ser entendidos como limitantes do âmbito da invenção. O especialista da técnica reconhece prontamente que muitas outras formas de realização são incluídas na invenção. Todas as publicações, patentes e sequências biológicas citadas nesta divulgação são incorporadas por referência e na sua totalidade. Na medida em que o material incorporado por referência, contradiz ou é inconsistente com a presente descrição, a presente descrição substituirá qualquer deste material. A citaçao de quaisquer destas referências não é uma admissão de que estas referências são técnica anterior da presente invenção. A menos que indicado o contrário, todos os números expressam quantidades de ingredientes da cultura de células, condicões de tratamento, e daqui em diante utiiizaaos ria descrição, incluindo reivindicações, devem ser entendidos como sendo modificados em todos os casos pelo termo "cerca de". Consequentemente, a menos 58 ÍO que indicado o contrário, os parâmetros numérico*7 aproximações e podem variar dependendo das propr-1-*^ ensam obter pela presente invenção. ^ rárí n ^ "i-.o 1 r> menos" cm o cr eCe'jt" dad©s desejadas que se que indica α o o o série de element elemento nas reconhecerão, ίΠ1 eO°k s enes ou serão E stes espec i a i 1 s r, a s na capazes de certificar, não u.t tf écn ada a oas

iliza°G mais ao que experimentação de rotina, muitos equivaleu r-eu cr> X\0·' formas de realização específicas da invenção aqui de Pretende-se qu e estes e qu i v a 1 ente s se j arn i n c 1 u ide*7 reivindicações que se seguem.

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LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS > GENZYME CORPORATION > TERAPIA GENICA PARA DISTÚRBIOS DA MEDULA ESPINA1 > 5302PCT > PCT/US2006/ > 2006-05-02 > US 60/677213 > <005-05-02 61 <151 <15 0> US 60/790217 < 151> 2006-04-08 < 16 0 > 2 <17 0> Paten11n version 3.3 < 210 > 1

< 211> 153 <212> PRT <213> Homo sapiens < 4 0 0 > 1

Met Gly Lys Ile Ser Ser Leu Pro Thr Gin Leu Phe Lys Cys Cys Phe 1 5 10 15 Cys Asp Phe Leu Lys Vai Lys Met His Thr Met Ser Ser Ser His Leu 20 25 30 Phe Tyr Leu Ala Leu Cys Leu Leu Thr Phe Thr Ser Ser Ala Thr Ala 35 40 45 Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Vai Asp Ala Leu Gin Phe 50 55 60 Vai Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly 65 70 75 80 Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gin Thr Gly Ile Vai Asp Glu Cys Cys 85 90 95 Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys Ala Pro Leu 100 105 110 Lys Pro Ala Lys Ser Ala Arg Ser Vai Arg Ala Gin Arg His Thr Asp 115 120 125 Met Pro Lys Thr Gin Lys Glu Vai His Leu Lys Asn Ala Ser Arg Gly 130 135 140 Ser Ala Gly Asn Lys Asn Tyr Arg Met 62 < 210 > 2

<211> 195 <212> PRT <213> Homo sapiens

Met Gly Lys Ile Ser Ser Leu Pro Thr Gin Leu Phe Lys Cys Cys Phe 1 5 10 15 Cys Asp Phe Leu Lys Vai Lys Met His Thr Met Ser Ser Ser His Leu 20 25 30 Phe Tyr Leu Ala Leu Cys Leu Leu Thr Phe Thr Ser Ser Ala Thr Ala 35 40 45 Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Vai Asp Ala Leu Gin Phe 50 55 60 Vai Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly 65 70 75 80 Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gin Thr Gly Ile Vai Asp Glu Cys Cys 85 90 95 Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys Ala Pro Leu 100 105 110 Lys Pro Ala Lys Ser Ala Arg Ser Vai Arg Ala Gin Arg His Thr Asp 115 120 125 Met Pro Lys Thr Gin Lys Tyr Gin Pro Pro Ser Thr Asn Lys Asn Thr 130 135 140 Lys Ser Gin Arg Arg Lys Gly Trp Pro Lys Thr His Pro Gly Gly Glu 145 150 155 160 63

Gin Lys Glu Gly Thr Glu Ala Ser Leu Gin Ile Arg Gly Lys Lys Lys 165 170 175

Glu Gin Arg Arg Glu Ile Gly Ser Arg Asn Ala Glu Cys Arg Gly Lys 180 185 190

Lys Gly Lys 195

Lisboa, 4 de Dezembro de 2012 64

Claims (2)

1. Vector virai neurotrópico recc vnbinante c o mp r e e n d e n d o um transgene terapêutico, para util .ização no t r a t a m e n t o d e um distúrbio de neurónio motor num indivíduo , compreendendo r·'. vV tratamento a administração 0 0 referido vector virai na região motora cio córtex do cérebro ou a, peio menos, uma região da região do núcleo cerebelar profundo do cérebro, em. que o produto do transgene é distribuído numa quantidade terapeuticamente eficaz a, pelo menos, uma subdivisão da medula espinal e/ou a, pelo menos, uma divisão do tronco encefálico e, em que o referido vector virai neurotrópico recombinante é um vector virai adeno-associado (vector AAV) . neurotrópico recombinante de acordo com a Re iv i ndic a çá o 1, para util ização distúrbio de neu rónio r notor num i reivindicação 1, em que o re seleccionado do grupo consi stindo AAV 4, AAV5, AAV6, 7\ 7\ T 7 'V Ah V i Θ AAV 8 . io tratamento de um AAV vector Vector virai neurotrópico recombinante de acordo com a reivindicação 1, para utilização no tratamento de um distúrbio de neurónio motor num indivíduo de acordo com a reivindicação 1, em que a referida região da região do núcleo cerebelar profundo do cérebro é seleccionado do grupo consistindo na região média, a região interposta e a região lateral. 1 Vector virai neurotrópico recombinante de acordo corri a reivindicação 1, para utilização no tratamento de um distúrbio de neurónio motor num indivíduo de acordo com a reivindicação 1, em que a referida distribuição é b r 1 a t e r a 1 * vector vir; neurotrópicc orno ií rpnnmn de >rdo ;om a Reivindicação 1, para utilização no tratamento de um distúrbid cie neurónio motor num indivíduo de acordo com a reivindicação 1, em que a referida subdivisão da medula espinal é seleccionada do grupo consistindo na subdivisão cervical, subdivisão torácica, a subdivisão lombar e a subdivisão sacral.
2. 6, Vector virai neurotrópico recombinante de acordo com a Reivindicação 1, para utilização no tratamento de um distúrbio de neurónio motor num indivíduo de acordo com a reivindicação 1, em que o referido transgene é distribuído em todas as subdivisões da medula espinal. 7 /ector vira. n e u r o t r óp1c o r e c omb i n; Re i v i ndi c a ç ão distúrbio de reivindicação , para euromo , era que do gr p o c o n s i s t i n d o e ra utilização no tratamento de um motor num indivíduo de acordo com o referido transgene é seleccionado factor de crescimento 1 de insulina (IGF-1), EPO (eritropoietina), calbindina D28, CBP (proteína de ligação à proteína de ligação ao elemento de resposta a AMPc [CREB]), parvalbumina, HIFl-alfa, SIRT-2, VEGF, SMN-1, SMN-2 e CNTF (factor neurotrófico ciliar). 2 Vector virai neurotrópico recombinante de acordo corri a Reivindicação 1, para utilização no tratamento de um distúrbio de neurónio motor num indivíduo de acordo com a reivindicação 1, em que o referido distúrbio de neurónio motor é seleccionado do grupo consistindo em esclerose 1ater a1 amiotróf i c a (ALS), e s c1e r o s e 1a t e r a1 pr imár i a (PLS), atrofia muscular bulbar espinal, ataxia cerebral espinal, atrofia cerebral espinal e lesão traumática da medula espinal. V e c t o r v i r a 1 n e u r o t r ó p i c o recombinante de a cor do com a Reivindicação 1, para uti 1i z a çá ο ηo trat ame nt o de um distúrbio de neurónio motor num indivíduo de acordo com a r e i v i n d i c a ç ã o 1, em que o referido indivíduo é um doente humano, Lisboa, 4 de Dezembro de 2012 3