ES2562490T3 - Terapia génica para trastornos neurometabólicos - Google Patents

Abstract

Una composición que comprende un vector de AAV que comprende un transgén que codifica una hidrolasa lisosomal, para uso en el tratamiento de una enfermedad por depósito lisosomal en un mamífero, en donde la composición se ha de administrar a un primer sitio en el SNC del mamífero y la concentración del vector en la composición es al menos 5 x 1012 gp/ml, de modo que la hidrolasa lisosomal es expresada en una cantidad terapéuticamente eficaz en un segundo sitio en el SNC que contiene neuronas que se proyectan al primer sitio y que está distal a y al menos a 2 mm de dicho primer sitio.

Description

DESCRIPCION

Terapia genica para trastornos neurometabolicos

Esta solicitud reivindica prioridad de la solicitud de patente de EE.UU. N° 60/467.195, presentada el 1 mayo de 2003, y de la solicitud de patente de EE.UU. N° 60/475.726, presentada el 4 de junio de 2003.

5 Campo de la invencion

La presente descripcion se refiere a composiciones y a metodos para tratar trastornos que afectan al sistema nervioso central (SNC). La presente descripcion se refiere, ademas, a composiciones que comprenden vectores virales tales como vectores de virus adeno-asociados (AAV) y a metodos de administracion de los mismos.

Antecedentes de la invencion

10 Un grupo de trastornos metabolicos conocidos como enfermedades por deposito lisosomal (LSD) incluye mas de cuarenta trastornos geneticos, muchos de los cuales implican defectos geneticos en diversas hidrolasas lisosomales. Enfermedades de deposito lisosomal representativas y las enzimas defectuosas asociadas estan listadas en la Tabla 1.

Tabla 1

Enfermedad por deposito lisosomal

Enzima defectuosa

Aspartilglucosaminuria

Aspartilglucosaminidasa

Fabry

a-galactosidasa A

Enfermedad Infantil de Batten * (CNL1)

Palmitoil Protema Tioesterasa

Enfermedad Infantil de Batten Tardfa Clasica* (CNL2)

Tripeptidil Peptidasa

Enfermedad Juvenil de Batten* (CNL3)

Protema Lisosomal de la Transmembrana

Batten, otras formas* (CNL4-CNL8)

Productos genicos multiples

Cistinosis

Transportador de cistema

Farber

Ceramidasa acida

Fucosidosis

a-L-fucosidasa acida

Galactosidosialidosis

Protema protectora/catepsina A

Gaucher tipos 1, 2* y 3*

p-glucosidasa acida, o glucocerebrosidasa

Gangliosidosis Gm1*

p-galactosidasa acida

Hunter*

Iduronato-2-sulfatasa

Hurler-Scheie*

a-L-iduronidasa

Krabbe*

Galactocerebrosidasa

a-manosidosis*

a-manosidasa acida

p-manosidosis*

p-manosidasa acida

Maroteaux-Lamy

Arilsulfatasa B

Leucodistrofia metacromatica*

Arilsulfatasa A

Morquio A

N-acetilgalactosamina-6-sulfato sulfatasa

Morquio B

p-galactosidasa acida

Mucolipidosis II/IN*

N-acetilglucosamina-1-fosfotransferasa

Niemann-Pick A*, B

Esfingomielinasa acida

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Enfermedad por deposito lisosomal

Enzima defectuosa

Niemann-Pick C*

NPC-1

Pompe*

a-glucosidasa acida

Sandhoff*

p-hexosaminidasa B

Sanfilippo A*

Heparan N-sulfatasa

Sanfilippo B*

a-N-acetilglucosaminidasa

Sanfilippo C*

Acetil-CoA:a-glucosaminida N-acetiltransferasa

Sanfilippo D*

N-acetilglucosamina-6-sulfato sulfatasa

Enfermedad de Schindler*

a-N-acetilgalactosaminidasa

Schindler-Kanzaki

a-N-acetilgalactosaminidasa

Sialidosis

a-neuramidasa

Sly*

p-glucuronidasa

Tay-Sachs*

p-hexosaminidasa A

Wolman*

Lipasa acida

* Implicacion del SNC

El rasgo distintivo de LSD es la acumulacion anormal de metabolitos en los lisosomas que conduce a la formacion de grandes numeros de lisosomas distendidos en el pericarion. Un reto importante para el tratamiento de LSD (en comparacion con el tratamiento de una enzimopatfa espedfica del hugado) es la necesidad de invertir la patolog^a por deposito lisosomal en multiples tejidos separados. Algunas LSDs pueden ser tratadas eficazmente mediante infusion intravenosa de la enzima que falta, conocida como terapia de reemplazo de enzimas (ERT). Por ejemplo, pacientes de Gaucher tipo 1 solo tienen una enfermedad visceral y responden favorablemente a la eRt con glucocerebrosidasa recombinante (Cerezyme®, Genzyme Corp.). Sin embargo, los pacientes con enfermedad metabolica que afecta al SNC (p. ej., enfermedad de Gaucher tipo 2 o 3) no responden a la ERT intravenosa, debido a que se evita que la enzima de reemplazo penetre en el cerebro por la barrera hematoencefalica (BBB). Ademas, intentos de introducir un enzima de reemplazo en el cerebro mediante inyeccion directa no han tenido exito, en parte debido a la citotoxicidad de la enzima a concentraciones locales altas (observaciones no publicadas) y a tasas de difusion parenquimales limitadas en el cerebro (Pardridge, Peptide Drug Delivery to the Brain, Raven Press, 1991).

La terapia genica es una modalidad de tratamiento emergente de trastornos que afectan al SNC, incluyendo LSDs. En este enfoque, la restauracion de la via metabolica normal y la reversion de la patologfa se producen por la transduccion de las celulas afectadas con un vector que porta una version sana del gen. La terapia genica del SNC se ha visto facilitada por el desarrollo de vectores virales capaces de infectar eficazmente neuronas post-mitoticas. Para una revision de vectores virales para la administracion de genes al SNC, vease Davidson et al. (2003) Nature Rev., 4:353-364. Vectores de virus adeno-asociados (AAV) se consideran optimos para la terapia genica del SNC, dado que son sustancialmente no toxicos, no inmunogenicos, neurotropicos y pueden mantener la expresion a largo plazo en el SNC (Kaplitt et al. (1994) Nat. Genet., 8:148-154; Bartlett et al. (1998) Hum. Gene Ther., 9:1181-1186; y Passini et al. (2002) J. Neurosci., 22:6437-6446).

Un producto de transgen terapeutico, p. ej., una enzima, puede ser secretado por las celulas transducidas y subsiguientemente puede ser recogido por otras celulas, en las que luego alivia la patologfa. Este proceso se conoce como correccion cruzada (Neufeld et al. (1970) Science, 169:141-146). Sin embargo, la correccion de la patologfa, tal como la patologfa de deposito en el contexto de LSD, esta tipicamente confinada a la vecindad inmediata del sitio de inyeccion debido a la difusion parenquimal limitada del vector inyectado y el producto transgenico secretado (Taylor et al. (1997) Nat. Med., 3:771-774; Skorupa et al. (1999) Exp. Neurol., 160:17-27). Por lo tanto, la neuropatologfa que afecta a multiples regiones del cerebro requiere un suministro generalizado del vector, utilizando multiples inyecciones distribuidas en el espacio, especialmente en un cerebro grande tal como el del ser humano. Esto aumenta significativamente el riesgo de lesion del cerebro. Ademas, a algunas regiones del cerebro puede ser diffcil acceder quirurgicamente. Por lo tanto, senan beneficiosos otros modos de transporte del vector dentro del SNC, ademas de la difusion.

Cuando se administra en las terminaciones axonales, algunos virus se internalizan y transportan de forma retrogada a lo largo del axon hacia el nucleo. Las neuronas en una region del cerebro estan interconectadas mediante axones

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a las regiones distales del cerebro, proporcionando con ello un sistema de transporte para el suministro de vectores. Estudios con adenovirus, HSV y el virus de la pseudo-rabia han utilizado propiedades de trafico de estos virus para suministrar genes a las estructuras distales dentro del cerebro (Soudas et al. (2001) FASEB J., 15:2283-2285; Breakefield et al. (1991) New Biol., 3:203-218; y deFalco et al. (2001) Science, 291:2608-2613). Sin embargo, inconvenientes asociados con estos vectores virales, p. ej., la inmunogenicidad y/o toxicidad celular, limitan su utilidad.

Varios grupos han informado que la transduccion del cerebro por el AAV serotipo 2 (AAV2) esta limitada al sitio de inyeccion intracardiacal (Kaplitt et al., (1994) Nat. Genet., 8:148-154; Passini et al. (2002) J. Neurosci., 22:64376446; y Chamberlin et al. (1998) Brain Res., 793:169-175). Un informe reciente sugiere que el transporte axonal retrogrado de AAV2 tambien puede producirse en circuitos seleccionados del cerebro de rata normal (Kaspar et al. (2002) Mol. Ther., 5:50-56). Sin embargo, no se sabe que parametros espedficos fueron los responsables del transporte axonal observado, y si el transporte axonal suficiente y eficaz ocurrina en una neurona enferma que esta en un estado de disfuncion celular. De hecho, se ha informado de lesiones observadas en las neuronas de LSD para interferir con o incluso bloquear el transporte axonal (revisado en Walkley (1998) Brain Pathol., 8:175-193)), sugiriendo que las neuronas comprometidas con la enfermedad no apoyan el trafico de AAV a lo largo de sus axones.

Por lo tanto, existe una necesidad en la tecnica de desarrollar nuevos metodos terapeuticos para el tratamiento de trastornos metabolicos que afectan al SNC.

SUMARIO DE LA INVENCION

La presente descripcion proporciona metodos y composiciones para el tratamiento o la prevencion de trastornos metabolicos tales como enfermedades por deposito lisosomal (LSD), que se caracterizan por o estan asociados con un riesgo de disminucion de la funcion del SNC.

La presente descripcion proporciona, ademas, metodos para el suministro mmimamente invasivo selectivo de un transgen a regiones seleccionadas en el cerebro de un sujeto afectado.

Ventajas adicionales de la presente descripcion, incluidas ventajas de la presente invencion, se expondran en parte en la siguiente descripcion, y en parte se desprenderan de la descripcion, o pueden aprenderse por la puesta en practica de la presente descripcion, incluida la presente invencion.

En los experimentos que conducen a la presente descripcion, incluida la presente invencion, a ratones inactivados por esfingomielinasa acida (ASM), un modelo de la enfermedad de Niemann-Pick tipo A, se les administro un vector de AAV2 que porta el gen ASM humano (AAV-ASM) mediante una sola inyeccion intracraneal en un hemisferio del cerebro. La presente descripcion, incluida la presente invencion, se basa, en parte, en el descubrimiento y la demostracion de que la inyeccion de AAV-ASM de alto tttulo en el cerebro enfermo resulta en la expresion de AAV- ASM dentro de multiples sitios distales en un patron consistente con la organizacion topografica de las neuronas de proyeccion que inervan el sitio de inyeccion. La presente descripcion, incluida la presente invencion, se basa ademas, en parte, en el descubrimiento y la demostracion de una extensa correccion de la patologfa por deposito lisosomal en el sitio de inyeccion y en todos los sitios distales a los que AAV-ASM fue transportado y en donde ASM fue expresado.

Por consiguiente, en un aspecto, la presente descripcion proporciona metodos para tratar trastornos neurometabolicos en mairnferos. Las poblaciones tratadas por los metodos de la presente descripcion incluyen, pero no se limitan a los pacientes que tienen o estan en riesgo de desarrollar una LSD tales como los trastornos listados en la Tabla 1, en particular, si dicha enfermedad afecta al SNC. En un caso ilustrativo, la enfermedad es la enfermedad de Niemann-Pick A.

En un aspecto, los metodos descritos incluyen administrar al SNC de un sujeto afectado un vector viral de AAV que porta un transgen que codifica un producto terapeutico y permitir que el transgen sea expresado dentro del SNC distalmente del sitio de administracion en un nivel terapeutico. En un caso ilustrativo, la administracion se logra mediante inyeccion intraparenquimal directa de una disolucion de vector de AAV de tftulo elevado en el cerebro enfermo. Despues de ello, el transgen se expresa distalmente, contralateralmente o ipsilateralmente al sitio de administracion en un nivel terapeutico de al menos 2, 3, 5, 8, 10,15, 20, 25, 30, 35, 40,45 o 50 mm del sitio de administracion.

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En otro aspecto, la presente descripcion tambien proporciona un metodo para suministrar un genoma de AAV recombinante al nucleo de una neurona en peligro de enfermedad in vivo. En algunos casos, la patologfa celular exhibida por la neurona es la de una enfermedad por deposito lisosomal tales como los trastornos listados en la Tabla 1. En un caso ilustrativo, la enfermedad es una enfermedad de Niemann-Pick A. El metodo de suministrar un genoma de AAV recombinante al nucleo de una neurona en peligro de enfermedad comprende poner en contacto una terminacion axonal de la neurona en peligro de enfermedad con una composicion que comprende una partfcula viral de AAV que comprende el genoma de AAV recombinante y permitir que la partfcula viral sea endocitosada y transportada de forma retrogada intracelularmente a lo largo del axon hacia el nucleo de la neurona. La concentracion del vector en la composicion es al menos: (a) 5, 6, 7, 8, 8,4, 9, 9,3, 10, 15, 20, 25 o 50 (x1012 gp/ml); (b) 5, 6, 7, 8, 8,4, 9, 9,3, 10, 15, 20, 25 o 50 (x109 ut/ml); o (c) 5, 6, 7, 8; 8,4, 9, 9,3, 10,15, 20, 25 o 50 (x1010 ui/ml). En determinados casos, la neurona es una neurona de proyeccion y/o la distancia de la terminacion axonal al nucleo de la neurona es al menos 2, 3, 5, 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 mm.

En otro aspecto, la presente descripcion proporciona un metodo para suministrar un producto de transgen terapeutico a una celula diana del SNC, que es una neurona o una celula glial, a un mairnfero afectado con un trastorno neurometabolico, p. ej., una LSD que afecta al SNC. El metodo incluye poner en contacto una terminacion axonal de una neurona con una composicion que contiene un vector de AAV que porta al menos una parte de un gen que codifica un producto de transgen terapeutico, permitiendo que la partfcula viral sea endocitosada y transportada de forma retrograda intracelularmente a lo largo del axon al nucleo de la neurona; permitiendo que el producto transgen terapeutico sea expresado y secretado por la neurona, y permitiendo que la celula diana absorba el producto transgen terapeutico, en el que el producto transgen terapeutico alivia de ese modo la patologfa en la celula diana. En determinados casos, la concentracion del vector en la composicion es al menos: (a) 5, 6, 7, 8, 8,4, 9, 9,3, 10, 15, 20, 25 o 50 (x1012 gp/ml); (b) 5, 6, 7, 8, 8,4, 9, 9,3, 10, 15, 20, 25 o 50 (x109 ut/ml); o (c) 5, 6, 7, 8, 8,4, 9, 9,3, 10, 15, 20, 25 o 50 (x 1010 ui/ml)

En los metodos de la presente descripcion, el transgen terapeutico codifica una molecula biologicamente activa, cuya expresion en el SNC da como resultado al menos una correccion parcial de la neuropatologfa. En algunos casos, el producto transgen terapeutico es una hidrolasa lisosomal. En un caso ilustrativo, la hidrolasa lisosomal es ASM. En otros casos, el transgen terapeutico es una metaloendopeptidasa, p. ej., neprilisina.

Sobre la base de la descripcion que esta contenida en esta memoria, un primer aspecto de la presente invencion proporciona una composicion que comprende un vector de AAV que comprende un transgen que codifica una hidrolasa lisosomal, para uso en el tratamiento de una enfermedad por deposito lisosomal en un mam^era, en donde la composicion se ha de administrar a un primer sitio en el SNC del mamffero y la concentracion del vector en la composicion es al menos 5 x 1012 gp/ml, de modo que la hidrolasa lisosomal es expresada en una cantidad terapeuticamente eficaz en un segundo sitio en el SNC que contiene neuronas que se proyectan al primer sitio y que esta distal a y al menos a 2 mm de dicho primer sitio.

En un aspecto adicional, la invencion proporciona el uso de un vector de AAV que comprende un genoma de AAV recombinante que comprende un transgen que codifica una hidrolasa lisosomal, para la preparacion de una composicion para tratar una enfermedad por deposito lisosomal en un mam^era, en donde la composicion se ha de poner en contacto con una terminacion axonal de una neurona comprometida con la enfermedad, de modo que el vector de AAV es endocitosado y transportado de forma retrogada intracelularmente a lo largo del axon de la neurona al nucleo de la neurona, y en donde la neurona es una neurona de proyeccion, y la distancia de la terminacion axonal al nucleo es de al menos 2 mm.

Aspectos y realizaciones adicionales de la presente invencion se recogen en las reivindicaciones adjuntas.

Ha de entenderse que tanto la descripcion general anterior como la siguiente descripcion detallada son solamente ilustrativas y explicativas y no son restrictivas de la invencion segun se reivindica.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

La Figura 1A muestra una representacion de una seccion transversal del cerebro de raton ASMKO, a las 5 o 15 semanas despues de una inyeccion de 2 pl de alto tttulo (9,3 x 1012 gp/ml) de AAV-ASM en el hipocampo. El sitio de la inyeccion se muestra por una lmea vertical; la expresion de ARNm de ASM, tal como se detecta por hibridacion in situ, se representa por los drculos mas pequenos; y la expresion de la protema ASM, segun se detecta por tincion inmunohistoqmmica, se representa por los drculos sombreados mas grandes. El patron de expresion dio lugar a una extensa area de la inversion de la patologfa (representado por el sombreado claro) en el hipocampo y las regiones corticales en los dos hemisferios del cerebro.

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La Figura 1B representa el transporte axonal de AAV a regiones distales del cerebro de raton despues de una inyeccion de AAV de alto titulo en el hipocampo tal como se describe para la Figura. 1A. La inyeccion en el hipocampo (10) dio como resultado el transporte axonal del vector viral a traves del circuito intrahipocampal al hipocampo contralateral (20) y a traves del circuito entorrinodentado al cortex entorrinal (30). El sitio de la inyeccion se muestra por una lmea vertical.

La Figura 1C es un diagrama esquematico que muestra las conexiones de los circuitos intrahipocampal y entorrinodentado del cerebro de raton. La inyeccion en el hipocampo (10) da lugar a la infeccion y la transduccion de cuerpos de celulas ubicados en la zona del asta de Amon 3 (CA3) y en la capa de celulas granulares dentadas (G). Ademas, un subconjunto del vector de AAV inyectado infecta las terminaciones axonales de las neuronas de proyeccion que inervan el lugar de la inyeccion, se somete a un transporte axonal retrogado y suministra el transgen al campo de CA3 (CA3) e hilio (H) en la parte contralateral del hipocampo (20), e ipsilateralmente y en el cortex entorrinal (30).

La Figura 2A muestra una representacion de una seccion transversal del cerebro de raton ASMKO, a las 5 o 15 semanas despues de una inyeccion intrahipocampal de AAV-ASM de alto titulo tal como se describe en la Figura 1A. La expresion de ARNm de ASM, tal como se detecta por hibridacion in situ, esta representada por los cticulos mas pequenos; y la expresion de protemas ASM, tal como se detecta por tincion inmunohistoqmmica, esta representada por los cticulos sombreados mas grandes. La inyeccion resulto en ARNm de ASM y la protema a detectar en el septum. Este patron de expresion dio lugar a una extensa zona de la inversion de la patologfa (representado por el sombreado claro).

La Figura 2B representa el transporte axonal de AAV a las regiones distales del cerebro de raton, siguiendo un alto titulo de inyeccion en el hipocampo tal como se describe en la Figura 1A. La inyeccion en el hipocampo (10) dio como resultado el transporte axonal del vector viral a traves del circuito septum-hipocampal desde el sitio de inyeccion (representado por una lmea vertical) al septum (40).

La Figura 2C es un diagrama esquematico que muestra las conexiones del circuito septum-hipocampal. La inyeccion en el hipocampo dio lugar a la transduccion de cuerpos celulares situados en el campo CA3 (11). Ademas, un subconjunto del vector de AAV infecta las terminaciones axonales de las neuronas de proyeccion que inervan el sitio de inyeccion, experimenta un transporte axonal retrogrado, y suministra el transgen al septum medial (40).

La Figura 3 representa el transporte axonal de AAV en el circuito nigroestriatal, despues de una inyeccion de alto titulo de AAV en el cuerpo estriado (50) del cerebro del raton. El transporte axonal de AAV se produce desde el sitio de inyeccion (representado por una lmea vertical) a la sustancia negra (60).

La Figura 4 representa el transporte axonal de AAV en el circuito medulo-cerebelar, despues de una inyeccion de alto titulo de aAV-ASM en el cerebelo (70) del cerebro de raton ASMKO. El transporte axonal de AAV2 se produce desde el sitio de inyeccion (representado por una lmea vertical) a la medula oblongada (80).

La Figura 5 representa el transporte axonal de AAV en los circuitos intrahipocampal, nigroestriado y entorrinodentado despues de una inyeccion de alto titulo de AAV7-ASM en el hipocampo ispilateral (10). Se detectaron celulas transducidas, tal como se determina mediante hibridacion in situ, a lo largo de todo el eje rostral- caudal del hipocampo contralateral (90), el septum medial (40) y el cortex entorrinal (100) despues de la inyeccion de AAV7-ASM del hipocampo ipsilateral (representado por una lmea vertical).

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION

Con el fin de que la presente descripcion, que incluye la presente invencion, pueda entenderse mas facilmente, se definen primero determinados terminos y expresiones. Definiciones adicionales se exponen a lo largo de la descripcion detallada.

El termino "transgen” se refiere a un polinucleotido que se introduce en una celula y es capaz de ser expresado en condiciones apropiadas y confiere una propiedad deseada a una celula en la que se introdujo, o que conduce de otro modo a un resultado terapeutico deseado.

La expresion "particulas de genoma (gp)" o "equivalentes de genoma", tal como se utiliza con referencia a un titulo viral, se refiere al numero de viriones que contienen el genoma de ADN de AAV recombinante, independientemente de la infectividad o la funcionalidad. El numero de particulas de genoma de una preparacion de vector particular se

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puede medir por procedimientos tales como los descritos en los Ejemplos en esta memoria o, por ejemplo, en Clark et al. (1999) Hum. Gene Ther., 10:1031-1039; Veldwijk et al. (2002) Mol. Ther., 6:272-278.

Las expresiones "unidad de infeccion (ui)", "partmula infecciosa" o "unidad de replicacion", tal como se utilizan en referencia a un tttulo viral, se refieren al numero de partmulas de vector de AAV recombinante infecciosas y competentes para la replicacion segun se mide por el ensayo de centro infeccioso, tambien conocido como ensayo del centro de replicacion tal como se describe, por ejemplo, en McLaughlin et al. (1988) J. Virol, 62:1963-1973.

La expresion “unidad de transduccion (ut)", tal como se utiliza con referencia a un tttulo viral, se refiere al numero de partmulas de vectores de AAV recombinantes infecciosas que resultan en la produccion de un producto transgenico funcional tal como se mide en ensayos funcionales tales como los descritos en los Ejemplos en esta memoria o, por ejemplo, en Xiao et al. (1997) Exp. Neurobiol, 144:113-124; o en Fisher et al. (1996) J. Virol, 70:520-532 (ensayo LFU).

El termino "terapeutico", la expresion “cantidad terapeuticamente eficaz" y sus afines se refieren a la cantidad de un compuesto que resulta en la prevencion o retraso de la aparicion o mejora de smtomas de un trastorno neurometabolico en un sujeto o un logro de un resultado biologico deseado tal como la correccion de una neuropatologfa, p. ej., una patologfa celular asociada con una enfermedad de almacenamiento lisosomal tal como se describe en esta memoria o en Walkley (1998) Brain Pathol., 8:175-193. La expresion "correccion terapeutica" se refiere al grado de correccion que se traduce en la prevencion o el retraso de la aparicion o la mejora de smtomas de trastorno metabolico en un sujeto. La cantidad eficaz se puede determinar por metodos bien conocidos en la tecnica y tal como se describe en las secciones siguientes.

Metodos y composiciones

En los experimentos que conducen a la presente descripcion, que incluye la presenta invencion, se utilizaron ratones (ASMKO) inactivados con esfingomielinasa acida (ASM). Los ratones ASMKO se han descrito previamente y son un modelo aceptado de la enfermedad de Niemann-Pick de los tipos A y B (Horinouchi et al. (1995) Nat. Genetics, 10:288-293; Jin et al. (2002) J. Clin. Invest., 109: 1183-1191; y Otterbach (1995) Cell, 81:1053-1061). La enfermedad de Niemann-Pick (NPD) se clasifica como una enfermedad por deposito lisosomal y es un trastorno neurometabolico heredado, caracterizado por una deficiencia genetica en esfingomielinasa acida (ASM; esfingomielina colinefosfohidrolasa, EC 3.1.3.12). La falta de protema ASM funcional resulta en la acumulacion de sustrato de esfingomielina dentro de los lisosomas de las neuronas y la glfa a lo largo del cerebro. Esto conduce a la formacion de grandes numeros de lisosomas distendidos en el pericarion, que es un rasgo distintivo y el fenotipo celular primario de tipo A NPD. La presencia de lisosomas distendidos se correlaciona con la perdida de la funcion celular normal y un curso neurodegenerativo progresivo que conduce a la muerte del individuo afectado en la infancia temprana (The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Diseases, comps. Scriver et al., McGraw-Hill, Nueva York, 2001, pags. 3589-3610). Fenotipos celulares secundarios (p. ej., alteraciones metabolicas adicionales) estan tambien asociados con esta enfermedad, de manera notable la acumulacion de alto nivel de colesterol en el compartimiento lisosomal. La esfingomielina tiene una fuerte afinidad por el colesterol, lo que resulta en el secuestro de grandes cantidades de colesterol en los lisosomas de ratones ASMKO y pacientes humanos (Leventhal et al. (2001) J. Biol. Chem., 276:44976-44983; Slotte (1997) Subcell. Biochem., 28:277-293; y Viana et al. (1990) J. Med. Genet., 27:499-504).

La presente descripcion, incluida la presente invencion, se basa, en parte, en el descubrimiento y la demostracion de que una inyeccion intrahipocampal de AAV-ASM de alto tttulo en los cerebros enfermos de ratones ASMKO resulta en la expresion de ARNm de aSm y de la protema distalmente desde el sitio de inyeccion en un patron consistente con la organizacion topografica de las neuronas de proyeccion que inervan el sitio de inyeccion. Ademas de la expresion robusta en el sitio de inyeccion, ARNm de aSm y protema tambien se detectan en varias regiones distales por fuera del hipocampo ipsilateral (inyectado), espedficamente en el giro dentado del hipocampo contralateral y CA3, y el septum medial y el cortex entorrinal. La presente descripcion, incluida la presente invencion, se basa, en parte, en el descubrimiento y la demostracion de la extensa correccion de la patologfa por deposito lisosomal en los sitios distales, permitiendo asf un mayor volumen de correccion a traves de un menor numero de sitios de inyeccion.

Por consiguiente, en un aspecto, la presente descripcion proporciona metodos para el tratamiento de trastornos neurometabolicos en marnfferos. Las poblaciones tratadas por los metodos de la presente descripcion incluyen, pero no se limitan a pacientes que tienen o estan en riesgo de desarrollar un trastorno neurometabolico, p. ej., una LSD, tales como las enfermedades listadas en la Tabla 1, particularmente si una enfermedad de este tipo afecta al SNC. En un caso ilustrativo, la enfermedad es una enfermedad de Niemann-Pick de tipo A. En determinados casos, los trastornos neurometabolicos pueden excluir las enfermedades Alzheimer, Parkinson, Huntington, de Tay Sachs, de

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Lesch-Nyan y de Creutzfeldt-Jakob. Sin embargo, los metodos de la presente descripcion que utilizan una metaloendopeptidasa como un transgen terapeutico estan dirigidos espedficamente al tratamiento de la enfermedad de Alzheimer y trastornos relacionados con el amiloide.

En algunos casos, el metodo de tratar un trastorno neurometabolico comprende la administracion de un vector de AAV alto titulo que porta un transgen terapeutico, de modo que el producto de transgen es expresado a un nivel terapeutico en un segundo sitio dentro del SNC, distal al primer sitio. En algunos casos, el titulo viral de la composicion es de al menos: (a) 5, 6, 7, 8, 8,4, 9, 9,3, 10, 15, 20, 25 o 50 (x1012 gp/ml); (b) 5, 6, 7, 8, 8,4, 9 ,9,3,10, 15, 20, 25 o 50 (x 109 ut/ml); o (c) 5, 6, 7, 8, 8,4, 9, 9,3, 10, 15, 20, 25 o 50 (x1010 ui/ml). En casos adicionales, la administracion se lleva a cabo mediante inyeccion parenquimal directa de una disolucion del vector de AAV de alto titulo en el cerebro enfermo, despues de ello el transgen es expresado en distal, contralateral o ipsilateralmente al sitio de administracion a un nivel terapeutico de al menos 2, 3, 5, 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 mm del sitio de administracion.

La distancia entre el primer y el segundo sitio se define como la region de minima distancia entre el sitio de administracion (primer sitio) y el lfmite de la transduccion detectable del sitio distal (segundo sitio), tal como se mide utilizando procedimientos conocidos en la tecnica o tal como se describe en los Ejemplos, p. ej., hibridacion in situ. Algunas neuronas en el SNC de mairnferos superiores pueden abarcar grandes distancias en virtud de sus proyecciones axonales. Por ejemplo, en los seres humanos, algunos axones pueden abarcar una distancia de 1000 mm o mayor. Por lo tanto, en diversos metodos de la presente descripcion, el AAV puede ser transportado axonalmente a lo largo de toda la longitud del axon a una distancia tal que alcance y transduzca al cuerpo de la celula madre.

Un sitio de la administracion del vector dentro del SNC se elige en base a la region diana deseada de neuropatologfa y la topologfa de los circuitos del cerebro implicados, en la medida en que el sitio de administracion y la region diana tengan conexiones axonales. La region diana se puede definir, por ejemplo, utilizando coordenadas estereotaxicas 3-D. En algunos casos de la presente descripcion, p. ej., en algunas realizaciones de la presente invencion, el sitio de administracion se elige de modo que al menos 0,1, 0,5, 1,5 o 10% de la cantidad total de vector inyectada sea suministrada distalmente a la region diana de al menos 1, 200, 500 o 1000 mm3. Un sitio de administracion puede estar localizado en una region inervada por neuronas de proyeccion que conectan regiones distales del cerebro. Por ejemplo, la sustancia negra y el area tegmental ventral envfan proyecciones densas al caudado y putamen (colectivamente conocido como el cuerpo estriado). Las neuronas dentro de la sustancia negra y el tegmento ventral pueden ser fijadas como objetivo para la transduccion mediante el transporte retrogrado de AAV despues de la inyeccion en el cuerpo estriado. Como otro ejemplo, el hipocampo recibe proyecciones axonales predecibles, bien definidas, de otras regiones del cerebro. Otros sitios de administracion pueden estar situados, por ejemplo, en la medula espinal, bulbo raqrndeo (medula y puente de Varolio), mesencefalo, cerebelo, diencefalo (talamo, hipotalamo), telencefalo (cuerpo estriado, corteza cerebral o dentro del cortex, los lobulos occipital, temporal, parietal o frontal), o combinaciones de los mismos.

Para la identificacion de estructuras en el cerebro humano, vease, p. ej., The Human Brain: Surface, ThreeDimensional Sectional Anatomy With MRI, and Blood Supply; 2a ed., comps. Deuteron et al, Springer Vela, 1999; Atlas Atlas of the Human Brain, comps. Mai et al., Academic Press; 1997; y Co-Planar Sterotaxic Atlas of the Human Brain: 3-Dimensional Proportional System: An Approach to Cerebral Imaging, comps. Tamarack et al., Thyme Medical Pub., 1988. Para la identificacion de estructuras en el cerebro de raton, vease, p. ej., The Mouse Brain in Sterotaxic Coordinates, 2a ed., Academic Press, 2000. Si se desea, la estructura del cerebro humano se puede correlacionar con estructuras similares en el cerebro de otro mamffero. Por ejemplo, la mayona de los mamfferos, incluyendo seres humanos y roedores, muestran una organizacion topografica similar a las proyecciones del hipocampo entorrinales, con neuronas en la parte lateral de la corteza entorrinal tanto lateral como media que se proyecta a la parte dorsal o el polo septal del hipocampo, mientras que la proyeccion al hipocampo ventral se origina principalmente de neuronas en partes medias de la corteza entorrinal (Principles of Neural Science, 4a ed., comps. Kandel et al., McGraw-Hill, 1991; The Rat Nervous System, 2a ed., ed. Paxinos, Academic Press, 1995). Ademas, las celulas de la capa ll de la corteza entorrinal se proyectan hacia el giro dentado y terminan en los dos tercios exteriores de la capa molecular del giro dentado. Los axones de las celulas de la capa Ill se proyectan bilateralmente a las zonas del cuerno de Amon CA1 y CA3 del hipocampo, terminando en la capa molecular del estrato lagunoso.

El segundo sitio (diana) puede estar situado en cualquier region del SNC, incluyendo el cerebro y la medula espinal, que contiene a las neuronas que se proyectan hacia el primer sitio (de administracion). En algunos casos de la presente descripcion, p. ej. en algunas realizaciones de la presente invencion, el segundo sitio esta en una region del SNC elegido de la sustancia negra, la medula oblonga o la medula espinal.

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Para suministrar el vector espedficamente a una region particular del sistema nervioso central, especialmente a una region particular del cerebro, puede ser administrado mediante microinyeccion estereotaxica. Por ejemplo, en el dfa de la cirugfa, los pacientes tendran la base del marco estereotaxico fijada en su lugar (atornillada en el craneo). El cerebro con la base del marco estereotaxico (compatible con MRI con las marcas fiduciarias) sera representado en imagenes utilizando MRI de alta resolucion. Las imagenes de MRI seran entonces transferidas a un ordenador que ejecuta el software estereotaxico. Se utilizara una serie de imagenes coronales, sagitales y axiales para determinar el sitio diana de la inyeccion del vector, y la trayectoria. El software traduce directamente la trayectoria en coordenadas tridimensionales apropiadas para el marco estereotaxico. Se practican orificios de trepanacion por encima del sitio de entrada y el aparato estereotaxico localizado con la aguja implantada a la profundidad determinada. Despues se inyectara el vector en un soporte farmaceuticamente aceptable. El vector de AAV es entonces administrado mediante inyeccion directa al sitio diana principal y es transportado de forma retrograda a los sitios diana distales a traves de los axones. Se pueden utilizar vfas de administracion adicionales, p. ej., la aplicacion cortical superficial bajo visualizacion directa, u otra aplicacion no estereotaxica.

El volumen total de material a administrar y el numero total de partfculas de vector a ser administradas seran determinados por los expertos en la tecnica en base a aspectos conocidos de la terapia genica. La eficacia y seguridad terapeutica pueden ser sometidas a ensayo en un modelo animal apropiado. Por ejemplo, existe una diversidad de modelos animales bien caracterizados para las LSDs, p. ej., tal como se describe en esta memoria o en Watson et al. (2001) Methods Mol. Med., 76:383-403; o Jeyakumar et al. (2002) Neuropath. Appl. Neurobiol., 28:343-357.

En ratones experimentales, el volumen total de disolucion de AAV inyectado oscila, por ejemplo, entre 1 y 5 pl. Para otros mairnferos, incluyendo el cerebro humano, los volumenes y las tasas de suministro se incrementan apropiadamente. Por ejemplo, se ha demostrado que volumenes de 150 pl se pueden inyectar de forma segura en el cerebro de primates (Janson et al. (2002) Hum. Gene Ther, 13:1391-1412). El tratamiento puede consistir en una sola inyeccion por sitio diana, o se puede repetir a lo largo del tracto de inyeccion, si es necesario. Se pueden utilizar multiples puntos de inyeccion. Por ejemplo, en algunas realizaciones de la presente descripcion, ademas del primer sitio de administracion, una composicion que comprende AAV que porta un transgen se administra a otro sitio que puede ser contralateral o ipsilateral al primer sitio de administracion.

En otro aspecto, la presente descripcion proporciona un metodo de suministrar un genoma de AAV recombinante mediante el transporte axonal retrogrado al nucleo de una neurona comprometida con la enfermedad in vivo. En algunos casos, la patologfa celular exhibida por una neurona es la de una LSD tal como se lista en la Tabla 1 (vease, p. ej., Walleley (1998) Brain Pathol., 8:175-193). En un caso ilustrativo; la enfermedad es la enfermedad de Niemann-Pick A. El metodo de suministrar un genoma de AAV recombinante al nucleo de una neurona comprometida con la enfermedad comprende poner en contacto una terminacion axonal de una neurona comprometida con la enfermedad con una composicion que comprende una partfcula viral AAV que comprende el genoma de AAV recombinante y permitir que la partfcula viral sea endocitosada y transportada intracelularmente de forma retrograda a lo largo del axon hacia el nucleo de la neurona, en donde la concentracion de genomas de AAV en la composicion es al menos: (a) 5, 6, 7, 8, 8,4, 9, 9,3, 10, 15, 20, 25 o 50 (x1012 ap/ml); (b) 5, 6, 7, 8, 8,4, 9, 9,3, 10, 15, 20, 25 o 50 (x109 ut/ml); o (c) 5, 6, 7, 8, 8,4, 9, 9,3, 10, 15, 20, 25 o 50 (x101<rui/ml). En determinados casos, la neurona es una neurona de proyeccion y/o la distancia desde la terminacion axonal hasta el nucleo de la neurona es al menos 2, 3, 5, 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 mm. En diversos casos, el genoma de AAV es transportado a lo largo de toda la longitud del axon, a distancias que vanan dependiendo de la longitud del axon. En seres humanos, estas distancias pueden ser tanto como 1000 mm o mayores.

En otro aspecto, la presente descripcion proporciona un metodo de suministrar un producto de transgen a una celula diana del SNC, que es una neurona o una celula glial, en un mamffero afectado por un trastorno neurometabolico, p. ej., una LSD tal como esta listada en la Tabla 1. El metodo comprende poner en contacto una terminacion axonal de una neurona con una composicion que comprende un vector de AAV que porta al menos una parte de un gen que codifica un producto de transgen terapeutico; permitir que las partfculas virales sean endocitosadas y transportadas intracelularmente de forma retrograda a lo largo del axon al nucleo de la neurona; permitir que el producto de transgen sea expresado y secretado por la neurona; y permitir que una segunda celula recoja el producto transgenico, en donde el producto transgenico alivia de ese modo la patologfa en la segunda celula. En algunos casos, la concentracion del vector de AAV en la composicion es al menos: (a) 5, 6, 7, 8, 8,4, 9, 9,3, 10, 15, 20, 25 o 50 (x1012 gp/ml); (b) 5, 6, 7, 8, 8,4, 9, 9,3, 10, 15, 20, 25 o 50 (x109 ut/ml); o (c) 5, 6, 7, 8, 8,4, 9, 9,3, 10, 15, 20, 25 o 50 (x1010 ui/ml). Por ejemplo, hidrolasas lisosoma!es pueden ser secretadas por las celulas transducidas y recogidas subsiguientemente por otra celula a traves de endocitosis mediada por el receptor de manosa-6-fosfato, siendo transducida o no transducida la segunda celula (Sando et al. (1977) Cell, 12:619-627; Taylor et al. (1997) Nat. Med., 3:771-774; Miranda et al. (2000) Gene Ther., 7:1768-1776; y Jin et al. (2002) J. Clin. Invest, 109:1183-1191).

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En los metodos de la presente descripcion, se puede utilizar el AAV de cualquier serotipo siempre y cuando el vector sea capaz de experimentar un transporte axonal retrogrado en un cerebro comprometido con la enfermedad. El serotipo del vector viral utilizado en determinadas realizaciones de la invencion se selecciona del grupo que consiste en AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7 y AAV8 (vease, p. ej., Gao et al. (2002) PNAS, 99:11854-11859; y Viral Vectors for Gene Therapy: Methods and Protocols, comp. Machida, Humana Press, 2003). Se pueden utilizar otros serotipos ademas de los mencionados en esta memoria. Sin embargo, AAV5 puede ser excluido espedficamente de los metodos de la presente descripcion utilizando una metaloendopeptidasa, p. ej., nerilisina, como un transgen terapeutico.

Vectores de AAV se derivan de parvovirus de ADN de cadena sencilla (ss) que son no patogenos para los mairnferos (revisado en Muzyscka (1992) Curr. Top. Microb. Immunol, 158:97-129). En smtesis, vectores basados en AAV tienen los genes virales rep y cap que representan el 96% del genoma viral separado, dejando a las dos repeticiones terminales invertidas (ITRs) flanqueantes de 145 pares de bases (pb), que se utilizan para iniciar la replicacion del ADN viral, el empaquetamiento y la integracion. En ausencia de virus helper, el AAV de tipo salvaje se integra en el genoma de la celula huesped humana con preferencial especificidad para el sitio en el cromosoma 19q 13.3, o puede permanecer expresado de forma episomal. Una sola partfcula de aAv puede alojar hasta 5 kb de ADNss, por lo tanto dejando aproximadamente 4,5 kp para un transgen y elementos reguladores, lo cual es tfpicamente suficiente. Sin embargo, los sistemas de trans-corte y empalme tal como se describe, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos N° 6.544.785, puede casi duplicar este lfmite.

En un caso ilustrativo de la presente descripcion, p. ej., en una realizacion ilustrativa de la presente invencion, AAV es AAV2. Virus adeno-asociados de muchos serotipos, especialmente AAV2, han sido ampliamente estudiados y caracterizados como vectores de terapia genica. Los expertos en la tecnica estaran familiarizados con la preparacion de vectores de la terapia genica basados en AAV, funcionales. Numerosas referencias a diversos metodos de produccion, purificacion y preparacion de AAV para la administracion a sujetos humanos se pueden encontrar en el extenso cuerpo de la bibliograffa publicada (vease, p. ej., Viral Vectors for Gene Therapy: Methods and Protocols, comp. Machida, Humana Press, 2003). Adicionalmente, la terapia genica basada en AAV dirigida a celulas del SNC se ha descrito en las Patentes de Estados Unidos N°s 6.180.613 y 6.503.888.

En determinados metodos de la presente descripcion, el vector comprende un transgen enlazado operativamente a un promotor. El transgen codifica una molecula biologicamente activa, cuya expresion en el SNC da como resultado al menos una correccion parcial de la neuropatologfa. En algunos casos, el transgen codifica una hidrolasa lisosomal. En un caso ilustrativo, la hidrolasa lisosomal es ASM. Se han publicado las secuencias de ADNc genomicas y funcionales de ASM humana (veanse, p. ej., las Patente de Estados Unidos N°s 5.773.278 y 6.541.218). Otras hidrolasas lisosomales se pueden utilizar para enfermedades apropiadas, por ejemplo, tal como se listan en la Tabla 1.

La presente descripcion proporciona, ademas, metodos de tratar la enfermedad de Alzheimer en mamfferos, incluyendo seres humanos. En metodos de este tipo, el transgen codifica una metaloendopeptidasa.

La metaloendopeptidasa puede ser, por ejemplo, la enzima degradadora del beta-amiloide neprilisina (EC 3.4.24.11; numero de acceso de secuencia, p. ej., P08473 (SWISS-PROT)), la enzima degradadora de insulina insulisina (CE 3.4.24.56; numero de acceso de secuencia, p. ej., P14735 (SWlSS-PROT)), o la timet oligopeptidasa (EC 3.4.24.15; numero de acceso de secuencia, p. ej., P52888 (SWISS-PROT)).

El nivel de expresion de los transgenes en las celulas eucariotas esta determinado en gran medida por el promotor transcripcional dentro de la casete de expresion del transgen. Promotores que muestran actividad a largo plazo y que son espedficos para tejidos e incluso las celulas se utilizan en algunos casos de la presente descripcion, p. ej., en algunas realizaciones de la presente invencion. Ejemplos no limitantes de promotores incluyen, pero no se limitan al promotor de citomegalovirus (CMV) (Kaplitt et al. (1994) Nat. Genet., 8:148-154), el promotor de CMV/p3-globina humana (Mandel et al (1998) J. Neurosci., 18:4271-4284), el promotor de GFAP (Xu et al. (2001) Gene Ther., 8:1323-1332), el promotor de enolasa espedfica para neuronas (NSE) de 1,8 kb (Klein et al. (1998) Exp. Neurol., 150:183-194), el promotor de beta actina de pollo (CBA)(Miyazaki (1989) Gene, 79:269-277) y el promotor de p- glucuronidasa (GUSB) (Shipley et al. (1991) Genetics, 10:1009-1018). Para prolongar la expresion, otros elementos reguladores pueden, adicionalmente, ser enlazados operativamente al transgen tal como, p. ej., el Elemento Post- Regulador del Virus de la Hepatitis de la Marmota (WPRE) (Donello et al. (1998) J. Virol., 72, 5085-5092) o el sitio de poliadenilacion de la hormona de crecimiento bovina (BGH).

Para algunas aplicaciones de terapia genica del SNC, sera necesario controlar la actividad transcripcional. Para este fin, la regulacion farmacologica de la expresion genica con vectores de AAV se puede obtener mediante la inclusion

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de diversos elementos reguladores y promotores de respuesta a los farmacos tal como se describe, por ejemplo, en Haberma et al. (1998) Gene Ther., 5:1604-16011; y Ye et al. (1995) Science, 283: 88-91.

Se pueden producir preparaciones de AAV de alto titulo utilizando tecnicas conocidas en la tecnica, p. ej., tal como se describe en la Patente de Estados Unidos N° 5.658.776 y Viral Vectors for Gene Therapy: Methods and Protocols, comp. Machida, Humana Press, 2003.

Los siguientes ejemplos proporcionan realizaciones ilustrativas de la invencion. Un experto ordinario en la tecnica reconocera que pueden realizarse numerosas modificaciones y variaciones. Los ejemplos no limitan en modo alguno la invencion.

EJEMPLOS

Titulacion de Vectores Recombinantes

Los tttulos de vectores de AAV se midieron de acuerdo con el numero de copias del genoma (partfculas de genoma por mililitro). Las concentraciones de partfculas de genoma se basaron en la PCR Taqman® del ADN del vector tal como se informo previamente (Clark et al. (1999) Hum. Gene Ther., 10:1031-1039; Veldwijk et al. (2002) Mol. Ther., 6:272-278). En smtesis, AAV-ASM purificada se trato con tampon de digestion de la capside (Tris-HCI 50 mM pH 8,0, EDTA 1,0 mM, SDS al 0,5%, 1,0 mg/ml de proteinasa K) a 50°C durante 1 hora para liberar ADN del vector. Las muestras de ADN fueron sometidos a una reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) con cebadores que se reasocian a secuencias espedficas en el ADN del vector, tal como la region del promotor, el transgen o la secuencia poli A. Los resultados de la PCR fueron entonces cuantificados mediante un software en Tiempo-real Taqman® tal como el proporcionado por el Sistema Detector de la Secuencia Prism 7700 de Perkin Elmer-Applied Biosystems (Foster City, CA).

Los vectores que portan un gen marcador ensayable tal como el gen p-galactosidasa o de la protema verde fluorescente gFp) se puede titular utilizando un ensayo de infectividad. Celulas susceptibles (p. ej., celulas HeLa o COS) se transducen con el AAV y se realiza un ensayo para determinar la expresion genica tal como la tincion de celulas transducidas con el vector de p-galactosidasa con X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-p-D-galactopiranosido) o microscopfa de fluorescencia celulas transducidas con GFP. Por ejemplo, el ensayo se realiza de la siguiente manera: 4 x 104 celulas HeLa se siembran en cada uno de los pocillos de una placa de cultivo de 24 pocillos utilizando medio de crecimiento normal. Despues de la union, es decir, aproximadamente 24 horas mas tarde, las celulas son infectadas con Ad tipo 5 a una multiplicidad de infeccion (MOI) de 10 y son transducidas con diluciones en serie del vector empaquetado y son incubadas a 37°C. Uno a tres dfas mas tarde, antes de que se observen extensos efectos citopaticos, se realiza el ensayo apropiado en las celulas (p. ej., tincion con X-gal microscopfa de fluorescencia). Si se utiliza un gen informador tal como p-gatactosidasa, las celulas se fijaron en paraformaldehfdo al 2%, glutaraldehfdo al 0,5% y se tinen para la actividad de p-galactosidasa utilizando X-gal. Se cuentan las diluciones del vector que dan celulas bien separadas. Cada una de las celulas positivas representa 1 unidad de transduccion (ut) del vector.

Correccion de la patologia de LSD en el cerebro de raton

Ratones ASMKO de diez semanas de edad contienen una patologfa NPD significativa en el sistema nervioso central. La identificacion de mutantes homocigotos recesivos se verifico mediante PCR. Dieciseis ratones ASMKO de 10 semanas de edad fueron anestesiados con isoflurano y montados en un marco estereotaxico, se practico una incision para exponer el craneo subyacente, y se realizo un agujero sobre un hemisferio de cada uno de los ratones. Dos microlitros de AAV2-CMV-ASM de alto titulo (9,3 x1012 gp/ml) (Targeted Genetics, Seattle, WA) se inyectaron en el hipocampo a una coordenada estereotaxica final de 2,0 mm rostral del bregma, 1,5 mm derecha de la imea media y 2,0 mm ventral de la superficie pial. Estas coordenadas del hipocampo aseguraron que vector de AAV2 quedara expuesto a las neuronas del giro dentado y de la zona 3 del cuerno de Amon (CA3), asf como a las terminaciones axonales de las neuronas de proyeccion del hipocampo contralateral, septum medial y cortex entorrinal. Las inyecciones se realizaron a una tasa de 0,2 pl/minuto, y se administro un total de 1,86 x1010 partfculas genomicas a cada uno de los cerebros. Los ratones fueron despues sacrificados a las 5 (n = 8) o 15 (n = 8) semanas post- inyeccion (pi). Ocho cerebros (n = 4 cada uno a las 5 y 15 semanas pi) se analizaron en cuanto a ARNm de ASM y la distribucion de protemas, y para la reduccion de los niveles suprafisiologicos de colesterol en los lisosomas. Los restantes 8 cerebros (n = 4 cada uno a las 5 y 15 semanas pi) fueron procesados para la histopatologfa para analizar la correccion de los lisosomas acumulados y distendidos, que es el metodo mas directo y preciso para determinar la patologfa inversa por deposito para las LSDs.

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Se detecto una transduccion robusta en el hipocampo inyectado (ipsilateral) a las 5 y 15 semanas pi. La capa de celulas granulares y el hilio del giro dentado, y las capas de celulas piramidales y oriens de CA3 fueron ampliamente transducidas por el vector de AAV2. Este patron de impresion de la transduccion se extendio a otras regiones del hipocampo ipsilateral tal como el submulo y las zona 1 (CA1) y 2 (CA2) del cuerno de Amon. La inmunofluorescencia con un anticuerpo monoclonal anti-ASM humano confirmo la presencia de protema ASM en muchas celulas. El patron general de protemas era similar al patron de ARNm, con alguna propagacion localizada adicional de protema.

ARNm de ASM humana y protema tambien se detectaron en regiones fuera del hipocampo ipsilateral en ambos instantes. El giro dentado contralateral y CA3, y el septum medial y el cortex entorrinal eran positivos para la hibridacion in situ y la inmunofluorescencia (Figuras 1A y 2A). El patron de la transduccion en estos sitios distales era consistente con la organizacion topografica de las neuronas de proyeccion que inervan el sitio de inyeccion (Figuras 1B y 2B). Esto demostro que AAV2 fue sometido a un transporte axonal retrogrado en los circuitos intrahipocampal, septohipocampal y entorrinodentado de cerebros ASMKO, y que el vector viral fue dirigido al nucleo despues del transporte hasta los axones (Figuras 1C y 2C). El patron de la transduccion no soporta una difusion parenquimal como la razon para el transporte de AAV2 a estos sitios distales. Si se habfa producido una difusion de este tipo, habnan quedado expuestas a virus migratorios estructuras entre los sitios inyectado y distal. Pero estas estructuras intermedias eran negativas para la hibridacion in situ. Por ejemplo, el cuerpo estriado, que posee un fuerte tropismo natural para AAV2; era negativo para la transferencia de genes, a pesar de estar en la trayectoria directa entre el hipocampo y el septum medial. Por lo tanto, la transferencia de genes a los sitios distales debe haber surgido por transporte axonal retrogrado, lo que indica que una neurona de proyeccion afectada puede funcionar como un sistema de transporte por autopista efectivo para el movimiento de AAV2 a traves de un cerebro enfermo.

Se investigo adicionalmente la capacidad de ASM de invertir las anomalfas de colesterol en el cerebro ASMKO. Filipina es una molecula autofluorescente aislada de Streptomyces filipinensis que se une a complejos de colesterol (Leventhal et al. (2001) J. Biol. Chem., 276:44976-44983; y Sarna et al. (2001) Eur. J. Neurosci., 13,1-9). Cerebros ASMKO no inyectados teman altos niveles de tincion con filipina debido a estos complejos de colesterol abundante, mientras que los cerebros normales de ratones no produdan tincion con filipina.

La inyeccion de AAV2-CMV-ASM resulto en la perdida completa de la tincion con filipina a lo largo de todo el hipocampo ipsilateral y contralateral, el septum y el cortex entorrinal a las 5 y 15 semanas pi de ratones ASMKO (Figuras 1A y 2A). Esto estaba en marcada contraposicion con controles ASMKO no inyectados emparentados en edad, en donde los altos niveles de tincion con filipina se detectaron en estas mismas estructuras. La perdida de la tincion con filipina en cerebros inyectados con AAV2 demuestra que se corrigio un fenotipo celular secundario (p. ej., defecto metabolico) de la enfermedad ASM. Esto sugiere considerablemente que la protema ASM fue fijada como objetivo del lisosoma e interactuo con el complejo de esfingomielina-colesterol. Esta interaccion dio probablemente como resultado la liberacion de colesterol a partir de esfingomielina, y la subsiguiente entrada de colesterol en sus vfas biologicas normales (tales como la degradacion o la translocacion a la membrana plasmatica (Leventhai et al. (2001) J. Biol. Chem., 276:44976-44983)).

Se observo una perdida de tincion con filipina en todas las capas de celulas y subcampos de los circuitos intrahipocampal, septohipocampal y entorrinodentado. El area de la correccion de colesterol era mucho mayor y mas extensa que el patron de protemas ASM. Esto indica que, tras el transporte axonal retrogrado de AAV2, las neuronas de proyeccion pueden haber funcionado como "bombas de enzimas" y pueden haber secretado protema ASM en el tejido circundante. De manera significativa, solo se necesita una pequena cantidad de ASM para tener un efecto terapeutico sobre la acumulacion de colesterol en las celulas afectadas por ASMKO, una cantidad por debajo del lfmite de deteccion del protocolo de inmunofluorescencia.

Tambien se evaluo si el transporte axonal del vector de AAV2-ASM da como resultado la correccion del fenotipo celular primario de NPD. La histopatologfa de secciones de cerebro de una micra de espesor demostro una notable reduccion de patologfa lisosomal acumulada y distendida en los cerebros inyectados con CMV-ASM-AAV2 a las 5 semanas pi (Tabla 2). La inversion de la patologfa que resulta en la restauracion parcial o completa de la arquitectura celular normal se produjo en todas las regiones de los hemisferios ipsilateral y contralateral del hipocampo. El septum medial y el cortex entorrinal tambien mostraron una reduccion sustancial en las lesiones por deposito. De manera similar a los datos de filipina, el numero de celulas corregidas era mayor y estaba mas extendido que el patron de protemas ASM. La inversion de la patologfa era evidente dentro de las regiones que se conoce que se proyectan al hipocampo, incluyendo los circuitos intrahipocampal, septohipocampai y entorrinodentado. En general, el volumen de la correccion era de 30-35 mm3 o mas en el hipocampo contralateral, de 5-8 mm3 o mas en el cortex entorrinal ipsilaferal, de 1-2 mm3 o mas en el cortex entorrinal contralateral y de 2-3 mm3 o mas en el septum medial. Esto apoya ademas que el transporte axonal del vector viral era el responsable de este efecto terapeutico, debido a que las estructuras cercanas (que no contribuyen en estos circuitos) habnan sido

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corregidas si la distribucion viral era mediada meramente por la difusion (vease, "cuerpo estriado ipsilateral" y "cuerpo estriado contralateral" en la Tabla 2).

Para demostrar que la inversion de la patologfa era espedfica para ASM, se inyecto a un grupo adicional de ratones ASMKO un vector de control que porta un gen informador, AAV2-CMV-p-gal (n = 2 en cada caso a las 5 y 15 semanas pi), y se proceso para la histopatologfa. En los cuatro cerebros las celulas permanecieron inundados con lisosomas distendidos, y conteman otras anomaKas como la expansion citoplasmatica y capas celulares desorganizadas.

Tabla 2

Region del Cerebro

No tratado Tratado con AAV2-ASM

Hipocampo ipsilateral

Campo 1

+ + + + +

Campo 3

++++ +

Capa de Celulas Granulares Dentadas

++++ +

Hilio

++++ +

Hipocampo contralateral

Campo 1

++++ +

Campo 3

++++ +

Capa de Celulas Granulares Dentadas

++++ +

Hilio

++++ +

Cortex Ipsilateral Entorrinal

+ + + + + +

Cortex Contralateral Entorrinal

++++ +++

Septum Ipsilateral Medial

++++ ++

Septum Contralateral Medial

++++ ++

Cuerpo Estriado Ipsilateral

++++ ++++

Cuerpo Estriado Contralateral

++++ ++++

++++ alto nivel de patologfa virtualmente en todas las celulas +++ patologfa en muchas celulas, la correccion se observa en algunas celulas ++ patologfa en algunas celulas, la correccion se observa en muchas celulas

+ poca o ninguna patologfa en la mayona de las celulas, virtualmente cada una de las celulas es corregida

Por lo tanto, de acuerdo con la presente invencion, una sola inyeccion de vector de AAV2 de alto tttulo es suficiente para transferir el gen ASM a las estructuras que inervan el hipocampo afectado por ASMKO. El numero de estructuras positivas para el vector de AAV2 era mayor que el demostrado por un estudio reciente en el hipocampo de ratas normales, que mostro un transporte axonal solo en el circuito entorrinodentado (Kaspar et al (2002) Mol. Ther., 5:50-56). Los resultados descritos en esta memoria demuestran que el transporte axonal puede producirse en las neuronas de proyeccion a las que se infligio una patologfa por deposito, y que este modo de transporte resulta en el aclaramiento de la patologfa por deposito en las estructuras proximales y multiples regiones distales al sitio de inyeccion. Los autores de la invencion demuestran tambien que el transporte axonal no se limita solo a los circuitos asociados con el hipocampo. Se produce un transporte axonal retrogrado en los circuitos nigroestriatal (Figura 3) y medulocerebelar (Figura 4). Esto demuestra que el transporte axonal de AAV2 en las neuronas comprometidas con la enfermedad es una propiedad general del vector viral.

Se llevo a cabo un estudio similar con AAV1-ASM a las concentraciones de 1-4x1013 gp/ml y AAV7-ASM a la concentracion de 8,4x1012 gp/ml. Mientras que AAV1 no exhida un transporte axonal retrogrado detectable, AAV7 sufrio un transporte axonal retrogrado, similar a AAV2, y produjo una correccion de la patologfa de LSD en regiones distales (vease la Figura 5).

Tratamiento de la enfermedad de Alzheimer

5

10

15

20

25

30

35

40

La enfermedad de Alzheimer (AD) es un trastorno neurodegenerativo caracterizado por la acumulacion de peptido p- amiloide (Ap) debido al catabolismo reducido de Ap. A medida que se acumula Ap, este se agrega en placas extracelulares, provocando un deterioro de la funcion sinaptica y la perdida de neuronas. La patologfa conduce a la demencia, perdida de coordinacion y muerte.

Neprilisina es una metaloendopeptidasa de zinc de 97 kD unida a la membrana que es la enzima limitante de la velocidad en la degradacion normal de Ap. La introduccion de neprilisina puede desacelerar el progreso de la enfermedad al separar agrupaciones de Ap antes de la agregacion. De hecho, se demostro que neprilisina degrada formas oligomericas de Ap, separando de este modo las placas existentes en un modelo animal de AD (Kanemitsu et al. (2003) Neurosci. Lett., 350:113-116). Ratones inactivados con neprilisina exhiben altos niveles de Ap (Iwata et al. (2001) J. Neurosci., 24:991-998). Inhibidores de neprilisina tales como tiorfano y fosforamidon aumentan los niveles de Ap, en cerebro de raton (Iwata et al. (2000) Nat. Med. , 6:143-150). Adicionalmente, se encontraron niveles reducidos de ARNm de neprilisina en zonas de alta carga de placa amiloide en cerebros humanos, lo que demuestra adicionalmente la relacion entre neprilisina y la AD (Yasojima et al. (2001) Neurosci. Lett, 297:97-100).

Las zonas del cerebro mas afectadas por la AD son el hipocampo, el cortex, el cerebelo, el cuerpo estriado y el talamo (vease, p. ej., Iwata et al (2001) supra; Yasojima et al. (2001) supra). Estas son las mismas zonas del cerebro que muestran un eficiente transporte axonal retrogrado con AAV.

Por consiguiente, AAV puede utilizarse para suministrar transgenes terapeuticos a regiones de alta carga de placa, mediante inyeccion directa y subsiguiente translocacion de virus a traves de los circuitos del cerebro a nuestros sitios de destino. La transferencia de genes mediada por el vector viral de neprisilina era efectiva en el tratamiento de modelos de ratones de la AD (Marr et al. (2003) J. Neurosci., 23:1992-1996; Marr et al. (2004) J. Mol. Neurosci., 22:5-11; Iwata et al. (2004) J. Neurosci., 24:991-998). Un informe reciente demostro que AAV5-neprilisina separaba Ap de los terminales presinapticos del hipocampo en ratones deficientes en neprilisina, desacelerar la formacion de placas en las sinapsis(Iwata et al. (2004) supra). En este informe, se encontro neprilisina en el hipocampo contralateral, pero sigue desconociendose si esto es atribuible al transporte retrogrado de virus o al transporte anterogrado de la protema expresada.

La memoria descriptiva se entiende mas a fondo a la vista de las ensenanzas de las referencias citadas dentro de la memoria descriptiva. Las realizaciones dentro de la memoria descriptiva proporcionan una ilustracion de realizaciones de la invencion y no deben interpretarse que limitan el alcance de la invencion. El experto en la tecnica reconoce facilmente que muchas otras realizaciones quedan abarcadas por la invencion. En la medida en que todas las publicaciones, patentes y secuencias biologicas citadas en esta descripcion contradigan o sean inconsistentes con la presente memoria descriptiva, la presente memoria descriptiva reemplaza a cualquiera de estos materiales. La cita de cualquier referencia en esta memoria no es una admision de que estas referencias sean tecnica anterior a la presente invencion.

A menos que se indique lo contrario, todos los numeros que expresan cantidades de ingredientes, cultivo celular, condiciones de tratamiento, etcetera, utilizados en la memoria descriptiva, incluidas las reivindicaciones, han de entenderse como modificados en todos los casos por el termino "aproximadamente. Por consiguiente, a menos que se indique otra cosa en contrario, los parametros numericos son aproximaciones y pueden variar dependiendo de las propiedades deseadas que se pretenda obtener mediante la presente invencion. A menos que se indique de otro modo, la expresion "al menos" que precede a una serie de elementos debe entenderse que se refiere a cada uno de los elementos en la serie. Los expertos en la tecnica reconoceran, o seran capaces de determinar, utilizando no mas que una experimentacion rutinaria, muchos equivalentes a las realizaciones espedficas de la invencion descrita en esta memoria. Tales equivalentes estan destinados a ser abarcados por las siguientes reivindicaciones.

Claims (17)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   REIVINDICACIONES

   1. Una composicion que comprende un vector de AAV que comprende un transgen que codifica una hidrolasa lisosomal, para uso en el tratamiento de una enfermedad por deposito lisosomal en un mai^ero, en donde la composicion se ha de administrar a un primer sitio en el SNC del mairnfero y la concentracion del vector en la composicion es al menos 5 x 1012 gp/ml, de modo que la hidrolasa lisosomal es expresada en una cantidad terapeuticamente eficaz en un segundo sitio en el SNC que contiene neuronas que se proyectan al primer sitio y que esta distal a y al menos a 2 mm de dicho primer sitio.
2. 2. La composicion para uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde la enfermedad por deposito lisosomal es la enfermedad de Niemann-Pick A.
3. 3. La composicion para uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde el mai^ero es un ser humano.
4. 4. La composicion para uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde la composicion se ha de administrar mediante inyeccion directa en el cerebro.
5. 5. La composicion para uso de acuerdo con la reivindicacion 4, en donde el segundo sitio es cotralateral al primer sitio.
6. 6. La composicion para uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde el primer sitio esta en una region del SNC seleccionada del grupo que consiste en la medula espinal, el bulbo raqmdeo, el hipocampo, el cuerpo estriado, la medula, el puente de Varolio, el mesencefalo, el cerebelo, el talamo, el hipotalamo, la corteza cerebral, el lobulo occipital, el lobulo temporal, el lobulo parietal y el lobulo frontal.
7. 7. La composicion para uso de acuerdo con la reivindicacion 4, en donde el primer sitio esta en el hipocampo y el segundo sitio esta en una region del cerebro seleccionada del grupo que consiste en el giro dentado contralateral y la CA3 contralateral, y el septum medial y el cortex entorrinal.
8. 8. La composicion para uso de acuerdo con la reivindicacion 4, en donde el primer sitio esta en una region del cerebro seleccionada del grupo que consiste en el cuerpo estriado y el cerebelo, y el segundo sitio esta en una region del cerebro seleccionada del grupo que consiste en la sustancia negra y la medula oblongada.
9. 9. La composicion para uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde la composicion se ha de administrar a un tercer sitio en el SNC del mai^ero.
10. 10. La composicion para uso de acuerdo con la reivindicacion 9, en donde el tercer sitio es contralateral al primer sitio.
11. 11. La composicion para uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde la hidrolasa lisosomal es aspartilglucosaminidasa, a-galactosidasa A, palmitoil protema tioesterasa, tripeptidil peptidasa, protema de la transmembrana lisosomal, transportador de cistema, ceramidasa acida, a-L-fucosidasa acida, protema protectora/catepsina A, p-glucosidasa acida o glucocerebrosidasa, p-glucosidasa acida, iduronato-2-sulfatasa, a-L- iduronidasa, galactocerebrosidasa, a-manosidasa acida, p-manosidasa acida, arilsulfatasa B, arilsulfatasa A, N- acetilgalactosamina-6-sulfato sulfatasa, N-acetilglucosamina-1-fosfotransferasa, esfingomielinasa acida, NPC-1, a- glucosidasa acida, p-hexosaminidasa B, heparan N-sulfatasa, a-N-acetilglucosaminidasa, acetil-CoA:a- glucosaminida N-acetiltransferasa, N-acetilglucosamina-6-sulfato sulfatasa, a-N-acetilgalactosaminidasa, a- neuramidasa, p-glucuronidasa, p-hexosaminidasa A o lipasa acida.
12. 12. La composicion para uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde la hidrolasa lisosomal es esfingomielinasa acida.
13. 13. Uso de un vector de AAV que comprende un genoma de AAV recombinante que comprende un transgen que codifica una hidrolasa lisosomal, para la preparacion de una composicion para tratar una enfermedad por deposito lisosomal en un marnffero, en donde la composicion se ha de poner en contacto con una terminacion axonal de una neurona comprometida con la enfermedad, de modo que el vector de AAV es endocitosado y es transportado de forma retrogada intracelularmente a lo largo del axon de la neurona al nucleo de la neurona, y la hidrolasa lisosomal es expresada y secretada por la neurona y es recogida por una celula diana, aliviando con ello la patologfa en la

    celula diana, en donde la concentracion de los genomas de AAV recombinante en la composicion es de al menos 5x1012 gp/ml, y en donde la neurona es una neurona de proyeccion.
14. 14. El uso de acuerdo con la reivindicacion 13, en donde la celula diana es una neurona secundaria o una celula glial.

    5 15. El uso de acuerdo con la reivindicacion 13, en donde la distancia desde la terminacion axonal al nucleo es de al

    menos 2 mm.
15. 16. El uso de acuerdo con la reivindicacion 13, en donde la enfermedad por deposito lisosomal es la enfermedad de Niemann-Pick A.
16. 17. El uso de acuerdo con la reivindicacion 13, en donde la hidrolasa lisosomal es esfingomielinasa acida.

    10 18. La composicion para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde el AAV es uno

    de serotipo seleccionado del grupo que consiste en AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7 y AAV8.
17. 19. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17, en donde el AAV es uno de serotipo seleccionado del grupo que consiste en AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7 y AAV8.