CN106729752A - A型尼曼‑皮克病的基因治疗 - Google Patents

Abstract

本发明涉及A型尼曼‑皮克病的基因治疗。本发明涉及用于使哺乳动物脑对外源性给予的酸性鞘磷酯酶多肽耐受的方法和组合物，其通过首先向该哺乳动物肝组织投递有效量的编码该多肽的转基因然后向该哺乳动物的中枢神经系统(CNS)给予有效量的该转基因实现。

Description

A型尼曼-皮克病的基因治疗

本申请是申请日为2007年2月8日、中国申请号为200780009401.1、发明名称为“A型尼曼-皮克病的基因治疗”的发明申请的分案申请。

相关申请的交互参考

本申请要求根据美国专利法第119条(e)项(35U.S.C.§119(e))的2006年2月8日申请的美国临时申请第60/771,628号，2006年2月9日申请的美国临时申请第60/772,360号的优先权，上述申请案的内容通过引用并入本公开中。

技术领域

本发明涉及治疗影响脑和内脏的疾病如A型尼曼-皮克病的组合物和方法。

发明内容

一组称为溶酶体贮积症(lysosomal storage diseases，LSD)的代谢性疾病包括超过40种遗传疾病，其中许多涉及不同溶酶体水解酶的遗传缺陷。表1列出了有代表性的溶酶体贮积症和相关的缺陷酶。

表1

*影响中枢神经系统

LSD的标志性特征是溶酶体中代谢物的异常积累，其导致在核周体中形成大量膨胀的溶酶体。对LSD治疗的主要困难(相对于肝特异性酶病的治疗而言)在于需要在多个单独的组织中逆转溶酶体贮积病变。有些LSD可通过静脉输注缺失的酶有效的治疗，称为酶替代疗法(enzyme replacement therapy,ERT)。例如，仅有内脏病的戈谢1型病人对重组葡萄糖脑苷脂酶(Genzyme Corp.)的ERT有良好反应。然而，患有影响CNS的代谢病的病人(例如2型或3型戈谢病)并不完全对静脉内ERT有反应，因为替代酶被血脑屏障(BBB)阻止而不能进入脑。此外，早期试图通过直接注射蛋白将替代酶引入脑的行为部分受限，这是由于局部高浓度酶的毒性以及脑实质中扩散率有限(Partridge,Peptide DrugDelivery to the Brain,Raven Press,1991)。

另外，可能会产生抗酶替代疗法中使用的输注的酶的抗体。该抗体可能没有临床意义，也可能导致超敏反应或降低治疗蛋白的生物利用度。Hunley,T.E.et al.(2004)Pediatrics 114(4):e532-e535。例如，Kakkis E.et al.(2004)PNAS 101(3):829-834报道在粘多糖贮积症I型(mucopolysaccharidosis I，MPS I)犬模型中已经观察到抗体对溶酶体贮积症酶替代疗法的不利作用。在MPS疾病包括MPS I、MPS VI和MPS VII的其他动物模型中，他们也报道了相似的结果。降低这些蛋白引起的免疫应答可能是合乎需要的。诱导抗原特异性耐受是降低这样的免疫应答的可能的方法，但是据报道难以实现。

基因疗法是刚出现的治疗影响CNS的疾病，包括LSD的治疗方式。在认可的动物模型中人们已经获得用基因疗法治疗A型尼曼-皮克病(Neimann-Pick Type A，NPA)的有希望的结果。Dodge et al.(2005)PNAS 102(49):18722-17827。NPA是由酸性鞘磷脂酶(acidsphingomyelinase，ASM)活性缺陷引起的溶酶体贮积症。ASM活性的缺失导致溶酶体鞘磷脂(sphingomyelin，SPM)的积累，继发的代谢缺陷如异常胆固醇代谢，进而导致包括中枢神经系统(central nervous system，CNS)的器官系统的细胞功能缺失。Schuchman andDesnick,The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease,McGraw-Hill,New York,pp.3589-3610和Horinouchi et al.(1995)Nat.Genet.10:288-293。

本发明提供包括下述步骤的方法：将有效量的含有编码免疫原转基因的病毒载体给予哺乳动物的肝组织，然后将有效量的含有编码免疫原转基因的第二病毒载体给予哺乳动物的脑。

本发明也提供治疗哺乳动物A型尼曼-皮克病的方法，包括下述步骤：将有效量的含有编码酸性鞘磷脂酶多肽转基因的病毒载体给予哺乳动物的肝组织，然后将有效量的含有编码酸性鞘磷脂酶多肽转基因的第二病毒载体给予所述哺乳动物的脑，由此治疗哺乳动物的A型尼曼-皮克病。

本发明也提供使哺乳动物的脑对预先选定的免疫原耐受的方法和组合物，其首先通过转基因全身性投递有效量的该免疫原然后将有效量的该免疫原给予哺乳动物的中枢神经系统(CNS)来实现。

本发明也提供使哺乳动物的脑对酸性鞘磷脂酶多肽耐受的方法和组合物，其通过首先向该哺乳动物的肝投递有效量的编码该多肽的转基因然后将有效量的编码该多肽的转基因给予所述哺乳动物的中枢神经系统(CNS)来实现。

本发明也提供改善患有NPA的哺乳动物中A型尼曼-皮克病(NPA)相关症状的方法和组合物，其通过使用编码酸性鞘磷脂酶多肽的转基因转导该哺乳动物的肝后再使用有效量的该转基因转导所述哺乳动物的脑组织来实现。

本发明的其他优点将部分通过下述说明来陈述，部分可通过本说明书而理解，或可通过实施本发明而得知。

本申请涉及下述实施方案。

1、包括下述步骤的方法：

a)给予有效量的包括编码免疫原的转基因的病毒载体至哺乳动物的肝组织；和

b)随后给予有效量的包括编码免疫原的转基因的第二病毒载体至所述哺乳动物的脑。

2、根据实施方案1所述的方法，其中在所述哺乳动物中检测到转基因的表达之后给予所述的第二载体。

3、根据实施方案1所述的方法，其中转基因编码溶酶体贮积症蛋白或多肽。

4、根据实施方案3所述的方法，其中蛋白或多肽为酸性鞘磷脂酶多肽或蛋白。

5、根据实施方案1所述的方法，其中哺乳动物为人。

6、根据实施方案1所述的方法，其中给予至哺乳动物的脑的位点选自脑干、中脑、海马、纹状体、延髓、脑桥、中脑泡、小脑、丘脑、下丘脑、大脑皮质、枕叶、颞叶、顶叶或额叶。

7、根据实施方案1所述的方法，其中给予至哺乳动物的脑的位点为小脑的小脑深部核团。

8、根据实施方案1所述的方法，其中病毒载体为腺伴随病毒(AAV)。

9、根据实施方案8所述的方法，其中AAV载体选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7或AAV8。

10、根据实施方案9所述的方法，其中AAV为重组AAV载体。

11、根据实施方案10所述的方法，其中重组AAV载体选自AAV2/1、AAV2/2、AAV2/5、AAV2/7或AAV2/8血清型载体。

12、根据实施方案10所述的方法，其中重组AAV载体包括肝特异性增强子和启动子元件。

13、根据实施方案1所述的方法，其中重复步骤b)。

14、治疗哺乳动物A型尼曼-皮克病的方法，其包括下述步骤：

a)给予有效量的包括编码酸性鞘磷脂酶多肽或蛋白转基因的病毒载体至哺乳动物的肝组织；和

b)随后给予有效量的包括编码酸性鞘磷脂酶多肽或蛋白转基因的第二病毒载体至所述哺乳动物的脑，由此治疗该哺乳动物的A型尼曼-皮克病。

15、根据实施方案14所述的方法，其中重复步骤b)。

16、根据实施方案14所述的方法，其中在所述哺乳动物中检测到转基因的表达之后给予所述的第二载体。

17、根据实施方案14所述的方法，其中哺乳动物为人。

18、根据实施方案14所述的方法，其中给予至哺乳动物的脑的位点选自脑干、中脑、海马、纹状体、延髓、脑桥、中脑泡、小脑、丘脑、下丘脑、大脑皮质、枕叶、颞叶、顶叶或额叶。

19、根据实施方案14所述的方法，其中给予至哺乳动物的脑的位点为小脑的小脑深部核团。

20、根据实施方案1所述的方法，其中病毒载体为腺伴随病毒(AAV)。

21、根据实施方案20所述的方法，其中AAV载体选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7或AAV8。

22、根据实施方案20所述的方法，其中AAV为重组AAV载体。

23、根据实施方案22所述的方法，其中重组AAV载体选自AAV2/1、AAV2/2、AAV2/5、AAV2/7或AAV2/8血清型载体。

24、根据实施方案20所述的方法，其中重组AAV载体包括肝特异性增强子和启动子元件。

附图说明

图1：图示了向小鼠中枢神经系统给予转基因的不同位点。

图2：图示了作为健康的量度的受治疗小鼠的体重。从6周龄开始测量(处理从第四周开始)。在6至36周(全身性注射该转基因后2至32周)期间所有组与未处理ASMKO小鼠比较。图注：*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；ns(不显著)。

图3：图示了作为运动功能恢复的量度的加速滚轮测试(Accelerating Rotarodtest)的结果。测量在10周龄开始(处理从第四周开始)。在10至36周(全身性注射该转基因后6至32周)期间所有组与未处理ASMKO小鼠比较。图注：*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；ns(不显著)。

图4：图示了作为运动功能恢复的量度的摇摆滚轮测试(rocking rotarod test)的结果。测量在10周龄开始(处理从第四周开始)。在10至36周(全身性注射该转基因后6至32周)期间所有组与未处理ASMKO小鼠比较。图注：*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；ns(不显著)。

图5：图示了作为认知功能恢复量度的Barnes迷宫测试(Barnes Maze test)的结果。测量在17周龄开始(处理从第四周开始)。在17至33周(全身性注射该转基因后13至29周)期间所有组与未处理ASMKO小鼠比较。图注：*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；ns(不显著)。

图6：图示了ASM联合基因治疗延长了ASMKO小鼠的寿命。ASMKO小鼠寿命中位数为34周。接受全身性转基因的小鼠寿命中位数为45周(p<0.0001)。接受颅内转基因的小鼠的寿命中位数为43周(p<0.0001)。100％的接受颅内和全身性转基因的小鼠寿命为54周。

图7A至图7D：图示了处理和未处理小鼠的循环中的抗hASM抗体水平。图注：*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。图7E显示了随时间的血清中人ASM蛋白水平。

图8A至图8F：图示了处理和未处理小鼠脑中鞘磷脂水平。

图9A至图9D：图示了处理和未处理小鼠各种内脏中鞘磷脂水平。

具体实施方式

贯穿本公开，许多出版物、专利和公布的专利说明书通过确定的引用以供参考。这些出版物、专利和公布的专利说明书所揭示的内容通过引用并入本公开，以更全面的公开本发明所涉及领域的状况。

定义

除非另有说明，本发明的实施将使用免疫学、分子生物学、微生物学、细胞生物学和重组DNA的常规技术，这些均属于本领域的技术。参见，例如Sambrook,Fritsch andManiatis,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版(1989)；Current ProtocolsIn Molecular Biology(F.M.Ausubel et al.eds.，(1987))；Methods In Enzymology系列(Academic Press,Inc.):Pcr 2:A Practical Approach(M.J.MacPherson,B.D.Hames andG.R.Taylor eds.(1995)),Harlow and Lane eds.，(1988)ANTIBODIES,A LABORATORYMANUAL And ANIMAL CELL CULTURE(R.I.Freshney ed.(1987))。

此处所用的一些术语有如下定义的意义。如说明书和权利要求中所用，除非上下文明确指明，单数形式“一个”、“一种”和“所述的”都包含复数范围。例如，术语“一种细胞”包括多种细胞，包括其混合物。

术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”可互换地使用，是指任何长度的核苷酸(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物)的聚合形式。多核苷酸可有任何三维结构和执行任何功能，包括已知的或未知的。下述的为多核苷酸的非限定性例子：基因或基因片段(例如，探针、引物、EST或SAGE标签)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、支链多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离DNA、任何序列的分离RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可包含修饰核苷酸，如甲基化核苷酸和核苷酸类似物。对核苷酸结构的修饰，如果有的话，可在聚合物组装之前或之后给予。核苷酸序列可被非核苷酸成分中断。多核苷酸可在聚合后进一步修饰，如通过与标记成分接合。该术语也指双链和单链分子。除非另有说明或必要时，本发明为多核苷酸的任何实施方案包括双链形式和已知的或预测的构成该双链形式的两条互补单链形式的每一条。

多核苷酸由四种核苷酸碱基的特定序列组成：腺嘌呤(A)；胞嘧啶(C)；鸟嘌呤(G)；胸腺嘧啶(T)；和当多核苷酸为RNA时尿嘧啶(U)针对鸟嘌呤。因此，术语“多核苷酸序列”是多核苷酸分子的字母代表形式。这种字母代表形式可输入到具有中央处理器的电脑的数据库中以及用于生物信息学应用如功能基因组学和同源性检索。

“基因”是指包含至少一个转录和翻译后能够编码特定多肽或蛋白质的开放读码框(ORF)的多核苷酸。任何此处描述的多核苷酸序列可用来鉴定其相关基因的更大片段或全长编码序列。分离更大片段序列的方法是本领技术人员已知的。

“基因产物”或换句话说“基因表达产物”是指在基因转录和翻译后产生的氨基酸(例如肽或多肽)。

术语“多肽”和术语“蛋白质”可互换地使用，在其最大意义上是指两个或更多个亚单位氨基酸、氨基酸类似物或拟肽(peptidomimetics)的化合物。亚单位可通过肽键连接。在另外一个实施方案中，亚单位可通过其他键连接，例如酯键、醚键等。此处所用术语“氨基酸”是指天然的和/或非天然的或合成的氨基酸，包括甘氨酸和D和L型旋光异构体、氨基酸类似物和拟肽。具有三个或更多个氨基酸的肽，如果肽链短，通常称为寡肽。如果肽链长，通常称为多肽或蛋白质。

“在转录控制下”是本领域熟知的术语，是指多核苷酸序列，通常是DNA序列的转录，依赖于其可操作地连接到对转录起始起作用或促进转录的元件。“可操作地连接”是指元件以允许其发挥功能的排列放在一起(juxtaposition)。

如本文所用，术语“包括”指组合物和方法包括所述成分，但是并不排除其他成分。当用于定义组合物和方法时，术语“基本由……组成”指排除对组合具有任何基本重要性的其他组分。因此，如本文所定义的，基本由组分组成的组合物将不排除来源于分离和纯化方法的微量污染物和药学上可接受的载体如磷酸盐缓冲盐水、防腐剂等。“由……组成”意味着排除超过痕量成分的其它成分和用于给予本发明的组合物的实质性的方法步骤。使用这些过渡术语定义的实施方案也在本发明的范围之内。

术语“分离的”意思为与细胞的或其他组分分离，其中多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其一个或多个片段(fragment(s))在天然状态下通常与之相连。在本发明的一个方面中，分离的多核苷酸从其在天然或原始环境下通常相连的3’和5’连续核苷酸中分离，例如在染色体上。对于本领域技术人员来说，显然非天然存在的多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其一个或多个片段不需要“分离”以将其从其天然存在的对应物中区别开来。此外，“浓缩的”、“隔离的(separated)”或“稀释的”多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其一个或多个片段与其天然存在的对应物区别在于浓度或每体积的分子数目大于“浓缩的”或小于“分散的”其天然存在的对应物的浓度或每体积的分子数目。与天然存在的对应物在一级序列或例如在糖基化模式上有区别的多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其一个或多个片段不一定以其分离的形式存在，因为它们与天然存在的对应物的区别在于一级序列或，可替代的，在于其他特征，如糖基化模式。因此，非天然存在的多核苷酸与分离的天然存在的多核苷酸分开，作为独立的(separate)实施方案提供。细菌细胞中产生的蛋白质与从天然产生蛋白质的真核细胞中分离的天然存在的蛋白质分开，作为独立的实施方案提供。

此处所用的“基因投递(gene delivery)”、“基因转移”等是指将外源多核苷酸(有时称为“转基因“)导入宿主细胞中，而不论使用何种导入方法。导入方法包括多种熟知的技术，如载体介导的基因转移(通过，例如病毒感染/转染或许多其他基于蛋白质或脂质的基因投递复合物)以及促进投递“裸”多核苷酸的技术(如电穿孔、“基因枪”投递和多种用于导入多核苷酸的其他技术)。导入的多核苷酸可在宿主细胞中稳定地或瞬时地维持。稳定地维持典型地需要该导入的多核苷酸或者包含与宿主细胞相容的复制起始或者整合到宿主细胞的复制子中，如染色体外复制子(例如质粒)或核或线粒体染色体。本领域已知许多能够介导基因转移到哺乳动物细胞中的载体。

“基因投递载体(gene delivery vehicle)”定义为任何能够携带插入的多核苷酸到宿主细胞中的分子。基因投递载体的例子为脂质体，生物相容的聚合物，包括天然聚合物和合成聚合物；脂蛋白；多肽；多糖；脂多糖；人工病毒包膜；重组酵母细胞，金属颗粒；和细菌或病毒，如杆状病毒、腺病毒和逆转录病毒、噬菌体、柯斯质粒、质粒、真菌载体和其他本领域中使用的典型重组载体，其在多种真核和原核宿主中表达已被描述，可用于基因治疗以及简单蛋白表达。

“病毒载体”定义为包括将要投递到宿主细胞中的多核苷酸的重组产生的病毒或病毒颗粒，体内(in vivo)的、离体的(ex vivo)或体外(in vitro)的。病毒载体的例子包括逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺伴随病毒载体、甲病毒载体等。甲病毒载体，如基于塞姆利基森林病毒(Semliki Forest virus)的载体和基于辛德毕斯病毒(Sindbis virus)的载体，也被开发用于基因治疗和免疫治疗。见Schlesinger and Dubensky(1999)Curr.Opin.Biotechnol.5:434-439和Ying et al.(1999)Nat.Med.5(7):823-827。在通过逆转录病毒载体介导基因转移的方面，载体构建体(construct)是指包含逆转录病毒基因组或其部分和治疗基因的多核苷酸。此处所用的“逆转录病毒介导的基因转移”或“逆转录病毒转导”具有相同的意思，是指通过病毒进入细胞和将其基因组整合到宿主细胞基因组从而使基因或核酸序列稳定地转移到宿主细胞中的过程。病毒可通过其正常的感染机制进入细胞或通过修饰从而结合到不同宿主细胞表面受体或配体以进入细胞。此处所用的“逆转录病毒载体”是指能够通过病毒或类似病毒进入机制将外源核酸导入细胞的病毒颗粒。

在通过DNA病毒载体，如腺病毒(Ad)或腺伴随病毒(AAV)介导基因转移的方面，载体构建体是指包含病毒基因组或其部分和转基因的多核苷酸。腺病毒(adenoviruses,Ads)是一组有相对详细描述的同源病毒，包括50种以上的血清型。参见例如WO 95/27071。腺病毒易于生长并且不需要整合到宿主基因组中。也构建了重组腺病毒来源的载体，特别是那些降低了重组可能性和产生野生型病毒的载体。参见例如WO 95/00655和WO 95/11984。野生型AAV具有整合到宿主细胞基因组中的高侵染性和特异性。参见Hermonat and Muzyczka(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6466-6470和Lebkowski et al.(1988)Mol.Cell.Biol.8:3988-3996。重组AAV载体也是本领域已知的。参见例如WO 01/36620 A2。

包含启动子和可将多核苷酸可操作的连接进去的克隆位点的载体是本领域熟知的。这样的载体能够体外或体内转录RNA并可通过商业途径获得，其来源如Stratagene(LaJolla,CA)和Promega Biotech(Madison,WI)。为使表达和/或体外转录最佳，可能需要去除、添加或改变克隆的5’和/或3’非翻译部分以排除额外的、潜在的不合适的替代翻译起始密码子或其他可干扰或降低表达的序列，无论是在转录水平还是在翻译水平。可替代地，可在起始密码子5’后紧接着插入一致性的核糖体结合位点以提高表达。

基因投递载体也包括一些非病毒载体，包括DNA/脂质体复合物、重组酵母细胞和靶向病毒蛋白质-DNA复合体。也包括定向抗体或其片段的脂质体可用于本发明的方法中。为提高向细胞的投递，本发明的核酸分子或蛋白质可结合(conjugate)到结合例如TCR、CD3或CD4的细胞表面抗原的抗体或其一个或多个结合片段(binding fragment(s))。

术语“基因组颗粒(gp)”或“基因组当量(genome equivalents)”在与病毒滴度有关的地方使用时，是指含有重组AAV DNA基因组的病毒体(virion)数，而不论其侵染性或功能性。特定载体制剂中的基因组颗粒数可通过如此处实施例中，或例如Clark et al.(1999)Hum.Gene Ther.10:1031-1039中和Veldwijket al.(2002)Mol.Ther.6:272-278中描述的方法进行测定。

术语“感染单位(iu)”、“感染颗粒”或“复制单位”在与病毒滴度有关的地方使用时，是指通过感染中心测定，也称为复制中心测定所测量的感染性载体颗粒数，该测定如例如在McLaughlin et al.(1988)J.Virol.62:1963-1973中描述的。

术语“转导单位(tu)”在与病毒滴度有关的地方使用时，是指导致功能转基因产物产生的如通过功能测定所测量的感染性载体颗粒数，该测定如在Xiao et al.(1997)Exp.Neurobiol.144:113-124或在Fisher et al.(1996)J.Virol.70:520-532(LFU测定)中描述的。

术语“治疗”、“治疗有效剂量”及其相关词是指导致预防或延迟受试者发病或改善受试者症状或获得期望的生物学效果的化合物的量，该生物学效果如神经病理学纠正，例如，与溶酶体贮积症相关的细胞病理学，如此处或Walkley(1998)Brain Pathol 8:175-193中所描述的。术语“治疗纠正”指产生预防或延缓发病或者减轻患者症状的纠正程度。有效量可通过本领域熟知的方法和如下述部分中描述的进行确定。

“组合物”意为活性试剂和另一种惰性的(例如可检测的试剂或标记)或活性的如佐剂的化合物或组合物的组合。

“药物组合物”意为包括活性试剂和惰性的或活性的载体的组合，以使得该组合物适于体外、体内或离体的诊断或治疗用途。

如本文所用，术语“药学上可接受的载体”包括任何标准的药物载体，例如磷酸盐缓冲盐水、水和乳剂，如油/水或水/油乳剂，以及各种类型的湿润剂。组合物也可包括稳定剂和防腐剂。对于载体、稳定剂和佐剂的实例；参见Martin,Remington's Pharm.Sci.,15thEd.(Mack Publ.Co.,Easton(1975))。

“有效量”为足以达到有益或所需结果如预防或治疗的量。有效量可通过一次或更多次给药、应用或剂量来给予。

“受试者”、“个体”或者“患者”在本文可互换使用，是指脊椎动物，优选哺乳动物，更优选人。哺乳动物包括但不限于鼠、猿、人、农场动物、竞技动物和宠物。

“对照”为在实验中为对比的目的使用的另外的受试者或样品。对照可为“阳性”或“阴性”。例如，当实验的目的为确定基因改变的表达水平与疾病相关时，一般优选使用阳性对照(具有上述改变并且表现出该疾病特征性症状的受试者或从该受试者中获得的样品)和阴性对照(缺少改变的表达和该疾病临床症状的受试者或从该受试者中获得的样品)。

通过病毒载体的基因治疗给予蛋白能够感染有丝分裂后神经元。病毒载体用于向CNS投递基因的综述见Davidson et al.(2003)Nature Rev.4:353-364。腺伴随病毒(AAV)在CNS基因治疗中有用，因为它们基本无毒、无免疫原性、具有亲神经性和能在CNS中维持表达(Kaplitt et al.(1994)Nat.Genet.8:148-154；Bartlett et al.(1998)Hum.GeneTher.9:1181-1186；和Passini et al.(2002)J.Neurosci.,22:6437-6446)。如此处所证明的，转基因在动物脑中表达导致对该转基因产物的免疫应答。见图7A。

申请人发现向已经对转基因耐受的哺乳动物CNS给予该转基因增强了疗效。因此，一方面本发明提供使哺乳动物的脑对预先选定的免疫原耐受的方法，该方法通过在向该哺乳动物的CNS给予所述的预先选定的免疫原之前将有效量的该预先选定的免疫原全身性给予该哺乳动物。如本文使用，术语“使……耐受”意为降低对免疫原的免疫应答。术语“免疫原”应包括任何初次引起免疫应答(T细胞或B细胞介导的)的试剂。如Ziegler等人(2004)所证实的，在给予编码肝特异性增强子/启动子控制下的转基因的重组AAV载体之后，在肝中该转基因的表达导致对该表达的转基因的抗体应答降低。

本方法适用于任何哺乳动物，因此，所述的“哺乳动物”包括但不限于鼠、猿、人、农场动物、竞技动物和宠物。在一个特别的方面，所述的哺乳动物为认可的A型和B型尼曼-皮克病动物模型的ASKMO小鼠。Horinouchi et al.(1995)Nat.Genetics 10:288-293；Jin etal.(2002)J.Clin.Invest.109:1183-1191；和Otterbach(1995)Cell 81:1053-1061。

A型尼曼-皮克病(NPA)归类于溶酶体贮积症，为遗传性的神经代谢异常，特征是遗传性的酸性鞘磷脂酶缺陷(ASM，鞘磷脂胆碱磷酸水解酶，EC 3.1.3.12)。功能性ASM蛋白的缺乏导致整个脑部神经元和神经胶质的溶酶体内鞘磷脂底物的积累。这导致核周体内大量膨胀溶酶体的形成，是A型NPD的标志性特征和主要的细胞表型。膨胀溶酶体的存在与正常的细胞功能的丢失和进行性的神经变性过程相关，其导致受影响的个体在幼童时期死亡(The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Diseases,eds.Scriver et al.,McGraw-Hill,New York,2001,pp.3589-3610)。次级细胞表型(例如其他代谢异常)也与此疾病相关，特别是溶酶体分隔中胆固醇的高水平积累。鞘磷脂对胆固醇有强的亲和性，其导致ASMKO小鼠和人类患者溶酶体中大量的胆固醇的分离。Leventhal et al.(2001)J.Biol.Chem.,276:44976-44983；Slotte(1997)Subcell.Biochem.28:277-293；和Vianaet al.(1990)J.Med.Genet.27:499-504。

在一个具体的方面，全身性给药的位点为哺乳动物的肝。可使用任何给药方法，其例子在下面提供。

全身性给予转基因后，转基因被给予到哺乳动物的CNS，特别是颅内直接给予到哺乳动物的脑，更特别的给予位点选自脑干、海马、纹状体、延髓、脑桥、中脑泡(mesencephalon)、小脑、中脑、丘脑、下丘脑、大脑皮质、枕叶、颞叶、顶叶或额叶。在一个实施方案中，特异的给予至小脑的小脑深部核团。

如上所述，给予编码多肽或蛋白的转基因到哺乳动物，以最终使用任何适当的基因转移方法投递该多肽或蛋白，其例子如上所述，以及如美国专利6,066,626所述。在一个方面，该转基因编码ASM。人ASM的基因组和功能cDNA序列已经公布，例如在美国专利5,773,278和6,541,218中)。在表1中鉴定了其他涉及CNS的适当的蛋白免疫原。

病毒载体是有用的基因转移载体。在一个特别实施方案中，病毒载体选自腺病毒、腺伴随病毒(AAV)、牛痘、疱疹病毒、杆状病毒或逆转录病毒。

适当的AAV载体在美国专利6,066,626和PCT公布WO 01/36620 A2全文中公开。修饰的载体，如第9栏，第14到66行中描述的，也可以使用。适当的血清型包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7或AAV8。AAV载体可为重组或杂交AAV载体，例如一种选自AAV2/1、AAV2/5、AAV2/7、AAV2/8、AAV1/2、AAV1/3、AAV1/5、AAV1/7或AAV1/8的，血清型载体，其中该命名是指ITR来源的血清型/衣壳来源的血清型。例如，AAV2/5载体包括AAV2血清型ITR和AAV5血清型衣壳。

通过给予包含产生多肽的转基因的病毒载体，向哺乳动物投递有效量的该多肽。在一个方面，包含转基因的病毒载体投递到肝，在投递到肝之后，立即将包含所述转基因的病毒载体投递到CNS。

在一个替代实施方案中，给予CNS的后一病毒载体在该多肽已经在哺乳动物中表达了有效时间从而使该哺乳动物对所述的多肽产生耐受之后进行。这可随所治疗的病人、所投递的多肽和所期望的疗效而变化。适当的时间进程以及在后向CNS给予的次数由主治医生决定。为确定哺乳动物是否对多肽耐受，可用所述的多肽攻毒(challenge)该哺乳动物来确定上述攻毒是否产生抗该多肽的免疫应答。免疫应答可通过在攻毒后测定抗该多肽的抗体滴度来确定。当与适当的对照相比时，攻毒后降低的或不显著的抗体滴度可能表明耐受状态。在哺乳动物中测定和产生抗体应答，用抗原或免疫原攻毒哺乳动物以及确定抗体滴度的方法是本领域熟知的。该哺乳动物产生耐受的适当时间也可通过确定在受试者中产生所述耐受的有效表达时间来选择。然后所选定的时间可应用于本方法，而不必分别测试每个患者。

在一个实施方案中，后一病毒载体向CNS的给予在投递到肝的病毒载体编码的多肽的表达检测到之后进行。多肽表达的检测可通过任何本领域已知的方法完成，该方法的例子包括但不限于分子的(通过检测mRNA)或免疫的(通过检测蛋白表达)或生物化学的(通过检测多肽活性，如酶活性，如果存在这样的活性的话)。

替代地，后一次给予可在第一次给予的数小时或数天或数星期之后。多次CNS给予到多CNS位点的用途也在本发明的范围内。

因而，在本发明的一个具体方面，提供使哺乳动物脑对酸性鞘磷脂酶多肽耐受的方法。该方法在向哺乳动物中枢神经系统组织(CNS)给予有效量的编码多肽的转基因之前向该哺乳动物的肝给予有效量的编码该多肽的转基因。

在本发明的另一个特别方面，提供改善患有NPA的哺乳动物的A型尼曼-皮克病(NPA)相关症状的方法。该方法需要向该哺乳动物的中枢神经系统(CNS)给予有效量的编码酸性鞘磷脂酶多肽的转基因，其中所述的给予在向该哺乳动物的肝组织全身性给予有效量的该转基因之后，从而在所述的CNS给予之前，哺乳动物产生对该多肽抗原特异性免疫应答的能力被消除或显著降低了。

在另一方面，本发明提供改善患有NPA的哺乳动物的A型尼曼-皮克病(NPA)相关症状的方法。所述的症状包括但不限于体重减轻或恶病质、运动功能丧失、认知功能丧失和过早死亡。该方法需要向哺乳动物的肝组织给予有效量的包含编码酸性鞘磷酯酶多肽转基因的病毒载体，然后向哺乳动物的CNS给予有效量的包含该转基因的病毒载体。在另一个实施方案中，投递所述病毒载体的CNS区域为脑。

仍是在另一方面中，本发明提供治疗患有NPA的哺乳动物的A型尼曼-皮克病(NPA)的方法，该方法通过向哺乳动物的肝组织给予有效量的包含编码酸性鞘磷脂酶多肽的转基因的AAV病毒载体，然后向该哺乳动物的CNS投递有效量的包含编码酸性鞘磷脂酶多肽的转基因的AAV载体，由此治疗该哺乳动物的NPA。在另一个实施方案中，投递所述病毒载体的CNS区域为脑。

此处所用的术语“治疗(treating)”、“治疗(treatment)”等意思为获得所需的治疗的、药理学的和/或生理的效果。所述的效果从完全或部分预防疾病或其病征或症状来说，可以是预防的效果，和/或从部分或完全治疗病症和/或由该病症导致的有害作用来说，可以是治疗的效果。

“治疗”也覆盖对任何哺乳动物病症的处理，包括：预防倾向于患病症但尚未诊断确定患有该病症的受试者病症的发生，例如，对疾病的遗传标签检测呈阳性的患者；抑制病症，即阻止其进展；或减轻或改善病症，例如引起病症的消退，该病症例如NPA病。

此处所用的“治疗”进一步包括全身性改善与病变相关的症状和/或延缓症状的发病(onset)。“治疗”的临床和亚临床证据随病变、个体和治疗而变化。

在一些实施方案中，本方法包括给予携带有预先选定的免疫原或转基因的AAV载体，从而转基因产物在选定的位点以治疗水平表达。在一些实施方案中，组合物的病毒滴度至少：(a)1.5、2.0、2.25、2.5、2.75、3.0、3.25、3.5、4.0、4.55、6、7、8、8.4、9、9.3、10、15、20、25或50(每次注射×10¹¹基因组拷贝(gc)；(b)1.5、2.0、2.25、2.5、2.75、3.0、3.25、3.5、4.0、4.5、5、6、7、8、8.4、9、9.3、10、15、20、25或50(×10⁹tu/ml)；或(c)1.5、2.0、2.25、2.5、2.75、3.0、3.25、3.5、4.0、4.5、5、6、7、8、8.4、9、9.3、10、15、20、25、或50(×10¹⁰感染单位[iu]/ml).

颅内给药可在脑的任何区，在给予多于一个颅内投递时可包括多个区。这样的位点包括，例如脑干(延髓和脑桥)、中脑泡、中脑、小脑(包括小脑深部核团)、间脑(丘脑、下丘脑)、端脑(纹状体、中脑、大脑皮质，或皮质内枕、颞、顶或额叶)。颅内注射位点的具体例子示于图1。

对于人脑结构的鉴定，参见例如The Human Brain:Surface,Three-DimensionalSectional Anatomy With MRI,and Blood Supply,2nd ed.,eds.Deuteron et al.,Springer Vela,1999；Atlas of the Human Brain,eds.Mai et al.,Academic Press；1997；和Co-Planar Sterotaxic Atlas of the Human Brain:3-DimensionalProportional System:An Approach to Cerebral Imaging,eds.Tamarack et al.,ThymeMedical Pub.,1988。对于鼠脑结构的鉴定，参见例如The Mouse Brain in SterotaxicCoordinates,2nd ed.,Academic Press,2000。假如需要，能将人类大脑结构和其他哺乳动物的大脑的相似结构联系起来。例如，大多数哺乳动物，包括人类和啮齿类，显示了相似的内嗅区-海马体投射的组织结构(topographical organization)，具有投射至海马体背侧或者中隔的内嗅皮层外侧和内侧中的神经元，而至海马体腹侧的投射神经元主要从内嗅皮层内侧部中的神经元起源(Principles of Neural Science,4th ed.,eds Kandel etal.,McGraw-Hill,1991；The Rat Nervous System,2nd ed.,ed.Paxinos,AcademicPress,1995)。此外，内嗅皮层中的第二层细胞投射至齿状回，终止于齿状回分子层外三分之二处。来源于第三层细胞的轴突两侧投射至海马体的CA1和CA3海马角区域，终止于多孔层(stratum lacunose)分子层。

为将载体特异性投递到中枢神经系统的特定区，特别是脑的特定区，可通过立体定位微注射给药(sterotaxic microinjection)。例如，手术当天，安装好患者的立体定位架(旋拧入头盖骨)。使用高分辨率的核磁共振对带有立体定位架(MRI相匹配的可信标签)的脑部成像。核磁共振图像传送到运行立体定位软件的电脑。使用一系列冠状、矢状和轴向图像确定载体注射的靶位和轨迹。这个软件能直接将轨迹转换成与立体定位架相匹配的三维形式。在进入部位上方钻孔(burr hole)，立体定位仪用植入在设定深度的针定位。然后，注入在药学可接受的载体中的载体。然后，AAV载体就通过直接注射到主要靶位点给予并通过轴突逆行运输到末梢靶位点。也可能使用额外的给药途径，例如可直接目视下的皮质表层给药方式，或其他非立体定位应用。

将要给予的物质的总量，和将要给予的载体颗粒数由本领域技术人员根据基因治疗的已知方面确定。治疗的有效性和安全性可在适当的动物模型中测试。例如，各种现有的被详细描述的LSD动物模型，例如如此处所描述的或在Watson et al.(2001)MethodsMol.Med.,76:383-403；或Jeyakumar et al.(2002)Neuropath.Appl.Neurobiol.,28:343-357；或Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease,8th edition(2001),McGraw-Hill出版的中描述的。

在实验小鼠中，所注射的AAV溶液的总体积为，例如每个注射位点1至5μl之间或约3μl，或替代地在10至400μl之间，或替代地在100至400μl之间，或替代地在150至250μl之间，或替代地约200μl。对于其他哺乳动物，包括人脑，体积和投递速率是适当成比例的。例如，已证明150μl的体积可安全地注入灵长类动物的脑(Janson et al.(2002)Hum.GeneTher.,13:1391-1412)。治疗可以由每个靶位点单次注射组成，也可以沿注射道重复进行，如果需要的话。可以使用多个注射靶位。例如，在一些实施方案中，除了第一个给药靶位之外，包含携带转基因的AAV的组合物可给药到第一个靶位对侧或者同侧的另一个靶位。

在本发明的方法中，任何血清型的AAV都可使用。在本发明的一个实施方案中，可以使用能够进行逆行轴突运输的AAV载体。病毒载体的血清型可选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7或AAV8(参见例如Gao et al.(2002)PNAS,99:11854-11859；和ViralVectors for Gene Therapy:Methods and Protocols,ed.Machida,Humana Press,2003)。除了列于此处的之外，其他血清型也可使用。也可使用伪型AAV载体(Pseudotyped AAVvectors)，其为那些在第二个AAV血清型的衣壳中包含一种AAV血清型的ITR的；例如，含有AAV2衣壳和AAV1基因组的AAV病毒载体或含有AAV5衣壳和AAV2基因组的AAV载体。(Auricchio et al.(2001)Hum.Mol.Genet,10(26):3075-81。)

AAV载体来源于对哺乳动物非致病的单链(ss)DNA细小病毒(DNA parvoviruse)(综述见Muzyscka(1992)Curr.Top.Microb.Immunol.,158:97-129)。简言之，基于AAV的载体将占病毒基因组96％的rep和cap病毒基因去除，留下两个145碱基对(bp)的侧翼末端反向重复(inverted terminal repeat，ITR)，其用于起始病毒DNA复制、包装和整合。在无辅助病毒时，野生型AAV整合入在染色体19q 13.3具有优选位点特异性的人宿主细胞基因组中，或可以以附加体的形式保持表达。单个AAV颗粒可装入达到5kb的ssDNA，因而留下约4.5kb给转基因和调节元件，这一般是足够的。然而，例如美国专利6,544,785号中所描述的反式剪接系统(trans-splicing system)可几乎使这一界限加倍。

在一个示例性实施方案中，AAV为AAV2或AAV8。许多血清型的腺伴随病毒，如AAV2，作为基因治疗的载体已被广泛研究和描述。本领域技术人员熟悉基于AAV的功能性基因治疗载体的制备。在广泛的已发表的文献中，可找到为数众多的有关给予人受试者的AAV生产、纯化和制备的不同方法的参考文献(参见，例如Viral Vectors for Gene Therapy:Methods and Protocols,ed.Machida,Humana Press,2003)。另外，美国专利6,180,613和6,503,888已经描述了以CNS细胞为靶标的基于AAV的基因治疗。

真核细胞中转基因的表达水平可被该转基因表达盒内的转录启动子和/或一个或多个增强子调节。组织特异性启动子，如肝特异性启动子，可用于一些实施方案中。组织特异性增强子，如肝特异性增强子，可用于一些实施方案中。组织特异性启动子和组织特异性增强子，如肝特异性启动子和增强子，可联合用于本发明的实施。

启动子的非限制性例子包括但不限于巨细胞病毒(CMV)启动子(Kaplitt et al.(1994)Nat.Genet.8:148-154)、CMV/人β3珠蛋白启动子(Mandel et al.(1998)J.Neurosci.18:4271-4284)、GFAP启动子(Xu et al.(2001)Gene Ther,8:1323-1332)、1.8-kb神经元特异性烯醇化酶(NSE)启动子(Klein et al.(1998)Exp.Neurol.150:183-194)、鸡β肌动蛋白(CBA)启动子(Miyazaki(1989)Gene 79:269-277)和β-葡糖醛酸酶(GUSB)启动子(Shipley et al.(1991)Genetics 10:1009-1018),人血清白蛋白启动子，α-1-抗胰蛋白酶启动子。为改善表达，其他调节元件可额外地可操作地连接到该转基因，例如旱獭肝炎病毒调控后元件(the Woodchuck Hepatitis Virus Post-Regulatory Element，WPRE)(Donello et al.(1998)J.Virol.72:5085-5092)或牛生长激素(BGH)多腺苷酸化位点。

适合本发明的其他启动子可以是任何能够促进相关的编码DNA序列在肝中表达的强组成型启动子。所述的强组成型启动子包括人和鼠巨细胞病毒启动子、截短的CMV启动子、人血清白蛋白启动子[HSA]和α-1-抗胰蛋白酶启动子。

对本发明有用的肝特异性增强子元件可以是任何能够增强相关的编码DNA序列在肝中组织特异性表达的肝特异性增强子。所述的肝特异性增强子包括一个或更多人血清白蛋白增强子(HSA)、人凝血酶原增强子(HPrT)、α-1微球蛋白增强子(A1MB)和内含子醛缩酶增强子。为获得更高表达可联合多个增强子元件。例如，两个相同的增强子可与肝特异性启动子联用。

包含下述启动子/增强子联合的病毒载体可用于本发明的实施：一个或更多个HSA增强子联合CMV启动子或HSA启动子；一个或更多个选自人凝血酶原(HprT)增强子或α-1微球蛋白A1MB增强子的增强子)联合CMV启动子；以及一个或更多个选自HprT增强子或A1MB增强子的增强子元件联合α-1-抗胰蛋白酶启动子。

已出版的PCT申请WO 01/36620公开了关于肝特异性构建体的其他信息。可替代地，神经元特异性启动子和/或增强子对于在CNS中定向投递和表达转基因有用。

在一些方面，控制转录活性是合乎需要的。为此，可通过包含不同的调节元件和药物应答启动子获得使用AAV载体的基因表达的药学调节，如例如在Habermaet al.(1998)Gene Ther.,5:1604-16011；和Ye et al.(1995)Science 283:88-91中描述的。

AAV制剂可通过本领域已知的技术生产，如例如在美国专利5,658,776和ViralVectors for Gene Therapy:Methods and Protocols,ed.Machida,Humana Press,2003中描述的。

在某些方面，检测和/或该转基因的表达水平可能是合乎需要的。检测基因表达的方法是本领域已知的，可通过如下讨论简单的使用，或由本领域技术人员进行修改。

已知很多定量所需基因表达的方法，包括但不限于杂交检测(Northern印迹分析)和基于PCR的杂交检测。

在检测mRNA水平的改变中，首先根据本领域的标准方法从含有该核酸的样品中提取该核酸。例如，mRNA可使用根据上述Sambrook等人(1989)的不同裂解酶或化学溶液分离或通过核酸结合树脂根据制造商提供的相应说明书提取。

含有至少10个核苷酸并表现出与表达产物序列互补或同源性的核酸分子可用作杂交探针或PCR引物。本领域已知特异性杂交不需要“完全匹配”的探针。通过少量数目碱基的替换、删除或插入对探针序列的小的改变不影响杂交特异性。一般来说，可耐受达到20％的碱基对错配(在最优比对时)。例如，用于检测mRNA的探针与包含在以前鉴定的序列，例如ASM序列中的可比大小的同源区至少约80％相同。可替代地，该探针与同源区比对后的相应基因序列至少85％或甚至至少90％相同。片段的总大小和所延伸的互补区大小取决于该特定核酸区段的期望用途或应用。基因的较小片段一般用于杂交实施例中，其中互补区的长度可变，如在约10和约100核苷酸之间，或甚至达到根据所想检测的互补序列的全长。

与大于约10个核苷酸长度的延伸片段(stretch)有互补序列的核酸探针将增加杂交体的稳定性和选择性，从而改善所获得的特定杂交分子的特异性。可设计具有多于约25，甚至优选地多于约50个核苷酸长度，或如果需要甚至更长的基因互补片段的核酸分子。可通过如化学手段直接合成该片段，通过使用核酸复制技术如美国专利4,603,102描述的有两个引发寡核苷酸的PCR^TM技术，或通过将选定的序列引入用于重组生产的重组载体的方法容易地制备所述的片段。

在一些实施方案中，使用本发明的核酸序列联合适当的方法如标签来检测杂交和互补序列是有利的。本领域已知多种适当的指示方法，包括荧光的、放射性的、酶的或其他的配体，如抗生物素蛋白/生物素，其能够给出可检测的信号。也可使用荧光标签或酶标签，如脲酶、碱性磷酸酶或过氧化物酶，而不是放射性或其他不利于环境的试剂。在使用酶标签的情况下，能用于提供人眼可见的或分光光度法的方式来鉴定同含有互补核酸的样品特异性杂交的比色指示剂底物是已知的。

杂交反应可在不同“严谨性”的条件下进行。相关的条件包括温度、离子强度、保温时间、反应混合物中其他溶质如甲酰胺的存在和洗涤过程。较高的严谨条件是指如较高温度和较低钠盐浓度的条件，其需要杂交元件间较高的最低互补性以形成稳定的杂交复合物。增加杂交反应严谨性的条件是本领域熟知的并且出版的。见上述Sambrook,等人(1989)。

也可使用定量PCR或高通量分析如基因表达系列分析(SAGE)来检测和定量mRNA水平或其表达，如在Velculescu,V.et al.(1995)Science 270:484-487中描述的。简而言之，该方法包括从怀疑含有该转录本的细胞或组织样本分离多种mRNA。可选地，该基因转录本可转换为cDNA。基因转录本的取样进行序列特异性分析和定量。将这些基因转录本序列丰度与包含病人和健康者标准数据组的参考数据库序列丰度相比较。

使用本领域已知的方法探针也可附着于用于高通量筛选检测中的固相支持物上。例如，国际PCT申请WO 97/10365和美国专利号5,405,783、5,412,087和5,445,934披露了可含有一种或更多种序列的高密度寡核苷酸芯片的构建。该芯片可使用美国专利5,405,783、5,412,087和5,445,934中披露的方法在衍生化的玻璃表面合成。光保护核苷亚磷酰胺可耦联到玻璃表面，通过光刻用掩膜的光解进行选择性去保护，并与第二个受保护的核苷亚磷酰胺反应。重复耦联/去保护过程直至完成所需的探针。

基因的表达水平可通过将怀疑含有该多核苷酸的样品暴露于探针修饰的芯片上来确定。提取的核酸通过例如荧光标签，优选地在扩增步骤中标记。标记的样品的杂交在适当的严谨水平下进行。探针-核酸杂交的程度使用检测装置如共聚焦显微镜定量测定。见美国专利5,578,832和5,631,734。获得的测定与基因表达水平直接相关。

杂交探针与样品核酸可通过本领域已知的多种方法检测。例如，杂交核酸可通过检测附着于样品核酸的一个或更多个标签来检测。该标签可通过任何本领域技术人员已知的方式并入。在一个方面，该标签在制备样品核酸的扩增步骤中同时并入。因而，例如使用标记的引物或标记的核苷酸的聚合酶链反应(PCR)将提供标记的扩增产物。在一个单独的实施方案中，使用标记的核苷酸(例如，荧光素标记的UTP和/或CTP)的如上所述的转录扩增将标签并入所转录的核酸。

可替代地，标签可直接加入原始样品核酸(例如mRNA、polyA、mRNA、cDNA等)中或在扩增完成后加入扩增产物中。将标签附着于核酸的方式对本领域技术人员是已知的，包括例如通过核酸的磷酸化(kinasing)反应和随后的核酸接头的附着(连接)将样品核酸与标签(例如荧光基团)连接的切口翻译法或末端标签(例如使用标记的RNA)法。

适合用于本发明的可检测的标签包括可通过光谱的、光化学的、生物化学的、免疫化学的、电的、光的或化学的手段检测的任何组合物。本发明中有用的标签包括用于用标记的抗生蛋白链菌素结合物染色的生物素、磁珠(例如Dynabeads^TM)、荧光染料(例如荧光素、德克萨斯红、罗丹明、绿色荧光蛋白之类)、放射性标签(例如³H、¹²⁵I、³⁵S、¹⁴C或³²P)、酶(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和其他ELISA中常用的酶)和比色标签如胶体金或有色玻璃或塑料(例如聚苯乙烯、聚丙烯、胶乳等)珠。教导使用上述标签的专利包括美国专利3,817,837、3,850,752、3,939,350、3,996,345、4,277,437、4,275,149和4,366,241。

检测上述标签的方法是本领域技术人员已知的。因此，例如放射性标签可通过使用照相胶片或闪烁计数器检测，荧光标记可使用光检测器检测发射光来检测。酶标签典型地通过给该酶提供底物并检测酶对该底物作用产生的反应产物来检测，比色标签通过简单地使该有色标签显现检测。

专利公布WO 97/10365公开了在杂交前或可替代地在杂交后将标签添加到一种或更多种靶(样品)核酸的方法。这些是在杂交前直接附着或并入靶(样品)核酸的可检测的标签。相反，“间接标签”在杂交后结合到杂交双链中。间接标签常常附着于在杂交前已经附着于靶核酸上的结合部分。因此，例如靶核酸可在杂交前生物素化。杂交后，抗生物素蛋白结合的荧光团将结合到带有生物素的杂交双链提供易于检测的标签。关于标记核酸分子和检测标记的杂交核酸分子的方法的详细综述，见Laboratory Techniques in Biochemistryand Molecular Biology,Vol.24:Hybridization with Nucleic Acid Probes,P.Tijssen,ed.Elsevier,N.Y.(1993)。

在杂交到高密度探针阵列前可使用国际PCT申请WO 97/10365中所披露的方法修饰核酸样品以降低样品复杂性从而降低背景信号并改善测量的敏感性。

芯片检测的结果典型地使用计算机软件程序分析。参见例如EP 0717 113 A2和WO95/20681。杂交数据读入程序，该程序计算靶基因的表达水平。该数字同已有的患病和健康个体的基因表达水平数据组相比较。所获数据与一组患病个体的数据之间相关表明受试者发病。

也可修改已有的免疫测定法来检测和定量表达。基因产物的确定需要测量该基因产物反应性抗体间发生的免疫特异性结合的量。为检测和定量免疫特异性结合或杂交或扩增过程中产生的信号，可使用包括但不限于检测探针放射性或化学发光基团的数字图像分析系统。

多肽产物的表达也可通过使用用于所表达的特定多肽的本领域已知的生物化学手段检测。

下述实施例提供本发明的示例性实施方案。本领域普通技术人员将认识到可实施的不改变本发明精神或范围的无数修饰和变化形式。这些修饰和变化形式涵盖于本发明的范围内。实施例不以任何方式限制本发明。

实施例

重组载体的滴定

AAV载体滴度可根据基因组拷贝数(每毫升的基因组颗粒)来测定。如以前报道的，基因组颗粒浓度以载体DNA的PCR为基础(Clark et al.(1999)Hum.GeneTher.10:1031-1039；Veldwijk et al.(2002)Mol.Ther.6:272-278)。简而言之，AAV载体用DNAse溶液处理以除去可能干扰病毒DNA精确测量的任何污染DNA。然后AAV载体用衣壳消化缓冲液(50mM Tris-HCl pH 8.0、1.0mM EDTA、0.5％SDS、1.0mg/ml蛋白酶K)在50℃处理1小时以释放载体DNA。DNA样品用与载体DNA中特异性序列如启动子区、转基因或多腺苷酸(poly A)序列退火的引物进行聚合酶链反应(PCR)。然后PCR结果通过如Perkin Elmer-Applied Biosystems(Foster City,CA)Prism 7700序列检测系统(Sequence DetectorSystem)提供的实时软件定量。

携带有如β-半乳糖苷酶或绿色荧光蛋白基因(GFP)的可测定标记基因的载体可通过感染性测定(infectivity assay)来滴定。易感细胞(例如HeLa或COS细胞)用AAV转导并进行测定以确定基因表达，如用X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷)染色β-半乳糖苷酶载体转导的细胞或对于转导GFP的细胞用荧光显微镜。例如，该测定如下述进行：4×10⁴HeLa细胞铺于使用标准生长培养基的24-孔培养板中的每个孔。贴壁后，即约24小时后，细胞用Ad 5以10的感染复数(MOI)感染，用系列稀释的包装载体转导并在37℃培养。一至三天后，在观察到广泛的细胞病变效应之前，对细胞进行适当的测定(例如X-gal染色或荧光显微镜)。如果使用了报告基因如β-半乳糖苷酶，细胞用2％的多聚甲醛、0.5％的戊二醛固定并用X-gal染色以测定β-半乳糖苷酶活性。计数产生良好分离的细胞的载体稀释。每个阳性细胞代表载体的1个转导单位(tu)。

全长人ASM cDNA克隆到含有来自AAV血清型2和8的ITR的质粒中。Jin et al.(2002)J Clin Invest.109:1183-1191。AAV8-hASM含有血清型2-末端反向重复(ITRS)和DC-190肝限制性启动子控制下的人酸性鞘磷脂酶(hASM)cDNA。[Ziegler et al.(2004)Mol.Ther.9:231-240]。AAV2-hASM含有血清型2-末端反向重复(ITRS)和CMV增强子和鸡β-肌动蛋白启动子控制下的人酸性鞘磷脂酶(hASM)cDNA。两个重组载体都通过三质粒共转染人293细胞产生并通过柱纯化。AAV8-hASM和AAV2-hASM制剂的最终滴度为5.0×10¹²基因组拷贝(gc)每ml，如通过每个载体都含有的牛生长激素多腺苷酸化信号序列的TaqMan PCR所确定的。

杂交载体可通过使用一系列的除了含有AAV血清型复制基因外还含有血清型特异性衣壳编码结构域的辅助质粒进行三重转染产生。该策略允许AAV ITR载体包装入每个血清型特异性的病毒颗粒中。Rabinowitz,et al.(2002)J Virol.76:791-801。通过这种方法hASM重组基因组可用于产生一系列伪型rAAV-hASM载体。重组AAV载体可通过离子交换层析纯化。O'Riordan,et al.(2000)J Gene Med 2:444-54。重组AAV载体也可通过CsCl离心纯化Rabinowitz et al.(2002)J.Urrol.76:791-801。AAV-ASM病毒体颗粒(抗DNAse颗粒)的最终滴度可通过CMV序列的TaqMan PCR确定。Clark et al.(1999)Hum.Gene Therapy 10:1031-1039。

ASMKO小鼠中脑和全身性的联合基因治疗

酸性鞘磷脂酶缺陷小鼠(ASMKO)，K.Horinouchi et al,Nat Genet.10(1995),pp.288-292,进行下述处理：

组1)小鼠在4周龄通过尾静脉注射3e11gc的含有两个HPrT增强子、人血清白蛋白启动子和人ASM转基因的AAV2/8载体；

组2)小鼠在6周龄通过在脑中的8个位点间的脑注射缝(split)注射含有增强子、启动子和人ASM转基因的2e11gc；

组3)小鼠在4周龄通过尾静脉注射3e11gc的含有两个HPrT增强子、人血清白蛋白启动子和人ASM转基因的AAV2/8载体，两周后相同小鼠通过在脑中的8个位点间的脑注射缝注射2e11gc的含有增强子、启动子和人ASM转基因的AAV2载体；以及

组4)小鼠不接受注射或接受仅有载体的假注射。

组5)非ASMKO小鼠或野生型小鼠不接受注射。

向所有进行立体定位外科手术的ASMKO小鼠脑的8个区每位点注射3μl AAV2-hASM(1.5e10gc)，总量为每脑24μl(1.2e11gc)。右半球的注射位点为下丘脑(-0.50、-1.00mm、-3.50mm)、海马(-2.00mm、-1.75mm、-1.75mm)、延髓(-6.00mm、-1.50mm、-3.75mm)和小脑(-6.00mm、-1.50mm、-2.25mm)；左半球注射的位点为纹状体(0.50mm、1.75mm、-2.75mm)、运动皮层(0.50mm、1.75mm、-1.25mm)、中脑(-4.50mm、1.00mm、-3.50mm)和小脑(-6.00mm、1.50mm、-2.25mm)。注射用Hamilton注射器(Hamilton USA,Reno,NV)以0.5μl/min的速率进行，每次注射后针留在原位2分钟以使在拔出针时病毒溶液的上流最小。

所有未处理的ASMKO小鼠以及仅进行脑注射AAV2(AAV2 brain-)和仅进行全身性注射AAV8(AAV 8systemic-alone)组的ASMKO小鼠最终都处于垂死状态。相反，通过脑和全身联合注射处理的ASMKO小鼠未达到垂死状态，但为做对比分析仍然在54周时处死。对动物进行广泛灌注以除去所有血液并分成生物化学组(cohort)和组织学组(cohort)。在生物化学组中，肝、肺、脾和骨骼肌切成两片；一片用于分析hASM水平，另一份用于分析鞘磷脂贮积。在脑中，左右半球分开，每个半球沿A-P轴进一步切成五个2mm的片。左半球的片进行hASM蛋白和抗hASM分析。

酸性鞘磷脂酶(ASM)血清水平和抗ASM血清抗体水平在整个研究中都进行测量。在整个研究过程中对小鼠进行多种测试：体重评价、加速滚轮测试、摇摆滚轮测试和Barnes迷宫测试。在整个实验过程中也收集了存活率曲线数据。小鼠死亡后，收集组织，测量每个小鼠的脑、肝、肺、脾和肌肉组织中的鞘磷脂水平。脑和肝中人ASM蛋白表达也通过使用免疫组化定性评价。研究在54周终止；所有组3(联合注射组，combo)小鼠在研究终止时都存活并且健康。

酸性鞘磷脂酶血清水平通过使用特异性抗该人类酶的多克隆抗体的酶联免疫吸附测定(ELISA)进行定量。图7A-7E图示了随时间的血清ASM蛋白水平。小鼠死亡时脑和肝中ASM也通过免疫组化测定。在组2和组3小鼠的脑中观察到阳性ASM染色，在组3的小鼠中观察到定性的更亮的染色。在纹状体、海马、中脑和小脑中观察到染色。在组1小鼠或未处理ASMKO小鼠的脑中没观察到ASM染色。在组1和组3小鼠的肝中观察到阳性ASM染色。在组2小鼠或未处理ASMKO小鼠的肝中没观察到ASM染色。

组织鞘磷脂水平定量方法如下：通过在氯仿:甲醇(1:2)中匀浆10至50mg组织制备组织提取物并在37℃孵育1小时。通过离心去除细胞碎片后，使用水提取匀浆两次，有机相(含有该脂质)转移到干净的玻璃管中然后在37℃加热通氮干燥。提取物中的鞘磷脂量通过使用Amplex Red鞘磷脂酶测定试剂盒(Molecular Probes)间接测量。提取物用固定量的来自蜡样芽胞杆菌的外源细菌鞘磷脂酶(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)在Amplex Red工作站中处理。鞘磷脂被细菌的酶水解以产生神经酰胺和磷酰胆碱。后者进一步水解成胆碱，胆碱依次氧化产生甜菜碱和过氧化氢。释放的过氧化氢通过与Amplex Red反应以产生高荧光性的能通过590nm处荧光发射检测的试卤灵来定量。正常C57BL/6小鼠组织中鞘磷脂水平约为鼠龄匹配的ASMKO小鼠中观察值的5-10％。图8A-8F和图9A-9D图示了脑和内脏器官中鞘磷脂水平。

血清中抗人酸性鞘磷脂酶特异性抗体水平通过ELISA测量。见图7E。将系列稀释血清加入到覆盖有酶或热灭活AAV颗粒的96孔板的孔中。结合的抗体通过使用辣根过氧化物酶结合的羊抗鼠免疫球蛋白G(IgG)、IgM和IgA(Zymed,San Francisco,CA,USA)检测。板和底物(Sigma-Aldrich)一起室温培养20分钟以显色。滴度定义为产生OD450等于或低于0.1的最高稀释血清的倒数。图7A至7D图示了处理和未处理小鼠的循环中的抗hASM抗体水平。

脑实质中的抗体通过如下修改的测定法来测量。组织裂解液在抗体稀释缓冲液中1:20稀释，一式两份加入到覆盖有100ng hASM的96孔板中。第二抗体HRP的结合和生色底物反应按前述方法进行。结合的hASM特异性抗体浓度应与来自结合物的HRP反应的颜色强度直接相关。因此，最终的结果报告为1:20裂解稀释液产生的OD450的绝对变化以提供与血清中使用的滴定法相比更敏感的抗体水平测定。

使用以1:200稀释的抗hASM生物素化单克隆抗体分析脑切片hASM表达，用抗生蛋白链菌素-Cy3-结合的第二抗体在红色荧光下显影[Passini,M.A.et al.(2005).Mol.Ther.11:754-762]。脑中胆固醇底物通过使用非律平(filipin)染色方案检测，如所报告的那样[Passini,M.A.et al.(2005).Mol.Ther.11:754-762]。简而言之，非律平(Sigma,St Louis,MO)溶解在100％甲醇中至10mg/ml的工作浓度。脑切片在暗中室温(RT)下孵育3h，然后RT下用PBS洗涤三次，在蓝色荧光下检查。进行Lysenin染色以确定鞘磷脂底物原位模式，如所报告的那样[Shihabuddin,L.S.et al.(2004).J.Neurosci.24:10642-10651]。简而言之，lysenin(Peptides International,Louisville,Kentucky)溶解在含有0.5％BSA、0.02％皂角甙(Sigma)和5％标准驴血清的PBS中至10mg/ml。脑切片与lysenin在4℃孵育过夜，然后过夜孵育1:250稀释的兔抗lysenin抗体(Peptides International)。Lysenin阳性细胞用1:250稀释的FITC抗兔抗体(Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA)显影并用绿色荧光检查。

每个小鼠通过使用本领域已知的方法在Smartrod(AccuScan)上进行加速和摇摆滚轮测试来测试运动功能，该方法在Sleat et al.(2004)J.Neurosci.24:9117-9126中进行了重复。小鼠通过使用Smartrod Rotorod Program(AccuScan Instruments,Columbus,OH)进行加速和摇摆滚轮测试来评价运动功能。加速滚轮上滚轮转动的速度进行了程序设定以在60秒从0-30rpm以恒定比率加速，摇摆滚轮进行程序设定以在54秒每2.5秒向前向后加速至最终速度25rpm。每只动物在每个时间点上进行四次试验，记录从平台上落下的停留时间(latency)。高的停留时间得分等于良好的表现。单个试验至少间隔15min以使动物有休息期。图3和4图示了作为测量运动功能恢复的滚轮测试的结果。

每个小鼠进行Barnes迷宫测试。对小鼠进行训练，使之找到藏在位于大的扁平塑料盘周边的20个洞穴中其中一个之下的暗隧道，塑料盘通过四个在上的卤素灯照亮。通过迷宫以找到正确的暗洞穴的时间与认知功能负相关——更短的通过时间表明更好的认知功能。图5图示了作为测量认知功能恢复的Barnes迷宫测试(Barnes Maze test)的结果。

存活曲线图示于图6。

以解决(addressing)ASMKO小鼠的功能异常和疾病后遗症对以脑和内脏两个为靶标的AAVhASM联合注射方案进行了评价。在联合组中(n＝11)，四周龄ASMKO小鼠通过尾静脉注射接受3.0×10¹¹基因组拷贝(gc)的AAV8-hASM。两周后，在6周龄，同样的小鼠注射AAV2-hASM至左半球的运动皮层、纹状体、中脑和小脑，以及到右半球的下丘脑、海马、延髓和小脑。每个结构注射1.5×10¹⁰gc，每脑的总量1.2×10¹¹gc。处理对照组在4周龄仅接受全身性注射AAV8-hASM(n＝12)或在6周龄仅接受脑注射AAV2-hASM(n＝14)，未处理对照组包括ASMKO(n＝23)和野生型(n＝10)小鼠。

进行定期眼采血以测量循环中hASM水平和抗hASM抗体水平。对仅进行全身性注射和联合注射处理的ASMKO小鼠血清的分析显示了最高的循环的hASM水平。因为该病毒血清型的趋向性和在设计表达盒时选定的肝限制性启动子(DC190)，AAV8-hASM转导和随后的表达主要为肝介导的。两组在注射后2周均达到hASM的峰值水平，其随后在本研究期间降低达10倍。来自未处理ASMKO和仅进行脑注射AAV2的组的血清中没有显示可检测的hASM水平。进一步的血清分析表明通过联合或仅进行全身性注射AAV8处理的小鼠中抗hASM抗体水平与未处理ASMKO小鼠中观察到的低基线水平相似。相反，仅进行脑注射AAV2的组的小鼠表现出快速强烈(200倍增加)的抗hASM抗体滴度的诱导。因而，全身性注射AAV8-hASM处理的小鼠看来好像对表达的hASM产生了免疫耐受。

联合或仅进行全身性注射AAV8处理的小鼠肝、肺、脾和肌肉中明显有高水平的该酶，推测起来是在循环中的该酶在6-磷酸甘露糖受体介导的胞吞作用后。仅进行脑注射AAV2的组的内脏器官中人ASM水平与未处理ASMKO对照小鼠中观察到的相比没有显著提高。对联合和仅进行脑注射AAV2的组的脑的分析显示高水平的hASM遍及轴索。然而，尽管在两个组中都使用了了相同的重组AAV2载体，与仅进行脑处理的组相比，联合组显示出显著更高的hASM水平。仅进行全身性注射处理的小鼠脑中hASM水平低并处于可与未处理ASMKO小鼠可类比的水平。这表明循环中来自于肝的hASM不能跨过血脑屏障进入CNS。有趣的是，脑匀浆中抗hASM抗体滴度在仅进行脑注射AAV2的组中比其他组包括联合组高约10倍。因而，脑中表达水平是抗体滴度的倒数(reciprocal)；联合组显示高水平的hASM和低水平的抗hASM抗体，而仅进行脑注射AAV2的组显示低水平的hASM和高水平的抗hASM抗体水平。

确定了hASM表达对于纠正ASMKO小鼠内脏和脑中贮积病变的效果。在所有检查的来源于仅进行全身性注射AAV8和联合组的内脏组织中，完全纠正了鞘磷脂贮积。相反，仅接受脑注射的动物内脏中含有高水平的鞘磷脂，这与未处理的ASMKO小鼠类似。对通过联合注射处理的ASMKO小鼠脑中鞘磷脂水平的分析显示该底物普遍降低到野生型水平。这对于仅进行脑注射AAV2的组来说的是一个改善，其仅在注射位点相应的脑块显示出显著的鞘磷脂降低。因此，仅进行脑注射的组的纠正范围显著小于并从未达到联合组中所观察到的效果。仅进行脑注射AAV2的组中较低效的鞘磷脂贮积减少与在该组中观察到的较低水平的酶相关。在仅进行全身性注射AAV8的组中观察到高水平的脑鞘磷脂，其与未处理的ASMKO相似。

对脑切片也进行hASM表达以及原位鞘磷脂和胆固醇贮积的组织学分析。hASM表达模式和鞘磷脂贮积的清除模式在仅进行脑注射AAV2的组中互相重叠。相反，接受联合治疗的动物中鞘磷脂贮积的纠正扩展到远超过注射位点之外。这导致了病变逆转的模式与联合治疗的转导区域相比既有重叠又有非重叠的模式。使用胆固醇标记非律平也观察到这种关系。联合组中大量脑区清除了胆固醇贮积，而仅进行脑注射AAV2的组中仅观察到局部的和更有限的胆固醇清除。因此，联合注射处理的小鼠与仅接受脑注射处理的小鼠相比，hASM从注射位点扩散以纠正脑远侧区贮积病变的能力显著性的更好。仅进行全身性注射AAV8的组未显示任何可测量的脑中鞘磷脂或胆固醇贮积的纠正，这一点从上述生物化学数据可以预测到。

从10周龄开始，小鼠每两周在加速和摇摆滚轮上测试运动功能。联合组动物在两个滚轮测试中所有检查的时间点都显示出显著改善的运动表现(p<0.001)。仅进行脑注射AAV2处理的小鼠显示与未处理的ASMKO小鼠相比在早期时间点加速滚轮上显示中度改善的运动表现。然而，在晚期时间点其表现下降了，这证明仅进行脑注射不足以维持对运动功能的纠正。对于更严格的测试运动功能和协调性的摇摆滚轮，仅进行脑注射AAV2的组在整个研究中自始至终表现差。仅进行全身性注射AAV8的组在任何一个测试中显示少至无的受益(little-to-no benefit)。

从17周龄开始，小鼠每4周也在Barnes迷宫上测试认知功能。在不利光刺激下小鼠利用记忆介导的空间行走线索逃离迷宫。仅进行脑注射AAV2的组比未处理的ASMKO表现更好，但从未达到野生型小鼠中观察到的表现水平。仅进行全身性注射处理的小鼠与未处理的对照相比显示或多或少的改善。相反，联合组在Barnes迷宫上表现出与野生型小鼠相似的熟练程度(p>0.05)。总结滚轮数据，脑和内脏两者病变的纠正对于最大功能结果是必需的。

小鼠每两周称重以评价其总体健康情况，其存活率通过Kaplan-Meier曲线分析。联合组体重增加概况与野生型相似，比仅进行脑注射AAV2和全身性注射AAV8的组显著要好(p<0.001)。垂死状态的动物定义为重度共济失调、不摔跤不能进行直线行走、不能清洁、体重损失20％和脱水，为人道主义目的将其处死。与寿命中位数为34周的未处理ASMKO小鼠相比，联合、仅进行脑注射AAV2和仅进行全身性注射AAV8的组显示存活率增加。然而，所有通过联合注射处理的ASMKO小鼠存活至54周龄并且未显示共济失调的迹象。这与仅进行脑注射AAV2和仅进行全身性注射AAV8的组相比是显著的改善，后者中所有动物最终变得处于垂死状态，寿命中位数为48和47周的(p<0.0001)。在单个部位注射的组中(singly injectedgroup)的没有一只动物存活至54周。因此，尽管仅对脑或内脏进行处理确实提供显著的存活受益，但比用联合治疗对上述身体区间都处理的效果要差。

根据本说明书中引用的参考文献的教导可对本说明书进行最充分的理解。本说明书中的实施方案提供对本发明的实施方案的示例性说明，不应解释为限制本发明的范围。技术人员易于认识到本发明涵盖许多其他实施方案。在本公开中引用的所有出版物、专利和生物序列以其整体通过引用合并于此。对于通过引用合并的材料与本说明矛盾或不一致的地方，本说明书将替代任何这样的材料。此处引用的任何参考文献并非承认该参考文献对于本发明来说属于现有技术。

除非另有说明，本说明书包括权利要求书中所用的所有表达成分量、细胞培养、处理条件等的数字应理解为在所有情况下通过词语“约”修饰。相应地，除非另有相反说明，数字参数为近似值，可根据本发明要获得的所需性质变化。除非另有说明，在一系列成分前的术语“至少”应理解为是指该系列的每个成分。本领域技术人员会认识到或通过不超过常规实验能够确定许多此处描述的本发明具体实施方案的等同内容。这些等同内容被权利要求所涵盖。

Claims (2)

1.包括下述步骤的方法：

a)给予有效量的包括编码免疫原的转基因的病毒载体至哺乳动物的肝组织；和

b)随后给予有效量的包括编码免疫原的转基因的第二病毒载体至所述哺乳动物的脑。

2.治疗哺乳动物A型尼曼-皮克病的方法，其包括下述步骤：

a)给予有效量的包括编码酸性鞘磷脂酶多肽或蛋白转基因的病毒载体至哺乳动物的肝组织；和

b)随后给予有效量的包括编码酸性鞘磷脂酶多肽或蛋白转基因的第二病毒载体至所述哺乳动物的脑，由此治疗该哺乳动物的A型尼曼-皮克病。