BR112016025819B1

BR112016025819B1 - Vetores de vírus adeno-associados para o tratamento de doenças de depósito lisossômico

Info

Publication number: BR112016025819B1
Application number: BR112016025819-3A
Authority: BR
Inventors: Maria Fàtima Bosch Tubert; Virginia AREBA HAURIGOT; Albert RIBERA SANCHEZ
Original assignee: Universitat Autònoma De Barcelona; Esteve Pharmaceuticals, S.A.
Priority date: 2014-05-14
Filing date: 2015-05-13
Publication date: 2022-08-16
Also published as: AU2015261519B2; AU2015261519A1; CN107002095A; CA2947468C; EP3143146B1; AR100419A1; RU2016149206A; BR112016025819A2; PT3143146T; CN107002095B; PH12016502248A1; MX2016014773A; TWI701332B; WO2015173308A1; SG11201609314XA; JP2017523802A; SA516380290B1; AU2015261519A2; NZ726316A; TW201625793A

Abstract

VETORES DE VÍRUS ADENO-ASSOCIADOS PARA O TRATAMENTO DE DOENÇAS DE DEPÓSITO LISOSSÔMICO. A presente invenção proporciona novos vectores de vírus adeno-associados e composições farmacêuticas que os contêm para o tratamento de doenças de depósito lisossômico e, especialmente, para o tratamento de mucopolissacaridoses do Tipo III B.

Description

[0001] A presente invenção refere-se aos vetores usados para a expressão de proteínas de interesse e seu uso na terapia genética. A presente invenção também se refere aos vetores e sequências de ácido nucleico que auxiliam no tratamento de mucopolissacaridose (MPS), e em particular, no tratamento de mucopolissacaridose do tipo III B, ou síndrome de Sanfilippo do tipo B.

ESTADO DA TÉCNICA

[0002] O lisossomo é uma organela encontrada no citoplasma de células de animais contendo mais de 50 hidrolases que quebram biomoléculas durante a reciclagem de componentes celulares fatigados ou após o engolfamento de vírus e bactérias. Essa organela contém diversos tipos de enzimas hidrolíticas incluindo proteases, nucleases e glicosidades, lipases, fosfolipases, fosfatases e sulfatases. Todas as enzimas são hidrolases ácidas.

[0003] As doenças de depósito lisossômico (LSDs) são causadas por defeitos genéticos que afetam uma ou mais enzimas lisossômicas. Essas doenças genéticas resultam geralmente de uma deficiência em uma atividade enzimática particular presente no lisossomo. Em um menor grau, essas doenças podem ocorrer devido às deficiências de proteínas envolvidas na biogênese lisossômica.

[0004] As LSDs são individualmente raras, embora, como um grupo, essas doenças sejam relativamente comuns na população geral. A prevalência combinada de LSDs é aproximadamente de 1 para cada 5.000 nascimentos. Verificar Meikle P, et al., JAMA 1999; 281:249-254. Entretanto, alguns grupos dentro da população geral são particularmente afetados por uma alta ocorrência de LSDs. Por exemplo, a prevalência de doenças de Gaucher e Tay-Sachs em indivíduos descendentes de judeus da Europa central e oriental (Ashkenazi) é de 1 para cada 600 e de 1 para cada 3.900 nascimentos, respectivamente.

[0005] A mucopolissacaridose do tipo III (MPSIII) conhecida coletivamente como síndrome de Sanfilippo é uma LSD causada pela deficiência em uma das enzimas envolvidas na etapa de degradação do glicosaminoglicano (GAG) sulfato de heparina (HS), levando ao seu acúmulo patológico. A MPSIII é classificada em quatro subtipos dependendo da deficiência enzimática. A perda da atividade enzimática de alfa-N-acetil-glucosaminidase causa o subtipo III B. A doença resultante é caracterizada clinicamente como uma neuropatia progressiva da primeira infância do SNC. O curso clínico pode geralmente ser dividido em três fases. Na primeira fase de uma doença, após um período livre de sintomas que se estende nos primeiros meses de vida, uma desaceleração no desenvolvimento mental torna-se aparente. Tal fase será seguida por problemas comportamentais severos e declínio intelectual progressivo durante a segunda fase da doença. Finalmente, com o surgimento de demência grave, os problemas comportamentais desaparecerão lentamente, e todas as funções motoras começarão a declinar, resultando eventualmente em disfagia, completa perda de locomoção e lesões do trato piramidal.

[0006] Além dos sintomas neurológicos, pacientes com MPSIIIB sofrem alterações não neurológicas incluindo infecções recorrentes no ouvido, nariz, garganta e peito, constipação e diarreia frequente, degeneração articular progressiva e anomalias esqueléticas que afetam a mobilidade, assim como, a hepatoesplenomegalia. Verificar Cleary e Wraith, Arch Dis Child. 1993;69 (3):403- 6, Neufeld e Muenzer, “A mucopolissacaridose” em Scriver C, et al., Eds., “A base metabólica e molecular da doença hereditária”, McGraw-Hill Publishing Co., New York, NY, US, 2001, pp. 3421-3452, van de Kamp et al., Clin Genet. 1981;20(2):152-60, Moog et al, Am J Med Genet C Semin Med Genet. 2007;145C(3):293-301.

[0007] Os pacientes normalmente morrem ao final da segunda ou início da terceira década de vida. Verificar Neufeld e Muenzer, supra. Uma forma progressivamente mais lenta da doença, de início tardio e maior sobrevivência, conhecida como o fenótipo atenuado foi descrita em um subconjunto de pacientes com MPSIIIB. Verificar Moog et al., supra e Valstar et al., Ann Neurol. 2010;68(6):876-87.

[0008] Não há atualmente um tratamento disponível para a MPSIIIB. Portanto, o controle da doença é sintomático e focado na melhora da qualidade de vida de pacientes e suas famílias. Tal fato é de importância especial aos sintomas de alterações crescentes no SNC. Por exemplo, o aumento intermitente da pressão intracraniana é uma causa reconhecida do distúrbio comportamental e não é incomum nas MPSs. Verificar Muenzer et al., Med. Genét. 2006;8(8):465-73. O espessamento de meninges devido ao acúmulo de mucopolissacarídeos seria a causa subjacente para o aumento de pressão do líquido cefalorraquidiano (LCR).

[0009] Assim, quando as alterações comportamentais são refratárias à medicação convencional, a inserção de um desvio de corrente do líquido cefalorraquidiano será considerada em ordem de aliviar a pressão. Os sintomas neurológicos melhoraram de forma significante em seis pacientes de Sanfilippo que tiveram a inserção do desvio de corrente cerebrospinal. Verificar Robertson et al., Eur J Pediatr. 1998;157(8):653-5. Por outro lado, a administração de melatonina foi considerada como o melhor tratamento para as desordens de sono características da doença, embora, não seja completamente eficaz. Verificar Fraser et al., Arch Dis Child. 2005;90(12):1239-42. Também não há tratamento específico para a patologia somática, e somente terapias paliativas podem ser aplicadas para cada sintoma individual.

[0010] Novas abordagens terapêuticas da MPSIIIB estão sendo testadas com diferentes níveis de sucesso. A terapia de privação de substrato (SDT) foca na redução da taxa de síntese de GAG de modo que se alguma atividade enzimática residual permanecer, o acúmulo excessivo de GAGs será evitado, ou pelo menos a taxa de acúmulo será diminuída. A genisteína, uma isoflavona de soja, foi sugerida para agir como um inibidor de produção de HS diminuindo a atividade da quinase do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR). Verificar Jakobkiewicz-Banecka et al., J Biomed Sci. 2009;16:26, Piotrowska et al., Eur J Hum Genet. 2006;14(7):846-52. Estudos recentes indicam que a genisteína inibe a síntese de GAGs em fibroblastos de pacientes sofrendo de diversas mucopolissacaridoses (tipos I, II, III-A e III-B). Verificar Piotrowska et al., supra. A administração oral da genisteína à longo prazo e à curto prazo em um modelo de rato com a doença MPSIIIB resultou na redução de acúmulo e melhor desenvolvimento em testes de função motora. Verificar Malinowska et al., Mol Genet Metab. 2009;98(3):235-42, Malinowska et al., PLoS One. 2010;5(12): e 14192. Quando administrada por via intravenosa, esperou-se que a genisteína estivesse capacitada a ultrapassar a barreira hematoencefálica (BHE), permitindo o tratamento da patologia no SNC. Baseando-se nesta ideia, um estudo piloto aberto em que um extrato de genisteína enriquecido com soja foi administrado em 5 pacientes com MPSIIIA e 5 com MPSIIIB por 12 meses resultou em uma melhora significante de ambos os parâmetros somático e neurológico. Verificar Piotrowska et al., Pesquisa terapêutica atual. 2008;69(2):166-179. Entretanto, estudos posteriores não apresentaram melhora em escala de incapacidade ou desenvolvimento comportamental em pacientes com MPSIIIA, MPSIIIB ou MPSIIIC tratados com genisteína por 12 meses. Verificar Delgadillo et al., J Inherit Metab Dis. 2011;34(5):1039-44, estudo NTR #1826 registrado no Registro de triagem nacional da Holanda e de Ruijter et al., Ann Neurol. 2012;71(1):110-20. Outra molécula, a rodamina B, também provou ser eficaz na diminuição de acúmulo de GAG em estudos pré-clínicos, com uma eficácia semelhante àquela observada com a genisteína. Verificar Hendriksz et al., “Guia para a pesquisa e controle de mucopolissacaridoses do tipo III”, 2012, disponível em www.mpssociety.co.uk. Imaginou-se a rodamina B para suprimir a síntese de cadeias de GAG inibindo a formação de precursores de açúcar e/ou atividade de glicolsiltransferases. Verificar Roberts et al., Mol Genet Metab. 2007;92(1-2):115- 21.

[0011] As células normais secretam quantidades significantes de enzimas lisossômicas rotuladas de manose-6-fosfato (M6P) que podem ser posteriormente repostas por outras células via receptores de M6P na membrana plasmática. Tal fato abre a possibilidade de tratamento de LSDs causadas pela deficiência de hidrolases solúveis inserindo a versão correta da enzima deficiente. Embora a terapia de substituição de enzima (ERT) ainda não esteja disponível para pacientes com Sanfilippo do tipo B, a administração por via intravenosa de alfa-N- acetil-glucosaminidase recombinante em ratos de 3 meses de vida com MPSIIIB apresentou a enzima recombinante distribuída em diversos órgãos, principalmente no fígado. Uma quantidade insignificante de enzima foi detectada no cérebro o que foi atribuído à presença da BHE limitando a entrada de proteínas providas exogenamente no parênquima cerebral. Verificar Yu et al., Mol Genet Metab. 2000;71(4):573-80 e Hendriksz et al, supra. Há um programa em desenvolvimento inicial de um produto de ERT para o tratamento de doença neurológica em pacientes com MPSIIIB. O programa HGT-3010 (Shire) é uma ERT baseado na distribuição da enzima recombinante por via intratecal e atualmente está em fase pré-clínica. A distribuição direta de ERT ao SNC reduziu a patologia neurológica em ratos com MPSIIIA e atualmente está sendo testada em pacientes com MPSIIIA. Verificar Hemsley K, et al., Comp. de genes cerebrais. 2008;53(2):161-8, Savas P, et al., Mol Genet Metab. 2004;82:273-285, NCT01155778 e NCT01299727 em www.clinicaltrials.gov. Entretanto, a implantação permanente do dispositivo de distribuição por via intratecal que a terapia exige está associada à riscos e falhas substanciais, e a terapia ela mesma, tem um custo muito alto por paciente/ano.

[0012] O transplante de células-tronco hematopoiéticas (HSCT) usando células- tronco da medula óssea (transplante de medula óssea, BMT) provou-se eficiente no tratamento de ambas as patologias somática e neurológica em pacientes com outras MPSs. Verificar Peters et al., Corrente sanguínea 1996;87(11):4894-902, Peters e Steward, Transplante de medula óssea 2003;31(4):229-39 e Yamada et al., Transplante de medula óssea 1998;21(6):629-34. As células mielóides de doadores são capazes de atravessar a BHE, entrar no parênquima cerebral e diferenciar-se em células micróglias secretando a enzima lisossômica deficiente que será então reposta por células circundantes levando à correção do acúmulo de GAG no cérebro. Verificar Krivit et. Al., Transplante celular. 1995;4(4):385-92. Entretanto, nenhum benefício claro foi observado em pacientes com Sanfilippo A ou B que foram submetidos ao BMT. Verificar Hoogerbrugge et al., Lancet 1995;345(8962):1398-402, Vellodi et al., J Inherit Metab Dis. 1992;15(6):911-8, Güngor e Tuncbilek, Turk J Pediatr. 1995;37(2):157-63, Sivakumur e Wraith, J Inherit Metab Dis. 1999;22(7):849-50 e Lange et al., Arq Neuropsiquiatr. 2006;64(1):1-4. A principal razão para a falha do BMT parece ser o ritmo lento de substituição da população de micróglias pela progênie de células hematopoiéticas comparado à rápida progressão da doença primária. Verificar Rovelli, Transplante de medula óssea 2008: 41 Suppl2:S87-9. Portanto, HSCT usando o BMT atualmente não é considerado como uma opção de tratamento para pacientes com MPSIII. Verificar Boelens et al., Pediatr Clin North Am. 2010;57(1):123-145. O HSCT usando células-tronco do sangue do cordão umbilical melhoraram o resultado cognitivo em ratos com MPSIIIB, mas exigiu administração celulares recorrentes. Verificar Willing et al., Transplante celular 2013; epub impresso frontal. Essa abordagem foi recentemente usada para transplantar diversas crianças com MPSIIIA e MPSIIIB; ainda não está claro se resultou na proteção contra a degeneração do SNC. Verificar de Ruijter et al., Curr Pharm Biotechnol, 2011; 12(6):923-30.

[0013] Dadas as limitações de opções terapêuticas atuais para a MPSIII e particularmente para a MPSIIIB, abordagens alternativas são necessárias. A terapia genética in vivo oferece a possibilidade de tratamento único para a MPSIIIB e outras doenças hereditárias com a prospecção de efeitos benéficos ao longo da vida. Diversas abordagens de terapia genética baseadas no uso de diferentes vetores virais juntamente às diferentes vias de administração foram testadas em modelos de animais com a doença MPSIIIB.

[0014] Vetores lentivirais codificando para o gene alfa-N-acetil-glucosaminidase foram administrados por via intravenosa em ratos jovens com MPSIIIB resultando em baixos níveis de expressão transgênica no fígado, baço, pulmão e coração, o que reduziu, mas não normalizou, o acúmulo de GAG nesses tecidos. Verificar Di Natale et al., Biochem J. 2005;388(2):639-46. O potencial terapêutico dos vetores lentivirais também foi testado pela distribuição direta de vetores ao parênquima cerebral via administração intracraniana. Verificar Di Domenico et al., Am J Med Genet A. 2009;149A (6):1209-18. Os ratos com MPSIIIB que sofreram administração em um único local do cérebro apresentaram aumento da atividade de alfa-N-acetil-glucosaminidase após 6 meses de tratamento, o que corrigiu apenas parcialmente as lesões do depósito lisossômico.

[0015] O transporte genético mediado por vetores de vírus adeno-associados (AAV), em particular, está emergindo rapidamente conforme a abordagem de escolha em muitas aplicações da terapia genética in vivo devido à alta eficácia de transdução e à ausência de patogenicidade desses vetores. Os vetores AAV podem efetuar a transdução de células pós-mitóticas e diversos estudos clínicos e pré-clínicos demonstraram o potencial do transporte genético mediado pelo vetor AAV para conduzir eficazmente a terapia de expressão transgênica em uma variedade de doenças. Verificar Bainbridge et al., N Engl J Med. 2008;358(21):2231-9, Hauswirth et al., Hum Ter. genética 2008;19(10):979-90, Maguire et al., N Engl J Med. 2008;358(21):2240-8, Niemeyer et al., Corrente sanguínea 2009;113(4):797-806, Rivera et al., Corrente sanguínea 2005;105(4):1424-30, Nathawani et al., N Engl J Med. 2011;365(25):2357-65 e Buchlis et al., Corrente sanguínea 2012;119(13):3038-41.

[0016] Quando os vetores AAV de serotipo 2 codificando para alfa-N-acetil- glucosaminidase foram distribuídos ao parênquima cerebral de ratos com MPSIIIB em um único local, a atividade e expressão de alfa-N-acetil-glucosaminidase foram restringidas ao local de injeção e somente uma melhora parcial do fenótipo da doença foi alcançada. Verificar Fu et al., Ter. mol. 2002;5(1):42-9, Cressant et al., J Neurosci. 2004;24(45):10229-39. Os vetores AAV2 distribuídos via intravenosa em ratos com MPSIIIB seguido de pré-tratamento com manitol para permear a BHE direcionaram à uma extensão de sobrevivência significante, melhora no desenvolvimento comportamental, e redução da patologia lisossômica cerebral, embora somente uma correção parcial da doença somática tenha sido alcançada. Verificar McCarty et al., Terapia gen. 2009;16(11):1340-52. Por outro lado, uma única administração de vetores AAV2 no líquido cefalorraquidiano (LCR) através de injeção intracisternal direcionou à restauração da atividade de alfa-N-acetil-glucosaminidase e redução de GAGs no cérebro do rato com MPSIII, embora não detectável. A atividade de alfa-N-acetil-glucosaminidase foi observada em tecidos somáticos. Verificar Fu et al., J Med. Gen. 2010;12(7):624- 33. Uma terapia combinada envolvendo a distribuição de AAV2 por via intravenosa e intracisternal demonstrou eficácia terapêutica significante à longo prazo no SNC, assim como, correção somática parcial. Verificar Fu et al., Ter. genética 2007;14(14):1065-77.

[0017] Outros estudos se beneficiaram do alto tropismo de células neurais apresentado pelos vetores AAV de serotipo 5 seguido de administração por via intraparenquimal. Esses vetores têm, contudo, uma baixa distribuição dentro do parênquima cerebral e a abordagem exige injeções múltiplas. A distribuição de vetores AAV5 em múltiplos locais do cérebro do rato recém-nascido com MPSIIIB juntamente ao transplante de medula óssea apresentaram eficácia terapêutica semelhante àquela obtida com os vetores de serotipo 2. Verificar Heldermon et al., Ter.mol. 2010;18(5):873-80. Em modelos de animais de grande tamanho cerebral a administração estereostática de vetores AAV5 em quatro localizações diferentes do cérebro em cachorros com MPSIIIB direcionou à detecção de alfa- N-acetil-glucosaminidase ativa em áreas espalhadas do cérebro. Contudo, a atividade enzimática permaneceu baixa ou indetectável em regiões mais próximas à cabeça e rabo, especialmente no cerebelo. Verificar Ellinwood et al., Ter. mol. 2011;19(2):251-9. A patologia lisossômica foi melhorada, mas não totalmente corrigida no tratamento de cachorros com MPSIIIB indicando que os níveis de atividade enzimática alcançada com essa abordagem foram insuficientes para lidar com o acúmulo de GAG. Apesar da eficácia parcial, um teste clínico baseado nessa abordagem foi recentemente iniciado. Verificar ISRCTN19853672 no registro ISRCTN. Quanto maior o cérebro, maior a dificuldade para lidar com todo o volume do órgão através de injeções intraparenquimais e administração de distribuição do vetor necessário para o homem em diversos locais gerando um desafio técnico de distribuição e exigindo o desenvolvimento de procedimentos cirúrgicos específicos. Verificar Souweidane et al., J Neurosurg Pediatr. 2010;6(2):115-122.

[0018] Até o momento, somente o estudo que usa os vetores AAV de serotipo 9 para o tratamento de MPSIIIB foi relatado. A abordagem se beneficia da habilidade dos vetores AAV9 para a transdução no SNC quando administrados sistematicamente. Verificar Foust et al., Nat Biotecnologia. 2009;27(1):59-65 e Duque, et al., Ter. mol. 2009;17(7):1187-1196. A distribuição por via intravenosa de vetores alfa-AAV9-N-acetil-glucosaminidase em ratos com MPSIIIB resultou na correção da patologia de depósito lisossômico no SNC e órgãos somáticos, melhora no desenvolvimento comportamental e extensão de vida útil. Verificar Fu et al., Mol. Ter. 2011;19(6):1025-33. Entretanto, esse curso de ação proposto tem diversas falhas. Primeiro, nada foi relatado sobre o promotor de CMV. Verificar Loser et al., J Virol. 1998 Jan;72(1):180-90. Segundo, a eficácia terapêutica foi alcançada com uma dosagem muito alta do vetor (>1x1013vg/kg). O uso de dosagens tão altas supõe um desafio para a tradução clínica do ponto de vista de segurança e fabricação.

[0019] Nenhuma das abordagens acima mencionadas restaurou totalmente a atividade alcançada de alfa-N-acetil-glucosaminidase, erradicação total de inclusões intracitoplasmáticas no SNC e tecidos somáticos, ou corrigiu todos os sinais clínicos da MPSIIIB. Assim, há a necessidade de uma nova abordagem para o tratamento de MPSIIIB tendo uma eficácia e perfis de segurança aperfeiçoados.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0020] A presente invenção provê novos vetores recombinantes para o tratamento de doenças, em particular, para o tratamento de mucopolissacaridose do tipo III (MPSIII), especialmente a MPSIIIB.

[0021] Em um primeiro aspecto, a invenção refere-se aos vetores de vírus adeno- associados (AAV) contendo uma sequência de nucleotídeos codificando para alfa- N-acetil-glucosaminidase (Naglu) SEQ ID NO. 1. Os vetores AAV de acordo com a invenção são de serotipo 9 (AAV9). Esses vetores provaram ser muito eficientes para reverter completamente o acúmulo patológico de GAGs em todas as regiões do cérebro e tecidos somáticos.

[0022] Os vetores AAV9, de acordo com a invenção, contém uma sequência de nucleotídeos codificando para Naglu que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO.2, e preferencialmente pelo menos 84% de identidade de sequência com a SEQ ID NO.2.

[0023] Os vetores AAV9 da presente invenção contém ainda um promotor ligado à sequência de nucleotídeos em ordem de controlar a expressão de Naglu. Um promotor adequado é o promotor de CAG, SEQ ID NO. 4.

[0024] Outro aspecto da invenção refere-se aos plasmídeos contendo uma sequência de nucleotídeos codificando para alfa-N-acetil-glucosaminidase (Naglu), e em particular, uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO. 2, ou preferencialmente, pelo menos 84% de identidade de sequência com a SEQ ID NO. 2.

[0025] Mais um aspecto da presente invenção ainda se refere à uma composição farmacológica compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de vetores AAV9 da invenção ou de um plasmídeo descrito na mesma.

[0026] A presente invenção provê ainda métodos usados para a distribuição de polinucleotídeos, especialmente, polinucleotídeos Naglu.

[0027] Mais um aspecto da invenção ainda se refere aos vetores AAV9 da invenção ou à um plasmídeo descrito na mesma para uso como um medicamento, em particular, para o tratamento de mucopolissacaridose do tipo III (MPSIII), especialmente a MPSIIIB.

[0028] A presente invenção também provê um método de produção de vetores AAV9 de acordo com a invenção.

[0029] Mais um aspecto da invenção refere-se às células isoladas compreendendo a sequência de nucleotídeos codificando para alfa-N-acetil- glucosaminidase (Naglu), e em particular, uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO. 2, ou preferencialmente, pelo menos 84% de identidade de sequência com a SEQ ID NO. 2.

[0030] BREVE DESCRIÇÃO DE DESENHOS

[0031] A Figura 1 é uma distribuição hidrodinâmica de plasmídeos codificando para alfa-N-acetil-glucosaminidase (pAAV-CAG-hNaglu). Ratos de dois meses com MPSIIIB foram injetados hidrodinamicamente com 50 μg de plasmídeo pAAV-CAG-hNaglu. Os histogramas descreveram a atividade de alfa-N-acetil- glucosaminidase medida 1 semana após a administração de plasmídeo no fígado (A) e soro (B). A atividade (NAGLU) de salina injetada em ratos WT foi definida em 100%. Os valores significam ± SEM de 3-4 ratos por grupo *** P<0.001 vs. WT.

[0032] A Figura 2 é a distribuição intravenosa (IV) de vetores AAV9 codificando para alfa-N-acetil-glucosaminidase humano (AAV9-CAG-hNaglu). A atividade de alfa-N-acetil-glucosaminidase no fígado (A) e no soro (B) de ratos selvagens (saudáveis), ratos com MPSIIIB não tratados, e ratos com MPSIIIB tratados com uma injeção IV de 5x1011 vg de AAV9-CAG-hNaglu. (C) Quantidade de glicosaminoglicanos (GAG) em órgãos somáticos. Os valores significam ± SEM de 5 a 8 ratos por grupo. $$$ P<0.001 vs. WT, ** P<0.01, *** P<0.001 vs. MPSIIIB não tratados. nd: não detectado.

[0033] A Figura 3 é uma distribuição intravenosa de vetores AAV9 codificando para alfa-N-acetil-glucosaminidase humano (AAV9-CAG-hNaglu). (A) Atividade de alfa-N-acetil-glucosaminidase em diferentes partes do cérebro (I-IV) de ratos do tipo selvagem (saudáveis), ratos com MPSIIIB não tratados, e ratos com MPSIIIB tratados com uma injeção IV de 5x1011 vg de AAV9-CAG-hNaglu. (B) Quantidade de glicosaminoglicanos (GAG) nas mesmas partes do cérebro. Os valores significam ± SEM de 5 a 8 ratos por grupo. *** P<0.001 vs. MPSIIIB não tratados. nd: não detectado.

[0034] A Figura 4 é uma distribuição intravenosa de vetores AAV9 codificando para alfa-N-acetil-glucosaminidase humano otimizado (AAV9-CAG-cohNaglu). A atividade de alfa-N-acetil-glucosaminidase no fígado (A) e soro (B) de ratos do tipo selvagem (saudáveis), ratos com MPSIIIB não tratados, e ratos com MPSIIIB tratados com uma injeção IV de 5x1011 vg de AAV9-CAG-cohNaglu. (B) Quantidade de glicosaminoglicanos (GAG) em órgãos somáticos. Os valores significam ± SEM de 5 a 8 ratos por grupo. $$$ P<0.001 vs. WT, ** P<0.01, *** P<0.001 vs. MPSIIIB não tratados. nd: não detectado.

[0035] A Figura 5 é uma distribuição intravenosa de vetores AAV9 codificando para alfa-N-acetil-glucosaminidase humano otimizado (AAV9-CAG-cohNaglu). (A) Atividade de alfa-N-acetil-glucosaminidase em diferentes partes do cérebro (I-IV) de ratos do tipo selvagem (saudáveis), ratos com MPSIIIB não tratados, e ratos com MPSIIIB tratados com uma injeção IV de 5x1011 vg de AAV9-CAG-cohNaglu. (B) Quantidade de glicosaminoglicanos (GAG) nas mesmas partes do cérebro. Os valores significam ± SEM de 5 a 8 ratos por grupo. *** P<0.001 vs. MPSIIIB não tratados. nd: não detectado.

[0036] A Figura 6 é uma distribuição intracisternal (IC) de vetores AAV9 codificando para alfa-N-acetil-glucosaminidase humano (AAV9-CAG-hNaglu). (A) Atividade de alfa-N-acetil-glucosaminidase em diferentes partes do cérebro (I-IV) de ratos do tipo selvagem (saudáveis), ratos com MPSIIIB não tratados, e ratos com MPSIIIB tratados com uma injeção intracisternal de 9.3x109 vg de AAV9- CAG-hNaglu. (B) Quantidade de glicosaminoglicanos (GAGs) nas mesmas áreas do cérebro. Os valores significam ± SEM de 5 a 8 ratos por grupo. *** P<0.001 vs. MPSIIIB não tratados. nd: não detectado.

[0037] A Figura 7 é uma distribuição intracisternal de vetores AAV9 codificando para alfa-N-acetil-glucosaminidase humano (AAV9-CAG-hNaglu). (A) Atividade de alfa-N-acetil-glucosaminidase no fígado de ratos do tipo selvagem (saudáveis), ratos com MPSIIIB não tratados, e ratos com MPSIIIB tratados com uma injeção por via intracisternal de 9.3x109 vg de AAV9-CAG-hNaglu. (B) Quantidade de glicosaminoglicanos (GAGs) em órgãos somáticos. Os valores significam ± SEM de 5 a 8 ratos por grupo. $$$ P<0.001 vs. WT, ** P<0.01, *** P<0.001 vs. MPSIIIB não tratados. nd: não detectado.

[0038] A Figura 8 é uma distribuição intracisternal de vetores AAV9 codificando para alfa-N-acetil-glucosaminidase humano otimizado (AAV9-CAG-cohNaglu). (A) Atividade de alfa-N-acetil-glucosaminidase em diferentes partes do cérebro (I-IV) de ratos do tipo selvagem (saudáveis), ratos com MPSIIIB não tratados, e ratos com MPSIIIB tratados com uma injeção por via intracisternal de 9.3x109 vg de AAV9-CAG-cohNaglu. (B) Quantidade de glicosaminoglicanos (GAGs) nas mesmas áreas do cérebro. Os valores significam ± SEM de 5 a 8 ratos por grupo. *** P<0.001 vs. MPSIIIB não tratados. nd: não detectado.

[0039] A Figura 9 é uma distribuição intracisternal (IC) de vetores AAV9 codificando para alfa-N-acetil-glucosaminidase humano otimizado (AAV9-CAG- cohNaglu). (A) Atividade de alfa-N-acetil-glucosaminidase no fígado de ratos do tipo selvagem (saudáveis), ratos com MPSIIIB não tratados, e ratos com MPSIIIB tratados com uma injeção por via intracisternal de 9.3x109 vg de AAV9-CAG- cohNaglu. (B) Quantidade de glicosaminoglicanos (GAGs) em órgãos somáticos. Os valores significam ± SEM de 5 a 8 ratos por grupo. $$$ P<0.001 vs. WT, ** P<0.01, *** P<0.001 vs. MPSIIIB não tratados. nd: não detectado.

[0040] A Figura 10 é uma distribuição hidrodinâmica de plasmídeo codificando para alfa-N-acetil-glucosaminidase-versão2 (pAAV-CAG-cohNaglu-versão2). Ratos de dois meses de vida com MPSIIIB foram injetados hidrodinamicamente com 50 μg de plasmídeo pAAV-CAG-cohNaglu-versão2. Os histogramas descreveram a atividade de alfa-N-acetil-glucosaminidase (NAGLU) medida 1 semana após a administração pós-plasmídeo no fígado (A) e no soro (B). A Atividade NAGLU em ratos WT injetados com salina foi ajustada em 100%. Os valores significam ± SEM de 3-4 ratos por grupo. *** P<0.001 vs. WT.

[0041] A Figura 11 é uma distribuição hidrodinâmica de plasmídeo codificando para alfa-N-acetil-glucosaminidase-versão3 otimizado (pAAV-CAG-cohNaglu- versão3). Ratos de dois meses de vida com MPSIIIB foram injetados hidrodinamicamente com 50 μg de plasmídeo pAAV-CAG-cohNaglu-versão3. Os histogramas descreveram a atividade de alfa-N-acetil-glucosaminidase (NAGLU) medida 1 semana após a administração pós-plasmídeo no fígado (A) e no soro (B). A Atividade de NAGLU em ratos WT injetados com salina foi ajustada em 100%. Os valores significam ± SEM de 3-4 ratos por grupo. *** P<0.001 vs. WT.

[0042] A Figura 12 é uma distribuição intracisternal de vetores AAV9 codificando para alfa-N-acetil-glucosaminidase murino otimizado (AAV9-CAG-comNaglu). Uma biodistribuição de genomas dos vetores de acordo com a administração na cisterna magna de ratos com MPSIIIB de 3x1010 vg de AAV9-CAG-comNaglu. Os genomas dos vetores foram quantificados no cérebro (A) e tecidos somáticos (B) por PCR quantitativo e referem-se à quantidade de DNA contida em um genoma diploide ND: não detectado.

[0043] A Figura 13 é uma distribuição intracisternal de vetores AAV9 codificando para alfa-N-acetil-glucosaminidase murino otimizado (AAV9-CAG-comNaglu). (A) Atividade de alfa-N-acetil-glucosaminidase em diferentes partes do cérebro (I-IV) de ratos do tipo selvagem (saudáveis), ratos com MPSIIIB não tratados, e ratos com MPSIIIB tratados administrados via cisterna magna com ambos 3.9x1010 vg do vetor de controle (AAV9-Nulo), ou 3x1010 vg de AAV9-CAG-comNaglu. (B) Quantidade de glicosaminoglicanos (GAGs) nas mesmas áreas do cérebro. Os valores significam ± SEM de 4 rato por grupo. ** P<0.01, *** P<0.001 vs. MPSIIIB- nulo. nd: não detectado.

[0044] A Figura 14 é uma distribuição intracisternal de vetores AAV9 codificando para alfa-N-acetil-glucosaminidase murino otimizado (AAV9-CAG-comNaglu). (A) Quantidade de intensidade de sinal obtido em diferentes áreas do cérebro de acordo com a coloração do marcador lisossômico LIMP-2, o que dá uma indicação do tamanho do compartimento lisossômico em ratos do tipo selvagem (saudáveis), ratos com MPSIIIB administrados via cisterna magna com ambos 3.9x1010 vg do vetor de controle (AAV9-Nulo), ou 3x1010 vg de AAV9-CAG- comNaglu. Os valores significam ± SEM de 4 rato por grupo. * P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001 vs. MPSIIIB-nulo. (B) Análise microscópica eletrônica do córtex cerebral e do cerebelo de ratos com MPSIIIB, MPSIIIB não tratados (imagem do meio), (imagens da esquerda) administrados via cisterna magna com AAV9-CAG- comNaglu (imagens da direita). 1. Neurônios; 2. Células perineurais da glia; 3. Neurônios purkinje. (C) Atividade de outras enzimas lisossômicas em extratos cerebrais obtidos de ratos do tipo selvagem (WT), ratos com MPSIIIB não tratados (MPSIIIB), e ratos com MPSIIIB administrados via cisterna magna com ambos 3.9x1010 vg do vetor de controle (AAV9-Nulo), ou 3x1010 vg de AAV9-CAG- comNaglu. SGSH, N-sulfoglucosamina sulfohidrolase, GUSB, glicuronídeose, beta, HEXB, hexosaminidase B. As atividades enzimáticas de WT foram ajustadas em 100%. Os valores significam ± SEM de 4 rato por grupo. *** P<0.001 vs. MPSIIIB-Nulo.

[0045] A Figura 15 é uma distribuição intracisternal de vetores AAV9 codificando para alfa-N-acetil-glucosaminidase murino otimizado (AAV9-CAG-comNaglu). Os histogramas representam a intensidade de sinal medida de acordo com a imunocoloração para o marcador de astrócitos GFAP (A) e para o marcador de micróglias BSI-B4 (B) nas partes frontal, parietal, e córtex occipital, colículo superior e tálamo de ratos do tipo selvagem (saudáveis), e ratos com MPSIIIB administrados via cisterna magna com ambos 3.9x1010 vg do vetor de controle (AAV9-Nulo), ou 3x1010 vg de AAV9-CAG-comNaglu. Os valores significam ± SEM de 2-3 rato por grupo. * P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001 vs. MPSIIIB-nulo. (C) Categoria funcional baseada em anotações de Ontologia genética (GO). Gráfico indicando a fração de transcrição associada à cada termo do processo biológico. Claramente, a maior parte de termos representam categorias relacionadas à inflamação/imunidade. (D) Agrupamento hierárquico de todos os grupos de experimento baseado na definição de genes que o programa CTEN atribuiu para ser representante de micróglia. Cada coluna representa um gene e cada curva representa um animal. O nível de expressão de cada gene é descrito em relação ao meio abundante para aquele gene que atravessa todas as amostras em uma escala de cinza apresentada na parte inferior. No dendograma de amostras mostrado acima a matriz representa todas as semelhanças em níveis de transcrição. Claramente, todos os ratos com MPSIIIB tratados com AAV9-CAG- comNaglu têm um perfil de expressão gênica próximo ao dos demais WT saudáveis e da mesma idade.

[0046] A Figura 16 é uma distribuição intracisternal de vetores AAV9 codificando para alfa-N-acetil-glucosaminidase murino otimizado (AAV9-CAG-comNaglu). A atividade de alfa-N-acetil-glucosaminidase no fígado (A) e no soro (B) de ratos do tipo selvagem (saudáveis), ratos com MPSIIIB não tratados, e ratos com MPSIIIB administrados via cisterna magna com ambos 3.9x1010 vg do vetor de controle (AAV9-Nulo), ou 3x1010 vg de AAV9-CAG-comNaglu. (C) Quantidade de glicosaminoglicanos (GAG) em órgãos somáticos. Os valores significam ± SEM de 4 a 8 ratos por grupo. $ P<0.05 vs. WT, ** P<0.01, ** P<0.001 vs. MPSIIIB não tratados. nd: não detectado. (D) Análise microscópica eletrônica do fígado. Vácuos eletro-luzentes múltiplos (setas) podem ser observados no citoplasma de hepatócitos dos ratos com MPSIIIB tratados com o vetor nulo e esses vacúolos desaparecem em animais tratados com AAV9-CAG-mNaglu. (E) Atividade de outras enzimas lisossômicas em extratos do fígado obtidos do mesmo grupo de animais como em (A e B). IDS, iduronato-2-sulfatase, IDUA, iduronídeose, alpha- L-, SGSH, N-sulfoglucosamina sulfohidrolase, GUSB, glicuronídeose, beta, HEXB, hexosaminidase B. As atividades enzimáticas de WT foram ajustadas em 100%. Os valores significam ± SEM de 4 ratos por grupo. ** P<0.01 e *** P<0.001 vs. MPSIIIB-Nulo.

[0047] A Figura 17 é uma distribuição intracisternal de vetores AAV9 codificando para alfa-N-acetil-glucosaminidase murino otimizado (AAV9-CAG-comNaglu). Avaliação comportamental em ratos do tipo selvagem (saudáveis) testados naturalmente, ratos com MPSIIIB não tratados e ratos com MPSIIIB administrados via cisterna magna com ambos 3.9x1010 vg do vetor de controle (AAV9-Nulo), ou 3x1010 vg de AAV9-CAG-comNaglu. Dados correspondentes à atividade exploratória e de locomoção registrados durante os primeiros 2 minutos, e representados como o meio ± SEM de 10 a 15 animais por grupo. (A) Latência na parte central, (B) Tempo na borda, (C) Entrada na parte central, (D) Tempo em repouso, (E) distância total percorrida, (F) Número total de linhas atravessadas. *P < 0.05 e **P < 0.01 vs. MPSIIIB-nulo. (G) Análise de sobrevivência de Kaplan- Meier em WT (n = 23), ratos com MPSIIIB não tratados (n = 12), ratos com MPSIIIB injetados com 3.9x1010 vg de AAV9-nulo (n = 5), ou 3x109 vg de AAV9- CAG-comNaglu (n = 8). Tratamento com terapia genética AAV9-CAG-comNaglu prolongando consideravelmente a extensão de vida de animais com MPSIIIB. P = 0.0007 para AAV9-CAG-comNaglu-ratos com MPSIIIB tratados vs. MPSIIIB-nulo.

[0048] A Figura 18 é uma distribuição intracisternal de vetores AAV9 codificando para alfa-N-acetil-glucosaminidase canino otimizado (AAV9-CAG-cocNaglu) em cachorros da raça Beagle. (A) Acompanhamento de anticorpos neutralizantes (Nab) anti-AAV9 titulados em soro e amostras de LCR correspondentes antes e após a distribuição intracefalorraquidiana de vetores AAV9-CAG-cocNaglu em cachorros Beagle saudáveis. Os cachorros 3 e 4 foram pré-imunizados através da distribuição intravenosa de 1x1011 vg/kg de vetores AAV9-nulos um mês antes da administração por via intracisternal. (B) Acompanhamento da atividade de alfa-N- acetil-glucosaminidase no LCR de cachorros adultos Beagle saudáveis de acordo com a administração intracefalorraquidiana de 6.5x1012 vg de vetores AAV9 codificando para alfa-N-acetil-glucosaminidase canino. Os cachorros 1 e 2 (símbolos em branco) estavam em condições naturais no momento da administração enquanto os cachorros 3 e 4 (símbolos preenchidos) tinham imunidade pré-existente contra o vetor AAV9. A contagem de glóbulos brancos (WBC) no LCR para cada ponto em todos os cachorros foi descrita no mesmo gráfico (linhas pontilhadas).

[0049] A Figura 19 é uma representação esquemática do plasmídeo pAAV-CAG- hNaglu (A) e uma representação esquemática do genoma do vetor AAV recombinante AAV9-CAG-hNaglu (B).

[0050] A Figura 20 é uma representação esquemática do plasmídeo pAAV-CAG- cohNaglu (A) e uma representação esquemática do genoma do vetor AAV recombinante AAV9-CAG-cohNaglu (B).

[0051] A Figura 21 é uma representação esquemática do plasmídeo pAAV-CAG- cohNaglu-versão2 (A) e uma representação esquemática do genoma do vetor AAV recombinante AAV9-CAG-cohNaglu-versão2 (B).

[0052] A Figura 22 é uma representação esquemática do plasmídeo pAAV-CAG- cohNaglu-versão3 (A) e uma representação esquemática do genoma do vetor AAV recombinante AAV9-CAG-cohNaglu-versão3 (B).

[0053] A Figura 23 é uma representação esquemática do plasmídeo pAAV-CAG- comNaglu (A) e uma representação esquemática do genoma do vetor AAV recombinante AAV9-CAG-comNaglu (B).

[0054] A Figura 24 é uma representação esquemática do plasmídeo pAAV-CAG- cocNaglu (A) e uma representação esquemática do genoma do vetor AAV recombinante AAV9-CAG-cocNaglu (B).

[0055] DEPÓSITO DE MICROORGANISMOS

[0056] O plasmídeo pAAV-CAG-cohNaglu (SEQ ID NO: 6) foi depositado em 13 de novembro de 2012 sob o número de registro DSM 26626 no Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Inhoffenstraβe 7 B, D-38124 Braunschweig - DSMZ, República Federal da Alemanha.

[0057] O plasmídeo pAAV-CAG-hNaglu (SEQ ID NO: 5) foi depositado em 13 de março de 2014 sob o número de registro DSM 28568 no Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Inhoffenstraβe 7 B, D-38124 Braunschweig - DSMZ, República Federal da Alemanha.

[0058] O plasmídeo pAAV-CAG-cohNaglu-versão2 (SEQ ID NO: 20) foi depositado em 29 de abril de 2015 sob o número de registro DSM 32042 no Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Inhoffenstraβe 7 B, D-38124 Braunschweig - DSMZ, República Federal da Alemanha.

[0059] O plasmídeo pAAV-CAG-cohNaglu-versão3 (SEQ ID NO: 23) foi depositado em 29 de abril de 2015 sob o número de registro DSM 32043 no Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Inhoffenstraβe 7 B, D-38124 Braunschweig - DSMZ, República Federal da Alemanha.

DEFINIÇÕES

[0060] O termo “sequência de nucleotídeos” refere-se à uma molécula de ácido nucleico, tanto DNA ou RNA contendo desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos, respectivamente. O ácido nucleico pode ser de cadeia dupla, cadeia única, ou conter porções de ambas as sequências de cadeia dupla ou cadeia única.

[0061] O termo “% de identidade de sequência” refere-se à porcentagem de nucleotídeos de uma sequência candidata que são idênticos aos nucleotídeos da sequência de referência após o alinhamento de sequências para alcançar a % máxima de identidade de sequência. A % de identidade de sequência pode ser determinada através de quaisquer métodos ou algoritmos estabelecidos na técnica, tais como, algoritmos ALIGN, BLAST e BLAST 2.0. Verificar Altschul S, et al., Acidos nuc. Res. 1977; 25:3389-3402 e Altschul S, et al., J Mol Biol. 1990;215:403-410.

[0062] Aqui, a % de identidade de sequência é calculada dividindo o número de nucleotídeos idênticos após o alinhamento da sequência de referência e a sequência candidata pelo número total de nucleotídeos na sequência de referência e multiplicando o resultado por 100.

[0063] Os termos “codificar” ou “codificando” referem-se ao código genético que determina como uma sequência de nucleotídeos é traduzida em um polipeptídeo ou em uma proteína. A ordem de nucleotídeos em uma sequência determina a ordem de aminoácidos ao longo de um polipeptídeo ou de uma proteína.

[0064] O termo “proteína” refere-se à uma macromolécula composta por uma ou mais cadeias lineares de aminoácidos ou polipeptídeos. As proteínas podem sofrer modificações pós-tradução, como conversão de um resíduo de cisteína para 3-oxoalanina, glicolisação ou ligação metálica. A glicolisação de uma proteína é a adição de carboidratos diferentes que estão ligados de forma covalente à cadeia de aminoácido.

[0065] O termo “quantidade eficaz” refere-se à uma quantidade de uma substância suficiente para alcançar a finalidade pretendida. Por exemplo, uma quantidade eficaz de um vetor AAV9 para aumentar a atividade de alfa-N-acetil- glucosaminidase (Naglu) será uma quantidade suficiente para reduzir o acúmulo de glicosaminoglicanos. Uma “quantidade terapeuticamente eficaz” de um vetor de expressão para tratar uma doença ou desordem será uma quantidade de vetor de expressão suficiente para reduzir ou erradicar os sinais e sintomas da doença ou desordem. A quantidade eficaz de uma dada substância variará de acordo com fatores, tais como, natureza da substância, via de administração, tamanho e espécie do animal que receberá a substância e a finalidade de administração da mesma. A quantidade eficaz em cada caso individual poderá ser determinada empiricamente por um especialista no estado da técnica de acordo com os métodos estabelecidos na técnica.

[0066] O termo “individual” refere-se à um mamífero, preferencialmente um mamífero humano ou não humano, mais preferencialmente rato, camundongo, outros roedores, coelho, cachorro, gato, porco, vaca, cavalo ou primata, ainda mais preferencialmente humanos.

[0067] O termo “operacionalmente ligado” refere-se à relação funcional e à localização da sequência promotora em relação ao gene de interesse (por exemplo, um promotor ou intensificador estará operacionalmente ligado à uma sequência de codificação se afetar a transcrição da sequência). Geralmente, um promotor operacionalmente ligado será contíguo à sequência de interesse. Contudo, um intensificador não tem que ser contíguo à sequência de interesse para controlar sua expressão.

[0068] O termo “tropismo” refere-se à maneira em que vírus diferentes se envolvem em espécies de hospedeiros alvo preferenciais, ou tipos de células específicas dentro dessas espécies.

[0069] O termo “terapia genética” refere-se ao transporte de material genético (por exemplo, DNA ou RNA) de interesse em um hospedeiro para tratar ou prevenir uma doença ou condição adquirida. O material genético de interesse codifica um produto (por exemplo, uma proteína polipeptídica, peptídeo ou RNA funcional) cuja produção in vivo é desejada. Por exemplo, o material genético de interesse pode codificar uma enzima, hormônio, receptor, ou valor terapêutico de polipeptídeo.

[0070] Os termos “vetor viral recombinante”, “vetor viral”, “vetor recombinante” ou “vetor” referem-se à um agente obtido a partir de um vírus que ocorre naturalmente por meio de técnicas de engenharia genética capazes de transportar material genético (por exemplo, DNA ou RNA) de interesse à uma célula, o que resultará na produção do produto codificado pelo referido material genético (por exemplo, proteína polipeptídica, peptídeo, ou RNA funcional) na célula alvo. No contexto da presente invenção, um “vetor recombinante” ou um “vetor” deverá ser compreendido como sendo um capsídeo proteico, assim como, o material genético contido dentro dele usado para transportar o referido material genético à uma célula. Ter por referência um “vetor recombinante” ou um “vetor” através de uma sequência de nucleotídeos, significa referir-se à um “vetor recombinante” ou a um “vetor” cujo genoma foi definido na listagem de sequências (SEQ ID) correspondente.

[0071] O termo “plasmídeo recombinante” ou “plasmídeo” refere-se à uma molécula de DNA auto replicante pequena, circular, de dupla cadeia obtida através de técnicas de engenharia genética capazes de transportar material genético de interesse à uma célula, o que resultará na produção do produto codificado pelo referido material genético (por exemplo, proteína polipeptídica, peptídeo ou RNA funcional) na célula alvo. Além disso, o termo “plasmídeo recombinante” ou “plasmídeo” também se refere à uma molécula de DNA auto replicante pequena, circular, de dupla cadeia obtida através de técnicas de engenharia genética usada durante a produção de vetores virais como portadores de genoma do vetor recombinante.

[0072] DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0073] A presente invenção provê novos vetores recombinantes para o tratamento de doenças, em particular, para o tratamento de mucopolissacaridose do tipo III (MPSIII), especialmente a MPSIIIB.

[0074] Além do material genético, o vetor recombinante também poderá conter elementos funcionais diferentes que incluem elementos de controle para a transcrição, como promotores ou operadores, fatores de transcrição ligando regiões, ou intensificadores e elementos de controle para o início ou finalização de tradução.

[0075] Os vetores de acordo com a invenção são vetores adeno-associados (AAV) que são usados para transportar o gene de interesse. Eles provaram ter uma alta eficácia na transdução de células pós-mitóticas em uma ampla taxa de tecidos. No contexto da presente invenção, os vetores são usados para a distribuição de alfa-N-acetil-glucosaminidase humano (hNaglu) polinucleotídica (SEQ ID NO: 2) ou de alfa-N-acetil-glucosaminidase humano polinucleotídica de códon otimizado (cohNaglu) (SEQ ID N: 3). Um vetor adeno-associado é um vetor derivado do genoma de um vírus adeno-associado da família Parvoviridae. O genoma do vírus adeno-associado é construído por ácido desoxirribonucleico monocatenário (ssDNA). Esses vetores infectam mamíferos, mas não são patogênicos (isto é, não causam doenças). Eles podem infectar células divididas ou não divididas e seu tropismo será modificado dependendo do serotipo. O serotipo é a classificação de grupos de viroses dependendo de seu antígeno do capsídeo. O serotipo do vírus adeno- associado determinado por seu capsídeo proteico definirá o tropismo do vírus e permitirá sua entrada em um tipo de célula específica. No contexto da presente invenção, o serotipo 9 dos vetores de vírus adeno- associados (AAV9) apresentam melhor capacidade para distribuir o material genético ao cérebro, assim como, aos órgãos periféricos através de uma única administração.

[0076] Os inventores descobriram surpreendentemente que a associação, na mesma entidade, do capsídeo AAV9 à uma sequência de nucleotídeos codificando para alfa-N-acetil-glucosaminidase junto com um promotor de CAG específico permitirá uma expressão de longa duração da enzima deficiente em todas as áreas do cérebro. Como uma consequência, o depósito lisossômico de glicosaminoglicanos (GAG) será corrigido prevenindo dessa forma as alterações neurológicas características de doenças MPSIII, e em particular, de MPSIIIB. Esse efeito foi obtido até mesmo no bulbo olfativo que é um formato distante do ponto de administração dos vetores. Além disso, os vetores AAV9 de acordo com a invenção, distribuídos no líquido cefalorraquidiano (LCR) foram capazes de alcançar a circulação sistêmica para transdução no fígado. A produção e secreção da enzima pelas células do fígado resultaram em uma doença da atividade de alfa-N-acetil-glucosaminidase no soro, ultimamente direcionando à redução de patologia lisossômica em diversos tecidos somáticos. Isso representou uma clara vantagem dos vetores de acordo com a invenção em relação às abordagens que corrigiram apenas parcialmente os sinais clínicos da doença e normalmente exerceram seu efeito ou no cérebro, ou na circulação sistêmica, mas não em ambos.

[0077] Portanto, a presente invenção refere-se aos vetores AAV9 recombinantes contendo um promotor de CAG (SED ID NO: 4) ligados à uma sequência de nucleotídeos codificando para alfa-N-acetil-glucosaminidase SEQ ID NO: 1.

[0078] Em particular, os vetores AAV9 recombinantes da presente invenção contém um promotor de CAG (SEQ ID NO: 4) ligados à uma sequência de nucleotídeos codificando para alfa-N-acetil-glucosaminidase SEQ ID NO: 1 que tem pelo menos 80 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 2. Mais preferencialmente, os vetores AAV9 recombinantes da presente invenção contêm um promotor de CAG (SEQ ID NO: 4) ligados à uma sequência de nucleotídeos codificando para alfa-N-acetil-glucosaminidase SEQ ID NO: 1 que tem pelo menos 84 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 2. Em particular, a sequência de nucleotídeos codificando para alfa-N-acetil-glucosaminidase SEQ ID NO: 1 tem uma identidade de sequência de 84 %, 87 %, 90 %, 95 %, 98 % ou 99 % com a SEQ ID NO: 2.

[0079] Em outra configuração particular os vetores AAV9 recombinantes da presente invenção contêm um promotor de CAG (SEQ ID N O: 4) ligado à uma sequência de nucleotídeos codificando para alfa-N-acetil-glucosaminidase SEQ ID NO: 1 que tem pelo menos 85 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3. Em particular, a sequência de nucleotídeos codificando para alfa-N-acetil- glucosaminidase SEQ ID NO: 1 tem uma identidade de sequência de 85 %, 87 %, 90 %, 95 %, 98 % ou 99 % com a SEQ ID NO: 3.

[0080] Em uma configuração preferida da invenção, a sequência de nucleotídeos codificando para alfa-N-acetil-glucosaminidase SEQ ID NO: 1 é a SEQ ID NO: 2.

[0081] Em uma configuração ainda mais preferida da invenção, a sequência de nucleotídeos codificando para alfa-N-acetil-glucosaminidase SEQ ID NO: 1 é a SEQ ID NO: 3. A sequência, conforme definido na SEQ ID NO: 3 apresenta 84 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 2.

[0082] Em uma configuração ainda mais preferida da invenção, a sequência de nucleotídeos codificando para alfa-N-acetil-glucosaminidase SEQ ID NO: 1 é a SEQ ID NO: 19.

[0083] Em uma configuração ainda mais preferida da invenção, a sequência de nucleotídeos codificando para alfa-N-acetil-glucosaminidase SEQ ID NO: 1 é a SEQ ID NO: 22.

[0084] Os vetores AAV9 de acordo com a presente invenção contêm um promotor que controla a tradução e transcrição do gene de interesse. Um promotor é uma sequência de nucleotídeos operacionalmente ligada ao referido gene de interesse. O promotor usado na presente invenção é o promotor de CAG que se refere à combinação compreendendo o estimulador precoce do citomegalovírus e o promotor de actina de aves. Ainda inclui uma porção de íntrons de globina que confere estabilidade ao RNAm derivado do gene de interesse, verificar Alexooulou A, et al., BMC Biologia Celular 2008; 9(2): 1-11. O promotor de CAG incluído nos vetores AAV9 da presente invenção tem uma sequência SEQ ID NO: 4. Em particular esse promotor de CAG provou ser mais eficiente do que o promotor de CMV normalmente usado na técnica.

[0085] Em uma configuração ainda mais preferida da invenção o vetor AAV9 recombinante é escolhido a partir de AAV9-CAG-hNaglu (SEQ ID NO: 9), AAV9- CAG-cohNaglu (SEQ ID NO: 10) e AAV9-CAG-cohNaglu-versão2 (SEQ ID NO: 21) e AAV9-CAG-cohNaglu-versão3 (SEQ ID NO: 24). Preferencialmente, o vetor AAV9 recombinante é escolhido a partir de AAV9-CAG-hNaglu (SEQ ID NO: 9), AAV9-CAG-cohNaglu (SEQ ID NO: 10). Mais especificamente, os vetores AAV9 recombinantes da presente invenção são compostos pelo capsídeo viral de serotipo 9 do vírus adeno-associado humano e por um genoma modificado tendo a sequência de repetição terminal invertida (ITRs) do vírus adeno-associado humano de serotipo 2, o promotor de CAG, a sequência de codificação (CDS) do gene alfa-N-acetil-glucosaminidase humano (Naglu) e o poliA do gene beta globina de coelho.

[0086] A presente invenção também se refere aos plasmídeos que contêm a sequência de nucleotídeos codificando para alfa-N-acetil-glucosaminidase SEQ ID NO: 1. Em particular, os plasmídeos de acordo com a presente invenção contêm uma sequência de nucleotídeos codificando para alfa-N-acetil-glucosaminidase SEQ ID NO: 1 que tem pelo menos 80 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 2. Preferencialmente, os plasmídeos de acordo com a presente invenção contêm uma sequência de nucleotídeos codificando para alfa-N-acetil- glucosaminidase SEQ ID NO: 1 que tem pelo menos 84 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 2. Em particular, a sequência de nucleotídeos codificando para alfa-N-acetil-glucosaminidase SEQ ID NO: 1 tem uma identidade de sequência de 84 %, 87 %, 90 %, 95 %, 98 % ou 99 % com a SEQ ID No: 2.

[0087] Em uma configuração preferida, os plasmídeos de acordo com a presente invenção contêm uma sequência de nucleotídeos codificando para alfa-N-acetil- glucosaminidase SEQ ID NO: 1 que tem pelo menos 85 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3. Em particular, a sequência de nucleotídeos codificando para alfa-N-acetil-glucosaminidase SEQ ID NO: 1 tem uma identidade de sequência de 85 %, 87 %, 90 %, 95 %, 98 % ou 99 % com a SEQ ID NO: 3.

[0088] Esses plasmídeos são usados para a produção de vetores AAV9 recombinantes da presente invenção através de transfecção de células HEK293 usando métodos conhecidos no estado da técnica.

[0089] Em uma configuração preferida da invenção, a sequência de nucleotídeos contida nos plasmídeos da invenção e codificando para alfa-N-acetil- glucosaminidase SEQ ID NO: 1 é a SEQ ID NO: 2.

[0090] Em outra configuração preferida da invenção, a sequência de nucleotídeos contida nos plasmídeos da invenção e codificando para alfa-N-acetil- glucosaminidase SEQ ID NO: 1 é a SEQ ID NO: 3

[0091] Em outra configuração preferida da invenção, a sequência de nucleotídeos contida nos plasmídeos da invenção e codificando para alfa-N-acetil- glucosaminidase SEQ ID NO: 1 é a SEQ ID NO: 19.

[0092] Em outra configuração preferida da invenção, a sequência de nucleotídeos contida nos plasmídeos da invenção e codificando para alfa-N-acetil- glucosaminidase SEQ ID NO: 1 é a SEQ ID NO: 22.

[0093] Em uma configuração mais preferida, os plasmídeos da invenção são escolhidos a partir de pAAV-CAG-hNaglu (SEQ ID NO: 5), pAAV-CAG-cohNaglu (SEQ ID NO: 6), pAAV-CAG-cohNaglu-versão2 (SEQ ID NO: 20) e pAAV-CAG- cohNaglu-versão3 (SEQ ID NO: 23), e especialmente escolhidos a partir de pAAV-CAG-hNaglu (SEQ ID NO: 5) e pAAV-CAG-cohNaglu (SEQ ID NO: 6), e preferencialmente o plasmídeo é pAAV-CAG-cohNaglu (SEQ ID NO: 6).

[0094] A presente invenção provê ainda um método para a produção de vetores AAV9 recombinantes de vírus adeno-associados de acordo com a invenção. O processo compreende as etapas: i) provendo um primeiro vetor compreendendo a sequência codificando para a proteína de interesse interposta entre uma primeira repetição terminal de AAV e uma segunda repetição terminal de AAV, um promotor de CAG operacionalmente ligado à sequência codificando para a proteína de interesse, um segundo vetor compreendendo um gene rep de AAV e um gene cap de AAV de serotipo 9, e um terceiro vetor compreendendo o gene de função auxiliar do adenovírus; ii) cotransfectando células competentes com os vetores da etapa i); iii) cultivando as células transfectadas da etapa ii); iv) purificando os vetores de expressão de cultura da etapa iii).

[0095] Em uma configuração preferida, as primeiras e segunda repetições terminais de AAV do primeiro vetor são ITRs de serotipo 2 de AAV. Em outra configuração preferida, os genes rep de AAV do segundo vetor são de serotipo 2 de AAV. Em outra configuração preferida, as células competentes são células HEK293.

[0096] A invenção também provê um método de preparação de plasmídeos de acordo com a invenção compreendendo as etapas: i) erradicando a sequência codificando para a proteína de interesse do plasmídeo inicial, através de digestão, em particular usando Mlul/EcoRI; ii) clonando a sequência codificando para a proteína de interesse entre dois locais de restrição do pAAV-CAG de plasmídeo da espinha dorsal AAV, aqui obtendo o plasmídeo correspondente incluindo a sequência codificando para a proteína de interesse.

[0097] A presente invenção contempla, em um aspecto adicional, composições farmacológicas contendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de vetores AAV9 aqui descritos, ou uma quantidade terapeuticamente eficaz de plasmídeos aqui descritos.

[0098] As composições farmacológicas da invenção compreendem os vetores AAV9 recombinantes em um portador aceitável farmacologicamente. A composição também pode compreender pelo menos uma substância auxiliar. As substâncias auxiliares podem ser selecionadas entre os portadores, excipientes, solventes, diluentes ou adjuvantes. Portadores aceitáveis, diluentes ou adjuvantes não são tóxicos e são preferencialmente inertes em dosagens e concentrações empregadas e incluem soluções tampões, tais como, fosfato, citrato ou outros ácidos orgânicos; antioxidantes; polipeptídeos de baixo peso molecular, proteínas, tais como, albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos; aminoácidos; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes; álcoois de açúcar, tais como, manitol ou sorbitol, formadores de sais, tais como sódio; e/ou surfactantes não iônicos, tais como, copolímero de bloco polietileno-polióxipropileno (Pluronic F68®) polietilenoglicoll (PEG).

[0099] Em uma configuração preferida, as composições farmacológicas de acordo com a invenção são adequadas para a administração por via parenteral. Exemplos de administração por via parenteral são administrações de injeções intravenosa, subcutânea, intracisternal e intramuscular. Preferencialmente, a composição farmacológica de acordo com a invenção é adequada para a administração por via intracisternal ou intravenosa. As composições adequadas para a referida administração parenteral incluem soluções aquosas esterilizadas ou dispersões, pó esterilizado para preparação extemporânea de soluções ou dispersões esterilizadas. Como uma vantagem, as composições farmacológicas de acordo com a invenção são preservadas da ação contaminante de fungos e bactérias.

[00100] A dosagem diária para humanos e animais poderá variar dependendo de fatores que tem sua base em espécies respectivas ou outros fatores, tais como, idade, gênero, peso ou nível de saúde adequado.

[00101] Outro aspecto da presente invenção refere-se ao uso terapêutico dos vetores AAV9 aqui descritos, ou aos plasmídeos anteriormente descritos. Conforme acima mencionado, os vetores AAV9 de acordo com a invenção alcançam uma expressão da enzima Naglu ausente corrigindo assim o depósito lisossômico de GAGs. Isso permite corrigir todos os sinais clínicos da mucopolissacaridose do tipo III (MPSIII) e especialmente, MPSIIIB. Sob esse aspecto, a presente invenção também se trata de vetores AAV9 recombinantes anteriormente descritos ou de plasmídeos anteriormente descritos para uso como um medicamento.

[00102] Em particular, a invenção refere-se aos vetores AAV9 anteriormente descritos ou aos plasmídeos anteriormente descritos para aumentar a atividade do gene alfa-N-acetil-glucosaminidase no corpo.

[00103] Em um aspecto ainda mais preferido, a presente invenção refere-se aos vetores AAV9 recombinantes anteriormente descritos, ou aos plasmídeos anteriormente descritos para o tratamento da mucopolissacaridose do tipo III (MPSIII) e especialmente a MPSIIIB.

[00104] Ainda em mais uma configuração, a presente invenção refere-se ao uso de vetores AAV9 recombinantes anteriormente descritos, ou de plasmídeos anteriormente descritos para a produção de um medicamento usado para o tratamento da mucopolissacaridose do tipo III (MPSIII), e especialmente a MPSIIIB.

[00105] Outra configuração da presente invenção está direcionada ao método de tratamento de mucopolissacaridoses do tipo III (MPSIII) e especialmente da MPSIIIB compreendendo a etapa de administração de pelo menos um vetor AAV9 anteriormente descrito, ou de pelo menos um plasmídeo anteriormente descrito para um indivíduo que necessita dos mesmos.

[00106] A presente invenção também provê uma célula isolada compreendendo a sequência de nucleotídeos codificando para alfa-N-acetil- glucosaminidase SEQ ID NO: 1. Em particular, a célula, de acordo com a invenção compreende uma sequência de nucleotídeos codificando para alfa-N- acetil-glucosaminidase SEQ ID NO: 1 tendo pelo menos 80 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 2. Preferencialmente, a sequência de nucleotídeos codificando para alfa-N-acetil-glucosaminidase SEQ ID NO: 1 tendo pelo menos 84 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 2. Em particular, uma sequência de nucleotídeos codificando para alfa-N-acetil-glucosaminidase SEQ ID NO: 1 tendo uma identidade de sequência de 84 %, 87 %, 90 %, 95 %, 98 %, ou 99 % com a SEQ ID NO: 2. Em um aspecto ainda mais particular, a sequência de nucleotídeos codificando para alfa-N-acetil-glucosaminidase SEQ ID NO: 1 tendo pelo menos 85 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3, e preferencialmente 85 %, 87 %, 90 %, 95 %, 98 %, ou 99 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3.

[00107] Em uma configuração preferida, as células da invenção compreendem uma sequência de nucleotídeos SEQ ID NO: 2 codificando para alfa-N-acetil-glucosaminidase SEQ ID NO: 1.

[00108] Em outra configuração preferida, as células da invenção compreendem uma sequência de nucleotídeos SEQ ID NO: 3 codificando para alfa-N-acetil-glucosaminidase SEQ ID NO: 1.

[00109] Em outra configuração preferida, as células da invenção compreendem uma sequência de nucleotídeos SEQ ID NO: 19 codificando para alfa-N-acetil-glucosaminidase SEQ ID NO: 1.

[00110] Em outra configuração preferida, as células da invenção compreendem uma sequência de nucleotídeos SEQ ID NO: 22 codificando para alfa-N-acetil-glucosaminidase SEQ ID NO: 1.

[00111] Os exemplos a seguir de algumas configurações da invenção são meramente ilustrativos e não podem ser considerados como restritivos em qualquer maneira. PROCEDIMENTOS GERAIS

1. Vetores AAV recombinantes.

[00112] Os vetores AAV aqui descritos foram obtidos através de transfecção tripla. Os materiais exigidos para a produção dos vetores foram: células HEK293 (expressando genes E1), plasmídeo auxiliar provendo função de adenovírus, plasmídeo provendo genes rep de AAV de serotipo 2 e genes cap de serotipo 9 (AAV9) e, finalmente, plasmídeo da espinha dorsal com ITRs de AAV2 e a construção de interesse.

[00113] Para a produção de alfa-N-acetil-glucosaminidase expressando vetores AAV, as sequências de codificação otimizadas ou não otimizadas de alfa- N-acetil-glucosaminidase murino, canino ou humano foram clonadas em um plasmídeo da espinha dorsal AAV sob o controle do promotor de CAG híbrido onipresente.

[00114] Os vetores foram produzidos através do auxiliar de transfecção livre de vírus de células HEK293 usando três plasmídeos com modificações. Verificar Matsushita T, et al., Ter Genética. 1998; 5:938-945 e Wright J, et al., Ter.mol. 2005;12:171-178. As células foram cultivadas com 70 % de confluência em frascos de cultura de célula (RB) (Corning, Corning, NY, US) em DMEM suplementadas com 10% de FBS e então co-transfectadas com: 1) um plasmídeo portando o cassete de expressão cercado por ITRs virais de serotipo 2 de AAV (descrito acima); 2) um plasmídeo portando genes rep2 de AAV e genes cap9 de AAV; e 3) um plasmídeo portando as funções auxiliares do adenovírus. Os vetores foram purificados por dois gradientes consecutivos de cloreto de césio usando um protocolo otimizado conforme descrito previamente. Verificar Ayuso E, et al., Ter. genética. 2010;17:503-510. Os vetores foram dialisados com PBS, filtrados, titulados através de qPCR e armazenados a -80°C até o uso.

[00115] Os vetores da presente invenção foram construídos de acordo com técnicas biológicas moleculares conhecidas no estado da técnica.

[00116] 2. Animais.

[00117] Um mutante congênico do modelo alfa-N-acetil-glucosaminidase C57BI/6J de um rato deficiente (MPSIIIB) foi comprado do Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA. Stock 003827). Verificar Li et al., Proc Natl Acad Sci. 1999; 96(25):14505-10. Os ratos afetados com MPSIIIB e de saúde sob controle eram consanguíneos de modelos heterozigóticos. O genótipo foi determinado no DNA genômico a partir de amostras da cauda através do método de PCR que amplifica uma sequência abrangendo a mutação alvo. As sequências dos respectivos primers senso e anti-senso foram: primer senso: 5’-GTC GTC TCC TGG TTC TGG AC-3’ (SEQ ID NO: 13), primer anti-senso: 5’-ACC ACT TCA TTC TGG CCA AT-3’ (SEQ ID NO: 14), Mutação primer anti-senso: 5’- CGC TTT CTG GGC TCA GAG-3’ (SEQ ID NO: 15). Os ratos foram alimentados ad libitum com uma dieta padrão (Harlan, Tekland) e mantidos sob um ciclo diurno de 12h (exposição a luz a partir de 9:00 horas).

[00118] 3. Distribuição hidrodinâmica de plasmídeos codificando para hNaglu em ratos.

[00119] Para a distribuição hidrodinâmica de plasmídeos pAAV-CAG-hNaglu, pAAV-CAG-cohNaglu-versão2 e pAAV-CAG-cohNaglu-versão3, animais do tipo selvagem e de dois meses de vida com MPSIIIB receberam por meio de injeção venosa caudal em <5 segundos uma dosagem total de 50 μg de plasmídeos em um volume igual a 10% do peso corpóreo do animal. Essa técnica resultou na expressão transgênica codificando o plasmídeo principalmente no fígado. Verificar Liu et al., Ter. genética. 1990;6(7):1258-66. Como controle, um grupo de ratos receberam um volume igual de solução salina. Os ratos foram sacrificados 1 semana após a injeção hidrodinâmica de plasmídeos. Os órgãos foram coletados conforme descrito na seção a seguir.

[00120] 4. Administração de vetor e coleção de amostra.

[00121] Para a distribuição intracisternal de vetores AAV9-CAG-comNaglu em ratos, uma dosagem total de 3x1010 vg foi injetada na cisterna magna dos animais de 2 meses de vida com MPSIIIB. Um grupo semelhante de animais foi injetado com 3.9x1010 vg do vetor de controle não codificado (AAV9-nulo). Aos 5 meses de vida, isto é, 3 meses após a administração do vetor, os ratos foram anestesiados e então uma perfusão transcardial foi efetuada com 10 ml de PBS para limpar completamente o sangue dos tecidos. Todo o cérebro e tecidos somáticos múltiplos (incluindo fígado, baço, pâncreas, rim, pulmão, coração, músculos esqueléticos e testículos) foram coletados e congelados em nitrogênio líquido e armazenados a -80°C ou imersos em formalina para análises histológicas posteriores.

[00122] Para a distribuição intravenosa de vetores AAV9-CAG-hNaglu e AAV9-CAG-cohNaglu, animais de 2 meses de vida com MPSIIIB receberam uma dosagem total de 5x1011 vg por meio de injeção venosa caudal. Aos 4 meses de vida, isto é, 2 meses após a administração do vetor, os ratos foram sacrificados e os órgãos foram coletados conforme descrito no parágrafo anterior.

[00123] Para a distribuição intracisternal de vetores AAV9-CAG-hNaglu e AAV9-CAG-cohNaglu, uma dosagem total de 9.3x109 vg foi injetada na cisterna magna de animais de 2 meses de vida com MPSIIIB. Aos 4 meses de vida, isto é, 2 meses após a administração do vetor, os ratos foram sacrificados e os órgãos foram coletados conforme descrito no parágrafo anterior.

[00124] Para a distribuição intracisternal de vetores AAV9-CAG-cocNaglu em cachorros, uma dosagem total de 6.5x1012 vg foi administrada em cachorros adultos saudáveis da raça Beagle via injeção na cisterna magna. Dois dos animais receberam uma injeção intravenosa de 1x1011 vg/kg de vetores AAV9- nulo 6 semanas antes da administração de vetores Naglu para pré-imunizar os mesmos com o AAV9. Primeiramente semanalmente, posteriormente mensalmente, amostras de soro e LCR foram coletadas e armazenadas a -80°C.

[00125] 5. Quantidade de número de cópias do genoma do vetor.

[00126] Tecidos («100 mg) foram digeridos durante a noite (ON) a 56°C em 400 μl de solução Proteinase K (0.2 mg/ml). O DNA total foi isolado de supernatantes através de extração usando técnicas padrões. O DNA foi resuspendido em água destilada e quantificado usando um NanoDrop ND-1000 (NanoDrop, Wilmington, DE, USA). O número de cópias do genoma do vetor em 20 ng de DNA total foi determinado por PCR quantitativo em tempo real com primers e provas específicas para o transgênico alfa-N-acetil-gluosaminidase murino que não amplifica o lócus genômico endógeno. Primer senso: 5’-GCC GAG GCC CAG TTC TAC-3’ (SEQ ID NO: 16); primer anti-senso: 5’-TTG GCG TAG TCC AGG ATG TTG-3’ (SEQ ID NO: 17); prova: 5’-AGC AGA ACA GCA GAT ACC AGA TCA CCC-3’ (SEQ ID NO: 18). Os valores finais foram determinados em comparação à uma curva padrão de referência construída a partir de diluições em série de plasmídeos linearizados usados para a produção do vetor AAV em 20 ng de DNA genômico não transduzido.

[00127] 6. Quantificação da atividade de alfa-N-acetil-glucosaminidase e de glicosaminoglicanos.

[00128] Amostras do fígado e do cérebro foram sonicadas em água Mili-Q. O soro foi analisado de forma não processada. A atividade de alfa-N-acetil- glucosaminidase foi determinada com um substrato fluorogênico derivado de 4- metilumbeliferona (Moscerdam Substrates, Oegstgeest, NL), conforme previamente descrito. Verificar Marsh e Fensom, Clin Genet. 1985;27(3):258-262. Os níveis de atividade no fígado e no cérebro foram normalizados à quantidade total de proteína quantificada por meio do teste de proteína de Bradford (Bio-Rad, Hercules, CA, US). A atividade do soro foi normalizada ao volume.

[00129] Para a quantidade de glicosaminoglicanos (GAG), amostras de tecido foram pesadas e então digeridas com proteinase K e extratos foram clarificados por centrifugação e filtração. Os níveis de GAG foram determinados em extratos de tecido por meio do kit de coloração Blyscan (Biocolor, Carrickfergus, County Antrim, GB), usando sulfato de condroitina-4 como padrão. Os níveis de GAG foram normalizados ao peso do tecido úmido.

[00130] 7. Atividade de outras enzimas lisossômicas.

[00131] A atividade de IDUA foi medida em 15 μg de proteína incubada por 1 h a 37°C com 4-metilumbeliferil-alfa-N-iduronídeo (Glycosynth). Para a atividade de IDS, 15 μg de proteína foi primeiramente incubada com sulfato de 4- metilumbeliferil-alfa-L-iduronídeo-2 (Moscerdam Substrates) por 4 h a 37°C, seguido por uma segunda incubação de 24 h a 37°C em uma piscina de enzimas lisossômicas de testículos bovino (LEBT-M2, Moscerdam Substrates). A atividade de SGSH foi medida conforme descrito anteriormente. Verificar Haurigot et al., J Clin Invest 2013;123(8):3254-71. Para a atividade de GUSB, 10 μg de proteína foi incubada com 4-metilumbeliferil-beta-D-glicuronídeo (Sigma) a 37°C por 1 h. A atividade de HEXB foi testada por incubação de 0.1 μg de proteína com 4- metilumbeliferil-N-acetil-beta-D-glicosaminida (Sigma) por 1 h a 37°C. Após a interrupção de reações aumentando o pH, a fluorescência liberada foi medida com o fluorômetro (BioTek Instruments). Todas as atividades enzimáticas foram normalizadas ao conteúdo total de proteína quantificado por Bradford (Bio-Rad).

[00132] 8. Análises histológicas.

[00133] Os tecidos foram fixados por 12-24 h em formalina, embebedados em parafina e separados. Para a detecção imuno-histoquímica de LAMP1 em tecidos somáticos, as divisões de parafina foram submetidas à solução tampão de citrato por meio do método de recolha de epitopo induzida por calor, pH 6, e então incubadas ao longo da noite a 4°C com o anticorpo de rato anti-LAMP1 (1D4B; Santa Cruz Biotecnologia, Santa Cruz, CA, US) diluído em 1:100 e posteriormente incubado com o anticorpo de coelho anti-rato biotinilado (Dako, Glostrup, DK) em 1:300. Para a detecção imuno-histoquímica de LIMP2 no cérebro, as seções de parafina foram incubadas ao longo da noite a 4°C com o anticorpo de coelho anti- LIMP2 (NB400; Novus Biologicals, Littleton, CO, USA) diluído em 1:100 e posteriormente incubado com anticorpo de cabra anti-coelho biotinilado (31820; Laboratórios vetoriais, Burlingame, CA, USA) em 1:300. Para a imunocoloração GFAP em amostras de cérebro, seções de parafina foram incubadas ao longo da noite a 4°C com anticorpo de coelho anti-GFAP (Ab6673; Abcam, Cambridge, UK) diluído em 1:1000 e posteriormente incubado com anticorpo de cabra anti-coelho biotinilado (31820; Laboratórios vetoriais, Burlingame, CA, USA) em 1:300. Os sinais de LAMP1, LIMP2 e GFAP foram ampliados encubando seções com o kit de coloração ABC-Peroxidase (Thermo Scientific, Waltham, MA, US) em diluição de 1:100 e visualizados usando 3,3-diaminobenzidina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, US) como um cromogênio. Imagens brilhantes foram obtidas com um microscópico óptico. (Eclipse 90i; Nikon, Tokyo, JP).

[00134] Para a coloração de células micróglias em amostras do cérebro, as divisões de parafina foram incubadas ao longo da noite a 4°C com lectina Bsi-B4 (L5391; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) diluídas em 1:100. O sinal de Bsi-B4 foi visualizado usando 3,3-diaminobenzidina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, US) como um cromogênio. Imagens brilhantes foram obtidas com um microscópico óptico. (Eclipse 90i; Nikon, Tokyo, JP).

[00135] O Programa de pesquisa avançada de elementos NIS 2.20 foi usado para quantificar os sinais de LIMP2, GFAP, e Bsi-B4 em imagens 3-5 de cada região do cérebro (ampliação original, x20) por animal, usando a mesma definição padrão de sinal em todos os animais. Então, a porcentagem de áreas positivas foi calculada, isto é, a área em pixels com um sinal positivo ao longo da área total do tecido na imagem.

[00136] 9. Análise de microscopia eletrônica de transmissão.

[00137] Os ratos foram sacrificados por meio de uma overdose de isoflurano (Isofluo, Labs. Esteve, Barcelona, ES) e perfurados via a veia cava inferior com 1 ml de 2.5% de glutaraldeído e 2% de paraformaldeído. Uma pequena porção (aproximadamente 1mm3) do lóbulo lateral do fígado e do córtex cerebral foram separadas e incubadas por 2 horas a 4°C no mesmo fixador. Após lavagem com solução tampão de cacodilato frio, os espécimes foram pós-fixados em 1 % de tetróxido de ósmio, coloridos em acetato de uranila aquosa, e então desidratados através de séries graduadas de etanol e umedecidos em resina epóxi. Seções ultrafinas (600-800 Á) de blocos de resina foram coloridas usando citrato de chumbo e examinadas em um microscópio eletrônico de transmissão (H-7000; Hitachi, Tokyo, JP).

[00138] 10. Análise transcriptômica.

[00139] Metade do cérebro do rato (-250 mg) foi mecanicamente homogeneizada e o RNA total foi isolado com mirVanaTM (Ambion, Life Technologies). O cDNA foi sintetizado e posteriormente hibridizado em uma placa de matriz Genechip Mouse Gene 2.1 ST 16 (Affymetrix) de Progenika Biopharma (Espanha); o processamento, hibridização e escaneamento das amostras foram efetuados de acordo com o equipamento e protocolos recomendados por Affymetrix. A normalização de dados foi dada pela técnica de microarranjo de RMA usando o programa Expression Console TM da Affymetrix®, obtendo valores normalizados transformados de log2. Os dados foram filtrados para enfocar a análise em sequências de codificação conhecidas obtendo uma listagem inicial de 26688 genes alterados, os quais foram posteriormente refiltrados para a remoção de genes com variação abaixo de 75%. Esse processo gerou uma listagem de trabalho de 6672 genes. Para os genes expressados diferentemente, o critério de FDR (Taxa de falsa descoberta) <0.1 com 80% de segurança foi estabelecido. Para a análise de agrupamento, os dados foram padronizados e representados como mapas de calor usando o programa J-Express Pro (jexpress.bioinfo.no). A análise funcional foi desenvolvida usando a ferramenta Genecodis 2.0 (genecodis2.dacya.ucm.es). Os dados padrões foram submetidos à base de dados ArrayExpress (http://www.ebi.ac. uk/arrayexpress/; accession code: E- MTAB-2984).

[00140] 11. Avaliação comportamental.

[00141] As alterações comportamentais foram avaliadas através do teste do campo aberto. Os animais foram colocados no canto esquerdo inferior de uma câmara brilhante (41 x 41 x 30 cm). A superfície da arena foi dividida em três quadrados concêntricos: parte central (14 x 14 cm), parte periférica (27 x 27 cm) e bordas (41 x 41 cm). O comportamento exploratório e atividade geral foram registrados durante os primeiros dois minutos usando um sistema de monitoramento de vídeo (Smart Junior, Panlab). O teste foi desenvolvido sempre no mesmo horário do dia (9:00 horas a 13:00 horas) para minimizar a influência de ciclos cicardianos.

[00142] 12. Análise estatística.

[00143] Todos os resultados foram expressados significando ± SEM. As comparações estatísticas foram efetuadas usando a análise de variância unidirecional ANOVA, e comparações múltiplas entre grupos de controle e tratamento foram efetuadas usando o pós-teste de Dunnett. A significância estatística foi considerada se P < 0.05. O método de Kaplan-Meier foi usado para analisar sobreviventes e o teste de hipóteses log-rank para comparações.

EXEMPLOS Exemplo 1: Construção de pAAV-CAG-hNaglu

[00144] A sequência de codificação (CDS) de alfa-N-acetil-glucosaminidase humano foi utilizada como material inicial (Sequência de referência NCBI: NM_000263) e quimicamente sintetizada para essa finalidade (GeneArt; Life Technologies). A CDS foi recebida clonada dentro do plasmídeo pMA(AmpR) circundada por locais de restrição Mlul e EcoRI em terminais 5’ e 3’, respectivamente. A CDS de alfa-N-acetil-glucosaminidase foi extraída por digestão de Mlul/EcoRI e então clonada entre os locais de restrição Mlul e EcoRI do plasmídeo pAAV-CAG (AmpR) da espinha dorsal AAV. O plasmídeo resultante foi nomeado de pAAV-CAG-hNaglu (número de registro DSM 28568). Verificar SEQ ID NO: 5, e Figura 19A.

[00145] O plasmídeo pAAV-CAG foi previamente gerado e continha as ITRs do genoma de AAV2, o promotor de CAG, e o sinal poliA da beta globina de coelho, assim como, local de multiclonagem para clonar as CDSs de interesse. O promotor de CAG é um promotor híbrido composto por um intermediário intensificador/promotor inicial de CMV e um promotor de betactina de aves. Esse promotor é capaz de conduzir uma potente expressão ubiquamente. Verificar Sawicki J et al., Exper Cell Res. 1998;244:367-369, Huang J et al., J Med. gen. 2003;5:900-908, Liu Y etal., Exp Mol Med. 2007; 39(2):170-175.

Exemplo 2: Produção de AAV9-CAG-hNaglu.

[00146] Os vetores AAV9-CAG-hNaglu (SEQ ID NO: 9 e Figura 19B) foram gerados através da transfecção do auxiliar livre de vírus de células HEK293 usando três plasmídeos com alterações. Verificar Matsushita, 1998, supra e Wright, 2005, supra. As células foram cultivadas com 70 % de confluência em frascos de cultura de célula (RB) (Corning, Corning, NY, US) em DMEM suplementadas com 10 % de FBS e então co-transfectadas com: 1) um plasmídeo portando o cassete de expressão circundado por ITRS de AAV2 (pAAV-CAG- hNaglu); 2) um plasmídeo portando os genes rep de AAV2 e cap de AAV9 (pREP2CAP9); e 3) um plasmídeo portando as funções auxiliares do adenovírus. Os vetores foram purificados por dois gradientes consecutivos de cloreto de césio usando tanto um protocolo padrão como um protocolo otimizado conforme previamente descrito. Verificar Ayuso, 2010, supra. Os vetores foram dialisados com PBS, filtrados, titulados por qPCR e armazenados a -80°C até o uso.

Exemplo 3: Construção de pAAV-CAG-cohNaglu.

[00147] Cassetes de expressão incluindo uma versão otimizada da CDS de alfa-N-acetil-glucosaminidase humano (cohNaglu) foram concebidos e obtidos. A otimização da sequência (GeneArt®) foi realizada para maximizar a eficácia de produção da proteína alfa-N-acetil-glucosaminidase em seres humanos através da eliminação de sítios de splicing crípticos e elementos de sequência de desestabilização do RNA para aumentar a estabilidade do RNA, adição de elementos de sequência estabilizando o RNA, otimização de códon e adaptação de conteúdo de G/C, alerta de estruturas secundárias de RNA estável entre outras alterações. A CDS otimizada foi recebida clonada no plasmídeo pMA-RQ (AmpR) circundada por locais de restrição Mlul e EcoRI em 5’ e 3’, respectivamente.

[00148] O plasmídeo pMA-RQ-cohNaglu foi digerido com Mlul e EcoRI para a extração da CDS de alfa-N-acetil-glucosaminidase otimizado. Posteriormente, esse fragmento foi clonado entre os mesmos locais de restrição do plasmídeo da espinha dorsal pAAV-CAG para gerar o plasmídeo pAAV-CAG-cohNaglu (número de registro DSM 26626). Verificar SEQ ID NO: 6 e Figura 20A.

Exemplo 4: Produção de AAV9-CAG-cohNaglu.

[00149] Os vetores AAV9-CAG-cohNaglu (SEQ ID NO: 10 e Figura 20B) foram gerados através da transfecção do auxiliar livre de vírus de células HEK293 usando três plasmídeos com alterações. Verificar Matsushita, 1998, supra e Wright, 2005, supra. As células foram cultivadas com 70 % de confluência em frascos de cultura de célula (RB) (Corning, Corning, NY, US) em DMEM suplementadas com 10 % de FBS e então co-transfectadas com: 1) um plasmídeo portando o cassete de expressão circundado por ITRs de AAV2 (pAAV-CAG- cohNaglu); 2) um plasmídeo portando os genes rep de AAV2 e cap de AAV9 (pREP2CAP9); e 3) um plasmídeo portando as funções auxiliares do adenovírus. Os vetores foram purificados por dois gradientes consecutivos de cloreto de césio usando tanto um protocolo padrão como um protocolo otimizado conforme previamente descrito. Verificar Ayuso, 2010, supra. Os vetores foram dialisados com PBS, filtrados, titulados por qPCR e armazenados a -80°C até o uso.

Exemplo 5: Construção de pAAV-CAG-cohNaglu-versão2.

[00150] Cassetes de expressão incluindo uma segunda versão otimizada da CDS de alfa-N-acetil-glucosaminidase humano (cohNaglu-versão2) foram concebidos e obtidos. A CDS otimizada (DNA 2.0®) foi recebida clonada no plasmídeo pJ208 (AmpR) circundada por locais de restrição Mlul e EcoRI em 5’ e 3’, respectivamente.

[00151] O plasmídeo pJ208-cohNaglu-versão2 foi digerido com Mlul e EcoRI para a extração da CDS de alfa-N-acetil-glucosaminidase-versão2 otimizado. Posteriormente, esse fragmento foi clonado entre os mesmos locais de restrição do plasmídeo da espinha dorsal pAAV-CAG para gerar o plasmídeo pAAV-CAG- cohNaglu-versão2 (número de registro DSM 32042). Verificar SEQ ID NO: 20 e Figura 21A.

Exemplo 6: Produção de AAV9-CAG-cohNaglu-versão2.

[00152] Os vetores AAV9-CAG-cohNaglu-versão2 (SEQ ID NO: 21 e Figura 21B) foram gerados através de transfecção do auxiliar livre de vírus de células HEK293 usando três plasmídeos com alterações. Verificar Matsushita, 1998, supra e Wright, 2005, supra. As células foram cultivadas com 70 % de confluência em frascos de cultura de célula (RB) (Corning, Corning, NY, US) em DMEM suplementadas com 10 % de FBS e então co-transfectadas com: 1) um plasmídeo portando o cassete de expressão circundado por ITRs de AAV2 (pAAV-CAG- cohNaglu-versão2); 2) um plasmídeo portando os genes rep de AAV2 e cap de AAV9 (pREP2CAP9); e 3) um plasmídeo portando as funções auxiliares do adenovírus. Os vetores foram purificados por dois gradientes consecutivos de cloreto de césio usando tanto um protocolo padrão como um protocolo otimizado conforme previamente descrito. Verificar Ayuso, 2010, supra. Os vetores foram dialisados com PBS, filtrados, titulados por qPCR e armazenados a -80°C até o uso.

Exemplo 7: Construção de pAAV-CAG-cohNaglu-versão3.

[00153] Cassetes de expressão incluindo uma terceira versão otimizada da CDS de alfa-N-acetil-glucosaminidase humano (cohNaglu-versão3) foram concebidos e obtidos. A CDS otimizada (GenScript, Inc) foi recebida clonada no plasmídeo pUC57 (AmpR) circundada por locais de restrição Mlul e EcoRI em 5’ e 3’, respectivamente.

[00154] O plasmídeo pUC57-cohNaglu-versão3 foi digerido com Mlul e EcoRI para a extração da CDS de alfa-N-acetil-glucosaminidase-versão3 otimizado. Posteriormente, esse fragmento foi clonado entre os mesmos locais de restrição do plasmídeo da espinha dorsal pAAV-CAG para gerar o plasmídeo pAAV-CAG-cohNaglu-versão3 (número de registro DSM 32043). Verificar SEQ ID NO: 23 e Figura 22A.

Exemplo 8: Produção de AAV9-CAG-cohNaglu-versão3.

[00155] Os vetores AAV9-CAG-cohNaglu-versão3 (SEQ ID NO: 24 e Figura 22B) foram gerados através da transfecção do auxiliar livre de vírus de células HEK293 usando três plasmídeos com alterações. Verificar Matsushita, 1998, supra e Wright, 2005, supra. As células foram cultivadas com 70 % de confluência em frascos de cultura de célula (RB) (Corning, Corning, NY, US) em DMEM suplementadas com 10 % de FBS e então co-transfectadas com: 1) um plasmídeo portando o cassete de expressão circundado por ITRs de AAV2 (pAAV-CAG- cohNaglu-versão3); 2) um plasmídeo portando os genes rep de AAV2 e cap de AAV9 (pREP2CAP9); e 3) um plasmídeo portando as funções auxiliares do adenovírus. Os vetores foram purificados por dois gradientes consecutivos de cloreto de césio usando tanto um protocolo padrão como um protocolo otimizado conforme previamente descrito. Verificar Ayuso, 2010, supra. Os vetores foram dialisados com PBS, filtrados, titulados por qPCR e armazenados a -80°C até o uso.

Exemplo 9: Construção de pAAV-CAG-comNaglu.

[00156] A CDS para alfa-N-acetil-glucosaminidase murino (Sequência de referência NCBI: NM_013792) foi submetida à otimização de sequência (GeneArt; Life Technologies). A CDS otimizada foi recebida clonada dentro do plasmídeo pMA-RQ (AmpR) circundada por locais de restrição Mlul e EcoRI em 5’ e 3’, respectivamente.

[00157] O fragmento da CDS de alfa-N-acetil-glucosaminidase murino otimizada foi extraído do plasmídeo pMA-RQ e posteriormente clonado entre os locais de restrição Mlul e EcoRI do plasmídeo pAAV-CAG da espinha dorsal AAV. O plasmídeo resultante foi nomeado de pAAV-CAG-comNaglu. Verificar SEQ ID NO: 7 e Figura 23A.

Exemplo 10: Produção de AAV9-CAG-comNaglu.

[00158] Os vetores AAV9-CAG-comNaglu (SEQ ID NO: 11 e Figura 23B) foram gerados através de transfecção do auxiliar livre de vírus de células HEK293 usando três plasmídeos com alterações. Verificar Matsushita, 1998, supra e Wright, 2005, supra. As células foram cultivadas com 70 % de confluência em frascos de cultura de célula (RB) (Corning, Corning, NY, US) em DMEM suplementadas com 10 % de FBS e então co-transfectadas com: 1) um plasmídeo portando o cassete de expressão circundado por ITRs de AAV2 (pAAV-CAG- comNaglu); 2) um plasmídeo portando os genes rep de AAV2 e cap de AAV9 (pREP2CAP9); e 3) um plasmídeo portando as funções auxiliares do adenovírus. Os vetores foram purificados por dois gradientes consecutivos de cloreto de césio usando tanto um protocolo padrão quanto um protocolo otimizado conforme previamente descrito. Verificar Ayuso, 2010, supra. Os vetores foram dialisados com PBS, filtrados, titulados por qPCR e armazenados a -80°C até o uso.

Exemplo 11: Construção de pAAV-CAG-cocNaglu.

[00159] A CDS para alfa-N-acetil-glucosaminidase canino (Sequência de referência NCBI: XM_548088.4) foi submetida à otimização de sequência (GeneArt; Life Technologies). A CDS otimizada foi recebida clonada dentro do plasmídeo pMA-RQ (AmpR) circundada por locais de restrição Mlul e EcoRI em 5’ e 3’, respectivamente.

[00160] O fragmento da CDS de alfa-N-acetil-glucosaminidase canino otimizado foi extraído do plasmídeo pMA-RQ e posteriormente clonado entre os locais de restrição Mlul e EcoRI do plasmídeo pAAV-CAG da espinha dorsal AAV. O plasmídeo resultante foi nomeado de pAAV-CAG-cocNaglu. Verificar SEQ ID NO: 8 e Figura 24A.

Exemplo 12: Produção de AAV9-CAG-cocNaglu.

[00161] Os vetores AAV9-CAG-cocNaglu (SEQ ID NO: 12 e Figura 24B) foram gerados através de transfecção do auxiliar livre de vírus de células HEK293 usando três plasmídeos com alterações. Verificar Matsushita, 1998, supra e Wright, 2005, supra. As células foram cultivadas com 70 % de confluência em frascos de cultura de célula (RB) (Corning, Corning, NY, US) em DMEM suplementadas com 10 % de FBS e então co-transfectadas com: 1) um plasmídeo portando o cassete de expressão circundado por ITRs de AAV2 (pAAV-CAG- cocNaglu); 2) um plasmídeo portando os genes rep de AAV2 e cap de AAV9 (pREP2CAP9); e 3) um plasmídeo portando as funções auxiliares do adenovírus. Os vetores foram purificados por dois gradientes consecutivos de cloreto de césio usando tanto um protocolo padrão como um protocolo otimizado conforme previamente descrito. Verificar Ayuso, 2010, supra. Os vetores foram dialisados com PBS, filtrados, titulados por qPCR e armazenados a -80°C até o uso.

Exemplo 13: distribuição hidrodinâmica do plasmídeo pAAV9-CAG-hNaglu.

[00162] Uma dosagem total de 50 μg do plasmídeo pAAV9-CAG-hNaglu contendo o cassete de expressão de alfa-N-acetil-glucosaminidase humano selvagem foi administrada em ratos de 2 meses de vida com MPSIIIB via injeção hidrodinâmica na veia caudal (HDTV). Essa técnica enfoca a expressão do plasmídeo distribuído para o fígado. Verificar Liu et al., Ter. genética 1990;6(7):1258-66.

[00163] Uma semana após a distribuição do plasmídeo, um aumento considerável da atividade de alfa-N-acetil-glucosaminidase ao longo de níveis de pré-tratamento foi documentada no fígado e no soro de todos os animais administrados com plasmídeos codificando para alfa-N-acetil-glucosaminidase humano selvagem. Verificar Figuras 1A e 1B.

[00164] Nenhuma atividade foi detectada em animais com MPSIIIB injetados com solução salina. Os níveis da atividade de alfa-N-acetil-glucosaminidase foram observados no fígado e no soro dos animais tratados correspondendo à 150 % e 1700 %, respectivamente do valor médio da atividade medida no fígado e no soro de animas WT, o qual foi ajustado para 100 %. Verificar Figuras 1A e 1B.

Exemplo 14: distribuição intravenosa de AAV9-CAG-hNaglu.

[00165] Uma dosagem total de genomas do vetor 5x1011 de vetores AAV9- CAG-hNaglu foi administrada em ratos de 2 meses de vida com MPSIIIB via injeção na veia caudal.

[00166] Compativelmente ao alto tropismo de vetores AAV9 no fígado dois meses após a administração, os animais tratados apresentaram altos níveis da atividade de alfa-N-acetil-glucosaminidase neste órgão (700 % de níveis da atividade observada em animais saudáveis) o que eliminou completamente ou reduziu consideravelmente o acúmulo patológico de GAGs observado nos tecidos somáticos de ratos com MPSIIIB não tratados. Verificar Figura 2A-C. Além disso, dada a alta eficácia com os vetores AAV de serotipo 9 na transdução cerebral a partir de administração sistêmica, os animais tratados apresentaram significantes níveis de atividade de alfa-N-acetil-glucosaminidase (20-30 % de ratos saudáveis) em todas as regiões analisadas do cérebro. Verificar Figura 3A. Essa restauração parcial da atividade de alfa-N-acetil-glucosaminidase foi suficiente para limpar o acúmulo de GAG de todas as áreas do cérebro. Verificar Figura 3B.

Exemplo 15: distribuição intravenosa de AAV9-CAG-cohNaglu.

[00167] Uma dosagem total de genomas do vetor 5x1011 de vetores AAV9- CAG-cohNaglu foi administrada em ratos de 2 meses de vida com MPSIIIB via injeção na veia caudal.

[00168] Dois meses após a administração os animais tratados apresentaram altos níveis de atividade de alfa-N-acetil-glucosaminidase no fígado (600 % de níveis dos saudáveis) e um aumento moderado (7 % de níveis dos saudáveis) em níveis de atividade no soro. Verificar Figura 4A e 4B. A produção de alfa-N-acetil- glucosaminidase eliminou completamente, ou reduziu consideravelmente o acúmulo patológico de GAGs observado nos tecidos somáticos de ratos com MPSIIIB não tratados. Verificar Figura 4C. Além disso, os animais tratados apresentaram níveis significantes da atividade de alfa-N-acetil-glucosaminidase (18-27 % de ratos saudáveis) em todas as regiões analisadas do cérebro. Verificar Figura 5A. Essa restauração parcial da atividade de alfa-N-acetil- glucosaminidase foi suficiente para limpar o acúmulo de GAG de todas as áreas do cérebro. Verificar Figura 5B.

Exemplo 16: distribuição intracisternal de AAV9-CAG-hNaglu.

[00169] Uma dosagem total de genomas do vetor 9.3x109 de vetores AAV9- CAG-hNaglu foi injetada na cisterna magna de ratos de 2 meses de vida com MPSIIIB em um volume total de 5 μl.

[00170] A administração intra-LCR de vetores AAV9-CAG-hNaglu direcionou à altos níveis de atividade de alfa-N-acetil-glucosaminidase em todas as áreas analisadas do cérebro (50-100% de ratos saudáveis); nas partes da frente do cérebro a atividade alcançou níveis observados em animais saudáveis. Verificar Figura 6A. O acúmulo excessivo de GAGs foi completamente abolido nos cérebros de ratos com MPSIIIB tratados. Verificar Figura 6B. A partir da distribuição ao LCR, os vetores AAV de serotipo 9 escoam no fluxo sanguíneo e transduzem para o fígado. Verificar Haurigot et al., J Clin Invest 2013;123(8):3254-71. De acordo com isso, a atividade de alfa-N-acetil- glucosaminidase foi detectada no fígado de ratos com MPSIIIB tratados em níveis de 32 % dos animais saudáveis. Verificar Figura 7A. Esse aumento na atividade de alfa-N-acetil-glucosaminidase mediou a correção de acúmulo de GAG no fígado, baço, coração, pulmão, testículos e bexiga urinária e também diminuiu significantemente o acúmulo de GAG no rim. Verificar Figura 7B.

Exemplo 17: distribuição intracisternal de AAV9-CAG-cohNaglu.

[00171] Uma dosagem total de genomas do vetor 9.3x109 de vetores AAV9- CAG-cohNaglu foi injetada na cisterna magna de ratos de 2 meses de vida com MPSIIIB em um volume total de 5 μl.

[00172] A administração por via intracisternal de vetores AAV9-CAG- cohNaglu direcionou à um aumento considerável em níveis da atividade de alfa-N- acetil-glucosaminidase que variou de 22 a 45 % de valores saudáveis em todas as áreas analisadas do cérebro. Verificar Figura 8A. Portanto, o acúmulo patológico de GAGs foi completamente revertido em todas as regiões do cérebro de ratos com MPSIIIB tratados. Verificar Figura 8B. A atividade de alfa-N-acetil- glucosaminidase também foi aumentada no fígado de ratos com MPSIIIB para 25 % de animais saudáveis. Verificar Figura 9A. Esse aumento na atividade de alfa- N-acetil-glucosaminidase mediou a correção de acúmulo de GAG no fígado, coração, pulmão, e bexiga urinária e também diminuiu significantemente o acúmulo de GAG no baço, testículos e rim. Verificar Figura 9B.

Exemplo 18: distribuição hidrodinâmica de plasmídeo pAAV9-CAG- cohNaglu-versão2.

[00173] Uma dosagem total de 50 μg de plasmídeo pAAV9-CAG-cohNaglu- versão2 portando um cassete de expressão contendo uma versão otimizada (versão2) de alfa-N-acetil-glucosaminidase humano foi administrada em ratos de 2 meses de vida com MPSIIIB via injeção hidrodinâmica na veia caudal. Conforme anteriormente mencionado, essa técnica enfoca na expressão do plasmídeo distribuído para o fígado. Verificar Liu et al., supra.

[00174] Uma semana após a distribuição do plasmídeo, o alfa-N-acetil- glucosaminidase foi aumentado ao longo de níveis de pré-tratamento no fígado e no soro de todos os animais que receberam uma injeção hidrodinâmica do plasmídeo contendo a versão2 otimizada da sequência de codificação de alfa-N- acetil-glucosaminidase. Verificar Figuras 10A e 10B. Nenhuma atividade foi detectada em animais MPSIIIB injetados com solução salina. Nos animais tratados, a atividade de alfa-N-acetil-glucosaminidase no fígado e no soro alcançou níveis que foram de 150 % e 1500 %, respectivamente do valor médio da atividade observada em animas WT (ajustado para 100 %). Verificar Figuras 10A e 10B.

Exemplo 19: distribuição hidrodinâmica de plasmídeo pAAV9-CAG- cohNaglu-versão3.

[00175] Uma dosagem total de 50 μg de plasmídeo pAAV9-CAG-cohNaglu- versão3 contendo uma versão de códon otimizado (versão3) de alfa-N-acetil- glucosaminidase humano expressando o cassete foi administrada em ratos de 2 meses de vida com MPSIIIB via injeção hidrodinâmica na veia caudal. Conforme anteriormente mencionado, essa técnica enfoca a expressão do plasmídeo distribuído para o fígado. Verificar Liu et al., supra.

[00176] Uma semana após a distribuição do plasmídeo, um aumento considerável na atividade de alfa-N-acetil-glucosaminidase ao longo de níveis de pré-tratamento foi documentada no fígado e no soro de todos os animais administrados com o plasmídeo portando a expressão do cassete que continha a versão3 de códon otimizado da sequência de codificação de alfa-N-acetil- glucosaminidase. Verificar Figuras 11A e 11B. Nenhuma atividade foi detectada em animais MPSIIIB injetados com solução salina. Os níveis da atividade de alfa- N-acetil-glucosaminidase observados no fígado e no soro dos animais tratados corresponderam à 170 % e 1100 %, respectivamente do valor médio da atividade determinada no fígado e no soro de animais WT que foi ajustado para 100 %. Verificar Figuras 11A e 11B.

Exemplo 20: distribuição intracisternal de AAV9-CAG-comNaglu.

[00177] Uma dosagem total de genomas do vetor 3x1010 de vetores AAV9- CAG-comNaglu foi injetada na cisterna magna de animais de 2 meses de vida com MPSIIIB em um volume total de 10 μl.

[00178] Os genomas do vetor AAV9 puderam ser detectados em todas as áreas analisadas do cérebro, assim como, na medula espinhal. Nos tecidos periféricos, os genomas do vetor puderam ser detectados em número de cópias gênicas consideráveis no fígado, e em um baixo número de cópias gênicas nos linfonodos os quais drenam a cabeça (linfonodos mandibulares). Verificar Figura 12A-B.

[00179] A administração intra-LCR de vetores AAV9-CAG-comNaglu direcionou à níveis muito altos da atividade de alfa-N-acetil-glucosaminidase em todas as áreas analisadas do cérebro: alcançando níveis que foram muitas vezes duas vezes maiores do que aqueles observados em animais saudáveis em todas as regiões. Verificar Figura 13A. Três meses após a distribuição do vetor, a patologia lisossômica característica da doença foi completamente revertida nos cérebros de ratos com MPSIIIB tratados, conforme indicado pela normalização de acúmulo de GAG e a intensidade do sinal para o marcador lisossômico LIMP-2+ em todas as áreas analisadas do cérebro. Verificar Figuras 13B e 14A. A análise ultra estrutural do córtex occipital e do cerebelo através de microscopia eletrônica de transmissão confirmou a redução na patologia lisossômica que foi muito evidente em células da glia perineural cortical que pareciam distendidas e repletas de grandes vacúolos de depósito em animais com MPSIIIB que receberam o vetor de controle, enquanto mantiveram uma aparência normal em animais tratados com AAV9-CAG-comNaglu. Verificar Figura 14B. Em LSDs, a atividade de diversas enzimas lisossômicas exceto as que foram diretamente afetadas pela mutação hereditária poderá ser alterada secundariamente para a perturbação de homeostase lisossômica normal. Verificar Sardiello et al., Ciência. 2009;325:473- 477. No cérebro de ratos machos de 5 meses de vida com MPSIIIB tratados com nulo ou não tratados, as atividades de iduronato 2-sulfatase (IDS), N- sulfoglucosamina-sulfohidrolase (SGSH), beta-glucoronidase (GUSB), e betahexosaminidase (HEXB) foram significantemente aumentadas. Verificar Figura 14C. Compativelmente à redução no acúmulo de GAG observado 3 meses após a distribuição intra-LCR de vetores AAV9-CAG-comNaglu, a atividade do cérebro, SGSH, GUSB, e HEXB retornaram aos níveis do tipo selvagem saudáveis em animais tratados. Verificar Figura 14C.

[00180] De acordo com a correção da patologia lisossômica todos os sinais de inflamação desapareceram do cérebro de ratos com MPSIIIB tratados. As intensidades do sinal de coloração usadas para detectar astrócitos (GFAP) e microgliose (BSI-B4) foram similares em ratos com MPSIIIB não tratados e em animais saudáveis, conforme oposto ao sinal documentado em ratos com MPSIIIB não tratados que mostraram uma clara regulação positiva desses marcadores de neuroinflamação. Verificar Figuras 15A e 15B. Para avaliar ainda mais a eficácia da terapia genética intra-LCR de AAV9-CAG-comNaglu na inflamação do SNC, um estudo do perfil de expressão gênica usando a ferramenta microarranjo Affimetrix® no RNA total isolado de WT e AAV9-CAG-comNaglu, ou de encéfalo com MPSIIIB tratado com AAV9-nulo foi realizado. Após o processamento de dados e filtração, 94 genes foram descobertos como expressados diferencialmente entre os três grupos. Quando a análise de enriquecimento de ontologia gênica (GO) foi usada para classificar genes expressados diferencialmente através do processo biológico, 67 dos 94 genes foram anotados com ontologias correspondentes. Verificar Figura 15C. Destes, a vasta maioria foi associada à inflamação e imunidade inata ou funções que podem ser atribuídas às células envolvidas nesses processos. Verificar Figura 15C. Para confirmar essa observação, foi usada a análise de enriquecimento genético (CTEN) para analisar a contribuição de diferentes tipos de células às alterações observadas em níveis de transcrição. Esse programa considera que há um enriquecimento de um tipo de célula específico se uma pontuação definida do programa for maior do que 2. A pontuação mais elevada para a definição de dados foi obtida a partir de células micróglias (pontuação = 60), um resultado de acordo com um papel importante da micróglia em doenças neuro-degenerativas e na MPSIIIB. Verificar Ohmi et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2003;100:1902-1907, McGeer et al. Alzheimer Dis Assoc Disord. 1998;12 (Suppl. 2):S1-E16, Derecki et al., Natureza. 2012;484: 105-109, DiRosario et al., J Neurosci Res. 2009;87:978-990, Archer, et al., J Inherit Metab Dis. 2014;37:1-12. Quando o efeito da distribuição intra-LCR de vetores AAV9-CAG-comNaglu foi avaliado, uma alteração impressionante no perfil da expressão gênica em relação aos animais que foram injetados com o AAV9-Nulo foi observada. Três meses após a administração do vetor a vasta maioria de genes em ratos com MPSIIIB tratados tiveram níveis de transcrição que pareceu àqueles de seus companheiros de pesquisa saudáveis. Quase 90 % dos genes expressados diferentemente nos ratos com MPSIIIB tratados apresentou uma correção em seus níveis de transcrição de pelo menos 50 % de acordo com o tratamento com o AAV9-CAG-comNaglu e em 60 % deles a correção foi de 75 %. Degraus maiores ou suavemente semelhantes de normalização em níveis de transcrição foram observados quando a definição de genes que o programa CTEN atribuiu à micróglia foi analisado separadamente. Verificar Figura 15D. Essa observação apoiou a ideia de que a micróglia é amplamente responsável pelo perfil de expressão gênica observado em MPSIIIB e está de acordo com a reversão completa de microglioses documentadas em animais tratados.

[00181] Os vetores AAV9 administrados no LCR escoam às periferias e transduzem para o fígado. Verificar Figura 9 e Haurigot et al., supra. Portanto, um aumento na atividade de alfa-N-acetil-glucosaminidase foi documentado no fígado e no soro de ratos com MPSIIIB tratados com o AAV9-CAG-comNaglu alcançando níveis de aproximadamente 800 % de níveis observados em animais saudáveis. Verificar Figuras 16A e 16B. Os níveis de atividade enzimática no soro correlacionaram-se bem àqueles da atividade no fígado de ratos tratados, sugerindo que o fígado foi a fonte principal da enzima de circulação. Quando a eficácia somática da terapia foi avaliada através da quantificação de conteúdo de GAG em diferentes órgãos, uma normalização total foi observada na maior parte dos tecidos incluindo fígado, baço, coração e pulmão com exceção do rim, em que um >50% de redução de GAGs foi observado. Verificar a Figura 16C. A análise ultra escultural do fígado em diferentes grupos experimentais apresentou o desaparecimento completo de vacúolos de depósito que são características da doença MPSIIIB em hepatócitos de ratos com MPSIIIB tratados com AAV9-CAG- comNaglu. Verificar Figura 16D. Conforme observado no SNC, a limpeza do material de depósito do compartimento lisossômico direcionou à restauração da atividade de outras enzimas lisossômicas. No fígado de ratos com MPSIIIB tratados com nulo ou não tratados, as atividades de alfa-iduronidase (IDUA), iduronato 2-sulfatase (IDS), SGSH, GUSB e HEXB foram alteradas. Verificar Figura 16E. Três meses seguidos com a transmissão gênica de NAGLU mediado por AAV9, a atividade de todas as enzimas retornou aos níveis normais suportando ainda o conceito de que o transporte genético LCR de NAGLU através de AAV9-CAG-comNaglu pode reverter o fenótipo da doença em órgãos periféricos. Verificar Figura 16E.

[00182] O impacto da administração por via intra-LCR do AAV9-CAG- comNaglu no comportamento foi avaliado através do teste de campo aberto que avalia a locomoção geral e atividade exploratória de ratos em arredores desconhecidos. Ratos com MPSIIIB tratados com AAV9-nulo e não tratados exibiram atividade exploratória reduzida quando comparado aos ratos saudáveis em termos de latência para entrada na parte central, tempo passado na borda, número de entradas para a parte central, tempo em repouso, distância total percorrida, e número de linhas atravessadas. A administração intracisternal de AAV9-CAG-comNaglu corrigiu completamente os déficits comportamentais. Verificar Figuras 17 A-F.

[00183] Além disso, o tratamento com o AAV9-CAG-comNaglu estendeu significantemente o tempo de vida de ratos com MPSIIIB. Aos 15 meses de vida, os ratos com MPSIIIB não tratados morreram enquanto 100 % dos animais que receberam o AAV9-CAG-comNaglu por via intracisternal permaneceram vivos aos 18 meses de vida. Verificar Figuras 17G. Os machos com MPSIIIB tratados apresentaram um tempo de sobrevivência médio de 21 meses comparado ao tempo de vida médio de 13.8 meses dos machos com MPSIIIB que receberam o AAV9-nulo; P=0.0007. O tempo médio de vida para os machos saudáveis foi de 26.6 meses. A normalização de respostas comportamentais e o excelente tempo de sobrevivência de ratos com MPSIIIB tratados demonstraram ainda a eficácia terapêutica do AAV9-CAG-comNaglu.

Exemplo 21: distribuição intracisternal de AAV9-CAG-cocNaglu em cachorros.

[00184] A primeira etapa em direção à aplicação clínica de uma terapia genética aborda exigir a demonstração de sua viabilidade em um modelo animal de grande porte. Previamente foi demonstrado que a distribuição de vetores AAV9 a partir de administração intra-cefalorraquidiana em cachorros Beagle, um modelo de animal com um tamanho de cérebro próximo ao dos humanos, foi muito semelhante àquela observada em ratos que receberam uma dosagem equivalente de vetor através da mesma via. Verificar Haurigot et al., supra. Resumidamente, a administração de 2x1013 vg de vetores AAV9 codificando para uma proteína reportada GFP demonstrou transdução generalizada de células no cérebro, cerebelo, meninges, medula espinhal, e gânglios da raiz dorsal. De forma semelhante às observações efetuadas em ratos, GFP também foi detectada no fígado dos cachorros Beagle onde uma média de 3.7 % de hepatócitos foi transduzida. Verificar Haurigot et al., supra. Da mesma forma, a administração intra-LCR de vetores AAV9 codificando para a enzima lisossômica sulfamidase, cujo déficit ocasiona a MPSIIIA, direcionou aos níveis sustentáveis de enzima no LCR dos cachorros tratados. O LCR banha o SNC ocasionando a disponibilidade da enzima em diferentes estruturas do SNC. De fato, a distribuição periódica da enzima recombinante no LCR é uma estratégia terapêutica atualmente sob pesquisa clínica para a MPSIIIA. Verificar NCT01155778 e NCT01299727, clinicaltrials.gov.

[00185] A mesma abordagem foi usada para ilustrar a eficácia potencial dos vetores AAV9 de acordo com a presente invenção.

[00186] Uma dosagem total de 6.5x1012 vg de vetores AAV9-CAG-cocNaglu foi administrada na cisterna magna de 4 cachorros Beagle adultos (cachorros 1- 4). Para avaliar o impacto de imunidade pré-existente em níveis do LCR da atividade de alfa-N-acetil-glucosaminidase que poderia ser alcançado através do tratamento, dois desses cachorros (cachorros 3 e 4) foram imunizados através de administração sistêmica de 1x1011 vg/kg de vetores AAV9-nulo não codificados 6 semanas antes da distribuição no LCR. No momento em que a administração por via intracisternal de vetores foi realizada, os cachorros selvagens tinham baixa titulação de anticorpos neutralizantes anti-AAV9 (NAbs) na circulação e no LCR, como seria esperado em animais que não foram previamente expostos ao vírus recombinante ou selvagem. Em contraste, os cachorros pré-imunizados tiveram alta titulação de NAb na circulação, mas baixos níveis no LCR, uma observação compatível à distribuição assimétrica de NAbs em torno da barreira hematoencefálica. Verificar Figura 18A e Haurigot et al., supra. A administração de vetores AAV9-CAG-cocNaglu na cisterna magna direcionou à um aumento significante na atividade da enzima medida em amostras de LCR de todos os 4 cachorros sem diferenças significantes em relação à presença ou não de imunidade pré-existente. Verificar Figura 18B. Os níveis de atividade enzimática alcançaram o pico entre a segunda e terceira semana e alcançaram níveis estacionários posteriormente. Da mesma maneira, esse aumento na atividade de alfa-N-acetil-glucosaminidase no LCR foi durador (>4 meses). Verificar Figura 18B.

Claims

1. “VETOR AAV9 RECOMBINANTE CONTENDO UMA SEQ ID NO. 4 PROMOTORA DE CAG” ligado à uma sequência de nucleotídeos codificando para alfa-N-acetil-glucosaminidase SEQ ID no. 1 caracterizado por a sequência de nucleotídeos que codifica para N-acetilglucosaminidase, alfa, SEQ ID NO: 1 é a sequência SEQ ID NO: 3, sequência SEQ ID NO: 19 ou sequência SEQ ID NO: 22.

2. “PLASMÍDEO” contendo o promotor CAG ligado a uma sequência de nucleotídeos que codifica para N-acetilglucosaminidase, alfa, SEQ ID NO: 1, caracterizado por o promotor CAG e a sequência de nucleotídeos são flanqueados por AAV2 ITRs, e em que o referido plasmídeo é pAAV-CAG-cohNaglu com acesso número DSM 26626, contendo a sequência de nucleotídeos SEQ ID NO: 3 que codifica para N-acetilglucosaminidase, alfa, SEQ ID NO: 1, pAAV-CAG-cohNaglu- version2 com o número de acesso DSM 32042, contendo a sequência de nucleotídeos SEQ ID NO: 19 que codifica para N-acetilglucosaminidase, alfa, SEQ ID NO: 1, pAAV-CAG-cohNaglu-version3 com número de acesso DSM 32043, contendo a sequência de nucleotídeos SEQ ID NO: 22 que codifica para N- acetilglucosaminidase, alfa, SEQ ID NO: 1.

3. - “COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA” caracterizada por compreender uma quantidade terapeuticamente eficaz do vetor AAV9 recombinante de acordo com a reivindicação 1 ou o plasmídeo de acordo com a reivindicação 2.

4. - “COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA” de acordo com a reivindicação 3 caracterizada por a referida composição farmacêutica ser administrada intravenosa ou intracisternalmente.

5. “USO DO VETOR AAV9 RECOMBINANTE” de acordo com a reivindicação 1, ou plasmídeo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por ser para a fabricação de um medicamento.

6. “USO DO VETOR AAV9 RECOMBINANTE” de acordo com a reivindicação 1, ou plasmídeo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por ser para a fabricação de um medicamento para aumentar a atividade alfa de N- acetilglucosaminidase no corpo.

7. “USO DO VETOR AAV9 RECOMBINANTE” de acordo com a reivindicação 1 ou o plasmídeo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por ser para a fabricação de um medicamento para o tratamento de mucopolissacaridose, de preferência mucopolissacaridose tipo IIIB.

8. “MÉTODO DE PRODUÇÃO DOS VETORES DEFINIDOS NA REIVINDICAÇÃO 1”, caracterizado por compreender as etapas de i) provimento um primeiro vetor compreendendo a sequência que codifica para N-acetilglucosaminidase, alfa interposta entre uma primeira repetição terminal de AAV e uma segunda repetição terminal de AAV, um promotor CAG operacionalmente ligado à sequência que codifica para a proteína de interesse; um segundo vetor compreendendo um gene rep de AAV e um gene cap de AAV do serótipo 9; e um terceiro vetor compreendendo o gene de função auxiliar de adenovírus; ii) co-transfecção das células competentes com os vetores da etapa i); iii) cultura das células transfectadas da etapa ii); e iv) purificação dos vetores de expressão da cultura da etapa iii).