KR102446169B1 - 리소좀 저장 장애의 치료를 위한 아데노연관 바이러스 벡터 - Google Patents

리소좀 저장 장애의 치료를 위한 아데노연관 바이러스 벡터 Download PDF

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Abstract

본 발명은 새로운 아데노연관 바이러스 벡터, 및 리소좀 저장 장애(lysosomal storage disease)의 치료, 특히 점액다당류증(mucopolysaccharidoses) 유형 IIIB의 치료를 위한, 이를 함유하는 약제학적 조성물을 제공한다.

Description

리소좀 저장 장애의 치료를 위한 아데노연관 바이러스 벡터{ADENOASSOCIATED VIRUS VECTORS FOR THE TREATMENT OF LYSOSOMAL STORAGE DISORDERS}
본 발명은 관심 단백질의 발현에 유용한 벡터, 및 유전자 치료법에서의 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 점액다당류증(mucopolysaccharidoses; MPS), 특히 점액다당류증 유형 III-B 또는 산필립포 B 증후군(Sanfilippo B syndrome)의 치료에 유용한 벡터 및 핵산 서열에 관한 것이다.
리소좀은 동물 세포의 세포질에서 발견되며, 낡은(worn-out) 세포 구성성분의 재순환 동안 또는 바이러스 및 박테리아의 포식 후, 생체 분자를 절단하는 하이드롤라제를 50개 넘게 함유하는 세포소기관이다. 이러한 세포소기관은 프로테아제, 뉴클레아제, 글리코시다제, 리파제, 포스포리파제, 포스파타제 및 설파타제를 비롯하여 몇몇 유형의 가수분해 효소를 함유한다. 모든 효소는 산 하이드롤라제이다.
리소좀 저장 장애(lysosomal storage disease; LSD)는 하나 이상의 리소좀 효소에 영향을 미치는 유전적 결함에 의해 유발된다. 이들 유전적 질환은 일반적으로, 리소좀에 존재하는 특정 효소 활성의 결핍으로 인한 것이다. 보다 협소하게는, 이들 질환은 리소좀 생물발생에 관여하는 단백질의 결핍으로 인한 것일 수 있다.
LSD는 개별적으로는 드물지만, 그룹으로서 이들 장애는 일반 집단에서 상대적으로 흔한 편이다. LSD의 조합된 유병률은 5,000명의 정상 출산 당 대략 1명이다. 문헌[Meikle P, et al., JAMA 1999;281:249-254]를 참조한다. 그러나, 일반 집단 내의 일부 그룹은 LSD의 발병률이 특히 높다. 예를 들어, 고셰병(Gaucher disease) 및 테이-삭스병(Tay-Sachs disease)의 유병률은 중부 및 동부 유럽 유대인의 후손(아슈케나지(Ashkenazi)) 개체들에서 각각 600명 당 1명 및 3,900명 당 1명이다.
통칭해서 산필립포 증후군으로 알려져 있는 유형 III 점액다당류증(MPSIII)은 글리코스아미노글리칸(GAG) 헤파란 설페이트(HS)의 단계식 분해에 관여하는 효소들 중 하나의 결핍에 의해 유발되어, 글리코스아미노글리칸(GAG) 헤파란 설페이트(HS)의 병리학적 축적을 초래하는 LSD이다. MPSIII는 효소 결핍에 따라 4개의 하위유형으로 분류된다. N-아세틸글루코스아미니다제, 알파의 효소적 활성의 상실은 하위유형 IIIB을 유발한다. 결과적으로 발병하는 질환은 임상적으로는, 아동기에서 발병하는 CNS의 진행성 신경병증으로서 특징화된다. 임상적 경로는 일반적으로 3개의 기(phase)로 구분될 수 있다. 질환의 제1 기에서, 생후 첫 수개월에 걸친 무증상 기간 후, 정신 발달의 지체가 뚜렷해진다. 이후, 질환의 제2 기 동안 심각한 행동 문제 및 진행성 지적 감퇴가 발생한다. 마지막으로, 중증 치매가 발병하면서, 행동 문제는 서서히 사라지고, 모든 운동 기능이 감퇴하기 시작하면서, 결국에는 연하 곤란(dysphagia), 운동 능력의 완전한 상실 및 피라미드로 병변(pyramidal tract lesion)이 초래된다. 신경학적 증상 외에도, MPSIIIB 환자는 재발성 귀, 코, 목구멍 및 흉부 감염, 빈번한 설사 및 변비, 운동성에 영향을 미치는 진행성 관절 퇴행 및 골격 이상뿐만 아니라 간 비대증(hepatomegaly) 및 비장 비대증(splenomegaly)을 비롯한 비-신경학적 변경(non-neurological alteration)을 앓게 된다. 문헌[Cleary and Wraith, Arch Dis Child. 1993;69 (3):403-6], [Neufeld and Muenzer, "The Mucopolysaccharidoses" in Scriver C, et al., Eds., "The metabolic and molecular basis of inherited disease", McGraw-Hill Publishing Co., New York, NY, US, 2001, pp. 3421-3452], [van de Kamp et al., Clin Genet. 1981;20(2):152-60], [Moog et al, Am J Med Genet C Semin Med Genet. 2007;145C(3):293-301]을 참조한다. 환자는 통상적으로 20대말 또는 30대 초반에 사망한다. 상기 문헌[Neufeld and Muenzer]을 참조한다. 약화된 표현형으로 알려져 있으며 발병이 느리고 생존율이 더 긴, 보다 느리게 진행하는 형태의 질환은 MPSIIIB 환자의 서브셋에 기술되어 있다. 문헌[Moog et al., supra and Valstar et al., Ann Neurol. 2010;68(6):876-87]을 참조하다.
현재로서는 MPSIIIB의 이용가능한 치료법은 존재하지 않는다. 따라서, 질환의 조절은 증상과 관련된 것이며, 환자와 그 가족의 삶의 질을 향상하는 것을 목적으로 한다. 이는 CNS 변경으로 인해 발생하는 증상들에 특히 중요하다. 예를 들어, 간헐적으로 상승하는 두개내압(intracranial pressure)은 행동 장애의 인지된 원인이며, MPS에서 흔하다. 문헌[Muenzer et al., Genet Med. 2006;8(8):465-73]을 참조한다. 뮤코다당류의 축적으로 인한 뇌척수막의 두터워짐은 뇌척수액(CSF) 압력의 상승의 근본 원인일 것이다. 따라서, 행동 변경이 종래의 약물치료에 불응성일 때, 압력을 경감시키기 위해 뇌척수액 션트(shunt)의 삽입이 고려된다. 신경학적 증상은 뇌척수액 션트가 삽입되었던 6명의 산필립포 환자에서 상당히 개선되었다. 문헌[Robertson et al., Eur J Pediatr. 1998;157(8):653-5]를 참조한다. 한편, 멜라토닌 투여는 질환의 특징인 수면 장애를 위한 최선의 치료법인 것으로 고려되지만, 완전히 효과적인 것은 아니다. 문헌[Fraser et al., Arch Dis Child. 2005;90(12):1239-42]를 참조한다. 체성 병증(somatic pathology)에 대한 특정한 치료법이 존재하지 않으며, 오로지 완화 치료법만이 각각의 개별 증상에 적용될 수 있다.
MPSIIIB에 대한 새로운 치료 접근법들이 시험중에 있으며, 그 성공률은 상이하다. 기질 제한 치료법(Substrate deprivation therapy; SDT)은 GAG 합성 속도를 감소시켜, 임의의 잔여 효소 활성이 남아 있는 경우, GAG의 과도한 축적을 방지하거나 적어도 축적 속도를 늦추는 것을 목적으로 한다. 대두의 이소플라본인 제니스테인(genistein)은 표피 성장 인자 수용체(EGFR)의 키나제 활성을 감소시킴으로써 HS 생성의 저해제로서 작용하는 것으로 제안되어 있다. 문헌[Jakobkiewicz-Banecka et al., J Biomed Sci. 2009;16:26], [Piotrowska et al., Eur J Hum Genet. 2006;14(7):846-52]를 참조한다. 최근의 연구들은, 제니스테인이 다양한 점액다당류증(유형 I, II, III-A 및 III-B)을 앓고 있는 환자의 섬유아세포에서 GAG의 합성을 저해한다고 가리킨다. 상기 문헌[Piotrowska et al.]을 참조한다. MPSIIIB 질환의 마우스 모델에 제니스테인을 단기 및 장기간 경구 투여하면, 저장이 감소되고, 운동 능력 검사에서 행동이 보다 양호해졌다. 문헌[Malinowska et al., Mol Genet Metab. 2009;98(3):235-42], [Malinowska et al., PLoS One. 2010;5(12):e14192]를 참조한다. 정맥내 투여 시, 제니스테인은 뇌혈관장벽(BBB)을 가로지를 수 있어서, CNS 병태의 치료를 가능하게 하는 것으로 예상된다. 이러한 개념을 지지하고자, 제니스테인-농화된 대두 추출물을 5명의 MPSIIIA 환자 및 5명의 MPSIIIB 환자에게 12개월 동안 투여한 오픈 라벨 파일럿 연구에서, 체성 파라미터 및 신경학적 파라미터 둘 모두가 상당히 향상되었다. 문헌[Piotrowska et al., Current Therapeutic Research. 2008;69(2):166-179]를 참조한다. 그러나, 후속적인 연구에서는, 제니스테인으로 12개월 동안 치료한 MPSIIIA, MPSIIIB 또는 MPSIIIC 환자의 장애 스케일 또는 행동 스코어 중 어떤 것에서도 개선이 나타나지 않았다. 문헌[Delgadillo et al., J Inherit Metab Dis. 2011;34(5):1039-44, study NTR #1826 registered at The Netherlands National Trial Register and de Ruijter et al., Ann Neurol. 2012;71(1):110-20]을 참조한다. 또 다른 분자인 로다민 B 또한, 전임상 연구에서 GAG 축적을 감소시키는 데 효과적인 것으로 입증되었으며, 그 효능은 제니스테인에서 관찰된 것과 유사하였다. www.mpssociety.co.uk에서 입수가능한 문헌[Hendriksz et al., "Guidelines for the investigation and Management of Mucopolysaccharidosis type III", 2012]를 참조한다. 로다민 B는 당 전구체의 형성 및/또는 글리코실 트랜스퍼라제의 활성을 저해함으로써 GAG 사슬의 합성을 억제하는 것으로 생각된다. 문헌[Roberts et al., Mol Genet Metab. 2007;92(1-2):115-21]을 참조한다.
정상적인 세포는 만노스-6-포스페이트(M6P)-태깅된 리소좀 효소를 상당량 분비하며, 이는 후속해서 원형질막 상의 M6P 수용체를 통해 다른 세포에 의해 흡수될 수 있다. 이는, 결측 효소(missing enzyme)의 올바른 버전을 주입함으로써, 가용성 하이드롤라제의 결핍에 의해 유발되는 LSD의 치료 가능성을 열어준다. 효소 대체 치료법(ERT)이 아직까지 산필립포 B 환자에게는 이용가능하지 않지만, 재조합 N-아세틸글루코스아미니다제, 알파를 3-월령의 MPSIIIB 마우스에게 정맥내 투여한 결과, 재조합 효소가 몇몇 기관들, 주로 간에 분포된 것으로 나타났다. 소량의 효소가 뇌에서 검출되었으며, 이는 외인성으로 제공되는 단백질이 뇌의 실질(brain parenchyma)에 들어가는 것을 제한하는 BBB의 존재로 인한 것이었다. 문헌[Yu et al., Mol Genet Metab. 2000;71(4):573-80] 및 상기 [Hendriksz et al]을 참조한다. MPSIIIB 환자에서 신경학적 질환의 치료를 위한 ERT 생성물에 대한 조기 개발 프로그램이 존재한다. HGT-3010 프로그램(Shire)은 재조합 효소의 척추강내 전달을 기재로 하는 ERT이며, 현재 전임상 기에 있다. CNS에의 ERT의 직접 전달은 MPSIIIA 마우스에서 신경학적 병증을 감소시켰으며, 현재 MPSIIIA 환자에서 시험중에 있다. www.clinicaltrials.gov에서 문헌[Hemsley K, et al., Genes Brain Behav. 2008;53(2):161-8], [Savas P, et al., Mol Genet Metab. 2004;82:273-285], NCT01155778 및 NCT01299727을 참조한다. 그러나, 치료법이 요구하는 영구적인 척추강내 전달 디바이스의 이식은 실질적인 위험 및 결점과 연관이 있으며, 치료법 그 자체는 매년 환자 1명 당 매우 높은 경제적 비용을 가진다.
골수-유래 줄기세포(골수 이식, BMT)를 사용한 조혈모세포 이식(HSCT)은 다른 MPS를 앓고 있는 환자에서 체성 병증 및 신경학적 병증 둘 모두의 치료에 효율적인 것으로 입증되었다. 문헌[Peters et al., Blood 1996;87(11):4894-902], [Peters and Steward, Bone Marrow Transplant 2003;31(4):229-39] 및 [Yamada et al., Bone Marrow Transplant 1998;21(6):629-34]를 참조한다. 공여자-유래 골수성 세포는 BBB를 가로지를 수 있으며, 뇌의 실질에 들어가고, 결측 리소좀 효소를 분비하는 미세아교세포로 분화하며, 그런 다음 이러한 효소는 주변 세포에 의해 흡수되어 뇌에서 GAG 축적을 정정(correction)한다. 문헌[Krivit et al., Cell Transplant. 1995;4(4):385-92]를 참조한다. 그러나, BMT를 받은 산필립포 A 환자 또는 산필립포 B 환자에서 명백한 이득이 관찰되지 않았다. 문헌[Hoogerbrugge et al., Lancet 1995;345(8962):1398-402], [Vellodi et al., J Inherit Metab Dis. 1992;15(6):911-8], [Guengoer and Tuncbilek, Turk J Pediatr. 1995;37(2):157-63], [Sivakumur and Wraith, J Inherit Metab Dis. 1999;22(7):849-50] 및 [Lange et al., Arq Neuropsiquiatr. 2006;64(1):1-4]를 참조한다. BMT 실패의 주요 원인은, 원발성 질환의 신속한 진행과 비교하여 조혈세포 자손으로의 미세아교세포 개체군의 느린 대체 속도 때문인 것으로 보인다. 문헌[Rovelli, Bone Marrow Transplant 2008;41Suppl2:S87-9]를 참조한다. 따라서, BMT를 사용한 HSCT는 현재 MPSIII 환자에 대한 치료 옵션으로 여겨지지 않는다. 문헌[Boelens et al., Pediatr Clin North Am. 2010;57(1):123-145]를 참조한다. 제대혈-유래 줄기세포를 사용한 HSCT는 MPSIIIB 마우스에서 인지적 결과를 개선하였으나, 반복된 세포 투여를 필요로 하였다. 문헌[Willing et al., Cell Transplantation 2013;epub ahead of print]를 참조한다. 이러한 접근법은 최근, MPSIIIA 및 MPSIIIB를 앓고 있는 몇몇 아동에게 이식하는 데 사용되어 왔으며; 이것이 CNS를 변성으로부터 보호하는지의 여부는 명확하지 않다. 문헌[de Ruijter et al., Curr Pharm Biotechnol. 2011;12(6):923-30]을 참조한다.
MPSIII, 특히 MPSIIIB에 대한 현재의 치료 옵션은 한계를 가지고 있기 때문에, 대안적인 접근법이 요망되고 있다. 생체내 유전자 치료법은 MPS IIIB 및 다른 유전적 질환에 대한 온-타임 치료(one-time treatment)의 가능성을 제공하며, 유익한 효과가 평생 동안 지속할 가능성을 동반한다. 상이한 투여 경로들과 조합된 상이한 바이러스 벡터들의 사용을 기재로 하는 몇몇 유전자 치료 접근법이 MPSIIIB 질환의 동물 모델에서 시험되었다.
인간 N-아세틸글루코스아미니다제, 알파 유전자를 코딩하는 렌티바이러스 벡터가 젊은 MPSIIIB 마우스에게 정맥내 투여되어, 간, 비장, 폐 및 심장에서 이식 유전자의 발현 수준을 낮추었으며, 이는 이들 조직에서 GAG 축적을 감소시켰으나 정상화하지는 않았다. 문헌[Di Natale et al., Biochem J. 2005;388(2):639-46]을 참조한다. 렌티바이러스 벡터를 두개내 투여를 통해 뇌의 실질에 직접 전달함으로써, 이러한 벡터의 치료적 잠재성 또한, 시험되었다. 문헌[Di Domenico et al., Am J Med Genet A. 2009;149A(6):1209-18]을 참조한다. 단일 뇌 부위에 투여를 받은 MPSIIIB 마우스는 증가된 N-아세틸글루코스아미니다제, 알파 활성을 치료 후 6개월까지 보여주었으며, 이는 리소좀 저장 병변을 오로지 부분적으로 정정하였다.
아데노연관 바이러스(AAV) 벡터-매개 유전자 트랜스퍼는 특히, 이들 벡터의 높은 형질도입 효율 및 병원성의 결여로 인해, 많은 생체내 유전자 치료법에서 선택적인 접근법으로서 빠르게 부상하고 있다. AAV 벡터는 체세포분열-후 세포(post-mitotic cell)에 형질도입될 수 있으며, 몇몇 전임상 연구 및 임상 연구들은 여러가지 질환들에 대한 치료적 이식유전자의 지속적인 발현을 효율적으로 유도하기 위한 AAV 벡터-매개 유전자 트랜스퍼의 잠재성을 나타내었다. 문헌[Bainbridge et al., N Engl J Med. 2008;358(21):2231-9], [Hauswirth et al., Hum Gene Ther. 2008;19(10):979-90], [Maguire et al., N Engl J Med. 2008;358(21):2240-8], [Niemeyer et al., Blood 2009;113(4):797-806], [Rivera et al., Blood 2005;105(4):1424-30], [Nathawani et al., N Engl J Med. 2011;365(25):2357-65] 및 [Buchlis et al., Blood 2012;119(13):3038-41]을 참조한다.
인간 N-아세틸글루코스아미니다제, 알파를 코딩하는 혈청형 2의 AAV 벡터를 MPSIIIB 마우스의 뇌의 실질에 단일 위치에서 전달하였을 때, N-아세틸글루코스아미니다제, 알파의 발현 및 활성은 주사 위치로 국한되었으며, 질환 표현형의 오로지 부분적인 개선만이 달성되었다. 문헌[Fu et al., Mol Ther. 2002;5(1):42-9], [Cressant et al., J Neurosci. 2004;24(45):10229-39]를 참조한다. AAV2 벡터를 MPSIIIB 마우스에게 정맥내로 전달한 다음, BBB에 침투하기 위해 만니톨로 전처리하면, 생존율이 상당히 연장되었으며, 행동 기능이 개선되었고, 뇌의 리소좀 병증이 감소하긴 하였지만, 체성 질환은 오로지 부분적으로만 정정되었다. 문헌[McCarty et al., Gene Ther. 2009;16(11):1340-52]를 참조한다. 한편, AAV2 벡터를 수조내 주사에 의해 뇌척수액(CSF)에 단일 투여하면, N-아세틸글루코스아미니다제, 알파의 활성이 복구되었고, MPSIIIB 마우스의 뇌에서 GAG가 감소하긴 하였지만, 체성 조직에서는 검출가능한 N-아세틸글루코스아미니다제, 알파 활성이 관찰되지 않았다. 문헌[Fu et al., J Gene Med. 2010;12(7):624-33]을 참조한다. AAV2의 수조내 전달과 정맥내 전달의 병용 치료법은 CNS에서 상당한 장기간의 치료 효능을 나타내었을 뿐만 아니라 부분적인 체성 정정도 나타내었다. 문헌[Fu et al., Gene Ther. 2007;14(14):1065-77]을 참조한다.
다른 연구들은 뇌실질내 투여(intraparenchymal administration) 후, 혈청형 5 AAV 벡터에 의해 나타난, 신경 세포에 대한 높은 향성(향성)을 이용하였다. 그러나, 이들 벡터는 뇌의 실질 내에서 낮은 분포도를 가지며, 이러한 접근법은 다수의 주사를 필요로 한다. 갓 태어난 MPSIIIB 마우스의 뇌의 다수의 부위들에의 AAV5 벡터의 전달과 골수 이식의 병용은, 혈청형 2 벡터를 사용한 경우 수득된 것과 유사한 치료 효능을 나타내었다. 문헌[Heldermon et al., Mol Ther. 2010;18(5):873-80]을 참조한다. 뇌 크기가 더 큰 동물 모델에서, MPSIIIB 개에서 4개의 상이한 뇌 위치들에의 AAV5 벡터의 정위고정성 투여(stereotactic administration)를 통해, 뇌의 광범위한 영역들에서 활성 N-아세틸글루코스아미니다제, 알파가 검출되었다. 그러나, 효소적 활성은 대부분의 로스트랄(rostral) 영역 및 대부분의 꼬달(caudal) 영역, 특히 소뇌에서 낮거나 검출 불가능하였다. 문헌[Ellinwood et al., Mol Ther. 2011;19(2):251-9]를 참조한다. 치료된 MPSIIIB 개에서 리소좀 병증은 개선되었으나, 완전히 정정되지는 않았으며, 이는 이러한 접근법으로 달성된 효소적 활성의 수준이 GAG 저장을 대처하는 데 불충분하였음을 가리킨다. 이러한 부분적인 효능에도 불구하고, 이러한 접근법을 기재로 하는 임상적 시도가 최근 개시되었다. ISRCT 레지스터에서 ISRCTN19853672를 참조한다. 뇌의 크기가 클수록, 뇌실질내 주사를 이용하여 기관의 전체 부피를 커버(cover)하는 것이 더 어려워지고, 인간에게의 전달은 몇몇 부위들에서의 벡터 투여를 필요로 하고, 따라서, 전달이 기술적으로 도전적이게 되며 특수한 외과적 처치의 개발을 필요로 한다. 문헌[Souweidane et al., J Neurosurg Pediatr. 2010;6(2):115-122]를 참조한다.
현재까지, MPSIIIB의 치료를 위해 혈청형 9의 AAV 벡터를 사용하는 연구는 오로지 1가지만 보고되었다. 이러한 접근법은, AAV9 벡터가 전신 투여되었을 때 CNS에 형질도입되는 능력을 이용한다. 문헌[Foust et al., Nat Biotechnol. 2009;27(1):59-65] 및 [Duque, et al., Mol Ther. 2009;17(7):1187-1196]을 참조한다. AAV9-N-아세틸글루코스아미니다제, 알파 벡터를 MPSIIIB 마우스에게 정맥내 전달하면, CNS 및 체성 기관들에서 리소좀 저장 병증이 정정되었으며, 행동 기능이 개선되었고, 수명이 연장되었다. 문헌[Fu et al., Mol Ther. 2011;19(6):1025-33]을 참조한다. 그러나, 이러한 제안된 작용 경로는 몇몇 결점들을 가진다. 우선, 이용되는 CMV 프로모터는 침묵화하는 것으로 보고되었다. 문헌[Loeser et al., J Virol. 1998 Jan;72(1):180-90]를 참조한다. 둘째로, 치료적 효능은 매우 높은 용량(1x1013vg/kg 이상)의 벡터에서 달성되었다. 이러한 고용량의 사용은 제조 및 안전성 관점에서 임상적 번역에 대한 도전과제를 제기할 것이다.
전술한 접근법들 중 어느 것도 N-아세틸글루코스아미니다제, 알파 활성을 완전히 복구하지 못하였거나, CNS 및 체성 조직에서 세포질내 봉입(intracytoplasmic inclusion)을 완전히 근절하지 못하였거나, MPSIIIB의 모든 임상적 징후를 정정하지 못하였다. 따라서, 보다 양호한 효능 및 안전성 프로파일을 가진, 신규 MPSIIIB 치료 접근법이 요망되고 있다.
본 발명은 질환, 특히 점액다당류증 유형 III(MPSIII), 특히 MPSIIIB의 치료를 위한 새로운 재조합 벡터를 제공한다.
제1 양태에서, 본 발명은 N-아세틸글루코스아미니다제, 알파(Naglu) 서열번호 1을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 아데노연관 바이러스 벡터(AAV)에 관한 것이다. 본 발명에 따른 AAV 벡터는 혈청형 9(AAV9)이다. 이들 벡터는 뇌 및 체성 조직의 모든 영역들에서 병리학적 GAG 저장을 완전히 역전시키는 데 매우 효율적인 것으로 입증되었다.
본 발명에 따른 AAV9 벡터는 서열번호 2와 적어도 80%의 서열 동일성, 바람직하게는 서열번호 2와 적어도 84%의 서열 동일성을 가진, Naglu를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 함유한다.
본 발명의 AAV9 벡터는 추가로, Naglu의 발현을 조절하기 위해, 코딩 뉴클레오타이드 서열에 연결된 프로모터를 함유한다. 적합한 프로모터는 CAG 프로모터, 서열번호 4이다.
본 발명의 또 다른 양태는 N-아세틸글루코스아미니다제, 알파(Naglu)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 특히 서열번호 2와 적어도 80%의 서열 동일성, 또는 바람직하게는 서열번호 2와 적어도 84%의 서열 동일성을 가진 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 플라스미드에 관한 것이다.
본 발명의 추가적인 양태는 본원에 기술된 본 발명의 AAV9 벡터 또는 플라스미드를 치료학적 유효량으로 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
나아가, 본 발명은 폴리뉴클레오타이드, 특히 Naglu 폴리뉴클레오타이드를 전달하는 데 유용한 방법을 제공한다.
본 발명의 보다 추가적인 양태는 특히 점액다당류증 유형 III(MPSIII), 특히 MPSIIIB의 치료를 위한 의약으로서 사용하기 위한, 본원에 기술된 본 발명의 AAV9 벡터 또는 플라스미드에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 본 발명에 따른 AAV 9 벡터의 제조 방법을 제공한다.
추가적인 양태에서, 본 발명은 N-아세틸글루코스아미니다제, 알파(Naglu)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 특히 서열번호 2와 적어도 80%의 서열 동일성, 또는 바람직하게는 서열번호 2와 적어도 84%의 서열 동일성을 가진 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 세포에 관한 것이다.
도 1. 인간 N-아세틸글루코스아미니다제, 알파를 인코딩하는 플라스미드(pAAV-CAG-hNaglu)의 유체 역학적 전달이다. 2개월령의 MPSIIIB 마우스에게 플라스미드 pAAV-CAG-hNaglu 50 ㎍을 유체 역학적으로 주사하였다. 히스토그램은 플라스미드 투여 후 1주일째에 간(A) 및 혈청(B)에서 측정된 N-아세틸글루코스아미니다제, 알파(NAGLU)의 활성을 도시하고 있다. 식염수-주사 WT 마우스의 NAGLU 활성을 100%로 설정하였다. 값은 1개 그룹 당 3 마리 내지 4 마리 마우스의 평균 ± SEM이다. *** P<0.001 vs. WT.
도 2. 인간 N-아세틸글루코스아미니다제, 알파를 코딩하는 AAV9 벡터(AAV9-CAG-hNaglu)의 정맥내(IV) 전달이다. 야생형(건강한) 마우스, 비-치료 MPSIIIB 마우스, 및 AAV9-CAG-hNaglu를 5x1011 vg로 IV 주사하여 치료한 MPSIIIB 마우스의 간(A) 및 혈청(B)에서 N-아세틸글루코스아미니다제, 알파의 활성. (C) 체성 기관에서 글리코스아미노글리칸(GAG)의 정량화이다. 값은 1개 그룹 당 5 마리 내지 8 마리 마우스의 평균 ± SEM이다. $$$ P<0.001 vs. WT, ** P<0.01, *** P<0.001 vs. 비-치료 MPSIIIB. nd: 검출되지 않음.
도 3. 인간 N-아세틸글루코스아미니다제, 알파를 코딩하는 AAV9 벡터(AAV9-CAG-hNaglu)의 정맥내 전달이다. (A) 야생형(건강한) 마우스, 비-치료 MPSIIIB 마우스, 및 AAV9-CAG-hNaglu를 5x1011 vg로 IV 주사하여 치료한 MPSIIIB 마우스의 뇌의 상이한 부분들(I 내지 IV)에서 N-아세틸글루코스아미니다제, 알파의 활성이다. (B) 뇌의 동일한 부분들에서 글리코스아미노글리칸(GAG)의 정량화이다. 값은 1개 그룹 당 5 마리 내지 8 마리 마우스의 평균 ± SEM이다. *** P<0.001 vs. 비-치료 MPSIIIB. nd: 검출되지 않음.
도 4. 최적화된 인간 N-아세틸글루코스아미니다제, 알파를 코딩하는 AAV9 벡터(AAV9-CAG-cohNaglu)의 정맥내 전달이다. 야생형(건강한) 마우스, 비-치료 MPSIIIB 마우스, 및 AAV9-CAG-cohNaglu를 5x1011 vg로 IV 주사하여 치료한 MPSIIIB 마우스의 간(A) 및 혈청(B)에서 N-아세틸글루코스아미니다제, 알파의 활성이다. (C) 체성 기관에서 글리코스아미노글리칸(GAG)의 정량화이다. 값은 1개 그룹 당 5 마리 내지 8 마리 마우스의 평균 ± SEM이다. $$$ P<0.001 vs. WT, ** P<0.01, *** P<0.001 vs. 비-치료 MPSIIIB. nd: 검출되지 않음.
도 5. 최적화된 인간 N-아세틸글루코스아미니다제, 알파를 코딩하는 AAV9 벡터(AAV9-CAG-cohNaglu)의 정맥내 전달이다. (A) 야생형(건강한) 마우스, 비-치료 MPSIIIB 마우스, 및 AAV9-CAG-cohNaglu를 5x1011 vg로 IV 주사하여 치료한 MPSIIIB 마우스의 뇌의 상이한 부분들(I 내지 IV)에서 N-아세틸글루코스아미니다제, 알파의 활성이다. (B) 뇌의 동일한 부분들에서 글리코스아미노글리칸(GAG)의 정량화이다. 값은 1개 그룹 당 5 마리 내지 8 마리 마우스의 평균 ± SEM이다. *** P<0.001 vs. 비-치료 MPSIIIB. nd: 검출되지 않음.
도 6. 인간 N-아세틸글루코스아미니다제, 알파를 코딩하는 AAV9 벡터(AAV9-CAG-hNaglu)의 수조내(IC) 전달이다. (A) 야생형(건강한) 마우스, 비-치료 MPSIIIB 마우스, 및 AAV9-CAG-hNaglu를 9.3x109 vg로 수조내 주사하여 치료한 MPSIIIB 마우스의 뇌의 상이한 부분들(I 내지 IV)에서 N-아세틸글루코스아미니다제, 알파의 활성이다. (B) 동일한 뇌 영역들에서 글리코스아미노글리칸(GAG)의 정량화이다. 값은 1개 그룹 당 5 마리 내지 8 마리 마우스의 평균 ± SEM이다. *** P<0.001 vs. 비-치료 MPSIIIB. nd: 검출되지 않음.
도 7. 인간 N-아세틸글루코스아미니다제, 알파를 코딩하는 AAV9 벡터(AAV9-CAG-hNaglu)의 수조내 전달이다. (A) 야생형(건강한) 마우스, 비-치료 MPSIIIB 마우스, 및 AAV9-CAG-hNaglu를 9.3x109 vg로 수조내 주사하여 치료한 MPSIIIB 마우스의 간에서 N-아세틸글루코스아미니다제, 알파의 활성이다. (B) 체성 기관에서 글리코스아미노글리칸(GAG)의 정량화이다. 값은 1개 그룹 당 5 마리 내지 8 마리 마우스의 평균 ± SEM이다. $$$ P<0.001 vs. WT, ** P<0.01, *** P<0.001 vs. 비-치료 MPSIIIB. nd: 검출되지 않음.
도 8. 최적화된 인간 N-아세틸글루코스아미니다제, 알파를 코딩하는 AAV9 벡터(AAV9-CAG-cohNaglu)의 수조내 전달이다. (A) 야생형(건강한) 마우스, 비-치료 MPSIIIB 마우스, 및 AAV9-CAG-cohNaglu를 9.3x109 vg로 수조내 주사하여 치료한 MPSIIIB 마우스의 뇌의 상이한 부분들(I 내지 IV)에서 N-아세틸글루코스아미니다제, 알파의 활성이다. (B) 동일한 뇌 영역들에서 글리코스아미노글리칸(GAG)의 정량화이다. 값은 1개 그룹 당 5 마리 내지 8 마리 마우스의 평균 ± SEM이다. *** P<0.001 vs. 비-치료 MPSIIIB. nd: 검출되지 않음.
도 9. 최적화된 인간 N-아세틸글루코스아미니다제, 알파를 코딩하는 AAV9 벡터(AAV9-CAG-cohNaglu)의 수조내 전달이다. (A) 야생형(건강한) 마우스, 비-치료 MPSIIIB 마우스, 및 AAV9-CAG-cohNaglu를 9.3x109 vg로 수조내 주사하여 치료한 MPSIIIB 마우스의 간에서 N-아세틸글루코스아미니다제, 알파의 활성이다. (B) 체성 기관에서 글리코스아미노글리칸(GAG)의 정량화이다. 값은 1개 그룹 당 5 마리 내지 8 마리 마우스의 평균 ± SEM이다. $$$ P<0.001 vs. WT, ** P<0.01, *** P<0.001 vs. 비-치료 MPSIIIB. nd: 검출되지 않음.
도 10. 최적화된 인간 N-아세틸글루코스아미니다제, 알파-버전2를 인코딩하는 플라스미드(pAAV-CAG-cohNaglu-버전2)의 유체 역학적 전달이다. 2개월령의 MPSIIIB 마우스에게 플라스미드 pAAV-CAG-cohNaglu-버전2 50 ㎍을 유체 역학적으로 주사하였다. 히스토그램은 플라스미드 투여 후 1주일째에 간(A) 및 혈청(B)에서 측정된 N-아세틸글루코스아미니다제, 알파(NAGLU)의 활성을 도시하고 있다. 식염수-주사 WT 마우스의 NAGLU 활성을 100%로 설정하였다. 값은 1개 그룹 당 3 마리 내지 4 마리 마우스의 평균 ± SEM이다. *** P<0.001 vs. WT.
도 11. 최적화된 인간 N-아세틸글루코스아미니다제, 알파-버전3를 인코딩하는 플라스미드(pAAV-CAG-cohNaglu-버전3)의 유체 역학적 전달이다. 2개월령의 MPSIIIB 마우스에게 플라스미드 pAAV-CAG-cohNaglu-버전3 50 ㎍을 유체 역학적으로 주사하였다. 히스토그램은 플라스미드 투여 후 1주일째에 간(A) 및 혈청(B)에서 측정된 N-아세틸글루코스아미니다제, 알파(NAGLU)의 활성을 도시하고 있다. 식염수-주사 WT 마우스의 NAGLU 활성을 100%로 설정하였다. 값은 1개 그룹 당 3 마리 내지 4 마리 마우스의 평균 ± SEM이다. *** P<0.001 vs. WT.
도 12. 최적화된 뮤린 N-아세틸글루코스아미니다제, 알파를 코딩하는 AAV9 벡터(AAV9-CAG-comNaglu)의 수조내 전달이다. AAV9-CAG-comNaglu 3x1010 vg를 MPSIIIB 마우스의 거대 수조(cisterna magna)에 투여한 후, 벡터 게놈의 생물분포이다. 벡터 게놈을 뇌(A) 및 체성 조직(B)에서 정량적 PCR에 의해 정량화하고, 2배체 게놈에 함유된 DNA의 양으로 지칭하였다. ND: 검출되지 않음.
도 13. 최적화된 뮤린 N-아세틸글루코스아미니다제, 알파를 코딩하는 AAV9 벡터(AAV9-CAG-comNaglu)의 수조내 전달이다. (A) 야생형(건강한) 마우스, 비-치료 MPSIIIB 마우스, 및 대조군 벡터(AAV9-Null) 3.9x1010 vg 또는 AAV9-CAG-comNaglu 3x1010 vg을 거대 수조에 투여한 MPSIIIB 마우스의 뇌의 상이한 부분들(I 내지 IV)에서 N-아세틸글루코스아미니다제, 알파의 활성이다. (B) 동일한 뇌 영역들에서 글리코스아미노글리칸(GAG)의 정량화이다. 값은 1개 그룹 당 4 마리 마우스의 평균 ± SEM이다. ** P<0.01, *** P<0.001 vs. MPSIIIB-null. nd: 검출되지 않음.
도 14. 최적화된 뮤린 N-아세틸글루코스아미니다제, 알파를 코딩하는 AAV9 벡터(AAV9-CAG-comNaglu)의 수조내 전달이다. (A) 야생형(건강한) 마우스, 및 대조군 벡터(AAV9-Null) 3.9x1010 vg 또는 AAV9-CAG-comNaglu 3x1010 vg을 거대 수조에 투여한 MPSIIIB 마우스에서, 리소좀 구획의 크기의 지표(indication)를 제공하는 리소좀 마커 LIMP-2를 염색한 후, 뇌의 상이한 영역들에서 수득된 신호 강도의 정량화이다. 값은 1개 그룹 당 4 마리 마우스의 평균 ± SEM이다. * P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001 vs. MPSIIIB-null. (B) 야생형(좌측 패널), 비-치료-MPSIIIB(중간 패널), 및 거대 수조에 AAV9-CAG-comNaglu를 투여한 MPSIIIB 마우스(우측 패널)의 대뇌 피질 및 소뇌의 전자 현미경 분석이다. 1. 뉴런; 2. 뉴런주위 신경교세포; 3. 푸르키네 뉴런(purkinje neuron). (C) 야생형(건강한) 마우스, 비-치료 MPSIIIB 마우스, 및 대조군 벡터(AAV9-Null) 3.9x1010 vg 또는 AAV9-CAG-comNaglu 3x1010 vg를 거대 수조에 투여한 MPSIIIB 마우스로부터 수득된 뇌 추출물 내 다른 리소좀 효소들의 활성이다. SGSH, N-설포글루코스아민 설포하이드롤라제, GUSB, 글루쿠로니다제, 베타, HEXB, 헥소스아미니다제 B. WT 효소 활성을 100%로 설정하였다. 값은 1개 그룹 당 4 마리 마우스의 평균 ± SEM이다. *** P<0.001 vs. MPSIIIB-Null.
도 15. 최적화된 뮤린 N-아세틸글루코스아미니다제, 알파를 코딩하는 AAV9 벡터(AAV9-CAG-comNaglu)의 수조내 전달이다. 히스토그램은, 야생형(건강한) 마우스, 및 대조군 벡터(AAV9-Null) 3.9x1010 vg 또는 AAV9-CAG-comNaglu 3x1010 vg을 거대 수조에 투여한 MPSIIIB 마우스로부터의 전두 피질(frontal cortex), 두정 피질(parietal cortex) 및 후두 피질(occipital cortex), 상구(superior colliculus) 및 시상(thalamus)의 절편들에서 성상세포 마커 GFAP(A) 및 미세아교세포 마커 BSI-B4(B)에 대한 면역염색 후 측정된 신호 강도를 나타낸다. 값은 1개 그룹 당 2마리 내지 3 마리 마우스의 평균 ± SEM이다. * P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001 vs. MPSIIIB-null. (C) 유전자 온톨로지(Gene Ontology; GO) 주석을 기재로 한 기능적 분류. 파이 챠트(pie chart)는 각각의 생물학적 공정 기간과 연관된 전사체(transcript)의 분획을 가리킨다. 명백하게는, 대부분의 기간은 염증/면역-관련 범주를 나타낸다. (D) CTEN 소프트웨어가 미세아교세포를 나타내는 것으로 할당된 유전자 세트를 기재로 하는 모든 실험군들의 계층적 군집화(hierarchical clustering)이다. 각각의 컬럼은 유전자를 나타내고, 각각의 열은 동물을 나타낸다. 각각의 유전자의 발현 수준은 하부에 도시된 회색 스케일에서 모든 검체들에 걸친 해당 유전자에 대한 평균 존재량(mean abundance)에 대해 도시되어 있다. 매트릭스 상부에 도시된 검체의 덴드로그램(dendrogram)은 전체적인 유사성을 전사체 수준에서 나타낸다. 명백하게는, AAV9-CAG-comNaglu로 치료한 모든 MPSIIIB 마우스들은 동일-연령의 건강한 WT 한배새끼(littermate)와 근접한 유전자 발현 프로파일을 가진다.
도 16. 최적화된 뮤린 N-아세틸글루코스아미니다제, 알파를 코딩하는 AAV9 벡터(AAV9-CAG-comNaglu)의 수조내 전달이다. 야생형(건강한) 마우스, 비-치료 MPSIIIB 마우스, 및 대조군 벡터(AAV9-Null) 3.9x1010 vg 또는 AAV9-CAG-comNaglu 3x1010 vg을 거대 수조에 투여한 MPSIIIB 마우스의 간(A) 및 혈청(B)에서 N-아세틸글루코스아미니다제, 알파의 활성이다. (C) 체성 기관에서의 글리코스아미노글리칸(GAG) 정량화이다. 값은 1개 그룹 당 4마리 내지 8 마리 마우스의 평균 ± SEM이다. $ P<0.05 vs. WT, ** P<0.01, ** P<0.001 vs. 비-치료 MPSIIIB. nd: 검출되지 않음. (D) 간의 전자 현미경 분석이다. 다수의 일렉트로-루슨트 액포(electrolucent vacuole)(화살표)는 null 벡터로 치료된 MPSIIIB 마우스의 간세포의 세포질에서 관찰될 수 있고, 이들 소낭은 AAV9-CAG-mNaglu로 치료된 동물에서는 사라진다. (E) (A 및 B)에서와 동일한 코호트의 동물로부터 수득된 간 추출물에서의 다른 리소좀 효소들의 활성이다. IDS, 이두로네이트-2-설파타제, IDUA, 이두로니다제, 알파-L-, SGSH, N-설포글루코스아민 설포하이드롤라제, GUSB, 글루쿠로니다제, 베타, HEXB, 헥소스아미니다제 B. WT 효소 활성을 100%로 설정하였다. 값은 1개 그룹 당 4마리 마우스의 평균 ± SEM이다. ** P<0.01 및 *** P<0.001 vs. MPSIIIB-Null.
도 17. 최적화된 뮤린 N-아세틸글루코스아미니다제, 알파를 코딩하는 AAV9 벡터(AAV9-CAG-comNaglu)의 수조내 전달이다. 네이브(naive)-시험 야생형(건강한) 마우스, 비-치료 MPSIIIB 마우스, 및 대조군 벡터(AAV9-Null) 3.9x1010 vg 또는 AAV9-CAG-comNaglu 3x1010 vg을 거대 수조에 투여한 MPSIIIB 마우스에서의 행동 평가이다. 데이터는 처음 2분 동안 기록된 보행성 활동량(locomotor activity) 및 탐험적 활동량(exploratory activity)에 상응하고, 1개 그룹 당 10마리 내지 15마리 동물의 평균 ± SEM으로서 나타난다. (A) 센터까지의 잠복기(Latency to centre), (B) 보더에서의 시간(Time in border), (C) 센터까지의 투입(Entries to centre), (D) 휴지 시간, (E) 총 이동 거리, (F) 교차한 라인의 총 수(Total number of lines crossed). *P < 0.05 및 **P < 0.01 vs. MPSIIIB-null. (G) WT(n = 23), 비-치료 MPSIIIB 마우스(n = 12), AAV9-Null 3.9x1010 vg(n = 5) 또는 AAV9-CAG-comNaglu(3x109 vg(n = 8)를 주사한 MPSIIIB 마우스에서의 Kaplan-Meier 생존율 분석. AAV9-CAG-comNaglu 유전자 치료법을 이용한 치료는 MPSIIIB 동물의 수명을 상당히 연장시켰다. AAV9-CAG-comNaglu-치료된 MPSIIIB 마우스 vs. MPSIIIB-null에 대해 P = 0.0007.
도 18. 최적화된 캐닌(canine) N-아세틸글루코스아미니다제, 알파를 코딩하는 AAV9 벡터(AAV9-CAG-cocNaglu)를 비글 견(Beagle dog)에게 수조내 전달이다. (A) AAV9-CAG-cocNaglu 벡터를 건강한 비글 견에게 CSF내(intra-CSF) 전달하기 전 및 전달한 후, 매칭된 혈청 및 CSF 검체 내 항-AAV9 중화 항체(Nab) 타이터(titer)의 추적 조사이다. 개 3 및 개 4를, 수조내 투여 1개월 전에, AAV9-null 벡터를 1x1011 vg/kg으로 정맥내 전달함으로써 예비-면역화하였다. (B) 캐닌 N-아세틸글루코스아미니다제, 알파를 인코딩하는 AAV9 벡터 6.5x1012 vg의 CSF내 투여 후, 건강한 비글 성견(adult dog)의 CSF에서 N-아세틸글루코스아미니다제, 알파 활성의 추적 조사이다. 개 1 및 개 2(오픈 심볼)는 투여 순간 네이브하였으며, 한편 개 3 및 개 4(필드 심볼(filled symbol))는 AAV9 벡터에 대해 기존의 면역성을 가졌다. 모든 개들에 대해 각각의 시점에 대한 CSF 백혈구 계수(WBC)는 동일한 그래프에 도시되어 있다(파선).
도 19. 플라스미드 pAAV-CAG-hNaglu의 도식도(a) 및 재조합 AAV 벡터 AAV9-CAG-hNaglu의 게놈의 도식도(b)이다.
도 20. 플라스미드 pAAV-CAG-cohNaglu의 도식도(a) 및 재조합 AAV 벡터 AAV9-CAG-cohNaglu의 게놈의 도식도(b)이다.
도 21. 플라스미드 pAAV-CAG-cohNaglu-버전2의 도식도(a) 및 재조합 AAV 벡터 AAV9-CAG-cohNaglu-버전2의 게놈의 도식도(b)이다.
도 22. 플라스미드 pAAV-CAG-cohNaglu-버전3의 도식도(a) 및 재조합 AAV 벡터 AAV9-CAG-cohNaglu-버전3의 게놈의 도식도(b)이다.
도 23. 플라스미드 pAAV-CAG-comNaglu의 도식도(a) 및 재조합 AAV 벡터 AAV9-CAG-comNaglu의 게놈의 도식도(b)이다.
도 24. 플라스미드 pAAV-CAG-cocNaglu의 도식도(a) 및 재조합 AAV 벡터 AAV9-CAG-cocNaglu의 게놈의 도식도(b)이다.
미생물 수탁
플라스미드 pAAV-CAG-cohNaglu(서열번호 6)를 DSMZ (독일생물자원센터) - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Inhoffenstraβe 7 B, D-38124 Braunschweig, Federal Republic of Germany에 수탁 번호 DSM 26626 으로 2012년 11월 13일에 수탁하였다.
플라스미드 pAAV-CAG-hNaglu(서열번호 5)를 DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Inhoffenstraβe 7 B, D-38124 Braunschweig, Federal Republic of Germany에 수탁 번호 DSM 28568 으로 2014년 3월 13일에 수탁하였다.
플라스미드 pAAV-CAG-cohNaglu-버전2(서열번호 20)를 DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Inhoffenstraβe 7 B, D-38124 Braunschweig, Federal Republic of Germany에 수탁 번호 DSM 32042 으로 2015년 4월 29일에 수탁하였다.
플라스미드 pAAV-CAG-cohNaglu-버전3(서열번호 23)를 DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Inhoffenstraβe 7 B, D-38124 Braunschweig, Federal Republic of Germany에 수탁 번호 DSM 32043 으로 2015년 4월 29일에 수탁하였다.
정의
용어 "뉴클레오타이드 서열"은 각각 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드를 함유하는 DNA 또는 RNA인 핵산 분자를 지칭한다. 핵산은 이중 가닥 또는 단일 가닥일 수 있거나, 이중 가닥 서열 또는 단일 가닥 서열 둘 모두의 일부를 함유할 수 있다.
용어 "서열 동일성%"는 최대 서열 동일성%를 달성하기 위해 서열을 정렬시킨 후, 참조 서열의 뉴클레오타이드와 일치하는 후보 서열의 뉴클레오타이드의 백분율을 지칭한다. 서열 동일성%는 당업계에 구축된 임의의 방법 또는 알고리즘, 예컨대 ALIGN, BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘에 의해 확인될 수 있다. 문헌[Altschul S, et al., Nuc Acids Res. 1977;25:3389-3402] 및 [Altschul S, et al., J Mol Biol. 1990;215:403-410]을 참조한다.
본원에서, 서열 동일성%는, 참조 서열과 후보 서열을 정렬시킨 후 일치하는 뉴클레오타이드의 수를, 참조 서열의 뉴클레오타이드의 총 수로 나눈 다음, 그 결과에 100을 곱하여 계산한다.
용어 "코딩하다(codify)" 또는 "코딩하는"은, 뉴클레오타이드 서열이 폴리펩타이드 또는 단백질로 어떻게 번역되는지 결정하는 유전 암호를 지칭한다. 서열에서 뉴클레오타이드의 순서는 폴리펩타이드 또는 단백질을 따라 아미노산의 순서를 결정한다.
용어 "단백질"은 아미노산 또는 폴리펩타이드의 하나 이상의 선형 사슬로 구성된 거대분자를 지칭한다. 단백질은 3-옥소알라닌으로의 시스테인 잔기의 전환, 글리코실화 또는 금속 결합과 같은 번역-후 변형을 받을 수 있다. 단백질의 글리코실화는 아미노산 사슬에 공유 연결된 상이한 탄수화물들의 첨가이다.
용어 "유효량"은 의도하는 목적을 달성하기에 충분한, 성분의 양을 지칭한다. 예를 들어, N-아세틸글루코스아미니다제, 알파(Naglu) 활성을 증가시키기 위한 AAV9 벡터의 유효량은 글리코스아미노글리칸 축적을 감소시키기에 충분한 양이다. 질환 또는 장애를 치료하기 위한 발현 벡터의 "치료학적 유효량"은, 질환 또는 장애의 징후 및 증상을 감소시키거나 근절하기에 충분한 발현 벡터의 양이다. 주어진 성분의 유효량은 성분의 성질, 투여 경로, 성분을 수용하는 동물의 크기와 종(species) 및 성분의 제공 목적과 같은 인자들에 따라 다를 것이다. 각각의 개별 경우 유효량은 당업계에 구축된 방법에 따라 당업자에 의해 경험적으로 결정될 수 있다.
용어 "개체"는 포유류, 바람직하게는 인간 또는 비-인간 포유류, 보다 바람직하게는 마우스, 래트, 다른 쥣과 동물, 토끼, 개, 고양이, 돼지, 소, 말 또는 영장류, 보다 더 바람직하게는 인간을 지칭한다.
용어 "작동적으로 연결된"은, 관심 유전자에 대한 프로모터 서열의 기능적인 관계 및 위치를 지칭한다(예, 프로모터 또는 인핸서가 코딩 서열의 전사에 영향을 미친다면, 코딩 서열에 작동적으로 연결됨). 일반적으로, 작동적으로 연결된 프로모터는 관심 서열에 인접한다. 그러나, 인핸서는 관심 서열의 발현을 조절하기 위해, 관심 서열에 인접해 있을 필요는 없다.
용어 "향성(tropism)"은, 상이한 바이러스들이 특정 숙주 종, 또는 해당 종 내의 특정 세포 유형을 우선적으로 표적화하도록 진화한 방식을 지칭한다.
용어 "유전자 치료법"은 유전적 또는 후천적 질환 또는 병태를 치료하거나 예방하기 위해 관심 유전 물질(예, DNA 또는 RNA)을 숙주 내로 트랜스퍼하는 것을 지칭한다. 관심 유전 물질은, 생체내에서의 이의 생성이 요망되는 생성물(예, 단백질 폴리펩타이드, 펩타이드 또는 기능성 RNA)을 인코딩한다. 예를 들어, 관심 유전 물질은 치료 가치를 가진 효소, 호르몬, 수용체 또는 폴리펩타이드를 인코딩할 수 있다.
용어 "재조합 바이러스 벡터", "바이러스 벡터", "재조합 벡터" 또는 "벡터"는, 관심 유전 물질(예, DNA 또는 RNA)을 세포에 트랜스퍼할 수 있는 유전자 조작 기술을 통해 자연-발생 바이러스로부터 수득되며, 표적 세포 내에서 상기 유전 물질(예, 단백질 폴리펩타이드, 펩타이드 또는 기능성 RNA)에 의해 인코딩된 생성물을 제조하는 작용제를 지칭한다. 본 발명의 맥락에서, "재조합 벡터" 또는 "벡터"는, 캡시드 단백질뿐만 아니라 유전 물질을 세포 내에 트랜스퍼하는 데 사용된 유전 물질인 것으로 이해되어야 한다. 뉴클레오타이드 서열을 통해 "재조합 벡터" 또는 "벡터"를 지칭하는 것은, 게놈이 상응하는 서열 목록(SEQ ID)에 나타나 있는 "재조합 벡터" 또는 "벡터"를 지칭함을 의미한다.
용어 "재조합 플라스미드" 또는 "플라스미드"는, 관심 유전 물질을 세포에 트랜스퍼할 수 있는 유전자 조작 기술을 통해 수득되며, 표적 세포 내에서 상기 유전 물질(예, 단백질 폴리펩타이드, 펩타이드 또는 기능성 RNA)에 의해 인코딩된 생성물을 제조하는, 작고 원형이며 이중 가닥인 자가-복제성 DNA 분자를 지칭한다. 더욱이, 용어 "재조합 플라스미드" 또는 "플라스미드"는 또한, 바이러스 벡터를 재조합 벡터 게놈의 담체(carrier)로서 제조하는 동안 사용되는 유전자 조작 기술을 통해 수득되는, 작고 원형이며 이중 가닥인 자가-복제성 DNA 분자를 지칭한다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 질환의 치료, 특히 점액다당류증 유형 III(MPSIII), 특히 MPSIIIB의 치료를 위한 새로운 재조합 벡터를 제공한다.
유전 물질 외에도, 재조합 벡터는 또한, 프로모터 또는 오퍼레이터와 같은 전사 조절 요소, 전사 인자 결합 영역 또는 인핸서, 및 번역 개시 또는 종결을 위한 조절 요소를 포함하는 상이한 기능성 요소들을 함유할 수도 있다.
본 발명에 따른 벡터는 관심 유전자를 트랜스퍼하는 데 사용되는 아데노연관 벡터(AAV)이다. 이러한 벡터는 광범위한 조직에서 체세포분열-후 세포를 형질도입하는 데 있어서 높은 효율을 가진 것으로 입증되었다. 본 발명의 맥락에서, 벡터는 인간 N-아세틸글루코스아미니다제, 알파(hNaglu) 폴리뉴클레오타이드(서열번호 2) 또는 코돈 최적화된 인간 N-아세틸글루코스아미니다제, 알파(cohNaglu) 폴리뉴클레오타이드(서열번호 3)를 전달하는 데 사용된다. 아데노연관 벡터는 파보비리 대(parvoviridae) 패밀리의 아데노연관 바이러스의 게놈으로부터 유래되는 벡터이다. 아데노연관 바이러스 게놈은 단일 가닥 데옥시리보핵산(ssDNA)의 구축물이다. 이들 벡터는 포유류를 감염시키지만, 비-병원성이다(즉, 질환을 유발하지 않음). 이들 벡터는 분열 세포 또는 비-분열 세포를 감염시킬 수 있고, 이들의 향성은 혈청형에 따라 변한다. 혈청형은 바이러스의 캡시드 항원에 따른 바이러스 그룹의 분류이다. 캡시드 단백질에 의해 결정되는 아데노연관 바이러스의 혈청형은 바이러스 향성을 한정(define)하고, 특정 세포 유형으로의 이의 도입을 허용한다. 본 발명의 맥락에서, 아데노연관 바이러스 벡터의 혈청형 9(AAV9)은 단일 투여 시, 유전 물질을 뇌뿐만 아니라 주변 기관에 전달하는 최상의 능력을 보여준다.
본 발명자들은 놀랍게도, 동일한 엔터티(entity)에서, AAV9 캡시드와, 특정 CAG 프로모터와 더불어, N-아세틸글루코스아미니다제, 알파를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열과의 연관이 뇌의 모든 영역들에서 결측 효소의 장기-지속적(long-lasting) 발현을 허용함을 발견하였다. 그 결과, 글리코스아미노글리칸(GAG)의 리소좀 축적이 정정되며, 이로써 MSPIII 질환, 특히 MPSIIIB의 특징인 신경학적 변경이 예방된다. 이러한 효과는 벡터의 투여 지점으로부터 원거리에 존재하는 후각망울(olfactory bulb)에서도 수득되었다. 나아가, 뇌척수액 내에 전달된 본 발명에 따른 AAV9 벡터는 전신 순환에 도달하여, 간에 형질도입될 수 있었다. 간 세포에 의한 효소의 제조 및 분비에 의해, 혈청 내에서 N-아세틸글루코스아미니다제, 알파의 활성이 증가하였으며, 궁극적으로는 많은 체성 조직들에서 리소좀 병증이 감소하였다. 이는, 질환의 임상적 징후를 오로지 부분적으로 정정한 기존의 접근법을 능가하였으며, 통상 뇌 또는 전신 순환 둘 모두에서가 아니라 둘 중 어느 하나에서 그 효과를 발휘하는 본 발명에 따른 벡터의 명백한 이점을 나타낸다.
이에, 본 발명은 N-아세틸글루코스아미니다제, 알파, 서열번호 1을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 연결된 CAG 프로모터(서열번호 4)를 함유하는 재조합 AAV9 벡터에 관한 것이다.
특히, 본 발명의 재조합 AAV9 벡터는, 서열번호 2와 적어도 80%의 서열 동일성을 가진, N-아세틸글루코스아미니다제, 알파, 서열번호 1을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 연결된 CAG 프로모터(서열번호 4)를 함유한다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 AAV9 재조합 벡터는 서열번호 2와 적어도 84%의 서열 동일성을 가진, N-아세틸글루코스아미니다제, 알파, 서열번호 1을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 연결된 CAG 프로모터(서열번호 4)를 함유한다. 특히, N-아세틸글루코스아미니다제, 알파, 서열번호 1을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 2와 84%, 87%, 90%, 95%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 가진다.
또 다른 특정 실시형태에서, 본 발명의 재조합 AAV9 벡터는, 서열번호 3과 적어도 85%의 서열 동일성을 가진, N-아세틸글루코스아미니다제, 알파, 서열번호 1을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 연결된 CAG 프로모터(서열번호 4)를 함유한다. 특히, N-아세틸글루코스아미니다제, 알파, 서열번호 1을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 3과 85%, 87%, 90%, 95%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 가진다.
본 발명의 바람직한 실시형태에서, N-아세틸글루코스아미니다제, 알파, 서열번호 1을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 2이다.
본 발명의 추가적인 바람직한 실시형태에서, N-아세틸글루코스아미니다제, 알파, 서열번호 1을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 3이다. 서열번호 3으로 나타낸 서열은 서열번호 2와 84%의 서열 동일성을 제시한다.
본 발명의 보다 추가적인 바람직한 실시형태에서, N-아세틸글루코스아미니다제, 알파, 서열번호 1을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 19이다.
본 발명의 보다 추가적인 바람직한 실시형태에서, N-아세틸글루코스아미니다제, 알파, 서열번호 1을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 22이다.
본 발명에 따른 AAV9 벡터는 관심 유전자의 번역 및 전사를 조절하는 프로모터를 함유한다. 프로모터는 상기 관심 유전자에 작동적으로 연결된 뉴클레오타이드 서열이다. 본 발명에 사용되는 프로모터는, 사이토메갈로바이러스 초기 인핸서 요소와 닭 β-액틴 프로모터를 포함하는 조합을 지칭하는 CAG 프로모터이다. 이러한 프로모터는 관심 유전자 유래의 mRNA에 안정성을 부여하는 β-글로빈 인트론의 일부를 추가로 포함한다. 문헌[Alexopoulou A, et al., BMC Cell Biology 2008; 9(2): 1-11]을 참조한다. 본 발명의 AAV9 벡터에 포함된 CAG 프로모터는 서열 서열번호 4를 가진다. 특히, 이러한 CAG 프로모터는 당업계에서 통상 사용되는 CMV 프로모터보다 더 효율적인 것으로 입증되었다.
본 발명의 추가적인 바람직한 실시형태에서, 재조합 AAV9 벡터는 AAV9-CAG-hNaglu(서열번호 9), AAV9-CAG-cohNaglu(서열번호 10), AAV9-CAG-cohNaglu-버전2(서열번호 21) 및 AAV9-CAG-cohNaglu-버전3(서열번호 24)로부터 선택된다. 바람직하게는, 재조합 AAV9 벡터는 AAV9-CAG-hNaglu(서열번호 9) 및 AAV9-CAG-cohNaglu(서열번호 10)로부터 선택된다. 보다 구체적으로는, 본 발명의 재조합 AAV9 벡터는 인간 아데노연관 바이러스의 혈청형 9의 바이러스 캡시드, 인간 아데노연관 바이러스 혈청형 2의 반전 말단 반복부(ITR)를 함유하는 변형된 게놈, CAG 프로모터, 인간 알파 N-아세틸글루코스아미디나제(Naglu) 유전자의 코딩 서열(CDS) 및 토끼 베타-글로빈 유전자 유래의 polyA로 구성된다.
본 발명은 또한, N-아세틸글루코스아미니다제, 알파, 서열번호 1을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 플라스미드에 관한 것이다. 특히, 본 발명에 따른 플라스미드는 서열번호 2와 적어도 80%의 서열 동일성을 가진, N-아세틸글루코스아미니다제, 알파, 서열번호 1을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 함유한다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 플라스미드는 서열번호 2와 적어도 84%의 서열 동일성을 가진, N-아세틸글루코스아미니다제, 알파, 서열번호 1을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 함유한다. 특히, N-아세틸글루코스아미니다제, 알파, 서열번호 1을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 2와 84%, 87%, 90%, 95%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 가진다.
바람직한 실시형태에서, 본 발명에 따른 플라스미드는 서열번호 3과 적어도 85%의 서열 동일성을 가진, N-아세틸글루코스아미니다제, 알파, 서열번호 1을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 함유한다. 특히, N-아세틸글루코스아미니다제, 알파, 서열번호 1을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 3과 85%, 87%, 90%, 95%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 가진다.
이들 플라스미드는 당업계에 알려진 방법을 사용하여 HEK293 세포를 형질감염시킴으로써 본 발명의 재조합 AAV9 벡터를 제조하는 데 유용하다.
본 발명의 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 플라스미드에 함유되고 N-아세틸글루코스아미니다제, 알파, 서열번호 1을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 2이다.
본 발명의 또 다른 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 플라스미드에 함유되고 N-아세틸글루코스아미니다제, 알파, 서열번호 1을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 3이다.
본 발명의 또 다른 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 플라스미드에 함유되고 N-아세틸글루코스아미니다제, 알파, 서열번호 1을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 19이다.
본 발명의 또 다른 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 플라스미드에 함유되고 N-아세틸글루코스아미니다제, 알파, 서열번호 1을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 22이다.
보다 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 플라스미드는 pAAV-CAG-hNaglu(서열번호 5), pAAV-CAG-cohNaglu(서열번호 6), pAAV-CAG-cohNaglu-버전2(서열번호 20) 및 pAAV-CAG-cohNaglu-버전3(서열번호 23)으로부터 선택되고, 특히 pAAV-CAG-hNaglu(서열번호 5) 및 pAAV-CAG-cohNaglu(서열번호 6)로부터 선택되며, 바람직하게는 플라스미드는 pAAV-CAG-cohNaglu(서열번호 6)이다.
나아가, 본 발명은 본 발명에 따른 아데노연관 바이러스 재조합 벡터 AAV9의 제조 방법을 제공한다. 본 방법은,
i) 제1 AAV 말단 반복부와 제2 AAV 말단 반복부 사이에 삽입되는 관심 단백질을 코딩하는 서열, 및 관심 단백질을 코딩하는 서열에 작동적으로 연결된 CAG 프로모터를 포함하는 제1 벡터; AAV rep 유전자, 및 혈청형 9 유래의 AAV cap 유전자를 포함하는 제2 벡터; 및 아데노바이러스 헬퍼 기능 유전자를 포함하는 제3 벡터를 제공하는 단계;
ii) 적격 세포(competent cell)를 단계 i)의 벡터들로 공동-형질감염시키는 단계;
iii) 단계 ii)의 형질감염된 세포를 배양하는 단계; 및
iv) 단계 iii)의 배양물로부터 발현 벡터들을 정제하는 단계
를 포함한다.
바람직한 실시형태에서, 제1 벡터의 AAV 제1 말단 반복부 및 제2 말단 반복부는 AAV 혈청형 2 유래의 ITR이다. 또 다른 바람직한 실시형태에서, 제2 벡터의 AAV rep 유전자는 AAV 혈청형 2로부터 유래된다. 또 다른 바람직한 실시형태에서, 적격 세포는 HEK293 세포이다.
본 발명은 또한, 본 발명에 따른 플라스미드의 제조 방법을 제공하며, 본 방법은,
i) 관심 단백질을 코딩하는 서열을 출발 플라스미드로부터 분해, 특히 MIuI/EcoRI을 사용한 분해에 의해 절단하는 단계, 및
ii) 관심 단백질을 코딩하는 서열을 AAV 백본 플라스미드 pAAV-CAG의 2개의 제한효소 부위들 사이에서 클로닝하여, 관심 단백질을 코딩하는 서열을 포함하는 상응하는 플라스미드를 수득하는 단계
를 포함한다.
부가적인 양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 치료학적 유효량의 AAV9 벡터 또는 본원에 기술된 치료학적 유효량의 플라스미드를 함유하는 약제학적 조성물을 고려한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체에 재조합 AAV9 벡터를 포함한다. 본 조성물은 또한, 적어도 하나의 보조 성분을 포함할 수 있다. 보조 성분은 담체, 부형제, 용매, 희석제 또는 보강제 중에서 선택될 수 있다. 허용가능한 담체, 희석제 또는 보강제는 무독성이며, 바람직하게는 적용되는 투여량 및 농도에서 불활성이고, 포스페이트, 시트레이트 또는 다른 유기산과 같은 완충제; 항산화제; 저분자량 폴리펩타이드, 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체; 아미노산; 단당류, 이당류, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함한 다른 탄수화물; 킬레이트제; 당 알코올, 예컨대 만니톨 또는 소르비톨, 염 형성 반대이온, 예컨대 나트륨; 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예컨대 폴리에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 공중합체(Pluronic F68®), 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다.
바람직한 실시형태에서, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 비경구 투여에 바람직하다. 비경구 투여의 예는 정맥내 주사, 피하 주사, 수조내 주사 및 근육내 주사이다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 정맥내 투여 또는 수조내 투여에 바람직하다. 이러한 비경구 투여에 적합한 조성물은 멸균 수용액 또는 분산액, 멸균 수용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 유리하게는, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 박테리아 및 진균류의 오염 작용으로부터 보존된다.
인간 및 동물에 대한 일일 투여량은 각각의 종(species) 또는 다른 인자들, 예컨대 연령, 성별, 체중 또는 병의 정도 등을 기재로 하는 인자들에 따라 다를 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 전술한 AAV9 벡터 또는 전술한 플라스미드의 치료학적 용도에 관한 것이다. 전술한 바와 같이, 본 발명에 따른 재조합 AAV9 벡터는 결측 Naglu 효소의 발현을 달성하며, 따라서, GAG의 리소좀 축적을 정정한다. 이로써, 점액다당류증 유형 III(MPSIII), 특히 MPSIIIB의 모든 임상 징후들을 정정할 수 있다. 이러한 양태에서, 본 발명은 또한, 의약으로서 사용하기 위한 전술한 재조합 AAV9 벡터 또는 전술한 플라스미드에 관한 것이다.
특히, 본 발명은 체내에서 알파 N-글루코스아미니다제 활성을 증가시키기 위한 전술한 재조합 AAV9 벡터 또는 전술한 플라스미드에 관한 것이다.
추가적인 바람직한 양태에서, 본 발명은 점액다당류증 유형 III(MPSIII), 특히 MPSIIIB의 치료를 위한 전술한 재조합 AAV9 벡터 또는 전술한 플라스미드에 관한 것이다.
보다 추가적인 실시형태에서, 본 발명은 점액다당류증 유형 III(MPSIII), 특히 MPSIIIB의 치료에 유용한 의약의 제조를 위한, 전술한 재조합 AAV9 벡터 또는 전술한 플라스미드의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 실시형태는 전술한 적어도 하나의 재조합 AAV9 벡터 또는 전술한 적어도 하나의 플라스미드를 이를 필요로 하는 피험자에게 투여하는 단계를 포함하는, 점액다당류증 유형 III(MPSIII), 특히 MPSIIIB의 치료 방법에 관한 것이다.
나아가, 본 발명은 N-아세틸글루코스아미니다제, 알파, 서열번호 1을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 세포를 제공한다. 특히, 본 발명에 따른 세포는 서열번호 2와 적어도 80%의 서열 동일성을 가진, N-아세틸글루코스아미니다제, 알파, 서열번호 1을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 바람직하게는, N-아세틸글루코스아미니다제, 알파, 서열번호 1을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 2와 적어도 84%의 서열 동일성을 가진다. 특히, N-아세틸글루코스아미니다제, 알파, 서열번호 1을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 2와 84%, 87%, 90%, 95%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 가진다. 추가적인 특정 양태에서, N-아세틸글루코스아미니다제, 알파, 서열번호 1을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 3과 적어도 85%의 서열 동일성을 가지며, 바람직하게는 서열번호 3과 85%, 87%, 90%, 95%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 가진다.
바람직한 실시형태에서, 본 발명의 세포는 N-아세틸글루코스아미니다제, 알파, 서열번호 1을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 서열번호 2를 포함한다.
또 다른 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 세포는 N-아세틸글루코스아미니다제, 알파, 서열번호 1을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 서열번호 3을 포함한다.
또 다른 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 세포는 N-아세틸글루코스아미니다제, 알파, 서열번호 1을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 서열번호 19를 포함한다.
또 다른 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 세포는 N-아세틸글루코스아미니다제, 알파, 서열번호 1을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 서열번호 22를 포함한다.
하기 실시예는 단지 본 발명의 소정의 실시형태를 예시하는 것일 뿐이며, 본 발명을 임의의 방식으로 제한하려는 것으로 간주될 수 없다.
일반적인 절차
1. 재조합 AAV 벡터
본원에 기술된 AAV 벡터를 3중 형질감염에 의해 수득하였다. 벡터 제조에 필요한 물질은, HEK293 세포(E1 유전자를 발현함), 아데노바이러스 기능을 제공하는 헬퍼 플라스미드, 혈청형 2 유래의 AAV rep 유전자 및 혈청형 9 유래의 cap 유전자를 제공하는 플라스미드(AAV9) 및 마지막으로 AAV2 ITR 및 관심 구축물을 갖는 백본 플라스미드였다.
N-아세틸글루코스아미니다제, 알파-발현 AAV 벡터를 생성하기 위해, 인간, 뮤린 또는 캐닌 N-아세틸글루코스아미니다제, 알파의 비-최적화된 CDS 또는 최적화된 CDS를 유비쿼터스 하이브리드 CAG 프로모터의 조절 하에 AAV 백본 플라스미드 내로 클로닝하였다.
벡터를, 변형이 된 3개의 플라스미드를 사용하여 HEK293 세포를 헬퍼 바이러스-프리 형질감염시켜서 생성하였다. 문헌[Matsushita T, et al., Gene Ther. 1998;5:938-945] 및 [Wright J, et al., Mol. Ther. 2005;12:171-178]을 참조한다. 세포를 10% FBS가 보충된 DMEM이 든 롤러 병(RB)(Corning, Corning, NY, US)에서 70% 포화도(confluence)까지 배양한 다음, 1) 혈청형 2 AAV의 바이러스 ITR의 측면에 있는(flanked) 발현 카세트를 가진 플라스미드(전술함); 2) AAV rep2 유전자 및 cap9 유전자를 가진 플라스미드; 및 3) 아데노바이러스 헬퍼 기능을 가진 플라스미드로 공동-형질감염시켰다. 벡터를 전술한 최적화된 프로토콜을 사용하여 2개의 연속적인 세슘 클로라이드 구배에 의해 정제하였다. 문헌[Ayuso E, et al., Gene Ther. 2010;17:503-510]을 참조한다. 벡터를 PBS에 대해 투석시키고, 여과한 다음, qPCR에 의해 적정하고, 사용할 때까지 -80℃에 보관하였다.
본 발명의 벡터를 당업계에 잘 알려져 있는 분자생물학 기술에 따라 구축하였다.
2. 동물
유사유전자형 돌연변이체(congenic mutant)인 C57Bl/6J N-아세틸글루코스아미니다제, 알파-결핍 마우스(MPSIIIB) 모델을 The Jackson Laboratory(Bar Harbor, ME, USA. Stock 003827)로부터 구매하였다. 문헌[Li et al., Proc Natl Acad Sci. 1999; 96(25):14505-10]을 참조한다. 병에 걸린 MPSIIIB 마우스 및 건강한 대조군 마우스를 이형접합 창시자(heterozygous founder)로부터 동계 교배하였다. 표적화된 돌연변이를 포함하는 서열을 증폭시키는 PCR 분석을 이용하여, 꼬리에 클립을 끼운 검체의 게놈 DNA에서 유전형을 확인하였다. 각각의 센스 프라이머 및 안티센스 프라이머의 서열은, 정방향 프라이머: 5'-GTC GTC TCC TGG TTC TGG AC-3'(서열번호 13), 역방향 프라이머: 5'-ACC ACT TCA TTC TGG CCA AT-3'(서열번호 14), 역방향 프라이머 돌연변이: 5'-CGC TTT CTG GGC TCA GAG-3'(서열번호 15)이었다. 마우스를 표준 식이요법(Harlan, Tekland))에 따라 마음대로 먹이를 주었으며, 12시간의 명암 사이클(9:00 A.M.에 명(light)) 하에 유지시켰다.
3. 마우스에의 hNAGLU -인코딩 플라스미드의 유체 역학적 전달
pAAV-CAG-hNaglu, pAAV-CAG-cohNaglu-버전2 및 pAAV-CAG-cohNaglu-버전3 플라스미드의 유체 역학적 전달을 위해, 2-월령의 MPSIIIB 및 야생형 동물에게, 총 용량으로서 동물의 체중 10%와 동일한 부피 중 플라스미드 50 ㎍을 5초 이내에 꼬리 정맥 주사를 통해 제공하였다. 이러한 기술을 통해, 플라스미드-인코딩된 이식유전자를 주로 간에서 발현시켰다. 문헌[Liu et al., Gene Ther. 1990;6(7):1258-66]을 참조한다. 대조군으로서, 마우스의 코호트에게 동일 부피의 식염수 용액을 제공하였다. 마우스를 플라스미드의 유체 역학적 주사 후 1주일째에 안락사시켰다. 하기 섹션에서 기술된 바와 같이 기관들을 수집하였다.
4. 벡터 투여 및 검체 수집
마우스에의 AAV9-CAG-comNaglu 벡터의 수조내 전달을 위해, 총 3x1010 vg 용량을 2-월령의 MPSIIIB 동물의 거대 수조에 주사하였다. 유사한 코호트의 동물에게 대조군 비-코딩(AAV9-null) 벡터를 3.9x1010 vg로 주사하였다. 5월령째에, 즉, 벡터 투여 후 3개월째에, 마우스를 안락사시킨 다음, PBS 10 ml을 사용하여 경심 관류((transcardially perfusion)시켜, 조직으로부터 혈액을 완전히 제거하였다. 전체 뇌 및 다수의 체성 조직들(간, 비장, 신장, 폐, 심장, 골격근 및 고환 포함)을 수집하고, 액체 질소에서 동결시키고 -80℃에 보관하거나 후속적인 조직학적 분석을 위해 포르말린에 침지시켰다.
AAV9-CAG-hNaglu 및 AAV9-CAG-cohNaglu 벡터의 정맥내 전달을 위해, 2-월령의 MPSIIIB 동물에게 총 5x1011 vg 용량을 꼬리 정맥 주사를 통해 제공하였다. 4월령째에, 즉, 벡터 투여 후 2개월째에, 마우스를 안락사시킨 다음, 기관들을 이전의 단락에서 기술된 바와 같이 수집하였다.
AAV9-CAG-hNaglu 및 AAV9-CAG-cohNaglu 벡터의 수조내 전달을 위해, 2-월령의 MPSIIIB 동물의 거대 수조에 총 9.3x109 vg 용량을 주사하였다. 4월령째에, 즉, 벡터 투여 후 2개월째에, 마우스를 안락사시킨 다음, 기관들을 이전의 단락에서 기술된 바와 같이 수집하였다.
개에게의 AAV9-CAG-cocNaglu 벡터의 수조내 전달을 위해, 건강한 비글 성견에게 총 6.5x1012 vg 용량을 거대 수조 주사를 통해 투여하였다. Naglu 벡터 투여 전 6주째에, 2마리의 동물에게 AAV9-null 벡터 1x1011 vg/kg을 정맥내 주사하여, 이들을 AAV9에 대해 예비-면역화시켰다. 처음에는 매주, 그 다음에는 매달 CSF 및 혈청 검체를 수집하고, -80℃에 보관하였다.
5. 벡터 게놈 복사수의 정량화
조직(약 100 mg)을 56℃에서 프로테이나제 K 용액(0.2 mg/ml) 400 ㎕에서 밤새(ON) 분해시켰다. 총 DNA를 표준 기술을 사용하여 추출에 의해 상층액으로부터 단리하였다. DNA를 증류수에 재현탁시키고, NanoDrop ND-1000(NanoDrop, Wilmington, DE, USA)을 사용하여 정량화하였다. 총 DNA 20 ng에서의 벡터 게놈 복사수를, 내인성 게놈 유전자좌를 증폭시키지 않는, 뮤린 N-아세틸글루코스아미니다제, 알파 이식 유전자에 특이적인 프라이머 및 프로브를 사용한 정량적 실시간 PCR에 의해 확인하였다. 정방향 프라이머: 5'-GCC GAG GCC CAG TTC TAC-3'(서열번호 16); 역방향 프라이머: 5'-TTG GCG TAG TCC AGG ATG TTG-3'(서열번호 17); 프로브: 5'-AGC AGA ACA GCA GAT ACC AGA TCA CCC-3'(서열번호 18). 최종 값을, 20 ng 비-형질도입된 게놈 DNA 내로 스파이킹된(spiked) AAV 벡터 제조에 사용된 선형화된 플라스미드의 단계 희석으로부터 구축된 참조 표준 곡선과 비교함으로써 확인하였다.
6. N- 아세틸글루코스아미니다제 , 알파 활성 및 글리코스아미노글리칸 정량화
간 및 뇌 검체를 Mili-Q 워터에서 소니케이션(sonication)하였다. 혈청을 가공하지 않은 채 분석하였다. 전술한 바와 같이, N-아세틸글루코스아미니다제, 알파 활성을 4-메틸움벨리페론(methylumbelliferone)-유래의 유오로제닉(uorogenic) 기질(Moscerdam Substrates, Oegstgeest, NL)을 사용하여 확인하였다. 문헌[Marsh and Fensom, Clin Genet. 1985;27(3):258-262]를 참조한다. 뇌 및 간의 활성 수준을 단백질의 총 양에 대해 정상화하고, Bradford 단백질 분석법(Bio-Rad, Hercules, CA, US)에 의해 정량화하였다. 혈청 활성을 부피에 대해 정상화하였다.
글리코스아미노글리칸(GAG) 정량화를 위해, 조직 검체를 칭량한 다음, 프로테이나제 K를 사용하여 분해하고, 추출물을 원심분리 및 여과에 의해 정제하였다. GAG 수준을, 콘드로이틴 4-설페이트를 표준으로서 사용하는 Blyscan 설페이티드 글리코스아미노글리칸 키트(Biocolor, Carrickfergus, County Antrim, GB)를 이용하여 조직 추출물에서 확인하였다. GAG의 수준을 습식 조직 중량으로 정상화하였다.
7. 다른 리소좀 효소의 활성
IDUA 활성을, 4-메틸움벨리페릴 α-N-이두로나이드(Glycosynth)와 함께 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 단백질 15 ㎍에서 측정하였다. IDS 활성에 대해, 단백질 15 ㎍을 우선, 4-메틸움벨리페릴-α-L-이두로나이드-2-설페이트(Moscerdam Substrates)와 함께 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션한 다음, 소 고환 유래의 리소좀 효소 풀(LEBT-M2, Moscerdam Substrates)과 함께 37℃에서 두번째 24시간 인큐베이션을 수행하였다. SGSH 활성을 전술한 바와 같이, 측정하였다. 문헌[Haurigot et al., J Clin Invest 2013;123(8):3254-71]을 참조한다. GUSB 활성에 대해, 단백질 10 ㎍을 4-메틸움벨리페릴-β-D-글루쿠로나이드(Sigma)와 함께 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. HEXB 활성을, 단백질 0.1 ㎍을 4-메틸움벨리페릴 N-아세틸-β-D-글루코아미나이드(Sigma)와 함께 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션함으로써 분석하였다. pH를 증가시킴으로써 반응을 중단시킨 후, 방출된 형광을 FLx800 형광계(BioTek Instruments)를 이용하여 측정하였다. 모든 효소 활성을 Bradford(Bio-Rad)에 의해 정량화된 단백질의 총 함량에 대해 정상화하였다.
8. 조직학적 분석
조직을 포르말린에서 12시간 내지 24시간 동안 고정시키고, 파라핀에 포매시킨 다음, 박절하였다. 체성 조직에서의 LAMP1의 면역조직화학적 검출을 위해, 파라핀 절편을 pH 6의 시트레이트 완충제에서 가열-유도 에피토프 복구(epitope retrieval)로 처리한 다음, 1:100으로 희석시킨 래트 항-LAMP1 항체(1D4B; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, US)와 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션하고, 후속해서 비오틴화된 토끼 항-래트 항체(Dako, Glostrup, DK)와 함께 1:300으로 인큐베이션하였다. 뇌에서의 LAMP1의 면역조직화학적 검출을 위해, 파라핀 절편을, 1:100으로 희석시킨 토끼 항-LIMP2 항체(NB400; Novus Biologicals, Littleton, CO, USA)와 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션하고, 후속해서 비오틴화된 염소 항-토끼 항체(31820; Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)와 함께 1:300으로 인큐베이션하였다. 뇌 검체에서의 GFAP 면역염색을 위해, 파라핀 절편을, 1:1000으로 희석시킨 토끼 항-GFAP 항체(Ab6673; Abcam, Cambridge, UK)와 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션하고, 후속해서 비오틴화된 염소 항-토끼 항체(31820; Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)와 함께 1:300으로 인큐베이션하였다. LAMP1, LIMP2 및 GFAP 신호를, 절편들을 ABC-퍼옥시다제 염색 키트(Thermo Scientific, Waltham, MA, US)와 함께 1:100으로 희석하여 인큐베이션함으로써 증폭시키고, 3,3-다이아미노벤지딘(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, US)을 색원체로서 사용하여 시각화하였다. 명시야 이미지를 광학 현미경(Eclipse 90i; Nikon, Tokyo, JP)에서 수득하였다.
뇌 검체에서 미세아교세포를 염색하기 위해, 파라핀 절편을 1:100으로 희석시킨 Bsi-B4 렉틴(L5391; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)과 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. Bsi-B4 신호를, 3,3-다이아미노벤지딘(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, US)을 색원체로서 사용하여 시각화하였다. 명시야 이미지를 광학 현미경(Eclipse 90i; Nikon, Tokyo, JP)에서 수득하였다.
NIS Elements Advanced Research 2.20 소프트웨어를 사용하여, 모든 동물들에 대해 동일한 신호 역치 설정을 사용하여 동물 1마리 당 각각의 뇌 영역의 3개 내지 5개의 이미지(오리지널 배율, x20)에서 LIMP2, GFAP 및 Bsi-B4 신호를 정량화하였다. 그런 다음, 양성 영역의 백분율, 즉 이미지에서 총 조직 영역에 걸쳐 양성 신호를 가진 영역의 픽셀을 계산하였다.
9. 투과 전자 현미경 분석
과용량의 이소플루오란(Isofluo, Labs. Esteve, Barcelona, ES)에 의해 마우스를 안락사시키고, 2.5% 글루타르알데하이드 및 2% 파라포름알데하이드 1 ml을 하대정맥을 통해 관류시켰다. 간의 측엽 및 대뇌 피질의 일부(대략 1 mm3)를 박절하고, 동일한 고정제에서 4℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 차가운 카코딜레이트(cacodylate) 완충제에서 세척한 후, 표본을 1% 오스뮴 테트록사이드에서 포스프고정(postfix)하고, 수성 우라닐 아세테이트에서 염색시킨 다음, 등급화된 에탄올 시리즈를 통해 탈수시키고, 에폭시 수지에서 포매하였다. 수지 블록으로부터의 초박 절편(600 Å 내지 800 Å)을 리드 시트레이트(lead citrate)를 사용하여 염색시키고, 투과 전자 현미경(H-7000; Hitachi, Tokyo, JP)에서 검사하였다.
10. 전사체 분석( transcriptomic analysis)
마우스 뇌의 절반(약 250 mg)을 기계적으로 균질화시키고, 총 RNA를 mirVanaTM(Ambion, Life Technologies)을 이용하여 단리하였다. cDNA를 합성하고, 후속해서 Progenika Biopharma(Spain)에 의한 GeneChip 마우스 유전자 2.1 ST 16 어레이 플레이트(Affymetrix)에서 혼성화하였으며; 검체 가공, 혼성화 및 스캐닝을 하기 Affymetrix의 권고된 프로토콜 및 장비에 따라 수행하였다. 데이터 정상화를 Affymetrix® Expression Console TM 툴을 사용하여 RMA(로우버스트 멀티어레이 평균화(Robust Multiarray averaging)) 방법에 의해 수행하여, log2 변환된 정상화된 값을 수득하였다. 데이터를 여과하여, 분석을 공지된 코딩 서열 상에서 포커싱하여, 26688개의 변경된 유전자의 초기 목록을 수득하였으며, 이를 후속해서 재여과하여, 75 백분위수 미만의 분산(variance)을 가진 유전자를 제거하였다. 이러한 공정에 의해, 6672개 유전자의 작업 목록이 생성되었다. 상이하게 발현되는 유전자에 대해, 80% 신뢰도를 가진 0.1 미만의 FDR(허위 발견율(False Discovery Rate)) 범주를 구축하였다. 클러스터링 분석을 위해, 데이터를 표준화하고, J-Express Pro 소프트웨어(jexpress.bioinfo.no)를 사용하여 히트맵(heatmap)으로서 나타낸다. 기능성 분석을 Genecodis Tool 2.0(genecodis2.dacya.ucm.es)을 사용하여 수행하였다. 어레이 데이터를 ArrayExpress 데이터베이스(http://www.ebi.ac. uk/arrayexpress/; 수납 코드: E-MTAB-2984)에 제출하였다.
11. 행동 평가
행동 변화를 오픈-필드 시험(Open-field test)을 통해 평가하였다. 동물을 불빛이 밝은 챔버(41 cm x 41 cm x 30 cm)의 하위 좌측 코너에 두었다. 공간(arena)의 표면을 3개의 동심원성 사각형(concentric square)으로 나누었다: 중심(14 cm x 14 cm), 주변(27 cm x 27 cm) 및 경계(41 cm x 41 cm). 탐험 행동 및 일반적인 활동량을 비디오-추적 시스템(Smart Junior, Panlab)을 사용하여 처음 2분 동안 기록하였다. 이러한 시험을 항상 하루 중 동일한 시간(9:00 am 내지 1:00 pm)에 수행하여, 체내 시계의 영향을 최소화하였다.
12. 통계학적 분석
모든 결과를 평균 ± SEM으로 표현한다. 통계학적 비교를 원-웨이 ANOVA를 사용하여 수행하였으며, 대조군과 치료군 사이의 다중 비교는 Dunnett's 포스트 시험을 사용하여 수행될 것이다. P가 0.05 미만이면 통계학적 유의성이 있다고 간주하였다. Kaplan-Meier 방법을 사용하여 생존율을 분석하고, 로그-랭크 시험(log-rank test)을 사용하여 비교할 것이다.
실시예
실시예 1: pAAV - CAG - hNaglu의 구축
인간 N-아세틸글루코스아미니다제, 알파 코딩 서열(CDS)을 출발 물질(NCBI 참조 서열: NM_000263)로서 이용하고, 이러한 목적을 위해 화학적으로 합성하였다(GeneArt; Life Technologies). CDS를, 각각 5' 말단 및 3' 말단에서 MluI 및 EcoRI 제한효소 부위의 측면에서 플라스미드 pMA(AmpR) 내로 클로닝하였다. N-아세틸글루코스아미니다제, 알파 CDS를 MluI/EcoRI 분해에 의해 절단한 다음, AAV 백본 플라스미드 pAAV-CAG(AmpR)의 MluI 및 EcoRI 제한효소 부위들 사이에 클로닝하였다. 생성된 플라스미드를 pAAV-CAG-hNaglu(수탁 번호 DSM 28568)로 명명하였다. 서열번호 5 및 도 19a를 참조한다.
pAAV-CAG 플라스미드를 이전에 생성하였으며, 이는 AAV2 게놈 유래의 ITR, CAG 프로모터 및 토끼 β-글로빈 유래의 polyA 신호, 뿐만 아니라 관심 CDS의 클로닝을 위한 멀티클로닝 부위를 함유하였다. CAG 프로모터는 CMV 초기/중간 인핸서 및 닭 β-액틴 프로모터로 구성된 하이브리드 프로모터이다. 이러한 프로모터는 강력한 발현을 유비쿼터스하게 유도할 수 있다. 문헌[Sawicki J et al., Exper Cell Res. 1998;244:367-369], [Huang J et al., J Gene Med. 2003;5:900-908], [Liu Y et al., Exp Mol Med. 2007; 39(2):170-175]를 참조한다.
실시예 2: AAV9 - CAG - hNaglu의 제조
벡터 AAV9-CAG-hNaglu(서열번호 9 및 도 19b)를, 변형이 된 3개의 플라스미드를 사용하여 HEK293 세포를 헬퍼 바이러스-프리 형질감염시켜서 생성하였다. 상기 문헌[Matsushita, 1998] 및 상기 문헌[Wright, 2005]를 참조한다. 세포를 10% FBS가 보충된 DMEM이 든 롤러 병(RB)(Corning, Corning, NY, US)에서 70% 포화도(confluence)까지 배양한 다음, 1) AAV2 ITR의 측면에 있는 발현 카세트를 가진 플라스미드(pAAV-CAG-hNaglu); 2) AAV2 rep 유전자 및 AAV9 cap 유전자를 가진 플라스미드(pREP2CAP9); 및 3) 아데노바이러스 헬퍼 기능을 가진 플라스미드로 공동-형질감염시켰다. 벡터를 전술한 바와 같이, 표준 프로토콜 또는 최적화된 프로토콜을 사용하여 2개의 연속적인 세슘 클로라이드 구배에 의해 정제하였다. 상기 문헌[Ayuso 2010]을 참조한다. 벡터를 PBS에 대해 투석시키고, 여과한 다음, qPCR에 의해 적정하고, 사용할 때까지 -80℃에 보관하였다.
실시예 3: pAAV - CAG - cohNaglu의 구축
인간 N-아세틸글루코스아미니다제, 알파 CDS의 최적화된 버전(cohNaglu)을 포함하는 발현 카세트를 디자인하고, 수득하였다. 서열 최적화(GeneArt®)를 수행하여, 다른 변화들 중에서도 RNA 안정성의 증가를 위한 크립틱 스플라이스 부위(cryptic splice site) 및 RNA 불안정화 서열 요소의 제거, RNA 안정화 서열 요소의 첨가, 코돈 최적화 및 G/C 함량 조정, 안정한 RNA 이차 구조의 회피를 통해 인간에서 N-아세틸글루코스아미니다제, 알파 단백질의 제조 효율을 최대화하였다. 최적화된 CDS를, 각각 5' 말단 및 3' 말단에서 MluI 및 EcoRI 제한효소 부위의 측면에서 플라스미드 pMA-RQ (AmpR)에서 클로닝하였다.
pMA-RQ-cohNaglu 플라스미드를 MluI 및 EcoRI을 이용하여 분해하여, 최적화된 N-아세틸글루코스아미니다제, 알파 CDS를 절단하였다. 후속해서, 이러한 단편을 pAAV-CAG 백본 플라스미드의 동일한 제한효소 부위들 사이에 클로닝하여, pAAV-CAG-cohNaglu 플라스미드(수탁 번호 DSM 26626)를 생성하였다. 서열번호 6 및 도 20a를 참조한다.
실시예 4: AAV9 - CAG - cohNaglu의 제조
벡터 AAV9-CAG-cohNaglu(서열번호 10 및 도 20b)를, 변형이 된 3개의 플라스미드를 사용하여 HEK293 세포를 헬퍼 바이러스-프리 형질감염시켜서 생성하였다. 상기 문헌[Matsushita, 1998] 및 상기 문헌[Wright, 2005]를 참조한다. 세포를 10% FBS가 보충된 DMEM이 든 롤러 병(RB)(Corning, Corning, NY, US)에서 70% 포화도까지 배양한 다음, 1) AAV2 ITR의 측면에 있는 발현 카세트를 가진 플라스미드(pAAV-CAG-cohNaglu); 2) AAV2 rep 유전자 및 AAV9 cap 유전자를 가진 플라스미드(pREP2CAP9); 및 3) 아데노바이러스 헬퍼 기능을 가진 플라스미드로 공동-형질감염시켰다. 벡터를 전술한 바와 같이, 표준 프로토콜 또는 최적화된 프로토콜을 사용하여 2개의 연속적인 세슘 클로라이드 구배에 의해 정제하였다. 상기 문헌[Ayuso 2010]을 참조한다. 벡터를 PBS에 대해 투석시키고, 여과한 다음, qPCR에 의해 적정하고, 사용할 때까지 -80℃에 보관하였다.
실시예 5: pAAV - CAG - cohNaglu - 버전2의 구축
인간 N-아세틸글루코스아미니다제, 알파 CDS의 제2 최적화된 버전(cohNaglu-버전2)을 포함하는 발현 카세트를 디자인하고, 수득하였다. 최적화된 CDS(DNA 2.0®)를, 각각 5' 말단 및 3' 말단에서 MluI 및 EcoRI 제한효소 부위의 측면에서 플라스미드 pJ208(AmpR)에서 클로닝하였다.
pJ208-cohNaglu-버전2 플라스미드를 MluI 및 EcoRI을 이용하여 분해하여, 최적화된 N-아세틸글루코스아미니다제, 알파-버전2 CDS를 절단하였다. 후속해서, 이러한 단편을 pAAV-CAG 백본 플라스미드의 동일한 제한효소 부위들 사이에 클로닝하여, pAAV-CAG-cohNaglu-버전2 플라스미드(수탁 번호 DSM 32042)를 생성하였다. 서열번호 20 및 도 21a를 참조한다.
실시예 6: AAV9 - CAG - cohNaglu - 버전2의 제조
벡터 AAV9-CAG-cohNaglu-버전2(서열번호 21 및 도 21b)를, 변형이 된 3개의 플라스미드를 사용하여 HEK293 세포를 헬퍼 바이러스-프리 형질감염시켜서 생성하였다. 상기 문헌[Matsushita, 1998] 및 상기 문헌[Wright, 2005]를 참조한다. 세포를 10% FBS가 보충된 DMEM이 든 롤러 병(RB)(Corning, Corning, NY, US)에서 70% 포화도까지 배양한 다음, 1) AAV2 ITR의 측면에 있는 발현 카세트를 가진 플라스미드(pAAV-CAG-cohNaglu-버전2); 2) AAV2 rep 유전자 및 AAV9 cap 유전자를 가진 플라스미드(pREP2CAP9); 및 3) 아데노바이러스 헬퍼 기능을 가진 플라스미드로 공동-형질감염시켰다. 벡터를 전술한 바와 같이, 표준 프로토콜 또는 최적화된 프로토콜을 사용하여 2개의 연속적인 세슘 클로라이드 구배에 의해 정제하였다. 상기 문헌[Ayuso 2010]을 참조한다. 벡터를 PBS에 대해 투석시키고, 여과한 다음, qPCR에 의해 적정하고, 사용할 때까지 -80℃에 보관하였다.
실시예 7: pAAV - CAG - cohNaglu - 버전3의 구축
인간 N-아세틸글루코스아미니다제, 알파 CDS의 제3 최적화된 버전(cohNaglu-버전3)을 포함하는 발현 카세트를 디자인하고, 수득하였다. 최적화된 CDS(GenScript, Inc)를, 각각 5' 말단 및 3' 말단에서 MluI 및 EcoRI 제한효소 부위의 측면에서 플라스미드 pUC57(AmpR)에서 클로닝하였다.
pUC57-cohNaglu-버전3 플라스미드를 MluI 및 EcoRI을 이용하여 분해하여, 최적화된 N-아세틸글루코스아미니다제, 알파-버전3 CDS를 절단하였다. 후속해서, 이러한 단편을 pAAV-CAG 백본 플라스미드의 동일한 제한효소 부위들 사이에 클로닝하여, pAAV-CAG-cohNaglu-버전3 플라스미드(수탁 번호 DSM 32043)를 생성하였다. 서열번호 23 및 도 22a를 참조한다.
실시예 8: AAV9 - CAG - cohNaglu - 버전3의 제조
벡터 AAV9-CAG-cohNaglu-버전3(서열번호 24 및 도 22b)을, 변형이 된 3개의 플라스미드를 사용하여 HEK293 세포를 헬퍼 바이러스-프리 형질감염시켜서 생성하였다. 상기 문헌[Matsushita, 1998] 및 상기 문헌[Wright, 2005]를 참조한다. 세포를 10% FBS가 보충된 DMEM이 든 롤러 병(RB)(Corning, Corning, NY, US)에서 70% 포화도까지 배양한 다음, 1) AAV2 ITR의 측면에 있는 발현 카세트를 가진 플라스미드(pAAV-CAG-cohNaglu-버전3); 2) AAV2 rep 유전자 및 AAV9 cap 유전자를 가진 플라스미드(pREP2CAP9); 및 3) 아데노바이러스 헬퍼 기능을 가진 플라스미드로 공동-형질감염시켰다. 벡터를 전술한 바와 같이, 표준 프로토콜 또는 최적화된 프로토콜을 사용하여 2개의 연속적인 세슘 클로라이드 구배에 의해 정제하였다. 상기 문헌[Ayuso 2010]을 참조한다. 벡터를 PBS에 대해 투석시키고, 여과한 다음, qPCR에 의해 적정하고, 사용할 때까지 -80℃에 보관하였다.
실시예 9: pAAV - CAG - comNaglu의 구축
뮤린 N-아세틸글루코스아미니다제, 알파에 대한 CDS(NCBI 참조 서열: NM_013792)를 서열 최적화(GeneArt; Life Technologies)시켰다. 최적화된 CDS를, 각각 5' 말단 및 3' 말단에서 MluI 및 EcoRI 제한효소 부위의 측면에서 플라스미드 pMA-RQ(AmpR) 내에 클로닝하였다.
MluI/EcoRI 최적화된 뮤린 N-아세틸글루코스아미니다제, 알파 CDS 단편을 pMA-RQ 플라스미드로부터 절단하고, 후속해서, 이를 AAV 백본 플라스미드 pAAV-CAG의 MluI 및 EcoRI 제한효소 부위들 사이에 클로닝하였다. 생성된 플라스미드를 pAAV-CAG-comNaglu로 명명하였다. 서열번호 7 및 도 23a를 참조한다.
실시예 10: AAV9 - CAG - comNaglu의 제조
벡터 AAV9-CAG-comNaglu(서열번호 11 및 도 23b)를, 변형이 된 3개의 플라스미드를 사용하여 HEK293 세포를 헬퍼 바이러스-프리 형질감염시켜서 생성하였다. 상기 문헌[Matsushita, 1998] 및 상기 문헌[Wright, 2005]를 참조한다. 세포를 10% FBS가 보충된 DMEM이 든 롤러 병(RB)(Corning, Corning, NY, US)에서 70% 포화도까지 배양한 다음, 1) AAV2 ITR의 측면에 있는 발현 카세트를 가진 플라스미드(pAAV-CAG-comNaglu); 2) AAV2 rep 유전자 및 AAV9 cap 유전자를 가진 플라스미드(pREP2CAP9); 및 3) 아데노바이러스 헬퍼 기능을 가진 플라스미드로 공동-형질감염시켰다. 벡터를 전술한 바와 같이, 표준 프로토콜 또는 최적화된 프로토콜을 사용하여 2개의 연속적인 세슘 클로라이드 구배에 의해 정제하였다. 상기 문헌[Ayuso 2010]을 참조한다. 벡터를 PBS에 대해 투석시키고, 여과한 다음, qPCR에 의해 적정하고, 사용할 때까지 -80℃에 보관하였다.
실시예 11: pAAV - CAG - cocNaglu의 구축
캐닌 N-아세틸글루코스아미니다제, 알파에 대한 CDS(NCBI 참조 서열: XM_548088.4)를 서열 최적화(GeneArt; Life Technologies)시켰다. 최적화된 CDS를, 각각 5' 말단 및 3' 말단에서 MluI 및 EcoRI 제한효소 부위의 측면에서 플라스미드 pMA-RQ(AmpR) 내에 클로닝하였다.
MluI/EcoRI 최적화된 캐닌 N-아세틸글루코스아미니다제, 알파 CDS 단편을 pMA-RQ 플라스미드로부터 절단하고, 후속해서, 이를 AAV 백본 플라스미드 pAAV-CAG의 MluI 및 EcoRI 제한효소 부위들 사이에 클로닝하였다. 생성된 플라스미드를 pAAV-CAG-cocNaglu로 명명하였다. 서열번호 8 및 도 24a를 참조한다.
실시예 12: AAV9 - CAG - cocNaglu의 제조
벡터 AAV9-CAG-cocNaglu(서열번호 12 및 도 24b)를, 변형이 된 3개의 플라스미드를 사용하여 HEK293 세포를 헬퍼 바이러스-프리 형질감염시켜서 생성하였다. 상기 문헌[Matsushita, 1998] 및 상기 문헌[Wright, 2005]를 참조한다. 세포를 10% FBS가 보충된 DMEM이 든 롤러 병(RB)(Corning, Corning, NY, US)에서 70% 포화도까지 배양한 다음, 1) AAV2 ITR의 측면에 있는 발현 카세트를 가진 플라스미드(pAAV-CAG-cocNaglu); 2) AAV2 rep 유전자 및 AAV9 cap 유전자를 가진 플라스미드(pREP2CAP9); 및 3) 아데노바이러스 헬퍼 기능을 가진 플라스미드로 공동-형질감염시켰다. 벡터를 전술한 바와 같이, 표준 프로토콜 또는 최적화된 프로토콜을 사용하여 2개의 연속적인 세슘 클로라이드 구배에 의해 정제하였다. 상기 문헌[Ayuso 2010]을 참조한다. 벡터를 PBS에 대해 투석시키고, 여과한 다음, qPCR에 의해 적정하고, 사용할 때까지 -80℃에 보관하였다.
실시예 13: 플라스미드 pAAV9 - CAG - hNaglu의 유체 역학적 전달
야생형 인간 N-아세틸글루코스아미니다제, 알파를 발현하는 카세트를 함유하는 플라스미드 pAAV9 - CAG - hNaglu 총 50 ㎍ 용량을 2-월령의 MPSIIIB 마우스에게 유체 역학적 꼬리 정맥(HDTV) 주사를 통해 투여하였다. 이러한 기술은 간에 전달된 플라스미드의 발현을 표적으로 한다. 문헌[Liu et al., Gene Ther. 1990;6(7):1258-66]을 참조한다.
플라스미드 전달 후 1주일째에, 치료전 수준을 능가하는 N-아세틸글루코스아미니다제, 알파 활성의 상당한 증가가 야생형 인간 N-아세틸글루코스아미니다제, 알파-코딩 플라스미드를 투여한 모든 동물의 간 및 혈청에서 문서화되었다. 도 1a 및 도 1b를 참조한다. 식염수 용액을 주사한 MPSIIIB 동물에서는 어떠한 활성도 검출되지 않았다. 표적화된 동물의 간 및 혈청에서 관찰된 N-아세틸글루코스아미니다제, 알파 활성의 수준은 각각, WT 동물의 간 및 혈청에서 측정되었으며 100%로 설정한 활성의 평균값의 150% 및 1700%에 상응하였다. 도 1a 및 도 1b를 참조한다.
실시예 14: AAV9 - CAG - hNaglu의 정맥내 전달
AAV9-CAG-hNaglu 벡터의 총 5x1011 용량의 벡터 게놈을 2-월령의 MPSIIIB 마우스에게 꼬리 정맥 주사를 통해 투여하였다.
간에 대한 AAV9 벡터의 높은 향성과 일치하여, 투여 후 2개월째에, 치료받은 동물은 이러한 기관에서 높은 수준의 N-아세틸글루코스아미니다제, 알파 활성(건강한 동물에서 관찰된 활성 수준의 700%)을 보여주었으며, 이는 비-치료 MPSIIIB 마우스의 체성 조직에서 관찰된 GAG의 병리학적 축적을 완전히 없애거나 상당히 감소시켰다. 도 2a 내지 도 2c를 참조한다. 또한, 혈청형 9의 AAV 벡터가 전신 투여 시 뇌에 형질도입되는 효율이 높으면, 치료받은 동물은 분석된 모든 뇌 영역들에서 유의미한 수준의 N-아세틸글루코스아미니다제, 알파 활성(건강한 마우스의 20% 내지 30%)을 보여주었다. 도 3a를 참조한다. N-아세틸글루코스아미니다제, 알파 활성의 이러한 부분적인 복구는 뇌의 모든 영역들로부터 GAG 저장을 제거하기에 충분하였다. 도 3b를 참조한다.
실시예 15: AAV9 - CAG - cohNaglu의 정맥내 전달
AAV9-CAG-cohNaglu 벡터의 총 5x1011 용량의 벡터 게놈을 2-월령의 MPSIIIB 마우스에게 꼬리 정맥 주사를 통해 투여하였다.
투여 후 2개월째에, 치료받은 동물은 간에서 높은 수준의 N-아세틸글루코스아미니다제, 알파 활성(건강한 동물의 수준의 600%)을 보여주었으며, 혈청에서 중간 정도 증가한 활성 수준(건강한 동물의 수준의 7%)을 보여주었다. 도 4a 및 도 4b를 참조한다. N-아세틸글루코스아미니다제, 알파 제조는 비-치료 MPSIIIB 마우스의 체성 조직에서 관찰된 GAG의 병리학적 축적을 완전히 없애거나 상당히 감소시켰다. 도 4c를 참조한다. 또한, 치료받은 동물은 분석된 모든 뇌 영역들에서 유의미한 수준의 N-아세틸글루코스아미니다제, 알파 활성(건강한 마우스의 18% 내지 27%)을 보여주었다. 도 5a를 참조한다. N-아세틸글루코스아미니다제, 알파 활성의 이러한 부분적인 복구는 뇌의 모든 영역들로부터 GAG 저장을 제거하기에 충분하였다. 도 5b를 참조한다.
실시예 16: AAV9 - CAG - hNaglu의 수조내 전달
AAV9-CAG-hNaglu 벡터의 총 9.3x109 용량의 벡터 게놈을 2-월령의 MPSIIIB 동물의 거대 수조에 총 5 ㎕ 부피로 주사하였다.
AAV9-CAG-hNaglu 벡터의 CSF내 투여는 분석한 모든 뇌 영역들에서 N-아세틸글루코스아미니다제, 알파의 활성의 수준을 증가시켰으며(건강한 마우스의 50% 내지 100%); 뇌의 가장 앞쪽에 위치한 부분에서 활성은 건강한 동물에서 관찰된 수준에 도달하였다. 도 6a를 참조한다. GAG의 과도한 저장은 치료된 MPSIIIB 마우스의 뇌에서 완전히 없어졌다. 도 6b를 참조한다. CSF에 전달되었을 때, 혈청형 9의 AAV 벡터는 혈류 내로 누출되고, 간에 형질도입된다. 문헌[Haurigot et al., J Clin Invest 2013;123(8):3254-71]을 참조한다. 이와 일치하여, N-아세틸글루코스아미니다제, 알파의 활성은 치료된 MPSIIIB 마우스의 간에서 건강한 동물의 32%의 수준으로 검출되었다. 도 7a를 참조한다. 이는 간, 비장, 심장, 폐, 고환 및 방광에서 GAG 축적의 정정을 매개하였으며, 또한 신장에서 GAG 저장을 상당히 감소시켰다. 도 7b를 참조한다.
실시예 17: AAV9 - CAG - cohNaglu의 수조내 전달
AAV9-CAG-cohNaglu 벡터의 총 9.3x109 용량의 벡터 게놈을 2-월령의 MPSIIIB 동물의 거대 수조에 총 5 ㎕ 부피로 주사하였다.
AAV9-CAG-cohNaglu 벡터의 수조내 투여는 분석한 모든 뇌 영역들에서 N-아세틸글루코스아미니다제, 알파의 활성의 수준을 상당히 증가시켰으며, 이는 건강한 마우스의 값의 22% 내지 45%의 범위였다. 도 8a를 참조한다. 이에, GAG의 병리학적 축적은 치료받은 MPSIIIB 마우스의 모든 뇌 영역들에서 완전히 역전되었다. 도 8b를 참조한다. N-아세틸글루코스아미니다제, 알파의 활성은 또한, 치료받은 MPSIIIB 마우스의 간에서 건강한 동물의 25%까지 증가되었다. 도 9a를 참조한다. N-아세틸글루코스아미니다제, 알파의 활성의 이러한 증가는 간, 심장, 폐 및 방광에서 GAG 축적의 정정을 매개하였으며, 또한 비장, 고환 및 신장에서 GAG 저장을 상당히 감소시켰다. 도 9b를 참조한다.
실시예 18: 플라스미드 pAAV9 - CAG - cohNaglu - 버전2의 유체 역학적 전달
인간 N-아세틸글루코스아미니다제, 알파의 최적화된 버전(버전2)을 함유하는 발현 카세트를 가진 플라스미드 pAAV9 - CAG - cohNaglu - 버전2 총 50 ㎍ 용량을 2-월령의 MPSIIIB 마우스에게 유체 역학적 꼬리 정맥 주사를 통해 투여하였다. 전술한 바와 같이, 이러한 기술은 간에 전달된 플라스미드의 발현을 표적으로 한다. 상기 문헌[Liu et al.]을 참조한다.
플라스미드 전달 후 1주일째에, N-아세틸글루코스아미니다제, 알파의 활성이, N-아세틸글루코스아미니다제, 알파-코딩 서열의 최적화된 버전2를 함유하는 플라스미드의 유체 역학적 주사를 받은 모든 동물의 간 및 혈청에서 처리전 수준을 능가하여 증가하였다. 도 10a 및 도 10b를 참조한다. 식염수 용액을 주사한 MPSIIIB 동물에서는 어떠한 활성도 검출되지 않았다. 치료받은 동물에서, 간 및 혈청 N-아세틸글루코스아미니다제, 알파의 활성은 각각, WT 동물에서 관찰된 활성의 평균값(100%로 설정됨)의 150% 및 1500%인 수준에 도달하였다. 도 10a 및 도 10b를 참조한다.
실시예 19: 플라스미드 pAAV9 - CAG - cohNaglu - 버전3의 유체 역학적 전달
인간 N-아세틸글루코스아미니다제, 알파의 최적화된 버전(버전3)을 함유하는 발현 카세트를 가진 플라스미드 pAAV9 - CAG - cohNaglu - 버전3 총 50 ㎍ 용량을 2-월령의 MPSIIIB 마우스에게 유체 역학적 꼬리 정맥 주사를 통해 투여하였다. 전술한 바와 같이, 이러한 기술은 간에 전달된 플라스미드의 발현을 표적으로 한다. 상기 문헌[Liu et al.]을 참조한다.
플라스미드 전달 후 1주일째에, 치료전 수준을 능가하는 N-아세틸글루코스아미니다제, 알파 활성의 상당한 증가가, 코돈-최적화된 인간 N-아세틸글루코스아미니다제, 알파-코딩 서열의 버전3을 함유하느 발현 카세트를 가진 플라스미들 투여한 모든 동물의 간 및 혈청에서 문서화되었다. 도 11a 및 도 11b를 참조한다. 식염수 용액을 주사한 MPSIIIB 동물에서는 어떠한 활성도 검출되지 않았다. 치료받은 동물의 간 및 혈청에서 관찰된 N-아세틸글루코스아미니다제, 알파 활성의 수준은 각각, WT 동물의 간 및 혈청에서 측정되었으며 100%로 설정한 활성의 평균값의 170% 및 1100%에 상응하였다. 도 11a 및 도 11b를 참조한다.
실시예 20: AAV9 - CAG - comNaglu의 수조내 전달
AAV9-CAG-comNaglu 벡터의 총 3x1010 용량의 벡터 게놈을 2-월령의 MPSIIIB 동물의 거대 수조에 총 10 ㎕ 부피로 주사하였다.
AAV9 벡터 게놈은 분석한 모든 뇌 영역들뿐만 아니라 척수에서도 검출될 수 있었다. 주변 조직에서, 벡터 게놈은 간에서만 상당한 유전자 복사수로 검출될 수 있었으며, 머리에서 빠져나가는(drain) 림프절(하악 림프절(mandibular lymph node))에서는 낮은 유전자 복사수로 검출될 수 있었다. 도 12a 내지 도 12b를 참조한다.
AAV9-CAG-comNaglu 벡터의 CSF내 투여는 분석한 모든 뇌 영역들에서 N-아세틸글루코스아미니다제, 알파의 활성의 수준을 매우 높게 증가시켰으며; 이러한 수준은 모든 영역들에서, 건강한 동물에서 관찰된 것보다 몇배 더 높았다. 도 13a를 참조한다. 벡터 전달 후 3개월째에, 해당 질환의 리소좀 병리학적 특징은 치료받은 MPSIIIB 마우스의 뇌에서 완전히 역전되었으며, 이는 분석한 모든 뇌 영역들에서 리소좀 마커 LIMP-2+에 대한 신호 강도 및 GAG 축적의 정상화에 의해 나타났다. 도 13b 및 도 14a를 참조한다. 투과 전자 현미경에 의한 후두 피질 및 소뇌의 초미세구조 분석에 의해 리소좀 병증의 감소를 확인하였으며, 이는 대조군 벡터를 제공받은 MPSIIIB 동물에서 넓어지고 충전된 큰 저장 소낭을 보인 피질의 뉴런주위 신경교세포에서 매우 명백하였으며, 한편, 이들은 AAV9-CAG-comNaglu로 치료받은 동물에서는 정상적인 외양을 가졌다. 도 14b를 참조한다. LSD에서, 유전적 돌연변이에 의해 직접 영향을 받은 것과는 별도로 몇몇 리소좀 효소의 활성은 정상적인 리소좀 항상성의 작은 변화(perturbation) 이후에 변경될 수 있다. 문헌[Sardiello et al., Science. 2009;325:473-477]을 참조한다. 5-월령의 비-치료 또는 Null-치료받은 수컷 MPSIIIB 마우스의 뇌에서, 이두로네이트 2-설파타제(IDS), N-설포글루코스아민 설포하이드롤라제(SGSH), β-글루쿠로니다제(GUSB) 및 β-헥소스아미니다제(HEXB)는 상당히 증가되었다. 도 14c를 참조한다. AAV9-CAG-comNaglu 벡터의 CSF내 전달 후 3개월째에 관찰된 GAG 저장의 감소와 일치하여, 뇌 SGSH, GUSB 및 HEXB의 활성은 치료받은 동물에서 건강한 야생형의 수준까지 되돌아갔다. 도 14c를 참조한다.
리소좀 병증의 정정과 일치하여, 염증의 모든 징후들은 치료받은 MPSIIIB 마우스의 뇌에서 사라졌다. 성상세포증(astrocytosis)을 검출하는 데 사용되는 염색(GFAP) 및 미세아교세포증(microgliosis)을 검출하는 데 사용되는 염색(BSI-B4)에 대한 신호 강도는 치료받은 MPSIIIB 마우스 및 건강한 동물에서 유사하였으며, 이는, 이들 신경염증 마커의 명백한 상향조절을 보인 비-치료 MPSIIIB 마우스에서 문서화된 신호와는 대조적이었다. CNS 염증에 미치는 CSF내 AAV9-CAG-comNaglu 유전자 치료법의 효능을 추가로 평가하기 위해, WT 및 AAV9-CAG-comNaglu 또는 AAV9-Null-치료받은 MPSIIIB 뇌수(encephalon)로부터 단리된 총 RNA 상에서 Affimetrix® 마이크로어레이 플랫폼을 사용하는 유전자 발현 프로파일링 연구를 수행하였다. 데이터 처리 및 여과 후, 3개의 그룹들에서 94개의 유전자가 상이하게 발현된 것으로 발견되었다. 유전자 온톨로지(GO) 농화 분석을 사용하여, 상이하게 발현된 유전자를 생물학적 공정에 의해 분류하였을 때, 94개의 유전자 중 67개의 유전자가 상응하는 온톨로지에 따라 주석이 달렸다(annotated). 도 15c를 참조한다. 이들 중에서, 대부분은, 이들 공정에 관여한 세포로 인한 것일 수 있는 염증 및 선천성 면역 또는 기능과 연관있었다. 도 15c를 참조한다. 이러한 관찰을 확인하기 위해, 본 바명자들은 세포 유형 농화(CETN) 분석을 사용하여, 전사체 수준에서의 관찰된 변화에 대한 상이한 세포 유형들의 기여도를 평가하였다. 이러한 소프트웨어는, 소프트웨어-정의된 스코어가 2 초과인 경우 특정 세포 유형의 농화가 존재한다고 간주한다. 본 발명자들의 데이터 세트에 대한 최고의 스코어는 미세아교세포(스코어 = 60)에서 수득되었으며, 이러한 결과는 신경퇴행성 질환 및 MPSIII에서 미세아교세포로 인한 중요한 역할과 일치하였다. 문헌[Ohmi et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2003;100:1902-1907], [McGeer et al. Alzheimer Dis Assoc Disord. 1998;12 (Suppl. 2):S1-E16], [Derecki et al., Nature. 2012;484: 105-109], [DiRosario et al., J Neurosci Res. 2009;87:978-990], [Archer, et al., J Inherit Metab Dis. 2014;37:1-12]를 참조한다. AAV9-CAG-comNaglu 벡터의 CSF내 전달의 효과를 평가하였을 때, AAV9-Null-주사된 동물에 대한 유전자 발현 프로파일의 놀랄만한 변화가 관찰되었다. 벡터 투여 후 3개월째에, 치료받은 MPSIIIB 마우스에서 대부분의 유전자들은 건강한 한배새끼와 유사한 전사체 수준을 가졌다. 비-치료 MPSIIIB 마우스에서 상이하게 발현된 유전자들 중 약 90%는 AAV9-CAG-comNaglu 치료 후 전사체 수준의 정정을 적어도 50%로 보여주었으며, 이들 중 60%에서 정정률은 75%였다. CTEN 소프트웨어가 미세아교세포에 지정한 유전자 세트를 개별적으로 분석하였을 때, 전사체 수준에서 유사하거나 약간 더 높은 정상화도(degree of normalization)가 관찰되었다. 도 15d를 참조한다. 이러한 관찰은, 미세아교세포가 MPSIIIB에서 관찰된 유전자 발현의 프로파일에 상당히 관여하며 치료받은 동물에서 문서화된 미세아교세포증의 완전한 역전과 일치한다는 생각을 지지한다.
CSF에 투여된 AAV9 벡터는 주변으로 누출되고, 간에 형질도입된다. 도 9 및 상기 문헌[Haurigot et al.]을 참조한다. 이에, N-아세틸글루코스아미니다제, 알파의 활성 증가는 AAV9-CAG-comNaglu로 치료받은 MPSIIIB 마우스의 간 및 혈청에서 문서화되었으며, 이는 건강한 동물에서 관찰된 수준의 대략 80%의 수준까지 도달하였다. 도 16a 및 도 16b를 참조한다. 혈청 내 효소적 활성의 수준은 치료받은 마우스의 간에서의 활성과 양호한 상관관계에 있었으며, 이는, 간이 순환 효소의 주요 공급원이었음을 제시한다. 치료법의 체성 효능을 상이한 기관들에서 GAG 함량의 정량화를 통해 평가하였을 때, 전체 정상화(full normalization)는 신장을 제외한 간, 비장, 심장 및 폐를 비롯한 대부분의 조직들에서 관찰되었으며, 여기서, GAG의 감소가 50% 초과로 관찰되었다. 도 16c를 참조한다. 상이한 실험 그룹들에서 간의 초미세구조 분석은, AAV9-CAG-comNaglu로 치료받은 MPSIIIB 마우스의 간세포로부터 MPSIIIB 질환의 특징인 저장 액포가 완전히 사라졌음을 보여주었다. 도 16d를 참조한다. CNS에서 관찰된 바와 같이, 리소좀 구획으로부터 저장 물질의 제거는 다른 리소좀 효소의 활성을 복구시켰다. 비-치료 또는 Null-치료받은 MPSIIIB 마우스의 간에서, α-이두로니다제(IDUA), 이두로네이트 2-설파타제(IDS), SGSH, GUSB 및 HEXB의 활성이 변경되었다. 도 16e를 참조한다. AAV9-매개 NAGLU 유전자 트랜스퍼 후 3개월째에, 이들 모든 효소의 활성은 정상 수준으로 되돌아갔으며, 이는, AAV9-CAG-comNaglu를 통한 NAGLU의 CSF 유전자 트랜스퍼가 주변 기관들에서도 질환 표현형을 역전시킬 수 있다는 개념을 더 지지한다. 도 16e를 참조한다.
AAV9-CAG-comNaglu의 CSF내 투여가 행동에 미치는 영향을 오픈 필드 시험을 이용하여 평가하였으며, 이는 알려지지 않은 환경에서 마우스의 일반적인 보행성 활동량 및 탐험적 활동량을 평가한다. 비-치료 및 AAV9-null-치료받은 MPSIIIB 마우스는 센터에 들어가기까지의 잠복기(latency to enter the centre), 보더에서 소요된 시간, 센터까지의 투입 수, 휴지 시간, 총 이동 거리 및 교차한 라인의 수의 측면에서, 건강한 마우스와 비교하여 탐험적 활동량의 감소를 나타내었다. AAV9-CAG-comNaglu의 수조내 투여는 행동 결핍(behavioural deficit)을 완전히 정정하였다. 도 17a 내지 도 17f를 참조한다.
더욱이, AAV9-CAG-comNaglu를 사용한 치료는 MPSIIIB 마우스의 수명을 상당히 연장하였다. 15월령까지, 모든 비-치료 MPSIIIB 마우스들을 식이요법시켰으며, 한편, 수조내 AAV9-CAG-comNaglu를 제공받은 동물들의 100%는 18월령에서도 여전히 생존하였다. 도 17g를 참조한다. 치료받은 MPSIIIB 수컷은 AAV9-null MPSIIIB 수컷에서의 13.8개월이라는 중앙 생존율과 비교하여 21개월이라는 중앙 생존율을 보여주었다; P=0.0007. 건강한 수컷에 대한 중앙 생존율은 26.6개월이었다. 치료받은 MPSIIIB 마우스의 행동 반응의 정상화 및 보다 큰 생존율은 AAV9-CAG-comNaglu의 치료 효능을 더 나타낸다.
실시예 21: 개에의 AAV9 - CAG - cocNaglu의 수조내 전달
유전자 치료 접근법의 임상적 적용을 위한 제1 단계는 대형 동물 모델에서의 이의 실행가능성에 대한 언급을 필요로 한다. 본 발명자들은 이전에, 뇌 크기가 인간과 보다 유사한 동물 모델인 비글 견에게 AAV9 벡터를 뇌척수액내 투여할 때 AAV9 벡터의 분포가 동일한 경로를 통해 동등한 용랴의 벡터를 제공받은 마우스에서 관찰된 것과 매우 유사하다고 언급하였다. 상기 문헌[Haurigot et al.]을 참조한다. 간략하게는, 수용체 단백질 GFP를 인코딩하는 AAV9 벡터를 2x1013 vg 투여하면, 뇌, 소뇌, 뇌척수막, 척수 및 배근신경절에서 세포의 광범위한 형질도입이 나타났다. 마우스에서의 관찰과 유사하게, GFP는 비글 견의 간에서도 검출되었으며, 이때, 평균 3.7%의 간세포에서 형질도입되었다. 상기 문헌[Haurigot et al.]을 참조한다. 중요하게는, 리소좀 효소 설파미다제의 결핍은 MPSIIIA를 유발하므로 이를 인코딩하는 AAV9 벡터의 CSF내 투여는, 치료받은 개의 CSF에서 효소의 수준을 유지시켰다. CSF는 CNS를 유동하며, 이는 효소를 상이한 CNS 구조물들에서 이용할 수 있게 한다. 사실상, CSF에의 재조합 효소의 주기적인 전달은 현재 MPSIIIA에 대한 임상 연구 하의 치료적 전략이다. NCT01155778 및 NCT01299727, clinicaltrials.gov를 참조한다.
동일한 접근법을 사용하여, 본 발명에 따른 AAV 9 벡터의 잠재적인 효능을 예시하였다.
총 6.5x1012 vg 용량의 AAV9-CAG-cocNaglu 벡터를 4마리의 비글 성견(개 1 내지 개 4)의 거대 수조에 투여하였다. 치료에 의해 달성될 수 있는 N-아세틸글루코스아미니다제, 알파 활성의 CSF 수준에 미치는 기존의 면역의 영향을 평가하기 위해, 이들 개 중 2마리(개 3 및 개 4)는 CSF 전달 전 6주째에, 비-코딩 AAV9-null 벡터 1x1011 vg/kg을 전신 투여하여 면역화하였다. 벡터의 수조내 투여가 수행되었을 때까지, 네이브 개들은 순환(circulation) 및 CSF에서 항-AAV9 중화 항체(NAb)를 낮은 타이터로 가졌으며, 이는 이전에 야생형 바이러스 또는 재조합 바이러스에 노출되지 않은 동물에 대해 기대될 것이다. 이와는 대조적으로, 예비-면역화된 개들은 순환에서는 높은 NAb 타이터를 가졌으나, CSF에서는 낮은 수준의 NAb 타이터를 가졌으며, 이러한 관찰은 뇌혈관장벽을 가로지르는 NAb의 비대칭적인 분포와 유사하다. 도 18a 및 상기 문헌[Haurigot et al.]을 참조한다. AAV9-CAG-cocNaglu 벡터를 거대 수조에 투여하면, 4마리의 모든 개들로부터 수득한 CSF 검체에서 관찰된 효소 활성의 상당한 증가를 초래하였으며, 기존의 면역의 존재 또는 부재와 관련해서는 유의미한 차이가 없었다. 도 18b를 참조한다. 효소의 활성 수준은 제2주와 제3주 사이에 피크에 도달하였으며, 이후에는 정상 상태(steady state)의 수준에 도달하였다. 중요하게는, CSF에서의 N-아세틸글루코스아미니다제, 알파의 활성의 이러한 증가는 오래 지속되었다(4개월 초과). 도 18b를 참조한다.
독일생물자원센터 DSM26626 20121113 독일생물자원센터 DSM28568 20140313 독일생물자원센터 DSM32042 20150429 독일생물자원센터 DSM32043 20150429
SEQUENCE LISTING <110> Laboratorios del Dr. ESTEVE S.A. <120> ADENOASSOCIATED VIRUS VECTORS FOR THE TREATMENT OF LYSOSOMAL STORAGE DISORDERS <130> PCT2212.5 <150> EP14382171 <151> 2014-05-14 <160> 24 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 743 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Glu Ala Val Ala Val Ala Ala Ala Val Gly Val Leu Leu Leu Ala 1 5 10 15 Gly Ala Gly Gly Ala Ala Gly Asp Glu Ala Arg Glu Ala Ala Ala Val 20 25 30 Arg Ala Leu Val Ala Arg Leu Leu Gly Pro Gly Pro Ala Ala Asp Phe 35 40 45 Ser Val Ser Val Glu Arg Ala Leu Ala Ala Lys Pro Gly Leu Asp Thr 50 55 60 Tyr Ser Leu Gly Gly Gly Gly Ala Ala Arg Val Arg Val Arg Gly Ser 65 70 75 80 Thr Gly Val Ala Ala Ala Ala Gly Leu His Arg Tyr Leu Arg Asp Phe 85 90 95 Cys Gly Cys His Val Ala Trp Ser Gly Ser Gln Leu Arg Leu Pro Arg 100 105 110 Pro Leu Pro Ala Val Pro Gly Glu Leu Thr Glu Ala Thr Pro Asn Arg 115 120 125 Tyr Arg Tyr Tyr Gln Asn Val Cys Thr Gln Ser Tyr Ser Phe Val Trp 130 135 140 Trp Asp Trp Ala Arg Trp Glu Arg Glu Ile Asp Trp 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Forward primer for quantification <400> 16 gccgaggccc agttctac 18 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for quantification <400> 17 ttggcgtagt ccaggatgtt g 21 <210> 18 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for quantification <400> 18 agcagaacag cagataccag atcaccc 27 <210> 19 <211> 2244 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cohNaglu-version2 CDS sequence <400> 19 cgcgtgccac catggaagca gtcgccgtcg ccgcagcagt gggtgtcctc ctcctcgccg 60 gtgctggagg tgccgccggg gacgaggccc gcgaggccgc agctgtgcgg gcccttgtgg 120 cccggcttct cggaccgggc cctgccgccg acttcagcgt gtcagtggaa cgcgcactgg 180 ctgcgaagcc tgggctcgat acttactccc tgggcggggg tggtgccgcc agagtgcggg 240 tccggggaag caccggggtg gccgccgcgg ccggcctgca ccggtacctt cgggactttt 300 gcggctgtca tgtcgcttgg tccggatccc agctgcgcct cccccgaccg ctgcccgccg 360 tgcctggaga gctgaccgag gccactccga accggtacag atactatcag aacgtgtgca 420 ctcagtccta ctccttcgtg tggtgggact gggccagatg ggagcgggag attgactgga 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tattctttcg tctggtggga ctgggctcga tgggagcgcg aaatcgattg 2400 gatggcactg aacggaatta atctggcact ggcatggagc ggacaggagg caatctggca 2460 gagagtgtac ctggcactgg gactgactca ggccgagatt aacgagttct tcaccgggcc 2520 agcttttctg gcatggggac ggatggggaa tctgcacaca tgggacggac cactgccacc 2580 ttcttggcac atcaagcagc tgtatctgca gcatagggtg ctggatcaga tgagaagttt 2640 tggcatgact ccagtgctgc ccgctttcgc aggacacgtc cctgaggccg tgaccagggt 2700 gttcccacag gtgaacgtca ctaagatggg cagctgggga cattttaatt gcagttactc 2760 atgtagcttc ctgctggccc ctgaagaccc aatttttccc atcattggca gcctgttcct 2820 gcgggagctg atcaaagaat ttggaaccga ccacatctac ggggccgata cattcaacga 2880 gatgcagcca cccagctccg aaccttccta cctggccgct gcaaccacag cagtgtatga 2940 ggccatgacc gctgtggaca cagaagccgt ctggctgctg caggggtggc tgtttcagca 3000 tcagccacag ttctggggac ctgcacagat ccgagctgtg ctgggagcag tcccacgagg 3060 aaggctgctg gtgctggatc tgtttgccga gtcccagccc gtctacacta ggaccgcttc 3120 tttccagggc cagcctttta tttggtgtat gctgcacaac tttggaggga atcatgggct 3180 gttcggagca ctggaggcag tgaacggagg accagaagca gctagactgt ttcctaattc 3240 tactatggtg ggcaccggaa tggctcccga gggcatctca cagaatgaag tggtctacag 3300 cctgatggca gagctgggat ggcgaaagga cccagtgcct gatctggcag cctgggtcac 3360 tagtttcgct gcaaggagat acggggtgtc acaccctgac gctggagcag cttggcgact 3420 gctgctgagg tctgtgtata actgcagtgg ggaggcctgt agaggccata atcgatcccc 3480 actggtgcgg cgaccatcac tgcagatgaa caccagcatt tggtacaatc gatccgatgt 3540 gtttgaagct tggaggctgc tgctgacaag tgccccttca ctggctactt ctccagcatt 3600 cagatatgac ctgctggatc tgacacggca ggcagtgcag gagctggtca gcctgtacta 3660 tgaggaagct cgcagcgcat acctgtccaa agaactggca tccctgctga gggcaggagg 3720 agtgctggct tatgagctgc tgccagctct ggacgaagtc ctggcatccg attctcgctt 3780 tctgctggga agctggctgg agcaggcccg agcagccgct gtgtccgagg ccgaagctga 3840 cttctacgag cagaactcta ggtatcagct gactctgtgg ggacccgaag ggaacatcct 3900 ggattacgcc aataagcagc tggccggact ggtggctaat tactataccc ctagatggcg 3960 gctgttcctg gaggcactgg tggacagcgt cgctcagggg attccattcc agcagcacca 4020 gtttgataag aacgtgttcc agctggaaca ggcctttgtc ctgtctaaac agcggtaccc 4080 tagtcagcca cgcggggaca cagtggatct ggctaagaaa atcttcctga aatactatcc 4140 tagatgggtc gccggcagct ggtgagaatt cgagctcggt acccgggaat caattcactc 4200 ctcaggtgca ggctgcctat cagaaggtgg tggctggtgt ggccaatgcc ctggctcaca 4260 aataccactg agatcttttt ccctctgcca aaaattatgg ggacatcatg aagccccttg 4320 agcatctgac ttctggctaa taaaggaaat ttattttcat tgcaatagtg tgttggaatt 4380 ttttgtgtct ctcactcgga aggacatatg ggagggcaaa tcatttaaaa catcagaatg 4440 agtatttggt ttagagtttg gcaacatatg cccatatgct ggctgccatg aacaaaggtt 4500 ggctataaag aggtcatcag tatatgaaac agccccctgc tgtccattcc ttattccata 4560 gaaaagcctt gacttgaggt tagatttttt ttatattttg ttttgtgtta tttttttctt 4620 taacatccct aaaattttcc ttacatgttt tactagccag atttttcctc ctctcctgac 4680 tactcccagt catagctgtc cctcttctct tatggagatc cctcgacctg cagcccaagc 4740 tgtagataag tagcatggcg ggttaatcat taactacaag gaacccctag tgatggagtt 4800 ggccactccc tctctgcgcg ctcgctcgct cactgaggcc gcccgggctt tgcccgggcg 4860 gcctcagtga gcgagcgagc gcgcag 4886

Claims (19)

  1. 서열번호 1의 알파-N-아세틸글루코스아미니다제를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 연결된, 서열번호 4의 CAG 프로모터를 함유하는 재조합 AAV9 벡터로서,
    상기 서열번호 1의 알파-N-아세틸글루코스아미니다제를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 3, 서열번호 19 또는 서열번호 22의 서열인, 재조합 AAV9 벡터.
  2. 서열번호 1의 알파-N-아세틸글루코스아미니다제를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 연결된, 서열번호 4의 CAG 프로모터를 함유하는 플라스미드로서,
    상기 플라스미드는, (i) 서열번호 1의 알파-N-아세틸글루코스아미니다제를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열인 서열번호 3의 서열을 포함하는, 수탁번호 DSM26626로 기탁된 pAAV-CAG-cohNaglu;
    (ii) 서열번호 1의 알파-N-아세틸글루코스아미니다제를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열인 서열번호 19의 서열을 포함하는, 수탁번호 DSM32042로 기탁된 pAAV-CAG-cohNaglu-version2; 또는
    (iii) 서열번호 1의 알파-N-아세틸글루코스아미니다제를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열인 서열번호 22의 서열을 포함하는, 수탁번호 DSM32043로 기탁된 pAAV-CAG-cohNaglu-version3인 것인, 플라스미드.
  3. 치료학적 유효량의 청구항 1의 재조합 AAV9 벡터, 또는 청구항 2의 플라스미드를 포함하는, 점액다당류증(mucopolysaccharidosis) IIIB형 치료용 약학적 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 조성물은 정맥내 또는 수조내(intracisternal) 투여용인 것인, 약학적 조성물.
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서,
    상기 재조합 AAV9 벡터는 체내에서 알파-N-아세틸글루코스아미니다제의 활성을 증가시키는 것인, 재조합 AAV9 벡터.
  7. 제2항에 있어서,
    상기 플라스미드는 체내에서 알파-N-아세틸글루코스아미니다제의 활성을 증가시키는 것인, 플라스미드.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 재조합 AAV9 벡터는 점액다당류증 IIIB형의 치료용인 것인, 재조합 AAV9 벡터.
  9. 제2항에 있어서,
    상기 플라스미드는 점액다당류증 IIIB형의 치료용인 것인, 플라스미드.
  10. 다음 단계를 포함하는, 제1항의 재조합 AAV9 벡터의 제조 방법:
    i) 제1 AAV 말단 반복부와 제2 AAV 말단 반복부 사이에 삽입되는 관심 단백질을 코딩하는 서열, 및 상기 관심 단백질을 코딩하는 서열에 작동적으로 연결된 CAG 프로모터를 포함하는 제1 벡터; AAV rep 유전자, 및 혈청형 9 유래의 AAV cap 유전자를 포함하는 제2 벡터; 및 아데노바이러스 헬퍼 기능 유전자를 포함하는 제3 벡터를 제공하는 단계;
    ii) 적격 세포(competent cell)를 상기 단계 i)의 벡터들로 공동-형질감염시키는 단계;
    iii) 상기 단계 ii)의 형질감염된 세포를 배양하는 단계; 및
    iv) 상기 단계 iii)의 배양물로부터 발현 벡터들을 정제하는 단계.
  11. 제1항의 재조합 AAV9 벡터를 포함하는, 단리된 세포.
  12. 삭제
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  19. 삭제
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