TW201625793A

TW201625793A - 用於治療溶酶體貯積病之腺相關病毒載體

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Publication number: TW201625793A
Application number: TW104115505A
Authority: TW
Inventors: 杜柏法蒂瑪柏舒; 曼朵莎維吉尼亞亞里高; 聖歇亞柏特里柏拉
Original assignee: 艾斯提夫博士實驗股份有限公司; 巴塞隆納歐都諾瑪大學
Priority date: 2014-05-14
Filing date: 2015-05-14
Publication date: 2016-07-16
Also published as: PH12016502248A1; EP3143146B1; CA2947468A1; TWI701332B; IL248538B; AU2015261519A1; RU2016149206A; SG11201609314XA; WO2015173308A1; CA2947468C; US11149285B2; US20170088859A1; BR112016025819A2; AU2015261519B2; BR112016025819B1; IL248538A0; AR100419A1; AU2015261519A2; MX2016014773A; JP6634073B2

Abstract

本發明提供新穎性腺相關病毒載體及含有該等載體之醫藥組合物，其用於治療溶酶體貯積病，且特定而言係用於治療IIIB型黏多糖症。

Description

用於治療溶酶體貯積病之腺相關病毒載體

本發明係關於可用於表現所關注蛋白質之載體及其於基因療法中之使用。本發明亦係關於有助於治療黏多糖症(MPS)、且具體而言用於治療III-B型黏多糖症或聖菲利伯氏B型症候群(Sanfilippo B syndrome)之載體及核酸序列。

溶酶體係在動物細胞之細胞質中發現之細胞器，其含有50種以上在損耗的細胞組份再循環期間或在吞食病毒及細菌後分解生物分子之水解酶。此細胞器含有若干類型之水解酶，包括蛋白酶、核酸酶、糖苷酶、脂酶、磷脂酶、磷酸酶及硫酸酯酶。所有酶皆係酸水解酶。

溶酶體貯積病(LSD)係由影響一或多種溶酶體酶之遺傳缺陷引起。該等遺傳病通常係因缺乏存在於溶酶體中之具體酶活性所致。在較小程度上，該等疾病可歸因於缺乏參與溶酶體生源之蛋白質。

LSD個別地係罕見的，但總體而言，該等病症在一般群體中相對常見。LSD之合併盛行率為約1個/5,000個活胎。參見Meikle P等人，JAMA 1999；281：249-254。然而，一般群體內之一些組尤其受高LSD發生率之折磨。例如，Jewish中部及東歐(Ashkenazi)個體之子代之高歇氏病(Gaucher disease)及泰-薩二氏病(Tay-Sachs disease)的盛行率分別係1/600胎及1/3,900胎。

III型黏多糖症(MPSIII)(統稱為聖菲利伯氏症候群)係由缺乏一種參與糖胺聚糖(GAG)硫酸類肝素(HS)逐步降解之酶引起、從而引起其病理性累積之LSD。端視酶缺乏，MPSIII歸類為四個亞型。N-乙醯葡萄糖胺苷酶α酶活性之損失產生亞型IIIB。所得疾病之臨床特徵在於兒童期發作型進行性CNS神經病變。臨床病程通常可分成三個時期。在疾病之第一個時期中，在跨越生命第一個月之無症狀時段後，心智發展之減緩變得明顯。此後係在疾病之第二個時期期間嚴重的行為問題及進行性智能衰退。最後，伴隨嚴重失智症之發作，行為問題緩慢消失，且所有運動功能開始衰退，最終導致吞嚥困難、完全喪失移行及錐體道病灶。除神經症狀外，MPSIIIB患者患有非神經性變化，包括復發性耳、鼻、喉及胸部感染、頻繁的腹瀉及便秘、影響活動之進行性關節退化及骨骼異常以及肝及脾腫大。參見Cleary及Wraith,Arch Dis Child.1993；69(3)：403-6；Neufeld及Muenzer,「The Mucopolysaccharidoses」，Scriver C等人編輯，「The metabolic and molecular basis of inherited disease」,McGraw-Hill Publishing公司，New York,NY,US,2001，第3421-3452頁；van de Kamp等人，Clin Genet.1981；20(2)：152-60；Moog等人，Am J Med Genet C Semin Med Genet.2007；145C(3)：293-301。患者通常在生命之第二個十年結束時或在生命之第三個十年開始時死亡。參見Neufeld及Muenzer，上文文獻。具有後期發作及較長存活期之更緩慢疾病進行性形式(稱為減毒表型)已闡述於MPSIIIB患者之亞組中。參見Moog等人，上文文獻及Valstar等人，Ann Neurol.2010；68(6)：876-87。

目前業內不存在可用於MPSIIIB之治療。因此，疾病之控制具有症狀性且旨在改良患者及其家族之生命品質。此對於源自CNS變化之彼等症狀特別重要。舉例而言，間歇性升高之顱內壓係行為紊亂之公認原因且在MPS中並不罕有。參見Muenzer等人，Genet Med. 2006；8(8)：465-73。因黏多糖沈積所致之腦膜增厚將係腦脊液(CSF)壓力升高之根本原因。因此，當行為變化對習用藥劑而言係難治的時，考慮插入腦脊液分流器以緩和壓力。在6個已插入腦脊液分流器之聖菲利伯氏患者中，神經症狀得到顯著改良。參見Robertson等人，Eur J Pediatr.1998；157(8)：653-5。另一方面，褪黑激素投與視為該疾病所特有之睡眠病症之最佳治療，但其並不完全有效。參見Fraser等人，Arch Dis Child.2005；90(12)：1239-42。亦不存在針對身體病理之特定治療，且對每一個別症狀僅可施用姑息性療法。

正在測試MPSIIIB之新穎治療方法且取得了不同程度之成功。受質剝奪療法(SDT)旨在降低GAG合成之速率，以使得若剩餘任何殘留酶活性，則防止GAG過量累積或至少減緩累積之速率。已表明金雀異黃酮(Genistein，一種大豆異黃酮)藉由降低表皮生長因子受體(EGFR)之激酶活性而用作HS產生之抑制劑。參見Jakobkiewicz-Banecka等人，J Biomed Sci.2009；16：26；Piotrowska等人，Eur J Hum Genet.2006；14(7)：846-52。最新研究指示，金雀異黃酮抑制患有多種黏多糖症(I型、II型、III-A型及III-B型)之患者之纖維母細胞中GAG之合成。參見Piotrowska等人，上文文獻。向小鼠MPSIIIB疾病模型短期及長期經口投與金雀異黃酮可減少貯積且在運動技能測試中產生較佳表現。參見Malinowska等人，Mol Genet Metab.2009；98(3)：235-42；Malinowska等人，PLoS One.2010；5(12)：e14192。當靜脈內投與時，預期金雀異黃酮能夠穿過血腦障壁(BBB)，從而允許治療CNS病理。支持此觀點，其中向5個MPSIIIA及5個MPSIIIB患者投與12個月之金雀異黃酮富集之大豆提取物的開放標籤先導研究可顯著改善身體及神經參數二者。參見Piotrowska等人，Current Therapeutic Research.2008；69(2)：166-179。然而，後續研究並不顯示經金雀異黃酮治療12個月之MPSIIIA、MPSIIIB或MPSIIIC患者之失能分級或行為評分的改良。參見Delgadillo等人，J Inherit Metab Dis.2011；34(5)：1039-44，在荷蘭國家試驗註冊表(Netherlands National Trial Register)註冊之研究NTR 1826號，及de Ruijter等人，Ann Neurol.2012；71(1)：110-20。亦已在臨床前研究中證實另一分子玫瑰紅(rhodamine)B可有效地減少GAG累積，且效能與使用金雀異黃酮所觀察到之效能類似。參見Hendriksz等人，「Guidelines for the investigation and Management of Mucopolysaccharidosis type III」,2012，在www.mpssociety.co.uk上獲得。認為玫瑰紅B藉由抑制糖前體之形成及/或糖基轉移酶之活性來阻抑GAG鏈之合成。參見Roberts等人，Mol Genet Metab.2007；92(1-2)：115-21。

正常細胞分泌大量甘露糖-6-磷酸酯(M6P)標記之溶酶體酶，其隨後可由其他細胞經由質膜上之M6P受體吸收。此使得可藉由輸注缺失酶之正確形式來治療由缺乏可溶性水解酶引起之LSD。儘管酶替代療法(ERT)尚無法用於聖菲利伯氏B型患者，但向3月齡之MPSIIIB小鼠靜脈內投與重組N-乙醯葡萄糖胺苷酶α顯示重組酶分佈至若干器官，主要分佈至肝。檢測在腦中檢測到微量酶，此歸因於限制以外源方式提供之蛋白質進入腦實質之BBB之存在。參見Yu等人，Mol Genet Metab.2000；71(4)：573-80及Hendriksz等人，上文文獻。用於治療MPSIIIB患者之神經疾病之ERT產品存在早期研發問題。HGT-3010程式(Shire)係基於重組酶之鞘內遞送之ERT，且當前處在臨床前時期中。將ERT直接遞送至CNS已減輕MPSIIIA小鼠之神經病理且目前正在MPSIIIA患者中進行測試。參見Hemsley K等人，Genes Brain Behav.2008；53(2)：161-8；Savas P等人，Mol Genet Metab.2004；82：273-285；www.clinicaltrials.gov上之NCT01155778及NCT01299727。然而，療法所需要之永久鞘內遞送器件之植入與重大風險及缺點相關，且療法自身對於每個患者/年具有極高經濟成本。

使用骨髓源性幹細胞(骨髓移植，BMT)之造血幹細胞移植(HSCT)已證實在治療患有其他MPS之患者之身體及神經病理二者中有效。參見Peters等人，Blood 1996；87(11)：4894-902；Peters及Steward,Bone Marrow Transplant 2003；31(4)：229-39；及Yamada等人，Bone Marrow Transplant 1998；21(6)：629-34。供體源性骨髓細胞能夠穿過BBB，進入腦實質，且分化成分泌缺失溶酶體酶之微膠質細胞，該缺失溶酶體酶隨後由周圍細胞吸收，從而校正腦中之GAG累積。參見Krivit等人，Cell Transplant.1995；4(4)：385-92。然而，在已經歷BMT之聖菲利伯氏A型或B型患者中並未觀察到明顯益處。參見Hoogerbrugge等人，Lancet 1995；345(8962)：1398-402；Vellodi等人，J Inherit Metab Dis.1992；15(6)：911-8；Güngör及Tuncbilek,Turk J Pediatr.1995；37(2)：157-63；Sivakumur及Wraith,J Inherit Metab Dis.1999；22(7)：849-50；及Lange等人，Arq Neuropsiquiatr.2006；64(1)：1-4。BMT失效之主要原因似乎在於與原發性疾病之快速進展相比，藉由造血細胞子代替代微膠質群體之緩慢進展。參見Rovelli,Bone Marrow Transplant 2008；41增刊2：S87-9。因此，目前並不將使用BMT之HSCT視為MPSIII患者之治療選擇。參見Boelens等人，Pediatr Clin North Am.2010；57(1)：123-145。使用臍帶血源性幹細胞之HSCT改良MPSIIIB小鼠之認知結果，但需要重複細胞投與。參見Willing等人，Cell Transplantation 2013；刊載前之電子版。此方法最近已用於對若干患有MPSIIIA及MPSIIIB之兒童進行移植；尚不清楚其是否可保護CNS免於退化。參見de Ruijter等人，Curr Pharm Biotechnol.2011；12(6)：923-30。

鑒於目前針對MPSIII、且尤其針對MPSIIIB之治療選擇之限制性，業內需要替代性方法。活體內基因療法提供一次性治療MPS IIIB及其他遺傳性疾病之可能性，且預期具有終身有益效應。在MPSIIIB 疾病之動物模型中已測試了基於使用不同病毒載體與不同投與途徑之組合之若干基因療法方法。

已向年幼的MPSIIIB小鼠靜脈內投與編碼人類N-乙醯葡萄糖胺苷酶α基因之慢病毒載體，在肝、脾、肺及心臟中產生較低轉基因表現量，此減少但並不正規化GAG在該等組織中之累積。參見Di Natale等人，Biochem J.2005；388(2)：639-46。亦已經由顱內投與將載體直接遞送至腦實質測試慢病毒載體之治療潛能。參見Di Domenico等人，Am J Med Genet A.2009；149A(6)：1209-18。在單一腦位點投與之MPSIIIB小鼠直至治療後6個月顯示增加的N-乙醯葡萄糖胺苷酶α活性，此僅部分校正溶酶體貯積病灶。

具體而言，由於腺相關病毒(AAV)載體之高轉導效率及缺少致病性，故該等載體介導之基因轉移隨著許多活體內基因療法應用之所選方法而快速出現。AAV載體可轉導有絲分裂後細胞，且若干臨床前及臨床研究已展示AAV載體介導之基因轉移有效地驅動用於眾多種疾病之治療性轉基因之持續表現的潛能。參見Bainbridge等人，N Engl J Med.2008；358(21)：2231-9；Hauswirth等人，Hum Gene Ther.2008；19(10)：979-90；Maguire等人，N Engl J Med.2008；358(21)：2240-8；Niemeyer等人，Blood 2009；113(4)：797-806；Rivera等人，Blood 2005；105(4)：1424-30；Nathawani等人，N Engl J Med.2011；365(25)：2357-65；及Buchlis等人，Blood 2012；119(13)：3038-41。

當將編碼人類N-乙醯葡萄糖胺苷酶α之血清型2 AAV載體遞送至MPSIIIB小鼠之腦實質之單一位置時，N-乙醯葡萄糖胺苷酶α表現及活性限於注射位點，且僅達成疾病表型之部分改善。參見Fu等人，Mol Ther.2002；5(1)：42-9；Cressant等人，J Neurosci.2004；24(45)：10229-39。在使用甘露醇預治療以滲透BBB後將AAV2載體靜脈內遞送至MPSIIIB小鼠可顯著延長存活期，改良行為表現，且減少腦溶酶體病理，但僅達成身體疾病之部分校正。參見McCarty等人，Gene Ther.2009；16(11)：1340-52。另一方面，在MPSIIIB小鼠腦中，藉由腦池內注射向腦脊液(CSF)單次投與AAV2載體可恢復N-乙醯葡萄糖胺苷酶α活性且減少GAG，但在身體組織中無法觀察到可檢測到之N-乙醯葡萄糖胺苷酶α活性。參見Fu等人，J Gene Med.2010；12(7)：624-33。涉及AAV2之腦池內及靜脈內遞送之組合療法已展示在CNS以及部分身體校正方面長期顯著的治療效能。參見Fu等人，Gene Ther.2007；14(14)：1065-77。

其他研究已利用在實質內投與後血清型5 AAV載體所顯示之神經元細胞之高向性。然而，該等載體在腦實質內具有低分佈，且該方法需要多次注射。將AAV5載體遞送至新生MPSIIIB小鼠之腦之多個位點與骨髓移植之組合顯示與使用血清型2載體所獲得類似之治療效能。參見Heldermon等人，Mol Ther.2010；18(5)：873-80。在較大腦大小之動物模型中，向MPSIIIB犬之4個不同的腦位置立體定向投與AAV5載體可檢測廣闊腦區域中之活性N-乙醯葡萄糖胺苷酶α。然而，酶活性在大部分吻區及大部分尾區、尤其在小腦中仍較低或無法檢測。參見Ellinwood等人，Mol Ther.2011；19(2)：251-9。溶酶體病理在所治療MPSIIIB犬中得到改良但未完全校正，此指示使用此方法達成之酶活性程度不足以應對GAG貯積。儘管具有此部分效能，但最近已開始基於此方法之臨床試驗。參見ISRCTN註冊表之ISRCTN19853672。腦越大，藉由實質內注射覆蓋器官之整個體積變得越困難，且遞送至人類需要若干位點處之載體投與，此使得遞送在技術上具有挑戰且需要研發出特定手術程序。參見Souweidane等人，J Neurosurg Pediatr.2010；6(2)：115-122。

迄今為止，業內已報導僅一項使用血清型9 AAV載體治療 MPSIIIB之研究。該方法在全身投與時利用AAV9載體轉導CNS之能力。參見Foust等人，Nat Biotechnol.2009；27(1)：59-65及Duque等人，Mol Ther.2009；17(7)：1187-1196。向MPSIIIB小鼠靜脈內遞送AAV9-N-乙醯葡萄糖胺苷酶α載體可校正CNS及身體器官中之溶酶體貯積病理，改良行為表現及延長壽命。參見Fu等人，Mol Ther.2011；19(6)：1025-33。然而，此提出之作用過程具有若干缺點。第一，已報導所用CMV啟動子沉默。參見Löser等人，J Virol.1998年1月；72(1)：180-90。第二，在極高劑量之載體(1×10¹³vg/kg)下達成治療效能。自製造及安全性觀點來看，使用該等高劑量將假定對臨床翻譯具有挑戰。

上文所提及之方法皆未完全恢復N-乙醯葡萄糖胺苷酶α活性，達成CNS及身體組織中之細胞質內內容物之完全根除或校正MPSIIIB之所有臨床體徵。因此，業內仍需要具有較佳效能及安全性概況之治療MPSIIIB之新穎方法。

本發明提供用於治療疾病、具體而言用於治療III型黏多糖症(MPSIII)、尤其MPSIIIB之新穎重組載體。

本發明之第一態樣係關於含有編碼N-乙醯葡萄糖胺苷酶α(Naglu)SEQ ID NO：1之核苷酸序列之腺相關病毒載體(AAV)。本發明之AAV載體具有血清型9(AAV9)。該等載體證實可極有效地完全復原腦及身體組織之所有區域中之病理性GAG貯積。

本發明之AAV9載體含有編碼Naglu之核苷酸序列，該序列與SEQ ID NO：2具有至少80%序列一致性，且較佳與SEQ ID NO：2具有至少84%序列一致性。

本發明之AAV9載體進一步含有連接至編碼核苷酸序列之啟動子以控制Naglu之表現。適宜啟動子係CAG啟動子SEQ ID NO：4。

本發明之另一態樣係關於質體，其含有編碼N-乙醯葡萄糖胺苷酶α(Naglu)之核苷酸序列，且具體而言與SEQ ID NO：2具有至少80%序列一致性或較佳與SEQ ID NO：2具有至少84%序列一致性之核苷酸序列。

本發明之另一態樣係關於醫藥組合物，其包含治療有效量之本發明AAV9載體或其中所述之質體。

本發明進一步提供可用於遞送多核苷酸、尤其Naglu多核苷酸之方法。

本發明之另一態樣係關於本發明之AAV9載體或其中所述之質體，其用作藥劑，具體而言用於治療III型黏多糖症(MPSIII)、尤其MPSIIIB。

本發明亦提供用於產生本發明之AAV 9載體之方法。

在另一態樣中，本發明係關於經分離之細胞，其包含編碼N-乙醯葡萄糖胺苷酶α(Naglu)之核苷酸序列，且具體而言與SEQ ID NO：2具有至少80%序列一致性或較佳與SEQ ID NO：2具有至少84%序列一致性之核苷酸序列。

微生物之寄存

質體pAAV-CAG-cohNaglu(SEQ ID NO：6)於2012年11月13日以登錄號DSM 26626寄存於DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen,Inhoffenstraße 7 B,D-38124 Braunschweig,Federal Republic of Germany。

質體pAAV-CAG-hNaglu(SEQ ID NO：5)於2014年3月13日以登錄號DSM 28568寄存於DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen,Inhoffenstraße 7 B,D-38124 Braunschweig,Federal Republic of Germany。

質體pAAV-CAG-cohNaglu-形式2(SEQ ID NO：20)於2015年4月29日以登錄號DSMZ 32043寄存於DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen,Inhoffenstraße 7 B,D-38124 Braunschweig,Federal Republic of Germany。

質體pAAV-CAG-cohNaglu-形式3(SEQ ID NO：23)於2015年4月29日以登錄號DSMZ 32044寄存於DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen,Inhoffenstraße 7 B,D-38124 Braunschweig,Federal Republic of Germany。

定義

術語「核苷酸序列」係指分別含有去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸之核酸分子，DNA或RNA。核酸可為雙鏈、單鏈或含有雙鏈或單鏈序列二者之部分。

術語「序列一致性%」係指在比對序列達成最大序列一致性%後，候選序列中與參考序列之核苷酸一致之核苷酸的百分比。序列一致性%可藉由業內已建立之任何方法或算法來測定，例如ALIGN、BLAST及BLAST 2.0算法。參見Altschul S等人，Nuc Acids Res.1977；25：3389-3402及Altschul S等人，J Mol Biol.1990；215：403-410。

在本文中，序列一致性%係用在比對參考序列與候選序列後一致之核苷酸數除以參考序列中之核苷酸總數，並用結果乘以100來計算。

術語「編碼(codify)」或「編碼(coding)」係指決定核苷酸序列如何翻譯成多肽或蛋白質之遺傳密碼。序列中核苷酸之順序決定沿多肽或蛋白質之胺基酸的順序。

術語「蛋白質」係指由一或多個胺基酸或多肽直鏈構成之大分子。蛋白質可具有翻譯後修飾，如半胱胺酸殘基轉化成3-側氧基丙胺酸、糖基化或金屬結合。蛋白質之糖基化係將共價連接之不同碳水化合物添加至胺基酸鏈。

術語「有效量」係指足以達成預期目的之物質之量。舉例而言，增加N-乙醯葡萄糖胺苷酶α(Naglu)活性之AAV9載體之有效量係足以減少糖胺聚糖累積之量。治療疾病或病症之表現載體之「治療有效量」係表現載體之足以減輕或根除疾病或病症之體徵及症狀的量。給定物質之有效量將隨諸如以下等要素而變化：物質之性質、投與途徑、接受物質之動物之大小及物種以及給予物質之目的。每一個別情形下之有效量可根據業內已建立之方法由熟習此項技術者憑經驗確定。

術語「個體」係指哺乳動物，較佳人類或非人類哺乳動物，更佳小鼠、大鼠、其他齧齒類動物、兔、犬、貓、豬、母牛、馬或靈長類動物，進一步更佳為人類。

術語「可操作地連接」係指啟動子序列相對於所關注基因之功能關係及位置(例如若啟動子或增強子影響編碼序列之轉錄，則該啟動子或增強子可操作地連接至該編碼序列)。通常，可操作地連接之啟動子與所關注序列鄰接。然而，增強子不必與所關注序列鄰接來控制其表現。

術語「向性」係指不同病毒已演化至優先靶向特定宿主物種或彼等物種內之特定細胞類型的方式。

術語「基因療法」係指將所關注之遺傳材料(例如DNA或RNA)轉移至宿主中來治療或預防遺傳性或獲得性疾病或病況。所關注之遺傳材料編碼期望在活體內產生之產物(例如蛋白質多肽、肽或功能性RNA)。舉例而言，所關注之遺傳材料可編碼具有治療價值之酶、激素、受體或多肽。

術語「重組病毒載體」、「病毒載體」、「重組載體」或「載體」係指經由遺傳改造技術自天然病毒獲得之藥劑，該等技術能夠使所關注之遺傳材料(例如DNA或RNA)轉移至細胞，從而在靶細胞中產生由該遺傳材料編碼之產物(例如蛋白質多肽、肽或功能性RNA)。在本發明背景下，「重組載體」或「載體」應理解為衣殼蛋白以及衣殼蛋白內所含之遺傳材料，其用於將該遺傳材料轉移至細胞中。經由核苷酸序列提及「重組載體」或「載體」意指其係指基因組係如序列表(SEQ ID)中所闡釋之「重組載體」或「載體」。

術語「重組質體」或「質體」係指經由遺傳改造技術獲得之小環狀雙鏈自我複製DNA分子，該等技術能夠將所關注之遺傳材料轉移至細胞，從而在靶細胞中產生由該遺傳材料編碼之產物(例如蛋白質多肽、肽或功能性RNA)。此外，術語「重組質體」或「質體」亦係指經由在製造病毒載體作為重組載體基因組之載劑期間使用之遺傳改造技術獲得之小環狀雙鏈自我複製DNA分子。

圖1. 編碼人類N-乙醯葡萄糖胺苷酶α之質體(pAAV-CAG-hNaglu)之流體力學遞送。以流體力學方式向兩月齡MPSIIIB小鼠注射50μg質體pAAV-CAG-hNaglu。直方圖繪示肝(A)及血清(B)中在質體投與後1週量測之N-乙醯葡萄糖胺苷酶α(NAGLU)活性。注射鹽水之WT小鼠之NAGLU活性設定為100%。值為3-4隻小鼠/組之平均值±SEM。相對於WT，*** P<0.001。

圖2. 編碼人類N-乙醯葡萄糖胺苷酶α之AAV9載體(AAV9-CAG-hNaglu)之靜脈內(IV)遞送。野生型(健康)小鼠、未經治療之MPSIIIB小鼠及經IV注射5×10¹¹vg AAV9-CAG-hNaglu治療之MPSIIIB小鼠的肝 (A)及血清(B)中之N-乙醯葡萄糖胺苷酶α活性。(C)身體器官中之糖胺聚糖(GAG)量化。值為5至8隻小鼠/組之平均值±SEM。相對於WT，$$$ P<0.001，相對於未經治療之MPSIIIB，** P<0.01，*** P<0.001。nd：未檢測到。

圖3. 編碼人類N-乙醯葡萄糖胺苷酶α之AAV9載體(AAV9-CAG-hNaglu)之靜脈內遞送。(A)野生型(健康)小鼠、未經治療之MPSIIIB小鼠及經IV注射5×10¹¹vg AAV9-CAG-hNaglu治療之MPSIIIB小鼠的不同腦部分(I-IV)中之N-乙醯葡萄糖胺苷酶α活性。(B)同一腦部分中之糖胺聚糖(GAG)量化。值為5至8隻小鼠/組之平均值±SEM。相對於未經治療之MPSIIIB，*** P<0.001。nd：未檢測到

圖4. 編碼最佳化人類N-乙醯葡萄糖胺苷酶α之AAV9載體(AAV9-CAG-cohNaglu)之靜脈內遞送。野生型(健康)小鼠、未經治療之MPSIIIB小鼠及經IV注射5×10¹¹vg AAV9-CAG-cohNaglu治療之MPSIIIB小鼠的肝(A)及血清(B)中之N-乙醯葡萄糖胺苷酶α活性。(C)身體器官中之糖胺聚糖(GAG)量化。值為5至8隻小鼠/組之平均值±SEM。相對於WT，$$$ P<0.001，相對於未經治療之MPSIIIB，** P<0.01，*** P<0.001。nd：未檢測到。

圖5. 編碼最佳化人類N-乙醯葡萄糖胺苷酶α之AAV9載體(AAV9-CAG-cohNaglu)之靜脈內遞送。(A)野生型(健康)小鼠、未經治療之MPSIIIB小鼠及經IV注射5×10¹¹vg AAV9-CAG-cohNaglu治療之MPSIIIB小鼠的不同腦部分(I-IV)之N-乙醯葡萄糖胺苷酶α活性。(B)同一腦部分中之糖胺聚糖(GAG)量化。值為5至8隻小鼠/組之平均值±SEM。相對於未經治療之MPSIIIB，*** P<0.001。nd：未檢測到。

圖6. 編碼人類N-乙醯葡萄糖胺苷酶α之AAV9載體(AAV9-CAG-hNaglu)之腦池內(IC)遞送。(A)野生型(健康)小鼠、未經治療之MPSIIIB小鼠及經腦池內注射9.3×10⁹vg AAV9-CAG-hNaglu治療之 MPSIIIB小鼠的不同腦部分(I-IV)中之N-乙醯葡萄糖胺苷酶α活性。(B)相同腦區域中之糖胺聚糖(GAG)之量化。值為5至8隻小鼠/組之平均值±SEM。相對於未經治療之MPSIIIB，*** P<0.001。nd：未檢測到。

圖7. 編碼人類N-乙醯葡萄糖胺苷酶α之AAV9載體(AAV9-CAG-hNaglu)之腦池內遞送。(A)野生型(健康)小鼠及未經治療之MPSIIIB小鼠及經腦池內注射9.3×10⁹vg AAV9-CAG-hNaglu治療之MPSIIIB小鼠的肝中之N-乙醯葡萄糖胺苷酶α活性。(B)身體器官中之糖胺聚糖(GAG)量化。值為5至8隻小鼠/組之平均值±SEM。相對於WT，$$$ P<0.001，相對於未經治療之MPSIIIB，** P<0.01，*** P<0.001。nd：未檢測到。

圖8. 編碼最佳化人類N-乙醯葡萄糖胺苷酶α之AAV9載體(AAV9-CAG-cohNaglu)之腦池內遞送。(A)野生型(健康)小鼠、未經治療之MPSIIIB小鼠及經腦池內注射9.3×10⁹vg AAV9-CAG-cohNaglu治療之MPSIIIB小鼠的不同腦部分(I-IV)中之N-乙醯葡萄糖胺苷酶α活性。(B)相同腦區域中之糖胺聚糖(GAG)之量化。值為5至8隻小鼠/組之平均值±SEM。相對於未經治療之MPSIIIB，*** P<0.001。nd：未檢測到。

圖9. 編碼最佳化人類N-乙醯葡萄糖胺苷酶α之AAV9載體(AAV9-CAG-cohNaglu)之腦池內遞送。(A)野生型(健康)小鼠、未經治療之MPSIIIB小鼠及經腦池內注射9.3×10⁹vg AAV9-CAG-cohNaglu治療之MPSIIIB小鼠的肝中之N-乙醯葡萄糖胺苷酶α活性。(B)身體器官中之糖胺聚糖(GAG)量化。值為5至8隻小鼠/組之平均值±SEM。相對於WT，$$$ P<0.001，相對於未經治療之MPSIIIB，** P<0.01，*** P<0.001。nd：未檢測到。

圖10. 編碼最佳化人類N-乙醯葡萄糖胺苷酶α-形式2之質體(pAAV-CAG-cohNaglu-形式2)之流體力學遞送。以流體力學方式向兩月齡MPSIIIB小鼠注射50μg質體pAAV-CAG-cohNaglu-形式2。直方圖繪示肝(A)及血清(B)中在質體投與後1週量測之N-乙醯葡萄糖胺苷酶α(NAGLU)活性。注射鹽水之WT小鼠之NAGLU活性設定為100%。值為3-4隻小鼠/組之平均值±SEM。相對於WT，*** P<0.001。

圖11. 編碼最佳化人類N-乙醯葡萄糖胺苷酶α-形式3之質體(pAAV-CAG-cohNaglu-形式3)之流體力學遞送。以流體力學方式向兩月齡MPSIIIB小鼠注射50μg質體pAAV-CAG-cohNaglu-形式3。直方圖繪示肝(A)及血清(B)中在質體投與後1週量測之N-乙醯葡萄糖胺苷酶α(NAGLU)活性。注射鹽水之WT小鼠之NAGLU活性設定為100%。值為3-4隻小鼠/組之平均值±SEM。相對於WT，*** P<0.001。

圖12. 編碼最佳化鼠類N-乙醯葡萄糖胺苷酶α之AAV9載體(AAV9-CAG-comNaglu)之腦池內遞送。在向MPSIIIB小鼠之大池投與3×10¹⁰vg AAV9-CAG-comNaglu後載體基因組之生物分佈。藉由定量PCR量化腦(A)及身體組織(B)中之載體基因組，且參考二倍體基因組中所含有之DNA之量。ND：未檢測到。

圖13. 編碼最佳化鼠類N-乙醯葡萄糖胺苷酶α之AAV9載體(AAV9-CAG-comNaglu)之腦池內遞送。(A)野生型(健康)小鼠、未經治療之MPSIIIB小鼠及在大池中投與3.9×10¹⁰vg對照載體(空AAV9)或3×10¹⁰vg AAV9-CAG-comNaglu之MPSIIIB小鼠的不同腦部分(I-V)中之N-乙醯葡萄糖胺苷酶α活性。(B)相同腦區域中之糖胺聚糖(GAG)之量化。值為4隻小鼠/組之平均值±SEM。相對於空MPSIIIB，** P<0.01，*** P<0.001。nd：未檢測到。

圖14. 編碼最佳化鼠類N-乙醯葡萄糖胺苷酶α之AAV9載體(AAV9-CAG-comNaglu)之腦池內遞送。(A)在野生型(健康)小鼠及在大池中投與3.9×10¹⁰vg對照載體(空AAV9)或3×10¹⁰vg AAV9-CAG-comNaglu之MPSIIIB小鼠中，在針對指示溶酶體隔室之大小之溶酶體標記物LIMP-2染色後，在不同腦區域中獲得的信號強度之量化。值為4隻小鼠/組之平均值±SEM。相對於空MPSIIIB，* P<0.05，** P<0.01，*** P<0.001。(B)野生型小鼠(左圖)、未經治療之MPSIIIB小鼠(中圖)及在大池中投與AAV9-CAG-comNaglu之MPSIIIB小鼠(右圖)之大腦皮質及小腦的電子顯微鏡分析。1.神經元；2.神經細胞周膠質細胞；3.浦肯野神經元(purkinje neuron)。(C)在自野生型(WT)小鼠、未經治療之MPSIIIB小鼠(MPSIIIB)及在大池中投與3.9×10¹⁰vg對照載體(空AAV9)或3×10¹⁰vg AAV9-CAG-comNaglu之MPSIIIB小鼠獲得的腦提取物中其他溶酶體酶之活性。SGSH，N-磺基葡糖胺磺基水解酶；GUSB，葡萄糖醛酸苷酶β；HEXB，己糖胺酶B。WT酶活性設定為100%。值為4隻小鼠/組之平均值±SEM。相對於空MPSIIIB，*** P<0.001。

圖15. 編碼最佳化鼠類N-乙醯葡萄糖胺苷酶α之AAV9載體(AAV9-CAG-comNaglu)之腦池內遞送。直方圖表示在來自野生型(健康)小鼠及在大池中投與3.9×10¹⁰vg對照載體(空AAV9)或3×10¹⁰vg AAV9-CAG-comNaglu之MPSIIIB小鼠之額、頂葉及枕葉皮質、上丘及視丘之切片中，在針對星狀細胞標記物GFAP(A)及微膠質標記物BSI-B4(B)免疫染色後量測的信號強度。值為2-3隻小鼠/組之平均值±SEM。相對於空MPSIIIB，* P<0.05，** P<0.01，*** P<0.001。(C)基於基因本體論(GO)註解之功能分類。指示轉錄本之分數之圓餅圖與每一生物過程術語相關。明顯地，大部分術語表示發炎/免疫相關之類別。(D)基於CTEN軟體所指派以代表微膠質細胞之基因集合之所有實驗組的階層式分群。每一行表示基因且每一列表示動物。以底部所顯示之灰度繪示所有樣品中之每一基因相對於該基因之平均豐度之表現量。矩陣上方所顯示之樣品之系統樹圖表示轉錄本含量之總體相似性。明顯地，經AAV9-CAG-comNaglu治療之所有MPSIIIB小鼠具有與年齡匹配之健康WT同胞仔接近之基因表現概況。

圖16. 編碼最佳化鼠類N-乙醯葡萄糖胺苷酶α之AAV9載體(AAV9-CAG-comNaglu)之腦池內遞送。野生型(健康)小鼠、未經治療之MPSIIIB小鼠及在大池中投與3.9×10¹⁰vg對照載體(空AAV9)或3×10¹⁰vg AAV9-CAG-comNaglu之MPSIIIB小鼠的肝(A)及血清(B)中之N-乙醯葡萄糖胺苷酶α活性。(C)身體器官中之糖胺聚糖(GAG)量化。值為4至8隻小鼠/組之平均值±SEM。相對於WT，$ P<0.05，相對於未經治療之MPSIIIB，** P<0.01，** P<0.001。nd：未檢測到。(D)肝之電子顯微鏡分析。在來自經空載體治療之MPSIIIB小鼠之肝細胞之細胞質中可觀察到多個電透光液泡(箭頭)，且該等囊泡在經AAV9-CAG-mNaglu治療之動物中消失。(E)在自與(A及B)相同之動物隊列獲得之肝提取物中其他溶酶體酶之活性。IDS，艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶；IDUA，α-L-艾杜糖醛酸酶；SGSH，N-磺基葡糖胺磺基水解酶；GUSB，葡萄糖醛酸苷酶β；HEXB，己糖胺酶B。WT酶活性設定為100%。值為4隻小鼠/組之平均值±SEM。相對於空MPSIIIB，** P<0.01且*** P<0.001。

圖17. 編碼最佳化鼠類N-乙醯葡萄糖胺苷酶α之AAV9載體(AAV9-CAG-comNaglu)之腦池內遞送。在未曾測試過之野生型(健康)小鼠、未經治療之MPSIIIB小鼠及在大池中投與3.9×10¹⁰vg對照載體(空AAV9)或3×10¹⁰vg AAV9-CAG-comNaglu之MPSIIIB小鼠中之行為評估。數據對應於在前2分鐘期間記錄之運動及探究活性，且表示為10至15隻動物/組之平均值±SEM。(A)至中心之潛伏期，(B)於邊界中之時間，(C)進入中心，(D)靜止時間，(E)總行進距離，(F)所穿過線之總數。相對於空MPSIIIB，*P<0.05且**P<0.01。(G)WT(n=23)、未經治療之MPSIIIB小鼠(n=12)、注射有3.9×10¹⁰vg空AAV9(n=5)或3×10⁹vg AAV9-CAG-comNaglu之MPSIIIB小鼠(n=8)中之卡普蘭-邁耶(Kaplan-Meier)存活分析。使用AAV9-CAG-comNaglu 基因療法治療顯著延長MPSIIIB動物之壽命。經AAV9-CAG-comNaglu治療之MPSIIIB小鼠對空MPSIIIB之P=0.0007。

圖18. 編碼最佳化犬N-乙醯葡萄糖胺苷酶α之AAV9載體(AAV9-CAG-cocNaglu)至比格犬(Beagle dog)之腦池內遞送。(A)在向健康比格犬CSF內遞送AAV9-CAG-cocNaglu載體之前及之後，對匹配血清及CSF樣品中抗AAV9中和抗體(Nab)效價之隨訪。藉由在腦池內投與前一個月靜脈內遞送1×10¹¹vg/kg空AAV9載體對犬3及4進行預免疫。(B)在CSF內投與6.5×10¹²vg編碼犬N-乙醯葡萄糖胺苷酶α之AAV9載體後，對健康成年比格犬之CSF之N-乙醯葡萄糖胺苷酶α活性的隨訪。犬1及2(空心符號)在投與時未經處理，而犬3及4(實心符號)具有針對AAV9載體之預存免疫。所有犬在每一時間點之CSF白血球計數(WBC)繪示於同一圖表中(虛線)。

圖19. 質體pAAV-CAG-hNaglu之示意圖(A)及重組AAV載體AAV9-CAG-hNaglu之基因組之示意圖(B)。

圖20. 質體pAAV-CAG-cohNaglu之示意圖(A)及重組AAV載體AAV9-CAG-cohNaglu之基因組之示意圖(B)。

圖21. 質體pAAV-CAG-cohNaglu-形式2之示意圖(A)及重組AAV載體AAV9-CAG-cohNaglu-形式2之基因組之示意圖(B)。

圖22. 質體pAAV-CAG-cohNaglu-形式3之示意圖(A)及重組AAV載體AAV9-CAG-cohNaglu-形式3之基因組之示意圖(B)。

圖23. 質體pAAV-CAG-comNaglu之示意圖(A)及重組AAV載體AAV9-CAG-comNaglu之基因組之示意圖(B)。

圖24. 質體pAAV-CAG-cocNaglu之示意圖(A)及重組AAV載體AAV9-CAG-cocNaglu之基因組之示意圖(B)。

除遺傳材料外，重組載體可亦含有不同的功能元件，包括轉錄控制元件(如啟動子或操縱子)、轉錄因子結合區域或增強子及用於起始或終止翻譯之控制元件。

本發明載體係用於轉移所關注基因之腺相關載體(AAV)。其已證實在轉導寬範圍組織之有絲分裂後細胞中具有高效率。在本發明背景下，該等載體用於遞送人類N-乙醯葡萄糖胺苷酶α(hNaglu)多核苷酸(SEQ ID NO：2)或密碼子最佳化人類N-乙醯葡萄糖胺苷酶α(cohNaglu)多核苷酸(SEQ ID NO：3)。腺相關載體係源自小DNA病毒科(parvoviridae)家族之腺相關病毒之基因組的載體。腺相關病毒基因組係由單鏈去氧核糖核酸(ssDNA)構建。該等載體感染哺乳動物但為非致病性的(即不會導致疾病)。其可感染分裂或未分裂之細胞，且其向性端視血清型而改變。血清型係病毒組之歸類，此端視其衣殼抗原而定。腺相關病毒之由其衣殼蛋白決定之血清型定義病毒向性且容許其進入特定細胞類型中。在本發明背景下，腺相關病毒載體血清型9(AAV9)顯示在單次投與後將遺傳材料遞送至腦以及周邊器官之最佳能力。

本發明者已驚奇地發現，在同一實體中，AAV9衣殼與編碼N-乙醯葡萄糖胺苷酶α之核苷酸序列以及特定CAG啟動子之關聯容許長效表現所有腦區域中之缺失酶。因此，糖胺聚糖(GAG)之溶酶體累積得到校正，以此方式防止MSPIII疾病、且具體而言MPSIIIB之神經變化特徵。甚至已在遠離載體投與點之嗅球中獲得此效應。此外，遞送至腦脊液中之本發明AAV9載體能夠達到全身循環以轉導肝。肝細胞對酶之產生及分泌可增加血清中之N-乙醯葡萄糖胺苷酶α活性，最終可減輕許多身體組織中之溶酶體病理。此表示本發明載體與僅部分校正疾病之臨床體徵、且通常在腦或全身循環中但非二者中發揮其效應之現有方法相比具有明顯優點。

因此，本發明係關於重組AAV9載體，其含有連接至編碼N-乙醯葡萄糖胺苷酶α SEQ ID NO：1之核苷酸序列之CAG啟動子(SEQ ID NO：4)。

具體而言，本發明之重組AAV9載體含有連接至與SEQ ID NO：2 具有至少80%序列一致性之編碼N-乙醯葡萄糖胺苷酶α SEQ ID NO：1之核苷酸序列的CAG啟動子(SEQ ID NO：4)。更佳地，本發明之AAV9重組載體含有連接至與SEQ ID NO：2具有至少84%序列一致性之編碼N-乙醯葡萄糖胺苷酶α SEQ ID NO：1之核苷酸序列的CAG啟動子(SEQ ID NO：4)。具體而言，編碼N-乙醯葡萄糖胺苷酶α SEQ ID NO：1之核苷酸序列與SEQ ID NO：2具有84%、87%、90%、95%、98%或99%序列一致性。

在另一具體實施例中，本發明之重組AAV9載體含有連接至與SEQ ID NO：3具有至少85%序列一致性之編碼N-乙醯葡萄糖胺苷酶α SEQ ID NO：1之核苷酸序列的CAG啟動子(SEQ ID NO：4)。具體而言，編碼N-乙醯葡萄糖胺苷酶α SEQ ID NO：1之核苷酸序列與SEQ ID NO：3具有85%、87%、90%、95%、98%或99%序列一致性。

在本發明之較佳實施例中，編碼N-乙醯葡萄糖胺苷酶α SEQ ID NO：1之核苷酸序列係SEQ ID NO：2。

在本發明之另一較佳實施例中，編碼N-乙醯葡萄糖胺苷酶α SEQ ID NO：1之核苷酸序列係SEQ ID NO：3。如SEQ ID NO：3中所闡釋之序列與SEQ ID NO：2呈現84%序列一致性。

在本發明之另一較佳實施例中，編碼N-乙醯葡萄糖胺苷酶α SEQ ID NO：1之核苷酸序列係SEQ ID NO：19。

在本發明之另一較佳實施例中，編碼N-乙醯葡萄糖胺苷酶α SEQ ID NO：1之核苷酸序列係SEQ ID NO：22。

本發明之AAV9載體含有控制所關注基因之翻譯及轉錄之啟動子。啟動子係可操作地連接至該所關注基因之核苷酸序列。用於本發明中之啟動子係CAG啟動子，其係指包含巨細胞病毒早期增強子元件及雞β-肌動蛋白啟動子之組合。其進一步包括賦予源自所關注基因之mRNA穩定性之β-球蛋白內含子之一部分，參見Alexopoulou A等人， BMC Cell Biology 2008；9(2)：1-11。本發明AAV9載體中所包括之CAG啟動子具有序列SEQ ID NO：4。具體而言，此CAG啟動子證實比業內通常所用之CMV啟動子更有效。

在本發明之另一較佳實施例中，重組AAV9載體選自AAV9-CAG-hNaglu(SEQ ID NO：9)、AAV9-CAG-cohNaglu(SEQ ID NO：10)及AAV9-CAG-cohNaglu-形式2(SEQ ID NO：21)及AAV9-CAG-cohNaglu-形式3(SEQ ID NO：24)。較佳地，重組AAV9載體選自AAV9-CAG-hNaglu(SEQ ID NO：9)、AAV9-CAG-cohNaglu(SEQ ID NO：10)。更特定而言，本發明之重組AAV9載體係由人類腺相關病毒血清型9之病毒衣殼及經改質基因組構成，該經改質基因組含有人類腺相關病毒血清型2之反轉末端重複(ITR)、CAG啟動子、人類α N-乙醯葡萄糖胺苷酶(Naglu)基因之編碼序列(CDS)及來自兔β-球蛋白基因之聚A。

本發明亦係關於含有編碼N-乙醯葡萄糖胺苷酶α SEQ ID NO：1之核苷酸序列之質體。具體而言，本發明之質體含有與SEQ ID NO：2具有至少80%序列一致性之編碼N-乙醯葡萄糖胺苷酶α SEQ ID NO：1之核苷酸序列。較佳地，本發明之質體含有與SEQ ID NO：2具有至少84%序列一致性之編碼N-乙醯葡萄糖胺苷酶α SEQ ID NO：1之核苷酸序列。具體而言，編碼N-乙醯葡萄糖胺苷酶α SEQ ID NO：1之核苷酸序列與SEQ ID NO：2具有84%、87%、90%、95%、98%或99%序列一致性。

在較佳實施例中，本發明之質體含有與SEQ ID NO：3具有至少85%序列一致性之編碼N-乙醯葡萄糖胺苷酶α SEQ ID NO：1之核苷酸序列。具體而言，編碼N-乙醯葡萄糖胺苷酶α SEQ ID NO：1之核苷酸序列與SEQ ID NO：3具有85%、87%、90%、95%、98%或99%序列一致性。

該等質體可用於藉由使用業內已知之方法轉染HEK293細胞來產生本發明之重組AAV9載體。

在本發明之較佳實施例中，含於本發明質體中且編碼N-乙醯葡萄糖胺苷酶α SEQ ID NO：1之核苷酸序列係SEQ ID NO：2。

在本發明之另一較佳實施例中，含於本發明質體中且編碼N-乙醯葡萄糖胺苷酶α SEQ ID NO：1之核苷酸序列係SEQ ID NO：3。

在本發明之另一較佳實施例中，含於本發明質體中且編碼N-乙醯葡萄糖胺苷酶α SEQ ID NO：1之核苷酸序列係SEQ ID NO：19。

在本發明之另一較佳實施例中，含於本發明質體中且編碼N-乙醯葡萄糖胺苷酶α SEQ ID NO：1之核苷酸序列係SEQ ID NO：22。

在更佳實施例中，本發明質體選自pAAV-CAG-hNaglu(SEQ ID NO：5)、pAAV-CAG-cohNaglu(SEQ ID NO：6)、pAAV-CAG-cohNaglu-形式2(SEQ ID NO：20)及pAAV-CAG-cohNaglu-形式3(SEQ ID NO：23)，且尤其選自pAAV-CAG-hNaglu(SEQ ID NO：5)及pAAV-CAG-cohNaglu(SEQ ID NO：6)，且較佳地質體係pAAV-CAG-cohNaglu(SEQ ID NO：6)。

本發明進一步提供用於產生本發明之腺相關病毒重組載體AAV9之方法。該方法包含以下步驟：i)提供第一載體，其包含插入第一AAV末端重複與第二AAV末端重複之間的編碼所關注蛋白質之序列、可操作地連接至編碼所關注蛋白質之序列之CAG啟動子；第二載體，其包含來自血清型9之AAV rep基因及AAV cap基因；及第三載體，其包含腺病毒輔助功能基因；ii)使用步驟i)之載體共轉染勝任細胞；iii)培養步驟ii)之經轉染細胞；及iv)自步驟iii)之培養物純化表現載體。

在較佳實施例中，第一載體之AAV第一及第二末端重複係來自AAV血清型2之ITR。在另一較佳實施例中，第二載體之AAV rep 基因來自AAV血清型2。在另一較佳實施例中，勝任細胞係HEK293細胞。

本發明亦提供用於製備本發明質體之方法，其包含以下步驟：i)藉由具體而言使用MIuI/EcoRI消化自起始質體切除編碼所關注蛋白質之序列，ii)將編碼所關注蛋白質之序列選殖至AAV骨架質體pAAV-CAG的兩個限制位點之間，由此獲得包括編碼所關注蛋白質之序列之相應質體。

在另一態樣中，本發明涵蓋醫藥組合物，其含有治療有效量之其中所述AAV9載體或治療有效量之其中所述質體。

本發明之醫藥組合物包含於醫藥上可接受之載劑中之重組AAV9載體。該組合物亦可包含至少一種輔助物質。輔助物質可尤其選自載劑、賦形劑、溶劑、稀釋劑或佐劑。可接受之載劑、稀釋劑或佐劑係無毒的且較佳在所用劑量及濃度下呈惰性，且包括緩衝液、例如磷酸鹽、檸檬酸鹽或其他有機酸；抗氧化劑；低分子量多肽、蛋白質，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物；胺基酸；單糖、二糖及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑；糖醇，例如甘露醇或山梨醇；鹽形成抗衡離子，例如鈉；及/或非離子型表面活性劑，例如聚乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物(Pluronic F68®)、聚乙二醇(PEG)。

在較佳實施例中，本發明之醫藥組合物適於非經腸投與。非經腸投與之實例係靜脈內、皮下、腦池內及肌內注射。較佳地，本發明之醫藥組合物適於靜脈內或腦池內投與。適於該非經腸投與之組合物包括無菌水溶液或分散液、用於臨時製備無菌溶液或分散液之無菌粉末。有利地，本發明之醫藥組合物經保存免於細菌及真菌之污染作用。

人類及動物之日劑量可端視基於各別物種之要素或其他要素(例如年齡、性別、體重或疾病程度等)而變化。

本發明之另一態樣係關於上文所述AAV9載體或上文所述質體之治療用途。如上文所提及，本發明之重組AAV9載體達成缺失Naglu酶之表現，因此校正GAG之溶酶體累積。此容許校正III型黏多糖症(MPSIII)且尤其MPSIIIB之所有臨床體徵。在此態樣中，本發明亦係關於上文所述之重組AAV9載體或上文所述之質體，其用作藥劑。

具體而言，本發明係關於上文所述之重組AAV9載體或上文所述之質體，其用於增加身體中之α N-葡萄糖胺苷酶活性。

在另一較佳態樣中，本發明係關於上文所述之重組AAV9載體或上文所述之質體，其用於治療III型黏多糖症(MPSIII)且尤其MPSIIIB。

在另一實施例中，本發明係關於上文所述重組AAV9載體或上文所述質體之用途，其用於製造可用於治療III型黏多糖症(MPSIII)且尤其MPSIIIB的藥劑。

本發明之另一實施例係關於治療III型黏多糖症(MPSIII)且尤其MPSIIIB之方法，其包含向有需要之個體投與至少上文所述重組AAV9載體或至少上文所述質體的步驟。

本發明進一步提供包含編碼N-乙醯葡萄糖胺苷酶α SEQ ID NO：1之核苷酸序列之經分離細胞。具體而言，本發明細胞包含與SEQ ID NO：2具有至少80%序列一致性之編碼N-乙醯葡萄糖胺苷酶α SEQ ID NO：1之核苷酸序列。較佳地，編碼N-乙醯葡萄糖胺苷酶α SEQ ID NO：1之核苷酸序列與SEQ ID NO：2具有至少84%序列一致性。具體而言，編碼N-乙醯葡萄糖胺苷酶α SEQ ID NO：1之核苷酸序列與SEQ ID NO：2具有84%、87%、90%、95%、98%或99%序列一致性。在另一具體態樣中，編碼N-乙醯葡萄糖胺苷酶α SEQ ID NO：1之核苷酸序列與SEQ ID NO：3具有至少85%序列一致性，且較佳與SEQ ID NO：3 具有85%、87%、90%、95%、98%或99%序列一致性。

在較佳實施例中，本發明細胞包含編碼N-乙醯葡萄糖胺苷酶α SEQ ID NO：1之核苷酸序列SEQ ID NO：2。

在另一較佳實施例中，本發明細胞包含編碼N-乙醯葡萄糖胺苷酶α SEQ ID NO：1之核苷酸序列SEQ ID NO：3。

在另一較佳實施例中，本發明細胞包含編碼N-乙醯葡萄糖胺苷酶α SEQ ID NO：1之核苷酸序列SEQ ID NO：19。

在另一較佳實施例中，本發明細胞包含編碼N-乙醯葡萄糖胺苷酶α SEQ ID NO：1之核苷酸序列SEQ ID NO：22。

以下實例僅說明本發明之某些實施例且不可視為以任何方式限制本發明。

一般程序 1.重組AAV載體

藉由三重轉染獲得本文所述之AAV載體。製備載體所需之材料係：HEK293細胞(表現E1基因)，提供腺病毒功能之輔助質體，提供來自血清型2之AAV rep 基因及來自血清型9(AAV9)之 cap 基因的質體，及最後含有AAV2 ITR之骨架質體及所關注構築體。

為產生表現N-乙醯葡萄糖胺苷酶α之AAV載體，在普遍存在之雜合CAG啟動子之控制下，將人類、鼠類或犬N-乙醯葡萄糖胺苷酶α之非最佳化或最佳化CDS選殖至AAV骨架質體中。

藉由使用三種經改質質體無輔助病毒轉染HEK293細胞來產生載體。參見Matsushita T等人，Gene Ther.1998；5：938-945及Wright J等人，Mol.Ther.2005；12：171-178。在滾瓶(RB)(Corning,Corning,NY,US)中之補充有10% FBS之DMEM中將細胞培養至70%鋪滿，且然後用以下質體共轉染：1)攜載側接有血清型2 AAV(上文所述)之病毒ITR之表現盒的質體；2)攜載AAV rep2及cap9基因之質體；及3)攜載腺病毒輔助功能之質體。使用如先前所述之最佳化方案藉由兩個連續氯化銫梯度純化載體。參見Ayuso E等人，Gene Ther.2010；17：503-510。針對PBS透析載體，過濾，藉由qPCR滴定且儲存在-80℃下直至使用。

根據業內熟知之分子生物學技術構築本發明載體。

2.動物

缺乏同基因型突變體C57Bl/6JN-乙醯葡萄糖胺苷酶α之小鼠(MPSIIIB)模型購自Jackson Laboratory(Bar Harbor,ME,USA.原液003827)。參見Li等人，Proc Natl Acad Sci.1999；96(25)：14505-10。受侵襲之MPSIIIB及健康對照小鼠係來自異型接合創立者(founder)之自交系。使用擴增涵蓋靶向突變之序列之PCR分析確定來自切尾樣品之基因組DNA的基因型。各別有義及反義引子之序列為：前置引子：5’-GTC GTC TCC TGG TTC TGG AC-3’(SEQ ID NO：13)，反向引子：5’-ACC ACT TCA TTC TGG CCA AT-3’(SEQ ID NO：14)，反向引子突變：5’-CGC TTT CTG GGC TCA GAG-3’(SEQ ID NO：15)。向小鼠隨意進給標準飲食(Harlan,Tekland))且維持在12h之光照-黑暗週期下(在9：00 A.M.進行光照)。

3.編碼hNAGLU之質體至小鼠之流體力學遞送

對於pAAV-CAG-hNaglu、pAAV-CAG-cohNaglu-形式2及pAAV-CAG-cohNaglu-形式3質體之流體力學遞送，在<5秒內經由尾靜脈注射使2月齡MPSIIIB及野生型動物接受體積等於動物體重之10%的總劑量為50μg之質體。此技術使得編碼質體之轉基因主要在肝中表現。參見Liu等人，Gene Ther.1990；6(7)：1258-66。作為對照，使小鼠隊列接受等體積之鹽水溶液。在流體力學注射質體後1週時殺死小鼠。如以下部分中所述收穫器官。

4.載體投與及樣品收集

對於AAV9-CAG-comNaglu載體至小鼠之腦池內遞送，將3×10¹⁰vg之總劑量注射至2月齡MPSIIIB動物之大池。向類似動物隊列注射3.9×10¹⁰vg對照非編碼(空AAV9)載體。在5月齡時，即在載體投與後3個月時，將小鼠麻醉，且然後經心臟灌注10ml PBS以自組織完全清除血液。收集整個腦及多個身體組織(包括肝、脾、胰臟、腎、肺、心臟、骨骼肌及睪丸)，且冷凍於液氮中並儲存在-80℃或浸沒於福馬林(formalin)中以供後續組織學分析。

對於AAV9-CAG-hNaglu及AAV9-CAG-cohNaglu載體之靜脈內遞送，經由尾靜脈注射使2月齡MPSIIIB動物接受5×10¹¹vg之總劑量。在4月齡時，即在載體投與後2個月時，將小鼠殺死且如先前段落中所述收穫器官。

對於AAV9-CAG-hNaglu及AAV9-CAG-cohNaglu載體之腦池內遞送，在2月齡MPSIIIB動物之大池中注射9.3×10⁹vg之總劑量。在4月齡時，即在載體投與後2個月時，將小鼠殺死且如先前段落中所述收穫器官。

對於AAV9-CAG-cocNaglu載體至犬之腦池內遞送，經由大池注射向健康成年比格犬投與6.5×10¹²vg之總劑量。在投與Naglu載體之前6週，使兩隻動物接受1×10¹¹vg/kg空AAV9載體之靜脈內注射以對其進行針對AAV9之預免疫。首先每週且然後每月，收集CSF及血清樣品且儲存在-80℃。

5.載體基因組拷貝數之量化

在56℃下在400μl蛋白酶K溶液(0.2mg/ml)中將組織(約100mg)消化過夜(ON)。藉由使用標準技術提取自上清液分離總DNA。將DNA懸浮於蒸餾水中且使用NanoDrop ND-1000(NanoDrop,Wilmington,DE,USA)量化。藉由定量實時PCR使用並不擴增內源基因座之特異性針對鼠類N-乙醯葡萄糖胺苷酶α轉基因之引子及探針來確定20ng總 DNA中之載體基因組拷貝數。前置引子：5’-GCC GAG GCC CAG TTC TAC-3’(SEQ ID NO：16)；反向引子：5’-TTG GCG TAG TCC AGG ATG TTG-3’(SEQ ID NO：17)；探針：5’-AGC AGA ACA GCA GAT ACC AGA TCA CCC-3’(SEQ ID NO：18)。藉由與參考標準曲線比較確定最終值，該參考標準曲線係自用於AAV載體產生之摻入20ng未經轉導之基因組DNA之線性化質體的連續稀釋構建。

6. N-乙醯葡萄糖胺苷酶α活性及糖胺聚糖量化

在Mili-Q水中對肝及腦樣品進行超音波處理。分析未經處理之血清。使用4-甲基傘形酮源性螢光受質(Moscerdam Substrates,Oegstgeest,NL)測定N-乙醯葡萄糖胺苷酶α活性，如先前所述。參見Marsh及Fensom,Clin Genet.1985；27(3)：258-262。針對蛋白質之總量正規化腦及肝活性程度，使用Bradford蛋白質分析(Bio-Rad,Hercules,CA,US)進行量化。針對體積正規化血清活性。

對於糖胺聚糖(GAG)量化，將組織樣品稱重且然後用蛋白酶K消化，並藉由離心澄清提取物且過濾。利用Blyscan硫酸化糖胺聚糖套組(Biocolor,Carrickfergus,County Antrim,GB)、使用4-硫酸軟骨素作為標準物來測定組織提取物中之GAG含量。將GAG之含量正規化至濕組織重量。

7.其他溶酶體酶之活性

在37℃下與4-甲基傘形酮基α-N-艾杜糖醛酸苷(Glycosynth)一起培育1h之15μg蛋白質中量測IDUA活性。對於IDS活性，首先將15μg蛋白質在37℃下與4-甲基傘形酮基-α-L-艾杜糖醛酸苷-2-硫酸酯(Moscerdam Substrates)一起培育4h，然後在37℃下與來自牛睾丸之溶酶體酶之彙集物(LEBT-M2,Moscerdam Substrates)再一起培育24h。如先前所述量測SGSH活性。參見Haurigot等人，J Clin Invest 2013；123(8)：3254-71。對於GUSB活性，在37℃下將10μg蛋白質與4- 甲基傘形酮基-β-D-葡萄糖醛酸苷(Sigma)一起培育1h。藉由在37℃下將0.1μg蛋白質與4-甲基傘形酮基N-乙醯基-β-D-葡萄糖苷(Sigma)一起培育1h來分析HEXB活性。藉由增加pH終止反應後，使用FLx800螢光計(BioTek Instruments)量測所釋放之螢光。針對藉由Bradford(Bio-Rad)量化之總蛋白質含量正規化所有酶活性。

8.組織學分析

將組織於福馬林中固定12-24h，包埋於石蠟中且進行切片。對於身體組織中之LAMP1之免疫組織化學檢測，使石蠟切片在檸檬酸鹽緩衝液(pH 6)中經受熱誘導之表位恢復，且然後在4℃下與以1：100稀釋之大鼠抗LAMP1抗體(1D4B；Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA,US)一起培育過夜，且隨後以1：300與生物素化兔抗大鼠抗體(Dako,Glostrup,DK)一起培育。對於腦中之LIMP2之免疫組織化學檢測，在4℃下將石蠟切片與以1：100稀釋之兔抗LIMP2抗體(NB400；Novus Biologicals,Littleton,CO,USA)一起培育過夜，且隨後以1：300與生物素化山羊抗兔抗體(31820；Vector Laboratories,Burlingame,CA,USA)一起培育。對於腦樣品中之GFAP免疫染色，在4℃下將石蠟切片與以1：1000稀釋之兔抗GFAP抗體(Ab6673；Abcam,Cambridge,UK)一起培育過夜，且隨後以1：300與生物素化山羊抗兔抗體(31820；Vector Laboratories,Burlingame,CA,USA)一起培育。藉由將切片與以1：100稀釋之ABC-過氧化酶染色套組(Thermo Scientific,Waltham,MA,US)一起培育來擴增LAMP1、LIMP2及GFAP信號，並使用3,3-二胺基聯苯胺(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,US)作為色原體使其可視化。使用光學顯微鏡(Eclipse 90i；Nikon,Tokyo,JP)獲得明場影像。

為對腦樣品中之微膠質細胞進行染色，在4℃下將石蠟切片與以1：100稀釋之Bsi-B4凝集素(L5391；Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)一起培育過夜。使用3,3-二胺基聯苯胺(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO, US)作為色原體使Bsi-B4信號可視化。使用光學顯微鏡(Eclipse 90i；Nikon,Tokyo,JP)獲得明場影像。

使用NIS Elements Advanced Research 2.20軟體來量化每隻動物每一腦區域之3-5個影像(原始放大倍數，×20)中之LIMP2、GFAP及Bsi-B4信號，對所有動物使用相同的信號臨限值設定。然後，計算陽性區域之百分比，即在影像中全部組織區域上具有陽性信號之區域(以像素計)。

9.透射電子顯微鏡分析

藉由過量異氟烷(Isofluo,Labs.Esteve,Barcelona,ES)殺死小鼠，且經由後大靜脈灌注1ml 2.5%戊二醛及2%多聚甲醛。將肝及大腦皮質之側葉之小部分(約1mm³)進行切片且在4℃下於相同固定劑中培育2小時。在冷二甲基胂酸鹽緩衝液中洗滌後，將樣本後固定於1%四氧化鋨中，於乙酸氧鈾水溶液中染色，且然後經由分級乙醇系列脫水並包埋於環氧樹脂中。使用檸檬酸鉛對來自樹脂塊之超薄切片(600-800Å)進行染色，且在透射電子顯微鏡(H-7000；Hitachi,Tokyo,JP)中檢查。

10.轉錄組分析

以機械方式將小鼠半腦(約250mg)均質化，且使用mirVanaTM(Ambion,Life Technologies)分離總RNA。合成cDNA並隨後於GeneChip Mouse Gene 2.1 ST 16陣列板(Affymetrix)中藉由Progenika Biopharma(Spain)進行雜化；遵循Affymetrix推薦之方案及設備實施樣品處理、雜化及掃描。使用Affymetrix® Expression Console TM工具藉由RMA(穩健的多陣列平均化)方法進行數據正規化，獲得log2轉變之正規化值。篩濾數據以集中分析已知編碼序列，獲得26688個經改變基因之初始列表，隨後將該等基因再篩濾，以去除具變異數在75%以下之基因。此過程產生6672個基因之工作列表。對於差異表現之基因，建立具有80%可信度之FDR(錯誤發現率)準則<0.1。對於分群分析，使用J-Express Pro軟體(jexpress.bioinfo.no)將數據標準化且表示為熱點圖。使用Genecodis Tool 2.0(genecodis2.dacya.ucm.es)實施功能分析。陣列數據已提交給ArrayExpress數據庫(http：//www.ebi.ac.uk/arrayexpress/；登錄密碼：E-MTAB-2984)。

11.行為評價

經由曠場測試(open-field test)評價行為變化。將動物置於亮光室(41×41×30cm)之左下拐角中。將活動場所之表面分成三個同心正方形：中心(14×14cm)、周邊(27×27cm)及邊界(41×41cm)。在前兩分鐘期間使用視頻追蹤系統(Smart Junior,Panlab)記錄探究行為及一般活動。始終在每天同一時間(9：00am至1：00pm)進行測試以最小化晝夜週期之影響。

12.統計學分析

所有結果皆表示為平均值±SEM。使用單因子ANOVA進行統計學比較，且將使用Dunnett事後測試進行對照組與治療組之間之多重比較。若P<0.05，則視為具有統計學顯著性。將使用卡普蘭-邁耶方法來分析存活，且使用對數秩測試進行比較。

實例 實例1：pAAV-CAG-hNaglu之構築

使用人類N-乙醯葡萄糖胺苷酶α編碼序列(CDS)作為起始材料(NCBI參考序列：NM_000263)且出於此目的進行化學合成(GeneArt；Life Technologies)。將CDS選殖至分別在5’及3’端側接有MluI及EcoRI限制位點之質體pMA(AmpR)內部。藉由MluI/EcoRI消化切除N-乙醯葡萄糖胺苷酶α CDS，且然後選殖至AAV骨架質體pAAV-CAG(AmpR)之MluI與EcoRI限制位點之間。所得質體命名為pAAV-CAG-hNaglu(登錄號DSMZ 28568)。參見SEQ ID NO：5及圖19A。

先前已產生pAAV-CAG質體，且其含有來自AAV2基因組之ITR、CAG啟動子及來自兔β-球蛋白之聚A信號以及用於選殖所關注CDS之多選殖位點。CAG啟動子係由CMV早期/中期增強子及雞β-肌動蛋白啟動子構成之雜合啟動子。此啟動子能夠普遍地驅動強效表現。參見Sawicki J等人，Exper Cell Res.1998；244：367-369；Huang J等人，J Gene Med.2003；5：900-908；Liu Y等人，Exp Mol Med.2007；39(2)：170-175。

實例2：AAV9-CAG-hNaglu之產生

藉由使用三種經改質質體無輔助病毒轉染HEK293細胞來產生載體AAV9-CAG-hNaglu(SEQ ID NO：9及圖19B))。參見Matsushita,1998，上文文獻及Wright,2005，上文文獻。在滾瓶(RB)(Corning,Corning,NY,US)中之補充有10% FBS之DMEM中將細胞培養至70%鋪滿，且然後用以下質體共轉染：1)攜載側接有AAV2 ITR之表現盒之質體(pAAV-CAG-hNaglu)；2)攜載AAV2 rep及AAV9 cap基因之質體(pREP2CAP9)；及3)攜載腺病毒輔助功能之質體。使用如先前所述之標準方案或最佳化方案藉由兩個連續氯化銫梯度來純化載體。參見Ayuso,2010，上文文獻。針對PBS透析載體，過濾，藉由qPCR滴定且儲存在-80℃下直至使用。

實例3：pAAV-CAG-cohNaglu之構築

設計且獲得包括人類N-乙醯葡萄糖胺苷酶α CDS之最佳化形式(cohNaglu)之表現盒。經由以下方式實施序列最佳化(GeneArt®)以最大化人類中N-乙醯葡萄糖胺苷酶α蛋白產生之效率：消除隱藏的剪接位點及RNA去穩定序列元件以增加RNA穩定性，添加RNA穩定序列元件，密碼子最佳化及G/C含量適應，尤其避免穩定的RNA二級結構變化。將最佳化CDS選殖至分別在5’及3’處側接有MluI及EcoRI限制位點之質體pMA-RQ(AmpR)中。

用MluI及EcoRI消化pMA-RQ-cohNaglu質體以切除最佳化N-乙醯葡萄糖胺苷酶α CDS。隨後，將此片段選殖至相同pAAV-CAG骨架質體之限制位點之間以產生pAAV-CAG-cohNaglu質體(登錄號DSMZ 26626)。參見SEQ ID NO：6及圖20A。

實例4：AAV9-CAG-cohNaglu之產生

藉由使用三種經改質質體無輔助病毒轉染HEK293細胞來產生載體AAV9-CAG-cohNaglu(SEQ ID NO：10及圖20B)。參見Matsushita,1998，上文文獻及Wright,2005，上文文獻。在滾瓶(RB)(Corning,Corning,NY,US)中之補充有10% FBS之DMEM中將細胞培養至70%鋪滿，且然後用以下質體共轉染：1)攜載側接有AAV2 ITR之表現盒之質體(pAAV-CAG-cohNaglu)；2)攜載AAV2 rep及AAV9 cap基因之質體(pREP2CAP9)；及3)攜載腺病毒輔助功能之質體。使用如先前所述之標準方案或最佳化方案藉由兩個連續氯化銫梯度來純化載體。參見Ayuso,2010，上文文獻。針對PBS透析載體，過濾，藉由qPCR滴定且儲存在-80℃下直至使用。

實例5：pAAV-CAG-cohNaglu-形式2之構築

設計且獲得包括人類N-乙醯葡萄糖胺苷酶α CDS之第二最佳化形式(cohNaglu-形式2)之表現盒。將最佳化CDS(DNA 2.0®)選殖至在5’及3’處分別側接有MluI及EcoRI限制位點之質體pJ208(AmpR)中。

用MluI及EcoRI消化pJ208-cohNaglu-形式2質體以切除最佳化N-乙醯葡萄糖胺苷酶α-形式2 CDS。隨後，將此片段選殖至pAAV-CAG骨架質體之相同限制位點之間以產生pAAV-CAG-cohNaglu-形式2質體(登錄號DSMZ 32043)。參見SEQ ID NO：20及圖21A。

實例6：AAV9-CAG-cohNaglu-形式2之產生

藉由使用三種經改質質體無輔助病毒轉染HEK293細胞來產生載體AAV9-CAG-cohNaglu-形式2(SEQ ID NO：21及圖21B)。參見 Matsushita,1998，上文文獻及Wright,2005，上文文獻。在滾瓶(RB)(Corning,Corning,NY,US)中之補充有10% FBS之DMEM中將細胞培養至70%鋪滿，且然後用以下質體共轉染：1)攜載側接有AAV2 ITR之表現盒之質體(pAAV-CAG-cohNaglu-形式2)；2)攜載AAV2 rep及AAV9 cap基因之質體(pREP2CAP9)；及3)攜載腺病毒輔助功能之質體。使用如先前所述之標準方案或最佳化方案藉由兩個連續氯化銫梯度來純化載體。參見Ayuso,2010，上文文獻。針對PBS透析載體，過濾，藉由qPCR滴定且儲存在-80℃下直至使用。

實例7：pAAV-CAG-cohNaglu-形式3之構築

設計且獲得包括人類N-乙醯葡萄糖胺苷酶α CDS之第三最佳化形式(cohNaglu-形式3)之表現盒。將最佳化CDS(GenScript公司)選殖至在5’及3’處分別側接有MluI及EcoRI限制位點之質體pUC57(AmpR)中。

用MluI及EcoRI消化pUC57-cohNaglu-形式3質體以切除最佳化N-乙醯葡萄糖胺苷酶α-形式3 CDS。隨後，將此片段選殖至pAAV-CAG骨架質體之相同限制位點之間以產生pAAV-CAG-cohNaglu-形式3質體(登錄號DSMZ 32044)。參見SEQ ID NO：23及圖22A。

實例8：AAV9-CAG-cohNaglu-形式3之產生

藉由使用三種經改質質體無輔助病毒轉染HEK293細胞來產生載體AAV9-CAG-cohNaglu-形式3(SEQ ID NO：24及圖22B)。參見Matsushita,1998，上文文獻及Wright,2005，上文文獻。在滾瓶(RB)(Corning,Corning,NY,US)中之補充有10% FBS之DMEM中將細胞培養至70%鋪滿，且然後用以下質體共轉染：1)攜載側接有AAV2 ITR之表現盒之質體(pAAV-CAG-cohNaglu-形式3)；2)攜載AAV2 rep及AAV9 cap基因之質體(pREP2CAP9)；及3)攜載腺病毒輔助功能之質體。使用如先前所述之標準方案或最佳化方案藉由兩個連續氯化銫梯度來純化載體。參見Ayuso,2010，上文文獻。針對PBS透析載體，過濾，藉由qPCR滴定且儲存在-80℃下直至使用。

實例9：pAAV-CAG-comNaglu之構築

使鼠類N-乙醯葡萄糖胺苷酶α之CDS(NCBI參考序列：NM_013792)經受序列最佳化(GeneArt；Life Technologies)。將最佳化CDS選殖至在5’及3’處分別側接有MluI及EcoRI限制位點之質體pMA-RQ(AmpR)內部。

自pMA-RQ質體切除MluI/EcoRI最佳化鼠類N-乙醯葡萄糖胺苷酶α CDS片段，且隨後選殖至AAV骨架質體pAAV-CAG之MluI與EcoRI限制位點之間。所得質體命名為pAAV-CAG-comNaglu。參見SEQ ID NO：7及圖23A。

實例10：AAV9-CAG-comNaglu之產生

藉由使用三種經改質質體無輔助病毒轉染HEK293細胞來產生載體AAV9-CAG-comNaglu(SEQ ID NO：11及圖23B)。參見Matsushita,1998，上文文獻及Wright,2005，上文文獻。在滾瓶(RB)(Corning,Corning,NY,US)中之補充有10% FBS之DMEM中將細胞培養至70%鋪滿，且然後用以下質體共轉染：1)攜載側接有AAV2 ITR之表現盒之質體(pAAV-CAG-comNaglu)；2)攜載AAV2 rep及AAV9 cap基因之質體(pREP2CAP9)；及3)攜載腺病毒輔助功能之質體。使用如先前所述之標準方案或最佳化方案藉由兩個連續氯化銫梯度來純化載體。參見Ayuso,2010，上文文獻。針對PBS透析載體，過濾，藉由qPCR滴定且儲存在-80℃下直至使用。

實例11：pAAV-CAG-cocNaglu之構築

使犬N-乙醯葡萄糖胺苷酶α之CDS(NCBI參考序列：XM_548088.4)經受序列最佳化(GeneArt；Life Technologies).將最佳化CDS選殖至在5’及3’處分別側接有MluI及EcoRI限制位點之質體 pMA-RQ(AmpR)內部。

自pMA-RQ質體切除MluI/EcoRI最佳化犬N-乙醯葡萄糖胺苷酶α CDS片段，且隨後選殖至AAV骨架質體pAAV-CAG之MluI與EcoRI限制位點之間。所得質體命名為pAAV-CAG-cocNaglu。參見SEQ ID NO：8及圖24A。

實例12：AAV9-CAG-cocNaglu之產生

藉由使用三種經改質質體無輔助病毒轉染HEK293細胞來產生載體AAV9-CAG-cocNaglu(SEQ ID NO：12及圖24B)。參見Matsushita,1998，上文文獻及Wright,2005，上文文獻。在滾瓶(RB)(Corning,Corning,NY,US)中之補充有10% FBS之DMEM中將細胞培養至70%鋪滿，且然後用以下質體共轉染：1)攜載側接有AAV2 ITR之表現盒之質體(pAAV-CAG-cocNaglu)；2)攜載AAV2 rep及AAV9 cap基因之質體(pREP2CAP9)；及3)攜載腺病毒輔助功能之質體。使用如先前所述之標準方案或最佳化方案藉由兩個連續氯化銫梯度來純化載體。參見Ayuso,2010，上文文獻。針對PBS透析載體，過濾，藉由qPCR滴定且儲存在-80℃下直至使用。

實例13：質體pAAV9-CAG-hNaglu之流體力學遞送

經由流體力學尾靜脈(HDTV)注射向2月齡MPSIIIB小鼠投與總劑量為50ug之含有野生型人類N-乙醯葡萄糖胺苷酶α表現盒之質體pAAV9-CAG-hNaglu。此技術靶向遞送至肝之質體之表現。參見Liu等人，Gene Ther.1990；6(7)：1258-66。

在質體遞送後一週，記載到在投與野生型人類N-乙醯葡萄糖胺苷酶α編碼質體之所有動物的肝及血清中，N-乙醯葡萄糖胺苷酶α活性與預治療程度相比顯著增加。參見圖1A及1B。在注射有鹽水溶液之MPSIIIB動物中未檢測到活性。在經治療動物之肝及血清中觀察到之N-乙醯葡萄糖胺苷酶α活性之程度分別對應於在WT動物之肝及血清中量測之活性的平均值(設定為100%)之150%及1700%。參見圖1A及1B。

實例14：AAV9-CAG-hNaglu之靜脈內遞送

經由尾靜脈注射向2月齡MPSIIIB小鼠投與AAV9-CAG-hNaglu載體之5×10¹¹個載體基因組之總劑量。

與AAV9載體對肝之高向性一致，在投與後兩個月，經治療動物顯示此器官中之高N-乙醯葡萄糖胺苷酶α活性程度(在健康動物中所觀察到活性程度之700%)，此完全消除或顯著減少在未經治療之MPSIIIB小鼠之身體組織中觀察到的病理性GAG累積。參見圖2A-C。另外，鑒於在全身投與後使用血清型9 AAV載體轉導腦之高效率，經治療動物顯示在所分析之所有腦區域中顯著的N-乙醯葡萄糖胺苷酶α活性程度(健康小鼠之20%-30%)。參見圖3A。N-乙醯葡萄糖胺苷酶α活性之此部分恢復足以清除所有腦區域之GAG貯積。參見圖3B。

實例15：AAV9-CAG-cohNaglu之靜脈內遞送

經由尾靜脈注射向2月齡MPSIIIB小鼠投與AAV9-CAG-cohNaglu載體之5×10¹¹個載體基因組之總劑量。

在投與後兩個月，經治療動物顯示肝中之高N-乙醯葡萄糖胺苷酶α活性程度(健康程度之600%)及血清中活性程度之適度增加(健康程度之7%)。參見圖4A及4B。N-乙醯葡萄糖胺苷酶α產生完全消除或顯著減少在未經治療之MPSIIIB小鼠之身體組織中觀察到的病理性GAG累積。參見圖4C。另外，經治療動物顯示在所分析之所有腦區域中顯著的N-乙醯葡萄糖胺苷酶α活性程度(健康小鼠之18%-27%)。參見圖5A。N-乙醯葡萄糖胺苷酶α活性之此部分恢復足以清除所有腦區域之GAG貯積。參見圖5B。

實例16：AAV9-CAG-hNaglu之腦池內遞送

將AAV9-CAG-hNaglu載體之9.3×10⁹個載體基因組之總劑量以5μl 之總體積注射至2月齡MPSIIIB動物之大池中。

CSF內投與AAV9-CAG-hNaglu載體產生所分析之所有腦區域中之高N-乙醯葡萄糖胺苷酶α活性程度(健康小鼠之50%-100%)；在腦之大多數最前部分中，活性達到在健康動物中觀察到之程度。參見圖6A。在經治療MPSIIIB小鼠之腦中完全消除了GAG之過度貯積。參見圖6B。當遞送至CSF時，血清型9 AAV載體滲漏至血流中且轉導肝。參見Haurigot等人，J Clin Invest 2013；123(8)：3254-71。與此一致，在經治療MPSIIIB小鼠之肝中檢測到程度為健康動物之32%之N-乙醯葡萄糖胺苷酶α活性。參見圖7A。N-乙醯葡萄糖胺苷酶α活性之此增加調介肝、脾、心臟、肺、睾丸及膀胱中之GAG累積之校正，且亦顯著減少腎中之GAG貯積。參見圖7B。

實例17：AAV9-CAG-cohNaglu之腦池內遞送

將AAV9-CAG-cohNaglu載體之9.3×10⁹個載體基因組之總劑量以5μl之總體積注射至2月齡MPSIIIB動物之大池中。

腦池內投與AAV9-CAG-cohNaglu載體使得所分析之所有腦區域中之N-乙醯葡萄糖胺苷酶α活性之程度顯著增加，該等程度介於健康值之22%至45%範圍內。參見圖8A。因此，在經治療MPSIIIB小鼠之所有腦區域中，病理性GAG累積皆完全復原。參見圖8B。在經治療MPSIIIB小鼠之肝中，N-乙醯葡萄糖胺苷酶α活性亦增加至健康動物之25%。參見圖9A。N-乙醯葡萄糖胺苷酶α活性之此增加調介肝、心臟、肺及膀胱中之GAG累積之校正，且亦顯著減少脾、睾丸及腎中之GAG貯積。參見圖9B。

實例18：質體pAAV9-CAG-cohNaglu-形式2之流體力學遞送

經由尾流體力學尾靜脈注射向2月齡MPSIIIB小鼠投與總劑量為50μg之攜載含有人類N-乙醯葡萄糖胺苷酶α之最佳化形式(形式2)之表現盒的質體pAAV9-CAG-cohNaglu-形式2。如上文所提及，此技術靶向遞送至肝之質體之表現。參見Liu等人，上文文獻。

在質體遞送後一週，在接受含有N-乙醯葡萄糖胺苷酶α編碼序列之最佳化形式2之質體的流體力學注射之所有動物之肝及血清中，N-乙醯葡萄糖胺苷酶α活性與預治療程度相比有所增加。參見圖10A及10B。在注射有鹽水溶液之MPSIIIB動物中未檢測到活性。在經治療動物中，肝及血清N-乙醯葡萄糖胺苷酶α活性分別達到為在WT動物中所觀察到之活性平均值(設定為100%)的150%及1500%之程度。參見圖10A及10B。

實例19：質體pAAV9-CAG-cohNaglu-形式3之流體力學遞送

經由尾流體力學尾靜脈注射向2月齡MPSIIIB小鼠投與總劑量為50μg之含有密碼子最佳化形式(形式3)人類N-乙醯葡萄糖胺苷酶α表現盒之質體pAAV9-CAG-cohNaglu-形式3。如上文所提及，此技術靶向遞送至肝之質體之表現。參見Liu等人，上文文獻。

在質體遞送後一週，記載到在投與攜載含有密碼子最佳化人類N-乙醯葡萄糖胺苷酶α編碼序列之形式3之表現盒的質體之所有動物之肝及血清中，N-乙醯葡萄糖胺苷酶α活性與預治療程度相比顯著增加。參見圖11A及11B。在注射有鹽水溶液之MPSIIIB動物中未檢測到活性。在經治療動物之肝及血清中觀察到之N-乙醯葡萄糖胺苷酶α活性之程度分別對應於在WT動物之肝及血清中測定之活性平均值(設定為100%)的170%及1100%。參見圖11A及11B。

實例20：AAV9-CAG-comNaglu之腦池內遞送

將AAV9-CAG-comNaglu載體之3×10¹⁰個載體基因組之總劑量以10μl之總體積注射至2月齡MPSIIIB動物之大池中。

在所分析之所有腦區域以及脊髓中可檢測到AAV9載體基因組。在周邊組織中，僅可在肝中檢測到相當基因拷貝數之載體基因組，且在頭部引流於其中之淋巴結(下顎淋巴結)中檢測到低基因拷貝數。參見圖12A-B。

CSF內投與AAV9-CAG-comNaglu載體產生所分析之所有腦區域中之極高的N-乙醯葡萄糖胺苷酶α活性程度；所達到之程度係在健康動物之所有區域中觀察到之彼等的若干倍。參見圖13A。在載體遞送後三個月，在經治療MPSIIIB小鼠之腦中，疾病之溶酶體病理特徵完全復原，如藉由在所分析之所有腦區域中針對溶酶體標記物LIMP-2+正規化GAG累積及信號強度所指示。參見圖13B及14A。藉由透射電子顯微鏡對枕葉皮質及小腦之超微結構分析確認溶酶體病理減輕，此在接受對照載體之MPSIIIB動物中之看上去膨脹且充滿大貯積囊泡之皮質神經細胞周膠質細胞中極其明顯，同時其在經AAV9-CAG-comNaglu治療之動物中具有正常外觀。參見圖14B。在LSD中，除直接受遺傳突變影響外，若干溶酶體酶之活性亦可繼發於正常溶酶體穩態之微擾而改變。參見Sardiello等人，Science.2009；325：473-477。在未經治療或經空治療之5月齡雄性MPSIIIB小鼠之腦中，艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶(IDS)、N-磺基葡糖胺磺基水解酶(SGSH)、β-葡萄糖醛酸苷酶(GUSB)及β-己糖胺酶(HEXB)之活性顯著增加。參見圖14C。與在CSF內遞送AAV9-CAG-comNaglu載體後3個月所觀察到之GAG貯積之減少一致，在經治療動物中腦SGSH、GUSB及HEXB之活性返回至健康野生型程度。參見圖14C。

與溶酶體病理之校正一致，所有發炎體徵皆自經治療MPSIIIB小鼠之腦消失。用於檢測星狀細胞增多(GFAP)及微膠質細胞增生(BSI-B4)之染色之信號強度在經治療MPSIIIB小鼠中與在健康動物中類似，此與在未經治療之MPSIIIB小鼠中所記載之顯示該等神經發炎標記物明顯上調之信號不同。參見圖15A及15B。為進一步評價CSF內AAV9-CAG-comNaglu基因療法對CNS發炎之效能，使用Affimetrix®微陣列平臺對自WT及經AAV9-CAG-comNaglu或空AAV9治療之 MPSIIIB腦分離之總RNA實施基因表現剖析研究。在數據處理及過濾後，發現94個基因在三組中差異表現。當藉由生物過程使用基因本體論(GO)富集分析來歸類差異表現之基因時，使用相應的本體論註解94個基因中之67個。參見圖15C。在該等基因中，絕大多數與發炎及先天免疫或可使細胞參與該等過程之功能相關。參見圖15C。為確認此觀察，使用細胞類型富集(CTEN)分析來評價不同細胞類型對所觀察到之轉錄本含量變化之貢獻。此軟體認為，若軟體定義之評分大於2，則存在特定細胞類型之富集。對於微膠質細胞獲得數據集合之最高評分(評分=60)，該結果與微膠質細胞在神經變性疾病及MPSIII中達成之重要作用一致。參見Ohmi等人，Proc Natl Acad Sci USA.2003；100：1902-1907；McGeer等人Alzheimer Dis Assoc Disord.1998；12(增刊2)：S1-E16；Derecki等人，Nature.2012；484：105-109；DiRosario等人，J Neurosci Res.2009；87：978-990；Archer等人，J Inherit Metab Dis.2014；37：1-12。在評估CSF內遞送AAV9-CAG-comNaglu載體之效應時，觀察到注射空AAV9之動物之基因表現概況之顯著變化。在載體投與後三個月，經治療MPSIIIB小鼠之絕大多數基因之轉錄本含量與健康同胞仔之彼等類似。幾乎90%的在未經治療之MPSIIIB小鼠中差異表現之基因顯示，在AAV9-CAG-comNaglu治療後其轉錄本含量至少50%之校正，且在其60%中校正為75%。在單獨分析CTEN軟體已指派至微膠質細胞之基因集合時，觀察到轉錄本含量之相似或稍高之正規化程度。參見圖15D。此觀察支持以下觀點：微膠質細胞極大地負責在MPSIIIB中所觀察到之基因表現概況，且與在經治療動物中所記載之微膠質細胞增生之完全逆轉一致。

投與CSF之AAV9載體滲漏至周邊且轉導肝。參見圖9及Haurigot等人，上文文獻。因此，記載到在經AAV9-CAG-comNaglu治療之MPSIIIB小鼠之肝及血清中N-乙醯葡萄糖胺苷酶α活性增加，所達到之程度係在健康動物中所觀察到之程度的約800%。參見圖16A及16B。血清中之酶活性程度與經治療小鼠肝中之活性之彼等密切相關，此表明肝係循環酶之主要來源。在經由量化不同器官中之GAG含量來評估療法之身體效能時，在除腎外之大部分組織(包括肝、脾、心臟及肺)中觀察到完全正規化，其中觀察到>50%之GAG減少。參見圖16C。對不同實驗組中肝之超微結構分析顯示，為MPSIIIB疾病所特有之貯積液泡自經AAV9-CAG-comNaglu治療之MPSIIIB小鼠的肝細胞完全消失。參見圖16D。如在CNS中所觀察到，自溶酶體隔室清除貯積材料可恢復其他溶酶體酶之活性。在未經治療或經空治療之MPSIIIB小鼠之肝中，α-艾杜糖醛酸酶(IDUA)、艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶(IDS)、SGSH、GUSB及HEXB之活性發生變化。參見圖16E。在AAV9介導之NAGLU基因轉移後三個月，所有該等之酶活性返回至正常程度，此進一步支持經由AAV9-CAG-comNaglu之NAGLU之CSF基因轉移亦可逆轉周邊器官之疾病表型的觀念。參見圖16E。

利用曠場測試評價CSF內投與AAV9-CAG-comNaglu對行為之影響，該測試評估小鼠在未知環境中之一般運動及探究活動。根據進入中心之潛伏期、花費在邊界之時間、進入中心之次數、靜止時間、總行進距離及所穿過線之數量，未經治療及經空AAV9治療之MPSIIIB小鼠顯示與健康小鼠相比減少的探究活動。腦池內投與AAV9-CAG-comNaglu完全校正行為缺陷。參見圖17A-F。

此外，使用AAV9-CAG-comNaglu治療顯著延長MPSIIIB小鼠之壽命。截至15月齡，所有未經治療之MPSIIIB小鼠皆死亡，而100%之接受腦池內AAV9-CAG-comNaglu之動物在18月齡時仍活著。參見圖17G。與空AAV9 MPSIIIB雄性之13.8個月之中值存活期相比，經治療之MPSIIIB雄性顯示21個月之中值存活期；P=0.0007。健康雄性之中值存活期為26.6個月。經治療MPSIIIB小鼠之正規化行為反應及較長存活期進一步展示AAV9-CAG-comNaglu之治療效能。

實例21：AAV9-CAG-cocNaglu至犬之腦池內遞送

針對基因療法方法之臨床應用之第一步驟需要展示其在大動物模型中之可行性。先前展示在腦脊液內投與比格犬(其係腦大小與人類較接近之動物模型)後AAV9載體之分佈與在經由相同途徑接受等效劑量載體之小鼠中所觀察到之分佈極類似。參見Haurigot等人，上文文獻。簡言之，投與2×10¹³vg編碼報導基因蛋白GFP之AAV9載體展示腦、小腦、腦膜、脊髓及背根神經節中細胞之廣泛轉導。與在小鼠中所作出之觀察類似，亦在比格犬之肝中檢測到GFP，其中轉導平均3.7%之肝細胞。參見Haurigot等人，上文文獻。重要的是，CSF內投與編碼溶酶體酶磺醯胺酶(其缺陷導致MPSIIIA)之AAV9載體在經治療犬之CSF中產生持續酶量。CSF浸潤CNS，此使得酶可用於不同的CNS結構。實際上，將重組酶定期遞送至CSF係目前處在MPSIIIA之臨床研究下之治療策略。參見NCT01155778及NCT01299727，clinicaltrials.gov。

已使用同一方法來說明本發明AAV 9載體之潛在效能。

向4隻成年比格犬(犬1-4)之大池投與總劑量為6.5×10¹²vg之AAV9-CAG-cocNaglu載體。為評估預存免疫對可藉由治療達成之CSF N-乙醯葡萄糖胺苷酶α活性程度之影響，藉由在CSF遞送前6週全身投與1×10¹¹vg/kg非編碼空AAV9載體對彼等犬中之兩者(犬3及4)實施免疫。截至腦池內投與載體之時間，未經處理之犬之循環及CSF中具有低抗AAV9中和抗體(NAb)效價，如對先前未暴露於野生型或重組病毒之動物所預期。相比之下，經預免疫之犬之循環中具有高NAb效價，但CSF中具有較低量，該觀察與穿過血腦障壁之NAb之不對稱分佈相容。參見圖18A及Haurigot等人，上文文獻。向大池投與AAV9-CAG-cocNaglu載體可顯著增加在來自所有4隻犬之CSF樣品中量測到之酶活性，且存在或不存在預存免疫無顯著差異。參見圖18B。酶活性程度在第2週與第3週之間出現峰值且此後達到穩態程度。重要的是，CSF中之N-乙醯葡萄糖胺苷酶α活性之此增加係長效的(>4個月)。參見圖18B。

<110> 西班牙商艾斯提夫博士實驗股份有限公司巴塞隆納歐都諾瑪大學

<120> 用於治療溶酶體貯積病之腺相關病毒載體

<130> TW2212.5

<150> EP14382171

<151> 2014-05-14

<160> 24

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 743

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

<210> 2

<211> 2232

<212> DNA

<213> 智人

<400> 2

<210> 3

<211> 2232

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> cohNaGlu核苷酸序列

<400> 3

<210> 4

<211> 646

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CAG核苷酸序列

<400> 4

<210> 5

<211> 8461

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pAAV-CAG-hNaGlu核苷酸序列

<400> 5

<210> 6

<211> 8467

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pAAV-CAG-cohNaGlu核苷酸序列

<400> 6

<210> 7

<211> 8472

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pAAV-CAG-comNaGlu核苷酸序列

<400> 7

<210> 8

<211> 8479

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pAAV-CAG-cocNaGlu核苷酸序列

<400> 8

<210> 9

<211> 4880

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> AAV9-CAG-hNaGlu核苷酸序列

<400> 9

<210> 10

<211> 4886

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> AAV9-CAG-cohNaGlu核苷酸序列

<400> 10

<210> 11

<211> 4891

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> AAV9-CAG-comNaGlu核苷酸序列

<400> 11

<210> 12

<211> 4898

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> AAV9-CAG-cocNaGlu核苷酸序列

<400> 12

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用於基因分型之正向引子

<400> 13

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用於基因分型之反向引子

<400> 14

<210> 15

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用於基因分型之反向引子突變

<400> 15

<210> 16

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用於量化之正向引子

<400> 16

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用於量化之反向引子

<400> 17

<210> 18

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用於量化之探針

<400> 18

<210> 19

<211> 2244

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> cohNaglu-形式2 CDS序列

<400> 19

<210> 20

<211> 8467

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pAAV-CAG-cohNaglu-形式2序列

<400> 20

<210> 21

<211> 4886

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> AAV9-CAG-cohNaglu-形式2序列

<400> 21

<210> 22

<211> 2244

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> cohNaglu-形式3 CDS序列

<400> 22

<210> 23

<211> 8467

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pAAV-CAG-cohNaglu-形式3序列

<400> 23

<210> 24

<211> 4886

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> AAV9-CAG-cohNaglu-形式3序列

<400> 24

Claims

一種重組AAV9載體，其含有連接至編碼N-乙醯葡萄糖胺苷酶α SEQ ID NO：1之核苷酸序列之CAG啟動子SEQ ID NO：4。
如請求項1之AAV9載體，其中該編碼N-乙醯葡萄糖胺苷酶α SEQ ID NO：1之核苷酸序列與SEQ ID NO：2具有至少80%序列一致性。
如請求項1之AAV9載體，其中該編碼N-乙醯葡萄糖胺苷酶α SEQ ID NO：1之核苷酸序列與SEQ ID NO：3具有至少85%序列一致性。
如請求項1至2中任一項之AAV9載體，其中該編碼N-乙醯葡萄糖胺苷酶α SEQ ID NO：1之核苷酸序列係序列SEQ ID NO：2。
如請求項1至2中任一項之AAV9載體，其中該編碼N-乙醯葡萄糖胺苷酶α SEQ ID NO：1之核苷酸序列係序列SEQ ID NO：3。
如請求項1至2中任一項之AAV9載體，其中該編碼N-乙醯葡萄糖胺苷酶α SEQ ID NO：1之核苷酸序列係序列SEQ ID NO：19。
如請求項1至2中任一項之AAV9載體，其中該編碼N-乙醯葡萄糖胺苷酶α SEQ ID NO：1之核苷酸序列係序列SEQ ID NO：22。
如請求項1至2中任一項之AAV9載體，其用作藥劑。
如請求項1至2中任一項之AAV9載體，其用於增加身體中之N-乙醯葡萄糖胺苷酶α活性。
如請求項1至2中任一項之AAV9載體，其用於治療黏多糖貯積病、較佳IIIB型黏多糖貯積病。
一種質體，其含有與SEQ ID NO：2具有至少80%序列一致性之編碼N-乙醯葡萄糖胺苷酶α SEQ ID NO：1之核苷酸序列。
如請求項11之質體，其中該質體係登錄號為DSM 26626之pAAV- CAG-cohNaglu，其含有編碼N-乙醯葡萄糖胺苷酶α SEQ ID NO：1之核苷酸序列SEQ ID NO：3。
如請求項11之質體，其中該質體係登錄號為DSM 28568之pAAV-CAG-hNaglu，其含有編碼N-乙醯葡萄糖胺苷酶α SEQ ID NO：1之核苷酸序列SEQ ID NO：2。
如請求項11之質體，其中該質體係登錄號為DSM 32043之pAAV-CAG-cohNaglu-形式2，其含有編碼N-乙醯葡萄糖胺苷酶α SEQ ID NO：1之核苷酸序列SEQ ID NO：19。
如請求項11之質體，其中該質體係登錄號為DSM 32044之pAAV-CAG-cohNaglu-形式3，其含有編碼N-乙醯葡萄糖胺苷酶α SEQ ID NO：1之核苷酸序列SEQ ID NO：22。
如請求項11至15中任一項之質體，其用作藥劑。
如請求項11至15中任一項之質體，其用於增加身體中之N-乙醯葡萄糖胺苷酶α活性。
如請求項11至15中任一項之質體，其用於治療黏多糖貯積病、較佳IIIB型黏多糖貯積病。
一種醫藥組合物，其包含治療有效量之如請求項1至10中任一項之重組AAV9載體或如請求項11至17中任一項之質體。
如請求項19之醫藥組合物，其用於靜脈內或腦池內投與。
一種如請求項1至10中任一項之重組AAV9載體或如請求項11至17中任一項之質體的用途，其用於製造用來增加身體中之N-乙醯葡萄糖胺苷酶α活性的藥劑。
一種如請求項1至10中任一項之重組AAV9載體或如請求項11至17中任一項之質體的用途，其用於製造用來治療黏多糖貯積病、較佳IIIB型黏多糖貯積病之藥劑。
一種產生如請求項1之載體之方法，其包含以下步驟： i)提供第一載體，其包含編碼插入第一AAV末端重複與第二AAV末端重複之間的所關注蛋白質之序列、可操作地連接至該編碼所關注蛋白質之序列之CAG啟動子；第二載體，其包含來自血清型9之AAV rep基因及AAV cap基因；及第三載體，其包含腺病毒輔助功能基因；ii)使用步驟i)之該等載體共轉染勝任細胞；iii)培養步驟ii)之該等經轉染細胞；及iv)自步驟iii)之培養物純化該等表現載體。
一種經分離細胞，其包含與SEQ ID NO：2具有至少80%序列一致性之編碼N-乙醯葡萄糖胺苷酶α SEQ ID NO：1之核苷酸序列。