CN111587289B - 一种新型药品递送系统及其提供方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种提供药品递送系统(特别是用于穿过血脑屏障(BBB)、包含衍生自John Cunningham病毒(JCV)的病毒样颗粒(VLP))的方法、药品递送系统和可通过所述方法获得的VLP。该方法包括将VLP解装配成五聚体并重装配成VLP的步骤。

Description

一种新型药品递送系统及其提供方法
发明领域
本发明涉及一种提供药品递送系统(DDS)(特别是用于穿过血脑屏障(BBB)、包含衍生自John Cunningham病毒(JCV)的病毒样颗粒(VLP))的方法、药品递送系统和可通过所述方法获得的含VLP和VLP的新组合物。
发明背景
血脑屏障(BBB)是血液和大脑之间的高选择性和通透性膜。该屏障用于将循环血液与中枢神经系统(CNS)中的脑细胞外液(BECF)分开。BBB在性质上具有高选择性，并且通过被动扩散仅允许脂溶性分子、水和某些气体通过。该屏障还选择性地转运对于神经功能而言是必需的分子(例如葡萄糖和氨基酸)。此外，BBB阻碍亲脂性潜在神经毒素进入大脑。
在生理条件下，BBB有效地起到基本上防止不需要的物质进入CNS的作用。由于BBB，大的纳米治疗剂和绝大多数小分子(估计有98％的小分子)被限制进入大脑。因此，在生理(健康)条件下，BBB的功能是非常宝贵的。然而，在需要用药物产品治疗CNS的CNS疾病或任何其他疾病的情况下，BBB则构成有效治疗的主要障碍。
除了成功地将药物产品(药品、货物(cargo))穿过BBB进行转移的问题之外，必须注意那些在CNS递送期间可能遇到的问题。即使药物产品穿过BBB，它也可能不以治疗相关浓度存在。此外，脑组织中的某些酶可以使药物产品失活，使其无效或效果较差。因此，药物产品可能能够穿过BBB，但一旦进入脑内就能够被解构。
已知几种策略用于影响药物产品的穿过BBB的转运。药物产品确实能够渗入大脑的程度因策略而异。一种策略是增加BBB的通透性。因此，不仅可以增加穿过BBB的药物产品的量，而且可以使药物产品的游离形式和结合形式都穿过屏障。
增加BBB通透性的方法包括渗透开放或化学开放。高渗性可能是渗透开放，当直接施加于其表面时，高渗性能够破坏BBB。化学开放是一种更具选择性和可控性的增加BBB通透性的方法。当血管活性白三烯治疗用于增加其通透性时，正常毛细血管似乎不受影响。脑肿瘤毛细血管对这些治疗更敏感。研究表明，缓激肽可以打开脑肿瘤毛细血管，而不会影响正常大脑中的毛细血管。
脑血管舒张或聚焦超声辐射代表了用于增加BBB通透性的其他方法。脑血管舒张是指扩张血管以增加脑血流量的过程。聚焦超声辐射即低频(例如260kHz)、MRI引导的超声可以引起该屏障的局部和可逆破坏。
将药物产品转运到CNS的另一种方法是使用基于衍生自John Cunningham病毒(JCV)的病毒样颗粒(VLP)的药品递送系统。VLP装载有药物(“货物”)。这种药品递送系统在WO 2013/131644A1中公开。其描述了在静脉内施用后，VLP可以在没有事先操作的情况下穿过BBB，从而将药品与VLP一起跨生理学上完整的BBB进行转运。用于制备包含来自JCV的VLP的药品递送系统的方法是WO 2013/017272 A1的主题。
WO 2013/131644 A1的公开内容提供了来自JCV的VLP在体内穿过生理学上完整的BBB的第一个实验证据。因此，装载有药物产品的来自JCV的VLP是用于进入CNS的有希望的药品递送系统。但是，仍然需要进一步提高该系统的功效。
发明概述
因此，本发明的目的是提供一种基于衍生自John Cunningham病毒(JCV)的VLP的药品递送系统，特别是用于将药物产品递送到CNS中，其具有改善的功效。特别是改进的功效意味着更多的货物到达CNS。改善的功效可能有可发生相互作用的多种原因。更高的功效可以例如是由于VLP更有效地穿过BBB，因此更大量的VLP和/或货物进入CNS。同样可以归因于在到达CNS后货物从VLP的改进释放。此外，更高的功效的原因可以是每个单独的VLP可以装载更大量的货物或者可以增加装载的VLP的总量。
本发明人惊奇地发现，当制备所述药品递送系统的方法包括两个将VLP解装配成五聚体并将五聚体重装配成VLP的步骤时，可以提供包含衍生自JCV的VLP并具有改善功效的药品递送系统。该方法包括以下步骤
a)提供包含JCV的VP1蛋白的组合物，
b)将a)的组合物的VP1蛋白暴露于诱导VP1装配成VLP的条件，
c)将b)的组合物的VLP暴露于将VLP解装配成五聚体的条件，
d)将c)的组合物的五聚体暴露于诱导五聚体重装配成VLP的条件，
e)将d)的组合物的VLP暴露于将VLP解装配成五聚体的条件，
f)将e)的组合物的五聚体暴露于货物和诱导五聚体装配成有货物的VLP的条件。
当药品递送系统的货物是萤光素酶表达质粒Nano时，通过萤光素酶的表达增加证明了通过根据本发明的方法可获得的药品递送系统的改善功效(下面的实施例1，图1)。因此，另外，显示了本发明的药品递送系统对于作为货物递送核酸的合适性。
实施例1还证明了步骤f)中获得的VLP有效地穿过BBB(下面的实施例1，图2和3)。因此，提供了证据，即VLP可以用作药品递送系统，用于将药品转运到CNS中。
此外，已发现步骤d)中获得的VLP特别适合于储存。它们保留-80℃的储存条件超过24小时。在储存后，可以进一步处理VLP以提供药品递送系统。因此，它们在制造包含与货物相关的VLP的药品递送系统期间代表合适的可储存中间产物。
因此，在一个特定方面，本发明涉及一种为VLP提供增加的储存合适性的方法。出于实际原因，这种VLP基本上促进了药品递送系统的生产。它允许大规模制造VLP，然后在没有货物的情况下进行中间储存。在储存之后，根据个人客户的要求，可以进一步处理储存的VLP并装载所需的货物。因此，步骤d)中提供的VLP的中间储存使得基于VLP的药品递送系统的制造过程具有更大的灵活性。
此外，已发现根据本发明的VLP是稳定的。它们的稳定性可以与VLP等同比较，后者是VP1生产和直接后续装配的结果，即没有解装配/重装配步骤(图6)。由此得出结论，令人惊讶的是，根据本发明的两个解装配和重装配步骤对VLP的稳定性没有负面影响。
在另一方面，本发明涉及包含VLP的药品递送系统或组合物。
进一步令人惊讶地发现，通过分两步重装配步骤d)的五聚体可以改善包含VLP的组合物的同质性(homogeneity)，其中第一步包括诱导步骤c)的五聚体的聚集，第二步包括将五聚体与诱导五聚体聚集的条件分开(下面的实施例3，图7和8)。
包含VLP的组合物的均匀尺寸分布是有利的，因为其允许产生确定的VLP群体用作药品递送系统，其对于满足限定的质量标准是重要的。
附图简要说明
图1在用根据本发明制备的VLP(两轮的解装配和重装配)或者已经解装配和重装配仅一次的VLP(现有技术)转染的胶质母细胞瘤细胞中测量的萤光素酶活性
图2作为单培养物的BBB模型的设置(A)和根据本发明制备的VLP的通透性(B)
图3作为共培养物的BBB模型的设置(A)和根据本发明制备的VLP的通透性(B)
图4根据本发明的VLP(在两轮的解装配/重装配之后)相对于现有技术的VLP(在一轮的解装配和重装配之后)以及中间储存的TEM图像
图5其中VLP中间储存的根据本发明的VLP(在两轮的解装配和重装配之后)(A)，进行一轮的解装配和重装配、中间储存五聚体的VLP(B)和新制备的VLP(C)的FFF-MALS分析。
图6新制备的VLP和其中中间储存的根据本发明的VLP(两轮的解装配和重装配)的nDSF分析
图7显示根据本发明步骤d)的VLP的PDI的DLS分析，其中在储存前存在或不存在诱导五聚体的聚集
图8显示根据本发明步骤d)的VLP的平均直径的DLS分析，其中在储存前和储存后存在或不存在诱导五聚体的聚集
图9用不同低温添加剂储存的VLP的nDSF分析(A)和萤光素酶活性(B)
发明详述
在本发明的第一方面，并非设计提供包含衍生自John Cunningham病毒(JCV)的病毒样颗粒(VLP)的药品递送系统的方法，其包括以下步骤：
a)提供包含VP1蛋白的组合物，
b)将a)的组合物的VP1蛋白暴露于诱导VP1装配成VLP的条件，
c)将b)的组合物的VLP暴露于将VLP解装配成五聚体的条件，
d)将c)的组合物的五聚体暴露于诱导五聚体重装配成VLP的条件，
e)将d)的组合物的VLP暴露于将VLP解装配成五聚体的条件，
f)将e)的组合物的五聚体暴露于货物和诱导五聚体装配成与货物缔合的VLP的条件。
在本发明的上下文中，为了便于解释，步骤b)得到的VLP也可称为“pVLP”(一级VLP)。由步骤d)得到的VLP也可称为“rVLP”(重装配的VLP)。作为步骤f)的结果的VLP也可以称为“cVLP”(货物VLP)。
根据本发明的第二方面，本发明涉及组合物，其包含衍生自John Cunningham病毒(JCV)的病毒样颗粒(VLP)，其特征在于一个或多个以下参数：
a.多分散指数(PDI)小于0.3，优选小于0.2，优选小于0.1，更优选0.01至0.09，
b.至少70％的VLP的平均直径为20nm至70nm，优选为30nm至70nm，更优选为35nm至65nm，更优选为40至60nm，
c.组合物中的VLP含量为至少80％(v/v)，优选至少85％(v/v)，优选至少90％(v/v)，优选至少95％(v/v)。
在第三方面，本发明涉及可通过本发明的方法获得的药品递送系统。药品递送系统可用于治疗和/或诊断方法，优选用于治疗神经病症。因此，本发明还涉及用根据本发明的药品递送系统治疗病症、特别是CNS疾病的方法。治疗方法优选包括将药品递送系统施用于有需要的受试者的步骤。
药品递送系统优选具有改善的功效。VLP可以穿过BBB而不用事先增加BBB的通透性。因此，本发明的药品递送系统可用于治疗CNS疾病的方法，其中该方法不包括增加待治疗的受试者的BBB的通透性的步骤。优选地，将本发明的药品递送系统施用于未接受损害或破坏BBB的任何化学或物理治疗的患者。
在本发明的第四方面，本发明涉及可通过包括本发明的方法的步骤a)至e)和进一步将e)组合物的五聚体暴露于诱导五聚体装配成VLP的条件的步骤的方法获得的衍生自John Cunningham病毒(JCV)的病毒样颗粒(VLP)。这些VLP是不带有货物的。它们作为疫苗特别有用。
在本发明的第五方面，提供了包含衍生自John Cunningham病毒(JCV)的病毒样颗粒(VLP)的组合物，其包含盐和缓冲液，pH为7.0-8.0，优选约7.5。该组合物优选包含：
a.120mM至170mM NaCl，优选150mM NaCl，
b.1至5mM CaCl2，优选2mM CaCl2，和
c.5至30mM Tris-HCl，优选10至25mM Tris-HCl，更优选10mM Tris-HCl。
该组合物允许在生理条件下处理VLP。在这些条件下，VLP基本上保持完整，优选它们基本上保持其衣壳结构。如果装载有货物，它们基本上保持与货物缔合(associate)。它特别适合作为用于将VLP静脉内施用于受试者、特别是人的药物组合物。
在本发明的又一方面，提供了包含VLP的组合物，其具有至少一种，优选所有以下特征(“目标参数”)：
表1：VLP和含VLP组合物的优选特征。
AUC＝曲线下面积
在本发明的上下文中，术语“药品递送系统”是指用于将药物产品施用于有需要的受试者、特别是人或动物的组合物。有利地，药品递送系统能够将包含在其中或附着于其上的药物产品递送至感兴趣的部位，优选在人或动物中。优选地，递送对目标具有选择性，即更多的药物产品被递送至目标而不是递送至身体或器官的其他部位。
“用于CNS的药品递送系统”意指药品递送系统选择性地靶向CNS。CNS是指脊髓和脑，特别是脑。术语“脑”包括其解剖学部分，例如额叶、顶叶、颞叶、枕叶和小脑。
本发明的药品递送系统可以通过各种途径施用，包括口服、皮肤、鼻或肺途径或注射。特别优选的是允许药物产品全身作用的剂型。在具体实施方案中，本发明的药品递送系统通过口服或肠胃外施用，特别是静脉内施用。
本发明的药品递送系统包含衍生自John Cunningham病毒(JCV)的病毒样颗粒(VLP)。“JC病毒”或John Cunningham病毒(JCV；NCBI Taxonomy 10632)是人多瘤病毒。JCV具有二十面体对称性，直径约45nm，由72个VP1五聚体组成。还存在少量结构蛋白VP2和VP3。
在本发明的上下文中，“病毒样颗粒”(VLP)被定义为具有由病毒结构蛋白或修饰的病毒结构蛋白或衍生自病毒结构蛋白的蛋白质组成的壳(也称为衣壳)的复制缺陷颗粒。根据本发明的VLP衍生自JCV，即其壳由病毒结构蛋白或修饰的病毒结构蛋白或衍生自JCV的病毒结构蛋白VP1、VP2和VP3、特别是衍生自VP1的蛋白组成。
在本发明特别优选的实施方案中，壳中唯一的病毒结构蛋白是VP1蛋白。在最优选的实施方案中，VLP的壳由VP1蛋白组成，即壳不含任何其他蛋白。
病毒结构蛋白，特别是VP1，装配成五聚体结构(五聚体)。根据本发明，VLP壳优选由几种VP1蛋白、特别是几种VP1五聚体、尤其是72个VP1五聚体组成。
在本发明的上下文中，“五聚体”是当五种多肽(例如VP1蛋白)装配时形成的结构。装配成五聚体可能是由于多肽之间形成共价键或非共价键。多肽通常形成具有五边形对称性的环状结构。在五聚体中，每个多肽亚单位优选与两个相邻的亚单位相互作用。
根据本发明的“肽”可以由优选通过肽键连接的任何类型的任何数量的氨基酸、优选天然存在的氨基酸组成。特别地，肽包含至少3个氨基酸，优选至少5个、至少7个、至少9个、至少12个或至少15个氨基酸。肽的长度没有上限。然而，优选地，根据本发明的肽的长度不超过500个氨基酸、优选400、300、250、200、150或120个氨基酸。超过约10个氨基酸的肽也可称为“多肽”。
VLP的结构蛋白(特别是VP1)与JCV的天然结构蛋白相同或衍生自JCV的天然结构蛋白。“修饰的或衍生的”包括一个或多个氨基酸的插入、缺失或取代，同时保留VP1装配成衣壳的功能。
在一个实施方案中，可以修饰天然(JCV)结构蛋白，以优化VLP的产生、其细胞靶向谱和特异性或其细胞内靶向谱或特异性。修饰或衍生可以包括编码结构蛋白，特别是VP1的核苷酸序列的密码子优化，以增强蛋白质翻译。
根据本发明的术语“VP1”或“病毒蛋白1”是指与JCV的天然VP1相同或衍生自JCV的天然VP1并且能够装配成衣壳的蛋白质。
根据本发明的术语“VP1”包括与根据SEQ ID NO：1的氨基酸序列就该序列而言具有至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少95％、更优选至少97％、更优选至少98％或至少99％的氨基酸序列同一性的蛋白质。在本发明最优选的实施方案中，VP1具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列。
根据本发明的术语“VP1”还包括天然VP1的部分。优选地，所述VP1的部分包含根据SEQ ID NO：1的氨基酸序列的至少氨基酸32至316或其与根据SEQ ID NO：1的氨基酸位置32至316就该序列而言具有至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少95％、更优选至少97％、更优选至少98％或至少99％的氨基酸序列同一性的衍生物。
在本发明的优选实施方案中，VP1具有与根据SEQ ID NO：1的氨基酸序列在其整个长度上为至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少95％、优选至少99％相同的氨基酸序列。在本发明最优选的实施方案中，VP1具有与根据SEQ ID NO：1的氨基酸序列相同的氨基酸序列。
在本发明的另一实施方案中，VP1具有与根据SEQ ID NO：3的氨基酸序列在其整个长度上为至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少95％、优选至少99％相同的氨基酸序列。在一个实施方案中，VP1的氨基酸序列与SEQ ID NO：3的氨基酸序列相同。
在一个实施方案中，VP1蛋白的核苷酸序列与SEQ ID NO：2的核苷酸序列在其整个长度上具有至少70％、更优选至少80％、更优选至少90％同一性，优选是SEQ ID NO：2的核苷酸序列。
在本发明的另一实施方案中，VP1蛋白的核苷酸序列与SEQ ID NO：4的核苷酸序列在其整个长度上具有至少70％、更优选至少80％、更优选至少90％同一性。在一个实施方案中，VP1蛋白的核苷酸序列与SEQ ID NO：4的核苷酸序列相同。
序列如表2所示。
表2：VP1蛋白的氨基酸和核苷酸序列。
在本发明的优选实施方案中，VP1具有与根据SEQ ID NO：1的氨基酸序列在其整个长度上至少90％相同的氨基酸序列。
在本发明的优选的实施方案中，VP1蛋白的核苷酸序列与SEQ ID NO：2的核苷酸序列在其整个长度上具有至少80％同一性。
JCV的结构蛋白(优选VP1)可以在例如大肠杆菌或昆虫细胞中表达。根据本发明的优选实施方案，结构蛋白(优选VP1)在昆虫细胞中表达。这是有利的，因为与来自JCV的野生型蛋白质在大肠杆菌中的表达相比，昆虫细胞中的表达导致较少的修饰，例如翻译后修饰。
根据本发明的VLP还可在衣壳中包含一种或几种另外的异源蛋白质，即与JCV蛋白质不相同或衍生自JCV蛋白质的蛋白质。例如，异源蛋白质可以锚定在衣壳中，即该蛋白质的至少一部分优选可从外部接近。原则上，任何蛋白质都适合作为这样的异源蛋白质，只要异源蛋白质可以掺入衣壳中并且基本上不干扰VLP的装配。
在根据本发明的药品递送系统中使用的VLP与货物缔合。这意味着货物与VLP可逆结合。这可以是例如或者是由于与衣壳的任何部分的物理化学相互作用或附着或通过将货物掺入衣壳中。掺入可以是完全的或不完全的。在本发明的特别优选的实施方案中，货物总量的主要部分完全掺入衣壳中。最优选的是货物完全包封在VLP的衣壳中。
在本发明的上下文中，“VLP包含货物”的表述与VLP“与货物缔合”的表述同义使用。VLP与货物的缔合可以是VLP与货物“装载”或“包装”的结果。
“装载”是指导致VLP和货物缔合的任何过程，例如，通过渗透冲击或通过将VP1或VP1五聚体与货物一起装配到VLP中。“装载的VLP”是由此过程产生的VLP。术语“包装”涉及通过将VP1或VP1五聚体与货物一起装配到VLP中来装载VLP的过程。由此产生的VLP称为“包装的”VLP。
在本发明的上下文中，术语“货物”用于与VLP缔合的任何药物产品。术语药物产品在本发明的上下文中与术语“药品”可互换使用。
药物产品是治疗或诊断物质。它可以具有任何化学性质，只要它与VLP缔合即可。优选地，药物产品是活性药物成分(API)，特别是“小分子”(优选≤1000道尔顿的有机化合物)、生物品或细胞抑制剂。在优选的实施方案中，生物品选自蛋白质、肽或核酸，特别是选自编码所需蛋白质的核酸，例如mRNA、cDNA、质粒或载体、抑制性核酸例如siRNA或miRNA等酸和具有催化活性的核酸如核酶。
在另一个实施方案中，根据本发明的VLP装载有选自以下的货物：单克隆抗体、抗精神病药、镇痛药、血栓溶解剂、抗抑郁药、免疫调节剂、免疫抑制剂、乙酰胆碱酯酶抑制剂、谷氨酸受体拮抗剂或调节剂、例如NMDA受体拮抗剂、精神兴奋剂、抗痴呆药、抗焦虑药、促智药、代谢增强剂、代谢调节剂、神经保护药、抗炎药、细胞抑制剂和细胞因子。
在特别优选的实施方案中，货物是核酸、特别是适用于RNA干扰(RNAi)或基因治疗的核酸、抗体、细胞抑制剂或细胞因子，更优选货物是核酸例如质粒或抗体。在最优选的实施方案中，货物是核酸，例如质粒。术语“抗体”包括抗体或其片段，以及抗体-药物偶联物(ADC)
优选地，货物是质粒。
在一个实施方案中，核酸(优选质粒)包含基因。在货物包含基因的情况下，其在CNS靶细胞中的表达优选是瞬时的。因此，根据本发明最优选的实施方案，药品递送系统包含与包含基因的质粒缔合的VLP，而CNS疾病的治疗通过所述基因在待治疗的受试者的靶细胞中的瞬时表达来实现。
根据本发明，将某些物质(例如VP1、五聚体、VLP)暴露于影响某物的条件(例如诱导装配)的表述是指将所考虑的物质(例如VP1、五聚体、VLP)带入可能导致这种特定效果的条件(例如诱导装配)。这种暴露可以通过改变材料的条件来进行，例如，通过使材料与不同的缓冲液、盐或pH等接触。这可以通过向包含该材料的组合物中添加某物或反之亦然，或者通过将该材料与该组合物分离，然后将该材料添加到不同的组合物中。
通过改变温度、辐射等也可以实现条件的改变。当然，可以组合和/或重复这种用于改变条件的手段。诱导所需效果的其他合适条件，例如VP1或五聚体装配成VLP和/或诱导VLP聚集，也是本领域技术人员所熟知的。这同样适用于暴露于相应条件的合适持续时间；这可以通过本领域技术人员的普通手段找到。
“将某物暴露于影响某物的条件”这一表达并不要求待实现该效果，即：即并非所有材料都必须实现所考虑的效果。例如，“诱导五聚体聚集的条件”基本上意味着条件适合诱导聚集。它并不要求所有五聚体都聚集在一起。
如本文所用，术语“装配”或“装配成VLP”是指所考虑的结构(VP1蛋白或五聚体)缔合并产生VLP的衣壳。如果VP1用作起始材料，则装配成VLP可以包括事先形成五聚体，这意味着VP1蛋白可以首先形成五聚体然后形成VLP，或者它们可以直接装配成VLP。装配成VLP是可逆的。
进而，术语“解装配”指当VLP的衣壳至少部分地分解成五聚体结构和/或结构蛋白时的过程。可以通过升高温度、通过添加蛋白酶和/或通过减少用于形成VLP的分子间相互作用(例如分子间二硫键)(例如通过添加还原剂或添加螯合剂)来诱导解装配。这些条件还可包括逐步暴露于一种条件。例如，可以在温度升高之前使组合物与还原剂接触。
诱导VP1和/或五聚体装配成VLP的方法通常是本领域技术人员已知的(Goldmannet al.(J.Virol.1999；73(5):4465-69)；DE 195 43553A1)。这同样适用于将VLP解装配成五聚体。因此，本领域技术人员知道控制VLP的装配和解装配的方法。
在本发明的一个实施方案中，含有VP1或五聚体的组合物中Ca2+离子的浓度用于控制VLP的装配/解装配。例如，为了诱导装配，可以增加游离Ca2+离子的浓度。如果需要解装配，可以通过向组合物中加入螯合剂来降低游离Ca2+离子的浓度。
诱导装配的另一种选择是增加VP1五聚体的浓度，以便于装配成VLP，例如通过减少包含五聚体的组合物中的溶剂。这可能需要改变碱土金属例如Ca2+或Mg2+的浓度。
根据本发明的优选实施方案，使VLP暴露于分子间二硫键还原的条件下，例如通过将VLP暴露于还原条件可以诱导解装配。在优选的实施方案中，该步骤在另外存在螯合剂的情况下完成。更优选地，通过在螯合剂存在下和任选地在升高的温度下将VLP暴露于还原条件来诱导解装配。
在本发明的具体实施方案中，VLP暴露于包含DTT和EDTA和/或EGTA的组合物，优选在15℃至30℃、优选20℃至25℃的温度下，最优选温度约为23℃。
根据本发明的优选实施方案，c)组合物的五聚体暴露于诱导其聚集的条件。如果在步骤d)之前执行，则该步骤是最合适的。在优选的实施方案中，至少20％的材料(例如五聚体)聚集，优选至少30％，更优选至少40％。
令人惊讶地发现，该步骤可以导致VLP的更均匀的尺寸分布(图7和图8)。这允许更好的质量管理和标准化，如果VLP用于药品递送系统，这是最重要的。因此，该附加程序优选地是药物输送系统的质量控制要求的一部分。
术语“聚集体”是指任何颗粒结构。“聚集”是指导致聚集体的过程。这个过程是可逆的。
五聚体或VLP的聚集可以通过与对照相比增加组合物中VLP的平均颗粒尺寸来确定。较大的粒度可通过标准方法测定，例如动态光散射(DLS)。
根据本发明的具体实施方案，五聚体或VP1的聚集可以由本领域已知的一种或多种试剂诱导，以促进蛋白质沉淀(沉淀剂)。因此，根据本发明，最优选使用沉淀剂。
“沉淀剂”是指促进VP1或五聚体聚集的试剂。沉淀剂的概念通常是本领域技术人员已知的。沉淀剂通常用于促进蛋白质的浓缩和纯化。沉淀可以是改变溶剂的溶剂化潜力的结果，更具体地，通过降低蛋白质的溶解度。通过将组合物的pH调节至蛋白质的等电点也可以降低溶解度。此外，降低组合物的温度也能够降低蛋白质的溶解度。
可能的沉淀剂例如是聚乙二醇(PEG)或醇，例如乙醇，和盐。后者被本领域技术人员称为“盐析剂”。
优选地，根据本发明，沉淀剂是盐。最优选的是包含称为“Hofmeister系列”的离子的盐。Hofmeister系列描述了就其影响所述蛋白质在溶液中的溶解度的能力而言，离子对特定蛋白质的疏水作用的排序。对蛋白质施加疏水作用的离子是特别优选的。在此，这种离子称为亲电离子。
包含至少一种亲电阴离子或阳离子的沉淀剂是优选的。优选的阴离子选自柠檬酸盐(C6H5O7 3-)、磷酸盐(PO4 3-)、硫酸盐(SO4 2-)、磷酸氢盐(HPO4 2-)、磷酸二氢盐(H2PO4-)、碘酸盐(IO3 -)、氢氧化物(OH-)、氟化物(F-)、溴酸盐(BrO3 -)或乙酸盐(CH3COO-)或其组合，更优选的阴离子是柠檬酸盐、磷酸盐或硫酸盐，最优选的阴离子是硫酸盐。
优选的阳离子是铵或季铵化合物(NR4 +，其中R是烷基或芳基)，例如四甲基铵((CH3)4N+)或二甲基铵((CH3)2N2 +)。进一步优选的阳离子选自包括钾(K+)、铯(Cs+)、铷(Rb+)或锂(Li+)或其组合，特别优选的是季铵化合物或铵，最优选的是铵。
因此，盐优选包含阴离子和阳离子，所述阴离子和阳离子选自柠檬酸盐(C6H5O7 3-)、磷酸盐(PO4 3-)、硫酸盐(SO4 2-)、磷酸氢盐(HPO4 2-)、磷酸二氢盐(H2PO4-)、碘酸盐(IO3 -)、氢氧化物(OH-))、氟化物(F-)、溴酸盐(BrO3 -)或乙酸盐(CH3COO-)、季铵化合物(NR4 +)，其中R是烷基或芳基，优选四甲基铵((CH3)4N+)或二甲基铵((CH3)2N2 +)、铵(NH4 +)、钾(K+)、铯(Cs+)、铷(Rb+)或锂(Li+)，优选包含SO4 2-和/或NH4 +。
根据优选实施方案，盐选自(NH4)2SO4、K2SO4、Na2SO4、(NH4)2HPO4、K2HPO4和Na2HPO4。最优选的盐是硫酸铵((NH4)2SO4)。
根据本发明，五聚体的聚集可以通过任何使五聚体与沉淀剂接触的方法诱导，例如通过将沉淀剂加入到包含五聚体的组合物中，或反之亦然，即将包含五聚体的组合物加入到沉淀剂中。还可以采用其它方式，例如透析使沉淀剂通过扩散到达五聚体。
根据本发明的一个优选实施方案，通过对包含沉淀剂的组合物(例如包含硫酸铵的组合物)进行透析来诱导五聚体的聚集。
根据本发明特别优选的实施方案，含有五聚体用于聚集的组合物具有0.3至5M、优选至多4M的硫酸铵浓度，甚至更优选在1.8至2.2M之间的浓度。最优选约2M。
诱导五聚体聚集的步骤优选具有至少1小时，更优选至少5小时，甚至更优选至少12小时，最优选至少16小时的持续时间。优选该步骤的持续时间小于24小时。在优选的实施方案中，该步骤的持续时间为14至19小时。在最优选的实施方案中，该步骤的持续时间为16至18小时。在此期间，五聚体暴露于诱导聚集的条件，特别是它们与硫酸铵接触。
在诱导五聚体聚集的步骤之后，有利的是在本发明的方法中包括将五聚体与用于诱导聚集的条件分开的步骤。适用于这种步骤的方法没有特别限制；本领域技术人员已知的允许五聚体与聚集诱导条件分开的任何方法都适用。
在本发明的优选实施方案中，五聚体与通过透析诱导其聚集的条件分开。如果通过使用沉淀剂诱导五聚体的聚集，则可以使用透析。也可以有利地应用透析原理以使五聚体与沉淀剂接触。最优选的是，如果根据本发明的方法包括至少两个透析步骤：步骤c)的组合物针对包含沉淀剂的组合物的第一次透析，和诱导聚集后针对基本上不含沉淀剂的组合物的第二次透析。
用于将五聚体与沉淀剂分开的透析优选是针对至少类似于生理条件的组合物。这样的组合物优选包含盐并且pH为6至8.5，优选6.5至8.5，更优选7至8，最优选7.2至7.5，特别是7.5。组合物的重量克分子渗透压浓度优选为280至310mosmol/l，最优选308mosmol/l。该组合物可以例如具有0.8至0.92％(w/v)、优选0.9％(w/v)的盐水(氯化钠)浓度。
将五聚体与用于诱导聚集的条件分开优选进行至少1小时，更优选进行至少5小时，12小时，更优选进行至少18小时，更优选进行约24小时或更长时间。更长的时间周期也是可能的，尤其取决于已被诱导聚集的五聚体的浓度、包含五聚体的组合物和沉淀剂的性质和浓度。在优选的实施方案中，将包含聚集的五聚体的组合物针对与生理条件相似的组合物透析约24小时。
该组合物优选还含有缓冲液。合适的缓冲系统是本领域技术人员已知的。在本发明的优选实施方案中，组合物包括TRIS缓冲液、HEPES缓冲液、磷酸盐缓冲液或碳酸氢盐缓冲液系统。最优选的是TRIS缓冲液。
在最优选的实施方案中，该组合物包含10mM Tris-HCl和150mM NaCl，pH为7.5。
为了便于将五聚体装配成VLP，组合物可进一步包含二价离子，例如Ca2+、Mg2+、Ba2 +、Cu2+、Fe2+、Zn2+或其组合。最优选的是Ca2+，例如CaCl2。在优选的实施方案中，组合物包含1至3mM CaCl2，优选2mM CaCl2。
在本发明的非常优选的实施方案中，至少与生理条件相似的组合物包含10mMTris-HCl，150mM NaCl和2mM CaCl2，pH为7.5。
在本发明的另一个方面，令人惊讶地发现，与五聚体的储存相比，VLP(rVLP)的储存是有利的(图4和图5)。如果储存五聚体并随后解冻和重装配，则主要形成“微小”颗粒以及聚集体。这些VLP不适用于药品递送系统的生产。然而，在储存后已经解离和重装配的VLP形成特别均匀的尺寸足够的VLP群。因此，在本发明的一个实施方案中，组合物提供有平均直径为20nm至70nm，优选为30nm至70nm，更优选为35nm至65nm，更优选为40至60nm的颗粒。均匀的尺寸分布对于满足质量控制要求是重要的。
在优选的实施方案中，根据本发明的方法包括储存来自步骤d)的组合物的VLP的步骤。将VLP保存在约-80℃至约4℃的温度下可持续至少10小时，15小时，20小时，优选至少24小时。可以储存超过3天。
在优选的实施方案中，VLP储存在低于0℃的温度下(冷冻)。可以使用不同的冷却速率进行冷冻。例如，通过施加约-1℃/分钟的冷却速率可以发生“缓慢”冷冻，而快速冷冻可以通过使样品接触来进行，即将包含该组合物的容器与液氮接触或将样品置于-80℃的冰箱中。
在优选的实施方案中，在包含低温添加剂的组合物中进行储存，所述低温添加剂优选选自多元醇、糖、无机盐、有机盐、氨基酸、聚合物、极端分解剂或其衍生物或组合。
在优选的实施方案中，无机盐包含硫酸根阴离子。包含硫酸根阴离子的优选盐是硫酸钾、硫酸钠、硫代硫酸钠、硫酸镁和硫酸铵。优选地，无机盐是硫酸铵。
氨基酸优选为甘氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸或丙氨酸。优选的氨基酸衍生物是甜菜碱。其他可能的低温添加剂是甘油、蔗糖、DMSO、依克多因或羟基依克多因。
已经发现，添加低温添加剂，特别是添加无机盐(例如包含硫酸根阴离子的盐，特别是硫酸铵)和/或氨基酸衍生物(例如甜菜碱)，对于VLP的稳定性和功能性或功效而言是有利的(图9)。如上所述，当使用VLP作为药品递送系统时，特别需要增强的稳定性和/或功能或功效。令人惊讶的是，在稳定性和功能性或功效方面，向步骤d)的组合物中添加低温添加剂对步骤f)的包装的VLP具有影响。
低温添加剂用于保护生物组织免受冻害(即由于结冰)。低温添加剂通常通过增加细胞中的溶质浓度来操作。然而，为了适合生物使用，它们必须易于渗透并且必须对细胞无毒。因此，这些添加剂适合于为五聚体和/或VLP提供更温和的储存条件。可以将冷冻添加剂补充到包含五聚体和/或VLP的组合物中以冷冻储存。
根据本发明的一个特别优选的实施方案，将冷冻添加剂加入到包含VLP的组合物中，用于随后在使用两个透析步骤(两步重装配)装配VLP(优选rVLP)后进行冷冻。
除基于多元醇的低温添加剂之外，合适的低温添加剂的摩尔浓度可以是0.5M、0.6M、0.7M、0.8M、0.9M、1M、1.1M、1.2M、1.3M、1.4M、1.5M、2M、3M、4M、5M。优选地，这些低温添加剂以约1M的摩尔浓度使用，优选以1M的摩尔浓度使用。
基于多元醇的低温添加剂可以以至少0.3M、至少0.4M、至少0.5M、至少0.6M、至少0.7M、至少0.8M、至少0.9M、至少1M、至少2M或至少3M的摩尔浓度使用。优选地，基于多元醇的低温添加剂，优选甘油5％，可以以约0.6M至0.7M的浓度使用，更优选地以0.68M的浓度使用。
或者，可以基于包含五聚体和/或VLP的组合物的体积百分比添加基于多元醇的低温添加剂。合适的体积百分比包括3％(v/v)、4％(v/v)、5％(v/v)、6％(v/v)、7％(v/v)、8％(v/v)、9％(v/v)或10％(v/v)。优选地，以5％(v/v)加入基于多元醇的低温添加剂。
在本发明的优选实施方案中，步骤c)的五聚体和/或步骤d)的VLP进行纯化。在本发明的上下文中，术语“纯化”是指从复杂组合物中分离或分开VP1、五聚体或VLP。可能的方法包括沉淀、错流过滤、色谱法例如制备色谱法、优选尺寸排阻色谱法和/或动态光散射法(DLS)。
术语“色谱法”是指通过在固定相和流动相之间分配其各个组分来分开物质混合物的方法。特别地，色谱法是指通过首先将目标物质结合并富集到固定相中，然后在第二步骤中洗脱(色谱的结合-洗脱模式)或通过将杂质结合到固定相并且在流穿中增加目标分子的纯度(流穿模式)来纯化物质的方法。
可以根据流动相中包含的分析物与固定相的相互作用的基础对色谱进行分组。根据本发明的优选类型的色谱法包括“反相”色谱法、“离子交换”色谱法、“亲和力”色谱法或尺寸排阻色谱法(SEC)。在离子交换色谱中，纯化方法可以根据固定相中存在的电荷进一步分开成阳离子交换色谱(CEX)(其中固定相带负电荷，从而保留带正电荷的分子)和阴离子交换色谱(AEX)(其中固定相具有正电荷，从而保留带负电荷的分子)。
特别地，色谱法可用于纯化通过根据本发明的方法获得的rVLP作为中间产物。特别地，AEX可用于纯化rVLP。
AEX中使用的固定相可以基于由固定相中存在的交换材料提供的“强阴离子交换剂”和“弱阴离子交换剂”所提供的离子相互作用的强度进一步描述。表述“阴离子交换剂”或“阴离子交换基质”是同义词并且都指天然或人造物质，其可以结合阴离子并且可以将这些阴离子交换为来自周围介质的阴离子。阴离子交换剂携带正离子并交换带负电的抗衡离子。
可以用核酸酶进一步处理本发明的VLP和/或进行无菌过滤。如果核酸用作货物，优选进行核酸酶处理。不同的核酸酶是本领域技术人员已知的并且包括例如benzonase核酸酶。用于无菌过滤的方法尤其包括使用适于除去杂质的过滤器的渗滤或超速离心。
根据本发明的又一方面，提供了包含衍生自John Cunningham病毒(JCV)的病毒样颗粒(VLP)的组合物，其特征在于一个或多个以下参数：
a.多分散指数(PDI)小于0.3，优选小于0.2，优选小于0.1，更优选0.01至0.09，
b.至少70％的VLP的平均直径为20nm至70nm，优选为30nm至70nm，更优选为35nm至65nm，更优选为40至60nm，
c.组合物中的VLP含量为至少80％(v/v)，优选至少85％(v/v)，优选至少90％(v/v)，优选至少95％(v/v)。
颗粒尺寸分布可以评估为“多分散指数”(PDI)。PDI表示组合物中粒径的分布，因此描述了颗粒的均匀性(uniformity)。PDI值可以使用不同方法获得，包括凝胶渗透色谱/尺寸排阻色谱、流变学、溶液粘度、膜渗透或光散射。
PDI优选地通过动态光散射(DLS)确定。在DLS中，原生分布是强度分布，其指示从各个“片(slice)”散射多少光。DLS允许从分布的统计数据确定平均尺寸和该平均尺寸的标准偏差。相对多分散性可以通过将标准偏差除以平均值来确定。根据分布的相对多分散性，多分散指数(PDI)可以作为其平方导出。通过DLS获得的PDI值可以分组为单分散(PDI<0.1)组合物和多分散(PDI>0.1)组合物，由此在多分散组内，较小的值表示组合物内更均匀的分布。
根据本发明，PDI值优选为0.1至0.4。更优选PDI值为0.1至0.3，甚至更优选0.1至0.2。
包含VLP的组合物的平均直径可以通过视觉方法测量，例如显微镜检查，优选配备有软件以确定平均直径，但也可以通过分析光散射方法，例如DLS或纳米固定方法，例如NTA。
组合物中的VLP含量可以通过例如FFF-MALS和/或DLS测量。两种方法都可以区分正确尺寸的VLP和聚集体，“小粒”(小的颗粒)和其他杂质，例如盐、碎片或五聚体。
这种组合物特别满足通常施加于药品递送系统的要求。显然，这种组合物是均匀的并且具有高纯度。
在另一方面，本发明涉及可通过本发明的方法获得的药品递送系统。这种药品递送系统具有如上所述的优点。特别地，这样的药品递送系统可用于治疗和/或诊断方法，优选用于治疗神经病症，即CNS疾病。
因此，本发明还涉及用根据本发明的药品递送系统治疗病症、特别是CNS疾病的方法。治疗方法优选包括将药物递送施用于有需要的受试者的步骤。
本发明还涉及药品递送系统在制备用于治疗神经病症即CNS疾病的药物中的用途。治疗方法优选不包括增加待治疗受试者的BBB通透性的步骤。优选地，将本发明的药品递送系统施用于未接受损害或破坏BBB的任何化学或物理治疗的患者。
术语“CNS疾病”(或“神经病症”)是指个体神经系统的任何病症，优选中枢神经系统的病症。它包括神经退行性疾病、精神病性或神经血管疾病。
在本发明的一个实施方案中，神经障碍选自中风，酒精成瘾，阿尔茨海默病，焦虑，关节炎，虚弱，注意力缺陷多动障碍，双相情感障碍，癌症疼痛，脑缺血，脑神经保护剂，颈肌张力障碍，舞蹈病伴有亨廷顿舞蹈病，慢性疼痛，慢性严重疼痛，认知障碍，皮质性肌阵挛，退行性神经疾病，抑郁症，糖尿病性神经性疼痛，糖尿病性神经病变，情绪不稳定，癫痫，与嗜睡症相关的过度嗜睡，纤维肌痛，脆性X综合征，弗里德赖希的共济失调，失眠，LennoxGastaut综合征，重度抑郁和焦虑症，与双相情感障碍相关的躁狂发作，记忆障碍，偏头痛，轻度认知障碍，中度至重度疼痛，运动神经元疾病，多发性硬化，肌肉骨骼疼痛，发作性睡病，神经痛，神经性疼痛，尼古丁依赖，强迫症，阿片类药物引起的不良反应，阿片类药物引起的便秘，骨关节炎疼痛，膀胱过度活动症，疼痛，帕金森病，小儿流口水，外周糖尿病神经病变，术后疼痛，带状疱疹后神经痛，经前焦虑障碍，精神病，难治性复合物部分性癫痫发作，不宁腿综合征(RLS)，精神分裂症，癫痫发作，严重慢性疼痛，睡眠障碍，戒烟，痉挛，脊髓损伤，中风，转甲状腺素蛋白家族性淀粉样多发性神经病，创伤性脑损伤，眩晕，恶病质，肌萎缩侧索硬化，脊髓小脑I型共济失调，锥体外系和运动障碍，短暂性脑缺血发作(TIA)，进行性多灶性脑白质病变(PML)，HIV感染，痴呆，如阿尔茨海默病，血管性痴呆，额颞叶痴呆，语义性痴呆和路易体痴呆，并优选选自包含阿尔茨海默病、帕金森病和多发性硬化症的组或由其组成的组。
在本发明的进一步的方面，本发明涉及可通过包括本发明的方法的步骤a)至e)和进一步将e)组合物的五聚体暴露于诱导五聚体装配成VLP的条件的步骤的方法获得的衍生自John Cunningham病毒(JCV)的病毒样颗粒(VLP)。在最终装配步骤中不添加货物。这种VLP可特别用作疫苗。
在一个实施方案中，根据本发明的VLP穿过血脑屏障(BBB)。因此，在本发明的一个实施方案中，药品递送系统可用于穿过BBB递送药品。根据本发明，药品递送系统和/或VLP和/或VLP包装的药品可以穿过BBB。
重要的是，通过药品递送系统穿过BBB使得药品递送系统能够展示靶向脑内特定细胞群的功能，即将货物递送至靶细胞。在本发明的上下文中，所述药品递送系统包括递送至靶细胞和/或递送入靶细胞。
在优选的实施方案中，本发明的VLP和/或其货物在施用于待治疗的受试者、特别是人后，可在CNS中在少于10天、优选少于5天、更优选在施用后少于3天内检测到。药品递送系统优选静脉内施用于受试者。当使用VLP作为可靠的药品递送系统时，这是特别有利的。
优选地，该方法不需要丧失BBB的完整性或增加BBB的通透性。
体外BBB的完整性可通过已知方法测量，例如通过相对经内皮电阻测量(TEER)(Rempe et al.,Biochem Bioph Res Comm 2011,406(1):64-69)。建立了许多BBB的体外模型，包括不同共培养物中的原代牛或人脑内皮细胞，例如人脑内皮细胞系HBEC-5i。在体内，诸如CT扫描或MRI的成像方法可与造影剂一起使用以可视化BBB通透性。也可以使用功能成像，例如PET或SPECT。
根据本发明，在施用药品递送系统之前或同时不需要损害BBB的通透性。因此，BBB优选是生理学上完整的，这意味着与健康的天然状态相比，完整性不降低和/或通透性不增加。本发明的VLP优选穿过生理学上完整的BBB。
包含药品递送系统的组合物优选不需要可破坏BBB完整性的添加剂。因此，在本发明的最优选实施方案中，药品递送系统不含任何可影响BBB通透性的添加剂。
材料与方法
VLP制造
使用衍生自秋夜蛾(草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda))的Sf9昆虫细胞系(Thermo Fischer scientific)通过蛋白质表达制备病毒样颗粒(VLP)。通过用含有JohnCunningham病毒VP1-蛋白表达盒的重组杆状病毒感染细胞来产生VLP。通过使用Bac-to-杆状病毒表达系统(Thermo Fischer Scientific)制备重组杆状病毒。在3.4L生物反应器(INFORS HT Minifors)中，在7至10天后，在pH6.3下产生VLP。随时间控制空气流量和温度(26℃)。为了除去细胞和细胞碎片，将悬浮液在4℃，5,000g下离心，收获含有VLP的上清液。
之后，使用两种不同的浓缩方法浓缩VLP：用7.5％聚乙二醇(PEG)沉淀或用flowTM系统(GE Healthcare)错流。对于PEG沉淀，将澄清的上清液与PEG混合以达到7.5％(v/v)并在4℃下孵育2小时，之后通过在4℃，10,000g下离心分离沉淀物并悬浮在50mM NaCl，10mM Tris-HCl，pH 7.5中。使用配备有300kDa截留膜(/>300kDa ECO,Sartorius)的/>flowTM系统进行错流。流动超滤在1.5巴的恒定压力和8的因子(1L上清液对8L缓冲液)下进行。
通过使用5mM DTT和10mM EDTA在室温下70min将VLP进一步解离为五聚体，并使用HiScale CaptoQ柱(GE Healthcare)通过阴离子交换色谱(AEX)纯化五聚体，其中NaCl不连续梯度为150mM至1M NaCl。用250mM NaCl步骤洗脱五聚体。洗脱后，五聚体如下处理：
a)与货物混合并重装配(参见“用货物包装新鲜或储存的五聚物”)；
b)在-80℃下用5％甘油冷冻储存五聚体(随后可与货物混合并重装配，参见“用货物包装新鲜或储存的五聚物”)或
c)立即置于具有20kDa截留值的透析盒(Slide-A-LyzerTMG2透析装置，ThermoScientific)中，并通过透析(两步透析)通过两步重装配来进行重装配。首先，将五聚体针对2M硫酸铵缓冲液(“AS”,10mM Tris-HCl,150mM NaCl,2M(NH4)2SO4,pH 7.5)透析24小时，然后在接下来的24小时转移到10mM Tris-HCl,150mM NaCl,2mM CaCl2,pH 7.5(标准重缔合缓冲液，“ST”)(AS>ST)。或者，在两个步骤中用ST缓冲液进行两步透析(ST>ST)。在两种情况下，为了将未重装配的材料和聚集体与VLP分开，在使用Zetasizer ZS Nano(MalvernInc.)的动态光散射(DLS)的级分的多分散指数(PDI)的控制下，使用HiPrepTM S-500HR柱(GE Healthcare)通过尺寸排阻色谱(SEC)纯化包含VLP的组合物。选择具有目标大小的VLP级分并合并，然后在具有5kDa截留膜的/>浓缩器(Sartorius)中浓缩，如果适用，随后在-80℃下储存。
用货物包装重装配的VLP
对于重装配的VLP的VLP包装，将上述步骤c)的储存的VLP从-80℃取出并使用热振荡器(23℃，350rpm)解冻。随后，通过在解离缓冲液(20mM Tris-HCl,150mM NaCl,5mM DTT,和10mM EDTA)存在下在23℃和45rpm孵育样品15分钟来进行解冻的VLP样品的解离。在货物(例如核酸)存在下重装配解离的VLP。简而言之，将解离的VLP与适当浓度的货物充分混合，然后使用20kDa MWCO透析室(Slide-A-LyzerTM MINI透析装置,Thermo Scientific)针对标准重缔合缓冲液(10mM Tris-HCl,150mM NaCl,2mM CaCl2,pH7.5)透析混合物。4至6小时后，用新鲜的透析缓冲液替换透析缓冲液，并将样品再孵育16至18小时。在使用核酸作为货物的情况下，通过与40uNuclease(Merck)/25μg VLP和2.5mM MgCl2在37℃孵育1小时来消化未包装的核酸。在分析之前，将样品过滤(/>Spin-离心管过滤器；孔径0.22μm)。之后直接分析VLP和/或在-80℃下储存。
用货物包装新鲜或储存的五聚体
对于五聚体包装，将新鲜或在-80℃下储存的五聚体与货物直接混合并重装配或使用热振荡器(23℃，350rpm)解冻，然后在货物(例如核酸)存在下重装配。简而言之，将五聚体与适当浓度的货物充分混合，然后使用20kDa MWCO透析室(Slide-A-LyzerTM MINI透析装置,Thermo Scientific)针对标准重缔合缓冲液(10mM Tris-HCl,150mM NaCl,2mMCaCl2,pH7.5)透析混合物。在使用核酸作为货物的情况下，通过与40u Nuclease(Merck)/25μg重装配的VLP和2.5mM MgCl2在37℃孵育1小时来消化未包装的核酸。之后直接分析重装配的五聚体。
VLP/萤光素酶测定的功能测试
在装载有核酸的VLP(由新鲜或储存的五聚体制备；或来自重装配和纯化的VLP)的情况下，萤光素酶Nano质粒已用作货物。将胶质母细胞瘤细胞在补充10％FCS(Thermo Fisher)和1％Pen-Strep(PAN-Biotech)的900μl DMEM培养基，高葡萄糖，GutaMAXTM(Thermo Fisher)中预先接种24小时，密度为3×104。在添加样品之前，移除相应量的培养基以在每个孔中保持恒定量的培养基。将样品加入细胞中并在37℃和5％CO2下孵育48小时。之后，除去细胞培养基，用PBS洗涤细胞。根据制造商的说明书(Nano/>Luciferase Assay(Promega))测定萤光素酶活性。在/>多检测系统(Promega)中的白色96孔板(Greiner bio-one)中测量发光。
VLP表征
为了验证样品解离、重装配和稳定性，使用Zetasizer Nano ZS(Malvern.)测量样品的动态光散射(DLS)和多分散指数(PDI)。使用Zetasizer软件(版本7.11，Malvern)记录VLP尺寸和PDI。另外，使用Tycho NT.6(Nanotemper)通过nDSF评估每个样品的拐点温度。
为了分析样品组成，进行了不对称流场流分级法(AF4，Wyatt Inc.)。通过使用多角度光散射(MALS)、动态光散射(DLS)和UV检测器分析样品。
在Zeiss EM900电子显微镜的帮助下，在80kV的电压下操作，进行透射电子显微镜(TEM)分析，在不同的实验步骤中直接观察样品。对于该方法，预先使用2％乙酸双氧铀(Sigma Aldrich)将样品在碳涂覆的铜网格(Plano GmbH)上染色。
用于验证BBB通透的人工血脑屏障(BBB)模型
通过在双室人工BBB模型中使用单一培养(直接定量通透的荧光标记物质)或共培养(由靶细胞中的通透物质引起的蛋白质表达)评估VLP的BBB通透。
在两种情况下，预先将24孔通透性支持物(插件(insert)，0.4μm，CorningCostar)在37℃下用磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的1:20纤连蛋白(BioReagent)和1:75I型胶原蛋白(Merck Millipore)的混合物包被90分钟。在小心地除去多余的包被后，将包被的插件转移到装有900μl培养基(EndoGRO,SCME004,Merck Millipore)的新鲜24孔板(GreinerBio-One)中。将7.5×104个BBB细胞(HBEC-5i，脑微血管内皮)用200μl培养基接种到插件中。将细胞培养96小时至120小时，每隔一天在孔中更换培养基。
单一培养实验(荧光标记货物的通透)
将制备的插件小心地转移到每孔填充有900μl无酚培养基(DMEM/F-12，HEPES，无酚红，Thermo Fisher Scientific)的新鲜24孔板中。在样品添加至插件之前，移除相应量的培养基以在每个插件中保持恒定量的200μl培养基。在37℃下在培养箱中孵育120分钟后，将3×100μl的每个孔转移至黑色96孔板中，并使用酶标仪(Tecan Infinite M200，Tecan)测定样品的荧光。
为了确认BBB的形成，通过向插件中加入EDTA来破坏BBB。将插件转移到含有新鲜无酚培养基的24孔板中。将EDTA(cEnd＝5mM,约5μl)加入到插件中并在37℃下孵育90分钟。然后，如上所述测定荧光。
通过将携带BBB细胞的插件的荧光信号归一化至不含BBB细胞的合适插件来计算通透。以相同的方式，在添加EDTA后验证BBB的完整性。
共培养实验(通透材料的活性)
将插件转移至含有目标细胞(胶质母细胞瘤细胞)的新鲜24孔板，所述胶质母细胞瘤细胞在补充10％FCS(Thermo Fisher)和1％Pen-Strep(PAN-Biotech)的900μl DMEM，高葡萄糖，GutaMAXTM(Thermo Fisher)中预先接种24小时，密度为3×104。在样品(包装有Nano质粒的VLP)添加至插件之前，移除相应量的培养基以在每个插件中保持恒定量的200μl培养基。24小时后，从24孔板中取出插件并用PBS洗涤。因此，使用解剖刀切下膜(带有BBB细胞)并转移到1.5ml反应小瓶中。根据制造商的说明书(Nano/>Luciferase Assay(Promega))测定萤光素酶活性。
将小室(含有目标细胞)再孵育24小时，然后根据制造商的说明书(NanoLuciferase Assay(Promega))进行萤光素酶测定。
具有冷冻保护的储存
将每种低温添加剂甘油(Carl Roth)、蔗糖(Carl Roth)、硫酸铵(Carl Roth)、DMSO(Carl Roth)和甜菜碱(Merck)加入到VLP中，得到最终添加剂浓度为1M(除了甘油，其含5％(v/v)对应于0.68M)。另外，一个等分试样不含添加剂物质(w/o)。通过应用两种冷冻速度将样品分开并冷冻：将每个样品的一半以约为-1℃/min的冷却速率冷冻(缓慢冷冻)，而另一半通过将容器浸入液氮中快速冷冻(快速冷冻)。所有样品在-80℃下储存，储存期为1至10天。在23℃下解冻并以350rpm振荡后，将样品在室温下用10mM Tris-HCl,150mMNaCl,2mM CaCl2,pH 7.5透析2小时以降低添加剂浓度及其对分析结果的影响。通过Zetasizer Nanoseries(Malvern)测定粒径和PDI。使用Tycho NT.6(Nanotemper)测量拐点温度。储存后的VLP功能在Nano质粒包装和随后的Nano/>Luciferase assay(Promega)的帮助下得到证实。
实施例
实施例1：功能分析
比较了使用不同方法制备的VLP的货物递送功效(图1)。为此，产生VLP，其经历两轮解装配和随后的重装配或一轮解装配和随后的重装配(在两种方法中，在萤光素酶质粒存在下最后重装配)。值得注意的是，与进行一轮解装配和随后的重装配并与“仅质粒”和“仅细胞”对照进行比较的VLP相比，经历两轮解装配和随后的重装配的VLP的萤光素酶活性显著增加。
接下来，分析了根据本发明制备的VLP穿透血脑屏障(BBB)的能力(图2)。图2A显示了用于在单一培养设置中测试VLP或质粒(圆圈)的BBB通透的人工血脑屏障(BBB)模型的设置。将人脑内皮细胞(BBB细胞，HBEC-5i)铺在可通透的支持物上。图2B显示与“仅质粒”对照相比，经历两轮解装配和随后的重装配(在荧光标记的质粒存在下的第二次重装配)的VLP的通透性。黑色柱代表完整BBB的实验。白色柱表示人工破坏的BBB(通过添加EDTA)的实验。引人注目的是，根据本发明制备的VLP能够以比裸质粒显著更大的比例穿过BBB。破坏BBB层的完整性破坏了这种差异，显示了根据本发明制备的VLP的选择性、有效的通透能力。
为了评估根据本发明产生的VLP向目标细胞的递送功效，使用共培养BBB模型(图3)。图3A显示了用于测试VLP或质粒(圆圈)的BBB通透和由共培养装置中靶细胞中的通透材料引起的随后蛋白质表达的人工BBB模型的设置。图3B显示了在插件中存在的BBB细胞(在HBEC-5i细胞中)中测量的萤光素酶活性和在通透后目标细胞中的萤光素酶活性。测试了人工BBB(“包被+BBB细胞”)和没有BBB细胞的包被(“仅包被”)。仅在存在细胞时并且当萤光素酶质粒包装到根据本发明制备的VLP中时(与仅质粒比较)测量插件的细胞的萤光素酶活性(因此，“仅包被”样品未显示出预期的任何萤光素酶活性)。目标细胞的萤光素酶活性也仅在具有根据本发明方法制备的VLP的样品中测量(与仅质粒比较)，无论BBB细胞层是否存在或仅存在包被。
因此，根据本发明制备的VLP能够有效地通过BBB，同时保持高感染性和货物递送能力。样品(包装)是指经历两轮解装配和随后的重装配(在萤光素酶质粒存在下进行第二次重装配)的VLP。
实施例2：储存五聚体vs.储存VLP
为了研究包含经过不同储存程序的负载VLP的组合物的同质性和均匀性，进行透射电子显微镜(TEM)。将通过一轮解装配和随后的重装配(五聚体冷冻，左)产生的VLP与通过两轮解装配和随后的重装配(VLP冷冻，右)产生的VLP进行比较(图4)。在后一种情况下产生的VLP显示出明显更均匀的分布，因为与VLP相比，它们缺乏任何可见的缺陷病毒颗粒结构，其中五聚体在制造过程中被冷冻。
为了进一步研究如图4中产生的负载VLP的同质性，进行FFF-MALS分析(图5)。将两个样品与作为参考的新制备的VLP(没有货物，因此没有解装配/重装配)进行比较。引人注目的是，与参考(图5C)相比，在两轮解装配和随后的重装配以及VLP的中间冷冻(图5A)之后产生的VLP显著降低了组合物中存在的VLP聚集体的量。此外，VLP的分布更均匀。VLP的尺寸和“小粒”和“盐、碎片、五聚体”的存在是可比较的。
值得注意的是，当在一轮解装配和随后的重装配(五聚体冷冻)后产生VLP时，可以鉴定出非常少的结构完整的VLP(图5B)。因此，本发明的方法允许中间储存的VLP作为重装配的VLP并且产生高度均匀的装载VLP群，其中几乎没有聚集体。给出的百分比不包括聚集体。
为了进一步表征与新制备的VLP(没有货物，因此没有解装配/重装配，“样品(wt)，虚线”)相比的在两轮解装配和随后的重装配VLP的中间冷冻(“样品(包装)”，实线)后产生的VLP的稳定性，进行nDSF分析以显示解链温度(拐点温度)(图6)。值得注意的是，两种VLP样品的解链曲线几乎不可区分，表明根据本发明方法制备的VLP与新制备的VLP同样稳定。
实施例3：在重装配之前诱导聚集
接下来，测量在五聚体重装配成VLP期间诱导聚集的效果。通过DLS分析同质性(图7和8)。图7显示了透析后通过诱导聚集(白色柱)和没有诱导聚集(黑色柱)获得的VLP的PDI。通过首先诱导聚集的重装配的VLP显示与没有诱导聚集的重装配的VLP相比PDI显著降低。因此，在重装配期间诱导聚集导致均匀得多的尺寸分布。两个样品在冷冻前取出(因此，它们进行了一轮解装配和重装配)。
图8显示了通过DLS测定的如图7制备的样品(图8，左)和经历相同重装配条件但随后的冷冻步骤的样品(图8，右)的平均尺寸分布。已经通过诱导聚集的重装配的两个样品(实线)显示非常均匀的尺寸分布，而未经历聚集步骤的样品(虚线)显示至少两个VLP群。更进一步地，冷冻步骤对后一样品显然是有害的，因为已经重装配而没有诱导聚集的包含VLP的组合物在冷冻后已经变得更加不均匀。然而，已经通过诱导聚集而重装配的VLP可以冷冻而不会对样品的均匀性产生任何影响。
实施例4：低温添加剂的作用
为了进一步仔细检查样品储存对VLP的影响，将不同的低温添加剂加入到包含VLP的组合物中，所述组合物在一轮解装配和随后的重装配和两个包括AS缓冲液透析步骤(用于在重装配期间诱导聚集)后冷冻(图9)。图9A显示了如nDSF分析所描绘的装载VLP的稳定性。值得注意的是，与其他低温添加剂相比，已经储存在包含硫酸铵的缓冲液中的VLP相当稳定(即显示出更高的拐点温度)。有趣的是，这种作用与VLP是快速冷冻(黑色柱)还是缓慢冷冻(虚线柱)无关。
在下一步中，将这些样品用于萤光素酶测定(图9B)。出乎意料的是，储存在包含硫酸铵的组合物中VLP强烈增加萤光素酶活性。与没有低温添加剂的样品和其他测试的低温添加剂相比，甜菜碱也是有利的。因此，使用低温添加剂(尤其是硫酸铵)显著提高了VLP的稳定性，并增加了装载VLP的感染性和货物递送功效。再次，这种作用与VLP是快速冷冻(黑色柱)还是缓慢冷冻(白色柱)无关。
序列表
<110> 纽卫制药有限公司
<120> 一种新型药品递送系统及其提供方法
<130> 60 168 K
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 354
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自JC病毒
<400> 1
Met Ala Pro Thr Lys Arg Lys Gly Glu Pro Lys Asp Pro Val Gln Val
1 5 10 15
Pro Lys Leu Leu Ile Arg Gly Gly Val Glu Val Leu Glu Val Lys Thr
20 25 30
Gly Val Asp Ser Ile Thr Glu Val Glu Cys Phe Leu Thr Pro Glu Met
35 40 45
Gly Asp Pro Asp Glu His Leu Arg Gly Phe Ser Lys Ser Ile Ser Ile
50 55 60
Ser Asp Thr Phe Glu Ser Asp Ser Pro Asn Arg Asp Met Leu Pro Cys
65 70 75 80
Tyr Ser Val Ala Arg Ile Pro Leu Pro Asn Leu Asn Glu Asp Leu Thr
85 90 95
Cys Gly Asn Ile Leu Met Trp Glu Ala Val Thr Leu Lys Thr Glu Val
100 105 110
Ile Gly Val Thr Ser Leu Met Asn Val His Ser Asn Gly Gln Ala Thr
115 120 125
His Asp Asn Gly Ala Gly Lys Pro Val Gln Gly Thr Ser Phe His Phe
130 135 140
Phe Ser Val Gly Gly Glu Ala Leu Glu Leu Gln Gly Val Val Phe Asn
145 150 155 160
Tyr Arg Thr Lys Tyr Pro Asp Gly Thr Ile Phe Pro Lys Asn Ala Thr
165 170 175
Val Gln Ser Gln Val Met Asn Thr Glu His Lys Ala Tyr Leu Asp Lys
180 185 190
Asn Lys Ala Tyr Pro Val Glu Cys Trp Val Pro Asp Pro Thr Arg Asn
195 200 205
Glu Asn Thr Arg Tyr Phe Gly Thr Leu Thr Gly Gly Glu Asn Val Pro
210 215 220
Pro Val Leu His Ile Thr Asn Thr Ala Thr Thr Val Leu Leu Asp Glu
225 230 235 240
Phe Gly Val Gly Pro Leu Cys Lys Gly Asp Asn Leu Tyr Leu Ser Ala
245 250 255
Val Asp Val Cys Gly Met Phe Thr Asn Arg Ser Gly Ser Gln Gln Trp
260 265 270
Arg Gly Leu Ser Arg Tyr Phe Lys Val Gln Leu Arg Lys Arg Arg Val
275 280 285
Lys Asn Pro Tyr Pro Ile Ser Phe Leu Leu Thr Asp Leu Ile Asn Arg
290 295 300
Arg Thr Pro Arg Val Asp Gly Gln Pro Met Tyr Gly Met Asp Ala Gln
305 310 315 320
Val Glu Glu Val Arg Val Phe Glu Gly Thr Glu Glu Leu Pro Gly Asp
325 330 335
Pro Asp Met Met Arg Tyr Val Asp Lys Tyr Gly Gln Leu Gln Thr Lys
340 345 350
Met Leu
<210> 2
<211> 1065
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自JC病毒
<400> 2
atggctccca ccaagcgcaa gggcgagccc aaggaccccg tgcaagtgcc caagctgctg 60
atccgtggtg gtgtcgaggt gctggaagtc aagaccggcg tggactccat taccgaggtg 120
gagtgcttcc tcacccccga gatgggtgac cctgacgagc acctgagggg cttctccaag 180
tccatctcca tctccgacac cttcgagtcc gactccccca accgtgacat gctgccctgc 240
tactccgtgg ctcgtatccc cctgcccaac ctgaacgagg acctgacttg cggcaacatc 300
ctgatgtggg aggctgtgac cctcaagacc gaggtcatcg gcgtgacttc cctgatgaac 360
gtgcactcca acggccaggc tacccacgac aacggtgctg gcaagcccgt gcagggaacc 420
tccttccact tcttctccgt gggtggcgag gctctggaac tccagggcgt ggtgttcaac 480
taccgtacca agtaccccga cggcaccatc ttccccaaga acgctactgt gcagtcccaa 540
gtgatgaaca ccgagcacaa ggcttacctg gacaagaaca aggcctaccc cgtggagtgc 600
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<211> 354
<212> PRT
<213> JC病毒
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35 40 45
Gly Asp Pro Asp Glu His Leu Arg Gly Phe Ser Lys Ser Ile Ser Ile
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agatacgttg acaaatatgg acagttgcag acaaaaatgc tgtaa 1065

Claims (6)

1.提供包含衍生自John Cunningham病毒(JCV)的病毒样颗粒(VLP)的药品递送系统的方法，其包括以下步骤：
a)提供包含VP1蛋白的组合物，其中VP1蛋白来源于JCV并且与根据SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少80％的氨基酸序列同一性，并且VP1蛋白能够装配成衣壳，
b)将a)的组合物的VP1蛋白暴露于诱导VP1装配成VLP的条件，
c)将b)的组合物的VLP暴露于将VLP解装配成五聚体的条件，
d)将c)的组合物的五聚体暴露于诱导五聚体重装配成VLP的条件，
e)将d)的组合物的VLP暴露于将VLP解装配成五聚体的条件，
f)将e)的组合物的五聚体暴露于货物和诱导五聚体装配成与货物缔合的VLP的条件。
2.根据权利要求1所述的方法，包括将来自步骤d)的组合物的VLP在约为-80℃的温度储存至少24小时。
3.根据权利要求2所述的方法，其中在包含硫酸铵或甜菜碱作为低温添加剂的组合物中进行储存。
4.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中对步骤b)的VLP、步骤c)的五聚体和/或步骤d)的VLP进行纯化。
5.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中VP1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
6.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中VP1蛋白的编码核苷酸序列是SEQ IDNO：2的核苷酸序列。
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