BR102019026837A2 - vlp para o tratamento de uma doença de depósito lisossômico - Google Patents

Abstract

A presente invenção refere-se a partículas semelhantes a vírus (VLPs) associadas a uma enzima lisossômica ou a um vetor de expressão que codifica uma enzima lisossômica que é usada em um método para o tratamento de uma doença de depósito lisossômico. A invenção também se refere a uma composição farmacêutica para uso em um método para o tratamento de uma doença de depósito lisossômico, a um vetor de expressão que codifica uma enzima lisossômica e a um método para associar uma VLP a um vetor de expressão que codifica uma enzima lisossômica.

Description

VLP PARA O TRATAMENTO DE UMA DOENÇA DE DEPÓSITO LISOSSÔMICO

[0001] A presente invenção refere-se a partículas semelhantes a ví-rus (VLP) associadas a uma enzima lisossômica ou a um vetor de expressão que codifica uma enzima lisossômica que são utilizadas em um método para o tratamento de uma doença de depósito lisossômico em um indivíduo em necessidade de tratamento, preferencialmente, um hu-mano. A invenção também se refere a uma composição farmacêutica para uso em um método para o tratamento de uma doença de depósito lisossômico, a um vetor de expressão que codifica uma enzima lisossômica e a um método de associar uma VLP a um vetor de expressão que codifica uma enzima lisossômica.

[0002] As doenças de depósito lisossômico (LSD) são um grupo de cerca de 50 doenças hereditárias. A LSD envolve principalmente a dis-função das hidrolases lisossômicas, que resultam em degradação pre-judicada do substrato. Como uma consequência, o material celular incompletamente processado se acumula em vários tipos de tecidos, e ocorrem manifestações clínicas específicas da doença.

[0003] Além da degradação do substrato, os lisossomas estão envolvidos na homeostase energética, geração de blocos de construção para o crescimento celular, sinalização mitogênica, iniciação dos tecidos para angiogênese e formação de metástase e ativação de programas transcricionais.

[0004] Um exemplo de uma doença de depósito lisossômico é a leu-codistrofia metacromática (MLD). A MLD é caracterizada por uma atividade diminuída da arilsulfatase A (ASA) causada por mutações no gene ASA que afetam o metabolismo dos esfingolipídios. Sem AAS, os sulfa-tídeos se acumulam em muitos tecidos do corpo, destruindo eventualmente a bainha de mielina do sistema nervoso. Os sintomas envolvem atrasos no desenvolvimento, fraqueza, rigidez museular, deterioração mental, demêneia e cegueira.

[0005] Existem três subtipos elínieos de MLD, com base na idade do indivíduo (humano) no iníeio dos primeiros sintomas (van Rappard e outros, Best Praet Res Clin Endoerinol Metab. 2015; 29 (2): 261-73).

[0006] A "forma infantil tardia" tem iníeio tipieamente antes dos 30 meses de idade da criança. Ela é earaeterizada pelo rápido aeúmulo de sulfatídeos e progressão da regressão psieomotora. A morte geralmente oeorrealguns anos após o iníeio dos sintomas. Nenhuma enzima funei-onal está presente.

[0007] Na "variante juvenil", os sintomas eomeçam entre os 2,5 e os 16 anos de idade. No iníeio, a progressão da doença é mais lenta do que na forma infantil tardia, mas uma vez que os sinais neurológieos se tornam mais evidentes, o deelínio é rápido e os paeientes aeabam perdendo todas as habilidades. O estágio final da doença pode durar vários anos, e sua duração é variável. A maioria dos paeientes tem um alelo ASA que permite a expressão de baixas quantidades de enzima funeio-nal.

[0008] A "variante adulta" tem um iníeio insidioso após os 16 anos de idade. A progressão da doença é geralmente mais lenta do que na forma infantil e juvenil. A morte ocorre décadas após o iníeio da doença. Os paeientes carregam duas mutações, permitindo a expressão de baixas quantidades de enzima funeional, o que atrasa o processo de aeú-mulo de sulfatídeos e, portanto, o aparecimento da doença.

[0009] As seguintes abordagens terapêutieas genéticas foram dis-eutidas na téenica anterior para o tratamento de MLD:

• - transplante de medula óssea de células-tronco hematopoié-ticas autólogas geneticamente modifieadas que envolvem a readminis-tração de células-troneo da medula óssea de um paeiente genetieamente modificadas usando vetores lentivirais para expressão estável de ASA
• - terapia celular envolvendo a entrega de células recombinantes microencapsuladas que superexpressam o gene ASA
• - terapia gênica in vivo, ou seja, a entrega de um vetor adenoviral otimizado (ou ) ou lentiviral que codifica hASA diretamente no SNC para fornecer correção a longo prazo, sustentada e persistente do defeito genético (Rosenberg e outros, J Neurosci Res. 2016; 94 (11 ): 1169-79).

[0010] As seguintes abordagens terapêuticas não genéticas foram discutidas na técnica anterior para o tratamento de MLD:

• - terapia de reposição enzimática envolvendo injeção intravenosa, intracerebroventricular ou intratecal da enzima ASA
• - terapia com células-tronco hematopoiéticas envolvendo cé-lulas-tronco hematopoiéticas de doadores que atravessam a barreira hematoencefálica (BBB) e diferenciam-se em células da microglia para produzir ASA de ocorrência natural
• - terapias baseadas em pequenas moléculas, por exemplo, aplicação de N-butildeoxinojirimicina (NB-DNJ) miglustat (Zavesca®, Actelion Pharmaceuticals Ltd, Allschwil, Suiça) ou Warfarin (coumadin)
• - terapia de redução de substrato.

[0011] Essas tentativas de tratamento são bastante inespecificas, o que significa que os fármacos não visam especificamente o SNC, mas são igualmente distribuidos pelo corpo do paciente após a administração. Além disso, surgem preocupações de segurança quando, por exemplo, vetores virais são administrados.

[0012] Portanto, existe a necessidade de terapias seguras e eficazes para o tratamento de doenças de depósito lisossômico. É assim um objetivo da presente invenção fornecer meios para uma nova terapia para o tratamento de doenças de depósito lisossômico, em particular de MLD, que supere ao menos uma destas restrições.

[0013] Os inventores descobriram que partículas semelhantes a ví-rus (VLPs), mais especificamente VLPs do vírus JC, associadas a uma enzima lisossômica ou a um vetor de expressão que codifica uma enzima lisossômica, preferencialmente incorporando uma enzima lisossômica ou incorporando um vetor de expressão codificando uma enzima lisossômica, são particularmente adequadas para o tratamento de doenças de depósito lisossômico, tal como MLD. As VLPs de acordo com a invenção podem ser utilizadas para a entrega eficaz de enzimas lisos-sômicas funcionais ou plasmídeos que codificam essas enzimas no SNC em um paciente em necessidade de tratamento. Para conseguir isso, de acordo com a invenção, as VLPs estão associadas a uma enzima lisossômica ou a um vetor de expressão que codifica uma enzima lisossômica, cuja ausência ou atividade reduzida é responsável pelo tratamento de LSD.

[0014] As VLPs de acordo com a invenção podem efetivamente atravessar a barreira hematoencefálica (BBB), vantajosamente mesmo que a BBB esteja fisiologicamente intacta. Portanto, a VLP associada a uma enzima lisossômica ou a um vetor de expressão que codifica uma enzima lisossômica pode efetivamente entregar a enzima lisossômica ou o vetor de expressão que codifica a enzima lisossômica no SNC.

[0015] Os inventores encontraram mRNA de ASA no cérebro de camundongos após a administração intravenosa da VLP de acordo com a invenção. Eles também encontraram a proteína ASA no cérebro depois disso. Desse modo, pode-se concluir que, com a administração de VLPs de acordo com a invenção, a atividade da enzima lisossômica no SNC pode ser aumentada. A atividade da enzima lisossômica aprimorada permite o tratamento eficaz das doenças de depósito lisossômico; se a enzima lisossômica é ASA, o tratamento de MLD torna-se possível.

[0016] Surpreendentemente, verificou-se que as VLPs de acordo com a invenção visam especificamente ο SNC, ou seja, elas não se dis-tribuem igualmente pelo corpo depois de terem sido administradas ao paciente, por exemplo, por via intravenosa. Isso significa que uma proporção maior de VLPs de acordo com a invenção é encontrada no SNC do que fora do SNC.

[0017] As VLPs de acordo com a invenção tem como alvo particular astrócitos, oligodendrócitos, neurônios e / ou microglia. Um alvo especificamente preferencial das VLPs da invenção são os oligodendrócitos.

[0018] As VLPs de acordo com a invenção também são estáveis e homogêneas, o que é especialmente importante para uso clínico, pois permite um melhor gerenciamento da qualidade e padronização do produto de fármaco.

[0019] Assim, foi demonstrado pelos inventores que as VLPs, em particular, as VLPs do vírus JC, associada a uma enzima lisossômica ou a um vetor de expressão que codifica uma enzima lisossômica pode ser usada para fornecer um tratamento eficaz e seguro de LSD, em particular de MLD.

[0020] Verifico u-se também que as VLPs derivadas de JCV com uma eficácia aprimorada podem ser fornecidas, quando o método para a produção da dita VLP compreende duas vezes as etapas de desmontar as VLPs em pentâmeros e remontar os pentâmeros em uma VLP.

[0021] O método de incorporação de uma enzima lisossômica, preferencialmente arilsulfatase humana A, ou incorporação de um vetor de expressão que codifica uma enzima lisossômica, preferencialmente arilsulfatase humana A, em uma VLP compreende, de preferência, as seguintes etapas:

• a) fornecer uma composição compreendendo proteínas VP1,
• b) expor as proteínas VP1 da composição de a) a condições que induzem a VP1 a se montar em VLPs,
• c) expor as VLPs da composição de b) a condições de desmontar as VLPs em pentâmeros,
• d) expor os pentâmeros da composição de c) a condições que induzam os pentâmeros a remontar nas VLPs
• e) expor as VLPs da composição de d) a condições de desmontagem das VLPs em pentâmeros,
• f) expor os pentâmeros da composição de e) à enzima lisos-sômica ou ao vetor de expressão a condições que induzem a montagem dos pentâmeros em uma VLP associada à enzima lisossômica ou ao vetor de expressão.

[0022] Uma eficácia aprimorada significa, em particular, que mais carga, isto é, em particular, a enzima lisossômica, de preferência a arilsulfatase A humana, ou um vetor de expressão que codifica uma enzima lisossômica, de preferência a arilsulfatase A humana, atinge o SNC. A eficácia aprimorada pode ter vários motivos, que podem interagir. A maior eficácia pode, por exemplo, ser devida a um cruzamento mais eficaz da BBB pela VLP, de modo que uma quantidade maior de VLPs e / ou carga entre no SNC. Também pode ser devido a uma liberação aprimorada da carga das VLPs depois de chegar ao SNC. Além disso, uma razão para a maior eficácia pode ser o fato de que cada VLP individual pode ser carregada com uma quantidade maior de carga ou a quantidade total de VLP carregada pode ser aumentada.

[0023] A eficácia aprimorada das VLPs obtidas pelo método de acordo com a invenção ou de um sistema de entrega de fármaco obtido pelo método de acordo com a invenção é exemplificativamente demonstrada pelo au mento da expressão de luciferase, quando a carga da VLP é o plasmídeo de expressão de luciferase NanoLuc® (Exemplo 11 abaixo, Figura 11).

[0024] O Exemplo 11 fornece ainda evidências de que a VLP obtida na etapaf) atravessa eficientemente a BBB (Exemplo 11 abaixo, Figuras 12 e 13). Com isso, são fornecidas evidências de que as VLPs podem ser usadas como um sistema de entrega de fármaco para o transporte de um fármaco para o SNC.

[0025] Além disso, verificou-se que as VLPs obtidas na etapa d) são particularmente adequadas para armazenamento. Eles suportam condições de armazenamento de -80° C por um período superior a 24 h. Após o armazenamento, a VLP pode ser processada posteriormente, por exemplo, para fornecer o sistema de entrega de fármaco. Portanto, elas representam um produto intermediário armazenável adequado durante a fabricação de um sistema de entrega de fármaco compreendendo as VLPs associadas a uma carga.

[0026] Em um aspecto particular, portanto, a invenção refere-se a um método para fornecer às VLPs uma maior adequabilidade ao armazenamento. Essas VLPs, por razões práticas, facilitam substancial-mente a produção do sistema de entrega de fármaco. Elas permitem a fabricação em larga escala de VLP e, então, seu armazenamento intermediário sem carga. Após o armazenamento, sob demanda do cliente individual, as VLPs armazenadas podem ser processadas e carregadas com a carga desejada. Portanto, o armazenamento intermediário das VLPs fornecidas na etapa d) permite mais flexibilidade no processo de fabricação de um sistema de entrega de fármaco com base nas VLPs.

[0027] Além disso, verificou-se que as VLPs de acordo com a invenção são estáveis. Sua estabilidade pode ser comparada igualmente com às VLPs que são resultado da produção de VP1 e de uma montagem subsequente direta, isto é, sem uma etapa de desmontagem / remontagem (Figura 16). Resulta então que as duas etapas de desmontagem e remontagem de acordo com a invenção, surpreendentemente, não têm um impacto negativo na estabilidade das VLPs.

[0028] Em ainda outro aspecto, a invenção refere-se a um sistema de entrega de fármaco ou uma composição compreendendo VLPs.

[0029] Foi ainda surpreendentemente descoberto que a homogeneidade da composição compreendendo VLPs pode ser melhorada remontando os pentâmeros da etapa d) em duas etapas, enquanto a primeira etapa compreende induzir a agregação dos pentâmeros da etapa c) e a segunda etapa compreende separar os pentâmeros das condições que induzem a agregação dos pentâmeros (Exemplo 13 abaixo, Figuras 17 e 18).

[0030] Uma distribuição de tamanho homogêneo da composição compreendendo VLPs é vantajosa porque permite produzir uma popu-lação definida de VLPs para uso como o sistema de entrega de fármaco, o que é importante para cumprir um padrão de qualidade definido.

[0031] A Figura 1 mostra a colocalização da proteína VP1 com o marcador de oligodendrócitos Olig2.

[0032] O painel superior esquerdo mostra a coloração dos núcleos celulares com o corante DAPI. O painel superior direito mostra a localização da proteína VP1 (fluorescência de FITC). O painel inferior esquerdo mostra a coloração com o anticorpo anti-Olig2 (fluorescência TRITC). O painel inferior direito representa as imagens mescladas da coloração para o marcador Olig2 e a proteína VP1. As células positivas para VP1 e Olig2 são marcadas com uma seta.

[0033] A Figura 2 mostra a colocalização da proteína VP1 com o marcadorneuronal NeuN.

[0034] O painel superior esquerdo mostra a coloração dos núcleos celulares com o corante DAPI. O painel superior direito mostra a localização da proteína VP1 (fluorescência de FITC). O painel inferior esquerdo mostra a coloração com o anticorpo anti-NeuN (fluorescência de TRITC). O painel inferior direito representa as imagens mescladas da coloração para o marcador NeuN e a proteína VP1. As células positivas para VP1 e NeuN são marcadas com uma seta.

[0035] A Figura 3 mostra a colocalização da proteína VP1 com o marcador de microglia Iba1.

[0036] O painel superior esquerdo mostra a coloração dos núcleos celulares com o corante DAPI. O painel superior direito mostra a localização da proteína VP1 (fluorescência de FITC). O painel inferior esquerdo mostra a coloração com o anticorpo anti-Iba1 (fluorescência de TRITC). O painel inferior direito representa as imagens mescladas da coloração para o marcador Iba1 e a proteína VP1. As célu las positivas para VP1 e Iba1 são marcadas com uma seta.

[0037] A Figura 4 mostra a permeação de VLPs associadas a um plasmídeo pNL em um modelo de BBB in vitro

[0038] A: Coloração com DAPI (esquerda) e WGA (direita) de célu-as de BBB em um modelo de BBB in vitro.

[0039] B: Permeação de corantes de fluorescência (FITC, TRITC), um corante fluorescente acoplado a um plasmídeo (FITC-pNL) e uma VLP associada a um plasmídeo pNL. Permeação em % em relação a uma permeação sem células. Quatro colunas da esquerda sem EDTA, quatro colunas da direita com EDTA.

[0040] A Figura 5 mostra a análise do mRNA de ASA no fígado e cérebro de camundongos sau dáveis injetados com VLPs associadas a um vetor de expressão que codifica ASA

[0041] Análise dos níveis de mRNA de ASA no fígado e cérebro de camundongos saudáveis às 72 e 120 h após a injeção de VLPs associados a um vetor de expressão que codifica ASA. Aumento em comparação com o veículo (tampão). Os números entre parênteses indicam o número respectivo de camundongos.

[0042] A Figura 6 mostra a análise de camundongos simples (camundongos saudáveis) - detecção de mRNA de ASA no cérebro

[0043] Análises com camundongos simples de mRNA de ASA após 72 h (parte superior) e 120 h (parte inferior) após injeção de VLPs associadas a um vetor de expressão que codifica ASA. Os números indicam camundongos simples. A regulação relativa significa a indução de gene (expressão) em comparação com o grupo controle de veiculo.

[0044] A Figura 7 mostra a análise de camundongos simples (camundongos sau dáveis) - Análise de Western Blot (detecção de hASA no cérebro) e qPCR correspondente

[0045] Análise de camundongos simples da proteína ASA (Western blot, parte superior) no cérebro após injeção de VLPs associadas a um vetor de expressão que codifica ASA e análise correspondente de qPCR (parte inferior). Veículo (tampão), plasmídeo e plasmídeo + VLP são comparados. Os números indicam camundongos simples. A regulação relativa significa a indução do gene (expressão) em comparação com o grupo controle de veículo.

[0046] A Figura 8 mostra a expressão de ASA humano em células de glioblastoma por qPCR.

[0047] As análises de qPCR da expressão de ASA humano após incubação de células de glioblastoma com VLPs associadas a vetores de expressão de hASA.

[0048] A: VLPs associadas a quatro vetores de expressão de hASA diferentes na relação de empacotamento de VLP : plasmídeo de 1:0,2

[0049] B: VLPs associadas ao Construto 4 de A em duas relações de empacotamento diferentes (alta concentração [VLP : plasmídeo de 1:0,5] e baixa concentração [VLP : plasmídeo de 1:0,2]

[0050] A Figura 9 mostra análises nDSF e AF4 de VLPs associadas a quatro vetores de expressão diferentes de hASA

[0051] A: Análises nDSF de quatro amostras (VLPs associadas aos Construtos 1-4 de vetores de expressão)

[0052] B: Análises AF4 das mesmas quatro amostras

[0053] A Figura 10 mostra imagens TEM de VLPs associadas a quatro diferentes vetores de expressão de hASA

[0054] Comparação de VLPs como tal ("VLP original": não associadas a uma carga) (esquerda) e VLPs associadas a quatro vetores de expressão diferentes (Construtos 1-4, à direita).

[0055] A Figura 11 mostra a atividade da luciferase comparando VLPs diferentemente preparadas

[0056] A atividade da luciferase medida em células de glioblastoma transfectadas com VLPs preparadas com duas rodadas de desmontagem e remontagem ou com as VLPs tendo sido desmontadas e remontadas apenas uma vez

[0057] A Figura 12 mostra a modelo de BBB como uma monocultura

[0058] ConFiguração (A) de um modelo de BBB como uma monocultura e permeabilidade (B) de VLPs preparadas com duas rodadas de desmontagem e remontagem

[0059] A Figura 13 mostra o modelo de BBB como uma cocultura

[0060] ConFiguração (A) de um modelo de BBB como uma cocultura e permeabilidade (B) de VLPs preparadas com duas rodadas de desmontagem e remontagem

[0061] A Figura 14 mostra imagens TEM de VLPs

[0062] Imagens TEM de VLPs preparadas com duas rodadas de desmontagem / remontagem versus VLPs preparadas com uma rodada de desmontagem e remontagem e com armazenamento intermediário

[0063] A Figura 15 mostra análises FFF-MALS de VLPs

[0064] Análises FFF-MALS de VLPs preparadas com duas rodadas de desmontagem e remontagem com armazenamento intermediário das VLPs (A), VLPs com uma rodada de desmontagem e remontagem com armazenamento intermediário dos pentâmeros (B), e VLPs recém-pre-paradas (C).

[0065] A Figura 16 mostra análises nDSF de VLPs

[0066] As análises nDSF de VLPs e VLPs recém-preparadas, pre-paradas com duas rodadas de desmontagem e remontagem com armazenamento intermediário

[0067] A Figura 17 mostra análises DLS mostrando o PDI de VLPs

[0068] As análises DLS mostrando o PDI de VLPs de acordo com a etapa d) do método que compreende duas rodadas de desmontagem e remontagem com ou sem indução da agregação de pentâmeros antes do armazenamento

[0069] A Figura 18 mostra análises DLS mostrando o diâmetro médio das VLPs

[0070] Análises DLS mostrando o diâmetro médio das VLPs de acordo com a etapa d) do método, que compreende duas rodadas de desmontagem e remontagem com ou sem indução da agregação de pentâmeros antes do armazenamento e após o armazenamento

[0071] A Figura 19 mostra análises de nDSF e atividade da lucife-rase das VLPs armazenadas com diferentes crioaditivos

[0072] Análises de nDSF (A) e atividade da luciferase (B)

[0073] Em um primeiro aspecto da invenção, a invenção refere-se às VLPs associadas a uma enzima lisossômica ou a um vetor de expressão que codifica uma enzima lisossômica para uso em um método para o tratamento de uma doença de depósito lisossômico em um indi-víduo, em particular, um humano. Portanto, a invenção também se refere a um método de tratamento de um ser humano que sofre de LSD com uma VLP associada a uma enzima lisossômica ou a um vetor de expressão que codifica uma enzima lisossômica. A enzima lisossômica é preferencialmente ASA. A LSD é preferencialmente MLD.

[0074] VLPs como tal, isto é, não associadas a uma carga, não compreendem nenhum material genético, porque elas são constituídas apenas de proteínas e, de outra forma, são "vazias". As VLPs de acordo com a presente invenção estão associadas a uma enzima lisossômica ou a um vetor de expressão que codifica uma enzima lisossômica. Em uma modalidade preferencial, as VLPs de acordo com a presente invenção não compreendem material genético viral que codifica uma proteína viral. Nesta modalidade, as VLPs podem compreender um elemento re-gulador viral como material genético viral.

[0075] O material genético viral compreende material genético viral que codifica uma proteína viral e elementos reguladores virais como material genético viral. O material genético viral é derivado do ácido nu-cleico de um vírus, isto é, ao menos 70% idêntico a um RNA ou DNA viral. De preferência, as VLPs de acordo com a invenção não compreendem nenhum material genético viral.

[0076] Assim, preferencialmente, no caso de as VLPs de acordo com a invenção compreenderem RNA ou DNA, o RNA ou DNA não é derivado de um vírus, isto é, o RNA ou DNA não é material genético viral, em particular o RNA ou DNA não codifica uma proteína viral. É particularmente preferencial que o RNA ou DNA não codifique uma proteína viral e não compreenda um elemento regulador viral.

[0077] Em uma modalidade preferencial, a VLP de acordo com a invenção está associada apenas a um vetor de expressão que codifica apenas uma enzima lisossômica, isto é, o vetor de expressão não codifica nenhuma outra proteína. Em uma modalidade preferencial, o vetor de expressão não codifica uma proteína viral. É particularmente preferencial que o vetor de expressão não codifique uma proteína viral e não compreenda um elemento regulador viral.

[0078] De preferência, o indivíduo é um animal ou um ser humano, de preferência, um ser humano.

[0079] As VLPs de acordo com a invenção, vantajosamente, permitem a entrega da enzima lisossômica ou do vetor de expressão que codifica uma enzima lisossômica a um sítio de interesse ("alvo"), preferencialmente em um ser humano. De preferência, a entrega é seletiva para o alvo, isto é, uma proporção mais alta da enzima lisossômica ou do vetor de expressão que codifica uma enzima lisossômica está entregue ao alvo do que a outros sítios do corpo ou órgãos.

[0080] O alvo é preferencialmente o SNC. O SNC refere-se à me-dula espinhal e ao cérebro, em particular ao cérebro. O termo "cérebro" inclui partes anatômicas do mesmo, tal como o lobo frontal, lobo parietal, lobo temporal, lobo occipital e cerebelo.

[0081] É particularmente vantajoso se a enzima lisossômica ou o vetor de expressão que codifica uma enzima lisossômica for entregue a uma célula-alvo, preferencialmente uma célula-alvo no SNC, em particular um astrócito, um oligodendrócito, um neurônio e / ou microglia. Em uma modalidade particularmente preferencial, a célula-alvo é um oligodendrócito. Portanto, a enzima lisossômica ou o vetor de expressão entra preferencialmente em astrócitos, oligodendrócitos, microglia ou neu-rônios, em particular, oligodendrócitos.

[0082] É particularmente vantajoso quando a célula-alvo entra em contato com uma quantidade eficaz da enzima lisossômica. Uma quan-tidade eficaz da enzima lisossômica significa que a quantidade é sufici-ente para aumentar a atividade da enzima cuja ausência causa a LSD.

[0083] A atividade enzimática no indivíduo é geralmente medida em sondas in vitro, tipicamente em sondas derivadas de tecidos sólidos, leucócitos, fibroblastos, células de líquido amniótico cultivadas, soro, lí-quido amniótico, urina ou gotas de lágrimas às quais um substrato é adicionado. Por exemplo, para arilsulfatase A, os substratos típicos incluem sulfato de p-nitrocatecol, sulfatídeo, em particular sulfatídeo [3H]-marcado, sulfato de lactossilceramida, sulfato de galactosil-esfingosina, sulfato de galactosil-esfingosina, 2-sulfato de ácido ascórbico ou semi-nolipídio (Raghavan e outros, J. Neurochem. 1981 ; 36 (2): 724-31). Em particular, o sulfato de p-nitrocatecol pode ser usado como um substrato para medir a atividade da arilsulfatase A e Β na urina de um indivíduo (Baum e outros, Clin Chim Acta. 1959; 4 (3): 453-5).

[0084] Em uma modalidade particularmente preferencial, as VLPs de acordo com a invenção atravessam a barreira hematoencefálica, de preferência a barreira hematoencefálica fisiologicamente intacta, para entrar no SNC juntamente com a enzima lisossômica ou o vetor de expressão. Em outras palavras, as VLPs de acordo com a invenção atravessam de preferência a BBB sem um au mento prévio da permeabilidade da BBB. As VLPs de acordo com a invenção são capazes de atravessar a BBB fisiologicamente intacta.

[0085] O cruzamento da BBB é especialmente vantajoso se o alvo for o SNC, em particular se a célula-alvo for um astrócito, um oligoden-drócito, neurônio e / ou microglia. Portanto, as VLPs de acordo com a invenção podem ser usadas em um método de tratamento de uma doença de depósito lisossômico, em que o método não compreende uma etapa anterior de aumentar a permeabilidade da BBB do indivíduo a ser tratado. As VLPs de acordo com a invenção, de preferência, são administradas a um paciente que não recebe u antes da administração qual-quer tratamento químico ou físico para prejudicar ou romper a BBB.

[0086] Em uma modalidade adicional, assim, as VLPs associadas a uma enzima lisossômica ou a um vetor de expressão que codifica uma enzima lisossômica ou a composição farmacêutica compreendendo as VLPs de acordo com a invenção estão livres de qualquer aditivo que possa impactar na permeabilidade da BBB.

[0087] A integridade da BBB in vitro pode ser medida por métodos conhecidos, por exemplo, por medição da resistência elétrica transen-dotelial relativa (TEER) (Rempe e outros, Biochem Bioph Res Comm 2011,406 (1): 64 a 69). Muitos modelos in vitro de BBB são estabelecidos, incluindo célulasendoteliais do cérebro bovino ou humano em diferentes coculturas, por exemplo, a linhagem de células endoteliais do cérebro humano HBEC-5i. In vivo, métodos de imagiologia, tal como varreduras CT ou MRI, podem ser usados juntamente com agentes de contraste para visualizar a permeabilidade da BBB. Imagiologia funcio-nal, tal como PET ou SPECT, também pode ser usada.

[0088] As VLPs de acordo com a invenção podem ser administradas por várias vias, incluindo administração oral, dérmica, nasal ou pul-monar ou injeção parentérica (i.v., s.c., i.m.). particularmente preferenciais são as formas de dosagem que permitem um efeito sistêmico da enzima lisossômica ou do vetor de expressão que codifica uma enzima lisossômica. Em uma modalidade específica, as VLPs de acordo com a invenção são administradas por via oral ou parentérica, em particular por via intravenosa.

[0089] Caso a aplicação das VLPs de acordo com a invenção leve a uma reação imune indesejada, medida, por exemplo, pela indução de citocinas inflamatórias e / ou moléculas de superfície em célulasimunes, pode ser necessário aplicar adicionalmente um imunossupressor para reduzir a ativação ou eficácia do sistema imune.

[0090] Em uma modalidade preferencial, as VLPs de acordo com a invenção, após a administração ao indivíduo a ser tratado, em particular um ser humano, podem ser detectadas no SNC em menos de 10 dias, preferencialmente em menos de 5 dias, mais preferencialmente em menos de 3 dias após a administração.

[0091] Em outra modalidade preferencial, a enzima lisossômica tem uma atividade enzimática terapeuticamente eficaz por ao menos 10 dias, preferencialmente por ao menos 20 dias, mais preferencialmente por ao menos 30 dias. A atividade enzimática terapeuticamente eficaz pode ser medida pela atividade enzimática que leva a um efeito tera-pêutico, isto é, ao menos um alívio ou atenuação de um sintoma da doença.

[0092] É particularmente vantajoso que a atividade enzimática terapeuticamente eficaz, de preferência no sítio alvo, seja mantida por ao menos 10 dias, preferencialmente por ao menos 20 dias, a fim de prolongar o período efetivo em que a enzima lisossômica exerce sua atividade. Desse modo, o número ou a frequência de injeções de VLP de acordo com a presente invenção pode ser limitado.

[0093] Na presente invenção, a enzima lisossômica é de preferência a arilsulfatase A.

[0094] Em particular, a enzima lisossômica é uma enzima humana. Portanto, em uma modalidade particularmente preferencial, a enzima lisossômica é a arilsulfatase humana A.

[0095] Em uma modalidade, a enzima lisossômica compreende uma sequência de aminoácidos que é ao menos 80%, mais preferencialmente ao menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 1 ao longo de todo o seu comprimento, de preferência tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

[0096] Em uma modalidade, a enzima lisossômica compreende uma sequência de nucleotídeos que é ao menos 70%, mais preferencialmente ao menos 80%, mais preferencialmente ao menos 90% idêntica à sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 2 ao longo de todo o seu comprimento, de preferência é a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2.

[0097] As sequências com as SEQ ID NOs: 1 e 2 pertencem à enzima arilsulfatase humana A e são mostradas na tabela abaixo:

[0098] Tabela 1: Sequências de aminoácidos e nucleotídeos da enzima arilsulfatase humana A

[0099] De preferência, o vetor de expressão que codifica a enzima lisossômica tem um tamanho inferior a 7 kb, preferencialmente inferior a 6 kb. A associação das VLPs com o vetor de expressão é mais eficiente quando o tamanho do vetor de expressão é relativamente pequeno, de preferência inferior a 6 kb ou mesmo inferior a 5 kb.

[0100] Em uma modalidade preferencial, o vetor de expressão tem um promotor selecionado a partir do grupo que compreende CMV e CAG.

[0101] O promotor CAG é particularmente vantajoso porque permite uma expressão duradoura. O promotor CAG também inibe reações imu-nes indesejadas, de modo que a aplicação adicional de imunossupres-sores possa ser reduzida ou mesmo completamente evitada.

[0102] O promotor CMV é preferencial se for necessária uma expressão mais forte e mais curta.

[0103] A necessidade de uma expressão curta ou duradoura pode variar dependendo da doença, do estágio da doença e do indivíduo a ser tratado. Uma expressão duradoura da enzima lisossômica permite um efeito duradouro que é benéfico se não houver, ou houver pouca atividade residual da enzima lisossômica no indivíduo. Caso exista atividade residual da enzima lisossômica, uma expressão mais curta pode ser suficiente. Da mesma forma, a necessidade de uma expressão leve ou forte pode variar.

[0104] De preferência, a enzima lisossômica é expressa, preferencialmente no sítio alvo, por ao menos 1 h, preferencialmente porao menos 5 h, mais preferencialmente por ao menos 12 h, mais preferencialmente por ao menos 1 dia, mais preferencialmente porao menos 3 dias, mais preferencialmente por ao menos 1 semana, mais preferencialmente por ao menos 1 mês, mais preferencialmente por ao menos 3 meses, mais preferencialmente por ao menos 6 meses, mais preferencialmente por ao menos 9 meses, mais preferencialmente por ao menos 1 ano, mais de preferência por ao menos 1,5 anos, mais preferencialmente por ao menos 2 anos.

[0105] Mais preferencialmente, a enzima lisossômica é expressa no sítio alvo por ao menos 1 mês.

[0106] Em uma modalidade, portanto, a enzima lisossômica é detectável no sítio alvo por ao menos 1 h, de preferência por ao menos 5 h, mais preferencialmente por ao menos 12 h, mais preferencialmente por ao menos 1 dia, mais preferencialmente por ao menos 3 dias, mais preferencialmente por ao menos 1 semana, mais preferencialmente por ao menos 1 mês, mais preferencialmente por ao menos 3 meses, mais preferencialmente por ao menos 6 meses, mais preferencialmente por ao menos 9 meses, mais preferencialmente por ao menos 1 ano, mais de preferência por ao menos 1,5 anos, mais preferencialmente por ao menos 2 anos.

[0107] Mais preferencialmente, a enzima lisossômica é detectável no sítio alvo por ao menos 1 mês.

[0108] De preferência, a expressão na célula-alvo é transiente. Uma expressão transiente não exclui que a expressão é duradoura. Em uma modalidade preferencial, a expressão é duradoura e transiente.

[0109] Em uma modalidade preferencial, o vetor de expressão é um plasmídeo.

[0110] Em uma modalidade particularmente preferencial, o plasmídeo é livre de genes de resistência a antibióticos. Isto é vantajoso porque permite a cultura de tais plasmideos sem antibióticos. Isto é particularmente crucial para uso clinico, porque a injeção de antibióticos pode levar à sensibilização ou a choques anafiláticos. Um plasmídeo "pFAR" é. por exemplo, um plasmídeo sem genes de resistência a antibióticos. De preferência, é utilizado um plasmídeo pFAR. Um plasmídeo pFAR permite uma expressão estável e duradoura sem a necessidade de usar antibióticos.

[0111] Em outra modalidade preferencial, um plasmídeo "pNL" ou um plasmídeo "pSF" é usado.

[0112] A expressão "plasmídeo pFAR". "plasmídeo pNL" ou "plasmídeo pSF’ significa que um plasmídeo com a estrutura de um plasmídeo pFAR. um plasmídeo pNL ou um plasmídeo pSF é usado para clo-nar o promotor e a enzima lisossômica de interesse na estrutura.

[0113] Um plasmídeo pFAR é. por exemplo, descrito em US 8.440.455 B2. Um plasmídeo pFAR particularmente preferencial é o pFAR4. cuja estrutura é descrita como SEQ ID NO: 21 na US 8.440.455 B2. a sequência é aqui descrita como SEQ ID NO: 7. A construção do plasmídeo "pFAR1"e do plasmídeo pFAR4 otimizado é descrita nas colunas 17 e 18 de US 8.440.455 B2.

[0114] O plasmídeo pFAR compreende preferencialmente um promotor CMV ou CAG. O plasmídeo pNL compreende preferencialmente um promotor CMV. O plasmídeo pSF compreende de preferência um promotor CAG.

[0115] Em uma modalidade preferencial, o vetor de expressão é pFAR-CMV-ASA. portanto, uma estrutura de pFAR com um promotor CMV e codificando o gene ASA humano. Em outra modalidade preferencial. o vetor de expressão é pFAR-CAG-ASA. Em outra modalidade preferencial, o vetor de expressão é pNL-CMV-ASA. O vetor de expressão pFAR-CAG-ASA é particularmente preferencial.

[0116] Foi demonstrado na presente invenção que o ASA humano pode ser expresso em células de glioblastoma usando diferentes vetores de expressão.

[0117] Em uma modalidade preferencial, se a carga é um vetor de expressão que codifica uma enzima lisossômica, o tratamento da doença de depósito lisossômico, preferencialmente MLD. é efetuado pela expressão transiente do gene da enzima lisossômica na célula-alvo. preferencialmente um oligodendrócito do indivíduo ser tratado.

[0118] Os indivíduos a serem tratados pelas VLPs de acordo com a presente invenção sâo. por exemplo, pacientes que sofrem de uma doença de depósito lisossômico ou indivíduos que se espera que sofram de uma doença de depósito lisossômico, por exemplo, porque eles abrangem uma mutação genética que é conhecida por afetar uma enzima lisossômica e. portanto, leva a uma doença de depósito lisossômico.

[0119] Em uma modalidade preferencial, a doença de depósito lisossômico é aquela que está associada ou potencialmente associada a um deficit neurológico do indivíduo. "Potencialmente associada" significa que o curso normal do desenvolvimento da doença leva a um deficit neurológico, embora o indivíduo ainda nâo tenha um deficit neurológico. De preferência, o indivíduo a ser tratado tem um deficit neurológico.

[0120] Um "deficit neurológico", de acordo com a invenção, refere-se à funçáo corporal anormal ou alterada devido a uma função alterada do cérebro, medula espinhal, músculos ou nervos ou outras partes do SNC. Exemplos incluem reflexos anormais, distúrbio da fala ou equilíbrio. diminuição da sensação, problemas de função mental, alterações da visão, problemas para caminhar ou fraqueza nos braços ou pernas. A referência é um indivíduo saudável, com reflexos normais, capacidade de falar, sensação normal, equilíbrio, função mental, visão e caminhada e força dos braços e pernas.

[0121] Uma doença de depósito lisossômico que está associada ou potencialmente associada a um deficit neurológico do indivíduo é, por exemplo. MLD. Em uma modalidade muito preferencial, a doença de depósito lisossômico é MLD.

[0122] Se a doença de depósito lisossômico estiver associada ou potencialmente associada a um déficit neurológico do indivíduo, o alvo das VLPs de acordo com a invenção é preferencialmente o SNC. Mais especificamente, a célula-alvo é um astrócito. um oligodendrócito, um neurônio ou microglia, em particular um oligodendrócito.

[0123] Existem diferentes modelos de camundongos de MLD que podem ser usados para estudar a doença e possíveis terapêuticas:

[0124] Camundongos ASA (- / -) têm um nocaute duplo do gene ASA. Animais deficientes armazenam o esfingolipldio cerebrosídeo-3-sulfato em vários tecidos neuronais e nâo neuronais. O padrão de depósito é comparável ao dos seres humanos afetados, mas defeitos graves da substância branca nâo sâo observados até os 2 anos de idade. O exame neurológico aos 12 a 14 meses de idade revela comprometimento significativo da coordenação neuromotora (Hess e outros. Proc Natl Acad Sa USA. 1996; 93 (25): 14821-6).

[0125] Camundongos ASA (-/-)/ CST (alternativamente ASA (- / -) / Gal3St1) sâo camundongos ASA (- / -) que superexpressam a enzima sintetizadora de sulfatídeo Cerebrosídeo sulfotransferase (CST) (alter-nativamente galactose-3-0-sulfotransferase-1 (Gal3St1)) nas células mielimzantes. Esses camundongos exibem um aumento significativo no depósito de sulfatídeo no cérebro e nos nervos periféricos. Os camundongos com idade superior a 1 ano desenvolvem sintomas neurológicos graves (Ramakrishnan e outros. J. Neurosci. 2007; 27 (35): 9482-90).

[0126] Em camundongos ASA (-/-)/ CGT. as células neurais superexpressam a enzima sintetizadora de sulfatideo UDP-galactose: cera-mida galactosiltransferase (CGT). Esses camundongos mostram aumento do depósito de sulfatideo nas células formadoras de mielina. resultando em degeneração axonal e desenvolvimento de sintomas neurológicos semelhantes a MLD. (Eckhardt e outros. J. Neurosci. 2007; 27 (34): 9009-21).

[0127] Camundongos ASA (-/-)/ hASAc69s mostram imunotole-rância a hASA (expressão de hASA inativo) e manutenção do fenótipo semelhante a MLD de camundongos ASA (- / -). A terapia de reposição enzimática foi estudada com este modelo (Matzner e outros. Mol Med. 2007; 13(9-10): 471-9).

[0128] Os camundongos ASA (-/-)/ CST / hASAc69s são camundongos mASA transgênicos duplos com imunotolerância a hASA (ex-pressão de hASA inativo) e taxas supranormais de síntese de sulfatideo (superexpressão de cerebrosídeo sulfotransferase (CST)). A terapia de reposição enzimática foi estudada com esse modelo (Matthes e outros. Hum Mol Genet. 2012; 21 (11): 2599-609).

[0129] As VLPs da invenção sâo preferencialmente derivadas do vírus John Cunningham (JCV). O "virus JC" ou o virus John Cunningham (JCV; NCBI Taxonomy 10632) é um poliomavírus humano. O JCV é de simetria icosaédrica. tem um diâmetro de cerca de 45 nm e consiste em 72 pentâmeros de VP1. Um pequeno número de proteínas estruturais VP2 e VP3 também está presente.

[0130] Uma "partícula semelhante a vírus’ (VLP) no contexto da presente invenção é definida como uma partícula deficiente em replicação com um casco (também denominado capsídeo) composto de proteínas estruturais virais ou proteínas estruturais virais modificadas ou proteínas derivadas de proteínas estruturais virais. Como explicado acima, a VLP. como tal. nâo compreende material genético. A VLP de acordo com a invenção é preferencialmente derivada de um virus de polioma humano, preferencialmente JCV. isto é. seu casco é de preferência composto por proteínas estruturais virais ou proteínas estruturais virais modificadas ou proteínas derivadas das proteínas estruturais virais VP1. VP2 e VP3 de JCV. Em uma modalidade preferencial, a VLP de acordo com a invenção é composta por proteínas VP1 do vírus JC.

[0131] Em uma modalidade particularmente preferencial da invenção. a única proteína estrutural viral no casco da VLP de acordo com a invenção é uma proteína VP1. Na modalidade mais preferencial, o casco da VLP de acordo com a invenção consiste em proteínas VP1. isto é. o casco nâo contém nenhuma outra proteína.

[0132] As proteínas estruturais virais, em particular a VP1. se agrupam em estruturas pentaméricas (pentâmeros). De acordo com a invenção. o casco da VLP de acordo com a invenção é de preferência composto por várias proteínas VP1. em particular vários pentâmeros de VP1. especialmente 72 pentâmeros de VP1.

[0133] Um "pentâmero" no contexto da invenção é uma estrutura que é formada quando cinco polipeptídeos, por exemplo, proteínas VP1. sâo montados. A montagem em um pentâmero pode ser devida à formação de ligações covalentes ou nâo covalentes entre os polipeptídeos. Os polipeptídeos formam tipicamente uma estrutura em forma de anel. tendo simetria pentagonal. Em um pentâmero. cada subunidade de polipeptídeo interage preferencialmente com duas subunidades adjacentes.

[0134] Um "peptídeo" de acordo com a presente invenção pode ser composto por qualquer número de aminoácidos de qualquer tipo. de preferência aminoácidos de ocorrência natural, que de preferência estão ligados por ligações peptídicas. Em particular, um peptídeo compreende ao menos 3 aminoácidos, preferencialmente ao menos 5. ao menos 7. ao menos 9. ao menos 12 ou ao menos 15 aminoácidos. Não há limite superior para o comprimento de um peptídeo. Contudo, preferencialmente um peptídeo de acordo com a invenção nâo excede um comprimento de 500 aminoácidos, preferencialmente 400. 300. 250. 200. 150 ou 120 aminoácidos. Um peptídeo que excede cerca de 10 aminoácidos também pode ser denominado "polipeptídeo".

[0135] As proteínas estruturais da VLP de acordo com a invenção, em particular a VP1. sâo preferencialmente idênticas ou derivadas das proteínas estruturais nativas de JCV. "Modificado ou derivado" abrange a inserção, deleção ou substituição de um ou mais aminoácidos, mantendo a função de VP1 para se montar em um capsídeo.

[0136] Em uma modalidade, a proteína estrutural nativa (JCV) pode ser modificada para otimizar a VLP de acordo com a invenção em relação à sua produção, seu perfil e especificidade de direcionamento celular ou seu perfil ou especificidade de direcionamento intracelular. A modificação ou derivação pode compreender uma otimização de códon da sequência de nucleotídeos que codifica a proteína estrutural, em particular a VP1. para melhorar a tradução da proteína.

[0137] Os termos "VP1" ou "proteína de vírus 1" de acordo com a presente invenção referem-se a uma proteína que é capaz de se montar em um capsídeo e que é preferencialmente idêntica ou é derivada da VP1 natural (nativa) de JCV.

[0138] O termo "VP1" de acordo com a invenção abrange uma proteína que tem uma identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 3 de ao menos 80%. mais preferencialmente ao menos 85%. mais preferencialmente ao menos 90%. mais preferencialmente ao menos 95%. mais preferencialmente ao menos 97%. mais preferencialmente ao menos 98% ou ao menos 99% ao longo desta sequência. Em uma modalidade mais preferencial da invenção. VP1 tem a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 3.

[0139] O termo "VP1" de acordo com a invenção também abrange frações da VP1 nativa. De preferência, as ditas frações de VP1 compreendem ao menos os ácidos 32 a 316 da sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 3 ou um seu derivado tendo uma identidade com a sequência de aminoácidos da posição de aminoácido 32 a 316 da SEQ ID NO: 3 de ao menos 80%. mais preferencialmente ao menos 85%. mais preferencialmente ao menos 90%. mais preferencialmente ao menos 95%. mais preferencialmente ao menos 97%. mais preferencialmente ao menos 98% ou ao menos 99% ao longo desta sequência.

[0140] Em outra modalidade da invenção, a VP1 tem uma sequência de aminoácidos que é ao menos 80%. mais preferencialmente ao menos 85%. mais preferencialmente ao menos 90%. mais preferencialmente ao menos 95%. mais preferencialmente ao menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 4 ao longo de todo o seu comprimento. Em uma modalidade, a sequência de aminoácidos de VP1 é idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4.

[0141] Em uma modalidade, a sequência de nucleotídeos da proteína VP1 é ao menos 70%. mais preferencialmente ao menos 80%. mais preferencialmente ao menos 90% idêntica à sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 5 ao longo de todo o seu comprimento, de preferência é a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 5.

[0142] Em outra modalidade da invençáo. a sequência de nucleotídeos da proteína VP1 é ao menos 70%. mais preferencialmente ao menos 80%. mais preferencialmente ao menos 90% idêntica à sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 6 ao longo de todo o seu comprimento. Em uma modalidade, a sequência de nucleotídeos da proteína VP1 é idêntica à sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 6.

[0143] As sequências sâo representadas na Tabela 2.

[0144] Tabela 2: Sequências de aminoacidos e nucleotídeos da proteína VP1.

[0145] Em uma modalidade preferencial da invenção, a VP1 tem uma sequência de aminoácidos que é ao menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 3 ao longo de todo o seu comprimento.

[0146] Em uma modalidade preferencial da invenção, a sequência de nucleotídeos da proteína VP1 é ao menos 80% idêntica à sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 5 ao longo de todo o seu comprimento.

[0147] As proteínas estruturais, preferencialmente VP1. podem ser expressas, por exemplo, em E. coli ou em células de insetos. De acordo com uma modalidade preferencial da invenção, as proteínas estruturais, preferencialmente VP1. sâo expressas em células de inseto. Isso é vantajoso porque a expressão em células de inseto leva a menos modificações. tal como modificações pós-traducionais. em comparação com a proteína de ocorrência natural, por exemplo de JCV. do que a expressão em E. coli.

[0148] A VLP de acordo com a invenção pode ainda compreender no capsídeo uma ou várias proteínas heterólogas adicionais, isto é. proteínas que nâo sâo idênticas ou denvadas da fonte da VP1. por exemplo. JCV. Por exemplo, uma proteína heteróloga pode estar ancorada no capsídeo, isto é. ao menos parte desta proteína sendo preferencialmente acessível a partir do exterior. Em princípio, qualquer proteína é adequada como uma proteína heteróloga. desde que a proteína heteró-loga possa ser incorporada ao capsídeo e nâo interfira substancialmente com a montagem da VLP de acordo com a invenção.

[0149] A VLP de acordo com a invenção está associada a uma carga, isto é. com uma enzima lisossômica ou um vetor de expressão que codifica uma enzima lisossômica. Isso significa que a carga está reversivelmente vinculada à VLP. Isso pode. por exemplo, ser devido a uma interação físico-química ou ligação a qualquer parte do capsídeo ou pela incorporação da carga no capsídeo. A incorporação pode ser completa ou incompleta. Em uma modalidade preferencial particular da invenção, a maior parte da quantidade total da carga é totalmente incorporada no capsídeo. O mais preferencial é que a carga seja totalmente encapsulada no capsídeo da VLP de acordo com a invenção.

[0150] No contexto da invenção, a expressão que a "VLP compreende a carga" é usada como sinônimo da expressão que a VLP está "associada à carga". A associação da VLP e da carga pode ser o resultado de "carregar" ou "empacotar" a VLP com a carga.

[0151] "Carregamento" significa qualquer processo que leve à associação da VLP e da carga, por exemplo, por choque osmótico ou por montagem de VP1 ou pentâmeros de VP1 à VLP juntamente com a carga. "VLP carregada" é a VLP resultante desse processo. O termo "empacotamento" refere-se ao processo de carregamento da VLP através da montagem de VP1 ou de pentâmeros de VP1 à VLP juntamente com a carga. A VLP resultante é denominada VLP "empacotada".

[0152] O termo "carga" é usado, no contexto da presente invenção, para uma enzima lisossômica ou um vetor de expressão que codifica uma enzima lisossômica.

[0153] Em uma modalidade especial da invenção, a VLP de acordo com a invenção é parte de uma composição farmacêutica para uso em um método para o tratamento de uma doença de depósito lisossômico em um indivíduo, em que a composição farmacêutica compreende ainda um veículo farmaceuticamente aceitável, e / ou excipiente.

[0154] Em uma modalidade preferencial, a composição farmacêutica compreende VLP de acordo com a invenção, um sal e um tampão e tem um pH entre 7.0 e 8.0. preferencialmente em torno de 7,5. A composição farmacêutica compreende preferencialmente:

[0155] a. NaCl de 120 mM a 170 mM. de preferência NaCl a 150 mM.

[0156] b. CaCl2 de 1 a 5 mM. de preferência CaCl2 a 2 mM. e

[0157] c. Tris-HCI de 5 a 30 mM. preferencialmente Tris-HCI de 10 a 25 mM. mais preferencialmente Tris-HCI a 10 mM.

[0158] Esta composição farmacêutica permite manipular as VLPs de acordo com a invenção em condições fisiológicas. Sob estas condições. as VLPs de acordo com a invenção permanecem essencialmente intactas, de preferência elas essencialmente mantêm sua estrutura cap-sídica. Se carregada com carga, tal como uma enzima lisossômica ou um vetor de expressão que codifica uma enzima lisossômica, as VLPs de acordo com a invenção permanecem essencialmente associadas à carga. A composição farmacêutica é especialmente adequada como composição farmacêutica para a administração intravenosa das VLPs de acordo com a invençáo a um indivíduo, em particular, a um ser humano.

[0159] Em um aspecto adicional, a invenção refere-se a um vetor de expressão que tem uma região de codificaçáo que codifica uma enzima lisossômica, preferencialmente a arilsulfatase humana A. um promotor selecionado a partir do grupo que compreende CAG e CMV. de preferência sendo CAG. e com um tamanho inferior a 7 kb. de preferência inferior a 6 kb.

[0160] Em uma modalidade preferencial, a enzima lisossômica codificada pelo vetor de expressão compreende uma sequência de nucleotídeos que é ao menos 70%. mais preferencialmente ao menos 80%. mais preferencialmente ao menos 90% idêntica à sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 2 ao longo de todo o seu comprimento, de preferência é a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 2.

[0161] De preferência, o vetor de expressão codifica a arilsulfatase humana A. compreende o promotor CAG e tem um tamanho inferior a 6 kb.

[0162] No caso em que as VLPs de acordo com a invenção nâo sejam imediatamente administradas após a fabricação, elas podem ser armazenadas, preferencialmente em nitrogênio líquido.

[0163] As VLPs de acordo com a invenção podem ser caracterizadas de acordo com métodos padrão, por exemplo, por um ensaio de Bradford. HA. DLS. nDSF. HPLC-SEC. AF4. TEM.

[0164] A invenção também se refere a um método de tratamento de uma doença de depósito lisossômico, em particular MLD. com as VLPs de acordo com a invenção. O método de tratamento compreende, de preferência, a etapa de administração das VLPs a um indivíduo em necessidade de tratamento.

[0165] A invenção também se refere ao uso das VLPs de acordo com a invenção para a fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença de depósito lisossômico, em particular MLD. O método de tratamento preferencialmente nâo compreende uma etapa para aumentar a permeabilidade da BBB do indivíduo a ser tratado. As VLPs da invenção, de preferência, sâo administradas a um paciente que nâo recebeu nenhum tratamento químico ou físico para prejudicar ou romper a BBB.

[0166] A invenção também se refere às VLPs de acordo com a invenção que sâo usadas para fornecer uma enzima lisossômica ou um vetor de expressão que codifica uma enzima lisossômica através doa BBB para o SNC. em particular para células do SNC. por exemplo, as-trócitos. oligodendrócitos. neurônios e microglia.

[0167] É importante ressaltar que o cruzamento da BBB pelas VLPs de acordo com a invenção permite que as VLPs exibam sua função de direcionar populações de células específicas no cérebro, ou seja. entregar uma enzima lisossômica ou um vetor de expressão que codifica uma enzima lisossômica para as células alvo. preferencialmente astrócitos. oligodendrócitos. neurônios e microglia. No contexto da invenção, as ditas VLPs compreendem uma entrega para as células alvo.

[0168] Em uma modalidade adicional, a invenção se refere a um método de associação de uma VLP a um vetor de expressão que codifica uma enzima lisossômica, preferencialmente arilsulfatase humana A. em que o método compreende as seguintes etapas:

[0169] - fomecer as VLP. em particular, derivadas de JCV

[0170] - expor as VLPs a condições de dissociação das VLPs em pentâmeros

[0171] - expor os pentâmeros ao vetor de expressão em uma relação de VLP para vetor de expressão de 1 a 0.5 a 1 a 0.1. preferencialmente em uma relação de 1 a 0.2. e a condições que induzem os pentâmeros a se montarem em uma VLP associada ao vetor de expressão

[0172] - opcionalmente punficar as VLPs

[0173] - executar uma etapa de diálise.

[0174] Em outra modalidade preferencial, é fornecido um método para associar uma VLP a uma enzima lisossômica, preferencialmente arilsulfatase A humana, ou um vetor de expressão que codifica uma enzima lisossômica, preferencialmente arilsulfatase A humana, em que o método compreende as seguintes etapas:

[0175] a) fomecer uma composição compreendendo proteínas VP1.

[0176] b) expor as proteínas VP1 da composição de a) a condições que induzem as VP1 a se montarem em VLPs,

[0177] c) expor as VLPs da composição de b) a condições de desmontagem das VLP em pentâmeros.

[0178] d) expor os pentâmeros da composição de c) a condições que induzam os pentâmeros a se remontarem nas VLPs

[0179] e) expor as VLP da composição de d) a condições de desmontagem das VLP em pentâmeros.

[0180] f) expor os pentâmeros da composição de e) à enzima lisossômica ou ao vetor de expressão a condições que induzem a montagem dos pentâmeros em uma VLP associada à enzima lisossômica ou ao vetor de expressão.

[0181] A relação de VLP para vetor de expressão (isto é. a relação de empacotamento) pode variar dependendo da necessidade específica. Por exemplo, a eficiência da formação de VLPs ou expressão gênica pode ser dependente da relação. De preferência, é utilizada uma relação de VLP para vetor de expressão de 1 para 0.5 a 1 para 0.1. mais preferencialmente de 1 para 0.2. O versado na técnica adaptará a relação ao vetor de expressão específico, preferencialmente plasmídeo, e uso desejado. É preferencial uma relação de empacotamento de 1 para 0.2.

[0182] No contexto da presente invenção, e para facilitar a explicação. as VLPs resultantes da etapa b) também podem ser denominadas "pVLP" (VLPs primárias). As VLPs resultantes da etapa d) também podem ser denominadas "rVLP" (VLPs remontadas). As VLPs resultantes da etapa f) também podem ser denominadas "cVLP" (VLPs com carga). De acordo com a presente invenção, a carga é uma enzima lisossômica, preferencialmente arilsulfatase humana A. ou um vetor de expressão que codifica uma enzima lisossômica, preferencialmente arilsulfatase humana A.

[0183] Em outro aspecto da invenção, a invenção refere-se às VLPs obtidas pelo método acima.

[0184] Em outro aspecto da invenção, a invenção refere-se a uma composição compreendendo VLPs de acordo com a invenção derivadas de JCV caracterizada por um ou mais dos seguintes parâmetros:

[0185] a. um Indice de polidispersividade (PDI) menor do que 0.3. preferencialmente menor do que 0.2. preferencialmente menor do que 0.1. mais preferencialmente em uma faixa entre 0.01 e 0,09.

[0186] b. ao menos 70% de VLPs com um diâmetro médio de 20 nm a 70 nm. preferencialmente de 30 nm a 70 nm. mais preferencialmente de 35 nm a 65 nm. mais preferencialmente de 40 a 60 nm.

[0187] c. um teor de VLPs na composição de ao menos 80% (em volume), preferencialmente ao menos 85% (em volume), preferencialmente ao menos 90% (em volume), preferencialmente ao menos 95% (em volume).

[0188] Em outro aspecto, a invenção refere-se a um sistema de entrega de fármaco obtido pelo método de acordo com a invenção. O sistema de entrega de fármaco pode ser usado em um método de terapia e / ou diagnóstico, preferencialmente para o tratamento de distúrbios neurológicos, ou seja, uma doença de depósito lisossômico, em particular MLD. Portanto, a invenção também se refere a um método de tratamento de um distúrbio, em particular uma doença do SNC. com o sistema de entrega de fármaco de acordo com a invenção. O método de tratamento compreende, de preferência, a etapa de administrar o sistema de entrega de fármaco a um indivíduo em necessidade de tratamento.

[0189] O sistema de entrega de fármaco tem preferencialmente uma eficácia melhorada. As VLPs de acordo com a invenção podem atravessar a BBB sem um aumento prévio da permeabilidade da BBB. Portanto, o sistema de entrega de fármaco da invenção pode ser usado em um método de tratamento de uma doença do SNC. em que o método nâo compreende uma etapa de aumentar a permeabilidade da BBB do indivíduo a ser tratado. O sistema de entrega de fármaco da invenção. de preferência, é administrado a um paciente que nâo recebeu nenhum tratamento químico ou físico para prejudicar ou romper a BBB.

[0190] Em ainda um aspecto adicional da invenção, é fornecida uma composição compreendendo as VLPs. que tem ao menos uma. de preferência todas, as seguintes características ("parâmetros alvo"):

[0191] Tabela 3: Características preferenciais das VLPs e da composição contendo as VLPs de acordo com a invenção.

[0192] AUC = área sob a curva

[0193] Em uma modalidade, as VLPs de acordo com a invenção mostram um pico de inflexão maior nas análises de nDSF de > 67° C.

[0194] Em uma modalidade, as análises AF4 das VLPs de acordo com a invenção revelam menos de 20% de agregados e menos de 15% de resíduos. Ao menos 70% sâo VLPs de 40 a 50 nm de tamanho.

[0195] O sistema de entrega de fármaco da invenção pode ser administrado por várias vias, incluindo por via oral, dérmica, nasal ou pulmonar ou injeção. Particularmente preferenciais sâo as formas de dosagem que permitem um efeito sistêmico do produto farmacêutico. Em uma modalidade especifica, o sistema de entrega de fármaco da invenção é administrado por via oral ou parentérica, em particular por via intravenosa.

[0196] No contexto da invenção, o termo "sistema de entrega de fármaco" refere-se a uma composição para administrar um produto farmacêutico a um indivíduo em necessidade de tratamento, em particular a um ser humano ou animal. Um sistema de entrega de fármaco, van-tajosamente. permite a entrega do produto farmacêutico nele contido ou ligado a um sítio de interesse, de preferência em um ser humano ou animal. Preferencialmente, a entrega é seletiva para o alvo, isto é. mais do produto farmacêutico está entregue ao alvo do que em outros sítios do corpo ou órgãos.

[0197] "Um sistema de entrega de fármaco para o SNC" significa que o sistema de entrega de fármaco visa seletivamente o SNC.

[0198] De acordo com a invenção, a expressão "expor" algo (por exemplo, as VP1. pentâmeros, as VLPs) a condições para afetar algo (por exemplo, induzir a montagem) refere-se a levar o material em consideração (por exemplo, as VP1. os pentâmeros, as VLPs) a condições que podem causar esse efeito (por exemplo, induzir a montagem). Essa exposição pode ser realizada alterando as condições do material, por exemplo, colocando o material em contato com um tampão, sal ou pH diferente etc. Isso é possível adicionando algo à composição que com-preende o material ou vice-versa ou separando o material da composição e adicionando o material a uma composição diferente.

[0199] Uma mudança de condições também pode ser alcançada variando a temperatura, a radiação etc. Naturalmente, esses meios para uma mudança de condições podem ser combinados e / ou repetidos. Outras condições adequadas que induzem o efeito desejado, como a montagem das VP1 ou pentâmeros às VLPs e / ou a indução da agregação das VLPs. também sâo bem conhecidas dos versados na técnica. O mesmo se aplica a uma duração adequada da exposição às respectivas condições; isso pode ser descoberto pelos meios comuns dos versados na técnica.

[0200] A expressão "expor algo a condições para afetar algo" nâo requer que o efeito seja concluído, isto é. nem todo o material precisa realizar o efeito em consideração. Por exemplo, "condições que induzem os pentâmeros a se agregarem" essencialmente significa que as condições sâo adequadas para induzir a agregação. Nâo significa que. de fato. todos os pentâmeros se agregam.

[0201] Conforme usado neste documento, o termo "montagem" ou "montagem em VLPs" significa que as estruturas em consideração (as proteínas VP1 ou os pentâmeros) se associam e estabelecem o capsídeo das VLPs. Se a VP1 for usada como material de partida, a montagem nas VLPs pode incluir a formação anterior de pentâmeros, o que significa que as proteínas VP1 podem formar primeiro pentâmeros e depois formar VLPs ou podem se montar diretamente em uma VLP. A montagem em VLPs é reversível.

[0202] O termo "desmontagem", por sua vez. refere-se a um processo. quando o capsídeo da VLP se desintegra ao menos parcialmente em estruturas pentaméricas e / ou proteínas estruturais. A desmontagem pode ser induzida aumentando a temperatura, adicionando proteases e / ou diminuindo interações intermoleculares usadas para formar as VLPs, tal como pontes dissulfeto intermoleculares (por exemplo, adicionando agentes de redução ou agentes quelantes). Tais condições também podem incluir a exposição gradual a uma condição. Por exemplo. a composição pode ser colocada em contato com um agente de redução antes que a temperatura seja aumentada.

[0203] Os métodos para induzir a VP1 e / ou os pentâmeros a serem montados nas VLPs sâo geralmente conhecidos dos versados na técnica (Goldmann e outros (J. Virol. 1999; 73 (5); 4465-69); DE 195 43 553 A1). O mesmo se aplica à desmontagem das VLPs em pentâmeros. O versado na técnica, portanto, conhece os métodos para o controle da montagem e desmontagem das VLPs.

[0204] Em uma modalidade da invenção, a concentração de íons Ca2+ na composição contendo a VP1 ou pentâmeros é usada para o controle da montagem / desmontagem das VLPs. Por exemplo, para induzir a montagem, a concentração de íons Ca2+ livres pode ser aumentada. Se a desmontagem for desejada, a concentração de íons Ca2+ livres pode ser reduzida adicionando um agente quelante à composição.

[0205] Uma outra opção para induzir a montagem é aumentar a concentração de pentâmeros de VP1. a fim de facilitar a montagem em VLPs. por exemplo, reduzindo o solvente na composição compreendendo os pentâmeros. Isso pode exigir uma adaptação da concentração de metais alcalinoterrosos, tal como Ca2+ ou Mg2+.

[0206] De acordo com uma modalidade preferencial da invenção, a desmontagem pode ser induzida expondo as VLPs a condições sob as quais as pontes dissulfeto intermoleculares sâo reduzidas, por exemplo, expondo as VLPs a condições de redução. Em uma modalidade preferencial. esta etapa é realizada na presença adicional de um agente quelante. Mais preferencialmente, a desmontagem é induzida expondo as VLPs a condições de redução na presença de um agente quelante e. opcionalmente, a uma temperatura aumentada.

[0207] Em uma modalidade particular da invenção, as VLPs são expostas a uma composição compreendendo DTT e EDTA e / ou EGTA, preferencialmente a uma temperatura de 15° C a 30° C, preferencialmente 20° C a 25° C, mais preferencialmente a um temperatura de cerca de 23° C.

[0208] De acordo com uma modalidade preferencial da invenção, os pentâmeros da composição de c) são expostos a condições que in-duzem a sua agregação. Esta etapa é mais adequada se executada antes da etapa d). Em uma modalidade preferencial, ao menos 20% do material (por exemplo, os pentâmeros) se agrega, preferencialmente ao menos 30%, mais preferencialmente ao menos 40%.

[0209] Surpreendentemente, verifico u-se que esta etapa pode levar a uma distribuição de tamanho mais homogênea das VLPs. Isso permite um melhor gerenciamento e padronização da qualidade, o que é de extrema importância se as VLPs forem usadas em um sistema de entrega de fármaco. Consequentemente, este procedimento adicional é de preferência parte dos requisitos de controle de qualidade de um sistema de entrega de fármaco.

[0210] O termo "agregado" significa qualquer estrutura particulada. "Agregação" significa um processo que leva a agregados. Este processo é reversível.

[0211] A agregação dos pentâmeros ou VLPs pode ser determinada por um tamanho médio de partículas aumentado das VLP na composição em comparação com o controle. O tamanho de partícula maior pode ser determinado por métodos-padrão, tal como espalhamento dinâmico de luz (DLS).

[0212] De acordo com uma modalidade particular da invenção, a agregação dos pentâmeros ou VP1 pode ser induzida por um ou mais agentes que são conhecidos na técnica para facilitar a precipitação de proteínas (agente de precipitação). O mais preferencial, de acordo com a invenção, é assim ou so de um agente de precipitação.

[0213] Um "agente de precipitação" refere-se a um agente que promove a agregação de VP1 ou pentâmeros. O conceito de agentes de precipitação é geralmente conhecido pelos versados na técnica. Os agentes de precipitação são tipicamente u sados para facilitar a concentração e purificação de proteínas. A precipitação pode ser o resuItado da alteração do potencial de solvatação do solvente, mais especificamente, diminuindo a solubilidade da proteína. A solubilidade também pode ser diminuída ajustando-se o pH da composição até o ponto isoelétrico de uma proteína. Além disso, a redução da temperatura da composição também pode diminuir a solubilidade de uma proteína.

[0214] Os possíveis agentes de precipitação são, por exemplo, polietileno glicol (PEG) ou álcool, por exemplo, etanol, e sais. Os últimos são conhecidos pelos versados na técnica como "agentes para salgar".

[0215] De preferência, de acordo com a invenção, o agente de precipitação é um sal. Os mais preferenciais são os sais compreendendo íons conhecidos como "série Hofmeister". A série Hofmeister descreve a ordem dos íons em relação ao seu efeito hidrofóbico em uma proteína específica em termos de sua capacidade de afetar a solubilidade da dita proteína em solução. Os íons que exercem um efeito hidrofóbico em uma proteína são especialmente preferenciais. Aqui, esses íons são chamados de íons cosmotrópicos.

[0216] É preferencial um agente de precipitação compreendendo ao menos um ânion ou cátion cosmotrópico. Os ânions preferenciais são selecionados a partir do grupo que consiste em citrato (C6H5O73-), fosfato (PO43-), sulfato (SO42-), hidrogênio fosfato (HPO42-), di-hidrogênio fosfato (H2PO4- ), iodato (IO3-), hidróxido (OH ), fluoreto (F-), bromato (BrO3-) ou acetato (CH3COO- ) ou combinações dos mesmos, os ânions mais preferenciais são citrato, fosfato ou sulfato, o ânion mais preferencial é o sulfato.

[0217] Os cátions preferenciais são compostos de amônio ou de amônio quaternário (NR4+ com R sendo um grupo alquila ou arila), tal como tetrametilamônio ((CH3)4N+) ou dimetilamônio ((CH3)2N2+). Cátions adicionais preferenciais são selecionados a partir da lista que compreende potássio (K+), césio (Cs+), rubídio (Rb+) ou lítio (Li+) ou combinações dos mesmos, particularmente preferenciais são compostos de amônio quaternário ou amônio, o mais preferencial é o amônio.

[0218] Portanto, o sal compreende preferencialmente um ânion e um cátion selecionados a partir do grupo que consiste em citrato (C6H5O73-), fosfato (PO43-), sulfato (SO42-), hidrogênio fosfato (HPO42-), di-hidrogênio fosfato (H2PO4 ), iodato (IO3-), hidróxido (OH ), fluoreto (F), bromato (BrO3-) ou acetato (CH3COO- ), compostos de amônio quaternário (NR4+) com R sendo um grupo alquila ou arila, preferencialmente tetrametilamônio ((CH3)4N+) ou dimetilamônio ((CH3)2N2+), amônio (NH4+), potássio (K+), césio (Cs+), rubídio (Rb+) ou lítio (Li+), de preferência compreendendo SO42- e / ou NH4+ ou combinações dos mesmos.

[0219] De acordo com uma modalidade preferencial, o sal é selecionado a partir do grupo que consiste em (NH4)2SO4, K2SO4, Na2SO4, (NH4)2HPO4, K2HPO4 e Na2HPO4. O sal mais preferencial é o sulfato de amônio ((NH4)2SO4).

[0220] De acordo com a invenção, a agregação dos pentâmeros pode ser induzida por qualquer meio para colocar os pentâmeros em contato com o agente de precipitação, por exemplo, adicionando o agente de precipitação à composição compreendendo os pentâmeros ou vice-versa, ou seja, adicionando a composição compreendendo os pentâmeros a um agente de precipitação. Também são possíveis outros meios, tal como uma diálise, de modo que o agente de precipitação atinja os pentâmeros por difusão.

[0221] De acordo com uma modalidade preferencial da presente invenção, a agregação dos pentâmeros é induzida por uma diálise contra uma composição compreendendo o agente de precipitação, por exemplo, uma composição compreendendo sulfato de amônio.

[0222] De acordo com uma modalidade particularmente preferencial da invenção, a composição que contém os pentâmeros para agregação, tem uma concentração de sulfato de amônio entre 0,3 a 5 M, preferencialmente até 4 M, ainda mais preferencial é uma concentração entre 1,8 e 2,2 M. Mais preferencialmente é de cerca de 2 M.

[0223] A etapa de induzir a agregação dos pentâmeros tem, de preferência, uma duração de ao menos 1 hora, mais preferencialmente de ao menos 5 horas, ainda mais preferencialmente de ao menos 12 horas, mais preferencialmente de ao menos 16 horas. É preferencial que a etapa tenha uma duração inferior a 24 horas. Em uma modalidade preferencial, a duração desta etapa está entre 14 e 19 horas. Em uma modalidade mais preferencial, a duração desta etapa está entre 16 e 18 horas. Durante esse período, os pentâmeros são expostos a condições para induzir a agregação, em particular eles estão em contato com sul-fato de amônio.

[0224] Após a etapa de induzir a agregação dos pentâmeros, é vantajoso incluir no processo da invenção uma etapa de separar os pentâmeros a partir das condições que foram utilizadas para induzir a agregação. Os métodos aplicáveis a essa etapa não são particularmente limitados; é aplicável qualquer método conhecido pelo versado na técnica que permita a separação dos pentâmeros a partir das condições de indução de agregação.

[0225] Em uma modalidade preferencial da invenção, os pentâmeros são separados a partir das condições que induzem a sua agregação por diálise. A diálise pode ser usada se a agregação dos pentâmeros for induzida usando um agente de precipitação. O princípio da diálise também pode ser aplicado favoravelmente para colocar os pentâmeros em contato com um agente de precipitação. O mais preferencial é que, se o método de acordo com a invenção incluir ao menos duas etapas de diálise: uma primeira diálise da composição da etapa c) contra uma composição compreendendo um agente de precipitação, e uma se-gunda diálise após a indução da agregação contra uma composição que é essencialmente livre do agente de precipitação.

[0226] A diálise para separar os pentâmeros do agente de precipitação é preferencialmente contra uma composição que é ao menos semelhante às condições fisiológicas. Tal composição compreende preferencialmente um sal e tem um pH de 6 a 8,5, preferencialmente de 6,5 a 8,5, mais preferencialmente de 7 a 8, mais preferencialmente de 7,2 a 7,5, em particular 7,5. A osmolaridade da composição está preferencialmente entre 280 e 310 mosmol /I, mais preferencialmente 308 mosmol /I. A composição pode, por exemplo, ter uma concentração salina (cloreto de sódio) de 0,8 a 0,92% (peso / volume), preferencialmente de 0,9% (peso / volume).

[0227] A separação dos pentâmeros a partir das condições usadas para induzir a agregação é realizada, de preferência, por ao menos 1 hora, mais preferencialmente por ao menos 5 horas, 12 horas, mais preferencialmente por ao menos 18 horas, mais preferencialmente por cerca de 24 horas ou mais. Também são possíveis períodos de tempo mais longos, entre outros, dependendo da concentração dos pentâmeros que foram induzidos a se agregarem, a composição compreendendo os pentâmeros e a natureza e a concentração do agente de precipitação. Em uma modalidade preferencial, a composição compreendendo os pentâmeros agregados é dialisada contra uma composição semelhante às condições fisiológicas por cerca de 24 horas.

[0228] A composição preferencialmente contém ainda um tampão. Os sistemas tampão adequados são conhecidos pelos versados na técnica. Em uma modalidade preferencial da invenção, a composição inclui um tampão TRIS, tampão HEPES, um tampão fosfato ou um sistema tampão de bicarbonato. O mais preferencial é um tampão TRIS.

[0229] Em uma modalidade mais preferencial, a composição compreende Tris-HCl a 10 mM e NaCl a 150 mM e tem um pH de 7,5.

[0230] A fim de facilitar a montagem dos pentâmeros em VLPs, a composição pode ainda compreender íons divalentes, tal como Ca2+ Mg2+, Ba2+, Cu2+, Fe2+, Zn2+ ou combinações dos mesmos. O mais preferencial é o Ca2+, por exemplo, CaCl2. Em uma modalidade preferencial, a composição compreende CaCl2 a 1 a 3 mM, preferencialmente CaCl2 a 2 mM.

[0231] Em uma modalidade muito preferencial da invenção, a composição que é ao menos semelhante às condições fisiológicas compreende Tris-HCl a 10 mM, NaCl a 150 mM e CaCl2 a 2 mM e tem um pH de 7,5.

[0232] Em ainda outro aspecto da invenção, foi surpreendente-mente descoberto que o armazenamento de VLPs (rVLPs) é vantajoso em comparação com o depósito de pentâmeros (Figura 14 e 15). Se os pentâmeros são depositados e subsequ entemente descongelados e remontados, partículas predominantemente "minúsculas" se formam bem como agregados. Essas VLPs não são adequadas para a produção de um sistema de entrega de fármaco. No entanto, as VLPs que foram dissociadas e remontadas após o armazenamento formam uma população particularmente homogênea de VLPs de tamanho adequado, de acordo com a invenção. Assim, em uma modalidade da invenção, uma composição é fornecida com partículas tendo um diâmetro médio de 20 nm a 70 nm, preferencialmente de 30 nm a 70 nm, mais preferencialmente de 35 nm a 65 nm, mais preferencialmente de 40 a 60 nm. Uma distribuição de tamanho homogênea é importante para atender aos requisitos de controle de qualidade.

[0233] Em uma modalidade preferencial, o método de acordo com a invenção compreende uma etapa de armazenamento de VLPs a partir da composição da etapa d). O armazenamento de VLPs a uma tempe-ratura de cerca de 80° C a cerca de 4o C é possível por uma duração de ao menos 10 h, 15 h, 20 h, preferencialmente por ao menos 24 h. É possível um armazenamento de mais de 3 dias.

[0234] Em uma modalidade preferencial, as VLPs são armazenadas a uma temperatura abaixo de 0° C (congelamento). O congelamento pode ser realizado usando diferentes taxas de resfriamento. Por exemplo, o congelamento "lento" pode ocorrer aplicando uma taxa de resfriamento de cerca de -1° C por minuto, enquanto o congelamento rápido pode ser realizado colocando em contato a amostra, isto é, o recipiente que compreende a composição, com nitrogênio líquido ou colocando a amostra em um congelador a -80° C.

[0235] Em uma modalidade preferencial, o armazenamento ocorre em uma composição compreendendo um crioaditivo, de preferência selecionado a partir do grupo que compreende polióis, açúcares, sais inorgânicos, sais orgânicos, aminoácidos, polímeros, extremólitos ou derivados ou combinações dos mesmos.

[0236] Em uma modalidade preferencial, o sal inorgânico compreende um ânion sulfato. Os sais preferenciais compreendendo um ânion sulfato são sulfato de potássio, sulfato de sódio, tiossulfato de sódio, sulfato de magnésio e sulfato de amônio. De preferência, o sal inorgânico é sulfato de amônio.

[0237] O aminoácido é preferencialmente glicina, glutamina, prolina ou alanina. Um derivado de aminoácido preferencial é a betaína. Outros possíveis crioaditivos são glicerol, sacarose, DMSO, ectoína ou hidro-xiectoína.

[0238] Verificou-se que a adição de crioaditivos, em particular a adição de um sal inorgânico (tal como um sal compreendendo um ânion sulfato, em particular sulfato de amônio) e / ou um derivado de aminoácido (tal como a betaína), é vantajosa à estabilidade e à funcionalidade ou eficácia das VLPs (Figura 19). Como mencionado acima, uma estabilidade e / ou funcionalidade ou eficácia aprimorada é particularmente desejada quando se usa as VLPs como um sistema de entrega de fármaco. Foi surpreendente que a adição de crioaditivos à composição da etapa d) tenha um impacto sobre as VLPs empacotadas da etapa f) em termos de estabilidade e funcionalidade ou eficácia.

[0239] Um crioaditivo serve ao propósito de proteger o tecido biológico contra danos causados pelo congelamento (isto é, devido à formação de gelo). Os crioaditivos geralmente operam aumentando a concentração de soluto nas células. No entanto, para serem adequados para uso biológico, eles devem penetrar facilmente e não devem ser tóxicos para as células. Tais aditivos são assim adequados para fornecer condições mais suaves de armazenamento para os pentâmeros e / ou as VLPs. Os crioaditivos podem ser suplementados em uma composição compreendendo pentâmeros e / ou VLPs para serem congelados para armazenamento.

[0240] De acordo com uma modalidade preferencial particular da presente invenção, o crioaditivo é adicionado à composição compreendendo VLPs para congelamento subsequente após a montagem das VLPs, preferencialmente rVLP, usando duas etapas de diálise (remontagem em duas etapas).

[0241] As concentrações molares adequadas de crioaditivos, exceto os crioaditivos à base de poliol, podem ser de 0,5 M, 0,6 M, 0,7 M, 0,8 M, 0,9 M, 1 M, 1,1 M, 1,2, 1,3 M, 1,4 M, 1,5 M, 2 M, 3 M, 4 M, 5 M. Preferencialmente, esses crioaditivos são utilizados em uma concentração molar de cerca de 1 M, preferencialmente em uma concentração molar de 1 M.

[0242] O crioaditivo à base de poliol pode ser usado em concentrações molares de ao menos 0,3 M, ao menos 0,4 M, ao menos 0,5 M, ao menos 0,6 M, ao menos 0,7 M, ao menos 0,8 M, ao menos 0,8 M, ao menos 0,9 M, ao menos 1 M, ao menos 2 M ou ao menos 3 Μ. De preferência, os crioaditivos à base de poliol, preferencialmente glicerol a 5%, podem ser utilizados a uma concentração de cerca de 0,6 M a 0,7 M, mais preferencialmente a uma concentração de 0,68 M.

[0243] Alternativamente, o crioaditivo à base de poliol pode ser adicionado com base na porcentagem em volume da composição compreendendo pentâmeros e / ou VLPs. A porcentagem em volume adequada inclui 3% (em volume), 4% (em volume), 5% (em volume), 6% (em volume), 7% (em volume), 7% (em volume), 8% (em volume), 9% (em volume) ou 10% (em volume). Preferencialmente, o agente crioaditivo à base de poliol é adicionado a 5% (em volume).

[0244] Em uma modalidade preferencial da invenção, os pentâmeros da etapa c) e / ou as VLPs da etapa d) são submetidos à purificação. O termo "purificação" no contexto da presente invenção refere-se ao isolamento ou separação de VP1, pentâmeros ou VLPs de uma composição complexa. Os métodos possíveis incluem precipitação, preferencialmente centrifugação, filtração, tal como ultrafiltração e / ou filtração de fluxo cruzado, preferencialmente filtração de fluxo cruzado, cromatografia, por exemplo, uma cromatografia preparativa, preferencialmente cromatografia por exclusão de tamanho ou cromatografia de afinidade, e / ou espalhamento dinâmico de luz (DLS). Em particular, as VLPs podem ser selecionadas com DLS. Vivaspin® é uma unidade de filtração exemplificativa que pode ser usada.

[0245] O termo "cromatografia" refere-se a um método que permite a separação de uma mistura de substâncias através da distribuição de seus componentes individuais entre uma fase estacionária e uma fase móvel. Em particular, a cromatografia refere-se a um método de purificação de uma substância ligando e enriquecendo a substância de interesse para a fase estacionária antes de elui-la em uma segunda etapa (modo de cromatografia de ligação e eluição) ou ligando impurezas à fase estacionária e aumentando a pureza da molécuIa de interesse no fluxo passante (modo de fluxo passante).

[0246] A cromatografia pode ser agrupada de acordo com a base da interação do analito compreendido na fase móvel com a fase estacionária. Os tipos preferenciais de cromatografia de acordo com a invenção abrangem cromatografia de "fase reversa", cromatografia de "troca iônica", cromatografia de "afinidade" ou cromatografia por exclusão de tamanho (SEC). Entre a cromatografia de troca iônica, o método de pu-rificação pode ser ainda mais separado, com base na carga presente na fase estacionária, em cromatografia de troca catiônica (CEX), na qual a fase estacionária tem carga negativa, retendo assim moléculas carregadas positivamente, e cromatografia de troca aniônica (AEX), na qual a fase estacionária tem uma carga positiva, retendo assim as moléculas carregadas negativamente.

[0247] Em particular, a cromatografia pode ser usada para purificar rVLP obtidas pelo método de acordo com a presente invenção como um produto intermediário. Em particular, AEX pode ser usada para purificar rVLP.

[0248] A fase estacionária usada em AEX pode ser ainda descrita com base na força da interação iônica fornecida pelo material de troca presente na fase estacionária em "trocadores de ânions fortes" e "trocadores de ânions fracos". As expressões "trocador de ânions" ou "matriz de troca de ânions" são sinônimas e referem-se a substâncias naturais ou artificiais que podem ligar ânions e podem trocá-los por ânions a partir de um meio circundante. Um trocador de ânions carrega íons positivos e troca contraíons carregados negativamente.

[0249] As VLPs da invenção podem ainda ser tratadas com uma nuclease e / ou serem submetidas à filtração estéril. Um tratamento de nuclease é preferencialmente feito se um ácido nucleico, tal como um vetor de expressão, for usado como carga. Diferentes nucleases são conhecidas pelos versados na técnica e incluem, por exemplo, benzo-nase. As nucleases são usadas para hidrolisar o DNA residual que não foi associado às VLPs. Os métodos para filtração estéril incluem, entre outros, diafiltração ou ultracentrifugação usando filtros adequados para a remoção de impurezas. Estes tratamentos são especialmente vantajosos para a aplicação clínica das VLPs da invenção.

[0250] A distribuição do tamanho de partícula de uma composição compreendendo as VLPs de acordo com a invenção pode ser avaliada como o "índice de polidispersividade" (PDI). O PDI indica a distribuição dos tamanhos de partícula em uma composição e, portanto, descreve a uniformidade das partículas. Os valores de PDI podem ser obtidos usando métodos diferentes, incluindo cromatografia de permeação em gel / cromatografia por exclusão de tamanho, reologia, viscosidade da solução, osmose da membrana ou espalhamento de luz.

[0251] O PDI é de preferência determinado por espalhamento dinâmico de luz (DLS). Em DLS, a distribuição nativa é a distribuição de intensidade que indica quanta luz é espalhada pelas várias "fatias". O DLS permite determinar o tamanho médio e o desvio padrão desse tamanho médio a partir das estatísticas da distribuição. A polidispersividade relativa pode ser determinada dividindo-se o desvio padrão pela média. A partir da polidispersividade relativa de uma distribuição, o índice de polidispersividade (PDI) pode ser derivado como seu quadrado. Os valores de PDI obtidos por DLS podem ser agrupados em composições monodispersas (PDI < 0,1) e composições polidispersas (PDI > 0,1), em que também dentro do grupo polidisperso, valores menores indicam uma distribuição mais uniforme dentro da composição.

[0252] De acordo com a invenção, são preferenciais valores de PDI de 0,1 a 0,4. Mais preferencialmente, o valor do PDI é de 0,1 a 0,3 e ainda mais preferencialmente de 0,1 a 0,2.

[0253] O diâmetro médio de uma composição compreendendo VLPs de acordo com a invenção pode ser medido por métodos visuais, tal como microscopia, de preferência equipados com software para determinar o diâmetro médio, mas também por métodos analíticos de espalhamento de luz, tai como DLS ou método de análise de nanopartícu -las por rastreamento, como NTA.

[0254] O teor de VLPs dentro da composição pode ser medido, por e)emplo, por FFF-MALS e / ou DLS. Ambos os métodos podem distin-guir entre as VLPs de tamanho certo e os agregados, "tinies" (pequenas partículas) e outras impurezas, tais como sais, detritos ou pentâmeros.

[0255] Tal composição compreendendo VLPs de acordo com a invenção, em particular, preenche os requisitos geralmente impostos a um sistema de entrega de fármaco. Obviamente, essa composição é homogênea e tem uma alta pureza.

[0256] Em outro aspecto, a invenção refere-se a um sistema de entrega de fármaco obtido pelo método de acordo com a invenção. Tal sistema de entrega de fármaco tem as vantagens como indicado acima. Em particular, esse sistema de entrega de fármaco pode ser usado em um método de terapia e / ou diagnóstico, preferencialmente para o tratamento de distúrbios neurológicos, isto é, doenças do SNC, ou seja, uma doença de depósito lisossômico, em particular MLD.

[0257] Portanto, a invenção também se refere a um método de tratamento de um distúrbio, em particular uma doença do SNC, ou seja, uma doença de depósito lisossômico, em particular MLD, com o sistema de entrega de fármaco de acordo com a invenção. O método de tratamento compreende, de preferência, a etapa de administrar a entrega do medicamento a um indivíduo em necessidade de tratamento.

[0258] A invenção também se refere ao uso do sistema de entrega de fármaco para a fabricação de um medicamento para o tratamento de distúrbios neurológicos, isto é, doenças do SNC, ou seja, uma doença de depósito lisossômico, em particular MLD. O método de tratamento preferencialmente não compreende uma etapa para aumentar a permeabilidade da BBB do indivíduo a ser tratado. O sistema de entrega de fármaco da invenção, de preferência, é administrado a um paciente que não recebeu nenhum tratamento químico ou físico para prejudicar ou romper a BBB.

[0259] Em uma modalidade, as VLP de acordo com a invenção atravessam a barreira hematoencefálica (BBB). Portanto, em uma modalidade da invenção, o sistema de entrega de fármaco pode ser usado para entregar a enzima lisossômica ou o vetor de expressão que codifica uma enzima lisossômica através da BBB. De acordo com a invenção, um sistema de entrega de fármaco e / ou uma VLP e / ou uma enzima lisossômica e / ou um vetor de expressão que codifica uma enzima lisossômica pode atravessar a BBB.

[0260] Importante, o cruzamento da BBB pelo sistema de entrega de fármaco permite que o sistema de entrega de fármaco mostre sua função de direcionar populações de células específicas dentro do cérebro, isto é, entregar uma carga às células alvo. No contexto da invenção, o dito sistema de entrega de fármaco compreende uma entrega para as células alvo.

[0261] Em uma modalidade preferencial, as VLPs da invenção e / ou sua carga, após administração ao indivíduo a ser tratado, em parti-cular um humano, podem ser detectadas no SNC em menos de 10 dias, preferencialmente em menos de 5 dias, mais preferencialmente em menos de 3 dias após a administração. O sistema de entrega de fármaco é preferencialmente administrado ao indivíduo por via intravenosa. Isso é particularmente vantajoso ao usar as VLPs como um sistema de entrega de fármaco confiável.

[0262] De preferência, o método não requer perda de integridade ou aumento da permeabilidade da BBB.

[0263] De acordo com a invenção, não é necessário prejudicar a permeabilidade da BBB antes ou durante a administração do sistema de entrega de fármaco. Assim, a BBB está preferencialmente fisiologicamente intacta, o que significa que a integridade não diminui e / ou a permeabilidade não aumenta em comparação com o estado nativo sau-dável. As VLPs da invenção atravessam preferencialmente a BBB fisiologicamente intacta.

[0264] A composição compreendendo o sistema de entrega de fármaco preferencialmente não requer um aditivo que possa prejudicar a integridade da BBB. Portanto, em uma modalidade mais preferencial da invenção, o sistema de entrega de fármaco está livre de qualquer aditivo que possa impactar na permeabilidade da BBB.

MATERIAIS E MÉTODOS Fabricação de VLPs

[0265] As partículas semelhantes a vírus (VLPs) foram fabricadas por expressão proteica usando uma linhagem de células de inseto Sf9 derivada da lagarta militar (Spodoptera frugiperda) (Thermo Fischer scientific). As VLPs foram produzidas infectando as células com Baculoví-rus recombinante contendo uma cassete de expressão da proteína VP1 do vírus John Cunningham. O Baculovírus recombinante foi preparado usando o sistema de expressão de Baculovíru s Bac-to-Bac® (Thermo Fischer Scientific). As VLPs foram produzidas em pH 6,3 após 7 a 10 dias em um biorreator de 3,4 L (INFORS HT Minifors). O fluxo e a tem-peratura do ar (26° C) foram controlados ao longo do tempo. Para remover as células e os detritos celulares, a suspensão foi centrifugada a 4° C, 5.000 g e o sobrenadante contendo VLP foi colhido.

[0266] Depois disso, as VLPs foram concentradas usando dois métodos diferentes de concentração: precipitação com polietileno glicol (PEG) a 7 ,5% ou fluxo cruzado com um sistema ÄKTAcross flow™ (GE Healthcare). Para precipitação com PEG, o sobrenadante clarificado foi misturado com PEG para atingir 7,5% (em volume) e incubado por 2 h a 4° C, depois o precipitado foi separado por centrifugação a 4° C, 10.000 g e suspenso em NaCl a 50 mM Tris-HCI a 10 mM, pH 7,5. O fluxo cruzado foi realizado com um sistema ÄKTAcross flow™ equipado com uma membrana de corte de 300 kDa (Hydrosart® 300kDa ECO, Sartorius). A uItrafiltração de fluxo foi realizada com uma pressão constante de 1,5 bar e um fator de 8 (1 L de sobrenadante contra 8 L de tampão).

[0267] As VLPs foram ainda dissociadas em pentâmeros usando DTT a 5mM e EDTA a 10 mM por 70 min em temperatura ambiente e os pentâmeros purificados por cromatografia de troca aniônica (AEX) usando a coluna HiScale CaptoQ (GE Healthcare) com um gradiente de NaCl de 150 mM a 1M. Os pentâmeros foram eluídos com uma etapa de NaCl a 250 mM. Após a eluição, os pentâmeros foram processados da seguinte forma:

[0268] Imediatamente colocados em cassetes de diálise com corte de 20 kDa (dispositivo de diálise Slide-A-Lyzer™ G2, Thermo Scientific) e remontados por remontagem em duas etapas por diálise (diálise em duas etapas). Primeiro, os pentâmeros foram dialisados contra tampão de sulfato de amônio a 2 M ("AS", Tris-HCl a 10 mM, NaCl a 150 mM, (NH4)2SO4, pH 7,5) por 24 h e depois transferidos pelas próximas 24 h para Tris-HCl a 10 mM, NaCl a 150 mM, CaCl2 a 2 mM, pH 7,5 (tampão de reassociação padrão, "ST"). Para separar o material não remontado e os agregados a partir das VLPs, a composição que compreende as VLPs foi purificada por cromatografia por exclusão de tamanho (SEC) usando a coluna HiPrep™ Sephacryl® S-500 HR (GE Healthcare) sob controle do índice de polidispersividade (PDI) das frações em espalhamento dinâmico de luz(DLS) usando Zetasizer ZS Nano (Malvern Inc.). A fração de VLPs com tamanho alvo foi selecionada e combinada e, em seguida, concentrada em concentradores Vivaspin® (Sartorius) com membrana de corte de 5 kDa, se aplicável, seguida de armazenamento a-80° C.

[0269] Detecção de VLPs em oligodendrócitos, neurônios e microglia

[0270] Lâminas do cérebro de camundongo com 10 μm de espes-sura foram reidratadas em xilol, concentrações subsequ entes de etanol de 100% a 70% e depois com água. Depois disso, a peroxidase endógena foi inativada com H2O2 a 0,5% e os sítios de ligação não específicos foram bloqueados com solução de albumina de soro bovino a 3%. A proteína VP1 foi detectada com o anticorpo de VP1 (diluído 1:500 em leite) em combinação com o anticorpo secundário conjugado à fluores-cência. As células do cérebro foram coradas com marcadores específicos de células:

[0271] Olig2 - oligodendrócitos (diluído 1:200 em leite)

[0272] NeuN - neurônios (diluído 1:200 em leite)

[0273] Ibal - célulasda microglia (diluídas 1:200 em leite).

[0274] Os núcleos celulares foram corados com reagente Hoe-chst33342 (2 μg / ml). As fatias foram visualizadas com um microscópio de fluorescência(Nikon).

[0275] Modelo artificial de barreira hematoencefálica (BBB) para verificação da permeação da BBB

[0276] A permeação da BBB de VLPs foi avaliada usando monocul-tura em um modelo artificial de BBB de dois compartimentos por quan-tificação direta de material marcado com fluorescência permeada: 4 kDa FITC-Dextran, 70 kDa TRITC-Dextran, plasmídeo pNL1.1 marcado com FITC (construto) ou Plasmídeo pNL1.1 marcado com FITC empacotado em VLP (empacotamento).

[0277] Para esse fim, os suportes permeáveis de 24 poços (inserto, 1 μm, ThinCert, Greiner Bio-One) foram transferidos para uma placa de 24 poços (Greiner Bio-One) preenchida com 900 μl de meio (DMEM / F-12, HEPES, Thermo Fisher Scientific). Posteriormente, 7,5 * 104 células de BBB (HBEC-5i, endotélio microvascular cerebral) foram semeadas nos insertos com 200 μΙ do mesmo meio. As células foram incubadas de 96 h a 120 h com a troca do meio nos poços a cada dois dias.

[0278] Os insertos preparados foram cuidadosamente transferidos para uma placa fresca de 24 poços preenchida com 900 mL de meio isento de fenol (DMEM / F-12, HEPES, sem fenol vermelho, Thermo Fisher Scientific) por poço. Antes de adicionar a amostra ao inserto, a quantidade correspondente de meio foi removida, para manter uma quantidade constante de 200 mL de meio em cada inserto. Após 120 min de incubação a 37° C em uma incubadora, 3x 100 μl de cada poço foram transferidos para uma placa preta de 96 poços e a fluorescência da amostra foi determinada usando um leitor de placas (Tecan Infinite M200, Tecan).

[0279] A coloração com aglutinina de germe de trigo (WGA) foi realizada colorindo a membrana das células com anticorpo contra WGA conjugado com Alexa488 por mais de 15 minutos em temperatura ambiente.

[0280] Para confirmar a formação de BBB, a BBB foi rompida pela adição de EDTA ao inserto. Os insertos foram transferidos para uma placa de 24 poços contendo meio fresco isento de fenol. EDTA (cEnd = 5 mM, aproximadamente 5 μl) foi adicionado aos insertos e incubado por 90 min a 37° C. Depois, a fluorescênciafoi determinada como descrito acima. A permeação foi calculada normalizando o sinal de fluorescência dos insertos que abrigavam célulasda BBB aos insertos apropriados sem células de BBB. Da mesma maneira, a integridade da BBB foi verificada após a adição de EDTA.

[0281] Clonagem de um vetor de expressão codificando hASA

[0282] Vetores de expressão:

[0283] 1) pFAR-CMV-ASA (3,5 kb)

[0284] 2) pFAR-CAG-ASA (4,6 kb)

[0285] 3) pNL-BB-ASA (4,9 kb)

[0286] 4) corte de pSF-CAG-ASA (3,1 kb+ 3,7 kb*)

[0287] O construto 1 e o construto 2 foram gerados a partir da es-qu eleto de plasmídeo pFAR4 (conforme descrito em SEQ ID NO: 21 de US 8.440.455 B2 e aqui descrito como SEQ ID NO: 7), os promotores CMV e CAG, respectivamente, e o gene ASA humano (SEQ ID NO: 2).

[0288] Para gerar o construto 3 (4,9 kb), o gene hASA (SEQ ID NO: 2) foi inserido em uma estrutura de plasmídeo pNL1.1 (Promega) usando o conjunto de Gibson. O construto compreende um promotor CMV.

[0289] Para gerar o construto 4 (3,1 kb+ 3,7kb), o gene hASA (SEQ ID NO: 2) foi inserido em uma estrutu ra de plasmídeo pSF-CAG (Oxford genetics) e, em seguida, foi linearizado pela digestão por restrição de um vetor de expressão de hASA com a ajuda de duas enzimas de restrição.

Empacotamento de VLPs com o vetor de expressão codificando hASA

[0290] Para empacotar vetores de expressão de hASA em VLPs, as VLPs pré-remontadas foram retiradas de 80° C e descongeladas usando um agitador térmico (23° C, 350 rpm). Posteriormente, as VLPs foram dissociadas incubando as amostras por 15 min a 23° C e 450 rpm na presença de tampão de dissociação (Tris-HCl a 20 mM, NaCl a 150 mM, DTT a 5 mM e EDTA a 10 mM). As VLPs dissociadas foram remontadas na presença de vetores de expressão de hASA. Em resumo, as VLPs dissociadas foram misturadas completamente com o vetor de expressão de hASA em concentrações apropriadas (relação de empacotamento de VLPs para construto de expressão 1:0,2), seguidas de diálise da mistura contra tampão de reassociação padrão (Tris-HCl a 10 mM, NaCl a 150 mM, CaCl2 a 2 mM, pH 7,5) usando uma câmara de diálise de 20 kDa MWCO (dispositivo de diálise Slide-A-Lyzer™ MINI, Thermo Scientific). As amostras foram incubadas por 16 a 18 h. As amostras foram transferidas da câmara de diálise para um copo de reação fresco e os ácidos nucleicos não empacotados, isto é, os vetores de expressão, foram digeridos por incubação com 40 u de Benzonase® Nuclease (Merck) por 25 μg de VLP e MgCl2 a 2,5 mM a 37° C por 1 h. As amostras foram filtradas (filtros de tubo de centrífuga Corning® Costar® Spin-X®; tamanho do poro 0,22 pm) e congeladas em N2 líquido. Posteriormente, as VLPs foram analisadas e / ou armazenadas a -80° C.

Caracterização de VLPs

[0291] Para verificar a estabilidade da amostra, as temperaturas de inflexão para cada amostra foram avaliadas por nDSF usando um Tycho NT.6 (Nanotemper).

[0292] Para analisar a composição da amostra, foi realizado o fracionamento do fluxo de campo de fluxo assimétrico (AF4, Wyatt Inc.). As amostras foram analisadas usando espalhamento de luzde múltiplos ângulos (MALS), espalhamento dinâmico de luz(DLS) e detector de UV.

[0293] As análises por microscopia eletrônica de transmissão (TEM) foram realizadas para visualizar diretamente a amostra em diferentes etapas experimentais com a ajuda de um microscópio eletrônico Zeiss EM900, operando a uma tensão de 80 kV. Para esta abordagem, as amostras foram coradas em grades de cobre revestidas de carbono (Plano GmbH) usando uranil acetato a 2% (Sigma Aldrich) previamente.

[0294] Expressão de hASA nas células: Isolamento de RNA, síntese de cDNA e qPCR

[0295] Após incubação das células por 72 h com as amostras (isto é, VLPs associadas a uma enzima lisossômica ou um vetor de expressão que codifica uma enzima lisossômica), as células de glioblastoma foram colhidas usando tripsina, peletizadas, e lavadas usando PBS.

[0296] O RNA foi isolado a partir do pelete celular utilizando um Kit de Isolamento de RNA (Macherey-Nagel). Após o isolamento, a concentração de RNA foi determinada usando NanoDrop (Thermo Scientific).

[0297] Para a síntese de cDNA foram utilizados 250 ng de RNA. Posteriormente, as amostras de cDNA foram diluídas 1:5 em ddH2O e as amostras foram armazenadas a -20° C até o uso.

[0298] O qPCR foi realizado em um Lightcycler (CFX96 Touch, BioRad) usando EvaGreen Dye e os iniciadores apropriados para hASA em uma diluição de 1:10.

[0299] Injeção de camundongos com VLP / hASA

[0300] Animais: machos BALB / cJ, fornecidos por Janvier Labs, com 10 semanas de idade no início do estudo.

[0301] Grupos:

[0302] Os animais foram injetados uma vez i.v. com 180 μl dos compostos de teste ou veículo. Metade dos camundongos em cada grupo de tratamento foi encerrada 72 h após a injeção, a outra metade foi encerrada 120 h após a injeção.

[0303] Após o término, os animais foram perfundidos com solução salina tamponada com Tris e os seguintes órgãos foram amostrados: cérebro, rim, fígado, pulmão, coração. As amostras de tecido foram congeladas em choque com N2 líquido e armazenadas a -80° C.

Análise de mRNA com qPCR no fígado e cérebro

[0304] Uma parte do tecido foi colocada em 500 μL de TBS + Triton-X100 a 0,5% com RNAse e homogeneizada com sonicação por 3 ciclos de 20 segundos cada. As amostras foram centrifugadas 10 min a 11.000 rpm. O RNA foi isolado do tecido usando um kit de isolamento de RNA (Macherey-Nagel). Após o isolamento, a concentração de RNA foi determinada usando NanoDrop (Thermo Scientific).

[0305] Para a síntese de cDNA foram utilizados 250 ng de RNA. Posteriormente, as amostras de cDNA foram diluidas 1:5 em ddH2O e as amostras foram armazenadas a -20° C até o uso.

[0306] O qPCR foi realizado em um Lightcycler (CFX96 Touch, BioRad) usando EvaGreen Dye e os iniciadores apropriados para hASA em uma diluição de 1:10.

Western Blot

[0307] Uma parte do tecido foi colocada em 500 μL de TBS+ Triton-X100 a 0,5% e homogeneizada com sonicação 3 ciclos de 20 segundos cada. As amostras foram centrifugadas por 10 min a 11.000 rpm e a concentração de proteína foi medida com o ensaio BCA. 50 μg de cada amostra foram colocados em um gel (gradiente 4-20% de SDS-PAGE) e foi realizado um protocolo padrão de eletroforese e blotting. A coloração do anticorpo (anticorpo hASA, 1:500 diluído em leite) foi preparada após lavagem com tampão e bloqueio em leite a 5% durante a noite a 4° C. A coloração secundária de anticorpos foi realizada com anticorpo anticamundongo de cabra conjugado com HRP. Após a coloração, a membrana foi lavada com tampão e desenvolvida. Depois disso, a membrana foi lavada com tampão, removida com tampão de remoção e corada com anticorpo antiactina (1-19) conjugado com HRP (diluição 1:1000 em leite) para a coloração de controle de actina.

EXEMPLOS

[0308] 1. A análise de colocalização revela a presença de proteína VP1 nos oligodendrócitos

[0309] Foi realizada um experimento de colocalização, a fim de identificar as respectivas células-alvo da VLP. Para este fim, a proteína VP1 foi colocalizada com o marcador Olig 2, que está localizado especificamente em oligodendrócitos. Como mostrado no painel inferior es-querdo da Figura 1, usando o marcador 0lig2, vários pontos irregulares poderiam ser detectados na fatia do cérebro, que em todos os casos também são manchadas pela mancha de núcleo DAPI (painel superior esquerdo da Figura 1) e, portanto, indicativo de oligodendrócitos. Cada um desses oligodendrócitos também é positivo para a proteína VP1, como mostrado no painel inferior direito da Figura 1. As células que são positivas para Olig2 e VP1 são marcadas com uma seta branca. Portanto, a proteína VP1 está localizada nos oligodendrócitos do SNC. Como resultado, as VLPs da presente invenção são especialmente ade-quadas para um tratamento terapêutico de doenças associadas a oligodendrócitos, por exemplo, MLD.

[0310] 2. A análise de colocalização revela a presença de proteína VP1 e luciferase nos neurônios

[0311] Em outro experimento de colocalização, a proteína VP1 foi colocalizada com o marcador NeuN, que está especificamente localizado nos neurônios. Como mostrado no painel inferior esquerdo da Figura 2, usando o marcador NeuN, vários pontos irregulares poderiam ser detectados na fatia do cérebro, que em todos os casos também são manchados pela mancha de núcleo DAPI (painel superior esquerdo da Figura 2) e, portanto, indicativo de neurônios. Cada um desses neurônios também é positivo para a proteína VP1, como mostrado no painel inferior direito da Figura 2. As células positivas para NeuN e VP1 são marcadas com uma seta branca. Portanto, a proteína VP1 está localizada nos neurônios do SNC.

[0312] 3. A análise de colocalização revela a presença de proteína VP1 e luciferase nas células da microglia

[0313] Em outro experimento de colocalização, a proteína VP1 foi colocalizada com o marcador Iba1, que está especificamente localizado nas células da microglia. Como mostrado no painel inferior esquerdo da Figura 3, usando o marcador Iba1, vários pontos irregulares poderiam ser detectados na fatia do cérebro, que em todos os casos também são manchados pela mancha de núcleo DAPI (painel superior esquerdo da Figura 3) e, portanto, indicativo de células da microglia. Cada uma dessas células da microglia também é positiva para a proteína VP1, como mostrado no painel inferior direito da Figura 3. As células que são positivas para Iba1 e VP1 são marcadas com uma seta branca. Portanto, a proteína VP1 está localizada nas células da microglia do SNC.

[0314] 4. A VLP associada a um plasmídeo pNL mostra uma boa permeação através da BBB em um modelo BBB in vitro

[0315] As Figuras A e B mostram um modelo de permeação da BBB in vitro. A Figura 4A mostra a coloração DAPI (esquerda) dos núcleos celulares e a coloração WGA (direita) das membranas celulares das cé-lulas da BBB. A camada celular está intacta, representando uma BBB intacta.

[0316] A Figura 4B mostra a permeação de corantes de fluorescên-cia (FITC, TRITC), um corante de fluorescência acoplado a um plasmídeo (FITC-pNL) e uma VLP associada a um plasmídeo pNL através do modelo de BBB. A permeação em % em relação a uma permeação sem células é mostrada. As quatro colunas à esquerda são amostras sem EDTA, as quatro colunas à direita com EDTA. Como pode ser visto, en-quanto todas as quatro amostras cruzaram a BBB artificial até certo ponto, a amostra "Empacotada", que representa a VLP associada a um plasmídeo pNL, apresento u a maior permeação. O rompimento da BBB pelo EDTA abriu a BBB para todas as quatro amostras.

[0317] 5. Aumento significativo dos níveis de mRNA de ASA no cérebro de camundongos saudáveis

[0318] Uma análise de mRNA no fígado e cérebro de camundongos saudáveis injetados com VLP associada a um vetor de expressão que codifica ASA revelo u um aumento significativo do mRNA de ASA no cérebro após 72 e 120 h (Figura 5). A injeção do vetor de expressão (plasmídeo) sem VLP não levou a um aumento da expressão. Portanto, a expressão é encontrada especificamente no cérebro.

[0319] 6. Análises de camundongo simples de mRNA de ASA no cérebro

[0320] Análises de camundongo simples após 72 h (em cima) e 120 h (em baixo) após a injeção de VLP associada a um vetor de expressão que codifica ASA (Figura 6). Os números indicam camundongos simples. Em quase todos os camundongos dessas análises, foi observada uma expressão aumentada de ASA.

[0321] 7. Análises com camundongo simples da proteína ASA no cérebro

[0322] A análise de camundongo simples da proteína ASA (Western blot, superior) no cérebro de camundongos saudáveis após a injeção de VLP associada a um vetor de expressão que codifica ASA e a correspondente análise qPCR (inferior) são mostradas na Figura 7. Veículo (tampão), plasmídeo e plasmídeo + VLP são comparados. É evidente que a associação da VLP com um plasmídeo leva a um au mento do mRNA e da expressão proteica de ASA no cérebro.

[0323] 8. Expressão de ASA com diferentes construtos de expressão de hASA

[0324] A Figura 8 mostra a expressão de ASA humano em células de glioblastoma por qPCR. Os valores foram normalizados para os respectivos controles plasmídicos.

[0325] Os vetores de expressão na Figura 8A são:

[0326] Construto 1: pFAR-CMV-ASA (3,5 kb)

[0327] Construto 2: pFAR-CAG-ASA (4,6 kb)

[0328] Construto 3: pNL-BB-ASA (4,9 kb)

[0329] Construto 4: corte de pSF-CAG-ASA (3,1 kb+ 3,7 kb*)

[0330] A relação de empacotamento de VLP : plasmídeo foi de 1:0,2. Todos os quatro vetores de expressão levam à expressão de ASA.

[0331] Na Figura 8B, o Construto 4 de A (corte de pSF-CAG-ASA (3,1 kb+ 3,7 kb*)) foi usado em duas relações diferentes de empacotamento (alta concentração [VLP : plasmídeo de 1:0,5] e baixa concentração [VLP : plasmídeo de 1:0,2]). Pode-se observar que a baixa concentração [relação de empacotamento VLP : plasmídeo de 1:0,2] leva a uma expressão mais alta de ASA.

[0332] 9. Análises de VLP após associação com diferentes constru-tos de expressão de hASA: análises nDSF e AF4

[0333] A Figura 9A mostra por meio de análises nDSF que todas as quatro amostras (VLPs associadas aos vetores de expressão da Figura 8A) são estáveis. As análises AF4 (Figura 9B) mostram ainda que a fração de VLPs é superior às frações de tinies, agregados e resíduos, pois a maioria das partículas detectadas é VLP, isto é, as VLPs são muito homogêneas.

[0334] 10. Imagens TEM de VLPs associadas a vetores de expressão

[0335] A Figura 10 mostra uma comparação de VLPs não empacotadas (sem vetor de expressão associado) (à esquerda) e VLPs associadas a quatro vetores de expressão diferentes (à direita; os mesmos vetores de expressão que na Figura 8A). Como pode ser visto, todas as amostras mostram VLPs visu almente iguais às VLPs não empacotadas.

MATERIAIS E MÉTODOS PARA EXEMPLOS ADICIONAIS Fabricação de VLPs

[0336] As partículas semelhantes a vírus (VLPs) foram fabricadas por expressão proteica usando uma linhagem de células de inseto Sf9 derivada da lagarta militar (Spodoptera frugiperda) (Thermo Fischer scientific). As VLPs foram produzidas infectando as células com Baculoví-rus recombinante contendo uma cassete de expressão da proteína VP1 do vírus John Cunningham. O Baculovírus recombinante foi preparado usando o sistema de expressão de Baculovíru s Bac-to-Bac® (Thermo Fischer Scientific). As VLPs foram produzidas em pH 6,3 após 7 a 10 dias em um biorreator de 3,4 L (INFORS HT Minifors). O fluxo e a tem-peratura do ar (26° C) foram controlados ao longo do tempo. Para remover as células e os detritos celulares, a suspensão foi centrifugada a 4° C, 5.000 g e o sobrenadante contendo VLP foi colhido.

[0337] Depois disso, as VLPs foram concentradas usando dois métodos diferentes de concentração: precipitação com polietileno glicol (PEG) a 7 ,5% ou fluxo cruzado com um sistema ÄKTAcross flow™ (GE Healthcare). Para precipitação com PEG, o sobrenadante clarificado foi misturado com PEG para atingir 7,5% (em volume) e incubado por 2 h a 4° C, depois o precipitado foi separado por centrifugação a 4° C, 10.000 g e suspenso em NaCl a 50 mM Tris-HCl a 10 mM, pH 7,5. O fluxo cruzado foi realizado com um sistema ÄKTAcross flow™ equipado com uma membrana de corte de 300 kDa (Hydrosart® 300kDa ECO, Sartorius). A ultrafiltração do fluxo foi realizada com uma pressão constante de 1,5 bar e um fator de 8 (1 L de sobrenadante contra 8 L de tampão).

[0338] As VLPs foram ainda dissociadas em pentâmeros usando DTT a 5mM e EDTA a 10 mM por 70 min em temperatura ambiente e os pentâmeros purificados por cromatografia de troca aniônica (AEX) usando a coluna HiScale CaptoQ (GE Healthcare) com um gradiente de NaCl a 150 mM para NaCl a 1M. Os pentâmeros foram eluidos com uma etapa de NaCl a 250 mM. Após a eluição, os pentâmeros foram processados da seguinte forma:

[0339] a) Misturados com carga e remontados (consultar "Empacotamento de pentâmeros frescos ou armazenados com carga");

[0340] b) Congelados a -80° C com glicerol a 5% para armazenamento de pentâmeros (que podem ser posteriormente misturados com carga e remontados, consultar "Empacotamento de pentâmeros frescos ou armazenados com carga") ou

[0341] c) Imediatamente colocados em cassetes de diálise com corte de 20 kDa (dispositivo de diálise Slide-A-Lyzer™ G2, Thermo Scientific) e remontados por remontagem em duas etapas por diálise (diálise em duas etapas). Primeiro, os pentâmeros foram dialisados contra tampão de sulfato de amônio a 2 M ("AS", Tris-HCl a 10 mM, NaCl a 150 mM, NaCl a 150 mM, (NH4)2SO4, pH 7,5) por 24 h e depois transferidos pelas próximas 24 h para Tris-HCl a 10 mM, NaCl a 150 mM, CaCl2 a 2 mM, pH 7,5 (tampão de reassociação padrão, "ST") (AS > ST). Alternativamente, a diálise em duas etapas foi realizada com tampão ST em ambas as etapas (ST > ST). Em ambos os casos, para separar o material não remontado e os agregados da VLP, a composição que compreende as VLPs foi purificada por cromatografia por exclusão de tamanho (SEC) usando a coluna HiPrep™ Sephacryl® S-500 HR (GE Healthcare) sob controle do índice de polidispersividade (PDI) de frações em espalhamento dinâmico de luz(DLS) usando Zetasizer ZS Nano (Malvern Inc.). A fração de VLPs com tamanho alvo foi selecionada e combinada e, em seguida, concentrada em concentradores Vivaspin® (Sar-torius) com membrana de corte de 5 kDa, se aplicável, seguida de armazenamento a -80° C.

Empacotamento de VLPs remontadas com carga

[0342] Para empacotamento de VLPs remontadas, as VLPs armazenadas da etapa c) acima foram retiradas de -80° C e descongeladas usando um agitador térmico (23° C, 350 rpm). Posteriormente, a dissociação das amostras de VLPs descongeladas foi realizada incubando-se as amostras por 15 min a 23° C e 45 rpm na presença de tampão de dissociação (Tris-HCl a 20 mM, NaCl a 150 mM, NaCl a 150 mM, DTT a 5 mM e EDTA a 10 mM). As VLPs dissociadas foram remontadas na presença de carga (por exemplo, ácido nucleico). Em resumo, as VLPs dissociadas foram bem misturadas com a carga em concentrações apropriadas, seguidas de diálise da mistura contra tampão de reassociação padrão (Tris-HCl a 10 mM, NaCl a 150 mM, CaCl2 a 2 mM, pH 7,5) usando uma câmara de diálise MWCO de 20 kDa (Dispositivo de diálise Slide-A-Lyzer™ MINI, Thermo Scientific). Após 4 a 6 h, o tampão de diálise foi substituido por um tampão de diálise fresco e as amostras foram incubadas por mais 16 a 18 h. No caso de usar ácidos nucleicos como carga, os ácidos nucleicos não empacotados foram digeridos por incubação com 40 u de Benzonase® Nuclease (Merck) por 25 μg de VLPs e MgCl2 a 2,5 mM em 37° C por 1 h. As amostras foram filtradas (filtros de tubo de centrifuga Corning® Costar® Spin-X®; tamanho do poro de 0,22 μm) antes da análise. As VLPs foram analisadas diretamente posteriormente e / ou armazenadas a -80° C.

Empacotamento de pentâmeros frescos ou armazenados com carga

[0343] Para empacotamento de pentâmeros, os pentâmeros frescos ou a -80° C foram misturados diretamente e remontados com carga ou descongelados usando um agitador térmico (23° C, 350 rpm) e depois remontados na presença de carga (por exemplo, ácido nucleico). Em resumo, os pentâmeros foram misturados minuciosamente com a carga em concentrações apropriadas, seguidos por diálise da mistura contra tampão de reassociação padrão (Tris-HCl a 10 mM, NaCl a 150 mM, CaCl2 a 2 mM, pH 7,5) usando uma câmara de diálise MWCO de 20 kDa (Dispositivo de diálise Slide-A-Lyzer™ MINI, Thermo Scientific). No caso de utilização de ácidos nucleicos como carga, os ácidos nucleicos não empacotados foram digeridos por incubação com 40 u de Benzonase® Nuclease (Merck) por 25 μg de VLPs remontadas e MgCl2 a 2,5 mM em 37° C por 1 h. Os pentâmeros remontados foram analisados diretamente posteriormente.

Teste de funcionalidade do ensaio de VLP / Luciferase

[0344] No caso de VLPs carregadas com ácidos nucleicos (fabricados a partir de pentâmeros frescos ou armazenados; ou de VLPs remontadas e purificadas), o plasmídeo NanoLuc® da luciferase foi usado como carga. As células de glioblastoma foram semeadas 24 horas de antecedência com uma densidade de 3 * 104 em 900 μΙ de meio DMEM, glicose alta, GutaMAX™ (Thermo Fisher) suplementado com FCS a 10% (Thermo Fisher) e Pen-Strep (PAN-Biotech) a 1%. Antes de adicionar a amostra, a quantidade correspondente de meio foi removida para manter uma quantidade constante de meio em cada poço. As amostras foram adicionadas às células e incubadas por 48 h a 37° C e CO2 a 5%. Depois disso, o meio celular foi eliminado e as células foram lavadas com PBS. A atividade da luciferase foi determinada de acordo com as instruções do fabricante (NanoGlo® luciferase Assay (Promega)). A lu-minescência foi medida em placas brancas de 96 poços (Greiner bio-one) no sistema de detecção Glomax® Multi (Promega).

Caracterização de VLPs

[0345] Para verificar a dissociação, remontagem e estabilidade da amostra, os índices de espalhamento dinâmico de luz (DLS) e de polidispersividade (PDI) das amostras foram medidos usando um Zetasizer Nano ZS (Malvern.). Os tamanhos das VLPs e o PDI foram documenta-dos com o software Zetasizer (versão 7.11, Malvern). Além disso, as temperaturas de inflexão para cada amostra foram avaliadas por nDSF usando um Tycho NT.6 (Nanotemper).

[0346] Para analisar a composição da amostra, foi realizado o fracionamento do fluxo de campo de fluxo assimétrico (AF4, Wyatt Inc.). As amostras foram analisadas usando espalhamento de luzde múltiplos ângulos (MALS), espalhamento dinâmico de luz(DLS) e detector de UV.

[0347] As análises por microscopia eletrônica de transmissão (TEM) foram realizadas para visu alizar diretamente a amostra em diferentes etapas experimentais com a ajuda de um microscópio eletrônico Zeiss EM900, operando a uma tensão de 80 kV. Para esta abordagem, as amostras foram coradas em grades de cobre revestidas de carbono (Plano GmbH) usando uranil acetato a 2% (Sigma Aldrich) previamente.

Modelo artificial de barreira hematoencefálica (BBB) para verificação da permeação da BBB

[0348] A permeação da BBB de VLPs foi avaliada usando monocul-tura (quantificação direta de material marcado com fluorescência permeado) ou cocultura (expressão de proteína causada por material permeado em células alvo) em um modelo artificial de BBB de dois compartimentos.

[0349] Em ambos os casos, os su portes permeáveis de 24 poços (inserto, 0,4 μm, Corning Costar) foram revestidos por 90 minutos a 37° C com uma mistura de Fibronectina 1:20 (BioReagent) e Colágeno tipo 11:75 (Merck Millipore) em solução salina tamponada com fosfato (PBS) com antecedência. Após a remoção cuidadosa do excesso de revestimento, os insertos revestidos foram transferidos para uma placa nova de 24 poços (Greiner Bio-One) preenchida com 900 μl de meio (Endo-GRO, SCME004, Merck Millipore). 7,5 * 104 células de BBB (HBEC-5i, endotélio microvascular cerebral) foram semeadas nos insertos com 200 μl de meio. As célulasforam incubadas por 96 h a 120 h com a troca do meio nos poços a cada dois dias.

Experimentos de monocultura (permeação de carga marcada com fluo-rescência)

[0350] Os insertos preparados foram cuidadosamente transferidos para uma nova placa de 24 poços preenchida com 900 μl de meio sem fenol (DMEM / F-12, HEPES, sem fenol vermelho, Thermo Fisher Scientific) por poço. Antes de adicionar a amostra ao inserto, a quantidade correspondente de meio foi removida, para manter uma quantidade constante de 200 μl de meio em cada inserto. Após 120 min de incubação a 37° C em uma incubadora, 3 x 100 μl de cada poço foram transferidos para uma placa preta de 96 poços e a fluorescênciada amostra foi determinada usando um leitor de placas (Tecan Infinite M200, Te-can).

[0351] Para confirmar a formação de BBB, a BBB foi rompida pela adição de EDTA ao inserto. Os insertos foram transferidos para uma placa de 24 poços contendo meio fresco livre de fenol. EDTA (cEnd = 5 mM, aprox. 5 μΙ) foi adicionado aos insertos e incubados durante 90 minutos a 37° C. Depois, a fluorescênciafoi determinada como descrito acima.

[0352] A permeação foi calcula da normalizando o sinal de fluorescência dos insertos que abrigavam células de BBB aos insertos apropriados sem células de BBB. Da mesma maneira, a integridade da BBB foi verificada após a adição de EDTA.

Experimentos de cocultura (atividade do material permeado)

[0353] Os insertos foram transferidos para uma placa nova de 24 poços, contendo células alvo (células de glioblastoma), que foram semeadas 24 horas de antecedência com uma densidade de 3 * 104 em 900 μl de DMEM, glicose alta, ™ (Thermo Fisher) suplemen-tado com FCS a 10% (Thermo Fisher) e Pen-Strep (PAN-Biotech) a 1%. Antes de adicionar a amostra (VLPs empacotadas com plasmídeo Na-noLuc®) ao inserto, a quantidade correspondente de meio foi removida para manter uma quantidade constante de 200 μl de meio em cada inserto. Após 24 h, o inserto foi removido da placa de 24 poços e lavado usando PBS. Consequentemente, a membrana (abrigando as células de BBB) foi cortada usando um bisturi e transferida para um frasco de reação de 1,5 ml. A atividade da luciferase foi determinada de acordo com as instruções do fabricante (NanoGlo® luciferase Assay (Promega)).

[0354] Os poços (contendo as célulasalvo) foram incubados por mais 24 horas antes da realização do teste de luciferase, de acordo com as instruções do fabricante (NanoGlo® luciferase Assay (Promega)).

Armazenamento com Crioproteção

[0355] Cada crioaditivo glicerol (Carl Roth), sacarose (Carl Roth), suIfato de amônio (Carl Roth), DMSO (Carl Roth) e betaina (Merck) foi adicionado às VLPs, resuItando em uma concentração aditiva final de 1 M, exceto o glicerol com 5% (em volume) correspondente a 0,68 M. Além disso, uma alíquota não continha uma substância aditiva (w / o). As amostras foram divididas e congeladas aplicando duas velocidades de congelamento: Metade de cada amostra foi congelada com uma taxa de resfriamento de aproximadamente -1° C / min (congelamento lento), enquanto a segunda metade foi congelada rapidamente mergulhando os recipientes em nitrogênio líquido (congelamento rápido). Todas as amostras foram armazenadas a -80° C com um período de armazenamento de 1 a 10 dias. Após descongelamento a 23° C e agitação a 350 rpm, as amostras foram dialisadas contra Tris-HCl a 10 mM, NaCl a 150 mM, CaCl2 a 2 mM, pH 7,5 em temperatura ambiente por 2 h para redu-zir a concentração de aditivo e seu impacto nos resultados da análise. O diâmetro das partículas e o PDI foram determinados por um Zetasizer Nanoseries (Malvern). As temperaturas de inflexão foram medidas usando um Tycho NT.6 (Nanotemper). A funcionalidade das VLPs após o armazenamento foi comprovada com a ajuda do empacotamento de plasmídeo NanoLuc® e subsequente ensaio NanoGlo® de luciferase (Promega).

EXEMPLOS ADICIONAIS Exemplo 11: Análises Funcionais

[0356] A carga que entrega a eficácia das VLPs, que foram preparadas usando métodos diferentes, foi comparada (Figura 11). Para este fim, foram geradas VLPs que passaram por duas rodadas de desmontagem e remontagem su bsequente ou uma rodada de desmontagem e remontagem subsequente (em ambos os métodos, a última remontagem na presença de um plasmídeo de luciferase). Notavelmente, a atividade da luciferase das VLPs que passaram por duas rodadas de des-montagem e remontagem subsequente foi significativamente aumen-tada em comparação com as VLPs que passaram por uma rodada de desmontagem e remontagem subsequente e comparada com os controles "somente plasmídeo" e "somente células".

[0357] Em seguida, a capacidade das VLPs preparadas com duas rodadas de desmontagem e su bsequente remontagem para penetrar na barreira hematoencefálica (BBB) foi analisada (Figura 12). A Figura 12A mostra a conFiguração de um modelo artificial de barreira hematoencefálica (BBB) para testar a permeação de BBB por VLPs ou plasmídeo (círculos) em uma conFiguração de monocultura. As células endoteliais do cérebro humano (células de BBB, HBEC-5i) foram colocadas no su-porte permeável. A Figura 12B mostra a permeabilidade das VLPs que passaram por duas rodadas de desmontagem e remontagem subsequente (segunda remontagem na presença de um plasmídeo marcado com fluorescência) em comparação com um controle "somente plasmídeo". As colunas pretas representam experimentos com a BBB intacta. As colunas brancas representam experimentos com uma BBB artificialmente rompida (pela adição de EDTA).surpreendentemente, as VLPs preparadas com duas rodadas de desmontagem e subsequente remontagem foram capazes de atravessar a BBB em relações significativamente maiores do que o plasmídeo nu. O rompimento da integridade da camada de BBB destruiu essa diferença, mostrando a capacidade de penetração seletiva e eficiente das VLPs preparadas com duas rodadas de desmontagem e subsequente remontagem.

[0358] Para avaliar a eficácia de entrega das VLPs geradas com duas rodadas de desmontagem e subsequente remontagem nas células alvo, foi utilizado um modelo de BBB de cocultura (Figura 13). A Figura 13A mostra a conFiguração de um modelo artificial de BBB para testar a permeação de BBB por VLPs ou plasmídeos (círculos) e a subsequ ente expressão proteica causada pelo material permeado nas célula salvo em uma conFiguração de cocuItura. A Figura 13B mostra a atividade da Iuciferase que foi medida nas céluIas de BBB presentes no inserto (nas célulasHBEC-5i) e a atividade da Iuciferase nas células alvo após permeação. Uma BBBa artificial ("Revestimento + células de BBB") e um revestimento sem células de BBB ("Somente revestimento") foram testados. A atividade da luciferase das células dos insertos foi medida apenas quando havia células presentes (portanto, as amostras "Somente revestimento" não apresentaram atividade da luciferase conforme o esperado) e quando o plasmídeo de luciferase foi empacotado em VLPs, preparadas com duas rodadas de desmontagem e remontagem subse-quente (em comparação com somente plasmídeo). A atividade da luciferase das células alvo também foi medida apenas nas amostras com as VLPs preparadas com duas rodadas de desmontagem e remontagem subsequente (comparada com somente plasmídeo), independentemente da presença da camada de células de BBB ou apenas do revestimento.

[0359] Assim, as VLPs preparadas com duas rodadas de desmontagem e subsequ ente remontagem são capazes de passar eficientemente pela BBB, mantendo uma alta capacidade de infectividade e entrega de carga. A amostra (empacotada) significa VLPs que passaram por duas rodadas de desmontagem e remontagem subsequ ente (se-gunda remontagem na presença de um plasmídeo de luciferase).

Exemplo 12: Armazenamento de Pentãmeros vs. Armazenamento de VLPs

[0360] Para investigar a homogeneidade e a uniformidade das composições compreendendo VLPs carregadas que passaram por diferentes procedimentos de armazenamento, foi realizada microscopia eletrônica de transmissão (TEM). As VLPs que foram geradas com uma rodada de desmontagem e remontagem subsequ ente (pentãmeros congelados, esquerda) foram comparadas com as VLPs que foram geradas com duas rodadas de desmontagem e remontagem subsequente (VLPs congeladas, direita) (Figura 14). As VLPs geradas no último caso mostraram uma distribuição significativamente mais uniforme, pois não tinham estruturas visíveis de partículas virais com defeito quando comparadas às VLPs em que os pentâmeros foram congelados durante a fabricação.

[0361] Para investigar melhor a homogeneidade das VLPs carregadas geradas como na Figura 14, foram realizadas análises de FFF-MALS (Figura 15). Ambas as amostras foram comparadas com as VLPs recém-preparadas (sem carga e, portanto, sem desmontagem / remontagem), servindo como referência. surpreendentemente, comparado com a referência (Figura 15 C), as VLPs geradas após duas rodadas de desmontagem e remontagem subsequ ente com congelamento intermediário das VLPs (Figura 15 A) reduziram significativamente a quantidade de agregados de VLP presentes na composição. Além disso, a distribui-ção de VLPs foi ainda mais uniforme. O tamanho das VLPs e a presença de "Tinies" e "Sais, detritos, pentâmeros" foram comparáveis.

[0362] Notavelmente, quando as VLPs foram geradas após uma rodada de desmontagem e subsequente remontagem (pentâmeros congelados), muito poucas VLPs estruturalmente intactas pu deram ser identificadas (Figura 15 Β). Portanto, o método com duas rodadas de desmontagem e remontagem subsequente permite o armazenamento intermediário de VLPs como VLPs remontadas e a geração de uma população altamente uniforme de VLPs carregadas com quase nenhum agregado. As porcentagens são fornecidas excluindo os agregados.

[0363] Para caracterizar ainda mais a estabilidade das VLPs que foram geradas após duas rodadas de desmontagem e remontagem sub-sequente com congelamento intermediário de VLPs ("Amostra (empacotada)", linha sólida) em comparação com as VLPs recém-preparadas (sem carga, portanto sem desmontagem / remontagem, "Amostra (wt)", linha pontilhada), análises nDSF foram realizadas de modo a revelar as temperaturas de fusão (temperaturas de inflexão) (Figura 16). Notavelmente, as curvas de fusão de ambas as amostras de VLP eram dificilmente distinguíveis, mostrando que as VLPs preparadas com duas rodadas de desmontagem e a remontagem subsequente são igualmente estáveis como as VLPs recém-preparadas.

Exemplo 13: Induzindo a agregação antes da remontagem

[0364] Em seguida, foi medido o efeito de induzir agregação durante a remontagem de pentâmeros em VLPs. A homogeneidade foi analisada por DLS (Figura 17 e 18). A Figura 17 mostra o PDI das VLPs obtidas após diálise com indução de agregação (coluna branca) e sem indução de agregação (coluna preta). As VLPs remontadas pela primeira indução de agregação mostraram um PDI fortemente reduzido em comparação com as VLPs remontadas sem indução de agregação. Portanto, a indução de agregação durante a remontagem levou a uma dis-tribuição de tamanho muito mais homogênea. As duas amostras foram coletadas antes do congelamento (portanto, foram submetidas a uma rodada de desmontagem e remontagem).

[0365] A Figura 18 mostra a distribuição de tamanho médio determinada por DLS das amostras preparadas como na Figura 17 (Figura 18, esquerda) e amostras que haviam passado pelas mesmas condições de remontagem, mas por uma etapa de congelamento subsequ ente (Figura 18, direita). Ambas as amostras que foram remontadas com indução de agregação (linhas sólidas) mostram uma distribuição de tamanho muito uniforme, enquanto as amostras que não foram sub-metidas à etapa de agregação (linhas pontilhadas) mostram ao menos duas populações de VLPs. Ainda mais, a etapa de congelamento foi obviamente prejudicial para a última amostra, uma vez que a composição compreendendo as VLPs que foram remontadas sem indução de agregação se tornou consideravelmente mais heterogênea após ο congelamento. No entanto, as VLPs que foram remontadas com a indução de agregação podem ser congeladas sem nenhum impacto na homogeneidade da amostra.

Exemplo 14: Efeito de Crioaditivos

[0366] Para examinar ainda mais o efeito do armazenamento da amostra em VLPs, foram adicionados diferentes crioaditivos às composições que compreendem as VLPs que foram congeladas após uma rodada de desmontagem e remontagem subsequente e duas etapas de diálise, incluindo tampão AS (para indução de agregação durante a remontagem) (Figura 19). A Figura 19A mostra a estabilidade de VLPs carregadas que foram armazenadas como representado conforme analisado por nDSF. Notavelmente, as VLPs que haviam sido armazenadas em um tampão compreendendo sulfato de amônio eram consideravelmente mais estáveis (isto é, mostram uma temperatura de inflexão mais alta) em comparação com os outros crioaditivos. Curiosamente, esse efeito foi independentemente de as VLPs terem sido congeladas rapidamente (colunas pretas) ou lentamente (colunas pontilhadas).

[0367] Em uma próxima etapa, essas amostras foram usadas em um ensaio de luciferase (Figura 19B). Inesperadamente, a atividade da luciferase foi fortemente aumentada por VLPs que foram armazenadas em uma composição compreendendo sulfato de amônio. A betaína também foi vantajosa em comparação com a amostra sem crioaditivo e os outros aditivos testados. Portanto, ou so de crioaditivos, especialmente sulfato de amônio, aumentou consideravelmente a estabilidade das VLPs e aumentou a capacidade de infectividade e entrega de carga das VLPs carregadas. Novamente, esse efeito foi independente de as VLPs terem sido congeladas rapidamente (colunas pretas) ou lentamente (colunas brancas).

MODALIDADES

[0368] 1. VLP associada a uma enzima lisossômica ou um vetor de expressão que codifica uma enzima lisossômica para uso em um método para o tratamento de uma doença de depósito lisossômico em um indivíduo.

[0369] 2. VLP para uso de acordo com a modalidade 1, em que a VLP não compreende material genético viral e o vetor de expressão não codifica proteínas virais.

[0370] 3. VLP para uso de acordo com a modalidade 1 ou 2, em que o indivíduo é um animal ou um ser humano, de preferência um ser hu-mano.

[0371] 4. VLP para uso de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o indivíduo tem um deficit neurológico.

[0372] 5. VLP para uso de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a enzima lisossômica é uma enzima humana.

[0373] 6. VLP para uso de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a enzima lisossômica é a arilsulfatase A.

[0374] 7. VLP para uso de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a enzima lisossômica compreende uma sequên-cia de aminoácidos que é ao menos 80%, mais preferencialmente ao menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 1 ao longo de todo o seu comprimento, preferencialmente tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

[0375] 8. VLP para uso de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a doença de depósito lisossômico é a Doença de Leucodistrofia Metacromática (MLD).

[0376] 9. VLP para uso de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o vetor de expressão tem um tamanho inferior a 7 kb, de preferência inferior a 6 kb.

[0377] 10. VLP para uso de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o vetor de expressão tem um promotor selecionado a partir do grupo que compreende CMV e CAG.

[0378] 11. VLP para uso de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a enzima lisossômica compreende uma se-quência de nucleotídeos que é ao menos 70%, mais preferencialmente ao menos 80%, mais preferencialmente ao menos 90% idêntica à se-quência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 2 ao longo de todo o seu comprimento, de preferência é a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2.

[0379] 12. VLP para uso de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a VLP é derivada de um vírus de polioma hu-mano, preferencialmente JCV.

[0380] 13. VLP para uso de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a VLP atravessa a barreira hematoencefálica, preferencialmente a barreira hematoencefálica fisiologicamente intacta, para entrar no SNC juntamente com a enzima lisossômica ou o vetor de expressão.

[0381] 14. VLP de acordo com a modalidade 13, em que a enzima lisossômica ou o vetor de expressão entra em astrócitos, oligodendróci-tos, microglia ou neurônios, preferencialmente oligodendrócitos.

[0382] 15. VLP para uso de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a VLP é administrada por via oral ou parentérica, de preferência por via intravenosa.

[0383] 16. VLP para uso de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que uma célula-alvo é colocada em contato com uma quantidade eficaz da enzima lisossômica.

[0384] 17. VLP para uso de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a enzima lisossômica tem uma atividade en-zimática terapeuticamente eficaz por ao menos 10 dias, preferencialmente por ao menos 20 dias, mais preferencialmente por ao menos 30 dias.

[0385] 18. VLP para uso de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a VLP é composta de proteínas VP1 do vírus JC.

[0386] 19. VLP de acordo com a modalidade 18, em que a proteína VP1 compreende uma sequência de aminoácidos que é ao menos 80% idêntica à sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 3 ao longo de todo o seu comprimento, de preferência ao menos 90% idêntica.

[0387] 20. Composição farmacêutica para uso em um método para o tratamento de uma doença de depósito lisossômico em um indivíduo, em que a composição farmacêutica compreende a VLP de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 19 e um veículo farmaceuticamente aceitável, e / ou excipiente.

[0388] 21. Vetor de expressão tendo uma região de codificação que codifica uma enzima lisossômica, preferencialmente a arilsulfatase hu-mana A, um promotor selecionado a partir do grupo que compreende CAG e CMV, sendo preferencialmente CAG, e tendo um tamanho inferior a 7 kb, preferencialmente inferior a 6 kb.

[0389] 22. Vetor de expressão de acordo com a modalidade 21, em que a enzima lisossômica compreende uma sequência de nucleotídeos que é ao menos 70%, mais preferencialmente ao menos 80%, mais preferencialmente ao menos 90% idêntica à sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 2 ao longo de todo o seu comprimento, preferencialmente, é a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2.

[0390] 23. Método para associar uma VLP com uma enzima lisossômica, preferencialmente arilsulfatase humana A, ou um vetor de expressão que codifica uma enzima lisossômica, preferencialmente arilsuIfatase humana A, em que o método compreende as seguintes etapas:

[0391] a) fornecer uma composição compreendendo proteínas VP1,

[0392] b) expor as proteínas VP1 da composição de a) a condições que induzem a VP1 a se montar em VLPs,

[0393] c) expor as VLPs da composição de b) a condições de desmontagem das VLPs em pentâmeros,

[0394] d) expor os pentâmeros da composição de c) a condições que induzam os pentâmeros a se remontarem em VLPs

[0395] e) expor as VLPs da composição de d) a condições de desmontagem das VLP em pentâmeros,

[0396] f) expor os pentâmeros da composição de e) à enzima lisos-sômica ou ao vetor de expressão a condições que induzem a montagem dos pentâmeros em uma VLP associada à enzima lisossômica ou ao vetor de expressão.

[0397] 24. VLP obtida pelo método de acordo com a modalidade 23.

Claims (32)

1. VLP incorporando uma enzima lisossômica ou incorporando um vetor de expressão que codifica uma enzima lisossômica para uso em um método para o tratamento da Doença da Leucodistrofia Me-tacromática (MLD) em um indivíduo, caracterizada pelo fato de que a VLP é derivada de JCV.
2. VLP para uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a VLP não compreende material genético viral e o vetor de expressão não codifica proteínas virais.
3. VLP para uso, de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o indivíduo é um animal ou um ser hu-mano, de preferência um ser humano.
4. VLP para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o indivíduo tem um deficit neurológico.
5. VLP para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que a enzima lisossômica é uma enzima humana.
6. VLP para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que a enzima lisossômica é a arilsulfatase A.
7. VLP para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que a enzima lisossômica compreende uma sequência de aminoácidos que é ao menos 80%, mais preferencialmente ao menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 1 ao longo de todo o seu comprimento, mais preferencialmente, tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.
8. VLP para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que o vetor de expressão tem um tamanho inferior a 7 kb, de preferência inferior a 6 kb.
9. VLP para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que o vetor de expressão tem um promotor selecionado a partir do grupo que compreende CMV e CAG.
10. VLP para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que a enzima lisossômica compreende uma sequência de nucleotídeos que é ao menos 70%, mais preferencialmente ao menos 80%, mais preferencialmente ao menos 90% idêntica à sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 2 ao longo de todo o seu comprimento, de preferência é a sequência de nu-cleotídeos de SEQ ID NO: 2.
11. VLP para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que a VLP atravessa a barreira hematoencefálica, preferencialmente a barreira hematoencefálica fisiologicamente intacta, para entrar no SNC juntamente com a enzima lisossômica ou o vetor de expressão.
12. VLP, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que a enzima lisossômica ou o vetor de expressão entra em astrócitos, oligodendrócitos, microglia ou neurônios, preferencialmente oligodendrócitos.
13. VLP para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que a VLP é administrada por via oral ou parentérica, de preferência por via intravenosa.
14. VLP para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que uma célula-alvo é colocado em contato com uma quantidade eficaz da enzima lisossômica.
15. VLP para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que a enzima lisossômica tem uma atividade enzimática terapeuticamente eficaz por ao menos 10 dias, preferencialmente por ao menos 20 dias, mais preferencialmente por ao menos 30 dias.
16. VLP para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que aVLP é composta por proteínas VP1 do virus JC.
17. VLP, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que a proteína VP1 compreende uma sequência de aminoácidos que é ao menos 80% idêntica à sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 3 ao longo de todo o seu comprimento, de preferência ao menos 90% idêntica.
18. Composição farmacêutica para uso em um método para o tratamento de uma doença de depósito lisossômico em um indivíduo, caracterizada pelo fato de que a composição farmacêutica compreende a VLP como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 17 e um veículo farmaceuticamente aceitável, e / ou excipiente.
19. Vetor de expressão tendo uma região de codificação caracterizado pelo fato de que codifica uma enzima lisossômica, preferencialmente a arilsulfatase humana A, um promotor selecionado a partir do grupo que compreende CAG e CMV, sendo preferencialmente CAG, e tendo um tamanho inferior a 7 kb, preferencialmente inferior a 6 kb.
20. Vetor de expressão, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a enzima lisossômica compreende uma sequência de nucleotídeos que é ao menos 70%, mais preferencialmente ao menos 80%, mais preferencialmente ao menos 90% idêntica à sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 2 ao longo de todo o seu comprimento, preferencialmente, é a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2.
21. Método para incorporar uma enzima lisossômica, preferencialmente arilsuIfatase humana A, ou incorporar um vetor de expressão que codifica uma enzima lisossômica, preferencialmente arilsuIfatase humana A, em uma VLP, caracterizado pelo fato de que o método compreende as seguintes etapas:

    • a) fornecer uma composição compreendendo proteínas VP1,
    • b) expor as proteínas VP1 da composição de a) a condições que induzem a VP1 a se montar em VLPs,
    • c) expor as VLPs da composição de b) a condições de desmontagem de VLPs em pentâmeros,
    • d) expor os pentâmeros da composição de c) a condições que induzam os pentâmeros a se remontarem em VLPs,
    • e) expor as VLPs da composição de d) a condições de desmontagem de VLPs em pentâmeros,
    • f) expor os pentâmeros da composição de e) à enzima lisossômica ou ao vetor de expressão a condições que induzem a montagem dos pentâmeros em uma VLP associada à enzima lisossômica ou ao vetor de expressão.
22. VLP caracterizada pelo fato de que é obtido pelo método como definido na reivindicação 21.
23. Sistema de entrega de fármaco obtido pelo método de acordo com a reivindicação 21.
24. VLP caracterizada pelo fato de que é para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, como um sistema de entrega de fármaco.
25. VLP para uso, de acordo com a reivindicação 24, caracterizada pelo fato de que o método de tratamento de MLD não compreende uma etapa de aumentar a permeabilidade de uma BBB do in-divíduo a ser tratado.
26. Método de tratamento de MLD com VLP caracterizado pelo fato de que incorpora uma enzima lisossômica ou um vetor de expressão que codifica uma enzima lisossômica, em que a VLP é derivada de JCV.
27. VLP incorporando uma enzima lisossômica ou um vetor de expressão caracterizada pelo fato de que codifica uma enzima lisossômica para uso no fornecimento da enzima lisossômica ou no vetor de expressão que codifica a enzima lisossômica para um alvo, em que o alvo é o SNC.
28. VLP para uso, de acordo com a reivindicação 27, caracterizada pelo fato de que a enzima lisossômica ou o vetor de expressão que codifica a enzima lisossômica é entregue a uma célula-alvo no SNC, em particular um astrócito, um oligodendrócito, um neurônio e / ou microglia.
29. VLP para uso, de acordo com a reivindicação 28, caracterizada pelo fato de que a enzima lisossômica é transientemente expressa na célula-alvo.
30. VLP incorporando uma enzima lisossômica ou um vetor de expressão caracterizada pelo fato de que codifica uma enzima lisossômica para uso no aumento da atividade da enzima lisossômica.
31. Uso da VLP de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para o tratamento de MLD.
32. Uso do sistema de entrega de fármaco de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para o tratamento de MLD.

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