BR112021010758A2 - Método para fornecer uma vlp derivada de vírus john cunningham - Google Patents

Abstract

a presente invenção refere-se a um método para fornecer uma partícula semelhante a vírus (vlp) derivada de vírus john cunningham (jcv), refere-se a uma vlp associada com uma carga, em particular uma proteína, e um sistema de liberação de fármaco (dds) obtenível pelo referido método, em particular para cruzar a barreira hematoencefálica (bbb), e uma composição contendo vlp. o método compreende as etapas de desmontagem de vlp em pentâmeros, induzindo os pentâmeros à agregação e remontagem em vlp.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODO

PARA FORNECER UMA VLP DERIVADA DE VÍRUS JOHN CUNNINGHAM". CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se a um método para fornecer uma partícula semelhante a vírus (VLP) derivada de vírus John Cunningham (JCV), se refere a uma VLP associada com uma carga, em particular uma proteína, e um sistema de liberação de fármaco (DDS) obtenível pelo referido método, em particular para cruzar a barreira hematoencefálica (BBB), e uma composição contendo VLP. O método inventivo é particularmente adequado para fornecer uma VLP associada com uma carga, em particular uma proteína.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] A barreira hematoencefálica (BBB) é uma membrana altamente seletiva e permeável entre o sangue e o cérebro. A barreira funciona para separar o sangue circulante do fluido extracelular cerebral (BECF) no sistema nervoso central (SNC). A BBB é altamente seletiva em natureza e permite, por difusão passiva, apenas a passagem de moléculas solúveis em lipídio, água e certos gases. A barreira também transporta seletivamente moléculas, tais como glicose e aminoácidos, que são essenciais para as funções neurais. Além disso, a BBB impede a entrada de neurotoxinas potenciais lipofílicas no cérebro.

[003] Sob condições fisiológicas a BBB funciona eficazmente para impedir substancialmente que o material indesejado entre no SNC. Produtos nanoterapêuticos grandes e a grande maioria de moléculas pequenas (estimadas são 98% das moléculas pequenas) são restritos a entrar no cérebro por causa da BBB. Sob condições fisiológicas (saudáveis), a função da BBB é, portanto, inestimável. No evento de uma doença do SNC ou qualquer outro transtorno que requer o tratamento do SNC com um produto farmacêutico, entretanto, a BBB constitui um maior obstáculo para um tratamento eficaz.

[004] Além do problema de transferir com êxito o produto farmacêutico (fármaco, carga) através da BBB, deve-se prestar atenção a estes problemas, que podem ser encontrados durante a liberação no SNC. Mesmo se o produto farmacêutico cruza a BBB, ele pode não estar presente em uma concentração terapeuticamente relevante. Além disso, certas enzimas no tecido cerebral podem inativar o produto farmacêutico, tornando-o ineficaz ou menos eficaz. Assim, o produto farmacêutico pode ser capaz de cruzar a BBB, mas pode ser desconstruído uma vez que ele está dentro do cérebro.

[005] Várias estratégias são conhecidas por afetar o transporte de um produto farmacêutico através da BBB. A extensão à qual um produto farmacêutico é realmente capaz de penetrar no cérebro varia de uma estratégia para a outra. Uma estratégia é aumentar a permeabilidade da BBB. Com isso, não apenas a quantidade do produto farmacêutico que cruza a BBB pode ser aumentada, mas tanto as formas livres e ligadas do produto farmacêutico podem ser feitas para cruzar a barreira.

[006] Meios para aumentar a permeabilidade da BBB incluem uma abertura osmótica ou abertura química. A abertura osmótica pode ser possível com hipertônicos, que têm a capacidade de romper a BBB quando aplicados diretamente sobre sua superfície. A abertura química é uma abordagem mais seletiva e controlável de aumentar a permeabilidade da BBB. Capilares normais parecem não ser afetados quando tratamentos com leucotrieno vasoativo são usados para aumentar sua permeabilidade. Capilares de tumor cerebral são mais sensíveis a estes tratamentos. Estudos revelaram que a bradicinina abre os capilares de tumor cerebral sem afetar os capilares no cérebro normal.

[007] Vasodilatação cerebral ou radiação de ultrassom focalizado representam outras abordagens para aumentar a permeabilidade da BBB. Vasodilatação cerebral se refere ao processo de ampliação de vasos sanguíneos para aumentar fluxo sanguíneo cerebral. Radiação de ultrassom focalizado, isto é, ultrassom guiado por MRI de baixa frequência (por exemplo, 260 kHz), pode induzir o rompimento localizado e reversível da barreira.

[008] Uma outra abordagem de transportar um produto farmacêutico no SNC é o uso de um sistema de liberação de fármaco com base em partículas semelhantes a vírus (VLP) derivadas de vírus John Cunningham (JCV). As VLP são carregadas com um fármaco ("carga"). Um tal sistema de liberação de fármaco é revelado no documento WO 2013/131644 A1. É descrito que, depois da administração intravenosa, a VLP pode cruzar a BBB sem uma manipulação anterior da mesma, transportando assim o fármaco junto com a VLP sobre uma BBB fisiologicamente intacta. Um método para a produção de um sistema de liberação de fármaco compreendendo VLP de JCV é o assunto do documento WO 2013/017272 A1.

[009] A descrição do documento WO 2013/131644 A1 forneceu a primeira evidência experimental do cruzamento de uma VLP de JCV sobre a BBB fisiológica intacta in vivo. Consequentemente a VLP de JCV carregada com um produto farmacêutico são sistemas de liberação de fármaco promissores para entrar no SNC. Entretanto, existe ainda uma necessidade de melhorar ainda mais a eficácia deste sistema.

[010] Entre os fármacos aos quais as VLP são carregadas (associadas), é particularmente desafiador carregar a VLP com uma proteína porque VLP sendo composto de proteínas pode interferir estruturalmente com a proteína a ser carregado, especialmente quando o ponto isoelétrico das proteínas que formam a VLP é similar ao ponto isoelétrico da proteína a ser carregada. Em particular é desafiador se a proteína deve ser incorporada na VLP, em particular se a proteína for grande, tal como um fragmento de anticorpo ou um anticorpo.

[011] Consequentemente, existe ainda uma necessidade de fornecer VLP associada com uma proteína, em particular uma proteína grande tal como um anticorpo.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[012] Assim, é um objetivo da presente invenção fornecer uma VLP derivada de vírus John Cunningham (JCV), em particular para a liberação de um produto farmacêutico no SNC, que tem uma eficácia melhorada. Uma eficácia melhorada em particular significa que mais carga atinge o SNC. A eficácia melhorada pode ter várias razões, que podem interagir. A eficácia mais alta pode, por exemplo, ser devido a um cruzamento mais eficaz da BBB pela VLP, de modo que uma quantidade mais alta de VLP e/ou carga entra no SNC. Isto pode ser igualmente devido a uma liberação melhorada da carga da VLP depois de atingir o SNC. Além disso, uma razão para a eficácia mais alta pode ser o fato de que cada VLP individual pode ser carregada com uma quantidade mais alta de carga ou a quantidade global de VLP carregada pode ser aumentada.

[013] Foi surpreendentemente descoberto pelos inventores que uma VLP derivada de JCV com uma eficácia melhorada pode ser fornecida, quando o método para a produção da referida VLP compreende duas vezes as etapas de desmontar a VLP em pentâmeros e remontar os pentâmeros em uma VLP e compreendendo uma etapa de agregar os pentâmeros antes da segunda etapa de remontagem. O método compreende as etapas seguintes a) fornecer uma composição compreendendo proteínas VP1 de JCV, b) expor as proteínas VP1 da composição de a) a condições que induzem a VP1 a se montar em VLP,

c) expor a VLP da composição de b) a condições que desmontam a VLP em pentâmeros, d) expor os pentâmeros da composição de c) a condições induzindo os pentâmeros a se remontar em VLP, e) expor a VLP da composição de d) a condições que desmontam a VLP em pentâmeros, f) expor os pentâmeros da composição de e) a condições que induzem a agregação dos pentâmeros, e g) expor os pentâmeros agregados da composição de f) a uma carga, em particular uma proteína, sob condições induzindo os pentâmeros agregados a se montar em uma VLP associada com a carga, em particular a proteína.

[014] Foi surpreendentemente descoberto que o método inventivo permite carregar uma VLP com uma carga, em particular uma proteína tal como um anticorpo, de modo que a carga, em particular a proteína tal como um anticorpo, seja associada com a VLP. As VLP associadas com a carga, em particular a proteína tal como um anticorpo, são homogêneas em tamanho e têm essencialmente a mesma faixa de tamanho como VLP "vazia" (isto é, não associada com uma carga). A carga, em particular a proteína, tal como um anticorpo, pode ser eficientemente liberada em células. Além disso, a permeação de carga, em particular proteína, tal como um anticorpo, através da BBB foi surpreendentemente alta quando a carga, em particular a proteína, tal como um anticorpo, foi associada com uma VLP.

[015] É particularmente preferido que os pentâmeros agregados na etapa g) são induzidos a se montar em uma VLP que incorpora a carga, em particular a proteína.

[016] Um sistema de liberação de fármaco obtenível pelo método de acordo com a invenção também é fornecido. Consequentemente, um sistema de liberação de fármaco compreendendo VLP derivada de

JCV também pode ser fornecido pelas etapas a) a g) do método como acima.

[017] Ainda em um outro aspecto da invenção, a invenção se refere a um método para fornecer uma VLP derivada de JCV, em particular a um sistema de liberação de fármaco compreendendo uma VLP derivada de JCV, como descrito acima (etapas a) a g)) mas sem etapa de agregação f). Tal método para fornecer um sistema de liberação de fármaco compreendendo uma VLP derivada de JCV compreende as etapas seguintes: a) fornecer uma composição compreendendo proteínas VP1, b) expor as proteínas VP1 da composição de a) a condições que induzem a VP1 a se montar em VLP, c) expor a VLP da composição de b) a condições que desmontam a VLP em pentâmeros, d) expor os pentâmeros da composição de c) a condições induzindo os pentâmeros a se remontar em VLP e) expor a VLP da composição de d) a condições que desmontam a VLP em pentâmeros, f) expor os pentâmeros da composição de e) a uma carga e condições induzindo os pentâmeros a se montar em uma VLP associada com a carga.

[018] A eficácia melhorada do sistema de liberação de fármaco obtenível pelo método de acordo com a invenção é demonstrada pela expressão aumentada de luciferase, quando a carga do sistema de liberação de fármaco é o plasmídeo de expressão de luciferase NanoLuc® (Exemplo 1 abaixo, Figura 1, Exemplo 1 é sem etapa de agregação f)). Com isso, adicionalmente, a adequabilidade do sistema de liberação de fármaco da invenção para a liberação de ácidos nucleicos como carga é mostrada.

[019] O Exemplo 1, além disso, fornece evidência de que a VLP obtida na etapa f) eficientemente cruza a BBB (Exemplo 1 abaixo, Figuras 2 e 3). Com isso, evidência é fornecida, de que a VLP pode ser usada como um sistema de liberação de fármaco para o transporte de um fármaco no SNC.

[020] Além disso, foi descoberto que as VLP obtidas na etapa d), são particularmente adequadas para armazenamento. Elas retêm as condições de armazenamento de -80 °C por um período de mais do que 24 h. Depois do armazenamento a VLP pode ser processada ainda para fornecer o sistema de liberação de fármaco ou a VLP. Consequentemente elas representam um produto intermediário armazenável adequado durante a fabricação de um sistema de liberação de fármaco compreendendo VLP associada com uma carga ou durante a fabricação de uma VLP associada com uma carga, em particular uma proteína.

[021] Em um aspecto particular, assim, a invenção se refere a um método para fornecer VLP com uma adequabilidade aumentada para armazenamento. Tais VLP, por razões práticas, substancialmente facilitam a produção do sistema de liberação de fármaco. Isto permite a fabricação em larga escala de VLP e, depois, seu armazenamento intermediário sem carga. Depois do armazenamento, a pedido do cliente individual, a VLP armazenada pode ser processada ainda e carregada com a carga desejada. Portanto, o armazenamento intermediário da VLP fornecida na etapa d) permite mais flexibilidade no processo de fabricação de um sistema de liberação de fármaco com base em VLP.

[022] Além disso, foi descoberto que as VLP descritas nesta invenção fornecidas com duas etapas de desmontagem e remontagem são estáveis. Sua estabilidade pode ser igualmente comparada com as VLP que são o resultado da produção de VP1 e uma montagem direta subsequente, isto é, sem uma etapa de desmontagem/remontagem

(Figura 6). A partir daí, segue-se que as duas etapas de desmontagem e remontagem de acordo com a invenção, surpreendentemente, não têm um impacto negativo sobre a estabilidade da VLP.

[023] Ainda em um outro aspecto, a invenção se refere a um sistema de liberação de fármaco ou uma composição compreendendo VLP.

[024] Adicionalmente, foi surpreendentemente descoberto que a homogeneidade da composição compreendendo VLP pode ser melhorada remontando-se os pentâmeros da etapa d) em duas etapas, ao passo que a primeira etapa compreende induzir a agregação dos pentâmeros da etapa c) e a segunda etapa compreende separar os pentâmeros das condições que induzem a agregação dos pentâmeros (Exemplo 3 abaixo, Figuras 7 e 8).

[025] Uma distribuição de tamanho homogênea da composição compreendendo VLP é vantajosa porque ela permite produzir uma população definida de VLP para o uso como o sistema de liberação de fármaco que é importante para satisfazer um padrão de qualidade definido.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[026] Figura 1 Atividade de luciferase medida em células de glioblastoma transfectadas com VLP preparada de acordo com a invenção sem a etapa de agregação f) (duas rodadas de desmontagem e remontagem) ou com VLP tendo sido desmontada e remontada apenas uma vez (estado da técnica)

[027] Figura 2 Configuração (A) de um modelo de BBB como uma monocultura e permeabilidade (B) de VLP preparada de acordo com a invenção sem a etapa de agregação f)

[028] Figura 3 Configuração (A) de um modelo de BBB como uma cocultura e permeabilidade (B) de VLP preparada de acordo com a invenção sem a etapa de agregação f)

[029] Figura 4 Imagens TEM de VLP de acordo com a invenção sem a etapa de agregação f) (depois de duas rodadas de desmontagem/remontagem) versus VLP do estado da técnica (depois de uma rodada de desmontagem e remontagem), e com armazenamento intermediário

[030] Figura 5 Análises FFF-MALS de VLP de acordo com a invenção sem a etapa de agregação f) (depois de duas rodadas de desmontagem e remontagem) com armazenamento intermediário da VLP (A), VLP com uma rodada de desmontagem e remontagem com armazenamento intermediário dos pentâmeros (B) e VLP recentemente preparada (C).

[031] Figura 6 Análises nDSF de VLP recentemente preparada e VLP de acordo com a invenção sem a etapa de agregação f) (duas rodadas de desmontagem e remontagem) com armazenamento intermediário

[032] Figura 7 Análises DLS que mostram o PDI de VLP de acordo com a etapa d) da invenção com ou sem induzir a agregação de pentâmeros antes do armazenamento

[033] Figura 8 Análises DLS que mostram o diâmetro médio de VLP de acordo com a etapa d) da invenção com ou sem induzir a agregação de pentâmeros antes do armazenamento e depois do armazenamento

[034] Figura 9 Análises nDSF (A) e Atividade de Luciferase (B) de VLP armazenada com diferentes crioaditivos (VLP preparada sem a etapa de agregação f)

[035] Figura 10 Imagens TEM de VLP de acordo com a invenção (com a etapa de agregação f), associada com anticorpos IgG (A) ou IgM (B)

[036] Figura 11 Análises DLS que mostram o diâmetro médio de pentâmeros (VLP (dissociada)) e VLP "vazia" (VLP (amostra original))

[037] Figura 12 Análises DLS que mostram o diâmetro médio de VLP de acordo com a invenção (com a etapa de agregação f), associada com Anticorpos de IgG (A) ou IgM (B)

[038] Figura 13 Citometria de fluxo de células de glioblastoma incubadas com VLP de acordo com a invenção (com a etapa de agregação f), associada com anticorpos IgG ou IgM

[039] Figura 14 Microscopia confocal de células de glioblastoma incubadas com VLP de acordo com a invenção (com a etapa de agregação f). A: Controle com anticorpo livre; B: Incubação com VLP associada com anticorpo IgM

[040] Figura 15 Microscopia confocal de células de glioblastoma incubadas com VLP de acordo com a invenção (com a etapa de agregação f) associada com o anticorpo IgM mostrado no eixo x, y e z (pilha Z)

[041] Figura 16 Microscopia confocal de células de glioblastoma incubadas com VLP de acordo com a invenção (com a etapa de agregação f) associada com anticorpo IgG anti-tubulina mostrado no eixo x, y e z (pilha Z)

[042] Figura 17 Permeabilidade de VLP de acordo com a invenção (com a etapa de agregação f) associada com anticorpos IgG ou IgM através da BBB (modelo de BBB) Descrição Detalhada da Invenção

[043] Em um primeiro aspecto da invenção, a invenção se refere a um método para fornecer uma partícula semelhante a vírus (VLP) derivada de vírus John Cunningham (JCV) compreendendo as etapas seguintes: a) fornecer uma composição compreendendo proteínas VP1, b) expor as proteínas VP1 da composição de a) a condições que induzem a VP1 a se montar em VLP,

c) expor a VLP da composição de b) a condições que desmontam a VLP em pentâmeros, d) expor os pentâmeros da composição de c) a condições induzindo os pentâmeros a se remontar em VLP e) expor a VLP da composição de d) a condições que desmontam a VLP em pentâmeros, f) expor os pentâmeros da composição de e) a condições que induzem a agregação dos pentâmeros, e g) expor os pentâmeros agregados da composição de f) a uma carga, em particular uma proteína, sob condições induzindo os pentâmeros agregados a se montar em uma VLP associada com a carga, em particular a proteína.

[044] Ainda em um outro aspecto da invenção, a invenção se refere a um método para fornecer uma VLP derivada de JCV, em particular a um sistema de liberação de fármaco compreendendo uma VLP derivada de JCV, como descrito nas (etapas a) a g)) acima mas sem a etapa de agregação f). Tal método para fornecer um sistema de liberação de fármaco compreendendo uma VLP derivada de JCV compreende as etapas seguintes: a) fornecer uma composição compreendendo proteínas VP1, b) expor as proteínas VP1 da composição de a) a condições que induzem a VP1 a se montar em VLP, c) expor a VLP da composição de b) a condições que desmontam a VLP em pentâmeros, d) expor os pentâmeros da composição de c) a condições induzindo os pentâmeros a se remontar em VLP e) expor a VLP da composição de d) a condições que desmontam a VLP em pentâmeros, f) expor os pentâmeros da composição de e) a uma carga e condições induzindo os pentâmeros a se montar em uma VLP associada com a carga.

[045] No contexto da presente invenção, e para a facilidade de explanação, a VLP resultante da etapa b) também pode ser denominada "pVLP" (VLP primária). A VLP resultante da etapa d) também pode ser denominada "rVLP" (VLP remontada). A VLP como o resultado da etapa g) também pode ser denominada "cVLP" (VLP de carga).

[046] Em um segundo aspecto da invenção, a invenção se refere a uma composição compreendendo partículas semelhantes a vírus (VLP) derivadas de vírus John Cunningham (JCV) caracterizadas por um ou mais dos parâmetros seguintes: a. um índice de polidispersibilidade (PDI) de menos do que 0,3, preferivelmente menos do que 0,2, preferivelmente menos do que 0,1, mais preferivelmente em uma faixa entre 0,01 e 0,09, b. pelo menos 70% de VLP com um diâmetro médio de 20 nm a 70 nm, preferivelmente de 30 nm a 70 nm, mais preferivelmente de 35 nm a 65 nm, mais preferivelmente de 40 a 60 nm, c. um teor de VLP dentro da composição de pelo menos 80% (v/v), preferivelmente pelo menos 85% (v/v), preferivelmente pelo menos 90% (v/v), preferivelmente pelo menos 95% (v/v).

[047] Em um terceiro aspecto, a invenção se refere a um sistema de liberação de fármaco obtenível pelo método de acordo com a invenção. O sistema de liberação de fármaco pode ser usado em um método de terapia e/ou diagnóstico, preferivelmente para o tratamento de transtornos neurológicos. Consequentemente a invenção também se refere a um método de tratamento um transtorno, em particular uma doença do SNC, com o sistema de liberação de fármaco de acordo com a invenção. O método de tratamento preferivelmente compreende a etapa de administrar o sistema de liberação de fármaco a um indivíduo em necessidade do mesmo.

[048] O sistema de liberação de fármaco preferivelmente tem uma eficácia melhorada. A VLP pode cruzar a BBB sem um aumento prévio da permeabilidade da BBB. Consequentemente, o sistema de liberação de fármaco da invenção pode ser usado em um método de tratamento de uma doença do SNC, em que o método não compreende uma etapa de aumentar a permeabilidade da BBB do indivíduo a ser tratado. O sistema de liberação de fármaco da invenção, preferivelmente, é administrado a um paciente que não recebeu qualquer tratamento químico ou físico para prejudicar ou romper a BBB.

[049] Em um quarto aspecto da invenção, a invenção se refere a uma partícula semelhantes a vírus (VLP) derivada de vírus John Cunningham (JCV) obtenível por um método compreendendo etapas a) a e) do método da invenção e uma etapa adicional de expor os pentâmeros da composição de e) a condições induzindo os pentâmeros a se montar em VLP. Estas VLP são livres de carga. Elas são particularmente úteis como uma vacina.

[050] Em um quinto aspecto da invenção, uma composição é fornecida que compreende partículas semelhantes a vírus (VLP) derivadas de vírus John Cunningham (JCV) compreendendo um sal e um tampão e tendo um pH entre 7,0 e 8,0, preferivelmente em torno de 7,5. A composição preferivelmente compreende: a. 120 mM a 170 mM de NaCl, preferivelmente 150 mM de NaCl, b. 1 a 5 mM de CaCl2, preferivelmente 2 mM de CaCl2, e c. 5 a 30 mM de Tris-HCl, preferivelmente 10 a 25 mM de Tris-HCl, mais preferivelmente 10 mM de Tris-HCl.

[051] Esta composição permite manejar a VLP sob condições fisiológicas. Sob estas condições as VLP essencialmente permanecem intactas, preferivelmente elas essencialmente mantêm sua estrutura de capsídeo. Se carregadas com carga, elas essencialmente permanecem associadas com a carga. A composição é preferivelmente adequada como uma composição farmacêutica, em que a composição farmacêutica pode compreender ainda um carreador e/ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Ela é especialmente adequada como uma composição farmacêutica para a administração intravenosa da VLP a um indivíduo, em particular a um humano.

[052] Ainda em um outro aspecto da invenção uma composição compreendendo VLP é fornecida, que tem pelo menos uma, preferivelmente todas, das características seguintes ("parâmetros alvos"): Tabela 1: Características preferidas da VLP e da composição contendo VLP. AUC = área sob a curva Métodos para avaliação Medição Parâmetros alvos Microscopia eletrônica VLP por malha de grade >50 partículas de transmissão (TEM) Forma das partículas redonda e delimitada Diâmetro das partículas 40 a 50 nm Agregados Não visível SDS PAGE e Western Banda de VP1 Banda de 40 kDa é observada Blot (WB) Degradação de VP1 Degradação menor ou nenhuma degradação Dispersão dinâmica da PDI <0,2 luz (DLS) Pico único (distribuição com base em volume) Sim diâmetro médio Z 40 a 50 nm Outros picos (distribuição com base em Não detectável volume) Bioanalisador Pureza de VP1 (40 kDa) >90% Ensaio de deslocamento Pico de fusão maior (em Tampão de Tris-HCl) >57°C térmico (TSA) Picos de fusão menores Não detectável Nano fluorometria Pico de inflexão maior >69°C diferencial de varredura Picos de inflexão menores Não detectável (nDSF) HPLC de exclusão por Agregados <5% de AUC total tamanho (SE-HPLC) Outras impurezas <5% de AUC total Fracionamento de fluxo Concentração de partículas >1,0 x 10¹¹ VLP/mL de campo (FFF-MALS) Tamanho de partículas 40 a 50 nm Agregados <5% de AUC total Outras impurezas <5% de AUC total

[053] No contexto da invenção, o termo "sistema de liberação de fármaco" se refere a uma composição para a administração de um produto farmacêutico a um indivíduo em necessidade do mesmo, em particular a um humano ou animal. Um sistema de liberação de fármaco, vantajosamente, permite a liberação do produto farmacêutico contido no mesmo ou ligado ao mesmo a um sítio de interesse, preferivelmente em um humano ou animal. Preferivelmente a liberação é seletiva para o alvo, isto é, mais do produto farmacêutico é liberado ao alvo do que a outros sítios do corpo ou órgão.

[054] "Um sistema de liberação de fármaco para o SNC" significa que o sistema de liberação de fármaco seletivamente alveja o SNC. SNC se refere à medula espinhal e ao cérebro, em particular ao cérebro. O termo "cérebro" inclui partes anatômicas do mesmo, tais como lobo frontal, lobo parietal, lobo temporal, lobo occipital, e cerebelo.

[055] A VLP ou o sistema de liberação de fármaco da invenção podem ser administrados por intermédio de várias vias, incluindo as vias oral, dérmica, nasal ou pulmonar ou injeção, tal como injeção parenteral (i.v., s.c., i.m.). Particularmente preferidas são formas de dosagem que permitem um efeito sistêmico do produto farmacêutico. Em uma modalidade específica a VLP ou o sistema de liberação de fármaco da invenção são administrados oralmente ou parenteralmente, em particular intravenosamente.

[056] O sistema de liberação de fármaco ou a VLP da presente invenção compreendem uma partícula semelhante a vírus (VLP) derivada de vírus John Cunningham (JCV). O "vírus JC" ou vírus John Cunningham (JCV; NCBI Taxonomy 10632) é um poliomavírus humano. O JCV tem simetria icosaédrica, tem um diâmetro de cerca de 45 nm e consiste em 72 pentâmeros VP1. Pequenos números das proteínas estruturais VP2 e VP3 também estão presentes.

[057] Uma "partícula semelhante a vírus" (VLP) no contexto da presente invenção é definida como uma partícula com deficiência de replicação com uma casca (também denominado capsídeo) composta de proteínas estruturais virais ou proteínas estruturais virais modificadas ou proteínas derivadas de proteínas estruturais virais. A VLP de acordo com a invenção é derivada de JCV, isto é, sua casca é composta por proteínas estruturais virais ou proteínas estruturais virais modificadas ou proteínas derivadas de proteínas estruturais virais VP1, VP2 e VP3 de JCV, em particular de VP1. Em uma modalidade preferida, a VLP de acordo com a invenção é composta por proteínas VP1 do vírus JC.

[058] Em uma modalidade particularmente preferida da invenção, a única proteína estrutural viral na casca é uma proteína VP1. Na modalidade mais preferida, a casca da VLP consiste em proteínas VP1, isto é, a casca não contém nenhuma outra proteína. Opcionalmente, a VLP compreende uma proteína VP2 e/ou VP3 além das proteínas VP1.

[059] VLP como tal, isto é, não estão associados a uma carga, não contêm nenhum material genético porque são constituídos apenas por proteínas e, por outro lado, estão "vazios". Em uma modalidade preferida, a VLP de acordo com a presente invenção não compreende material genético viral que codifica uma proteína viral, em particular material genético viral JC que codifica uma proteína viral JC. Nesta modalidade, a VLP pode compreender um elemento regulador viral, em particular o elemento regulador viral JC ou um elemento regulador viral derivado de JCV, como material genético viral.

[060] O material genético viral compreende material genético viral que codifica uma proteína viral e elementos reguladores virais como material genético viral. O material genético viral é derivado do ácido nucleico de um vírus, isto é, pelo menos 70% idêntico a um RNA ou DNA viral. Preferivelmente, a VLP de acordo com a invenção não compreende qualquer material genético viral.

[061] Assim, preferivelmente, no caso de a VLP de acordo com a invenção compreender RNA ou DNA, o RNA ou DNA não é derivado de um vírus, isto é, o RNA ou DNA não é material genético viral, em particular o RNA ou DNA não codifica uma proteína viral. É particularmente preferido que o RNA ou DNA não codifique uma proteína viral e não compreenda um elemento regulador viral.

[062] As proteínas estruturais virais, em particular a VP1, se montam em estruturas pentaméricas (pentâmeros). De acordo com a invenção, a casca de VLP é preferencialmente composta por várias proteínas VP1, em particular vários pentâmeros VP1, especialmente 72 pentâmeros VP1.

[063] Um "pentâmero" no contexto da invenção é uma estrutura que é formada quando cinco polipeptídeos, por exemplo, proteínas VP1, se juntam. A montagem em um pentâmero pode ser devido à formação de ligações covalentes ou não covalentes entre os polipeptídeos. Os polipeptídeos normalmente formam uma estrutura em forma de anel, com simetria pentagonal. Em um pentâmero, cada subunidade polipeptídica preferivelmente interage com duas subunidades adjacentes.

[064] Um "peptídeo" de acordo com a presente invenção pode ser composto por qualquer número de aminoácidos de qualquer tipo, preferencialmente aminoácidos de ocorrência natural, que preferencialmente estão ligados por ligações peptídicas. Em particular, um peptídeo compreende pelo menos 3 aminoácidos, preferivelmente pelo menos 5, pelo menos 7, pelo menos 9, pelo menos 12 ou pelo menos 15 aminoácidos. Não há limite superior para o comprimento de um peptídeo. No entanto, preferivelmente um peptídeo de acordo com a invenção não excede um comprimento de 500 aminoácidos, preferivelmente 400, 300, 250, 200, 150 ou 120 aminoácidos. Um peptídeo que excede cerca de 10 aminoácidos também pode ser denominado um "polipeptídeo".

[065] As proteínas estruturais da VLP, em particular a VP1, são idênticas ou derivadas das proteínas estruturais nativas de JCV. "Modificado ou derivado" abrange a inserção, deleção ou substituição de um ou mais aminoácidos, mantendo a função de VP1 para montar em um capsídeo.

[066] Em uma modalidade, a proteína estrutural nativa (JCV) pode ser modificada a fim de otimizar a VLP no que diz respeito à sua produção, seu perfil de direcionamento celular e especificidade ou seu perfil ou especificidade de direcionamento intracelular. A modificação ou derivação pode compreender uma otimização de códons da sequência de nucleotídeos que codifica a proteína estrutural, em particular a VP1, para aumentar a tradução da proteína.

[067] Os termos "VP1" ou "proteína de vírus 1" de acordo com a presente invenção referem-se a uma proteína que é idêntica ou é derivada da VP1 natural (nativa) do JCV e que é capaz de se montar em um capsídeo.

[068] O termo "VP1" de acordo com a invenção abrange uma proteína que tem uma identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID Nº: 1 de pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 85%, mais preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mais preferivelmente pelo menos 97%, mais preferivelmente pelo menos 98% ou pelo menos 99% sobre esta sequência. Em uma modalidade mais preferida da invenção a VP1 tem a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID Nº: 1.

[069] O termo "VP1" de acordo com a invenção também abrange frações da VP1 nativa. Preferivelmente, as referidas frações de VP1 compreendem pelo menos os ácidos 32 a 316 da sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID Nº: 1 ou um derivado dos mesmos tendo uma identidade com a sequência de aminoácidos da posição de aminoácido 32 a 316 da SEQ ID Nº: 1 de pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 85%, mais preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mais preferivelmente pelo menos 97%, mais preferivelmente pelo menos 98% ou pelo menos 99% sobre esta sequência.

[070] Em uma modalidade preferida da invenção a VP1 tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 85%, mais preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mais preferivelmente pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID Nº: 1 sobre seu comprimento inteiro. Em uma modalidade mais preferida da invenção, a VP1 tem uma sequência de aminoácidos que é idêntica à sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID Nº: 1.

[071] Em uma outra modalidade da invenção a VP1 tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 85%, mais preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mais preferivelmente pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID Nº: 3 sobre seu comprimento inteiro. Em uma modalidade, a sequência de aminoácidos de VP1 é idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID Nº: 3.

[072] Em uma modalidade, a sequência de nucleotídeos da proteína VP1 é pelo menos 70%, mais preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 90% idêntica à sequência de nucleotídeos da SEQ ID Nº: 2 sobre seu comprimento inteiro, preferivelmente é a sequência de nucleotídeos da SEQ ID Nº: 2.

[073] Em uma outra modalidade da invenção a sequência de nucleotídeos da proteína VP1 é pelo menos 70%, mais preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 90% idêntica à sequência de nucleotídeos da SEQ ID Nº: 4 sobre seu comprimento inteiro. Em uma modalidade, a sequência de nucleotídeos da proteína VP1 é idêntica à sequência de nucleotídeos da SEQ ID Nº: 4.

[074] As sequências são descritas na tabela 2. Tabela 2: Sequências de aminoácidos e nucleotídeos da proteína VP1. Proteína/DNA Sequência Fonte SEQ

ID Nº: Proteína MAPTKRKGEPKDPVQVPKLLIRGGVEVLEVKT derivada de 1

GVDSITEVECFLTPEMGDPDEHLRGFSKSISIS JCV DTFESDSPNRDMLPCYSVARIPLPNLNEDLTC GNILMWEAVTLKTEVIGVTSLMNVHSNGQATH DNGAGKPVQGTSFHFFSVGGEALELQGVVFN YRTKYPDGTIFPKNATVQSQVMNTEHKAYLDK NKAYPVECWVPDPTRNENTRYFGTLTGGENV PPVLHITNTATTVLLDEFGVGPLCKGDNLYLSA VDVCGMFTNRSGSQQWRGLSRYFKVQLRKR RVKNPYPISFLLTDLINRRTPRVDGQPMYGMD AQVEEVRVFEGTEELPGDPDMMRYVDKYGQL

QTKML DNA ATGGCTCCCACCAAGCGCAAGGGCGAGCCC derivada de 2

AAGGACCCCGTGCAAGTGCCCAAGCTGCTG JCV ATCCGTGGTGGTGTCGAGGTGCTGGAAGTC AAGACCGGCGTGGACTCCATTACCGAGGTG GAGTGCTTCCTCACCCCCGAGATGGGTGAC CCTGACGAGCACCTGAGGGGCTTCTCCAAG TCCATCTCCATCTCCGACACCTTCGAGTCCG ACTCCCCCAACCGTGACATGCTGCCCTGCT ACTCCGTGGCTCGTATCCCCCTGCCCAACC TGAACGAGGACCTGACTTGCGGCAACATCC TGATGTGGGAGGCTGTGACCCTCAAGACCG AGGTCATCGGCGTGACTTCCCTGATGAACG TGCACTCCAACGGCCAGGCTACCCACGACA ACGGTGCTGGCAAGCCCGTGCAGGGAACCT CCTTCCACTTCTTCTCCGTGGGTGGCGAGG CTCTGGAACTCCAGGGCGTGGTGTTCAACT ACCGTACCAAGTACCCCGACGGCACCATCT TCCCCAAGAACGCTACTGTGCAGTCCCAAG TGATGAACACCGAGCACAAGGCTTACCTGG ACAAGAACAAGGCCTACCCCGTGGAGTGCT GGGTGCCCGACCCCACCCGTAACGAGAACA CCCGTTACTTCGGCACCCTGACCGGTGGAG AGAACGTGCCCCCCGTGCTGCACATCACCA ACACCGCTACCACCGTGCTGCTGGACGAGT TCGGTGTCGGTCCCCTGTGCAAGGGCGACA ACCTGTACCTGTCCGCTGTGGACGTGTGCG GCATGTTCACCAACCGTTCCGGTTCCCAGC AGTGGCGTGGCCTGTCCCGCTACTTCAAGG TGCAGCTGCGCAAGCGTCGTGTGAAGAACC CCTACCCTATCTCCTTCCTGCTGACCGACCT GATCAACCGTCGTACCCCTCGTGTGGACGG CCAGCCCATGTACGGCATGGACGCTCAGGT GGAAGAGGTCCGCGTGTTCGAGGGCACCG AGGAATTGCCCGGCGACCCCGACATGATGC GTTACGTGGACAAGTACGGCCAGCTCCAGA

CCAAGATGCTGTAA Proteína MAPTKRKGERKDPVQVPKLLIRGGVEVLEVKT JCV do tipo 3 GVDSITEVECFLTPEMGDPDEHLRGFSKSISIS selvagem DTFESDSPSKDMLPCYSVARIPLPNLNEDLTC (AFH57194,1)

GNILMWEAVTLKTEVIGVTSLMNVHSNGQAAH DNGAGKPVQGTSFHFFSVGGEALELQGVVFN YRTKYPDGTIFPKNATVQSQVMNTEHKAYLDK NKAYPVECWVPDPTRNENTRYFGTLTGGENV PPVLHITNTATTVLLDEFGVGPLCKGDNLYLSA VDVCGMFTNRSGSQQWRGLSRYFKVQLRKR RVKNPYPISFLLTDLINRRTPRVDGQPMYGMD AQVEEVRVFEGTEELPGDPDMMRYVDRYGQL

QTKML DNA ATGGCCCCAACAAAAAGAAAAGGAGAAAGG JCV do tipo 4 AAGGACCCCGTGCAAGTTCCAAAACTTCTTA selvagem TAAGAGGAGGAGTAGAAGTTCTAGAAGTTAA (J02226)

AACTGGGGTTGACTCAATTACAGAGGTAGAA TGCTTTTTAACTCCAGAAATGGGTGACCCAG ATGAGCATCTTAGGGGTTTTAGTAAGTCAAT ATCTATATCAGATACATTTGAAAGTGACTCC CCAAATAGGGACATGCTTCCTTGTTACAGTG TGGCCAGAATTCCACTACCCAATCTAAATGA GGATCTAACCTGTGGAAATATACTCATGTGG GAGGCTGTGACCTTAAAAACTGAGGTTATAG GGGTGACAAGTTTGATGAATGTGCACTCTAA TGGGCAAGCAACTCATGACAATGGTGCAGG GAAGCCAGTGCAGGGCACCAGCTTTCATTTT TTTTCTGTTGGGGGGGAGGCTTTAGAATTAC AGGGGGTGCTTTTTAATTACAGAACAAAGTA CCCAGATGGAACAATTTTTCCAAAGAATGCC ACAGTGCAATCTCAAGTCATGAACACAGAGC ACAAGGCGTACCTAGATAAGAACAAAGCATA TCCTGTTGAATGTTGGGTTCCTGATCCCACC AGAAATGAAAACACAAGATATTTTGGGACAC TAACAGGAGGAGAAAATGTTCCTCCAGTTCT TCATATAACAAACACTGCCACAACAGTGTTG CTTGATGAATTTGGTGTTGGGCCACTTTGCA AAGGTGACAACTTATACTTGTCAGCTGTTGA TGTCTGTGGCATGTTTACAAACAGGTCTGGT TCCCAGCAGTGGAGAGGACTCTCCAGATAT TTTAAGGTGCAGCTAAGGAAAAGGAGGGTT AAAAACCCCTACCCAATTTCTTTCCTTCTTAC TGATTTAATTAACAGAAGGACTCCTAGAGTT GATGGGCAGCCTATGTATGGCATGGATGCT CAAGTAGAGGAGGTTAGAGTTTTTGAGGGA ACAGAGGAGCTTCCAGGGGACCCAGACATG ATGAGATACGTTGACAAATATGGACAGTTGC AGACAAAAATGCTGTAA

[075] Em uma modalidade preferida da invenção, a VP1 tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID Nº: 1 sobre seu comprimento inteiro.

[076] Em uma modalidade preferida da invenção, a sequência de nucleotídeos da proteína VP1 é pelo menos 80% idêntica à sequência de nucleotídeos da SEQ ID Nº: 2 sobre seu comprimento inteiro.

[077] As proteínas estruturais de JCV, preferivelmente VP1, podem ser expressas em, por exemplo, E. coli ou em células de inseto. De acordo com uma modalidade preferida da invenção, as proteínas estruturais, preferivelmente VP1, são expressas em células de inseto. Isso é vantajoso porque a expressão em células de inseto leva a menos modificações, como modificações pós-tradução, em comparação com a proteína de tipo selvagem de JCV do que a expressão em E. coli.

[078] A VLP de acordo com a invenção pode ainda compreender no capsídeo uma ou várias proteínas heterólogas adicionais, isto é, proteínas que não são idênticas ou derivadas de uma proteína JCV. Por exemplo, uma proteína heteróloga pode ser ancorada no capsídeo, isto é, pelo menos parte desta proteína sendo preferencialmente acessível do exterior. Em princípio, qualquer proteína é adequada como tal proteína heteróloga, desde que a proteína heteróloga possa ser incorporada no capsídeo e não interfira substancialmente com a montagem da VLP.

[079] A VLP de acordo com a invenção está associada a uma carga, em particular a uma proteína. Isso significa que a carga, em particular a proteína, está reversivelmente ligada a VLP. Isso pode, por exemplo, seja devido a uma interação físico-química com ou ligação a qualquer parte do capsídeo ou pela incorporação da carga, em particular a proteína, no capsídeo. Em uma modalidade preferida, a VLP incorpora a carga, em particular a proteína. A incorporação pode ser completa ou incompleta. Em uma modalidade particular preferida da invenção, a maior parte da quantidade total da carga é totalmente incorporada no capsídeo. O mais preferido é que a carga esteja totalmente encapsulada no capsídeo da VLP.

[080] Em ainda outro aspecto, a VLP usada no sistema de distribuição de fármacos de acordo com a invenção está associada a uma carga. Isso significa que a carga está reversivelmente ligada a VLP. Isso pode, por exemplo, seja devido a uma interação físico-química com ou ligação a qualquer parte do capsídeo ou pela incorporação da carga no capsídeo. Em uma modalidade preferencial, a VLP incorpora a carga. A incorporação pode ser completa ou incompleta. Em uma modalidade particular preferida da invenção, a maior parte da quantidade total da carga é totalmente incorporada no capsídeo. O mais preferido é que a carga esteja totalmente encapsulada no capsídeo da VLP.

[081] No contexto da invenção, a expressão que a "VLP compreende a carga" é usada como sinônimo da expressão que a VLP é "associado à carga". A associação da VLP e da carga pode ser o resultado do "carregamento" ou "empacotamento" da VLP com a carga.

[082] "Carregamento" significa qualquer processo que leva à associação de VLP e carga, por exemplo, por choque osmótico ou por montagem de pentâmeros VP1 ou VP1 em VLP junto com a carga. "VLP carregado" é a VLP resultante desse processo. O termo "empacotamento" se refere ao processo de carregamento da VLP por meio da montagem dos pentâmeros VP1 ou VP1 na VLP junto com a carga. A VLP resultante é denominada VLP "empacotada".

[083] O termo "carga" é utilizado, no contexto da presente invenção, para qualquer produto farmacêutico que esteja associado a VLP. O termo produto farmacêutico é usado no contexto da presente invenção indistintamente com o termo "fármaco".

[084] O produto farmacêutico é uma substância terapêutica ou de diagnóstico. Pode ser de qualquer natureza química, desde que esteja associado a VLP. Preferivelmente, o produto farmacêutico é um ingrediente farmacêutico ativo (API), em particular uma "molécula pequena" (preferivelmente um composto orgânico de ≤ 1000 Daltons), um biológico ou um citostático. Em uma modalidade preferida, o biológico é selecionado a partir do grupo que consiste em uma proteína, um peptídeo ou um ácido nucleico, em particular selecionado do grupo que consiste em ácidos nucleicos que codificam uma proteína desejada, como mRNA, cDNA, um plasmídeo ou vetor, nucleico inibitório ácidos, como siRNA ou miRNA, e ácidos nucleicos com atividade catalítica, como uma ribozima. Preferivelmente, a carga é uma proteína. Em uma modalidade particularmente preferida, a proteína é um anticorpo, fragmento de anticorpo, preferivelmente um nanocorpo, derivado do anticorpo ou fragmento de anticorpo, ou um conjugado de anticorpo- fármaco (ADC).

[085] Em uma modalidade preferida, o anticorpo é um anticorpo IgG, um anticorpo IgM, um anticorpo IgA, um anticorpo IgD ou um anticorpo IgE. Particularmente preferido é um anticorpo IgG ou um anticorpo IgM. Em uma modalidade, o anticorpo é uma imunoglobulina de lhama (camelídeo).

[086] O fragmento de anticorpo pode ocorrer naturalmente ou ser produzido artificialmente. O fragmento de anticorpo é preferencialmente selecionado a partir do grupo que compreende um anticorpo de cadeia pesada, um fragmento de ligação ao antígeno (Fab), um fragmento variável de cadeia única (scFv) e um nanocorpo. Um nanocorpo é preferido.

[087] Um nanocorpo ou anticorpo de domínio único (sdAb) é preferencialmente um fragmento de anticorpo que consiste em um único domínio de anticorpo monomérico variável. Como um anticorpo inteiro, ele é capaz de se ligar seletivamente a um antígeno específico. Os nanocorpos têm um peso molecular de cerca de 10 a 40 kDa, preferivelmente cerca de 10 a 20 kDa. O nanocorpo também pode ser um intracorpo, o que preferencialmente significa que o nanocorpo é expresso dentro de uma célula, por exemplo, dentro de uma célula-alvo ou dentro de um procariota ou outra célula não alvo.

[088] Preferivelmente, a carga, em particular a proteína, tem um peso molecular de cerca de 10 kDa a cerca de 4000 kDa. Se a carga for um anticorpo, fragmento de anticorpo, derivado do anticorpo ou fragmento de anticorpo, ou um conjugado de anticorpo-fármaco (ADC), a carga terá preferencialmente um peso molecular de cerca de 10 kDa a cerca de 1500 kDa.

[089] Em uma modalidade, a carga, em particular a proteína, é um complexo de proteína. Um complexo de proteínas pode ser constituído por mais de uma proteína igual ou diferente.

[090] Em uma outra modalidade, a VLP de acordo com a invenção é carregada com uma carga que é selecionada a partir do grupo que consiste em anticorpos monoclonais, fármacos antipsicóticos, fármacos analgésicos, trombolíticos, antidepressivos, imunomoduladores, imunossupressores, inibidores de acetilcolinesterase, antagonistas ou moduladores do receptor de glutamato, tais como antagonistas do receptor NMDA, psicoestimulantes, fármacos antidemência, fármacos ansiolíticos, fármacos nootrópicos, intensificadores metabólicos, moduladores metabólicos, fármacos neuroprotetores, anticonvulsivos, citostáticos e citocinas.

[091] Em uma modalidade particularmente preferida, a carga é um ácido nucleico, em particular um ácido nucleico que é adequado para interferência de RNA (RNAi) ou terapia gênica, um anticorpo, um citostático ou uma citocina, mais preferencialmente a carga é um ácido nucleico como um plasmídeo ou um anticorpo. Em uma modalidade mais preferida, a carga é um ácido nucleico, como um plasmídeo.

[092] Preferivelmente, a carga é um plasmídeo ou um anticorpo ou um plasmídeo que codifica um anticorpo ou uma combinação dos mesmos.

[093] Em uma modalidade, o ácido nucleico, preferivelmente o plasmídeo, compreende um gene. No caso de a carga compreender um gene, sua expressão na célula alvo do SNC é preferencialmente transitória. Assim, de acordo com uma modalidade mais preferida da invenção, o sistema de distribuição de fármacos compreendendo uma VLP associada a um plasmídeo que compreende um gene, enquanto o tratamento da doença do SNC é efetuado pela expressão transitória do referido gene na célula alvo do indivíduo para ser tratado.

[094] A carga, em particular a proteína, em particular o anticorpo, não está limitada no que diz respeito à sua especificidade. Por exemplo, a carga, em particular a proteína, em particular o anticorpo, não é limitada no que diz respeito a locais e modos de ação. Em uma modalidade, a VLP de acordo com a invenção tem como alvo o SNC e a carga associada, em particular a proteína, em particular o anticorpo, tem o seu local de ação no SNC.

[095] De acordo com a invenção, a expressão "expor" algo (por exemplo, a VP1, pentâmeros, a VLP) a condições para afetar algo (por exemplo, induzir a montagem) refere-se a trazer o material em consideração (por exemplo, o VP1, os pentâmeros, a VLP) para condições que podem causar este certo efeito (por exemplo, induzir a montagem). Tal exposição pode ser realizada alterando as condições para o material, e. colocando o material em contato com um tampão, sal ou pH diferente, etc. Isso é possível adicionando algo à composição que compreende o material ou vice-versa ou separando o material da composição e, em seguida, adicionando o material a uma composição diferente.

[096] Uma mudança de condições também pode ser alcançada por variação de temperatura, radiação, etc. Naturalmente, tais meios para uma mudança de condições podem ser combinados e/ou repetidos. Outras condições adequadas que induzem o efeito desejado, tais como a montagem da VP1 ou pentâmeros em VLP e/ou indução de agregação da VLP, também são bem conhecidas do especialista. O mesmo se aplica a uma duração adequada de exposição às respectivas condições; isso pode ser descoberto por meio de um especialista.

[097] A expressão "expor algo a condições para afetar algo" não exige que o efeito seja completado, isto é, nem todo o material tem que cumprir o efeito em consideração. Por exemplo, "condições induzindo os pentâmeros a agregar" significa essencialmente que as condições são adequadas para induzir a agregação. Não requer que de fato todos os pentâmeros sejam agregados.

[098] Conforme usada nesta invenção, o termo "montagem" ou "montagem em VLP" significa que as estruturas em consideração (as proteínas VP1 ou os pentâmeros) se associam e estabelecem o capsídeo da VLP. Se a VP1 for usada como o material de partida, a montagem em VLP pode incluir a formação anterior de pentâmeros, o que significa que as proteínas VP1 podem primeiro formar pentâmeros e, em seguida, formar VLP ou podem se montar diretamente em uma VLP. A montagem na VLP é reversível.

[099] O termo "desmontagem", por sua vez, refere-se a um processo, quando o capsídeo da VLP pelo menos parcialmente se desintegra em estruturas pentaméricas e/ou proteínas estruturais. A desmontagem pode ser induzida aumentando a temperatura, adicionando proteases e/ou diminuindo as interações intermoleculares usadas para formar a VLP, tais como pontes dissulfeto intermoleculares (por exemplo, adicionando agentes redutores ou adicionando agentes quelantes). Essas condições também podem incluir a exposição gradual a uma condição. Por exemplo, a composição pode ser colocada em contato com um agente de redução antes que a temperatura seja aumentada.

[0100] O agente de redução é preferencialmente selecionado do grupo que consiste em 2-mercaptoetanol, cloridrato de Tris-2- carboxietilfosfina (TCEP), peróxido de hidrogênio (H2O2), ditiotreitol (DTT), tiossulfato e ácido fórmico, mais preferencialmente selecionado do grupo que consiste em 2-mercaptoetanol, TCEP e DTT. Mais preferencialmente, o agente de redução é DTT.

[0101] Assim, em uma modalidade preferida, na etapa c) e/ou na etapa e) do método inventivo, as VLP são expostas a um agente de redução, preferivelmente selecionado a partir do grupo que consiste em 2-mercaptoetanol, TCEP, H2O2, DTT, tiossulfato e ácido fórmico, mais preferencialmente selecionado do grupo que consiste em 2- mercaptoetanol, TCEP e DTT, mais preferencialmente DTT.

[0102] Os métodos de indução de VP1 e/ou pentâmeros para se juntarem em VLP são geralmente conhecidos do especialista (Goldmann et al. (J. Virol. 1999; 73 (5): 4465-69); DE 195 43 553 A1). O mesmo se aplica à desmontagem da VLP em pentâmeros. O especialista, portanto, está ciente dos métodos para o controle da montagem e desmontagem de VLP.

[0103] Em uma modalidade da invenção, a concentração de íons Ca2+ na composição contendo o VP1 ou pentâmeros é usada para o controle da montagem/desmontagem da VLP. Por exemplo, a fim de induzir a montagem, a concentração de íons Ca2+ livres pode ser aumentada. Se a desmontagem for desejada, a concentração de íons Ca2+ livres pode ser reduzida adicionando um agente quelante à composição.

[0104] Uma outra opção para induzir a montagem é aumentar a concentração de pentâmeros VP1 a fim de facilitar a montagem em VLP, por exemplo, reduzindo o solvente na composição que compreende os pentâmeros. Isso pode exigir uma adaptação da concentração de metais alcalino-terrosos, como Ca2+ ou Mg2+.

[0105] De acordo com uma modalidade preferida da invenção, a desmontagem pode ser induzida expondo a VLP a condições sob as quais as pontes dissulfeto intermoleculares são reduzidas, por exemplo, expondo a VLP a condições de redução. Em uma modalidade preferida, esta etapa é realizada na presença adicional de um agente quelante. Mais preferencialmente, a desmontagem é induzida expondo a VLP a condições de redução na presença de um agente quelante e, opcionalmente, a uma temperatura elevada.

[0106] Em uma modalidade particular da invenção, as VLP são expostas a uma composição compreendendo DTT e EDTA e/ou EGTA, preferivelmente a uma temperatura de 15°C a 30°C, preferivelmente 20°C a 25°C, mais preferencialmente a uma temperatura de cerca de 23°C.

[0107] De acordo com a invenção na etapa f) (etapa de agregação), os pentâmeros da composição de e) são expostos a condições que induzem a agregação dos pentâmeros.

[0108] De acordo com uma modalidade preferida da invenção, os pentâmeros da composição de c) são também expostos a condições que induzem a sua agregação. Esta etapa é mais adequada se realizada antes da etapa d).

[0109] Em uma modalidade preferida, pelo menos 20% do material (por exemplo, os pentâmeros da composição de e) e preferivelmente também os pentâmeros da composição de c)) agregam, preferivelmente pelo menos 30%, mais preferencialmente pelo menos 40%.

[0110] Foi surpreendentemente descoberto que o método de acordo com a invenção permite a formação de VLP associada a uma proteína, como um anticorpo. Especificamente, um anticorpo como um anticorpo IgG ou mesmo um anticorpo IgM pode ser associado a uma VLP e a VLP resultante está intacta (Figura 10). A VLP também mostra surpreendentemente uma distribuição de tamanho homogênea (Figura 12). O anticorpo associado à VLP é eficientemente distribuído para e/ou dentro das células (Figs. 13 a 16). Além disso, a permeação do anticorpo associado a uma VLP de acordo com a invenção através da BBB foi maior quando a VLP foi associada a um anticorpo em comparação com o anticorpo livre (sem VLP) (Figura 17).

[0111] Foi surpreendentemente descoberto que a etapa de expor os pentâmeros da composição de c) a condições que induzem a agregação dos mesmos pode levar a uma distribuição de tamanho mais homogênea da VLP (Figura 7 e Figura 8).

[0112] Uma distribuição homogênea de tamanhos permite um melhor gerenciamento e padronização da qualidade, o que é de extrema importância se as VLP forem usadas em um sistema de liberação de medicamentos. Consequentemente, este procedimento adicional preferencialmente faz parte dos requisitos de controle de qualidade de um sistema de distribuição de fármacos.

[0113] A permeação através da BBB permite o uso da VLP associada a um fármaco, por exemplo, um anticorpo, para ser usada como um sistema de liberação de fármaco eficiente para o transporte de um fármaco, por exemplo, um anticorpo, para o SNC.

[0114] O termo "agregado" significa qualquer estrutura particulada. "Agregação" significa um processo que leva a agregações. Este processo é reversível.

[0115] A agregação dos pentâmeros ou VLP pode ser determinada por um aumento do tamanho médio de partícula da VLP na composição em comparação com o controle. O maior tamanho de partícula pode ser determinado por métodos padrão, como espalhamento dinâmico de luz (DLS).

[0116] De acordo com uma modalidade particular da invenção, a agregação dos pentâmeros ou VP1 pode ser induzida por um ou mais agentes que são conhecidos na técnica para facilitar a precipitação de proteínas (agente de precipitação). Mais preferido, de acordo com a invenção, é assim a utilização de um agente de precipitação.

[0117] Um "agente de precipitação" refere-se a um agente que promove a agregação de VP1 ou pentâmeros. O conceito de agentes de precipitação é geralmente conhecido do especialista na técnica. Os agentes de precipitação são tipicamente usados para facilitar a concentração e purificação de proteínas. A precipitação pode ser o resultado da alteração do potencial de solvatação do solvente, mais especificamente, pela redução da solubilidade da proteína. A solubilidade também pode ser diminuída ajustando o pH da composição ao ponto isoelétrico de uma proteína. Além disso, diminuir a temperatura da composição também pode diminuir a solubilidade de uma proteína.

[0118] Os agentes de precipitação possíveis são, e. polietilenoglicol

(PEG) ou álcool, por exemplo etanol e sais. Os últimos são conhecidos pelo especialista como "agentes para relargagem".

[0119] Preferivelmente, de acordo com a invenção, o agente de precipitação é um sal. Mais preferidos são os sais que compreendem íons conhecidos como a "série Hofmeister". A série Hofmeister descreve a ordenação de íons com relação ao seu efeito hidrofóbico em uma proteína específica em termos de sua capacidade de afetar a solubilidade da referida proteína em solução. Os íons que exercem um efeito hidrofóbico sobre uma proteína são especialmente preferidos. Aqui, esses íons são chamados de íons cosmotrópicos.

[0120] Um agente de precipitação compreendendo pelo menos um ânion ou cátion cosmotrópico é preferido. Os ânions preferidos são selecionados a partir do grupo consistindo em citrato (C6H5O73-), fosfato (PO43-), sulfato (SO42-), fosfato de hidrogênio (HPO42-), fosfato de di- hidrogênio (H2PO4-), iodato (IO3-), hidróxido (OH-), fluoreto (F-), bromato (BrO3-) ou acetato (CH3COO-) ou combinações dos mesmos, os ânions mais preferidos são citrato, fosfato ou sulfato, o ânion mais preferido é sulfato.

[0121] Os cátions preferidos são compostos de amônio ou amônio quaternário (NR4+ com R sendo um grupo alquila ou arila), tal como tetrametilamônio ((CH3)4N+) ou dimetilamônio ((CH3)2N2+). Outros cátions preferidos são selecionados a partir da lista compreendendo potássio (K+), césio (Cs+), rubídio (Rb+) ou lítio (Li+) ou combinações dos mesmos, particularmente preferidos são composto de amônio quaternário ou amônio, o mais preferido é amônio.

[0122] Portanto, o sal preferivelmente compreende um ânion e um cátion selecionados a partir do grupo consistindo em citrato (C6H5O73-), fosfato (PO43-), sulfato (SO42-), fosfato de hidrogênio (HPO42-), fosfato de di-hidrogênio (H2PO4-), iodato (IO3-), hidróxido (OH-), fluoreto (F-), bromato (BrO3-) ou acetato (CH3COO-), compostos de amônio quaternário (NR4+) com R sendo um grupo alquila ou arila, preferivelmente tetrametilamônio ((CH3)4N+) ou dimetilamônio ((CH3)2N2+), amônio (NH4+), potássio (K+), césio (Cs+), rubídio (Rb+) ou lítio (Li+), preferivelmente compreendendo SO42- e/ou NH4+ ou combinações dos mesmos.

[0123] De acordo com uma modalidade preferida o sal é selecionado a partir do grupo consistindo em (NH4)2SO4, K2SO4, Na2SO4, (NH4)2HPO4, K2HPO4 e Na2HPO4. O sal mais preferido é sulfato de amônio ((NH4)2SO4).

[0124] De acordo com a invenção, a agregação dos pentâmeros pode ser induzida por qualquer meio para colocar os pentâmeros em contato com o agente de precipitação, por exemplo, adicionando o agente de precipitação à composição que compreende os pentâmeros ou vice-versa, nomeadamente adicionando a composição que compreende os pentâmeros a um agente de precipitação. Também são possíveis outros meios, tais como uma diálise de modo que o agente de precipitação alcance os pentâmeros por difusão ou filtração de fluxo cruzado. Também é possível filtrar ou centrifugar a composição que compreende os pentâmeros e ressuspender os pentâmeros filtrados ou peletizados em uma composição que compreende o agente de precipitação. Diálise ou filtração de fluxo cruzado são preferidos.

[0125] De acordo com uma modalidade preferida da presente invenção, a agregação dos pentâmeros é induzida por uma diálise contra uma composição compreendendo o agente de precipitação, por exemplo uma composição compreendendo sulfato de amônio.

[0126] Colocando os pentâmeros em contato com o agente de precipitação na etapa f) e opcionalmente antes da etapa d), a agregação é preferencialmente induzida. Ao mesmo tempo, a concentração do agente de redução (se tal agente de redução foi usado na etapa c) e/ou e), pode ser reduzida. Em uma modalidade preferida, a concentração do agente de redução, em particular DTT, é reduzida, preferivelmente o agente de redução, em particular DTT, é completamente removido. É particularmente preferido que o agente de redução, em particular DTT, seja completamente removido antes da etapa g).

[0127] De acordo com uma modalidade particularmente preferida da invenção, a composição contendo os pentâmeros para agregação, tem uma concentração de sulfato de amônio entre 0,3 a 5 M, preferivelmente até 4 M, ainda mais preferida é uma concentração entre 1,8 e 2,2 M. O mais preferido é cerca de 2 M.

[0128] A etapa de induzir a agregação dos pentâmeros preferencialmente tem uma duração de pelo menos uma hora, mais preferido de pelo menos 5 horas, ainda mais preferido de pelo menos 12 horas, o mais preferido de pelo menos 16 horas. É preferível que a etapa tenha uma duração inferior a 24 horas. Em uma modalidade preferida, a duração desta etapa é entre 14 e 19 horas. Em uma modalidade mais preferida, a duração desta etapa é entre 16 e 18 horas. Durante este tempo, os pentâmeros são expostos a condições de indução de agregação, em particular eles estão em contato com sulfato de amônio. Particularmente preferido é que os pentâmeros sejam expostos a condições que induzem agregação, preferivelmente por diálise, durante 4 a 24 horas.

[0129] Após a etapa de induzir a agregação dos pentâmeros, é vantajoso incluir no processo da invenção uma etapa de separação dos pentâmeros das condições que foram utilizadas para induzir a agregação. Os métodos aplicáveis para tal etapa não são particularmente limitados; qualquer método conhecido do especialista, que permite a separação dos pentâmeros das condições de indução de agregação é aplicável.

[0130] Em uma modalidade preferida da invenção, os pentâmeros são separados das condições que induzem a sua agregação por diálise.

A diálise pode ser usada se a agregação dos pentâmeros for induzida pelo uso de um agente de precipitação. O princípio da diálise também pode ser aplicado favoravelmente para colocar os pentâmeros em contato com um agente de precipitação. O mais preferido é, se o método de acordo com a invenção inclui pelo menos quatro etapas de diálise: uma primeira diálise da composição da etapa c) e da composição da etapa e) contra uma composição compreendendo um agente de precipitação, e uma segunda diálise após a indução de agregação contra uma composição que é essencialmente livre do agente de precipitação.

[0131] A diálise para separar os pentâmeros do agente de precipitação é preferencialmente contra uma composição que é pelo menos semelhante às condições fisiológicas. Tal composição compreende preferencialmente um sal e tem um pH de 6 a 8,5, preferencialmente de 6,5 a 8,5, mais preferencialmente de 7 a 8, mais preferencialmente de 7,2 a 7,5, em particular 7,5. A osmolaridade da composição é preferencialmente entre 280 e 310 mosmol/l, mais preferencialmente 308 mosmol/l. A composição pode, por exemplo, ter uma concentração de solução salina (cloreto de sódio) de 0,8 a 0,92 % (p/v), preferivelmente de 0,9% (p/v).

[0132] A separação dos pentâmeros das condições que foram utilizadas para induzir a agregação é preferencialmente realizada por pelo menos 1 hora, mais preferencialmente por pelo menos 5 horas, 12 horas, mais preferencialmente por pelo menos 18 horas, mais preferencialmente por cerca de 24 horas ou mais. Períodos de tempo mais longos também são possíveis, inter alia, dependendo da concentração dos pentâmeros que foram induzidos a agregar, a composição compreendendo os pentâmeros e a natureza e concentração do agente de precipitação. Em uma modalidade preferida, a composição compreendendo os pentâmeros agregados é dialisada contra uma composição semelhante às condições fisiológicas durante cerca de 24 horas.

[0133] As composições de acordo com a invenção contêm ainda preferencialmente um tampão. Os sistemas tampão adequados são conhecidos do especialista. Em uma modalidade preferida da invenção, a composição inclui um tampão de TRIS, tampão de HEPES, um tampão de fosfato ou um sistema tampão de bicarbonato. O mais preferido é um tampão de TRIS.

[0134] Em uma modalidade mais preferida a composição compreende 10 mM de Tris-HCl e 150 mM de NaCl e tem um pH de 7,5.

[0135] De modo a facilitar a montagem dos pentâmeros em VLP, a composição pode compreender ainda íons bivalentes, tais como Ca2+, Mg2+, Ba2+, Cu2+, Fe2+, Zn2+ ou combinações dos mesmos. O mais preferido é Ca2+, por exemplo CaCl2. Em uma modalidade preferida, a composição compreende 1 a 3 mM de CaCl2, preferivelmente 2 mM de CaCl2.

[0136] Em uma modalidade muito preferida da invenção, a composição que é pelo menos similar a condições fisiológicas compreende 10 mM de Tris-HCl, 150 mM de NaCl e 2 mM de CaCl2 e tem um pH de 7,5.

[0137] Na etapa g) a razão de massa de VLP para carga, em particular proteína, em particular anticorpo, é preferencialmente de 20 para 1. Para carga adicional, em particular proteínas, com estrutura e tamanho diferente (preferivelmente até 4000 kDa), a razão de massa pode variam e dependem da estrutura e dobra da carga, em particular da proteína ou do complexo proteico. Em geral, a carga com um diâmetro de cerca de 36 nm pode ser empacotada no lúmen da VLP. A associação da carga pode permitir quantidades maiores, se necessário, porque a carga não precisa ser totalmente incorporada ao lúmen da VLP.

[0138] Ainda em outro aspecto da invenção, foi surpreendentemente descoberto que o armazenamento de VLP (rVLP) é vantajoso em comparação com o armazenamento de pentâmeros (Figura 4 e Figura 5). Se os pentâmeros forem armazenados e subsequentemente descongelados e remontados, partículas predominantemente "minúsculas" se formam, bem como agregados. Estas VLP não são adequadas para a produção de um sistema de distribuição de fármacos. As VLP, no entanto, que foram dissociadas e remontadas após o armazenamento, formam uma população particularmente homogênea de VLP de tamanho adequado. Assim, em uma modalidade da invenção, uma composição é fornecida com partículas com um diâmetro médio de 20 nm a 70 nm, preferencialmente de 30 nm a 70 nm, mais preferencialmente de 35 nm a 65 nm, mais preferencialmente de 40 a 60 nm. Uma distribuição homogênea de tamanhos é importante para atender aos requisitos de controle de qualidade.

[0139] Em uma modalidade preferida, o método de acordo com a invenção compreende uma etapa de armazenamento de VLP da composição da etapa d). Armazenar a VLP a uma temperatura de cerca de 80°C a cerca de 4°C é possível por uma duração de pelo menos 10 h, 15 h, 20 h, preferivelmente por pelo menos 24 horas. É possível um armazenamento de até mais de 3 dias.

[0140] Em uma modalidade preferida, as VLP são armazenadas a uma temperatura abaixo de 0°C (congelamento). O congelamento pode ser realizado usando diferentes taxas de resfriamento. Por exemplo, o congelamento "lento" pode ocorrer aplicando uma taxa de resfriamento de cerca de -1°C por minuto, enquanto o congelamento rápido pode ser realizado pelo contato da amostra, isto é, o recipiente que contém a composição, com nitrogênio líquido ou colocando a amostra em um freezer a -80°C.

[0141] Em uma modalidade preferida, o armazenamento ocorre em uma composição que compreende um crioaditivo, preferivelmente selecionado do grupo que compreende polióis, açúcares, sais inorgânicos, sais orgânicos, aminoácidos, polímeros, extremólitos ou derivados ou combinações dos mesmos.

[0142] Em uma modalidade preferida, o sal inorgânico compreende um ânion sulfato. Os sais preferidos que compreendem um ânion sulfato são sulfato de potássio, sulfato de sódio, tiossulfato de sódio, sulfato de magnésio e sulfato de amônio. Preferivelmente, o sal inorgânico é sulfato de amônio.

[0143] O aminoácido é preferencialmente glicina, glutamina, prolina ou alanina. Um derivado de aminoácido preferido é a betaína. Outros crioaditivos possíveis são glicerol, sacarose, DMSO, ectoína ou hidroxiectoína.

[0144] Verificou-se que a adição de crioaditivos, em particular a adição de um sal inorgânico (tal como um sal compreendendo um ânion sulfato, em particular sulfato de amônio) e/ou um derivado de aminoácido (tal como betaína), é vantajoso com respeito à estabilidade e à funcionalidade ou eficácia da VLP (Figura 9). Como afirmado supra, uma estabilidade e/ou funcionalidade ou eficácia aumentadas é particularmente desejada quando se usa VLP como um sistema de distribuição de fármacos. Foi surpreendente que a adição de crioaditivos à composição da etapa d) tenha um impacto na VLP empacotada da etapa f) em termos de estabilidade e funcionalidade ou eficácia.

[0145] Um crioaditivo serve ao propósito de proteger o tecido biológico de danos por congelamento (isto é, devido à formação de gelo). Os crioaditivos geralmente operam aumentando a concentração de soluto nas células. No entanto, para serem adequados para uso biológico, devem penetrar facilmente e não devem ser tóxicos para as células. Esses aditivos são, portanto, adequados para fornecer condições de armazenamento mais suaves para os pentâmeros e/ou VLP. Os crioaditivos podem ser suplementados a uma composição compreendendo pentâmeros e/ou VLP a serem congelados para armazenamento.

[0146] De acordo com uma modalidade particular preferida da presente invenção, o crioaditivo é adicionado à composição que compreende VLP para subsequente congelamento após a VLP, preferivelmente rVLP, ter sido montada usando duas etapas de diálise (remontagem em duas etapas).

[0147] As concentrações molares adequadas de crioaditivos, exceto para os crioaditivos à base de poliol, podem ser 0,5 M, 0,6 M, 0,7 M, 0,8 M, 0,9 M, 1 M, 1,1 M, 1,2, 1,3 M, 1,4 M, 1,5 M, 2 M, 3 M, 4 M, 5 M. Preferencialmente, estes crioaditivos são usados em uma concentração molar de cerca de 1 M, preferencialmente em uma concentração molar de 1 M.

[0148] O crioaditivo à base de poliol pode ser usado em concentrações molares de pelo menos 0,3 M, pelo menos 0,4 M, pelo menos 0,5 M, pelo menos 0,6 M, pelo menos 0,7 M, pelo menos 0,8 M, pelo menos 0,9 M, pelo menos 1 M, pelo menos 2 M ou pelo menos 3 M. Preferivelmente, os crioaditivos à base de poliol, preferivelmente glicerol 5%, podem ser usados em uma concentração de cerca de 0,6 M a 0,7 M, mais preferencialmente em uma concentração de 0,68 M.

[0149] Alternativamente, o crioaditivo à base de poliol pode ser adicionado com base na porcentagem de volume da composição que compreende pentâmeros e/ou VLP. A porcentagem de volume adequada inclui 3% (v/v), 4% (v/v), 5% (v/v), 6% (v/v), 7% (v/v), 8% (v/v), 9% (v/v) ou 10% (v/v). Preferencialmente, o crioaditivo à base de poliol é adicionado a 5% (v/v).

[0150] Em uma modalidade preferida da invenção, a VLP da etapa b), os pentâmeros da etapa c), a VLP da etapa d) e/ou a VLP da etapa g) estão indivíduos a purificação. O termo "purificação", no contexto da presente invenção, refere-se a isolar ou separar o VP1, pentâmeros ou VLP de uma composição complexa. Em particular, esta etapa pode ser usada para separar a VLP na etapa g) de carga não associada, em particular proteína não associada, preferivelmente anticorpo não associado. Métodos possíveis incluem precipitação, preferivelmente centrifugação, filtração, tal como ultrafiltração e/ou filtração de fluxo cruzado, preferivelmente filtração de fluxo cruzado, cromatografia, por exemplo, uma cromatografia preparativa, preferivelmente cromatografia de exclusão por tamanho ou cromatografia de afinidade e/ou dispersão de luz dinâmica (DLS). Em particular, a VLP pode ser selecionada com DLS. Vivaspin® é uma unidade de filtração exemplar que pode ser usada.

[0151] Preferivelmente, as VLP na etapa g) são separadas da carga não associada, em particular proteína não associada, preferivelmente anticorpo não associado, por filtração.

[0152] O termo "cromatografia" refere-se a um método que permite a separação de uma mistura de substâncias distribuindo seus componentes individuais entre uma fase estacionária e uma fase móvel. Em particular, a cromatografia se refere a um método de purificação de uma substância pela primeira ligação e enriquecimento da substância de interesse à fase estacionária antes de eluí-la em uma segunda etapa (modo ligar e eluir da cromatografia) ou ligando impurezas à fase estacionária e aumentar a pureza da molécula de interesse no fluxo contínuo (modo fluxo contínuo).

[0153] A cromatografia pode ser agrupada de acordo com a base da interação do analito compreendido na fase móvel com a fase estacionária. Os tipos preferidos de cromatografia de acordo com a invenção abrangem cromatografia de "fase reversa", cromatografia de "troca iônica", cromatografia de "afinidade" ou cromatografia de exclusão de tamanho (SEC). Entre a cromatografia de troca iônica, o método de purificação pode ser posteriormente separado com base na carga presente na fase estacionária em cromatografia de troca catiônica (CEX), na qual a fase estacionária tem uma carga negativa, retendo, assim, moléculas carregadas positivamente, e a troca aniônica cromatografia (AEX), em que a fase estacionária tem carga positiva, retendo moléculas com carga negativa.

[0154] Em particular, a cromatografia pode ser usada para purificar rVLP obtido pelo método de acordo com a presente invenção como um produto intermediário. Em particular, AEX pode ser usado para purificar rVLP.

[0155] A fase estacionária usada em AEX pode ser ainda descrita com base na força da interação iônica fornecida pelo material de troca presente na fase estacionária em "trocadores de ânions fortes" e "trocadores de ânions fracos". As expressões "trocador de ânions" ou "matriz de troca de ânions" são sinônimos e ambas se referem a substâncias naturais ou artificiais que podem ligar ânions e trocá-los por ânions de um meio circundante. Um trocador de ânions carrega íons positivos e troca contra-íons carregados negativamente.

[0156] A VLP da invenção pode ainda ser tratada com uma nuclease e/ou ser submetida a filtração estéril. Um tratamento com nuclease é preferencialmente feito se um ácido nucleico for usado como carga. Diferentes nucleases são conhecidas do especialista e incluem, por exemplo, benzonase. Os métodos para filtração estéril incluem, inter alia, diafiltração ou ultracentrifugação usando filtros adequados para a remoção de impurezas.

[0157] Em ainda outro aspecto da invenção, é fornecida uma VLP associada a uma carga, em particular uma proteína, que pode ser obtida pelo método de acordo com a invenção. Preferivelmente, a VLP incorpora a carga, em particular a proteína. Em uma modalidade preferida, a proteína é um anticorpo, fragmento de anticorpo, preferivelmente um nanocorpo, derivado do anticorpo ou fragmento de anticorpo, ou um conjugado de anticorpo-fármaco (ADC).

[0158] Em uma modalidade preferida, o anticorpo é um anticorpo IgG, um anticorpo IgM, um anticorpo IgA, um anticorpo IgD ou um anticorpo IgE. Particularmente preferido é um anticorpo IgG ou um anticorpo IgM. Em uma modalidade, o anticorpo é uma imunoglobulina de lhama (camelídeo).

[0159] O fragmento de anticorpo pode ocorrer naturalmente ou ser produzido artificialmente. O fragmento de anticorpo é preferencialmente selecionado a partir do grupo que compreende um anticorpo de cadeia pesada, um fragmento de ligação ao antígeno (Fab), um fragmento variável de cadeia única (scFv) e um nanocorpo. Um nanocorpo é preferido.

[0160] Foi particularmente surpreendente que uma VLP incorporando um anticorpo possa ser obtida pelo método de acordo com a invenção porque uma VLP também é composta por proteínas de modo que interferências estruturais entre a VLP e a proteína, em particular o anticorpo, sejam incorporadas ou associadas com ocorrem, especialmente quando o ponto isoelétrico das diferentes proteínas é semelhante.

[0161] As VLP obtidas de acordo com a invenção são particularmente vantajosas porque são homogêneas, isto é, mais uniformes em tamanho, altamente puros e apresentam maior capacidade de liberação de carga por meio de um modelo BBB. A VLP também é mais estável após o congelamento. A carga, em particular a proteína, como um anticorpo, pode ser eficientemente entregue nas células. Além disso, a VLP associada a um anticorpo mostra uma maior permeação através do SNC em comparação com o anticorpo livre.

[0162] Portanto, a VLP de acordo com a invenção pode, em particular, ser usada para entregar a carga associada, em particular a proteína associada, a um alvo, em particular no SNC, preferivelmente em uma célula alvo no SNC. Isto é particularmente vantajoso quando a proteína é um anticorpo, fragmento de anticorpo, preferencialmente um nanocorpo, derivado do anticorpo ou fragmento de anticorpo ou um conjugado de anticorpo-fármaco (ADC).

[0163] Ainda em um outro aspecto da invenção, uma composição compreendendo partículas semelhantes a vírus (VLP) derivadas de vírus John Cunningham (JCV) é fornecida, que é caracterizada por um ou mais dos parâmetros seguintes: a. um índice de polidispersibilidade (PDI) de menos do que 0,3, preferivelmente menos do que 0,2, preferivelmente menos do que 0,1, mais preferivelmente em uma faixa entre 0,01 e 0,09, b. pelo menos 70% de VLP com um diâmetro médio de 20 nm a 70 nm, preferivelmente de 30 nm a 70 nm, mais preferivelmente de 35 nm a 65 nm, mais preferivelmente de 40 a 60 nm, c. um teor de VLP dentro da composição de pelo menos 80% (v/v), preferivelmente pelo menos 85% (v/v), preferivelmente pelo menos 90% (v/v), preferivelmente pelo menos 95% (v/v).

[0164] A distribuição do tamanho das partículas pode ser avaliada como o "Índice de Polidispersidade" (PDI). O PDI indica a distribuição dos tamanhos das partículas em uma composição e, portanto, descreve a uniformidade das partículas. Os valores de PDI podem ser obtidos usando diferentes métodos, incluindo cromatografia de permeação em gel/cromatografia de exclusão de tamanho, reologia, viscosidade da solução, osmose de membrana ou dispersão de luz.

[0165] O PDI é preferencialmente determinado por espalhamento dinâmico de luz (DLS). Em DLS, a distribuição nativa é a distribuição de intensidade que indica quanta luz é espalhada das várias "fatias". O DLS permite a determinação do tamanho médio e do desvio padrão desse tamanho médio a partir das estatísticas da distribuição. A polidispersidade relativa pode ser determinada dividindo o desvio padrão pela média. A partir da polidispersidade relativa de uma distribuição, o índice de polidispersidade (PDI) pode ser derivado como seu quadrado. Os valores de PDI obtidos por DLS podem ser agrupados em composições monodispersas (PDI <0,1) e composições polidispersas (PDI> 0,1), em que também dentro do grupo polidisperso valores menores indicam uma distribuição mais uniforme dentro da composição.

[0166] De acordo com a invenção, os valores de PDI de 0,1 a 0,4 são preferidos. Mais preferencialmente, o valor de PDI é de 0,1 a 0,3 e ainda mais preferencialmente de 0,1 a 0,2.

[0167] O diâmetro médio de uma composição compreendendo VLP pode ser medido por métodos visuais, como microscopia, preferivelmente equipado com software para determinar o diâmetro médio, mas também por métodos analíticos de espalhamento de luz, como DLS ou método de nanotracking, como NTA.

[0168] O conteúdo de VLP dentro da composição pode ser medido por, por exemplo, FFF-MALS e/ou DLS. Ambos os métodos podem distinguir entre a VLP de tamanho certo e agregados, "minúsculos" (pequenas partículas) e outras impurezas, como sais, detritos ou pentâmeros.

[0169] Tal composição em particular cumpre os requisitos normalmente impostos a um sistema de administração de fármacos. Obviamente, essa composição é homogênea e possui alta pureza.

[0170] Noutro aspecto, a invenção refere-se a um sistema de distribuição de fármacos que pode ser obtido pelo método de acordo com a invenção. Um tal sistema de administração de fármacos tem as vantagens supra declaradas. Em particular, tal sistema de distribuição de fármacos pode ser usado em um método de terapia e/ou diagnóstico,

preferivelmente para o tratamento de distúrbios neurológicos, isto é, doenças do SNC.

[0171] Portanto, a invenção também se refere a um método de tratamento de um distúrbio, em particular uma doença do SNC, com o sistema de administração de fármacos de acordo com a invenção. O método de tratamento compreende preferencialmente a etapa de administrar a liberação do medicamento a um indivíduo em necessidade do mesmo.

[0172] A invenção também se refere ao uso do sistema de distribuição de fármacos para a fabricação de um medicamento para o tratamento de distúrbios neurológicos, isto é, Doenças do SNC. O método de tratamento preferencialmente não compreende uma etapa de aumento da permeabilidade da BBB do indivíduo a ser tratado. O sistema de distribuição de fármacos da invenção, preferivelmente, é administrado a um paciente que não recebeu qualquer tratamento químico ou físico para prejudicar ou romper a BBB.

[0173] O termo "doenças do SNC" (ou "distúrbios neurológicos") refere-se a qualquer distúrbio do sistema nervoso de um indivíduo, preferivelmente do sistema nervoso central. Inclui distúrbios neurodegenerativos, psicóticos ou neurovasculares.

[0174] Em uma modalidade da invenção, o distúrbio neurológico é selecionado a partir do grupo que consiste em acidente vascular cerebral, dependência de álcool, doença de Alzheimer, ansiedade, artrite, astenia, distúrbio de déficit de atenção e hiperatividade, distúrbio bipolar, dor oncológica, isquemia cerebral, neuroprotetor cerebral, distonia cervical, Coréia associada à doença de Huntington, dor crônica, dor crônica severa, distúrbio cognitivo, mioclonia cortical, doenças nervosas degenerativas, depressão, dor neuropática diabética, neuropatia diabética, labilidade emocional, epilepsia, sonolência excessiva associada a narcolepsia, fibromialgia, síndrome do X Frágil,

Ataxia de Friedreich, insônia, síndrome de Lennox Gastaut, transtornos depressivos e de ansiedade maiores, episódios maníacos associados a transtorno bipolar, comprometimento da memória, enxaqueca, comprometimento cognitivo leve, dor moderada a intensa, doença do neurônio motor, esclerose múltipla, dor musculoesquelética, narcolepsia, neuralgia, dor neuropática, dependência de nicotina, obsessiva transtorno compulsivo, efeito adverso induzido por opioide, constipação induzida por opioide, dor de osteoartrite, bexiga hiperativa, dor, doença de Parkinson, baba pediátrica, neuropatia diabética periférica, dor pós-operatória, neuralgia pós-herpética, distúrbio disfórico pré-menstrual, psicose, complexo refratário convulsões parciais, síndrome das pernas inquietas (SPI), esquizofrenia, convulsão, dor crônica severa, distúrbio do sono, cessação do tabagismo, espasticidade, lesão da medula espinhal, acidente vascular cerebral, transtirretina polineuropatia amiloide familiar, lesão cerebral traumática, vertigem, caquexia, esclerose lateral amiotrófica, ataxia espinocerebelar tipo I, distúrbios extrapiramidais e de movimento, ataque isquêmico transitório (TIA), leucoencefalopatia multifocal progressiva (PML), infecção por HIV, demência, como doença de Alzheimer, demência vascular, demência frontotemporal, demência semântica e demência com corpos de Lewy, e preferivelmente selecionado do grupo que compreende ou consiste em doença de Alzheimer, doença de Parkinson facilidade e esclerose múltipla.

[0175] Em um outro aspecto da invenção, a invenção se refere a partículas semelhantes a vírus (VLP) derivadas do vírus John Cunningham (JCV) que podem ser obtidas por um método que compreende as etapas a) a e) do método inventivo e uma etapa adicional de exposição do pentâmeros da composição de e) para condições induzindo os pentâmeros a se montarem em VLP. Nenhuma carga é adicionada na etapa final de montagem. Tal VLP pode ser particularmente útil como vacina.

[0176] Em uma modalidade, a VLP de acordo com a invenção atravessa a barreira hematoencefálica (BBB). Portanto, em uma modalidade da invenção, a VLP e/ou o sistema de distribuição de fármaco pode ser usado para administrar um fármaco através da BBB. De acordo com a invenção, um sistema de distribuição de fármaco e/ou uma VLP e/ou o fármaco com o qual a VLP é empacotada pode cruzar a BBB.

[0177] É importante ressaltar que o cruzamento da BBB pelo sistema de distribuição de fármacos permite que a VLP e/ou o sistema de distribuição de fármacos exiba sua função de direcionar populações de células específicas dentro do cérebro, isto é, entregar uma carga às células-alvo. No contexto da invenção, o referido sistema de distribuição de fármaco compreende uma distribuição para e/ou nas células-alvo. Portanto, a carga pode ser entregue para e/ou nas células-alvo.

[0178] Em uma modalidade preferida, a VLP da invenção e/ou sua carga, após administração ao indivíduo a ser tratado, em particular um humano, pode ser detectada no SNC em menos de 10 dias, preferivelmente em menos de 5 dias, mais preferivelmente em menos de 3 dias após a administração. A VLP e/ou o sistema de distribuição de fármaco são preferencialmente administrados ao indivíduo por via intravenosa. Isso é particularmente vantajoso ao usar a VLP como um sistema confiável de liberação de fármacos.

[0179] Preferivelmente, o método não requer uma perda de integridade ou aumento da permeabilidade da BBB.

[0180] A integridade da BBB in vitro pode ser medida por métodos conhecidos, por exemplo, por medição da resistência elétrica transendotelial relativa (TEER) (Rempe et al., Biochem Bioph Res Comm 2011, 406 (1): 64-69). Muitos modelos in vitro de BBB são estabelecidos, incluindo células endoteliais de cérebro humano ou bovino primário em diferentes co-culturas, por exemplo, a linha de células endoteliais de cérebro humano HBEC-5i. In vivo, métodos de imagem, como tomografia computadorizada ou ressonância magnética, podem ser usados em conjunto com agentes de contraste para visualizar a permeabilidade de BBB. Imagens funcionais, como PET ou SPECT, também podem ser usadas.

[0181] De acordo com a invenção, não é necessário prejudicar a permeabilidade da BBB antes ou durante a administração da VLP e/ou do sistema de distribuição do fármaco. Assim, a BBB está preferivelmente fisiologicamente intacta, o que significa que a integridade não é diminuída e/ou a permeabilidade não é aumentada em comparação com o estado nativo saudável. A VLP da invenção cruza preferivelmente a BBB fisiologicamente intacta.

[0182] A composição que compreende a VLP e/ou o sistema de distribuição de fármaco, preferivelmente, não requer um aditivo que possa perturbar a integridade da BBB. Portanto, em uma modalidade mais preferida da invenção, a VLP e/ou o sistema de distribuição de fármaco está livre de qualquer aditivo que possa impactar a permeabilidade da BBB.

MATERIAIS E MÉTODOS Fabricação de VLP

[0183] Partículas semelhantes a vírus (VLP) foram fabricadas pela expressão de proteínas usando uma linha de células de inseto Sf9 derivada da lagarta do cartucho (Spodoptera frugiperda) (Thermo Fischer scientific). As VLP foram produzidas infectando as células com Baculovírus recombinante contendo um cassete de expressão da proteína VP1 do vírus John Cunningham. O Baculovírus recombinante foi preparado usando o sistema de expressão Bac-to-Bac® Baculovírus (Thermo Fischer Scientific). As VLP foram produzidas em pH 6,3 após 7 a 10 dias em um biorreator de 3,4 L (INFORS HT Minifors). O fluxo de ar e a temperatura (26°C) foram controlados ao longo do tempo. Para remover as células e os detritos celulares, a suspensão foi centrifugada a 4°C, 5.000 g e o sobrenadante contendo VLP foi colhido.

[0184] Depois disso, as VLP foram concentradas usando dois métodos de concentração diferentes: precipitação com 7,5% de polietilenoglicol (PEG) ou fluxo cruzado com um sistema ÄKTAcross flow™ (GE Healthcare). Para precipitação de PEG, o sobrenadante clarificado foi misturado com PEG para atingir 7,5% (v/v) e incubado por duas horas a 4°C, após o que o precipitado foi separado por centrifugação a 4°C, 10.000 g e suspenso em NaCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 7,5. O fluxo cruzado foi realizado com um sistema ÄKTAcross flow™ equipado com uma membrana de corte de 300 kDa (Hydrosart® 300 kDa ECO, Sartorius). A ultrafiltração em fluxo foi realizada com pressão constante de 1,5 bar e fator 8 (1 L de sobrenadante contra 8 L de tampão).

[0185] VLP foram ainda dissociados em pentâmeros usando 5mM DTT e 10 mM EDTA por 70 min à temperatura ambiente e os pentâmeros purificados por cromatografia de troca aniônica (AEX) usando coluna HiScale CaptoQ (GE Healthcare) com um gradiente de NaCl de 150 mM a 1M NaCl. Os pentâmeros foram eluídos com uma etapa de NaCl 250 mM. Após a eluição, os pentâmeros foram processados da seguinte forma: a) Misturado à carga e remontado (ver "Empacotamento de pentâmeros frescos ou armazenados com carga"); b) Congelado a -80°C com 5% de glicerol para armazenamento de pentâmeros (que podem ser posteriormente misturados com a carga e remontados, consulte "Empacotamento de pentâmeros frescos ou armazenados com carga") ou c) Imediatamente colocado em cassetes de diálise com corte de 20 kDa (Dispositivo de diálise Slide-A-Lyzer™ G2, Thermo

Scientific) e remontado por remontagem em duas etapas por diálise (diálise em duas etapas). Primeiro, os pentâmeros foram dialisados contra tampão de sulfato de amônio 2 M ("AS", Tris-HCl 10 mM, NaCl 150 mM, 2 M (NH4) 2SO4, pH 7,5) por 24 h e, em seguida, transferidos pelas próximas 24 horas em 10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl2, pH 7,5 (tampão de reassociação padrão, "ST") (AS> ST). Alternativamente, a diálise em duas etapas foi realizada com tampão ST em ambas as etapas (ST> ST). Em ambos os casos, para separar o material não remontado e agregados da VLP, a composição que compreende a VLP foi purificada por cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) usando coluna HiPrep™ Sephacryl® S-500 HR (GE Healthcare) sob controle do índice de polidispersidade (PDI) de frações em espalhamento dinâmico de luz (DLS) usando Zetasizer ZS Nano (Malvern Inc.). A fração de VLP com tamanho-alvo foi selecionada e agrupada e, em seguida, concentrada em concentradores Vivaspin® (Sartorius) com membrana de corte de 5 kDa, se aplicável, seguido de armazenamento a -80°C. Empacotamento de VLP remontada com carga

[0186] Para o empacotamento de VLP de VLP remontado sem etapa de agregação f), VLP armazenado da etapa c) acima foram retirados de -80°C e descongelados usando um agitador térmico (23°C, 350 rpm). Posteriormente, a dissociação das amostras VLP descongeladas foi realizada incubando as amostras por 15 min a 23°C e 450 rpm na presença de tampão de dissociação (Tris-HCl 20 mM, NaCl 150 mM, DTT 5 mM e EDTA 10 mM). As VLP dissociadas foram remontadas na presença de carga (por exemplo, ácido nucleico). Em suma, a VLP dissociada foi misturada completamente com a carga em concentrações adequadas, seguido de diálise da mistura contra tampão de reassociação padrão (Tris-HCl 10 mM, NaCl 150 mM, CaCl2 2 mM, pH 7,5) usando uma câmara de diálise MWCO de 20 kDa (Dispositivo de diálise Slide-A-Lyzer™ MINI, Thermo Scientific). Após 4 a 6 horas, o tampão de diálise foi substituído por tampão de diálise fresco e as amostras foram incubadas por mais 16 a 18 horas. No caso de usar ácidos nucléicos como carga, os ácidos nucléicos não empacotados foram digeridos por incubação com 40 u de Benzonase® Nuclease (Merck) por 25 µg de VLP e 2,5 mM de MgCl2 a 37°C por uma hora. As amostras foram filtradas (filtros de tubo de centrífuga Corning ® Costar® Spin-X®; tamanho de poro 0,22 μm) antes da análise. As VLP foram analisadas diretamente em seguida e/ou armazenadas a -80°C. Empacotamento de anticorpos em VLP

[0187] Para empacotar os anticorpos (AB) em VLP, as VLP armazenadas da etapa c) acima foram retiradas de -80°C e descongeladas usando um agitador térmico (23°C, 350 rpm). Posteriormente, a dissociação das amostras VLP descongeladas foi realizada incubando as amostras por 15 min a 23°C e 450 rpm na presença de tampão de dissociação (Tris-HCl 20 mM, NaCl 150 mM, DTT 5 mM e EDTA 10 mM). Na primeira etapa do processo de empacotamento de duas etapas, as VLP dissociadas foram dialisadas por 4 horas a 24 horas contra tampão de sulfato de amônio (Tris-HCl 10 mM, NaCl 150 mM, AmSu 2 M, pH 7,5) usando um 20 Câmara de diálise kDa MWCO (Dispositivo de diálise Slide-A-Lyzer™ MINI, Thermo Scientific). Após a primeira diálise, AB foram adicionados a VLP com uma proporção de massa de 20 para 1 e a mistura foi dialisada (20 kDa MWCO, Dispositivo de diálise Slide-A-Lyzer™ MINI, Thermo Scientific) em uma segunda etapa contra tampão de reassociação padrão (Tris- HCl 10 mM, NaCl 150 mM, CaCl2 2 mM, pH 7,5) durante 16 h a 18 h. Em seguida, as amostras foram filtradas (filtros tubulares de centrífuga Corning® Costar® Spin-XR; tamanho de poro 0,22 µm). O AB livre (residual) foi removido lavando a amostra pelo menos cinco vezes com excesso de três vezes do tampão de reassociação padrão usando um concentrador VivaSpin® (100 kDa MWCO, Sartorius) até que nenhuma fluorescência foi observada no permeado. As VLP foram analisadas diretamente em seguida e/ou armazenadas a -80 °C. Empacotamento de pentâmeros frescos ou armazenados com carga

[0188] Para empacotamento de pentâmero, pentâmeros frescos ou armazenados a -80 °C foram diretamente misturados e remontados com carga ou descongelados usando um agitador térmico (23°C, 350 rpm) e, em seguida, remontados na presença de carga (por exemplo, ácido nucleico). Em suma, os pentâmeros foram misturados completamente com a carga em concentrações adequadas, seguido de diálise da mistura contra tampão de reassociação padrão (Tris-HCl 10 mM, NaCl 150 mM, CaCl2 2 mM, pH 7,5) usando uma câmara de diálise MWCO de 20 kDa (Dispositivo de diálise Slide-A-Lyzer™ MINI, Thermo Scientific). No caso de usar ácidos nucléicos como carga, os ácidos nucléicos não empacotados foram digeridos por incubação com 40 u de Benzonase® Nuclease (Merck) por 25 µg de VLP remontado e 2,5 mM de MgCl2 a 37°C por uma hora. Os pentâmeros remontados foram analisados diretamente em seguida. Teste de funcionalidade de ensaio de VLP/Luciferase

[0189] No caso de VLP carregado com ácidos nucleicos (fabricado a partir de pentâmeros frescos ou armazenados; ou de VLP remontado e purificado), o plasmídeo luciferase NanoLuc® foi usado como carga. As células de glioblastoma foram semeadas com 24 horas de antecedência com uma densidade de 3*104 em 900 µl de meio DMEM, alta glicose, GutaMAX™ (Thermo Fisher) suplementado com 10% de FCS (Thermo Fisher) e 1% de Pen-Strep (PAN-Biotech). Antes de adicionar a amostra, a quantidade correspondente de meio foi removida para manter uma quantidade constante de meio em cada poço. As amostras foram adicionadas às células e incubadas durante 48 horas a

37°C e 5% de CO2. Depois disso, o meio celular foi eliminado e as células foram lavadas com PBS. A atividade da luciferase foi determinada de acordo com as instruções do fabricante (NanoGlo® Luciferase Assay (Promega)). A luminescência foi medida em placas brancas de 96 poços (Greiner bio-one) no sistema de detecção Glomax® Multi (Promega). Caracterização de VLP

[0190] Para verificar a dissociação, remontagem e estabilidade da amostra, o espalhamento dinâmico de luz (DLS) e os índices de polidispersidade (PDI) das amostras foram medidos usando um Zetasizer Nano ZS (Malvern.). Os tamanhos de VLP e PDI foram documentados com o software Zetasizer (versão 7.11, Malvern). Além disso, as temperaturas de inflexão para cada amostra foram avaliadas por nDSF usando um Tycho NT.6 (Nanotemper).

[0191] Para analisar a composição da amostra, foi realizado o fracionamento de fluxo de campo de fluxo assimétrico (AF4, Wyatt Inc.). As amostras foram analisadas usando espalhamento de luz multiangular (MALS), espalhamento de luz dinâmico (DLS) e detector de UV.

[0192] As análises de microscopia eletrônica de transmissão (TEM) foram realizadas para visualização direta da amostra em diferentes etapas experimentais com o auxílio de um microscópio eletrônico Zeiss EM900, operando em uma tensão de 80 kV. Para esta abordagem, as amostras foram coradas em grades de cobre revestidas com carbono (Plano GmbH) usando 2% de acetato de uranila (Sigma Aldrich) previamente. Modelo de barreira hematoencefálica artificial (BBB) para verificar a permeação de BBB

[0193] A permeação de BBB de VLP foi avaliada usando monocultura (quantificação direta de material permeado com marcação fluorescente) ou co-cultura (expressão de proteína causada por material permeado em células alvo) em um modelo de BBB artificial de dois compartimentos.

[0194] Em ambos os casos, suportes permeáveis de 24 poços (inserção, 0,4 µm, Corning Costar) foram revestidos por 90 min a 37°C com uma mistura de Fibronectina 1:20 (BioReagent) e Colágeno Tipo I 1:75 (Merck Millipore) em solução salina tamponada com fosfato (PBS) com antecedência. Depois de remover cuidadosamente o excesso de revestimento, os insertos revestidos foram transferidos para uma nova placa de 24 poços (Greiner Bio-One) cheia com 900 µl de meio (EndoGRO, SCME004, Merck Millipore). 7,5 * 104 células de BBB (HBEC-5i, endotélio microvascular cerebral) foram semeadas nas inserções com 200 µl de meio. As células foram incubadas por 96 h a 120 h com troca da mídia nos poços a cada dois dias. Experimentos de monocultura (permeação de carga marcada com fluorescência)

[0195] As inserções preparadas foram cuidadosamente transferidas para uma nova placa de 24 poços cheia com 900 µl de meio livre de fenol (DMEM/F-12, HEPES, sem vermelho de fenol, Thermo Fisher Scientific) por poço. Antes de adicionar a amostra ao inserto, a quantidade correspondente de meio foi removida, para manter uma quantidade constante de 200 µl de meio em cada inserção. Após 120 min de incubação a 37°C em uma incubadora, 3x 100 µl de cada poço foram transferidos para uma placa preta de 96 poços e a fluorescência da amostra foi determinada usando um leitor de placas (Tecan Infinite M200, Tecan)

[0196] Para confirmar a formação de BBB, a BBB foi rompido pela adição de EDTA à inserção. As inserções foram transferidas para uma placa de 24 poços contendo meio fresco livre de fenol. EDTA (cEnd = 5 mM, aprox. 5 µl) foi adicionado às inserções e incubado durante 90 min a 37°C. Posteriormente, a fluorescência foi determinada conforme descrito acima.

[0197] A permeação foi calculada normalizando o sinal de fluorescência das inserções contendo células de BBB para as inserções apropriadas sem células de BBB. Da mesma forma, a integridade da BBB foi verificada após a adição de EDTA. Experimentos de co-cultura (atividade do material permeado)

[0198] As inserções foram transferidas para uma nova placa de 24 poços, contendo células alvo (células de glioblastoma), que foram semeadas 24 horas antes com uma densidade de 3 * 104 em 900 µl de DMEM, alta glicose, GutaMAX™ (Thermo Fisher) suplementado com 10% FCS (Thermo Fisher) e 1 % Pen-Strep (PAN-Biotech). Antes de adicionar a amostra (VLP empacotada com plasmídeo NanoLuc®) à inserção, a quantidade correspondente de meio foi removida para manter uma quantidade constante de 200 µl de meio em cada inserção. Após 24 h, a inserção foi removida da placa de 24 poços e lavada usando PBS. Consequentemente, a membrana (contendo as células de BBB) foi cortada com um bisturi e transferida para um frasco de reação de 1,5 ml. A atividade da luciferase foi determinada de acordo com as instruções do fabricante (NanoGlo® Luciferase Assay (Promega)).

[0199] Os poços (contendo as células alvo) foram incubados por mais 24 horas antes do ensaio de luciferase ser realizado de acordo com as instruções do fabricante (NanoGlo® Luciferase Assay (Promega)). Armazenamento com crioproteção

[0200] Cada glicerol crioaditivo (Carl Roth), sacarose (Carl Roth), sulfato de amônio (Carl Roth), DMSO (Carl Roth) e betaína (Merck) foi adicionado a VLP resultando em uma concentração de aditivo final de 1 M, exceto para glicerol com 5% (v/v) correspondendo a 0,68 M. Além disso, uma alíquota não continha uma substância aditiva (a/o). As amostras foram divididas e congeladas aplicando duas velocidades de congelamento: Metade de cada amostra foi congelada com uma taxa de resfriamento de aprox. -1°C/min (congelamento lento), enquanto a segunda metade foi congelada rapidamente mergulhando os recipientes em nitrogênio líquido (congelamento rápido). Todas as amostras foram armazenadas a -80°C com um período de armazenamento de 1 a 10 dias. Após descongelamento a 23°C e agitação a 350 rpm, as amostras foram dialisadas contra Tris-HCl 10 mM, NaCl 150 mM, CaCl2 2 mM, pH 7,5 à temperatura ambiente por 2 h para reduzir a concentração de aditivo e seu impacto nos resultados da análise. O diâmetro da partícula e o PDI foram determinados por um Zetasizer Nanoseries (Malvern). As temperaturas de inflexão foram medidas usando um Tycho NT.6 (Nanotemper). A funcionalidade VLP após o armazenamento foi comprovada com a ajuda do empacotamento do plasmídeo NanoLuc® e subsequente ensaio NanoGlo® Luciferase (Promega). Citometria de fluxo para analisar a fixação de anticorpos associados a VLP a células

[0201] As células de glioblastoma foram semeadas com 24 horas de antecedência com uma densidade de 3 * 104 em 900 μl de meio DMEM de alta glicose (GutaMAX™, Thermo Fisher) suplementado com 10% de FCS (Thermo Fisher) e 1% de Pen-Strep (PAN-Biotech). Antes de adicionar a amostra, a quantidade correspondente de meio foi removida para manter uma quantidade constante de meio em cada poço. Anticorpos (marcados com AF488) associados com VLP fabricados de acordo com a invenção (com etapa de agregação f) com uma razão de massa de 20 para 1 foram adicionados aos poços e incubados a 37°C e 5% de CO2. Após 16 horas a 18 horas, o meio foi cuidadosamente descartado e as células foram lavadas duas vezes com PBS. A colheita de células foi realizada usando 150 µL de Tripsina/EDTA por poço. Após a separação das células, as células foram cuidadosamente ressuspensas usando 0,05% de FCS em 500 µl de PBS. Para investigações de citometria de fluxo, as células de dois poços foram reunidas e centrifugadas a 500 x g por 5 minutos. O sobrenadante foi descartado e as células foram ressuspensas em aprox. 200 µl de PBS. As células foram usadas diretamente para citometria de fluxo. Microscopia confocal para analisar a absorção dos anticorpos associados a VLP em células

[0202] As células de glioblastoma foram semeadas com 24 horas de antecedência com uma densidade de 3 * 104 em 900 μl de meio DMEM de alta glicose (GutaMAX™, Thermo Fisher) suplementado com 10% de FCS (Thermo Fisher) e 1% de Pen-Strep (PAN-Biotech) em as lamínulas. Antes de adicionar a amostra, a quantidade correspondente de meio foi removida para manter uma quantidade constante de meio em cada poço. Anticorpos (IgM não específico, IgG primário anti- tubulina marcado com AF488) associados com VLP fabricado de acordo com a invenção (com a etapa de agregação f) com uma razão de massa de 20 para 1 foram adicionados aos poços e incubados a 37°C e 5% CO2. Após 24 horas a 48 horas, o meio foi descartado cuidadosamente e as células foram lavadas duas vezes com PBS. Em seguida, as células foram fixadas com metanol gelado por 15 minutos. Para investigações confocais, a membrana celular foi corada com anticorpo aglutinina de germe de trigo (WGA) (WGA AF633) e o núcleo da célula foi corado com DAPI. A microscopia confocal foi preparada com o microscópio confocal Nikon Eclipse Ti.

EXEMPLOS Exemplo 1: Análises funcionais

[0203] A eficácia de liberação de carga de VLP, que foi preparada usando métodos diferentes, foi comparada (Figura 1). Para este fim,

foram geradas VLP que passaram por duas rodadas de desmontagem e remontagem subsequente ou uma rodada de desmontagem e remontagem subsequente (em ambos os métodos, última remontagem na presença de um plasmídeo de luciferase). Notavelmente, a atividade da luciferase de VLP que passou por duas rodadas de desmontagem e remontagem subsequente foi significativamente aumentada em comparação com VLP que passou por uma rodada de desmontagem e remontagem subsequente e em comparação com os controles "apenas plasmídeo" e "apenas células".

[0204] Em seguida, a capacidade da VLP preparada de acordo com a presente invenção para penetrar na barreira hematoencefálica (BBB) foi analisada (Figura 2). A Figura 2A mostra a configuração de um modelo de barreira hematoencefálica (BBB) artificial para testar a permeação de BBB por VLP ou plasmídeo (círculos) em uma configuração de monocultura. As células endoteliais do cérebro humano (células de BBB, HBEC-5i) foram plaqueadas no suporte permeável. A Figura 2B mostra a permeabilidade da VLP que passou por duas rodadas de desmontagem e remontagem subsequente (segunda remontagem na presença de um plasmídeo marcado com fluorescência) em comparação com um controle "apenas plasmídeo". As colunas pretas representam experimentos com a BBB intacta. As colunas brancas representam experimentos com uma BBB rompida artificialmente (pela adição de EDTA). Surpreendentemente, as VLP preparadas de acordo com a presente invenção foram capazes de cruzar a BBB em proporções significativamente maiores do que o plasmídeo nu. A ruptura da integridade da camada BBB destruiu esta diferença, mostrando a capacidade de penetração seletiva e eficiente da VLP preparada de acordo com a presente invenção.

[0205] Para avaliar a eficácia de liberação de VLP gerada de acordo com a presente invenção em células alvo, um modelo BBB de co-cultura foi usado (Figura 3). A Figura 3A mostra a configuração de um modelo BBB artificial para testar a permeação de BBB por VLP ou plasmídeo (círculos) e a expressão de proteína subsequente causada por material permeado em células alvo em uma configuração de co-cultura. A Figura 3B mostra a atividade da luciferase que foi medida nas células de BBB presentes na inserção (em células HBEC-5i) e a atividade da luciferase nas células alvo após a permeação. Uma BBB artificial ("Revestimento + células de BBB") e um revestimento sem células de BBB ("Apenas revestimento") foram testados. A atividade da luciferase das células das inserções foi medida apenas quando havia células presentes (assim, as amostras "Somente revestimento" não mostraram qualquer atividade da luciferase como esperado) e quando o plasmídeo da luciferase foi empacotado em VLP que foram preparados de acordo com a presente invenção (em comparação com o plasmídeo apenas). A atividade da luciferase das células alvo também foi medida apenas nas amostras com a VLP preparada de acordo com o método da presente invenção (em comparação com o plasmídeo apenas), independentemente se a camada de células de BBB estava presente ou apenas o revestimento.

[0206] Assim, as VLP preparadas de acordo com a presente invenção são capazes de passar eficientemente através da BBB enquanto retêm uma alta infecciosidade e capacidade de liberação de carga. Amostra (empacotada) significa VLP que passou por duas rodadas de desmontagem e remontagem subsequente (segunda remontagem na presença de um plasmídeo de luciferase).

Exemplo 2: Armazenamento de pentâmeros vs. armazenamento de

VLP

[0207] Para investigar a homogeneidade e uniformidade das composições que compreendem VLP carregado que passaram por diferentes procedimentos de armazenamento, a microscopia eletrônica de transmissão (TEM) foi realizada. VLP que foram gerados com uma rodada de desmontagem e remontagem subsequente (pentâmeros congelados, esquerda) foram comparados com VLP que foram gerados com duas rodadas de desmontagem e remontagem subsequente (VLP congelado, direita) (Figura 4). A VLP gerada no último caso mostrou uma distribuição significativamente mais uniforme, uma vez que não tinham quaisquer estruturas de partícula viral defeituosa visível em comparação com a VLP em que os pentâmeros foram congelados durante a fabricação.

[0208] Para investigar mais a homogeneidade da VLP carregada gerada como na Figura 4, análises de FFF-MALS foram realizadas (Figura 5). Ambas as amostras foram comparadas com VLP recém- preparada (sem carga, portanto, sem desmontagem/remontagem), servindo como referência. Surpreendentemente, em comparação com a referência (Figura 5 C), VLP gerado após duas rodadas de desmon- tagem e remontagem subsequente com congelamento intermediário de VLP (Figura 5 A) reduziu significativamente a quantidade de agregados de VLP presentes na composição. Além disso, a distribuição de VLP era ainda mais uniforme. O tamanho da VLP e a presença de "Minúsculos" e "Sais, detritos, pentâmeros" eram comparáveis.

[0209] Notavelmente, quando as VLP foram geradas após uma rodada de desmontagem e remontagem subsequente (pentâmeros congelados), muito poucas VLP estruturalmente intactas puderam ser identificadas (Figura 5 B). Portanto, o método inventivo permite o armazenamento intermediário de VLP como VLP remontada e a geração de uma população altamente uniforme de VLP carregada com quase nenhum agregado. As percentagens são fornecidas excluindo os agregados.

[0210] Para caracterizar ainda mais a estabilidade de VLP que foram geradas após duas rodadas de desmontagem e subsequente remontagem com congelamento intermediário de VLP ("Amostra (empacotada)", linha sólida) em comparação com VLP recém- preparado (sem carga, portanto, sem desmontagem/remontagem, "Amostra (wt)", linha pontilhada) As análises de nDSF foram realizadas para revelar as temperaturas de fusão (temperaturas de inflexão) (Figura 6). Notavelmente, as curvas de fusão de ambas as amostras de VLP eram dificilmente distinguíveis, mostrando que as VLP preparadas de acordo com o método inventivo são igualmente estáveis como VLP recentemente preparada. Exemplo 3: Indução da agregação antes da remontagem

[0211] Em seguida, o efeito de induzir a agregação durante a remontagem de pentâmeros em VLP foi medido. A homogeneidade foi analisada por DLS (Figuras 7 e 8). A Figura 7 mostra o PDI de VLP obtido após a diálise com indução de agregação (coluna branca) e sem indução de agregação (coluna preta). A VLP remontada pela primeira indução de agregação mostrou um PDI fortemente reduzido em comparação com a VLP remontada sem indução de agregação. Portanto, a indução da agregação durante a remontagem levou a uma distribuição de tamanho muito mais homogênea. Ambas as amostras foram coletadas antes do congelamento (portanto, elas passaram por uma rodada de desmontagem e remontagem).

[0212] A Figura 8 mostra a distribuição de tamanho médio determinada por DLS das amostras preparadas como na Figura 7 (Figura 8, esquerda) e amostras que sofreram as mesmas condições de remontagem, mas uma etapa de congelamento subsequente (Figura 8,

direita). Ambas as amostras que foram remontadas com indução de agregação (linhas contínuas) apresentam uma distribuição de tamanho muito uniforme, enquanto as amostras que não passaram pela etapa de agregação (linhas pontilhadas) mostram pelo menos duas populações de VLP. Ainda mais, a etapa de congelamento foi obviamente prejudicial para a última amostra, uma vez que a composição compreendendo a VLP que havia sido remontada sem indução de agregação tornou-se consideravelmente mais heterogênea após o congelamento. No entanto, a VLP que havia sido remontada com indução de agregação pode ser congelada sem qualquer impacto na homogeneidade da amostra. Exemplo 4: Efeito dos crioaditivos

[0213] Para examinar ainda mais o efeito do armazenamento de amostra na VLP, diferentes crioaditivos foram adicionados às composições compreendendo VLP que foram congeladas após uma rodada de desmontagem e remontagem subsequente e duas etapas de diálise incluindo tampão AS (para indução de agregação durante a remontagem) (Figura 9). A Figura 9A mostra a estabilidade da VLP carregada que foi armazenada conforme representado conforme analisado por nDSF. Notavelmente, as VLP que foram armazenadas em um tampão compreendendo sulfato de amônio eram consideravelmente mais estáveis (isto é, mostram uma temperatura de inflexão mais alta) em comparação com os outros crioaditivos. Curiosamente, este efeito foi independente se a VLP foi congelada rapidamente (colunas pretas) ou lentamente (colunas pontilhadas).

[0214] Em uma próxima etapa, essas amostras foram usadas em um ensaio de luciferase (Figura 9B). Inesperadamente, a atividade da luciferase foi fortemente aumentada por VLP que foram armazenadas em uma composição compreendendo sulfato de amônio. A betaína também foi vantajosa em comparação com a amostra sem crioaditivo e os outros crioaditivos testados. Portanto, o uso de crioaditivos, especialmente sulfato de amônio, aumentou consideravelmente a estabilidade da VLP e aumentou a infectividade e a eficácia de liberação de carga da VLP carregada. Novamente, esse efeito foi independente se a VLP foi congelada rapidamente (colunas pretas) ou lentamente (colunas brancas). Exemplo 5: Formação de VLP associada com um anticorpo

[0215] As análises de TEM foram realizadas de VLP associada a um anticorpo IgG ou IgM de acordo com a invenção (com a etapa de agregação f). Na Figura 10 é mostrado que VLP é de fato formada (esquerda: VLP com IgG empacotado; direita: VLP com IgM empacotado). As VLP são visualizadas como partículas de formato redondo.

[0216] Assim, foi mostrado que a VLP pode ser associada com um anticorpo e formar VLP intacta. Exemplo 6: Homogeneidade de VLP associada com um anticorpo

[0217] As análises de DLS com VLP associada a um anticorpo IgG ou IgM fabricado de acordo com a invenção (com etapa de agregação f) revelaram a mesma distribuição de tamanho que VLP "vazio" (Figuras 11 e 12). A Figura 11 mostra uma comparação de pentâmeros (VLP (dissociado)) e VLP "vazio" (VLP (amostra original)). Ambas as amostras são relativamente uniformes em tamanho, mas as VLP "vazias" são maiores em tamanho. A Figura 12 mostra a distribuição de tamanho da VLP associada a um anticorpo IgG (A) ou IgM (B) em comparação com a VLP "vazia". Como pode ser visto, as VLP associadas ao anticorpo são muito homogêneas e semelhantes às da amostra original em homogeneidade e tamanho. Exemplo 7: Liberação eficiente de anticorpos a e/ou em células por

VLP

[0218] A Figura 13 mostra análises de citometria de fluxo de células que foram incubadas com VLP associado a IgG e IgM (fabricado de acordo com a invenção (com etapa de agregação f)) em comparação com controles (células sem adição de VLP: controle de células; células com adição de IgM sem VLP: controle de IgM; células com adição de IgG sem VLP: controle de IgG). A barra mostra as células positivas. Quase todas as células que foram incubadas com VLP associada a IgG e IgM são positivas. Notavelmente, a fluorescência é muito maior em comparação com a incubação apenas com anticorpos IgG ou IgM (controle IgG/controle IgM).

[0219] Foi assim demonstrado que os anticorpos podem ser eficientemente entregues às células por VLP que foram associadas a esses anticorpos.

[0220] Este descoberto foi posteriormente confirmado por microscopia confocal (Figuras 14 a 16). A microscopia confocal foi preparada com microscópio confocal Nikon por imagem XY ou XYZ. O núcleo da célula foi detectado com DAPI (em azul), a membrana celular foi detectada com anticorpo WGA para definir a estrutura celular (em vermelho). O anticorpo foi detectado no canal verde. Para todas as amostras foi usado exatamente o mesmo parâmetro fluorescente (tempo de exposição e capacidade do laser). O controle de anticorpo não empacotado (anticorpo livre, Figura 14A) não mostrou nenhum sinal no canal verde para AB, enquanto a membrana celular e o núcleo da célula (sinais de vermelho e azul) puderam ser detectados, o que significa que a captação de anticorpo livre está abaixo do limite de detecção (que é verificado com a ajuda do FACS, Figura 13).

[0221] As VLP empacotadas com anticorpo IgM não específico (Figura 14B) foram eficientemente distribuídas às células e mostraram sinais muito fortes para o anticorpo (sinais verdes) ambos co-localizados com a membrana celular e espalhados de forma não específica nas células; membrana celular e núcleo celular foram marcados em vermelho e azul, respectivamente.

[0222] A Figura 15 mostra uma única célula após a liberação de IgM inespecífico associado a VLP na célula-alvo. Com a ajuda do Z-stack, toda a célula pode ser escaneada e a carga (IgM AF488) pode ser detectada dentro da célula (sinais verdes detectados no corpo da célula). Os sinais WGA da membrana ajudaram a definir a estrutura celular e a determinar a forma celular. Para cada canal e para a sobreposição de vermelho e verde, a célula é mostrada em grande escala à esquerda e na parte inferior e direita da célula, o zoom no eixo z a partir do eixo x e do eixo y, respectivamente, é mostrado. Assim, pode-se verificar que o anticorpo é detectado dentro da célula.

[0223] A Figura 16 mostra a absorção de anticorpo IgG direcionado contra tubulina nas células-alvo. Com a ajuda do Z-stack, as células inteiras podem ser escaneadas e a carga (antitubulina IgG AF488) pode ser detectada dentro das células (sinais verdes detectados no corpo da célula). Os sinais WGA da membrana ajudaram a definir a estrutura celular e a determinar a forma da célula.

[0224] A liberação eficiente do anticorpo em células foi assim demonstrada. Exemplo 8: Permeação mais alta de anticorpos associados com

VLP

[0225] Um modelo BBB in vitro foi escolhido para analisar a permeabilidade de VLP empacotado com IgG ou IgM (fabricado de acordo com a invenção (com etapa de agregação f)) e comparado com "anticorpo livre" (IgG/IgM sem VLP) e FITC- ou TRITC -dextrano conjugado (4kDa FITC/70kDa TRITC). Surpreendentemente, a associação de VLP com anticorpo aumentou o transporte de anticorpo através da BBB em comparação com o anticorpo livre (Figura 17). A integridade da BBB foi verificada usando 4kDa FITC dextrano e 70kDa TRITC dextrano. Os valores são a porcentagem de permeação em comparação com uma permeação sem células de BBB.

MODALIDADES ESPECÍFICAS Para o aspecto da invenção sem a etapa de agregação f)

1. Método para fornecer um sistema de liberação de fármaco compreendendo uma partícula semelhante a vírus (VLP) derivada de vírus John Cunningham (JCV) compreendendo as etapas seguintes: a) fornecer uma composição compreendendo proteínas VP1, b) expor as proteínas VP1 da composição de a) a condições que induzem a VP1 a se montar em VLP, c) expor a VLP da composição de b) a condições que desmontam a VLP em pentâmeros, d) expor os pentâmeros da composição de c) a condições induzindo os pentâmeros a se remontar em VLP e) expor a VLP da composição de d) a condições que desmontam a VLP em pentâmeros, f) expor os pentâmeros da composição de e) a uma carga e condições induzindo os pentâmeros a se montar em uma VLP associada com a carga.

2. O método de acordo com a modalidade 1, ao passo que antes da etapa d) os pentâmeros da composição de c) são expostos a condições que induzem a agregação dos pentâmeros.

3. O método de acordo com a modalidade 2, ao passo que a agregação é induzida por um agente de precipitação, preferivelmente selecionado a partir do grupo consistindo em polietilenoglicol (PEG), álcool, um sal ou uma combinação dos mesmos, o mais preferivelmente por um sal.

4. O método de acordo com a modalidade 3, ao passo que o sal compreende um ânion e um cátion selecionados a partir do grupo consistindo em citrato (C6H5O73-), fosfato (PO43-), sulfato (SO42-),

fosfato de hidrogênio (HPO42-), fosfato de di-hidrogênio (H2PO4-), iodato (IO3-), hidróxido (OH-), fluoreto (F-), bromato (BrO3-) ou acetato (CH3COO-), compostos de amônio quaternário (NR4+) com R sendo um grupo alquila ou arila, preferivelmente tetrametilamônio ((CH3)4N+) ou dimetilamônio ((CH3)2N2+), amônio (NH4+), potássio (K+), césio (Cs+), rubídio (Rb+) ou lítio (Li+), preferivelmente compreendendo SO42- e/ou NH4+.

5. O método de acordo com a modalidade 3 ou 4, ao passo que o sal é selecionado a partir do grupo consistindo em (NH4)2SO4, K2SO4, Na2SO4, (NH4)2HPO4, K2HPO4 e Na2HPO4, preferivelmente (NH4)2SO4.

6. O método de acordo com qualquer uma das modalidades 2 a 5, ao passo que a etapa d) inclui separar os pentâmeros da composição d) das condições que induzem a agregação dos pentâmeros.

7. O método de acordo com a modalidade 6, ao passo que a separação é obtida por uma diálise contra uma composição compreendendo um sal e um tampão e um pH de 6 a 8,5, preferivelmente de 6,5 a 8,5, mais preferivelmente de 7 a 8, o mais preferivelmente de 7,2 a 7,5, em particular de 7,5.

8. O método de acordo com qualquer uma das modalidades precedentes, ao passo que a composição da etapa d) é caracterizada por a) um índice de polidispersibilidade (PDI) de menos do que 0,3, preferivelmente menos do que 0,2, preferivelmente menos do que 0,1, mais preferivelmente está em uma faixa entre 0,01 e 0,09 e/ou b) pelo menos 70% da VLP tendo um diâmetro médio de 20 nm a 70 nm, preferivelmente de 30 nm a 70 nm, mais preferivelmente de 35 nm a 65 nm, mais preferivelmente de 40 a 60 nm.

9. O método de acordo com qualquer uma das modalidades precedentes, compreendendo uma etapa de armazenar a VLP da composição da etapa d) por pelo menos 10 horas, 15 horas , 20 horas , preferivelmente por pelo menos 24 horas a uma temperatura de cerca de -80°C a cerca de 4°C, mais preferivelmente a uma temperatura de cerca de -80°C por pelo menos 24 horas .

10. O método de acordo com a modalidade 9, ao passo que o armazenamento ocorre em uma composição compreendendo um crioaditivo, preferivelmente selecionado a partir do grupo compreen- dendo polióis, açúcares, sais inorgânicos, sais orgânicos, aminoácidos, polímeros, extremólitos ou derivados ou combinações dos mesmos.

11. O método de acordo com a modalidade 10, ao passo que o sal inorgânico compreende um ânion sulfato e preferivelmente é sulfato de amônio e/ou o aminoácido é glicina, glutamina, prolina, alanina e/ou o derivado de aminoácido é betaína.

12. O método de acordo com qualquer uma das modalidades precedentes, ao passo que a VLP da etapa b), os pentâmeros da etapa c) e/ou a VLP da etapa d) são submetidos à purificação.

13. O método de acordo com qualquer uma das modalidades precedentes, ao passo que a VP1 compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID Nº: 1 sobre seu comprimento inteiro, preferivelmente tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID Nº: 1.

14. O método de acordo com qualquer uma das modali- dades precedentes, ao passo que uma sequência de nucleotídeos da proteína VP1 é pelo menos 70%, mais preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 90% idêntica à sequência de nucleotídeos da SEQ ID Nº: 2 sobre seu comprimento inteiro, preferivelmente é a sequência de nucleotídeos da SEQ ID Nº: 2.

15. Composição compreendendo partículas semelhantes a vírus (VLP) derivadas de vírus John Cunningham (JCV) caracterizada por um ou mais dos parâmetros seguintes: a) um índice de polidispersibilidade (PDI) de menos do que 0,3, preferivelmente menos do que 0,2, preferivelmente menos do que 0,1, mais preferivelmente em uma faixa entre 0,01 e 0,09, b) pelo menos 70% de VLP com um diâmetro médio de 20 nm a 70 nm, preferivelmente de 30 nm a 70 nm, mais preferivelmente de 35 nm a 65 nm, mais preferivelmente de 40 a 60 nm, c) um teor de VLP dentro da composição de pelo menos 80% (v/v), preferivelmente pelo menos 85% (v/v), preferivelmente pelo menos 90% (v/v), preferivelmente pelo menos 95% (v/v).

16. Sistema de liberação de fármaco obtenível pelo método de acordo com qualquer uma das modalidades precedentes.

17. O sistema de liberação de fármaco de acordo com a modalidade 16 para o uso em um método de terapia e/ou diagnóstico, preferivelmente para o tratamento de transtornos neurológicos, em particular de doenças do SNC, em um indivíduo em necessidade do mesmo.

18. Partículas semelhantes a vírus (VLP) derivadas de vírus John Cunningham (JCV) obteníveis por um método compreen- dendo as etapas a) a e) da modalidade 1 e uma etapa adicional de expor os pentâmeros da composição de e) a condições induzindo os pentâmeros a se montar em VLP.

19. O sistema de liberação de fármaco de acordo com as modalidades 16 ou 17 ou a VLP de acordo com a modalidade 18, ao passo que a VLP cruza a barreira hematoencefálica (BBB).

20. O sistema de liberação de fármaco ou a VLP de acordo com a modalidade 19, ao passo que a VLP é detectável no SNC dentro de 10 dias ou menos depois da administração do sistema de liberação de fármaco, preferivelmente depois da administração i.v..

21. O sistema de liberação de fármaco ou a VLP de acordo com a modalidade 19 ou 20, ao passo que a VLP cruza a BBB fisiologicamente intacta.

22. O sistema de liberação de fármaco ou a VLP de acordo com a modalidade 20, ao passo que o cruzamento não requer uma perda de integridade ou permeabilidade aumentada da BBB.

23. O sistema de liberação de fármaco de acordo com a modalidade 17, ao passo que o indivíduo não recebeu um tratamento de aumentar a permeabilidade de sua BBB ou induzir o rompimento da mesma.

24. Composição compreendendo partículas semelhantes a vírus (VLP) derivadas de vírus John Cunningham (JCV) compreendendo um sal e um tampão e um pH de 7,0 a 8,0, preferivelmente de 7,5, preferivelmente compreendendo: a) 120 mM a 170 mM de NaCl, preferivelmente 150 mM de NaCl, b) 1 a 5 mM de CaCl2, preferivelmente 2 mM de CaCl2, e c) 5 a 30 mM de Tris-HCl, preferivelmente 10 a 25 mM de Tris-HCl, mais preferivelmente 10 mM de Tris-HCl.

Claims (30)

REIVINDICAÇÕES

1. Método para fornecer uma partícula semelhante a vírus (VLP) derivada de vírus John Cunningham (JCV), caracterizado pelo fato de que compreende as etapas seguintes: a) fornecer uma composição compreendendo proteínas VP1, b) expor as proteínas VP1 da composição de a) a condições que induzem a VP1 a se montar em VLP, c) expor a VLP da composição de b) a condições que desmontam a VLP em pentâmeros, d) expor os pentâmeros da composição de c) a condições induzindo os pentâmeros a se remontar em VLP e) expor a VLP da composição de d) a condições que desmontam a VLP em pentâmeros, f) expor os pentâmeros da composição de e) a condições que induzem a agregação dos pentâmeros, g) expor os pentâmeros agregados da composição de f) a uma carga, em particular uma proteína, sob condições induzindo os pentâmeros agregados a se montar em uma VLP associada com a carga, em particular a proteína.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os pentâmeros agregados na etapa g) são induzidos a se montar em uma VLP que incorpora a carga, em particular a proteína.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que antes da etapa d) os pentâmeros da composição de c) são expostos a condições que induzem a agregação dos pentâmeros.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a agregação é induzida por um agente de precipitação, preferivelmente selecionado a partir do grupo consistindo em polietilenoglicol (PEG), álcool, um sal ou uma combinação dos mesmos, o mais preferivelmente por um sal.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o sal compreende um ânion e um cátion selecionados a partir do grupo consistindo em citrato (C6H5O73-), fosfato (PO43-), sulfato (SO42-), fosfato de hidrogênio (HPO42-), fosfato de di-hidrogênio (H2PO4-), iodato (IO3-), hidróxido (OH-), fluoreto (F-), bromato (BrO3-) ou acetato (CH3COO-), compostos de amônio quaternário (NR4+) com R sendo um grupo alquila ou arila, preferivelmente tetrametilamônio ((CH3)4N+) ou dimetilamônio ((CH3)2N2+), amônio (NH4+), potássio (K+), césio (Cs+), rubídio (Rb+) ou lítio (Li+), preferivelmente compreendendo SO42- e/ou NH4+.

6. Método, de acordo com a reivindicação 4 ou 5, caracterizado pelo fato de que o sal é selecionado a partir do grupo consistindo em (NH4)2SO4, K2SO4, Na2SO4, (NH4)2HPO4, K2HPO4 e Na2HPO4, preferivelmente (NH4)2SO4.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 6, caracterizado pelo fato de que os pentâmeros são levados em contato com o agente de precipitação, preferivelmente por diálise ou filtração de fluxo cruzado.

8. Método, de acordo com a reivindicação 1 e/ou reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que depois da indução da agregação, os pentâmeros da composição f) e/ou d) são separados das condições que induzem a agregação dos pentâmeros.

9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a separação é obtida por uma diálise contra uma composição compreendendo um sal e um tampão e um pH de 6 a 8,5, preferivelmente de 6,5 a 8,5, mais preferivelmente de 7 a 8, o mais preferivelmente de 7,2 a 7,5, em particular de 7,5.

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que na etapa c) e/ou na etapa e) as VLP são expostas a um agente de redução, preferivelmente selecionado a partir do grupo consistindo em 2-mercaptoetanol, cloridrato de Tris-2-carboxietilfosfina (TCEP), peróxido de hidrogênio (H2O2), Ditiotreitol (DTT), tiossulfato e ácido fórmico, mais preferivelmente selecionado a partir do grupo consistindo em 2- mercaptoetanol, TCEP e DTT, o mais preferivelmente DTT.

11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a carga, em particular a proteína, tem um peso molecular de cerca de 10 kDa a cerca de 4000 kDa.

12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a proteína é um anticorpo, fragmento de anticorpo, preferivelmente um nanocorpo, derivado do anticorpo ou do fragmento de anticorpo, ou um conjugado de anticorpo- fármaco (ADC).

13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo IgG, um anticorpo IgM, um anticorpo IgA, um anticorpo IgD ou um anticorpo IgE, preferivelmente um anticorpo IgG ou um anticorpo IgM.

14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a composição da etapa d) é definida por a) um índice de polidispersibilidade (PDI) de menos do que 0,3, preferivelmente menos do que 0,2, preferivelmente menos do que 0,1, mais preferivelmente está em uma faixa entre 0,01 e 0,09 e/ou b) pelo menos 70% da VLP tendo um diâmetro médio de 20 nm a 70 nm, preferivelmente de 30 nm a 70 nm, mais preferivelmente de 35 nm a 65 nm, mais preferivelmente de 40 a 60 nm.

15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que compreende uma etapa de armazenamento da VLP da composição da etapa d) por pelo menos 10 horas , 15 horas , 20 horas , preferivelmente por pelo menos 24 horas a uma temperatura de cerca de -80°C a cerca de 4°C, mais preferivelmente a uma temperatura de cerca de -80°C por pelo menos 24 horas .

16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o armazenamento ocorre em uma composição compreendendo um crioaditivo, preferivelmente selecionado a partir do grupo compreendendo polióis, açúcares, sais inorgânicos, sais orgânicos, aminoácidos, polímeros, extremólitos ou derivados ou combinações dos mesmos.

17. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o sal inorgânico compreende um ânion sulfato e preferivelmente é sulfato de amônio e/ou o aminoácido é glicina, glutamina, prolina, alanina e/ou o derivado de aminoácido é betaína.

18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a VLP da etapa b), os pentâmeros da etapa c), a VLP da etapa d) e/ou a VLP da etapa g) são submetidos à purificação.

19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a VP1 compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID Nº: 1 sobre seu comprimento inteiro, preferivelmente tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID Nº: 1.

20. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que uma sequência de nucleotídeos da proteína VP1 é pelo menos 70%, mais preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 90% idêntica à sequência de nucleotídeos da SEQ ID Nº: 2 sobre seu comprimento inteiro, preferivelmente é a sequência de nucleotídeos da SEQ ID Nº: 2.

21. VLP associada com uma carga, em particular uma proteína, caracterizado pelo fato de que é obtenível pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações precedentes.

22. VLP, de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo fato de que a VLP incorpora a carga, em particular a proteína.

23. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende partículas semelhantes a vírus (VLP) derivadas de vírus John Cunningham (JCV), definidas por um ou mais dos parâmetros seguintes: a) um índice de polidispersibilidade (PDI) de menos do que 0,3, preferivelmente menos do que 0,2, preferivelmente menos do que 0,1, mais preferivelmente em uma faixa entre 0,01 e 0,09, b) pelo menos 70% de VLP com um diâmetro médio de 20 nm a 70 nm, preferivelmente de 30 nm a 70 nm, mais preferivelmente de 35 nm a 65 nm, mais preferivelmente de 40 a 60 nm, c) um teor de VLP dentro da composição de pelo menos 80% (v/v), preferivelmente pelo menos 85% (v/v), preferivelmente pelo menos 90% (v/v), preferivelmente pelo menos 95% (v/v).

24. Sistema de liberação de fármaco, caracterizado pelo fato de que é obtenível pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 20.

25. Sistema de liberação de fármaco, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que é para o uso em um método de terapia e/ou diagnóstico, preferivelmente para o tratamento de transtornos neurológicos, em particular de doenças do SNC, em um indivíduo em necessidade do mesmo.

26. Sistema de liberação de fármaco, de acordo com a reivindicação 24 ou 25, caracterizado pelo fato de que as VLP cruzam a barreira hematoencefálica (BBB).

27. Sistema de liberação de fármaco, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que as VLP são detectáveis no SNC dentro de 10 dias ou menos depois da administração do sistema de liberação de fármaco, preferivelmente depois da administração i.v..

28. Sistema de liberação de fármaco, de acordo com a reivindicação 26 ou 27, caracterizado pelo fato de que as VLP cruzam a BBB fisiologicamente intacta.

29. Sistema de liberação de fármaco, de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 28, caracterizado pelo fato de que o cruzamento não requer uma perda de integridade ou permeabilidade aumentada da BBB.

30. Sistema de liberação de fármaco, de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 29, caracterizado pelo fato de que o indivíduo não recebeu um tratamento de aumentar a permeabilidade de sua BBB ou induzir o rompimento da mesma.