JP6884432B2 - 新規薬物送達システムおよびそれを提供する方法 - Google Patents
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Description
本発明は、John Cunninghamウイルス(JCV)に由来するウイルス様粒子(VLP)を含む、薬物送達システム(DDS)を提供するための、特に血液脳関門(BBB)を横断するための方法、薬物送達システムならびに上記方法によって得られる新規なVLPおよびVLP含有組成物に関する。
血液脳関門(BBB)は、血液と脳との間にある高度に選択的かつ透過性の膜である。その関門は、循環血液を、中枢神経系(CNS)における脳細胞外液(BECF)から分離するように機能する。BBBは、本来は高度に選択的であり、受動拡散によって、脂溶性分子、水およびある種のガスの通過のみを可能にする。その関門はまた、分子(例えば、グルコースおよびアミノ酸)を選択的に輸送し、これら分子は、神経機能に必須である。さらに、BBBは、親油性の潜在的な神経毒が脳に入ることを妨げる。
国際公開第2013/131644号 A1の開示は、JCVに由来するVLPがインビボでその生理学的に無傷のBBBを超えて横断するという最初の実験による証拠を提供した。よって、薬学的生成物に装填されたJCVに由来するVLPは、CNSに入るための有望な薬物送達システムである。しかし、このシステムの有効性をさらに改善することが依然として必要である。
従って、本発明の目的は、改善された有効性を有する、John Cunninghamウイルス(JCV)に由来するVLPに基づく、特に薬学的生成物をCNSへと送達するための、薬物送達システムを提供することである。改善された有効性は、特に、より多くのカーゴがCNSに達することを意味する。その改善された有効性は、相互作用し得る多数の理由があり得る。より高い有効性は、例えば、より多量のVLPおよび/またはカーゴがCNSに入るように、VLPによるBBBのより有効な横断に起因し得る。それは、CNSに達した後に、そのVLPからのカーゴの改善された放出に等しく起因し得る、さらに、そのより高い有効性の理由は、各個々のVLPがより多量のカーゴに装填され得るか、または装填されるVLPの量全体が増大され得るという事実であり得る。
a)JCVのVP1タンパク質を含む組成物を提供する工程、
b)上記工程a)の組成物のVP1タンパク質を、上記VP1を誘導する条件に曝して、VLPへとアセンブルする工程、
c)上記b)の組成物のVLPを、上記VLPをペンタマーへと脱アセンブルする条件に曝す工程、
d)上記c)の組成物のペンタマーを、上記ペンタマーを誘導する条件に曝して、VLPへと再アセンブルする工程、
e)上記d)の組成物のVLPを、上記VLPをペンタマーへと脱アセンブルする条件に曝す工程、
f)上記e)の組成物のペンタマーを、カーゴ、および上記ペンタマーを誘導する条件に曝して、上記カーゴと会合したVLPへとアセンブルする工程。
本発明の第1の局面において、本発明は、以下の工程を包含する、John Cunninghamウイルス(JCV)に由来するウイルス様粒子(VLP)を含む薬物送達システムを提供するための方法に関する:
a) VP1タンパク質を含む組成物を提供する工程、
b) 工程a)の組成物のVP1タンパク質を、そのVP1を誘導する条件に曝して、VLPへとアセンブルする工程、
c) b)の組成物のVLPを、そのVLPをペンタマーへと脱アセンブルする条件に曝す工程、
d) c)の組成物のペンタマーを、そのペンタマーを誘導する条件に曝してVLPへと再アセンブルする工程、
e) d)の組成物のVLPを、そのVLPをペンタマーへと脱アセンブルする条件に曝す工程、
f) e)の組成物のペンタマーを、カーゴおよびそのペンタマーを誘導する条件に曝して、そのカーゴと会合したVLPへとアセンブルする工程。
a. 0.3未満、好ましくは0.2未満、好ましくは0.1未満、より好ましくは0.01〜0.09の間の範囲の多分散指数(PDI)
b. VLPのうちの少なくとも70%が20nm〜70nm、好ましくは30nm〜70nm、より好ましくは35nm〜65nm、より好ましくは40〜60nmの平均直径を有する、
c. その組成物内のVLP含有量が、少なくとも80%(v/v)、好ましくは少なくとも85%(v/v)、好ましくは少なくとも90%(v/v)、好ましくは少なくとも95%(v/v)。
a. 120mM〜170mM NaCl、好ましくは150mM NaCl、
b. 1〜5mM CaCl2、好ましくは2mM CaCl2、および
c. 5〜30mM Tris−HCl、好ましくは10〜25mM Tris−HCl、より好ましくは10mM Tris−HCl、
を含む。
a. 0.3未満、好ましくは0.2未満、好ましくは0.1未満、より好ましくは0.01〜0.09の間の範囲の多分散指数(PDI)、
b. VLPのうちの少なくとも70%が、20nm〜70nmの、好ましくは30nm〜70nmの、より好ましくは35nm〜65nmの、より好ましくは40〜60nmの平均直径を有する、
c. その組成物内のVLP含有量が、少なくとも80%(v/v)、好ましくは少なくとも85%(v/v)、好ましくは少なくとも90%(v/v)、好ましくは少なくとも95%(v/v)。
VLP製造
ウイルス様粒子(VLP)を、ヨトウムシ(fall armyworm)(Spodoptera frugiperda)に由来するSf9昆虫細胞株(Thermo Fischer scientific)を使用するタンパク質発現によって製造した。VLPを、その細胞にJohn Cunninghamウイルス VP1タンパク質発現カセットを含む組換えバキュロウイルスを感染させることによって生成した。その組換えバキュロウイルスを、Bac−to−Bac(登録商標) Baculovirus発現系(Thermo Fischer Scientific)を使用することによって調製した。VLPを、3.4L バイオリアクター(INFORS HT Minifors)中での7〜10日後に、pH6.3において生成した。空気流および温度(26℃)をその時間にわたって制御した。細胞および細胞デブリを除去するために、懸濁物を、4℃、5.000gで遠心分離し、そのVLPを含む上清を採取した。
a) カーゴと混合し、再アセンブルした(「カーゴでの新鮮なまたは貯蔵したペンタマーのパッケージング」を参照のこと);
b) ペンタマーの貯蔵のために5% グリセロールとともに−80℃で凍結した(これをその後、カーゴと混合および再アセンブルされ得る。「カーゴでの新鮮なまたは貯蔵したペンタマーのパッケージング」を参照のこと)または
c) 20kDaカットオフを有する透析カセット(Slide−A−LyzerTM G2 Dialysis Device, Thermo Scientific)へと直ぐに配置し、透析(2工程透析)による2工程再アセンブルによって再アセンブルした。第1に、ペンタマーを、2M 硫酸アンモニウム緩衝液(「AS」、10mM Tris−HCl、150mM NaCl、2M (NH4)2SO4、pH7.5)に対して24時間にわたって透析し、次いで、次の24時間にわたって10mM Tris−HCl、150mM NaCl、2mM CaCl2、pH7.5(標準的再会合緩衝液、「ST」)に移した(AS>ST)。あるいは、その2工程透析を、ST緩衝液で、両方の工程において行った(ST>ST)。両方の場合に、アセンブリされていない物質および凝集物をそのVLPから分離するために、そのVLPを含む組成物を、HiPrepTM Sephacryl(登録商標)S−500 HRカラム(GE Healthcare)を使用して、Zetasizer ZS Nano(Malvern Inc.)を使用する動的光散乱法(DLS)において画分の多分散指数(PDI)の制御下で、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)によって精製した。標的化したサイズを有するVLP画分を選択およびプールし、次いで、適用可能である場合に5kDa カットオフ膜を有するVivaspin(登録商標)濃縮器(Sartorius)中で濃縮し、続いて、−80℃で貯蔵した。
再アセンブルしたVLPのVLPパッケージングのために、上記の工程c)の貯蔵したVLPを−80℃から取り出し、サーマルシェイカー(23℃、350rpm)を使用して融解した。その後、融解したVLPサンプルの解離を、解離緩衝液(20mM Tris−HCl、150mM NaCl、5mM DTT、および10mM EDTA)の存在下で、23℃および45rpmにおいて15分間そのサンプルをインキュベートすることによって行った。解離したVLPを、カーゴ(例えば、核酸)の存在下で再アセンブルした。簡潔には、その解離したVLPを、適切な濃度のカーゴと徹底的に混合し、続いて、その混合物を、20kDa MWCO透析チャンバ(Slide−A−LyzerTM MINI Dialysis Device, Thermo Scientific)を使用して標準的な再会合緩衝液(10mM Tris−HCl、150mM NaCl、2mM CaCl2、pH7.5)に対して透析した。4〜6時間後、透析緩衝液を、新鮮な透析緩衝液に交換し、サンプルをさらに16〜18時間インキュベートした。核酸をカーゴとして使用する場合、パックされていない核酸を、25μg VLPおよび2.5mM MgCl2につき、37℃において1時間、40 u Benzonase(登録商標) Nuclease(Merck)とインキュベートすることによって消化した。サンプルを、透析する前に濾過した(Corning(登録商標) Costar(登録商標) Spin−X(登録商標)遠心分離チューブフィルタ;孔サイズ0.22μm)。VLPを、その後直接分析し、そして/または−80℃で貯蔵した。
ペンタマーパッケージングのために、新鮮なまたは−80℃で貯蔵したペンタマーを直接混合し、カーゴで再アセンブルしたか、またはサーマルシェイカー(23℃、350rpm)を使用して融解し、次いで、カーゴ(例えば、核酸)の存在下で再アセンブルした。簡潔には、そのペンタマーを、適切な濃度のカーゴと徹底的に混合し、続いて、その混合物を、20kDa MWCO透析チャンバ(Slide−A−LyzerTM MINI Dialysis Device, Thermo Scientific)を使用して標準的な再会合緩衝液(10mM Tris−HCl、150mM NaCl、2mM CaCl2、pH7.5)に対して透析した。核酸をカーゴとして使用する場合、パックされていない核酸を、25μg 再アセンブルVLPおよび2.5mM MgCl2につき、37℃において1時間、40 u Benzonase(登録商標) Nuclease(Merck)とインキュベートすることによって消化した。再アセンブルしたペンタマーを、その後直接分析した。
核酸に装填したVLPの場合(新鮮なまたは貯蔵したペンタマーから;または再アセンブルおよび精製したVLPから製造)、ルシフェラーゼ NanoLuc(登録商標)プラスミドを、カーゴとして使用した。膠芽腫細胞を、予め、10% FCS(Thermo Fisher)および1% Pen−Strep(PAN−Biotech)を補充した900μl DMEM培地、高グルコース、GutaMAXTM(Thermo Fisher)中に、3×104の密度で24時間播種した。そのサンプルを添加する前に、その相当する量の培地を、各ウェル中の一定量の培地を維持するために除去した。サンプルをその細胞に添加し、37℃および5% CO2において48時間インキュベートした。その後、細胞培地を排除し、細胞をPBSで洗浄した。ルシフェラーゼ活性を、製造業者の説明書に従って決定した(NanoGlo(登録商標) Luciferase Assay(Promega))。Glomax(登録商標)マルチ検出システム(Promega)において、白色96ウェルプレート(Greiner bio−one)中でルミネッセンスを測定した。
サンプル解離を堅守するために、サンプルの再アセンブルおよび安定性、動的光散乱法(DLS)および多分散指数(PDI)を、Zetasizer Nano ZS(Malvern.)を使用して測定した。そのVLPサイズおよびPDIを、Zetasizer Software(バージョン7.11, Malvern)で記録した。さらに、各サンプルの屈折温度を、Tycho NT.6(Nanotemper)を使用してnDSFによって評価した。
VLPのBBB透過を、2区画人工BBBモデルにおいて、単一培養物(透過性にした蛍光標識物質の直接定量)または共培養物(標的細胞における透過した物質によって引き起こされるタンパク質発現)のいずれかを使用することによって評価した。
その調製した挿入物を、1ウェルあたり900μlのフェノール非含有培地(DMEM/F−12、HEPES、フェノールレッドなし、Thermo Fisher Scientific)を満たした新たな24ウェルプレートに注意深く移した。サンプルをその挿入物に添加する前に、各挿入物において200μl 培地の一定量を維持するために、その相当する量の培地を除去した。インキュベーター中で、37℃において120分間のインキュベーション後に、各ウェルの3×100μlを、黒色96ウェルプレートに移し、そのサンプルの蛍光を、プレートリーダー(Tecan Infinite M200, Tecan)を使用して決定した。
挿入物を、標的細胞(膠芽腫細胞)を含む、10% FCS(Thermo Fisher)および1% Pen−Strep(PAN−Biotech)を補充した900μl DMEM、高グルコース、GutaMAXTM(Thermo Fisher)中、3×104の密度で予め24時間播種した新たな24ウェルプレートに移した。そのサンプル(NanoLuc(登録商標)プラスミドでパックされたVLP)をその挿入物に添加する前に、各挿入物において200μl 培地の一定量を維持するために、その相当する量の培地を除去した。24時間後に、その挿入物を、その24ウェルプレートから除去し、PBSで洗浄した。応じて、その膜(BBB細胞を有する)を外科用メスを使用して切断し、1.5ml 反応バイアルに移した。ルシフェラーゼ活性を、その製造業者の説明書に従って決定した(NanoGlo(登録商標) Luciferase Assay(Promega))。
各凍結防止添加剤であるグリセロール(Carl Roth)、スクロース(Carl Roth)、硫酸アンモニウム(Carl Roth)、DMSO(Carl Roth)およびベタイン(Merck)を、0.68Mに相当する5%(v/v)でのグリセロールを除いて、最終添加剤濃度1Mを生じるように、VLPに添加した。さらに、1つのアリコートは、添加剤物質を含まなかった(w/o)。そのサンプルを分割し、2つの凍結速度を適用することによって凍結した: 各サンプルの1/2を、およそ−1℃/分の冷却速度で凍結した(遅い凍結)一方で、その2/2を、その容器を液体窒素へと漬けることによって迅速に凍結した(迅速凍結)。全てのサンプルを−80℃において1〜10日間の貯蔵期間で貯蔵した。23℃での融解および350rpmでの振盪後に、そのサンプルを、10mM Tris−HCl、150mM NaCl、2mM CaCl2、pH 7.5に対して、室温において2時間透析して、添加剤濃度および分析結果に対するそれらの影響を低減させた。粒子直径およびPDIを、Zetasizer Nanoseries(Malvern)によって決定した。屈折温度を、Tycho NT.6(Nanotemper)を使用して測定した。貯蔵後のVLP機能性を、NanoLuc(登録商標)プラスミドパッケージングおよびその後のNanoGlo(登録商標) Luciferase assay(Promega)の助けを借りて証明した。
VLPの有効性を送達するカーゴ(これを、種々の方法を使用して調製した)を比較した(図1)。この目的のために、2ラウンドの脱アセンブルおよびその後の再アセンブルまたは1ラウンドの脱アセンブルおよびその後の再アセンブル(両方の方法において、ルシフェラーゼプラスミドの存在下で最後の再アセンブル)を受けたVLPを生成した。顕著なことには、2ラウンドの脱アセンブルおよびその後の再アセンブルを受けたVLPのルシフェラーゼ活性は、1ラウンドの脱アセンブルおよびその後の再アセンブルを受けたVLPと比較して、および「プラスミドのみ」および「細胞のみ」のコントロールと比較して、有意に増大した。
種々の貯蔵手順を受けた標識VLPを含む組成物の均質性および均質性を調査するために、透過型電子顕微鏡法(TEM)を行った。1ラウンドの脱アセンブルおよびその後の再アセンブルで生成されたVLP(凍結されたペンタマー、左)を、2ラウンドの脱アセンブルおよびその後の再アセンブルで生成されたVLP(凍結されたVLP、右)と比較した(図4)。後者の場合に生成されたVLPは、顕著により均質な分布を示した。なぜならそれらは、そのペンタマーが製造の間に凍結されたVLPと比較した場合に、いかなる目に見える欠損性ウイルス粒子をも欠いたからである。
次に、ペンタマーをVLPへと再アセンブルする間に凝集を誘導する効果を測定した。DLSによって均質性を分析した(図7および図8)。図7は、凝集の誘導あり(白い棒)および凝集の誘導なし(黒い棒)の透析後に得られたVLPのPDIを示す。第1の凝集の誘導によって再アセンブルされたVLPは、凝集の誘導なしで再アセンブルされたVLPと比較して、強く低減したPDIを示した。従って、再アセンブルの間の凝集の誘導は、遙かにより均質なサイズ分布をもたらした。両方のサンプルを、凍結する前に採取した(従って、それらは1ラウンドの脱アセンブルおよび再アセンブルを受けた)。
VLPに対するサンプル貯蔵の効果をさらに綿密に調べるために、種々の凍結防止添加剤を、1ラウンドの脱アセンブルおよびその後の再アセンブル、ならびにAS緩衝液を含む2回の透析工程(再アセンブルの間の凝集の誘導のため)後に凍結したVLPを含む組成物に添加した(図9)。図9Aは、nDSFによって分析した場合に示されるように貯蔵された装填VLPの安定性を示す。顕著なことには、硫酸アンモニウムを含む緩衝液中に貯蔵されたVLPは、他の凍結防止添加剤と比較して、かなりより安定した(すなわち、より高い屈折温度を示す)。興味深いことには、この効果は、そのVLPが迅速に凍結されたか(黒い棒)またはゆっくりと凍結されたか(点付きの棒)に関わらず無関係であった。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目1)
John Cunninghamウイルス(JCV)に由来するウイルス様粒子(VLP)を含む薬物送達システムを提供するための方法であって、該方法は、以下の工程:
a) VP1タンパク質を含む組成物を提供する工程、
b) 該a)の組成物の該VP1タンパク質を、VLPへとアセンブルするように該VP1を誘導する条件に曝す工程、
c) 該b)の組成物の該VLPを、該VLPをペンタマーへと脱アセンブルする条件に曝す工程、
d) 該(c)の組成物の該ペンタマーを、VLPへと再アセンブルするように該ペンタマーを誘導する条件に曝す工程
e) 該d)の組成物の該VLPを、該VLPをペンタマーへと脱アセンブルする条件へと曝す工程、
f) 該e)の組成物の該ペンタマーを、カーゴと会合したVLPへとアセンブルするように、該カーゴおよび該ペンタマーを誘導する条件に曝す工程、
を包含する方法。
(項目2)
工程d)の前に、前記c)の組成物の前記ペンタマーは、該ペンタマーの凝集を誘導する条件へと曝される、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記凝集は、沈殿剤、好ましくは、ポリエチレングリコール(PEG)、アルコール、塩またはこれらの組み合わせからなる群より選択される沈殿剤によって、最も好ましくは塩によって誘導される、項目2に記載の方法。
(項目4)
前記塩は、シトレート(C6H5O7 3−)、ホスフェート(PO4 3−)、スルフェート(SO4 2−)、リン酸水素(HPO4 2−)、リン酸二水素(H2PO4−)、ヨウ素酸(IO3 −)、ヒドロキシド(OH−)、フルオリド(F−)、臭素酸(BrO3 −)またはアセテート(CH3COO−)、四級アンモニウム化合物(NR4 +)であって、Rは、アルキル基もしくはアリール基であるもの、好ましくはテトラメチルアンモニウム((CH3)4N+)またはジメチルアンモニウム((CH3)2N2 +)、アンモニウム(NH4 +)、カリウム(K+)、セシウム(Cs+)、ルビジウム(Rb+)またはリチウム(Li+)からなる群より選択される、アニオンおよびカチオンを含み、好ましくはSO4 2−および/またはNH4 +を含む、項目3に記載の方法。
(項目5)
前記塩は、(NH4)2SO4、K2SO4、Na2SO4、(NH4)2HPO4、K2HPO4およびNa2HPO4からなる群より選択され、好ましくは(NH4)2SO4である、項目3または4に記載の方法。
(項目6)
工程d)は、d)の組成物のペンタマーを、該ペンタマーの凝集を誘導する条件から分離することを包含する、項目2〜5のいずれかに記載の方法。
(項目7)
前記分離は、塩および緩衝液、ならびに6〜8.5の、好ましくは6.5〜8.5の、より好ましくは7〜8の、最も好ましくは7.2〜7.5の、特に7.5のpHを含む組成物に対する透析によって達成される、項目6に記載の方法。
(項目8)
前記工程d)の組成物は、
a)0.3未満、好ましくは0.2未満、好ましくは0.1未満の多分散指数(PDI)、より好ましくは0.01〜0.09の間の範囲の多分散指数、および/または
b)VLPのうちの少なくとも70%が20nm〜70nmの、好ましくは30nm〜70nmの、より好ましくは35nm〜65nmの、より好ましくは40〜60nmの平均直径を有する、
によって特徴づけられる、前述の項目のいずれかに記載の方法。
(項目9)
約−80℃〜約4℃の温度において少なくとも10時間、15時間、20時間、好ましくは少なくとも24時間にわたって、より好ましくは約−80℃の温度において少なくとも24時間にわたって、前記工程d)の組成物からのVLPを貯蔵する工程を包含する、前述の項目のいずれかに記載の方法。
(項目10)
貯蔵する工程は、凍結防止添加剤、好ましくはポリオール、糖、無機塩、有機塩、アミノ酸、ポリマー、エクストリモライト、またはこれらの誘導体もしくは組み合わせを含む群から選択される凍結防止添加剤を含む組成物の中で起こる、項目9に記載の方法。
(項目11)
前記無機塩は、スルフェートアニオンを含み、好ましくは硫酸アンモニウムであり、そして/または前記アミノ酸は、グリシン、グルタミン、プロリン、アラニンであり、そして/または前記アミノ酸誘導体は、ベタインである、項目10に記載の方法。
(項目12)
前記工程b)のVLP、前記工程c)のペンタマーおよび/または前記工程d)のVLPは精製に供される、前述の項目のいずれかに記載の方法。
(項目13)
前記VP1は、配列番号1に従うアミノ酸配列と、その全長にわたって少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含み、好ましくは配列番号1のアミノ酸配列を有する、前述の項目のいずれかに記載の方法。
(項目14)
前記VP1タンパク質のヌクレオチド配列は、配列番号2のヌクレオチド配列と、その全長にわたって少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%同一であり、好ましくは配列番号2のヌクレオチド配列である、前述の項目のいずれかに記載の方法。
(項目15)
以下のパラメーターのうちの1またはこれより多くによって特徴づけられる、John Cunninghamウイルス(JCV)に由来するウイルス様粒子(VLP)を含む組成物:
a)0.3未満、好ましくは0.2未満、好ましくは0.1未満、より好ましくは0.01〜0.09の間の範囲の多分散指数(PDI)、
b)VLPのうちの少なくとも70%が、20nm〜70nm、好ましくは30nm〜70nmの、より好ましくは35nm〜65nmの、より好ましくは40〜60nmの平均直径を有する、
c)前記組成物内のVLP含有量が、少なくとも80%(v/v)。好ましくは少なくとも85%(v/v)、好ましくは少なくとも90%(v/v)、好ましくは少なくとも95%(v/v)。
(項目16)
前述の項目のいずれかに記載の方法によって得られ得る、薬物送達システム。
(項目17)
必要性のある被験体における治療および/または診断の方法における使用のための、好ましくは神経学的障害の、特にCNS疾患の処置のための、項目16に記載の薬物送達システム。
(項目18)
項目1の工程a)〜e)、および前記e)の組成物の前記ペンタマーをVLPへとアセンブルするように該ペンタマーを誘導する条件に曝すというさらなる工程を包含する方法によって得られ得る、John Cunninghamウイルス(JCV)に由来するウイルス様粒子(VLP)。
(項目19)
前記VLPは血液脳関門(BBB)を横断する、項目16もしくは17に記載の薬物送達システム、または項目18に記載のVLP。
(項目20)
VLPは、前記薬物送達システムの投与後に、好ましくはi.v.投与後に、10日間以内にCNSにおいて検出可能である、項目19に記載の薬物送達システムまたはVLP。
(項目21)
前記VLPは、生理学的に無傷のBBBを横断する、項目19または20に記載の薬物送達システムまたはVLP。
(項目22)
前記横断は、前記BBBの完全性の喪失または透過性の増大を要求しない、項目20に記載の薬物送達システムまたはVLP。
(項目23)
前記被験体は、彼のBBBの透過性を増大させるか、またはその混乱を誘導するという処置を受けたことがない、項目17に記載の薬物送達システム。
(項目24)
塩および緩衝液を含み、そしてpH7.0〜8.0、好ましくは7.5の、John Cunninghamウイルス(JCV)に由来するウイルス様粒子(VLP)を含む組成物であって、該組成物は、好ましくは:
a)120mM〜170mM NaCl、好ましくは150mM NaCl、
b)1〜5mM CaCl2、好ましくは2mM CaCl2、および
c)5〜30mM Tris−HCl、好ましくは10〜25mM Tris−HCl、より好ましくは10mM Tris−HCl、
を含む、組成物。
Claims (24)
- John Cunninghamウイルス(JCV)に由来するウイルス様粒子(VLP)を含む薬物送達システムを提供するための方法であって、該方法は、以下の工程:
a) VP1タンパク質を含む組成物を提供する工程、
b) 該a)の組成物の該VP1タンパク質を、VLPへとアセンブルするように該VP1を誘導する条件に曝す工程、
c) 該b)の組成物の該VLPを、該VLPをペンタマーへと脱アセンブルする条件に曝す工程、
d) 該(c)の組成物の該ペンタマーを、VLPへと再アセンブルするように該ペンタマーを誘導する条件に曝す工程
e) 該d)の組成物の該VLPを、該VLPをペンタマーへと脱アセンブルする条件へと曝す工程、
f) 該e)の組成物の該ペンタマーを、カーゴと会合したVLPへとアセンブルするように、該カーゴおよび該ペンタマーを誘導する条件に曝す工程、
を包含する方法。 - 工程d)の前に、前記c)の組成物の前記ペンタマーは、該ペンタマーの凝集を誘導する条件へと曝される、請求項1に記載の方法。
- 前記凝集は、沈殿剤、好ましくは、ポリエチレングリコール(PEG)、アルコール、塩またはこれらの組み合わせからなる群より選択される沈殿剤によって、最も好ましくは塩によって誘導される、請求項2に記載の方法。
- 前記塩は、シトレート(C6H5O7 3−)、ホスフェート(PO4 3−)、スルフェート(SO4 2−)、リン酸水素(HPO4 2−)、リン酸二水素(H2PO4−)、ヨウ素酸(IO3 −)、ヒドロキシド(OH−)、フルオリド(F−)、臭素酸(BrO3 −)またはアセテート(CH3COO−)、四級アンモニウム化合物(NR4 +)であって、Rは、アルキル基もしくはアリール基であるもの、好ましくはテトラメチルアンモニウム((CH3)4N+)またはジメチルアンモニウム((CH3)2N2 +)、アンモニウム(NH4 +)、カリウム(K+)、セシウム(Cs+)、ルビジウム(Rb+)またはリチウム(Li+)からなる群より選択される、アニオンおよびカチオンを含み、好ましくはSO4 2−および/またはNH4 +を含む、請求項3に記載の方法。
- 前記塩は、(NH4)2SO4、K2SO4、Na2SO4、(NH4)2HPO4、K2HPO4およびNa2HPO4からなる群より選択され、好ましくは(NH4)2SO4である、請求項3または4に記載の方法。
- 工程d)は、d)の組成物のペンタマーを、該ペンタマーの凝集を誘導する条件から分離することを包含する、請求項2〜5のいずれかに記載の方法。
- 前記分離は、塩および緩衝液、ならびに6〜8.5の、好ましくは6.5〜8.5の、より好ましくは7〜8の、最も好ましくは7.2〜7.5の、特に7.5のpHを含む組成物に対する透析によって達成される、請求項6に記載の方法。
- 前記工程d)の組成物は、
a)0.3未満、好ましくは0.2未満、好ましくは0.1未満の、動的光散乱法(DLS)によって決定された多分散指数(PDI)、より好ましくは0.01〜0.09の間の範囲の、動的光散乱法(DLS)によって決定された多分散指数、および/または
b)VLPのうちの少なくとも70%が20nm〜70nmの、好ましくは30nm〜70nmの、より好ましくは35nm〜65nmの、より好ましくは40〜60nmの平均直径を有する、
によって特徴づけられる、請求項1〜7のいずれかに記載の方法。 - 約−80℃〜約4℃の温度において少なくとも10時間、15時間、20時間、好ましくは少なくとも24時間にわたって、より好ましくは約−80℃の温度において少なくとも24時間にわたって、前記工程d)の組成物からのVLPを貯蔵する工程を包含する、請求項1〜8のいずれかに記載の方法。
- 貯蔵する工程は、凍結防止添加剤、好ましくはポリオール、糖、無機塩、有機塩、アミノ酸、ポリマー、エクストリモライト、またはこれらの誘導体もしくは組み合わせを含む群から選択される凍結防止添加剤を含む組成物の中で起こる、請求項9に記載の方法。
- 前記無機塩は、スルフェートアニオンを含み、好ましくは硫酸アンモニウムであり、そして/または前記アミノ酸は、グリシン、グルタミン、プロリン、アラニンであり、そして/または前記アミノ酸誘導体は、ベタインである、請求項10に記載の方法。
- 前記工程b)のVLP、前記工程c)のペンタマーおよび/または前記工程d)のVLPは精製に供される、請求項1〜11のいずれかに記載の方法。
- 前記VP1は、配列番号1に従うアミノ酸配列と、その全長にわたって少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含み、好ましくは配列番号1のアミノ酸配列を有し、ここで、該VP1はキャプシドへとアセンブルし得る、請求項1〜12のいずれかに記載の方法。
- 前記VP1タンパク質のヌクレオチド配列は、配列番号2のヌクレオチド配列と、その全長にわたって少なくとも90%同一であり、好ましくは配列番号2のヌクレオチド配列であり、ここで、該VP1タンパク質はキャプシドへとアセンブルし得る、請求項1〜13のいずれかに記載の方法。
- 以下のパラメーターのうちの1またはこれより多くによって特徴づけられる、John Cunninghamウイルス(JCV)に由来するウイルス様粒子(VLP)を含む組成物であって、請求項1に記載の方法で得られた組成物:
a)0.3未満、好ましくは0.2未満、好ましくは0.1未満、より好ましくは0.01〜0.09の間の範囲の、動的光散乱法(DLS)によって決定された多分散指数(PDI)、
b)前記VLPのうちの少なくとも70%が、20nm〜70nm、好ましくは30nm〜70nmの、より好ましくは35nm〜65nmの、より好ましくは40〜60nmの平均直径を有する、
c)VLP含有量が、少なくとも80%(v/v)。好ましくは少なくとも85%(v/v)、好ましくは少なくとも90%(v/v)、好ましくは少なくとも95%(v/v)。 - 請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法によって得られた、薬物送達システム。
- 必要性のある被験体における治療および/または診断の方法における使用のための、好ましくは神経学的障害の、特にCNS疾患の処置のための、請求項16に記載の薬物送達システム。
- 請求項1の工程a)〜e)、および前記e)の組成物の前記ペンタマーをVLPへとアセンブルするように該ペンタマーを誘導する条件に曝すというさらなる工程を包含する方法によって得られた、John Cunninghamウイルス(JCV)に由来するウイルス様粒子(VLP)。
- 前記VLPは血液脳関門(BBB)を横断する、請求項16もしくは17に記載の薬物送達システム、または請求項18に記載のVLP。
- 前記VLPは、前記薬物送達システムの投与後に、好ましくはi.v.投与後に、10日間以内にCNSにおいて検出可能である、請求項19に記載の薬物送達システムまたはVLP。
- 前記VLPは、生理学的に無傷のBBBを横断する、請求項19または20に記載の薬物送達システムまたはVLP。
- 前記横断は、前記BBBの完全性の喪失または透過性の増大を要求しない、請求項20に記載の薬物送達システムまたはVLP。
- 前記被験体は、彼のBBBの透過性を増大させるか、またはその混乱を誘導するという処置を受けたことがない、請求項17に記載の薬物送達システム。
- 塩および緩衝液を含み、そしてpH7.0〜8.0、好ましくは7.5の、請求項15に記載の組成物であって、該組成物は、好ましくは:
a)120mM〜170mM NaCl、好ましくは150mM NaCl、
b)1〜5mM CaCl2、好ましくは2mM CaCl2、および
c)5〜30mM Tris−HCl、好ましくは10〜25mM Tris−HCl、より好ましくは10mM Tris−HCl、
を含む、組成物。
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