JP2020105169A - リソソーム蓄積症の処置のためのｖｌｐ - Google Patents

Abstract

【課題】リソソーム蓄積症を処置するための方法において使用される、リソソーム酵素またはリソソーム酵素をコードする発現ベクターと会合したウイルス様粒子（ＶＬＰ）を提供すること。【解決手段】一局面において、本発明はまた、リソソーム蓄積症を処置するための方法における使用のための薬学的組成物、リソソーム酵素をコードする発現ベクター、およびＶＬＰとリソソーム酵素をコードする発現ベクターとを会合させるための方法に関する。【選択図】なし

Description

発明の分野
本発明は、必要性のある被験体、好ましくはヒトにおいてリソソーム蓄積症を処置するための方法において使用される、リソソーム酵素またはリソソーム酵素をコードする発現ベクターと会合したウイルス様粒子（ＶＬＰ）に関する。本発明はまた、リソソーム蓄積症を処置するための方法における使用のための薬学的組成物、リソソーム酵素をコードする発現ベクター、およびＶＬＰを、リソソーム酵素をコードする発現ベクターと会合させるための方法に関する。

発明の背景
リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）は、約５０の遺伝性疾患のグループである。ＬＳＤは、大部分は、基質分解の欠陥を生じる、リソソームヒドロラーゼの機能不全を包含する。結論として、不完全に処理された細胞物質が、種々の組織タイプ内に蓄積し、疾患特異的な臨床発現が起こる。

基質分解の他に、リソソームは、エネルギーホメオスタシス、細胞成長のための構築ブロックの生成、有糸分裂促進シグナル伝達、血管新生のための組織のプライミングおよび転移形成ならびに転写プログラムの活性化に関与する。

リソソーム蓄積症の一例は、異染性白質ジストロフィー（ＭＬＤ）である。ＭＬＤは、スフィンゴ脂質の代謝に影響を及ぼすＡＳＡ遺伝子における変異によって引き起こされるアリールスルファターゼＡ（ＡＳＡ）の活性の減少によって特徴づけられる。ＡＳＡがなければ、スルファチドが身体の多くの組織において蓄積し、最終的には、神経系のミエリン鞘を破壊する。症状は、発達遅延、虚弱、筋硬直、精神機能低下、痴呆および盲を含む。

ＭＬＤには、最初の症状の発症時の被験体（ヒト）の年齢に基づいて３つのサブタイプが存在する（ｖａｎ Ｒａｐｐａｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｂｅｓｔ Ｐｒａｃｔ Ｒｅｓ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ． ２０１５；２９（２）：２６１−７３）：

「幼児型（ｌａｔｅ−ｉｎｆａｎｔｉｌｅ ｆｏｒｍ）」は、代表的にはその子供の３０ヶ月齢より前にその発症がある。それは、スルファチドの急激な蓄積および精神運動発達退行（ｐｓｙｃｈｏｍｏｔｏｒ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）の進行によって特徴づけられる。死亡は、代表的には、症状の発症後数年以内に起こる。機能的な酵素は存在しない。

「若年型（ｊｕｖｅｎｉｌｅ ｖａｒｉａｎｔ）」では、症状は、２．５歳齢〜１６歳齢の間に始まる。始めは、疾患進行が幼児型より遅いが、一旦神経学的徴候がより明白になれば、その衰えは急激であり、患者は最終的には全てのスキルを失う。その疾患の末期段階は、数年間続き得、その継続期間は種々である。大部分の患者は、少量の機能的酵素の発現を可能にする１つのＡＳＡアレルを有する。

「成人型（ａｄｕｌｔ ｖａｒｉａｎｔ）」は、１６歳齢より後に潜行性の発症を有する。疾患進行は、幼児型および若年型におけるより概してゆっくりである。死亡は、疾患発症後の数十年以内に起こる。患者は、スルファチド蓄積のプロセスを遅らせ、それによって、その疾患の発症を遅らせる、少量の機能的高度の発現を可能にする２つの変異を有する。

以下の遺伝子治療アプローチが、ＭＬＤの処置に関して先行技術において考察されている：
−ＡＳＡの安定な発現のためにレンチウイルスベクターを使用して遺伝的に改変した患者の骨髄幹細胞の再投与を包含する、遺伝的に改変した自家造血幹細胞の骨髄移植
−ＡＳＡ遺伝子を過剰発現する微小被包組換え細胞の送達を包含する細胞治療
−インビボ遺伝子治療、すなわち、長期の持続したかつ絶え間ない遺伝的欠損の矯正を提供するために、ＣＮＳへのｈＡＳＡをコードする最適化したアデノウイルス（またはアデノ随伴ウイルス）またはレンチウイルスベクターの直接送達（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｒｅｓ． ２０１６；９４（１１）：１１６９−７９）。

以下の非遺伝子治療的アプローチは、ＭＬＤの処置に関して先行技術において考察されている：
−ＡＳＡ酵素の静脈内、脳室内または髄腔内注射を包含する酵素補充療法
−血液脳関門（ＢＢＢ）を横断しかつミクログリア細胞へと分化して、野生型ＡＳＡを生成するドナー造血幹細胞を含む造血幹細胞治療
−低分子ベースの治療、例えば、Ｎ−ブチルデオキシノジリマイシン（ＮＢ−ＤＮＪ）ミグルスタット（Ｚａｖｅｓｃａ（登録商標）， Ａｃｔｅｌｉｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｌｔｄ， Ａｌｌｓｃｈｗｉｌ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）またはワルファリン（クマジン）の適用
−基質合成抑制療法（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ）。

これらの処置の試みは、むしろ非特異的である、つまり、その薬物は、ＣＮＳを特異的に標的とするのではなく、投与後に患者の身体にわたって等しく分布する。さらに、例えば、ウイルスベクターが投与される場合には、安全性の懸念事項が生じる。
よって、リソソーム蓄積症の処置のための安全でかつ効果的な治療が必要である。従って、本発明の目的は、これらの制約のうちの少なくとも１つを克服する、リソソーム蓄積症、特にＭＬＤを処置するための新規な治療のための手段を提供することである。

ｖａｎ Ｒａｐｐａｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｂｅｓｔ Ｐｒａｃｔ Ｒｅｓ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ． ２０１５；２９（２）：２６１−７３ Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｒｅｓ． ２０１６；９４（１１）：１１６９−７９

発明の要旨
本発明者らは、リソソーム酵素またはリソソーム酵素をコードする発現ベクターと会合した、好ましくはリソソーム酵素を組み込むまたはリソソーム酵素をコードする発現ベクターを組み込むウイルス様粒子（ＶＬＰ）、より具体的にはＪＣウイルスのＶＬＰが、リソソーム蓄積症（例えば、ＭＬＤ）の処置に特に十分適していることを見出した。本発明に従うＶＬＰは、機能的リソソーム酵素またはこのような酵素をコードするプラスミドを、必要性のある患者のＣＮＳへと有効に送達するために使用され得る。これを達成するために、本発明に従って、上記ＶＬＰは、上記酵素の非存在または低減した活性が処置されるべきＬＳＤの原因であるリソソーム酵素またはリソソーム酵素をコードする発現ベクターと会合される。

本発明に従うＶＬＰは、血液脳関門（ＢＢＢ）を、有利には、さらに生理学的に無傷のＢＢＢを効果的に横断し得る。よって、ソソーム酵素またはリソソーム酵素をコードする発現ベクターと会合したＶＬＰは、上記リソソーム酵素または上記リソソーム酵素をコードする発現ベクターをＣＮＳへと効果的に送達し得る。

本発明者らは、本発明に従うＶＬＰの静脈内投与後のマウスの脳においてＡＳＡ ｍＲＮＡを見出した。彼らはまた、その後の脳においてＡＳＡタンパク質を見出した。それによって、本発明に従うＶＬＰを投与すると、ＣＮＳにおけるリソソーム酵素は増強され得ることが結論づけられ得る。その増強されたリソソーム酵素活性は、リソソーム蓄積症の効果的な処置を可能にする；そのリソソーム酵素がＡＳＡである場合、ＭＬＤの処置は可能になる。

驚くべきことに、本発明に従うＶＬＰは、ＣＮＳを特異的に標的化する、すなわち、それらが、患者へと、例えば、静脈内に投与された後に、身体にわたって等しく分布しないことが見出された。それは、本発明に従うＶＬＰのより大きな割合が、ＣＮＳの外側ではなくＣＮＳの中で見出されることを意味する。

本発明に従うＶＬＰは特に、星状細胞、乏突起膠細胞、ニューロンおよび／またはミクログリアを標的とする。本発明のＶＬＰの具体的に好ましい標的は、乏突起膠細胞である。

本発明に従うＶＬＰはまた、安定でかつ均質であり、このことは、薬物製品のより良好な品質管理および標準化を可能にすることから、臨床使用にとって特に重要である。

従って、リソソーム酵素またはリソソーム酵素をコードする発現ベクターと会合したＶＬＰ、特に、ＪＣウイルスのＶＬＰが、ＬＳＤの、特にＭＬＤの有効かつ安全な処置を提供するために使用され得ることは、本発明者らによって示された。

改善された有効性を有するＪＣＶに由来するＶＬＰは、上記ＶＬＰを生成するための方法が、２回の、ＶＬＰをペンタマーへと脱アセンブルする工程および上記ペンタマーをＶＬＰへと再アセンブルする工程を含む場合に提供され得ることがまた見出された。

ＶＬＰへと、リソソーム酵素、好ましくはヒトアリールスルファターゼＡを組み込む、またはリソソーム酵素、好ましくはヒトアリールスルファターゼＡをコードする発現ベクターを組み込むための方法は、好ましくは以下の工程を包含する：
ａ） ＶＰ１タンパク質を含む組成物を提供する工程、
ｂ） 上記ａ）の組成物のＶＰ１タンパク質を、上記ＶＰ１を誘導する条件に曝して、ＶＬＰへとアセンブルする工程、
ｃ） 上記ｂ）の組成物のＶＬＰを、上記ＶＬＰをペンタマーへと脱アセンブルする条件に曝す工程、
ｄ） 上記ｃ）の組成物のペンタマーを、上記ペンタマーを誘導する条件に曝して、ＶＬＰへと再アセンブルする工程、
ｅ） 上記ｄ）の組成物のＶＬＰを、上記ＶＬＰをペンタマーへと脱アセンブルする条件に曝す工程、
ｆ） 上記ｅ）の組成物のペンタマーを、上記リソソーム酵素または上記発現ベクターへと、上記ペンタマーを誘導する条件に曝して、上記リソソーム酵素または上記発現ベクターと会合したＶＬＰへとアセンブルする工程。

改善された有効性は特に、より多くのカーゴ、すなわち、特に、リソソーム酵素、好ましくはヒトアリールスルファターゼＡ、またはリソソーム酵素、好ましくはヒトアリールスルファターゼＡをコードする発現ベクターがＣＮＳに達することを意味する。その改善された有効性は、相互作用し得る、多方面にわたる理由があり得る。より高い有効性は、例えば、より多量のＶＬＰおよび／またはカーゴがＣＮＳに入るように、上記ＶＬＰによるＢＢＢのより有効な横断に起因し得る。それは等しく、ＣＮＳに達した後に、そのＶＬＰからのカーゴの改善された放出に起因し得る。さらに、より高い有効性の理由は、各個々のＶＬＰに、より多量のカーゴが装填され得るか、または装填されたＶＬＰの量全体が増大され得るという事実であり得る。

本発明に従う方法によって得られ得るＶＬＰまたは本発明に従う方法によって得られ得る薬物送達システムの改善された有効性は、上記ＶＬＰのカーゴがルシフェラーゼ発現プラスミドＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）である場合に、ルシフェラーゼの増大した発現によって例証として示される（以下の実施例１１、図１１）。

実施例１１はさらに、上記工程ｆ）で得られるＶＬＰが、ＢＢＢを効率的に横断するという証拠を与える（以下の実施例１１、図１２および図１３）。それとともに、上記ＶＬＰが薬物をＣＮＳへと輸送するための薬物送達システムとして使用され得るという証拠が提供される。

さらに、上記工程ｄ）で得られるＶＬＰは、貯蔵に特に適していることが見出された。それらは、−８０℃の貯蔵条件に、２４時間を超える期間にわたって耐える（ｗｉｔｈｈｏｌｄ）。貯蔵後、上記ＶＬＰは、例えば上記薬物送達システムを提供するために、さらに処理され得る。よって、それらは、カーゴと会合したＶＬＰを含む薬物送達システムの製造の間に適切な貯蔵可能な中間生成物を表す。

１つの特定の局面において、従って、本発明は、貯蔵の適切性が増大したＶＬＰを提供するための方法に関する。このようなＶＬＰは、現実的な理由から、上記薬物送達システムの生成を実質的に促進する。それは、ＶＬＰの大規模製造、および次いで、カーゴなしのそれらの中間貯蔵を可能にする。貯蔵後に、個々の顧客の需要に際して、その貯蔵されたＶＬＰは、さらに処理され得、所望のカーゴに装填される。従って、上記工程ｄ）で提供されるＶＬＰの中間貯蔵は、ＶＬＰに基づいて、薬物送達システムの製造プロセスにおいてさらなる融通性を可能にする。

さらに、本発明に従うＶＬＰが安定していることが見出された。それらの安定性は、ＶＰ１生成および直接的なその後のアセンブリ（すなわち、脱アセンブル／再アセンブル工程なし）からの結果であるＶＬＰと等しく匹敵し得る（図１６）。このことから、本発明に従う２回の脱アセンブル工程および再アセンブル工程は、驚くべきことに、上記ＶＬＰの安定性に対する負の影響を有しないということになる。

なお別の局面において、本発明は、薬物送達システムまたはＶＬＰを含む組成物に関する。

驚くべきことに、上記ＶＬＰを含む組成物の均質性が、上記工程ｄ）のペンタマーを２工程で再アセンブルすることによって改善され得ることがさらに見出されたのに対して、上記第１の工程は、上記工程ｃ）のペンタマーの凝集を誘導する工程を包含し、上記第２の工程は、上記ペンタマーを、上記ペンタマーの凝集を誘導する条件から分離する工程を包含する（以下の実施例１３、図１７および図１８）。

ＶＬＰを含む組成物の均質のサイズ分布は、規定された品質基準を満たすために重要である上記薬物送達システムとしての使用のためのＶＬＰの規定された集団を生成することを可能にするので、有利である。

本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
被験体において異染性白質ジストロフィー（ＭＬＤ）を処置するための方法における使用のための、リソソーム酵素を組み込むかまたはリソソーム酵素をコードする発現ベクターを組み込むＶＬＰであって、ここで該ＶＬＰは、ＪＣＶに由来する、ＶＬＰ。
（項目２）
前記ＶＬＰは、ウイルス遺伝物質を含まず、前記発現ベクターは、ウイルスタンパク質をコードしない、項目１に記載の使用のためのＶＬＰ。
（項目３）
前記被験体は、動物またはヒトであり、好ましくはヒトである、項目１または２に記載の使用のためのＶＬＰ。
（項目４）
前記被験体は、神経学的欠損を有する、上記項目のいずれか１項に記載の使用のためのＶＬＰ。
（項目５）
前記リソソーム酵素は、ヒト酵素である、上記項目のいずれか１項に記載の使用のためのＶＬＰ。
（項目６）
前記リソソーム酵素は、アリールスルファターゼＡである、上記項目のいずれか１項に記載の使用のためのＶＬＰ。
（項目７）
前記リソソーム酵素は、配列番号１に従うアミノ酸配列とその全長にわたって少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％同一である、最も好ましくは配列番号１のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む、上記項目のいずれか１項に記載の使用のためのＶＬＰ。
（項目８）
前記発現ベクターは、７ｋｂ未満、好ましくは６ｋｂ未満のサイズを有する、上記項目のいずれか１項に記載の使用のためのＶＬＰ。
（項目９）
前記発現ベクターは、ＣＭＶおよびＣＡＧを含む群から選択されるプロモーターを有する、上記項目のいずれか１項に記載の使用のためのＶＬＰ。
（項目１０）
前記リソソーム酵素は、配列番号２のヌクレオチド配列とその全長にわたって少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％同一である、好ましくは配列番号２のヌクレオチド配列であるヌクレオチド配列を含む、上記項目のいずれか１項に記載の使用のためのＶＬＰ。
（項目１１）
前記ＶＬＰは、血液脳関門を、好ましくは生理学的に無傷の血液脳関門を横断して、前記リソソーム酵素または前記発現ベクターと一緒にＣＮＳに入る、上記項目のいずれか１項に記載の使用のためのＶＬＰ。
（項目１２）
前記リソソーム酵素または前記発現ベクターは、星状細胞、乏突起膠細胞、ミクログリアまたはニューロン、好ましくは乏突起膠細胞に入る、上記項目のいずれか１項に記載のＶＬＰ。
（項目１３）
前記ＶＬＰは、経口的にまたは非経口的に、好ましくは静脈内に投与される、上記項目のいずれか１項に記載の使用のためのＶＬＰ。
（項目１４）
標的細胞は、有効量のリソソーム酵素と接触される、上記項目のいずれか１項に記載の使用のためのＶＬＰ。
（項目１５）
前記リソソーム酵素は、少なくとも１０日間、好ましくは少なくとも２０日間、より好ましくは少なくとも３０日間にわたって、治療上有効な酵素活性を有する、上記項目のいずれか１項に記載の使用のためのＶＬＰ。
（項目１６）
前記ＶＬＰは、ＪＣウイルスのＶＰ１タンパク質から構成される、上記項目のいずれか１項に記載の使用のためのＶＬＰ。
（項目１７）
前記ＶＰ１タンパク質は、配列番号３に従うアミノ酸配列とその全長にわたって少なくとも８０％同一である、好ましくは少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、上記項目のいずれか1項に記載の使用のためのＶＬＰ。
（項目１８）
被験体においてリソソーム蓄積症を処置するための方法における使用のための薬学的組成物であって、ここで該薬学的組成物は、上記項目のいずれかに記載のＶＬＰ、ならびに薬学的に受容可能なキャリア、および／または賦形剤を含む、薬学的組成物。
（項目１９）
リソソーム酵素、好ましくはヒトアリールスルファターゼＡをコードするコード領域、ＣＡＧおよびＣＭＶを含む群から選択され、好ましくはＣＡＧであるプロモーターを有し、７ｋｂ未満、好ましくは６ｋｂ未満のサイズを有する、発現ベクター。
（項目２０）
前記リソソーム酵素は、配列番号２のヌクレオチド配列とその全長にわたって少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％同一である、好ましくは配列番号２のヌクレオチド配列であるヌクレオチド配列を含む、上記項目のいずれか1項に記載の発現ベクター。
（項目２１）
ＶＬＰへと、リソソーム酵素、好ましくはヒトアリールスルファターゼＡを組み込むか、またはリソソーム酵素、好ましくはヒトアリールスルファターゼＡをコードする発現ベクターを組み込むための方法であって、ここで該方法は、以下の工程：
ａ） ＶＰ１タンパク質を含む組成物を提供する工程、
ｂ） 該ａ）の組成物のＶＰ１タンパク質を、該ＶＰ１を誘導する条件に曝して、ＶＬＰへとアセンブルする工程、
ｃ） 該ｂ）の組成物のＶＬＰを、該ＶＬＰをペンタマーへと脱アセンブルする条件に曝す工程、
ｄ） 該ｃ）の組成物のペンタマーを、該ペンタマーを誘導する条件に曝して、ＶＬＰへと再アセンブルする工程、
ｅ） 該ｄ）の組成物のＶＬＰを、該ＶＬＰをペンタマーへと脱アセンブルする条件に曝す工程、
ｆ） 該ｅ）の組成物のペンタマーを、該リソソーム酵素または該発現ベクターに、該ペンタマーを誘導する条件に曝して、該リソソーム酵素または該発現ベクターと会合したＶＬＰへとアセンブルする工程、
を包含する方法。
（項目２２）
上記項目のいずれか1項に記載の方法によって得られ得るＶＬＰ。
（項目２３）
上記項目のいずれか1項に記載の方法によって得られ得る薬物送達システム。
（項目２４）
薬物送達システムとしての上記項目のいずれか1項に記載の使用のためのＶＬＰ。
（項目２５）
前記ＭＬＤを処置するための方法は、前記処置されるべき被験体のＢＢＢの透過性を増大させる工程を包含しない、上記項目のいずれか1項に記載の使用のためのＶＬＰ。
（項目２６）
リソソーム酵素を組み込むかまたはリソソーム酵素をコードする発現ベクターを組み込むＶＬＰにより、ＭＬＤを処置するための方法であって、ここで該ＶＬＰは、ＪＣＶに由来する、方法。
（項目２７）
リソソーム酵素またはリソソーム酵素をコードする発現ベクターを標的に送達することにおいて使用するための、該リソソーム酵素または該リソソーム酵素をコードする発現ベクターを組み込むＶＬＰであって、ここで該標的はＣＮＳである、ＶＬＰ。
（項目２８）
前記リソソーム酵素または前記リソソーム酵素をコードする発現ベクターは、ＣＮＳにおける標的細胞、特に、星状細胞、乏突起膠細胞、ニューロンおよび／またはミクログリアに送達される、上記項目のいずれか1項に記載の使用のためのＶＬＰ。
（項目２９）
前記リソソーム酵素は、前記標的細胞において一過性に発現される、上記項目のいずれか1項に記載の使用のためのＶＬＰ。
（項目３０）
リソソーム酵素活性を高めることにおいて使用するための、リソソーム酵素またはリソソーム酵素をコードする発現ベクターを組み込むＶＬＰ。
（項目３１）
ＭＬＤの処置のための医薬の製造のための、上記項目のいずれか1項に記載のＶＬＰの使用。
（項目３２）
ＭＬＤの処置のための医薬の製造のための、上記項目のいずれか1項に記載の薬物送達システムの使用。

（項目１Ａ）
被験体において異染性白質ジストロフィー（ＭＬＤ）を処置するための方法における使用のための、リソソーム酵素を組み込むかまたはリソソーム酵素をコードする発現ベクターを組み込むＶＬＰを含む組成物であって、ここで該ＶＬＰは、ＪＣＶに由来する、組成物。
（項目２Ａ）
前記ＶＬＰは、ウイルス遺伝物質を含まず、前記発現ベクターは、ウイルスタンパク質をコードしない、項目１Ａに記載の組成物。
（項目３Ａ）
前記被験体は、動物またはヒトであり、好ましくはヒトである、項目１Ａまたは２Ａに記載の組成物。
（項目４Ａ）
前記被験体は、神経学的欠損を有する、上記項目のいずれか１項に記載の組成物。
（項目５Ａ）
前記リソソーム酵素は、ヒト酵素である、上記項目のいずれか１項に記載の組成物。
（項目６Ａ）
前記リソソーム酵素は、アリールスルファターゼＡである、上記項目のいずれか１項に記載の組成物。
（項目７Ａ）
前記リソソーム酵素は、配列番号１に従うアミノ酸配列とその全長にわたって少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％同一である、最も好ましくは配列番号１のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む、上記項目のいずれか１項に記載の組成物。
（項目８Ａ）
前記発現ベクターは、７ｋｂ未満、好ましくは６ｋｂ未満のサイズを有する、上記項目のいずれか１項に記載の組成物。
（項目９Ａ）
前記発現ベクターは、ＣＭＶおよびＣＡＧを含む群から選択されるプロモーターを有する、上記項目のいずれか１項に記載の組成物。
（項目１０Ａ）
前記リソソーム酵素は、配列番号２のヌクレオチド配列とその全長にわたって少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％同一である、好ましくは配列番号２のヌクレオチド配列であるヌクレオチド配列を含む、上記項目いずれか１項に記載の組成物。
（項目１１Ａ）
前記ＶＬＰは、血液脳関門を、好ましくは生理学的に無傷の血液脳関門を横断して、前記リソソーム酵素または前記発現ベクターと一緒にＣＮＳに入る、上記項目のいずれか１項に記載の組成物。
（項目１２Ａ）
前記リソソーム酵素または前記発現ベクターは、星状細胞、乏突起膠細胞、ミクログリアまたはニューロン、好ましくは乏突起膠細胞に入る、上記項目に記載の組成物。
（項目１３Ａ）
前記組成物は、経口的にまたは非経口的に、好ましくは静脈内に投与される、上記項目のいずれか１項に記載の組成物。
（項目１４Ａ）
標的細胞は、有効量のリソソーム酵素と接触される、上記項目のいずれか１項に記載の組成物。
（項目１５Ａ）
前記リソソーム酵素は、少なくとも１０日間、好ましくは少なくとも２０日間、より好ましくは少なくとも３０日間にわたって、治療上有効な酵素活性を有する、上記項目のいずれか１項に記載の組成物。
（項目１６Ａ）
前記ＶＬＰは、ＪＣウイルスのＶＰ１タンパク質から構成される、上記項目のいずれか１項に記載の組成物。
（項目１７Ａ）
前記ＶＰ１タンパク質は、配列番号３に従うアミノ酸配列とその全長にわたって少なくとも８０％同一である、好ましくは少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、上記項目のいずれか１項に記載の組成物。
（項目１８Ａ）
被験体においてリソソーム蓄積症を処置するための方法における使用のための薬学的組成物であって、ここで該薬学的組成物は、上記項目のいずれかに記載の組成物、ならびに薬学的に受容可能なキャリア、および／または賦形剤を含む、薬学的組成物。
（項目１９Ａ）
リソソーム酵素、好ましくはヒトアリールスルファターゼＡをコードするコード領域、ＣＡＧおよびＣＭＶを含む群から選択され、好ましくはＣＡＧであるプロモーターを有し、７ｋｂ未満、好ましくは６ｋｂ未満のサイズを有する、発現ベクター。
（項目２０Ａ）
前記リソソーム酵素は、配列番号２のヌクレオチド配列とその全長にわたって少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％同一である、好ましくは配列番号２のヌクレオチド配列であるヌクレオチド配列を含む、上記項目に記載の発現ベクター。
（項目２１Ａ）
ＶＬＰへと、リソソーム酵素、好ましくはヒトアリールスルファターゼＡを組み込むか、またはリソソーム酵素、好ましくはヒトアリールスルファターゼＡをコードする発現ベクターを組み込むための方法であって、ここで該方法は、以下の工程：
ａ） ＶＰ１タンパク質を含む組成物を提供する工程、
ｂ） 該ａ）の組成物のＶＰ１タンパク質を、該ＶＰ１を誘導する条件に曝して、ＶＬＰへとアセンブルする工程、
ｃ） 該ｂ）の組成物のＶＬＰを、該ＶＬＰをペンタマーへと脱アセンブルする条件に曝す工程、
ｄ） 該ｃ）の組成物のペンタマーを、該ペンタマーを誘導する条件に曝して、ＶＬＰへと再アセンブルする工程、
ｅ） 該ｄ）の組成物のＶＬＰを、該ＶＬＰをペンタマーへと脱アセンブルする条件に曝す工程、
ｆ） 該ｅ）の組成物のペンタマーを、該リソソーム酵素または該発現ベクターに、該ペンタマーを誘導する条件に曝して、該リソソーム酵素または該発現ベクターと会合したＶＬＰへとアセンブルする工程、
を包含する方法。
（項目２２Ａ）
上記項目のいずれか１項に記載の方法によって得られ得るＶＬＰ。
（項目２３Ａ）
上記項目のいずれか１項に記載の方法によって得られ得る薬物送達システム。
（項目２４Ａ）
薬物送達システムとしての上記項目のいずれか１項に記載の組成物。
（項目２５Ａ）
前記ＭＬＤを処置するための方法は、前記処置されるべき被験体のＢＢＢの透過性を増大させる工程を包含しない、上記項目のいずれか１項に記載の組成物。
（項目２６Ａ）
リソソーム酵素またはリソソーム酵素をコードする発現ベクターを標的に送達することにおいて使用するための、該リソソーム酵素または該リソソーム酵素をコードする発現ベクターを組み込むＶＬＰを含む組成物であって、ここで該標的はＣＮＳである、組成物。
（項目２７Ａ）
前記リソソーム酵素または前記リソソーム酵素をコードする発現ベクターは、ＣＮＳにおける標的細胞、特に、星状細胞、乏突起膠細胞、ニューロンおよび／またはミクログリアに送達される、上記項目のいずれか１項に記載の組成物。
（項目２８Ａ）
前記リソソーム酵素は、前記標的細胞において一過性に発現される、上記項目のいずれか１項に記載の組成物。
（項目２９Ａ）
リソソーム酵素活性を高めることにおいて使用するための、リソソーム酵素またはリソソーム酵素をコードする発現ベクターを組み込むＶＬＰを含む組成物。
（項目３０Ａ）
ＭＬＤの処置のための医薬の製造のための、上記項目のいずれか１項に記載の組成物の使用。
（項目３１Ａ）
ＭＬＤの処置のための医薬の製造のための、上記項目のいずれか１項に記載の薬物送達システムの使用。
（項目３２Ａ）
ＭＬＤの処置のための、上記項目のいずれか１項に記載の薬物送達システムを含む組成物。

開示の要約
本発明は、リソソーム蓄積症を処置するための方法において使用される、リソソーム酵素またはリソソーム酵素をコードする発現ベクターと会合したウイルス様粒子（ＶＬＰ）に関する。本発明はまた、リソソーム蓄積症を処置するための方法における使用のための薬学的組成物、リソソーム酵素をコードする発現ベクター、およびＶＬＰを、リソソーム酵素をコードする発現ベクターと会合させるための方法に関する。

図１ ＶＰ１タンパク質と乏突起膠細胞マーカーＯｌｉｇ２との共局在。 左上のパネルは、色素ＤＡＰＩでの細胞核の染色を示す。右上のパネルは、ＶＰ１タンパク質（ＦＩＴＣ−蛍光）の位置を示す。左下のパネルは、抗Ｏｌｉｇ２抗体（ＴＲＩＴＣ−蛍光）での染色を示す。右下のパネルは、Ｏｌｉｇ２マーカーおよびＶＰ１タンパク質の染色の複合写真を表す。ＶＰ１およびＯｌｉｇ２に関して陽性の細胞を矢印で示す。

図２ ＶＰ１タンパク質とニューロンマーカーＮｅｕＮとの共局在。 左上のパネルは、色素ＤＡＰＩでの細胞核の染色を示す。右上のパネルは、ＶＰ１タンパク質（ＦＩＴＣ−蛍光）の位置を示す。左下のパネルは、抗ＮｅｕＮ抗体（ＴＲＩＴＣ−蛍光）での染色を示す。右下のパネルは、ＮｅｕＮマーカーおよびＶＰ１タンパク質に関する染色の複合写真を表す。ＶＰ１およびＮｅｕＮに関して陽性の細胞を矢印で示す。

図３ ＶＰ１タンパク質とミクログリアマーカーＩｂａ１との共局在。 左上のパネルは、色素ＤＡＰＩでの細胞核の染色を示す。右上のパネルは、ＶＰ１タンパク質（ＦＩＴＣ−蛍光）の位置を示す。左下のパネルは、抗Ｉｂａ１抗体（ＴＲＩＴＣ−蛍光）での染色を示す。右下のパネルは、Ｉｂａ１マーカーおよびＶＰ１タンパク質に関する染色の複合写真を表す。ＶＰ１およびＩｂａ１に関して陽性の細胞を矢印で示す。

図４ インビトロＢＢＢモデルにおいてｐＮＬプラスミドと会合したＶＬＰの透過。 Ａ： インビトロＢＢＢモデルにおけるＢＢＢ細胞のＤＡＰＩ染色（左）およびＷＧＡ染色（右）。Ｂ： 蛍光色素（ＦＩＴＣ、ＴＲＩＴＣ）、プラスミドに連結した蛍光色素（ＦＩＴＣ−ｐＮＬ）およびｐＮＬプラスミドと会合したＶＬＰの透過。細胞なしの透過に対する透過（％単位）。左の４つの棒は、ＥＤＴＡなし、右の４つの棒は、ＥＤＴＡあり。

図５ ＡＳＡをコードする発現ベクターと会合したＶＬＰを注射した健康なマウスの肝臓および脳におけるＡＳＡ ｍＲＮＡ分析。 ＡＳＡをコードする発現ベクターと会合したＶＬＰの注射の７２時間後および１２０時間後の、健康なマウスの肝臓および脳におけるＡＳＡ ｍＲＮＡレベルの分析。ビヒクル（緩衝液）と比較した倍数増大。括弧の中の数字は、マウスのそれぞれの数字を示す。

図６ それぞれのマウス分析（健康なマウス） - 脳におけるＡＳＡ ｍＲＮＡ検出 ＡＳＡをコードする発現ベクターと会合したＶＬＰの注射の７２時間後（上）および１２０時間後（下）のＡＳＡ ｍＲＮＡのそれぞれのマウス分析。数字は、それぞれのマウスを示す。相対的な倍数調節は、ビヒクルコントロール群との比較における遺伝子アップレギュレーション（発現）を意味する。

図７ それぞれのマウス分析（健康なマウス） − ウェスタンブロット分析（脳におけるｈＡＳＡ検出）および相当するｑＰＣＲ ＡＳＡをコードする発現ベクターと会合したＶＬＰの注射後の脳におけるＡＳＡタンパク質のそれぞれのマウス分析（ウェスタンブロット、上）および相当するｑＰＣＲ分析（下）。ビヒクル（緩衝液）、プラスミドおよびプラスミド＋ＶＬＰを比較する。数字は、それぞれのマウスを示す。総体的な倍数調節は、ビヒクルコントロール群との比較における遺伝子アップレギュレーション（発現）を意味する。

図８ ｑＰＣＲによる膠芽腫細胞のヒトＡＳＡの発現 膠芽腫細胞をｈＡＳＡ発現ベクターと会合したＶＬＰとともにインキュベートした後のヒトＡＳＡ発現のｑＰＣＲ分析Ａ： １：０．２のＶＬＰ：プラスミドのパッケージング比において４種の異なるｈＡＳＡ発現ベクターと会合したＶＬＰＢ： ２つの異なるパッケージング比（高濃度［ＶＬＰ：プラスミド １：０．５］および低濃度［ＶＬＰ：プラスミド １：０．２］においてＡの構築物４と会合したＶＬＰ。

図９ ４種の異なるｈＡＳＡ発現ベクターと会合したＶＬＰのｎＤＳＦおよびＡＦ４分析 Ａ： ４サンプル（発現ベクター構築物１〜４と会合したＶＬＰ）のｎＤＳＦ分析。Ｂ： その同じ４サンプルのＡＦ４分析

図１０ ４種の異なるｈＡＳＡ発現ベクターと会合したＶＬＰのＴＥＭ画像 ＶＬＰ自体（「ＶＬＰオリジナル」：カーゴと会合していない）（左）および４種の異なる発現ベクターと会合したＶＬＰ（構築物１〜４、右）の比較。

図１１ 異なって調製されたＶＬＰを比較するルシフェラーゼ活性 ２ラウンドの脱アセンブルおよび再アセンブルで調製したＶＬＰ、または１回だけ脱アセンブルおよび再アセンブルしたＶＬＰのいずれかでトランスフェクトした膠芽腫細胞において測定したルシフェラーゼ活性。

図１２ 単一培養物としてのＢＢＢモデル 単一培養物としてのＢＢＢモデルの構成（Ａ）ならびに２ラウンドの脱アセンブルおよび再アセンブルで調製したＶＬＰの透過性（Ｂ）

図１３ 共培養物としてのＢＢBモデル 共培養物としてのＢＢＢモデルの構成（Ａ）ならびに２ラウンドの脱アセンブルおよび再アセンブルで調製したＶＬＰの透過性（Ｂ）

図１４ ＶＬＰのＴＥＭ画像 ２ラウンドの脱アセンブル／再アセンブルで調製したＶＬＰ 対 １ラウンドの脱アセンブルおよび再アセンブルと中間貯蔵とで調製したＶＬＰのＴＥＭ画像

図１５ ＶＬＰのＦＦＦ−ＭＡＬＳ分析 ２ラウンドの脱アセンブルおよび再アセンブルとＶＬＰの中間貯蔵とで調製したＶＬＰ（Ａ）、１ラウンドの脱アセンブルおよび再アセンブルとペンタマーの中間貯蔵とで調製したＶＬＰ（Ｂ）、ならびに新鮮に調製したＶＬＰ（Ｃ）のＦＦＦ−ＭＡＬＳ分析。

図１６ ＶＬＰのｎＤＳＦ分析 新鮮に調製したＶＬＰ、ならびに２ラウンドの脱アセンブルおよび再アセンブルと中間貯蔵とで調製したＶＬＰのｎＤＳＦ分析

図１７ ＶＬＰのＰＤＩを示すＤＬＳ分析 貯蔵前にペンタマーの凝集を誘導することありまたはなしでの２ラウンドの脱アセンブルおよび再アセンブルを含む方法の工程ｄ）に従うＶＬＰのＰＤＩを示すＤＬＳ分析

図１８ ＶＬＰの平均直径を示すＤＬＳ分析 貯蔵前および貯蔵後にペンタマーの凝集を誘導することありまたはなしでの２ラウンドの脱アセンブルおよび再アセンブルを含む方法の工程ｄ）に従うＶＬＰの平均直径を示すＤＬＳ分析

図１９ 種々の凍結防止添加剤（ｃｒｙｏａｄｄｉｔｉｖｅ）とともに貯蔵したＶＬＰのｎＤＳＦ分析およびルシフェラーゼ活性 ｎＤＳＦ分析（Ａ）およびルシフェラーゼ活性（Ｂ）

実施形態の説明
発明の詳細な説明
本発明の第１の局面において、本発明は、被験体、特に、ヒトにおいてリソソーム蓄積症を処置するための方法における使用のための、リソソーム酵素またはリソソーム酵素をコードする発現ベクターと会合したＶＬＰに関する。よって、本発明はまた、ＬＳＤに罹患しているヒトを、リソソーム酵素またはリソソーム酵素をコードする発現ベクターと会合したＶＬＰで処置するための方法に関する。そのリソソーム酵素は、好ましくはＡＳＡである。そのＬＳＤは、好ましくはＭＬＤである。

ＶＬＰ自体、すなわち、カーゴと会合しないＶＬＰは、いかなる遺伝物質をも含まない。なぜならそれらは、タンパク質から構成されるに過ぎず、他の状態では「空（ｅｍｐｔｙ）」だからである。本発明に従うＶＬＰは、リソソーム酵素またはリソソーム酵素をコードする発現ベクターと会合される。好ましい実施形態において、本発明に従うＶＬＰは、ウイルスタンパク質をコードするウイルス遺伝物質を含まない。この実施形態において、そのＶＬＰは、ウイルス遺伝物質としてウイルス調節エレメントを含み得る。

ウイルス遺伝物質は、ウイルスタンパク質をコードするウイルス遺伝物質およびウイルス遺伝物質としてのウイルス調節エレメントを含む。ウイルス遺伝物質は、ウイルスの核酸に由来する、すなわち、ウイルスのＲＮＡまたはＤＮＡと少なくとも７０％同一である。好ましくは、本発明に従うＶＬＰは、いかなるウイルス遺伝物質をも含まない。

従って、好ましくは、本発明に従うＶＬＰがＲＮＡまたはＤＮＡを含む場合、そのＲＮＡまたはＤＮＡは、ウイルスに由来しない、すなわち、そのＲＮＡまたはＤＮＡは、ウイルス遺伝物質ではなく、特に、そのＲＮＡまたはＤＮＡは、ウイルスタンパク質をコードしない。そのＲＮＡまたはＤＮＡがウイルスタンパク質をコードせず、かつウイルス調節エレメントを含まないことは、特に好ましい。

好ましい実施形態において、本発明に従うＶＬＰは、リソソーム酵素をコードするのみの発現ベクターとのみ会合される、すなわち、その発現ベクターは、いかなる他のタンパク質をもコードしない。好ましい実施形態において、その発現ベクターは、ウイルスタンパク質をコードしない。その発現ベクターがウイルスタンパク質をコードせず、かつウイルス調節エレメントを含まないことは、特に好ましい。

好ましくは、その被験体は、動物またはヒトであり、好ましくはヒトである。

本発明に従うＶＬＰは、有利なことには、好ましくはヒトにおいて、リソソーム酵素またはリソソーム酵素をコードする発現ベクターを目的の部位（「標的（ｔａｒｇｅｔ）」）へと送達することを可能にする。好ましくは、その送達は、標的に対して選択的であり、すなわち、そのリソソーム酵素またはリソソーム酵素をコードする発現ベクターの割合が高いほど、身体または器官の他の部位よりその標的へと送達される。

その標的は、好ましくはＣＮＳである。ＣＮＳは、脊髄および脳、特に、脳をいう。用語「脳（ｂｒａｉｎ）」とは、その解剖学的部分（例えば、前頭葉、頭頂葉、側頭葉、後頭葉、および小脳）を含む。

そのリソソーム酵素またはリソソーム酵素をコードする発現ベクターが、標的細胞、好ましくはＣＮＳにおける標的細胞、特に、星状細胞、乏突起膠細胞、ニューロンおよび／またはミクログリアへと、および／またはその中へと送達される場合には、特に有利である。特に好ましい実施形態において、その標的細胞は乏突起膠細胞である。よって、そのリソソーム酵素または発現ベクターは好ましくは、星状細胞、乏突起膠細胞、ミクログリアまたはニューロンに、特に、乏突起膠細胞に入る。

その標的細胞が有効量のリソソーム酵素と接触される場合は特に有利である。リソソーム酵素の有効量は、その量が、その酵素（その酵素の非存在がＬＳＤを引き起こす）の活性を増強するために十分であることを意味する。

その被験体における酵素活性は通常は、インビトロプローブで、代表的には、固体組織、白血球、繊維芽細胞、培養した羊水細胞、血清、羊水、尿または涙液（これらに対して基質が添加される）に由来するプローブで測定される。例えば、アリールスルファターゼＡに関しては、代表的な基質としては、ｐ−ニトロカテコールスルフェート、スルファチド、特に、［^３Ｈ]標識スルファチド、ラクトシルセラミドスルフェート、ガラクトシル−スフィンゴシンスルフェート、アスコルビン酸２−スルフェートまたはセミノリピドが挙げられる（Ｒａｇｈａｖａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ． １９８１；３６（２）：７２４−３１）。特に、ｐ−ニトロカテコールスルフェートは、被験体の尿中でアリールスルファターゼＡおよびＢの活性を測定するために基質として使用され得る（Ｂａｕｍ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ Ｃｈｉｍ Ａｃｔａ． １９５９；４（３）：４５３−５）。

特に好ましい実施形態において、本発明に従うＶＬＰは、血液脳関門を、好ましくは生理学的に無傷の血液脳関門を横断して、そのリソソーム酵素または発現ベクターと一緒にＣＮＳに入る。言い換えると、本発明に従うＶＬＰは好ましくは、ＢＢＢの透過性の事前の増大なしにＢＢＢを横断する。本発明に従うＶＬＰは、生理学的に無傷のＢＢＢを横断し得る。

ＢＢＢの横断は、その標的がＣＮＳである場合、特に、その標的細胞が星状細胞、乏突起膠細胞、ニューロンおよび／またはミクログリアである場合、特に有利である。よって、本発明に従うＶＬＰは、リソソーム蓄積症を処置するための方法において使用され得、ここでその方法は、処置されるべき被験体のＢＢＢの透過性を増大させる事前の工程を含まない。本発明に従うＶＬＰは、好ましくは、ＢＢＢを損なうかまたは混乱させるためのいかなる化学的処置も物理的処置も施す前には受容しなかった患者に投与される。

さらなる実施形態において、このようにして、そのリソソーム酵素もしくはリソソーム酵素をコードする発現ベクターと会合したＶＬＰ、または本発明に従うＶＬＰを含む薬学的組成物は、ＢＢＢの透過性に影響を及ぼし得るいかなる添加剤をも含まない。

インビトロでのＢＢＢの完全性は、公知の方法によって、例えば、相対的内皮電気抵抗測定（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ）（ＴＥＥＲ）によって測定され得る（Ｒｅｍｐｅ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍ ２０１１， ４０６ （１）： ６４−６９）。ＢＢＢの多くのインビトロモデルが確立されている（種々の共培養における初代ウシまたはヒト脳内皮細胞（例えば、ヒト脳内皮細胞株ＨＢＥＣ−５ｉ）が挙げられる）。インビボでは、画像化法（例えば、ＣＴスキャンまたはＭＲＩ）は、ＢＢＢ透過性を可視化するために、造影剤と一緒に使用され得る。機能的画像化（例えば、ＰＥＴまたはＳＰＥＣＴ）も使用され得る。

本発明に従うＶＬＰは、種々の経路（経口投与、皮膚投与、鼻投与または肺経路または非経口注射（ｉ．ｖ．、ｓ．ｃ．、ｉ．ｍ．）が挙げられる）を介して投与され得る。そのリソソーム酵素またはリソソーム酵素をコードする発現ベクターの全身効果を可能にする投与形態が特に好ましい。具体的実施形態において、本発明に従うＶＬＰは、経口的にまたは非経口的に、特に、静脈内に投与される。

本発明に従うＶＬＰの適用が、例えば、炎症性サイトカインおよび／または免疫細胞上の表面分子のアップレギュレーションによって測定される望ましくない免疫反応をもたらす場合、その免疫系の活性化または有効性を低減するために免疫抑制薬をさらに適用することが必要であり得る。

好ましい実施形態において、本発明に従うＶＬＰは、処置されるべき被験体、特にヒトに投与された後、投与後、１０日間未満、好ましくは５日間未満、より好ましくは３日間未満でＣＮＳにおいて検出され得る。

別の好ましい実施形態において、そのリソソーム酵素は、少なくとも１０日間、好ましくは少なくとも２０日間、より好ましくは少なくとも３０日間にわたって、治療上有効な酵素活性を有する。その治療上有効な酵素活性は、治療効果を、すなわち、疾患症状の少なくとも緩和または軽減をもたらす酵素活性によって測定され得る。

好ましくはその標的部位における治療上有効な酵素活性は、リソソーム酵素がその活性を発揮する有効な期間を延ばすために、少なくとも１０日間、好ましくは少なくとも２０日間にわたって維持されることは、特に有利である。それによって、本発明に従うＶＬＰの注射の回数または頻度は、制限され得る。

本発明において、そのリソソーム酵素は好ましくは、アリールスルファターゼＡである。

特に、そのリソソーム酵素はヒト酵素である。よって、特に好ましい実施形態において、そのリソソーム酵素はヒトアリールスルファターゼＡである。

一実施形態において、そのリソソーム酵素は、配列番号１に従うアミノ酸配列とその全長にわたって少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％同一である、好ましくは配列番号１のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む。

一実施形態において、そのリソソーム酵素は、配列番号２のヌクレオチド配列とその全長にわたって少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％同一である、好ましくは配列番号２のヌクレオチド配列であるヌクレオチド配列を含む。

配列番号１および２を有する配列は、酵素ヒトアリールスルファターゼＡに属し、以下の表に示される：

好ましくは、そのリソソーム酵素をコードする発現ベクターは、７ｋｂ未満、好ましくは６ｋｂ未満のサイズを有する。そのＶＬＰとその発現ベクターとの会合は、その発現ベクターのサイズが比較的小さい、好ましくは６ｋｂ未満またはさらに５ｋｂ未満の場合に、より効率的である。

好ましい実施形態において、その発現ベクターは、ＣＭＶおよびＣＡＧを含む群から選択されるプロモーターを有する。

そのＣＡＧプロモーターは特に有利である。なぜならそれは、長期間持続する発現を可能にするからである。そのＣＡＧプロモーターはまた、免疫抑制薬のさらなる適用が低減され得るか、またはさらには完全に回避され得るように、望ましくない免疫反応を阻害する。

そのＣＭＶプロモーターは、より強くかつより短期間の発現が必要とされる場合に好ましい。

長期間持続する発現または短期間の発現の必要性は、その疾患、その疾患のステージおよび処置されるべき被験体に依存して変動し得る。そのリソソーム酵素の長時間持続する発現は、その被験体においてリソソーム酵素の活性が存在しないかまたはごくわずかな活性が残っている場合に有益である、長時間持続する効果を可能にする。そのリソソーム酵素の活性が残っている場合、より短期間の発現が十分であり得る。同様に、軽いまたは強い発現の必要性は、変動し得る。

好ましくは、そのリソソーム酵素は、好ましくは標的部位において、少なくとも１時間、好ましくは少なくとも５時間、より好ましくは少なくとも１２時間、より好ましくは少なくとも１日間、より好ましくは少なくとも３日間、より好ましくは少なくとも１週間、より好ましくは少なくとも１ヶ月、より好ましくは少なくとも３ヶ月、より好ましくは少なくとも６ヶ月、より好ましくは少なくとも９ヶ月、より好ましくは少なくとも１年間、より好ましくは少なくとも１．５年間、より好ましくは少なくとも２年間にわたって、発現される。

最も好ましくは、そのリソソーム酵素は、少なくとも１ヶ月間にわたってその標的部位において発現される。

従って、一実施形態において、そのリソソーム酵素は、少なくとも１時間、好ましくは少なくとも５時間、より好ましくは少なくとも１２時間、より好ましくは少なくとも１日間、より好ましくは少なくとも３日間、より好ましくは少なくとも１週間、より好ましくは少なくとも１ヶ月間、より好ましくは少なくとも３ヶ月間、より好ましくは少なくとも６ヶ月間、より好ましくは少なくとも９ヶ月間、より好ましくは少なくとも１年間、より好ましくは少なくとも１．５年間、より好ましくは少なくとも２年間にわたって、その標的部位において検出可能である。

最も好ましくは、そのリソソーム酵素は、少なくとも１ヶ月間にわたってその標的部位において検出可能である。

好ましくは、その標的細胞における発現は一過性である。一過性の発現は、その発現が長時間持続することを排除しない。好ましい実施形態において、その発現は、長時間持続しかつ一過性である。

好ましい実施形態において、その発現ベクターはプラスミドである。

特に好ましい実施形態において、そのプラスミドは、抗生物質耐性遺伝子を含まない。これは、抗生物質なしでそのようなプラスミドを培養することを可能にすることから有利である。これは、抗生物質の注射が感作またはアナフィラキシーショックをもたらし得ることから、臨床使用にとって特に重大である。「ｐＦＡＲ」プラスミドは、例えば、抗生物質耐性遺伝子なしのプラスミドである。好ましくは、ｐＦＡＲプラスミドが使用され得る。ｐＦＡＲプラスミドは、抗生物質を使用する必要性なしに、長時間持続しかつ安定な発現を可能にする。

別の好ましい実施形態において、「ｐＮＬ」プラスミドまたは「ｐＳＦ」プラスミドが使用される。

発現「ｐＦＡＲプラスミド」、「ｐＮＬプラスミド」または「ｐＳＦプラスミド」は、ｐＦＡＲプラスミド、ｐＮＬプラスミドまたはｐＳＦプラスミドの骨格を有するプラスミドが、そのプロモーターおよび目的のリソソーム酵素をその骨格へとクローニングするために使用されることを意味する。

ｐＦＡＲプラスミドは、例えば、米国特許第８，４４０，４５５ Ｂ２号に記載される。特に好ましいｐＦＡＲプラスミドは、ｐＦＡＲ４であり、その骨格は、米国特許第８，４４０，４５５ Ｂ２号において配列番号２１として開示され、その配列は、本明細書では配列番号７として開示される。「ｐＦＡＲ１」プラスミドおよび最適化した「ｐＦＡＲ４」プラスミドの構築は、米国特許第８，４４０，４５５ Ｂ２号の第１７欄および１８欄に開示される。

そのｐＦＡＲプラスミドは好ましくは、ＣＭＶまたはＣＡＧプロモーターを含む。そのｐＮＬプラスミドは好ましくは、ＣＭＶプロモーターを含む。そのｐＳＦプラスミドは好ましくは、ＣＡＧプロモーターを含む。

好ましい実施形態において、その発現ベクターは、ｐＦＡＲ−ＣＭＶ−ＡＳＡ、従って、ＣＭＶプロモーターを有し、ヒトＡＳＡ遺伝子をコードするｐＦＡＲ骨格である。別の好ましい実施形態において、その発現ベクターは、ｐＦＡＲ−ＣＡＧ−ＡＳＡである。別の好ましい実施形態において、その発現ベクターは、ｐＮＬ−ＣＭＶ−ＡＳＡである。その発現ベクターｐＦＡＲ−ＣＡＧ−ＡＳＡは特に好ましい。

ヒトＡＳＡが種々の発現ベクターを使用して膠芽腫細胞において発現され得ることは、本発明において示されている。

好ましい実施形態において、そのカーゴがリソソーム酵素をコードする発現ベクターである場合、リソソーム蓄積症、好ましくはＭＬＤの処置は、処置されるべき被験体の標的細胞、好ましくは乏突起膠細胞におけるリソソーム酵素遺伝子の一過性の発現によってもたらされる。

本発明に従うＶＬＰによって処置されるべき被験体は、例えば、リソソーム蓄積症に罹患している被験体またはリソソーム蓄積症に罹患すると予測される被験体である。なぜなら例えば、彼らは、リソソーム酵素に影響を及ぼすことが公知であり、従ってリソソーム蓄積症をもたらす遺伝的変異を含むからである。

好ましい実施形態において、そのリソソーム蓄積症は、その被験体の神経学的欠損と関連するかまたは潜在的に関連するものである。「潜在的に関連する（ｐｏｔｅｎｔｉａｌｌｙ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）」とは、その疾患の発生の通常の過程が最終的には神経学的欠損をもたらすが、その被験体が神経学的欠損を未だ有していなくてもよいことを意味する。好ましくは、その処置されるべき被験体は、神経学的欠損を有する。

本発明に従う「神経学的欠損（ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃ ｄｅｆｉｃｉｔ）」とは、脳、脊髄、筋、またはＣＮＳの神経もしくは他の部分の質変化した機能に起因する、異常なまたは質変化した身体機能に言及する。例としては、異常反射、発話もしくは平衡の障害、感覚低下、精神機能の問題、視覚の変化、歩行の問題または腕もしくは足の虚弱が挙げられる。参照は、正常な反射、発話能力、正常な感覚、平衡、精神機能、視覚および歩行、ならびに腕および足の強さを有する健康な被験体である。

被験体の神経学的欠損と関連するかまたは潜在的に関連するリソソーム蓄積症は、例えば、ＭＬＤである。非常に好ましい実施形態において、そのリソソーム蓄積症はＭＬＤである。

そのリソソーム蓄積症が、その被験体の神経学的欠損と関連するかまたは潜在的に関連する場合、本発明に従うＶＬＰの標的は、好ましくはＣＮＳである。より具体的には、その標的細胞は、星状細胞、乏突起膠細胞、ニューロンまたはミクログリア、特に、乏突起膠細胞である。

ＭＬＤの種々のマウスモデルが存在し、それらは、疾患および考えられる治療剤を研究するために使用され得る：

ＡＳＡ（−／−）マウスは、ＡＳＡ遺伝子のダブルノックアウトを有する。欠損動物は、スフィンゴ脂質セレブロシド−３−スルフェートを種々のニューロン組織および非ニューロン組織に貯蔵する。その貯蔵パターンは、罹患したヒトのものに匹敵するが、白質の全体的な欠陥は、２歳齢までに観察されない。１２ヶ月齢〜１４ヶ月齢での神経学的な検査から、神経運動協調性の顕著な機能障害が明らかになる（Ｈｅｓｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． １９９６；９３（２５）：１４８２１−６）。

ＡＳＡ（−／−）／ＣＳＴ（あるいは、ＡＳＡ（−／−）／Ｇａｌ３Ｓｔ１）は、ミエリン形成細胞において、スルファチド合成酵素セレブロシドスルホトランスフェラーゼ（ＣＳＴ）（あるいは、ガラクトース−３−Ｏ−スルホトランスフェラーゼ−１（Ｇａｌ３Ｓｔ１））を過剰発現するＡＳＡ（−／−）マウスである。これらのマウスは、脳および末梢神経においてスルファチド貯蔵の顕著な増大を示す。１歳齢を過ぎたマウスは、重篤な神経学的症状を発生させる（Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ２００７；２７（３５）：９４８２−９０）。

ＡＳＡ（−／−）／ＣＧＴマウスにおいて、神経細胞は、スルファチド合成酵素ＵＤＰ−ガラクトース：セラミドガラクトシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴ）を過剰発現する。これらのマウスは、ミエリン形成細胞において増大したスルファチド貯蔵を示し、ＭＬＤに類似する軸索変性および神経学的症状の発生を生じる（Ｅｃｋｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ２００７；２７（３４）：９００９−２１）。

ＡＳＡ（−／−）／ｈＡＳＡｃ６９ｓマウスは、ｈＡＳＡに対する免疫寛容（不活性ｈＡＳＡの発現）およびＡＳＡ（−／−）マウスのＭＬＤ様表現型の維持を示す。酵素補充療法は、このモデルで研究されている（Ｍａｔｚｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ Ｍｅｄ． ２００７；１３（９−１０）：４７１−９）。

ＡＳＡ（−／−）／ＣＳＴ／ｈＡＳＡｃ６９ｓマウスは、ｈＡＳＡに対する免疫寛容（不活性ｈＡＳＡの発現）およびスルファチド合成の正常範囲を超えた速度（ｓｕｐｒａｎｏｒｍａｌ ｒａｔｅｓ）（セレブロシドスルホトランスフェラーゼ（ＣＳＴ）過剰発現）を有するダブルトランスジェニックｍＡＳＡマウスである。酵素補充療法は、このモデルで研究されている（Ｍａｔｔｈｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ． ２０１２；２１（１１）：２５９９−６０９）。

本発明のＶＬＰは、好ましくはＪｏｈｎ Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍウイルス（ＪＣＶ）に由来する。その「ＪＣウイルス」またはＪｏｈｎ Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍウイルス（ＪＣＶ； ＮＣＢＩ Ｔａｘｏｎｏｍｙ １０６３２）は、ヒトポリオーマウイルスである。ＪＣＶは、正二十面体対称のウイルスであり、直径約４５ｎｍを有し、７２のＶＰ１ペンタマーからなる。少数の構造タンパク質ＶＰ２およびＶＰ３もまた存在する。

「ウイルス様粒子（ｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ ｐａｒｔｉｃｌｅ）」（ＶＬＰ）とは、本発明の状況において、ウイルス構造タンパク質または改変されたウイルス構造タンパク質またはウイルス構造タンパク質に由来するタンパク質から構成される殻（キャプシドともいわれる）を有する複製欠損粒子として定義される。上記で説明されるように、そのＶＬＰ自体は、遺伝物質を含まない。本発明に従うＶＬＰは好ましくは、ヒトポリオーマウイルス、好ましくはＪＣＶに由来する。すなわち、その殻は好ましくは、ウイルス構造タンパク質または改変されたウイルス構造タンパク質またはＪＣＶのウイルス構造タンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３に由来するタンパク質から構成される。好ましい実施形態において、本発明に従うＶＬＰは、ＪＣウイルスのＶＰ１タンパク質から構成される。

本発明の特に好ましい実施形態において、本発明に従うＶＬＰの殻における唯一のウイルス構造タンパク質は、ＶＰ１タンパク質である。最も好ましい実施形態において、本発明に従うＶＬＰの殻は、ＶＰ１タンパク質からなる。すなわち、その殻は、いかなる他のタンパク質をも含まない。

そのウイルス構造タンパク質、特に、ＶＰ１は、ペンタマー構造（ペンタマー）へとアセンブルする。本発明によれば、本発明に従うＶＬＰ殻は好ましくは、いくつかのＶＰ１タンパク質、特に、いくつかのＶＰ１ペンタマー、特に、７２のＶＰ１ペンタマーから構成される。

「ペンタマー（ｐｅｎｔａｍｅｒ）」とは、本発明の状況において、５つのポリペプチド、例えば、ＶＰ１タンパク質がアセンブルする場合に形成される構造である。ペンタマーへのアセンブルは、そのポリペプチド間の共有結合または非共有結合の形成に起因し得る。そのポリペプチドは代表的には、五角形対称を有する環形状の構造を形成する。ペンタマーでは、各ポリペプチドサブユニットは、好ましくは２つの隣接するサブユニットと相互作用する。

本発明に従う「ペプチド（ｐｅｐｔｉｄｅ）」は、任意の数の任意のタイプのアミノ酸、好ましくは天然に存在するアミノ酸から構成され得、これらは好ましくはペプチド結合によって連結される。特に、ペプチドは、少なくとも３個のアミノ酸、好ましくは少なくとも５個、少なくとも７個、少なくとも９個、少なくとも１２個または少なくとも１５個のアミノ酸を含む。ペプチドの長さに上限はない。しかし、好ましくは本発明に従うペプチドは、５００個のアミノ酸、好ましくは４００個、３００個、２５０個、２００個、１５０個または１２０個のアミノ酸の長さを超えない。約１０個のアミノ酸を超えるペプチドは、「ポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」ともいわれ得る。

本発明に従うＶＬＰの構造タンパク質、特にＶＰ１は、好ましくはＪＣＶの天然の構造タンパク質に同一であるかまたはこの構造タンパク質に由来する。「改変されたまたは由来する（ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｏｒ ｄｅｒｉｖｅｄ）」とは、ＶＰ１の機能を保持してキャプシドへとアセンブルすると同時に、１またはこれより多くのアミノ酸の挿入、欠失または置換を包含する。

一実施形態において、その天然の（ＪＣＶ）構造タンパク質は、その生成、その細胞標的化プロフィールおよび特異性、またはその細胞内標的化プロフィールもしくは特異性に関して、本発明に従うＶＬＰを最適化するために改変され得る。改変または誘導体化は、タンパク質翻訳を増強するために、その構造タンパク質、特にＶＰ１をコードするヌクレオチド配列のコドン最適化を含み得る。

本発明に従う用語「ＶＰ１」または「ウイルスタンパク質１（ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ １）」は、キャプシドへとアセンブルし得、そして好ましくはＪＣＶの天然の（ｎａｔｕｒａｌ）（天然の（ｎａｔｉｖｅ））ＶＰ１に同一であるかまたはこれに由来するタンパク質をいう。

本発明に従う用語「ＶＰ１」とは、配列番号３に従うアミノ酸配列と、この配列にわたって少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質を包含する。本発明の最も好ましい実施形態において、そのＶＰ１は、配列番号３に従うアミノ酸配列を有する。

本発明に従う用語「ＶＰ１」はまた、その天然のＶＰ１の画分を包含する。好ましくは、上記ＶＰ１の画分は、配列番号３に従うアミノ酸配列のうちの少なくともアミノ酸３２〜３１６、または配列番号３のアミノ酸３２位〜３１６位のアミノ酸配列と、この配列にわたって少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有するその誘導体を含む。

本発明の別の実施形態において、そのＶＰ１は、配列番号４に従うアミノ酸配列とその全長にわたって少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有する。一実施形態において、ＶＰ１のアミノ酸配列は、配列番号４のアミノ酸配列と同一である。

一実施形態において、そのＶＰ１タンパク質のヌクレオチド配列は、配列番号５のヌクレオチド配列とその全長にわたって少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％同一であり、好ましくは配列番号５のヌクレオチド配列である。

本発明の別の実施形態において、そのＶＰ１タンパク質のヌクレオチド配列は、配列番号６のヌクレオチド配列とその全長にわたって少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％同一である。一実施形態において、そのＶＰ１タンパク質のヌクレオチド配列は、配列番号６のヌクレオチド配列と同一である。

配列は、表２に示される。

本発明の好ましい実施形態において、そのＶＰ１は、配列番号３に従うアミノ酸配列とその全長にわたって少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する。

本発明の好ましい実施形態において、そのＶＰ１タンパク質のヌクレオチド配列は、配列番号５のヌクレオチド配列とその全長にわたって少なくとも８０％同一である。

その構造タンパク質、好ましくはＶＰ１は、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉまたは昆虫細胞において発現され得る。本発明の好ましい実施形態によれば、その構造タンパク質、好ましくはＶＰ１は、昆虫細胞において発現される。これは、昆虫細胞における発現が、野生型タンパク質（例えば、ＪＣＶの）と比較して、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現より少ない改変（例えば、翻訳後修飾）をもたらすことから有利である。

本発明に従うＶＬＰは、そのキャプシドの中に、１またはいくつかのさらなる異種タンパク質、すなわち、そのＶＰ１の供給源（例えば、ＪＣＶ）と同一でないかまたはその供給源に由来しないタンパク質をさらに含み得る。例えば、異種タンパク質は、キャプシドの中に繋留され得る。すなわち、このタンパク質のうちの少なくとも一部は、好ましくは外側からアクセス可能である。原則的に、任意のタンパク質は、その異種タンパク質がキャプシドの中に組み込まれ得、本発明に従うＶＬＰのアセンブルに実質的に干渉しない限りにおいて、このような異種タンパク質として適している。

本発明に従うＶＬＰは、カーゴ、すなわち、リソソーム酵素またはリソソーム酵素をコードする発現ベクターと会合される。これは、そのカーゴがＶＬＰに可逆的に結合されることを意味する。これは、例えば、そのキャプシドの任意の部分との物理化学的相互作用もしくはそのキャプシドの任意の部分への付着に起因するか、またはそのキャプシドへのカーゴの組み込みによるかのいずれかであり得る。その組み込みは、完全または不完全であり得る。本発明の特に好ましい実施形態において、そのカーゴの総量のうちの大部分は、そのキャプシドへと完全に組み込まれる。最も好ましいのは、そのカーゴが本発明に従うＶＬＰのキャプシドの中に完全に被包されることである。

本発明の状況では、「ＶＬＰがカーゴを含む（ＶＬＰ ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ ｔｈｅ ｃａｒｇｏ）」という表現は、そのＶＬＰが「そのカーゴと会合される（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｃａｒｇｏ）」という表現と同義に使用される。そのＶＬＰとそのカーゴとの会合は、そのＶＬＰにカーゴを「装填（ｌｏａｄｉｎｇ）」かまたは「パッキング（ｐａｃｋｉｎｇ）」した結果であり得る。

「装填」とは、ＶＬＰおよびカーゴの会合を、例えば、浸透圧ショックによって、またはＶＰ１もしくはＶＰ１ペンタマーを、ＶＬＰへとそのカーゴと一緒にアセンブルすることによってもたらす任意のプロセスを意味する。「装填されたＶＬＰ（ｌｏａｄｅｄ ＶＬＰ）」とは、このプロセスから生じるＶＬＰである。用語「パッキング」とは、ＶＰ１またはＶＰ１ペンタマーをＶＬＰへとそのカーゴと一緒にアセンブルすることを介して、そのＶＬＰに装填するというプロセスに関する。これらから生じるＶＬＰは、「パックされた（ｐａｃｋｅｄ）」ＶＬＰといわれる。

用語「カーゴ（ｃａｒｇｏ）」とは、本発明の状況において、リソソーム酵素またはリソソーム酵素をコードする発現ベクターに関して使用される。

本発明の具体的実施形態において、本発明に従うＶＬＰは、被験体においてリソソーム蓄積症を処置するための方法における使用のための薬学的組成物の一部であり、ここでその薬学的組成物は、薬学的に受容可能なキャリア、および／または賦形剤をさらに含む。

好ましい実施形態において、その薬学的組成物は、本発明に従うＶＬＰ、塩および緩衝液を含み、７．０〜８．０の間の、好ましくは７．５あたりのｐＨを有する。その薬学的組成物は、好ましくは以下を含む：
ａ． １２０ｍＭ〜１７０ｍＭ ＮａＣｌ、好ましくは１５０ｍＭ ＮａＣｌ、
ｂ． １〜５ｍＭ ＣａＣｌ_２、好ましくは２ｍＭ ＣａＣｌ_２、および
ｃ． ５〜３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、好ましくは１０〜２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、より好ましくは１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ。

この薬学的組成物は、本発明に従うＶＬＰを生理学的条件下で取り扱うことを可能にする。これらの条件下では、本発明に従うＶＬＰは、本質的に無傷のままであり、好ましくは、それらは本質的にそれらのキャプシド構造を維持する。カーゴ（例えば、リソソーム酵素またはリソソーム酵素をコードする発現ベクター）を装填した場合、本発明に従うＶＬＰは、本質的にはそのカーゴと会合したままである。その薬学的組成物は、本質的には、本発明に従うＶＬＰを被験体、特にヒトへと静脈内投与するための薬学的組成物として特に適している。

さらなる局面において、本発明は、リソソーム酵素、好ましくはヒトアリールスルファターゼＡをコードするコード領域、ＣＡＧおよびＣＭＶを含む群から選択され、好ましくはＣＡＧであるプロモーターを有し、そして７ｋｂ未満、好ましくは６ｋｂ未満のサイズを有する発現ベクターに関する。

好ましい実施形態において、その発現ベクターによってコードされるリソソーム酵素は、配列番号２のヌクレオチド配列とその全長にわたって少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％同一であり、好ましくは配列番号２のヌクレオチド配列であるヌクレオチド配列を含む。

好ましくは、その発現ベクターは、ヒトアリールスルファターゼＡをコードし、プロモーターＣＡＧを含み、６ｋｂ未満のサイズを有する。

本発明に従うＶＬＰが製造後直ぐに投与されない場合、それらは、好ましくは液体窒素中に貯蔵され得る。

本発明に従うＶＬＰは、標準的方法に従って、例えば、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ、ＨＡ、ＤＬＳ、ｎＤＳＦ、ＨＰＬＣ−ＳＥＣ、ＡＦ４、ＴＥＭによって、特徴づけられ得る。

本発明はまた、リソソーム蓄積症、特にＭＬＤを、本発明に従うＶＬＰで処置するための方法に関する。上記処置するための方法は、好ましくは、そのＶＬＰを必要性のある被験体に投与する工程を包含する。

本発明はまた、リソソーム蓄積症、特にＭＬＤを処置するための医薬の製造のための本発明に従うＶＬＰの使用に関する。上記処置方法は、好ましくは、処置されるべき被験体のＢＢＢの透過性を増大させる工程を包含しない。本発明のＶＬＰは、好ましくは、ＢＢＢを損なうまたは混乱させるためのいかなる化学的処置も物理的処置も受けたことがない患者に投与される。

本発明はまた、ＢＢＢを横断してＣＮＳへと、特にＣＮＳの細胞、例えば、星状細胞、乏突起膠細胞、ニューロンおよびミクログリアへとリソソーム酵素またはリソソーム酵素をコードする発現ベクターを送達するために使用される本発明に従うＶＬＰに関する。

重要なことには、本発明に従うＶＬＰによるＢＢＢの横断は、そのＶＬＰが、脳内の特定の細胞集団を標的化するという機能を示す、すなわち、リソソーム酵素またはリソソーム酵素をコードする発現ベクターを、標的細胞、好ましくは星状細胞、乏突起膠細胞、ニューロンおよびミクログリアに送達することを可能にする。本発明の状況において、上記ＶＬＰは、標的細胞へのおよび／または中への送達を包含する。

さらなる実施形態において、本発明は、ＶＬＰを、リソソーム酵素、好ましくはヒトアリールスルファターゼＡをコードする発現ベクターと会合させるための方法に関し、ここでその方法は、以下の工程：
−ＶＬＰ、特に、ＪＣＶに由来するＶＬＰを提供する工程、
−そのＶＬＰを、そのＶＬＰをペンタマーへと解離する条件に曝す工程
−そのペンタマーを、ＶＬＰ 対 発現ベクターが１：０．５〜１：０．１の比において、好ましくは１：０．２の比においてその発現ベクターに、およびそのペンタマーを誘導する条件に曝して、その発現ベクターと会合したＶＬＰへとアセンブルする工程、
−必要に応じて、そのＶＬＰを精製する工程、
−透析工程を行う工程、
を包含する。

別の好ましい実施形態において、ＶＬＰを、リソソーム酵素、好ましくはヒトアリールスルファターゼＡと、またはリソソーム酵素、好ましくはヒトアリールスルファターゼＡをコードする発現ベクターと会合させるための方法が提供され、ここでその方法は、以下の工程：
ａ） ＶＰ１タンパク質を含む組成物を提供する工程、
ｂ） ａ）の組成物のＶＰ１タンパク質を、そのＶＰ１を誘導する条件に曝して、ＶＬＰへとアセンブルする工程、
ｃ） ｂ）の組成物のＶＬＰを、そのＶＬＰをペンタマーへと脱アセンブルする条件に曝す工程、
ｄ） ｃ）の組成物のペンタマーを、そのペンタマーを誘導する条件に曝して、ＶＬＰへと再アセンブルする工程、
ｅ） ｄ）の組成物のＶＬＰを、そのＶＬＰをペンタマーへと脱アセンブルする条件に曝す工程、
ｆ） ｅ）の組成物のペンタマーを、そのリソソーム酵素または発現ベクターへと、そのペンタマーを誘導する条件に曝して、そのリソソーム酵素または発現ベクターと会合したＶＬＰへとアセンブルする工程、
を包含する。

ＶＬＰ 対 発現ベクターの比（すなわち、パッケージング比）は、具体的な必要性に依存して変動し得る。例えば、ＶＬＰ形成または遺伝子発現の効率は、その比に依存し得る。好ましくは、ＶＬＰ 対 発現ベクターが１：０．５〜１：０．１という比、より好ましくは１：０．２という比が使用される。当業者は、その具体的な発現ベクター、好ましくはプラスミド、および所望の使用法に合わせてその比を調節する。１：０．２というパッケージング比が好ましい。

本発明の状況において、および説明を容易にするために、工程ｂ）から生じるＶＬＰは、「ｐＶＬＰ」（一次ＶＬＰ）ともいわれ得る。工程ｄ）から生じるＶＬＰは、「ｒＶＬＰ」（再アセンブルＶＬＰ）ともいわれ得る。工程ｆ）の結果としてのＶＬＰは、「ｃＶＬＰ」（カーゴＶＬＰ）ともいわれ得る。本発明によれば、カーゴは、リソソーム酵素、好ましくはヒトアリールスルファターゼＡ、またはリソソーム酵素、好ましくはヒトアリールスルファターゼＡをコードする発現ベクターである。

本発明の別の局面において、本発明は、上記の方法によって得られ得るＶＬＰに関する。

本発明の別の局面において、本発明は、以下のパラメーターのうちの１またはこれより多くによって特徴づけられるＪＣＶに由来した本発明に従うＶＬＰを含む組成物に関する：
ａ． ０．３未満、好ましくは０．２未満、好ましくは０．１未満、より好ましくは０．０１〜０．０９の間の範囲の多分散指数（ＰＤＩ）、
ｂ． ２０ｎｍ〜７０ｎｍ、好ましくは３０ｎｍ〜７０ｎｍ、より好ましくは３５ｎｍ〜６５ｎｍ、より好ましくは４０〜６０ｎｍの平均直径を有するＶＬＰが少なくとも７０％、
ｃ． 組成物内のＶＬＰ含有量が少なくとも８０％（ｖ／ｖ）、好ましくは少なくとも８５％（ｖ／ｖ）、好ましくは少なくとも９０％（ｖ／ｖ）、好ましくは少なくとも９５％（ｖ／ｖ）。

別の局面において、本発明は、本発明に従う方法によって得られ得る薬物送達システムに関する。その薬物送達システムは、好ましくは、神経学的障害、すなわち、リソソーム蓄積症、特にＭＬＤを処置するための、治療および／または診断の方法において使用され得る。よって、本発明はまた、本発明に従う薬物送達システムで、障害、特にＣＮＳ疾患を処置するための方法に関する。その処置方法は、好ましくは、その薬物送達システムを必要性のある被験体に投与する工程を包含する。

その薬物送達システムは、好ましくは、改善された有効性を有する。本発明に従うＶＬＰは、ＢＢＢの透過性の事前の増大なしに、ＢＢＢを横断し得る。よって、本発明の薬物送達システムは、ＣＮＳ疾患を処置するための方法において使用され得、ここでその方法は、処置されるべき被験体のＢＢＢの透過性を増大させる工程を包含しない。本発明の薬物送達システムは、好ましくは、ＢＢＢを損なうかまたは混乱させるためのいかなる化学的処置も物理的処置も受けたことがない患者に投与される。

本発明のさらなる局面において、以下の特徴（標的パラメーター（ｔａｒｇｅｔ ｐａｒａｍｅｔｅｒ））のうちの少なくとも１つ、好ましくは全てを有するＶＬＰを含む組成物が提供される：

一実施形態において、本発明に従うＶＬＰは、ｎＤＳＦ分析において＞６７℃の大きな変曲ピーク(inflection peak)を示す。

一実施形態において、本発明に従うＶＬＰのＡＦ４分析は、２０％未満の凝集物および１５％未満の極小物を明らかにする。少なくとも７０％は、４０〜５０ｎｍサイズのＶＬＰである。

本発明の薬物送達システムは、種々の経路（経口、皮膚、鼻または肺の経路または注射が挙げられる）を介して投与され得る。その薬学的生成物の全身作用を可能にする投与形態が特に好ましい。具体的実施形態において、本発明の薬物送達システムは、経口的にまたは非経口的に、特に静脈内に投与される。

本発明の状況において、用語「薬物送達システム（ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍ）」とは、必要性のある被験体、特に、ヒトまたは動物に薬学的生成物を投与するための組成物をいう。薬物送達システムは、有利なことには、その中に含まれるかまたはそこに付着される薬学的生成物の、好ましくはヒトまたは動物において、目的の部位への送達を可能にする。好ましくは、その送達は、その標的に対して選択的である。すなわち、その薬学的生成物のより多くは、身体または器官の他の部位ではなく標的部位に送達される。

「ＣＮＳの薬物送達システム」は、その薬物送達システムがＣＮＳを選択的に標的化することを意味する。

本発明によれば、表現、何か（例えば、ＶＰ１、ペンタマー、ＶＬＰ）を何かをもたらす（例えば、アセンブリを誘導する）ための条件に「曝す（ｅｘｐｏｓｉｎｇ）」とは、考慮中の物質（例えば、ＶＰ１、ペンタマー、ＶＬＰ）を、このある種の効果を引き起こし得る（例えば、アセンブリを誘導する）条件にもたらすことをいう。このような曝露は、その物質のための条件を変化させることによって、例えば、その物質に種々の緩衝液、塩またはｐＨなどとの接触をもたらすことによって行われ得る。これは、何かを、その物質を含む組成物に添加する（逆も同様）か、またはその物質をその組成物から分離し、そして次いで、その物質を異なる組成物に添加するかのいずれかによって、可能である。

条件の変更はまた、温度、照射などを変動させることによって達成され得る。当然のことながら、条件の変更のためのこのような手段は、組み合わされ得るおよび／または反復され得る。その所望の効果（例えば、そのＶＰ１もしくはペンタマーの、ＶＬＰへのアセンブリおよび／またはそのＶＬＰの凝集を誘導する）を誘導する他の適切な条件はまた、当業者に周知である。その同じことが、そのそれぞれの条件への曝露の適切な継続期間にも当てはまる；これは、当業者の通常の手段によって見出され得る。

表現「何かを、何かをもたらすための条件に曝す（ｅｘｐｏｓｉｎｇ ｓｏｍｅｔｈｉｎｇ ｔｏ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ａｆｆｅｃｔｉｎｇ ｓｏｍｅｔｈｉｎｇ）」は、企図されるべき効果を要求しない、すなわち、その物質の全てが考慮中の効果を達成しなければならないわけではない。例えば、「そのペンタマーが凝集するように誘導する条件（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｔｈｅ ｐｅｎｔａｍｅｒｓ ｔｏ ａｇｇｒｅｇａｔｅ）」は本質的に、その条件が凝集を誘導するために適していることを意味する。それは、実際に全てのペンタマーが凝集することを要求しない。

本明細書で使用される場合、用語「アセンブリ（ａｓｓｅｍｂｌｙ）」または「ＶＬＰへとアセンブルする（ａｓｓｅｍｂｌｅ ｉｎｔｏ ＶＬＰ）」とは、考慮中の構造（ＶＰ１タンパク質またはペンタマーのいずれか）が会合してＶＬＰのキャプシドを確立することを意味する。ＶＰ１が出発物質として使用される場合、ＶＬＰへのアセンブリは、ペンタマーの事前の形成を含み得る。これは、そのＶＰ１タンパク質が先ず、ペンタマーを形成し得、次いで、ＶＬＰを形成し得るか、またはそれらはＶＬＰへと直接アセンブリし得ることを意味する。ＶＬＰのアセンブリは、可逆的である。

用語「脱アセンブル（ｄｉｓａｓｓｅｍｂｌｙ）」とは、翻って、そのＶＬＰのキャプシドがペンタマー構造および／または構造タンパク質へと少なくとも部分的に崩壊する場合のプロセスをいう。その脱アセンブルは、温度を上昇させることによって、プロテアーゼを添加することによって、および／またはＶＬＰを形成するために使用される分子間相
互作用（例えば、分子間ジスルフィド架橋）を減少させることによって（例えば、還元剤を添加するかもしくはキレート化剤を添加することによって）誘導され得る。このような条件はまた、条件への段階的曝露を包含し得る。例えば、その組成物は、その温度が上昇する前に、還元剤と接触され得る。

そのＶＰ１および／またはペンタマーを誘導して、ＶＬＰへとアセンブルするための方法は一般に、当業者に公知である（Ｇｏｌｄｍａｎｎら（Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． １９９９； ７３（５）： ４４６５−６９）； ＤＥ １９５ ４３ ５５３ Ａ１）。その同じことが、ペンタマーへのＶＬＰの脱アセンブルに当てはまる。当業者は、よって、ＶＬＰのアセンブリおよび脱アセンブルの制御のための方法を認識する。

本発明の一実施形態において、そのＶＰ１またはペンタマーを含む組成物中のＣａ^２＋イオンの濃度は、そのＶＬＰのアセンブリ／脱アセンブルの制御のために使用される。例えば、そのアセンブリを誘導するために、遊離Ｃａ^２＋イオンの濃度が増大され得る。その脱アセンブルが望ましい場合、遊離Ｃａ^２＋イオンの濃度は、キレート化剤をその組成物に添加することによって低下させられ得る。

そのアセンブリを誘導するためのさらなる選択肢は、ＶＬＰへのアセンブリを、例えば、そのペンタマーを含む組成物中の溶媒を低減することによって促進するために、ＶＰ１ペンタマーの濃度を増大させることである。これは、アルカリ土類金属（例えば、Ｃａ^２＋またはＭｇ^２＋）の濃度の適合を要求し得る。

よって、本発明の好ましい実施形態によれば、脱アセンブルは、そのＶＬＰを分子間ジスルフィド架橋が例えば、そのＶＬＰを還元条件に曝すことによって還元される条件に曝すことによって誘導され得る。好ましい実施形態において、この工程は、キレート化剤のさらなる存在下で達成される。より好ましくは、その脱アセンブルは、そのＶＬＰを、キレート化剤の存在下で、および必要に応じて高温で還元条件に曝すことによって誘導される。

本発明の特定の実施形態において、そのＶＬＰは、ＤＴＴならびにＥＤＴＡおよび／またはＥＧＴＡを含む組成物に、好ましくは１５℃〜３０℃、好ましくは２０℃〜２５℃の温度で、最も好ましくは約２３℃の温度で曝される。

本発明の好ましい実施形態によれば、ｃ）の組成物のペンタマーは、その凝集を誘導する条件に曝される。この工程は、工程ｄ）の前に行われる場合に最も適切である。好ましい実施形態において、その物質（例えば、そのペンタマー）のうちの少なくとも２０％（好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％）が凝集する。

驚くべきことに、この工程はそのＶＬＰのより均質のサイズ分布をもたらし得ることが見出された。これは、よりよい品質管理および標準化を可能にし、これは、そのＶＬＰが薬物送達システムにおいて使用される場合に最も重要である。よって、このさらなる手順は、好ましくは、薬物送達システムの品質制御要件の一部である。

用語「凝集物（ａｇｇｒｅｇａｔｅ）」とは、任意の粒状構造を意味する。「凝集（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）」とは、凝集物をもたらすプロセスを意味する。このプロセスは、可逆的である。

そのペンタマーまたはＶＬＰの凝集は、コントロールと比較して、その組成物中のＶＬＰの増大した平均粒度によって決定され得る。そのより大きな粒度は、標準的方法（例えば、動的光散乱法（ＤＬＳ））によって決定され得る。

本発明の特定の実施形態によれば、そのペンタマーまたはＶＰ１の凝集は、タンパク質の沈殿を促進することが当該分野で公知である１またはこれより多くの薬剤（沈殿剤）によって誘導され得る。従って、最も好ましいのは、本発明によれば、沈殿剤の使用である。

「沈殿剤（ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ａｇｅｎｔ）」とは、ＶＰ１またはペンタマーの凝集を促進する薬剤をいう。沈殿剤の概念は一般に、当業者に公知である。沈殿剤は代表的には、タンパク質の濃縮および精製を促進するために使用される。沈殿は、より具体的には、そのタンパク質の溶解性を低下させることによって、溶媒の溶媒和能力の質を変化させる結果であり得る。その溶解性は、その組成物のｐＨをタンパク質の等電点へと調節することによっても低下され得る。さらに、その組成物の温度を低下させることは、タンパク質の溶解性をも低減し得る。

考えられる沈殿剤は、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、またはアルコール（例えば、エタノール）、および塩である。後者は、「塩析するための薬剤（ａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ ｓａｌｔｉｎｇ ｏｕｔ）」として当業者に公知である。

好ましくは、本発明によれば、その沈殿剤は塩である。最も好ましいのは、「ホフマイスターシリーズ（Ｈｏｆｍｅｉｓｔｅｒ ｓｅｒｉｅｓ）」として公知のイオンを含む塩である。そのホフマイスターシリーズは、溶液中の具体的タンパク質の溶解性に影響を及ぼす能力に関して、そのタンパク質に対するそれらの疎水性効果に関するイオンの組織化を説明する。タンパク質に対して疎水性効果を発揮するイオンは、特に好ましい。本明細書で、このようなイオンは、コスモトロピックイオンといわれる。

少なくとも１種のコスモトロピックアニオンまたはカチオンを含む沈殿剤が好ましい。好ましいアニオンは、シトレート（Ｃ_６Ｈ_５Ｏ_７ ^３−）、ホスフェート（ＰＯ_４ ^３−）、スルフェート（ＳＯ_４ ^２−）、リン酸水素（ＨＰＯ_４ ^２−）、リン酸二水素（Ｈ_２ＰＯ_４ ⁻）、ヨウ素酸（ＩＯ_３ ⁻）、ヒドロキシド（ＯＨ⁻）、フルオリド（Ｆ⁻）、臭素酸（ＢｒＯ_３ ⁻）またはアセテート（ＣＨ_３ＣＯＯ⁻）またはこれらの組み合わせからなる群より選択され、より好ましいアニオンは、シトレート、ホスフェートまたはスルフェートであり、最も好ましいアニオンはスルフェートである。

好ましいカチオンは、アンモニウムまたは四級アンモニウム化合物（ＮＲ_４ ^＋であってＲは、アルキル基もしくはアリール基であるもの（例えば、テトラメチルアンモニウム（（ＣＨ_３）_４Ｎ^＋）もしくはジメチルアンモニウム（（ＣＨ_３）_２Ｎ_２ ^＋））である。さらに好ましいカチオンは、カリウム（Ｋ^＋）、セシウム（Ｃｓ^＋）、ルビジウム（Ｒｂ^＋）もしくはリチウム（Ｌｉ^＋）またはこれらの組み合わせを含むリストから選択され、特に好ましいのは、四級アンモニウム化合物またはアンモニウムであり、最も好ましいのはアンモニウムである。

従って、その塩は、好ましくは、シトレート（Ｃ_６Ｈ_５Ｏ_７ ^３−）、ホスフェート（ＰＯ_４ ^３−）、スルフェート（ＳＯ_４ ^２−）、リン酸水素（ＨＰＯ_４ ^２−）、リン酸二水素（Ｈ_２ＰＯ_４ ⁻）、ヨウ素酸（ＩＯ_３ ⁻）、ヒドロキシド（ＯＨ⁻）、フルオリド（Ｆ⁻）、臭素酸（ＢｒＯ_３ ⁻）またはアセテート（ＣＨ_３ＣＯＯ⁻）、四級アンモニウム化合物（ＮＲ_４ ^＋であって、Ｒはアルキル基もしくはアリール基であるもの）（好ましくはテトラメチルアンモニウム（（ＣＨ_３）_４Ｎ^＋）もしくはジメチルアンモニウム（（ＣＨ_３）_２Ｎ_２ ^＋））、アンモニウム（ＮＨ_４ ^＋）、カリウム（Ｋ^＋）、セシウム（Ｃｓ^＋）、ルビジウム（Ｒｂ^＋）またはリチウム（Ｌｉ^＋）からなる、好ましくは、ＳＯ_４ ^２−および／もしくはＮＨ_４ ^＋またはこれらの組み合わせを含む群より選択アレルアニオンおよびカ
チオンを含む。

好ましい実施形態によれば、その塩は、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、Ｋ_２ＳＯ_４、Ｎａ_２ＳＯ_４、（ＮＨ_４）_２ＨＰＯ_４、Ｋ_２ＨＰＯ_４およびＮａ_２ＨＰＯ_４からなる群より選択される。最も好ましい塩は、硫酸アンモニウム（（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４）である。

本発明によれば、そのペンタマーの凝集は、そのペンタマーをその沈殿剤と接触した状態にするための任意の手段によって、例えば、その沈殿剤を、そのペンタマーを含む組成物に（または逆もまた同様（すなわち、そのペンタマーを含む組成物を、沈殿剤に））添加することによって、誘導され得る。他の手段（例えば、透析、その結果、その沈殿剤が拡散によってペンタマーに達する）も可能である。

本発明の１つの好ましい実施形態によれば、そのペンタマーの凝集は、その沈殿剤を含む組成物、例えば、硫酸アンモニウムを含む組成物に対する組成物に対する透析によって誘導される。

本発明の特に好ましい実施形態によれば、凝集のためのペンタマーを含む組成物は、０．３〜５Ｍの間の、好ましくは４Ｍまでの硫酸アンモニウム濃度を有し、さらにより好ましいのは、１．８〜２．２Ｍの間の濃度である。最も好ましいのは、およそ２Ｍである。

そのペンタマーの凝集を誘導する工程は、好ましくは少なくとも１時間、より好ましくは少なくとも５時間、さらにより好ましくは少なくとも１２時間、最もより好ましくは少なくとも１６時間の継続期間を有する。その工程が、２４時間未満の継続時間を有することは好ましい。好ましい実施形態において、この工程の継続時間は、１４〜１９時間の間である。最も好ましい実施形態において、この工程の継続時間は、１６〜１８時間の間である。この時間の間に、そのペンタマーは、凝集を誘導するための条件に曝され、特にそれらは、硫酸アンモニウムとの接触状態にある。

そのペンタマーの凝集を誘導する工程の後に、そのペンタマーを、その凝集を誘導するために使用された条件から分離する工程を本発明のプロセスに含めることは、有利である。このような工程に適用可能な方法は、特に限定されない；当業者に公知の、そのペンタマーを、凝集を誘導する条件から分離することを可能にする任意の方法が、適用可能である。

本発明の好ましい実施形態において、そのペンタマーは、透析によって、それらの凝集を誘導する条件から分離される。そのペンタマーの凝集が沈殿剤を使用することによって誘導される場合に、透析が使用され得る。透析の原理はまた、都合がよいことには、そのペンタマーを沈殿剤との接触にもたらすために適用される。最も好ましいのは、本発明に従う方法が少なくとも２つの透析工程：工程ｃ）の組成物の、沈殿剤を含む組成物に対する第１の透析、および凝集の誘導後の、その沈殿剤を本質的に含まない組成物に対する第２の透析、を包含する場合である。

そのペンタマーをその沈殿剤から分離するための透析は、好ましくは、生理学的条件に少なくとも類似である組成物に対するものである。このような組成物は、好ましくは塩を含み、６〜８．５の、好ましくは６．５〜８．５の、より好ましくは７〜８の、最も好ましくは７．２〜７．５の、特に７．５のｐＨを有する。その組成物の容積モル浸透圧は、好ましくは２８０〜３１０ｍｏｓｍｏｌ／ｌの間、最も好ましくは３０８ｍｏｓｍｏｌ／ｌである。その組成物は、例えば、０．８〜０．９２％（ｗ／ｖ）の、好ましくは０．９％（ｗ／ｖ）の濃度の生理食塩水（塩化ナトリウム）濃度を有し得る。

そのペンタマーを、その凝集を誘導するために使用された条件から分離する工程は、好ましくは少なくとも１時間にわたって、より好ましくは少なくとも５時間、１２時間にわたって、より好ましくは少なくとも１８時間にわたって、より好ましくは約２４時間もしくはこれより長い間、行われる。より長い期間はまた、特に、凝集するように誘導されたペンタマーの濃度、そのペンタマーを含む組成物、ならびにその沈殿剤の性質および濃度に依存して、可能である。好ましい実施形態において、その凝集したペンタマーを含む組成物は、生理学的条件に類似の組成物に対して、約２４時間にわたって透析される。

その組成物は、好ましくは、緩衝液をさらに含む。適切な緩衝系は、当業者に公知である。本発明の好ましい実施形態において、その組成物は、ＴＲＩＳ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ホスフェート緩衝液または炭酸水素緩衝系を含む。最も好ましいのは、ＴＲＩＳ緩衝液である。

最も好ましい実施形態において、その組成物は、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌおよび１５０ｍＭ ＮａＣｌを含み、ｐＨ７．５を有する。

そのペンタマーをＶＬＰへとアセンブルすることを促進するために、その組成物は、二価イオン（例えば、Ｃａ^２＋、Ｍｇ^２＋、Ｂａ^２＋、Ｃｕ^２＋、Ｆｅ^２＋、Ｚｎ^２＋またはこれらの組み合わせ）をさらに含み得る。最も好ましいのは、Ｃａ^２＋、例えば、ＣａＣｌ_２である。好ましい実施形態において、その組成物は、１〜３ｍＭ ＣａＣｌ_２、好ましくは２ｍＭ ＣａＣｌ_２を含む。

本発明の非常に好ましい実施形態において、生理学的条件に少なくとも類似のその組成物は、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび２ｍＭ ＣａＣｌ_２を含み、ｐＨ７．５を有する。

本発明のなお別の局面において、驚くべきことに、ＶＬＰ（ｒＶＬＰ）の貯蔵は、ペンタマーの貯蔵と比較して有利であることが見出された（図１４および図１５）。ペンタマーが貯蔵され、その後、融解および再アセンブルされる場合、主に、「非常に小さい（ｔｉｎｙ）」粒子が凝集物と同様に形成する。これらのＶＬＰが、薬物送達システムの生成に適切ではない。しかし、本発明によれば、貯蔵後に解離および再アセンブルしたＶＬＰは、適切なサイズにされたＶＬＰの特に均質の集団を形成する。従って、本発明の一実施形態において、組成物は、２０ｎｍ〜７０ｎｍの、好ましくは３０ｎｍ〜７０ｎｍの、より好ましくは３５ｎｍ〜６５ｎｍの、より好ましくは４０〜６０ｎｍの平均直径を有する粒子とともに提供される。均質のサイズ分布は、品質制御要件を満たすために重要である。

好ましい実施形態において、本発明に従う方法は、工程ｄ）の組成物からのＶＬＰを貯蔵する工程を包含する。約−８０℃〜約４℃の温度においてそのＶＬＰを貯蔵する工程は、少なくとも１０時間、１５時間、２０時間の貯蔵期間にわたって、好ましくは少なくとも２４時間にわたって可能である。さらに３日間より長い貯蔵は、可能である。

好ましい実施形態において、そのＶＬＰは、０℃未満の温度において貯蔵される（凍結する工程）。凍結する工程は、種々の冷却速度を使用して行われ得る。例えば、「ゆっくりとした（ｓｌｏｗ）」凍結は、約−１℃／分の冷却速度を適用することによって起こり得る一方で、速い凍結は、そのサンプル（すなわち、その組成物を含む容器）と液体窒素とを接触させるか、またはそのサンプルを−８０℃の冷凍庫の中に配置することによって、行われ得る。

好ましい実施形態において、貯蔵する工程は、凍結防止添加剤、好ましくはポリオール、糖、無機塩、有機塩、アミノ酸、ポリマー、エクストリモライトまたはこれらの誘導体もしくは組み合わせからなる群より選択される凍結防止添加剤を含む組成物の中で起こる。

好ましい実施形態において、その無機塩は、スルフェートアニオンを含む。スルフェートアニオンを含む好ましい塩は、硫酸カリウム、硫酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウムおよび硫酸アンモニウムである。好ましくは、その無機塩は硫酸アンモニウムである。

そのアミノ酸は、好ましくはグリシン、グルタミン、プロリンまたはアラニンである。好ましいアミノ酸誘導体は、ベタインである。さらに可能な凍結防止添加剤は、グリセロール、スクロース、ＤＭＳＯ、エクトインまたはヒドロキシエクトインである。

凍結防止添加剤の添加、特に無機塩（例えば、スルフェートアニオンを含む塩、特に硫酸アンモニウム）および／またはアミノ酸誘導体（例えば、ベタイン）の添加は、そのＶＬＰの安定性および機能性または有効性に関して有利であることが見出された（図１９）。前出で述べたように、増強された安定性および／または機能性もしくは有効性は、ＶＬＰを薬物送達システムとして使用する場合に特に望ましい。凍結防止添加剤を、工程ｄ）の組成物に添加することは、安定性および機能性または有効性に関して、工程ｆ）のパックされたＶＬＰに影響を有することは、驚くべきことであった。

凍結防止添加剤は、生物学的組織を、凍結損傷（すなわち、氷の形成に起因）から保護する目的を果たす。その凍結防止添加剤は通常、細胞における溶質濃度を増大させることによって機能する。しかし、生物学的使用に適切であるために、それらは容易に透過しなければならず、細胞に対して毒性であってはならない。従って、このような添加剤は、そのペンタマーおよび／またはＶＬＰにとってより温和な貯蔵条件を提供するために適している。凍結防止添加剤は、貯蔵のために凍結されるべきペンタマーおよび／またはＶＬＰを含む組成物に補充され得る。

本発明の特定の好ましい実施形態によれば、その凍結防止添加剤は、ＶＬＰ、好ましくはｒＶＬＰが２つの透析工程を使用してアセンブリされた（２工程再アセンブル）後のその後の凍結のために、ＶＬＰを含む組成物に添加される。

ポリオールベースの凍結防止添加剤を除く凍結防止添加剤の適切なモル濃度は、０．５Ｍ、０．６Ｍ、０．７Ｍ、０．８Ｍ、０．９Ｍ、１Ｍ、１．１Ｍ、１．２Ｍ、１．３Ｍ、１．４Ｍ、１．５Ｍ、２Ｍ、３Ｍ、４Ｍ、５Ｍであり得る。優先的には、これらの凍結防止添加剤は、約１Ｍのモル濃度で、好ましくは１Ｍのモル濃度で使用される。

そのポリオールベースの凍結防止添加剤は、少なくとも０．３Ｍ、少なくとも０．４Ｍ、少なくとも０．５Ｍ、少なくとも０．６Ｍ、少なくとも０．７Ｍ、少なくとも０．８Ｍ、少なくとも０．９Ｍ、少なくとも１Ｍ、少なくとも２Ｍまたは少なくとも３Ｍのモル濃度で使用され得る。好ましくは、そのポリオールベースの凍結防止添加剤、好ましくはグリセロール ５％は、約０．６Ｍ〜０．７Ｍの濃度で、より好ましくは０．６８Ｍの濃度で使用され得る。

あるいは、そのポリオールベースの凍結防止添加剤は、ペンタマーおよび／またはＶＬＰを含む組成物の容積％に基づいて添加され得る。適切な容積％は、３％（ｖ／ｖ）、４％（ｖ／ｖ）、５％（ｖ／ｖ）、６％（ｖ／ｖ）、７％（ｖ／ｖ）、８％（ｖ／ｖ）、９％（ｖ／ｖ）または１０％（ｖ／ｖ）を含む。優先的には、そのポリオールベースの凍結防止添加剤は、５％（ｖ／ｖ）において添加される。

本発明の好ましい実施形態において、工程ｃ）のペンタマーおよび／または工程ｄ）のＶＬＰは、精製を受ける。用語「精製（ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」とは、本発明の状況において、ＶＰ１、ペンタマーまたはＶＬＰを複雑な組成物から単離または分離することに言及する。考えられる方法としては、沈殿、好ましくは遠心分離、濾過（例えば、限外濾過および／もしくはクロスフロー濾過、好ましくはクロスフロー濾過）、クロマトグラフィー（例えば、分取用クロマトグラフィー、好ましくはサイズ排除クロマトグラフィーもしくはアフィニティークロマトグラフィー）、ならびに／または動的光散乱法（ＤＬＳ）が挙げられる。特に、そのＶＬＰは、ＤＬＳで選択され得る。Ｖｉｖａｓｐｉｎ（登録商標）は、使用され得る例示的濾過ユニットである。

用語「クロマトグラフィー（ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）」とは、固定相と移動相との間でその個々の構成要素を分布させることによって、物質の混合物の分離を可能にする方法をいう。特に、クロマトグラフィーとは、その目的の物質を定常相に先ず結合および富化し、その後第２の工程でそれを溶離する（クロマトグラフィーの結合および溶離モード）ことによって、または不純物をその定常相に結合させてその目的の分子の純度をフロースルーの中で増大させる（フロースルーモード）ことによって、物質を精製するための方法をいう。

クロマトグラフィーは、移動相の中に含まれる分析物と固定相との相互作用に基づくことに従ってグループに分けられ得る。本発明に従うクロマトグラフィーの好ましいタイプは、「逆相（ｒｅｖｅｒｓｅｄ ｐｈａｓｅ）」クロマトグラフィー、「イオン交換（ｉｏｎ−ｅｘｃｈａｎｇｅ）」クロマトグラフィー、「アフィニティー（ａｆｆｉｎｉｔｙ）」クロマトグラフィー、またはサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を包含する。イオン交換クロマトグラフィーの中でも、その精製方法は、固定相の中に存在する電荷に基づいて、カチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）（ここでその固定相は負電荷を有し、従って、正に荷電した分子を保持する）、およびアニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）（ここでその固定相は、正電荷を有し、従って、負に荷電した分子を保持する）へとさらに分けられ得る。

特に、クロマトグラフィーは、中間生成物として、本発明に従う方法によって得られるｒＶＬＰを精製するために使用され得る。特にＡＥＸは、ｒＶＬＰを精製するために使用され得る。

ＡＥＸにおいて使用される固定相は、固定相に存在する交換物質によって提供されるイオン性相互作用の強度に基づいて、「強アニオン交換体（ｓｔｒｏｎｇ ａｎｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅｒ）」および「弱アニオン交換体（ｗｅａｋ ａｎｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅｒ）」へとさらに記載され得る。表現「アニオン交換体（ａｎｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅｒ）」または「アニオン交換マトリクス（ａｎｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｍａｔｒｉｘ）」は類義語であり、ともに、アニオンに結合し得、アニオンに対してこれらを周りの媒体から交換し得る天然または人工の物質をいう。アニオン交換体は、陽イオンを有し、負に荷電した対イオンを交換する。

本発明のＶＬＰは、ヌクレアーゼでさらに処理され得る、および／または滅菌濾過に供され得る。ヌクレアーゼ処理は、好ましくは、核酸（例えば、発現ベクター）がカーゴとして使用される場合に行われる。種々のヌクレアーゼが当業者に公知であり、例えば、ベンゾナーゼが挙げられる。ヌクレアーゼは、ＶＬＰと会合されていない残りのＤＮＡを加水分解するために使用される。滅菌濾過に関する方法としては、とりわけ、ダイアフィルトレーションまたは不純物の除去に適したフィルタを使用する超遠心分離が挙げられる。これらの処理は、本発明のＶＬＰの臨床適用のために特に有利である。

本発明によるＶＬＰを含む組成物の粒度分布は、「多分散指数（Ｐｏｌｙ Ｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙ Ｉｎｄｅｘ）」（ＰＤＩ）として評価され得る。そのＰＤＩは、組成物中の粒度分布を示し、従って、粒子の均質性を記載する。ＰＤＩ値は、種々の方法（ゲル浸透クロマトグラフィー／サイズ排除クロマトグラフィー、レオロジー、溶液粘性、膜透過または光散乱法が挙げられる）を使用して得られ得る。

そのＰＤＩは、好ましくは動的光散乱法（ＤＬＳ）によって決定される。ＤＬＳでは、本来の分布は、どの程度の光を種々の「スライス（ｓｌｉｃｅ）」から散乱するかを示す強度分布である。ＤＬＳは、分布の統計から、平均サイズおよびこの平均サイズからの標準偏差の決定を可能にする。相対的多分散性は、その標準偏差を平均で除算することによって決定される。分布の相対的多分散性から、多分散指数（ＰＤＩ）は、その平方として導出され得る。ＤＬＳによって得られるＰＤＩ値は、単分散性の（ＰＤＩ＜０．１）組成物および多分散性の（ＰＤＩ＞０．１）組成物へとグループに分けられ得、それによって、その多分散性の群内ではまた、より小さな値は、その組成物内でのより均質な分布を示す。

本発明によれば、０．１〜０．４のＰＤＩ値は好ましい。より好ましくは，そのＰＤＩ値は、０．１〜０．３であり、さらにより好ましくは０．１〜０．２である。

本発明によるＶＬＰを含む組成物の平均直径は、視覚的方法（例えば、顕微鏡法（好ましくは平均直径を決定するためにソフトウェアが装備される））によって測定され得るが、分析的光散乱法（例えば、ＤＬＳ）またはナノトラッキング法（例えば、ＮＴＡ）によっても測定され得る。

その組成物内のＶＬＰ含有量は、例えば、ＦＦＦ−ＭＡＬＳおよび／またはＤＬＳによって測定され得る。両方の方法は、適切なサイズにされたＶＬＰおよび凝集物、「非常に小さいもの」（小粒子）と他の不純物（例えば、塩、デブリまたはペンタマー）との間を区別し得る。

本発明によるＶＬＰを含むこのような組成物は、特に、薬物送達システムに通常課される要件を満たす。明らかに、このような組成物は、均質でありかつ高純度を有する。

別の局面において、本発明は、本発明に従う方法によって得られ得る薬物送達システムに関する。このような薬物送達システムは、上記で述べられるとおりの利点を有する。特に、このような薬物送達システムは、治療および／または診断の方法において、好ましくは神経学的障害（すなわち、ＣＮＳ疾患、すなわちリソソーム蓄積症、特にＭＬＤ）の処置のために使用され得る。

よって、本発明はまた、障害（特にＣＮＳ疾患、すなわちリソソーム蓄積症、特にＭＬＤ）を本発明に従う薬物送達システムで処置するための方法に関する。処置する方法は、好ましくは、必要性のある被験体にその薬物送達を投与する工程を包含する。

本発明はまた、神経学的障害、すなわち、ＣＮＳ疾患、すなわちリソソーム蓄積症、特にＭＬＤの処置のための医薬の製造のための薬物送達システムの使用に関する。処置方法は、好ましくは、その処置されるべき被験体のＢＢＢの透過性を増大させる工程を包含しない。本発明の薬物送達システムは、好ましくは、ＢＢＢを損なうかまたは混乱させるためのいかなる化学的または物理的処置をも受けたことのない患者に投与される。

一実施形態において、本発明に従うＶＬＰは、血液脳関門（ＢＢＢ）を横断する。従って、本発明の一実施形態において、その薬物送達システムは、リソソーム酵素またはリソソーム酵素をコードする発現ベクターを、ＢＢＢを横断して送達するために使用され得る。本発明によれば、薬物送達システムおよび／またはＶＬＰおよび／またはリソソーム酵素および／またはリソソーム酵素をコードする発現ベクターは、ＢＢＢを横断し得る。

重要なことには、その薬物送達システムによるＢＢＢの横断は、その薬物送達システムが、脳内の特定の細胞集団を標的化するという機能を示すことを、すなわち、カーゴを標的化された細胞に送達することを可能にする。本発明の状況において、上記薬物送達システムは、標的化された細胞へのおよび／またはその中への送達を含む。

好ましい実施形態において、本発明のＶＬＰおよび／またはそのカーゴは、処置されるべき被験体、特にヒトへの投与後に、投与後に１０日間未満で、好ましくは５日間未満で、より好ましくは３日間未満で、ＣＮＳにおいて検出され得る。その薬物送達システムは、好ましくは、被験体に静脈内投与される。これは、そのＶＬＰを信頼性の高い薬物送達システムとして使用する場合に特に有利である。

好ましくは、その方法は、ＢＢＢの完全性の喪失または増大した透過性を要しない。

本発明によれば、その薬物送達システムを投与する前またはその間に、ＢＢＢの透過性を損なうことは必要とされない。従って、ＢＢＢは、好ましくは生理学的に無傷であり、これは、その完全性が低下されないおよび／またはその透過性が健康的な天然の状態と比較して増大されないことを意味する。本発明のＶＬＰは、好ましくは生理学的に無傷のＢＢＢを横断する。

その薬物送達システムを含む組成物は、好ましくは、ＢＢＢの完全性を混乱させ得る添加剤を要しない。よって、本発明の最も好ましい実施形態において、その薬物送達システムは、ＢＢＢの透過性に影響を及ぼし得るいかなる添加剤をも含まない。

材料および方法
ＶＬＰ製造
ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を、ヨトウムシ（ｆａｌｌ ａｒｍｙｗｏｒｍ）（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）に由来するＳｆ９昆虫細胞株（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用するタンパク質発現によって製造した。ＶＬＰを、その細胞にＪｏｈｎ Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍウイルス ＶＰ１タンパク質発現カセットを含む組換えバキュロウイルスを感染させることによって生成した。その組換えバキュロウイルスを、Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ（登録商標） Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ発現系（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用することによって調製した。ＶＬＰを、３．４Ｌ バイオリアクター（ＩＮＦＯＲＳ ＨＴ Ｍｉｎｉｆｏｒｓ）中での７〜１０日後に、ｐＨ６．３において生成した。空気流および温度（２６℃）をその時間にわたって制御した。細胞および細胞デブリを除去するために、懸濁物を、４℃、５．０００ｇで遠心分離し、そのＶＬＰを含む上清を採取した。

そのＶＬＰを、２つの異なる濃縮法：７．５％ ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）での沈殿またはAＫＴＡｃｒｏｓｓ ｆｌｏｗ^ＴＭシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でのクロスフロー、を使用して濃縮した。ＰＥＧ沈殿に関して、その清澄にされた上清を、ＰＥＧと混合して７．５％（ｖ／ｖ）を達成し、４℃において２時間にわたってインキュベートし、その後、その沈殿物を、４℃、１０．０００ｇでの遠心分離によって分離し、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５中で懸濁した。クロスフローを、３００ｋＤａカットオフ膜（Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ（登録商標） ３００ｋＤａ ＥＣＯ， Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を備えたAＫＴＡｃｒｏｓｓ ｆｌｏｗ^ＴＭシステムで行った。そのフロー限外濾過を１．５バールの一定圧および８倍（８Ｌの緩衝液に対して１Ｌの上清）で行った。

ＶＬＰを、室温において７０分間、５ｍＭ ＤＴＴおよび１０ｍＭ ＥＤＴＡを使用することによってペンタマーへとさらに解離し、そのペンタマーを、１５０ｍＭから１Ｍ ＮａＣｌへのＮａＣｌ段階的勾配でＨｉＳｃａｌｅ ＣａｐｔｏＱカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、アニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）によって精製した。ペンタマーを、２５０ｍＭ ＮａＣｌ工程で溶離した。溶離後、そのペンタマーを以下のとおり処理した：

２０ｋＤａカットオフを有する透析カセット（Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ^ＴＭ Ｇ２ Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｄｅｖｉｃｅ， Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）へと直ぐに配置し、透析（２工程透析）による２工程再アセンブルによって再アセンブルした。第１に、ペンタマーを、２Ｍ 硫酸アンモニウム緩衝液（「ＡＳ」、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２Ｍ （ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、ｐＨ７．５）に対して２４時間にわたって透析し、次いで、次の２４時間にわたって１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ_２、ｐＨ７．５（標準的再会合緩衝液、「ＳＴ」）に移した。再アセンブルされていない物質および凝集物をそのＶＬＰから分離するために、そのＶＬＰを含む組成物を、ＨｉＰｒｅｐ^ＴＭ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ（登録商標）Ｓ−５００ ＨＲカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ＺＳ Ｎａｎｏ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｃ．）を使用する動的光散乱法（ＤＬＳ）において画分の多分散指数（ＰＤＩ）の制御下で、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって精製した。標的化したサイズを有するＶＬＰ画分を選択およびプールし、次いで、適用可能である場合に５ｋＤａ カットオフ膜を有するＶｉｖａｓｐｉｎ（登録商標）濃縮器（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）中で濃縮し、続いて、−８０℃で貯蔵した。

乏突起膠細胞、ニューロンおよびミクログリア中でのＶＬＰの検出
１０μｍの薄いマウス脳スライドを、キシロールで、その後にエタノール濃度１００％から７０％へ、そして水で再水和した。内因性ペルオキシダーゼを０．５％ Ｈ_２Ｏ_２で不活性化した後、非特異的結合部位を、３％ ウシ血清アルブミン溶液でブロックした。ＶＰ１タンパク質を、ＶＰ１抗体（牛乳中１：５００希釈）で、蛍光結合体化二次抗体と組み合わせて検出した。脳細胞を、細胞特異的マーカーで染色した：
Ｏｌｉｇ２ -乏突起膠細胞（牛乳中１：２００希釈）
ＮｅｕＮ - ニューロン（牛乳中１：２００希釈）
ＩｂａＩ - ミクログリア細胞（牛乳中１：２００希釈）。
細胞核を、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２試薬（２μｇ／ｍｌ）で染色した。スライドを、蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ）で可視化した。

血液脳関門（ＢＢＢ）透過を検証するための人工ＢＢＢモデル
ＶＬＰのＢＢＢ透過を、２区画人工ＢＢＢモデルにおいて、透過性にした蛍光標識物質：４ｋＤａ ＦＩＴＣ−デキストラン、７０ｋＤａ ＴＲＩＴＣ−デキストラン、ＦＩＴＣ標識ｐＮＬ１．１プラスミド（構築物）またはＶＬＰへとパックしたＦＩＴＣ標識ｐＮＬ１．１プラスミド（パッケージング）の直接定量によって、単一培養物を使用することによって評価した。

その目的のために、２４ウェル透過可能支持体（挿入物、１μｍ、ＴｈｉｎＣｅｒｔ， Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ−Ｏｎｅ）を、９００μｌ 培地（ＤＭＥＭ／Ｆ−１２、ＨＥＰＥＳ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を満たした２４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ−Ｏｎｅ）へと移した。その後、７．５＊１０^４ ＢＢＢ細胞（ＨＢＥＣ−５ｉ， 脳微小血管内皮細胞）を、２００μｌのその同じ培地とともに挿入物へと播種した。細胞を、９６時間〜１２０時間にわたって、２日ごとにウェル中の培地を交換しながらインキュベートした。

その調製した挿入物を、１ウェルあたり９００μｌのフェノール非含有培地（ＤＭＥＭ／Ｆ−１２、ＨＥＰＥＳ、フェノールレッドなし、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で満たした新しい２４ウェルプレートへと注意深く移した。サンプルをその挿入物に添加する前に、各挿入物において２００μｌ 培地の一定量を維持するために、その相当する量の培地を除去した。インキュベーター中で、３７℃において１２０分間のインキュベーション後に、各ウェルの３×１００μｌを、黒色９６ウェルプレートに移し、そのサンプルの蛍光を、プレートリーダー（Ｔｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００， Ｔｅｃａｎ）を使用して決定した。

コムギ胚芽凝集素（ＷＧＡ）染色を、その細胞の膜を、室温において１５＋分間、Ａｌｅｘａ４８８と結合体化したＷＧＡに対する抗体で染色することによって行った。

ＢＢＢ形成を確認するために、そのＢＢＢを、ＥＤＴＡをその挿入物に添加することによって混乱させた。その挿入物を、新鮮なフェノール非含有培地を含む２４ウェルプレートに移した。ＥＤＴＡ（ｃＥｎｄ＝５ｍＭ、およそ５μｌ）を、その挿入物に添加し、９０分間、３７℃においてインキュベートした。その後、蛍光を上記で記載されるように決定した。透過を、ＢＢＢ細胞を有するその挿入物の蛍光シグナルを、ＢＢＢ細胞なしの適切な挿入物に対して正規化することによって計算した。その同じ様式で、そのＢＢＢの完全性を、ＥＤＴＡの添加後に検証した。

ｈＡＳＡをコードする発現ベクターのクローニング
発現ベクター：
１） ｐＦＡＲ−ＣＭＶ−ＡＳＡ（３．５ｋｂ）
２） ｐＦＡＲ−ＣＡＧ−ＡＳＡ（４．６ｋｂ）
３） ｐＮＬ−ＢＢ−ＡＳＡ（４．９ｋｂ）
４） ｐＳＦ−ＣＡＧ−ＡＳＡカット（３．１ｋｂ ＋ ３．７ｋｂ＊）

構築物１および構築物２を、ｐＦＡＲ４プラスミド骨格（米国特許第８，４４０，４５５ Ｂ２号の配列番号２１で開示されるとおりであり、本明細書では配列番号７として開示される）、それぞれ、ＣＭＶおよびＣＡＧプロモーター、ならびにヒトＡＳＡ遺伝子（配列番号２）から生成した。

構築物３（４．９ｋｂ）を生成するために、そのｈＡＳＡ遺伝子（配列番号２）を、ｐＮＬ１．１プラスミド骨格（Ｐｒｏｍｅｇａ）へとＧｉｂｓｏｎアセンブルを使用して挿入した。その構築物は、ＣＭＶプロモーターを含む。

構築物４（３．１ｋｂ ＋ ３．７ｋｂ）を生成するために、そのｈＡＳＡ遺伝子（配列番号２）をｐＳＦ−ＣＡＧプラスミド骨格（Ｏｘｆｏｒｄ ｇｅｎｅｔｉｃｓ）へと挿入し、次いで、２種の制限酵素の助けを借りて、ｈＡＳＡ発現ベクターの制限消化によって線状にした。

ｈＡＳＡをコードする発現ベクターを用いたＶＬＰのパッケージング
ｈＡＳＡ発現ベクターをＶＬＰへとパッケージングするために、予め再アセンブルした（ｐｒｅ−ｒｅａｓｓｅｍｂｌｅｄ）ＶＬＰを、−８０℃から取り出し、サーマルシェイカーを使用して融解した（２３℃、３５０ｒｐｍ）。その後、ＶＬＰを、そのサンプルを１５分間、２３℃および４５０ｒｐｍにおいて、解離緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＤＴＴ、および１０ｍＭ ＥＤＴＡ）の存在下でインキュベートすることによって解離した。解離したＶＬＰを、ｈＡＳＡ発現ベクターの存在下で再アセンブルした。簡潔には、その解離したＶＬＰを、適切な濃度（ＶＬＰ 対 発現構築物のパッケージング比は１：０．２）のｈＡＳＡ発現ベクターと徹底的に混合し、続いて、その混合物を標準的再会合緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ_２、ｐＨ７．５）に対して、２０ｋＤａ ＭＷＣＯ透析チャンバ（Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ^ＴＭ ＭＩＮＩ Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｄｅｖｉｃｅ， Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して透析した。サンプルを、１６〜１８時間インキュベートした。サンプルを、その透析チャンバから新たな反応カップへと移し、そのパックされていない核酸、すなわち、発現ベクターを、２５μｇ ＶＬＰあたり４０ ｕ Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標） Ｎｕｃｌｅａｓｅ（Ｍｅｒｃｋ）および２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２とともに３７℃において１時間インキュベートすることによって消化した。サンプルを濾過し（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標） Ｃｏｓｔａｒ（登録商標） Ｓｐｉｎ−Ｘ（登録商標）遠心分離チューブフィルタ；孔サイズ０．２２μｍ）、液体Ｎ_２中で凍結した。その後、ＶＬＰを分析した、および／または−８０℃で貯蔵した。

ＶＬＰ特徴付け
サンプル安定性を検証するために、各サンプルの変曲温度を、Ｔｙｃｈｏ ＮＴ．６（Ｎａｎｏｔｅｍｐｅｒ）を使用してｎＤＳＦによって評価した。

サンプル組成を分析するために、非対称的フローフィールドフローフラクショネーション（ＡＦ４， Ｗｙａｔｔ Ｉｎｃ．）を行った。サンプルを、多角度光散乱（ＭＡＬＳ）、動的光散乱（ＤＬＳ）およびＵＶ検出器を使用することによって分析した。

透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）分析を、そのサンプルを種々の実験工程で、８０ｋＶの電圧で作動するＺｅｉｓｓ ＥＭ９００電子顕微鏡の力を借りて、直接可視化するために行った。このアプローチのために、サンプルを、予め２％ 酢酸ウラニル（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して、カーボン被覆銅グリッド（Ｐｌａｎｏ ＧｍｂＨ）上で染色した。

細胞におけるｈＡＳＡ発現： ＲＮＡ単離、ｃＤＮＡ合成およびｑＰＣＲ
その細胞を７２時間、そのサンプル（すなわち、リソソーム酵素またはリソソーム酵素をコードする発現ベクターと会合したＶＬＰ）とともにインキュベートした後、膠芽腫細胞を、トリプシンを使用して採取し、ペレットにし、ＰＢＳを使用して洗浄した。

そのＲＮＡを、ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）を使用してその細胞ペレットから単離した。単離後、ＮａｎｏＤｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してＲＮＡ濃度を決定した。

ｃＤＮＡ合成のために、２５０ｎｇ ＲＮＡを使用した。その後、ｃＤＮＡサンプルをｄｄＨ_２Ｏ中で１：５希釈し、サンプルを、使用するまで−２０℃で貯蔵した。

ｑＰＣＲを、ＥｖａＧｒｅｅｎ Ｄｙｅおよび１：１０希釈においてｈＡＳＡの適切なプライマーを使用して、Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（ＣＦＸ９６ Ｔｏｕｃｈ， ＢｉｏＲａｄ）で行った。

マウスへのＶＬＰ／ｈＡＳＡの注射
動物： ＢＡＬＢ／ｃＪ雄性（Ｊａｎｖｉｅｒ Ｌａｂｓから提供、研究開始時に１０週齢）。
群：

その動物に、１８０μｌの試験化合物またはビヒクルを１回ｉ．ｖ．注射した。各処置群におけるマウスのうちの半分は、注射の７２時間後に終了させ、他方の半分は、注射の１２０時間後に終了させた。

終了時に、その動物を、Ｔｒｉｓ緩衝化生理食塩水で灌流し、以下の器官をサンプルとして採取した：脳、腎臓、肝臓、肺、心臓。組織サンプルを、液体Ｎ_２中で急速凍結させ、−８０℃で貯蔵した。

肝臓および脳のｑＰＣＲでのｍＲＮＡ分析
その組織の一部を、ＲＮＡｓｅを含む５００μｌ ＴＢＳ＋０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００中に置き、超音波処理３サイクル２０秒間（各々）でホモジナイズした。サンプルを、１０分間、１１．０００ｒｐｍにおいて遠心分離した。そのＲＮＡを、ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）を使用して組織から単離した。単離後、ＮａｎｏＤｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してＲＮＡ濃度を決定した。

ｃＤＮＡ合成のために、２５０ｎｇ ＲＮＡを使用した。その後、ｃＤＮＡサンプルをｄｄＨ_２Ｏ中で１：５希釈し、サンプルを、使用するまで−２０℃で貯蔵した。

ｑＰＣＲを、ＥｖａＧｒｅｅｎ Ｄｙｅおよび１：１０希釈においてｈＡＳＡの適切なプライマーを使用して、Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（ＣＦＸ９６ Ｔｏｕｃｈ， ＢｉｏＲａｄ）で行った。

ウェスタンブロット
その組織の一部を、５００μｌ ＴＢＳ＋０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００中に置き、超音波処理３サイクル２０秒間（各々）でホモジナイズした。サンプルを、１０分間、１１．０００ｒｐｍにおいて遠心分離し、タンパク質濃度を、ＢＣＡアッセイで測定した。各サンプル５０μｇを、ゲル（４〜２０％ 勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）へと配置し、標準的な電気泳動およびブロッティングプロトコルを行った。抗体染色（ｈＡＳＡ抗体、牛乳中１：５００希釈）を、緩衝液で洗浄し、５％牛乳中で一晩、４℃においてブロッキングした後に調製した。二次抗体染色を、ＨＲＰ結合体化ヤギ抗マウス抗体で行った。染色後に、その膜を緩衝液で洗浄し、発色させた。その膜を緩衝液で洗浄した後、ストリッピング緩衝液で除去し、アクチンコントロール染色のためにアクチン（１−１９）ＨＲＰ結合体化抗体（牛乳中１：１０００希釈）で染色した。

１．共局在分析は、乏突起膠細胞におけるＶＰ１タンパク質の存在を明らかにする
共局在実験を、ＶＬＰのそれぞれの標的細胞を同定するために行った。この目的のために、そのＶＰ１タンパク質は、マーカーＯｌｉｇ ２（これは、乏突起膠細胞上に特異的に位置する）と共局在した。図１の左下のパネルに示されるように、Ｏｌｉｇ２マーカーを使用することによって、いくつかの不規則なスポットが脳スライスで検出され得、これは、全ての場合において、核染色ＤＡＰＩによって染色され（図１の左上のパネル）、従って、乏突起膠細胞を示す。これら乏突起膠細胞の各々はまた、図１の右下のパネルに示されるように、ＶＰ１タンパク質に関して陽性である。Ｏｌｉｇ２およびＶＰ１に関して陽性である細胞を、白い矢印で示す。よって、そのＶＰ１タンパク質は、ＣＮＳの乏突起膠細胞に位置する。結果として、本発明のＶＬＰは、乏突起膠細胞と関連した疾患、例えば、ＭＬＤの治療的処置に得に適している。

２．共局在分析は、ニューロンにおけるＶＰ１タンパク質およびルシフェラーゼの存在を明らかにする。
別の共局在実験において、ＶＰ１タンパク質は、マーカーＮｅｕＮ（これは、ニューロンに特異的に位置する）と共局在した。図２の左下のパネルに示されるように、ＮｅｕＮマーカーを使用することによって、いくつかの不規則なスポットが脳スライスで検出され得、これは、全ての場合において、核染色ＤＡＰＩによって染色され（図２の左上のパネル）、従って、ニューロンを示す。これらニューロンの各々はまた、図２の右下のパネルに示されるように、ＶＰ１タンパク質に関して陽性である。ＮｅｕＮおよびＶＰ１に関して陽性である細胞を、白い矢印で示す。よって、ＶＰ１タンパク質は、ＣＮＳのニューロンに位置する。

３．共局在分析は、ミクログリア細胞におけるＶＰ１タンパク質およびルシフェラーゼの存在を明らかにする
別の共局在実験において、ＶＰ１タンパク質は、マーカーＩｂａ１（これは、ミクログリア細胞に特異的に位置する）と共局在した。図３の左下のパネルに示されるように、Ｉｂａ１マーカーを使用することによって、いくつかの不規則なスポットが脳スライスで検出され得、これは、全ての場合において、核染色ＤＡＰＩによって染色され（図３の左上のパネル）、従って、ミクログリア細胞を示す。これらミクログリア細胞の各々はまた、図３の右下のパネルに示されるように、ＶＰ１タンパク質に関して陽性である。Ｉｂａ１およびＶＰ１に関して陽性である細胞を、白い矢印で示す。よって、ＶＰ１タンパク質は、ＣＮＳのミクログリア細胞に位置する。

４．ｐＮＬプラスミドと会合したＶＬＰは、インビトロＢＢＢモデルにおいてＢＢＢを横断して良好な透過を示す
図４ＡおよびＢは、インビトロＢＢＢ透過モデルを示す。図４Ａは、細胞核のＤＡＰＩ染色（左）およびＢＢＢ細胞の細胞膜のＷＧＡ染色（右）を示す。細胞層は、無傷であり、無傷のＢＢＢを表す。

図４Ｂは、ＢＢBモデルを横断する、蛍光色素（ＦＩＴＣ、ＴＲＩＴＣ）、プラスミドに連結された蛍光色素（ＦＩＴＣ−ｐＮＬ）およびｐＮＬプラスミドと会合したＶＬＰの透過を示す。細胞なしの透過に対する％透過を示す。左の４つの棒は、ＥＤＴＡなしのサンプルであり、右の４つの棒は、ＥＤＴＡありのサンプルである。認められ得るように、全４種のサンプルは、人工ＢＢＢをある程度横断した一方で、ｐＮＬプラスミドと会合したＶＬＰを表すサンプル「パッケージング」は、最高の透過を示した。ＥＤＴＡによるＢＢＢの混乱は、全４種のサンプルに関してＢＢＢを開いた。

５．健康なマウスの脳におけるＡＳＡ ｍＲＮＡレベルの顕著な増大
ＡＳＡをコードする発現ベクターと会合したＶＬＰを注射した健康なマウスの肝臓および脳におけるｍＲＮＡ分析は、７２時間後および１２０時間後に脳におけるＡＳＡ ｍＲＮＡの顕著な増大を明らかにした（図５）。ＶＬＰなしの発現ベクター（プラスミド）の注射は、増大した発現をもたらさなかった。よって、発現は、脳において特異的に見出される。

６．脳におけるＡＳＡ ｍＲＮＡのそれぞれのマウス分析
ＡＳＡをコードする発現ベクターと会合したＶＬＰの注射の７２時間後（上）および１２０時間後（下）のそれぞれのマウス分析（図６）。数字は、それぞれのマウスを示す。これらの分析のうちのほぼ全てのマウスにおいて、増大したＡＳＡ発現が観察された。

７．脳におけるＡＳＡタンパク質のそれぞれのマウス分析
ＡＳＡをコードする発現ベクターと会合したＶＬＰの注射後の健康なマウスの脳におけるＡＳＡタンパク質のそれぞれのマウス分析（ウェスタンブロット、上）および相当するｑＰＣＲ分析（下）を、図７に示す。ビヒクル（緩衝液）、プラスミドおよびプラスミド ＋ ＶＬＰを比較する。そのＶＬＰとプラスミドとの会合が脳におけるＡＳＡの増大したｍＲＮＡおよびタンパク質発現をもたらすことは、明らかである。

８．種々のｈＡＳＡ発現構築物でのＡＳＡ発現
図８は、ｑＰＣＲによる、膠芽腫細胞におけるヒトＡＳＡの発現を示す。その値を、それぞれのプラスミドコントロールに対して正規化した。

図８Ａにおける発現ベクターは、以下のとおりである：
構築物１： ｐＦＡＲ−ＣＭＶ−ＡＳＡ（３．５ｋｂ）
構築物２： ｐＦＡＲ−ＣＡＧ−ＡＳＡ（４．６ｋｂ）
構築物３： ｐＮＬ−ＢＢ−ＡＳＡ（４．９ｋｂ）
構築物４： ｐＳＦ−ＣＡＧ−ＡＳＡカット（３．１ｋｂ ＋ ３．７ｋｂ＊）。

ＶＬＰ：プラスミドのパッケージング比は、１：０．２であった。全４種の発現ベクターは、ＡＳＡ発現をもたらす。

図８Ｂにおいて、Ａの構築物４（ｐＳＦ−ＣＡＧ−ＡＳＡカット（３．１ｋｂ ＋ ３．７ｋｂ＊））を、２種の異なるパッケージング比（高濃度 ［ＶＬＰ：プラスミドは１：０．５]および低濃度［ＶＬＰ：プラスミドは１：０．２］）において使用した。低濃度［ＶＬＰ：プラスミドのパッケージング比は１：０．２］は、より高いＡＳＡ発現をもたらすことが認められ得る。

９．種々のｈＡＳＡ発現構築物との会合後のＶＬＰ分析： ｎＤＳＦ分析およびＡＦ４分析
図９Ａは、ｎＤＳＦ分析によって、全４種のサンプル（図８Ａの発現ベクターと会合したＶＬＰ）が安定であることを示す。ＡＦ４分析（図９Ｂ）は、検出された粒子のうちの大部分がＶＬＰである、すなわち、そのＶＬＰは非常に均一であるという点において、ＶＬＰの画分が極小物、凝集物および残留物の画分より優れていることをさらに示す。

１０．発現ベクターと会合したＶＬＰのＴＥＭ画像
図１０は、パックされていないＶＬＰ（会合した発現ベクターなし）（左）および４種の異なる発現ベクターと会合したＶＬＰ（右；図８Ａとにおけるものと同じ発現ベクター）の比較を示す。認められ得るように、全サンプルは、そのパックされていないＶＬＰと実質的に同じであるＶＬＰを示す。

さらなる実施例のための材料および方法
ＶＬＰ製造
ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を、ヨトウムシ（ｆａｌｌ ａｒｍｙｗｏｒｍ）（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）に由来するＳｆ９昆虫細胞株（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用するタンパク質発現によって製造した。ＶＬＰを、その細胞にＪｏｈｎ Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍウイルス ＶＰ１タンパク質発現カセットを含む組換えバキュロウイルスを感染させることによって生成した。その組換えバキュロウイルスを、Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ（登録商標） Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ発現系（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用することによって調製した。ＶＬＰを、３．４Ｌ バイオリアクター（ＩＮＦＯＲＳ ＨＴ Ｍｉｎｉｆｏｒｓ）中での７〜１０日後に、ｐＨ６．３において生成した。空気流および温度（２６℃）をその時間にわたって制御した。細胞および細胞デブリを除去するために、懸濁物を、４℃、５．０００ｇで遠心分離し、そのＶＬＰを含む上清を採取した。

そのＶＬＰを、２つの異なる濃縮法：７．５％ ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）での沈殿またはAＫＴＡｃｒｏｓｓ ｆｌｏｗ^ＴＭシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でのクロスフロー、を使用して濃縮した。ＰＥＧ沈殿に関して、その清澄にされた上清を、ＰＥＧと混合して７．５％（ｖ／ｖ）を達成し、４℃において２時間にわたってインキュベートし、その後、その沈殿物を、４℃、１０．０００ｇでの遠心分離によって分離し、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５中で懸濁した。クロスフローを、３００ｋＤａカットオフ膜（Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ（登録商標） ３００ｋＤａ ＥＣＯ， Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を備えたAＫＴＡｃｒｏｓｓ ｆｌｏｗ^ＴＭシステムで行った。そのフロー限外濾過を１．５バールの一定圧および８倍（８Ｌの緩衝液に対して１Ｌの上清）で行った。

ＶＬＰを、室温において７０分間、５ｍＭ ＤＴＴおよび１０ｍＭ ＥＤＴＡを使用することによってペンタマーへとさらに解離し、そのペンタマーを、１５０ｍＭから１Ｍ ＮａＣｌへのＮａＣｌ段階的勾配でＨｉＳｃａｌｅ ＣａｐｔｏＱカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、アニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）によって精製した。ペンタマーを、２５０ｍＭ ＮａＣｌ工程で溶離した。溶離後、そのペンタマーを以下のとおり処理した：
ａ） カーゴと混合し、再アセンブルした（「カーゴでの新鮮なまたは貯蔵したペンタマーのパッケージング」を参照のこと）；
ｂ） ペンタマーの貯蔵のために５％ グリセロールとともに−８０℃で凍結した（これをその後、カーゴと混合および再アセンブルされ得る。「カーゴでの新鮮なまたは貯蔵したペンタマーのパッケージング」を参照のこと）または
ｃ） ２０ｋＤａカットオフを有する透析カセット（Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ^ＴＭ
Ｇ２ Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｄｅｖｉｃｅ， Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）へと直ぐに配置し、透析（２工程透析）による２工程再アセンブルによって再アセンブルした。第１に、ペンタマーを、２Ｍ 硫酸アンモニウム緩衝液（「ＡＳ」、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２Ｍ （ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、ｐＨ７．５）に対して２４時間にわたって透析し、次いで、次の２４時間にわたって１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ_２、ｐＨ７．５（標準的再会合緩衝液、「ＳＴ」）に移した（ＡＳ＞ＳＴ）。あるいは、その２工程透析を、ＳＴ緩衝液で、両方の工程において行った（ＳＴ＞ＳＴ）。両方の場合に、アセンブリされていない物質および凝集物をそのＶＬＰから分離するために、そのＶＬＰを含む組成物を、ＨｉＰｒｅｐ^ＴＭ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ（登録商標）Ｓ−５００ ＨＲカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ＺＳ Ｎａｎｏ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｃ．）を使用する動的光散乱法（ＤＬＳ）において画分の多分散指数（ＰＤＩ）の制御下で、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって精製した。標的化したサイズを有するＶＬＰ画分を選択およびプールし、次いで、適用可能である場合に５ｋＤａ カットオフ膜を有するＶｉｖａｓｐｉｎ（登録商標）濃縮器（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）中で濃縮し、続いて、−８０℃で貯蔵した。

カーゴでの再アセンブルしたＶＬＰのパッケージング
再アセンブルしたＶＬＰのＶＬＰパッケージングのために、上記の工程ｃ）の貯蔵したＶＬＰを−８０℃から取り出し、サーマルシェイカー（２３℃、３５０ｒｐｍ）を使用して融解した。その後、融解したＶＬＰサンプルの解離を、解離緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＤＴＴ、および１０ｍＭ ＥＤＴＡ）の存在下で、２３℃および４５ｒｐｍにおいて１５分間そのサンプルをインキュベートすることによって行った。解離したＶＬＰを、カーゴ（例えば、核酸）の存在下で再アセンブルした。簡潔には、その解離したＶＬＰを、適切な濃度のカーゴと徹底的に混合し、続いて、その混合物を、２０ｋＤａ ＭＷＣＯ透析チャンバ（Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ^ＴＭ ＭＩＮＩ Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｄｅｖｉｃｅ， Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して標準的な再会合緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ_２、ｐＨ７．５）に対して透析した。４〜６時間後、透析緩衝液を、新鮮な透析緩衝液に交換し、サンプルをさらに１６〜１８時間インキュベートした。核酸をカーゴとして使用する場合、パックされていない核酸を、２５μｇ ＶＬＰおよび２．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２につき、３７℃において１時間、４０ ｕ Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標） Ｎｕｃｌｅａｓｅ（Ｍｅｒｃｋ）とインキュベートすることによって消化した。サンプルを、透析する前に濾過した（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標） Ｃｏｓｔａｒ（登録商標） Ｓｐｉｎ−Ｘ（登録商標）遠心分離チューブフィルタ；孔サイズ０．２２μｍ）。ＶＬＰを、その後直接分析し、そして／または−８０℃で貯蔵した。

カーゴでの新鮮なまたは貯蔵したペンタマーのパッケージング
ペンタマーパッケージングのために、新鮮なまたは−８０℃で貯蔵したペンタマーを直接混合し、カーゴで再アセンブルしたか、またはサーマルシェイカー（２３℃、３５０ｒｐｍ）を使用して融解し、次いで、カーゴ（例えば、核酸）の存在下で再アセンブルした。簡潔には、そのペンタマーを、適切な濃度のカーゴと徹底的に混合し、続いて、その混合物を、２０ｋＤａ ＭＷＣＯ透析チャンバ（Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ^ＴＭ ＭＩＮＩ Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｄｅｖｉｃｅ， Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して標準的な再会合緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ_２、ｐＨ７．５）に対して透析した。核酸をカーゴとして使用する場合、パックされていない核酸を、２５μｇ 再アセンブルＶＬＰおよび２．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２につき、３７℃において１時間、４０ ｕ Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標） Ｎｕｃｌｅａｓｅ（Ｍｅｒｃｋ）とインキュベートすることによって消化した。再アセンブルしたペンタマーを、その後直接分析した。

ＶＬＰの機能性試験／ルシフェラーゼアッセイ
核酸に装填したＶＬＰの場合（新鮮なまたは貯蔵したペンタマーから；または再アセンブルおよび精製したＶＬＰから製造）、ルシフェラーゼ ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）プラスミドを、カーゴとして使用した。膠芽腫細胞を、予め、１０％ ＦＣＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）および１％ Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ（ＰＡＮ−Ｂｉｏｔｅｃｈ）を補充した９００μｌ ＤＭＥＭ培地、高グルコース、ＧｕｔａＭＡＸ^ＴＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）中に、３×１０^４の密度で２４時間播種した。そのサンプルを添加する前に、その相当する量の培地を、各ウェル中の一定量の培地を維持するために除去した。サンプルをその細胞に添加し、３７℃および５％ ＣＯ_２において４８時間インキュベートした。その後、細胞培地を排除し、細胞をＰＢＳで洗浄した。ルシフェラーゼ活性を、製造業者の説明書に従って決定した（ＮａｎｏＧｌｏ（登録商標） Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ））。Ｇｌｏｍａｘ（登録商標）マルチ検出システム（Ｐｒｏｍｅｇａ）において、白色９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ−ｏｎｅ）中でルミネッセンスを測定した。

ＶＬＰ特徴付け
サンプル解離を堅守するために、サンプルの再アセンブルおよび安定性、動的光散乱法（ＤＬＳ）および多分散指数（ＰＤＩ）を、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ．）を使用して測定した。そのＶＬＰサイズおよびＰＤＩを、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（バージョン７．１１， Ｍａｌｖｅｒｎ）で記録した。さらに、各サンプルの屈折温度を、Ｔｙｃｈｏ ＮＴ．６（Ｎａｎｏｔｅｍｐｅｒ）を使用してｎＤＳＦによって評価した。

サンプル組成を分析するために、非対称フローフィールドフローフラクショネーション（ＡＦ４， Ｗｙａｔｔ Ｉｎｃ．）を行った。サンプルを、多角度光散乱法（ＭＡＬＳ）、動的光散乱法（ＤＬＳ）およびＵＶ検出器を使用することによって分析した。

透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）分析を、８０ｋＶの電圧で作動するＺｅｉｓｓ ＥＭ９００電子顕微鏡の助けを借りて、種々の実験工程においてそのサンプルを直接可視化するために行った。このアプローチのために、サンプルを、予め２％ 酢酸ウラニル（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して、炭素被覆銅グリッド（Ｐｌａｎｏ ＧｍｂＨ）の上で染色した。

血液脳関門（ＢＢＢ）透過を検証するための人工ＢＢＢモデル
ＶＬＰのＢＢＢ透過を、２区画人工ＢＢＢモデルにおいて、単一培養物（透過性にした蛍光標識物質の直接定量）または共培養物（標的細胞における透過した物質によって引き起こされるタンパク質発現）のいずれかを使用することによって評価した。

両方の場合に、２４ウェル透過可能支持体（挿入物、０．４μｍ、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ）を、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中の１：２０ フィブロネクチン（ＢｉｏＲｅａｇｅｎｔ）および１：７５ Ｉ型コラーゲン（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の混合物で、３７℃において９０分間、予め被覆した。過剰な被覆を注意深く除去した後、被覆した挿入物を、９００μｌ 培地（ＥｎｄｏＧＲＯ， ＳＣＭＥ００４， Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を満たした新たな２４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ−Ｏｎｅ）へと移した。７．５×１０^４ ＢＢＢ細胞（ＨＢＥＣ−５ｉ， 脳毛細血管内皮細胞）を２００μｌ 培地とともにその挿入物へと播種した。細胞を、９６時間〜１２０時間にわたって、そのウェル中の培地を２日ごとに交換しながらインキュベートした。

単一培養物実験（蛍光標識カーゴの透過）
その調製した挿入物を、１ウェルあたり９００μｌのフェノール非含有培地（ＤＭＥＭ／Ｆ−１２、ＨＥＰＥＳ、フェノールレッドなし、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を満たした新たな２４ウェルプレートに注意深く移した。サンプルをその挿入物に添加する前に、各挿入物において２００μｌ 培地の一定量を維持するために、その相当する量の培地を除去した。インキュベーター中で、３７℃において１２０分間のインキュベーション後に、各ウェルの３×１００μｌを、黒色９６ウェルプレートに移し、そのサンプルの蛍光を、プレートリーダー（Ｔｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００， Ｔｅｃａｎ）を使用して決定した。

ＢＢＢ形成を確認するために、そのＢＢＢを、ＥＤＴＡをその挿入物に添加することによって混乱させた。その挿入物を、新鮮なフェノール非含有培地を含む２４ウェルプレートに移した。ＥＤＴＡ（ｃ_Ｅｎｄ＝５ｍＭ、およそ５μｌ）を、その挿入物に添加し、９０分間、３７℃においてインキュベートした。その後、蛍光を上記で記載されるように決定した。

透過を、ＢＢＢ細胞を有するその挿入物の蛍光シグナルを、ＢＢＢ細胞なしの適切な挿入物に対して正規化することによって計算した。その同じ様式で、そのＢＢＢの完全性を、ＥＤＴＡの添加後に検証した。

共培養物実験（透過した物質の活性）
挿入物を、標的細胞（膠芽腫細胞）を含む、１０％ ＦＣＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）および１％ Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ（ＰＡＮ−Ｂｉｏｔｅｃｈ）を補充した９００μｌ ＤＭＥＭ、高グルコース、ＧｕｔａＭＡＸ^ＴＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）中、３×１０^４の密度で予め２４時間播種した新たな２４ウェルプレートに移した。そのサンプル（ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）プラスミドでパックされたＶＬＰ）をその挿入物に添加する前に、各挿入物において２００μｌ 培地の一定量を維持するために、その相当する量の培地を除去した。２４時間後に、その挿入物を、その２４ウェルプレートから除去し、ＰＢＳで洗浄した。応じて、その膜（ＢＢＢ細胞を有する）を外科用メスを使用して切断し、１．５ｍｌ 反応バイアルに移した。ルシフェラーゼ活性を、その製造業者の説明書に従って決定した（ＮａｎｏＧｌｏ（登録商標） Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ））。

そのウェル（その標的細胞を含む）を、さらに２４時間、ルシフェラーゼアッセイをその製造業者の説明書に従って行う前に、インキュベートした（ＮａｎｏＧｌｏ（登録商標） Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ））。

低温保護を伴う貯蔵
各凍結防止添加剤であるグリセロール（Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ）、スクロース（Ｃａｒｌ
Ｒｏｔｈ）、硫酸アンモニウム（Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ）、ＤＭＳＯ（Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ）およびベタイン（Ｍｅｒｃｋ）を、０．６８Ｍに相当する５％（ｖ／ｖ）でのグリセロールを除いて、最終添加剤濃度１Ｍを生じるように、ＶＬＰに添加した。さらに、１つのアリコートは、添加剤物質を含まなかった（ｗ／ｏ）。そのサンプルを分割し、２つの凍結速度を適用することによって凍結した： 各サンプルの１／２を、およそ−１℃／分の冷却速度で凍結した（遅い凍結）一方で、その２／２を、その容器を液体窒素へと漬けることによって迅速に凍結した（迅速凍結）。全てのサンプルを−８０℃において１〜１０日間の貯蔵期間で貯蔵した。２３℃での融解および３５０ｒｐｍでの振盪後に、そのサンプルを、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ_２、ｐＨ ７．５に対して、室温において２時間透析して、添加剤濃度および分析結果に対するそれらの影響を低減させた。粒子直径およびＰＤＩを、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏｓｅｒｉｅｓ（Ｍａｌｖｅｒｎ）によって決定した。屈折温度を、Ｔｙｃｈｏ ＮＴ．６（Ｎａｎｏｔｅｍｐｅｒ）を使用して測定した。貯蔵後のＶＬＰ機能性を、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）プラスミドパッケージングおよびその後のＮａｎｏＧｌｏ（登録商標） Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）の助けを借りて証明した。
さらなる実施例

実施例１１：機能分析
ＶＬＰの有効性を送達するカーゴ（これを、種々の方法を使用して調製した）を比較した（図１１）。この目的のために、２ラウンドの脱アセンブルおよびその後の再アセンブルまたは１ラウンドの脱アセンブルおよびその後の再アセンブル（両方の方法において、ルシフェラーゼプラスミドの存在下で最後の再アセンブル）を受けたＶＬＰを生成した。顕著なことには、２ラウンドの脱アセンブルおよびその後の再アセンブルを受けたＶＬＰのルシフェラーゼ活性は、１ラウンドの脱アセンブルおよびその後の再アセンブルを受けたＶＬＰと比較して、および「プラスミドのみ」および「細胞のみ」のコントロールと比較して、有意に増大した。

次に、２回の脱アセンブル工程およびその後の再アセンブル工程により調製されたＶＬＰが血液脳関門（ＢＢＢ）を透過する能力を分析した（図１２）。図１２Ａは、単一培養物設定においてＶＬＰもしくはプラスミド（丸）によってＢＢＢ透過を試験する人工血液脳関門（ＢＢＢ）モデルの設定を示す。ヒト脳内皮細胞（ＢＢＢ細胞、ＨＢＥＣ−５ｉ）を、透過可能な支持体上にプレートした。図１２Ｂは、「プラスミドのみ」のコントロールと比較して、２ラウンドの脱アセンブルおよびその後の再アセンブル（蛍光標識プラスミドの存在下での第２の再アセンブル）を受けたＶＬＰの透過性を示す。黒い棒は、無傷のＢＢＢでの実験を表す。白い棒は、人工的に混乱させたＢＢＢ（ＥＤＴＡの添加によって）での実験を表す。顕著なことには、２回の脱アセンブル工程およびその後の再アセンブル工程により調製されたＶＬＰは、裸のプラスミドより有意に大きな比でＢＢＢを横断する能力があった。ＢＢＢ層の完全性の混乱は、この差異を破壊し、２回の脱アセンブル工程およびその後の再アセンブル工程により調製されたＶＬＰの選択的で効率的な透過能力を示す。

２回の脱アセンブル工程およびその後の再アセンブル工程により生成されたＶＬＰの有効性の、標的細胞への送達を評価するために、共培養ＢＢＢモデルを使用した（図１３）。図１３Ａは、ＶＬＰまたはプラスミド（丸）によるＢＢＢ透過および共培養設定において標的細胞の中に透過した物質によって引き起こされるその後のタンパク質発現を試験するために、人工ＢＢＢモデルの設定を示す。図１３Ｂは、挿入物に存在するＢＢＢ細胞において（ＨＢＥＣ−５ｉ細胞において）測定されたルシフェラーゼ活性および透過後の標的細胞におけるルシフェラーゼ活性を示す。人工ＢＢＢ（「被覆＋ＢＢＢ細胞」）およびＢＢＢ細胞なしの被覆（「被覆のみ」）を試験した。その挿入物の細胞のルシフェラーゼ活性は、細胞が存在する場合に（従って、「被覆のみ」サンプルが予測されるようにいかなるルシフェラーゼ活性をも示さなかった）およびルシフェラーゼプラスミドが２回の脱アセンブル工程およびその後の再アセンブル工程により調製されたＶＬＰへとパックされた場合に（プラスミドのみと比較して）のみ測定された。その標的細胞のルシフェラーゼ活性はまた、ＢＢＢ細胞層が存在するかまたは被覆のみかに関係なく、２回の脱アセンブル工程およびその後の再アセンブル工程により調製されたＶＬＰを有するサンプル中でのみ（プラスミドのみと比較して）測定された。

従って、２回の脱アセンブル工程およびその後の再アセンブル工程により調製されたＶＬＰは、高感染性およびカーゴ送達能力を保持すると同時に、ＢＢＢを効率的に通過する能力がある。サンプル（パックされた）は、２ラウンドの脱アセンブルおよびその後の再アセンブル（ルシフェラーゼプラスミドの存在下での第２の再アセンブル）を受けたＶＬＰを意味する。

実施例１２： ペンタマーの貯蔵 対 ＶＬＰの貯蔵
種々の貯蔵手順を受けた標識ＶＬＰを含む組成物の均質性および均質性を調査するために、透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）を行った。１ラウンドの脱アセンブルおよびその後の再アセンブルで生成されたＶＬＰ（凍結されたペンタマー、左）を、２ラウンドの脱アセンブルおよびその後の再アセンブルで生成されたＶＬＰ（凍結されたＶＬＰ、右）と比較した（図１４）。後者の場合に生成されたＶＬＰは、顕著により均質な分布を示した。なぜならそれらは、そのペンタマーが製造の間に凍結されたＶＬＰと比較した場合に、いかなる目に見える欠損性ウイルス粒子をも欠いたからである。

図１４におけるように生成された装填ＶＬＰの均質性をさらに調査するために、ＦＦＦ−ＭＡＬＳ分析を行った（図１５）。両方のサンプルを、参照として働く新鮮に調製したＶＬＰ（カーゴなし、従って、脱アセンブル／再アセンブルなし）と比較した。顕著なことには、参照（図１５Ｃ）と比較すると、ＶＬＰの中間凍結を伴う２ラウンドの脱アセンブルおよびその後の再アセンブル後に生成されたＶＬＰ（図１５Ａ）は、その組成物中に存在するＶＬＰ凝集物の量を顕著に低減した。さらに、ＶＬＰの分布は、さらにより均質であった。そのＶＬＰのサイズならびに「非常に小さいもの」および「塩、デブリ、ペンタマー」の存在は、匹敵していた。

顕著なことには、ＶＬＰが１ラウンドの脱アセンブルおよびその後の再アセンブル（凍結されたペンタマー）後に生成された場合、構造的に無傷のＶＬＰはほとんど同定できなかった（図５Ｂ）。従って、２回の脱アセンブル工程およびその後の再アセンブル工程による方法は、再アセンブルされたＶＬＰとしてのＶＬＰの中間貯蔵およびほとんど凝集物のない装填ＶＬＰの非常に均質な集団の生成を可能にする。パーセンテージを、凝集物を除いて示す。

ＶＬＰの中間凍結（「サンプル（パックされた）」、実線）を、新鮮に調製したＶＬＰ（カーゴなし、従って、脱アセンブル／再アセンブルなし「サンプル（ｗｔ）」、破線）と比較して２ラウンドの脱アセンブルおよびその後の再アセンブル後に生成されたＶＬＰの安定性をさらに特徴づけるために、ｎＤＳＦ分析を、融解温度（屈折温度）を明らかにするために行った（図１６）。顕著なことには、両方のＶＬＰサンプルの融解曲線は、ほぼ区別可能でなく、２回の脱アセンブル工程およびその後の再アセンブル工程により調製されたＶＬＰが新鮮に調製したＶＬＰと等しく安定であることを示す。

実施例１３：再アセンブル前に凝集を誘導する
次に、ペンタマーをＶＬＰへと再アセンブルする間に凝集を誘導する効果を測定した。ＤＬＳによって均質性を分析した（図１７および図１８）。図１７は、凝集の誘導あり（白い棒）および凝集の誘導なし（黒い棒）の透析後に得られたＶＬＰのＰＤＩを示す。第１の凝集の誘導によって再アセンブルされたＶＬＰは、凝集の誘導なしで再アセンブルされたＶＬＰと比較して、強く低減したＰＤＩを示した。従って、再アセンブルの間の凝集の誘導は、遙かにより均質なサイズ分布をもたらした。両方のサンプルを、凍結する前に採取した（従って、それらは１ラウンドの脱アセンブルおよび再アセンブルを受けた）。

図１８は、図１７におけるように調製されたサンプル（図１８、左）およびその後の凍結工程を除いて同じ再アセンブル条件を受けたサンプル（図１８、右）のＤＬＳによって決定した平均サイズ分布を示す。凝集の誘導ありで再アセンブルした両方のサンプル（実線）は、非常に均質なサイズ分布を示す一方で、凝集工程を受けなかったサンプル（破線）は、少なくとも２つのＶＬＰ集団を示す。さらには、その凍結工程は、後者のサンプルにとって明らかに有害であった。なぜなら凝集の誘導なしで再アセンブルされたＶＬＰを含む組成物は、凍結後にかなりより不均質になったからである。しかし、凝集の誘導ありで再アセンブルされたＶＬＰは、そのサンプルの均質性に何ら影響なく凍結できた。

実施例１４：凍結防止添加剤の効果
ＶＬＰに対するサンプル貯蔵の効果をさらに綿密に調べるために、種々の凍結防止添加剤を、１ラウンドの脱アセンブルおよびその後の再アセンブル、ならびにＡＳ緩衝液を含む２回の透析工程（再アセンブルの間の凝集の誘導のため）後に凍結したＶＬＰを含む組成物に添加した（図１９）。図１９Ａは、ｎＤＳＦによって分析した場合に示されるように貯蔵された装填ＶＬＰの安定性を示す。顕著なことには、硫酸アンモニウムを含む緩衝液中に貯蔵されたＶＬＰは、他の凍結防止添加剤と比較して、かなりより安定した（すなわち、より高い屈折温度を示す）。興味深いことには、この効果は、そのＶＬＰが迅速に凍結されたか（黒い棒）またはゆっくりと凍結されたか（点付きの棒）に関わらず無関係であった。

次の工程において、これらのサンプルを、ルシフェラーゼアッセイにおいて使用した（図１９Ｂ）。予測外なことには、そのルシフェラーゼ活性は、硫酸アンモニウムを含む組成物中に貯蔵されたＶＬＰによって強力に増大された。ベタインはまた、凍結防止添加剤なしのサンプルおよび他の試験した凍結防止添加剤と比較した場合に有利であった。従って、凍結防止添加剤、特に硫酸アンモニウムの使用は、ＶＬＰの安定性をかなり増大させ、その装填ＶＬＰの感染性およびカーゴ送達有効性を増大させた。繰り返すと、この効果は、そのＶＬＰが迅速に凍結されたか（黒い棒）またはゆっくりと凍結されたか（白い棒）に関わらず無関係であった。

実施形態
１．被験体におけるリソソーム蓄積症を処置するための方法における使用のためのリソソーム酵素またはリソソーム酵素をコードする発現ベクターと会合したＶＬＰ。

２．上記ＶＬＰは、ウイルス遺伝物質を含まず、上記発現ベクターはウイルスタンパク質をコードしない、実施形態１に記載の使用のためのＶＬＰ。

３．上記被験体は、動物またはヒト、好ましくはヒトである、実施形態１または２に記載の使用のためのＶＬＰ。

４．上記被験体は、神経学的欠損を有する、上述の実施形態のうちのいずれかに記載の使用のためのＶＬＰ。

５．上記リソソーム酵素はヒト酵素である、上述の実施形態のうちのいずれかに記載の使用のためのＶＬＰ。

６．上記リソソーム酵素はアリールスルファターゼＡである、上述の実施形態のうちのいずれかに記載の使用のためのＶＬＰ。

７．上記リソソーム酵素は、配列番号１に従うアミノ酸配列とその全長にわたって少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％同一であり、好ましくは配列番号１のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む、上述の実施形態のうちのいずれかに記載の使用のためのＶＬＰ。

８．上記リソソーム蓄積症は異染性白質ジストロフィー（ＭＬＤ）である、上述の実施形態のうちのいずれかに記載の使用のためのＶＬＰ。

９．上記発現ベクターは、７ｋｂ未満、好ましくは６ｋｂ未満のサイズを有する、上述の実施形態のうちのいずれかに記載の使用のためのＶＬＰ。

１０．上記発現ベクターは、ＣＭＶおよびＣＡＧを含む群から選択されるプロモーターを有する、上述の実施形態のうちのいずれかに記載の使用のためのＶＬＰ。

１１．上記リソソーム酵素は、配列番号２のヌクレオチド配列とその全長にわたって少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％同一である、好ましくは配列番号２のヌクレオチド配列であるヌクレオチド配列を含む、上述の実施形態のうちのいずれかに記載の使用のためのＶＬＰ。

１２．上記ＶＬＰは、ヒトポリオーマウイルス、好ましくはＪＣＶに由来する、上述の実施形態のうちのいずれかに記載の使用のためのＶＬＰ。

１３．上記ＶＬＰは、血液脳関門を、好ましくは生理学的に無傷の血液脳関門を横断して、上記リソソーム酵素または上記発現ベクターと一緒にＣＮＳに入る、上述の実施形態のうちのいずれかに記載の使用のためのＶＬＰ。

１４．上記リソソーム酵素または上記発現ベクターは、星状細胞、乏突起膠細胞、ミクログリアまたはニューロン、好ましくは乏突起膠細胞に入る、実施形態１３に記載のＶＬＰ。

１５．上記ＶＬＰは、経口的にまたは非経口的に、好ましくは静脈内に投与される、上述の実施形態のうちのいずれかに記載の使用のためのＶＬＰ。

１６．標的細胞は、有効量のリソソーム酵素と接触される、上述の実施形態のうちのいずれかに記載の使用のためのＶＬＰ。

１７．上記リソソーム酵素は、少なくとも１０日間、好ましくは少なくとも２０日間、より好ましくは少なくとも３０日間にわたって、治療上有効な酵素活性を有する、上述の実施形態のうちのいずれかに記載の使用のためのＶＬＰ。

１８．上記ＶＬＰは、ＪＣウイルスのＶＰ１タンパク質から構成される、上述の実施形態のうちのいずれかに記載の使用のためのＶＬＰ。

１９．上記ＶＰ１タンパク質は、配列番号３に従うアミノ酸配列とその全長にわたって少なくとも８０％同一である、好ましくは少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態１８に記載のＶＬＰ。

２０．被験体におけるリソソーム蓄積症を処置するための方法における使用のための薬学的組成物であって、ここで上記薬学的組成物は、実施形態１〜１９のいずれか１つに記載のＶＬＰ、ならびに薬学的に受容可能なキャリア、および／または賦形剤を含む、薬学的組成物。

２１．リソソーム酵素、好ましくはヒトアリールスルファターゼＡをコードするコード領域、ＣＡＧおよびＣＭＶを含む群から選択され、好ましくはＣＡＧであるプロモーターを有し、７ｋｂ未満、好ましくは６ｋｂ未満のサイズを有する、発現ベクター。

２２．上記リソソーム酵素は、配列番号２のヌクレオチド配列とその全長にわたって少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％同一である、好ましくは配列番号２のヌクレオチド配列であるヌクレオチド配列を含む、実施形態２１に記載の発現ベクター。

２３．ＶＬＰを、リソソーム酵素、好ましくはヒトアリールスルファターゼＡ、またはリソソーム酵素、好ましくはヒトアリールスルファターゼＡをコードする発現ベクターと会合させるための方法であって、ここで上記方法は、以下の工程：
ａ） ＶＰ１タンパク質を含む組成物を提供する工程
ｂ） 上記ａ）の組成物のＶＰ１タンパク質を、上記ＶＰ１を誘導する条件に曝して、ＶＬＰへとアセンブルする工程、
ｃ） 上記ｂ）の組成物のＶＬＰを、上記ＶＬＰをペンタマーへと脱アセンブルする条件に曝す工程、
ｄ） 上記ｃ）の組成物のペンタマーを、上記ペンタマーを誘導する条件に曝して、ＶＬＰへと再アセンブルする工程、
ｅ） 上記ｄ）の組成物のＶＬＰを、上記ＶＬＰをペンタマーへと脱アセンブルする条件に曝す工程、
ｆ） 上記ｅ）の組成物のペンタマーを、上記リソソーム酵素または該発現ベクターに、上記ペンタマーを誘導する条件下に曝して、上記リソソーム酵素または上記発現ベクターと会合したＶＬＰへとアセンブルする工程、
を包含する方法。

２４．実施形態２３に記載の方法によって得られ得る、ＶＬＰ。

Claims (32)

1. 被験体において異染性白質ジストロフィー（ＭＬＤ）を処置するための方法における使用のための、リソソーム酵素を組み込むかまたはリソソーム酵素をコードする発現ベクターを組み込むＶＬＰを含む組成物であって、ここで該ＶＬＰは、ＪＣＶに由来する、組成物。
2. 前記ＶＬＰは、ウイルス遺伝物質を含まず、前記発現ベクターは、ウイルスタンパク質をコードしない、請求項１に記載の組成物。
3. 前記被験体は、動物またはヒトであり、好ましくはヒトである、請求項１または２に記載の組成物。
4. 前記被験体は、神経学的欠損を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
5. 前記リソソーム酵素は、ヒト酵素である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
6. 前記リソソーム酵素は、アリールスルファターゼＡである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
7. 前記リソソーム酵素は、配列番号１に従うアミノ酸配列とその全長にわたって少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％同一である、最も好ましくは配列番号１のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
8. 前記発現ベクターは、７ｋｂ未満、好ましくは６ｋｂ未満のサイズを有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
9. 前記発現ベクターは、ＣＭＶおよびＣＡＧを含む群から選択されるプロモーターを有する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
10. 前記リソソーム酵素は、配列番号２のヌクレオチド配列とその全長にわたって少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％同一である、好ましくは配列番号２のヌクレオチド配列であるヌクレオチド配列を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
11. 前記ＶＬＰは、血液脳関門を、好ましくは生理学的に無傷の血液脳関門を横断して、前記リソソーム酵素または前記発現ベクターと一緒にＣＮＳに入る、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
12. 前記リソソーム酵素または前記発現ベクターは、星状細胞、乏突起膠細胞、ミクログリアまたはニューロン、好ましくは乏突起膠細胞に入る、請求項１１に記載の組成物。
13. 前記組成物は、経口的にまたは非経口的に、好ましくは静脈内に投与される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
14. 標的細胞は、有効量のリソソーム酵素と接触される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組成物。
15. 前記リソソーム酵素は、少なくとも１０日間、好ましくは少なくとも２０日間、より好ましくは少なくとも３０日間にわたって、治療上有効な酵素活性を有する、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の組成物。
16. 前記ＶＬＰは、ＪＣウイルスのＶＰ１タンパク質から構成される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の組成物。
17. 前記ＶＰ１タンパク質は、配列番号３に従うアミノ酸配列とその全長にわたって少なくとも８０％同一である、好ましくは少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載の組成物。
18. 被験体においてリソソーム蓄積症を処置するための方法における使用のための薬学的組成物であって、ここで該薬学的組成物は、請求項１〜１７のいずれかに記載の組成物、ならびに薬学的に受容可能なキャリア、および／または賦形剤を含む、薬学的組成物。
19. リソソーム酵素、好ましくはヒトアリールスルファターゼＡをコードするコード領域、ＣＡＧおよびＣＭＶを含む群から選択され、好ましくはＣＡＧであるプロモーターを有し、７ｋｂ未満、好ましくは６ｋｂ未満のサイズを有する、発現ベクター。
20. 前記リソソーム酵素は、配列番号２のヌクレオチド配列とその全長にわたって少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％同一である、好ましくは配列番号２のヌクレオチド配列であるヌクレオチド配列を含む、請求項１９に記載の発現ベクター。
21. ＶＬＰへと、リソソーム酵素、好ましくはヒトアリールスルファターゼＡを組み込むか、またはリソソーム酵素、好ましくはヒトアリールスルファターゼＡをコードする発現ベクターを組み込むための方法であって、ここで該方法は、以下の工程：
    ａ） ＶＰ１タンパク質を含む組成物を提供する工程、
    ｂ） 該ａ）の組成物のＶＰ１タンパク質を、該ＶＰ１を誘導する条件に曝して、ＶＬＰへとアセンブルする工程、
    ｃ） 該ｂ）の組成物のＶＬＰを、該ＶＬＰをペンタマーへと脱アセンブルする条件に曝す工程、
    ｄ） 該ｃ）の組成物のペンタマーを、該ペンタマーを誘導する条件に曝して、ＶＬＰへと再アセンブルする工程、
    ｅ） 該ｄ）の組成物のＶＬＰを、該ＶＬＰをペンタマーへと脱アセンブルする条件に曝す工程、
    ｆ） 該ｅ）の組成物のペンタマーを、該リソソーム酵素または該発現ベクターに、該ペンタマーを誘導する条件に曝して、該リソソーム酵素または該発現ベクターと会合したＶＬＰへとアセンブルする工程、
    を包含する方法。
22. 請求項２１に記載の方法によって得られ得るＶＬＰ。
23. 請求項２１に記載の方法によって得られ得る薬物送達システム。
24. 薬物送達システムとしての請求項１〜１７のいずれか１項に記載の組成物。
25. 前記ＭＬＤを処置するための方法は、前記処置されるべき被験体のＢＢＢの透過性を増大させる工程を包含しない、請求項２４に記載の組成物。
26. リソソーム酵素またはリソソーム酵素をコードする発現ベクターを標的に送達することにおいて使用するための、該リソソーム酵素または該リソソーム酵素をコードする発現ベクターを組み込むＶＬＰを含む組成物であって、ここで該標的はＣＮＳである、組成物。
27. 前記リソソーム酵素または前記リソソーム酵素をコードする発現ベクターは、ＣＮＳにおける標的細胞、特に、星状細胞、乏突起膠細胞、ニューロンおよび／またはミクログリアに送達される、請求項２６に記載の組成物。
28. 前記リソソーム酵素は、前記標的細胞において一過性に発現される、請求項２７に記載の組成物。
29. リソソーム酵素活性を高めることにおいて使用するための、リソソーム酵素またはリソソーム酵素をコードする発現ベクターを組み込むＶＬＰを含む組成物。
30. ＭＬＤの処置のための医薬の製造のための、請求項１〜１７のいずれかに記載の組成物の使用。
31. ＭＬＤの処置のための医薬の製造のための、請求項２３に記載の薬物送達システムの使用。
32. ＭＬＤの処置のための、請求項２３に記載の薬物送達システムを含む組成物。