CN115968403A

CN115968403A - 用于治疗脑白质营养不良的vlp

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Publication number: CN115968403A
Application number: CN202180046442.8A
Authority: CN
Inventors: V·德米纳; O·厄恩斯特; A·赫尔曼; M·斯塔普
Original assignee: Newhealth Pharmaceutical Co ltd
Current assignee: Newhealth Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2020-05-22
Filing date: 2021-05-19
Publication date: 2023-04-14
Also published as: CA3184307A1; WO2021234046A1; BR112022023669A2; US20230310652A1; JP2023526528A; EP4153756A1

Abstract

本发明涉及与在特定脑白质营养不良中异常表达的酶或编码所述酶的表达载体或编码所述酶的mRNA或其组合缔合的病毒样颗粒(VLP)，其用于治疗有需要的受试者(优选人)的特定脑白质营养不良的方法。本发明还涉及用于治疗特定脑白质营养不良的方法的药物组合物、编码异常表达的酶的表达载体和使VLP与酶、编码酶的表达载体或编码酶的mRNA或其组合缔合的方法。

Description

用于治疗脑白质营养不良的VLP

技术领域

背景技术

脑白质营养不良是一组罕见的、进行性、代谢性、遗传性疾病，其影响脑、脊髓并常常影响周围神经。每种类型的脑白质营养不良都是由特定的基因异常引起的，导致脑的白质(髓鞘)的异常发育或破坏。每种类型的脑白质营养不良影响髓鞘的不同部分，导致一系列神经系统问题。

脑白质营养不良的一个例子是Canavan病(CD)。CD是一种罕见的遗传性神经系统疾病，其特征是脑和脊髓(中枢神经系统)的海绵状变性。婴儿早期出现的躯体症状可能包括进行性智力下降伴肌张力丧失、头部控制不良、头部异常大(畸形巨头)和/或易激惹。躯体症状出现在婴儿早期，并通常进展迅速。

CD是由ASPA基因缺陷引起的，该基因负责天冬氨酸酰化酶的产生。天冬氨酸酰化酶活性的降低阻止了N-乙酰天冬氨酸的正常分解，其中N-乙酰天冬氨酸的蓄积或其进一步代谢的缺乏干扰了大脑神经纤维的髓鞘的生长。

脑白质营养不良的另一个例子是Krabbe病。Krabbe病，又称为球形细胞性脑白质营养不良，是由位于14号染色体(14q31)上的GALC基因中的突变引起的常染色体隐性脂质贮积障碍，其是常染色体隐性遗传的。GALC基因中的突变引起溶酶体酶半乳糖脑苷脂酶的缺乏，该酶是鞘脂半乳糖神经酰胺和鞘氨醇半乳糖苷(半乳糖基-鞘氨醇)的分解(代谢)所必需的。未能分解这些鞘脂导致脑内神经周围的髓鞘变性(脱髓鞘)。特征性的球形细胞出现在脑的受累区域。这种代谢性疾病的特征是进行性神经功能障碍伴易激惹、发育消退、体张力异常、惊厥和周围神经病变。

基于重组腺相关病毒的基因治疗方法已在现有技术中讨论用于治疗脑白质营养不良如Canavan病和Krabbe病。

然而，当施用病毒载体时，会出现安全性问题。

因此，需要脑白质营养不良如Canavan病和Krabbe病的安全有效的疗法。因此，本发明的目的是提供克服了先前的限制的用于治疗脑白质营养不良诸如Canavan病和Krabbe病的新疗法的手段。

发明内容

本发明人已经发现，与在特定脑白质营养不良中异常表达的酶或编码这种酶的表达载体或编码这种酶的mRNA或其组合缔合的病毒样颗粒(VLP)，更具体地JC病毒的VLP特别适合于治疗特定的脑白质营养不良。根据本发明的VLP可用于将功能性酶或编码此类酶的质粒或编码此类酶的mRNA或其组合有效递送至有需要的患者的CNS中。为了实现这一点，根据本发明，VLP与酶或编码酶的表达载体或编码酶的mRNA或其组合(其活性的缺失或降低是要治疗的脑白质营养不良的原因)缔合。

特别地，本发明人已经发现，与天冬氨酸酰化酶或编码天冬氨酸酰化酶的表达载体或编码天冬氨酸酰化酶的mRNA或其组合缔合的病毒样颗粒(VLP)，更具体地JC病毒的VLP特别适于治疗Canavan病。根据本发明的VLP可用于将功能性天冬氨酸酰化酶或编码天冬氨酸酰化酶的质粒或编码天冬氨酸酰化酶的mRNA或其组合有效递送至有需要的患者的CNS中。为了实现这一点，根据本发明，VLP与天冬氨酸酰化酶或编码天冬氨酸酰化酶的表达载体或编码天冬氨酸酰化酶的mRNA或其组合(其活性的缺失或降低是导致Canavan病的原因)缔合。

此外，本发明人已经发现，与半乳糖脑苷脂酶或编码半乳糖脑苷脂酶的表达载体或编码半乳糖脑苷脂酶的mRNA或其组合缔合的病毒样颗粒(VLP)，更具体地JC病毒的VLP特别适合于治疗Krabbe病。根据本发明的VLP可用于将功能性半乳糖脑苷脂酶或编码半乳糖脑苷脂酶的质粒或编码半乳糖脑苷脂酶的mRNA或其组合有效递送至有需要的患者的CNS中。为此，根据本发明，VLP与半乳糖脑苷脂酶或编码半乳糖脑苷脂酶的表达载体或编码半乳糖脑苷脂酶的mRNA或其组合(其活性的缺失或降低是导致Krabbe病的原因)缔合。

与此一致，在其最广义上，根据本发明的“酶”分别涉及具有天冬氨酸酰化酶或半乳糖脑苷脂酶活性的多肽。

根据本发明的VLP可以有效地穿过血脑屏障(BBB)，有利地甚至穿过生理上完整的BBB。因此，分别与天冬氨酸酰化酶或半乳糖脑苷脂酶或编码相应酶的表达载体或编码相应酶的mRNA或其组合缔合的VLP可有效地将酶或编码酶的表达载体或编码相应酶的mRNA或其组合递送至CNS中。

本发明人在施用根据本发明的VLP后，分别在不同的小鼠和人细胞系以及小鼠脑中发现ASPA和GALC mRNA。他们还在人工BBB模型中发现了根据本发明的与天冬氨酸酰化酶(ASPA)或半乳糖脑苷脂酶(GALC)缔合的VLP在体外通过血脑屏障(BBB)的渗透。因此，可以得出结论，根据本发明的VLP的施用可增强CNS中的相应酶活性。如果酶分别为天冬氨酸酰化酶(ASPA)和半乳糖脑苷脂酶(GALC)，则增强的酶活性可分别实现Canavan病和Krabbe病的有效治疗。

令人惊讶的是，已经发现根据本发明的VLP特异性地靶向CNS，即它们在已经例如静脉内施用给患者之后不均匀分布在身体上。这意味着在CNS中发现的根据本发明的VLP的比例大于CNS之外的比例。

根据本发明的VLP特别靶向星形胶质细胞、少突胶质细胞、神经元和/或小胶质细胞。本发明的VLP的特别优选的靶标是少突胶质细胞。

根据本发明的VLP也是稳定的和均质的，这对于临床用途特别重要，因为它允许对药物产品的更好的质量管理和标准化。

因此，本发明人已经证明，分别与天冬氨酸酰化酶和半乳糖脑苷脂酶或编码相应酶的表达载体或编码相应酶的mRNA或其组合缔合的VLP，特别是JC病毒的VLP，可用于提供分别对Canavan病和Krabbe病的有效和安全的治疗。

附图简述

图1：小鼠器官中内源性ASPA表达的检测

左图显示使用小鼠特异性引物检测不同小鼠器官中的内源性，即鼠ASPA表达。右图显示使用人ASPA(hASPA)特异性引物检测不同小鼠器官中的内源性，即鼠ASPA表达。

图2：hASPA表达

左上图显示人星形细胞瘤细胞在与包封的hASPA(即包装有hASPA编码质粒的VLP)孵育后hASPA的表达(mRNA)。右上图显示使用hASPA编码质粒脂质体转染后人星形细胞瘤细胞中的hASPA蛋白表达(通过FACS分析)。左下图显示了用hASPA编码质粒脂质体转染(“Lipo”)或与包封的hASPA(即包装有hASPA编码质粒的VLP)孵育(“负载的EnPC”)后，人星形细胞瘤细胞中hASPA的表达(mRNA)。右下图显示了用hASPA编码质粒脂质体转染(“Lipo”)或与包封的hASPA(即包装有hASPA编码质粒的VLP)孵育(“负载的EnPC”)后小鼠成纤维细胞中hASPA的表达(mRNA)。

图3：体外BBB模型中与hASPA缔合的VLP的渗透性

左上图显示了孔中的人星形细胞瘤细胞与(+BBB)和不与(-BBB)接种到孔中的插件中的HBEC-5i内皮细胞共培养后人星形细胞瘤细胞中的hASPA表达(mRNA)。将包装有hASPA编码质粒的VLP(“负载的EnPC”)或单独hASPA编码质粒(“质粒对照”)添加到插件，并在24小时后将插件转移至具有新鲜培养基的孔中，再孵育48小时。72小时后收获细胞沉淀。

右上图显示了孔中的人星形细胞瘤细胞与接种到孔中的插件中的HBEC-5i内皮细胞共培养后HBEC-5i内皮细胞中的hASPA表达(mRNA)。将包装有hASPA编码质粒的VLP(“负载的EnPC”)或单独hASPA编码质粒(“质粒对照”)添加到插件，并在24小时后将插件转移至具有新鲜培养基的孔中，再孵育48小时。72小时后收获细胞沉淀。

左下图显示了孔中的人星形细胞瘤细胞与(+BBB)和不与(-BBB)接种到孔中的插件中的HBEC-5i内皮细胞共培养后人星形细胞瘤细胞中的hASPA表达(mRNA)。将包装有hASPA编码质粒的VLP(“负载的EnPC”)或单独hASPA编码质粒(“质粒对照”)添加到插件，并在48小时后将插件转移至具有新鲜培养基的孔中，再孵育24小时。72小时后收获细胞沉淀。

右下图显示了孔中的人星形细胞瘤细胞与接种到孔中的插件中的HBEC-5i内皮细胞共培养后HBEC-5i内皮细胞中的hASPA表达(mRNA)。将包装有hASPA编码质粒的VLP(“负载的EnPC”)或单独hASPA编码质粒(“质粒对照”)添加到插件，并在48小时后将插件转移至具有新鲜培养基的孔中，再孵育24小时。72小时后收获细胞沉淀。

图4：小鼠器官中内源性GALC表达的检测

左图显示使用小鼠特异性引物检测不同小鼠器官中的内源性，即鼠GALC表达。右图显示了使用人GALC(hGALC)特异性引物检测不同小鼠器官中的内源性，即鼠GALC表达。

图5：hGALC表达

左图显示了与包封的hGALC(即包装有hGALC编码质粒的VLP)孵育后人星形细胞瘤细胞中hGALC的表达(mRNA)。左图显示了用hGALC编码质粒脂质体转染(“Lipo”)或与包封的hGALC(即包装有hGALC编码质粒的VLP)孵育(“负载的EnPC”)后小鼠成纤维细胞中hGALC的表达(mRNA)。

图6：体外BBB模型中与hGALC缔合的VLP渗透性

左上图显示了孔中的人星形细胞瘤细胞与(+BBB)和不与(-BBB)接种到孔中的插件中的HBEC-5i内皮细胞共培养后人星形细胞瘤细胞中的hGALC表达(mRNA)。将包装有hGALC编码质粒的VLP(“负载的EnPC”)或单独hGALC编码质粒(“质粒对照”)添加到插件，并在24小时后将插件转移至具有新鲜培养基的孔中，再孵育48小时。72小时后收获细胞沉淀。

右上图显示了孔中的人星形细胞瘤细胞与接种到孔中的插件中的HBEC-5i内皮细胞共培养后HBEC-5i内皮细胞中的hGALC表达(mRNA)。将包装有hGALC编码质粒的VLP(“负载的EnPC”)或单独hGALC编码质粒(“质粒对照”)添加到插件，并在24小时后将插件转移至具有新鲜培养基的孔中，再孵育48小时。72小时后收获细胞沉淀。

左下图显示了孔中的人星形细胞瘤细胞与(+BBB)和不与(-BBB)接种到孔中的插件中的HBEC-5i内皮细胞共培养后人星形细胞瘤细胞中的hGALC表达(mRNA)。将包装有hGALC编码质粒的VLP(“负载的EnPC”)或单独hGALC编码质粒(“质粒对照”)添加到插件，并在48小时后将插件转移至具有新鲜培养基的孔中，再孵育24小时。72小时后收获细胞沉淀。

右下图显示了孔中的人星形细胞瘤细胞与接种到孔中的插件中的HBEC-5i内皮细胞共培养后HBEC-5i内皮细胞中的hGALC表达(mRNA)。将包装有hGALC编码质粒的VLP(“负载的EnPC”)或单独hGALC编码质粒(“质粒对照”)添加到插件，并在48小时后将插件转移至具有新鲜培养基的孔中，再孵育24小时。72小时后收获细胞沉淀。

图7：与hASPA或hGALC mRNA缔合的VLP的DLS分析

图显示了与hASPA mRNA(黑线；“负载hASPA mRNA的EnPC”)或hGALC mRNA(灰色线；“负载hGALC mRNA的EnPC”)缔合的VLP的DLS分析。

图8：hASPA和hGALC体外表达(mRNA作为货物)

左图显示与包装有hASPA编码mRNA的VLP(“负载mRNA的EnPC”)孵育、与hASPA编码mRNA(“mRNA对照”)孵育或用hASPA编码mRNA脂质体转染(“lipofection”)后，人星形细胞瘤细胞中hASPA的表达(mRNA；两个技术重复的qPCR分析)。显示了具有SEM的平均值。

右图显示了与包装有hGALC编码mRNA的VLP(“负载mRNA的EnPC”)孵育、与hGALC编码mRNA(“mRNA对照”)孵育或用hGALC编码mRNA脂质体转染(“lipofection”)后，人星形细胞瘤细胞中hGALC的表达(mRNA；两个技术重复的qPCR分析)。显示了具有SEM的平均值。

图9：与hASPA或hGALC mRNA缔合的VLP的免疫细胞化学

左上图显示与包装有hASPA编码mRNA的VLP(“负载mRNA的EnPC”)孵育并用抗hASPA抗体染色后的人星形细胞瘤细胞。左下图显示与hASPA编码mRNA(“mRNA对照”)孵育并使用抗hASPA抗体染色后的人星形细胞瘤细胞。

右上图显示与包装有hGALC编码mRNA的VLP(“负载mRNA的EnPC”)孵育并用抗hGALC抗体染色后的人星形细胞瘤细胞。右下图显示与hGALC编码mRNA(“mRNA对照”)孵育并使用抗hGALC抗体染色后的人星形细胞瘤细胞。

图10：体内hASPA和hGALC表达(mRNA作为货物)

图显示了分别在6h和24h后注射与hASPA mRNA缔合的VLP(从左到右的第1列和第2列，“脑(hASPA)”)、注射与hGALC mRNA缔合的VLP(从左到右的第3列和第4列；“脑(hGALC)”)、注射hASPA mRNA(从左到右的第5列和第6列；“脑(hASPA)-Ctrls”)或注射hGALCmRNA(从左到右的第7列和第8列；“脑(hGALC)-Ctrls”)后小鼠脑裂解物中的mRNA表达(两个技术重复的qPCR分析)。数字“n”表示动物数量。显示了中位数。

发明详述

在本发明的第一方面中，本发明涉及与天冬氨酸酰化酶或编码天冬氨酸酰化酶的表达载体或编码天冬氨酸酰化酶的mRNA或其组合缔合的VLP，其用于治疗受试者、特别是人的Canavan病的方法。因此，本发明还涉及用与天冬氨酸酰化酶或编码天冬氨酸酰化酶的表达载体或编码天冬氨酸酰化酶的mRNA或其组合缔合的VLP来治疗患有Canavan病的人的方法。

在本发明的相关方面中，本发明涉及与半乳糖脑苷脂酶或编码半乳糖脑苷脂酶的表达载体或编码半乳糖脑苷脂酶的mRNA或其组合缔合的VLP，其用于治疗受试者、特别是人的Krabbe病的方法。因此，本发明还涉及用与半乳糖脑苷脂酶或编码半乳糖脑苷脂酶的表达载体或编码半乳糖脑苷脂酶的mRNA或其组合缔合的VLP来治疗患有Krabbe病的人的方法。

“它们的组合”或“其组合”优选地是指酶和表达载体的组合、酶和mRNA的组合、表达载体和mRNA的组合或酶、表达载体和mRNA的组合。

VLP本身(即不与货物缔合)不包含任何遗传物质，因为它们仅由蛋白质构成并在其他方面为“空的”。根据本发明的VLP分别与天冬氨酸酰化酶或半乳糖脑苷脂酶或编码相应酶的表达载体或编码相应酶的mRNA或其组合缔合。在一个优选的实施方案中，根据本发明的VLP不包含编码病毒蛋白的病毒遗传物质。在该实施方案中，VLP可以包含病毒调节元件作为病毒遗传物质。

病毒遗传物质包括编码病毒蛋白的病毒遗传物质和作为病毒遗传物质的病毒调节元件。病毒遗传物质衍生自病毒的核酸，即与病毒RNA或DNA至少70％相同。优选地，根据本发明的VLP不包含任何病毒遗传物质。

因此，优选地，在根据本发明的VLP包含RNA或DNA的情况下，RNA或DNA不是衍生自病毒，即RNA或DNA不是病毒遗传物质，特别是RNA或DNA不编码病毒蛋白。特别优选RNA或DNA不编码病毒蛋白并且不包含病毒调节元件。

在一个优选的实施方案中，根据本发明的VLP仅与仅分别编码天冬氨酸酰化酶或半乳糖脑苷脂酶的表达载体或mRNA缔合，即表达载体或mRNA不编码任何其他蛋白质。在一个优选的实施方案中，表达载体或mRNA不编码病毒蛋白。特别优选的是，表达载体或mRNA不编码病毒蛋白并且不包含病毒调节元件。

优选地，受试者是动物或人，优选地是人。

有利地，根据本发明的VLP使得能够分别将天冬氨酸酰化酶或半乳糖脑苷脂酶或编码相应酶的表达载体或编码相应酶的mRNA或其组合递送至优选在人中的感兴趣的部位(“靶标”)。优选地，递送对靶标具有选择性，即，与身体或器官的其他部位相比，更高比例的相应酶或编码所述酶的表达载体或编码所述酶的mRNA或其组合被递送至靶标。

靶标优选是CNS。CNS是指脊髓和脑，特别是脑。术语“脑”包括其解剖学部分，例如额叶、顶叶、颞叶、枕叶和小脑。

如果分别将天冬氨酸酰化酶或半乳糖脑苷脂酶或编码相应酶的表达载体或编码相应酶的mRNA或其组合递送至靶细胞和/或递送到靶细胞(优选CNS中的靶细胞，尤其是星形胶质细胞、少突胶质细胞、神经元和/或小胶质细胞)中，则是特别有利的。在特别优选的实施方案中，靶细胞是少突胶质细胞。因此，分别地天冬氨酸酰化酶或半乳糖脑苷脂酶或表达载体或mRNA或其组合优选进入星形胶质细胞、少突胶质细胞、小胶质细胞或神经元，特别是少突胶质细胞。

当靶细胞与分别地有效量的天冬氨酸酰化酶或半乳糖脑苷脂酶接触时是特别有利的。有效量的相应酶是指该量足以增强酶的活性(该酶的缺乏引起相应的脑白质营养不良)。

通常在向其添加底物的体外探针中(通常在源自固体组织、白细胞、成纤维细胞、培养的羊水细胞、血清、羊水、尿液或泪滴的探针中)测量受试者中的酶活性。例如，对于天冬氨酸酰化酶，典型底物是N-乙酰基-L-天冬氨酸(NAA)，其可直接测量为[14C]-放射性标记的NAA(Madhavarao等人,Anal.Biochem.2002；308:314-319)或在偶联反应中间接测量，其中用光度法测量NADH转化为NAD+(Matalon等人,Am.J.Med.Genet.1988；29:463-471)。类似地，半乳糖脑苷脂酶的典型底物是荧光底物4-甲基伞形酮-β-吡喃半乳糖苷(4-MU-β-D-半乳糖苷酶，MUGAL(Martino等人,Clin.Chem.2009；55:541-548)。

在特别优选的实施方案中，根据本发明的VLP穿过血脑屏障，优选生理上完整的血脑屏障，以与分别地天冬氨酸酰化酶或半乳糖脑苷脂酶或表达载体或mRNA或其组合一起进入CNS。换句话说，根据本发明的VLP优选在不事先增加BBB的穿透性的情况下穿过BBB。根据本发明的VLP能够穿过生理上完整的BBB。

如果靶标是CNS，特别是如果靶标细胞是星形胶质细胞、少突胶质细胞、神经元和/或小胶质细胞，则BBB的穿透是特别有利的。因此，根据本发明的VLP可以用于分别治疗Canavan病和Krabbe病的方法中，其中该方法不包括增加待治疗的受试者的BBB的穿透性的先前步骤。优选地，将根据本发明的VLP施用至在施用之前未接受用于损害或破坏BBB的任何化学或物理治疗的患者。

因此，在另一个实施方案中，与分别地天冬氨酸酰化酶或半乳糖脑苷脂酶或编码相应酶的表达载体或编码相应酶的mRNA或其组合缔合的VLP或包含根据本发明的VLP的药物组合物不含可影响BBB的穿透性的任何添加剂。

BBB的体外完整性可以通过已知方法测量，例如通过相对跨内皮电阻测量法(TEER)(Rempe等人,Biochem Bioph Res Comm 2011,406(1):64-69)。建立了许多BBB体外模型，包括不同共培养物中的原代牛或人脑内皮细胞，例如人脑内皮细胞系HBEC-5i。在体内，可以将成像方法(例如CT扫描或MRI)与造影剂一起使用以可视化BBB穿透性。也可以使用功能成像，例如PET或SPECT。

根据本发明的VLP可以通过各种途径施用，包括口服、经皮、经鼻施用或肺途径或肠胃外注射(静脉内、皮下、肌内)。特别优选的是允许分别地天冬氨酸酰化酶或半乳糖脑苷脂酶或编码相应酶的表达载体或编码相应酶的mRNA或其组合的全身作用的剂型。在一个具体的实施方案中，根据本发明的VLP口服或肠胃外施用，特别是静脉内施用。

在根据本发明的VLP的应用导致不想要的免疫反应(例如通过炎性细胞因子和/或免疫细胞上的表面分子的上调测量)的情况下，可能需要额外应用免疫抑制剂以减少免疫系统的激活或功效。

在一个优选的实施方案中，在施用至待治疗的受试者特别是人后，可以在施用后少于10天，优选少于5天，更优选少于3天在CNS中检测到根据本发明的VLP。

在另一个优选的实施方案中，分别地天冬氨酸酰化酶或半乳糖脑苷脂酶具有至少10天、优选至少20天、更优选至少30天的治疗上有效的酶活性。可以通过导致治疗效果(即至少减轻或缓解疾病症状)的酶活性来测量治疗上有效的酶活性。

特别有利的是，治疗上有效的酶活性(优选地在靶位点处的)保持至少10天，优选至少20天，以延长分别地天冬氨酸酰化酶或半乳糖脑苷脂酶发挥其活性时的有效期。因此，可以限制根据本发明的VLP的注射次数或频率。

在一个实施方案中，天冬氨酸酰化酶包含在其整个长度上与根据SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少80％、优选至少90％相同的氨基酸序列，更优选地具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列。

在一个实施方案中，天冬氨酸酰化酶由核苷酸序列编码，该核苷酸序列在其整个长度上与SEQ ID NO：2的核苷酸序列至少70％、优选至少80％、更优选至少90％相同，最优选地是SEQ ID NO：2的核苷酸序列。

在一个实施方案中，天冬氨酸酰化酶由mRNA序列编码，该mRNA序列在其整个长度上与SEQ ID NO：9的mRNA序列至少70％、优选至少80％、更优选至少90％相同，最优选地包括SEQ ID NO：9的mRNA序列。

在一个实施方案中，半乳糖脑苷脂酶包含在其整个长度上与根据SEQ ID NO：3的氨基酸序列至少80％、优选至少90％相同的氨基酸序列，更优选具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列。

在一个实施方案中，半乳糖脑苷脂酶由核苷酸序列编码，该核苷酸序列在其整个长度上与SEQ ID NO：4的核苷酸序列至少70％、优选至少80％、更优选至少90％相同，最优选地是SEQ ID NO：4的核苷酸序列。

在一个实施方案中，半乳糖脑苷脂酶由mRNA序列编码，该mRNA序列在其整个长度上与SEQ ID NO：10的mRNA序列至少70％、优选至少80％、更优选至少90％相同，最优选地包含SEQ ID NO：10的mRNA序列。

SEQ ID NO：1、2和9的序列涉及人天冬氨酸酰化酶，SEQ ID NO：3、4和10的序列涉及人半乳糖脑苷脂酶，并显示于下表中：

表1：人天冬氨酸酰化酶和人半乳糖脑苷脂酶的氨基酸和核苷酸序列(DNA和mRNA)。

优选地，编码分别地天冬氨酸酰化酶或半乳糖脑苷脂酶的表达载体的尺寸小于7kb，优选小于6kb。当表达载体的尺寸相对较小，优选小于6kb、更优选小于5kb、最优选小于4kb时，VLP与表达载体的缔合更有效。

在一个优选的实施方案中，表达载体具有选自CMV和CAG的启动子。

CAG启动子是特别有利的，因为它允许持久的表达。CAG启动子还抑制不想要的免疫反应，因此可以减少或甚至完全避免免疫抑制剂的额外应用。

如果需要更强和更短的表达，则优选CMV启动子。

持久表达或短期表达的需要可以根据疾病、疾病阶段和待治疗的受试者而变化。酶的持久表达允许持久的作用，如果在受试者中不存在分别地天冬氨酸酰化酶或半乳糖脑苷脂酶活性或只有很少的残留活性，则其是有益的。如果存在分别地天冬氨酸酰化酶或半乳糖脑苷脂酶的残留活性，则较短的表达可能是足够的。同样，对轻量表达或强烈表达的需求可能会有所不同。

优选地，分别地天冬氨酸酰化酶或半乳糖脑苷脂酶表达(优选在靶位点处)至少1小时，优选至少5小时，更优选至少12小时，更优选至少1天，更优选至少3天，更优选至少1周，更优选至少1个月，更优选至少3个月，更优选至少6个月，更优选至少9个月，更优选至少1年，更多优选至少1.5年，更优选至少2年。

最优选地，分别地天冬氨酸酰化酶或半乳糖脑苷脂酶在靶位点处表达至少1个月。

因此，在一个实施方案中，分别地天冬氨酸酰化酶或半乳糖脑苷脂酶在靶位点处可检测至少1小时，优选至少5小时，更优选至少12小时，更优选至少1天，更优选至少3天，更优选至少1周，更优选至少1个月，更优选至少3个月，更优选至少6个月，更优选至少9个月，更优选至少1年，更多优选至少1.5年，更优选至少2年。

最优选地，分别地天冬氨酸酰化酶或半乳糖脑苷脂酶在靶位点处可检测至少1个月。

优选地，靶细胞中的表达是瞬时的。瞬时表达不排除该表达是持久的。在一个优选的实施方案中，表达是持久的和瞬时的。

在一个优选的实施方案中，表达载体是质粒。

在特别优选的实施方案中，质粒不含抗生素抗性基因。这是有利的，因为它允许在不使用抗生素的情况下培养此类质粒。这对于临床使用特别重要，因为注射抗生素可能会导致过敏或过敏性休克。“pFAR”质粒是例如没有抗生素抗性基因的质粒。pFAR质粒允许持久和稳定的表达而无需使用抗生素并且可用于实践本发明。

在另一个优选实施方案中，使用“pNL”质粒或“pSF”质粒。

表述“pFAR质粒”、“pNL质粒”或“pSF质粒”是指具有pFAR质粒、pNL质粒或pSF质粒的主链的质粒用于将启动子和感兴趣的酶克隆到主链中。

pFAR质粒例如在US 8,440,455 B2中描述。特别优选的pFAR质粒是pFAR4，其主链在US 8,440,455 B2中以SEQ ID NO：21公开。“pFAR1”质粒和优化的“pFAR4”质粒的构建在US 8,440,455 B2的第17和18栏中公开。

pFAR质粒优选包含CMV或CAG启动子。pNL质粒优选包含CMV启动子。pSF质粒优选包含CAG启动子。

在优选的实施方案中，表达载体分别是pNL-CMV-hASPA或pNL-CMV-hGALC，因此具有CMV启动子并分别编码人ASPA或GALC基因的pNL主链。在另一个优选实施方案中，表达载体是pFAR-CAG-hASPA或pFAR-CAG-hGALC。特别优选的是表达载体pNL-CMV-hASPA或pNL-CMV-GALC。

在本发明中已经表明，天冬氨酸酰化酶和半乳糖脑苷脂酶分别可以在不同的细胞系中表达。

在优选的实施方案中，如果货物是分别编码天冬氨酸酰化酶或半乳糖脑苷脂酶的表达载体，则Canavan病和Krabbe病的治疗分别受待治疗受试者的靶细胞(优选少突胶质细胞)中相应基因的瞬时表达的影响。

在另一个优选实施方案中，如果货物是分别编码天冬氨酸酰化酶或半乳糖脑苷脂酶的mRNA，则Canavan病和Krabbe病的治疗分别受待治疗受试者的靶细胞(优选少突胶质细胞)中相应基因的瞬时表达的影响。

根据本发明的VLP治疗的受试者例如是分别患有Canavan病或Krabbe病的患者，或预期患有所述疾病的受试者，例如，因为它们包含已知分别影响天冬氨酸酰化酶或半乳糖脑苷脂酶的基因突变，并且因此分别导致Canavan病和Krabbe病。

存在Canavan病和Krabbe病的不同的小鼠模型，其可用于研究疾病和可能的疗法：

由于ASPA基因中的无义突变，ASPA^nur7小鼠不表达天冬氨酸酰化酶。其特征是中枢神经系统中髓鞘的早发性海绵状变性伴NAA水平升高。与野生型小鼠相比，ASPA^nur7小鼠小得多，并且可检测到震颤和惊厥(Traka等人,J.Neurosci.2009；28:11537-11549)。

Twitcher小鼠具有GALC基因中的突变。与寿命仅为约40天的野生型小鼠相比，缺陷小鼠更小并且活性较低。在CNS和PNS中可检测到髓鞘缺乏。发病机制是由半乳糖基鞘氨醇(鞘氨醇半乳糖苷)在神经系统中的异常蓄积所引起的(Suzuki等人,Brain Pathology1995；5(3):249-258)。

本发明的VLP优选衍生自John Cunningham病毒(JCV)。“JC病毒”或JohnCunningham病毒(JCV；NCBI分类标准10632)是人多瘤病毒。JCV具有二十面体对称性，直径为约45nm，并由72个VP1五聚体组成。还存在少量的结构蛋白VP2和VP3。

在本发明的上下文中，“病毒样颗粒”(VLP)被定义为具有由病毒结构蛋白或修饰的病毒结构蛋白或衍生自病毒结构蛋白的蛋白组成的外壳(也称为衣壳)的复制缺陷颗粒。如上所述，VLP本身不包含遗传物质。根据本发明的VLP优选衍生自人多瘤病毒，优选JCV，即其外壳优选由JCV的病毒结构蛋白VP1、VP2和VP3或JCV的修饰的病毒结构蛋白VP1、VP2和VP3或衍生自JCV的病毒结构蛋白VP1、VP2和VP3的蛋白组成。在一个优选的实施方案中，根据本发明的VLP由JC病毒的VP1蛋白组成。

在本发明的一个特别优选的实施方案中，根据本发明的VLP的外壳中唯一的病毒结构蛋白是VP1蛋白。在最优选的实施方案中，根据本发明的VLP的外壳由VP1蛋白组成，即该外壳不包含任何其他蛋白。

病毒结构蛋白特别是VP1组装成五聚体结构(五聚体)。根据本发明，根据本发明的VLP外壳优选地由几种VP1蛋白，特别是几种VP1五聚体，尤其是72种VP1五聚体组成。

在本发明的上下文中，“五聚体”是当五个多肽例如VP1蛋白组装时形成的结构。组装成五聚体可能是由于多肽之间形成了共价或非共价键。多肽通常形成具有五边形对称性的环状结构。在五聚体中，每个多肽亚基优选与两个相邻的亚基相互作用。

根据本发明的“肽”可以由任何类型的任何数目的氨基酸，优选天然存在的氨基酸(其优选地通过肽键连接)组成。特别地，肽包含至少3个氨基酸，优选至少5个，至少7个，至少9个，至少12个或至少15个氨基酸。肽的长度没有上限。然而，优选地，根据本发明的肽的长度不超过500个氨基酸，优选地不超过400、300、250、200、150或120个氨基酸。超过约10个氨基酸的肽也可以称为“多肽”。

优选地，根据本发明的VLP的结构蛋白特别是VP1与JCV的天然结构蛋白相同或衍生自JCV的天然结构蛋白。“修饰或衍生”涵盖一种或多种氨基酸的插入、缺失或取代，同时保留VP1组装成衣壳的功能。

在一个实施方案中，可以对天然(JCV)结构蛋白进行修饰以便在其产生、其细胞靶向概况和特异性或其细胞内靶向概况或特异性方面优化根据本发明的VLP。修饰或衍生可包括对编码结构蛋白特别是VP1的核苷酸序列进行密码子优化，以增强蛋白翻译。

根据本发明的术语“VP1”或“病毒蛋白1”是指能够组装到衣壳中并且优选地与JCV的天然(自然)VP1相同或衍生自JCV的天然(自然)VP1的蛋白。

根据本发明的术语“VP1”包括在序列上与根据SEQ ID NO：5或6的氨基酸序列具有至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少97％，更优选至少98％或至少99％的氨基酸序列同一性的蛋白质。在本发明的最优选的实施方案中，VP1具有根据SEQ ID NO：5或6的氨基酸序列。

根据本发明的术语“VP1”也包括天然VP1的部分。优选地，VP1的所述部分至少包含根据SEQ ID NO：5或6的氨基酸序列的32至316位的氨基酸或其衍生物，所述衍生物在序列上与SEQ ID NO：5或6的氨基酸位置32至316的氨基酸序列具有至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少97％，更优选至少98％或至少99％的同一性。

在一个实施方案中，VP1蛋白的核苷酸序列在其全长上与SEQ IDNO：7的核苷酸序列至少70％，更优选至少80％，更优选至少90％相同，其优选为SEQ ID NO：7的核苷酸序列。

在本发明的另一个实施方案中，VP1蛋白的核苷酸序列在其全长上与SEQ ID NO：8的核苷酸序列至少70％，更优选至少80％，更优选至少90％相同。在一个实施方案中，VP1蛋白的核苷酸序列与SEQ ID NO：8的核苷酸序列相同。

序列描述于表2。

表2：VP1蛋白的氨基酸和核苷酸序列。

在本发明的优选实施方案中，VP1的氨基酸序列在其整个长度上与根据SEQ IDNO：5或6的氨基酸序列至少90％相同。

在本发明的一个优选实施方案中，VP1蛋白的核苷酸序列在其整个长度上与SEQID NO：7或8的核苷酸序列至少80％相同。

结构蛋白优选VP1可以在例如大肠杆菌或昆虫细胞中表达。根据本发明的一个优选实施方案，结构蛋白优选VP1在昆虫细胞中表达。这是有利的，因为与在大肠杆菌中的表达相比，在昆虫细胞中的表达导致与例如来自JCV的野生型蛋白相比更少的修饰，例如翻译后修饰。

根据本发明的VLP还可在衣壳中包含一种或几种另外的异源蛋白质，即与VP1的来源(例如，JCV)不同或不衍生自VP1的来源(例如，JCV)的蛋白质。例如，异源蛋白可以锚定在衣壳中，即该蛋白的至少一部分优选可从外部接近。原则上，任何蛋白质都适合作为这种异源蛋白质，只要该异源蛋白质可以掺入衣壳中并且基本不干扰根据本发明的VLP的组装。

根据本发明的VLP与货物缔合，即与分别地天冬氨酸酰化酶或半乳糖脑苷脂酶或编码相应酶的表达载体或编码相应酶的mRNA或其组合缔合。这意味着货物可逆地结合到VLP。这可以例如是由于与衣壳的任何部分的物理化学相互作用或附着，或者是由于货物掺入到衣壳中。掺入可以是完整的或不完整的。在本发明的一个特别优选的实施方案中，货物总量的主要部分完全掺入到衣壳中。最优选的是，将货物完全封装在根据本发明的VLP的衣壳中。

在本发明的上下文中，“VLP包含货物”的表述与VLP“与货物缔合”的表述同义。VLP与货物的缔合可能是用货物“装载”或“包装”VLP的结果。

“装载”是指导致VLP与货物缔合的任何过程，例如通过渗透冲击或通过将VP1或VP1五聚体与货物一起组装到VLP中。“装载的VLP”是此过程产生的VLP。术语“包装”涉及通过将VP1或VP1五聚体与货物一起组装到VLP中来装载VLP的过程。由此产生的VLP被称为“包装的”VLP。

在本发明的上下文中，术语“货物”用于酶特别是天冬氨酸酰化酶或半乳糖脑苷脂酶或编码此类酶的表达载体或编码此类酶的mRNA或其组合。

与上述一致，包装有酶或编码酶的表达载体或编码酶的mRNA或其组合的VLP，特别地，包装有天冬氨酸酰化酶或半乳糖脑苷脂酶的VLP或包装有编码天冬氨酸酰化酶或半乳糖脑苷脂酶的表达载体的VLP或包装有编码天冬氨酸酰化酶或半乳脑苷脂酶的mRNA的VLP或其组合也可分别称为“包封的天冬氨酸酰化酶(ASPA)”和“包封的半乳糖脑苷脂酶(GALC)”。

在本发明的一个特定实施方案中，根据本发明的VLP是用于在受试者中治疗分别地Canavan病或Krabbe病的方法中的药物组合物的一部分，其中所述药物组合物还包含药学上可接受的载剂和/或赋形剂。

在一个优选的实施方案中，药物组合物包含根据本发明的VLP、盐和缓冲剂，并且pH为7.0至8.0，优选为约7.5。该药物组合物优选包含：

a.120mM至170mM的NaCl，优选150mM的NaCl，

b.1-5mM的CaCl₂，优选2mM的CaCl₂，和

c.5至30mM的Tris-HCl，优选10至25mM的Tris-HCl，更优选10mM的Tris-HCl。

该药物组合物允许在生理条件下处理根据本发明的VLP。在这些条件下，根据本发明的VLP基本上保持完整，优选它们基本上保持其衣壳结构。如果装载有货物例如分别地天冬氨酸酰化酶或半乳糖脑苷脂酶或编码相应酶的表达载体或编码相应酶的mRNA或其组合，则根据本发明的VLP基本上保持与货物缔合。该药物组合物特别适合作为用于将根据本发明的VLP静脉内施用至受试者特别是人的药物组合物。

在另一方面，本发明涉及一种表达载体，其具有编码分别地天冬氨酸酰化酶或半乳糖脑苷脂酶的编码区、选自包含CAG和CMV的组的启动子，并且其尺寸小于7kb，优选小于6kb，更优选小于5kb，最优选小于4kb。

在一个优选的实施方案中，由表达载体(即编码区)编码的分别地天冬氨酸酰化酶或半乳糖脑苷脂酶包含在其全长上与分别地SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的核苷酸序列至少70％，更优选至少80％，更优选至少90％相同的核苷酸序列，其优选是分别地SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的核苷酸序列。

如果在制造后没有立即施用根据本发明的VLP，则可以将其储存，优选储存在液氮中。

根据本发明的VLP可以根据标准方法表征，例如通过Bradford测定、HA、DLS、nDSF、HPLC-SEC、AF4、TEM表征。

本发明还涉及用根据本发明的VLP治疗Canavan病或Krabbe病的方法。该治疗方法优选包括将VLP施用至有需要的受试者的步骤。

本发明还涉及根据本发明的VLP在制备用于治疗分别地Canavan病或Krabbe病的药物中的用途。治疗方法优选不包括增加待治疗的受试者的BBB的穿透性的步骤。优选地，将本发明的VLP施用至尚未接受任何用于损害或破坏BBB的化学或物理治疗的患者。

本发明还涉及根据本发明的VLP，其用于将分别地天冬氨酸酰化酶或半乳糖脑苷脂酶或编码相应酶的表达载体或编码相应酶的mRNA或其组合跨过BBB递送至CNS，特别是CNS细胞，例如星形胶质细胞、少突胶质细胞、神经元和小胶质细胞。

重要的是，根据本发明的VLP穿过BBB能够使VLP展现出靶向脑内的特定细胞群的功能，即，将分别地天冬氨酸酰化酶或半乳糖脑苷脂酶或编码相应酶的表达载体或编码相应酶的mRNA或其组合递送至靶细胞，优选星形胶质细胞、少突胶质细胞、神经元和小胶质细胞。在本发明的上下文中，所述VLP包括递送至靶细胞和/或递送到靶细胞中。

在另一个实施方案中，本发明涉及将VLP与编码分别地天冬氨酸酰化酶或半乳糖脑苷脂酶的表达载体缔合的方法，其中该方法包括以下步骤：

-提供VLP，尤其是衍生自JCV的VLP

-使VLP暴露于将VLP分解为五聚体的条件下

-以1:0.5至1:0.1的VLP与表达载体的比例优选1:0.2的比例使五聚体暴露于表达载体，并暴露于诱导五聚体组装成与表达载体缔合的VLP的条件下

-可选地纯化VLP

-执行透析步骤。

在另一个优选的实施方案中，提供了将VLP与分别地天冬氨酸酰化酶或半乳糖脑苷脂酶或编码相应酶的表达载体或编码相应酶的mRNA或其组合缔合的方法，其中该方法包括以下步骤：

a)提供包含VP1蛋白的组合物，

b)将a)的组合物的VP1蛋白暴露于诱导VP1组装成VLP的条件下，

c)将b)的组合物的VLP暴露于将VLP分解为五聚体的条件下，

d)将c)的组合物的五聚体暴露于诱导五聚体重新组装成VLP的条件下，

e)将d)的组合物的VLP暴露于将VLP分解成五聚体的条件下，

f)将e)的组合物的五聚体与分别地天冬氨酸酰化酶或半乳糖脑苷脂酶或表达载体或mRNA或其组合暴露于诱导五聚体组装成与相应酶或表达载体或mRNA或其组合缔合的VLP的条件下。

VLP与表达载体的比例(即包装比例)可以根据特定需要而变化。例如，VLP形成或基因表达的效率可以取决于该比例。优选地，使用1:0.5至1:0.1，更优选地1:0.2的VLP与表达载体的比例。本领域技术人员将针对特定表达载体(优选质粒)和所需用途调整比例。1:0.2的包装比例是优选的。

VLP与mRNA的比例(即包装比例)可为1:0.2。

在本发明的上下文中，和为了易于解释，由步骤b)得到的VLP也可以称为“pVLP”(初级VLP)。由步骤d)得到的VLP也可以称为“rVLP”(重新组装的VLP)。由步骤f)得到的VLP也可以被称为“cVLP”(货物VLP)。根据本发明，货物是酶，特别是天冬氨酸酰化酶或半乳糖脑苷脂酶，优选人天冬氨酸酰化酶或人半乳糖脑苷脂酶，或编码此类酶，优选人天冬氨酸酰化酶或人半乳糖脑苷脂酶的表达载体，或编码此类酶，优选人天冬氨酸酰化酶或人半乳糖脑苷脂酶的mRNA，或其组合。

在本发明的另一方面，本发明涉及可通过上述方法获得的VLP。

在本发明的另一方面，本发明涉及一种组合物，其包含由JCV衍生的根据本发明的VLP，其特征在于以下参数中的一个或多个：

a.多分散指数(PDI)小于0.3，优选小于0.2，优选小于0.1，更优选在0.01和0.09的范围内，

b.至少70％的VLP的平均直径为20nm至70nm，优选为30nm至70nm，更优选为35nm至65nm，更优选为40至60nm，

c.组合物中的VLP含量为至少80％(v/v)，优选至少85％(v/v)，优选至少90％(v/v)，优选至少95％(v/v)。

在另一方面，本发明涉及可通过根据本发明的方法获得的药物递送系统。药物递送系统可以用于治疗和/或诊断的方法中，优选地用于治疗神经系统疾病，即脑白质营养不良，特别是Canavan病或Krabbe病。因此，本发明还涉及一种用根据本发明的药物递送系统治疗疾病，特别是CNS疾病的方法。该治疗方法优选包括将药物递送系统施用至有需要的受试者的步骤。

药物递送系统优选具有改善的功效。根据本发明的VLP可以在不事先增加BBB的穿透性的情况下穿过BBB。因此，本发明的药物递送系统可以用于治疗CNS疾病的方法，其中该方法不包括增加待治疗的受试者的BBB的穿透性的步骤。优选地，将本发明的药物递送系统施用至尚未接受任何用于损害或破坏BBB的化学或物理治疗的患者。

在本发明的又一方面，提供了一种包含VLP的组合物，其具有以下特征(“目标参数”)中的至少一个优选所有特征：

表3：根据本发明的VLP和含VLP的组合物的优选特性。

AUC＝曲线下面积

在一个实施方案中，根据本发明的VLP在nDSF分析中显示出＞67℃的主要拐点峰。

在一个实施方案中，根据本发明的VLP的AF4分析显示出小于20％的聚集体和小于15％的微小体(tinies)。至少70％为尺寸为40至50nm的VLP。

本发明的药物递送系统可以通过各种途径施用，包括口服、经皮、经鼻或肺途径或注射。特别优选的是允许药物产品具有全身作用的剂型。在一个具体的实施方案中，本发明的药物递送系统口服或肠胃外施用，特别是静脉内施用。

在本发明的上下文中，术语“药物递送系统”是指用于将药物产品施用至有需要的受试者，特别是人或动物的组合物。药物递送系统有利地使得能够将包含在其中或附着于其上的药物产品递送至感兴趣的部位(优选在人或动物中)。优选地，递送对于靶标是选择性的，即，更多的药物产品被递送到靶标而不是身体或器官的其他部位。

“用于CNS的药物递送系统”是指药物递送系统选择性地靶向CNS。

根据本发明，表述使某种物质(例如VP1、五聚体、VLP)“暴露于”影响某种物质(例如诱导组装)的条件下是指将所考虑的材料(例如VP1、五聚体、VLP)置于可能导致这种特定影响(例如，诱导组装)的条件下。可以通过改变材料的条件来进行这样的暴露，例如通过使材料与不同的缓冲剂、盐或pH接触。这可以通过向包含材料的组合物中添加某种物质来实现或反之亦然，或者通过将材料与组合物分离，然后将材料加入至不同的组合物中来实现。

条件的改变也可以通过改变温度、辐射等来实现。自然地，这样的用于改变条件的手段可以被组合和/或重复。诱导期望效果(例如VP1或五聚体组装成VLP和/或诱导VLP的聚集)的其他合适条件也是本领域技术人员众所周知的。这同样适用于暴露于相应条件的合适持续时间；这可以通过本领域技术人员的普通方法来发现。

“将某种物质暴露于影响某种物质的条件”这一表达并不需要完成其效果，即并非所有材料都必须达到所考虑的效果。例如，“诱导五聚体聚集的条件”实质上意味着该条件适合于诱导聚集。并不需要确实所有五聚体都聚集。

如本文所用，术语“组装”或“组装成VLP”是指所考虑的结构(VP1蛋白或五聚体)缔合并建立VLP的衣壳。如果将VP1用作起始材料，则组装成VLP可以包括先形成五聚体，这意味着VP1蛋白可以首先形成五聚体，然后形成VLP，或者它们可以直接组装成VLP。VLP的组装是可逆的。

术语“分解”进而是指VLP的衣壳至少部分分解成五聚体结构和/或结构蛋白的过程。可以通过升高温度、通过添加蛋白酶和/或通过减少用于形成VLP的分子间相互作用例如分子间二硫键(例如，通过添加还原剂或添加螯合剂)来诱导分解。这样的条件还可以包括逐步暴露于条件。例如，可以在温度升高之前使组合物与还原剂接触。

诱导VP1和/或五聚体组装成VLP的方法是本领域技术人员通常已知的(Goldmann等人(J.Virol.1999；73(5):4465-69)；DE 195 43 553A1)。这同样适用于将VLP分解为五聚体。因此，技术人员知道用于控制VLP的组装和分解的方法。

在本发明的一个实施方案中，包含VP1或五聚体的组合物中的Ca²⁺离子的浓度用于控制VLP的组装/分解。例如，为了诱导组装，可以增加游离Ca²⁺离子的浓度。如果需要分解，可通过向组合物中添加螯合剂来降低游离Ca²⁺离子的浓度。

诱导组装的另一种选择是增加VP1五聚体的浓度(例如通过减少包含五聚体的组合物中的溶剂)以促进组装成VLP。这可能需要调整碱土金属(例如Ca²⁺或Mg²⁺)的浓度。

根据本发明的优选实施方案，可以通过将VLP暴露于分子间二硫键被还原的条件下(例如通过使VLP暴露于还原条件下)来诱导分解。在一个优选的实施方案中，该步骤在另外存在螯合剂的情况下完成。更优选地，通过在螯合剂存在下和任选地在升高的温度下使VLP暴露于还原条件来诱导分解。

在本发明的特定实施方案中，优选在15℃至30℃，优选20℃至25℃，最优选在约23℃的温度下将VLP暴露于包含DTT和EDTA和/或EGTA的组合物。

根据本发明的优选实施方案，将c)的组合物的五聚体暴露于诱导其聚集的条件下。如果在步骤d)之前执行，此步骤是最合适的。在优选的实施方案中，至少20％，优选至少30％，更优选至少40％的材料(例如五聚体)聚集。

令人惊讶地发现，该步骤可以导致VLP的更均匀的尺寸分布。这样可以实现更好的质量管理和标准化，如果在药物递送系统中使用VLP，这是至关重要的。因此，该额外程序优选地是药物递送系统的质量控制要求的一部分。

术语“聚集体”是指任何颗粒结构。“聚集”是指导致聚集的过程。这个过程是可逆的。

五聚体或VLP的聚集可以通过组合物中VLP的与对照相比增加的平均粒径来确定。较大的粒径可以通过标准方法例如动态光散射(DLS)来确定。

根据本发明的一个具体实施方案，五聚体或VP1的聚集可以由本领域已知的促进蛋白质沉淀的一种或多种试剂(沉淀剂)诱导。因此，根据本发明，最优选使用沉淀剂。

“沉淀剂”是指促进VP1或五聚体聚集的试剂。沉淀剂的概念通常是本领域技术人员已知的。沉淀剂通常用于促进蛋白质的浓缩和纯化。沉淀可以是改变溶剂的溶剂化潜能的结果，更具体地说，是通过降低蛋白质的溶解度来实现的。也可以通过将组合物的pH调节至蛋白质的等电点来降低溶解度。此外，降低组合物的温度也可以降低蛋白质的溶解度。

可能的沉淀剂是例如聚乙二醇(PEG)或醇(例如乙醇)和盐。后者被本领域技术人员称为“盐析剂”。

优选地，根据本发明，沉淀剂是盐。最优选的是包含离子的盐，称为“Hofmeister系列”。Hofmeister系列描述了离子关于其对特定蛋白质的疏水作用(在其影响该蛋白质在溶液中的溶解度的能力方面)的顺序。特别优选对蛋白质具有疏水作用的离子。在本文中，这样的离子称为kosmotropic离子。

优选的是包含至少一种kosmotropic阴离子或阳离子的沉淀剂。优选的阴离子选自柠檬酸根(C₆H₅O₇ ^3-)、磷酸根(PO₄ ^3-)、硫酸根(SO₄ ^2-)、磷酸氢根(HPO₄ ^2-)、磷酸二氢根(H₂PO₄-)、碘酸根(IO₃ ^-)、氢氧根(OH^-)、氟离子(F^-)、溴酸根(BrO₃ ^-)或乙酸根(CH₃COO^-)或它们的组合，更优选的阴离子是柠檬酸根、磷酸根或硫酸根，最优选的阴离子是硫酸根。

优选的阳离子是铵或季铵化合物(NR₄ ⁺，R是烷基或芳基)，例如四甲基铵((CH₃)₄N⁺)或二甲基铵((CH₃)₂N₂ ⁺)。其他优选的阳离子选自钾(K⁺)、铯(Cs⁺)、铷(Rb⁺)或锂(Li⁺)或它们的组合，特别优选的是季铵化合物或铵，最优选的是铵。

因此，该盐优选包含选自以下的阴离子和阳离子：柠檬酸根(C₆H₅O₇ ^3-)、磷酸根(PO₄ ^3-)、硫酸根(SO₄ ^2-)、磷酸氢根(HPO₄ ^2-)、磷酸二氢根(H₂PO₄-)、碘酸根(IO₃ ^-)、氢氧根(OH^-)、氟离子(F^-)、溴酸根(BrO₃ ^-)或乙酸根(CH₃COO^-)、季铵化合物(NR₄ ⁺，R是烷基或芳基)，优选四甲基铵((CH₃)₄N⁺)或二甲基铵((CH₃)₂N₂ ⁺)、铵(NH₄ ⁺)、钾(K⁺)、铯(Cs⁺)、铷(Rb⁺)或锂(Li⁺)，优选包含SO₄ ^2-和/或NH₄ ⁺，或它们的组合。

根据一个优选的实施方案，该盐选自(NH₄)₂SO₄、K₂SO₄、Na₂SO₄、(NH₄)₂HPO₄、K₂HPO₄和Na₂HPO₄。最优选的盐是硫酸铵((NH₄)₂SO₄)。

根据本发明，五聚体的聚集可以通过使五聚体与沉淀剂接触的任何方法来诱导，例如通过将沉淀剂添加至包含五聚体的组合物中，或反之亦然，即将包含五聚体的组合物添加至沉淀剂。其他方法(例如透析以使沉淀剂通过扩散到达五聚体)也是可能的。

根据本发明的一个优选实施方案，通过对包含沉淀剂的组合物，例如包含硫酸铵的组合物进行透析来诱导五聚体的聚集。

根据本发明的一个特别优选的实施方案，包含用于聚集的五聚体的组合物具有0.3至5M，优选至多4M的硫酸铵浓度，甚至更优选的是1.8至2.2M的浓度。最优选的是约2M。

诱导五聚体聚集的步骤的持续时间优选为至少1小时，更优选为至少5小时，甚至更优选为至少12小时，最优选为至少16小时。优选该步骤的持续时间小于24小时。在一个优选的实施方案中，该步骤的持续时间为14至19小时。在最优选的实施方案中，该步骤的持续时间为16至18小时。在此期间，五聚体暴露于诱导聚集的条件下，特别是它们与硫酸铵接触。

在诱导五聚体聚集的步骤之后，有利的是，将五聚体与已经用于诱导聚集的条件分离的步骤包括在本发明的方法中。适用于这样的步骤的方法没有特别限制；允许将五聚体与聚集诱导条件分离的本领域技术人员已知的任何方法均适用。

在本发明的优选实施方案中，通过透析使五聚体与诱导其聚集的条件分离。如果通过使用沉淀剂诱导五聚体的聚集，则可以使用透析。也可以有利地应用透析原理以使五聚体与沉淀剂接触。如果根据本发明的方法包括至少两个透析步骤，最优选的是：针对包含沉淀剂的组合物进行步骤c)的组合物的第一次透析，以及在诱导聚集后针对基本上不含沉淀剂的组合物进行第二次透析。

用于将五聚体与沉淀剂分离的透析优选是针对至少类似于生理条件的组合物。这样的组合物优选包含盐并且具有6至8.5，优选6.5至8.5，更优选7至8，最优选7.2至7.5，特别是7.5的pH。组合物的克分子渗透压浓度优选为280至310mosmol/l，最优选308mosmol/l。该组合物可以例如具有0.8至0.92％(w/v)，优选0.9％(w/v)的盐水(氯化钠)浓度。

将五聚体与用于诱导聚集的条件分离优选进行至少1小时，更优选至少5小时、12小时，更优选至少18小时，更优选大约24小时或更长时间。取决于被诱导聚集的五聚体的浓度、包含五聚体的组合物以及沉淀剂的性质和浓度，更长的时间段也是可能的。在一个优选的实施方案中，将包含聚集的五聚体的组合物针对与生理条件相似的组合物透析约24小时。

组合物优选还包含缓冲剂。合适的缓冲系统是本领域技术人员已知的。在本发明的一个优选实施方案中，组合物包含TRIS缓冲剂、HEPES缓冲剂、磷酸盐缓冲剂或碳酸氢盐缓冲剂系统。最优选的是TRIS缓冲剂。

在最优选的实施方案中，组合物包含10mM Tris-HCl和150mM NaCl，并且pH为7.5。

为了促进五聚体组装成VLP，组合物可进一步包含二价离子，例如Ca²⁺、Mg²⁺、Ba²⁺、Cu²⁺、Fe²⁺、Zn²⁺或其组合。最优选的是Ca²⁺，例如CaCl₂。在一个优选的实施方案中，组合物包含1-3mM CaCl₂，优选2mM CaCl₂。

在本发明的非常优选的实施方案中，至少与生理条件相似的组合物包含10mMTris-HCl、150mM NaCl和2mM CaCl₂，并且pH为7.5。

在本发明的另一方面，令人惊奇地发现，与五聚体的储存相比，VLP(rVLP)的储存是有利的。如果储存五聚体然后将其解冻并重新组装，则主要形成“微小”颗粒以及聚集体。这些VLP不适合用于生产药物递送系统。然而，在储存后已解离并重新组装的VLP形成根据本发明的适当尺寸的VLP的特别均匀的群体。因此，在本发明的一个实施方案中，向组合物提供具有20nm至70nm，优选30nm至70nm，更优选35nm至65nm，更优选40至60nm的平均直径的颗粒。为了满足质量控制要求，均匀的尺寸分布很重要。

在一个优选的实施方案中，根据本发明的方法包括储存来自步骤d)的组合物的VLP的步骤。将VLP在约-80℃至约4℃的温度下储存至少10小时、15小时、20小时、优选至少24小时是可能的。甚至超过3天的储存是可能的。

在优选的实施方案中，将VLP储存在低于0℃的温度下(冷冻)。可以使用不同的冷却速度进行冷冻。例如，通过施加每分钟约-1℃的冷却速度可发生“慢速”冷冻，而可通过使样品(即包含组合物的容器)与液氮接触或通过将样品置于-80℃的冰箱中来进行快速冷冻。

在一个优选的实施方案中，在包含冷冻添加剂的组合物中进行储存，所述冷冻添加剂优选选自由以下组成的组：多元醇，糖，无机盐，有机盐，氨基酸，聚合物，极端电解质(extremolyte)或衍生物或其组合。

在一个优选的实施方案中，无机盐包含硫酸根阴离子。优选的包含硫酸根阴离子的盐是硫酸钾、硫酸钠、硫代硫酸钠、硫酸镁和硫酸铵。优选地，无机盐是硫酸铵。

氨基酸优选是甘氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸或丙氨酸。优选的氨基酸衍生物是甜菜碱。其他可能的冷冻添加剂是甘油、蔗糖、DMSO、四氢嘧啶(ectoin)或(hydroxyectoin)。

已经发现，添加冷冻添加剂，特别是添加无机盐(例如包含硫酸根阴离子的盐，特别是硫酸铵)和/或氨基酸衍生物(例如甜菜碱)在VLP的稳定性、功能性或功效方面是有利的。如上所述，当使用VLP作为药物递送系统时，特别期望增强的稳定性和/或功能性或功效。令人惊讶的是，在步骤d)的组合物中冷冻添加剂的添加在稳定性和功能性或功效方面对步骤f)的包装的VLP有影响。

冷冻添加剂的目的是保护生物组织免受冷冻损害(即由于冰的形成)。冷冻添加剂通常通过增加细胞中的溶质浓度来发挥作用。但是，为了适合生物学用途，它们必须易于穿透并且必须对细胞没有毒性。因此，这样的添加剂适合为五聚体和/或VLP提供较温和的储存条件。可以将冷冻添加剂添加到包含五聚体和/或VLP的组合物中以冷冻储存。

根据本发明的一个特别优选的实施方案，将冷冻添加剂添加到包含VLP的组合物中，以在使用两个透析步骤(两步重新组装)组装VLP(优选rVLP)之后进行随后的冷冻。

除了基于多元醇的冷冻添加剂以外，冷冻添加剂的合适摩尔浓度可以是0.5M、0.6M、0.7M、0.8M、0.9M、1M、1.1M、1.2、1.3M、1.4M、1.5M、2M、3M、4M、5M。这些冷冻添加剂优选以约1M的摩尔浓度使用，优选以1M的摩尔浓度使用。

基于多元醇的冷冻添加剂可以以至少0.3M、至少0.4M、至少0.5M、至少0.6M、至少0.7M、至少0.8M、至少0.9M、至少1M、至少2M或至少3M的摩尔浓度使用。优选地，可以以约0.6M至0.7M的浓度，更优选以0.68M的浓度使用基于多元醇的冷冻添加剂(优选为5％的甘油)。

可替代地，可以基于包含五聚体和/或VLP的组合物的体积百分比来添加基于多元醇的冷冻添加剂。合适的体积百分比包括3％(v/v)、4％(v/v)、5％(v/v)、6％(v/v)、7％(v/v)、8％(v/v)、9％(v/v)或10％(v/v)。优选地，以5％(v/v)添加基于多元醇的冷冻添加剂。

在本发明的优选实施方案中，对步骤c)的五聚体和/或步骤d)的VLP进行纯化。在本发明的上下文中，术语“纯化”是指从复杂的组合物中分离或分开VP1、五聚体或VLP。可能的方法包括沉淀、错流过滤、超滤、色谱例如制备色谱，优选尺寸排阻色谱，和/或动态光散射(DLS)。

是可以使用的示例性超滤单元。

术语“色谱”是指一种方法，其允许通过在固定相和流动相之间分配其各个成分来分开物质的混合物。特别地，色谱是指通过首先将目标物质结合并富集到固定相上然后在第二步骤中将其洗脱(色谱的结合和洗脱模式)或通过将杂质结合到固定相上并提高流通中的目标分子的纯度(流通模式)来纯化物质的方法。

色谱可以根据流动相中包含的分析物与固定相之间的相互作用进行分组。根据本发明的色谱的优选类型包括“反相”色谱、“离子交换”色谱、“亲和”色谱或尺寸排阻色谱(SEC)。在离子交换色谱中，可以基于固定相中存在的电荷将纯化方法进一步分开为阳离子交换色谱(CEX)(其中固定相具有负电荷，从而保留带正电荷的分子)以及阴离子交换色谱(AEX)(其中固定相具有正电荷，从而保留带负电荷的分子)。

特别地，色谱可以用于纯化通过根据本发明的方法获得的作为中间产物的rVLP。特别地，可以使用AEX纯化rVLP。

AEX中使用的固定相可以根据通过将固定相中存在的材料交换成“强阴离子交换剂”和“弱阴离子交换剂”所提供的离子相互作用的强度来进一步描述。表述“阴离子交换剂”或“阴离子交换基质”是同义词，两者均指天然或人造物质，其可以结合阴离子并可以将其与周围介质中的阴离子交换。阴离子交换剂携带正离子并交换带负电荷的抗衡离子。

本发明的VLP可以用核酸酶例如DNAse或RNAse进一步处理和/或进行无菌过滤。如果将核酸例如表达载体或mRNA或其组合用作货物，则优选进行核酸酶处理。不同的核酸酶是本领域技术人员已知的，包括例如benzonase。核酸酶用于水解未与VLP缔合的残留DNA或mRNA。无菌过滤的方法尤其包括使用适于去除杂质的过滤器的渗滤或超速离心。这些处理对于本发明的VLP的临床应用特别有利。

可以将根据本发明的包含VLP的组合物的粒径分布评估为“多分散指数”(PDI)。PDI表示组合物中粒径的分布，因此描述了颗粒的均匀性。可以使用不同的方法获得PDI值，包括凝胶渗透色谱/尺寸排阻色谱、流变学、溶液粘度、膜渗透或光散射。

PDI优选地通过动态光散射(DLS)确定。在DLS中，原始分布是指示从各种“切片”散射的光量的强度分布。DLS允许根据分布统计信息确定平均尺寸和与该平均尺寸的标准偏差。相对多分散性可以通过将标准偏差除以平均值来确定。从分布的相对多分散性可以得出作为其平方的多分散指数(PDI)。通过DLS获得的PDI值可以分为单分散的(PDI＜0.1)组合物和多分散的(PDI＞0.1)组合物，由此在多分散的组中较小的值还表明组合物内的分布更均匀。

根据本发明，0.1至0.4的PDI值是优选的。PDI值更优选为0.1至0.3，甚至更优选为0.1至0.2。

根据本发明的包含VLP的组合物的平均直径可以通过视觉方法(例如显微镜，优选地配备有确定平均直径的软件)来测量，但是也可以通过分析光散射方法例如DLS或纳米跟踪方法例如NTA来测量。

组合物中的VLP含量可以通过例如FFF-MALS和/或DLS测量。两种方法都可以区分尺寸合适的VLP和聚集体、“微小体”(小颗粒)和其他杂质，例如盐、碎片或五聚体。

这种包含根据本发明的VLP的组合物尤其满足通常施加在药物递送系统上的要求。显然，这样的组合物是均匀的并且具有高纯度。

在另一方面，本发明涉及可通过根据本发明的方法获得的药物递送系统。这样的药物递送系统具有如上所述的优点。特别地，这样的药物递送系统可以用于治疗和/或诊断的方法中，优选地用于治疗神经系统疾病，即CNS疾病，即脑白质营养不良，特别是Canavan病或Krabbe病。

因此，本发明还涉及用根据本发明的药物递送系统治疗病症，特别是CNS疾病，即脑白质营养不良，特别是Canavan病或Krabbe病的方法。治疗方法优选包括将药物递送系统施用至有需要的受试者的步骤。

本发明还涉及该药物递送系统在制备用于治疗神经系统疾病(即CNS疾病，即脑白质营养不良，特别是Canavan病或Krabbe病)的药物中的用途。治疗方法优选不包括增加待治疗的受试者的BBB的穿透性的步骤。优选地，将本发明的药物递送系统施用至尚未接受任何用于损害或破坏BBB的化学或物理治疗的患者。

在一个实施方案中，根据本发明的VLP穿过血脑屏障(BBB)。因此，在本发明的一个实施方案中，药物递送系统可以用于跨过BBB递送分别地天冬氨酸酰化酶或半乳糖脑苷脂酶或编码相应酶的表达载体或编码相应酶的mRNA或其组合。根据本发明，药物递送系统和/或VLP和/或分别地天冬氨酸酰化酶或半乳糖脑苷脂酶和/或编码相应酶的表达载体和/或编码相应酶的mRNA和/或其组合可以穿过BBB。

重要的是，药物递送系统穿过血脑屏障使药物递送系统能够发挥其靶向脑内的特定细胞群的功能，即将货物递送至靶细胞。在本发明的上下文中，所述药物递送系统包括递送至靶细胞和/或递送到靶细胞中。

在一个优选的实施方案中，本发明的VLP和/或其货物在施用至待治疗的受试者，特别是人后，可以在少于10天，优选少于5天，更优选在施用后少于3天在CNS中被检测到。优选将药物递送系统静脉内施用至受试者。当将VLP用作可靠的药物递送系统时，这特别有利。

优选地，该方法不需要BBB的完整性损失或增加BBB的穿透性。

根据本发明，不需要在施用药物递送系统之前或期间损害BBB的穿透性。因此，BBB优选在生理上是完整的，这意味着与健康的天然状态相比，完整性没有降低和/或穿透性没有增加。本发明的VLP优选穿过生理上完整的BBB。

包含药物递送系统的组合物优选不需要可能破坏BBB完整性的添加剂。因此，在本发明的最优选的实施方案中，药物递送系统不含任何可影响BBB的穿透性的添加剂。

材料和方法

VLP制造

病毒样颗粒(VLP)通过使用衍生自秋粘虫(草地贪夜蛾)的Sf9昆虫细胞系(ThermoFisher Scientific)通过蛋白表达来制造。通过用含有John Cunningham病毒VP1-蛋白表达盒的重组杆状病毒感染细胞来产生VLP。重组杆状病毒是通过使用Bac-to-

杆状病毒表达系统(Thermo Fisher Scientific)制备的。在pH 6.3下在3.4L生物反应器(INFORSHT Minifors)中放置7至10天后，产生VLP。随时间控制气流和温度(26℃)。为了除去细胞和细胞碎片，将悬浮液在4℃、5.000g下离心，收集含有VLP的上清液。

之后，使用两种不同的浓缩方法对VLP进行浓缩：使用7.5％的聚乙二醇(PEG)的沉淀或使用

flow^TM系统(GE Healthcare)的错流。为了进行PEG沉淀，将澄清的上清液与PEG混合以达到7.5％(v/v)的浓度，并在4℃下孵育2小时，然后通过在4℃、10.000g离心分离出沉淀并将其悬浮在50mM NaCl、10mM Tris-HCl(pH 7.5)中。错流是使用配有300kDa截止膜(

300kDa ECO,Sartorius)的

flow^TM系统进行的。流动超滤在1.5bar的恒定压力下以8的因子(1L上清液针对8L缓冲液)进行。

通过在室温下使用5mM DTT和10mM EDTA持续70分钟将VLP进一步分解为五聚体，然后使用HiScale CaptoQ柱(GE Healthcare)通过阴离子交换色谱(AEX)以150mM至1MNaCl的NaCl梯度纯化五聚体。用250mM NaCl步骤洗脱五聚体。洗脱后，如下处理五聚体：

立即放入20kDa截止值的透析盒(Slide-A-Lyzer^TMG2 Dialysis Device,ThermoFisher Scientific)中，并通过两步重新组装通过透析(两步透析)进行重新组装。首先，将五聚体针对2M硫酸铵缓冲液(“AS”，10mM Tris-HCl，150mM NaCl，2M(NH4)2SO4，pH 7.5)透析24小时，然后对于接下来的24小时转移到10mM Tris-HCl、150mM NaCl、2mM CaCl2(pH7.5)(标准重缔合缓冲液，“ST”)中。为了从VLP中分离出未重新组装的材料和聚集体，使用HiPrep^TM

S-500HR色谱柱(GE Healthcare)通过尺寸排阻色谱(SEC)在级分的多分散指数(PDI)控制下在使用Zetasizer ZS Nano(Malvern Inc.)的动态光散射(DLS)中纯化包含VLP的组合物。选择具有目标尺寸的VLP级分并合并，然后在带有5kDa截止膜的

浓缩器(Sartorius)中浓缩，然后在-80℃下储存(如果适用)。

用于验证BBB渗透性的人工血脑屏障(BBB)模型

在二室人工BBB模型中使用共培养物通过直接定量靶细胞中渗透的材料的表达的hASPA或hGALC mRNA或蛋白(包装在VLP中的pNL-BB-hASPA或pNL-BB-hGALC)评估VLP的BBB渗透性。

为此，将3*10⁴个人星形细胞瘤细胞接种至填充有900μl培养基(DMEM+10％FCS+1％Pen/Strep，Thermo Fisher Scientific)的24孔板(Greiner Bio-One)中。将7.5*10⁴个BBB细胞(HBEC-5i，脑微血管内皮)接种至具有200μl培养基(DMEM/F-12，HEPES，ThermoFisher Scientific)的24孔可渗透支持物(插件，1μm，ThinCert，Greiner Bio-One)中。随后，将插件转移至接种人星形细胞瘤细胞的24孔板中。未接种BBB细胞的插件作为对照。细胞孵育96h至120h，每隔一天更换孔中的培养基。

对于BBB渗透测定，向插件加入25μg负载hASPA或hGALC质粒的VLP或单独hASPA或hGALC质粒。还将样品添加至未接种BBB细胞的插件作为对照。24小时或48小时后，将制备的插件小心转移至每孔装有900μl培养基(DMEM/F-12，HEPES，Thermo Fisher Scientific)的新鲜24孔板中，再孵育24小时或48小时。共72小时后收获细胞沉淀。用PBS洗涤后剪下插件膜，并转移至1.5ml试管中。用TrypLE分离细胞后，去除膜并沉淀细胞。将细胞沉淀在-80℃下冷冻，直至进一步用于RNA分离、cDNA合成和qPCR分析。

编码hASPA或hGALC的表达载体的克隆

为了生成构建体pNL-BB-hASPA，如EP2862860 A1的SEQ IDNO：14中所公开的，在Thermo Fisher Scientific(GeneArt基因合成)合成hASPA基因，两端具有额外连接的限制性位点。用基于限制性酶的克隆将该基因插入pNL1.1质粒主链(Promega)中。该构建体包含CMV启动子。

为了生成构建体pNL-BB-hGALC，如EP2882284 A1的SEQ IDNO：1中所公开的，在Thermo Fisher Scientific(GeneArt基因合成)合成hGALC基因，并添加包含66个核苷酸的信号序列(参见本申请的SEQ ID NO：4和NCBI参考序列NM_000153.4(核苷酸1至2100))，得到如EP2882284A1的SEQ ID NO：2和本申请的SEQ ID NO：3中公开的蛋白质序列。限制性位点连接在两端。使用基于限制性酶的克隆将该基因插入pNL1.1.质粒主链(Promega)中。该构建体包含CMV启动子。

用编码hASPA或hGALC的表达载体或编码hASPA或hGALC的mRNA包装VLP

为了将hASPA或hGALC表达载体或hASPA或hGALC mRNA包装到VLP中，从-80℃取出预重新组装的VLP，并使用热振荡器(23℃，350rpm)解冻。随后，通过在解离缓冲液(20mMTris-HCl，150mM NaCl，5mM DTT和10mM EDTA)的存在下，将样品在23℃和450rpm下孵育15分钟来解离VLP。在hASPA或hGALC表达载体或hASPA或hGALC mRNA的存在下，解离的VLP被重新组装。简而言之，将解离的VLP与hASPA或hGALC表达载体或hASPA或hGALC mRNA以适当的浓度充分混合(VLP与表达构建体的包装比例为1:0.2或1:0.5；VLP与mRNA的包装比例为1:0.2)，然后将混合物针对标准重缔合缓冲液(10mM Tris-HCl，150mM NaCl，2mM CaCl2，pH7.5)使用20kDa MWCO透析室(Slide-A-Lyzer^TMMINI透析设备，Thermo FisherScientific)进行透析。将样品孵育16至18小时。将样品从透析室转移到新鲜的反应杯中，并将未包装的核酸即表达载体或mRNA通过在37℃下使用每25μg VLP 40u

核酸酶(Merck)和2.5mM MgCl2孵育1小时来消化。过滤样品(

离心管过滤器；孔径0.22μm)，并在液态N2中冷冻。之后，分析和/或将VLP储存在-80℃。

VLP表征

为了验证样品的稳定性，根据制造商的说明，使用TychoNT.6(Nanotemper)通过nDSF评估每个样品的拐点温度。

为了分析样品组成，进行了不对称流场流分级(AF4，Wyatt Inc.)。通过使用多角度光散射(MALS)、动态光散射(DLS)和UV检测器分析样品。

借助在80kV电压下工作的Zeiss EM900电子显微镜进行透射电子显微镜(TEM)分析以在不同的实验步骤下直接可视化样品。对于这种方法，样品事先使用2％乙酸铀酰(Sigma Aldrich)在碳涂层的铜网格(Plano GmbH)上染色。

为了定量包封的货物量，根据生产商的说明(Thermo Fisher Scientific)，在96孔板中进行了RiboGreen^TM测定。在480/520nm处测量荧光。仅使用货物的标准曲线计算包封量。

为了确认VLP的存在，借助于Hitachi Chromaster和带有连接的前置柱的Sepax2000柱进行尺寸排阻色谱(SEC)。使用10mM Tris-HCl/150mM NaCl作为运行缓冲液。使用设置为220nm、260nm和280nm的二极管阵列检测器进行样品分析。

为了分析VLP的存在并确认蛋白质和包封货物的共定位，使用1％琼脂糖凝胶和Tris-醋酸盐缓冲液进行琼脂糖凝胶电泳(AGE)。使用甘油和溴酚蓝制备上样缓冲液。将凝胶与GelRed^TM孵育后，观察包封货物。为了观察VLP，将凝胶与Instant Blue孵育。使用Biorad Gel Doc^TMXR+凝胶文件系统拍摄图像。

在细胞中的hASPA或hGALC表达：RNA分离、cDNA合成和qPCR

使用hASPA或hGALC表达载体的细胞处理

将不同细胞系与包装有hASPA或hGALC编码质粒的VLP或单独的hASPA或hGALC编码质粒孵育48或72小时后，使用胰蛋白酶收获人星形细胞瘤或小鼠成纤维细胞，沉淀，并用PBS洗涤。还收获转染hASPA或hGALC编码质粒的细胞，并沉淀用于随后的RNA分离、cDNA合成和qPCR。为此，将Lipofectamin 3000(Thermo Scientific)与Opti-MEM(ThermoScientific)孵育，将1μg质粒DNA与P3000试剂(Thermo Scientific)孵育，混合并在室温下孵育15分钟，并加入细胞中。将细胞在37℃下孵育48小时。

使用hASPA或hGALC mRNA的细胞处理

将30.000个细胞与包装有hASPA或hGALC编码mRNA的VLP或单独的hASPA/hGALC编码mRNA孵育24小时后，使用胰蛋白酶收获人星形细胞瘤细胞，沉淀，并用PBS洗涤。还收获转染了hASPA/hGALC编码mRNA的细胞，并沉淀用于随后的RNA分离、cDNA合成和qPCR。对于转染，将稀释的转染试剂溶液(Stemfect^TM转染试剂盒)和稀释的mRNA溶液混合，室温孵育15分钟，并加入细胞中。分别与6.25μg VLP、10ng mRNA孵育或转染10ng mRNA。将细胞在37℃下孵育24小时。合并两个孔用于RNA分离/cDNA合成。

RNA分离

使用RNA分离试剂盒(Macherey-Nagel)从细胞沉淀中分离RNA。分离后，使用NanoDrop(Thermo Scientific)测定RNA浓度。

cDNA合成

使用250ng至500ng(表达载体)或400ng(mRNA)RNA进行cDNA合成。使用RevertAid第一链cDNA合成试剂盒(Thermo Scientific)，使用由Oligo-DT引物和随机引物以1:2的比例组成的引物混合物合成cDNA。向mRNA/水混合物中加入引物混合物、dNTP、反应缓冲液、RiboLock和RevertAid的主混合物，并在热循环仪中进行一步合成。然后，在ddH₂O中以1:5稀释cDNA样品，并将样品储存在-20℃下直至使用。

qPCR

使用EvaGreen染料和以1:20稀释度的用于hASPA或hGALC的适当引物在Lightcycler(CFX96 Touch，BioRad)中进行qPCR。

免疫细胞化学

将盖玻片上的30.000个细胞与6.25μg包装有hASPA或hGALC编码mRNA的VLP或单独的10ng hASPA/hGALC编码mRNA孵育48h后，用PBS洗涤人星形细胞瘤细胞，并用4％PFA固定。用10ng hASPA/hGALC编码mRNA转染的细胞也用PBS洗涤，并用4％PFA固定。如上所述，将细胞与lipofection在37℃下孵育48小时。

固定的细胞用PBS洗涤，用0.2％Triton-X-100透化，再次洗涤，并用1％BSA在室温下封闭30min。将细胞与一抗(GALC：Poteintech；ASPA：Abcam)在4℃下孵育过夜。

将细胞与在1％BSA中稀释的二抗(Cy5标记的山羊抗兔IgG，Abcam)在室温下孵育2小时。用PBS洗涤细胞，并在显微镜载玻片上用RotiMount(使用DAPI，Roth)覆盖细胞。使用共聚焦显微镜(Leica SP8)分析干燥样品。

小鼠脑中的hASPA和hGALC表达

Balb/C小鼠(每个时间点每个构建体每组4只)在尾静脉中注射了与hASPA或hGALCmRNA缔合的VLP，或注射了单独的mRNA，并在注射后6或24h终止。用PBS灌注小鼠，取出大脑并冷冻休克。

使用GentleMACS^TM解离器(Miltenyi Biotec)裂解每只动物的一个解冻的小鼠大脑半球(每组n＝4)，并根据Nucleo

RNA分离试剂盒(Macherey-Nagel)的说明进行RNA分离。

根据生产商的说明，使用RevertAid^TM第一链cDNA合成试剂盒(Thermo FisherScientific)进行cDNA合成。

如上所述进行qPCR(细胞中hASPA或hGALC表达)。对于脑样品的qPCR，使用BioradOpus 384热循环仪，并计算了与缓冲液对照相比的倍数变化。

实施例

1.小鼠器官中ASPA表达的检测

为了确保在后续实验中充分且显著特异性地检测人ASPA的表达，使用种属特异性引物评估了小鼠ASPA在不同小鼠器官中的内源性表达。结果见图1。可以看出，当使用小鼠特异性引物时，在所有器官中均检测到ASPA表达，肾脏和肺中的水平最高(对应于最低值)。相比之下，使用人ASPA特异性引物，在小鼠器官中未检测到ASPA表达，因此证明引物适用于特异性检测人ASPA(hASPA)的表达。

2.hASPA的表达和用编码hASPA的表达载体包装VLP

将VLP与hASPA编码质粒以VLP与表达构建体1:0.2和1:0.5的包装比例混合。如上文材料和方法所述，对如此包装的VLP进行表征。将人星形细胞瘤细胞和小鼠成纤维细胞与包装的VLP孵育，并测定hASPA的表达。转染了hASPA编码质粒的细胞和与作为对照的未包装的质粒孵育的细胞。结果概述于表4，并描述于图2。

表4

3.与hASPA质粒缔合的VLP在体外BBB模型中导致星形细胞瘤中hASPA的表达

如上文材料和方法所述，评估VLP的BBB渗透性。结果如图3所示。hASPA在与BBB细胞(HBEC-5i内皮细胞)共培养的星形细胞瘤细胞中显著表达，证明与hASPA缔合的VLP穿过人工BBB。在与BBB细胞共培养的星形细胞瘤细胞中，较长的共培养时间导致较高的表达，表明随着时间的推移，与hASPA缔合的VLP通过人工BBB的渗透性增加，和随着时间的推移，星形细胞瘤细胞中hASPA的表达增加，并且内皮细胞中hASPA的表达减少。

4.小鼠器官中GALC表达的检测

为了确保在后续实验中充分且显著特异性地检测人GALC表达，使用种属特异性引物评估了小鼠GALC在不同小鼠器官中的内源性表达。结果如图4所示。可以看出，当使用小鼠特异性引物时，在所有器官中均检测到GALC表达，在肾脏和肺中的水平最高(对应于最低值)。相比之下，使用人GALC特异性引物，在小鼠器官中未检测到GALC表达，因此证明引物适用于特异性检测人GALC(hGALC)的表达。

5.hGALC表达和使用编码hGALC的表达载体包装VLP

将VLP与hGALC编码质粒以VLP与表达构建体1:0.2的包装比例混合。如上文材料和方法所述，对如此包装的VLP进行表征。将人星形细胞瘤细胞和小鼠成纤维细胞与包装的VLP共同孵育，并测定hGALC的表达。结果概述于表5，并描述于图5。

表5

6.与hGALC质粒缔合的VLP在体外BBB模型中导致星形细胞瘤中hGALC的表达

如上文材料和方法所述，评估VLP的BBB渗透性。结果如图6所示。hGALC在与BBB细胞(HBEC-5i内皮细胞)共培养的星形细胞瘤细胞中显著表达，证明与hGALC缔合的VLP穿过人工BBB。在与BBB细胞共培养的星形细胞瘤细胞中，较长的共培养时间导致较高的表达，表明随着时间的推移，与hGALC缔合的VLP通过人工BBB的渗透性增加，和随着时间的推移，星形细胞瘤细胞中hGALC的表达增加，并且内皮细胞中hGALC的表达减少。

7.用hASPA和hGALC mRNA包装VLP

如上所述，用编码hASPA和hGALC酶的mRNA包装VLP。概述见表6：

表6

如表6所示，用hASPA或hGALC mRNA包装的VLP是稳定的，并且可用mRNA包装。包装后样品中尺寸均匀的VLP可通过不同方法进行检测。还可见mRNA缔合的VLP条带(琼脂糖凝胶电泳)。因此，两种RNA的包装均有效。

两种VLP(分别与hASPA或hGALC mRNA缔合)均显示出均匀的尺寸分布，即DLS分析中仅有一个峰(图7)。

8.细胞中hASPA和hGALC的表达(mRNA为货物)/qPCR

为了评价使用mRNA作为VLP的货物后人星形细胞瘤细胞中hASPA和hGALC mRNA的表达，如上所述进行了qPCR分析。与与mRNA缔合的VLP孵育后，与两个对照相比，检测到大量的两种mRNA(图8)。因此，显示了与hASPA和hGALC mRNA缔合的VLP可有效用于细胞转染。

9.细胞中hASPA和hGALC的表达(mRNA为货物)/免疫细胞化学

通过免疫细胞化学法证实人星形细胞瘤细胞中hASPA和hGALC的表达(图9)。在细胞与与mRNA缔合的VLP孵育后，在样品中检测到hASPA和hGALC蛋白的表达。在对照样品中看到低得多的表达或无表达。

10.小鼠脑中hASPA和hGALC的表达

使用裂解的小鼠脑的体内实验证实了在小鼠中注射与mRNA缔合的VLP后hASPA和hGALC的表达(mRNA)(图10)。对照显示低得多的表达。6小时后的表达与24小时相比更高，可能是由于mRNA的使用和随着时间的推移而耗竭。

实施方案

1.与酶或编码所述酶的表达载体缔合的VLP，其用于治疗受试者的脑白质营养不良的方法，其中所述酶是天冬氨酸酰化酶或半乳糖脑苷脂酶。

2.根据实施方案1所述使用的VLP，其中

(i)该酶为天冬氨酸酰化酶，和脑白质营养不良为Canavan病；或

(ii)该酶为半乳糖脑苷脂酶，和脑白质营养不良为Krabbe病。

3.根据实施方案1或2所述使用的VLP，其中VLP不包含病毒遗传物质，并且表达载体不编码病毒蛋白。

4.根据前述实施方案中任一项所述使用的VLP，其中所述受试者是动物或人，优选地是人。

5.根据前述实施方案中任一项所述使用的VLP，其中所述酶包含在其整个长度上与根据SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少80％、优选至少90％相同的氨基酸序列，更优选具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列；或其中所述酶包含在其整个长度上与根据SEQ ID NO：3的氨基酸序列至少80％、优选至少90％相同的氨基酸序列，更优选地具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列。

6.根据前述实施方案中任一项所述使用的VLP，其中所述表达载体具有小于7kb、优选小于6kb、更优选小于5kb、最优选小于4kb的尺寸。

7.根据前述实施方案中任一项所述使用的VLP，其中所述表达载体具有选自CMV和CAG的启动子。

8.根据前述实施方案中任一项所述使用的VLP，其中所述酶由核苷酸序列编码，所述核苷酸序列在其整个长度上与SEQ ID NO：2的核苷酸序列至少70％、优选至少80％、更优选至少90％相同，最优选地是SEQ ID NO：2的核苷酸序列；或者所述酶由核苷酸序列编码，该核苷酸序列在其整个长度上与SEQ ID NO：4的核苷酸序列至少70％、优选至少80％、更优选至少90％相同，最优选地是SEQ ID NO：4的核苷酸序列。

9.根据前述实施方案中任一项所述使用的VLP，其中所述VLP衍生自人多瘤病毒，优选JCV。

10.根据前述实施方案中任一项所述使用的VLP，其中所述VLP与所述酶或所述表达载体一起穿过血脑屏障，优选生理上完整的血脑屏障，以进入CNS。

11.根据实施方案10所述使用的VLP，其中所述酶或所述表达载体进入星形胶质细胞、少突胶质细胞、小胶质细胞或神经元，优选少突胶质细胞。

12.根据前述实施方案中任一项所述使用的VLP，其中所述VLP经口或胃肠外施用，优选静脉内施用。

13.根据前述实施方案中任一项所述使用的VLP，其中靶细胞与有效量的酶接触。

14.根据前述实施方案中任一项所述使用的VLP，其中所述酶在至少10天、优选至少20天、更优选至少30天内具有治疗有效的酶活性。

15.根据前述实施方案中任一项所述使用的VLP，其中所述VLP由JC病毒的VP1蛋白组成。

16.根据实施方案15所述使用的VLP，其中所述VP1蛋白包含在其整个长度上与根据SEQ ID NO：5或6的氨基酸序列至少80％相同、优选至少90％相同的氨基酸序列。

17.用于治疗受试者的脑白质营养不良的方法的药物组合物，其中所述药物组合物包含根据实施方案1至16中任一项所述的VLP和药学上可接受的载剂和/或赋形剂。

18.表达载体，其具有编码酶的编码区、选自CAG和CMV的启动子，并且具有小于7kb、优选小于6kb、更优选小于5kb、最优选小于4kb的尺寸，其中所述酶是天冬氨酸酰化酶或半乳糖脑苷脂酶。

19.根据实施方案18所述的表达载体，其中所述编码区包含在其整个长度上与SEQID NO：2的核苷酸序列至少70％、优选至少80％、更优选至少90％相同的核苷酸序列，最优选地是SEQ ID NO：2的核苷酸序列，或其中所述编码区包含在其整个长度上与SEQ ID NO：4的核苷酸序列至少70％、优选至少80％、更优选至少90％相同的核苷酸序列，最优选地是SEQ ID NO：4的核苷酸序列。

20.将VLP与酶或编码酶的表达载体缔合的方法，其中所述酶是天冬氨酸酰化酶或半乳糖脑苷脂酶，并且其中所述方法包括以下步骤：

a)提供包含VP1蛋白的组合物，

b)将a)的组合物的VP1蛋白暴露于诱导VP1组装成VLP的条件下，

c)将b)的组合物的VLP暴露于将VLP分解成五聚体的条件下，

e)将d)的组合物的VLP暴露于将VLP分解成五聚体的条件下，

f)将e)的组合物的五聚体与酶或表达载体暴露于诱导五聚体组装成与所述酶或表达载体缔合的VLP的条件下。

21.可通过根据实施方案20的方法获得的VLP。

序列表

<110> 纽卫制药有限公司

<120> 用于治疗脑白质营养不良的VLP

<130> 62 907 K

<150> PCT/EP2020/064324

<151> 2020-05-22

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 313

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

Met Thr Ser Cys His Ile Ala Glu Glu His Ile Gln Lys Val Ala Ile

1 5 10 15

Phe Gly Gly Thr His Gly Asn Glu Leu Thr Gly Val Phe Leu Val Lys

20 25 30

His Trp Leu Glu Asn Gly Ala Glu Ile Gln Arg Thr Gly Leu Glu Val

35 40 45

Lys Pro Phe Ile Thr Asn Pro Arg Ala Val Lys Lys Cys Thr Arg Tyr

50 55 60

Ile Asp Cys Asp Leu Asn Arg Ile Phe Asp Leu Glu Asn Leu Gly Lys

65 70 75 80

Lys Met Ser Glu Asp Leu Pro Tyr Glu Val Arg Arg Ala Gln Glu Ile

85 90 95

Asn His Leu Phe Gly Pro Lys Asp Ser Glu Asp Ser Tyr Asp Ile Ile

100 105 110

Phe Asp Leu His Asn Thr Thr Ser Asn Met Gly Cys Thr Leu Ile Leu

115 120 125

Glu Asp Ser Arg Asn Asn Phe Leu Ile Gln Met Phe His Tyr Ile Lys

130 135 140

Thr Ser Leu Ala Pro Leu Pro Cys Tyr Val Tyr Leu Ile Glu His Pro

145 150 155 160

Ser Leu Lys Tyr Ala Thr Thr Arg Ser Ile Ala Lys Tyr Pro Val Gly

165 170 175

Ile Glu Val Gly Pro Gln Pro Gln Gly Val Leu Arg Ala Asp Ile Leu

180 185 190

Asp Gln Met Arg Lys Met Ile Lys His Ala Leu Asp Phe Ile His His

195 200 205

Phe Asn Glu Gly Lys Glu Phe Pro Pro Cys Ala Ile Glu Val Tyr Lys

210 215 220

Ile Ile Glu Lys Val Asp Tyr Pro Arg Asp Glu Asn Gly Glu Ile Ala

225 230 235 240

Ala Ile Ile His Pro Asn Leu Gln Asp Gln Asp Trp Lys Pro Leu His

245 250 255

Pro Gly Asp Pro Met Phe Leu Thr Leu Asp Gly Lys Thr Ile Pro Leu

260 265 270

Gly Gly Asp Cys Thr Val Tyr Pro Val Phe Val Asn Glu Ala Ala Tyr

275 280 285

Tyr Glu Lys Lys Glu Ala Phe Ala Lys Thr Thr Lys Leu Thr Leu Asn

290 295 300

Ala Lys Ser Ile Arg Cys Cys Leu His

305 310

<210> 2

<211> 942

<212> DNA

<213> 智人

<400> 2

atgacttctt gtcacattgc tgaagaacat atacaaaagg ttgctatctt tggaggaacc 60

catgggaatg agctaaccgg agtatttctg gttaagcatt ggctagagaa tggcgctgag 120

attcagagaa cagggctgga ggtaaaacca tttattacta accccagagc agtgaagaag 180

tgtaccagat atattgactg tgacctgaat cgcatttttg accttgaaaa tcttggcaaa 240

aaaatgtcag aagatttgcc atatgaagtg agaagggctc aagaaataaa tcatttattt 300

ggtccaaaag acagtgaaga ttcctatgac attatttttg accttcacaa caccacctct 360

aacatggggt gcactcttat tcttgaggat tccaggaata actttttaat tcagatgttt 420

cattacatta agacttctct ggctccacta ccctgctacg tttatctgat tgagcatcct 480

tccctcaaat atgcgaccac tcgttccata gccaagtatc ctgtgggtat agaagttggt 540

cctcagcctc aaggggttct gagagctgat atcttggatc aaatgagaaa aatgattaaa 600

catgctcttg attttataca tcatttcaat gaaggaaaag aatttcctcc ctgcgccatt 660

gaggtctata aaattataga gaaagttgat tacccccggg atgaaaatgg agaaattgct 720

gctatcatcc atcctaatct gcaggatcaa gactggaaac cactgcatcc tggggatccc 780

atgtttttaa ctcttgatgg gaagacgatc ccactgggcg gagactgtac cgtgtacccc 840

gtgtttgtga atgaggccgc atattacgaa aagaaagaag cttttgcaaa gacaactaaa 900

ctaacgctca atgcaaaaag tattcgctgc tgtttacatt ag 942

<210> 3

<211> 685

<212> PRT

<213> 智人

<400> 3

Met Ala Glu Trp Leu Leu Ser Ala Ser Trp Gln Arg Arg Ala Lys Ala

1 5 10 15

Met Thr Ala Ala Ala Gly Ser Ala Gly Arg Ala Ala Val Pro Leu Leu

20 25 30

Leu Cys Ala Leu Leu Ala Pro Gly Gly Ala Tyr Val Leu Asp Asp Ser

35 40 45

Asp Gly Leu Gly Arg Glu Phe Asp Gly Ile Gly Ala Val Ser Gly Gly

50 55 60

Gly Ala Thr Ser Arg Leu Leu Val Asn Tyr Pro Glu Pro Tyr Arg Ser

65 70 75 80

Gln Ile Leu Asp Tyr Leu Phe Lys Pro Asn Phe Gly Ala Ser Leu His

85 90 95

Ile Leu Lys Val Glu Ile Gly Gly Asp Gly Gln Thr Thr Asp Gly Thr

100 105 110

Glu Pro Ser His Met His Tyr Ala Leu Asp Glu Asn Tyr Phe Arg Gly

115 120 125

Tyr Glu Trp Trp Leu Met Lys Glu Ala Lys Lys Arg Asn Pro Asn Ile

130 135 140

Thr Leu Ile Gly Leu Pro Trp Ser Phe Pro Gly Trp Leu Gly Lys Gly

145 150 155 160

Phe Asp Trp Pro Tyr Val Asn Leu Gln Leu Thr Ala Tyr Tyr Val Val

165 170 175

Thr Trp Ile Val Gly Ala Lys Arg Tyr His Asp Leu Asp Ile Asp Tyr

180 185 190

Ile Gly Ile Trp Asn Glu Arg Ser Tyr Asn Ala Asn Tyr Ile Lys Ile

195 200 205

Leu Arg Lys Met Leu Asn Tyr Gln Gly Leu Gln Arg Val Lys Ile Ile

210 215 220

Ala Ser Asp Asn Leu Trp Glu Ser Ile Ser Ala Ser Met Leu Leu Asp

225 230 235 240

Ala Glu Leu Phe Lys Val Val Asp Val Ile Gly Ala His Tyr Pro Gly

245 250 255

Thr His Ser Ala Lys Asp Ala Lys Leu Thr Gly Lys Lys Leu Trp Ser

260 265 270

Ser Glu Asp Phe Ser Thr Leu Asn Ser Asp Met Gly Ala Gly Cys Trp

275 280 285

Gly Arg Ile Leu Asn Gln Asn Tyr Ile Asn Gly Tyr Met Thr Ser Thr

290 295 300

Ile Ala Trp Asn Leu Val Ala Ser Tyr Tyr Glu Gln Leu Pro Tyr Gly

305 310 315 320

Arg Cys Gly Leu Met Thr Ala Gln Glu Pro Trp Ser Gly His Tyr Val

325 330 335

Val Glu Ser Pro Val Trp Val Ser Ala His Thr Thr Gln Phe Thr Gln

340 345 350

Pro Gly Trp Tyr Tyr Leu Lys Thr Val Gly His Leu Glu Lys Gly Gly

355 360 365

Ser Tyr Val Ala Leu Thr Asp Gly Leu Gly Asn Leu Thr Ile Ile Ile

370 375 380

Glu Thr Met Ser His Lys His Ser Lys Cys Ile Arg Pro Phe Leu Pro

385 390 395 400

Tyr Phe Asn Val Ser Gln Gln Phe Ala Thr Phe Val Leu Lys Gly Ser

405 410 415

Phe Ser Glu Ile Pro Glu Leu Gln Val Trp Tyr Thr Lys Leu Gly Lys

420 425 430

Thr Ser Glu Arg Phe Leu Phe Lys Gln Leu Asp Ser Leu Trp Leu Leu

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Asp Ser Asp Gly Ser Phe Thr Leu Ser Leu His Glu Asp Glu Leu Phe

450 455 460

Thr Leu Thr Thr Leu Thr Thr Gly Arg Lys Gly Ser Tyr Pro Leu Pro

465 470 475 480

Pro Lys Ser Gln Pro Phe Pro Ser Thr Tyr Lys Asp Asp Phe Asn Val

485 490 495

Asp Tyr Pro Phe Phe Ser Glu Ala Pro Asn Phe Ala Asp Gln Thr Gly

500 505 510

Val Phe Glu Tyr Phe Thr Asn Ile Glu Asp Pro Gly Glu His His Phe

515 520 525

Thr Leu Arg Gln Val Leu Asn Gln Arg Pro Ile Thr Trp Ala Ala Asp

530 535 540

Ala Ser Asn Thr Ile Ser Ile Ile Gly Asp Tyr Asn Trp Thr Asn Leu

545 550 555 560

Thr Ile Lys Cys Asp Val Tyr Ile Glu Thr Pro Asp Thr Gly Gly Val

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Phe Ile Ala Gly Arg Val Asn Lys Gly Gly Ile Leu Ile Arg Ser Ala

580 585 590

Arg Gly Ile Phe Phe Trp Ile Phe Ala Asn Gly Ser Tyr Arg Val Thr

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Gly Asp Leu Ala Gly Trp Ile Ile Tyr Ala Leu Gly Arg Val Glu Val

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Thr Ala Lys Lys Trp Tyr Thr Leu Thr Leu Thr Ile Lys Gly His Phe

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Thr Ser Gly Met Leu Asn Asp Lys Ser Leu Trp Thr Asp Ile Pro Val

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Asn Phe Pro Lys Asn Gly Trp Ala Ala Ile Gly Thr His Ser Phe Glu

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Phe Ala Gln Phe Asp Asn Phe Leu Val Glu Ala Thr Arg

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<210> 4

<211> 2100

<212> DNA

<213> 智人

<400> 4

agtcatgtga cccacacaat ggctgagtgg ctactctcgg cttcctggca acgccgagcg 60

aaagctatga ctgcggccgc gggttcggcg ggccgcgccg cggtgccctt gctgctgtgt 120

gcgctgctgg cgcccggcgg cgcgtacgtg ctcgacgact ccgacgggct gggccgggag 180

ttcgacggca tcggcgcggt cagcggcggc ggggcaacct cccgacttct agtaaattac 240

ccagagccct atcgttctca gatattggat tatctcttta agccgaattt tggtgcctct 300

ttgcatattt taaaagtgga aataggtggt gatgggcaga caacagacgg cactgagccc 360

tcccacatgc attatgcact agatgagaat tatttccgag gatacgagtg gtggttgatg 420

aaagaagcta agaagaggaa tcccaatatt acactcattg ggttgccatg gtcattccct 480

ggatggctgg gaaaaggttt cgactggcct tatgtcaatc ttcagctgac tgcctattat 540

gtcgtgacct ggattgtggg cgccaagcgt taccatgatt tggacattga ttatattgga 600

atttggaatg agaggtcata taatgccaat tatattaaga tattaagaaa aatgctgaat 660

tatcaaggtc tccagcgagt gaaaatcata gcaagtgata atctctggga gtccatctct 720

gcatccatgc tccttgatgc cgaactcttc aaggtggttg atgttatagg ggctcattat 780

cctggaaccc attcagcaaa agatgcaaag ttgactggga agaagctttg gtcttctgaa 840

gactttagca ctttaaatag tgacatgggt gcaggctgct ggggtcgcat tttaaatcag 900

aattatatca atggctatat gacttccaca atcgcatgga atttagtggc tagttactat 960

gaacagttgc cttatgggag atgcgggttg atgacggccc aggagccatg gagtgggcac 1020

tacgtggtag aatctcctgt ctgggtatca gctcatacca ctcagtttac tcaacctggc 1080

tggtattacc tgaagacagt tggccattta gagaaaggag gaagctacgt agctctgact 1140

gatggcttag ggaacctcac catcatcatt gaaaccatga gtcataaaca ttctaagtgc 1200

atacggccat ttcttcctta tttcaatgtg tcacaacaat ttgccacctt tgttcttaag 1260

ggatctttta gtgaaatacc agagctacag gtatggtata ccaaacttgg aaaaacatcc 1320

gaaagatttc tttttaagca gctggattct ctatggctcc ttgacagcga tggcagtttc 1380

acactgagcc tgcatgaaga tgagctgttc acactcacca ctctcaccac tggtcgcaaa 1440

ggcagctacc cgcttcctcc aaaatcccag cccttcccaa gtacctataa ggatgatttc 1500

aatgttgatt acccattttt tagtgaagct ccaaactttg ctgatcaaac tggtgtattt 1560

gaatatttta caaatattga agaccctggc gagcatcact tcacgctacg ccaagttctc 1620

aaccagagac ccattacatg ggctgccgat gcatccaaca caatcagtat tataggagac 1680

tacaactgga ccaatctgac tataaagtgt gatgtataca tagagacccc tgacacagga 1740

ggtgtgttca ttgcaggaag agtaaataaa ggtggtattt tgattagaag tgccagagga 1800

attttcttct ggatttttgc aaatggatct tacagggtta caggtgattt agctggatgg 1860

attatatatg ctttaggacg tgttgaagtt acagcaaaaa aatggtatac actcacgtta 1920

actattaagg gtcatttcac ctctggcatg ctgaatgaca agtctctgtg gacagacatc 1980

cctgtgaatt ttccaaagaa tggctgggct gcaattggaa ctcactcctt tgaatttgca 2040

cagtttgaca actttcttgt ggaagccaca cgctaatact taacagggca tcatagaata 2100

<210> 5

<211> 354

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 衍生自JC病毒

<400> 5

Met Ala Pro Thr Lys Arg Lys Gly Glu Pro Lys Asp Pro Val Gln Val

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Gly Val Asp Ser Ile Thr Glu Val Glu Cys Phe Leu Thr Pro Glu Met

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Gly Asp Pro Asp Glu His Leu Arg Gly Phe Ser Lys Ser Ile Ser Ile

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Ser Asp Thr Phe Glu Ser Asp Ser Pro Asn Arg Asp Met Leu Pro Cys

65 70 75 80

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Ile Gly Val Thr Ser Leu Met Asn Val His Ser Asn Gly Gln Ala Thr

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His Asp Asn Gly Ala Gly Lys Pro Val Gln Gly Thr Ser Phe His Phe

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165 170 175

Val Gln Ser Gln Val Met Asn Thr Glu His Lys Ala Tyr Leu Asp Lys

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Asn Lys Ala Tyr Pro Val Glu Cys Trp Val Pro Asp Pro Thr Arg Asn

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Glu Asn Thr Arg Tyr Phe Gly Thr Leu Thr Gly Gly Glu Asn Val Pro

210 215 220

Pro Val Leu His Ile Thr Asn Thr Ala Thr Thr Val Leu Leu Asp Glu

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Phe Gly Val Gly Pro Leu Cys Lys Gly Asp Asn Leu Tyr Leu Ser Ala

245 250 255

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Arg Gly Leu Ser Arg Tyr Phe Lys Val Gln Leu Arg Lys Arg Arg Val

275 280 285

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Met Leu

<210> 6

<211> 354

<212> PRT

<213> JC病毒

<400> 6

Met Ala Pro Thr Lys Arg Lys Gly Glu Arg Lys Asp Pro Val Gln Val

1 5 10 15

Pro Lys Leu Leu Ile Arg Gly Gly Val Glu Val Leu Glu Val Lys Thr

20 25 30

Gly Val Asp Ser Ile Thr Glu Val Glu Cys Phe Leu Thr Pro Glu Met

35 40 45

Gly Asp Pro Asp Glu His Leu Arg Gly Phe Ser Lys Ser Ile Ser Ile

50 55 60

Ser Asp Thr Phe Glu Ser Asp Ser Pro Ser Lys Asp Met Leu Pro Cys

65 70 75 80

Tyr Ser Val Ala Arg Ile Pro Leu Pro Asn Leu Asn Glu Asp Leu Thr

85 90 95

Cys Gly Asn Ile Leu Met Trp Glu Ala Val Thr Leu Lys Thr Glu Val

100 105 110

Ile Gly Val Thr Ser Leu Met Asn Val His Ser Asn Gly Gln Ala Ala

115 120 125

His Asp Asn Gly Ala Gly Lys Pro Val Gln Gly Thr Ser Phe His Phe

130 135 140

Phe Ser Val Gly Gly Glu Ala Leu Glu Leu Gln Gly Val Val Phe Asn

145 150 155 160

Tyr Arg Thr Lys Tyr Pro Asp Gly Thr Ile Phe Pro Lys Asn Ala Thr

165 170 175

Val Gln Ser Gln Val Met Asn Thr Glu His Lys Ala Tyr Leu Asp Lys

180 185 190

Asn Lys Ala Tyr Pro Val Glu Cys Trp Val Pro Asp Pro Thr Arg Asn

195 200 205

Glu Asn Thr Arg Tyr Phe Gly Thr Leu Thr Gly Gly Glu Asn Val Pro

210 215 220

Pro Val Leu His Ile Thr Asn Thr Ala Thr Thr Val Leu Leu Asp Glu

225 230 235 240

Phe Gly Val Gly Pro Leu Cys Lys Gly Asp Asn Leu Tyr Leu Ser Ala

245 250 255

Val Asp Val Cys Gly Met Phe Thr Asn Arg Ser Gly Ser Gln Gln Trp

260 265 270

Arg Gly Leu Ser Arg Tyr Phe Lys Val Gln Leu Arg Lys Arg Arg Val

275 280 285

Lys Asn Pro Tyr Pro Ile Ser Phe Leu Leu Thr Asp Leu Ile Asn Arg

290 295 300

Arg Thr Pro Arg Val Asp Gly Gln Pro Met Tyr Gly Met Asp Ala Gln

305 310 315 320

Val Glu Glu Val Arg Val Phe Glu Gly Thr Glu Glu Leu Pro Gly Asp

325 330 335

Pro Asp Met Met Arg Tyr Val Asp Arg Tyr Gly Gln Leu Gln Thr Lys

340 345 350

Met Leu

<210> 7

<211> 1065

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 衍生自JC病毒

<400> 7

atggctccca ccaagcgcaa gggcgagccc aaggaccccg tgcaagtgcc caagctgctg 60

atccgtggtg gtgtcgaggt gctggaagtc aagaccggcg tggactccat taccgaggtg 120

gagtgcttcc tcacccccga gatgggtgac cctgacgagc acctgagggg cttctccaag 180

tccatctcca tctccgacac cttcgagtcc gactccccca accgtgacat gctgccctgc 240

tactccgtgg ctcgtatccc cctgcccaac ctgaacgagg acctgacttg cggcaacatc 300

ctgatgtggg aggctgtgac cctcaagacc gaggtcatcg gcgtgacttc cctgatgaac 360

gtgcactcca acggccaggc tacccacgac aacggtgctg gcaagcccgt gcagggaacc 420

tccttccact tcttctccgt gggtggcgag gctctggaac tccagggcgt ggtgttcaac 480

taccgtacca agtaccccga cggcaccatc ttccccaaga acgctactgt gcagtcccaa 540

gtgatgaaca ccgagcacaa ggcttacctg gacaagaaca aggcctaccc cgtggagtgc 600

tgggtgcccg accccacccg taacgagaac acccgttact tcggcaccct gaccggtgga 660

gagaacgtgc cccccgtgct gcacatcacc aacaccgcta ccaccgtgct gctggacgag 720

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ggcatgttca ccaaccgttc cggttcccag cagtggcgtg gcctgtcccg ctacttcaag 840

gtgcagctgc gcaagcgtcg tgtgaagaac ccctacccta tctccttcct gctgaccgac 900

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gtggaagagg tccgcgtgtt cgagggcacc gaggaattgc ccggcgaccc cgacatgatg 1020

cgttacgtgg acaagtacgg ccagctccag accaagatgc tgtaa 1065

<210> 8

<211> 1065

<212> DNA

<213> JC病毒

<400> 8

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ataagaggag gagtagaagt tctagaagtt aaaactgggg ttgactcaat tacagaggta 120

gaatgctttt taactccaga aatgggtgac ccagatgagc atcttagggg ttttagtaag 180

tcaatatcta tatcagatac atttgaaagt gactccccaa atagggacat gcttccttgt 240

tacagtgtgg ccagaattcc actacccaat ctaaatgagg atctaacctg tggaaatata 300

ctcatgtggg aggctgtgac cttaaaaact gaggttatag gggtgacaag tttgatgaat 360

gtgcactcta atgggcaagc aactcatgac aatggtgcag ggaagccagt gcagggcacc 420

agctttcatt ttttttctgt tgggggggag gctttagaat tacagggggt gctttttaat 480

tacagaacaa agtacccaga tggaacaatt tttccaaaga atgccacagt gcaatctcaa 540

gtcatgaaca cagagcacaa ggcgtaccta gataagaaca aagcatatcc tgttgaatgt 600

tgggttcctg atcccaccag aaatgaaaac acaagatatt ttgggacact aacaggagga 660

gaaaatgttc ctccagttct tcatataaca aacactgcca caacagtgtt gcttgatgaa 720

tttggtgttg ggccactttg caaaggtgac aacttatact tgtcagctgt tgatgtctgt 780

ggcatgttta caaacaggtc tggttcccag cagtggagag gactctccag atattttaag 840

gtgcagctaa ggaaaaggag ggttaaaaac ccctacccaa tttctttcct tcttactgat 900

ttaattaaca gaaggactcc tagagttgat gggcagccta tgtatggcat ggatgctcaa 960

gtagaggagg ttagagtttt tgagggaaca gaggagcttc caggggaccc agacatgatg 1020

agatacgttg acaaatatgg acagttgcag acaaaaatgc tgtaa 1065

<210> 9

<211> 1140

<212> RNA

<213> 智人

<400> 9

aggaaauaag agagaaaaga agaguaagaa gaaauauaag agccaccaug acuucuuguc 60

acauugcuga agaacauaua caaaagguug cuaucuuugg aggaacccau gggaaugagc 120

uaaccggagu auuucugguu aagcauuggc uagagaaugg cgcugagauu cagagaacag 180

ggcuggaggu aaaaccauuu auuacuaacc ccagagcagu gaagaagugu accagauaua 240

uugacuguga ccugaaucgc auuuuugacc uugaaaaucu uggcaaaaaa augucagaag 300

auuugccaua ugaagugaga agggcucaag aaauaaauca uuuauuuggu ccaaaagaca 360

gugaagauuc cuaugacauu auuuuugacc uucacaacac caccucuaac auggggugca 420

cucuuauucu ugaggauucc aggaauaacu uuuuaauuca gauguuucau uacauuaaga 480

cuucucuggc uccacuaccc ugcuacguuu aucugauuga gcauccuucc cucaaauaug 540

cgaccacucg uuccauagcc aaguauccug uggguauaga aguugguccu cagccucaag 600

ggguucugag agcugauauc uuggaucaaa ugagaaaaau gauuaaacau gcucuugauu 660

uuauacauca uuucaaugaa ggaaaagaau uuccucccug cgccauugag gucuauaaaa 720

uuauagagaa aguugauuac ccccgggaug aaaauggaga aauugcugcu aucauccauc 780

cuaaucugca ggaucaagac uggaaaccac ugcauccugg ggaucccaug uuuuuaacuc 840

uugaugggaa gacgauccca cugggcggag acuguaccgu guaccccgug uuugugaaug 900

aggccgcaua uuacgaaaag aaagaagcuu uugcaaagac aacuaaacua acgcucaaug 960

caaaaaguau ucgcugcugu uuacauuagg cggccgcuua auuaagcugc cuucugcggg 1020

gcuugccuuc uggccaugcc cuucuucucu cccuugcacc uguaccucuu ggucuuugaa 1080

uaaagccuga guaggaaguc uagaguuuaa acauuuaaau cugcagaucc caauggcgcg 1140

<210> 10

<211> 2256

<212> RNA

<213> 智人

<400> 10

aggaaauaag agagaaaaga agaguaagaa gaaauauaag agccaccaug gcugaguggc 60

uacucucggc uuccuggcaa cgccgagcga aagcuaugac ugcggccgcg gguucggcgg 120

gccgcgccgc ggugcccuug cugcugugug cgcugcuggc gcccggcggc gcguacgugc 180

ucgacgacuc cgacgggcug ggccgggagu ucgacggcau cggcgcgguc agcggcggcg 240

gggcaaccuc ccgacuucua guaaauuacc cagagcccua ucguucucag auauuggauu 300

aucucuuuaa gccgaauuuu ggugccucuu ugcauauuuu aaaaguggaa auagguggug 360

augggcagac aacagacggc acugagcccu cccacaugca uuaugcacua gaugagaauu 420

auuuccgagg auacgagugg ugguugauga aagaagcuaa gaagaggaau cccaauauua 480

cacucauugg guugccaugg ucauucccug gauggcuggg aaaagguuuc gacuggccuu 540

augucaaucu ucagcugacu gccuauuaug ucgugaccug gauugugggc gccaagcguu 600

accaugauuu ggacauugau uauauuggaa uuuggaauga gaggucauau aaugccaauu 660

auauuaagau auuaagaaaa augcugaauu aucaaggucu ccagcgagug aaaaucauag 720

caagugauaa ucucugggag uccaucucug cauccaugcu ccuugaugcc gaacucuuca 780

aggugguuga uguuauaggg gcucauuauc cuggaaccca uucagcaaaa gaugcaaagu 840

ugacugggaa gaagcuuugg ucuucugaag acuuuagcac uuuaaauagu gacaugggug 900

caggcugcug gggucgcauu uuaaaucaga auuauaucaa uggcuauaug acuuccacaa 960

ucgcauggaa uuuaguggcu aguuacuaug aacaguugcc uuaugggaga ugcggguuga 1020

ugacggccca ggagccaugg agugggcacu acgugguaga aucuccuguc uggguaucag 1080

cucauaccac ucaguuuacu caaccuggcu gguauuaccu gaagacaguu ggccauuuag 1140

agaaaggagg aagcuacgua gcucugacug auggcuuagg gaaccucacc aucaucauug 1200

aaaccaugag ucauaaacau ucuaagugca uacggccauu ucuuccuuau uucaaugugu 1260

cacaacaauu ugccaccuuu guucuuaagg gaucuuuuag ugaaauacca gagcuacagg 1320

uaugguauac caaacuugga aaaacauccg aaagauuucu uuuuaagcag cuggauucuc 1380

uauggcuccu ugacagcgau ggcaguuuca cacugagccu gcaugaagau gagcuguuca 1440

cacucaccac ucucaccacu ggucgcaaag gcagcuaccc gcuuccucca aaaucccagc 1500

ccuucccaag uaccuauaag gaugauuuca auguugauua cccauuuuuu agugaagcuc 1560

caaacuuugc ugaucaaacu gguguauuug aauauuuuac aaauauugaa gacccuggcg 1620

agcaucacuu cacgcuacgc caaguucuca accagagacc cauuacaugg gcugccgaug 1680

cauccaacac aaucaguauu auaggagacu acaacuggac caaucugacu auaaagugug 1740

auguauacau agagaccccu gacacaggag guguguucau ugcaggaaga guaaauaaag 1800

gugguauuuu gauuagaagu gccagaggaa uuuucuucug gauuuuugca aauggaucuu 1860

acaggguuac aggugauuua gcuggaugga uuauauaugc uuuaggacgu guugaaguua 1920

cagcaaaaaa augguauaca cucacguuaa cuauuaaggg ucauuucacc ucuggcaugc 1980

ugaaugacaa gucucugugg acagacaucc cugugaauuu uccaaagaau ggcugggcug 2040

caauuggaac ucacuccuuu gaauuugcac aguuugacaa cuuucuugug gaagccacac 2100

gcuaagcggc cgcuuaauua agcugccuuc ugcggggcuu gccuucuggc caugcccuuc 2160

uucucucccu ugcaccugua ccucuugguc uuugaauaaa gccugaguag gaagucuaga 2220

guuuaaacau uuaaaucugc agaucccaau ggcgcg 2256

Claims

1.与酶或编码所述酶的表达载体或编码所述酶的mRNA或其组合缔合的VLP，其用于治疗受试者的脑白质营养不良的方法，其中所述酶是天冬氨酸酰化酶或半乳糖脑苷脂酶。

2.根据权利要求1所述使用的VLP，其中

(i)所述酶为天冬氨酸酰化酶，和所述脑白质营养不良为Canavan病；或

(ii)所述酶为半乳糖脑苷脂酶，和所述脑白质营养不良为Krabbe病。

3.根据权利要求1或2所述使用的VLP，其中所述VLP不包含病毒遗传物质，并且所述表达载体或所述mRNA不编码病毒蛋白。

4.根据前述权利要求中任一项所述使用的VLP，其中所述受试者是动物或人，优选地是人。

5.根据前述权利要求中任一项所述使用的VLP，其中所述酶包含在其整个长度上与根据SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少80％、优选至少90％相同的氨基酸序列，更优选具有SEQID NO：1的氨基酸序列；或其中所述酶包含在其整个长度上与根据SEQ ID NO：3的氨基酸序列至少80％、优选至少90％相同的氨基酸序列，更优选具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列。

6.根据前述权利要求中任一项所述使用的VLP，其中所述表达载体具有小于7kb、优选小于6kb、更优选小于5kb、最优选小于4kb的尺寸。

7.根据前述权利要求中任一项所述使用的VLP，其中所述表达载体具有选自CMV和CAG的启动子。

8.根据前述权利要求中任一项所述使用的VLP，其中所述酶由核苷酸序列编码，所述核苷酸序列在其整个长度上与SEQ ID NO：2的核苷酸序列至少70％、优选至少80％、更优选至少90％相同，最优选是SEQ ID NO：2的核苷酸序列；或所述酶由核苷酸序列编码，所述核苷酸序列在其整个长度上与SEQ ID NO：4的核苷酸序列至少70％、优选至少80％、更优选至少90％相同，最优选是SEQ ID NO：4的核苷酸序列。

9.根据前述权利要求中任一项所述使用的VLP，其中所述酶由mRNA序列编码，所述mRNA序列在其整个长度上与SEQ ID NO：9的mRNA序列至少70％、优选至少80％、更优选至少90％相同，最优选包含SEQ ID NO：9的mRNA序列；或所述酶由mRNA序列编码，所述mRNA序列在其整个长度上与SEQ ID NO：10的mRNA序列至少70％、优选至少80％、更优选至少90％相同，最优选包含SEQ ID NO：10的mRNA序列。

10.根据前述权利要求中任一项所述使用的VLP，其中所述VLP衍生自人多瘤病毒，优选JCV。

11.根据前述权利要求中任一项所述使用的VLP，其中所述VLP与所述酶或所述表达载体或所述mRNA或其组合一起穿过血脑屏障，优选生理上完整的血脑屏障，以进入CNS。

12.根据权利要求11所述的VLP，其中所述酶或所述表达载体或所述mRNA或其组合进入星形胶质细胞、少突胶质细胞、小胶质细胞或神经元，优选少突胶质细胞。

13.根据前述权利要求中任一项所述使用的VLP，其中所述VLP经口或胃肠外施用，优选静脉内施用。

14.根据前述权利要求中任一项所述使用的VLP，其中靶细胞与有效量的酶接触。

15.根据前述权利要求中任一项所述使用的VLP，其中所述酶在至少10天、优选至少20天、更优选至少30天内具有治疗有效的酶活性。

16.根据前述权利要求中任一项所述使用的VLP，其中所述VLP由JC病毒的VP1蛋白组成。

17.根据权利要求16所述使用的VLP，其中所述VP1蛋白包含在其整个长度上与根据SEQID NO：5或6的氨基酸序列至少80％相同、优选至少90％相同的氨基酸序列。

18.用于治疗受试者的脑白质营养不良的方法的药物组合物，其中所述药物组合物包含根据权利要求1至17中任一项所述的VLP和药学上可接受的载剂和/或赋形剂。

19.表达载体，其具有编码酶的编码区、选自CAG和CMV的启动子，并且具有小于7kb、优选小于6kb、更优选小于5kb、最优选小于4kb的尺寸，其中所述酶是天冬氨酸酰化酶或半乳糖脑苷脂酶。

20.根据权利要求19所述的表达载体，其中所述编码区包含在其整个长度上与SEQ IDNO：2的核苷酸序列至少70％、优选至少80％、更优选至少90％相同的核苷酸序列，最优选地是SEQ ID NO：2的核苷酸序列，或其中所述编码区包含在其整个长度上与SEQ ID NO：4的核苷酸序列至少70％、优选至少80％、更优选至少90％相同的核苷酸序列，最优选地是SEQ IDNO：4的核苷酸序列。

21.将VLP与酶或编码酶的表达载体或编码酶的mRNA或其组合缔合的方法，其中所述酶是天冬氨酸酰化酶或半乳糖脑苷脂酶，并且其中所述方法包括以下步骤：

a)提供包含VP1蛋白的组合物，

b)将a)的组合物的VP1蛋白暴露于诱导VP1组装成VLP的条件下，

c)将b)的组合物的VLP暴露于将VLP分解成五聚体的条件下，

e)将d)的组合物的VLP暴露于将VLP分解成五聚体的条件下，

f)将e)的组合物的五聚体与酶或表达载体或mRNA或其组合暴露于诱导五聚体组装成与所述酶或表达载体或mRNA或其组合缔合的VLP的条件下。

22.可通过权利要求21所述的方法获得的VLP。