JP2023526528A - 白質ジストロフィーの処置のためのｖｌｐ - Google Patents

白質ジストロフィーの処置のためのｖｌｐ Download PDF

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Abstract

本発明は、必要性のある被験体（好ましくはヒト）における特定の白質ジストロフィーの処置のための方法において使用される、特定の白質ジストロフィーにおいて異常に発現される酵素もしくは上記酵素をコードする発現ベクターもしくは上記酵素をコードするｍＲＮＡ、またはこれらの組み合わせと会合されたウイルス様粒子（ＶＬＰ）に関する。本発明はまた、特定の白質ジストロフィーの処置のための方法における使用のための薬学的組成物、上記異常に発現される酵素をコードする発現ベクターおよびＶＬＰと上記酵素、上記酵素をコードする発現ベクターもしくは上記酵素をコードするｍＲＮＡ、またはこれらの組み合わせとを会合させる方法に関する。

Description

発明の分野
本発明は、必要性のある被験体、好ましくはヒトにおける特定の白質ジストロフィーの処置のための方法において使用される、特定の白質ジストロフィーにおいて異常に発現される酵素もしくは上記酵素をコードする発現ベクターもしくは上記酵素をコードするｍＲＮＡまたはこれらの組み合わせと会合されたウイルス様粒子（ＶＬＰ）に関する。本発明はまた、特定の白質ジストロフィーの処置のための方法における使用のための薬学的組成物、異常に発現される酵素をコードする発現ベクター、およびＶＬＰと、上記酵素、上記酵素をコードする発現ベクター、上記酵素をコードするｍＲＮＡまたはこれらの組み合わせとを会合させる方法に関する。
発明の背景
白質ジストロフィーは、脳、脊髄およびしばしば末梢神経に影響を及ぼす、希少な、進行性の代謝性の遺伝的疾患の１グループである。白質ジストロフィーの各タイプは、脳の白質（ミエリン鞘）の異常な発生または破壊をもたらす特異的遺伝子異常によって引き起こされる。白質ジストロフィーの各タイプは、ミエリン鞘の異なる部分に影響を及ぼし、神経学的問題のある範囲をもたらす。
白質ジストロフィーの一例は、カナバン病（ＣＤ）である。ＣＤは、脳および脊髄（中枢神経系）の海綿状変性によって特徴づけられる希少な遺伝性の神経学的障害である。乳児期に現れる身体的症状としては、筋緊張の喪失、首のすわりが不十分である、異常に大きな頭部（巨大頭蓋症）、および／または被刺激性が付随する進行性の精神的低下が挙げられ得る。身体的症状は、乳児期に現れ、通常は、急速に進行する。
ＣＤは、酵素アスパルトアシラーゼの生成を担う欠損性ＡＳＰＡ遺伝子によって引き起こされる。アスパルトアシラーゼ活性の減少は、Ｎ－アセチルアスパラギン酸の通常の破壊を妨げ、ここでＮ－アセチルアスパラギン酸の蓄積、またはそのさらなる代謝の欠如は、脳の神経線維のミエリン鞘の成長に干渉する。
白質ジストロフィーの別の例は、クラッベ病である。クラッベ病は、グロボイド細胞白質ジストロフィーとしても公知であり、第１４染色体（１４ｑ３１）上に位置するＧＡＬＣ遺伝子における変異によって引き起こされる常染色体劣性遺伝脂質蓄積障害である。これは、常染色体劣性遺伝様式で遺伝する。ＧＡＬＣ遺伝子における変異は、スフィンゴ脂質であるガラクトシルセラミドおよびサイコシン（ガラクトシル－スフィンゴシン）の破壊（代謝）に必須のリソソーム酵素であるガラクトセレブロシダーゼの欠損を引き起こす。これらのスフィンゴ脂質を破壊できないことで、脳の神経の周囲のミエリン鞘の変性（脱髄）が生じる。特徴的なグロボイド細胞が、脳の罹患領域に現れる。この代謝障害は、被刺激性、発達退行（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）、異常な身体の緊張、てんかん発作（ｓｅｉｚｕｒｅ）および末梢神経障害を伴う進行性の神経学的機能障害によって特徴づけられる。
組換えアデノ随伴ウイルスに基づく遺伝子治療アプローチは、カナバン病およびクラッベ病のような白質ジストロフィーの処置のために先行技術にいて考察されている。
しかし、ウイルスベクターが投与される場合、安全性の懸念が生じる。
よって、白質ジストロフィー（例えば、カナバン病およびクラッベ病）の処置のための安全かつ有効な治療が必要である。従って、本発明の目的は、以前の制約を克服する、カナバン病およびクラッベ病のような白質ジストロフィーの処置のための新規な治療の手段を提供することである。
発明の要旨
本発明者らは、特定の白質ジストロフィーにおいて異常に発現される酵素もしくはこのような酵素をコードする発現ベクターもしくはこのような酵素をコードするｍＲＮＡまたはこれらの組み合わせと会合されたウイルス様粒子（ＶＬＰ）、より具体的には、ＪＣウイルスのＶＬＰが、特定の白質ジストロフィーの処置に特に十分に適していることを見出した。本発明に従うＶＬＰは、機能的酵素もしくはこのような酵素をコードするプラスミドもしくはこのような酵素をコードするｍＲＮＡまたはこれらの組み合わせの、その必要性のある患者のＣＮＳへの有効な送達のために使用され得る。これを達成するために、本発明に従って、上記ＶＬＰは、酵素（その活性の非存在もしくは低減が、処置されるべき白質ジストロフィーの原因である）もしくは酵素をコードする発現ベクターもしくは酵素をコードするｍＲＮＡまたはこれらの組み合わせと会合される。
特に、本発明者らは、アスパルトアシラーゼもしくはアスパルトアシラーゼをコードする発現ベクターもしくはアスパルトアシラーゼをコードするｍＲＮＡまたはこれらの組み合わせと会合されたウイルス様粒子（ＶＬＰ）、より具体的には、ＪＣウイルスのＶＬＰが、カナバン病の処置に特に十分に適していることを見出した。本発明に従うＶＬＰは、機能的アスパルトアシラーゼもしくはアスパルトアシラーゼをコードするプラスミドもしくはアスパルトアシラーゼをコードするｍＲＮＡまたはこれらの組み合わせの、その必要性のある患者のＣＮＳへの有効な送達のために使用され得る。これを達成するために、本発明に従って、上記ＶＬＰは、アスパルトアシラーゼ（その活性の非存在もしくは低減が、カナバン病の原因である）もしくはアスパルトアシラーゼをコードする発現ベクターもしくはアスパルトアシラーゼをコードするｍＲＮＡまたはこれらの組み合わせと会合される。
さらに、本発明者らは、ガラクトセレブロシダーゼもしくはガラクトセレブロシダーゼをコードする発現ベクターもしくはガラクトセレブロシダーゼをコードするｍＲＮＡまたはこれらの組み合わせと会合されたウイルス様粒子（ＶＬＰ）、より具体的にはＪＣウイルスのＶＬＰが、クラッベ病の処置に特に十分に適していることを見出した。本発明に従うＶＬＰは、機能的ガラクトセレブロシダーゼもしくはガラクトセレブロシダーゼをコードするプラスミドもしくはガラクトセレブロシダーゼをコードするｍＲＮＡまたはこれらの組み合わせの、その必要性のある患者のＣＮＳへの有効な送達のために使用され得る。これを達成するために、本発明に従って、上記ＶＬＰは、ガラクトセレブロシダーゼ（その活性の非存在もしくは低減が、クラッベ病の原因である）もしくはガラクトセレブロシダーゼをコードする発現ベクターもしくはガラクトセレブロシダーゼをコードするｍＲＮＡまたはこれらの組み合わせと会合される。
これに伴って、その最も広い意味で、本発明に従う「酵素（ｅｎｚｙｍｅ）」は、それぞれ、アスパルトアシラーゼまたはガラクトセレブロシダーゼの活性を有するポリペプチドに関する。
本発明に従うＶＬＰは、血液脳関門（ＢＢＢ）、有利なことには生理学的に無傷のＢＢＢですら効果的に横断し得る。よって、アスパルトアシラーゼもしくはガラクトセレブロシダーゼそれぞれ、またはそれぞれの酵素をコードする発現ベクターまたはそれぞれの酵素をコードするｍＲＮＡあるいはこれらの組み合わせと会合されたＶＬＰは、上記酵素もしくは上記酵素をコードする発現ベクターもしくは上記それぞれの酵素をコードするｍＲＮＡまたはこれらの組み合わせを、ＣＮＳへと効果的に送達し得る。
本発明者らは、ＡＳＰＡおよびＧＡＬＣ ｍＲＮＡをそれぞれ、種々のマウスおよびヒトの細胞株において、ならびに本発明に従うＶＬＰの投与後のマウスの脳において見出した。それらはまた、人工ＢＢＢモデルにおいて、本発明に従うアスパルトアシラーゼ（ＡＳＰＡ）またはガラクトセレブロシダーゼ（ＧＡＬＣ）とインビトロで会合したＶＬＰでの血液脳関門（ＢＢＢ）を経る透過を見出した。それによって、本発明に従うＶＬＰの投与に伴って、ＣＮＳにおけるそれぞれの酵素活性が増強され得ると結論づけられ得る。その増強された酵素活性は、上記酵素が、それぞれ、アスパルトアシラーゼ（ＡＳＰＡ）およびガラクトセレブロシダーゼ（ＧＡＬＣ）である場合、それぞれ、カナバン病およびクラッベ病の有効な処置を可能にする。
驚くべきことに、本発明に従うＶＬＰは、ＣＮＳを特異的に標的化する、すなわち、それらは、患者へと、例えば、静脈内に投与された後に、身体にわたって等しくは分布しないことが見出された。それは、本発明に従うＶＬＰのより大きな割合が、ＣＮＳの外側よりＣＮＳの中で見出されることを意味する。
本発明に従うＶＬＰは、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、ニューロンおよび／またはミクログリアを特に標的化する。本発明のＶＬＰの具体的に好ましい標的は、オリゴデンドロサイトである。
本発明に従うＶＬＰはまた、薬物製品のより良好な品質管理および標準化を可能にすることから、安定かつ均質である（これは臨床用途にとって特に重要である）。
従って、アスパルトアシラーゼおよびガラクトセレブロシダーゼそれぞれ、もしくはそれぞれの酵素をコードする発現ベクターもしくはそれぞれの酵素をコードするｍＲＮＡまたはこれらの組み合わせと会合されたＶＬＰ、特に、ＪＣウイルスのＶＬＰが、それぞれ、カナバン病およびクラッベ病の有効かつ安全な処置を提供するために使用され得ることが、本発明者らによって示された。
図１ マウス器官における内因性ＡＳＰＡ発現の検出。 左のパネルは、マウス特異的プライマーでの、種々のマウス器官における内因性の、すなわち、マウスＡＳＰＡ発現の検出を示す。右のパネルは、ヒトＡＳＰＡ（ｈＡＳＰＡ）に特異的なプライマーでの、種々のマウス器官における内因性の、すなわち、マウスＡＳＰＡ発現の検出を示す。
図２ ｈＡＳＰＡ発現。 左上のパネルは、被包されたｈＡＳＰＡ、すなわち、ｈＡＳＰＡコードプラスミドでパックされたＶＬＰとのインキュベーション後の、ヒト星細胞腫細胞におけるｈＡＳＰＡ発現（ｍＲＮＡ）を示す。右上のパネルは、ｈＡＳＰＡコードプラスミドでのリポフェクション後のヒト星細胞腫細胞におけるｈＡＳＰＡタンパク質発現（ＦＡＣＳ分析による）を示す。左下のパネルは、ｈＡＳＰＡコードプラスミドでのリポフェクション（「Ｌｉｐｏ」）または被包されたｈＡＳＰＡ、すなわち、ｈＡＳＰＡコードプラスミドでパックされたＶＬＰ（「装填されたＥｎＰＣｓ」）とのインキュベーション後のヒト星細胞腫細胞におけるｈＡＳＰＡ発現（ｍＲＮＡ）を示す。右下のパネルは、ｈＡＳＰＡコードプラスミドでのリポフェクション（「Ｌｉｐｏ」）または被包されたｈＡＳＰＡ、すなわち、ｈＡＳＰＡコードプラスミドでパックされたＶＬＰ（「装填されたＥｎＰＣｓ」）とのインキュベーション後のマウス線維芽細胞におけるｈＡＳＰＡ発現（ｍＲＮＡ）を示す。
図３ インビトロＢＢＢモデルにおけるｈＡＳＰＡと会合されたＶＬＰの透過。 左上のパネルは、ウェル中のヒト星細胞腫細胞を、上記ウェル中の挿入物に播種したＨＢＥＣ－５ｉ内皮細胞とともに（＋ＢＢＢ）およびなしで（－ＢＢＢ）共培養した後のヒト星細胞腫細胞におけるｈＡＳＰＡ発現（ｍＲＮＡ）を示す。ｈＡＳＰＡコードプラスミドでパックされたＶＬＰ（「装填されたＥｎＰＣｓ」）またはｈＡＳＰＡコードプラスミド単独（「プラスミドコントロール」）を、上記挿入物に添加し、挿入物を、２４時間後に新鮮な培地とともにさらに４８時間にわたってウェルに移した。細胞ペレットを、７２時間後に採取した。 右上のパネルは、ウェル中のヒト星細胞腫細胞を、上記ウェル中の挿入物に播種したＨＢＥＣ－５ｉ内皮細胞とともに共培養した後のＨＢＥＣ－５ｉ内皮細胞におけるｈＡＳＰＡ発現（ｍＲＮＡ）を示す。ｈＡＳＰＡコードプラスミドでパックされたＶＬＰ（「装填されたＥｎＰＣｓ」）またはｈＡＳＰＡコードプラスミド単独（「プラスミドコントロール」）を、上記挿入物に添加し、挿入物を、２４時間後に新鮮な培地とともにさらに４８時間にわたってウェルに移した。細胞ペレットを、７２時間後に採取した。 左下のパネルは、ウェル中のヒト星細胞腫細胞を、上記ウェル中の挿入物に播種したＨＢＥＣ－５ｉ内皮細胞とともに（＋ＢＢＢ）およびなしで（－ＢＢＢ）共培養した後のヒト星細胞腫細胞におけるｈＡＳＰＡ発現（ｍＲＮＡ）を示す。ｈＡＳＰＡコードプラスミドでパックされたＶＬＰ（「装填されたＥｎＰＣｓ」）またはｈＡＳＰＡコードプラスミド単独（「プラスミドコントロール」）を、上記挿入物に添加し、挿入物を、４８時間後に新鮮な培地とともにさらに２４時間にわたってウェルに移した。細胞ペレットを、７２時間後に採取した。 右下のパネルは、ウェル中のヒト星細胞腫細胞を、上記ウェル中の挿入物に播種したＨＢＥＣ－５ｉ内皮細胞とともに共培養した後のＨＢＥＣ－５ｉ内皮細胞におけるｈＡＳＰＡ発現（ｍＲＮＡ）を示す。ｈＡＳＰＡコードプラスミドでパックされたＶＬＰ（「装填されたＥｎＰＣｓ」）またはｈＡＳＰＡコードプラスミド単独（「プラスミドコントロール」）を、上記挿入物に添加し、挿入物を、４８時間後に新鮮な培地とともにさらに２４時間にわたってウェルに移した。細胞ペレットを、７２時間後に採取した。
図４ マウス器官における内因性ＧＡＬＣ発現の検出。 左のパネルは、マウス特異的プライマーでの、種々のマウス器官における内因性の、すなわち、マウスＧＡＬＣ発現の検出を示す。右のパネルは、ヒトＧＡＬＣ（ｈＧＡＬＣ）に特異的なプライマーでの、種々のマウス器官における内因性の、すなわち、マウスＧＡＬＣ発現の検出を示す。
図５ ｈＧＡＬＣ発現。 左のパネルは、被包されたｈＧＡＬＣ、すなわち、ｈＧＡＬＣコードプラスミドでパックされたＶＬＰとのインキュベーション後のヒト星細胞腫細胞におけるｈＧＡＬＣ発現（ｍＲＮＡ）を示す。右のパネルは、ｈＧＡＬＣコードプラスミドでのリポフェクション（「Ｌｉｐｏ」）または被包されたｈＧＡＬＣ、すなわち、ｈＧＡＬＣコードプラスミドでパックされたＶＬＰ（「装填されたＥｎＰＣｓ」）とのインキュベーション後のマウス線維芽細胞におけるｈＧＡＬＣ発現（ｍＲＮＡ）を示す。
図６ インビトロＢＢＢモデルにおけるｈＧＡＬＣと会合されたＶＬＰの透過。 左上のパネルは、ウェル中のヒト星細胞腫細胞を、上記ウェル中の挿入物に播種したＨＢＥＣ－５ｉ内皮細胞とともに（＋ＢＢＢ）およびなしで（－ＢＢＢ）共培養した後のヒト星細胞腫細胞におけるｈＧＡＬＣ発現（ｍＲＮＡ）を示す。ｈＧＡＬＣコードプラスミドでパックされたＶＬＰ（「装填されたＥｎＰＣｓ」）またはｈＧＡＬＣコードプラスミド単独（「プラスミドコントロール」）を、上記挿入物に添加し、挿入物を、２４時間後に新鮮な培地とともにさらに４８時間にわたってウェルに移した。細胞ペレットを、７２時間後に採取した。 右上のパネルは、ウェル中のヒト星細胞腫細胞を、上記ウェル中の挿入物に播種したＨＢＥＣ－５ｉ内皮細胞とともに共培養した後のＨＢＥＣ－５ｉ内皮細胞におけるｈＧＡＬＣ発現（ｍＲＮＡ）を示す。ｈＧＡＬＣコードプラスミドでパックされたＶＬＰ（「装填されたＥｎＰＣｓ」）またはｈＧＡＬＣコードプラスミド単独（「プラスミドコントロール」）を、上記挿入物に添加し、挿入物を、２４時間後に新鮮な培地とともにさらに４８時間にわたってウェルに移した。細胞ペレットを、７２時間後に採取した。 左下のパネルは、ウェル中のヒト星細胞腫細胞を、上記ウェル中の挿入物に播種したＨＢＥＣ－５ｉ内皮細胞とともに（＋ＢＢＢ）およびなしで（－ＢＢＢ）共培養した後のヒト星細胞腫細胞におけるｈＧＡＬＣ発現（ｍＲＮＡ）を示す。ｈＧＡＬＣコードプラスミドでパックされたＶＬＰ（「装填されたＥｎＰＣｓ」）またはｈＧＡＬＣコードプラスミド単独（「プラスミドコントロール」）を、上記挿入物に添加し、挿入物を、４８時間後に新鮮な培地とともにさらに２４時間にわたってウェルに移した。細胞ペレットを、７２時間後に採取した。 右下のパネルは、ウェル中のヒト星細胞腫細胞を、上記ウェル中の挿入物に播種したＨＢＥＣ－５ｉ内皮細胞とともに共培養した後のＨＢＥＣ－５ｉ内皮細胞におけるｈＧＡＬＣ発現（ｍＲＮＡ）を示す。ｈＧＡＬＣコードプラスミドでパックされたＶＬＰ（「装填されたＥｎＰＣｓ」）またはｈＧＡＬＣコードプラスミド単独（「プラスミドコントロール」）を、上記挿入物に添加し、挿入物を、４８時間後に新鮮な培地中の標的細胞とともにさらに２４時間にわたってウェルに移した。細胞ペレットを、７２時間後に採取した。
図７ ｈＡＳＰＡまたはｈＧＡＬＣ ｍＲＮＡと会合されたＶＬＰのＤＬＳ分析。 図表は、ｈＡＳＰＡ ｍＲＮＡと会合されたＶＬＰ（黒線；「ｈＡＳＰＡ ｍＲＮＡで装填されたＥｎＰＣ」）またはｈＧＡＬＣ ｍＲＮＡ（灰色の線；「ｈＧＡＬＣ ｍＲＮＡで装填されたＥｎＰＣｓ」）のＤＬＳ分析を示す。
図８ インビトロでのｈＡＳＰＡおよびｈＧＡＬＣ発現（カーゴとしてのｍＲＮＡ）。 左のパネルは、ｈＡＳＰＡコードｍＲＮＡでパックされたＶＬＰ（「ｍＲＮＡで装填されたＥｎＰＣｓ」）とのインキュベーション、ｈＡＳＰＡコードｍＲＮＡ（「ｍＲＮＡコントロール」）とのインキュベーションまたはｈＡＳＰＡコードｍＲＮＡでのリポフェクション（「Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ」）後のヒト星細胞腫細胞におけるｈＡＳＰＡ発現（ｍＲＮＡ； ２回の技術的複製物のｑＰＣＲ分析）を示す。平均とＳＥＭを示す。 右のパネルは、ｈＧＡＬＣコードｍＲＮＡでパックされたＶＬＰ（「ｍＲＮＡで装填されたＥｎＰＣｓ」）とのインキュベーション、ｈＧＡＬＣコードｍＲＮＡ（「ｍＲＮＡコントロール」）とのインキュベーションまたはｈＧＡＬＣコードｍＲＮＡでのリポフェクション（「Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ」）後のヒト星細胞腫細胞におけるｈＧＡＬＣ発現（ｍＲＮＡ； ２回の技術的複製物のｑＰＣＲ分析）を示す。平均とＳＥＭを示す。
図９ ｈＡＳＰＡまたはｈＧＡＬＣ ｍＲＮＡと会合されたＶＬＰの免疫細胞化学。 左上のパネルは、ＨＡＳＰＡコードｍＲＮＡでパックされたＶＬＰ（「ｍＲＮＡで装填されたＥｎＰＣｓ」）とのインキュベーションおよび抗ｈＡＳＰＡ抗体での染色後のヒト星細胞腫細胞を示す。左下のパネルは、ｈＡＳＰＡコードｍＲＮＡ（「ｍＲＮＡコントロール」）とのインキュベーションおよび抗ｈＡＳＰＡ抗体での染色後のヒト星細胞腫細胞を示す。 右上のパネルは、ｈＧＡＬＣコードｍＲＮＡでパックされたＶＬＰ（「ＭＲＮＡで装填されたＥｎＰＣｓ」）とのインキュベーションおよび抗ｈＧＡＬＣ抗体での染色後のヒト星細胞腫細胞を示す。右下のパネルは、ｈＧＡＬＣコードｍＲＮＡ（「ｍＲＮＡコントロール」）とのインキュベーションおよび 抗ｈＧＡＬＣ抗体での染色後のヒト星細胞腫細胞を示す。
図１０ インビボでのｈＡＳＰＡおよびｈＧＡＬＣ発現（カーゴとしてのｍＲＮＡ）。 この図表は、それぞれ、６時間および２４時間後に、ｈＡＳＰＡ ｍＲＮＡと会合されたＶＬＰの注射（左から右に、カラム１およびカラム２、「脳（ｈＡＳＰＡ）」）、ｈＧＡＬＣ ｍＲＮＡと会合されたＶＬＰの注射（左から右にカラム３およびカラム４； 「脳（ｈＧＡＬＣ）」）、ｈＡＳＰＡ ｍＲＮＡの注射（左から右にカラム５およびカラム６； 「脳（ｈＡＳＰＡ） － コントロール」）またはｈＧＡＬＣ ｍＲＮＡの注射（左から右にカラム７および８； 「脳（ｈＧＡＬＣ） － コントロール」）した後のマウス脳の溶解物中のｍＲＮＡ発現（２回の技術的複製物のｑＰＣＲ分析）を示す。数字「ｎ」は、動物の数を示す。メジアンが示される。
発明の詳細な説明
本発明の第１の局面において、本発明は、被験体（特に、ヒト）におけるカナバン病の処置のための方法における使用のためのアスパルトアシラーゼもしくはアスパルトアシラーゼをコードする発現ベクターもしくはアスパルトアシラーゼをコードするｍＲＮＡまたはこれらの組み合わせと会合されたＶＬＰに関する。よって、本発明はまた、カナバン病に罹患しているヒトを、アスパルトアシラーゼもしくはアスパルトアシラーゼをコードする発現ベクターもしくはアスパルトアシラーゼをコードするｍＲＮＡまたはこれらの組み合わせと会合されたＶＬＰで処置する方法に関する。
本発明の関連する局面において、本発明は、被験体（特に、ヒト）におけるクラッベ病の処置のための方法における使用のためのガラクトセレブロシダーゼもしくはガラクトセレブロシダーゼをコードする発現ベクターもしくはガラクトセレブロシダーゼをコードするｍＲＮＡまたはこれらの組み合わせと会合されたＶＬＰに関する。よって、本発明はまた、クラッベ病に罹患しているヒトを、ガラクトセレブロシダーゼもしくはガラクトセレブロシダーゼをコードする発現ベクターもしくはガラクトセレブロシダーゼをコードするｍＲＮＡまたはこれらの組み合わせと会合されたＶＬＰで処置する方法に関する。
「これらの組み合わせ（ａ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｔｈｅｒｅｏｆ）」または「これらの組み合わせ（ｔｈｅ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｔｈｅｒｅｏｆ）」とは、好ましくは、酵素および発現ベクターの組み合わせ、酵素およびｍＲＮＡの組み合わせ、発現ベクターおよびｍＲＮＡの組み合わせ、または酵素、発現ベクターおよびｍＲＮＡの組み合わせに言及する。
ＶＬＰ、それ自体（すなわち、カーゴと会合されていない）は、いかなる遺伝物質をも含まない。なぜならそれらは、タンパク質から構成されるのみであり、他の点では「空」だからである。本発明に従うＶＬＰは、アスパルトアシラーゼもしくはガラクトセレブロシダーゼそれぞれ、または上記それぞれの酵素をコードする発現ベクター、または上記それぞれの酵素をコードするｍＲＮＡあるいはこれらの組み合わせと会合される。好ましい実施形態において、本発明に従うＶＬＰは、ウイルスタンパク質をコードするウイルス遺伝物質を含まない。この実施形態において、上記ＶＬＰは、ウイルス遺伝物質としてウイルス調節エレメントを含み得る。
ウイルス遺伝物質は、ウイルス遺伝物質として、ウイルスタンパク質をコードするウイルス遺伝物質およびウイルス調節エレメントを含む。ウイルス遺伝物質は、ウイルスの核酸に由来する、すなわち、ウイルスＲＮＡまたはＤＮＡと少なくとも７０％同一である。好ましくは、本発明に従うＶＬＰは、いかなるウイルス遺伝物質をも含まない。
従って、好ましくは、本発明に従うＶＬＰがＲＮＡまたはＤＮＡを含む場合、上記ＲＮＡまたはＤＮＡは、ウイルスに由来しない。すなわち、上記ＲＮＡまたはＤＮＡは、ウイルス遺伝物質ではない。特に、上記ＲＮＡまたはＤＮＡは、ウイルスタンパク質を含まない。上記ＲＮＡまたはＤＮＡが、ウイルスタンパク質をコードせず、ウイルス調節エレメントを含まないことは、特に好ましい。
好ましい実施形態において、本発明に従うＶＬＰは、アスパルトアシラーゼもしくはガラクトセレブロシダーゼそれぞれをコードするのみの、すなわち、上記発現ベクターまたは上記ｍＲＮＡは、いかなる他のタンパク質をもコードしない発現ベクターまたはｍＲＮＡとのみ会合される。好ましい実施形態において、上記発現ベクターまたは上記ｍＲＮＡは、ウイルスタンパク質をコードしない。上記発現ベクターまたは上記ｍＲＮＡが、ウイルスタンパク質をコードせず、ウイルス調節エレメントを含まないことは、特に好ましい。
好ましくは、上記被験体は、動物またはヒトであり、好ましくはヒトである。
本発明に従うＶＬＰは、有利なことには、アスパルトアシラーゼもしくはガラクトセレブロシダーゼそれぞれ、または上記それぞれの酵素をコードする発現ベクター、または上記それぞれの酵素をコードするｍＲＮＡあるいはこれらの組み合わせを、目的の部位（「標的」）に、好ましくはヒトにおいて送達することを可能にする。好ましくは、上記送達は、標的に関して選択的である。すなわち、上記それぞれの酵素もしくは上記酵素土をコードする発現ベクターもしくは上記酵素をコードするｍＲＮＡまたはこれらの組み合わせのより高い割合が、身体もしくは器官の他の部位より上記標的に対して送達される。
上記標的は、好ましくはＣＮＳである。ＣＮＳとは、脊髄および脳を、特に脳をいう。用語「脳（ｂｒａｉｎ）」とは、その解剖学的部分（例えば、前頭葉、頭頂葉、側頭葉、後頭葉、および小脳）を含む。
アスパルトアシラーゼもしくはガラクトセレブロシダーゼそれぞれ、または上記それぞれの酵素をコードする発現ベクターもしくは上記それぞれの酵素をコードするｍＲＮＡまたはこれらの組み合わせが、標的細胞、好ましくはＣＮＳ中の標的細胞、特に、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、ニューロンおよび／またはミクログリアに、および／またはその中に送達されるのであれば、特に有利である。特に好ましい実施形態において、上記標的細胞は、オリゴデンドロサイトである。よって、アスパルトアシラーゼもしくはガラクトセレブロシダーゼそれぞれ、または上記発現ベクターまたは上記ｍＲＮＡあるいはこれらの組み合わせは、好ましくは、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、ミクログリアまたはニューロン、特に、オリゴデンドロサイトに入る。
上記標的細胞が、有効量のアスパルトアシラーゼもしくはガラクトセレブロシダーゼそれぞれと接触されている場合には、特に有利である。上記それぞれの酵素の有効量は、上記量が、酵素の活性（上記酵素の非存在は、それぞれの白質ジストロフィーを引き起こす）を増強するために十分であることを意味する。
上記被験体中の酵素活性は、通常、インビトロにおいてプローブで、代表的には、固形組織、白血球、線維芽細胞、培養された羊水細胞、血清、羊水、尿または涙液（これらに基質が加えられる）に由来するプローブで測定される。例えば、アスパルトアシラーゼに関しては、代表的基質は、Ｎ－アセチル－Ｌ－アスパラギン酸（ＮＡＡ）であり、これは、［１４Ｃ］－放射性標識ＮＡＡとして直接的に（Ｍａｄｈａｖａｒａｏら， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２００２； ３０８： ３１４－３１９）、またはＮＡＤＨからＮＡＤ＋への変換が測光法で測定される共役反応において間接的に（Ｍａｔａｌｏｎら， Ａｍ． Ｊ． Ｍｅｄ． Ｇｅｎｅｔ． １９８８； ２９： ４６３－４７１）測定され得る。同様に、ガラクトセレブロシダーゼに関しては、代表的基質は、蛍光発生基質である４－メチルウンベリフェロン－β－ガラクトピラノシド（４－ＭＵ－β－Ｄ－ガラクトシダーゼ、ＭＵＧＡＬ（Ｍａｒｔｉｎｏら， Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ． ２００９； ５５： ５４１－５４８））である。
特に好ましい実施形態において、本発明に従うＶＬＰは、血液脳関門、好ましくは生理学的に無傷の血液脳関門を横断して、アスパルトアシラーゼもしくはガラクトセレブロシダーゼそれぞれ、または上記発現ベクターまたは上記ｍＲＮＡあるいはこれらの組み合わせと一緒にＣＮＳに入る。言い換えると、本発明に従うＶＬＰは、好ましくは、ＢＢＢの透過性を事前に増大させることなく、ＢＢＢを横断する。本発明に従うＶＬＰは、生理学的に無傷のＢＢＢを横断し得る。
ＢＢＢの横断は、標的がＣＮＳである場合に、特に、上記標的細胞がアストロサイト、オリゴデンドロサイト、ニューロンおよび／またはミクログリアである場合に特に有利である。よって、本発明に従うＶＬＰは、カナバン病およびクラッベ病それぞれの処置の方法において使用され得る。ここで上記方法は、処置されるべき被験体のＢＢＢの透過性を増大させる事前の工程を含まない。本発明に従うＶＬＰは、好ましくは、好ましくは、ＢＢＢを損なうかまたは混乱させるためのいかなる化学的または物理的処置をも受けたことがない患者に投与される。
従って、さらなる実施形態において、上記アスパルトアシラーゼもしくはガラクトセレブロシダーゼそれぞれ、または上記それぞれの酵素をコードする発現ベクターまたは上記それぞれの酵素をコードするｍＲＮＡあるいはこれらの組み合わせ、あるいは本発明に従うＶＬＰを含む薬学的組成物は、ＢＢＢの透過性を損ない得るいかなる添加剤をも含まない。
インビトロでのＢＢＢの完全性は、公知の方法によって、例えば、相対的な経内皮電気抵抗測定（ｔｒａｎｓｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ）（ＴＥＥＲ）（Ｒｅｍｐｅら， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍ ２０１１， ４０６ （１）： ６４－６９）によって、測定され得る。ＢＢＢの多くのインビトロモデルは、確立される（種々の共培養物中での初代のウシまたはヒト脳内皮細胞（例えば、ヒト脳内皮細胞株ＨＢＥＣ－５ｉ）を含む。インビボでは、画像化法（例えば、ＣＴスキャンまたはＭＲＩ）は、ＢＢＢ透過性を可視化するために造影剤と一緒に使用され得る。機能的画像化（例えば、ＰＥＴまたはＳＰＥＣＴ）も使用され得る。
本発明に従うＶＬＰは、種々の経路（経口、皮膚、鼻の投与または肺の経路または非経口的注射（ｉ．ｖ．、ｓ．ｃ．、ｉ．ｍ．）を含む）を介して投与され得る。アスパルトアシラーゼもしくはガラクトセレブロシダーゼそれぞれ、または上記それぞれの酵素をコードする発現ベクターまたは上記それぞれの酵素をコードするｍＲＮＡあるいはこれらの組み合わせの全身効果を可能にする投与形態は、特に好ましい。具体的実施形態において、本発明に従うＶＬＰは、経口的にまたは非経口的に、特に静脈内に投与される。
本発明に従うＶＬＰの適用が、不要な免疫反応（例えば、炎症性サイトカインのおよび／または免疫細胞上の表面分子のアップレギュレーションによって測定される）をもたらす場合には、免疫系の活性化または有効性を低減するために免疫抑制剤をさらに適用することが必要であり得る。
好ましい実施形態において、本発明に従うＶＬＰは、処置されるべき被験体、特にヒトに投与された後、投与後１０日間未満、好ましくは５日間未満、より好ましくは３日間未満でＣＮＳにおいて検出され得る。
別の好ましい実施形態において、アスパルトアシラーゼもしくはガラクトセレブロシダーゼそれぞれは、少なくとも１０日間、好ましくは少なくとも２０日間、より好ましくは少なくとも３０日間、治療上有効な酵素活性を有する。上記治療上有効な酵素活性は、治療効果を、すなわち、少なくとも疾患症状の軽減または緩和をもたらす酵素活性によって測定され得る。
好ましくは標的部位における治療上有効な酵素活性は、アスパルトアシラーゼもしくはガラクトセレブロシダーゼそれぞれがその活性を発揮する場合に有効な期間を延ばすために、少なくとも１０日間、好ましくは少なくとも２０日間維持されることは、特に有利である。それによって、本発明に従うＶＬＰの注射回数または頻度が制限され得る。
１つの実施形態において、上記アスパルトアシラーゼは、配列番号１に従うアミノ酸配列とその全長にわたって少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％同一であり、より好ましくは、配列番号１のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む。
１つの実施形態において、上記アスパルトアシラーゼは、配列番号２のヌクレオチド配列とその全長にわたって少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％同一であり、最も好ましくは、配列番号２のヌクレオチド配列であるヌクレオチド配列によってコードされる。
１つの実施形態において、上記アスパルトアシラーゼは、配列番号９のｍＲＮＡ配列とその全長にわたって少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％同一であり、最も好ましくは配列番号９のｍＲＮＡ配列を含むｍＲＮＡ配列によってコードされる。
１つの実施形態において、上記ガラクトセレブロシダーゼは、配列番号３に従うアミノ酸配列とその全長にわたって少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％同一であり、より好ましくは配列番号３のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む。
１つの実施形態において、上記ガラクトセレブロシダーゼは、配列番号４のヌクレオチド配列とその全長にわたって少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％同一であり、最も好ましくは、配列番号４のヌクレオチド配列であるヌクレオチド配列によってコードされる。
１つの実施形態において、上記ガラクトセレブロシダーゼは、配列番号１０のｍＲＮＡ配列とその全長にわたって少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％同一であり、最も好ましくは、配列番号１０のｍＲＮＡ配列を含むｍＲＮＡ配列によってコードされる。
配列番号１、２および９を有する配列は、酵素ヒトアスパルトアシラーゼに関し、配列番号３、４および１０を有する配列は、酵素ヒトガラクトセレブロシダーゼに関し、以下の表に示される：
Figure 2023526528000001
Figure 2023526528000002
Figure 2023526528000003
Figure 2023526528000004
Figure 2023526528000005
Figure 2023526528000006
Figure 2023526528000007
好ましくは、アスパルトアシラーゼもしくはガラクトセレブロシダーゼそれぞれコードする発現ベクターは、７ｋｂ未満、好ましくは６ｋｂ未満のサイズを有する。上記ＶＬＰと上記発現ベクターとを会合させることは、上記発現ベクターのサイズが相対的に小さい、好ましくは６ｋｂ未満、より好ましくは５ｋｂ未満、最も好ましくは 未満である場合に、より効率的である。
好ましい実施形態において、上記発現ベクターは、ＣＭＶおよびＣＡＧからなる群より選択されるプロモーターを有する。
上記ＣＡＧプロモーターは、長時間持続する発現を可能にすることから、特に有利である。上記ＣＡＧプロモーターはまた、免疫抑制剤のさらなる適用が低減され得るかまたはさらには完全に回避され得るように、不要な免疫反応を阻害する。
上記ＣＭＶプロモーターは、より強い、かつより短期間の発現が必要とされる場合に好ましい。
長期間持続するかまたは短期間の発現の必要性は、上記疾患、上記疾患のステージ、および処置されるべき被験体に依存して変動し得る。上記酵素の長期間持続する発現は、被験体において、アスパルトアシラーゼもしくはガラクトセレブロシダーゼそれぞれの活性が全くないかごくわずかしか残留活性がない場合に有益である長時間持続する効果を可能にする。アスパルトアシラーゼもしくはガラクトセレブロシダーゼそれぞれの残留活性が存在する場合、より短期間の発現が、十分であり得る。同様に、軽いまたは強い発現の必要性は変動し得る。
好ましくは、アスパルトアシラーゼもしくはガラクトセレブロシダーゼそれぞれが、好ましくは、標的部位において、少なくとも１時間、好ましくは少なくとも５時間、より好ましくは少なくとも１２時間、より好ましくは少なくとも１日間、より好ましくは少なくとも３日間、より好ましくは少なくとも１週間、より好ましくは少なくとも１ヶ月間、より好ましくは少なくとも３ヶ月間、より好ましくは少なくとも６ヶ月間、より好ましくは少なくとも９ヶ月間、より好ましくは少なくとも１年間、より好ましくは少なくとも１．５年間、より好ましくは少なくとも２年間にわたって発現される。
最も好ましくは、アスパルトアシラーゼもしくはガラクトセレブロシダーゼそれぞれが、標的部位において少なくとも１ヶ月間発現される。
１つの実施形態において、従って、アスパルトアシラーゼもしくはガラクトセレブロシダーゼそれぞれが、標的部位において、少なくとも１時間、好ましくは少なくとも５時間、より好ましくは少なくとも１２時間、より好ましくは少なくとも１日間、より好ましくは少なくとも３日間、より好ましくは少なくとも１週間、より好ましくは少なくとも１ヶ月間、より好ましくは少なくとも３ヶ月間、より好ましくは少なくとも６ヶ月間、より好ましくは少なくとも９ヶ月間、より好ましくは少なくとも１年間、より好ましくは少なくとも１．５年間、より好ましくは少なくとも２年間にわたって検出可能である。
最も好ましくは、アスパルトアシラーゼもしくはガラクトセレブロシダーゼそれぞれは、標的部位において、少なくとも１ヶ月間検出可能である。
好ましくは、標的細胞における発現は、一過性である。一過性の発現は、発現が長時間持続することを排除しない。好ましい実施形態において、上記発現は、長時間持続し、一過性である。
好ましい実施形態において、上記発現ベクターは、プラスミドである。
特に好ましい実施形態において、上記プラスミドは、抗生物質耐性遺伝子を含まない。これは、このようなプラスミドを抗生物質なしで培養することを可能にすることから、有利である。これは、抗生物質の注射が感作またはアナフィラキシーショックをもたらし得ることから、臨床的使用にとって特に重要である。「ｐＦＡＲ」プラスミドは、例えば、抗生物質耐性遺伝子のないプラスミドである。ｐＦＡＲプラスミドは、抗生物質を使用する必要性梨に、長時間持続し、安定な発現を可能にし、本発明を実施するために使用され得る。
別の好ましい実施形態において、「ｐＮＬ」プラスミドまたは「ｐＳＦ」プラスミドが使用される。
表現「ｐＦＡＲプラスミド」、「ｐＮＬプラスミド」または「ｐＳＦプラスミド」は、ｐＦＡＲプラスミド、ｐＮＬプラスミドまたはｐＳＦプラスミドの骨格を有するプラスミドが、プロモーターおよび目的の酵素を上記骨格の中にクローニングするために使用されることを意味する。
ｐＦＡＲプラスミドは、例えば、ＵＳ ８，４４０，４５５ Ｂ２に記載される。特に好ましいｐＦＡＲプラスミドは、ｐＦＡＲ４であり、その骨格は、ＵＳ ８，４４０，４５５ Ｂ２の中で配列番号２１として開示されている。「ｐＦＡＲ１」プラスミドの構築および最適化された「ｐＦＡＲ４」プラスミドは、ＵＳ ８，４４０，４５５ Ｂ２の第１７欄および第１８欄に開示されている。
ｐＦＡＲプラスミドは、好ましくは、ＣＭＶまたはＣＡＧプロモーターを含む。上記ｐＮＬプラスミドは、好ましくは、ＣＭＶプロモーターを含む。上記ｐＳＦプラスミドは、好ましくは、ＣＡＧプロモーターを含む。
好ましい実施形態において、上記発現ベクターは、それぞれ、ｐＮＬ－ＣＭＶ－ｈＡＳＰＡまたはｐＮＬ－ＣＭＶ－ｈＧＡＬＣ、従って、ＣＭＶプロモーターを有し、それぞれ、ヒトＡＳＰＡまたはＧＡＬＣ遺伝子をコードするｐＮＬ骨格である。別の好ましい実施形態において、上記発現ベクターは、ｐＦＡＲ－ＣＡＧ－ｈＡＳＰＡまたはｐＦＡＲ－ＣＡＧ－ｈＧＡＬＣである。上記発現ベクターｐＮＬ－ＣＭＶ－ｈＡＳＰＡまたはｐＮＬ－ＣＭＶ－ＧＡＬＣはそれぞれ、特に好ましい。
本発明において、アスパルトアシラーゼおよびガラクトセレブロシダーゼそれぞれが、異なる細胞株において発現され得ることが示されている。
好ましい実施形態において、上記カーゴが、アスパルトアシラーゼもしくはガラクトセレブロシダーゼそれぞれをコードする発現ベクターである場合、カナバン病およびクラッベ病それぞれの処置は、処置されるべき被験体の標的細胞、好ましくは、オリゴデンドロサイトにおいてそれぞれの遺伝子の一過性の発現によってもたらされる。
別の好ましい実施形態において、上記カーゴが、アスパルトアシラーゼもしくはガラクトセレブロシダーゼそれぞれをコードするｍＲＮＡである場合、カナバン病およびクラッベ病それぞれの処置は、処置されるべき被験体の標的細胞、好ましくは、オリゴデンドロサイトにおいてそれぞれの遺伝子の一過性の発現によってもたらされる。
本発明に従うＶＬＰによって処置されるべき被験体は、例えば、カナバン病もしくはクラッベ病それぞれに罹患している患者、または例えば、上記疾患に罹患していると予測される被験体である。なぜなら彼らは、アスパルトアシラーゼもしくはガラクトセレブロシダーゼそれぞれに影響を及ぼすことが公知であり、従って、カナバン病およびクラッベ病をそれぞれをもたらす遺伝的変異を含むからである。
カナバン病およびクラッベ病の種々のマウスモデルが存在し、上記疾患および考えられる治療剤を試験するために使用され得る：
ＡＳＰＡｎｕｒ７マウスは、ＡＳＰＡ遺伝子におけるナンセンス変異に起因して、アスパルトアシラーゼ酵素を発現しない。それらは、ＮＡＡレベルの増大が付随する中枢神経系におけるミエリンの早期発症型海綿状変性によって特徴づけられる。ＡＳＰＡｎｕｒ７マウスは、野生型マウスと比較して遙かに小さく、振戦およびてんかん発作が検出され得る（Ｔｒａｋａら， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ２００９； ２８： １１５３７－１１５４９）。
Ｔｗｉｔｃｈｅｒマウスは、ＧＡＬＣ遺伝子において変異を有する。欠損マウスは、野生型マウスと比較して遙かに小さくかつ活動的でなく、寿命は、約４０日間しかない。ミエリンの欠如が、ＣＮＳおよびＰＮＳにおいて検出され得る。病因が、神経系におけるガラクトシルスフィンゴシン（サイコシン）の異常な蓄積から生じる（Ｓｕｚｕｋｉら， Ｂｒａｉｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ １９９５； ５（３）： ２４９－２５８）。
本発明のＶＬＰは、好ましくは、Ｊｏｈｎ Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍウイルス（ＪＣＶ）に由来する。その「ＪＣウイルス（ＪＣ ｖｉｒｕｓ）」またはＪｏｈｎ Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍウイルス（ＪＣＶ； ＮＣＢＩ Ｔａｘｏｎｏｍｙ １０６３２）は、ヒトポリオーマウイルスである。ＪＣＶは、正二十面体対称であり、直径約４５ｎｍを有し、７２のＶＰ１ペンタマーからなる。少数の構造タンパク質ＶＰ２およびＶＰ３もまた存在する。
「ウイルス様粒子（ｖｉｒｕｓ－ｌｉｋｅ ｐａｒｔｉｃｌｅ）」（ＶＬＰ）とは、本発明の状況において、ウイルス構造タンパク質または改変されたウイルス構造タンパク質またはウイルス構造タンパク質に由来するタンパク質から構成される殻（キャプシドともいわれる）を有する複製欠損粒子として定義される。上記で説明されるように、ＶＬＰ自体は、遺伝物質を含まない。本発明に従うＶＬＰは、好ましくは、ヒトポリオーマウイルス、好ましくはＪＣＶに由来する。すなわち、その殻は、好ましくは、ウイルス構造タンパク質または改変されたウイルス構造タンパク質またはＪＣＶに由来するウイルス構造タンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３に由来するタンパク質から構成される。好ましい実施形態において、本発明に従うＶＬＰは、ＪＣウイルスのＶＰ１タンパク質から構成される。
本発明の特に好ましい実施形態において、本発明に従うＶＬＰの殻における唯一のウイルス構造タンパク質は、ＶＰ１タンパク質である。最も好ましい実施形態において、本発明に従うＶＬＰの殻は、ＶＰ１タンパク質からなる。すなわち、上記殻は、いかなる他のタンパク質をも含まない。
そのウイルス構造タンパク質、特にそのＶＰ１は、ペンタマー構造（ペンタマー）へとアセンブルする。本発明によれば、本発明に従うＶＬＰ殻は、好ましくは、いくつかのＶＰ１タンパク質、特にいくつかのＶＰ１ペンタマー、特に、７２のＶＰ１ペンタマーから構成される。
「ペンタマー（ｐｅｎｔａｍｅｒ）」とは、本発明の状況において、５個のポリペプチド、例えば、ＶＰ１タンパク質がアセンブルする場合に形成される構造である。ペンタマーへのアセンブリは、そのポリペプチド間の共有結合または非共有結合の形成に起因し得る。そのポリペプチドは、代表的には、五角形対称を有する環形状の構造を形成する。ペンタマーでは、各ポリペプチドサブユニットは、好ましくは２個の隣接するサブユニットと相互作用する。
本発明に従う「ペプチド（ｐｅｐｔｉｄｅ）」は、任意の数の任意のタイプのアミノ酸、好ましくは天然に存在するアミノ酸から構成され得、これらは好ましくは、ペプチド結合によって連結される。特に、ペプチドは、少なくとも３個のアミノ酸、好ましくは少なくとも５個、少なくとも７個、少なくとも９個、少なくとも１２個または少なくとも１５個のアミノ酸を含む。ペプチドの長さに上限はない。しかし、好ましくは、本発明に従うペプチドは、５００個のアミノ酸、好ましくは４００個、３００個、２５０個、２００個、１５０個、または１２０個のアミノ酸の長さを超えない。約１０個のアミノ酸を超えるペプチドは、「ポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」といわれ得る。
本発明に従うＶＬＰの構造タンパク質、特にそのＶＰ１は、好ましくは、ＪＣＶのネイティブな構造タンパク質と同一であるかまたはその構造タンパク質に由来する。「改変されたまたは由来する（ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｏｒ ｄｅｒｉｖｅｄ）」とは、ＶＰ１の機能を保持してキャプシドへとアセンブルすると同時に、１またはこれより多くのアミノ酸の挿入、欠失または置換を包含する。
一実施形態において、そのネイティブな（ＪＣＶ）構造タンパク質は、その生成、その細胞標的化プロフィールおよび特異性またはその細胞内標的化プロフィールもしくは特異性に関して、本発明に従うＶＬＰを最適化するために改変され得る。改変または誘導体化は、タンパク質翻訳を増強するために、その構造タンパク質、特にそのＶＰ１をコードするヌクレオチド配列のコドン最適化を含み得る。
本発明に従う用語「ＶＰ１」または「ウイルスタンパク質１（ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ １）」とは、キャプシドへとアセンブリし得るタンパク質であって、好ましくはＪＣＶの天然の（ネイティブな）ＶＰ１に同一であるかまたはこれに由来するタンパク質をいう。
本発明に従う用語「ＶＰ１」は、配列番号５または６に従うアミノ酸配列と、この配列にわたって少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質を包含する。本発明の最も好ましい実施形態において、そのＶＰ１は、配列番号５または６に従うアミノ酸配列を有する。
本発明に従う用語「ＶＰ１」はまた、そのネイティブなＶＰ１の画分を包含する。好ましくは、上記ＶＰ１の画分は、配列番号５もしくは６に従うアミノ酸配列の少なくともアミノ酸３２～３１６、または配列番号５もしく６のアミノ酸３２位～３１６位に由来するアミノ酸配列と、この配列にわたって少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有するその誘導体を含む。
一実施形態において、そのＶＰ１タンパク質のヌクレオチド配列は、配列番号７のヌクレオチド配列とその全長にわたって少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％同一であり、好ましくは配列番号７のヌクレオチド配列である。
本発明の別の実施形態において、そのＶＰ１タンパク質のヌクレオチド配列は、配列番号８のヌクレオチド配列とその全長にわたって少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％同一である。一実施形態において、そのＶＰ１タンパク質のヌクレオチド配列は、配列番号８のヌクレオチド配列と同一である。
その配列は、表２に示される。
Figure 2023526528000008
Figure 2023526528000009
Figure 2023526528000010
Figure 2023526528000011
本発明の好ましい実施形態において、そのＶＰ１は、配列番号５または６に従うアミノ酸配列とその全長にわたって少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する。
本発明の好ましい実施形態において、そのＶＰ１タンパク質のヌクレオチド配列は、配列番号７または８のヌクレオチド配列とその全長にわたって少なくとも８０％同一である。
構造タンパク質、好ましくはＶＰ１は、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉまたは昆虫細胞において発現され得る。本発明の好ましい実施形態によれば、その構造タンパク質、好ましくはＶＰ１は、昆虫細胞において発現される。これは、昆虫細胞における発現がＥ．ｃｏｌｉにおける発現ではなく、例えば、ＪＣＶに由来する野生型タンパク質と比較してより少ない改変（例えば、翻訳後修飾）をもたらすことから、有利である。
本発明に従うＶＬＰは、キャプシド中に、１または数個のさらなる異種タンパク質（すなわち、ＶＰ１の供給源、例えば、ＪＣＶに同一でないかまたはそのタンパク質に由来しないタンパク質）をさらに含み得る。例えば、異種タンパク質は、そのキャプシドの中に繋留され得る、すなわち、このタンパク質のうちの少なくとも一部は、好ましくは外側からアクセス可能である。原則的に、任意のタンパク質は、そのような異種タンパク質がキャプシドの中に組み込まれ得、本発明に従うＶＬＰのアセンブリに実質的に干渉しない限りにおいて、異種タンパク質として適している。
本発明に従うＶＬＰは、カーゴと、すなわち、アスパルトアシラーゼもしくはガラクトセレブロシダーゼそれぞれ、または上記それぞれの酵素をコードする発現ベクターまたは上記それぞれの酵素をコードするｍＲＮＡ、あるいはこれらの組み合わせと会合される。これは、そのカーゴがそのＶＬＰに可逆的に結合されることを意味する。これは、例えば、そのカーゴの任意の一部との物理化学的相互作用もしくは付着に起因するか、またはそのキャプシドへのそのカーゴの組み込みによるかのいずれかであり得る。その組み込みは、完全または不完全であり得る。本発明の特に好ましい実施形態において、そのカーゴの総量の大部分は、そのキャプシドへと完全に組み込まれる。最も好ましいのは、そのカーゴが本発明に従うＶＬＰのキャプシドの中に完全に被包されることである。
本発明の状況では、「ＶＬＰがカーゴを含む（ＶＬＰ ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ ｔｈｅ ｃａｒｇｏ）」という表現は、そのＶＬＰが「そのカーゴと会合される（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｃａｒｇｏ）」という表現と同義に使用される。そのＶＬＰとそのカーゴとの会合は、ＶＬＰをそのカーゴに「装填（ｌｏａｄｉｎｇ）」または「パッキング」した結果であり得る。
「装填」とは、ＶＬＰとカーゴとの会合を、例えば、浸透圧ショックによってまたはＶＰ１もしくはＶＰ１ペンタマーをＶＬＰへとそのカーゴと一緒にアセンブルすることによってもたらす任意のプロセスを意味する。「装填されたＶＬＰ（ｌｏａｄｅｄ ＶＬＰ）」は、このプロセスから生じるＶＬＰである。用語「パッキング（ｐａｃｋｉｎｇ）」とは、ＶＰ１またはＶＰ１ペンタマーをＶＬＰへとそのカーゴと一緒にアセンブルすることを介して、そのＶＬＰを装填するプロセスに関する。これから生じるＶＬＰは、「パックされた（ｐａｃｋｅｄ）」ＶＬＰといわれる。
用語「カーゴ」が、本発明の状況において、酵素、特に、アスパルトアシラーゼおよびガラクトセレブロシダーゼ、またはこのような酵素をコードする発現ベクターまたはこのような酵素をコードするｍＲＮＡあるいはこれらの組み合わせのために使用される。
上記に伴って、酵素もしくは上記酵素をコードする発現ベクターもしくは上記酵素をコードするｍＲＮＡまたはこれらの組み合わせでパックされたＶＬＰ、特に、アスパルトアシラーゼもしくはガラクトセレブロシダーゼでパックされたＶＬＰまたはアスパルトアシラーゼもしくはガラクトセレブロシダーゼをコードする発現ベクターでパックされたＶＬＰまたはアスパルトアシラーゼもしくはガラクトセレブロシダーゼをコードするｍＲＮＡでパックされたＶＬＰ、あるいはこれらの組み合わせがまた、それぞれ、「被包されたアスパルトアシラーゼ（ＡＳＰＡ）」および「被包されたガラクトセレブロシダーゼ（ＧＡＬＣ）」といわれ得る。
本発明の特別な実施形態において、本発明に従うＶＬＰは、被験体においてカナバン病またはクラッベ病それぞれの処置のための方法における使用のための薬学的組成物の一部であり、ここで上記薬学的組成物は、薬学的に受容可能なキャリア、および／または賦形剤をさらに含む。
好ましい実施形態において、上記薬学的組成物は、本発明に従うＶＬＰ、塩および緩衝液を含み、７．０～８．０の間、好ましくはおよそ７．５のｐＨを有する。上記薬学的組成物は、好ましくは、
ａ． １２０ｍＭ～１７０ｍＭ ＮａＣｌ、好ましくは１５０ｍＭ ＮａＣｌ、
ｂ． １～５ｍＭ ＣａＣｌ２、好ましくは２ｍＭ ＣａＣｌ２、および
ｃ． ５～３０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、好ましくは１０～２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、より好ましくは１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、
を含む。
この薬学的組成物は、本発明に従うＶＬＰを生理学的条件下で扱うことを可能にする。これらの条件下では、本発明に従うＶＬＰは、本質的に無傷のままであり、好ましくは、それらは、それらのキャプシド構造を本質的に維持する。カーゴ（例えば、アスパルトアシラーゼもしくはガラクトセレブロシダーゼそれぞれ、もしくは上記それぞれの酵素をコードする発現ベクター、もしくは上記それぞれの酵素をコードするｍＲＮＡ、またはこれらの組み合わせ）に装填される場合、本発明に従うＶＬＰは、上記カーゴと本質的に会合したままである。上記薬学的組成物は、被験体への、特にヒトへの本発明に従うＶＬＰの静脈内投与のための薬学的組成物として特に適している。
さらなる局面において、本発明は、アスパルトアシラーゼもしくはガラクトセレブロシダーゼそれぞれをコードするコード領域、ＣＡＧおよびＣＭＶを含む群から選択されるプロモーターを有し、７ｋｂ未満、好ましくは６ｋｂ未満、より好ましくは５ｋｂ未満、最も好ましくは４ｋｂ未満のサイズを有する発現ベクターに関する。
好ましい実施形態において、上記アスパルトアシラーゼもしくはガラクトセレブロシダーゼそれぞれ（発現ベクター、すなわち、上記コード領域によってコードされる）は、配列番号２もしくは配列番号４それぞれのヌクレオチド配列とその全長にわたって少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％同一であり、好ましくは配列番号２もしくは配列番号４それぞれのヌクレオチド配列であるヌクレオチド配列を含む。
本発明に従うＶＬＰが製造後直ぐに投与されない場合、それらは、好ましくは液体窒素中で貯蔵され得る。
本発明に従うＶＬＰは、標準的方法に従って、例えば、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ、ＨＡ、ＤＬＳ、ｎＤＳＦ、ＨＰＬＣ－ＳＥＣ、ＡＦ４、ＴＥＭによって特徴づけられ得る。
本発明はまた、カナバン病またはクラッベ病を、本発明に従うＶＬＰで処置する方法に関する。上記処置方法は、好ましくは、上記ＶＬＰを、その必要性のある被験体に投与する工程を包含する。
本発明はまた、カナバン病またはクラッベ病それぞれの処置のための医薬の製造のための本発明に従うＶＬＰの使用に関する。上記処置方法は、好ましくは、処置されるべき被験体のＢＢＢの透過性を増大させる工程を包含しない。本発明のＶＬＰは、好ましくは、ＢＢＢを損なうかまたは混乱させるためのいかなる化学的または物理的処置をも受けたことのない患者に投与される。
本発明はまた、アスパルトアシラーゼもしくはガラクトセレブロシダーゼそれぞれ、または上記それぞれの酵素をコードする発現ベクターまたは上記それぞれの酵素をコードするｍＲＮＡあるいはこれらの組み合わせを、ＢＢＢを横断してＣＮＳへと、特に、ＣＮＳの細胞（例えば、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、ニューロンおよびミクログリア）へと送達するために使用される、本発明に従うＶＬＰに関する。
重要なことには、本発明に従うＶＬＰによるＢＢＢの横断は、上記ＶＬＰが脳内の特異的細胞集団を標的化する、すなわち、アスパルトアシラーゼもしくはガラクトセレブロシダーゼそれぞれ、または上記それぞれの酵素をコードする発現ベクターまたは上記それぞれの酵素をコードするｍＲＮＡあるいはこれらの組み合わせを、標的細胞（好ましくは、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、ニューロンおよびミクログリア）へと速達するというその機能を示すことを可能にする。本発明の状況において、上記ＶＬＰは、標的細胞へのおよび／またはその中への送達を含む。
さらなる実施形態において、本発明は、ＶＬＰと、アスパルトアシラーゼもしくはガラクトセレブロシダーゼそれぞれをコードする発現ベクターとを会合させる方法であって、ここで上記方法は、以下の工程：
－ ＶＬＰ、特に、ＪＣＶに由来するＶＬＰを提供する工程、
－ 上記ＶＬＰを、上記ＶＬＰをペンタマーへと解離する条件へと曝す工程、
－ 前記ペンタマーを前記発現ベクターに、１：０．５～１：０．１のＶＬＰ 対 発現ベクターの比、好ましくは１：０．２の比において、および上記ペンタマーを上記発現ベクターと会合されたＶＬＰへとアセンブルする条件へと曝す工程、
－ 必要に応じて、上記ＶＬＰを精製する工程、
－ 透析工程を行う工程、
を包含する方法に関する。
別の好ましい実施形態において、ＶＬＰと、アスパルトアシラーゼもしくはガラクトセレブロシダーゼそれぞれ、または上記それぞれの酵素をコードする発現ベクター、または上記それぞれの酵素をコードするｍＲＮＡあるいはこれらの組み合わせとを会合させる方法であって、ここで上記方法は、以下の工程：
ａ）ＶＰ１タンパク質を含む組成物を提供する工程、
ｂ）上記ａ）の組成物のＶＰ１タンパク質を、ＶＬＰへとアセンブルするように上記ＶＰ１を誘導する条件へと曝す工程、
ｃ）上記ｂ）の組成物のＶＬＰを、上記ＶＬＰをペンタマーへと解離する条件へと曝す工程、
ｄ）上記ｃ）の組成物のペンタマーを、ＶＬＰへと再アセンブルするように上記ペンタマーを誘導する条件へと曝す工程、
ｅ）上記ｄ）の組成物のＶＬＰを、ペンタマーへと上記ＶＬＰを脱アセンブルする条件へと曝す工程、
ｆ）上記ｅ）の組成物のペンタマーを、アスパルトアシラーゼもしくはガラクトセレブロシダーゼそれぞれ、または上記発現ベクターまたは上記ｍＲＮＡあるいはこれらの組み合わせに、上記それぞれの酵素もしくは上記発現ベクターもしくは上記ｍＲＮＡまたはこれらの組み合わせと会合されたＶＬＰへとアセンブルするように上記ペンタマーを誘導する条件へと曝す工程、
を包含する方法が提供される。
ＶＬＰ 対 発現ベクターの比（すなわち、パッケージング比）は、具体的な必要性に応じて変動し得る。例えば、ＶＬＰ形成または遺伝子発現の効率は、上記比に依存し得る。好ましくは、１：０．５～１：０．１の、より好ましくは１：０．２のＶＬＰ 対 発現ベクターの比が使用される。当業者は、具体的な発現ベクター、好ましくはプラスミドに対する比、および所望の使用法に合わせて調整する。１：０．２のパッケージング比が好ましい。
ＶＬＰ 対 ｍＲＮＡの比（すなわち、パッケージング比）は、１：０．２であり得る。
本発明の状況において、および説明しやすさのために、工程ｂ）から生じるＶＬＰは、
「ｐＶＬＰ」（一次ＶＬＰ）ともいわれ得る。工程ｄ）から得られるＶＬＰは、「ｒＶＬＰ」（再アセンブルＶＬＰ）ともいわれ得る。工程ｆ）の結果としてのＶＬＰは、「ｃＶＬＰ」（カーゴＶＬＰ）ともいわれ得る。本発明によれば、カーゴは、酵素、特に、アスパルトアシラーゼもしくはガラクトセレブロシダーゼ、好ましくはヒトアスパルトアシラーゼもしくはヒトガラクトセレブロシダーゼ、またはこのような酵素、好ましくはヒトアスパルトアシラーゼもしくはヒトガラクトセレブロシダーゼをコードする発現ベクター、またはこのような酵素、好ましくはヒトアスパルトアシラーゼもしくはヒトガラクトセレブロシダーゼをコードするｍＲＮＡ、あるいはこれらの組み合わせである。
本発明の別の局面において、本発明は、上記の方法によって得られ得るＶＬＰに関する。
本発明の別の局面において、本発明は、以下のパラメーターのうちの１またはこれより多くによって特徴づけられるＪＣＶに由来する本発明に従うＶＬＰを含む組成物に関する：
ａ． ０．３未満、好ましくは０．２未満、好ましくは０．１未満、より好ましくは０．０１～０．０９の間の範囲の多分散指数（ＰＤＩ）、
ｂ． ＶＬＰのうちの少なくとも７０％が、２０ｎｍ～７０ｎｍ、好ましくは３０ｎｍ～７０ｎｍの、より好ましくは３５ｎｍ～６５ｎｍの、より好ましくは４０～６０ｎｍの平均直径を有する、
ｃ． 上記組成物内のＶＬＰ含有量が、少なくとも８０％（ｖ／ｖ）、好ましくは少なくとも８５％（ｖ／ｖ）、好ましくは少なくとも９０％（ｖ／ｖ）、好ましくは少なくとも９５％（ｖ／ｖ）。
別の局面において、本発明は、本発明に従う方法によって得られ得る薬物送達システムに関する。上記薬物送達システムは、治療および／または診断の方法において、好ましくは、神経学的障害、すなわち白質ジストロフィー、特に、カナバン病またはクラッベ病の処置のために使用され得る。よって、本発明はまた、障害、特に、ＣＮＳ疾患の、本発明に従う薬物送達システムでの処置の方法に関する。上記処置方法は、好ましくは、薬物送達システムを、その必要性のある被験体に投与する工程を包含する。
上記薬物送達システムは、好ましくは改善された有効性を有する。本発明に従うＶＬＰは、ＢＢＢの透過性の事前の増大なしに、ＢＢＢを横断し得る。よって、本発明の薬物送達システムは、ＣＮＳ疾患を処置するための方法において使用され得、ここでその方法は、処置されるべき被験体のＢＢＢの透過性を増大させる工程を包含しない。本発明の薬物送達システムは、好ましくは、ＢＢＢを損なうかまたは混乱させるためのいかなる化学的または物理的処置をも受けたことがない患者に投与される。
本発明のなおさらなる局面において、以下の特徴（「標的パラメーター（ｔａｒｇｅｔ ｐａｒａｍｅｔｅｒ）」）のうちの少なくとも１つ、好ましくは全てを有するＶＬＰを含む組成物が、提供される：
Figure 2023526528000012
１つの実施形態において、本発明に従うＶＬＰは、＞６７℃のｎＤＳＦ分析において主要な屈折ピークを示す。
１つの実施形態において、本発明に従うＶＬＰのＡＦ４分析から、２０％未満の凝集物および１５％未満の非常に小さいものが明らかにされる。少なくとも７０％は、サイズが４０～５０ｎｍのＶＬＰである。
本発明の薬物送達システムは、種々の経路（経口、皮膚、鼻または肺の経路または注射を含む）を介して投与され得る。特に好ましいのは、その薬学的生成物の全身的効果を可能にする投与形態である。具体的実施形態において、本発明の薬物送達システムは、経口的にまたは非経口的に、特に静脈内に投与される。
本発明の状況において、用語「薬物送達システム（ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍ）」とは、薬学的生成物をその必要性のある被験体に、特にヒトまたは動物に投与するための組成物をいう。薬物送達システムは、有利なことには、その中に含まれるかまたはそこに付着される薬学的生成物の、好ましくはヒトまたは動物において、目的の部位への送達を可能にする。好ましくは、その送達は、その標的に対して選択的である。すなわち、その薬学的生成物のうちの多くは、身体または器官の他の部位ではなくその標的に送達される。
「ＣＮＳの薬物送達システム（ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｔｈｅ ＣＮＳ）」とは、その薬物送達システムがＣＮＳを選択的に標的化することを意味する。
本発明によれば、表現、何か（例えば、ＶＰ１、ペンタマー、ＶＬＰ）を何かをもたらす（例えば、アセンブリを誘導する）ための条件に「曝す（ｅｘｐｏｓｉｎｇ）」とは、考慮中の物質（例えば、ＶＰ１、ペンタマー、ＶＬＰ）を、このある種の効果を引き起こし得る（例えば、アセンブリを誘導する）条件にもたらすことをいう。このような曝露は、その物質のための条件を変化させることによって、例えば、その物質に種々の緩衝液、塩またはｐＨなどとの接触をもたらすことによって行われ得る。これは、何かを、その物質を含む組成物に添加する（逆も同様）か、またはその物質をその組成物から分離し、そして次いで、その物質を異なる組成物に添加するかのいずれかによって、可能である。
条件の変更はまた、温度、照射などを変動させることによって達成され得る。当然のことながら、条件の変更のためのこのような手段は、組み合わされ得るおよび／または反復され得る。その所望の効果（例えば、そのＶＰ１もしくはペンタマーの、ＶＬＰへのアセンブリおよび／またはそのＶＬＰの凝集を誘導する）を誘導する他の適切な条件はまた、当業者に周知である。その同じことが、そのそれぞれの条件への曝露の適切な継続期間にも当てはまる；これは、当業者の通常の手段によって見出され得る。
表現「何かを、何かをもたらすための条件に曝す（ｅｘｐｏｓｉｎｇ ｓｏｍｅｔｈｉｎｇ ｔｏ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ａｆｆｅｃｔｉｎｇ ｓｏｍｅｔｈｉｎｇ）」は、企図されるべき効果を要求しない、すなわち、その物質の全てが考慮中の効果を達成しなければならないわけではない。例えば、「そのペンタマーが凝集するように誘導する条件（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｔｈｅ ｐｅｎｔａｍｅｒｓ ｔｏ ａｇｇｒｅｇａｔｅ）」は本質的に、その条件が凝集を誘導するために適していることを意味する。それは、実際に全てのペンタマーが凝集することを要求しない。
本明細書で使用される場合、用語「アセンブリ（ａｓｓｅｍｂｌｙ）」または「ＶＬＰへとアセンブルする（ａｓｓｅｍｂｌｅ ｉｎｔｏ ＶＬＰ）」とは、考慮中の構造（ＶＰ１タンパク質またはペンタマーのいずれか）が会合してＶＬＰのキャプシドを確立することを意味する。ＶＰ１が出発物質として使用される場合、ＶＬＰへのアセンブリは、ペンタマーの事前の形成を含み得る。これは、そのＶＰ１タンパク質が先ず、ペンタマーを形成し得、次いで、ＶＬＰを形成し得るか、またはそれらはＶＬＰへと直接アセンブリし得ることを意味する。ＶＬＰのアセンブリは、可逆的である。
用語「脱アセンブル（ｄｉｓａｓｓｅｍｂｌｙ）」とは、翻って、そのＶＬＰのキャプシドがペンタマー構造および／または構造タンパク質へと少なくとも部分的に崩壊する場合のプロセスをいう。その脱アセンブルは、温度を上昇させることによって、プロテアーゼを添加することによって、および／またはＶＬＰを形成するために使用される分子間相互作用（例えば、分子間ジスルフィド架橋）を減少させることによって（例えば、還元剤を添加するかもしくはキレート化剤を添加することによって）誘導され得る。このような条件はまた、条件への段階的曝露を包含し得る。例えば、その組成物は、その温度が上昇する前に、還元剤と接触され得る。
そのＶＰ１および／またはペンタマーを誘導して、ＶＬＰへとアセンブルするための方法は一般に、当業者に公知である（Ｇｏｌｄｍａｎｎら（Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． １９９９； ７３（５）： ４４６５－６９）； ＤＥ １９５ ４３ ５５３ Ａ１）。その同じことが、ペンタマーへのＶＬＰの脱アセンブルに当てはまる。当業者は、よって、ＶＬＰのアセンブリおよび脱アセンブルの制御のための方法を認識する。
本発明の一実施形態において、そのＶＰ１またはペンタマーを含む組成物中のＣａ２＋イオンの濃度は、そのＶＬＰのアセンブリ／脱アセンブルの制御のために使用される。例えば、そのアセンブリを誘導するために、遊離Ｃａ２＋イオンの濃度が増大され得る。その脱アセンブルが望ましい場合、遊離Ｃａ２＋イオンの濃度は、キレート化剤をその組成物に添加することによって低下させられ得る。
そのアセンブリを誘導するためのさらなる選択肢は、ＶＬＰへのアセンブリを、例えば、そのペンタマーを含む組成物中の溶媒を低減することによって促進するために、ＶＰ１ペンタマーの濃度を増大させることである。これは、アルカリ土類金属（例えば、Ｃａ２＋またはＭｇ２＋）の濃度の適合を要求し得る。
本発明の好ましい実施形態によれば、脱アセンブルは、そのＶＬＰを分子間ジスルフィド架橋が例えば、そのＶＬＰを還元条件に曝すことによって還元される条件に曝すことによって誘導され得る。好ましい実施形態において、この工程は、キレート化剤のさらなる存在下で達成される。より好ましくは、その脱アセンブルは、そのＶＬＰを、キレート化剤の存在下で、および必要に応じて高温で還元条件に曝すことによって誘導される。
本発明の特定の実施形態において、そのＶＬＰは、ＤＴＴならびにＥＤＴＡおよび／またはＥＧＴＡを含む組成物に、好ましくは１５℃～３０℃、好ましくは２０℃～２５℃の温度で、最も好ましくは約２３℃の温度で曝される。
本発明の好ましい実施形態によれば、ｃ）の組成物のペンタマーは、その凝集を誘導する条件に曝される。この工程は、工程ｄ）の前に行われる場合に最も適切である。好ましい実施形態において、その物質（例えば、そのペンタマー）のうちの少なくとも２０％（好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％）が凝集する。
驚くべきことに、この工程はそのＶＬＰのより均質のサイズ分布をもたらし得ることが見出された。これは、よりよい品質管理および標準化を可能にし、これは、そのＶＬＰが薬物送達システムにおいて使用される場合に最も重要である。よって、このさらなる手順は、好ましくは、薬物送達システムの品質制御要件の一部である。
用語「凝集物（ａｇｇｒｅｇａｔｅ）」とは、任意の粒状構造を意味する。「凝集（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）」とは、凝集物をもたらすプロセスを意味する。このプロセスは、可逆的である。
そのペンタマーまたはＶＬＰの凝集は、コントロールと比較して、その組成物中のＶＬＰの増大した平均粒度によって決定され得る。そのより大きな粒度は、標準的方法（例えば、動的光散乱法（ＤＬＳ））によって決定され得る。
本発明の特定の実施形態によれば、そのペンタマーまたはＶＰ１の凝集は、タンパク質の沈殿を促進することが当該分野で公知である１またはこれより多くの薬剤（沈殿剤）によって誘導され得る。従って、最も好ましいのは、本発明によれば、沈殿剤の使用である。
「沈殿剤（ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ａｇｅｎｔ）」とは、ＶＰ１またはペンタマーの凝集を促進する薬剤をいう。沈殿剤の概念は一般に、当業者に公知である。沈殿剤は代表的には、タンパク質の濃縮および精製を促進するために使用される。沈殿は、より具体的には、そのタンパク質の溶解性を低下させることによって、溶媒の溶媒和能力の質を変化させる結果であり得る。その溶解性は、その組成物のｐＨをタンパク質の等電点へと調節することによっても低下され得る。さらに、その組成物の温度を低下させることは、タンパク質の溶解性をも低減し得る。
考えられる沈殿剤は、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、またはアルコール（例えば、エタノール）、および塩である。後者は、「塩析するための薬剤（ａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ ｓａｌｔｉｎｇ ｏｕｔ）」として当業者に公知である。
好ましくは、本発明によれば、その沈殿剤は塩である。最も好ましいのは、「ホフマイスターシリーズ（Ｈｏｆｍｅｉｓｔｅｒ ｓｅｒｉｅｓ）」として公知のイオンを含む塩である。そのホフマイスターシリーズは、溶液中の具体的タンパク質の溶解性に影響を及ぼす能力に関して、そのタンパク質に対するそれらの疎水性効果に関するイオンの組織化を説明する。タンパク質に対して疎水性効果を発揮するイオンは、特に好ましい。本明細書で、このようなイオンは、コスモトロピックイオンといわれる。
少なくとも１種のコスモトロピックアニオンまたはカチオンを含む沈殿剤が好ましい。好ましいアニオンは、シトレート（Ｃ６Ｈ５Ｏ７ ３－）、ホスフェート（ＰＯ４ ３－）、スルフェート（ＳＯ４ ２－）、リン酸水素（ＨＰＯ４ ２－）、リン酸二水素（Ｈ２ＰＯ４ －）、ヨウ素酸（ＩＯ３ －）、ヒドロキシド（ＯＨ－）、フルオリド（Ｆ－）、臭素酸（ＢｒＯ３ －）またはアセテート（ＣＨ３ＣＯＯ－）またはこれらの組み合わせからなる群より選択され、より好ましいアニオンは、シトレート、ホスフェートまたはスルフェートであり、最も好ましいアニオンはスルフェートである。
好ましいカチオンは、アンモニウムまたは四級アンモニウム化合物（ＮＲ４ ＋であってＲは、アルキル基もしくはアリール基であるもの（例えば、テトラメチルアンモニウム（（ＣＨ３）４Ｎ＋）もしくはジメチルアンモニウム（（ＣＨ３）２Ｎ２ ＋））である。さらに好ましいカチオンは、カリウム（Ｋ＋）、セシウム（Ｃｓ＋）、ルビジウム（Ｒｂ＋）もしくはリチウム（Ｌｉ＋）またはこれらの組み合わせを含むリストから選択され、特に好ましいのは、四級アンモニウム化合物またはアンモニウムであり、最も好ましいのはアンモニウムである。
従って、その塩は、好ましくは、シトレート（Ｃ６Ｈ５Ｏ７ ３－）、ホスフェート（ＰＯ４ ３－）、スルフェート（ＳＯ４ ２－）、リン酸水素（ＨＰＯ４ ２－）、リン酸二水素（Ｈ２ＰＯ４ －）、ヨウ素酸（ＩＯ３ －）、ヒドロキシド（ＯＨ－）、フルオリド（Ｆ－）、臭素酸（ＢｒＯ３ －）またはアセテート（ＣＨ３ＣＯＯ－）、四級アンモニウム化合物（ＮＲ４ ＋であって、Ｒはアルキル基もしくはアリール基であるもの）（好ましくはテトラメチルアンモニウム（（ＣＨ３）４Ｎ＋）もしくはジメチルアンモニウム（（ＣＨ３）２Ｎ２ ＋））、アンモニウム（ＮＨ４ ＋）、カリウム（Ｋ＋）、セシウム（Ｃｓ＋）、ルビジウム（Ｒｂ＋）またはリチウム（Ｌｉ＋）からなる、好ましくは、ＳＯ４ ２－および／もしくはＮＨ４ ＋またはこれらの組み合わせを含む群より選択アレルアニオンおよびカチオンを含む。
好ましい実施形態によれば、その塩は、（ＮＨ４）２ＳＯ４、Ｋ２ＳＯ４、Ｎａ２ＳＯ４、（ＮＨ４）２ＨＰＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４およびＮａ２ＨＰＯ４からなる群より選択される。最も好ましい塩は、硫酸アンモニウム（（ＮＨ４）２ＳＯ４）である。
本発明によれば、そのペンタマーの凝集は、そのペンタマーをその沈殿剤と接触した状態にするための任意の手段によって、例えば、その沈殿剤を、そのペンタマーを含む組成物に（または逆もまた同様（すなわち、そのペンタマーを含む組成物を、沈殿剤に））添加することによって、誘導され得る。他の手段（例えば、透析、その結果、その沈殿剤が拡散によってペンタマーに達する）も可能である。
本発明の１つの好ましい実施形態によれば、そのペンタマーの凝集は、その沈殿剤を含む組成物、例えば、硫酸アンモニウムを含む組成物に対する組成物に対する透析によって誘導される。
本発明の特に好ましい実施形態によれば、凝集のためのペンタマーを含む組成物は、０．３～５Ｍの間の、好ましくは４Ｍまでの硫酸アンモニウム濃度を有し、さらにより好ましいのは、１．８～２．２Ｍの間の濃度である。最も好ましいのは、およそ２Ｍである。
そのペンタマーの凝集を誘導する工程は、好ましくは少なくとも１時間、より好ましくは少なくとも５時間、さらにより好ましくは少なくとも１２時間、最もより好ましくは少なくとも１６時間の継続期間を有する。その工程が、２４時間未満の継続時間を有することは好ましい。好ましい実施形態において、この工程の継続時間は、１４～１９時間の間である。最も好ましい実施形態において、この工程の継続時間は、１６～１８時間の間である。この時間の間に、そのペンタマーは、凝集を誘導するための条件に曝され、特にそれらは、硫酸アンモニウムとの接触状態にある。
そのペンタマーの凝集を誘導する工程の後に、そのペンタマーを、その凝集を誘導するために使用された条件から分離する工程を本発明のプロセスに含めることは、有利である。このような工程に適用可能な方法は、特に限定されない；当業者に公知の、そのペンタマーを、凝集を誘導する条件から分離することを可能にする任意の方法が、適用可能である。
本発明の好ましい実施形態において、そのペンタマーは、透析によって、それらの凝集を誘導する条件から分離される。そのペンタマーの凝集が沈殿剤を使用することによって誘導される場合に、透析が使用され得る。透析の原理はまた、都合がよいことには、そのペンタマーを沈殿剤との接触にもたらすために適用される。最も好ましいのは、本発明に従う方法が少なくとも２つの透析工程：工程ｃ）の組成物の、沈殿剤を含む組成物に対する第１の透析、および凝集の誘導後の、その沈殿剤を本質的に含まない組成物に対する第２の透析、を包含する場合である。
そのペンタマーをその沈殿剤から分離するための透析は、好ましくは、生理学的条件に少なくとも類似である組成物に対するものである。このような組成物は、好ましくは塩を含み、６～８．５の、好ましくは６．５～８．５の、より好ましくは７～８の、最も好ましくは７．２～７．５の、特に７．５のｐＨを有する。その組成物の容積モル浸透圧は、好ましくは２８０～３１０ｍｏｓｍｏｌ／ｌの間、最も好ましくは３０８ｍｏｓｍｏｌ／ｌである。その組成物は、例えば、０．８～０．９２％（ｗ／ｖ）の、好ましくは０．９％（ｗ／ｖ）の濃度の生理食塩水（塩化ナトリウム）濃度を有し得る。
そのペンタマーを、その凝集を誘導するために使用された条件から分離する工程は、好ましくは少なくとも１時間にわたって、より好ましくは少なくとも５時間、１２時間にわたって、より好ましくは少なくとも１８時間にわたって、より好ましくは約２４時間もしくはこれより長い間、行われる。より長い期間はまた、特に、凝集するように誘導されたペンタマーの濃度、そのペンタマーを含む組成物、ならびにその沈殿剤の性質および濃度に依存して、可能である。好ましい実施形態において、その凝集したペンタマーを含む組成物は、生理学的条件に類似の組成物に対して、約２４時間にわたって透析される。
その組成物は、好ましくは、緩衝液をさらに含む。適切な緩衝系は、当業者に公知である。本発明の好ましい実施形態において、その組成物は、ＴＲＩＳ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ホスフェート緩衝液または炭酸水素緩衝系を含む。最も好ましいのは、ＴＲＩＳ緩衝液である。
最も好ましい実施形態において、その組成物は、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌおよび１５０ｍＭ ＮａＣｌを含み、ｐＨ７．５を有する。
そのペンタマーをＶＬＰへとアセンブルすることを促進するために、その組成物は、二価イオン（例えば、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｂａ２＋、Ｃｕ２＋、Ｆｅ２＋、Ｚｎ２＋またはこれらの組み合わせ）をさらに含み得る。最も好ましいのは、Ｃａ２＋、例えば、ＣａＣｌ２である。好ましい実施形態において、その組成物は、１～３ｍＭ ＣａＣｌ２、好ましくは２ｍＭ ＣａＣｌ２を含む。
本発明の非常に好ましい実施形態において、生理学的条件に少なくとも類似のその組成物は、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび２ｍＭ ＣａＣｌ２を含み、ｐＨ７．５を有する。
本発明のなお別の局面において、驚くべきことに、ＶＬＰ（ｒＶＬＰ）の貯蔵は、ペンタマーの貯蔵と比較して有利であることが見出された。ペンタマーが貯蔵され、その後、融解および再アセンブルされる場合、主に、「非常に小さい（ｔｉｎｙ）」粒子が凝集物と同様に形成する。これらのＶＬＰが、薬物送達システムの生成に適切ではない。しかし、貯蔵後に解離および再アセンブルしたＶＬＰは、適切なサイズにされた本発明に従うＶＬＰの特に均質の集団を形成する。従って、本発明の一実施形態において、組成物は、２０ｎｍ～７０ｎｍの、好ましくは３０ｎｍ～７０ｎｍの、より好ましくは３５ｎｍ～６５ｎｍの、より好ましくは４０～６０ｎｍの平均直径を有する粒子とともに提供される。均質のサイズ分布は、品質制御要件を満たすために重要である。
好ましい実施形態において、本発明に従う方法は、工程ｄ）の組成物からのＶＬＰを貯蔵する工程を包含する。約－８０℃～約４℃の温度においてそのＶＬＰを貯蔵する工程は、少なくとも１０時間、１５時間、２０時間の貯蔵期間にわたって、好ましくは少なくとも２４時間にわたって可能である。さらに３日間より長い貯蔵は、可能である。
好ましい実施形態において、そのＶＬＰは、０℃未満の温度において貯蔵される（凍結する工程）。凍結する工程は、種々の冷却速度を使用して行われ得る。例えば、「ゆっくりとした（ｓｌｏｗ）」凍結は、約－１℃／分の冷却速度を適用することによって起こり得る一方で、速い凍結は、そのサンプル（すなわち、その組成物を含む容器）と液体窒素とを接触させるか、またはそのサンプルを－８０℃の冷凍庫の中に配置することによって、行われ得る。
好ましい実施形態において、貯蔵する工程は、凍結防止添加剤、好ましくはポリオール、糖、無機塩、有機塩、アミノ酸、ポリマー、エクストリモライトまたはこれらの誘導体もしくは組み合わせからなる群より選択される凍結防止添加剤を含む組成物の中で起こる。
好ましい実施形態において、その無機塩は、スルフェートアニオンを含む。スルフェートアニオンを含む好ましい塩は、硫酸カリウム、硫酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウムおよび硫酸アンモニウムである。好ましくは、その無機塩は硫酸アンモニウムである。
そのアミノ酸は、好ましくはグリシン、グルタミン、プロリンまたはアラニンである。好ましいアミノ酸誘導体は、ベタインである。さらに可能な凍結防止添加剤は、グリセロール、スクロース、ＤＭＳＯ、エクトインまたはヒドロキシエクトインである。
凍結防止添加剤の添加、特に無機塩（例えば、スルフェートアニオンを含む塩、特に硫酸アンモニウム）および／またはアミノ酸誘導体（例えば、ベタイン）の添加は、そのＶＬＰの安定性および機能性または有効性に関して有利であることが見出された。前出で述べたように、増強された安定性および／または機能性もしくは有効性は、ＶＬＰを薬物送達システムとして使用する場合に特に望ましい。凍結防止添加剤を、工程ｄ）の組成物に添加することは、安定性および機能性または有効性に関して、工程ｆ）のパックされたＶＬＰに影響を有することは、驚くべきことであった。
凍結防止添加剤は、生物学的組織を、凍結損傷（すなわち、氷の形成に起因）から保護する目的を果たす。その凍結防止添加剤は通常、細胞における溶質濃度を増大させることによって機能する。しかし、生物学的使用に適切であるために、それらは容易に透過しなければならず、細胞に対して毒性であってはならない。従って、このような添加剤は、そのペンタマーおよび／またはＶＬＰにとってより温和な貯蔵条件を提供するために適している。凍結防止添加剤は、貯蔵のために凍結されるべきペンタマーおよび／またはＶＬＰを含む組成物に補充され得る。
本発明の特に好ましい実施形態によれば、その凍結防止添加剤は、ＶＬＰ、好ましくはｒＶＬＰが２つの透析工程を使用してアセンブリされた（２工程再アセンブル）後のその後の凍結のために、ＶＬＰを含む組成物に添加される。
ポリオールベースの凍結防止添加剤を除く凍結防止添加剤の適切なモル濃度は、０．５Ｍ、０．６Ｍ、０．７Ｍ、０．８Ｍ、０．９Ｍ、１Ｍ、１．１Ｍ、１．２、１．３Ｍ、１．４Ｍ、１．５Ｍ、２Ｍ、３Ｍ、４Ｍ、５Ｍであり得る。優先的には、これらの凍結防止添加剤は、約１Ｍのモル濃度で、好ましくは１Ｍのモル濃度で使用される。
そのポリオールベースの凍結防止添加剤は、少なくとも０．３Ｍ、少なくとも０．４Ｍ、少なくとも０．５Ｍ、少なくとも０．６Ｍ、少なくとも０．７Ｍ、少なくとも０．８Ｍ、少なくとも０．９Ｍ、少なくとも１Ｍ、少なくとも２Ｍまたは少なくとも３Ｍのモル濃度で使用され得る。好ましくは、そのポリオールベースの凍結防止添加剤、好ましくはグリセロール ５％は、約０．６Ｍ～０．７Ｍの濃度で、より好ましくは０．６８Ｍの濃度で使用され得る。
あるいは、そのポリオールベースの凍結防止添加剤は、ペンタマーおよび／またはＶＬＰを含む組成物の容積％に基づいて添加され得る。適切な容積％は、３％（ｖ／ｖ）、４％（ｖ／ｖ）、５％（ｖ／ｖ）、６％（ｖ／ｖ）、７％（ｖ／ｖ）、８％（ｖ／ｖ）、９％（ｖ／ｖ）または１０％（ｖ／ｖ）を含む。優先的には、そのポリオールベースの凍結防止添加剤は、５％（ｖ／ｖ）において添加される。
本発明の好ましい実施形態において、工程ｃ）のペンタマーおよび／または工程ｄ）のＶＬＰは、精製に供される。用語「精製（ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」とは、本発明の状況において、そのＶＰ１、ペンタマーまたはＶＬＰを、複雑な組成物から単離または分離することをいう。考えられる方法は、沈殿、クロスフロー濾過、限外濾過、クロマトグラフィー、例えば、分取クロマトグラフィー、好ましくはサイズ排除クロマトグラフィー、および／または動的光散乱法（ＤＬＳ）を含む。Ｖｉｖａｓｐｉｎ（登録商標）は、使用され得る例示的な限外濾過ユニットである。
用語「クロマトグラフィー（ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）」とは、固定相と移動相との間でその個々の構成要素を分布させることによって、物質の混合物の分離を可能にする方法をいう。特に、クロマトグラフィーとは、その目的の物質を定常相に先ず結合および富化し、その後第２の工程でそれを溶離する（クロマトグラフィーの結合および溶離モード）ことによって、または不純物をその定常相に結合させてその目的の分子の純度をフロースルーの中で増大させる（フロースルーモード）ことによって、物質を精製するための方法をいう。
クロマトグラフィーは、移動相の中に含まれる分析物と固定相との相互作用に基づくことに従ってグループに分けられ得る。本発明に従うクロマトグラフィーの好ましいタイプは、「逆相（ｒｅｖｅｒｓｅｄ ｐｈａｓｅ）」クロマトグラフィー、「イオン交換（ｉｏｎ－ｅｘｃｈａｎｇｅ）」クロマトグラフィー、「アフィニティー（ａｆｆｉｎｉｔｙ）」クロマトグラフィー、またはサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を包含する。イオン交換クロマトグラフィーの中でも、その精製方法は、固定相の中に存在する電荷に基づいて、カチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）（ここでその固定相は負電荷を有し、従って、正に荷電した分子を保持する）、およびアニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）（ここでその固定相は、正電荷を有し、従って、負に荷電した分子を保持する）へとさらに分けられ得る。
特に、クロマトグラフィーは、中間生成物として、本発明に従う方法によって得られるｒＶＬＰを精製するために使用され得る。特にＡＥＸは、ｒＶＬＰを精製するために使用され得る。
ＡＥＸにおいて使用される固定相は、固定相に存在する交換物質によって提供されるイオン性相互作用の強度に基づいて、「強アニオン交換体（ｓｔｒｏｎｇ ａｎｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅｒ）」および「弱アニオン交換体（ｗｅａｋ ａｎｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅｒ）」へとさらに記載され得る。表現「アニオン交換体（ａｎｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅｒ）」または「アニオン交換マトリクス（ａｎｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｍａｔｒｉｘ）」は類義語であり、ともに、アニオンに結合し得、アニオンに対してこれらを周りの媒体から交換し得る天然または人工の物質をいう。アニオン交換体は、陽イオンを有し、負に荷電した対イオンを交換する。
本発明のＶＬＰは、ヌクレアーゼ（例えば、ＤＮＡｓｅまたはＲＮＡｓｅ）でさらに処理され得、そして／または滅菌濾過に供され得る。ヌクレアーゼ処理は、好ましくは、核酸（例えば、発現ベクターまたはｍＲＮＡまたはこれらの組み合わせ）がカーゴとして使用される場合に行われる。種々のヌクレアーゼが当業者に公知であり、例えば、ベンゾナーゼを含む。ヌクレアーゼは、上記ＶＬＰと会合されていない残留ＤＮＡまたはｍＲＮＡを加水分解するために使用される。滅菌濾過の方法としては、特に、不純物の除去のために適したフィルタを使用するダイアフィルトレーションまたは超遠心分離が挙げられる。これらの処理は、本発明のＶＬＰの臨床的適用のために特に有利である。
本発明に従うＶＬＰを含む組成物の粒度分布は、「多分散指数（Ｐｏｌｙ Ｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙ Ｉｎｄｅｘ）」（ＰＤＩ）として評価され得る。そのＰＤＩは、組成物中の粒度分布を示し、従って、粒子の均質性を記載する。ＰＤＩ値は、種々の方法（ゲル浸透クロマトグラフィー／サイズ排除クロマトグラフィー、レオロジー、溶液粘性、膜透過または光散乱法が挙げられる）を使用して得られ得る。
そのＰＤＩは、好ましくは動的光散乱法（ＤＬＳ）によって決定される。ＤＬＳでは、本来の分布は、どの程度の光を種々の「スライス（ｓｌｉｃｅ）」から散乱するかを示す強度分布である。ＤＬＳは、分布の統計から、平均サイズおよびこの平均サイズからの標準偏差の決定を可能にする。相対的多分散性は、その標準偏差を平均で除算することによって決定される。分布の相対的多分散性から、多分散指数（ＰＤＩ）は、その平方として導出され得る。ＤＬＳによって得られるＰＤＩ値は、単分散性の（ＰＤＩ＜０．１）組成物および多分散性の（ＰＤＩ＞０．１）組成物へとグループに分けられ得、それによって、その多分散性の群内ではまた、より小さな値は、その組成物内でのより均質な分布を示す。
本発明によれば、０．１～０．４のＰＤＩ値は好ましい。より好ましくは、そのＰＤＩ値は、０．１～０．３であり、さらにより好ましくは０．１～０．２である。
ＶＬＰを含む組成物の平均直径は、視覚的方法（例えば、顕微鏡法（好ましくは平均直径を決定するためにソフトウェアが装備される））によって測定され得るが、分析的光散乱法（例えば、ＤＬＳ）またはナノトラッキング法（例えば、ＮＴＡ）によっても測定され得る。
その組成物内のＶＬＰ含有量は、例えば、ＦＦＦ－ＭＡＬＳおよび／またはＤＬＳによって測定され得る。両方の方法は、適切なサイズにされたＶＬＰおよび凝集物、「非常に小さいもの」（小粒子）と他の不純物（例えば、塩、デブリまたはペンタマー）との間を区別し得る。
このような本発明に従うＶＬＰを含む組成物は、特に、薬物送達システムに通常課される要件を満たす。明らかに、このような組成物は、均質でありかつ高純度を有する。
別の局面において、本発明は、本発明に従う方法によって得られ得る薬物送達システムに関する。このような薬物送達システムは、前出で述べられたとおりの利点を有する。特に、このような薬物送達システムは、治療および／または診断の方法において、好ましくは神経学的障害、すなわち、ＣＮＳ疾患、すなわち、白質ジストロフィー、特に、カナバン病またはクラッベ病の処置のために使用され得る。
よって、本発明はまた、障害、すなわち、ＣＮＳ疾患、すなわち、白質ジストロフィー、特に、カナバン病またはクラッベ病を、本発明に従う薬物送達システムで処置する方法に関する。上記処置方法は、好ましくは、薬物送達システムを、その必要性のある被験体に投与する工程を包含する。
本発明はまた、神経学的障害、すなわち、ＣＮＳ疾患、すなわち、白質ジストロフィー、特に、カナバン病またはクラッベ病の処置のための医薬の製造のための薬物送達システムの使用に関する。上記処置方法は、好ましくは、処置されるべき被験体のＢＢＢの透過性を増大させる工程を包含しない。本発明の薬物送達システムは、好ましくは、ＢＢＢを損なうかまたは混乱させるためのいかなる化学的または物理的処置をも受けたことのない患者に投与される。
１つの実施形態において。本発明に従うＶＬＰは、血液脳関門（ＢＢＢ）を横断する。従って、本発明の１つの実施形態において、上記薬物送達システムは、アスパルトアシラーゼもしくはガラクトセレブロシダーゼそれぞれ、または上記それぞれの酵素をコードする発現ベクターまたは上記それぞれの酵素をコードするｍＲＮＡあるいはこれらの組み合わせを、ＢＢＢを横断して送達するために使用され得る。本発明によれば、薬物送達システムおよび／またはＶＬＰおよび／またはアスパルトアシラーゼもしくはガラクトセレブロシダーゼそれぞれおよび／または上記それぞれの酵素をコードする発現ベクターおよび／または上記それぞれの酵素をコードするｍＲＮＡおよび／またはこれらの組み合わせが、ＢＢＢを横断し得る。
重要なことには、その薬物送達システムによるＢＢＢの横断は、その薬物送達システムが、脳内の特定の細胞集団を標的化するという機能を示すことを、すなわち、カーゴを標的化された細胞に送達することを可能にする。本発明の状況において、上記薬物送達システムは、標的化された細胞へのおよび／またはその中への送達を含む。
好ましい実施形態において、本発明のＶＬＰおよび／またはそのカーゴは、処置されるべき被験体、特にヒトへの投与後に、投与後に１０日間未満で、好ましくは５日間未満で、より好ましくは３日間未満で、ＣＮＳにおいて検出され得る。その薬物送達システムは、好ましくは、被験体に静脈内投与される。これは、そのＶＬＰを信頼性の高い薬物送達システムとして使用する場合に特に有利である。
好ましくは、その方法は、ＢＢＢの完全性の喪失または増大した透過性を要しない。
本発明によれば、その薬物送達システムを投与する前またはその間に、ＢＢＢの透過性を損なうことは必要とされない。従って、ＢＢＢは、好ましくは生理学的に無傷であり、これは、その完全性が低下されないおよび／またはその透過性が健康的な天然の状態と比較して増大されないことを意味する。本発明のＶＬＰは、好ましくは生理学的に無傷のＢＢＢを横断する。
その薬物送達システムを含む組成物は、好ましくは、ＢＢＢの完全性を混乱させ得る添加剤を要しない。よって、本発明の最も好ましい実施形態において、その薬物送達システムは、ＢＢＢの透過性に影響を及ぼし得るいかなる添加剤をも含まない。
材料および方法
ＶＬＰ製造
ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を、ヨトウムシ（ｆａｌｌ ａｒｍｙｗｏｒｍ）（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）に由来するＳｆ９昆虫細胞株（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用するタンパク質発現によって製造した。ＶＬＰを、その細胞にＪｏｈｎ Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍウイルス ＶＰ１タンパク質発現カセットを含む組換えバキュロウイルスを感染させることによって生成した。その組換えバキュロウイルスを、Ｂａｃ－ｔｏ－Ｂａｃ（登録商標） Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ発現系（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用することによって調製した。ＶＬＰを、３．４ｌ バイオリアクター（ＩＮＦＯＲＳ ＨＴ Ｍｉｎｉｆｏｒｓ）中での７～１０日後に、ｐＨ６．３において生成した。空気流および温度（２６℃）をその時間にわたって制御した。細胞および細胞デブリを除去するために、懸濁物を、４℃、５．０００ｇで遠心分離し、そのＶＬＰを含む上清を採取した。
その後、ＶＬＰを、２つの異なる濃縮法：７．５％ ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）での沈殿またはＡＫＴＡｃｒｏｓｓ ｆｌｏｗＴＭシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でのクロスフロー、を使用して濃縮した。ＰＥＧ沈殿に関して、その清澄にされた上清を、ＰＥＧと混合して７．５％（ｖ／ｖ）を達成し、４℃において２時間にわたってインキュベートし、その後、その沈殿物を、４℃、１０．０００ｇでの遠心分離によって分離し、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５中で懸濁した。クロスフローを、３００ｋＤａカットオフ膜（Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ（登録商標） ３００ｋＤａ ＥＣＯ， Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を備えたＡＫＴＡｃｒｏｓｓ ｆｌｏｗＴＭシステムで行った。そのフロー限外濾過を１．５バールの一定圧および８倍（８ｌの緩衝液に対して１ｌの上清）で行った。
ＶＬＰを、室温において７０分間、５ｍＭ ＤＴＴおよび１０ｍＭ ＥＤＴＡを使用することによってペンタマーへとさらに解離し、そのペンタマーを、１５０ｍＭから１Ｍ ＮａＣｌへのＮａＣｌ段階的勾配でＨｉＳｃａｌｅ ＣａｐｔｏＱカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、アニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）によって精製した。ペンタマーを、２５０ｍＭ ＮａＣｌ工程で溶離した。溶離後、そのペンタマーを以下のとおり処理した：
２０ｋＤａカットオフを有する透析カセット（Ｓｌｉｄｅ－Ａ－ＬｙｚｅｒＴＭ Ｇ２ Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｄｅｖｉｃｅ， Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）へと直ぐに配置し、透析（２工程透析）による２工程再アセンブルによって再アセンブルした。第１に、ペンタマーを、２Ｍ 硫酸アンモニウム緩衝液（「ＡＳ」、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２Ｍ （ＮＨ４）２ＳＯ４、ｐＨ７．５）に対して２４時間にわたって透析し、次いで、次の２４時間にわたって１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２、ｐＨ７．５（標準的再会合緩衝液、「ＳＴ」）に移した。アセンブリされていない物質および凝集物をそのＶＬＰから分離するために、そのＶＬＰを含む組成物を、ＨｉＰｒｅｐＴＭ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ（登録商標）Ｓ－５００ ＨＲカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ＺＳ Ｎａｎｏ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｃ．）を使用する動的光散乱法（ＤＬＳ）において画分の多分散指数（ＰＤＩ）の制御下で、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって精製した。標的化したサイズを有するＶＬＰ画分を選択およびプールし、次いで、適用可能である場合に５ｋＤａ カットオフ膜を有するＶｉｖａｓｐｉｎ（登録商標）濃縮器（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）中で濃縮し、続いて、－８０℃で貯蔵した。
ＢＢＢ透過を検証するための人工血液脳関門（ＢＢＢ）モデル
ＶＬＰのＢＢＢ透過を、標的細胞において発現されたｈＡＳＰＡもしくはｈＧＡＬＣ ｍＲＮＡまたは透過した物質（ＶＬＰへとパッケージングされたｐＮＬ－ＢＢ－ｈＡＳＰＡもしくはｐＮＬ－ＢＢ－ｈＧＡＬＣ）のタンパク質の直接定量によって、２区画人工ＢＢＢモデルにおいて共培養物を使用することによって評価した。
その目的のために、３×１０４のヒト星細胞腫細胞を、９００μｌ 培地（ＤＭＥＭ＋１０％ ＦＣＳ＋１％ Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を満たした２４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ）に播種した。７．５×１０４ ＢＢＢ細胞（ＨＢＥＣ－５ｉ、脳毛細血管内皮細胞）を、２４ウェル透過性支持体（挿入物、１μｍ、 ＴｈｉｎＣｅｒｔ， Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ）へと２００μｌ 培地（（ＤＭＥＭ／Ｆ－１２、ＨＥＰＥＳ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とともに播種した。その後、挿入物を、２４ウェルプレートへと移し、その中にヒト星細胞腫細胞を播種した。播種したＢＢＢ細胞なしの挿入物を、コントロールとして含めた。細胞を、９６時間～１２０時間にわたって、そのウェル中の培地を２日ごとに交換しながらインキュベートした。
ＢＢＢ透過アッセイに関しては、２５μｇの、ｈＡＳＰＡもしくはｈＧＡＬＣプラスミドまたはｈＡＳＰＡもしくはｈＧＡＬＣプラスミド単独を装填したＶＬＰを、上記挿入物に添加した。サンプルをまた、コントロールとしてＢＢＢ細胞を播種していない挿入物に添加した。２４時間後または４８時間後のいずれかに、調製した挿入物を、１ウェルあたり９００μｌの培地（ＤＭＥＭ／Ｆ－１２、ＨＥＰＥＳ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を満たした新たな２４ウェルプレートに注意深く移し、さらに２４時間または４８時間にわたってインキュベートした。合計７２時間後に、細胞ペレットを採取した。挿入膜をＰＢＳで洗浄した後に切断し、１．５ｍｌ チューブに移した。細胞をＴｒｙｐＬＥで剥離した後、その膜を除去し、細胞をペレット化した。その細胞ペレットを、－８０℃において、ＲＮＡ単離、ｃＤＮＡ合成およびｑＰＣＲ分析のためにさらに使用するまで凍結した。
ｈＡＳＰＡまたはｈＧＡＬＣをコードする発現ベクターのクローニング
構築物ｐＮＬ－ＢＢ－ｈＡＳＰＡを生成するために、ｈＡＳＰＡ遺伝子を、ＥＰ２８６２８６０ Ａ１の配列番号１４に記載されるように、両末端にさらに制限部位を付着させて、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ＧｅｎｅＡｒｔ ｇｅｎｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）において合成した。上記遺伝子を、制限酵素ベースのクローニングでｐＮＬ１．１プラスミド骨格（Ｐｒｏｍｅｇａ）へと挿入した。その構築物は、ＣＭＶプロモーターを含む。
構築物ｐＮＬ－ＢＢ－ｈＧＡＬＣを生成するために、ｈＧＡＬＣ遺伝子を、ＥＰ２８８２２８４ Ａ１の配列番号１に開示されるように、６６ヌクレオチドを含むシグナル配列を付加して（本出願の配列番号４およびＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＮＭ＿０００１５３．４（ヌクレオチド１～２１００）を参照のこと）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ＧｅｎｅＡｒｔ ｇｅｎｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）において合成したところ、ＥＰ２８８２２８４ Ａ１の配列番号２および本出願の配列番号３に開示されるとおりのタンパク質配列を生じた。制限部位を両末端に結合させた。遺伝子を、制限酵素ベースのクローニングでｐＮＬ１．１．プラスミド骨格（Ｐｒｏｍｅｇａ）へと挿入した。その構築物は、ＣＭＶプロモーターを含む。
ｈＡＳＰＡもしくはｈＧＡＬＣをコードする発現ベクターまたはｈＡＳＰＡもしくはｈＧＡＬＣをコードするｍＲＮＡでのＶＬＰのパッケージング
ｈＡＳＰＡもしくはｈＧＡＬＣ発現ベクターまたはｈＡＳＰＡもしくはｈＧＡＬＣ ｍＲＮＡをＶＬＰへとパッケージングするために、事前に再アセンブルしたＶＬＰを、－８０℃から取り出して、サーマルシェイカー（２３℃、３５０ｒｐｍ）を使用して融解した。その後、ＶＬＰを、上記サンプルを１５分間、２３℃および４５０ｒｐｍにおいて解離緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＤＴＴ、および１０ｍＭ ＥＤＴＡ）の存在下でインキュベートすることよって解離した。解離したＶＬＰを、ｈＡＳＰＡもしくはｈＧＡＬＣ発現ベクターまたはｈＡＳＰＡもしくはｈＧＡＬＣ ｍＲＮＡの存在下で再アセンブルした。端的には、解離したＶＬＰを、ｈＡＳＰＡもしくはｈＧＡＬＣ発現ベクターまたはｈＡＳＰＡもしくはｈＧＡＬＣ ｍＲＮＡと、適切な濃度において（ＶＬＰ 対 発現構築物のパッケージング比 １：０．２または１：０．５； ＶＬＰ 対 ｍＲＮＡのパッケージング比 １：０．２）激しく混合し、続いて、その混合物を、２０ｋＤａ ＭＷＣＯ透析チャンバ（Ｓｌｉｄｅ－Ａ－ＬｙｚｅｒＴＭ ＭＩＮＩ Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｄｅｖｉｃｅ， Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して標準的解離緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ， １５０ｍＭ ＮａＣｌ， ２ｍＭ ＣａＣｌ２， ｐＨ７．５）に対して透析した。サンプルを、１６～１８時間にわたってインキュベートした。サンプルを、透析チャンバから新しい反応カップへと移し、パッキングされていない核酸、すなわち、発現ベクターまたはｍＲＮＡを、２５μｇ ＶＬＰおよび２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２あたり３７℃で１時間にわたって、４０ ｕ Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標） Ｎｕｃｌｅａｓｅ（Ｍｅｒｃｋ）とともにインキュベートすることによって消化した。サンプルを濾過し（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標） Ｃｏｓｔａｒ（登録商標） Ｓｐｉｎ－Ｘ（登録商標） 遠心分離チューブフィルター；孔サイズ０．２２μｍ）、液体窒素中で凍結した。その後、ＶＬＰを分析および／またはー８０℃で貯蔵した。
ＶＬＰ特徴付け
サンプル安定性を検証するために、各サンプルの屈折温度を、Ｔｙｃｈｏ ＮＴ．６（Ｎａｎｏｔｅｍｐｅｒ）を使用して製造業者の説明書に従ってｎＤＳＦによって評価した。
サンプル組成を分析するために、非対称フローフィールドフローフラクショネーション（ＡＦ４， Ｗｙａｔｔ Ｉｎｃ．）を行った。サンプルを、多角度光散乱法（ＭＡＬＳ）、動的光散乱法（ＤＬＳ）およびＵＶ検出器を使用することによって分析した。
透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）分析を、８０ｋＶの電圧で作動するＺｅｉｓｓ ＥＭ９００電子顕微鏡の助けを借りて、種々の実験工程においてそのサンプルを直接可視化するために行った。このアプローチのために、サンプルを、予め２％ 酢酸ウラニル（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して、炭素被覆銅グリッド（Ｐｌａｎｏ ＧｍｂＨ）の上で染色した。
被包されたカーゴ量を定量するために、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎＴＭ Ａｓｓａｙを、製造業者の説明書（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に従って９６ウェルプレートにおいて行った。蛍光を、４８０／５２０ｎｍで測定した。被包された量を、カーゴ単独の較正曲線を使用して計算した。
ＶＬＰの存在を検証するために、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を、Ｈｉｔａｃｈｉ Ｃｈｒｏｍａｓｔｅｒおよびプレカラムに接続されたＳｅｐａｘ ２０００カラムの助けを借りて行った。泳動緩衝液として、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ／１５０ｍＭ ＮａＣｌを使用した。２２０ｎｍ、２６０ｎｍ、および２８０ｎｍに設定したダイオードアレイ検出器を、サンプル分析のために使用した。
ＶＬＰの存在を分析し、タンパク質および被包されたカーゴの共局在を検証するために、アガロースゲル電気泳動（ＡＧＥ）を、１％ アガロースゲルおよびＴｒｉｓ－酢酸緩衝液を使用して行った。装填緩衝液を、グリセロールおよびブロモフェノールブルーを使用して調製した。被包されたカーゴを、上記ゲルをＧｅｌＲｅｄＴＭとともにインキュベートした後に可視化した。ＶＬＰを可視化するために、ゲルを、Ｉｎｓｔａｎｔ Ｂｌｕｅとともにインキュベートした。Ｂｉｏｒａｄ Ｇｅｌ ＤｏｃＴＭ ＸＲ＋ Ｇｅｌ Ｄｏｃｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを使用して画像を撮った。
細胞におけるｈＡＳＰＡまたはｈＧＡＬＣ発現： ＲＮＡ単離、ｃＤＮＡ合成およびｑＰＣＲ
ｈＡＳＰＡまたはｈＧＡＬＣ発現ベクターでの細胞処理
種々の細胞株を、４８または７２時間にわたって、ｈＡＳＰＡコードプラスミドもしくはｈＧＡＬＣコードプラスミドまたはｈＡＳＰＡコードプラスミドもしくはｈＧＡＬＣコードプラスミド単独でパックされたＶＬＰとともにインキュベートした後、ヒト星細胞腫またはマウス線維芽細胞を、トリプシンを使用して採取し、ペレット化し、ＰＢＳを使用して洗浄した。ｈＡＳＰＡコードプラスミドもしくはｈＧＡＬＣコードプラスミドでトランスフェクトした細胞をまた採取し、その後のＲＮＡ単離、ｃＤＮＡ合成およびｑＰＣＲのためにペレット化した。このために、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ ３０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とともにインキュベートし、１μｇのプラスミドＤＮＡをＰ３０００試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とともにインキュベートし、混合し、１５分間室温でインキュベートし、細胞に添加した。細胞を、４８時間、３７℃でインキュベートした。
ｈＡＳＰＡまたはｈＧＡＬＣ ｍＲＮＡでの細胞処理
３０．０００細胞を２４時間にわたって、ｈＡＳＰＡもしくはｈＧＡＬＣコードｍＲＮＡまたはｈＡＳＰＡ／ｈＧＡＬＣコードｍＲＮＡ単独でパックされたＶＬＰとともにインキュベートした後、ヒト星細胞腫細胞を、トリプシンを使用して採取し、ペレット化し、ＰＢＳを使用して洗浄した。ｈＡＳＰＡ／ｈＧＡＬＣコードｍＲＮＡでトランスフェクトした細胞をまた採取し、その後のＲＮＡ単離、ｃＤＮＡ合成およびｑＰＣＲのためにペレット化した。トランスフェクションのために、希釈したトランスフェクション試薬溶液（ＳｔｅｍｆｅｃｔＴＭ トランスフェクションキット）および希釈したｍＲＮＡ溶液を混合し、１５分間、室温でインキュベートし、細胞に添加した。それぞれ、６．２５μｇ ＶＬＰ、１０ｎｇ ｍＲＮＡとインキュベーションするか、または１０ｎｇ ｍＲＮＡとトランスフェクトとする。細胞を、２４時間、３７℃でインキュベートした。２つのウェルを、ＲＮＡ単離／ｃＤＮＡ合成のためにプールした。
ＲＮＡ単離
ＲＮＡを、ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）を使用して細胞ペレットから単離した。単離後に、ＲＮＡ濃度を、ＮａｎｏＤｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して決定した。
ｃＤＮＡ合成
ｃＤＮＡ合成のために、２５０ｎｇ～５００ｎｇの間（発現ベクター）または４００ｎｇ（ｍＲＮＡ） ＲＮＡを使用した。ｃＤＮＡを、１：２の比においてＯｌｉｇｏ－ＤＴプライマーおよびランダムプライマーから構成されるプライマーミックを使用して、ＲｅｖｅｒｔＡｉｄ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ合成キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で合成した。プライマーミックス、ｄＮＴＰｓ、反応緩衝液、ＲｉｂｏＬｏｃｋおよびＲｅｖｅｒｔＡｉｄのマスターミックスを、ｍＲＮＡ／水混合物に添加し、合成をサーモサイクラーの中で１工程において行った。その後、ｃＤＮＡサンプルを、ｄｄＨ２Ｏ中で１：５希釈し、サンプルを、使用するまで－２０℃で貯蔵した。
ｑＰＣＲ
ｑＰＣＲを、Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（ＣＦＸ９６ Ｔｏｕｃｈ， ＢｉｏＲａｄ）において、ＥｖａＧｒｅｅｎ Ｄｙｅおよび１：２０希釈でｈＡＳＰＡまたはｈＧＡＬＣに関する別個のプライマーを使用して行った。
免疫細胞化学
３０．０００細胞をカバースリップ上で４８時間、ｈＡＳＰＡコードｍＲＮＡもしくはｈＧＡＬＣコードｍＲＮＡでパックされた６．２５μｇ ＶＬＰと、または１０ｎｇのｈＡＳＰＡ／ｈＧＡＬＣコードｍＲＮＡ単独とともにインキュベートした後、ヒト星細胞腫細胞をＰＢＳで洗浄し、４％ ＰＦＡで固定した。１０ｎｇのｈＡＳＰＡ／ｈＧＡＬＣコードｍＲＮＡでトランスフェクトした細胞をまた、ＰＢＳで洗浄し、４％ ＰＦＡで固定した。細胞を、前出で記載されたとおりリポフェクションとともに４８時間、３７℃でインキュベートした。
固定した細胞をＰＢＳで洗浄し、０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）－Ｘ－１００で透過化し、再び洗浄し、１％ ＢＳＡで３０分間、室温でブロックした。細胞を、一次抗体（ＧＡＬＣ： Ｐｏｔｅｉｎｔｅｃｈ； ＡＳＰＡ： Ａｂｃａｍ）とともに一晩４℃でインキュベートした。
細胞を、１％ ＢＳＡ中で希釈した二次抗体（ヤギ抗ウサギＩｇＧ Ｃｙ５標識， Ａｂｃａｍ）とともに２時間、室温でインキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、顕微鏡スライドの上をＲｏｔｉＭｏｕｎｔで（ＤＡＰＩ（Ｒｏｔｈ）で）覆った。乾燥させたサンプルを、共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ ＳＰ８）で分析した。
マウス脳におけるｈＡＳＰＡおよびｈＧＡＬＣ発現
Ｂａｌｂ／Ｃマウス（４匹／群／構築物／時点）の尾静脈に、ｈＡＳＰＡもしくはｈＧＡＬＣ ｍＲＮＡと会合されたＶＬＰを注射したか、またはｍＲＮＡ単独を注射し、注射の６時間後２４時間後に終了した。マウスにＰＢＳを灌流させ、脳を取り出し、急速凍結した。
１つの融解したマウス脳半球／動物（ｎ＝４／群）を、ＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳＴＭ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して溶解し、ＲＮＡ単離を、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標） ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）の説明書に従って行った。
ｃＤＮＡ合成を、ＲｅｖｅｒｔＡｉｄＴＭ Ｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ合成キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して製造業者の説明書に従って行った。
ｑＰＣＲを、前出（細胞におけるｈＡＳＰＡまたはｈＧＡＬＣ発現）で記載されたとおりに行った。脳サンプルでのｑＰＣＲに関しては、Ｂｉｏｒａｄ Ｏｐｕｓ ３８４ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒを使用し、緩衝液コントロールとの比較における倍率変化を計算した。
１．マウス器官におけるＡＳＰＡ発現の検出
後に続く実験におけるヒトＡＳＰＡ発現の適切なかつ顕著に特異的な検出を確実にするために、マウスＡＳＰＡの内因性発現を、種特異的プライマーを使用して種々のマウス器官で評価した。その結果を図１に示す。マウス特異的プライマーを使用する場合、ＡＳＰＡ発現は、全ての器官において検出され、最高レベル（最低値に相当する）は腎臓および肺であることが認められ得る。対照的に、ヒトＡＳＰＡに特異的なプライマーを用いると、ＡＳＰＡ発現はマウス器官では検出されず、従って、ヒトＡＳＰＡ（ｈＡＳＰＡ）の発現を特異的に検出するために上記プライマーが適切であることを示す。
２．ｈＡＳＰＡ発現およびｈＡＳＰＡをコードする発現ベクターでのＶＬＰのパッケージング
ＶＬＰを、１：０．２および１：０．５のＶＬＰ 対 発現構築物のパッケージング比においてｈＡＳＰＡコードプラスミドと混合した。そのようにしてパッケージングされたＶＬＰを、材料および方法において前出で記載されるように特徴付けした。ヒト星細胞腫細胞およびマウス線維芽細胞を、そのパッケージングされたＶＬＰとともにインキュベートし、ｈＡＳＰＡ発現を決定した。ｈＡＳＰＡコードプラスミドでトランスフェクトした細胞およびパッケージングされていないプラスミドとともにインキュベートした細胞を、コントロールとして供した。その結果を表４にまとめ、図２に示す。
Figure 2023526528000013
３． ｈＡＳＰＡプラスミドと会合されたＶＬＰは、インビトロＢＢＢモデルで星細胞腫においてｈＡＳＰＡ発現をもたらす
ＶＬＰのＢＢＢ透過を、材料および方法において前出で記載されるように評価した。その結果を、図３に示す。ｈＡＳＰＡは、ＢＢＢ細胞（ＨＢＥＣ－５ｉ内皮細胞）とともに共培養された星細胞腫細胞において顕著に発現される。これは、ｈＡＳＰＡと会合されたＶＬＰが人工ＢＢＢを横断することを示す。より長期間共培養すると、ＢＢＢ細胞と共培養された星細胞腫細胞においてより高い発現がもたらされ、これは、人工ＢＢＢを通過するｈＡＳＰＡと会合されたＶＬＰの透過が、時間とともに増大し、時間とともに、星細胞腫細胞におけるｈＡＳＰＡの発現が増加し、内皮細胞において減少することを示す。
４．マウス器官におけるＧＡＬＣ発現の検出
後に続く実験におけるヒトＧＡＬＣ発現の適切なかつ顕著に特異的な検出を確実にするために、マウスＧＡＬＣの内因性発現を、種特異的プライマーを使用して種々のマウス器官で評価した。その結果を図４に示す。マウス特異的プライマーを使用する場合、ＧＡＬＣ発現は、全ての器官において検出され、最高レベル（最低値に相当する）は腎臓および肺であることが認められ得る。対照的に、ヒトＧＡＬＣに特異的なプライマーを用いると、ＧＡＬＣ発現はマウス器官では検出されず、従って、ヒトＧＡＬＣ（ｈＧＡＬＣ）の発現を特異的に検出するために上記プライマーが適切であることを示す。
５．ｈＧＡＬＣ発現およびｈＧＡＬＣをコードする発現ベクターでのＶＬＰのパッケージング
ＶＬＰを、１：０．２のＶＬＰ 対 発現構築物のパッケージング比においてｈＧＡＬＣコードプラスミドと混合した。そのようにしてパッケージングされたＶＬＰを、材料および方法において前出で記載されるように特徴付けした。ヒト星細胞腫細胞およびマウス線維芽細胞を、そのパッケージングされたＶＬＰとともにインキュベートし、ｈＧＡＬＣ発現を決定した。その結果を表５にまとめ、図５に示す。
Figure 2023526528000014
６．ｈＧＡＬＣプラスミドと会合されたＶＬＰは、インビトロＢＢＢモデルで星細胞腫においてｈＧＡＬＣ発現をもたらす
ＶＬＰのＢＢＢ透過を、材料および方法において前出で記載されるように評価した。その結果を、図６に示す。ｈＧＡＬＣは、ＢＢＢ細胞（ＨＢＥＣ－５ｉ内皮細胞）とともに共培養された星細胞腫細胞において顕著に発現される。これは、ｈＧＡＬＣと会合されたＶＬＰが人工ＢＢＢを横断することを示す。より長期間共培養すると、ＢＢＢ細胞と共培養された星細胞腫細胞においてより高い発現がもたらされ、これは、人工ＢＢＢを通過するｈＧＡＬＣと会合されたＶＬＰの透過が、時間とともに増大し、時間とともに、星細胞腫細胞におけるｈＧＡＬＣの発現が増加し、内皮細胞においてｈＧＡＬＣが減少することを示す。
７．ｈＡＳＰＡおよびｈＧＡＬＣ ｍＲＮＡでのＶＬＰのパッケージング
酵素ｈＡＳＰＡおよびｈＧＡＬＣをコードするｍＲＮＡでのＶＬＰのパッケージングを、前出で記載されるように行った。概要を表６に示す：
Figure 2023526528000015
表６から理解され得るように、ｈＡＳＰＡまたはｈＧＡＬＣ ｍＲＮＡでパックされたＶＬＰは、安定であり、ｍＲＮＡでパックされ得る。パッケージング後のサンプル中の均一なサイズのＶＬＰが、種々の方法で検出され得る。ｍＲＮＡと会合されたＶＬＰバンドがまた見える（アガロースゲル電気泳動）、よって、両方のＲＮＡでのパッケージングが、効果的であった。
両方のＶＬＰ（それぞれ、ｈＡＳＰＡまたはｈＧＡＬＣ ｍＲＮＡと会合）は、均一なサイズ分布、すなわち、ＤＬＳ分析においてただ１つのピークを示す（図７）。
８．細胞におけるｈＡＳＰＡおよびｈＧＡＬＣ発現（カーゴとしてのｍＲＮＡ）／ｑＰＣＲ
ＶＬＰのカーゴとしてｍＲＮＡを使用した後のヒト星細胞腫細胞におけるｈＡＳＰＡおよびｈＧＡＬＣ ｍＲＮＡの発現を評価するために、ｑＰＣＲ分析を前出で記載されるように行った。ｍＲＮＡと会合されたＶＬＰとのインキュベーション後に、多量の両方のｍＲＮＡが、両方のコントロールと比較して検出された（図８）。従って、ｈＡＳＰＡおよびｈＧＡＬＣ ｍＲＮＡと会合されたＶＬＰは、細胞トランスフェクションのために効果的に使用され得ることが示された。
９．細胞におけるｈＡＳＰＡおよびｈＧＡＬＣ発現（カーゴとしてのｍＲＮＡ） ／ 免疫細胞化学
ヒト星細胞腫細胞におけるｈＡＳＰＡおよびｈＧＡＬＣ発現を、免疫細胞化学によって確認した（図９）。ｈＡＳＰＡおよびｈＧＡＬＣ両方のタンパク質発現を、細胞をｍＲＮＡと会合されたＶＬＰとともにインキュベートした後にサンプル中で検出した。コントロールサンプル中では、発現がほとんどまたは全く見えない。
１０．マウス脳におけるｈＡＳＰＡおよびｈＧＡＬＣ発現
溶解したマウス脳でのインビボ実験から、ｍＲＮＡと会合されたＶＬＰの脳への注射後にｈＡＳＰＡおよびｈＧＡＬＣ発現（ｍＲＮＡ）が確認された（図１０）。コントロールは、遙かに低い発現を示す。発現は、経時的なｍＲＮＡ使用および枯渇におそらく起因して、２４時間と比較して６時間後により高い。
実施形態
実施形態１。 被験体における白質ジストロフィーの処置のための方法における使用のための酵素または前記酵素をコードする発現ベクターと会合されたＶＬＰであって、ここで前記酵素は、アスパルトアシラーゼまたはガラクトセレブロシダーゼである、ＶＬＰ。
実施形態２。 （ｉ）前記酵素は、アスパルトアシラーゼであり、前記白質ジストロフィーは、カナバン病である；または
（ｉｉ）前記酵素は、ガラクトセレブロシダーゼであり、前記白質ジストロフィーは、クラッベ病である、
実施形態１に記載の使用のためのＶＬＰ。
実施形態３。 前記ＶＬＰは、ウイルス遺伝物質を含まず、前記発現ベクターは、ウイルスタンパク質をコードしない、実施形態１または２に記載の使用のためのＶＬＰ。
実施形態４。 前記被験体は、動物またはヒトであり、好ましくはヒトである、前述の実施形態のいずれかに記載の使用のためのＶＬＰ。
実施形態５。 前記酵素は、配列番号１に従うアミノ酸配列とその全長にわたって少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％同一であり、より好ましくは、配列番号１のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含むか；または前記酵素は、配列番号３に従うアミノ酸配列とその全長にわたって少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％同一であり、より好ましくは配列番号３のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む、前述の実施形態のいずれかに記載の使用のためのＶＬＰ。
実施形態６。 前記発現ベクターは、７ｋｂ未満、好ましくは６ｋｂ未満、より好ましくは５ｋｂ未満、最も好ましくは４ｋｂ未満のサイズを有する、前述の実施形態のいずれかに記載の使用のためのＶＬＰ。
実施形態７。 前記発現ベクターは、ＣＭＶおよびＣＡＧからなる群より選択されるプロモーターを有する、前述の実施形態のいずれかに記載の使用のためのＶＬＰ。
実施形態８。 前記酵素は、配列番号２のヌクレオチド配列とその全長にわたって少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％同一であり、最も好ましくは配列番号２のヌクレオチド配列であるヌクレオチド配列によってコードされるか；または前記酵素は、配列番号４のヌクレオチド配列とその全長にわたって少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％同一であり、最も好ましくは、配列番号４のヌクレオチド配列であるヌクレオチド配列によってコードされる、前述の実施形態のいずれかに記載の使用のためのＶＬＰ。
実施形態９。 前記ＶＬＰは、ヒトポリオーマウイルス、好ましくはＪＣＶに由来する、前述の実施形態のいずれかに記載の使用のためのＶＬＰ。
実施形態１０。 前記ＶＬＰは、血液脳関門を、好ましくは生理学的に無傷の血液脳関門を横断して、前記酵素もしくは前記発現ベクターと一緒にＣＮＳに入る、前述の実施形態のいずれかに記載の使用のためのＶＬＰ。
実施形態１１。 前記酵素もしくは前記発現ベクターは、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、ミクログリアまたはニューロン、好ましくはオリゴデンドロサイトに入る、実施形態１０に記載のＶＬＰ。
実施形態１２。 前記ＶＬＰは、経口的にまたは非経口的に、好ましくは静脈内に投与される、前述の実施形態のいずれかに記載の使用のためのＶＬＰ。
実施形態１３。 標的細胞は、有効量の前記酵素と接触させられる、前述の実施形態のいずれかに記載の使用のためのＶＬＰ。
実施形態１４。 前記酵素は、治療上有効な酵素活性を、少なくとも１０日間、好ましくは少なくとも２０日間、より好ましくは少なくとも３０日間有する、前述の実施形態のいずれかに記載の使用のためのＶＬＰ。
実施形態１５。 前記ＶＬＰは、ＪＣウイルスのＶＰ１タンパク質から構成される、前述の実施形態のいずれかに記載の使用のためのＶＬＰ。
実施形態１６。 前記ＶＰ１タンパク質は、配列番号５または６に従うアミノ酸配列とその全長にわたって少なくとも８０％同一、好ましくは少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態１５に記載のＶＬＰ。
実施形態１７。 被験体における白質ジストロフィーの処置のための方法における使用のための薬学的組成物であって、ここで前記薬学的組成物は、実施形態１～１６のいずれかに記載のＶＬＰ、ならびに薬学的に受容可能なキャリア、および／または賦形剤を含む、薬学的組成物。
実施形態１８。 酵素をコードするコード領域、ＣＡＧおよびＣＭＶからなる群より選択されるプロモーターを有し、７ｋｂ未満、好ましくは６ｋｂ未満、より好ましくは５ｋｂ未満、最も好ましくは４ｋｂ未満のサイズを有する発現ベクターであって、ここで前記酵素は、アスパルトアシラーゼまたはガラクトセレブロシダーゼである、発現ベクター。
実施形態１９。 前記コード領域は、配列番号２のヌクレオチド配列とその全長にわたって少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％同一であり、最も好ましくは配列番号２のヌクレオチド配列であるヌクレオチド配列を含むか、または前記コード領域は、配列番号４のヌクレオチド配列とその全長にわたって少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％同一であり、最も好ましくは、配列番号４のヌクレオチド配列であるヌクレオチド配列を含む、実施形態１８に記載の発現ベクター。
実施形態２０。 ＶＬＰと、酵素、もしくは酵素をコードする発現ベクターとを会合させる方法であって、ここで前記酵素は、アスパルトアシラーゼまたはガラクトセレブロシダーゼであり、そして前記方法は、以下の工程：
ａ） ＶＰ１タンパク質を含む組成物を提供する工程、
ｂ） 前記工程ａ）の組成物の前記ＶＰ１タンパク質を、ＶＬＰへとアセンブルするように前記ＶＰ１を誘導する条件へと曝す工程、
ｃ） 前記ｂ）の組成物の前記ＶＬＰを、前記ＶＬＰをペンタマーへと脱アセンブルする条件へと曝す工程、
ｄ） 前記（ｃ）の組成物の前記ペンタマーを、ＶＬＰへと再アセンブルするように前記ペンタマーを誘導する条件へと曝す工程
ｅ） 前記ｄ）の組成物の前記ＶＬＰを、前記ＶＬＰをペンタマーへと脱アセンブルする条件へと曝す工程、
ｆ） 前記ｅ）の組成物の前記ペンタマーを、前記酵素もしくは前記発現ベクターに、前記酵素もしくは前記発現ベクターと会合されたＶＬＰへとアセンブルするように、前記ペンタマーを誘導する条件へと曝す工程、
を包含する方法。
実施形態２１。 実施形態２０に記載の方法によって得られ得る、ＶＬＰ。

Claims (22)

  1. 被験体における白質ジストロフィーの処置のための方法における使用のための酵素もしくは前記酵素をコードする発現ベクターもしくは前記酵素をコードするｍＲＮＡ、またはこれらの組み合わせと会合されたＶＬＰであって、ここで前記酵素は、アスパルトアシラーゼまたはガラクトセレブロシダーゼである、ＶＬＰ。
  2. （ｉ）前記酵素は、アスパルトアシラーゼであり、前記白質ジストロフィーは、カナバン病である；または
    （ｉｉ）前記酵素は、ガラクトセレブロシダーゼであり、前記白質ジストロフィーは、クラッベ病である、
    請求項１に記載の使用のためのＶＬＰ。
  3. 前記ＶＬＰは、ウイルス遺伝物質を含まず、前記発現ベクターまたは前記ｍＲＮＡは、ウイルスタンパク質をコードしない、請求項１または２に記載の使用のためのＶＬＰ。
  4. 前記被験体は、動物またはヒトであり、好ましくはヒトである、前述の請求項のいずれかに記載の使用のためのＶＬＰ。
  5. 前記酵素は、配列番号１に従うアミノ酸配列とその全長にわたって少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％同一であり、より好ましくは、配列番号１のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含むか；または前記酵素は、配列番号３に従うアミノ酸配列とその全長にわたって少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％同一であり、より好ましくは配列番号３のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む、前述の請求項のいずれかに記載の使用のためのＶＬＰ。
  6. 前記発現ベクターは、７ｋｂ未満、好ましくは６ｋｂ未満、より好ましくは５ｋｂ未満、最も好ましくは４ｋｂ未満のサイズを有する、前述の請求項のいずれかに記載の使用のためのＶＬＰ。
  7. 前記発現ベクターは、ＣＭＶおよびＣＡＧからなる群より選択されるプロモーターを有する、前述の請求項のいずれかに記載の使用のためのＶＬＰ。
  8. 前記酵素は、配列番号２のヌクレオチド配列とその全長にわたって少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％同一であり、最も好ましくは配列番号２のヌクレオチド配列であるヌクレオチド配列によってコードされるか；または前記酵素は、配列番号４のヌクレオチド配列とその全長にわたって少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％同一であり、最も好ましくは、配列番号４のヌクレオチド配列であるヌクレオチド配列によってコードされる、前述の請求項のいずれかに記載の使用のためのＶＬＰ。
  9. 前記酵素は、配列番号９のｍＲＮＡ配列とその全長にわたって少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％同一であり、最も好ましくは、配列番号９のｍＲＮＡ配列を含むｍＲＮＡ配列によってコードされるか；または前記酵素は、配列番号１０のｍＲＮＡ配列とその全長にわたって少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％同一であり、最も好ましくは、配列番号１０のｍＲＮＡ配列を含むｍＲＮＡ配列によってコードされる、前述の請求項のいずれかに記載の使用のためのＶＬＰ。
  10. 前記ＶＬＰは、ヒトポリオーマウイルス、好ましくはＪＣＶに由来する、前述の請求項のいずれかに記載の使用のためのＶＬＰ。
  11. 前記ＶＬＰは、血液脳関門を、好ましくは生理学的に無傷の血液脳関門を横断して、前記酵素もしくは前記発現ベクターもしくは前記ｍＲＮＡまたはこれらの組み合わせと一緒にＣＮＳに入る、前述の請求項のいずれかに記載の使用のためのＶＬＰ。
  12. 前記酵素もしくは前記発現ベクターもしくは前記ｍＲＮＡまたはこれらの組み合わせは、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、ミクログリアまたはニューロン、好ましくはオリゴデンドロサイトに入る、請求項１１に記載のＶＬＰ。
  13. 前記ＶＬＰは、経口的にまたは非経口的に、好ましくは静脈内に投与される、前述の請求項のいずれかに記載の使用のためのＶＬＰ。
  14. 標的細胞は、有効量の前記酵素と接触させられる、前述の請求項のいずれかに記載の使用のためのＶＬＰ。
  15. 前記酵素は、治療上有効な酵素活性を、少なくとも１０日間、好ましくは少なくとも２０日間、より好ましくは少なくとも３０日間有する、前述の請求項のいずれかに記載の使用のためのＶＬＰ。
  16. 前記ＶＬＰは、ＪＣウイルスのＶＰ１タンパク質から構成される、前述の請求項のいずれかに記載の使用のためのＶＬＰ。
  17. 前記ＶＰ１タンパク質は、配列番号５または６に従うアミノ酸配列とその全長にわたって少なくとも８０％同一、好ましくは少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載のＶＬＰ。
  18. 被験体における白質ジストロフィーの処置のための方法における使用のための薬学的組成物であって、ここで前記薬学的組成物は、請求項１～１７のいずれかに記載のＶＬＰ、ならびに薬学的に受容可能なキャリア、および／または賦形剤を含む、薬学的組成物。
  19. 酵素をコードするコード領域、ＣＡＧおよびＣＭＶからなる群より選択されるプロモーターを有し、７ｋｂ未満、好ましくは６ｋｂ未満、より好ましくは５ｋｂ未満、最も好ましくは４ｋｂ未満のサイズを有する発現ベクターであって、ここで前記酵素は、アスパルトアシラーゼまたはガラクトセレブロシダーゼである、発現ベクター。
  20. 前記コード領域は、配列番号２のヌクレオチド配列とその全長にわたって少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％同一であり、最も好ましくは配列番号２のヌクレオチド配列であるヌクレオチド配列を含むか、または前記コード領域は、配列番号４のヌクレオチド配列とその全長にわたって少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％同一であり、最も好ましくは、配列番号４のヌクレオチド配列であるヌクレオチド配列を含む、請求項１９に記載の発現ベクター。
  21. ＶＬＰと、酵素、もしくは酵素をコードする発現ベクターもしくは酵素をコードするｍＲＮＡまたはこれらの組み合わせとを会合させる方法であって、ここで前記酵素は、アスパルトアシラーゼまたはガラクトセレブロシダーゼであり、そして前記方法は、以下の工程：
    ａ） ＶＰ１タンパク質を含む組成物を提供する工程、
    ｂ） 前記工程ａ）の組成物の前記ＶＰ１タンパク質を、ＶＬＰへとアセンブルするように前記ＶＰ１を誘導する条件へと曝す工程、
    ｃ） 前記ｂ）の組成物の前記ＶＬＰを、前記ＶＬＰをペンタマーへと脱アセンブルする条件へと曝す工程、
    ｄ） 前記（ｃ）の組成物の前記ペンタマーを、ＶＬＰへと再アセンブルするように前記ペンタマーを誘導する条件へと曝す工程
    ｅ） 前記ｄ）の組成物の前記ＶＬＰを、前記ＶＬＰをペンタマーへと脱アセンブルする条件へと曝す工程、
    ｆ） 前記ｅ）の組成物の前記ペンタマーを、前記酵素もしくは前記発現ベクターもしくは前記ｍＲＮＡまたはこれらの組み合わせに、前記酵素もしくは前記発現ベクターもしくは前記ｍＲＮＡまたはこれらの組み合わせと会合されたＶＬＰへとアセンブルするように、前記ペンタマーを誘導する条件へと曝す工程、
    を包含する方法。
  22. 請求項２１に記載の方法によって得られ得る、ＶＬＰ。
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