JP2022513034A - 神経セロイドリポフスチン症の遺伝子治療 - Google Patents

神経セロイドリポフスチン症の遺伝子治療 Download PDF

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Abstract

本明細書において、バッテン病を治療するための方法及び組成物を提供する。そのような組成物は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）、ＡＡＶキャプシドを含む当該ｒＡＡＶ、及びその内部にパッケージされたベクターゲノムを含み、当該ベクターゲノムは、（ａ）ＡＡＶ ５’逆位末端（ＩＴＲ）配列；（ｂ）プロモーター；（ｃ）ヒトＴＰＰ１をコードするＣＬＮ２コード配列；（ｄ）ＡＡＶ ３’ＩＴＲを含む。また、本明細書において、本明細書に記載のｒＡＡＶを、それを必要とする対象に複数の経路で投与することを含む、バッテン病の治療方法を提供する。本明細書に記載のｒＡＡＶを含む医薬組成物及びバッテン病を治療する関連する方法も本明細書に提供する。【選択図】図１Ａ

Description

本出願は、２０１８年１１月１４日に出願された米国仮出願第６２／７６７，４１０号及び２０１９年１０月２１日に出願された米国仮出願第６２／９２４，０６０号の利益を主張するものであり、両出願は、その全体が参照により本明細書に援用される。
電子的に提出した配列表の参照
本願では、２０１９年１１月３日に作成したファイル名「１２６５６－１２５－２２８＿ＳＥＱ＿ＬＩＳＴＩＮＧ」、ファイルサイズ３６，３９３バイトのテキストファイルとして本願と共に提出した配列表を、参照により援用する。
神経セロイドリポフスチン症（ＮＣＬ）は、希少・遺伝性の神経変性疾患の一群である。それらは、患者に認められるセロイド及びリポフスチンに類似した自家蛍光リポ色素の蓄積を伴う、神経遺伝性蓄積症の最も一般的な疾患と考えられている。ＮＣＬは、筋肉の緊張または痙攣の異常な増加、失明または視力障害、認知症、筋肉協調運動の障害、知的障害、運動障害、発作、及び不安定歩行を含む、多様であるが進行性の症状に関連している。この疾患の発症率は、およそ１２，５００人に１人である。ＮＣＬには主に３つのタイプがある：成人型（クーフス病またはパリー病）；若年型及び乳児期遅発型（ヤンスキー・ビールショウスキー病）。神経セロイドリポフスチン症（ＮＣＬ）は、もともと発症年齢と臨床症状（本明細書に記載）によって定義されていた。しかしながら、その後、新しい分子所見に基づいて再分類され、臨床表現型によって以前に示唆されていたよりも、様々な遺伝的バリアントに対してはるかに多くの重複のエビデンスが提供された。
ＮＣＬに関連する少なくとも２０種の遺伝子が同定されている。ＣＬＮ２変異を有するＮＣＬ患者は、トリペプチジルペプチダーゼ１（ＴＴＰ１）と呼ばれるペプスタチン非感受性リソソームペプチダーゼを欠損している。ＴＴＰ１は、ポリペプチドのＮ末端からトリペプチドを除去する。ＣＬＮ２遺伝子の１３個のエクソンすべてで変異が報告されている。いくつかの変異は、経過をより長引かせる結果をもたらす。発症は通常、乳児期後期であるが、より後期での発症が報告されている。ＣＬＮ２では、５８を超える変異が記載されている。
バッテン病の一種であるＣＬＮ２病は、まれなリソソーム蓄積症（ＬＳＤ）であり、発症率は、出生１０万人あたり０．０７～０．５１と推定されている（Ａｕｇｅｓｔａｄ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｃｌａｕｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２；Ｍｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂａｔｔｅｎ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｒｅｇｉｓｔｒｙ；Ｐｏｕｐｅｔｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｓａｎｔｏｒｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｔｅｉｘｅｉｒａ ｅｔ ａｌ．，２００３）。ＣＬＮ２疾患は、染色体１１ｑ１５に位置し、可溶性リソソーム酵素トリペプチジル－ペプチダーゼ－１（ＴＰＰ１）をコードするＣＬＮ２遺伝子の変異によって引き起こされる、致死性の常染色体劣性神経変性ＬＳＤである。ＣＬＮ２遺伝子の変異、及びそれに続くＴＰＰ１酵素活性の欠損は、貯蔵物質のリソソーム蓄積と脳及び網膜の神経変性をもたらす（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，１９９８；Ｗｌｏｄａｗｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００３）。ＣＬＮ２疾患は、２～４歳での早期発症を特徴とし、初期の特徴として、通常、再発性発作（てんかん）及び運動の調整困難（運動失調）が挙げられる。この疾患はまた、以前に習得したスキルの喪失（発達の退行）をもたらす。てんかんは多くの場合、医学的治療に抵抗性であり、精神運動機能の全般的な衰退が、満３歳～満５歳の間に急速かつ一様に起こり（Ｓｃｈｕｌｚ ｅｔ ａｌ．，２０１３）、その後、小児期半ばまでに早期に死亡する（Ｎｉｃｋｅｌ Ｍ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｗｏｒｇａｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００７）。
組換えＴＰＰ１（Ｂｒｉｎｅｕｒａ（登録商標）セリポナーゼα、ＢｉｏＭａｒｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）による酵素補充療法（ＥＲＴ）は、ＣＬＮ２疾患の治療のために米国（ＵＳ）及び欧州連合（ＥＵ）において最近承認され、これは、永続的な埋込型デバイスを介して側脳室への隔週注入として投与される。Ｂｒｉｎｅｕｒａ（登録商標）の臨床的有用性は、ＦＤＡによって運動機能の安定化に限定するように指定されたが、一方、欧州医薬品庁（ＥＭＡ）は、言語スキルにもプラスの影響があると判断した（Ｂｒｉｎｅｕｒａ（登録商標）、ＦＤＡ医薬品承認審査概要；Ｂｒｉｎｅｕｒａ（登録商標）欧州公開医薬品審査報告書［ＥＰＡＲ］；Ｓｃｈｕｌｚ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。Ｂｒｉｎｅｕｒａ（登録商標）は、脳に直接ポートを移植するための専門的な専門知識を必要とし、脳室内（ＩＣＶ）投与に精通し、訓練を受けた専門家が、医療現場で２週間ごとに４時間の注入中に投与する必要がある。ＣＳＦ及びリソソームでのＢｒｉｎｅｕｒａ（登録商標）の半減期は短く、それぞれ７時間及び１１．５日と推定されていることが主な原因で、これらを繰り返し注入する必要がある（Ｂｒｉｎｅｕｒａ（登録商標）、ＥＰＡＲ）。したがって、ＥＲＴの反復投与に伴う重い負担や高い罹患率を患者に強いることなく、ＣＬＮ２疾患患者の中枢神経系（ＣＮＳ）において耐久性のある長期ＴＰＰ１酵素活性を提供することができる新規治療法に対する未だ満たされていない大きなニーズが残されている。したがって、ＣＬＮ２疾患の治療を必要とする対象にＴＰＰ１を送達し、発現させるのに有用な組成物が必要である。イヌＴＰＰ１（ｒＡＡＶ２．ｃａＴＰＰ１）を発現する組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の単回投与は、主に上衣細胞でのＴＰＰ１の高発現と、脳脊髄液への酵素の分泌をもたらし、臨床的有用性をもたらすことが示された。参照により本明細書に援用されるＫａｔｚ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ． ２０１５ Ｎｏｖ １１；７（３１３）：３１３ｒａ１８０；及びＫＡＴＺ，ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ２０１７ Ｆｅｂ ２４（４）：２１５－２２３を参照のこと。しかしながら、ＡＡＶ２は脳実質に浸透せず、ニューロンを標的としないため、新規神経向性ＡＡＶで達成可能な有用性に比べて期待される有用性は限定される。
本明細書において、バッテン病を有する対象への投与に適した水性懸濁液を提供する。一実施形態では、懸濁液は、懸濁水溶液と、バッテンの治療薬として有用な約７．５×１０１２ＧＣ（７．５×１０９ＧＣ／ｇ脳）～２．７×１０１５ＧＣ（２．１×１０１２ＧＣ／ｇ脳）の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）のウイルス粒子を含み、当該ｒＡＡＶは、ＡＡＶキャプシドを有し、以下を含むベクターゲノムをその内部にパッケージングしている：（ａ）ＡＡＶ ５’逆位末端（ＩＴＲ）配列；（ｂ）プロモーター；（ｃ）ヒトＴＰＰ１をコードするＣＬＮ２コード配列；及び（ｄ）ＡＡＶ ３’ＩＴＲ。
また、本明細書では、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を、第１の経路及び第２の経路を介して、それを必要とする対象に投与することを含む、対象におけるＣＬＮ２バッテン病の治療方法を提供し、当該第１の経路及び当該第２の経路は、中枢神経系（ＣＮＳ）への経路であり、当該第１の経路は脳領域への経路であり、当該第２の経路は脊髄領域への経路であり、当該組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）は、ＡＡＶキャプシド及びその内部にパッケージされたベクターゲノムを含み、当該ベクターゲノムは、以下を含む：（ａ）ＡＡＶ ５’逆位末端（ＩＴＲ）配列；（ｂ）プロモーター；（ｃ）ヒトＴＰＰ１をコードするＣＬＮ２コード配列；及び（ｄ）ＡＡＶ ３’ＩＴＲ。
特定の実施形態では、当該第１の経路は、脳室内（ＩＣＶ）または大槽内（ＩＣ）である。特定の実施形態では、当該第２の経路は、腰部髄腔内（ＩＴ－Ｌ）である。特定の実施形態では、当該方法は、第３の経路を介して当該対象に当該ｒＡＡＶを投与することをさらに含み、当該第３の経路は、脳室内（ＩＣＶ）、槽内（ＩＣ）、腰部髄腔内、頭蓋内、静脈内、血管内、動脈内、筋肉内、眼内、皮下、及び皮内からなる群から選択される。
特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２バッテン病の治療方法は、脳室内（ＩＣＶ）及び腰部髄腔内（ＩＴ－Ｌ）経路を介して、当該ｒＡＡＶを、それを必要とする対象に共投与することを含む。特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２バッテン病の治療方法は、槽内（ＩＣ）及び腰部髄腔内（ＩＴ－Ｌ）経路を介して、当該ｒＡＡＶを、それを必要とする対象に共投与することを含む。特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２バッテン病の治療方法は、脳室内（ＩＣＶ）、腰部髄腔内（ＩＴ－Ｌ）、及び静脈内経路を介して、当該ｒＡＡＶを、それを必要とする対象に共投与することを含む。特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２バッテン病の治療方法は、槽内（ＩＣ）、腰部髄腔内（ＩＴ－Ｌ）、及び静脈内経路を介して、当該ｒＡＡＶを、それを必要とする対象に共投与することを含む。
別の態様では、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を、第１の経路及び第２の経路を介して、それを必要とする対象に投与することを含む、対象におけるＣＬＮ２バッテン病の治療方法を提供し、当該第１の経路は、中枢神経系（ＣＮＳ）への経路であり、当該第２の経路は、ｒＡＡＶをＣＮＳの外側へ送達し、当該組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）は、ＡＡＶキャプシド及びその内部にパッケージされたベクターゲノムを含み、当該ベクターゲノムは、以下を含む：（ａ）ＡＡＶ ５’逆位末端（ＩＴＲ）配列；（ｂ）プロモーター；（ｃ）ヒトＴＰＰ１をコードするＣＬＮ２コード配列；及び（ｄ）ＡＡＶ ３’ＩＴＲ。特定の実施形態では、当該第１の経路は、腰部髄腔内（ＩＴ－Ｌ）、脳室内（ＩＣＶ）または槽内（ＩＣ）である。特定の実施形態では、当該第２の経路は、静脈内、血管内、動脈内、筋肉内、眼内、皮下、及び皮内からなる群から選択される。特定の実施形態では、当該第２の経路は静脈内である。
別の態様では、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を、第１の経路及び第２の経路を介して、それを必要とする対象に投与することを含む、対象におけるＣＬＮ２バッテン病の治療方法を提供し、当該第１の経路は、中枢神経系（ＣＮＳ）への経路であり、当該第２の経路は、ｒＡＡＶを肝臓へ送達し、当該組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）は、ＡＡＶキャプシド及びその内部にパッケージされたベクターゲノムを含み、当該ベクターゲノムは、以下を含む：（ａ）ＡＡＶ ５’逆位末端（ＩＴＲ）配列；（ｂ）プロモーター；（ｃ）ヒトＴＰＰ１をコードするＣＬＮ２コード配列；及び（ｄ）ＡＡＶ ３’ＩＴＲ。特定の実施形態では、当該第１の経路は、腰部髄腔内（ＩＴ－Ｌ）、脳室内（ＩＣＶ）または槽内（ＩＣ）である。特定の実施形態では、当該第２の経路は、静脈内、血管内、動脈内、筋肉内、眼内、皮下、及び皮内からなる群から選択される。特定の実施形態では、当該第２の経路は静脈内である。
特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２バッテン病の治療方法は、髄腔内及び静脈内経路を介して、当該ｒＡＡＶを、それを必要とする対象に共投与することを含む。特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２バッテン病の治療方法は、腰部髄腔内（ＩＴ－Ｌ）及び静脈内経路を介して、当該ｒＡＡＶを、それを必要とする対象に共投与することを含む。特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２バッテン病の治療方法は、脳室内（ＩＣＶ）及び静脈内経路を介して、当該ｒＡＡＶを、それを必要とする対象に共投与することを含む。特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２バッテン病の治療方法は、槽内（ＩＣ）及び静脈内経路を介して、当該ｒＡＡＶを、それを必要とする対象に共投与することを含む。
特定の実施形態では、本明細書に提供するＣＬＮ２バッテン病の治療方法は、当該第２の経路を介して当該ｒＡＡＶを投与することと同時に、当該第１の経路を介して当該ｒＡＡＶを投与することを含み得る。
特定の実施形態では、本明細書に提供するＣＬＮ２バッテン病の治療方法は、当該第２の経路を介して当該ｒＡＡＶを投与する前に、当該第１の経路を介して当該ｒＡＡＶを投与することを含み得る。特定の実施形態では、本明細書に提供するＣＬＮ２バッテン病の治療方法は、当該第２の経路を介して当該ｒＡＡＶを投与した後に、当該第１の経路を介して当該ｒＡＡＶを投与することを含み得る。
特定の実施形態では、本明細書に提供するＣＬＮ２バッテン病の治療方法は、当該対象の脊髄内のＴＰＰ１活性の増加をもたらし得る。特定の実施形態では、本明細書に提供するＣＬＮ２バッテン病の治療方法は、当該対象の肝ＴＰＰ１活性の増加をもたらし得る。特定の実施形態では、本明細書に提供するＣＬＮ２バッテン病の治療方法は、当該対象の血清ＴＰＰ１活性の増加をもたらし得る。特定の実施形態では、本明細書に提供するＣＬＮ２バッテン病の治療方法は、当該対象の皮質内のミクログリア活性の低下をもたらし得る。特定の実施形態では、本明細書に提供するＣＬＮ２バッテン病の治療方法は、当該対象の脳内のＴＰＰ１活性の増加をもたらし得る。
特定の実施形態では、当該ｒＡＡＶを、治療有効量で投与する。
特定の実施形態では、当該対象はヒトである。
特定の実施形態では、（ｃ）のコード配列は、コドン最適化ヒトＣＬＮ２であり、これは、配列番号２の天然ヒトコード配列に対して少なくとも７０％同一である。特定の実施形態では、（ｃ）のコード配列は、配列番号３である。
特定の実施形態では、ｒＡＡＶキャプシドは、ＡＡＶ９またはそのバリアントである。
特定の実施形態では、プロモーターはニワトリβアクチン（ＣＢＡ）プロモーターである。特定の実施形態では、プロモーターは、ＣＢＡプロモーター配列とサイトメガロウイルスエンハンサーエレメントを含むハイブリッドプロモーターである。
特定の実施形態では、ＡＡＶ ５’ＩＴＲ及び／またはＡＡＶ ３’ＩＴＲは、ＡＡＶ２由来である。
特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ポリＡをさらに含む。特定の実施形態では、ポリＡは、合成ポリＡであるか、またはウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ＳＶ４０、ウサギβ－グロビン（ＲＧＢ）、または修飾ＲＧＢ（ｍＲＧＢ）由来である。
特定の実施形態では、ベクターゲノムは、イントロンをさらに含む。特定の実施形態では、イントロンは、ＣＢＡ、ヒトβグロビン、ＩＶＳ２、ＳＶ４０、ｂＧＨ、αグロブリン、βグロブリン、コラーゲン、オボアルブミン、またはｐ５３由来である。
特定の実施形態では、ベクターゲノムは、エンハンサーをさらに含む。特定の実施形態では、エンハンサーは、ＣＭＶエンハンサー、ＲＳＶエンハンサー、ＡＰＢエンハンサー、ＡＢＰＳエンハンサー、αｍｉｃ／ｂｉｋエンハンサー、ＴＴＲエンハンサー、ｅｎ３４、ＡｐｏＥである。
特定の実施形態では、ベクターゲノムは、サイズが約３キロベース～約５．５キロベースである。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、サイズが約４キロベースである。
特定の実施形態では、ｒＡＡＶを産生することができる浮遊細胞株を浮遊培養で増殖させることを含む方法を使用して、ｒＡＡＶを製造する。特定の実施形態では、当該浮遊細胞株は、ＨＥＫ２９３浮遊細胞株である。
医薬組成物もまた、本明細書において提供する。特定の実施形態では、本明細書において、以下を含む医薬組成物を提供し：
（ａ）組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）、
（ｂ）塩化ナトリウム、
（ｃ）塩化マグネシウム、
（ｄ）塩化カリウム、
（ｅ）デキストロース、
（ｆ）ポロキサマー１８８、
（ｇ）第一リン酸ナトリウム、及び
（ｈ）第二リン酸ナトリウム、
その場合、当該組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）は、ＡＡＶキャプシド及びその内部にパッケージされたベクターゲノムを含み、当該ベクターゲノムは、以下を含む：（ｉ）ＡＡＶ ５’逆位末端（ＩＴＲ）配列；（ｉｉ）プロモーター；（ｉｉｉ）ヒトＴＰＰ１をコードするＣＬＮ２コード配列；及び（ｉｖ）ＡＡＶ ３’ＩＴＲ。
特定の実施形態では、医薬組成物は、塩化カルシウムをさらに含む。
特定の実施形態では、当該塩化ナトリウム、当該塩化マグネシウム、当該塩化カリウム、当該デキストロース、当該ポロキサマー１８８、当該第一リン酸ナトリウム、当該第二リン酸ナトリウム、及び当該塩化カルシウムは、それぞれ、無水、一水和物、二水和物、３水和物、４水和物、５水和物、６水和物、７水和物、８水和物、９水和物、または１０水和物の形態である。
特定の実施形態では、医薬組成物は、以下を含む。
（ａ）当該ｒＡＡＶ、
（ｂ）約８．７７ｇ／Ｌの濃度の塩化ナトリウム、
（ｃ）約０．２４４ｇ／Ｌの濃度の塩化マグネシウム６水和物、
（ｄ）約０．２２４ｇ／Ｌの濃度の塩化カリウム、
（ｅ）約０．２０６ｇ／Ｌの濃度の塩化カルシウム二水和物、
（ｆ）約０．７９３ｇ／Ｌの濃度の無水デキストロース、
（ｇ）約０．００１％（体積／体積）の濃度のポロキサマー１８８、
（ｈ）約０．０２７８ｇ／Ｌの濃度の第一リン酸ナトリウム一水和物、及び
（ｉ）約０．１１４ｇ／Ｌの濃度の第二リン酸ナトリウム無水物。
特定の実施形態では、医薬組成物のベクターゲノム濃度（ＶＧＣ）は、約１×１０１１ＧＣ／ｍＬ、約３×１０１１ＧＣ／ｍＬ、約６×１０１１ＧＣ／ｍＬ、約１×１０１２ＧＣ／ｍＬ、約３×１０１２ＧＣ／ｍＬ、約６×１０１２ＧＣ／ｍＬ、約１×１０１３ＧＣ／ｍＬ、約２×１０１３ＧＣ／ｍＬ、約３×１０１３ＧＣ／ｍＬ、約４×１０１３ＧＣ／ｍＬ、約５×１０１３ＧＣ／ｍＬ、約６×１０１３ＧＣ／ｍＬ、約７×１０１３ＧＣ／ｍＬ、約８×１０１３ＧＣ／ｍＬ、約９×１０１３ＧＣ／ｍＬ、または約１×１０１４ＧＣ／ｍＬ、約３×１０１４ＧＣ／ｍＬ、約６×１０１４ＧＣ／ｍＬ、または約１×１０１５ＧＣ／ｍＬである。
特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは、約６．０～約９．０の範囲にある。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは約７．４である。
特定の実施形態では、医薬組成物中の当該ｒＡＡＶは、参照医薬組成物中の同じ組換えｒＡＡＶに比べて凍結／解凍サイクルに対して、少なくとも２％、５％、７％、１０％、１２％、１５％、１７％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、１００％、２倍、３倍、５倍、１０倍、１００倍、または１０００倍安定である。特定の実施形態では、医薬組成物における当該ｒＡＡＶの安定性は、以下によって決定される。
（ａ）ｒＡＡＶの感染力、
（ｂ）ｒＡＡＶの凝集レベル、または
（ｃ）ｒＡＡＶによって放出された遊離ＤＮＡのレベル。
特定の実施形態では、医薬組成物は、液体組成物である。特定の実施形態では、医薬組成物は、凍結組成物である。特定の実施形態では、医薬組成物は、凍結乾燥組成物または再構成された凍結乾燥組成物である。
特定の実施形態では、医薬組成物は、脳室内（ＩＣＶ）、槽内（ＩＣ）、腰部髄腔内、頭蓋内、静脈内、血管内、動脈内、筋肉内、眼内、筋肉内、皮下、または皮内投与に適した特性を有する。
特定の実施形態では、医薬組成物中のｒＡＡＶの（ｉｉｉ）のコード配列は、コドン最適化されたヒトＣＬＮ２であり、これは、配列番号２の天然ヒトコード配列に対して少なくとも７０％同一である。特定の実施形態では、医薬組成物中のｒＡＡＶの（ｉｉｉ）のコード配列は、配列番号３である。
特定の実施形態では、医薬組成物中のｒＡＡＶのｒＡＡＶキャプシドは、ＡＡＶ９またはそのバリアントである。
特定の実施形態では、医薬組成物中のｒＡＡＶのプロモーターは、ニワトリβアクチン（ＣＢＡ）プロモーターである。特定の実施形態では、医薬組成物中のｒＡＡＶのプロモーターは、ＣＢＡプロモーター配列とサイトメガロウイルスエンハンサーエレメントを含むハイブリッドプロモーターである。
特定の実施形態では、医薬組成物中のｒＡＡＶのＡＡＶ ５’ＩＴＲ及び／またはＡＡＶ ３’ＩＴＲは、ＡＡＶ２由来である。
特定の実施形態では、医薬組成物中のｒＡＡＶのベクターゲノムは、ポリＡをさらに含む。特定の実施形態では、ポリＡは、合成ポリＡであるか、またはウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ＳＶ４０、ウサギβ－グロビン（ＲＧＢ）、または修飾ＲＧＢ（ｍＲＧＢ）由来である。
特定の実施形態では、医薬組成物中のｒＡＡＶのベクターゲノムは、イントロンをさらに含む。特定の実施形態では、イントロンは、ＣＢＡ、ヒトβグロビン、ＩＶＳ２、ＳＶ４０、ｂＧＨ、αグロブリン、βグロブリン、コラーゲン、オボアルブミン、またはｐ５３由来である。
特定の実施形態では、医薬組成物中のｒＡＡＶのベクターゲノムは、エンハンサーをさらに含む。特定の実施形態では、エンハンサーは、ＣＭＶエンハンサー、ＲＳＶエンハンサー、ＡＰＢエンハンサー、ＡＢＰＳエンハンサー、αｍｉｃ／ｂｉｋエンハンサー、ＴＴＲエンハンサー、ｅｎ３４、ＡｐｏＥである。
特定の実施形態では、医薬組成物中のｒＡＡＶのベクターゲノムは、サイズが約３キロベース～約５．５キロベースである。特定の実施形態では、医薬組成物中のｒＡＡＶのベクターゲノムは、サイズが約４キロベースである。
特定の実施形態では、ｒＡＡＶを産生することができる浮遊細胞株を浮遊培養で増殖させることを含む方法を使用して、医薬組成物中のｒＡＡＶを製造する。
別の態様では、本明細書で提供する医薬組成物を対象に投与することを含む、当該対象におけるＣＬＮ２バッテン病の治療方法を本明細書で提供する。特定の実施形態では、当該医薬組成物を、治療有効量で投与する。特定の実施形態では、当該対象はヒトである。
さらに別の態様では、本明細書において、１つ以上の容器及び使用説明書を含むキットを提供し、１つ以上の容器は、本明細書で提供する医薬組成物を含む。
本明細書ではまた、ｒＡＡＶの製造方法も提供する。特定の実施形態では、方法は、ｒＡＡＶを産生することができる浮遊細胞株を浮遊培養で増殖させることを含む。
他の態様及び実施形態は、本明細書に記載の情報に基づいて容易に明らかになるであろう。
例示的実施形態
１． 対象におけるＣＬＮ２バッテン病の治療方法であって、それを必要とする対象に第１の経路及び第２の経路を介して組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を投与することを含み、前記第１の経路及び前記第２の経路が、中枢神経（ＣＮＳ）への経路であり、前記第１の経路が、脳領域への経路であり、前記第２の経路が、脊髄領域への経路であり、そして
前記組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）が、ＡＡＶキャプシド及びその内部にパッケージされたベクターゲノムを含み、前記ベクターゲノムが：
（ａ）ＡＡＶ ５’逆位末端（ＩＴＲ）配列；
（ｂ）プロモーター；
（ｃ）ヒトＴＰＰ１をコードするＣＬＮ２コード配列；及び
（ｄ）ＡＡＶ ３’ＩＴＲを含む、前記治療方法。
２． 前記第１の経路が、脳室内（ＩＣＶ）または槽内（ＩＣ）である、項目１に記載の方法。
３． 前記第２の経路が、腰部髄腔内（ＩＴ－Ｌ）である、項目１～２のいずれか一項に記載の方法。
４． 前記方法が、第３の経路を介して前記対象に前記ｒＡＡＶを投与することをさらに含み、前記第３の経路が、脳室内（ＩＣＶ）、槽内（ＩＣ）、腰部髄腔内、頭蓋内、静脈内、血管内、動脈内、筋肉内、眼内、皮下、及び皮内からなる群から選択される、項目１～３のいずれか一項に記載の方法。
５． 対象におけるＣＬＮ２バッテン病の治療方法であって、それを必要とする対象に第１の経路及び第２の経路を介して組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を投与することを含み、前記第１の経路が、中枢神経（ＣＮＳ）への経路であり、前記第２の経路が、ｒＡＡＶを肝臓へ送達し、そして
前記組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）が、ＡＡＶキャプシド及びその内部にパッケージされたベクターゲノムを含み、前記ベクターゲノムが：
（ａ）ＡＡＶ ５’逆位末端（ＩＴＲ）配列；
（ｂ）プロモーター；
（ｃ）ヒトＴＰＰ１をコードするＣＬＮ２コード配列；及び
（ｄ）ＡＡＶ ３’ＩＴＲを含む、前記治療方法。
６． 前記第１の経路が、腰部髄腔内（ＩＴ－Ｌ）、脳室内（ＩＣＶ）または槽内（ＩＣ）である、項目５に記載の方法。
７． 前記第２の経路が、静脈内、血管内、動脈内、筋肉内、眼内、皮下、及び皮内からなる群から選択される、項目５～６のいずれか一項に記載の方法。
８． 前記第２の経路が静脈内である、項目７に記載の方法。
９． 前記方法が、前記第２の経路を介して前記ｒＡＡＶを投与すると同時に、前記第１の経路を介して前記ｒＡＡＶを投与することを含む、項目１～８のいずれか一項に記載の方法。
１０． 前記方法が、前記第２の経路を介して前記ｒＡＡＶを投与する前に、前記第１の経路を介して前記ｒＡＡＶを投与することを含む、項目１～８のいずれか一項に記載の方法。
１１． 前記方法が、前記第２の経路を介して前記ｒＡＡＶを投与した後に、前記第１の経路を介して前記ｒＡＡＶを投与することを含む、項目１～８のいずれか一項に記載の方法。
１２． 前記第１の経路を介した前記ｒＡＡＶの投与と、前記第２の経路を介した前記ｒＡＡＶの投与との間の間隔が、約０．５時間、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約１週間、約８日、約９日、約１０日、約１１日、約１２日、約１３日、約２週間、約３週間、約４週間、約５週間、約６週間、約７週間、約８週間、約９週間、約１０週間、約１１週間、約１２週間、約１か月、約２か月、約３か月、約４か月、約５か月、約６か月、またはそれ以上である、項目１０～１１のいずれか一項に記載の方法。
１３． 前記方法が、前記対象の脊髄において、第２の対象の脊髄における参照ＴＰＰ１活性に比べて、少なくとも２％、３％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１２％、１５％、１７％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％高いＴＰＰ１活性をもたらし、前記脊髄における前記参照ＴＰＰ１活性が、前記第２の対象が前記方法を使用した治療を受けていない場合に測定され、前記第２の対象が、前記対象と同じであるかまたは異なっている、項目１～１２のいずれか一項に記載の方法。
１４． 前記方法が、第２の対象の参照肝ＴＰＰ１活性に比べて、少なくとも２％、３％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１２％、１５％、１７％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％高い前記対象の肝ＴＰＰ１活性をもたらし、前記参照肝ＴＰＰ１活性が、前記第２の対象が前記方法を使用した治療を受けていない場合に測定され、前記第２の対象が、前記対象と同じであるかまたは異なっている、項目１～１３のいずれか一項に記載の方法。
１５． 前記方法が、第２の対象の参照血清ＴＰＰ１活性に比べて、少なくとも２％、３％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１２％、１５％、１７％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％高い前記対象の血清ＴＰＰ１活性をもたらし、前記参照血清ＴＰＰ１活性が、前記第２の対象が前記方法を使用した治療を受けていない場合に測定され、前記第２の対象が、前記対象と同じであるかまたは異なっている、項目１～１４のいずれか一項に記載の方法。
１６． 前記方法が、前記対象の皮質において、第２の対象の皮質における参照ミクログリア活性に比べて、少なくとも２％、３％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１２％、１５％、１７％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％低いミクログリア活性をもたらし、前記皮質における前記参照ミクログリア活性が、前記第２の対象が前記方法を使用した治療を受けていない場合に測定され、前記第２の対象が、前記対象と同じであるかまたは異なっている、項目１～１５のいずれか一項に記載の方法。
１７． 前記方法が、前記対象の脳において、第２の対象の脳における参照ＴＰＰ１活性に比べて、少なくとも２％、３％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１２％、１５％、１７％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％高いＴＰＰ１活性をもたらし、前記脳における前記参照ＴＰＰ１活性が、前記第２の対象が前記方法を使用した治療を受けていない場合に測定され、前記第２の対象が、前記対象と同じであるかまたは異なっている、項目１～１６のいずれか一項に記載の方法。
１８． 前記ｒＡＡＶを治療有効量で投与する、項目１～１７のいずれか一項に記載の方法。
１９． 前記対象がヒトである、項目１～１８のいずれか一項に記載の方法。
２０． 前記（ｃ）のコード配列が、配列番号２の天然ヒトコード配列に対して少なくとも７０％同一であるコドン最適化ヒトＣＬＮ２である、項目１～１９のいずれか一項に記載の方法。
２１． 前記（ｃ）のコード配列が配列番号３である、項目１～２０のいずれか一項に記載の方法。
２２． 前記ｒＡＡＶキャプシドが、ＡＡＶ９またはそのバリアントである、項目１～２１のいずれか一項に記載の方法。
２３． 前記プロモーターがニワトリβアクチン（ＣＢＡ）プロモーターである、項目１～２２のいずれか一項に記載の方法。
２４． 前記プロモーターが、ＣＢＡプロモーター配列とサイトメガロウイルスエンハンサーエレメントを含むハイブリッドプロモーターである、項目１～２３のいずれか一項に記載の方法。
２５． 前記ＡＡＶ ５’ＩＴＲ及び／またはＡＡＶ ３’ＩＴＲがＡＡＶ２由来である、項目１～２４のいずれかに記載の方法。
２６． 前記ベクターゲノムがポリＡをさらに含む、項目１～２５のいずれかに記載の方法。
２７． 前記ポリＡが、合成ポリＡであるか、またはウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ＳＶ４０、ウサギβ－グロビン（ＲＧＢ）、もしくは修飾ＲＧＢ（ｍＲＧＢ）由来である、項目２６に記載の方法。
２８． 前記ベクターゲノムがイントロンをさらに含む、項目１～２７のいずれかに記載の方法。
２９． 前記イントロンが、ＣＢＡ、ヒトβグロビン、ＩＶＳ２、ＳＶ４０、ｂＧＨ、αグロブリン、βグロブリン、コラーゲン、オボアルブミン、またはｐ５３由来である、項目２８に記載の方法。
３０． 前記ベクターゲノムがエンハンサーをさらに含む、項目１～２９のいずれかに記載の方法。
３１． 前記エンハンサーが、ＣＭＶエンハンサー、ＲＳＶエンハンサー、ＡＰＢエンハンサー、ＡＢＰＳエンハンサー、αｍｉｃ／ｂｉｋエンハンサー、ＴＴＲエンハンサー、ｅｎ３４、ＡｐｏＥである、項目３０に記載の方法。
３２． 前記ベクターゲノムのサイズが、約３キロベース～約５．５キロベースである、項目１～３１のいずれかに記載の方法。
３３． 前記ベクターゲノムのサイズが約４キロベースである、項目１～３２のいずれかに記載の方法。
３４． 前記ｒＡＡＶを産生することができる浮遊細胞株を浮遊培養で増殖させることを含む方法を使用して、前記ｒＡＡＶを製造する、項目１～３３のいずれかに記載の方法。
３５． 前記浮遊細胞株がＨＥＫ２９３浮遊細胞株である、項目３４に記載の方法。
３６．
（ａ）組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）、
（ｂ）塩化ナトリウム、
（ｃ）塩化マグネシウム、
（ｄ）塩化カリウム、
（ｅ）デキストロース、
（ｆ）ポロキサマー１８８、
（ｇ）第一リン酸ナトリウム、及び
（ｈ）第二リン酸ナトリウムを含む医薬組成物であって、
前記組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）が、ＡＡＶキャプシド及びその内部にパッケージされたベクターゲノムを含み、前記ベクターゲノムが：（ｉ）ＡＡＶ ５’逆位末端（ＩＴＲ）配列；（ｉｉ）プロモーター；（ｉｉｉ）ヒトＴＰＰ１をコードするＣＬＮ２コード配列；及び（ｉｖ）ＡＡＶ ３’ＩＴＲを含む、前記医薬組成物。
３７． 塩化カルシウムをさらに含む、項目３６に記載の医薬組成物。
３８． 前記塩化ナトリウム、前記塩化マグネシウム、前記塩化カリウム、前記デキストロース、前記ポロキサマー１８８、前記第一リン酸ナトリウム、前記第二リン酸ナトリウム、及び前記塩化カルシウムが、それぞれ、無水、一水和物、二水和物、３水和物、４水和物、５水和物、６水和物、７水和物、８水和物、９水和物、または１０水和物の形態である、項目３７に記載の医薬組成物。
３９．
（ａ）前記ｒＡＡＶ、
（ｂ）約８．７７ｇ／Ｌの濃度の塩化ナトリウム、
（ｃ）約０．２４４ｇ／Ｌの濃度の塩化マグネシウム６水和物、
（ｄ）約０．２２４ｇ／Ｌの濃度の塩化カリウム、
（ｅ）約０．２０６ｇ／Ｌの濃度の塩化カルシウム二水和物、
（ｆ）約０．７９３ｇ／Ｌの濃度の無水デキストロース、
（ｇ）約０．００１％（体積／体積）の濃度のポロキサマー１８８、
（ｈ）約０．０２７８ｇ／Ｌの濃度の第一リン酸ナトリウム一水和物、及び
（ｉ）約０．１１４ｇ／Ｌの濃度の第二リン酸ナトリウム無水物を含む、項目３６～３８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
４０． 前記医薬組成物のベクターゲノム濃度（ＶＧＣ）が、約１×１０１１ＧＣ／ｍＬ、約３×１０１１ＧＣ／ｍＬ、約６×１０１１ＧＣ／ｍＬ、約１×１０１２ＧＣ／ｍＬ、約３×１０１２ＧＣ／ｍＬ、約６×１０１２ＧＣ／ｍＬ、約１×１０１３ＧＣ／ｍＬ、約２×１０１３ＧＣ／ｍＬ、約３×１０１３ＧＣ／ｍＬ、約４×１０１３ＧＣ／ｍＬ、約５×１０１３ＧＣ／ｍＬ、約６×１０１３ＧＣ／ｍＬ、約７×１０１３ＧＣ／ｍＬ、約８×１０１３ＧＣ／ｍＬ、約９×１０１３ＧＣ／ｍＬ、または約１×１０１４ＧＣ／ｍＬ、約３×１０１４ＧＣ／ｍＬ、約６×１０１４ＧＣ／ｍＬ、または約１×１０１５ＧＣ／ｍＬである、項目３６～３９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
４１． 前記医薬組成物のｐＨが、約６．０～約９．０の範囲にある、項目３６～４０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
４２． 前記医薬組成物のｐＨが約７．４である、項目４１に記載の医薬組成物。
４３． 前記医薬組成物中の前記ｒＡＡＶが、参照医薬組成物中の同じ組換えｒＡＡＶに比べて、凍結／解凍サイクルに対して、少なくとも２％、５％、７％、１０％、１２％、１５％、１７％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、１００％、２倍、３倍、５倍、１０倍、１００倍、または１０００倍安定である、項目３６～４２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
４４． 前記ｒＡＡＶの安定性が、
（ａ）ｒＡＡＶの感染力、
（ｂ）ｒＡＡＶの凝集レベル、または
（ｃ）ｒＡＡＶによって放出された遊離ＤＮＡのレベルによって決定される、項目４３に記載の医薬組成物。
４５． 前記医薬組成物が液体組成物である、項目３６～４４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
４６． 前記医薬組成物が凍結組成物である、項目３６～４４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
４７． 前記医薬組成物が、凍結乾燥組成物または再構成された凍結乾燥組成物である、項目３６～４４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
４８． 前記医薬組成物が、脳室内（ＩＣＶ）、槽内（ＩＣ）、腰部髄腔内、頭蓋内、静脈内、血管内、動脈内、筋肉内、眼内、筋肉内、皮下、または皮内投与に適した特性を有する、項目３６～４７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
４９． 前記（ｉｉｉ）のコード配列が、配列番号２の天然ヒトコード配列に対して少なくとも７０％同一であるコドン最適化ヒトＣＬＮ２である、項目３６～４８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
５０． 前記（ｉｉｉ）のコード配列が配列番号３である、項目３６～４９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
５１． 前記ｒＡＡＶキャプシドが、ＡＡＶ９またはそのバリアントである、項目３６～５０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
５２． 前記プロモーターがニワトリβアクチン（ＣＢＡ）プロモーターである、項目３６～５１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
５３． 前記プロモーターが、ＣＢＡプロモーター配列とサイトメガロウイルスエンハンサーエレメントを含むハイブリッドプロモーターである、項目３６～５２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
５４． 前記ＡＡＶ ５’ＩＴＲ及び／またはＡＡＶ ３’ＩＴＲがＡＡＶ２由来である、項目３６～５３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
５５． 前記ベクターゲノムがポリＡをさらに含む、項目３６～５４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
５６． 前記ポリＡが、合成ポリＡであるか、またはウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ＳＶ４０、ウサギβ－グロビン（ＲＧＢ）、もしくは修飾ＲＧＢ（ｍＲＧＢ）由来である、項目３６～５５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
５７． 前記ベクターゲノムがイントロンをさらに含む、項目３６～５６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
５８． 前記イントロンが、ＣＢＡ、ヒトβグロビン、ＩＶＳ２、ＳＶ４０、ｂＧＨ、αグロブリン、βグロブリン、コラーゲン、オボアルブミン、またはｐ５３由来である、項目３６～５７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
５９． 前記ベクターゲノムがエンハンサーをさらに含む、項目３６～５８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
６０． 前記エンハンサーが、ＣＭＶエンハンサー、ＲＳＶエンハンサー、ＡＰＢエンハンサー、ＡＢＰＳエンハンサー、αｍｉｃ／ｂｉｋエンハンサー、ＴＴＲエンハンサー、ｅｎ３４、ＡｐｏＥである、項目３６～５９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
６１． 前記ベクターゲノムのサイズが、約３キロベース～約５．５キロベースである、項目３６～６０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
６２． 前記ベクターゲノムのサイズが約４キロベースである、項目３６～６１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
６３． 前記ｒＡＡＶを産生することができる浮遊細胞株を浮遊培養で増殖させることを含む方法を使用して、前記ｒＡＡＶを製造する、項目３６～６２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
６４． 項目３６～６３のいずれか一項に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、前記対象におけるＣＬＮ２バッテン病の治療方法。
６５． 前記医薬組成物を治療有効量で投与する、項目６４に記載の方法。
６６． 前記対象がヒトである、項目６４～６５のいずれか一項に記載の方法。
６７． １つ以上の容器及び使用説明書を含むキットであって、前記１つ以上の容器が、項目３６～６３のいずれか一項に記載の医薬組成物を含む、前記キット。
ＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＴＰＰ１ｃｏ．ＲＢＧベクターゲノムの概略図である。ＩＴＲは、ＡＡＶ２逆位末端配列を表す。ＣＢ７は、サイトメガロウイルスエンハンサーを備えたニワトリβアクチンプロモーターを表す。ＲＢＧ ポリＡは、ウサギβグロビンポリアデニル化シグナルを表す。
ＡＡＶ．ｈＴＰＰ１ｃｏベクターの産生プラスミドのマップを示す。
ＡＡＶシスプラスミド構築物のマップを示す。ＩＴＲ：逆位末端配列；ＣＭＶ ＩＥプロモーター：サイトメガロウイルス前初期プロモーター；ＣＢプロモーター：ニワトリβ－アクチンプロモーター ニワトリβ－アクチンイントロン；ｈＣＬＮ２：ヒトＣＬＮ２ ｃＤＮＡ；ウサギグロビンポリＡ：ウサギβグロビンポリアデニル化シグナル；Ｋａｎ－ｒ：カナマイシン耐性遺伝子。
ＡＡＶトランスパッケージングプラスミド構築物のマップを示す。
アデノウイルスヘルパープラスミドのマップを示す。
ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２処理したＴＰＰ１ｍ１Ｊノックアウトマウスで生存率が増加したことを示す。
ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２処理したＴＰＰ１ｍ１Ｊノックアウトマウスの脳においてＴＰＰ１活性が増加したことを示す。ウィルコクソン検定を使用して、未処理のＴＰＰ１ｍ１Ｊノックアウトマウスに比べて、＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１。個々の値を、平均値及びＳＥＭと共に示す。
ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２処理したＴＰＰ１ｍ１Ｊノックアウトマウスの脊髄においてＴＰＰ１活性が増加したことを示す。ウィルコクソン検定を使用して、未処理のＴＰＰ１ｍ１Ｊノックアウトマウスに比べて、＊＊ｐ＜０．０１。個々の値を、平均値及びＳＥＭと共に示す。
ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２処理したＴＰＰ１ｍ１Ｊノックアウトマウスにおいてアストロサイトーシスが減少したことを示す。一元配置ＡＮＯＶＡを使用して、未処理のＴＰＰ１ｍ１Ｊノックアウトマウスに比べて、＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１。個々の値を、平均値及びＳＥＭと共に示す。
ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２処理したＴＰＰ１ｍ１Ｊノックアウトマウスにおいてミクログリア活性化が減少したことを示す。一元配置ＡＮＯＶＡを使用して、未処理のＴＰＰ１ｍ１Ｊノックアウトマウスに比べて、＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１。個々の値を、平均値及びＳＥＭと共に示す。
ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２処理したＴＰＰ１ｍ１Ｊノックアウトマウスにおいて肝ＴＰＰ１活性が増加したことを示す。ウィルコクソン検定を使用して、未処理のＴＰＰ１ｍ１Ｊノックアウトマウスに比べて、＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１。個々の値を、平均値及びＳＥＭと共に示す。
ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２処理したＴＰＰ１ｍ１Ｊノックアウトマウスにおいて血清ＴＰＰ１活性が増加したことを示す。ウィルコクソン検定を使用して、未処理のＴＰＰ１ｍ１Ｊノックアウトマウスに比べて、＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１。個々の値を、平均値及びＳＥＭと共に示す。
ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２療法が、１か月齢でのＨＤでの処理後、ノックアウト動物において生存率を増加させたことを示す。ＩＣＶの２６週間後にすべての生存動物を剖検したところ、対照とＬＤ処理ノックアウトの間に差異は観察されなかった。ＷＴ雄（黒丸）、ＷＴ雌（灰色の四角）、及びＨＤ ＫＯ雄（黒×）は、これら３群において死亡が観察されていないため、プロットに重ねて示す。ＷＴ：野生型；ＫＯ：ＴＰＰ１ｍ１Ｊノックアウト；Ｍ：雄マウス、Ｆ：雌マウス、ＬＤ：低用量（３×１０９ＧＣ／動物）；ＨＤ：高用量（３×１０１１ＧＣ／動物）。
アストロサイトーシスの正常化を示す。Ａ．脳幹。結果は、２０倍率視野あたりのアストロサイトの平均数である。「ＫＯ ＰＢＳ処理」（ＩＣＶなし）は、自然史研究（Ｗ２５５３Ａ）から得られた３か月齢の動物（発症前）である。独立マンホイットニー検定によるＰ値。ＷＴ：野生型；ＫＯ：ＴＰＰ１ｍ１Ｊノックアウト；及びＨＤ：高用量（３×１０１１ＧＣ／動物）。 アストロサイトーシスの正常化を示す。Ｂ．海馬。結果は、２０倍率視野あたりのアストロサイトの平均数である。「ＫＯ ＰＢＳ処理」（ＩＣＶなし）は、自然史研究（Ｗ２５５３Ａ）から得られた３か月齢の動物（発症前）である。独立マンホイットニー検定によるＰ値。ＷＴ：野生型；ＫＯ：ＴＰＰ１ｍ１Ｊノックアウト；及びＨＤ：高用量（３×１０１１ＧＣ／動物）。 アストロサイトーシスの正常化を示す。Ｃ．皮質。結果は、２０倍率視野あたりのアストロサイトの平均数である。「ＫＯ ＰＢＳ処理」（ＩＣＶなし）は、自然史研究（Ｗ２５５３Ａ）から得られた３か月齢の動物（発症前）である。独立マンホイットニー検定によるＰ値。ＷＴ：野生型；ＫＯ：ＴＰＰ１ｍ１Ｊノックアウト；及びＨＤ：高用量（３×１０１１ＧＣ／動物）。
生存率データを示す。すべてのビヒクル処理ＴＰＰ１ｍ１Ｊノックアウトマウスが、死亡が確認されたか、または１９週齢の前に人道的に安楽死させた一方で、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２処理した雌（３×１０１１ＧＣ／動物）の６７％とＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２処理した雄（３×１０１１ＧＣ／動物）の５７％は、計画された２３週間目のエンドポイントにおいて生存していた。ＫＯ３ｅ１１ Ｍ：ＡＡＶ９．ＣＢ７．ＨＣＬＮ２処理した雄ノックアウト（３×１０１１）；ＫＯ３ｅ１１ Ｆ：ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２処理した雌ノックアウト（３×１０１１）；ＫＯ Ｍ：ビヒクル処理した雄ノックアウト；ＫＯ Ｆ：ビヒクル処理した雌ノックアウト；ＷＴ Ｍ：野生型の雄；ＷＴ Ｆ：野生型の雌。
ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２が、ＴＰＰ１ｍ１Ｊノックアウトマウスにおいて生存率を増加させたことを示す。ＴＰＰ１ｍ１Ｊノックアウトマウスの群に、０、１．２５×１０１０、５×１０１０、２×１０１１または８．５×１０１１ＧＣ／動物の用量を投与した。ＷＴマウスの追加的な群は未処理とした（試験は進行中である）。
ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２が、ＴＰＰ１ｍ１Ｊノックアウトマウスの脳においてＴＰＰ１活性を増加させたことを示す。ＴＰＰ１ｍ１Ｊノックアウトマウスの群に、０、１．２５×１０１０、５×１０１０、２×１０１１または８．５×１０１１ＧＣ／動物の用量を投与した。ＷＴマウスの追加的な群は未処理とした。１３週齢（９週目）で動物を安楽死させ、Ａ）雄及びＢ）雌について、脳の右半球のＴＰＰ１活性を分析した。＊ｐ≦０．０５；＊＊ｐ≦０．０１。両側直接ウィルコクソン順位和検定を使用してＰ値を取得し、２群間に差異がないという帰無仮説の下に、各投与群を独立した対照群と比較した。
ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２が、ＴＰＰ１ｍ１Ｊノックアウトマウスの脊髄においてＴＰＰ１活性を増加させたことを示す。ＴＰＰ１ｍ１Ｊノックアウトマウスの群に、０、１．２５×１０１０、５×１０１０、２×１０１１または８．５×１０１１ＧＣ／動物の用量を投与した。ＷＴマウスの追加的な群は未処理とした。１３週齢（９週目）で動物を安楽死させ、脊髄（胸部）のＴＰＰ１活性を分析した。黒は雄、灰色は雌を表す。分析した試料数が限られていたため、雄と雌のデータを組み合わせた。＊ｐ≦０．０５；＊＊ｐ≦０．０１。両側直接ウィルコクソン順位和検定を使用してＰ値を取得し、２群間に差異がないという帰無仮説の下に、各投与群を独立した対照群と比較した。
ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２が、ＴＰＰ１ｍ１Ｊノックアウトマウスの肝臓においてＴＰＰ１活性を増加させたことを示す。ＴＰＰ１ｍ１Ｊノックアウトマウスの群に、０、１．２５×１０１０、５×１０１０、２×１０１１または８．５×１０１１ＧＣ／動物の用量を投与した。ＷＴマウスの追加的な群は未処理とした。１３週齢（９週目）で動物を安楽死させ、Ａ）雄及びＢ）雌について、肝臓のＴＰＰ１活性を分析した。＊ｐ≦０．０５；＊＊ｐ≦０．０１。両側直接ウィルコクソン順位和検定を使用してＰ値を取得し、２群間に差異がないという帰無仮説の下に、各投与群を独立した対照群と比較した。
ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２が、ＴＰＰ１ｍ１Ｊノックアウトマウスの血清においてＴＰＰ１活性を増加させたことを示す。ＴＰＰ１ｍ１Ｊノックアウトマウスの群に、０、１．２５×１０１０、５×１０１０、２×１０１１または８．５×１０１１ＧＣ／動物の用量を投与した。ＷＴマウスの追加的な群は未処理とした。１３週齢（９週目）で動物を安楽死させ、Ａ）雄及びＢ）雌について、血清ＴＰＰ１活性のために採血した。＊ｐ≦０．０５；＊＊ｐ≦０．０１。両側直接ウィルコクソン順位和検定を使用してＰ値を取得し、２群間に差異がないという帰無仮説の下に、各投与群を独立した対照群と比較した。
ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２が、ＴＰＰ１ｍ１Ｊノックアウトマウスのアストロサイトーシスを減少させたことを示す。ＴＰＰ１ｍ１Ｊノックアウトマウスの群に、０（群２）、１．２５×１０１０（群３）、５×１０１０（群４）、２×１０１１（群５）または８．５×１０１１ＧＣ／動物（群６）の用量を投与した。ＷＴマウスの追加的な群は未処理とした（群１）。脳の切片をＧＦＡＰで染色して、Ａ）体性感覚バレル皮質（Ｓ１ＢＦ）及びＢ）視床（後外側腹側核［ＶＰＬ］及び後内側腹側核［ＶＰＭ］）のアストロサイトの免疫蛍光の相対レベルを測定した。＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１、＊＊＊ｐ≦０．００１。
ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２が、ＴＰＰ１ｍ１Ｊノックアウトマウスのミクログリア活性化を減少させたことを示す。ＴＰＰ１ｍ１Ｊノックアウトマウスの群に、０（群２）、１．２５×１０１０（群３）、５×１０１０（群４）、２×１０１１（群５）または８．５×１０１１ＧＣ／動物（群６）の用量を投与した。ＷＴマウスの追加的な群は未処理とした（群１）。脳の切片をＣＤ６８で染色して、Ａ）体性感覚バレル皮質（Ｓ１ＢＦ）及びＢ）視床（後外側腹側核［ＶＰＬ］及び後内側腹側核［ＶＰＭ］）のミクログリアの免疫蛍光の相対レベルを測定した。
Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの血清におけるＴＰＰ１活性を示す。Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの群に、０、１．２５×１０１０、５×１０１０、２×１０１１または８．５×１０１１ＧＣ／動物の用量を投与した。投与の４週間後または１３週間後に動物を安楽死させ、Ａ）雄及びＢ）雌について、血清ＴＰＰ１活性のために採血した。時間一致対照群に対して、＊ｐ≦０．０５；＊＊ｐ≦０．０１。両側直接ウィルコクソン順位和検定を使用してＰ値を取得し、２群間に差異がないという帰無仮説の下に、各投与群を独立した対照群と比較した。
Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの脳におけるＴＰＰ１活性を示す。Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの群に、０、１．２５×１０１０、５×１０１０、２×１０１１または８．５×１０１１ＧＣ／動物の用量を投与した。投与の４週間後または１３週間後に動物を安楽死させ、Ａ）雄及びＢ）雌について、ＴＰＰ１活性のために脳を採取した。時間一致対照群に対して、＊ｐ≦０．０５；＊＊ｐ≦０．０１。両側直接ウィルコクソン順位和検定を使用してＰ値を取得し、２群間に差異がないという帰無仮説の下に、各投与群を独立した対照群と比較した。
Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの肝臓におけるＴＰＰ１活性を示す。Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの群に、０、１．２５×１０１０、５×１０１０、２×１０１１または８．５×１０１１ＧＣ／動物の用量を投与した。投与の４週間後または１３週間後に動物を安楽死させ、Ａ）雄及びＢ）雌について、ＴＰＰ１活性のために肝臓を採取した。時間一致対照群に対して、＊ｐ≦０．０５；＊＊ｐ≦０．０１。両側直接ウィルコクソン順位和検定を使用してＰ値を取得し、２群間に差異がないという帰無仮説の下に、各投与群を独立した対照群と比較した。
血清中のＴＰＰ１活性及び濃度のベースラインからの差異を示す。カニクイザルの群（ｎ＝３／用量）に、０、３．４×１０１１、３．２×１０１２または２．９×１０１３ゲノムコピー（ＧＣ）／動物の用量で、大槽（ＣＭ）への注射を介してＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２を投与した（用量１ｍＬ）。（Ａ）ＴＰＰ１活性及び（Ｂ）ＴＰＰ１濃度の分析のために、投与前（－１日目または１日目）ならびに４、８、１１、１５、１８、２２、２５、及び２９日目に血液試料を採取した。ベースラインからの差異の平均値を、平均標準誤差と共に示す。
ＣＳＦ中のＴＰＰ１活性及び濃度のベースラインからの差異を示す。カニクイザルの群（ｎ＝３／用量）に、０、３．４×１０１１、３．２×１０１２または２．９×１０１３ゲノムコピー（ＧＣ）／動物の用量で、大槽（ＣＭ）への注射を介してＡＡＶ９．ＣＢ７．ＨＣＬＮ２を投与した（用量１ｍＬ）。（Ａ）ＴＰＰ１活性及び（Ｂ）ＴＰＰ１濃度の分析のために、投与前（－１日目または１日目）ならびに４、８、１１、１５、１８、２２、２５、及び２９日目にＣＳＦ試料を採取した。ベースラインからの差異の平均値を、平均標準誤差と共に示す。
脳領域である前頭皮質におけるＴＰＰ１濃度を示す。カニクイザルの群（ｎ＝３／用量）に、０、３．４×１０１１、３．２×１０１２または２．９×１０１３ゲノムコピー（ＧＣ）／動物の用量で、大槽（ＣＭ）への注射を介してＡＡＶ９．ＣＢ７．ＨＣＬＮ２を投与した（用量１ｍＬ）。２９日目の剖検で、前頭皮質の深部（＞３ｍｍ；Ｄ）または表層（深さ＜３ｍｍ；Ｓ）領域から２つの組織パンチを採取した。個々の値を、平均値及び標準偏差と共に示す。 脳領域である線条体におけるＴＰＰ１濃度を示す。カニクイザルの群（ｎ＝３／用量）に、０、３．４×１０１１、３．２×１０１２または２．９×１０１３ゲノムコピー（ＧＣ）／動物の用量で、大槽（ＣＭ）への注射を介してＡＡＶ９．ＣＢ７．ＨＣＬＮ２を投与した（用量１ｍＬ）。２９日目の剖検で線条体の深部（＞３ｍｍ；Ｄ）または表層（深さ＜３ｍｍ；Ｓ）領域から２つの組織パンチを採取した。個々の値を、平均値及び標準偏差と共に示す。 脳領域である視床におけるＴＰＰ１濃度を示す。カニクイザルの群（ｎ＝３／用量）に、０、３．４×１０１１、３．２×１０１２または２．９×１０１３ゲノムコピー（ＧＣ）／動物の用量で、大槽（ＣＭ）への注射を介してＡＡＶ９．ＣＢ７．ＨＣＬＮ２を投与した（用量１ｍＬ）。２９日目の剖検で視床の深部（＞３ｍｍ；Ｄ）または表層（深さ＜３ｍｍ；Ｓ）領域から２つの組織パンチを採取した。個々の値を、平均値及び標準偏差と共に示す。 脳領域である中脳におけるＴＰＰ１濃度を示す。カニクイザルの群（ｎ＝３／用量）に、０、３．４×１０１１、３．２×１０１２または２．９×１０１３ゲノムコピー（ＧＣ）／動物の用量で、大槽（ＣＭ）への注射を介してＡＡＶ９．ＣＢ７．ＨＣＬＮ２を投与した（用量１ｍＬ）。２９日目の剖検で中脳の深部（＞３ｍｍ；Ｄ）または表層（深さ＜３ｍｍ；Ｓ）領域から２つの組織パンチを採取した。個々の値を、平均値及び標準偏差と共に示す。
脳領域である（Ａ）後頭皮質、（Ｂ）延髄及び（Ｃ）小脳におけるＴＰＰ１濃度を示す。カニクイザルの群（ｎ＝３／用量）に、０、３．４×１０１１、３．２×１０１２または２．９×１０１３ゲノムコピー（ＧＣ）／動物の用量で、大槽（ＣＭ）への注射を介してＡＡＶ９．ＣＢ７．ＨＣＬＮ２を投与した（用量１ｍＬ）。２９日目の剖検で、（Ａ）後頭皮質、（Ｂ）延髄及び（Ｃ）小脳の深部（＞３ｍｍ；Ｄ）または表層（深さ＜３ｍｍ；Ｓ）領域から２つの組織パンチを採取した。個々の値を、平均値及び標準偏差と共に示す。
脊髄におけるＴＰＰ１濃度を示す。カニクイザルの群（ｎ＝３／用量）に、０、３．４×１０１１、３．２×１０１２または２．９×１０１３ゲノムコピー（ＧＣ）／動物の用量で、大槽（ＣＭ）への注射を介してＡＡＶ９．ＣＢ７．ＨＣＬＮ２を投与した（用量１ｍＬ）。２９日目の剖検時に、（Ａ）ＴＰＰ１活性及び（Ｂ）ＴＰＰ１濃度のために、脊髄の頸部、胸部、または腰部のいずれかの領域から２つの組織パンチを採取した。個々の値を、平均値及び標準偏差と共に示す。
Ｎａｌｇｅｎｅ ＨＤＰＥ ＢＤＳボトルの２つの異なる充填量で測定した温度特性を示す。
－８０℃と室温または－２０℃との間でサイクルさせた２ｍＬクライオバイアルの０．６ｍＬ充填について記録した温度特性を示す。
高速凍結／高速解凍（ＦＦ／ＦＴ）温度特性を示す。
高速凍結／高速解凍（ＦＦ／ＦＴ）温度特性（左軸）ならびにシェルフ温度及びプローブ温度の変化速度（右軸）を示す。
高速凍結／低速解凍（ＦＦ／ＳＴ）温度特性を示す。
低速凍結／高速解凍（ＳＦ／ＦＴ）の温度特性を示す。
低速凍結／低速解凍（ＳＦ／ＳＴ）温度特性を示す。
低速凍結／低速解凍（ＳＦ／ＳＴ）の温度特性（左軸）ならびにシェルフ温度及びプローブ温度の変化速度（右軸）を示す。
髄腔内緩衝液中のＡＡＶ９．ＣＢ７．ＨＣＬＮ２のＳＥＣ結果特性の拡大図を示す。
ＡＡＶ９．ＣＢ７．ＨＣＬＮ２凍結融解試料のＤＬＳ直径の結果を示す。
ＡＡＶ９．ＣＢ７．ＨＣＬＮ２修飾エリオットのＢ製剤緩衝液の低温ＤＳＣサーモグラムを示す。
バルク原薬の製造の流れ図である（上流）。
バルク原薬の製造の流れ図である（下流）。
本明細書において、バッテン病を治療するための方法及び組成物を提供する。そのような組成物は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）、ＡＡＶキャプシドを含む当該ｒＡＡＶ、及びその内部にパッケージされたベクターゲノムを含み、当該ベクターゲノムは、（ａ）ＡＡＶ ５’逆位末端（ＩＴＲ）配列；（ｂ）プロモーター；（ｃ）ヒトＴＰＰ１をコードするＣＬＮ２コード配列；（ｄ）ＡＡＶ ３’ＩＴＲを含む（Ｉ節を参照のこと）。本明細書で提供するｒＡＡＶ及び関連する医薬組成物を使用してバッテン病を治療する方法もまた、本明細書で提供する（ＩＩ節を参照のこと）。より具体的には、本明細書において、本明細書に記載のｒＡＡＶを、それを必要とする対象に複数の経路で投与することを含む、バッテン病の治療方法を提供する（ＩＩ節を参照のこと）。本明細書ではまた、本明細書に記載のｒＡＡＶを、浮遊細胞培養を使用して製造する方法も提供する（ＩＩＩ節を参照のこと）。
Ｉ． 組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）
特定の実施形態では、本明細書において提供するＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２を、以下の実施形態に記載する。本明細書に記載の方法及び組成物は、ＮＣＬを治療するために、それを必要とする対象にヒトトリペプチジルペプチダーゼ１（ＴＰＰ１）タンパク質をコードするＣＬＮ２核酸配列を送達するための組成物及び方法を含む。一実施形態では、そのような組成物は、配列番号３に示すような、ＣＬＮ２コード配列のコドン最適化を含む。生成物の効力を高め、したがって、より低い用量の試薬を使用し得ることから、安全性が高まることは望ましい。本明細書には、配列番号２に示すように、天然のＣＬＮ２コード配列を含む組成物も包含される。
ＣＬＮ２としても知られるＴＰＰ１遺伝子は、トリペプチジルペプチダーゼＩ活性を有するリソソームセリンプロテアーゼであるトリペプチジルペプチダーゼ１をコードする。これは、リソソームプロテイナーゼによって生成される分解産物からトリペプチドを生成し、非置換のＮ末端を有する基質を必要とする、非特異的なリソソームペプチダーゼとして作用するとも考えられている。本明細書中で使用する場合、用語「ＴＰＰ１」、「ＣＬＮ２」、及び「トリペプチジルペプチダーゼ１」は、コード配列を指す場合に同じ意味で用いられる。ヒトトリペプチジルペプチダーゼ１をコードする天然の核酸配列は、ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿０００３９１．３で報告され、本明細書中では配列番号２に再現されている。ヒトトリペプチジルペプチダーゼ１の２つのアイソフォームは、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ受託番号Ｏ１４７７３－１及びＯ１４７７３－２として報告されている（本明細書中では配列番号１及び４として再現されている）。ＣＬＮ２遺伝子の変異は、乳児期遅発型ＮＣＬ（ＬＩＮＣＬ）病に関連している。
特定の実施形態では、ＡＡＶ．ｈＴＰＰ１ｃｏベクターを、ＷＯ２０１８２０９２０５Ａ１に記載されるように設計してもよい。特定の実施形態では、ヒト（ｈ）ＴＰＰ１エンドコーディング最適化ｃＤＮＡを、最適なコドン使用法のためにカスタム設計し、合成してもよい。特定の実施形態では、次いで、配列番号３として再現されるｈＴＰＰ１ｃｏ ｃＤＮＡを導入遺伝子発現カセット内に配置してもよく、これは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期エンハンサー（Ｃ４）とニワトリβアクチンプロモーターの間のハイブリッドであるＣＢ７プロモーターによって駆動されたが、このプロモーターからの転写は、ニワトリβアクチンイントロン（ＣＩ）の存在によって増強される（図１Ａ及び１Ｂ）。特定の実施形態では、発現カセットのポリＡシグナルは、ウサギβグロビン（ＲＢＧ）ポリＡである。
特定の実施形態では、ＡＡＶ．ｈＴＰＰ１ｃｏベクターの６８４１ｂｐ産生プラスミド（ＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＴＰＰ１ｃｏ．ＲＢＧ）を、本明細書に記載のｈＴＰＰ１ｃｏ発現カセットと、それに隣接するＡＡＶ２由来ＩＴＲ及び選択マーカーとしてのアンピシリン耐性を用いて構築してもよい（図１Ｂ）。特定の実施形態では、カナマイシン耐性を有する同様のＡＡＶ．ｈＴＰＰ１ｃｏ産生プラスミドもまた、構築してもよい。特定の実施形態では、両方のプラスミドに由来するベクターは、本明細書に記載のｈＴＰＰ１ｃｏ発現カセットと、それに隣接するＡＡＶ２由来ＩＴＲを有する一本鎖ＤＮＡゲノムであってもよい。
特定の実施形態では、ＡＡＶ．ｈＴＰＰ１ｃｏベクターを、三重トランスフェクションによって作製してもよく、０．００１％のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８（ＰＦ６８）を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）からなる賦形剤中に製剤化してもよい。例えば、Ｍｉｚｕｋａｍｉ，Ｈｉｒｏａｋｉ，ｅｔ ａｌ．，Ａ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｆｏｒ ＡＡＶ ｖｅｃｔｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｄｉｓｓ． Ｄｉ－ｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１９９８を参照のこと。特定の実施形態では、産生されたベクターのゲノム力価を、ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を介して測定してもよい。例えば、Ｍ．Ｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ，Ｈｕ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１４ Ａｐｒ；２５（２）：１１５－２５． ｄｏｉ： １０．１０８９／ｈｇｔｂ．２０１３．１３１． Ｅｐｕｂ ２０１４ Ｆｅｂ １４を参照のこと。
本明細書において、例示的なＡＡＶ．ｈＴＰＰ１ｃｏベクターを記載し、これは、本明細書中ではＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２と呼ばれることもある。これらの用語は同じ意味で用いられる。さらに、一実施形態では、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２ベクターが言及される場合、本明細書に記載するような成分を利用する代替の実施形態が企図される。
本発明の特定の実施形態では、対象は、神経セロイドリポフスチン症（ＮＣＬ）を有し、本発明の成分、組成物、及び方法は、それを治療するように設計される。本明細書中で使用する場合、本明細書中で使用する用語「対象」とは、ヒト、獣医動物または家畜、飼育動物またはペット、及び臨床研究に通常使用される動物を含む哺乳動物を意味する。一実施形態では、これらの方法及び組成物の対象はヒトである。さらに他の適切な対象として、限定されないが、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、非ヒト霊長類などが挙げられる。本明細書中で使用する場合、用語「対象」は、「患者」と同じ意味で用いられる。
神経セロイドリポフスチン症（ＮＣＬ）は、進行性の知的能力及び運動能力の悪化、発作、及び早期死亡を特徴とする遺伝性の神経変性リソソーム蓄積症の一群である。視力喪失はほとんどの形態の特徴である。臨床表現型は、伝統的に、乳児期、乳児期遅発型、若年期、成人期、及び北部てんかん（精神遅滞を伴う進行性てんかん［ＥＰＭＲ］としても知られる）の臨床的特徴の発症年齢及び出現順序に従って特徴づけられている。しかしながら、そこには遺伝学的及び対立遺伝子的な異質性が存在し；原因遺伝子と発症年齢の両方を考慮に入れるために、新しい命名法及び分類システムが提唱され、開発されており；例えば、古典的乳児期遅発型ＣＬＮ２疾患である。最初の症状は通常、２歳～４歳の間に現れ、通常はてんかんから始まり、その後、発達段階の退行、ミオクローヌス性運動失調、及び錐体路徴候が続く。視覚障害は通常、４～６歳で現れ、急速に進行して明暗の認識のみとなる。平均余命は６歳～１０代前半までの範囲である。本明細書中で使用する場合、用語「バッテン病」は、ＣＬＮ２疾患を指すために使用され、これは「ＮＣＬ」と同じ意味で用いられる。
一態様では、ヒト（ｈ）ＴＰＰ１をコードする、コドン最適化された改変型核酸配列を提供する。特定の実施形態では、改変型ヒト（ｈ）ＴＰＰ１ ｃＤＮＡを、本明細書中に（配列番号３として）提供し、この配列は、天然ＴＰＰ１配列（配列番号２）と比較して翻訳が最大化されるように設計された。好ましくは、コドン最適化ＴＰＰ１コード配列は、完全長の天然ＴＰＰ１コード配列（配列番号２）に対して約８０％未満の同一性、好ましくは約７５％以下の同一性を有する。一実施形態では、コドン最適化ＴＰＰ１コード配列は、配列番号２の天然ＴＰＰ１コード配列に対して約７４％の同一性を有する。一実施形態では、コドン最適化ＴＰＰ１コード配列は、ＡＡＶ（例えば、ｒＡＡＶ）を介した送達後の天然ＴＰＰ１に比べて高い翻訳速度を特徴とする。一実施形態では、コドン最適化ＴＰＰ１コード配列は、配列番号２の完全長天然ＴＰＰ１コード配列と、約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、７０％、６９％、６８％、６７％、６６％、６５％、６４％、６３％、６２％、６１％未満またはそれ未満の同一性を共有する。一実施形態では、コドン最適化核酸配列は、配列番号３のバリアントである。別の実施形態では、コドン最適化核酸配列は、配列番号３と、約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、７０％、６９％、６８％、６７％、６６％、６５％、６４％、６３％、６２％、６１％またはそれ以上の同一性を共有する。一実施形態では、コドン最適化核酸配列は、配列番号３である。別の実施形態では、核酸配列は、ヒトでの発現のためにコドン最適化されている。他の実施形態では、異なるＴＰＰ１コード配列を選択する。
核酸配列に関しての用語「同一性の割合（％）」、「配列同一性」、「配列同一性の割合」、または「～％同一である」は、一致するようにアラインする場合の２つの配列内の同一の残基を指す。配列同一性比較の長さは、ゲノムの全長にわたっていてもよく、遺伝子コード配列の全長、または少なくとも約５００～５０００ヌクレオチドの断片であることが望ましい。しかしながら、例えば、少なくとも約９ヌクレオチド、通常は少なくとも約２０～２４ヌクレオチド、少なくとも約２８～３２ヌクレオチド、少なくとも約３６またはそれ以上のヌクレオチドのより小さな断片間の同一性もまた、望ましい場合がある。
タンパク質、ポリペプチド、約３２アミノ酸、約３３０アミノ酸、もしくはそのペプチド断片の全長にわたるアミノ酸配列または対応する核酸配列コード配列について、同一性の割合を容易に決定し得る。適切なアミノ酸断片は、少なくとも約８アミノ酸の長さであってもよく、最大約７００アミノ酸であり得る。一般的に、２つの異なる配列間の「同一性」、「相同性」、または「類似性」を言及する場合、「同一性」、「相同性」または「類似性」は、「アラインした」配列を参照して決定される。「アラインした」配列または「アラインメント」は、複数の核酸配列またはタンパク質（アミノ酸）配列を指し、参照配列と比較して、欠失または追加の塩基またはアミノ酸の補正を含むことが多い。
同一性は、配列のアラインメントを準備することによって、及び当技術分野で公知であるかまたは市販の様々なアルゴリズム及び／またはコンピュータプログラムを使用することによって決定することができる［例えば、ＢＬＡＳＴ、ＥｘＰＡＳｙ；ＣｌｕｓｔａｌＯ；ＦＡＳＴＡ；例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用して］。アラインメントは、公的に利用可能な、または市販の様々な多重配列アラインメントプログラムのいずれかを使用して実行する。例えば、「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ」、「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ」、「ＭＡＰ」、「ＰＩＭＡ」、「ＭＳＡ」、「ＢＬＯＣＫＭＡＫＥＲ」、「ＭＥＭＥ」、及び「Ｍａｔｃｈ－Ｂｏｘ」プログラムなどの配列アラインメントプログラムを、アミノ酸配列に対して利用することができる。一般的に、これらのプログラムはいずれもデフォルト設定で使用するが、当業者は必要に応じてこれらの設定を変更することができる。あるいは、当業者は、参照されるアルゴリズム及びプログラムによって提供されるレベルと少なくとも同じレベルの同一性またはアラインメントを提供する別のアルゴリズムまたはコンピュータプログラムを利用することができる。例えば、Ｊ．Ｄ．Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，“Ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ”，２７（１３）：２６８２－２６９０（１９９９）を参照のこと。
多重配列アラインメントプログラムは、核酸配列にも利用することができる。そのようなプログラムの例として、「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ」、「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ」、「ＣＡＰ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｓｓｅｍｂｌｙ」、「ＢＬＡＳＴ」、「ＭＡＰ」、及び「ＭＥＭＥ」などが挙げられ、これらはインターネット上のＷｅｂサーバーからアクセスすることができる。そのようなプログラムの他の供給元は、当業者に公知である。あるいは、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩユーティリティも使用される。上記のプログラムに含まれるアルゴリズムを含む、ヌクレオチド配列同一性を測定するために使用することができる当技術分野で公知の多くのアルゴリズムもまた、存在する。別の例として、ＧＣＧバージョン６．１のプログラムであるＦａｓｔａ（商標）を使用してポリヌクレオチド配列を比較することができる。ＦＡＳＴＡ（商標）は、クエリー配列と検索配列と間の最適なオーバーラップ領域のアラインメント及び配列同一性の割合を提供する。例えば、核酸配列間の配列同一性の割合は、参照により本明細書に援用されるＧＣＧ Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．１に提供されるように、Ｆａｓｔａ（商標）を、そのデフォルトパラメーター（ワードサイズ６、及びスコアリングマトリックス用のＮＯＰＡＭ因子）で使用して、決定することができる。
コドン最適化コード領域は、様々な異なる方法によって設計することができる。この最適化は、オンラインで利用可能な方法（例えば、ＧｅｎｅＡｒｔ）、公開されている方法、またはコドン最適化サービスを提供する会社、例えばＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ）を使用して実行してもよい。１つのコドン最適化方法は、例えば、その全体が参照により本明細書に援用される米国国際特許公開第ＷＯ２０１５／０１２９２４号に記載されている。例えば、米国特許公開第２０１４／００３２１８６号及び米国特許公開第２００６／０１３６１８４号も参照されたい。好適には、製品のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の全長を改変する。しかしながら、いくつかの実施形態では、ＯＲＦの断片のみを改変してもよい。これらの方法の１つを使用することにより、任意の所与のポリペプチド配列に出現頻度を適用し、ポリペプチドをコードするコドン最適化コード領域の核酸断片を生成することができる。
コドンへの実際の改変を実行するため、または本明細書に記載するように設計されたコドン最適化コード領域を合成するために、いくつかのオプションが利用可能である。そのような改変または合成は、当業者に周知の標準的かつ日常的な分子生物学的操作を使用して実施することができる。１つのアプローチでは、それぞれの長さが８０～９０ヌクレオチドであり、所望の配列の長さに及ぶ一連の相補的オリゴヌクレオチドペアを、標準的な方法によって合成する。これらのオリゴヌクレオチドペアは、アニーリング時に、付着末端を含む８０～９０塩基対の二本鎖断片を形成するように合成され、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の塩基が、ペアの他方のオリゴヌクレオチドに相補的な領域をはみ出して延長されるように、ペアの各オリゴヌクレオチドが合成される。各オリゴヌクレオチドペアの一本鎖末端は、別のオリゴヌクレオチドペアの一本鎖末端とアニーリングするように設計する。オリゴヌクレオチドペアをアニーリングさせ、次いでこれらの二本鎖断片のおよそ５～６個を一本鎖付着末端を介して一緒にアニーリングさせ、次いでそれらを一緒にライゲーションし、標準的な細菌クローニングベクター、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，カールズバッド，カリフォルニアから入手可能なＴＯＰＯ（登録商標）ベクターにクローニングする。次いで、構築物を標準的な方法によって配列決定する。８０～９０塩基対の断片が一緒に連結されて出来た５～６断片、すなわち約５００塩基対の断片からなるこれらの構築物のいくつかを、所望の配列全体が一連のプラスミド構築物で表されるように調製する。次いで、これらのプラスミドのインサートを適切な制限酵素で切断し、一緒にライゲーションして最終的な構築物を形成する。次いで、最終的な構築物を標準的な細菌クローニングベクターにクローニングし、配列決定する。当業者であれば、追加的な方法はすぐに明らかであろう。さらに、遺伝子合成は商業的に容易に利用可能である。
「改変型」とは、例えば、非ウイルス送達系（例えば、ＲＮＡベースの系、裸のＤＮＡなど）を生成するために、またはパッケージング宿主細胞でウイルスベクターを生成するために、及び／または対象内の宿主細胞に送達するために、本明細書に記載のＴＰＰ１タンパク質をコードする核酸配列を集合させ、エレメント上に保有するＴＰＰ１配列を宿主細胞へ移行させる任意の適切な遺伝子エレメント、例えば、裸のＤＮＡ、ファージ、トランスポゾン、コスミド、エピソームなどに配置することを意味する。一実施形態では、遺伝的エレメントはプラスミドである。そのような改変型構築物を作製するために使用する方法は、核酸操作の当業者に公知であり、方法には、遺伝子工学、組換え工学、及び合成技術が含まれる。例えば、Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ （２０１２）を参照のこと。
本明細書中で使用する場合、用語「宿主細胞」とは、組換えＡＡＶを産生プラスミドから産生するパッケージング細胞株を指し得る。あるいは、用語「宿主細胞」とは、コード配列を発現させることが望まれる任意の標的細胞を指し得る。したがって、「宿主細胞」は、任意の手段、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、マイクロインジェクション、形質転換、ウイルス感染、トランスフェクション、リポソーム送達、膜融合技術、高速ＤＮＡコーティングペレット、ウイルス感染及びプロトプラスト融合によって細胞に導入された外来性または異種ＤＮＡを含む原核生物細胞または真核生物細胞を指す。本明細書の特定の実施形態では、用語「宿主細胞」は、ウイルスベクターまたは組換えウイルスを生成し、パッケージングするために使用する細胞を指す。本明細書の他の実施形態では、用語「宿主細胞」は、本明細書に記載の組成物をｉｎ ｖｉｔｒｏ評価するための様々な哺乳動物種のＣＮＳ細胞の培養物を指す。さらに他の実施形態では、用語「宿主細胞」は、バッテン病についてｉｎ ｖｉｖｏで治療中の対象の脳細胞を指すことを意図している。そのような宿主細胞として、上衣、すなわち脳室系の上皮内層を含む、ＣＮＳの上皮細胞が挙げられる。他の宿主細胞として、ニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、及びミクログリアが挙げられる。
本明細書中で使用する場合、用語「治療」または「治療すること」とは、バッテン病の１つ以上の症状を改善することを目的として、本明細書に記載の１つ以上の化合物または組成物を対象に投与することを包含するものと定義される。したがって、「治療」は、所与の対象における、神経セロイドリポフスチン症（ＮＣＬ）の発症もしくは進行の低減、疾患の予防、疾患症状の重症度の軽減、または失明の進行を含むそれらの進行の遅延、疾患症状の除去、疾患の発症の遅延、または疾患の進行もしくは治療の有効性のモニタリングのうちの１つ以上を含み得る。
一実施形態では、ＴＰＰ１をコードする核酸配列は、それに共有結合したタグポリペプチドをコードする核酸をさらに含む。タグポリペプチドは、限定されないが、ｍｙｃタグポリペプチド、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼタグポリペプチド、緑色蛍光タンパク質タグポリペプチド、ｍｙｃ－ピルビン酸キナーゼタグポリペプチド、Ｈｉｓ６タグポリペプチド、インフルエンザウイルス血球凝集素タグポリペプチド、ｆｌａｇタグポリペプチド、及びマルトース結合タンパク質タグポリペプチドを含む、既知の「エピトープタグ」から選択してもよい。
別の態様では、ＴＰＰ１をコードする核酸配列を含む発現カセットを提供する。一実施形態では、配列は、コドン最適化配列である。別の実施形態では、コドン最適化された核酸配列は、ヒトＴＰＰ１をコードする配列番号３である。
本明細書中で使用する場合、「発現カセット」とは、ＴＰＰ１タンパク質のコード配列、プロモーターを含み、それに対する他の調節配列を含み得る核酸分子を指し、このカセットを、ウイルスベクター（例えば、ウイルス粒子）のキャプシドにパッケージングしてもよい。一般的には、ウイルスベクターを生成するためのそのような発現カセットは、ウイルスゲノムのパッケージングシグナル及び本明細書に記載の配列などの他の発現調節配列に隣接する、本明細書に記載のＣＬＮ２配列を含む。例えば、ＡＡＶウイルスベクターの場合、パッケージングシグナルは、５’逆位末端配列（ＩＴＲ）と３’ＩＴＲである。ＡＡＶキャプシドにパッケージする場合、発現カセットと組み合わせたＩＴＲは、本明細書では「組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ゲノム」または「ベクターゲノム」と呼ばれ得る。一実施形態では、発現カセットは、ＴＰＰ１タンパク質をコードするコドン最適化核酸配列を含む。一実施形態では、カセットは、宿主細胞においてＴＰＰ１をコードするコドン最適化核酸配列の発現を指示する発現調節配列と作動可能に関連するコドン最適化ＣＬＮ２を提供する。
別の実施形態では、ＡＡＶベクターで使用するための発現カセットを提供する。その実施形態では、ＡＡＶ発現カセットは、少なくとも１つのＡＡＶ逆位末端（ＩＴＲ）配列を含む。別の実施形態では、発現カセットは、５’ＩＴＲ配列及び３’ＩＴＲ配列を含む。一実施形態では、５’及び３’ＩＴＲは、ＴＰＰ１をコードするコドン最適化核酸配列に隣接し、場合により、宿主細胞においてＴＰＰ１をコードするコドン最適化核酸配列の発現を指示する追加の配列を含む。したがって、本明細書に記載のように、ＡＡＶ発現カセットは、その５’末端に５’ＡＡＶ逆位末端配列（ＩＴＲ）が隣接し、その３’末端に３’ＡＡＶ ＩＴＲが隣接する上記の発現カセットを表すことを意味する。したがって、このｒＡＡＶゲノムは、発現カセットをＡＡＶウイルス粒子、すなわちＡＡＶ ５’及び３’ＩＴＲにパッケージングするために必要な最小限の配列を含む。ＡＡＶ ＩＴＲを、本明細書に記載のような任意のＡＡＶのＩＴＲ配列から取得してもよい。これらのＩＴＲは、得られる組換えＡＡＶで使用されるキャプシドと同じＡＡＶ起源のＩＴＲであるか、または異なるＡＡＶ起源の（ＡＡＶシュードタイプを生成するための）ＩＴＲであってもよい。一実施形態では、簡便性のために、及び規制当局の承認を迅速化するために、ＡＡＶ２由来のＩＴＲ配列またはその欠失バージョン（ΔＩＴＲ）を使用する。しかしながら、他のＡＡＶ供給源由来のＩＴＲを選択してもよい。ＩＴＲの供給源がＡＡＶ２に由来し、ＡＡＶキャプシドが別のＡＡＶ供給源に由来する場合、得られるベクターをシュードタイプと呼称してもよい。通常、ＡＡＶベクターゲノムは、ＡＡＶ ５’ＩＴＲ、ＴＰＰ１コード配列及び任意の調節配列、ならびにＡＡＶ ３’ＩＴＲを含む。しかしながら、これらのエレメントの他の構成も適切である場合がある。Ｄ配列及び末端解離部位（ｔｒｓ）を欠失させたΔＩＴＲと呼ばれる５’ＩＴＲの短縮版が記載されている。他の実施形態では、完全長ＡＡＶ５’及び３’ＩＴＲを使用する。次いで、各ｒＡＡＶゲノムを産生プラスミドに導入することができる。
本明細書中で使用する場合、用語「調節配列」、「転写調節配列」または「発現調節配列」とは、イニシエーター配列、エンハンサー配列、及びプロモーター配列などのＤＮＡ配列を指し、これらは、それらが作動可能に連結されている、タンパク質をコードする核酸配列の転写を、誘導、抑制、または調節する。
本明細書中で使用する場合、用語「作動可能に連結した」または「作動可能に関連する」は、転写及び発現を調節するための、ＴＰＰ１をコードする核酸配列と連続する発現調節配列及び／またはトランスまたは遠隔で作用する発現調節配列の両方を指す。
一態様では、本明細書に記載の発現カセットのいずれかを含むベクターを提供する。本明細書に記載するように、そのようなベクターは、様々な起源のプラスミドであり得、本明細書にさらに記載するように、組換え型複製欠損ウイルスの生成のための特定の実施形態において有用である。
本明細書中で使用する「ベクター」とは、その内部に外来性または異種または改変型核酸導入遺伝子を挿入し得、次いで適切な宿主細胞に導入することができる核酸分子である。ベクターは、好ましくは、１つ以上の複製起点、及び組換えＤＮＡを挿入することができる１つ以上の部位を有する。ベクターは、多くの場合、ベクターを含まない細胞からベクターを含む細胞を選択することができる手段を有しており、例えば、ベクターは薬剤耐性遺伝子をコードしている。一般的なベクターとして、プラスミド、ウイルスゲノム、及び（主に酵母と細菌において）「人工染色体」が挙げられる。特定のプラスミドを本明細書に記載する。
一実施形態では、ベクターは、例えば、ミセル、リポソーム、陽イオン性脂質－核酸組成物、ポリ－グリカン組成物及び他のポリマー、脂質及び／またはコレステロール系核酸複合体、及び本明細書に記載のような他の構築物を含む、様々な組成物及びナノ粒子と結合させた、記載の発現カセットを含む非ウイルス性プラスミド、例えば、「裸のＤＮＡ」、「裸のプラスミドＤＮＡ」、ＲＮＡ、及びｍＲＮＡである。例えば、Ｘ．Ｓｕ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，２０１１，８（３），ｐｐ７７４－７８７；ｗｅｂ公開：Ｍａｒｃｈ ２１，２０１１；ＷＯ２０１３／１８２６８３、ＷＯ２０１０／０５３５７２及びＷＯ２０１２／１７０９３０を参照のこと（これらはすべて、参照により本明細書に援用される）。そのような非ウイルス性ＴＰＰ１ベクターを、本明細書に記載の経路により投与してもよい。ウイルスベクター、または非ウイルスベクターを、遺伝子導入及び遺伝子治療の用途で使用するために、生理学的に許容される担体と共に製剤化することができる。
別の実施形態では、ベクターは、本明細書に記載の発現カセットを含むウイルスベクターである。「ウイルスベクター」は、外来性または異種のＣＬＮ２核酸導入遺伝子を有する複製欠損ウイルスとして定義される。一実施形態では、本明細書に記載の発現カセットを、薬物送達またはウイルスベクターの産生に使用されるプラスミド上に設計してもよい。適切なウイルスベクターは、好ましくは複製欠損型であり、脳細胞を標的とするベクターの中から選択される。ウイルスベクターは、アデノウイルス；ヘルペスウイルス；レンチウイルス；レトロウイルス；パルボウイルスなどを含むがこれらに限定されない遺伝子治療に適した任意のウイルスを含み得る。しかしながら、理解を容易にするために、アデノ随伴ウイルスを例示的なウイルスベクターとして本明細書中で参照する。
「複製欠損ウイルス」または「ウイルスベクター」とは、目的の遺伝子を含む発現カセットがウイルスキャプシドまたはエンベロープにパッケージングされた合成または組換え型のウイルス粒子を指し、同様にウイルスキャプシドまたはエンベロープ内にパッケージングされる任意のウイルスゲノム配列は、複製欠損型であり；すなわち、それらは、子孫ビリオンを生成することはできないが、標的細胞に感染する能力を保持している。一実施形態では、ウイルスベクターのゲノムは、複製に必要な酵素をコードする遺伝子を含まない（人工ゲノムの増幅及びパッケージングに必要なシグナルに隣接する目的の導入遺伝子のみを含む「ガットレス」であるようにこのゲノムを設計することができる）が、これらの遺伝子を生成中に供給してもよい。したがって、複製に必要なウイルス酵素の存在下以外では、子孫のビリオンによる複製及び感染は生じ得ないため、これは遺伝子治療での使用に安全であるとみなされる。
別の実施形態では、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを提供する。ｒＡＡＶは、ＡＡＶキャプシドとその内部にパッケージされたベクターゲノムを含む。
ベクターゲノムは、一実施形態では：（ａ）ＡＡＶ ５’逆位末端（ＩＴＲ）配列；（ｂ）プロモーター；（ｃ）ヒトＴＰＰ１をコードするコード配列；及び（ｄ）ＡＡＶ ３’ＩＴＲを含む。別の実施形態では、ベクターゲノムは、本明細書に記載の発現カセットである。一実施形態では、ＣＬＮ２配列は、完全長ＴＰＰ１タンパク質をコードする。一実施形態では、ＴＰＰ１配列は、配列番号１のタンパク質配列である。別の実施形態では、コード配列は、配列番号３またはそのバリアントである。
パルボウイルスファミリーのメンバーであるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、４．７キロベース（ｋｂ）～６ｋｂの一本鎖線状ＤＮＡゲノムを有する小型非エンベロープ正二十面体型ウイルスである。既知のＡＡＶ血清型には、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９などがある。ＩＴＲまたは他のＡＡＶ構成要素は、当業者に利用可能な技術を使用してＡＡＶから容易に単離または設計され得る。そのようなＡＡＶは、学術的、商業的、または公的な情報源（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から単離し、設計し、または入手してもよい。あるいは、ＡＡＶ配列を、文献またはデータベース、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ、ＰｕｂＭｅｄなどで利用可能であるような公開された配列を参照することにより、合成手段または他の適切な手段によって設計してもよい。ＡＡＶウイルスは、従来の分子生物学技術によって設計してもよく、それにより、核酸配列の細胞特異的送達、免疫原性の最小化、安定性と粒子寿命の調整、効率的な分解、核への正確な送達などのためにこれらの粒子を最適化することができる。
ＡＡＶの断片は、様々なベクター系及び宿主細胞において容易に利用し得る。望ましいＡＡＶ断片として、ｖｐ１、ｖｐ２、ｖｐ３及び超可変領域を含むｃａｐタンパク質、ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２、及びｒｅｐ４０を含むｒｅｐタンパク質、ならびにこれらのタンパク質をコードする配列が挙げられる。そのような断片を、単独で、他のＡＡＶ血清型配列もしくは断片と組み合わせて、または他のＡＡＶ配列もしくは非ＡＡＶウイルス配列由来のエレメントと組み合わせて使用してもよい。本明細書中で使用する場合、人工ＡＡＶ血清型には、限定されないが、非天然キャプシドタンパク質を有するＡＡＶが含まれる。本発明の新規ＡＡＶ配列（例えば、ｖｐ１キャプシドタンパク質の断片）を、別のＡＡＶ血清型（既知または新規）、同じＡＡＶ血清型の非隣接部分、非ＡＡＶウイルス源、または非ウイルス源から得られ得る異種配列と組み合わせて使用して、そのような人工キャプシドを任意の適切な技術によって生成してもよい。人工ＡＡＶ血清型は、限定されないが、キメラＡＡＶキャプシド、組換えＡＡＶキャプシド、または「ヒト化」ＡＡＶキャプシドであってもよい。一実施形態では、ベクターは、ＡＡＶ９ ｃａｐ及び／またはｒｅｐ配列を含む。参照により本明細書に援用される米国特許第７，９０６，１１１号を参照のこと。
一実施形態では、本明細書において、配列番号６のアミノ酸配列を特徴とするＡＡＶ９キャプシドを有するＡＡＶベクターを提供し、それを必要とする患者においてその発現を指示する調節配列の制御下にある古典的乳児期遅発型神経セロイドリポフスチン症２（ＣＬＮ２）遺伝子をコードする核酸を、本明細書中に提供する。
本明細書中で使用する場合、「ＡＡＶ９キャプシド」は、配列番号６の異なる長さのタンパク質をもたらす選択的スプライシングバリアントとして一般的に発現する約６０の可変タンパク質（ｖｐ）の集合体であるＤＮＡｓｅ耐性粒子を特徴とする。参照により本明細書に援用されるＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＳ９９２６４．１も参照のこと。ＵＳ７９０６１１１及びＷＯ２００５／０３３３２１も参照のこと。本明細書中で使用する場合、「ＡＡＶ９バリアント」には、例えば、ＷＯ２０１６／０４９２３０、ＵＳ８，９２７，５１４、ＵＳ２０１５／０３４４９１１、及びＵＳ８，７３４，８０９に記載のバリアントが含まれる。そのアミノ酸配列は配列番号６に再現されており、そのコード配列は配列番号７に再現されている。一実施形態では、ＡＡＶ９キャプシドは、配列番号７によってコードされるキャプシド、またはそれと少なくとも約９０％、９５％、９５％、９８％、もしくは９９％の同一性を共有する配列を有する。
最も大型のタンパク質であるｖｐ１は、一般的に、配列番号６のアミノ酸配列の完全長（配列番号６のａａ １～７３６）である。特定の実施形態では、ＡＡＶ９ ｖｐ２タンパク質は、配列番号６の１３８～７３６のアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、ＡＡＶ９ ｖｐ３は、配列番号６の２０３～７３６のアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、ｖｐ１、２、または３タンパク質は、トランケーションを有する場合がある（例えば、Ｎ末端またはＣ末端の１つ以上のアミノ酸）。ＡＡＶ９キャプシドは、約６０個のｖｐタンパク質からなり、ｖｐ１、ｖｐ２及びｖｐ３は、組み立てられたキャプシド内に約１個のｖｐと、約１個のｖｐ２と、約１０～２０個のｖｐ３の比率で存在する。この比率は、使用する産生系によって異なり得る。特定の実施形態では、ｖｐ２が存在しない改変型ＡＡＶ９キャプシドを生成してもよい。
ＤＮＡ（ゲノムまたはｃＤＮＡ）またはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）を含む、このＡＡＶ９キャプシドをコードする核酸配列を設計することは当技術分野の技術の範囲内である。特定の実施形態では、ＡＡＶ９ ｖｐ１キャプシドタンパク質をコードする核酸配列を、配列番号７で提供する。他の実施形態では、配列番号７に対して７０％～９９．９％の同一性の核酸配列を、ＡＡＶ９キャプシドを発現させるために選択してもよい。特定の他の実施形態では、核酸配列は、配列番号７と少なくとも約７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％同一、または少なくとも９９％～９９．９％同一である。
本明細書中で使用する場合、ＡＡＶの群に関連する用語「クレード」とは、ＡＡＶ ｖｐ１アミノ酸配列のアラインメントに基づいて、近隣結合アルゴリズムを使用して、少なくとも７５％（少なくとも１０００回反復の）のブートストラップ値及び０．０５以下のポアソン補正距離測定によって決定される、互いに系統発生的に関連するＡＡＶの群を指す。近隣結合アルゴリズムは、文献に記載されている。例えば、Ｍ．Ｎｅｉ ａｎｄ Ｓ．Ｋｕｍａｒ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２０００）を参照のこと。このアルゴリズムを実装するために使用することができるコンピュータプログラムが利用可能である。例えば、ＭＥＧＡ ｖ２．１プログラムは、改変型Ｎｅｉ－Ｇｏｊｏｂｏｒｉ法を実装する。これらの技術及びコンピュータプログラム、ならびにＡＡＶ ｖｐ１キャプシドタンパク質の配列を使用して、当業者は、選択されたＡＡＶが、本明細書中で同定されるクレードのうちの１つに含まれるか、別のクレードに含まれるか、またはこれらのクレードの外側であるかどうかを容易に判定することができる。例えば、クレードＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ及びＦを識別し、新規ＡＡＶの核酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５３０５５３～ＡＹ５３０６２９）を提供するＧ Ｇａｏ，ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，２００４ Ｊｕｎ；７８（１０）：６３８１－６３８８を参照されたい。ＷＯ２００５／０３３３２１も参照のこと。ＡＡＶ９は、クレードＦ内にあることをさらに特徴とする。他のクレードＦ ＡＡＶには、ＡＡＶｈｕ３１及びＡＡＶｈｕ３２が含まれる。
本明細書中で使用する場合、ＡＡＶに関して、バリアントという用語は、アミノ酸配列または核酸配列と、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％またはそれ以上の配列同一性を共有する配列を含む、既知のＡＡＶ配列に由来する任意のＡＡＶ配列を意味する。別の実施形態では、ＡＡＶキャプシドは、任意の記載の、または既知のＡＡＶキャプシド配列に対して最大約１０％の変異を含み得るバリアントを含む。すなわち、ＡＡＶキャプシドは、本明細書中で提供し、及び／または当技術分野で公知のＡＡＶキャプシドに対して約９０％～約９９．９％の同一性、約９５％～約９９％の同一性、または約９７％～約９８％の同一性を共有する。一実施形態では、ＡＡＶキャプシドは、ＡＡＶ９キャプシドと少なくとも９５％の同一性を共有する。ＡＡＶキャプシドの同一性の割合を決定する場合、可変タンパク質（例えば、ｖｐ１、ｖｐ２、またはｖｐ３）のいずれかに対して比較を行ってもよい。一実施形態では、ＡＡＶキャプシドは、ｖｐ１、ｖｐ２、またはｖｐ３にわたってＡＡＶ９と少なくとも９５％の同一性を共有する。
本明細書中で使用する場合、「人工ＡＡＶ」は、限定されないが、非天然キャプシドタンパク質を有するＡＡＶを意味する。選択されたＡＡＶ配列（例えば、ｖｐ１キャプシドタンパク質の断片）を、異なる選択されたＡＡＶ、同じＡＡＶの非隣接部分、非ＡＡＶウイルス源、または非ウイルス源から得られ得る異種配列と組み合わせて使用して、そのような人工キャプシドを任意の適切な技術によって生成してもよい。人工ＡＡＶは、限定されないが、シュードタイプＡＡＶ、キメラＡＡＶキャプシド、組換えＡＡＶキャプシド、または「ヒト化」ＡＡＶキャプシドであってもよい。１つのＡＡＶのキャプシドを異種キャプシドタンパク質に置換したシュードタイプベクターは、本発明において有用である。一実施形態では、ＡＡＶ２／９及びＡＡＶ２／ｒｈ．１０は、例示的なシュードタイプベクターである。
別の実施形態では、自己相補的ＡＡＶを使用する。「自己相補的ＡＡＶ」とは、組換えＡＡＶ核酸配列によって保持されるコード領域が、分子内二本鎖ＤＮＡ鋳型を形成するように設計された発現カセットを有するプラスミドまたはベクターを指す。感染後、第２鎖の細胞媒介合成を待つよりもむしろ、ｓｃＡＡＶの２つの相補的な半体が会合して、即座に複製及び転写を行う準備ができている１つの二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）単位を形成する。例えば、Ｄ Ｍ ＭｃＣａｒｔｙ ｅｔ ａｌ，“Ｓｅｌｆ－ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ（ｓｃＡＡＶ）ｖｅｃｔｏｒｓ ｐｒｏｍｏｔｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｏｆ ＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，（Ａｕｇｕｓｔ ２００１），Ｖｏｌ ８，Ｎｕｍｂｅｒ １６，Ｐａｇｅｓ １２４８－１２５４を参照のこと。自己相補的ＡＡＶは、例えば、米国特許第６，５９６，５３５号；同第７，１２５，７１７号；及び同第７，４５６，６８３号に記載されており、その各々はその全体が参照により本明細書に援用される。
核酸配列またはタンパク質を説明するために使用する用語「外来性」とは、その核酸またはタンパク質が、染色体、または宿主細胞においてそれが存在する位置に天然には存在しないことを意味する。外来性核酸配列はまた、同じ宿主細胞または対象に由来し、それらに挿入されているが、非天然状態、例えば、異なるコピー数で、または異なる調節エレメントの調節下に存在する配列も指す。
核酸配列またはタンパク質を説明するために使用する用語「異種」とは、その核酸またはタンパク質が、それを発現する宿主細胞もしくは対象とは異なる生物または同じ生物の異なる種に由来することを意味する。タンパク質またはプラスミド、発現カセット、もしくはベクター内の核酸に関して使用する場合の用語「異種」とは、当のタンパク質または核酸が、天然に互いに同じ関係で見出されない別の配列または部分配列と共に存在することを示す。
さらに別の実施形態では、本明細書に記載の発現カセットのいずれかを含む発現カセットを使用して、組換えＡＡＶゲノムを生成する。
一実施形態では、ウイルスベクターを生成するために、及び／または、例えば、裸のＤＮＡ、ファージ、トランスポゾン、コスミド、エピソームなどを宿主細胞に送達するために有用な適切な遺伝子エレメント（ベクター）に、本明細書に記載の発現カセットを組み込み、そこに含まれるＣＬＮ２配列を移行させる。選択されたベクターを、トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソーム送達、膜融合技術、高速ＤＮＡコーティングペレット、ウイルス感染及びプロトプラスト融合を含む任意の適切な方法によって送達してもよい。そのような構築物を作製するために使用する方法は、核酸操作の当業者に公知であり、方法には、遺伝子工学、組換え工学、及び合成技術が含まれる。Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹを参照のこと。
発現カセットまたはｒＡＡＶゲノムまたは産生プラスミドをビリオンにパッケージングするために、ＩＴＲは、発現カセットと同じ構築物内でシスで必要とされる唯一のＡＡＶ成分である。一実施形態では、複製（ｒｅｐ）及び／またはキャプシド（ｃａｐ）のコード配列を、ＡＡＶゲノムから除去し、これらを、ＡＡＶベクターを生成するためにトランスでまたはパッケージング細胞株によって供給する。
対象への送達に適したＡＡＶウイルスベクターを生成し、単離するための方法は、当技術分野で公知である。例えば、米国特許７７９０４４９；米国特許７２８２１９９；ＷＯ２００３／０４２３９７；ＷＯ２００５／０３３３２１、ＷＯ２００６／１１０６８９；及びＵＳ７５８８７７２Ｂ２を参照されたい。１つの系では、産生用細胞株に、ＩＴＲに隣接させた導入遺伝子をコードする構築物と、ｒｅｐ及びｃａｐをコードする構築物（複数可）を一過性にトランスフェクトする。第２の系では、ｒｅｐとｃａｐを安定的に供給するパッケージング細胞株に、ＩＴＲに隣接させた導入遺伝子をコードする構築物を一過性にトランスフェクトする。特定の実施形態では、産生用細胞株またはパッケージング細胞株は、本明細書に記載のＡＡＶウイルスベクターを、浮遊培養において産生用細胞株またはパッケージング細胞株を増殖させることによって製造することができるような浮遊細胞株である。これらの各系では、ヘルパーアデノウイルスまたはヘルペスウイルスの感染に応答してＡＡＶビリオンが生成されるため、混入ウイルスからｒＡＡＶを分離する必要がある。より最近では、ＡＡＶを回収するためにヘルパーウイルスの感染を必要としない系が開発された－必要とされるヘルパー機能（すなわち、アデノウイルスＥ１、Ｅ２ａ、ＶＡ、及びＥ４またはヘルペスウイルスＵＬ５、ＵＬ８、ＵＬ５２、及びＵＬ２９、ならびにヘルペスウイルスポリメラーゼ）はまた、系によってトランスで供給される。これらのより新しい系では、必要なヘルパー機能をコードする構築物で細胞を一過性にトランスフェクトすることによってヘルパー機能を供給することができるか、または、ヘルパー機能をコードする遺伝子を安定して含むように細胞を改変することができ、その遺伝子の発現を転写レベルまたは転写後レベルで調節することができる。
用語「単離された」とは、物質を元の環境（例えば、それが天然型の場合は自然環境）から除去することを意味する。例えば、生きている動物内に存在する天然ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されていないが、天然の系に共存する物質の一部またはすべてから分離させた同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、たとえその後に天然の系に再導入する場合であっても、単離されている。そのようなポリヌクレオチドは、ベクターの一部で有り得、及び／またはそのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、組成物の一部で有り得、そしてそのようなベクターまたは組成物がその自然環境の一部ではないという点で依然として単離され得る。
さらに別の系では、ＩＴＲに隣接する発現カセット及びｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子を、バキュロウイルス系ベクターを用いて感染させることによって昆虫細胞に導入する。これらの産生系の概説については、一般的に、例えば、その内容の全体が参照により本明細書に援用されるＺｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００９，“Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ－ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｈｙｂｒｉｄ ｆｏｒ ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，”Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０：９２２－９２９を参照のこと。これら及び他のＡＡＶ産生系を作製し、使用する方法は、以下の米国特許にも記載されており、その各々の内容は、その全体が参照により本明細書に援用される：５，１３９，９４１；５，７４１，６８３；６，０５７，１５２；６，２０４，０５９；６，２６８，２１３；６，４９１，９０７；６，６６０，５１４；６，９５１，７５３；７，０９４，６０４；７，１７２，８９３；７，２０１，８９８；７，２２９，８２３；及び７，４３９，０６５。一般的に、例えば、Ｇｒｉｅｇｅｒ ＆ Ｓａｍｕｌｓｋｉ，２００５，“Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ａｓ ａ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｖｅｃｔｏｒ：Ｖｅｃｔｏｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，”Ａｄｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇｉｎ／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９９：１１９－１４５；Ｂｕｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００８，“Ｒｅｃｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，”Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．１０：７１７－７３３を参照のこと；また、以下に引用する参考文献は、それぞれ、その全体が参照により本明細書に援用される。
一態様では、本明細書において、ｒＡＡＶを産生することができる浮遊細胞株を浮遊培養で増殖させることを含む、本明細書に記載のｒＡＡＶの製造方法を提供する。
特定の実施形態では、無血清及び動物成分フリーの培地を使用して細胞を浮遊培養に適応させることにより、付着細胞株から浮遊細胞株を誘導する。特定の実施形態では、浮遊細胞株は、ＨＥＫ２９３浮遊細胞株である。
本発明の任意の実施形態を構築するために使用する方法は、核酸操作の当業者に公知であり、方法には、遺伝子工学、組換え工学、及び合成技術が含まれる。例えば、Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ （２０１２）を参照のこと。同様に、ｒＡＡＶビリオンの生成方法は周知であり、適切な方法の選択は、本発明を制限するものではない。例えば、Ｋ．Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ，（１９９３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：５２０－５３２及び米国特許第５，４７８，７４５号を参照されたい。
「プラスミド」は、一般的に、当業者によく知られた標準的な命名規則に従って、大文字及び／または数字の前後に小文字のｐで示される。本発明に従って使用することができる多くのプラスミドならびに他のクローニングベクター及び発現ベクターは周知であり、当業者であれば容易に利用可能である。さらに、当業者であれば、本発明での使用に適した任意の数の他のプラスミドを容易に構築し得る。本発明におけるそのようなプラスミド、及び他のベクターの特性、構築及び使用は、本開示から当業者に容易に明らかになるであろう。
一実施形態では、産生プラスミドは、本明細書に記載のプラスミドであるか、または参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１２／１５８７５７に記載されているプラスミドである。様々なプラスミドが、ｒＡＡＶベクターの作製に使用するために当技術分野で公知であり、本明細書において有用である。ＡＡＶ ｃａｐ及び／またはｒｅｐタンパク質を発現する宿主細胞内で産生プラスミドを培養する。宿主細胞内で、各ｒＡＡＶゲノムをレスキューし、キャプシドタンパク質またはエンベロープタンパク質にパッケージングして感染性ウイルス粒子を形成させる。
一態様では、上記の発現カセットを含む産生プラスミドを提供する。一実施形態では、産生プラスミドは、図１Ｂに示すプラスミドである。このプラスミドは、ｒＡＡＶ－ヒトコドン最適化ＴＰＰ１ベクターの生成例において使用される。そのようなプラスミドは、５’ＡＡＶ ＩＴＲ配列；選択されたプロモーター；ポリＡ配列；及び３’ＩＴＲを含むプラスミドであり；さらに、プラスミドは、ニワトリβアクチンイントロンなどのイントロン配列も含む。例示的な概略図を図１Ａに示す。さらなる実施形態では、イントロン配列は、約３キロベース（ｋｂ）～約６ｋｂ、約４．７ｋｂ～約６ｋｂ、約３ｋｂ～約５．５ｋｂ、または約４．７ｋｂ～５．５ｋｂのサイズのｒＡＡＶベクターゲノムを保持する。ＴＰＰ１コード配列を含む産生プラスミドの例は、配列番号５に見出し得る。別の実施形態では、産生プラスミドを、ベクタープラスミド産生効率が最適化されるように改変する。そのような改変として、他の中性配列を追加するか、またはベクタープラスミドのスーパーコイルのレベルを調節するためのλスタッファー配列を含めることが挙げられる。そのような改変が本明細書において企図される。他の実施形態では、ターミネーター及び他の配列を、プラスミドに含める。
特定の実施形態では、ｒＡＡＶ発現カセット、ベクター（ｒＡＡＶベクターなど）、ウイルス（ｒＡＡＶなど）、及び／または産生プラスミドは、ＡＡＶ逆位末端配列、ＴＰＰ１をコードするコドン最適化核酸配列、及び／または宿主細胞におけるコードされたタンパク質の発現を指示する発現調節配列を含む。他の実施形態では、ｒＡＡＶ発現カセット、ウイルス、ベクター（ｒＡＡＶベクターなど）、及び／または産生プラスミドは、イントロン、コザック配列、ポリＡ、転写後調節エレメントなどのうちの１つ以上をさらに含む。一実施形態では、転写後調節エレメントは、ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＰ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）である。
発現カセット、ベクター及びプラスミドは、本明細書に記載のように、例えば、コドン最適化を含む当技術分野で公知の技術を使用して特定の種に対して最適化することができる他の成分を含む。本明細書に記載のカセット、ベクター、プラスミド及びウイルスまたは他の組成物の成分は、発現調節配列の一部としてプロモーター配列を含む。別の実施形態では、プロモーターは細胞特異的である。用語「細胞特異的」とは、組換えベクター用に選択された特定のプロモーターが、特定の細胞または組織タイプにおいて、最適化されたＴＰＰ１コード配列の発現を指示することができることを意味する。一実施形態では、プロモーターは、上衣、すなわち脳室系の上皮内層における導入遺伝子の発現に特異的である。別の実施形態では、プロモーターは、ニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、及びミクログリアから選択される脳細胞内での発現に特異的である。一実施形態では、クローニングを容易にするために、１つ以上の制限酵素部位を追加するようにプロモーターを改変する。
別の実施形態では、プロモーターは、遍在的または構成的プロモーターである。適切なプロモーターの例は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサーエレメントを有するハイブリッドニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーター、例えば、配列番号５のｎｔ ３３９６～４０６１に示す配列である。別の実施形態では、プロモーターはＣＢ７プロモーターである。他の適切なプロモーターとして、ヒトβ－アクチンプロモーター、ヒト伸長因子－１αプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、シミアンウイルス４０プロモーター、及び単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーターが挙げられる。例えば、Ｄａｍｄｉｎｄｏｒｊ ｅｔ ａｌ，（Ａｕｇｕｓｔ ２０１４）Ａ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ Ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ Ｌｏｃａｔｅｄ ｉｎ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ．ＰＬｏＳ ＯＮＥ ９（８）：ｅ１０６４７２を参照のこと。さらに他の適切なプロモーターとして、ウイルスプロモーター、構成的プロモーター、調節性プロモーターが挙げられる［例えば、ＷＯ２０１１／１２６８０８及びＷＯ２０１３／０４９４３を参照のこと］。あるいは、生理学的合図に応答するプロモーターを、本明細書に記載の発現カセット、ｒＡＡＶゲノム、ベクター、プラスミド、及びウイルスにおいて利用してもよい。一実施形態では、プロモーターは、ＡＡＶベクターのサイズ制限のために、１０００ｂｐ未満の小さなサイズである。別の実施形態では、プロモーターは４００ｂｐ未満である。当業者は、他のプロモーターを選択してもよい。
さらなる実施形態では、プロモーターは、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、ファージλ（ＰＬ）プロモーター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）プロモーター、テトラサイクリン調節性トランスアクチベーター応答性プロモーター（ｔｅｔ）系、ＲＳＶ ＬＴＲ、ＭｏＭＬＶ ＬＴＲ、ＢＩＶ ＬＴＲまたはＨＩＶ ＬＴＲなどの末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーター、モロニーマウス肉腫ウイルスのＵ３領域プロモーター、グランザイムＡプロモーター、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（複数可）、ＣＤ３４プロモーター、ＣＤ８プロモーター、チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーター、Ｂ１９パルボウイルスプロモーター、ＰＧＫプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、ＨＳＰ６５及びＨＳＰ７０プロモーターなどの熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）プロモーター、免疫グロブリンプロモーター、ＭＭＴＶプロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ｌａｃプロモーター、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター、ノパリンシンテターゼプロモーター、ＭＮＤプロモーター、またはＭＮＣプロモーターから選択される。そのプロモーター配列は、当業者に公知であるか、または文献もしくは、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ、ＰｕｂＭｅｄなどのデータベースにおいて公的に入手可能である。
別の実施形態では、プロモーターは、誘導性プロモーターである。誘導性プロモーターは、ラパマイシン／ラパログプロモーター、エクジソンプロモーター、エストロゲン応答性プロモーター、及びテトラサイクリン応答性プロモーター、またはヘテロ二量体リプレッサースイッチを含む既知のプロモーターから選択され得る。いずれもその全体が参照により本明細書に援用されるＳｏｃｈｏｒ ｅｔ ａｌ，Ａｎ Ａｕｔｏｇｅｎｏｕｓｌｙ Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｏｃｕｌａｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０１５ Ｎｏｖ ２４；５：１７１０５及びＤａｂｅｒ Ｒ，Ｌｅｗｉｓ Ｍ．，Ａ ｎｏｖｅｌ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｗｉｔｃｈ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００９ Ａｕｇ ２８；３９１（４）：６６１－７０，Ｅｐｕｂ ２００９ Ｊｕｎ ２１を参照されたい。
他の実施形態では、本明細書に記載の発現カセット、ベクター、プラスミド及びウイルスは、他の適切な転写開始配列、転写終結配列、エンハンサー配列、スプライシングシグナル及びポリアデニル化（ポリＡ）シグナルなどの効率的なＲＮＡプロセシングシグナル；ＴＡＴＡ配列；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を高める配列（すなわち、コザックコンセンサス配列）；イントロン；タンパク質の安定性を高める配列；ならびに所望により、コード産物の分泌を促進する配列を含む。発現カセットまたはベクターには、本明細書に記載のエレメントをまったく含めないか、１つまたはそれ以上を含ませてもよい。
適切なポリＡ配列の例として、例えば、合成ポリＡまたはウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ＳＶ４０、ウサギβ－グロビン（ＲＧＢ）、もしくは修飾ＲＧＢ（ｍＲＧＦ）由来のポリＡ配列が挙げられる。さらなる実施形態では、ポリＡは、配列番号５のｎｔ ３３～１５９の核酸配列を有する。
適切なエンハンサーの例として、例えば、ＣＭＶエンハンサー、ＲＳＶエンハンサー、αフェトプロテインエンハンサー、ＴＴＲ最小プロモーター／エンハンサー、ＬＳＰ（ＴＨ結合グロブリンプロモーター／α１－ミクログロブリン／ビクニンエンハンサー）、ＡＰＢエンハンサー、ＡＢＰＳエンハンサー、αｍｉｋ／ｂｉｋエンハンサー、ＴＴＲエンハンサー、ｅｎ３４、ＡｐｏＥなどが挙げられる。
一実施形態では、ＴＰＰ１コード配列の上流にコザック配列を含ませて、正しい開始コドンからの翻訳を増強する。別の実施形態では、発現カセットにＣＢＡエクソン１及びイントロンを含ませる。一実施形態では、ＴＰＰ１コード配列を、ハイブリッドニワトリβアクチン（ＣＢＡ）プロモーターの調節下に置く。このプロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期エンハンサー、近位ニワトリβアクチンプロモーター、及びイントロン１配列に隣接するＣＢＡエクソン１からなる。
別の実施形態では、イントロンは、ＣＢＡ、ヒトβグロビン、ＩＶＳ２、ＳＶ４０、ｂＧＨ、αグロブリン、βグロブリン、コラーゲン、卵白アルブミン、ｐ５３、またはそれらの断片から選択される。
一実施形態では、発現カセット、ベクター、プラスミド及びウイルスは、５’ＩＴＲ、ニワトリβアクチン（ＣＢＡ）プロモーター、ＣＭＶエンハンサー、ＣＢＡエクソン１及びイントロン、ヒトコドン最適化ＣＬＮ２配列、ウサギグロビンポリＡならびに３’ＩＴＲを含む。さらなる実施形態では、発現カセットは、配列番号８のｎｔ １～４０２０を含む。さらにさらなる実施形態では、５’ＩＴＲは、配列番号５のｎｔ ３１９９～ｎｔ ３３２８の核酸配列を有し、３’ＩＴＲは、配列番号５のｎｔ ２４８～ｎｔ ３７７の核酸配列を有する。さらなる実施形態では、産生プラスミドは、配列番号５の配列を有し、これを図１Ｃ～１Ｅにも示す。
ＩＩ． バッテン病の治療方法及び医薬組成物
ＩＩ－１． バッテン病の治療方法
別の態様では、ＣＬＮ２遺伝子の欠損によって引き起こされるバッテン病の治療方法は、本明細書に記載のように、それを必要とする対象にＴＰＰ１をコードするベクター（ｒＡＡＶなど）を送達することを含む。一実施形態では、バッテン病を有する対象を本明細書に記載のｒＡＡＶで治療する方法を提供する。また、本明細書において、本明細書に記載のｒＡＡＶを、それを必要とする対象に複数の経路で投与することを含む、バッテン病の治療方法を提供する。
一態様では、本明細書において、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を、第１の経路及び第２の経路を介して、それを必要とする対象に投与することを含む、対象におけるＣＬＮ２バッテン病の治療方法を提供し、当該第１の経路及び当該第２の経路は、中枢神経系（ＣＮＳ）への経路であり、当該第１の経路は脳領域への経路であり、当該第２の経路は脊髄領域への経路であり、当該組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）は、ＡＡＶキャプシド及びその内部にパッケージされたベクターゲノムを含み、当該ベクターゲノムは、以下を含む：（ａ）ＡＡＶ ５’逆位末端（ＩＴＲ）配列；（ｂ）プロモーター；（ｃ）ヒトＴＰＰ１をコードするＣＬＮ２コード配列；及び（ｄ）ＡＡＶ ３’ＩＴＲ。
特定の実施形態では、脳領域は、脳を覆う髄腔内空間であり得る。特定の実施形態では、脳領域は脳室であり得る。特定の実施形態では、脳領域は大槽であり得る。特定の実施形態では、脳領域への送達は、脳脊髄液（ＣＳＦ）への送達であり得る。
特定の実施形態では、脊髄領域は、脊髄の周りの髄腔内空間であり得る。特定の実施形態では、脊髄領域は脊柱管であり得る。特定の実施形態では、脊髄領域はくも膜下腔であり得る。特定の実施形態では、脊髄領域への送達は、脳脊髄液（ＣＳＦ）への送達であり得る。
特定の実施形態では、当該第１の経路は、脳室内（ＩＣＶ）または槽内（ＩＣ）である。他の実施形態では、当該第１の経路は、脳室内（ＩＣＶ）または槽内（ＩＣ）以外の脳領域への投与経路である。
特定の実施形態では、当該第２の経路は、腰部髄腔内（ＩＴ－Ｌ）である。他の実施形態では、当該第１の経路は、髄腔内腰椎（ＩＴ－Ｌ）以外の脊髄領域への投与経路である。
特定の実施形態では、当該方法は、第３の経路を介して当該対象に当該ｒＡＡＶを投与することをさらに含み、当該第３の経路は、脳室内（ＩＣＶ）、槽内（ＩＣ）、腰部髄腔内、頭蓋内、静脈内、血管内、動脈内、筋肉内、眼内、皮下、及び皮内からなる群から選択される。特定の実施形態では、当該第３の経路はｒＡＡＶを肝臓へ送達する。特定の実施形態では、当該第３の経路は静脈内である。
特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２バッテン病の治療方法は、脳室内（ＩＣＶ）及び腰部髄腔内（ＩＴ－Ｌ）経路を介して、当該ｒＡＡＶを、それを必要とする対象に共投与することを含む。特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２バッテン病の治療方法は、槽内（ＩＣ）及び腰部髄腔内（ＩＴ－Ｌ）経路を介して、当該ｒＡＡＶを、それを必要とする対象に共投与することを含む。特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２バッテン病の治療方法は、脳室内（ＩＣＶ）、腰部髄腔内（ＩＴ－Ｌ）、及び静脈内経路を介して、当該ｒＡＡＶを、それを必要とする対象に共投与することを含む。特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２バッテン病の治療方法は、槽内（ＩＣ）、腰部髄腔内（ＩＴ－Ｌ）、及び静脈内経路を介して、当該ｒＡＡＶを、それを必要とする対象に共投与することを含む。
別の態様では、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を、第１の経路及び第２の経路を介して、それを必要とする対象に投与することを含む、対象におけるＣＬＮ２バッテン病の治療方法を提供し、当該第１の経路は、中枢神経系（ＣＮＳ）への経路であり、当該第２の経路は、ｒＡＡＶをＣＮＳの外側へ送達し、当該組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）は、ＡＡＶキャプシド及びその内部にパッケージされたベクターゲノムを含み、当該ベクターゲノムは、以下を含む：（ａ）ＡＡＶ ５’逆位末端（ＩＴＲ）配列；（ｂ）プロモーター；（ｃ）ヒトＴＰＰ１をコードするＣＬＮ２コード配列；及び（ｄ）ＡＡＶ ３’ＩＴＲ。特定の実施形態では、当該第１の経路は、腰部髄腔内（ＩＴ－Ｌ）、脳室内（ＩＣＶ）または槽内（ＩＣ）である。特定の実施形態では、当該第２の経路は、静脈内、血管内、動脈内、筋肉内、眼内、皮下、及び皮内からなる群から選択される。特定の実施形態では、当該第２の経路は静脈内である。
別の態様では、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を、第１の経路及び第２の経路を介して、それを必要とする対象に投与することを含む、対象におけるＣＬＮ２バッテン病の治療方法を提供し、当該第１の経路は、中枢神経系（ＣＮＳ）への経路であり、当該第２の経路は、ｒＡＡＶを肝臓へ送達し、当該組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）は、ＡＡＶキャプシド及びその内部にパッケージされたベクターゲノムを含み、当該ベクターゲノムは、以下を含む：（ａ）ＡＡＶ ５’逆位末端（ＩＴＲ）配列；（ｂ）プロモーター；（ｃ）ヒトＴＰＰ１をコードするＣＬＮ２コード配列；及び（ｄ）ＡＡＶ ３’ＩＴＲ。
特定の実施形態では、当該第１の経路は、腰部髄腔内（ＩＴ－Ｌ）、脳室内（ＩＣＶ）または槽内（ＩＣ）である。他の実施形態では、当該第１の経路は、腰部髄腔内（ＩＴ－Ｌ）、脳室内（ＩＣＶ）または槽内（ＩＣ）以外のＣＮＳへの投与経路である。
特定の実施形態では、当該第２の経路は、静脈内、血管内、動脈内、筋肉内、眼内、皮下、及び皮内からなる群から選択される。特定の実施形態では、当該第２の経路は静脈内である。他の実施形態では、当該第２の経路は、静脈内、血管内、動脈内、筋肉内、眼内、皮下、及び皮内以外の、ｒＡＡＶを肝臓へ送達する投与経路である。
特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２バッテン病の治療方法は、ＣＮＳ及び静脈内経路に、当該ｒＡＡＶを、それを必要とする対象に共投与することを含む。特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２バッテン病の治療方法は、髄腔内及び静脈内経路を介して、当該ｒＡＡＶを、それを必要とする対象に共投与することを含む。特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２バッテン病の治療方法は、腰部髄腔内（ＩＴ－Ｌ）及び静脈内経路を介して、当該ｒＡＡＶを、それを必要とする対象に共投与することを含む。特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２バッテン病の治療方法は、脳室内（ＩＣＶ）及び静脈内経路を介して、当該ｒＡＡＶを、それを必要とする対象に共投与することを含む。特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２バッテン病の治療方法は、槽内（ＩＣ）及び静脈内経路を介して、当該ｒＡＡＶを、それを必要とする対象に共投与することを含む。特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２バッテン病の治療方法は、腰部髄腔内（ＩＴ－Ｌ）、脳室内（ＩＣＶ）または槽内（ＩＣ）、及び静脈内経路以外の経路を介してＣＮＳに、当該ｒＡＡＶを、それを必要とする対象に共投与することを含む。
特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２バッテン病の治療方法は、ＣＮＳ及び血管内経路への経路を介して、当該ｒＡＡＶを、それを必要とする対象に共投与することを含む。特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２バッテン病の治療方法は、髄腔内及び血管内経路を介して、当該ｒＡＡＶを、それを必要とする対象に共投与することを含む。特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２バッテン病の治療方法は、腰部髄腔内（ＩＴ－Ｌ）及び血管内経路を介して、当該ｒＡＡＶを、それを必要とする対象に共投与することを含む。特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２バッテン病の治療方法は、脳室内（ＩＣＶ）及び血管内経路を介して、当該ｒＡＡＶを、それを必要とする対象に共投与することを含む。特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２バッテン病の治療方法は、槽内（ＩＣ）及び血管内経路を介して、当該ｒＡＡＶを、それを必要とする対象に共投与することを含む。特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２バッテン病の治療方法は、腰部髄腔内（ＩＴ－Ｌ）、脳室内（ＩＣＶ）または槽内（ＩＣ）、及び血管内経路以外の経路を介してＣＮＳに、当該ｒＡＡＶを、それを必要とする対象に共投与することを含む。
特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２バッテン病の治療方法は、ＣＮＳ及び動脈内経路への経路を介して、当該ｒＡＡＶを、それを必要とする対象に共投与することを含む。特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２バッテン病の治療方法は、髄腔内及び動脈内経路を介して、当該ｒＡＡＶを、それを必要とする対象に共投与することを含む。特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２バッテン病の治療方法は、腰部髄腔内（ＩＴ－Ｌ）及び動脈内経路を介して、当該ｒＡＡＶを、それを必要とする対象に共投与することを含む。特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２バッテン病の治療方法は、脳室内（ＩＣＶ）及び動脈内経路を介して、当該ｒＡＡＶを、それを必要とする対象に共投与することを含む。特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２バッテン病の治療方法は、槽内（ＩＣ）及び動脈内経路を介して、当該ｒＡＡＶを、それを必要とする対象に共投与することを含む。特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２バッテン病の治療方法は、腰部髄腔内（ＩＴ－Ｌ）、脳室内（ＩＣＶ）または槽内（ＩＣ）、及び動脈内経路以外の経路を介してＣＮＳに、当該ｒＡＡＶを、それを必要とする対象に共投与することを含む。
特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２バッテン病の治療方法は、ＣＮＳ及び筋肉内経路への経路を介して、当該ｒＡＡＶを、それを必要とする対象に共投与することを含む。特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２バッテン病の治療方法は、髄腔内及び筋肉内経路を介して、当該ｒＡＡＶを、それを必要とする対象に共投与することを含む。特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２バッテン病の治療方法は、腰部髄腔内（ＩＴ－Ｌ）及び筋肉内経路を介して、当該ｒＡＡＶを、それを必要とする対象に共投与することを含む。特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２バッテン病の治療方法は、脳室内（ＩＣＶ）及び筋肉内経路を介して、当該ｒＡＡＶを、それを必要とする対象に共投与することを含む。特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２バッテン病の治療方法は、槽内（ＩＣ）及び筋肉内経路を介して、当該ｒＡＡＶを、それを必要とする対象に共投与することを含む。特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２バッテン病の治療方法は、腰部髄腔内（ＩＴ－Ｌ）、脳室内（ＩＣＶ）または槽内（ＩＣ）、及び筋肉内経路以外の経路を介してＣＮＳに、当該ｒＡＡＶを、それを必要とする対象に共投与することを含む。
特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２バッテン病の治療方法は、ＣＮＳ及び眼内経路への経路を介して、当該ｒＡＡＶを、それを必要とする対象に共投与することを含む。特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２バッテン病の治療方法は、髄腔内及び眼内経路を介して、当該ｒＡＡＶを、それを必要とする対象に共投与することを含む。特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２バッテン病の治療方法は、腰部髄腔内（ＩＴ－Ｌ）及び眼内経路を介して、当該ｒＡＡＶを、それを必要とする対象に共投与することを含む。特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２バッテン病の治療方法は、脳室内（ＩＣＶ）及び眼内経路を介して、当該ｒＡＡＶを、それを必要とする対象に共投与することを含む。特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２バッテン病の治療方法は、槽内（ＩＣ）及び眼内経路を介して、当該ｒＡＡＶを、それを必要とする対象に共投与することを含む。特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２バッテン病の治療方法は、腰部髄腔内（ＩＴ－Ｌ）、脳室内（ＩＣＶ）または槽内（ＩＣ）、及び眼内経路以外の経路を介してＣＮＳに、当該ｒＡＡＶを、それを必要とする対象に共投与することを含む。
特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２バッテン病の治療方法は、ＣＮＳ及び皮下経路への経路を介して、当該ｒＡＡＶを、それを必要とする対象に共投与することを含む。特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２バッテン病の治療方法は、髄腔内及び皮下経路を介して、当該ｒＡＡＶを、それを必要とする対象に共投与することを含む。特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２バッテン病の治療方法は、腰部髄腔内（ＩＴ－Ｌ）及び皮下経路を介して、当該ｒＡＡＶを、それを必要とする対象に共投与することを含む。特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２バッテン病の治療方法は、脳室内（ＩＣＶ）及び皮下経路を介して、当該ｒＡＡＶを、それを必要とする対象に共投与することを含む。特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２バッテン病の治療方法は、槽内（ＩＣ）及び皮下経路を介して、当該ｒＡＡＶを、それを必要とする対象に共投与することを含む。特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２バッテン病の治療方法は、腰部髄腔内（ＩＴ－Ｌ）、脳室内（ＩＣＶ）または槽内（ＩＣ）、及び皮下経路以外の経路を介してＣＮＳに、当該ｒＡＡＶを、それを必要とする対象に共投与することを含む。
特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２バッテン病の治療方法は、ＣＮＳ及び皮内経路への経路を介して、当該ｒＡＡＶを、それを必要とする対象に共投与することを含む。特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２バッテン病の治療方法は、髄腔内及び皮内経路を介して、当該ｒＡＡＶを、それを必要とする対象に共投与することを含む。特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２バッテン病の治療方法は、腰部髄腔内（ＩＴ－Ｌ）及び皮内経路を介して、当該ｒＡＡＶを、それを必要とする対象に共投与することを含む。特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２バッテン病の治療方法は、脳室内（ＩＣＶ）及び皮内経路を介して、当該ｒＡＡＶを、それを必要とする対象に共投与することを含む。特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２バッテン病の治療方法は、槽内（ＩＣ）及び皮内経路を介して、当該ｒＡＡＶを、それを必要とする対象に共投与することを含む。特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２バッテン病の治療方法は、腰部髄腔内（ＩＴ－Ｌ）、脳室内（ＩＣＶ）または槽内（ＩＣ）、及び皮内経路以外の経路を介してＣＮＳに、当該ｒＡＡＶを、それを必要とする対象に共投与することを含む。
特定の実施形態では、本明細書に提供するＣＬＮ２バッテン病の治療方法は、当該第２の経路を介して当該ｒＡＡＶを投与することと同時に、当該第１の経路を介して当該ｒＡＡＶを投与することを含み得る。
特定の実施形態では、本明細書に提供するＣＬＮ２バッテン病の治療方法は、当該第２の経路を介して当該ｒＡＡＶを投与する前に、当該第１の経路を介して当該ｒＡＡＶを投与することを含み得る。特定の実施形態では、本明細書に提供するＣＬＮ２バッテン病の治療方法は、当該第２の経路を介して当該ｒＡＡＶを投与した後に、当該第１の経路を介して当該ｒＡＡＶを投与することを含み得る。
特定の実施形態では、当該第１の経路を介した当該ｒＡＡＶの投与と、当該第２の経路を介した当該ｒＡＡＶの投与との間の間隔は、約０．５時間、１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約１週間、約８日、約９日、約１０日、約１１日、約１２日、約１３日、約２週間、約３週間、約４週間、約５週間、約６週間、約７週間、約８週間、約９週間、約１０週間、約１１週間、約１２週間、約１か月、約２か月、約３か月、約４か月、約５か月、約６か月、またはそれ以上であってもよい。
特定の実施形態では、当該第１の経路を介した当該ｒＡＡＶの投与と、当該第２の経路を介した当該ｒＡＡＶの投与との間の間隔は、０．５時間、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、約１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、またはそれ以上であってもよい。
特定の実施形態では、本明細書に提供するＣＬＮ２バッテン病の治療方法は、当該対象の脊髄内のＴＰＰ１活性の増加をもたらし得る。特定の実施形態では、本明細書に提供するＣＬＮ２バッテン病の治療方法は、当該対象の脊髄において、第２の対象の脊髄における参照ＴＰＰ１活性に比べて、少なくとも２％、３％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１２％、１５％、１７％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％高いＴＰＰ１活性をもたらし得、脊髄における参照ＴＰＰ１活性は、当該第２の対象が当該方法を使用した治療を受けていない場合に測定され、当該第２の対象は、当該対象と同じであるかまたは異なっている。特定の実施形態では、本明細書に提供するＣＬＮ２バッテン病の治療方法は、当該対象の脊髄において、第２の対象の脊髄における参照ＴＰＰ１活性に比べて、２％、３％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１２％、１５％、１７％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％高いＴＰＰ１活性をもたらし得、脊髄における参照ＴＰＰ１活性は、当該第２の対象が当該方法を使用した治療を受けていない場合に測定され、当該第２の対象は、当該対象と同じであるかまたは異なっている。
特定の実施形態では、本明細書に提供するＣＬＮ２バッテン病の治療方法は、当該対象の肝ＴＰＰ１活性の増加をもたらし得る。特定の実施形態では、本明細書に提供するＣＬＮ２バッテン病の治療方法は、第２の対象の参照肝ＴＰＰ１活性に比べて、少なくとも２％、３％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１２％、１５％、１７％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％高い当該対象の肝ＴＰＰ１活性をもたらし得、参照肝ＴＰＰ１活性は、当該第２の対象が当該方法を使用した治療を受けていない場合に測定され、当該第２の対象は、当該対象と同じであるかまたは異なっている。特定の実施形態では、本明細書に提供するＣＬＮ２バッテン病の治療方法は、当該対象の脊髄において、第２の対象の脊髄における参照ＴＰＰ１活性に比べて、２％、３％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１２％、１５％、１７％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％高いＴＰＰ１活性をもたらし得、脊髄における参照ＴＰＰ１活性は、当該第２の対象が当該方法を使用した治療を受けていない場合に測定され、当該第２の対象は、当該対象と同じであるかまたは異なっている。
特定の実施形態では、本明細書に提供するＣＬＮ２バッテン病の治療方法は、当該対象の血清ＴＰＰ１活性の増加をもたらし得る。特定の実施形態では、本明細書に提供するＣＬＮ２バッテン病の治療方法は、第２の対象の参照血清ＴＰＰ１活性に比べて、少なくとも２％、３％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１２％、１５％、１７％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％高い当該対象の血清ＴＰＰ１活性をもたらし得、参照血清ＴＰＰ１活性は、当該第２の対象が当該方法を使用した治療を受けていない場合に測定され、当該第２の対象は、当該対象と同じであるかまたは異なっている。特定の実施形態では、本明細書に提供するＣＬＮ２バッテン病の治療方法は、第２の対象の参照血清ＴＰＰ１活性に比べて、２％、３％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１２％、１５％、１７％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％高い当該対象の血清ＴＰＰ１活性をもたらし得、参照血清ＴＰＰ１活性は、当該第２の対象が当該方法を使用した治療を受けていない場合に測定され、当該第２の対象は、当該対象と同じであるかまたは異なっている。
特定の実施形態では、本明細書に提供するＣＬＮ２バッテン病の治療方法は、当該対象の皮質内のミクログリア活性の低下をもたらし得る。特定の実施形態では、本明細書に提供するＣＬＮ２バッテン病の治療方法は、当該対象の皮質において、第２の対象の皮質における参照ミクログリア活性に比べて、少なくとも２％、３％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１２％、１５％、１７％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％低いミクログリア活性をもたらし得、皮質における参照ミクログリア活性は、当該第２の対象が当該方法を使用した治療を受けていない場合に測定され、当該第２の対象は、当該対象と同じであるかまたは異なっている。特定の実施形態では、本明細書に提供するＣＬＮ２バッテン病の治療方法は、当該対象の皮質において、第２の対象の皮質における参照ミクログリア活性に比べて、２％、３％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１２％、１５％、１７％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％低いミクログリア活性をもたらし得、皮質における参照ミクログリア活性は、当該第２の対象が当該方法を使用した治療を受けていない場合に測定され、当該第２の対象は、当該対象と同じであるかまたは異なっている。
特定の実施形態では、本明細書に提供するＣＬＮ２バッテン病の治療方法は、当該対象の脳内のＴＰＰ１活性の増加をもたらし得る。特定の実施形態では、本明細書に提供するＣＬＮ２バッテン病の治療方法は、第２の対象の脳内の参照ＴＰＰ１活性に比べて、少なくとも２％、３％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１２％、１５％、１７％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％高い当該対象の脳内のＴＰＰ１活性をもたらし得、脳内の参照ＴＰＰ１活性は、当該第２の対象が当該方法を使用した治療を受けていない場合に測定され、当該第２の対象は、当該対象と同じであるかまたは異なっている。特定の実施形態では、本明細書に提供するＣＬＮ２バッテン病の治療方法は、第２の対象の脳内の参照ＴＰＰ１活性に比べて、２％、３％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１２％、１５％、１７％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％高い当該対象の脳内のＴＰＰ１活性をもたらし得、脳内の参照ＴＰＰ１活性は、当該第２の対象が当該方法を使用した治療を受けていない場合に測定され、当該第２の対象は、当該対象と同じであるかまたは異なっている。
特定の実施形態では、当該ｒＡＡＶを、治療有効量で投与する。
特定の実施形態では、当該対象はヒトである。
特定の実施形態では、（ｃ）のコード配列は、コドン最適化ヒトＣＬＮ２であり、これは、配列番号２の天然ヒトコード配列に対して少なくとも７０％同一である。特定の実施形態では、（ｃ）のコード配列は、配列番号３である。
特定の実施形態では、ｒＡＡＶキャプシドは、ＡＡＶ９またはそのバリアントである。
特定の実施形態では、プロモーターはニワトリβアクチン（ＣＢＡ）プロモーターである。特定の実施形態では、プロモーターは、ＣＢＡプロモーター配列とサイトメガロウイルスエンハンサーエレメントを含むハイブリッドプロモーターである。
特定の実施形態では、ＡＡＶ ５’ＩＴＲ及び／またはＡＡＶ ３’ＩＴＲは、ＡＡＶ２由来である。
特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ポリＡをさらに含む。特定の実施形態では、ポリＡは、合成ポリＡであるか、またはウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ＳＶ４０、ウサギβ－グロビン（ＲＧＢ）、または修飾ＲＧＢ（ｍＲＧＢ）由来である。
特定の実施形態では、ベクターゲノムは、イントロンをさらに含む。特定の実施形態では、イントロンは、ＣＢＡ、ヒトβグロビン、ＩＶＳ２、ＳＶ４０、ｂＧＨ、αグロブリン、βグロブリン、コラーゲン、オボアルブミン、またはｐ５３由来である。
特定の実施形態では、ベクターゲノムは、エンハンサーをさらに含む。特定の実施形態では、エンハンサーは、ＣＭＶエンハンサー、ＲＳＶエンハンサー、ＡＰＢエンハンサー、ＡＢＰＳエンハンサー、αｍｉｃ／ｂｉｋエンハンサー、ＴＴＲエンハンサー、ｅｎ３４、ＡｐｏＥである。
特定の実施形態では、ベクターゲノムは、サイズが約３キロベース～約５．５キロベースである。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、サイズが約４キロベースである。
特定の実施形態では、ｒＡＡＶを産生することができる浮遊細胞株を浮遊培養で増殖させることを含む方法を使用して、ｒＡＡＶを製造する。特定の実施形態では、当該浮遊細胞株は、ＨＥＫ２９３浮遊細胞株である。
本発明の特定の実施形態では、対象は、神経セロイドリポフスチン症（ＮＣＬ）を有し、本発明の成分、組成物、及び方法は、それを治療するように設計される。本明細書中で使用する場合、本明細書中で使用する用語「対象」とは、ヒト、獣医動物または家畜、飼育動物またはペット、及び臨床研究に通常使用される動物を含む哺乳動物を意味する。一実施形態では、これらの方法及び組成物の対象はヒトである。さらに他の適切な対象として、限定されないが、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、非ヒト霊長類などが挙げられる。本明細書中で使用する場合、用語「対象」は、「患者」と同じ意味で用いられる。
神経セロイドリポフスチン症（ＮＣＬ）は、進行性の知的能力及び運動能力の悪化、発作、及び早期死亡を特徴とする遺伝性の神経変性リソソーム蓄積症の一群である。視力喪失はほとんどの形態の特徴である。臨床表現型は、伝統的に、乳児期、乳児期遅発型、若年期、成人期、及び北部てんかん（精神遅滞を伴う進行性てんかん［ＥＰＭＲ］としても知られる）の臨床的特徴の発症年齢及び出現順序に従って特徴づけられている。しかしながら、そこには遺伝学的及び対立遺伝子的な異質性が存在し；原因遺伝子と発症年齢の両方を考慮に入れるために、新しい命名法及び分類システムが提唱され、開発されており；例えば、古典的乳児期遅発型ＣＬＮ２疾患である。最初の症状は通常、２歳～４歳の間に現れ、通常はてんかんから始まり、その後、発達段階の退行、ミオクローヌス性運動失調、及び錐体路徴候が続く。視覚障害は通常、４～６歳で現れ、急速に進行して明暗の認識のみとなる。平均余命は６歳～１０代前半までの範囲である。本明細書中で使用する場合、用語「バッテン病」は、ＣＬＮ２疾患を指すために使用され、これは「ＮＣＬ」と同じ意味で用いられる。
本明細書中で使用する場合、用語「治療」または「治療すること」とは、バッテン病の１つ以上の症状を改善することを目的として、本明細書に記載の１つ以上の化合物または組成物を対象に投与することを包含するものと定義される。したがって、「治療」は、所与の対象における、神経セロイドリポフスチン症（ＮＣＬ）の発症もしくは進行の低減、疾患の予防、疾患症状の重症度の軽減、または失明の進行を含むそれらの進行の遅延、疾患症状の除去、疾患の発症の遅延、または疾患の進行もしくは治療の有効性のモニタリングのうちの１つ以上を含み得る。
方法において使用する「投与」とは、ＣＬＮ２遺伝子の欠損を特徴とする標的選択細胞に組成物を送達することを意味する。一実施形態では、方法は、髄腔内注射によって組成物を送達することを含む。別の実施形態では、対象へのＩＣＶ注射を使用する。別の実施形態では、対象への腰部髄腔内（ＩＴ－Ｌ）注射を使用する。一実施形態では、方法は、槽内（ＩＣ）注射を介して組成物を送達することを含む（すなわち、大槽への画像誘導後頭下穿刺を介した髄腔内送達）。本明細書中で使用する場合、髄腔内という用語は、いくつかの実施形態では、槽内注射を指し得る。さらに別の方法では、血管内注射を使用してもよい。別の実施形態では、筋肉内注射を使用する。本開示を与えられた当業者は、さらに他の投与方法を選択してもよい。
「投与」または「投与経路」とは、医薬担体または賦形剤の存在下または非存在下で、本明細書に記載の組成物を対象へ送達することである。所望により、投与経路を組み合わせてもよい。いくつかの実施形態では、投与を定期的に繰り返す。本明細書に記載の医薬組成物は、任意の適切な経路または異なる経路の組み合わせによって、それを必要とする対象に送達するように設計される。いくつかの実施形態では、脳への直接送達（場合により、髄腔内、槽内、ＩＣＶまたはＩＴ－Ｌ注射によって）、または全身経路、例えば、血管内、動脈内、眼内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、及び他の非経口投与経路による送達を使用する。本明細書に記載の核酸分子、発現カセット及び／またはベクターを、単一の組成物または複数の組成物で送達してもよい。場合により、２つ以上の異なるＡＡＶ、または複数のウイルスを送達してもよい［例えば、ＷＯ２０１１／１２６８０８及びＷＯ２０１３／０４９４９３を参照のこと］。別の実施形態では、複数のウイルスは、異なる複製欠損ウイルス（例えば、ＡＡＶ及びアデノウイルス）を単独で、またはタンパク質と組み合わせて含み得る。本明細書中で使用する場合、用語「髄腔内送達」または「髄腔内投与」とは、薬物が脳脊髄液（ＣＳＦ）に到達するように、脊髄管、より具体的にはくも膜下腔内へ注射することによる薬物の投与経路を指す。髄腔内送達には、腰椎穿刺、脳室内（脳室内（ＩＣＶ）を含む）、後頭下／槽内、及び／またはＣ１－２穿刺が含まれ得る。例えば、くも膜下腔にわたって拡散させるために、腰椎穿刺によって物質を導入してもよい。別の例では、注射は大槽内であってもよい。
本明細書中で使用する場合、用語「槽内送達」または「槽内投与」とは、大槽小脳の脳脊髄液中に直接的に、より具体的には、後頭下穿刺を介するか、または大槽への直接注射によるか、または恒久的に配置されたチューブを介した、薬物の投与経路を指す。本明細書に記載の組成物を脳脊髄液に送達するのに有用な装置は、参照により本明細書に援用されるＰＣＴ／ＵＳ２０１７／１６１３３に記載されている。
ＩＩ－２． 医薬組成物
別の態様では、本明細書において医薬組成物も提供する。
特定の実施形態では、本明細書で提供する医薬組成物は、（ａ）組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）、（ｂ）塩化ナトリウム、（ｃ）塩化マグネシウム、（ｄ）塩化カリウム、（ｅ）デキストロース、（ｆ）ポロキサマー１８８、（ｇ）第一リン酸ナトリウム、及び（ｈ）第二リン酸ナトリウムを含む。特定の実施形態では、医薬組成物は、塩化カルシウムをさらに含む。
特定の実施形態では、医薬組成物中のｒＡＡＶは、当技術分野で公知の任意のｒＡＡＶであり得る。特定の実施形態では、医薬組成物中のｒＡＡＶは、以下の特許出願、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０２７６５０（国際公開第ＷＯ２０１７／１８１０２１号として公開）、ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０２７５６８（国際公開第ＷＯ２０１８／１９１６６６号として公開）、ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０１５９１０（国際公開第ＷＯ２０１８／１４４４４１号として公開）、ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０５２８５５（国際公開第ＷＯ２０１９／０６７５４０号として公開）、ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０４２２０５、ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０４３６３１、ＷＯ２０１９０７９４９４Ａ１、ＷＯ２０１９１６４８５４Ａ１、ＷＯ２０１９０７９４９６Ａ２、ＵＳ２０１９０２１１０９１Ａ１、ＵＳ２０１９０３８７７７Ａ１、ＵＳ２０１８２８９８３９Ａ１、ＵＳ２０１９１２７４５５Ａ１、ＫＲ２０１６００１０５２６Ａ、ＫＲ２０１９００８６５０３Ａ、ＴＷ２０１９０３１４６Ａ、ＷＯ２０１９２０４５１４Ａ１、ＷＯ２０１９２０４５１４Ａ１、ＷＯ２０１９１９１１１４Ａ１、ＷＯ２０１９１６９００４Ａ１、ＷＯ２０１９１６８９６１Ａ１、ＷＯ２０１９１６４８５４Ａ１、ＷＯ２０１９１１３２２４Ａ１、ＷＯ２０１９１０８８５６Ａ１、ＷＯ２０１９１０８８５７Ａ１、ＷＯ２０１９０６０６６２Ａ１、ＷＯ２０１９０３５０６６Ａ１、ＷＯ２０１９０３６４８４Ａ１、ＷＯ２０１９０１０３３５Ａ１、ＷＯ２０１８２３２１４９Ａ１、ＷＯ２０１８２１８３５９Ａ１、ＷＯ２０１８２０９２０５Ａ１、ＷＯ２０１８２０４６２６Ａ１、ＷＯ２０１８２００５４２Ａ１、ＷＯ２０１８２００４１９Ａ１、ＷＯ２０１８１９１４９０Ａ１、ＷＯ２０１８１８３２９３Ａ１、ＷＯ２０１８１６０８４９Ａ１、ＷＯ２０１８１６０５８２Ａ８、ＷＯ２０１８１６０５７３Ａ１、ＷＯ２０１８１６０５８５Ａ２、ＷＯ２０１８１５２４８５Ａ１、ＷＯ２０１８１４４７０９Ａ２、ＷＯ２０１８１２６１１２Ａ１、ＷＯ２０１８１２６１１６Ａ１、ＷＯ２０１８０５９５４９Ａ１、ＷＯ２０１８０５７９１６Ａ１、ＷＯ２０１８０２２９０５Ａ２、ＷＯ２０１８０２２５１１Ａ１、ＷＯ２０１８００９８１４Ａ１、ＷＯ２０１７１９６８１４Ａ１、ＷＯ２０１７１８４４６３Ａ１、ＷＯ２０１７１８１０６８Ａ１、ＷＯ２０１７１８０９３６Ａ１、ＷＯ２０１７１８０８５４Ａ１、ＷＯ２０１７１８０８５７Ａ１、ＷＯ２０１７１５１８８４Ａ１、ＷＯ２０１７１５１８２３Ａ１、ＷＯ２０１７１４７１８０Ａ１、ＷＯ２０１７１３６５００Ａ１、ＷＯ２０１７１３６５３３Ａ１、ＷＯ２０１７１２０２９４Ａ１、ＷＯ２０１７１１４４９７Ａ１、ＷＯ２０１７１０６３４５Ａ１、ＷＯ２０１７１０６３５４Ａ１、ＷＯ２０１７１０６３２６Ａ１、ＷＯ２０１７１０６２４４Ａ１、ＷＯ２０１７１０６２０２Ａ２、ＷＯ２０１７１００６７６Ａ１、ＷＯ２０１７１００７０４Ａ１、ＷＯ２０１７１００６７４Ａ１、ＷＯ２０１７１００６８２Ａ１、ＷＯ２０１７１６０３６０Ａ９、ＷＯ２０１７０８７９００Ａ１、ＷＯ２０１７０７９６５６Ａ２、ＷＯ２０１７０６２７５０Ａ１、ＷＯ２０１７０５３７３２Ａ２、ＷＯ２０１７０４０５２４Ａ１、ＷＯ２０１７０４０５２８Ａ１、ＷＯ２０１７０２４１９８Ａ１、ＷＯ２０１７０１５１０２Ａ１、ＷＯ２０１６１９６３２８Ａ１、ＷＯ２０１６２００５４３Ａ８、ＷＯ２０１６１７９０３４Ａ２、ＷＯ２０１６１７６１９１Ａ１、ＷＯ２０１６１７６２１２Ａ１、ＷＯ２０１６０７３５５６Ａ１、ＷＯ２０１６０１９３６４Ａ１、ＷＯ２０１５１７５６３９Ａ１、ＷＯ２０１５１６４７２３Ａ１、ＷＯ２０１５１３８８７０Ａ２、ＷＯ２０１５１３８３５７Ａ２、ＷＯ２０１５０６６６２７Ａ１、ＷＯ２０１５００９５７５Ａ１、ＷＯ２０１５０１２９２４Ａ２、ＷＯ２０１４１５１３４１Ａ１、ＷＯ２０１４１５１２６５Ａ１、ＷＯ２０１４１２４２８２Ａ１、ＷＯ２０１４０５９０６８Ａ１、ＷＯ２０１４０５２６９３Ａ２、ＷＯ２０１４０１２０２５Ａ２、ＷＯ２０１３１７３７０２Ａ２、ＷＯ２０１３１６２７４８Ａ１、ＷＯ２０１３１４２３３７Ａ１、ＷＯ２０１４０１１２１０Ａ１、ＷＯ２０１３０４９４９３Ａ１、ＷＯ２０１２１５８７５７Ａ１、ＷＯ２０１２１４５５７２Ａ１、ＷＯ２０１２１１２８３２Ａ１、ＷＯ２０１２０７１３１８Ａ２、ＷＯ２０１１１２６８０８Ａ９、ＷＯ２０１１１１２５５４Ａ１、ＷＯ２０１１０６０２３３Ａ１、ＷＯ２０１１０４１５０２Ａ１、ＷＯ２０１１０３８１８７Ａ１、ＷＯ２０１１０３８０６３Ａ１、ＷＯ２０１０１３８６７５Ａ１、ＷＯ２０１０１２７０９７Ａ１、ＷＯ２０１０１０２１４０Ａ１、ＷＯ２０１００５６７５９Ａ１、ＷＯ２０１００５１３６７Ａ１、ＷＯ２０１００６２５６２Ａ１、ＷＯ２０１００４０１３５Ａ１、ＷＯ２０１００１１６４２Ａ２、ＷＯ２０１０００８７８２Ａ１、ＷＯ２００９１３４６８１Ａ２、ＷＯ２００９１３６９７７Ａ２、ＷＯ２００９１０５０８４Ａ２、ＷＯ２００９０７３１０４Ａ２、ＷＯ２００９０７３１０３Ａ２、ＷＯ２００８１５０４５９Ａ１、ＷＯ２００８１４０８１２Ａ２、ＷＯ２００８０８５４８６Ａ１、ＷＯ２００８０７９１７２Ａ２、ＷＯ２００８０１９１３１Ａ２、ＷＯ２００８０１３９２８Ａ２、ＷＯ２００７１３０４５５Ａ２、ＷＯ２００７１２７２６４Ａ２、ＷＯ２００８０２７０８４Ａ２、ＷＯ２００７１０６４７６Ａ２、ＷＯ２００７０７０７０５Ａ２、ＷＯ２００７０２４７０８Ａ２、ＷＯ２００７００２２８５Ａ２、ＷＯ２００６１１０６８９Ａ２、ＷＯ２００６１０２０７２Ａ２、ＷＯ２００６０３９２１８Ａ２、ＷＯ２００６０７８２７９Ａ２、ＷＯ２００５１１８６１１Ａ２、ＷＯ２００５０６２９５７Ａ２、ＷＯ２００５０３３３２１Ａ２、ＷＯ２００５０３０２９２Ａ２、ＷＯ２００５０２７９９５Ａ２、ＷＯ２００５０１８４３１Ａ２、ＷＯ２００５００１１０３Ａ２、ＷＯ２００４１０８９２２Ａ３、ＷＯ２００４０９４６０６Ａ２、ＷＯ２００４００９７６９Ａ２、ＷＯ０３０９３４６０Ａ１、ＷＯ０３０５７１７１Ａ２、ＷＯ０３０４６１２４Ａ２、ＷＯ０３０５２０５１Ａ３、ＷＯ０３０５２０５２Ａ３、ＷＯ０３０４２３９７Ａ３、ＷＯ０３０３８０６２Ａ２、ＷＯ０３０２４５０２Ａ２、ＷＯ０３０１４３６７Ａ１、ＷＯ０３０００８５１Ａ２、ＷＯ０２１００３１７Ａ２、ＷＯ０２０８２９０４Ａ２、ＷＯ０２３０４１０Ａ２、ＷＯ０２２０７１８Ａ２、ＷＯ０２１０４１０Ａ１、ＷＯ０１８３６９２Ａ２、ＷＯ０１７４１６３Ａ１、ＷＯ０１７２３２９Ａ１、ＷＯ０１２３００１Ａ２、ＷＯ０１２３５９７Ａ９、ＷＯ００５７８３７Ａ２、ＷＯ００５５３４２Ａ１、ＷＯ００２８０６１Ａ２、ＷＯ９９４４６４５Ａ１、ＷＯ９９４３３６０Ａ１、ＷＯ９９３１９８２Ａ１、ＷＯ９９１５６７７Ａ１、ＷＯ９９１４３５４Ａ１、ＷＯ９９１５６８５Ａ１、ＷＯ９９１００１３Ａ１、ＷＯ９６３９５３０Ａ３、ＷＯ９６３９４１６Ａ１、ＷＯ９６２６２８６Ａ１、及びＷＯ９６１３５９８Ａ２において開示されている任意のｒＡＡＶである（本明細書で参照されるすべての刊行物、特許及び特許出願は、その全体が参照により援用される）。
特定の実施形態では、医薬組成物中のｒＡＡＶは、ＲＧＸ－１２１（ＲＥＧＥＮＸＢＩＯ Ｉｎｃ．）、ＲＧＸ－１１１（ＲＥＧＥＮＸＢＩＯ Ｉｎｃ．）、ＲＧＸ－３１４（ＲＥＧＥＮＸＢＩＯ Ｉｎｃ．）、ＲＧＸ－１８１（ＲＥＧＥＮＸＢＩＯ Ｉｎｃ．）、ＲＧＸ－５０１（ＲＥＧＥＮＸＢＩＯ Ｉｎｃ．）、Ｇｌｙｂｅｒａ（登録商標）（ａｌｉｐｏｇｅｎｅ ｔｉｐａｒｖｏｖｅｃ）（ｕｎｉＱｕｒｅ）、Ｖｏｒｅｔｉｇｅｎｅ ｎｅｐａｒｖｏｖｅｃ（ＳＰＫ－ＲＰＥ６５）（Ｓｐａｒｋ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ；ＭｉｅｒａＧＴｘ ＵＫ ＩＩ Ｌｔｄ／Ｓｙｎｅ Ｑｕａ Ｎｏｎ Ｌｔｄ／ＵＣＬ）、ｒＡＡＶ２－ＣＢＳＢ－ｈＲＰＥ６５（ＵＰｅｎｎ；ＮＥＩ）、ｒＡＡＶ２－ｈＲＰＥ６５（ＨＭＯ）、ＳＰＫ－ＣＨＭ（Ｓｐａｒｋ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、ＣＮＧＡ３－ＡＣＨＭ（ＡＧＴＣ）、ＣＮＧＢ３－ＡＣＨＭ（ＡＧＴＣ）、ｓｃＡＡＶ２－Ｐ１ＮＤ４（ＮＥＩ）、ＸＬＲＳ遺伝子治療薬（Ｂｉｏｇｅｎ／ＡＧＴＣ）、ＢＭＮ－２７０（Ｂｉｏｍａｒｉｎ）、ＳＢ－５２５（Ｓａｎｇａｍｏ）、ＤＴＸ１０１（Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、ＳＰＫ－９００１（ＳＰＫ－ＦＩＸ）（Ｓｐａｒｋ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ／Ｐｆｉｚｅｒ）、ＡＭＴ－０６０（ｕｎｉＱｕｒｅ／Ｓｔ．Ｊｕｄｅ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ）、ＳＢ－ＦＩＸ（Ｓａｎｇａｍｏ）、ｓｃＡＡＶ２／８－ＬＰ１－ｈＦＩＸｃｏ（Ｓｔ．Ｊｕｄｅ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ／ＵＣＬ）、ＡＤＶＭ－０４３（Ａｄｖｅｒｕｍ）、ＡＶＸＳ－１０１（ＡｖｅＸｉｓ）、ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィン（ＮＩＣＨＤ）、ＬＧＭＤ２Ｄ（ＮＣＨ）、ｒＡＡＶ１．ＣＭＶ．ヒトフォリスタチン３４４（ＮＣＨ）、ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ＤＹＳＦ．ＤＶ（ＮＣＨ）、ＡＲＴ－１０２（Ａｒｔｈｒｏｇｅｎ）、脳内遺伝子治療薬（ＩＮＳＥＲＭ）、ＣＥＲＥ－１１０（Ｃｅｒｅｇｅｎｅ）、ＣＥＲＥ－１２０（Ｃｅｒｅｇｅｎｅ／Ｓａｎｇａｍｏ）、ＡＡＶ－ｈＡＡＤＣ（ＮＩＨ）、ＡＡＶ２ＣＵｈＣＬＮ２（ワイルコーネル医科大学；Ａｂｅｏｎａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、ＳＡＦ－３０１（Ｌｙｓｏｇｅｎｅ）、ＤＴＸ３０１（Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、及びＴＴ－０３４（Ｔａｃｅｒｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）からなる群から選択され得る（Ｎａｓｏ ｅｔ ａｌ． ＢｉｏＤｒｕｇｓ．２０１７；３１（４）：３１７－３３４を参照のこと）。
特定の実施形態では、医薬組成物中のｒＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、及びＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ｒＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、またはＡＡＶ．ＨＳＣ１６からなる群から選択される１つ以上のアデノ随伴ウイルス血清型由来の成分を含み得る。いくつかの実施形態では、医薬組成物中のｒＡＡＶは、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９血清型のキャプシドタンパク質を含む。好ましい実施形態では、医薬組成物中のｒＡＡＶは、ＡＡＶ９由来の成分を含む。
特定の実施形態では、医薬組成物は、複数の化合物を含む。特定の実施形態では、化合物は、異なる水和物形態、例えば、無水物、一水和物、二水和物、３水和物、４水和物、５水和物、６水和物、７水和物、８水和物、９水和物、及び１０水和物の形態からなるがこれらに限定されない群から選択される水和物形態である。
特定の実施形態では、医薬組成物中の化合物の重量／体積濃度は、異なる水和物形態の化合物と同等のモル量を有する無水形態の化合物に基づいて表され得る。特定の実施形態では、無水形態は天然には存在しない場合がある。
特定の実施形態では、医薬組成物中の特定の水和物形態の化合物は、同等のモル量を有する異なる水和物形態の同じ化合物を表し得る。
特定の実施形態では、医薬組成物は、塩化カルシウム、例えば、二水和物形態の塩化カルシウムを含む。他の実施形態では、医薬組成物は、塩化カルシウムを含まない。
特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは約７．４である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは約６．０～８．８である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは約６．０～９．０である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは約６．０である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは約６．１である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは約６．２である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは約６．３である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは約６．４である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは約６．５である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは約６．６である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは約６．７である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは約６．８である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは約６．９である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは約７．０である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは約７．１である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは約７．２である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは約７．３である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは約７．４である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは約７．５である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは約７．６である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは約７．７である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは約７．８である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは約７．９である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは約８．０である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは約８．１である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは約８．２である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは約８．３である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは約８．４である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは約８．５である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは約８．６である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは約８．７である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは約８．８である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは約８．９である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは約９．０である。
特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは７．４である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは６．０～８．８である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは６．０～９．０である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは６．０である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは６．１である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは６．２である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは６．３である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは６．４である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは６．５である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは６．６である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは６．７である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは６．８である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは６．９である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは７．０である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは７．１である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは７．２である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは７．３である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは７．４である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは７．５である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは７．６である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは７．７である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは７．８である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは７．９である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは８．０である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは８．１である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは８．２である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは８．３である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは８．４である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは８．５である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは８．６である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは８．７である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは８．８である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは８．９である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは９．０である。
特定の実施形態では、本明細書で提供する医薬組成物は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）、ならびに塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カリウム、デキストロース、ポロキサマー１８８、第一リン酸ナトリウム、及び第二リン酸ナトリウムからなる群から選択される１つ以上の化合物を含む。特定の実施形態では、医薬組成物は、塩化カルシウムをさらに含む。
特定の実施形態では、本明細書で提供する医薬組成物は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）、ならびに塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カリウム、デキストロース、ポロキサマー１８８、第一リン酸ナトリウム、及び第二リン酸ナトリウムからなる群から選択される１つの化合物を含む。特定の実施形態では、医薬組成物は、塩化カルシウムをさらに含む。
特定の実施形態では、本明細書で提供する医薬組成物は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）、ならびに塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カリウム、デキストロース、ポロキサマー１８８、第一リン酸ナトリウム、及び第二リン酸ナトリウムからなる群から選択される２つの化合物を含む。特定の実施形態では、医薬組成物は、塩化カルシウムをさらに含む。
特定の実施形態では、本明細書で提供する医薬組成物は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）、ならびに塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カリウム、デキストロース、ポロキサマー１８８、第一リン酸ナトリウム、及び第二リン酸ナトリウムからなる群から選択される３つの化合物を含む。特定の実施形態では、医薬組成物は、塩化カルシウムをさらに含む。
特定の実施形態では、本明細書で提供する医薬組成物は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）、ならびに塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カリウム、デキストロース、ポロキサマー１８８、第一リン酸ナトリウム、及び第二リン酸ナトリウムからなる群から選択される４つの化合物を含む。特定の実施形態では、医薬組成物は、塩化カルシウムをさらに含む。
特定の実施形態では、本明細書で提供する医薬組成物は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）、ならびに塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カリウム、デキストロース、ポロキサマー１８８、第一リン酸ナトリウム、及び第二リン酸ナトリウムからなる群から選択される５つの化合物を含む。特定の実施形態では、医薬組成物は、塩化カルシウムをさらに含む。
特定の実施形態では、本明細書で提供する医薬組成物は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）、ならびに塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カリウム、デキストロース、ポロキサマー１８８、第一リン酸ナトリウム、及び第二リン酸ナトリウムからなる群から選択される６つの化合物を含む。特定の実施形態では、医薬組成物は、塩化カルシウムをさらに含む。
特定の実施形態では、本明細書で提供する医薬組成物は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）、ならびに塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カリウム、デキストロース、ポロキサマー１８８、第一リン酸ナトリウム、及び第二リン酸ナトリウムからなる群から選択される７つすべての化合物を含む。特定の実施形態では、医薬組成物は、塩化カルシウムをさらに含む。
特定の実施形態では、本明細書において、以下を含む医薬組成物を提供し：
（ａ）組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）、
（ｂ）塩化ナトリウム、
（ｃ）塩化マグネシウム、
（ｄ）塩化カリウム、
（ｅ）デキストロース、
（ｆ）ポロキサマー１８８、
（ｇ）第一リン酸ナトリウム、及び
（ｈ）第二リン酸ナトリウム、
その場合、当該組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）は、ＡＡＶキャプシド及びその内部にパッケージされたベクターゲノムを含み、当該ベクターゲノムは、以下を含む：（ｉ）ＡＡＶ ５’逆位末端（ＩＴＲ）配列；（ｉｉ）プロモーター；（ｉｉｉ）ヒトＴＰＰ１をコードするＣＬＮ２コード配列；及び（ｉｖ）ＡＡＶ ３’ＩＴＲ。
特定の実施形態では、医薬組成物は、塩化カルシウムをさらに含む。
特定の実施形態では、当該塩化ナトリウム、当該塩化マグネシウム、当該塩化カリウム、当該デキストロース、当該ポロキサマー１８８、当該第一リン酸ナトリウム、当該第二リン酸ナトリウム、及び当該塩化カルシウムは、それぞれ、無水、一水和物、二水和物、３水和物、４水和物、５水和物、６水和物、７水和物、８水和物、９水和物、または１０水和物の形態である。
特定の実施形態では、医薬組成物は、以下を含む。
（ａ）当該ｒＡＡＶ、
（ｂ）約８．７７ｇ／Ｌの濃度の塩化ナトリウム、
（ｃ）約０．２４４ｇ／Ｌの濃度の塩化マグネシウム６水和物、
（ｄ）約０．２２４ｇ／Ｌの濃度の塩化カリウム、
（ｅ）約０．２０６ｇ／Ｌの濃度の塩化カルシウム二水和物、
（ｆ）約０．７９３ｇ／Ｌの濃度の無水デキストロース、
（ｇ）約０．００１％（体積／体積）の濃度のポロキサマー１８８、
（ｈ）約０．０２７８ｇ／Ｌの濃度の第一リン酸ナトリウム一水和物、及び
（ｉ）約０．１１４ｇ／Ｌの濃度の第二リン酸ナトリウム無水物。
特定の実施形態では、医薬組成物のベクターゲノム濃度（ＶＧＣ）は、約１×１０１１ＧＣ／ｍＬ、約３×１０１１ＧＣ／ｍＬ、約６×１０１１ＧＣ／ｍＬ、約１×１０１２ＧＣ／ｍＬ、約３×１０１２ＧＣ／ｍＬ、約６×１０１２ＧＣ／ｍＬ、約１×１０１３ＧＣ／ｍＬ、約２×１０１３ＧＣ／ｍＬ、約３×１０１３ＧＣ／ｍＬ、約４×１０１３ＧＣ／ｍＬ、約５×１０１３ＧＣ／ｍＬ、約６×１０１３ＧＣ／ｍＬ、約７×１０１３ＧＣ／ｍＬ、約８×１０１３ＧＣ／ｍＬ、約９×１０１３ＧＣ／ｍＬ、または約１×１０１４ＧＣ／ｍＬ、約３×１０１４ＧＣ／ｍＬ、約６×１０１４ＧＣ／ｍＬ、または約１×１０１５ＧＣ／ｍＬである。特定の実施形態では、医薬組成物のベクターゲノム濃度（ＶＧＣ）は、１×１０１１ＧＣ／ｍＬ、３×１０１１ＧＣ／ｍＬ、６×１０１１ＧＣ／ｍＬ、１×１０１２ＧＣ／ｍＬ、３×１０１２ＧＣ／ｍＬ、６×１０１２ＧＣ／ｍＬ、１×１０１３ＧＣ／ｍＬ、２×１０１３ＧＣ／ｍＬ、約３×１０１３ＧＣ／ｍＬ、４×１０１３ＧＣ／ｍＬ、５×１０１３ＧＣ／ｍＬ、６×１０１３ＧＣ／ｍＬ、７×１０１３ＧＣ／ｍＬ、８×１０１３ＧＣ／ｍＬ、９×１０１３ＧＣ／ｍＬ、または１×１０１４ＧＣ／ｍＬ、３×１０１４ＧＣ／ｍＬ、６×１０１４ＧＣ／ｍＬ、または１×１０１５ＧＣ／ｍＬである。
特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは、約６．０～約９．０の範囲にある。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは約７．４である。
特定の実施形態では、医薬組成物中のｒＡＡＶは、参照医薬組成物中の同じ組換えｒＡＡＶに比べて凍結／解凍サイクルに対して、少なくとも２％、５％、７％、１０％、１２％、１５％、１７％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、１００％、２倍、３倍、５倍、１０倍、１００倍、または１０００倍安定である。特定の実施形態では、組換えＡＡＶの安定性を、ＩＶ節及び実施例に開示する１つ以上のアッセイによって測定する。
特定の実施形態では、医薬組成物中の当該ｒＡＡＶの安定性を、以下によって測定する。
（ａ）ｒＡＡＶの感染力、
（ｂ）ｒＡＡＶの凝集レベル、または
（ｃ）ｒＡＡＶによって放出された遊離ＤＮＡのレベル。
特定の実施形態では、医薬組成物は、液体組成物である。特定の実施形態では、医薬組成物は、凍結組成物である。特定の実施形態では、医薬組成物は、凍結乾燥組成物または再構成された凍結乾燥組成物である。
特定の実施形態では、医薬組成物は、脳室内（ＩＣＶ）、槽内（ＩＣ）、腰部髄腔内、頭蓋内、静脈内、血管内、動脈内、筋肉内、眼内、筋肉内、皮下、または皮内投与に適した特性を有する。
特定の実施形態では、医薬組成物中のｒＡＡＶの（ｉｉｉ）のコード配列は、コドン最適化されたヒトＣＬＮ２であり、これは、配列番号２の天然ヒトコード配列に対して少なくとも７０％同一である。特定の実施形態では、医薬組成物中のｒＡＡＶの（ｉｉｉ）のコード配列は、配列番号３である。
特定の実施形態では、医薬組成物中のｒＡＡＶのｒＡＡＶキャプシドは、ＡＡＶ９またはそのバリアントである。
特定の実施形態では、医薬組成物中のｒＡＡＶのプロモーターは、ニワトリβアクチン（ＣＢＡ）プロモーターである。特定の実施形態では、医薬組成物中のｒＡＡＶのプロモーターは、ＣＢＡプロモーター配列とサイトメガロウイルスエンハンサーエレメントを含むハイブリッドプロモーターである。
特定の実施形態では、医薬組成物中のｒＡＡＶのＡＡＶ ５’ＩＴＲ及び／またはＡＡＶ ３’ＩＴＲは、ＡＡＶ２由来である。
特定の実施形態では、医薬組成物中のｒＡＡＶのベクターゲノムは、ポリＡをさらに含む。特定の実施形態では、ポリＡは、合成ポリＡであるか、またはウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ＳＶ４０、ウサギβ－グロビン（ＲＧＢ）、または修飾ＲＧＢ（ｍＲＧＢ）由来である。
特定の実施形態では、医薬組成物中のｒＡＡＶのベクターゲノムは、イントロンをさらに含む。特定の実施形態では、イントロンは、ＣＢＡ、ヒトβグロビン、ＩＶＳ２、ＳＶ４０、ｂＧＨ、αグロブリン、βグロブリン、コラーゲン、オボアルブミン、またはｐ５３由来である。
特定の実施形態では、医薬組成物中のｒＡＡＶのベクターゲノムは、エンハンサーをさらに含む。特定の実施形態では、エンハンサーは、ＣＭＶエンハンサー、ＲＳＶエンハンサー、ＡＰＢエンハンサー、ＡＢＰＳエンハンサー、αｍｉｃ／ｂｉｋエンハンサー、ＴＴＲエンハンサー、ｅｎ３４、ＡｐｏＥである。
特定の実施形態では、医薬組成物中のｒＡＡＶのベクターゲノムは、サイズが約３キロベース～約５．５キロベースである。特定の実施形態では、医薬組成物中のｒＡＡＶのベクターゲノムは、サイズが約４キロベースである。
特定の実施形態では、ｒＡＡＶを産生することができる浮遊細胞株を浮遊培養で増殖させることを含む方法を使用して、医薬組成物中のｒＡＡＶを製造する。
別の態様では、本明細書で提供する医薬組成物を対象に投与することを含む、当該対象におけるＣＬＮ２バッテン病の治療方法を本明細書で提供する。特定の実施形態では、当該医薬組成物を、治療有効量で投与する。特定の実施形態では、当該対象はヒトである。
さらに別の態様では、本明細書において、１つ以上の容器及び使用説明書を含むキットを提供し、１つ以上の容器は、本明細書で提供する医薬組成物を含む。
特定の実施形態では、医薬組成物は、０．００１％（重量／体積、０．０１ｇ／Ｌ）の濃度でポロキサマー１８８を含む。特定の実施形態では、医薬組成物は、０．０００５％（重量／体積、０．００５ｇ／Ｌ）～０．０５％（重量／体積、０．５ｇ／Ｌ）の濃度でポロキサマー１８８を含む。特定の実施形態では、医薬組成物は、０．０００１％（重量／体積、０．００１ｇ／Ｌ）～０．０１％（重量／体積、０．１ｇ／Ｌ）の濃度でポロキサマー１８８を含む。特定の実施形態では、医薬組成物は、０．０００５％（重量／体積、０．００５ｇ／Ｌ）～０．００１％（重量／体積、０．０１ｇ／Ｌ）の濃度でポロキサマー１８８を含む。特定の実施形態では、医薬組成物は、０．００１％（重量／体積、０．０１ｇ／Ｌ）～０．０５％（重量／体積、０．５ｇ／Ｌ）の濃度でポロキサマー１８８を含む。特定の実施形態では、医薬組成物は、０．０００５％（重量／体積、０．００５ｇ／Ｌ）の濃度でポロキサマー１８８を含む。特定の実施形態では、医薬組成物は、０．０００６％（重量／体積、０．００６ｇ／Ｌ）の濃度でポロキサマー１８８を含む。特定の実施形態では、医薬組成物は、０．０００７％（重量／体積、０．００７ｇ／Ｌ）の濃度でポロキサマー１８８を含む。特定の実施形態では、医薬組成物は、０．０００８％（重量／体積、０．００８ｇ／Ｌ）の濃度でポロキサマー１８８を含む。特定の実施形態では、医薬組成物は、０．０００９％（重量／体積、０．００９ｇ／Ｌ）の濃度でポロキサマー１８８を含む。特定の実施形態では、医薬組成物は、０．００１％（重量／体積、０．０１ｇ／Ｌ）の濃度でポロキサマー１８８を含む。特定の実施形態では、医薬組成物は、０．００２％（重量／体積、０．０２ｇ／Ｌ）の濃度でポロキサマー１８８を含む。特定の実施形態では、医薬組成物は、０．００３％（重量／体積、０．０３ｇ／Ｌ）の濃度でポロキサマー１８８を含む。特定の実施形態では、医薬組成物は、０．００４％（重量／体積、０．０４ｇ／Ｌ）の濃度でポロキサマー１８８を含む。特定の実施形態では、医薬組成物は、０．００５％（重量／体積、０．０５ｇ／Ｌ）の濃度でポロキサマー１８８を含む。特定の実施形態では、医薬組成物は、０．０１％（重量／体積、０．１ｇ／Ｌ）の濃度でポロキサマー１８８を含む。特定の実施形態では、医薬組成物は、０．０５％（重量／体積、０．５ｇ／Ｌ）の濃度でポロキサマー１８８を含む。
本明細書中で使用する場合、及び特に明記されていない限り、用語「約」とは、所与の値または範囲の±１０％以内を意味する。
本明細書に記載の医薬組成物は、任意の適切な経路または異なる経路の組み合わせによって、それを必要とする対象に送達するように設計される。
さらに他の態様では、これらの核酸配列、ベクター、発現カセット及びｒＡＡＶウイルスベクターは、医薬組成物において有用であり、医薬組成物はまた、薬学的に許容される担体、賦形剤、緩衝液、希釈剤、界面活性剤、防腐剤及び／またはアジュバントなども含む。そのような医薬組成物を使用してそのような組換え改変型ＡＡＶまたは人工ＡＡＶで送達することにより、宿主細胞内で最適化されたＴＰＰ１を発現させる。
核酸配列、ベクター、発現カセット及びｒＡＡＶウイルスベクターを含有するこれらの医薬組成物を調製するために、配列またはベクターまたはウイルスベクターを、好ましくは、従来の方法によって汚染について評価し、次いで、患者への投与に適した医薬組成物に製剤化する。そのような製剤は、ｐＨを適切な生理学的レベルに維持するための薬学的及び／または生理学的に許容されるビヒクルまたは担体、例えば、緩衝生理食塩水または他の緩衝液、例えば、ＨＥＰＥＳ、ならびに場合により、他の薬剤、医薬品、安定剤、緩衝液、担体、アジュバント、希釈剤、界面活性剤、または賦形剤などの使用を含む。注射の場合、担体は通常、液体である。例示的な生理学的に許容される担体として、無菌のパイロジェンフリーの水及び無菌のパイロジェンフリーのリン酸緩衝生理食塩水が挙げられる。様々なそのような公知の担体は、参照により本明細書に援用される米国特許公開第７，６２９，３２２号に示されている。一実施形態では、担体は等張塩化ナトリウム溶液である。別の実施形態では、担体は平衡塩類溶液である。一実施形態では、担体は、ｔｗｅｅｎを含む。ウイルスを長期間保存する場合は、グリセロールまたはＴｗｅｅｎ２０の存在下で凍結させてもよい。
例示的な特定の一実施形態では、担体または賦形剤の組成物は、１８０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＮａＰｉ、ｐＨ７．３、０．０００１％～０．０１％のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８（ＰＦ６８）を含有する。緩衝液の生理食塩水成分の正確な組成範囲は、１６０ｍＭ～１８０ｍＭ ＮａＣｌである。場合により、具体的に記載している緩衝液の代わりに、異なるｐＨ緩衝液（潜在的にＨＥＰＥＳ、重曹、ＴＲＩＳ）を使用する。さらに代わりに、０．９％のＮａＣｌを含有する緩衝液が有用である。
本明細書中で使用する場合、用語「用量」とは、治療の過程で対象に送達する総投与量、または単一の単位（または複数の単位もしくは分割投与量）の投与で送達する量を指し得る。医薬ウイルス組成物は、本明細書に記載のＴＰＰ１をコードするコドン最適化核酸配列を保有する、ある量の複製欠損ウイルスが含まれるように、投与あたり約１．０×１０９ＧＣ～約１．０×１０１６ＧＣの範囲（範囲内のすべての整数または端数を含む）の投薬単位で製剤化することができる。一実施形態では、組成物を、投与あたり少なくとも１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、または９×１０９ＧＣ（範囲内のすべての整数または端数を含む）を含有するように製剤化する。別の実施形態では、組成物を、投与あたり少なくとも１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、または９×１０１０ＧＣ（範囲内のすべての整数または端数を含む）を含有するように製剤化する。別の実施形態では、組成物を、投与あたり少なくとも１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、または９×１０１１ＧＣ（範囲内のすべての整数または端数を含む）を含有するように製剤化する。別の実施形態では、組成物を、投与あたり少なくとも１×１０１２、２×１０１２、３×１０１２、４×１０１２、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、または９×１０１２ＧＣ（範囲内のすべての整数または端数を含む）を含有するように製剤化する。別の実施形態では、組成物を、投与あたり少なくとも１×１０１３、２×１０１３、３×１０１３、４×１０１３、５×１０１３、６×１０１３、７×１０１３、８×１０１３、または９×１０１３ＧＣ（範囲内のすべての整数または端数を含む）を含有するように製剤化する。別の実施形態では、組成物を、投与あたり少なくとも１×１０１４、２×１０１４、３×１０１４、４×１０１４、５×１０１４、６×１０１４、７×１０１４、８×１０１４、または９×１０１４ＧＣ（範囲内のすべての整数または端数を含む）を含有するように製剤化する。別の実施形態では、組成物を、投与あたり少なくとも１×１０１５、２×１０１５、３×１０１５、４×１０１５、５×１０１５、６×１０１５、７×１０１５、８×１０１５、または９×１０１５ＧＣ（範囲内のすべての整数または端数を含む）を含有するように製剤化する。一実施形態では、ヒトへの投与の場合、用量を、投与あたり１×１０１０～約１×１０１２ＧＣの範囲（範囲内のすべての整数または端数を含む）とすることができる。別の実施形態では、組成物を、少なくとも７．５×１０１２ＧＣ（７．５×１０９ＧＣ／ｇ脳質量）～２．７×１０１５ＧＣ（２．１×１０１２ＧＣ／ｇ脳質量）を含有するように製剤化する。平均的な人間の脳の質量は、約１，３００ｇ～約１，４００ｇであることが当技術分野で知られている。また、本明細書の組成物は、約１０００ｇ～約１３００ｇの範囲の脳量を有する子供に有用であると考えられる。すべての用量は、例えば、参照により本明細書に援用されるＭ．Ｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１４ Ａｐｒ；２５（２）：１１５－２５． ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｇｔｂ．２０１３．１３１に記載されているように、ｏｑＰＣＲまたはデジタルドロップレットＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）によって測定されるものを含む、任意の既知の方法によって測定してもよい。
一実施形態では、バッテン患者への投与に適した水性懸濁液を提供する。懸濁液は、水性懸濁液と、バッテン病の治療薬として有用な、脳１グラムあたり約７．５×１０９ＧＣまたはウイルス粒子～約２．１×１０１２ＧＣまたはウイルス粒子の本明細書に記載の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）とを含む。
本発明の医薬組成物の複数の「ブースター」用量を投与することが望ましい場合もある。例えば、ＣＮＳ内の導入遺伝子の期間に応じて、６か月間隔で、または最初の投与後毎年、ブースター用量を送達してもよい。ＡＡＶ中和抗体がｒＡＡＶベクターの投与によって生成されなかったという事実は、追加のブースター投与を可能にするはずである。
そのようなブースター用量及びその必要性は、例えば、ＴＰＰ１活性、及び以下の実施例に記載する神経認知試験を使用して、主治医がモニタリングすることができる。他の同様の試験を使用して、経時的な治療対象の状態を判定してもよい。適切な試験の選択は、主治医が行ってもよい。さらに代わりに、本発明の方法はまた、単一または複数の感染において大量のウイルス含有溶液を注射して、ＴＰＰ１活性レベルを、正常な対象において認められるレベルに近づけることを含み得る。
これらの上記の用量は、患者のサイズ、使用するウイルス力価、投与経路、及び方法の所望の効果に応じて、様々な量の担体、賦形剤または緩衝製剤中で、約１００マイクロリットル～約５０ｍＬの範囲（範囲内のすべての数値を含む）で投与してもよい。一実施形態では、容量は１０ｍＬ未満である。一実施形態では、担体、賦形剤または緩衝液の容量は、少なくとも約５００μＬである。一実施形態では、容量は約７５０μＬである。別の実施形態では、容量は約１ｍＬである。別の実施形態では、容量は約２ｍＬである。別の実施形態では、容量は約３ｍＬである。別の実施形態では、容量は約４ｍＬである。別の実施形態では、容量は約５ｍＬである。別の実施形態では、容量は約６ｍＬである。別の実施形態では、容量は約７ｍＬである。別の実施形態では、容量は約８ｍＬである。別の実施形態では、容量は約９ｍＬである。別の実施形態では、容量は約１０ｍＬである。別の実施形態では、容量は約１１ｍＬである。別の実施形態では、容量は約１２ｍＬである。別の実施形態では、容量は約１３ｍＬである。別の実施形態では、容量は約１４ｍＬである。別の実施形態では、容量は約１５ｍＬである。別の実施形態では、容量は約１６ｍＬである。別の実施形態では、容量は約１７ｍＬである。別の実施形態では、容量は約１８ｍＬである。別の実施形態では、容量は約１９ｍＬである。別の実施形態では、容量は約２０ｍＬである。別の実施形態では、容量は約２１ｍＬである。別の実施形態では、容量は約２２ｍＬである。別の実施形態では、容量は約２３ｍＬである。別の実施形態では、容量は約２４ｍＬである。別の実施形態では、容量は約２５ｍＬ以上である。一実施形態では、最大注入量は、脳脊髄液の総量の約１０％である。
一実施形態では、ウイルス構築物を、マウスなどの小動物対象に対して約１００マイクロリットルｍＬ～約１ｍＬの容量で、少なくとも１×１０９～約１×１０１３ＧＣの用量で送達してもよい。より大きな獣医学対象の場合、上記のより大きなヒト用量及び容量が有用である。様々な獣医学動物への物質投与の良好な実践の議論については、例えば、Ｄｉｅｈｌ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，２１：１５－２３（２００１）を参照のこと。この文献は、参照により本明細書に援用される。
毒性などの望ましくない影響のリスクを低減するために、ウイルスまたは他の送達ビヒクルの最低有効濃度を利用することが望ましい。これらの範囲のさらに他の用量は、治療しようとする対象、好ましくはヒト、の身体状態、対象の年齢、及び障害の発症の程度を考慮して、主治医が選択してもよい。
本明細書に記載のさらに別の態様は、哺乳動物対象におけるバッテン病の治療方法、進行の遅延方法または停止方法である。一実施形態では、好ましくは生理学的に適合性のある担体、希釈剤、賦形剤及び／またはアジュバントに懸濁させた、ＣＬＮ２の天然型、改変型またはコドン最適化配列を有するｒＡＡＶを、ヒト対象を含む所望の対象に治療有効量で投与してもよい。この方法は、核酸配列、発現カセット、ｒＡＡＶゲノム、プラスミド、ベクターもしくはｒＡＡＶベクターまたはそれらを含有する組成物のいずれかを、それを必要とする対象に投与することを含む。一実施形態では、組成物を、髄腔内に送達する。別の実施形態では、組成物を、ＩＣＶを介して送達する。別の実施形態では、組成物を、槽内に送達する。さらに別の実施形態では、組成物を、バッテン病の治療に適した投与経路の組み合わせを使用して送達し、それには静脈内投与または他の従来の投与経路も含まれ得る。
これらの方法で使用するために、本明細書でさらに記載するように、各用量の容量及びウイルス力価を個別に決定する。用量、投与及びレジメンは、この仕様の教示を与えられた主治医が決定してもよい。別の実施形態では、方法は、組成物を２つ以上の用量（例えば、分割用量）で投与することを含む。別の実施形態では、選択された発現カセット（例えば、ＣＬＮ２含有カセット）を含むｒＡＡＶの第２の投与を、後の時点で実施する。そのような時点は、最初の投与から数週間後、数か月後、または数年後であり得る。そのような第２の投与を、一実施形態では、第１の投与のｒＡＡＶとは異なるキャプシドを有するｒＡＡＶを用いて実施する。別の実施形態では、第１及び第２の投与のｒＡＡＶは、同じキャプシドを有する。
さらに他の実施形態では、本明細書に記載の組成物を、単一の組成物または複数の組成物で送達してもよい。場合により、２つ以上の異なるＡＡＶ、または複数のウイルスを送達してもよい（例えば、ＷＯ２０１１／１２６８０８及びＷＯ２０１３／０４９４９３を参照のこと）。別の実施形態では、複数のウイルスは、異なる複製欠損ウイルス（例えば、ＡＡＶ及びアデノウイルス）を含み得る。
本発明に従って、「治療有効量」のｈＴＰＰ１を本明細書に記載のように送達して、所望の結果、すなわち、バッテン病またはその１つ以上の症状の治療を達成する。身体、発作、行動、及び能力の包括的な評価系である統一バッテン病評価尺度（ＵＢＤＲＳ）が提案されている。ｒａｒｅｄｉｓｅａｓｅｓ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｆｉｌｅｓ／ｍｉｎｋ．ｐｄｆで閲覧可能なＭｉｎｋ，Ｊ．，Ｔｈｅ Ｕｎｉｆｉｅｄ Ｂａｔｔｅｎ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｒａｔｉｎｇ Ｓｃａｌｅを参照のこと。ＣＬＮ２疾患臨床評価尺度（ＣＲＳ）（すなわち、ドイツのハンブルク大学医療センター－エッペンドルフによって開発されたハンブルク尺度）は、疾患の進行を評価するために最も一般的に使用されるツールの１つである。この尺度には、運動能力の喪失、発作活動、視力喪失、言語喪失を含む、複数の機能分野における疾患の進行の評価が組み込まれており：各機能分野を、正常な状態には「３」のスコア、軽度またはかろうじて可知の異常には「２」のスコア、そして重度の異常には「１」のスコア、ならびに機能の完全な喪失には０のスコアが割り当てられるように評価する。次いで、これらのスコアを合計して、参照により本明細書に援用されるＳｔｅｉｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ，Ｌａｔｅ ｉｎｆａｎｔｉｌｅ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｃｅｒｏｉｄ ｌｉｐｏｆｕｓｃｉｎｏｓｉｓ：ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｃｏｕｒｓｅ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ＣＬＮ２ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ，Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ．２００２ Ｎｏｖ １；１１２（４）：３４７－５４の合計障害スコアを各患者に割り当てる。また、参照により本明細書に援用されるＷｙｒｗｉｃｈ ｅｔ ａｌ，Ａｎ Ａｄａｐｔｅｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ Ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｋｅｙ Ｓｙｍｐｔｏｍｓ ｏｆ ＣＬＮ２ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｂｏｒｎ Ｅｒｒｏｒｓ ｏｆ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ＆ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，２０１８，Ｖｏｌｕｍｅ ６：１－７も参照されたい。ＣＬＮ２疾患患者の大多数は、ＣＬＮ２疾患ＣＲＳを使用した測定によると、治療を行わない場合、運動機能と言語機能の一貫した進行性の喪失を経験する（Ｎｉｃｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。一実施形態では、治療の目標は、疾患の進行を制限することである。これは、ＣＬＮ２疾患評価疾患尺度またはＵＢＤＲＳを使用して、症状の定量的及び定性的評価によって評価してもよい。
別の実施形態では、方法は、追加の試験、例えば、アッセイ及び神経認知試験を実施して、治療の有効性を判定することを含む。そのような試験には、上記のＵＢＤＲＳの一部として実施する試験が含まれ、これには、限定されないが：音声の明瞭さ、舌の突出、視力、緊張（腕、脚、首）、強度（腕、脚）、手のタッピング、かかとの踏みつけ、自発運動（運動失調）、常同症、ジストニア、ミオクローヌス、振戦、舞踏病、測定障害、歩調、姿勢の安定性、発作、行動と気分、及び全体的な健康の評価が含まれる。
本明細書に記載の方法の一実施形態では、本明細書に記載の組成物の一度の送達、例えば、最適化されたＣＬＮ２カセットのＡＡＶ送達は、対象におけるバッテン病の治療に有用である。本明細書に記載の方法の別の実施形態では、本明細書に記載の組成物の一度の送達、例えば、最適化されたＣＬＮ２カセットのＡＡＶ送達は、ＣＬＮ２欠損を有する対象におけるバッテン病の予防に有用である。
したがって、一実施形態では、組成物を、疾患の発症前に投与する。別の実施形態では、組成物を、神経学的障害の開始前に投与する。別の実施形態では、組成物を、神経学的障害の開始後に投与する。一実施形態では、新生児治療とは、分娩から８時間、最初の１２時間、最初の２４時間、または最初の４８時間以内に、本明細書に記載のＴＰＰ１コード配列、発現カセットまたはベクターを投与することとして定義される。別の実施形態では、特に霊長類（ヒトまたは非ヒト）の場合、新生児の分娩は、約１２時間～約１週間、２週間、３週間、もしくは約１か月の期間内、または約２４時間～約４８時間後である。別の実施形態では、組成物を、症状の発症後に送達する。一実施形態では、患者の治療（例えば、最初の注射）を、生後１年の前に開始する。別の実施形態では、治療を、最初の１年後、または最初の２～３年後の年齢、５年後の年歳、１１年後の年齢、またはそれ以上の年齢で開始する。一実施形態では、治療を、約４歳～約１２歳で開始する。一実施形態では、治療を、約４歳以降に開始する。一実施形態では、治療を、約５歳以降に開始する。一実施形態では、治療を、約６歳以降に開始する。一実施形態では、治療を、約７歳以降に開始する。一実施形態では、治療を、約８歳以降に開始する。一実施形態では、治療を、約９歳以降に開始する。一実施形態では、治療を、約１０歳以降に開始する。一実施形態では、治療を、約１１歳以降に開始する。一実施形態では、治療を、約１２歳以降に開始する。しかしながら、治療を、約１５歳、約２０歳、約２５歳、約３０歳、約３５歳、または約４０歳以降に開始することができる。一実施形態では、子宮内での治療は、本明細書に記載の組成物を胎児に投与することとして定義される。例えば、参照により本明細書に援用されるＤａｖｉｄ ｅｔ ａｌ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎ ｕｔｅｒｏ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｇｉｖｅｓ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｓｈｅｅｐ，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１１ Ａｐｒ；２２（４）：４１９－２６． ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｕｍ．２０１０．００７．Ｅｐｕｂ ２０１１ Ｆｅｂ ２を参照されたい。
別の実施形態では、組成物を、後日再投与する。場合により、複数の再投与を行うことができる。そのような再投与は、同じタイプのベクター、異なるウイルスベクターを用いて、または本明細書に記載のような非ウイルス送達を介して行ってもよい。
本明細書に記載の治療の目標には、バッテン病の進行を制限または停止することが含まれる。治療の望ましい結果には、限定されないが、神経認知試験によって判定される、ＵＢＤＲＳ及び／またはＣＬＮ２疾患評価尺度の評価スコアのいずれかの増加、ＴＰＰ１の活性レベルまたは発現レベルの増加、運動機能の増加（または運動機能の障害の進行の減少）、及びＭＲＩによる皮質体積の増加（または皮質の障害の進行の減少）が含まれる。望ましい結果には、筋力低下の軽減、筋力及び筋緊張の増加、または呼吸器の健康の維持もしくは増加、または震えや痙攣の軽減が含まれる。他の望ましいエンドポイントは、医師が決定することができる。
さらに別の実施形態では、上記の方法のいずれかを、別の、または二次的な治療と組み合わせて実施する。二次療法は、これらの変異もしくは欠損、またはそれに関連する効果のいずれかを予防、阻止または改善するうえで役立つ、現在公知であるかまたは未知の療法であり得る。二次療法は、上記の組成物の投与の前、同時、または後に投与することができる。一実施形態では、二次療法は、神経栄養因子、抗酸化剤、抗アポトーシス剤の投与など、網膜細胞の健康を維持するための非特異的アプローチを含む。非特異的アプローチは、タンパク質、組換えＤＮＡ、組換えウイルスベクター、幹細胞、胎児組織、または遺伝子組換え細胞の注入によって実現される。後者には、カプセル化された遺伝子組換え細胞が含まれ得る。一実施形態では、二次療法は、脳室内セリポナーゼα（ＢＭＮ １９０）である。参照により本明細書に援用されるＳｃｈｕｌｚ ｅｔ ａｌ，Ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｃｅｒｌｉｐｏｎａｓｅ ａｌｆａ（ＢＭＮ １９０）ｉｎ ｃｈｉｌｄｒｅｎ ｗｉｔｈ ＣＬＮ ２ ｄｉｓｅａｓｅ：ｒｅｓｕｌｔｓ ｆｒｏｍ ａ ｐｈａｓｅ １／２ ｏｐｅｎ ｌａｂｅｌ，ｄｏｓｅ－ｅｓｃａｌａｔｉｏｎ ｓｔｕｄｙ，Ｊ Ｉｎｈｅｒｉｔ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓｅａｓｅ，３９：Ｓ５１を参照されたい。推奨用量は、隔週で投与する３０～３００ｍｇのＩＣＶ注入である。
一実施形態では、組換えｒＡＡＶの生成方法は、上記のようにＡＡＶ発現カセットを有するプラスミドを取得し、ＡＡＶウイルスゲノムを感染性ＡＡＶのエンベロープまたはキャプシド内へパッケージング可能とするのに十分なウイルス配列の存在下で、プラスミドを保有するパッケージング細胞を培養することを含む。ｒＡＡＶベクター生成の特定の方法は上記に記載されており、上記の発現カセット及びゲノムにおける、及び以下の実施例におけるコドン最適化ＣＬＮ２を送達することができるｒＡＡＶベクターを生成する際に使用してもよい。
本発明の特定の実施形態では、対象はバッテン病を有し、本発明の成分、組成物、及び方法は、それを治療するように設計される。本明細書中で使用する場合、本明細書中で使用する用語「対象」とは、ヒト、獣医動物または家畜、飼育動物またはペット、及び臨床研究に通常使用される動物を含む哺乳動物を意味する。一実施形態では、これらの方法及び組成物の対象はヒトである。さらに他の適切な対象として、限定されないが、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、非ヒト霊長類などが挙げられる。本明細書中で使用する場合、用語「対象」は、「患者」と同じ意味で用いられる。
本明細書中で使用する場合、用語「治療」または「治療すること」とは、バッテン病の１つ以上の症状を改善することを目的として、本明細書に記載の１つ以上の化合物または組成物を対象に投与することを包含するものと定義される。したがって、「治療」は、所与の対象における、バッテン病の発症もしくは進行の低減、疾患の予防、疾患症状の重症度の軽減、または神経障害の進行を含むそれらの進行の遅延、疾患症状の除去、疾患の発症の遅延、または疾患の進行もしくは治療の有効性のモニタリングのうちの１つ以上を含み得る。
一態様では、機能性ＴＰＰ１タンパク質をコードするコード配列を提供する。「機能性ｈＴＰＰ１」とは、天然のＴＰＰ１タンパク質、または疾患に関連しないその天然のバリアントまたは多形の生物学的活性レベルの少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、もしくはほぼ同等、または１００％超を提供するＴＰＰ１タンパク質をコードする遺伝子を意味する。
ＴＰＰ１の発現及び活性レベルをｉｎ ｖｉｔｒｏで測定するための様々なアッセイが存在する。例えば、以下の実施例２を参照されたい。本明細書に記載の方法はまた、バッテン病またはその症状を治療するための他の任意の療法と組み合わせることができる。ＣＬＮ２疾患の管理は複雑である。症状の負荷が高く、機能低下の速度が速いため、患者は広範な集学的医療を必要とし、家族は広範な心理社会的支援を必要とするが、現在この病態の管理ガイドラインは存在しない。例えば、参照により本明細書に援用されるＷｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ，Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ＣＬＮ２ ｄｉｓｅａｓｅ，Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ６９（２０１７）１０２ｅ１１２を参照されたい。しかしながら、特定の実施形態では、標準治療は、脳室内セリポナーゼα（ＢＭＮ １９０）を含み得る。参照により本明細書に援用されるＳｃｈｕｌｚ ｅｔ ａｌ，Ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｃｅｒｌｉｐｏｎａｓｅ ａｌｆａ（ＢＭＮ １９０）ｉｎ ｃｈｉｌｄｒｅｎ ｗｉｔｈ ＣＬＮ ２ ｄｉｓｅａｓｅ：ｒｅｓｕｌｔｓ ｆｒｏｍ ａ ｐｈａｓｅ １／２ ｏｐｅｎ ｌａｂｅｌ，ｄｏｓｅ－ｅｓｃａｌａｔｉｏｎ ｓｔｕｄｙ，Ｊ Ｉｎｈｅｒｉｔ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓｅａｓｅ，３９：Ｓ５１を参照されたい。推奨用量は、隔週で投与する３０～３００ｍｇのＩＣＶ注入である。
特定の実施形態では、ＡＡＶ９．ＣＬＮ２ベクターを産生する。いくつかの適切な精製方法を選択し得る。適切な精製方法の例は、例えば、２０１６年１２月９日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６５９７０号及びその優先権書類、２０１６年４月１３日に出願された米国特許出願第６２／３２２，０７１号及び参照により本明細書に援用される２０１５年１２月１１日に出願された同第６２／２２６，３５７号（表題「Ｓｃａｌａｂｌｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ＡＡＶ９」）に記載されている。
ＡＡＶウイルスベクターの場合、ゲノムコピー（「ＧＣ」）の定量化は、製剤中に含まれる用量の尺度として使用され得る。当技術分野で公知の任意の方法を使用して、本発明の複製欠損ウイルス組成物のゲノムコピー（ＧＣ）数を測定することができる。ＡＡＶ ＧＣ数の滴定を実行する１つの方法は、以下のとおりである：精製ＡＡＶベクター試料を最初にＤＮａｓｅで処理して、混入した宿主ＤＮＡを製造プロセスから排除する。次いで、ＤＮａｓｅ耐性粒子を熱処理してキャプシドからゲノムを遊離させる。次いで、遊離したゲノムを、ウイルスゲノムの特定の領域（例えば、ポリＡシグナル）を標的とするプライマー／プローブセットを使用したリアルタイムＰＣＲによって定量化する。ゲノムコピー数を測定するための別の適切な方法は、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、特に最適化されたｑＰＣＲまたはデジタルドロップレットＰＣＲである［Ｌｏｃｋ Ｍａｒｔｉｎ，ｅｔ ａｌ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ａｐｒｉｌ ２０１４，２５（２）：１１５－１２５．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｇｔｂ．２０１３．１３１、２０１３年１２月１３日編集前にオンラインで公開］。あるいは、ＶｉｒｏＣｙｔ３１００を粒子の定量、またはフローサイトメトリーに使用することができる。別の方法では、その全体が参照により援用されるＳ．Ｋ．ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ，１９８８ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２：１９６３に記載されているように、最適化ＴＰＰ１コード配列をコードする核酸配列を保有する組換えアデノ随伴ウイルスの有効量を測定する。
複製欠損ウイルス組成物は、ヒト患者に対して、約１．０×１０９ＧＣ～約９×１０１５ＧＣ（範囲内のすべての整数または端数を含む）、好ましくは１．０×１０１２ＧＣ～２．７×１０１５ＧＣの範囲の量の複製欠損ウイルスを含む投与単位で製剤化することができる（体重７０ｋｇの平均的な対象を治療するために）。一実施形態では、組成物を、投与あたり少なくとも１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、または９×１０９ＧＣ（範囲内のすべての整数または端数を含む）を含有するように製剤化する。別の実施形態では、組成物を、投与あたり少なくとも１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、または９×１０１０ＧＣ（範囲内のすべての整数または端数を含む）を含有するように製剤化する。別の実施形態では、組成物を、投与あたり少なくとも１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、または９×１０１１ＧＣ（範囲内のすべての整数または端数を含む）を含有するように製剤化する。別の実施形態では、組成物を、投与あたり少なくとも１×１０１２、２×１０１２、３×１０１２、４×１０１２、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、または９×１０１２ＧＣ（範囲内のすべての整数または端数を含む）を含有するように製剤化する。別の実施形態では、組成物を、投与あたり少なくとも１×１０１３、２×１０１３、３×１０１３、４×１０１３、５×１０１３、６×１０１３、７×１０１３、８×１０１３、または９×１０１３ＧＣ（範囲内のすべての整数または端数を含む）を含有するように製剤化する。別の実施形態では、組成物を、投与あたり少なくとも１×１０１４、２×１０１４、３×１０１４、４×１０１４、５×１０１４、６×１０１４、７×１０１４、８×１０１４、または９×１０１４ＧＣ（範囲内のすべての整数または端数を含む）を含有するように製剤化する。別の実施形態では、組成物を、投与あたり少なくとも１×１０１５、２×１０１５、３×１０１５、４×１０１５、５×１０１５、６×１０１５、７×１０１５、８×１０１５、または９×１０１５ＧＣ（範囲内のすべての整数または端数を含む）を含有するように製剤化する。一実施形態では、ヒトへの投与の場合、用量を、投与あたり１×１０１０～約２．７×１０１５ＧＣの範囲（範囲内のすべての整数または端数を含む）とすることができる。
特定の実施形態では、用量は、約１×１０９ＧＣ／ｇ脳質量～約２．１×１０１２ＧＣ／ｇ脳質量の範囲内であってもよい。特定の実施形態では、用量は、約３×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量～約３×１０１１ＧＣ／ｇ脳質量の範囲内であってもよい。特定の実施形態では、用量は、約５×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量～約１．８５×１０１１ＧＣ／ｇ脳質量の範囲内であってもよい。
一実施形態では、ウイルス構築物を、少なくとも約１×１０９ＧＣ～約２．１×１０１５、または約１×１０１１～５×１０１３ＧＣの用量で送達してもよい。これらの用量及び濃度の送達に適した容量は、当業者が決定してもよい。例えば、約１μＬ～１５０ｍＬの容量を選択してもよく、大人にはより大容量を選択する。一実施形態では、容量は約１０ｍＬ以下である。一般的には、新生児の場合、適切な容量は、約０．５ｍＬ～約１０ｍＬであり、より高齢の乳児では、約０．５ｍＬ～約１５ｍＬを選択してもよい。幼児には、約０．５ｍＬ～約２０ｍＬの容量を選択してもよい。小児には、最大約３０ｍＬの容量を選択してもよい。１３歳未満及び１０代では、最大約５０ｍＬの容量を選択してもよい。さらに他の実施形態では、患者に、約５ｍＬ～約１５ｍＬの容量、または約７．５ｍＬ～約１０ｍＬの容量を選択して、髄腔内投与を行ってもよい。さらに他の実施形態では、患者に、約５ｍＬ～約１５ｍＬの容量、または約７．５ｍＬ～約１０ｍＬの容量を選択して、槽内投与を行ってもよい。他の適切な容量及び用量を決定してもよい。用量は、任意の副作用に対する治療効果のバランスを取るように調整し、そのような用量は、組換えベクターを使用する治療用途に応じて変化させてよい。
上記の組換えベクターを、公開されている方法に従って宿主細胞に送達してもよい。特定の実施形態では、ヒト患者への投与のために、生理食塩水、界面活性剤、及び生理学的に適合性のある塩または塩の混合物を含有する水溶液にｒＡＡＶを適切に懸濁する。適切には、製剤を、生理的に許容されるｐＨ、例えばｐＨ６～９、またはｐＨ６．５～７．５、ｐＨ７．０～７．７、またはｐＨ７．２～７．８の範囲に調整する。脳脊髄液のｐＨが約７．２８～約７．３２であるため、髄腔内送達または槽内送達には、この範囲内のｐＨが望ましい場合があり；一方、静脈内送達の場合、６．８～約７．２のｐＨが望ましい場合がある。一実施形態では、ｐＨは約７．３である。しかしながら、最も広い範囲内の他のｐＨ及びこれらの部分的範囲を、他の送達経路のために選択してもよい。
非毒性の非イオン性界面活性剤の中から、適切な界面活性剤または界面活性剤の組み合わせを選択してもよい。一実施形態では、例えば、中性ｐＨを有し、平均分子量が８４００である、ポロキサマー１８８としても公知のＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８（ＢＡＳＦ）などの一級ヒドロキシル基で終結する二官能性ブロックコポリマー界面活性剤を選択する。他の界面活性剤及び他のポロキサマー、すなわち、ポリオキシエチレン（ポリ（エチレンオキシド））の２つの親水性鎖に隣接するポリオキシプロピレン（ポリ（プロピレンオキシド））の中央疎水性鎖からなる非イオン性トリブロックコポリマー、ＳＯＬＵＴＯＬ ＨＳ １５（マクロゴール－１５ ヒドロキシステアリン酸）、ＬＡＢＲＡＳＯＬ（ポリオキシカプリル酸グリセリド）、ポリオキシ１０オレイルエーテル、ＴＷＥＥＮ（ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル）、エタノール及びポリエチレングリコールを選択してもよい。一実施形態では、製剤はポロキサマーを含有する。これらのコポリマーは、一般的に、文字「Ｐ」（ポロキサマー用）に続いて３桁の数字で名付けられ：最初の２桁×１００は、ポリオキシプロピレンコアのおよその分子量を示し、最後の数字×１０はポリオキシエチレン含有率を示す。一実施形態では、ポロキサマー１８８を選択する。界面活性剤は、最大で懸濁液の約０．０００５％～約０．００１％の量で存在させてもよい。
一例では、製剤には、例えば、塩化ナトリウム、重炭酸ナトリウム、デキストロース、硫酸マグネシウム（例えば、硫酸マグネシウム・７Ｈ２Ｏ）、塩化カリウム、塩化カルシウム（例えば、塩化カルシウム・２Ｈ２Ｏ）、第二リン酸ナトリウム、及びその混合物のうちの１つ以上を水中に含有する緩衝生理食塩水を含有させてもよい。適切には、髄腔内送達または槽内送達の場合、浸透圧は、脳脊髄液と適合する範囲内（例えば、約２７５～約２９０）であり；例えば、ｅｍｅｄｉｃｉｎｅ．ｍｅｄｓｃａｐｅ．ｃｏｍ／ａｒｔｉｃｌｅ／２０９３３１６－ｏｖｅｒｖｉｅｗを参照のこと。場合により、髄腔内送達または槽内送達の場合、市販の希釈剤を懸濁剤として、または別の懸濁剤及び他の任意選択の賦形剤と組み合わせて、使用してもよい。例えば、Ｅｌｌｉｏｔｔｓ Ｂ（登録商標）溶液（Ｌｕｋａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ）を参照のこと。他の実施形態では、製剤に、１つ以上の透過促進剤を含有させてもよい。適切な透過促進剤の例として、例えば、マンニトール、グリコール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、サリチル酸ナトリウム、カプリル酸ナトリウム、カプリン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン－９－ラウリルエーテール、またはＥＤＴＡが挙げられる。
別の実施形態では、組成物は、担体、溶媒、安定剤、希釈剤、賦形剤及び／またはアジュバントを含む。当業者であれば、導入ウイルスが向けられている適応症を考慮して、適切な担体を容易に選択し得る。例えば、１つの適切な担体として生理食塩水が挙げられ、これを、様々な緩衝液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）と共に製剤化してもよい。他の例示的な担体として、無菌生理食塩水、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチン、落花生油、ごま油、及び水が挙げられる。緩衝液／担体には、ｒＡＡＶが注入チューブに付着するのを防ぐが、ｉｎ ｖｉｖｏでのｒＡＡＶ結合活性を妨げない成分を含めるべきである。
一実施形態では、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２医薬品の提案された構成は、２ｍＬバイアルに含まれる１ｍＬの製剤緩衝液中のＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２ベクターの凍結溶液である。提案された製剤緩衝液は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１．２ｍＭ塩化マグネシウム、３ｍＭ塩化カリウム、１．４ｍＭ塩化カルシウム、１ｍＭリン酸ナトリウム、４．４ｍＭデキストロース、及び０．００１％ポロキサマー１８８、ｐＨ７．３である。ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２医薬品の提案された定量的組成を以下の表１に示す。
表１．注射用ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２溶液の提案された定量組成、１ｍＬ／バイアル
Figure 2022513034000002
場合により、本発明の組成物は、ｒＡＡＶ及び担体（複数可）に加えて、防腐剤、または化学安定剤などの他の従来の医薬成分を含み得る。適切な例示的な防腐剤として、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン、エチルバニリン、グリセリン、フェノール、及びパラクロロフェノールが挙げられる。適切な化学安定剤として、ゼラチン及びアルブミンが挙げられる。
本発明による組成物は、上記で定義されたような薬学的に許容される担体を含み得る。適切には、本明細書に記載の組成物は、注射、浸透圧ポンプ、髄腔内カテーテルを介して対象に送達するために、または別の装置もしくは経路で送達するために設計された、薬学的に適切な担体に懸濁し、及び／または適切な賦形剤と混合させた有効量の１つ以上のＡＡＶを含む。一例では、組成物を髄腔内送達用に製剤化する。一実施形態では、髄腔内送達は、脊柱管、例えばくも膜下腔への注射を包含する。一実施形態では、送達経路は、脳室内注射（ＩＣＶ）である。別の実施形態では、送達経路は、腰部髄腔内（ＩＴ－Ｌ）送達である。さらに別の実施形態では、送達経路は、槽内（ＩＣ）注射（すなわち、大槽への画像誘導後頭下穿刺を介した髄腔内送達）である。
本明細書に記載のウイルスベクターは、ｈＴＰＰ１を、それを必要とする対象（例えば、ヒト患者）に送達するための薬剤の調製、対象への機能性ＴＰＰ１の供給、及び／またはバッテン病の治療に使用し得る。治療の過程は、場合により、同じウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ９ベクター）または異なるウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ９及びＡＡＶｒｈ１０）の反復投与を含み得る。さらに、本明細書に記載のウイルスベクター及び非ウイルス送達系を使用した他の組み合わせを選択してもよい。
本明細書に記載のｈＴＰＰ１ ｃＤＮＡ配列を、当技術分野で周知の技術を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び合成的に生成することができる。例えば、Ｘｉｏｎｇ ｅｔ ａｌ，ＰＣＲ－ｂａｓｅｄ ａｃｃｕｒａｔｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｌｏｎｇ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ １，７９１－７９７（２００６）に記載されているように、長いＤＮＡ配列のＰＣＲベースの正確な合成（ＰＡＳ）法を利用してもよい。デュアル非対称ＰＣＲ法とオーバーラップ伸長ＰＣＲ法を組み合わせた方法が、Ｙｏｕｎｇ ａｎｄ Ｄｏｎｇ，Ｔｗｏ－ｓｔｅｐ ｔｏｔａｌ ｇｅｎｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｍｅｔｈｏｄ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００４；３２（７）：ｅ５９に記載されている。Ｇｏｒｄｅｅｖａ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ． Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＰＣＲ－ｂａｓｅｄ ｇｅｎｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ ｐｈｙｔａｓｅ ｇｅｎｅ ｃｏｄｏｎ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ． ２０１０ Ｍａｙ；８１（２）：１４７－５２． Ｅｐｕｂ ２０１０ Ｍａｒ １０も参照されたい；また、オリゴヌクレオチド合成及び遺伝子合成に関する以下の特許、Ｇｅｎｅ Ｓｅｑ．２０１２ Ａｐｒ；６（１）：１０－２１；ＵＳ８００８００５；及びＵＳ７９８５５６５も参照されたい。これらの各文献は、参照により本明細書に援用される。さらに、ＰＣＲを介してＤＮＡを生成するためのキットとプロトコールが市販されている。これらには、Ｔａｑポリメラーゼ；ＯｎｅＴａｑ（登録商標）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）；Ｑ５（登録商標）高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）；及びＧｏＴａｑ（登録商標）Ｇ２ポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を含むがこれらに限定されないポリメラーゼの使用が含まれる。ＤＮＡはまた、本明細書に記載のｈＯＴＣ配列を含むプラスミドでトランスフェクトした細胞から生成され得る。キット及びプロトコールは公知かつ市販されており、ＱＩＡＧＥＮプラスミドキット；Ｃｈａｒｇｅｓｗｉｔｃｈ（登録商標）Ｐｒｏフィルタープラスミドキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；及びＧｅｎＥｌｕｔｅ（商標）プラスミドキット（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で有用な他の技術として、サーモサイクリングの必要性を排除する配列特異的等温増幅法が挙げられる。これらの方法では、通常、熱の代わりに、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ，Ｌａｒｇｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）などの鎖置換ＤＮＡポリメラーゼを使用して、二本鎖ＤＮＡを分離させる。ＤＮＡは、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼである逆転写酵素（ＲＴ）を使用した増幅により、ＲＮＡ分子から生成してもよい。ＲＴは、元のＲＮＡテンプレートに相補的なＤＮＡ鎖を重合し、これはｃＤＮＡと呼ばれる。次いで、このｃＤＮＡを、上記のようにＰＣＲまたは等温法によってさらに増幅することができる。ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ；ＧＥＮＥＷＩＺ（登録商標）；ＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；及びＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓを含むがこれらに限定されない企業で、カスタムＤＮＡを商業的に生成することもできる。
用語「発現」は、本明細書中ではその最も広い意味で使用され、ＲＮＡの、またはＲＮＡとタンパク質の産生を含む。ＲＮＡに関して、用語「発現」または「翻訳」は、特にペプチドまたはタンパク質の産生に関連している。発現は、一過性であっても、安定的であってもよい。
本発明に関する用語「翻訳」は、ｍＲＮＡ鎖がアミノ酸配列の集合を制御してタンパク質またはペプチドが生成される、リボソームでのプロセスに関する用語である。
なお、用語「ａ」または「ａｎ」は、１つ以上を指す。したがって、用語「ａ」（または「ａｎ」）、「１つ以上」、及び「少なくとも１つ」は、本明細書中で同じ意味で用いられる。
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、排他的ではなく包括的に解釈されるべきである。「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ）」、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」及びその変形の用語は、包括的ではなく排他的に解釈されるべきである。本明細書の様々な実施形態は、「含む」という言葉を使用して提示されるが、他の状況下では、関連する実施形態はまた、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」または「本質的に～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｃｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という言葉を使用して解釈及び記載されるものとする。
本明細書中で使用する場合、「疾患」、「障害」及び「病態」は、対象の異常状態を示すために同じ意味で用いられる。
本明細書中で使用する場合、用語「約（ａｂｏｕｔ）」または「約（～）」は、特に明記しない限り、所与の参照からの１０％の変動性を意味する。
本明細書中で使用する用語「調節」またはその変形は、生物学的経路の１つ以上の成分を阻害する組成物の能力を指す。
本明細書中で他に定義されていない限り、本明細書中で使用する技術用語及び科学用語は、当業者によって、及び本出願で用いる用語の多くに対して当業者に一般的な指針を与える公開文書を参照して、一般に理解されている意味と同じ意味を有する。
ＩＩＩ． 製造方法
本明細書において、本明細書に記載のｒＡＡＶの製造方法をさらに提供する。特定の実施形態では、方法は、ｒＡＡＶを産生することができる浮遊細胞株を浮遊培養で増殖させることを含む。
特定の実施形態では、製造方法において、緩衝液を使用してもよい。例示的な緩衝液として、トリス、ビストリス、ビストリスプロパン、リン酸塩、及びＨＥＰＥＳが挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態では、懸濁液の主要なバイオリアクタープロセスの実施のための時間範囲は、１～１０日であってよい。特定の実施形態では、懸濁液の主要なバイオリアクタープロセスの実施のための時間範囲は、５～８日であってよい。特定の実施形態では、懸濁液の主要なバイオリアクタープロセスの実施のための時間の長さは、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、または１０日であってもよい。
特定の実施形態では、懸濁液の主要なバイオリアクタープロセスを実施するための時間範囲の中で、１つ以上のｐＨ、溶存酸素、及び温度レベルを調節してもよい。特定の実施形態では、懸濁液の主要なバイオリアクタープロセスを実施するための時間範囲の中で、ｐＨレベルを調節してもよい。特定の実施形態では、懸濁液の主要なバイオリアクタープロセスを実施するための時間範囲の中で、溶存酸素レベルを調節してもよい。特定の実施形態では、懸濁液の主要なバイオリアクタープロセスを実施するための時間範囲の中で、温度レベルを調節してもよい。
特定の実施形態では、一過性トランスフェクションを、細胞増殖の１～１０日後に実施してもよい。特定の実施形態では、一過性トランスフェクションを、細胞増殖の１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、または１０日後に実施してもよい。特定の実施形態では、細胞増殖を、ＤＭＥＭ及び１０％ＦＢＳを含む培養培地中で実施してもよい。
特定の実施形態では、一過性トランスフェクションを、ｐＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ＣＬＮ２．ＲＢＧ．ＫａｎＲベクターゲノムプラスミド、ｐＡｄＤｅｌｔａＦ６、及びｐＡＡＶ２９ＫａｎＲＧＸＲｅｐ２ ＡＡＶプラスミドを含む混合物を使用して実施してもよい。特定の実施形態では、混合物は、０．１～１００ｍｇの量のｐＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ＣＬＮ２．ＲＢＧ．ＫａｎＲベクターゲノムプラスミドを含む。特定の実施形態では、混合物は、１～５００ｍｇの量のｐＡｄＤｅｌｔａＦ６を含む。特定の実施形態では、混合物は、１～５００ｍｇの量のｐＡＡＶ２９ＫａｎＲＧＸＲｅｐ２ ＡＡＶプラスミドを含む。特定の実施形態では、一過性トランスフェクション後、細胞を１～１０日間インキュベートしてもよい。特定の実施形態では、一過性トランスフェクション後、細胞を、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、または１０日間インキュベートしてもよい。
特定の実施形態では、ベクター回収の間、細胞培養物に、０．１～１０ｍｇの量の塩化マグネシウムを補充してもよい。特定の実施形態では、ベクター回収の間、細胞培養物に、０．１ｍｇ、０．５ｍｇ、１ｍｇ、１．５ｍｇ、２ｍｇ、２．５ｍｇ、３ｍｇ、３．５ｍｇ、４ｍｇ、４．５ｍｇ、５ｍｇ、５．５ｍｇ、６ｍｇ、６．５ｍｇ、７ｍｇ、７．５ｍｇ、８ｍｇ、８．５ｍｇ、９ｍｇ、９．５ｍｇ、または１０ｍｇの量の塩化マグネシウムで補充してもよい。
特定の実施形態では、ｒＡＡＶの精製プロセスは、４つの工程、すなわち、ＴＦＦによる濃縮及び緩衝液交換、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ならびにＴＦＦによる濃縮及び緩衝液交換を含み得る。
特定の実施形態では、タンジェンシャルフロー濾過による濃縮及び緩衝液交換に使用する緩衝液は、トリス、塩化ナトリウム、及び６．０～８．５の範囲のｐＨを含み得る。例示的な緩衝液として、トリス、ビストリス、ビストリスプロパン、リン酸塩、及びＨＥＰＥＳが挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態では、アフィニティークロマトグラフィーに使用する緩衝液は、トリス、塩化ナトリウム、及び６．０～８．５の範囲のｐＨを含み得る。特定の実施形態では、アフィニティークロマトグラフィーに使用する緩衝液は、トリス、クエン酸ナトリウム、及び６．０～８．５の範囲のｐＨを含み得る。特定の実施形態では、アフィニティークロマトグラフィーに使用する緩衝液は、ビストリスプロパン、ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８、及び７～１４の範囲のｐＨを含み得る。例示的な緩衝液として、トリス、ビストリス、ビストリスプロパン、リン酸塩、及びＨＥＰＥＳが挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態では、ｒＡＡＶの精製プロセスは、イオン交換クロマトグラフィーを含む。特定の実施形態では、ｒＡＡＶの精製プロセスは、陽イオン交換クロマトグラフィーを含む。特定の実施形態では、ｒＡＡＶの精製プロセスは、陰イオン交換クロマトグラフィーを含む。特定の実施形態では、イオン交換クロマトグラフィーに使用する緩衝液は、ビストリスプロパン、ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８、及び４～１４の範囲のｐＨを含み得る。例示的な緩衝液として、トリス、ビストリス、ビストリスプロパン、リン酸塩、及びＨＥＰＥＳが挙げられるが、これらに限定されない。
ＩＶ． アッセイ
ＩＶ－１． バッテン病の治療方法に関連するアッセイ
当業者は、本明細書に記載のアッセイ及び／または当技術分野で公知の技術（例えば、ＷＯ２０１８２０９２０５Ａ１に記載のアッセイ）を使用して、本明細書に記載の組成物及び方法を試験する、例えば、バッテン病の治療方法において本明細書に提供するｒＡＡＶを試験し得る。アッセイの詳細は、実施例１及び２に提供されている。実施例１及び２はまた、そのようなアッセイをどのように使用して、本明細書で提供するｒＡＡＶを試験することができるかをより詳細に示している。
関連するアッセイとして：ＣＬＮ２バッテン病のＴＰＰ１ｍ１Ｊマウスモデルでのｉｎ ｖｉｖｏ試験、ＴＰＰ１ｍ１Ｊノックアウトマウスの自然史研究、ＴＰＰ１ｍ１Ｊノックアウトマウスでの薬理学試験、ＴＰＰ１酵素活性を測定するアッセイ、ｄｉｇｉｔａｌ ｖｉｖａｒｉｕｍでの非侵襲的フルタイムモニタリングを使用したマウスの脳室内効果の評価、Ｃ５７ＢＬ／６ ＴＰＰ１ｍ１ＪノックアウトマウスでのＡＡＶ９送達（ＩＣＶ）を使用したＴＰＰ１置換の効果の測定、安全性薬理アッセイ、マウスでの毒性試験、及びカニクイザルでの薬力学的試験、ベクターの生体内分布のアッセイ、ベクターの脱落アッセイ、反復投与試験、発がん性試験、及び他の毒性試験が挙げられるが、これらに限定されない。
ＩＶ－２． 医薬組成物に関連するアッセイ
当業者は、本明細書に記載のアッセイ及び／または当技術分野で公知の技術を使用して、本明細書に記載の組成物及び方法を試験する、例えば、本明細書に提供する製剤を試験してもよい。アッセイの詳細を、実施例３及び４に提供する。実施例３及び４はまた、そのようなアッセイをどのように使用して、本明細書で提供する製剤を試験することができるかをより詳細に示している。
Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１９ Ｃｅｌｌ ＆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｉｎｓｉｇｈｔｓ，５（４）：５３７－５４７（その全体が参照により援用される）に記載されているように、例示的なアッセイとして、以下が挙げられるが、これらに限定されない：（１）ゲノムコピー数測定のためのデジタルドロップレットＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）；（２）分光光度法によるＡＡＶのゲノム含有量及び全キャプシド割合の分析；（３）キャプシドのＤＮＡ分布及び純度を測定するためのサイズ排除クロマトグラフィー；（４）キャピラリー電気泳動を使用したキャプシドウイルスタンパク質の純度の評価；（５）ｉｎ ｖｉｔｒｏ力価法－ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＡＡＶベクターの感染力の差異を定量化するための信頼できる方法としての相対的感染力；ならびに（６）キャプシドの空／全比率及びサイズ分布を測定するための超遠心分析法（ＡＵＣ）。
Ａ． 凍結／解凍サイクルアッセイ
制御された凍結／解凍サイクルを、凍結乾燥機で実行することができる。バイアルは、シェルフ上で十分な間隔を空けることができ、緩衝液の４つのバイアルをサーモカップリングすることができる。
Ｂ． 温度ストレスアッセイ
温度ストレス発生安定性試験を、１．０×１０１２ＧＣ／ｍＬで、３７℃、４日間にわたって実施して、本明細書で提供する製剤の相対的安定性を評価することができる。
安定性を評価するために使用することができるアッセイとして、ｉｎ ｖｉｔｒｏ相対力価（ＩＶＲＰ）、ベクターゲノム濃度（ｄｄＰＣＲによるＶＧＣ）、色素蛍光による遊離ＤＮＡ、動的光散乱、外観、及びｐＨが挙げられるが、これらに限定されない。
Ｃ． 長期安定性アッセイ
長期の開発安定性試験を１２か月間実施して、本明細書で提供する製剤における、－８０℃（≦－６０℃）及び－２０℃（－２５℃～－１５℃）でのｉｎ ｖｉｔｒｏ相対力価及び他の品質の維持を実証することができる。
Ｄ． ｉｎ ｖｉｔｒｏ相対力価（ＩＶＲＰ）アッセイ
ｄｄＰＣＲ ＧＣ力価を遺伝子発現に関連付けるために、ＨＥＫ２９３細胞を形質導入し、細胞培養上清を抗ＶＥＧＦ Ｆａｂタンパク質レベルについてアッセイすることにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏバイオアッセイを実施してもよい。ＨＥＫ２９３細胞を３枚のポリ－Ｄ－リジンでコーティングした９６ウェル組織培養プレートに一晩プレーティングする。次いで、細胞を野生型ヒトＡｄ５ウイルスに事前感染させた後、構築物ＩＩ参照標準と被験物質の３つの独立して調製した段階希釈液で形質導入し、各調製物を別々のプレートの異なる位置にプレーティングする。形質導入の３日後に、細胞培養培地をプレートから回収し、ＥＬＩＳＡを介してＶＥＧＦ結合Ｆａｂタンパク質レベルを測定する。ＥＬＩＳＡの場合、ＶＥＧＦでコーティングされた９６ウェルＥＬＩＳＡプレートをブロックし、次いで回収した細胞培養培地と共にインキュベートして、ＨＥＫ２９３細胞によって産生された抗ＶＥＧＦ Ｆａｂを捕捉する。Ｆａｂ特異的抗ヒトＩｇＧ抗体を使用して、ＶＥＧＦで捕捉されたＦａｂタンパク質を検出する。洗浄後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）基質溶液を添加し、発色させ、停止緩衝液で停止させ、プレートリーダーでプレートを読み取る。ＨＲＰ産物の吸光度またはＯＤを対数希釈に対してプロットし、各被験物質の相対力価を、平行類似性試験に合格した後の４パラメーターロジスティック回帰モデルでフィッティングした同じプレート上の参照標準に対して、式：ＥＣ５０参照÷ＥＣ５０被験物質を使用して計算する。被験物質の力価は、３枚のプレートの加重平均から計算した、参照標準力価の割合として報告される。
ｄｄＰＣＲ ＧＣ力価を機能的遺伝子発現に関連付けるために、ＨＥＫ２９３細胞に形質導入し、導入遺伝子（酵素など）の活性をアッセイすることにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏバイオアッセイを実施してもよい。ＨＥＫ２９３細胞を、３枚の９６ウェル組織培養プレートに一晩プレーティングする。次いで、細胞を野生型ヒトアデノウイルス血清型５型ウイルスに事前感染させた後、酵素参照標準と被験物質の３つの独立して調製した段階希釈液で形質導入し、各調製物を別々のプレートの異なる位置にプレーティングする。形質導入の２日後に、細胞を溶解し、低ｐＨで処理して酵素を活性化し、導入遺伝子（酵素）による切断時に蛍光シグナルを増加させるペプチド基質を使用して酵素活性をアッセイする。ＲＦＵの蛍光を対数希釈に対してプロットし、各被験物質の相対力価を、平行類似性試験に合格した後の４パラメーターロジスティック回帰モデルでフィッティングした同じプレート上の参照標準に対して、式：ＥＣ５０参照÷ＥＣ５０被験物質を使用して計算する。被験物質の力価は、３枚のプレートの加重平均から計算した、参照標準力価の割合として報告される。
Ｅ． ベクターゲノム濃度アッセイ
ｄｄＰＣＲを使用してベクターゲノム濃度ＧＣを評価することもできる。
Ｆ． 色素蛍光アッセイを使用した遊離ＤＮＡ分析
ＤＮＡに結合したＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ核酸ゲル染色（「ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ色素」）の蛍光によって、遊離ＤＮＡを測定することができる。マイクロプレートリーダーを使用して蛍光を測定し、ＤＮＡ標準で定量することができる。ｎｇ／μＬでの結果を報告することができる。
測定したｎｇ／μＬでの遊離ＤＮＡを、遊離ＤＮＡの割合に変換するために、２つのアプローチを使用して総ＤＮＡを推定することができる。第１のアプローチでは、ＵＶ－可視分光法によって測定したＧＣ／ｍＬ（ＯＤ）を使用して、試料中の総ＤＮＡを推定した（式中、ＭはＤＮＡの分子量、１Ｅ６は単位変換係数である）：
推定総ＤＮＡ（ｎｇ／μＬ）＝１Ｅ６×ＧＣ／ｍＬ（ＯＤ）×Ｍ（ｇ／ｍｏｌ）／６．０２Ｅ２３
第２のアプローチでは、試料を０．０５％ポロキサマー１８８と共に８５℃に２０分間加熱することができ、加熱した試料中でＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ色素アッセイによって測定した実際のＤＮＡを総量として使用することができる。したがって、これはすべてのＤＮＡを回収し、定量化したという仮定を有する。例えば、ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ色素による総ＤＮＡの測定（ＵＶ測定値と比較して）は、構築物ＩＩ ｄＰＢＳ製剤では１３１％、スクロース製剤を含む構築物ＩＩ修飾ｄＰＢＳでは１５２％であることがわかる（遊離ＤＮＡのｎｇ／μＬから割合への変換の変動は、報告された結果の範囲として捉えることができる）。トレンド分析には、生のｎｇ／μＬを使用することができ、または一貫した方法で測定した割合を使用することができる。
Ｇ． サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）
ＳＥＣは、Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ Ａｒｃ機器ＩＤ０４４７（Ｃ３ＰＯ）で、パス長２５ｍｍのフローセルを用いて、Ｓｅｐａｘ ＳＲＴ ＳＥＣ－１０００ピークカラム（ＰＮ２１５９５０Ｐ－４６３０、ＳＮ：８Ａ１１９８２、ＬＮ：ＢＴ０９０、５μｍ １０００Ａ、４．６×３００ｍｍ）を使用して実施することができる。移動相は、例えば、２０ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ ＮａＣｌ、０．００５％ポロキサマー１８８、ｐＨ６．５とすることができ、流速は０．３５ｍＬ／分で２０分間、カラムは周囲温度とする。データ収集は、２ポイント／秒のサンプリングレートと１．２ｎｍの解像度で実施することができ、２１４、２６０、及び２８０ｎｍで２５ポイントの平均平滑化を行う。理想的な標的負荷は１．５Ｅ１１ＧＣであり得る。試料には、理想的な標的の約１／３である５０μＬを注入するか、５μＬを注入することができる。
Ｈ． 動的光散乱（ＤＬＳ）アッセイ
動的光散乱（ＤＬＳ）は、試料量３０μＬのＣｏｒｎｉｎｇ３５４０ ３８４ウェルプレートを使用してＷｙａｔｔ ＤｙｎａＰｒｏＩＩＩで実施することができる。反復ごとに１０秒間にそれぞれ１０回の取得結果を収集することができ、試料ごとに３回の反復測定を実施した。溶媒は、試料に使用する溶媒に応じて、例えば、ｄＰＢＳ中の構築物ＩＩの場合は「ＰＢＳ」、スクロース試料を含む修飾ｄＰＢＳ中の構築物ＩＩの場合は「４％スクロース」を設定することができる。データ品質基準（ベースライン、ＳＯＳ、ノイズ、適合）を満たさない結果を「マーク」して、分析から除外することができる。スクロース試料を含む修飾ｄＰＢＳの低遅延時間カットオフを１．４μｓから１０μｓに変更して、約１ｎｍでのスクロース賦形剤のピークが、人為的に低いキュムラント分析直径の結果をもたらすことに対して影響を及ぼすことを排除することができる。
Ｉ． 示差走査熱量測定
低温示差走査熱量測定（低温ＤＳＣ）は、ＴＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ＤＳＣ２５０を使用して実行することができる。約２０μＬの試料をＴｚｅｒｏ ｐａｎにロードし、Ｔｚｅｒｏ Ｈｅｒｍｅｔｉｃ ｌｉｄで圧着することができる。試料を２５℃で２分間平衡化し、次いで５℃／分で－６０℃に冷却し、２分間平衡化してから、次いで５℃／分で２５℃に加熱することができる。熱流データは、従来の様式で収集することができる。
Ｊ． リアルタイムの緩衝液ｐＨ追跡
様々な製剤緩衝液のｐＨを、－３０℃までのｐＨを検出可能なＩＮＬＡＢ ＣＯＯＬＰＲＯ－ＩＳＭ低温ｐＨプローブでモニタリングした。１ミリリットルの緩衝液を１５ｍＬのＦａｌｃｏｎチューブに入れ、次いでｐＨプローブを緩衝液に浸した。１枚のパラフィルムを使用して、ファルコンチューブとｐＨプローブの間のギャップを密閉し、汚染と蒸発を防いだ。ファルコンチューブと一緒にプローブを－２０ＡＤ冷凍庫に入れた。緩衝液のｐＨと温度を、約２０時間、またはｐＨ対温度の挙動が繰り返しパターンを達成するまで、２．５分ごとに記録した。自動霜取りプロセスによって引き起こされる温度変化は、緩衝液のｐＨ安定性のためのストレス条件を生成した。
Ｋ． 重量モル浸透圧濃度
浸透圧計は、凝固点降下の技術を使用して浸透圧を測定する。機器のキャリブレーションは、５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、８５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、及び２０００ｍＯｓｍ／ｋｇ ＮＩＳＴトレーサブル標準を使用して実施することができる。２９０ｍＯｓｍ／ｋｇの参照溶液を使用して、浸透圧計のシステム適合性を判定することができる。
Ｌ． 密度測定
密度は、Ａｎｔｏｎ Ｐａａｒ ＤＭＡ５００濃度計で、水を基準として測定することができる。試料間で、濃度計を、水、次いでメタノールで洗浄し、風乾することができる。
Ｍ． 粘度測定
粘度は、当技術分野で公知の方法、例えば、２０１９年に公開された米国薬局方（ＵＳＰ）及びそれ以前のバージョン（その全体が参照により本明細書に援用される）で提供されている方法を使用して測定することができる。
Ｎ． ウイルス感染力アッセイ
Ｆｒａｎｃｏｉｓ，ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ ＆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（２０１８）Ｖｏｌ．１０，ｐｐ．２２３－２３６（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているようにＴＣＩＤ５０感染力価アッセイを使用することができる。２０１８年１０月１５日に提出された仮出願６２／７４５８５９に記載されている相対感染力アッセイを使用することができる。
Ｏ． 結晶化及びガラス転移温度
例示的な方法は、Ｃｒｏｙｌｅ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．８（１７）：１２８１－９０に記載されている（その全体が参照により本明細書に援用される）。
ＩＶ－３． 組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）に関連するアッセイ及び製造方法
当業者は、本明細書に記載のアッセイ及び／または当技術分野で公知の技術（例えば、ＷＯ２０１８２０９２０５Ａ１に記載のアッセイ）を使用して、本明細書に記載の組成物及び方法を試験する、例えば、本明細書に提供するｒＡＡＶを試験し得る。アッセイの詳細は、実施例５に提供されている。実施例５はまた、そのようなアッセイをどのように使用して、本明細書で提供するｒＡＡＶを試験することができるかをより詳細に示している。
バルク原薬の製造プロセスは、図３８及び図３９に示すフロー図に要約されている。バルク原薬は、実施例５に記載の３つのプラスミドを用いたＨＥＫ２９３細胞のポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介一過性トランスフェクションによって製造することができる。
関連するアッセイとして、以下が挙げられ得るが、これらに限定されない：一過性トランスフェクション、ベクター回収、ベクター精製プロセス、例えば、タンジェンシャルフロー濾過及びアフィニティークロマトグラフィーによる濃縮及びバッファー交換、イオン交換クロマトグラフィー、ならびに任意選択のＴＦＦによる濃縮または希釈に関するアッセイ。
以下の実施例は、例示を目的としたものに過ぎず、本発明を限定することを意図するものではない。
実施例１：ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２は、ＣＬＮ２バッテン病のモデルであるＴＰＰ１ｍ１Ｊマウスの生存率と神経病理学を改善する
本実施例は、ＣＬＮ２疾患のモデルであるＴＰＰ１ｍ１Ｊノックアウトマウスを使用して、本明細書で提供するｒＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２を評価するために使用し得る方法を提供する。
ＴＰＰ１ｍ１Ｊノックアウトマウスは、ＣＬＮ２の代替マウスモデルと同様に、ヒトにおけるＣＬＮ２疾患の特徴を示す（Ｓｌｅａｔ ｅｔ ａｌ，２００４． Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ；２４（４１）：９１１７－２６．；Ｇｅｒａｅｔｓ ｅｔ ａｌ，２０１７．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ；１２（５）：ｅ０１７６５２６）。本試験の目的は、ＴＰＰ１酵素を欠くマウスの脳における寿命、ＴＰＰ１活性、及び病理の評価を通じて、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２の有効性を確立することであった。
方法
ＴＰＰ１ｍ１Ｊノックアウトマウスの群（Ｎ＝１０／性別／群；約４週齢）に、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２の単一脳室内（ＩＣＶ）注射（５μＬ）を、０、１．２５×１０１０、５×１０１０、２×１０１１または８．５×１０１１ＧＣ／動物の用量で投与した。投与の９週間後に動物を安楽死させるか（５匹／性別／群）、または試験を継続して（５匹／性別／群）、寿命に対するＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２の効果を評価した。投与前及び剖検時に、ＴＰＰ１ｍ１Ｊノックアウトマウスの遺伝子型を決定する。
以下のエンドポイントを評価した：生存中の観察、ＴＰＰ１活性（血清、脳［右半球］、脊髄［胸部］及び肝臓）、抗ＴＰＰ１抗体［血清］及び神経病理。神経病理学的検査では、脳、頸椎及び腰髄のニューロン喪失、ならびに自家蛍光貯蔵物質のリソソーム内蓄積、アストロサイトーシス（ＧＦＡＰ）及びミクログリア活性化（ＣＤ６８）を評価した。
ＴＰＰ１による非蛍光ＡＡＦ－ＡＭＣ基質から蛍光なしのＡＭＣへの切断を測定する酵素アッセイを使用してＴＰＰ１の酵素活性を評価した。ＭＳＤプラットフォームを使用した溶液ブリッジングイムノアッセイによって抗ＴＰＰ１抗体の存在を評価した。
結果
図２に示すように、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２処理したＴＰＰ１ｍ１Ｊノックアウトマウスの生存率が増加した。ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２は、ＴＰＰ１酵素欠損マウスに≧２×１０１１ＧＣ／動物の用量で投与すると、生存率の向上を示す。結果は、雄と雌の両方において最高用量で１００％の生存を示した。
未処理のＴＰＰ１ｍ１Ｊノックアウトマウスで観察された臨床徴候は、８週目以降に一般的に認められ、徴候には、この疾患モデルに通常関連付けられる振戦及び後肢開脚が含まれていた。生存しているＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２処理動物では、臨床徴候は、８週目以降の未処理動物で観察された徴候と同等であった（振戦及び異常な歩行）が、食物摂取は正常であり、動物は体重を増やし続けた。
図３に示すように、ＴＰＰ１活性は、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２処理したＴＰＰ１ｍ１Ｊノックアウトマウスの脳で増加した。ＴＰＰ１活性は、すべてのＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２処理動物で増加し、性別による差異はなかった。ＴＰＰ１活性は≧５×１０１０ＧＣ／動物で同等であった。
図４に示すように、ＴＰＰ１活性は、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２処理したＴＰＰ１ｍ１Ｊノックアウトマウスの脊髄において増加した。ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２処理した動物において、用量に関連したＴＰＰ１活性の増加が観察された。
９週目に、抗ＴＰＰ１抗体の発生率が高く、高用量で最も低いシグナルが観察されたが、これは、アッセイの干渉に起因するか、免疫寛容の誘導を反映したものである可能性がある。
図５に示すように、アストロサイトーシスは、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２処理したＴＰＰ１ｍ１Ｊノックアウトマウスで減少した。ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２は、視床（ＶＰＭ／ＶＰＬ）及び皮質（Ｓ１ＢＦ）におけるアストロサイトーシス（ＧＦＡＰ）を減少させ、最高用量における動物とＷＴ動物は同等であった。
図６に示すように、ミクログリア活性化は、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２処理したＴＰＰ１ｍ１Ｊノックアウトにおいて減少した。ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２は、視床（ＶＰＭ／ＶＰＬ）及び皮質（Ｓ１ＢＦ）におけるミクログリア活性化（ＣＤ６８）を減少させた。≧２×１０１１ＧＣ／動物において、ＣＤ６８免疫反応性は、ＷＴ動物と同等であった。
図７に示すように、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２処理したＴＰＰ１ｍ１Ｊノックアウトマウスにおいて、肝ＴＰＰ１活性が増加した。ＡＡＶ９．ＣＢ７．ＣＬＮ２は、肝臓におけるＴＰＰ１活性を増加させ、雄でより大きな増加が認められた。
図８に示すように、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２処理したＴＰＰ１ｍ１Ｊノックアウトマウスにおいて、血清ＴＰＰ１活性が増加した。ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２は、血清中のＴＰＰ１活性を増加させ、雄でより大きな増加が観察された。
結論
ＣＬＮ２疾患の生物学的に適切な動物モデルにおいて、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２の単回投与により、脳、脊髄及び肝臓でのＴＰＰ１活性の増加、視床及び皮質でのアストロサイトーシスとミクログリア活性化の減少を通じた生存率の向上が示された。
脳のＴＰＰ１活性を増加させるだけでは生存率は向上しなかったことから、このモデルにおいて脊髄と肝臓に形質導入することの潜在的な治療上の利点が示された。
肝臓の形質導入効率における性別による差異は、血清型、プロモーターまたは導入遺伝子とは無関係に、ＡＡＶの取り込みに対するげっ歯類特有のアンドロゲン依存性の影響とみなされた（Ｌｏｎｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ，２００２． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｖｏｌ．５，Ｎｏ．５；Ｄａｖｉｄｏｆｆ ｅｔ ａｌ，２００３． Ｂｌｏｏｄ．１５；１０２（２）：４８０－８）。最小有効用量は、２×１０１１ＧＣ／動物であり得る。
実施例２：ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２に関する試験
本実施例は、本明細書で提供するｒＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２を評価するために使用し得る方法を提供し、これには、非臨床的試験及びヒトにおける効果の試験が含まれる。
Ｉ． 非臨床試験
Ａ． 非臨床薬理学
ｉｎ ｖｉｖｏでの一連の非臨床薬理試験を、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２で実施した。これらの試験を、ＣＬＮ２疾患の関連するマウスモデルで実施し、ＣＳＦへのＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２の脳室内（ＩＣＶ）投与後に、生存率の向上及び脳ＴＰＰ１活性の増加が示された。神経病理学的分析により、脳、頸椎及び腰髄におけるニューロン喪失の減少、ならびに自己蛍光貯蔵物質のリソソーム内蓄積、アストロサイトーシス及びミクログリア活性化が示された。
ｉｎ ｖｉｖｏ薬理学試験を、ＴＰＰ１ｍ１Ｊノックアウト（ＫＯ）マウス、乳児期遅発型神経セロイドリポフスチン症（ＬＩＮＣＬ）バッテン病（ＣＬＮ２）の生物学的に適切な疾患モデルを使用して実施した。ＴＰＰ１ｍ１Ｊノックアウトマウスは、ＣＬＮ２遺伝子のエクソン８の下流のスプライスドナー部位に一塩基変異を有し、これは可溶性リソソーム酵素ＴＰＰ１をコードしている。この変異は、神経組織で最も顕著に、リポフスチンのリソソーム蓄積をもたらした。リポフスチンの蓄積は、炎症、グリア細胞の活性化、それに続く神経細胞の変性と相関していた。ニューロンの変性は、脳、脊髄、及び運動ニューロンで生じた。ＴＰＰ１ｍ１Ｊノックアウトマウスを用いた自然史研究では、これらのマウスは、早期月齢での臨床症状の発症、異常な表現型の急速な進行、及び寿命の短縮、ならびに同様の病態生理学的、生化学的、及び機能的変化を含む、ヒトにおけるＣＬＮ２疾患の特徴を示した。ＴＰＰ１ｍ１Ｊノックアウトマウスに認められた変化は、ＣＬＮ２の代替マウスモデルであるＴＰＰ１ｔｍ１ＰｌｏｂまたはＣｌｎ２Ｒ２０７Ｘ／Ｒ２０７Ｘマウスで認められた変化と同様であった（Ｓｌｅａｔ ＤＥ，ｅｔ ａｌ． Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．１９９９；６４（６）：１５１１－２３；Ｇｅｒａｅｔｓ ｅｔ ａｌ，２０１７．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ；１２（５）：ｅ０１７６５２６） したがって、全体として、ＴＰＰ１ｍ１Ｊノックアウトマウスは、ＣＬＮ２疾患の生物学的に適切なげっ歯類モデルとみなされる。
大槽への投与は若年のマウスでは不可能であるため、すべてのマウス試験は、ＣＳＦへのＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２のＩＣＶ注射によって実施した。ＩＣＶ注射後のＡＡＶ９ベクター系製品の体内分布は、大槽への髄腔内注射（提案された臨床投与経路）と同等と考えられる。複数の種での非臨床試験により、ＡＡＶのＣＮＳ及び末梢組織内の体内分布がこれらの投与経路間で同等であることが示されている（Ｈａｕｒｉｇｏｔ Ｖ，ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２０１３；１２３（８）：３２５４－７１；Ｈｉｎｄｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ，２０１７；ＭｃＬｅａｎ ｅｔ ａｌ，２０１４，Ｂｅｌｌｅ ｅｔ ａｌ，２０１９）。したがって、これは、マウスにおけるＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２の有効性と安全性を評価するための許容可能なアプローチである。
試験の要約を表２に示す。
表２． ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２を用いた非臨床試験
Figure 2022513034000003
 ＧＣ：ゲノムコピー；ＧＬＰ：優良試験所基準；ＩＣＶ：脳室内；ＣＭ：髄腔内大槽；ＩＴ－Ｌ：髄腔内腰椎；ＫＯ：ノックアウト；ＮＡ：該当なし；ＭＦＤ：投与可能な最大用量；ＲＯＡ：投与経路；ＴＰＰ１：トリペプチジルペプチダーゼ－１。
１． ｉｎ ｖｉｖｏ薬理学
ａ） ＴＰＰ１ｍ１Ｊノックアウトマウスの自然史研究
この研究の目的は、ＴＰＰ１ｍ１Ｊノックアウトマウスの表現型と組織病理学、及びヒトのＣＬＮ２疾患の重要な特徴を再現する動物モデルの能力を特徴づけることであった。この自然史研究には、２０匹の動物からなる５群（１０匹／性別／群）が含まれ、最長２４週間観察した。また、動物の群を４週齢及び１４週齢で安楽死させて疾患の進行を評価した。生存期間の中央値は、雄のノックアウト動物で１６週間、雌のノックアウト動物で１９．５週間であり、ＣＬＮ２疾患の他のマウスモデルと同等であった（Ｓｌｅａｔ ＤＥ，ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２００４；２４（４１）：９１１７－２６．；Ｇｅｒａｅｔｓ ｅｔ ａｌ，２０１７．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ；１２（５）：ｅ０１７６５２６）。ＴＰＰ１ｍ１Ｊノックアウトマウスは、１か月齢と３か月齢の両方で、大脳と肝臓におけるＴＰＰ１酵素活性の欠損（検出不可能なレベル）を示した。ＣＬＮ２の臨床表現型の発症は、歩行異常に基づいておよそ３か月齢であった。最も顕著な疾患の症状は、３．５か月での発作後の突然死であった。発作は雌よりも雄の方が早く観察され、ケージ内の仲間との争いに起因するストレスの増加と関連していた。ＴＰＰ１ｍ１Ｊノックアウトマウスの生後１週間（及びおそらくは出生前）から、ＴＰＰ１酵素活性の欠損により、ニューロンの細胞質内にリポフスチン顆粒としても知られるリソソーム消化の脂質含有残基の蓄積が生じた。ニューロンの細胞質内でのリポフスチンの蓄積は、生後１か月のＴＰＰ１ｍ１Ｊノックアウト動物のヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色によって明らかになり、アストロサイトの活性化またはアストロサイトーシス（神経炎症の指標）の増加と相関していた。その後、ＴＰＰ１ｍ１Ｊノックアウトマウスは、運動機能の進行性の悪化と歩行異常、振戦、発作、体重減少及び摂食不能、ならびに早期死亡を経験した。ＧＦＡＰ染色によって同定された神経炎症は、３か月齢でピークに達し、ＴＰＰ１ｍ１Ｊノックアウト動物の発症と相関していた。発症後に生存していたＴＰＰ１ｍ１Ｊノックアウト動物は、ＣＮＳのニューロンに貯蔵物質の進行性の蓄積を示していた。
これらの結果は、ＴＰＰ１ｍ１Ｊノックアウトマウスが、早期月齢での臨床症状の発症、異常な表現型の急速な進行、及び寿命の短縮、ならびに同様の病態生理学的、生化学的、及び機能的変化含む、ヒトにおけるＣＬＮ２疾患の特徴を示すことを示した。このデータに基づいて、ＴＰＰ１ｍ１Ｊノックアウトマウスは、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２の有効性を評価するための適切なモデルとみなされた。
ｂ） ＴＰＰ１ｍ１ＪノックアウトマウスにおけるＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２の薬理学
ＴＰＰ１ｍ１ＪノックアウトマウスにおけるＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２の治療効果を試験するために、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２を１か月齢のＣ５７Ｂｌ／６ ＴＰＰ１ｍ１Ｊノックアウトマウス（１０匹／性別／群）に、０（ＰＢＳ）、３×１０９ＧＣ／動物、または３×１０１１ＧＣ／動物の用量でＩＣＶ投与した。エンドポイントには、臨床所見、運動協調性（ロッキングロータロッド試験）、学習能力（学習ロータロッド試験）、体重、ＴＰＰ１活性、及び抗ＴＰＰ１抗体が含まれていた。試験終了時に、ＩＣＶ注射の２６週間後、生存動物において、脳と肝臓におけるＴＰＰ１活性、ベクターの肝臓内分布、及び脳の組織病理学の修正を評価した。ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２処理に関連する有害な臨床所見はなかった。ＣＬＮ２関連エンドポイントのＣＮＳ及び末梢パラメーターの両方の改善に関連するＴＰＰ１レベルの用量依存的な増加が観察された。３×１０１１ＧＣ／動物で、ＴＰＰ１ｍ１Ｊノックアウトマウスにおける生存率は、２６週間後に、雄では１００％、雌では７０％であった（図９）。
投与後１１週目に、運動協調性（ロッキングロータロッドから落下するまでの待機時間）は、３×１０１１ＧＣ／動物のみでＴＰＰ１ｍ１ＪノックアウトマウスＷＴ動物と同等であった；しかしながら、投与後２０週間で、ＷＴ対照と比較した場合に、この用量での落下までの待機時間は減少した。これに反して、投与後１３週目及び２０週目の両方での運動学習において、３×１０１１ＧＣ／動物でのＷＴマウスとＴＰＰ１ｍ１Ｊマウスとの間に差はなかった。３×１０９ＧＣ／動物でのＴＰＰ１ｍ１Ｊノックアウトマウスでの運動協調性または学習は向上せず、未処理ＴＰＰ１ｍ１Ｊノックアウトマウスと同等であった。ＴＰＰ１ｍ１Ｊノックアウトマウスでは、脳全体のニューロンの細胞質内でのリソソーム貯蔵の蓄積が観察された。未処理ＴＰＰ１ｍ１Ｊノックアウトマウスと比較した場合、３×１０１１ＧＣ／動物でＴＰＰ１ｍ１Ｊノックアウトマウスにおいて、リソソーム貯蔵物質は減少し、神経細胞の形態は正常と考えられた。アストロサイトーシス（ＧＦＡＰ染色）についての脳の評価により、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２が皮質及び海馬において１００％の効率でアストロサイトーシスを予防することができることが示された（図１０）。アストロサイトーシスの減少が脳幹で観察された（図１０）。３×１０９ＧＣ／動物で、生存率または病理への影響はなかった。まとめると、これらの結果は、ＣＬＮ２疾患の臨床症状及び組織病理学を予防するためのＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２の治療効果を実証した。
注射後１０週目及び２６週目に回収した血清試料中で、ＴＰＰ１酵素活性を測定した。３×１０１１ＧＣ／動物では、注射後１０週目に、動物は、超生理的なＴＰＰ１血清活性を発現し、治療後２６週目にはＷＴ値に近づいた。１０週目では、すべてのＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２処理した動物、特に低用量で処理した動物は、血清中に高レベルの抗ＴＰＰ１抗体を発現した。高用量で処理した雄は、おそらく部分的な寛容化または高濃度ＴＰＰ１でのアッセイへの干渉のために、導入遺伝子に対してより穏やかな体液性免疫応答を発現したようであった。
試験のエンドポイントで、ＴＰＰ１酵素活性を３つの臓器：大脳、小脳／脳幹、及び肝臓において、ＰＢＳ処理ＷＴマウスと高用量ＴＰＰ１ｍ１Ｊマウスの間で比較した。各組織について、ＴＰＰ１活性は、処理したＴＰＰ１ｍ１Ｊノックアウトマウスにおいてより高かったが、このことは、ＴＰＰ１機能を回復させるためのＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２ ＩＣＶ療法の高い有効性を示している。ＴＰＰ１ｍ１Ｊノックアウトマウス以外は、群内で性別による差異は観察されなかった。高用量での肝ＴＰＰ１活性は、雌よりも雄の方が１０倍高かった。
この試験では、最小有効量は３×１０１１ＧＣ／動物であるとみなされ、これは、生存率、生存中の観察、リソソーム蓄積物質の減少、正常な神経細胞の形態、及びアストロサイトーシスの予防に基づいて、７．５×１０１１ＧＣ／ｇ脳（推定脳重量０．４ｇ）に相当する。この用量での平均ＴＰＰ１活性は、脳（大脳と小脳の組み合わせ）で１９２０５Ｕ／ｍｇ／時間、肝臓で９９９９１Ｕ／ｍｇ／時間、及び血清で１７７Ｕ／μＬ／時間であった。
ｃ） Ｄｉｇｉｔａｌ Ｖｉｖａｒｉｕｍでの非侵襲的フルタイムモニタリングを使用したマウスにおける脳室内ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２の有効性の評価
ＴＰＰ１ｍ１ＪノックアウトマウスにおけるＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２の有効性を試験するために、ｄｉｇｉｔａｌ ｖｉｖａｒｉｕｍ（Ｖｉｕｍ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）でバイアスのない非侵襲的フルタイムモニタリングを使用して、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２を、３×１０１１ＧＣ／動物で、７週齢のＴＰＰ１ｍ１Ｊノックアウトマウス（７匹の雄と６匹の雌）にＩＣＶ投与した。処理した動物を、年齢を一致させたビヒクル処理したＴＰＰ１ｍ１Ｊノックアウトマウス（５匹の雄と５匹の雌）及びＷＴマウス（５匹の雄と８匹の雌）と比較した。以下のエンドポイントを継続的に記録したが、これには、夜間の動き、日中の動き、呼吸数、及び概日リズムが含まれていた。ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２ ＩＣＶ注射の２週間後（９週齢）に記録を開始し、予定された殺処分（注射後１６週目、２３週齢）または予定外の死亡の場合はそれ以前まで続けた。試験の終わりに、脳と肝臓の秤量、及び脳と肝臓の組織病理学の評価を、生存していた動物で実施した。未処理のＴＰＰ１ｍ１Ｊノックアウトマウスは、振戦、猫背の姿勢、異常歩行、発作を有し、病態の悪化により安楽死させたか、または死亡が判明した。臨床徴候は１４．９週目から観察されたが；一方、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２処理したＴＰＰ１ｍ１Ｊノックアウトマウスの５４％（１３匹中７匹）は、試験全体を通して臨床的に注目すべき点はなかった。最初の臨床事象での平均年齢は、ＴＰＰ１ｍ１Ｊノックアウトビヒクル処理マウスで１６．１週、６匹のＡＡＶ９．ＣＢ７．ＨＣＬＮ２処理ＴＰＰ１ｍ１Ｊノックアウトマウスで１８．６週であった。７匹のＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２処理ＴＰＰ１ｍ１Ｊノックアウトマウスは、臨床徴候を示さなかった。
ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２は、３×１０１１ＧＣ／動物の用量で十分に忍容され、ＴＰＰ１ｍ１Ｊノックアウトマウスの寿命を延ばした。ビヒクル処理ＴＰＰ１ｍ１Ｊノックアウトマウスの生存期間中央値は、雄では１７．６週、雌では１７．４週であった。平均して、臨床的に目に見える徴候の発症から１．５週間後に死亡が発生した。最終殺処分エンドポイント（注射後１６週目、２３週齢）では、処理した雄の５７％（７匹中４匹）と処理した雌の６７％（６匹中４匹）が生存していたが、一方、すべての未処理ＴＰＰ１ｍ１Ｊノックアウトマウスは、１９週齢までに死亡した（図１１）。ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２処理ＴＰＰ１ｍ１Ｊノックアウトマウスは、試験の全体にわたってＷＴマウスに近い体重を維持したが、一方、ビヒクル処理マウスは、１３週齢から徐々に体重を失った。呼吸速度はすべての群で同等であり、遺伝子型または処理の影響は検出することができなかった。正常な健康なマウスは、夜間（暗期）に活動が増加し、日中の明期には活動が低下し、明確な二相性概日運動特性を示す。雄と雌の両方のビヒクル処理ＴＰＰ１ｍ１Ｊノックアウトマウスは、二相性特性を失い始め、１６週齢前後の暗期に活動の低下を示した。ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２処理したマウスは、試験が終了するまでＷＴと同一の概日運動特性を示した。ビヒクル処理したＴＰＰ１ｍ１Ｊノックアウトマウスは、ＷＴマウスに比べて夜間の移動速度が減少し、注射後７．７週目（１４．７週齢）には、統計的に有意な減少が観測された。逆に、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２処理ＴＰＰ１ｍ１Ｊノックアウトマウスは、夜間の活動レベルを維持していたが、これはビヒクル処理ＴＰＰ１ｍ１Ｊノックアウトマウスに比べて統計学的に有意に高く、また、ＷＴマウスと比べて統計学的に有意差がなかった。試験終了時の脳の顕微鏡検査により、試験終了時のＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２処理ＴＰＰ１ｍ１Ｊノックアウトマウスの皮質及び海馬におけるアストロサイトーシスの減少が示された。
本試験では、疾患の生存率の改善、及び疾患に関連する神経行動障害、すなわち概日活動及び夜間運動の正常化（これらは、神経炎症（アストロサイトーシス）の減少と相関していた）に基づいて、最小有効量を３×１０１１ＧＣ／動物（７．５×１０１１ＧＣ／ｇ脳（脳重量０．４ｇと仮定）に相当する）であるとみなした。
ｄ） Ｃ５７ＢＬ／６ ＴＰＰ１ｍ１ＪノックアウトマウスにおけるＡＡＶ９送達（ＩＣＶ）を使用したＴＰＰ１置換の効果
この試験の目的は、寿命を延ばし、リソソーム蓄積物質を減少させ、ＴＰＰ１酵素を欠損するマウスの脳の病理を軽減する、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２の最小有効量を確立することであった。ＴＰＰ１ｍ１Ｊノックアウトマウスの群に、ビヒクルまたはＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２の単回ＩＣＶ投与を行い、生存率をモニタリングした。野生型Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの追加的な群を対照として含めた。この試験は２つの部分に分けられ、第１の部分は９週間後の薬力学（ＴＰＰ１活性）と神経病理学を評価する部分であり、第２の部分はこれらのマウスの寿命を評価する部分であった。ＴＰＰ１ｍ１Ｊノックアウトマウスの群（ｎ＝３０／性別／群）に、０（ビヒクル）、１．２５×１０１０、５×１０１０、２×１０１１、８．５×１０１１ＧＣ／動物の用量でＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２の単回ＩＣＶ注射（５μＬ）を投与した。動物（５匹／性別／群）を、投与の９週間後（１３週齢）に安楽死させた。寿命に対するＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２の効果を評価するために試験の第２部分に割り当てた動物は進行中であり、以下に記載する。この試験では、以下のパラメーターとエンドポイントを評価した：死亡率、臨床所見、体重、神経行動学的観察（投与前及び８週目）、ＴＰＰ１活性、抗ＴＰＰ１抗体、肉眼的剖検所見、臓器重量及び神経病理（９週目）。神経病理学的検査では、脳、頸椎及び腰髄のニューロン喪失、ならびに自家蛍光貯蔵物質のリソソーム内蓄積、アストロサイトーシス（ＧＦＡＰ）及びミクログリア活性化（ＣＤ６８）を評価した。
ビヒクル及びＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２を、１日目に１回ＩＣＶ注射により投与した。未処理のＴＰＰ１ｍ１Ｊノックアウトマウスで認められた臨床徴候は、８週目以降に一般的に認められ、徴候には、この疾患モデルに通常関連付けられる振戦及び後肢開脚が含まれていた。この群の死亡率は、これらのマウスを用いた以前の試験と同様に、１１～１８週齢（中央値１８週）であった。図１２Ａ～１２Ｂに示すように、≦５×１０１０ＧＣ／動物の用量では、生存率は向上しなかった。１．２５×１０１０ＧＣ／動物では、生存期間中央値は、雄と雌でそれぞれ１５週間及び１７週間であった。５×１０１０ＧＣ／動物では、生存期間中央値は、雄と雌でそれぞれ１８週間及び１６週間であった。≧２×１０１１ＧＣ／動物の用量では、生存率の明らかな改善が現在３６週齢の動物で観察された。
４０週齢では、２×１０１１ＧＣ／動物で５／５の雄と３／５の雌が生存し、８．５×１０１１ＧＣ／動物では１００％の雄と雌が生存する。ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２処理した動物に認められた臨床徴候は、未処理ＴＰＰ１ｍ１Ｊノックアウトマウスと同等であり、運動失調、歯がカチカチ鳴る、高い保因及び低い保因などの追加の所見が認められた。１２週齢（８週目）では、神経行動学的観察により、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２処理動物において、未処理ＴＰＰ１ｍ１Ｊノックアウトマウスでは記録されなかった野外での軽度の間代性動作と異常歩行の所見が記録された。２０週齢の野外観察では、生存していた２つのＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２処理群における大多数の動物が間代性動作を伴っており、２匹の動物をホームケージから取り出した際に痙攣が認められた。間代性動作は、１６週目において、２／５の未処理の雌ＷＴ動物でも認められた。３０週齢では、≧２×１０１１ＧＣ／動物の体重は、雄ではＷＴ動物と同等であり、雌ではわずかに低かった（約１５％）。９週目のコホートでは、未処理またはＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２処理動物のいずれにおいても、肉眼的所見または臓器重量への影響はなかった。
９週目に、導入遺伝子産物（ＴＰＰ１活性）の用量に関連した増加が、脳（図１３Ａ～１３Ｂ）、脊髄（図１４）、肝臓（図１５Ａ～１５Ｂ）及び血清（図１６Ａ～１６Ｂ）で観察された。一般的に、ＴＰＰ１活性は、脊髄を除いて、雌よりも雄の方が大きかった。ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２処理した動物の大多数は、抗ＴＰＰ１抗体に陽性であった。高用量（８．５×１０１１ＧＣ／動物）と比較した場合、低用量（１．２５×１０１０ＧＣ／動物）において、最も高いＡＴＰＡ応答が観察された。低用量と高用量の差異は、高い導入遺伝子産物濃度でのアッセイに起因するか、免疫寛容の誘導を反映したものである可能性があるため、その有意性は不明である。
神経病理学的分析により、進行中の生存と相関する≧２×１０１１ＧＣ／動物の脳でのマウスの皮質及び視床におけるアストロサイトーシス（図１７Ａ～１７Ｂ）及びミクログリア活性化（図１８Ａ～１８Ｂ）の減少が示された。したがって、この試験におけるＭＥＤは、２×１０１１ＧＣ／動物（５×１０１１ＧＣ／ｇ脳（脳重量０．４ｇを仮定して）の用量に相当）であるとみなされた。
この試験は、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２が、脳、脊髄及び肝臓の形質導入と、それに続くＣＬＮ２疾患の神経病理学的特徴であるアストロサイトーシス及びミクログリア活性化の減少を通じて、ＣＬＮ２疾患のマウスモデルの生存率を向上させることを示した。５×１０１０ＧＣ／動物の用量を与えた動物では、最高用量の場合と同等レベルのＴＰＰ１活性であったが、同等レベルの脳ＴＰＰ１活性を有する群において生存率の向上はなく、生存率（５×１０１０ＧＣ／動物）及び神経病理学的エンドポイントの向上に対する影響を欠いており、このことは、脊髄及び肝臓の形質導入がこれらの動物の全生存率に寄与していたことを示唆している可能性がある。
この試験では、生存率の向上とアストロサイトーシス及びミクログリア活性化の減少に基づいて、最小有効量は２×１０１１ＧＣ／動物（５×１０１１ＧＣ／ｇ脳（脳重量０．４ｇと仮定）に相当）であるとみなされた。
２． 安全性薬理学
中枢神経系：神経行動学的エンドポイントは、マウスでの３か月毒性試験、及びカニクイザルでの４週間薬力学的試験に含まれた。
マウスでの３か月毒性試験：機能観察総合検査（ＦＯＢ）による評価を、１３週目に実施し、これには、活動、姿勢、飼育、行動、刺激への応答（アプローチ、クリック、テールピンチ、及びタッチ）、瞳孔反応、グリップ反応及び疼痛知覚（侵害受容性［熱］）刺激に対する応答待機時間）の評価が含まれていた。これらのパラメーターには影響がなく、野外において後ろ足で立つ回数が、雄では≧２．００×１０１１ＧＣ／動物において、雌では８．５０×１０１１ＧＣ／動物において減少していたことが唯一の注目すべき所見であった。他の所見がない場合、これはＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２関連性であるとはみなされなかった。
カニクイザルでの４週間薬力学的試験：カニクイザルでの４週間試験では、臨床所見に加えて、４週目における包括的な神経学的検査を実施し、これには、一般的な感覚及び運動機能、脳反射（瞳孔、輪状及び角膜反射）及び脊髄反射（感覚反射、膝反射、皮膚反射、固有受容反射、尾反射）が含まれていた。これらのエンドポイントに対するＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２関連の影響はなく、すべての動物に、試験中の行動異常または臨床徴候はなかった。
呼吸器系：特定の呼吸器試験は実施しなかったが、４週間後もしくは１３週間後における、マウス毒性試験のＦＯＢにおいて評価した呼吸器エンドポイント、または肺における微視的変化に影響はなかった。
心血管系：特定の心血管試験は実施せず、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２による処理の４週間後または１３週間後のマウス毒性試験において、心血管系への影響を示す微視的変化はなかった。
ａ） 概要
ＬＩＮＣＬバッテン病（ＣＬＮ２）のための疾患モデルであるＴＰＰ１ｍ１Ｊノックアウトマウスを用いて、一連のｉｎ ｖｉｖｏ薬理学試験を実施した。ＴＰＰ１ｍ１Ｊノックアウトマウスは、ＣＬＮ２遺伝子のエクソン８の下流のスプライスドナー部位に一塩基変異を有し、これは可溶性リソソーム酵素ＴＰＰ１をコードしている。これらのマウスを用いた自然史研究は、ＣＬＮ２疾患の他のマウスモデルと同様の、早期月齢での臨床症状の発症、異常な表現型の急速な進行、及び寿命の短縮、ならびに同様の病態生理学的、生化学的、及び機能的変化を含む、ヒトにおけるＣＬＮ２疾患の特徴を示していた（Ｓｌｅａｔ ＤＥ，ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２００４；２４（４１）：９１１７－２６．；Ｇｅｒａｅｔｓ ｅｔ ａｌ，２０１７． ＰＬｏＳ Ｏｎｅ；１２（５）：ｅ０１７６５２６）。ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２を、ＩＣＶ ＴＰＰ１ｍ１Ｊノックアウトマウスに投与した場合、生存期間中央値が１８週間（未処理）から４０週間（試験継続中）に向上した。行動エンドポイントの評価は、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２で処理したＴＰＰ１ｍ１Ｊノックアウトマウスにおいて、運動協調と学習の改善、及び明確な二相性概日性運動特性の回復を示した。標準的な臨床観察に関して、未処理動物とＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２処理動物の間で発症及び臨床徴候（振戦及び異常歩行）に明確な差異はなかったが、これらの臨床所見の進行はなく、試験を継続するにつれて、動物は体重を増加し続けている。すべての薬理学試験において、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２は、脳と脊髄のＴＰＰ１活性を増加させた。高用量において観察されたＴＰＰ１活性の変動性は、生存率と神経病理学的エンドポイントの減少に明確な用量反応性があったことから、妥当性は不明であった。ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２を使用したすべての試験において、リソソーム蓄積物質の明らかな減少、正常な神経細胞の形態、及びアストロサイトーシスとミクログリアの活性化の減少が認められた。ＴＰＰ１の発現を介してＣＬＮ２の神経病理学的表現型を弱めるという点で、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２の効果は、ｒｈＴＰＰ１をＣＬＮ２－／－マウス及びＴＰＰ１－ｎｕｌｌダックスフントに投与した後に記載された効果と同等である（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ，２００８；Ｖｕｉｌｌｅｍｅｎｏｔ ｅｔ ａｌ，２０１５）。脳活性の増加に加えて、ＡＡＶｒｈ１０．ｈＣＬＮ２で認められるように肝ＴＰＰ１活性が増加した（Ｓｏｎｄｈｉ ｅｔ ａｌ ２００７）。血液脳関門はＴＰＰ１がＣＮＳを離れるのを防ぐ可能性が高いため、全身的に検出される活性は、投与直後の末梢循環へのＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２の漏出に関連している可能性がある。全身性ＴＰＰ１は、ＣＮＳ外の組織と臓器におけるリソソーム貯蔵物質の蓄積に関連する機能障害を減弱し得るため、これはＣＬＮ２疾患の治療に潜在的に有益である（Ｋａｔｚ，ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ２０１７ Ｆｅｂ ２４（４）：２１５－２２３）。肝臓の形質導入効率（ＴＰＰ１活性）におけるげっ歯類の薬理学試験で観察された性別関連の差異は、血清型、プロモーター、または導入遺伝子とは無関係に、ＡＡＶの取り込みに対するアンドロゲン依存性の影響であると考えられる（Ｌｏｎｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ，２００２．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｖｏｌ．５，Ｎｏ．５；Ｄａｖｉｄｏｆｆ ｅｔ ａｌ，２００３． Ｂｌｏｏｄ．１５；１０２（２）：４８０－８）。ＡＡＶ９．ＣＢ７．ＨＣＬＮ２を用いたカニクイザルの４週間薬力学試験では、肝臓への形質導入において雄と雌の間に明確な差異はなかった。
要約すると、生物学的に適切な疾患の動物モデルにおけるＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２の単回投与により、脳、脊髄、及び肝臓におけるＴＰＰ１活性の増加を通じて生存率を向上させ、脳、頸部脊髄及び腰部脊髄におけるニューロンの喪失ならびに自己蛍光貯蔵物質のリソソーム内蓄積、アストロサイトーシス及びミクログリア活性化を減弱することが示された。これらの試験では、最小有効用量は、≧２×１０１１ＧＣ／動物の用量であると考えられ、これは５×１０１１ＧＣ／ｇ脳に相当する。
Ｂ． 動物における薬物動態及び製品の代謝
薬力学（導入遺伝子産物）及び免疫原性の評価を、マウスでの３か月毒性試験及びカニクイザルでの４週間薬力学試験で評価した。
１． ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２：Ｃ５７Ｂｌ／６マウスでの３か月間毒性試験
Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの群（ｎ＝３０／性別／群）に、０（ビヒクル）、１．２５×１０１０、５×１０１０、２×１０１１、８．５×１０１１ＧＣ／動物の用量でＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２の単回ＩＣＶ注射（５μＬ）を投与した。正確な投与装置を用いた互換性試験により、低用量でのいくらかのベクター損失が示され、したがって、１．２５×１０１０、５×１０１０、２×１０１１、８．５×１０１１ＧＣ／動物に対して、投与する実際の用量は、それぞれ、０．９×１０９（７０％回収）、３．９×１０１０（７７％回収）、１．８×１０１１ＧＣ／動物（９０％回収）及び８．５×１０１１ＧＣ／動物（１００％回収）であった。
結果を、図１９Ａ～１９Ｂ、２０Ａ～２０Ｂ及び２１Ａ～２１Ｂに示す。マウスへのＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２の投与は、脳ＴＰＰ１活性における性別に関する差異を伴わずに、雄及び雌における脳ＴＰＰ１活性の用量依存的増加をもたらした（図２０Ａ～２０Ｂ）。両方の性別における４週目と１３週目の間で脳ＴＰＰ１活性に差はなかった。肝ＴＰＰ１活性は、４週目と１３週目の両方で雄と雌で増加し、雄のみで４週目と１３週目の間に差がなかった（図２１Ａ～２１Ｂ）。しかしながら、雌では、肝ＴＰＰ１活性は４週目よりも１３週目が一貫して低かった。最も高い用量である８．５×１０１１ＧＣ／動物では、肝ＴＰＰ１活性は、１３週目の脳ＴＰＰ１活性に比べて１８倍（雄）及び４倍（雌）高かった。血清ＴＰＰ１活性の用量依存的な増加が雄と雌で観察された（図１９Ａ～１９Ｂ）。１３週目では、血清ＴＰＰ１活性は、すべての用量群で雌よりも雄の方が一般的に高く、８．５×１０１１ＧＣ／動物では、雄と雌の間でおよそ１１倍の増加であった。１３週目の血清ＴＰＰ１活性は、４週目と比較した場合、雄で増加し、雌で減少していた。
ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２処理した動物の大多数は、４週目と１３週目において、抗ＴＰＰ１抗体に陽性であった。高用量（８．５×１０１１ＧＣ／動物）と比較した場合、低用量（１．２５×１０１０ＧＣ／動物）において、より高いＡＴＰＡ応答が観察された。
２． ＡＡＶ９．ＣＢ７．ＨＣＬＮ２：カニクイザルにおける髄腔内投与による単回投与の薬力学試験
カニクイザルの群（雄１匹及び雌２匹／群）に、０、３．４×１０１１、３．２×１０１２または２．９×１０１３ゲノムコピー（ＧＣ）／動物（１ｍＬ／動物）の用量で、大槽穿刺（ＣＭ）を介した髄腔内注射により、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２を投与した。さらなる動物の群（雄１匹と雌２匹）に、腰部髄腔内穿刺（ＩＴ－Ｌ；１ｍＬ／動物）を介して３．２×１０１２ＧＣ／動物を投与した。血清及びＣＳＦの試料を、試験中に回収した。ＴＰＰ１活性とＴＰＰ１濃度を、以下に対して評価した：血清とＣＳＦ（投与前［－１日目または１日目］、４、８、１１、１５、１８、２２、２５及び２９日目）、肝臓、脊髄（頸部、胸部及び腰部）及び脳。脳については、前頭皮質、後頭皮質、小脳、線条体、延髄、中脳及び視床由来の表層または深層試料を分析した。
１５匹中６匹の動物は、投与前試料の時点で抗導入遺伝子産物（ＴＰＰ１）抗体（ＡＴＰＡ）応答が陽性であるとみなされた。２９日目に、ＡＴＰＡ陽性動物の発生率は、０ＧＣ／動物で１／３動物、３．４×１０１１ＧＣ／動物（ＣＭ）で２／３動物、３．２×１０１２ＧＣ／動物（ＣＭ）で３／３動物、２．９×１０１３ＧＣ／動物（ＣＭ）で３／３動物及び３．２×１０１２ＧＣ／動物（ＩＴ－Ｌ）で２／３動物であった。
２．９×１０１３ＧＣ／動物（ＣＭ）では、血清及びＣＳＦの両方でＴＰＰ１活性と濃度の増加が観察され、ピークレベルは一般的に１５日目に認められた（図２２Ａ～２２Ｂ及び２３Ａ～２３Ｂ）。その後、試験の終わりに向かってＴＰＰ１活性と濃度が低下する傾向があった。血清及びＣＳＦ中のＴＰＰ１活性と濃度の低下は、試験の終わりにこれらの動物で観察され、組換えヒトタンパク質を投与した非ヒト霊長類で通常認められる免疫原性と関連していた。３．２×１０１２ＧＣ／動物（ＣＭ）で、ここでもおそらくヒト導入遺伝子産物の免疫原性に関連して、１８日目以降に減少するベースライン値と比較した場合、平均血清ＴＰＰ１活性と濃度に最小の増加があった。この群で観察されるＣＳＦ ＴＰＰ１活性または濃度に明らかな増加はなかったが、１匹の動物は８日目～２５日目の間にわずかな増加を示した。３．４×１０１１ＧＣ／動物（ＣＭ）で、血清またはＣＳＦで観察されたＴＰＰ１活性または濃度に増加は認められなかった。
２．９×１０１３ＧＣ／動物（ＣＭ）で、中脳（深層［１／３動物］及び表層）、延髄（深層及び表層）及び小脳（深層及び表層）について対照群と比較した場合、平均ＴＰＰ１活性が増加していた。この用量で、前頭皮質（深層及び表層）、線条体（深層及び表層）、視床（表層）、中脳（深層及び表層）、後頭皮質（深層及び表層）、延髄（深層及び表層）及び小脳（深層及び表層；表３；図２４Ａ～２４Ｄ及び２５Ａ～２５Ｃ）について対照群と比較した場合、平均ＴＰＰ１濃度が増加していた。３．２×１０１２ＧＣ／動物で、対照群と比較した場合、ＴＰＰ１活性またはＴＰＰ１濃度に明確な差はなかった。１匹の動物は、対照の平均値と比較した場合、ほとんどの深部脳領域で小さな上昇の傾向を示した。最も低い用量（３．２×１０１２ＧＣ／動物）での動物について、対照群と比較した場合、すべての脳領域で増加が観察されたものの、用量反応性はなく、一般的に、高用量に比べて値が低かったため、処理との関係性は不明確である。
表３．ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２処理（ＣＭ）カニクイザルの脳領域におけるＴＰＰ１濃度
Figure 2022513034000004
対照群と比較した場合、２．９×１０１３ＧＣ／動物で、ＴＰＰ１活性は、脊髄のすべての領域（頸部、胸部及び腰部）において増加した。２／３の動物では、これらの変化は対照群よりも最大５．３倍大きかった。この群の残りの動物は依然としてＴＰＰ１活性の増加を示したが、これは他の２匹の動物よりも少なく、対照群よりも最大２．４倍大きかった。ＴＰＰ１濃度の増加は、ＴＰＰ１活性の特性に従い、脊髄のすべての領域（頸部、胸部、腰部）で増加が観察された。ＴＰＰ１活性は脊髄の異なる領域間で差異を示さなかったが、ＴＰＰ１濃度は、脊髄の腰部領域で、頸部または胸部領域に比べて高かった。３．２×１０１２ＧＣ／動物で、ＴＰＰ１活性は、脊髄のすべての領域（頸部、胸部及び腰部）で増加し、対照群に比べて最大で２倍増加した（図２６Ａ～２６Ｂ）。これはＴＰＰ１濃度にも反映され、最大１．８倍の増加が観察された。３．４×１０１１ＧＣ／動物で、ＴＰＰ１活性及びＴＰＰ１濃度は、対照群と比較した場合、脊髄の頸部、胸部及び腰部領域で増加し、最大で１．６倍増加した。
２．９×１０１３ＧＣ／動物で、ＴＰＰ１活性及びＴＰＰ１濃度は、それぞれ７倍及び４倍増加した。３．２×１０１２ＧＣ／動物で、ＴＰＰ１活性及びＴＰＰ１濃度は、それぞれ３．７倍及び１．５倍増加した。３．４×１０１１ＧＣ／動物で、ＴＰＰ１活性及びＴＰＰ１濃度は、それぞれ１．８倍及び１．６倍増加した。
試験の過程にわたって、対照群と比較した場合に、３．２×１０１２ＧＣ／動物（ＩＴ－Ｌ）で、血清ＴＰＰ１活性に明確な差はなかった。血清ＴＰＰ１濃度を評価した場合にはこれは反映されず、なぜなら４日目以降から試験終了までわずかな増加が観察されたからである。ＣＳＦの場合、ＴＰＰ１活性は対照群と同等であったが、ベースラインと比較した場合、ＴＰＰ１濃度は８日目以降わずかな増加を示し、これは、等用量のＣＭ投与では観察されなかった。前頭皮質（深層及び表層）、線条体（深層及び表層）、視床（深層及び表層）、中脳（深層及び表層）、後頭皮質（深層及び表層）、延髄（深層及び表層）及び小脳（深層及び表層）について、ＴＰＰ１活性の上昇が最小になる傾向が観察された。これはＴＰＰ１濃度についても、程度はより低いものの同様に認められ、主に１匹または２匹の動物におけるわずかな増加によるものであった。増加は最小限であり、すべての動物で観察されたわけではないため、処理との関係性は不明である。脊髄を除いて、この用量でＣＭまたはＩＴ－Ｌを介してＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２を投与した動物間に明確な差異はなかった。一般的に、ＴＰＰ１活性と濃度の両方が、同じ用量のＣＭ群と比較した場合、ＩＴ－Ｌ処理動物の脊髄、特に頸部と腰部で大きかった。脊髄の頸部における増加は、この群の動物を、投与直後にトレンデレンブルグ体位に置いたことと関連している可能性がある。
３． 概要
３か月マウス毒性試験におけるＴＰＰ１（導入遺伝子産物）の評価により、脳、肝臓、及び血清におけるＴＰＰ１活性の用量に関連した増加が示された。薬理学試験と同様に、肝ＴＰＰ１活性は雌よりも雄の方が大きかったが、これはカニクイザルでは明確ではなかった。１か月と３か月の間に明確な差異はなく、４週間目までに導入遺伝子の発現がピークに達したことが示された。この試験では、薬理学試験で認められたように、抗ＴＰＰ１抗体の発生率が高く、高用量で最も低い値が観察されたが、これはアッセイの干渉に起因するか、または免疫寛容の誘導を反映したものである可能性がある。
４週間薬力学試験では、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２の投与により、用量２．９×１０１３ＧＣ／動物（４．２０×１０１１ＧＣ／ｇ脳（試験終了時の脳重量に基づく）の群平均用量に相当）での血清及びＣＳＦにおけるＴＰＰ１活性及び濃度の増加が誘導された。２週目までにＣＳＦ及び血清で認められたＴＰＰ１の減少は、生物療法を用いた非臨床試験で一般的に認められた効果と同様に、ヒト導入遺伝子産物に対する免疫原性と関連していた。ＣＳＦ及び血清においてＴＰＰ１レベルの低下が認められたが、一方、抗Ｔｐｐ１抗体の存在が脳内のＴＰＰ１レベルに影響を及ぼし、クリアランスの増加または他のメカニズム（中和抗体）のために濃度を過小評価した可能性があるかどうかについては不明である。
この試験における最も高い用量で、カニクイザルの組換えヒトＴＰＰ１（ｒｈＴＰＰ１）について公開されたもの（Ｖｕｉｌｌｅｍｅｎｏｔ ｅｔ ａｌ，２０１４）と同様に、２９日目に脳領域のＴＰＰ１濃度が増加した。ＩＣＶ投与した場合のＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２とｒｈＴＰＰ１の主な差異は、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２を形質導入した細胞は、持続注入によってｒｈＴＰＰ１を与え、ゼロ次の薬物動態特性を達成するのとほぼ同等のＴＰＰ１を常時生成することである。したがって、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２を投与すると、ｒｈＴＰＰ１をＩＣＶ送達する場合に認められるような、脳及びＣＳＦにおけるＴＰＰ１についてのそのようなピーク・トラフは存在しない。この試験において低用量で明確な効果が欠如していたことは、脳内のＴＰＰ１に増加を認めるためのカニクイザルにおける最小用量が、４．２０×１０１１ＧＣ／ｇ脳のＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２であり得ることを示唆していた。この試験では、脊髄の形質導入があったが、脊髄において最大のＴＰＰ１活性／濃度を有する２匹の動物はまた、最も高いＣＳＦ ＴＰＰ１濃度を有することが観察された動物でもあったことから、これがＣＳＦにおけるＴＰＰ１の増加を説明している可能性がある。ＴＰＰ１ｍ１Ｊノックアウトマウスの薬理学試験と同様に、肝臓及び血清における導入遺伝子産物が増加した。これは、投与直後の末梢循環へのＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２の分布に関連しており、前述のようにＣＬＮ２疾患の治療に潜在的に有益であり得る。この試験では低用量で明確な効果がなかったため、カニクイザルのデータは、脳と脊髄におけるＴＰＰ１活性の増加を認めるために、２．９×１０１３ＧＣ／動物の用量（４．２０×１０１１ＧＣ／ｇ脳の用量に相当（試験終了時の脳重量から計算された用量））が必要である可能性があり、これらの用量は、マウスの薬理学試験で達成された最小効果用量と同等であったことを示唆していた。
Ｃ． 毒性
１． 単回投与試験
ａ） ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２：Ｃ５７Ｂｌ／６マウスでの３か月間毒性試験
この試験の目的は、単回ＩＣＶ投与後のＣ５７Ｂｌ／６マウスにおけるＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２の薬力学、毒性、及び免疫原性を評価することであった。マウスの群（ｎ＝３０／性別／群）に、０（ビヒクル）、１．２５×１０１０、５×１０１０、２×１０１１、８．５×１０１１ＧＣ／動物の用量でＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２の単回ＩＣＶ注射（５μＬ）を投与した。投与後４週間（１０匹／性別／群）または１３週間後（１０匹／性別／群）に動物を安楽死させた。追加的なサテライト動物の群（ｎ＝５／性別／群）を各時点で安楽死させて、脳及び肝臓における導入遺伝子産物（ＴＰＰ１活性）を評価した。正確な投与装置を用いた互換性試験により、より低用量でのいくらかのベクター損失が示され、したがって、１．２５×１０１０、５×１０１０、２×１０１１、８．５×１０１１ＧＣ／動物に対して、投与する実際の用量は、それぞれ、０．９×１０９（７０％回収）、３．９×１０１０（７７％回収）、１．８×１０１１ＧＣ／動物（９０％回収）及び８．５×１０１１ＧＣ／動物（１００％回収）であった。
この試験では、以下のパラメーターとエンドポイントを評価した：死亡率、臨床所見、体重、食物消費、眼底検査、機能観察総合検査（ＦＯＢ）評価、臨床病理パラメーター（血液学及び臨床化学）、ＴＰＰ１酵素活性（血清、脳及び肝臓）及び抗ＴＰＰ１抗体（血清）、肉眼的剖検所見、臓器重量、肉眼検査及び顕微鏡検査。
９０日間にわたる最大８．５×１０１１ＧＣ／動物の用量で、単回ＩＣＶ用量のＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２を与えたマウスでは明確な治療関連の所見はなかった。８．５×１０１１ＧＣ／動物でＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２を投与した６０匹の動物のうちの３匹で、投与後一週間以内に死亡が確認されたか（２／３）または死の直前に安楽死させた（１／３）が、その死因は判別しなかった。４日目に死の直前に安楽死させた雄動物の臨床徴候には、痩せた外観、活動低下、運動失調、触ると冷たく、猫背の姿勢、立毛及び重度の脱水症、ならびに動物がＩＣＶ注射から完全に回復しなかったことを示唆するストレスを示す微視的変化が含まれていた。この動物における他のすべての微視的変化は、４週目または１３週目に安楽死させた動物で認められた。これらの死亡は高用量でのみ発生したため、処理との関係は不明確である。
１３週目でのＦＯＢ評価に続き、野外における後ろ足で立つ回数の著しい減少が、１３週目に、雄では≧２．００×１０１１ＧＣ／動物で、雌では８．５０×１０１１ＧＣ／動物で観察された。４週目に観察した血液学（ＭＣＶ、ヘマトクリット値の減少ならびにＭＣＨＣ及びＲＤＷの増加）及び臨床化学（尿素窒素、クレアチニン及びトリグリセリド濃度の低下）パラメーターにわずかな影響があったが、これは１３週目までに部分的に解消した。８．５０ｘ１０１１ＧＣ／動物で、４週目に雄と雌においてアルブミンの減少（×０．９）が認められ、１３週目では雌においてのみ認められた。
ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２の投与後、脳、脊髄及び坐骨神経に顕微鏡的変化が観察された。８．５０×１０１１ＧＣ／動物のみで、片側の脳の壊死（推定注射部位で）と、関連する炎症（亜急性／慢性）が、４週目に１／１０の雄と３／１０の雌において（軽度～中等度）、１３週目に１／１０の雄と２／１０の雌において（最小度～中等度）認められた。２．００×１０１１（２／１０の雄及び２／１０の雌）及び８．５０×１０１１（３／１０の雄及び７／１０の雌）ＧＣ／動物で、４週目にマウスの脳に末梢血単核細胞浸潤（最小度～中等度）が認められた。１３週目では、８．５０×１０１１ＧＣ／動物のみで少数のマウス（１／１０の雄及び５／１０の雌）で観察された。これらの浸潤は、壊死、炎症、及び／または被験物質に対する免疫応答とみなされた。
脊髄において、末梢神経根の軸索変性症（最小度～中等度）が、≧２．００×１０１１ＧＣ／動物で、４週目及び１３週目にマウスで認められた。坐骨神経において、軸索変性症（最小度～中等度）が、≧５．００×１０１０ＧＣ／動物で、４週目及び１３週目にマウスで認められた。坐骨神経の軸索変性症（最小度）は、４日目に殺処分した雄でも観察された。これらの所見は複数の神経切片において存在し、このことはこの所見が両側に分布していることを示唆している。軸索変性症は、好酸球軸索腫脹、軸索断片化、食細胞マクロファージを伴う消化槽の形成、及び関連する反応性神経膠症によって特徴づけられた。
ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２に関連する非有害性の所見は、４週目及び１３週目での≧１．２５×１０１０ＧＣ／動物でマウスの脾臓において生じ、最小度～軽度のリンパ過形成（胚中心及び辺縁帯）、ならびに赤脾髄、造血細胞、及び／または辺縁帯の過形成（最小度～軽度）における細胞充実性の発生率及び／または重症度の増加からなっていた。これらの所見は、脾臓重量の増加と相関していた。１３週目では、脾臓における変化は、高用量でのみ、雄の動物で検出されなかった。
坐骨神経と脊髄の神経根において認められる所見に基づいて、最大無毒性量（ＮＯＡＥＬ）は１．２５×１０１０ＧＣ／動物であるとみなされた。
ｂ） ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２：カニクイザルにおける髄腔内投与による単回投与の薬力学試験
この試験の目的は、４週間後のカニクイザルにおけるＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２（ＡＡＶ９．ｈＣＬＮ２）の薬力学と毒性を評価することであった。カニクイザルの群（雄１匹及び雌２匹／群）に、０、３．４×１０１１、３．２×１０１２または２．９×１０１３ゲノムコピー（ＧＣ）／動物（１ｍＬ／動物）の用量で、大槽穿刺（ＣＭ）を介した髄腔内注射により、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２を投与した。さらなる動物の群（雄１匹と雌２匹）に、腰部髄腔内穿刺（ＩＴ－Ｌ；１ｍＬ／動物）を介して３．２×１０１２ＧＣ／動物を投与した。試験の終わりに、動物を２９日目に安楽死させた。含まれるエンドポイント：臨床所見、体重、食物消費（定性的）、神経学的検査（一般的な感覚及び運動機能、脳反射及び脊髄反射）薬力学（ＴＰＰ１活性及び濃度）、ＣＳＦ総細胞数、臓器重量、肉眼検査及び顕微鏡検査（脳［前脳から脳幹にまたがる］、脊髄神経根と神経節が付着した脊髄［頸部、胸部、腰部及び腰仙部］、坐骨神経及び三叉神経節）。薬力学的評価のために、血清、ＣＳＦ、肝臓、脊髄（頸部、胸部及び腰部領域）及び脳（前頭皮質、後頭皮質、小脳、線条体、延髄、中脳及び視床由来の表層または深層の試料を分析した）の試料を評価した。
試験中に観察された治療に関連する臨床徴候、体重への影響、または身体的及び神経学的検査はなかった。試験の終わりに、ＣＳＦ細胞数に有意な変化はなかった。
２．９×１０１３ＧＣ／動物（ＣＭ）では、後根神経節（ＤＲＧ）、主に２／３の動物の腰仙部のＤＲＧにおいて観察される顕微鏡的変化があった。ＤＲＧにおける有害な微視的変化は、神経変性（最小度～軽度）と細胞充実性の増加であり、主に脊髄神経根、背側神経根（１／３動物のみ）ならびに腰部（中等度）及び腰仙部（中等度）領域の背側脊髄路の変性の重症度の増加に関連するリンパ球／マクロファージの浸潤（中等度～顕著）である。この用量での単一の動物では、脳における微視的変化（神経変性、神経膠症）も潜在的に有害であると考えられたが、脳における変化はごくわずかであり、神経系の機能障害は予想されなかった。グリア反応のエビデンスがなかったため、この試験での他の動物では脳の神経変性は起こりそうにないと考えられた。壊死性ニューロンはすぐに除去したが、通常、検出可能な持続的なグリア応答が存在していた。影響を受けた２匹の動物では、ＤＲＧの所見は、影響を受けなかった動物と比較して、より高程度の形質導入（ＴＰＰ１の活性と濃度で示される）と関連していた。これらの動物の腰部におけるＴＰＰ１活性は、影響を受けていない動物より２倍以上大きかった。
３．２×１０１２ＧＣ／動物（ＣＭ）では、主に観察した１／３の動物の腰仙部ＤＲＧにおいて、顕微鏡的変化があった。ＤＲＧにおける変化は、ニューロンの変性（中等度）と細胞充実性の増加であり、主に、腰椎及び腰仙部の脊髄神経根（中等度）及び腰仙部の背側神経根（中等度）の変性の重症度の増加に関連するリンパ球／マクロファージの浸潤（顕著）であった。
３．２×１０１２ＧＣ／動物（ＩＴ－Ｌ）で、ＤＲＧにおける変化は、腰仙領域（軽度）における神経変性と細胞充実性の増加であり、主に、腰椎及び腰仙部（中等度）中のリンパ球／マクロファージの浸潤であった。１匹の動物では、ＤＲＧの頸部において、細胞充実性の増加（顕著）とニューロンの変性（最小度）が観察された。同じ動物において、腰仙部の脊髄神経根の変性（中等度）及び頸部の背側神経根の変性（軽度）の重症度が増加していた。この動物の頸部における変化は、ＩＴ－ＣＭ群と比較した場合、頸部のより高程度の形質導入（すなわち、ＴＰＰ１の活性と濃度）と関連している可能性がある。この動物は頸部において最も高いＴＰＰ１活性を示し、この群の他の２匹の動物よりもおよそ３倍高かった。この群では、脊髄の腰部において最も高いＴＰＰ１活性を有する２匹の動物が、腰部／腰仙部ＤＲＧにおける変性と共に認められたことにも注目されたい。
２．９×１０１３または３．２×１０１２ＧＣ／動物で処理した動物において認められる脊髄神経根、背側神経根及び背側脊髄路における変性は、ＩＴカテーテルの配置に関連付けられる可能性がある一方で、これは対照動物で観察され、このレベルでの変性の一部は、いくつかの神経節のＤＲＧにおける細胞充実性及びニューロン変性の増加に起因していた。
いくつかのＤＲＧにおいて観察された細胞充実性の増加の正確な細胞構成要素は判定されなかった。形態学的外観からは、サテライトグリア細胞の増加とリンパ球及びマクロファージの浸潤との組み合わせが示唆された。脊髄切片のＩＢＡ－１染色（ミクログリア用）により、複数の動物の脊髄切片に存在するいくつかの神経節における浸潤のマクロファージ成分が確認された。増加した細胞充実性を構成する主な細胞型は浸潤リンパ球であると考えられた。ＡＴＰＡ陽性の動物とＤＲＧにおける所見の発生との明確な相関関係はなかった。最も高い用量では、すべての動物がＡＴＰＡ陽性であったが、ＤＲＧの変化は、２／３匹の動物でのみ認められた。しかしながら、３．２×１０１２ＧＣ／動物（ＩＴ－Ｌ）の投与後に陰性だった一匹の動物は、ＤＲＧの所見を示さなかった。
３．４×１０１１ＧＣ／動物では、被験物質に関連した変化は認められなかった。したがって、ＤＲＧにおける所見に基づいて、最大無毒性量（ＮＯＡＥＬ）は、３．４×１０１１ＧＣ／動物であると考えられた。
２． 遺伝毒性
ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２は、ＷＴ ＡＡＶの組み込み機構を含まない組換えＡＡＶである。ＡＡＶが宿主細胞に内在化されると、ＡＡＶは核への輸送と脱コーティングを経て、核内に存続する環状エピソームを形成する。ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２は、産物の生産に使用されるソースヘルパープラスミドに、複製にとって重要な必須のシスエレメントが含まれていないため、形質導入された細胞では複製することができない。これは、ｒｅｐエレメントの存在に加えて、再生産するために活性ヘルパーウイルスも必要とするＷＴ ＡＡＶとは対照的である。
入手可能な科学文献と臨床データに基づくと、ＡＡＶの組み込みは観察されていない。ＡＡＶ処理マウスにおける肝腫瘍の発生率の増加を示唆する記事がいくつか存在するが；ベクターＤＮＡはこれらの腫瘍ではほとんどなく、導入遺伝子産物の発現を欠いていた（Ｂｅｌｌ Ｐ，ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２００６；２５：３４－４４）。最近の研究によると、腫瘍の発生率は、ＡＡＶ９処理したＭＰＳ ＩＩマウスと未処理のＷＴマウスで非常に類似していた（それぞれ、３８％と３６％）（Ｆｕ Ｈ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ．２０１８；１０：３２７－３４０）。したがって、最近承認されたＡＡＶ９、Ｏｎａｓｅｍｎｏｇｅｎｅ ａｂｅｐａｒｖｏｖｅｃ－ｘｉｏｉと並んで、最近の研究から得られたエビデンスの重みは、ｒＡＡＶが挿入変異原性のリスクが低いことを裏付けている。
３． 発がん性試験
ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２を用いた３か月マウス毒性試験では、前腫瘍性または腫瘍性病変は観察されなかった。
４． 他の毒性試験
ａ） 免疫毒性
マウス及びサルにおけるＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２を用いた毒性試験のデータから、白血球に対するＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２に関連する影響、または免疫毒性を示す脾臓、リンパ節もしくは胸腺における形態学的変化がないことが示された（ＩＣＨ Ｓ８による）。マウス毒性試験で観察された脾臓の変化は、ヒト導入遺伝子産物に対して観察された免疫原性に対する適応反応であると考えられ得る。
ｂ） 概要
薬力学（導入遺伝子産物）及び免疫原性（抗ＴＰＰ１抗体）を含むＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２の非臨床的安全性を、カニクイザル及びマウスを対象とした単回投与毒性試験で、それぞれ最長１か月及び最長３か月間評価した。これらの試験の両方で、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２に関連した生命に有害な所見はなかった。マウスとカニクイザルの両方での主な所見は、脊髄、背側神経節及び坐骨神経の軸索変性であった。
実施例３：ｒＡＡＶを含む医薬組成物の凍結／解凍試験
Ｉ． 序文
凍結速度及び解凍速度は、生物製剤の安定性に影響を与え得る（Ｃａｏ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．８２（６）：６８４－９０）。ゆっくりと凍結している間に水の結晶化は、生物製剤の安定性に影響を与え得る賦形剤の濃度をもたらし得る。生物製剤の安定性への影響と共に、相分離またはｐＨシフトもまた生じ得る。急速に凍結すると、氷の結晶が小さくなり、氷と水の界面領域が大きくなり、界面応力が生じ得る。急速な凍結はまた、氷の中に気泡を閉じ込め、解凍中に気液界面応力を引き起こし得る。ゆっくりと解凍すると、氷の再結晶化が生じ得、界面応力のために溶液中の生物製剤の安定性に影響を与え得る。
凍結融解ストレスは、ＡＡＶキャプシドを破壊し、少量の遊離ＤＮＡを放出し得る。臨床試験中、充填仕上げ、保管、臨床パッケージング及びラベリングに使用する複数のベンダー間でＦＤＰを出荷し、最終的に臨床現場に配送する。出荷中または製品の取り扱い中に予期しない温度変動が発生すると、製品が温まったり、解凍して再凍結したりする可能性がある。凍結と解凍の速度の相対的な影響は、可動域を評価するだけでなく、ＣＭＯ及びクリニックでの凍結と解凍の指示をガイドするために使用することができる。凍結融解の影響は、ＡＡＶの種類とその製剤にも依存する場合がある。これらの要因を、この試験で評価した。
ＢＤＳボトル内のより大きな容量（６０～１１０ｍＬ）は、６０ｍＬ及び１１０ｍＬの水に対してそれぞれ約０．５℃／分及び０．３℃／分の全体平均速度で凍結することが判明した。より小さいＣＺバイアルの０．６ｍＬの充填物は、室温または－２０℃から凍結させるのに約３０～４０分かかり（約２．０℃／分の速度）、一方、解凍には室温から３０分、－２０℃からは１０分かかった（それぞれ約２．４℃／分及び４．５℃／分の速度）。以前の研究では、６０ｍＬと１１０ｍＬの水で満たされた２５０ｍＬのＮａｌｇｅｎｅ ＨＤＰＥ（ＢＤＳ）ボトルが、－６５℃未満で凍結するのにそれぞれ１６３分と２６６分かかることが示された。これらの容量に対応する凍結速度は、６０ｍＬと１１０ｍＬの水でそれぞれ０．５３℃／分と０．３３℃／分であった。解凍中、融点に達するまで温度の急激な上昇が観察され、融点に達すると、温度は室温に向かってゆっくりと上昇した。解凍には、６０ｍＬボトルと１１０ｍＬボトルでそれぞれ２７３分と３３７分かかった（０．３２℃～０．２５℃／分の全体的な平均速度に相当）。ボトル内の凍結及び解凍の温度特性を図２７に示す。
別の以前の研究では、２ｍＬのＮａｌｇｅｎｅクライオバイアルに０．６ｍＬの水を満たした凍結／解凍温度特性が調査された。温度サイクルは、－８０℃の冷凍庫と－２０℃の冷凍庫またはベンチトップ（室温）の間で行った。データを図２８に示す。平均して、室温から－６０℃への凍結には約４０分かかり、－２０℃から－６０℃への凍結には約３０分かかった。これは、両方の研究で約２．０℃／分の速度に相当する。－６０℃～－２０℃への解凍は比較的迅速に起こり、約１０分かかったが、一方、室温への解凍には約３０分かかった。これは、－２０℃の試験では約４．５℃／分、室温の試験では２．４℃／分の速度に相当する。
本実施例では、低速及び高速の凍結融解速度での凍結／解凍の複数のサイクルの影響を評価した。ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２の製品品質に対する約０．１３℃／分（１１時間の凍結または解凍）及び１．５℃／分（１時間の凍結または解凍）の凍結／解凍速度の影響を評価した。これは、ＡＡＶ９の品質に対する、温度の実可動域における変動性をさらに特徴づけるために実施した。低速は、ＢＤＳの遅い凍結と解凍で予想されるよりも遅くなるように選択した。高速については、約１℃／分の最大達成可能速度（低速の約１０倍）を、高速の解凍と凍結の代表として試験した。複数のサイクルを適用して、診療所で発生し得る範囲を超えて試料にストレスをかけた。試料を、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの相対効力、サイズ排除クロマトグラフィーの純度、遊離ＤＮＡレベル（凍結融解ストレスに感受性であることが明らかとなった新規ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ色素ベースのアッセイを使用）、及び動的光散乱によるサイズ分布によって分析した。
ＩＩ． 凍結融解試験結果の要約
全体として、データは、０．１２℃／分（または約１１時間超）の低速～１℃／分（または約１時間超）の高速の範囲の速度で、５回の凍結／解凍サイクルの髄腔内製剤におけるＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２の品質属性への影響が最小限であることを示している。
凍結／解凍速度は、ＢＤＳのボトルまたはＤＰのバイアルに対して、診療所で発生し得る予想速度がカバーされるように選択した。複数のサイクルを適用して、診療所で発生し得る範囲を超えて試料にストレスをかけた。
凍結融解試験の結果の全体的な要約を表４に示す。
表４． 所見の要約
Figure 2022513034000005
 １． 遊離ＤＮＡの割合は、ＧＣ／ｍＬ（ＯＤ２６０ｎｍ）から計算した合計と比較した測定レベルに基づいている。ｎｇ／μＬレベルの詳細と、熱によるキャプシド破壊後の合計の結果との比較については、結果の節を参照されたい。
２． ２６０ｎｍの波長チャネルに基づいて計算したＳＥＣの結果。
３． 実際の製品温度の「高」速は、凍結の場合は約１時間、解凍の場合は１．５時間であった。「低」速は、凍結と解凍の両方で約１１時間であった。
ＩＩＩ． 材料
バイアル：ＣＺ ２ｍＬバイアル、１３ｍｍ、１９５５００５７（Ｗｅｓｔ，Ｄａｉｋｙｏ）
ストッパー：１３ｍｍ血清ＮｏｖａＰｕｒｅ ＲＰ Ｓ２－Ｆ４５１ ４４３２／５０ Ｇｒａｙ（Ｗｅｓｔ）
ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２：「改質型エリオットＢ髄腔内製剤』（８．７７ｇ／Ｌの塩化ナトリウム、０．２４４ｇ／Ｌの塩化マグネシウム、０．０２７８ｇ／Ｌの第一リン酸ナトリウム一水和物、０．１１４ｇ／Ｌの無水第二リン酸ナトリウム、０．２２４ｇ／Ｌの塩化カリウム、０．２０６ｇ／Ｌの塩化カルシウム、０．７９３ｇ／Ｌのデキストロース、０．００１％ポロキサマー１８８、ｐＨ７．２６）中に、３×１０１３ＧＣ／ｍＬで製剤化し、ＣＺバイアルに０．５ｍＬをバイアル封入した（表５）。
表５．ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２製剤
Figure 2022513034000006
Figure 2022513034000007
ＩＶ． 装置
Ｇｅｎｅｓｉｓ ２５ＥＬ凍結乾燥機（ＳＰ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）アセットタグ０９４１（ＦＦＦ）温度プローブ熱電対搭載型。
Ｃｙｔａｔｉｏｎ ５プレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ）、アセットタグ０８６７（ＦＦＦ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）
Ｃａｒｙ ６０ ＵＶ－可視光分光光度計（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）、アセットタグ０９９９（ＦＦＦ）
サーマルミキサー／ヒートブロック（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｓ／Ｎ：０１０１４３１８１１０７６８
Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ Ａｒｃ機器ＩＤ ０４４７（Ｃ３ＰＯ）及びＳｅｐａｘ ＳＲＴ ＳＥＣ－１０００ピークカラム（ＰＮ２１５９５０Ｐ－４６３０，ＳＮ：８Ａ１１９８２，ＬＮ：ＢＴ０９０，５μｍ １０００Ａ，４．６×３００ｍｍ）
ＴＡ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ 示差走査熱量計、ＤＳＣ２５０／ＲＣＳ９０、シリアル番号ＤＳＣ２Ａ－００９８０、アセットタグ０８６６。
Ｖ． 方法
Ａ． 凍結乾燥機内での制御された凍結－解凍サイクル
表６に従って凍結乾燥機内で制御された凍結／解凍サイクルを実行した。バイアルをシェルフに十分な間隔で配置し、４つの緩衝液のバイアルをサーモカップリングした。
表６． 制御された凍結速度及び解凍速度の設定
Figure 2022513034000008
 ａ．シェルフは、凍結と解凍のサイクルの間に少なくとも１時間、－６０℃及び２５℃で保持するようにプログラムされた（実験室のスケジューリングの目的で、いくつかの実行ではより長い凍結保持を行った）。ｂ．すべての試料と凍結対照を、冷凍庫内で－８０℃まで制御せずに凍結し、試験の最後に、ベンチで分析前に室温で解凍した。ｃ．コンデンサーの負荷を減らすために、ＦＦ／ＳＴの第１のサイクルを２５℃から－５５℃まで実行した。その後の４サイクルは－６０℃に設定した。
Ｂ． ｉｎ－ｖｉｔｒｏ相対効力
ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２のＩＶＲＰを実施した。ｄｄＰＣＲ ＧＣ力価を機能性遺伝子発現に関連付けるために、ＨＥＫ２９３細胞を形質導入し、トリペプチジルペプチダーゼＩ（ＴＰＰ１）酵素活性をアッセイすることにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏバイオアッセイを実施した。ＨＥＫ２９３細胞を、３枚の９６ウェル組織培養プレートに一晩プレーティングした。次いで、細胞を野生型ヒトアデノウイルス血清型５型ウイルスに事前感染させた後、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２参照標準と被験物質の３つの独立して調製した段階希釈液で形質導入し、各調製物を別々のプレートの異なる位置にプレーティングした。形質導入の２日後に、細胞を溶解し、低ｐＨで処理してＴＰＰ１酵素を活性化し、ＴＰＰ１による切断時に蛍光シグナルを増加させるペプチド基質を使用してＴＰＰ１酵素活性をアッセイした。ＲＦＵの蛍光を対数希釈に対してプロットし、各被験物質の相対力価を、平行類似性試験に合格した後の４パラメーターロジスティック回帰モデルでフィッティングした同じプレート上の参照標準に対して、式：ＥＣ５０参照÷ＥＣ５０被験物質を使用して計算した。被験物質の力価は、３枚のプレートの加重平均から計算した、参照標準力価の割合として報告された。
Ｃ． 遊離ＤＮＡ分析
ＤＮＡに結合したＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ核酸ゲル染色（「ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ色素」）の蛍光によって、遊離ＤＮＡを測定した。マイクロプレートリーダーを使用して蛍光を測定し、ＤＮＡ標準で定量した。ｎｇ／μＬでの結果を報告した。
測定したｎｇ／μＬでの遊離ＤＮＡを、遊離ＤＮＡの割合に変換するために、２つのアプローチを使用して総ＤＮＡを推定した。第１のアプローチでは、ＵＶ－可視分光法によって測定したＧＣ／ｍＬ（ＯＤ）を使用して、試料中の総ＤＮＡを推定した（式中、ＭはＤＮＡの分子量、１Ｅ６は単位変換係数である）：
推定総ＤＮＡ（ｎｇ／μＬ）＝１Ｅ６×ＧＣ／ｍＬ（ＯＤ）×Ｍ（ｇ／ｍｏｌ）／６．０２Ｅ２３
第２のアプローチでは、試料を０．０５％ポロキサマー１８８と共に８５℃に２０分間加熱し、加熱した試料中でＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ色素アッセイによって測定した実際のＤＮＡを総量として使用した。したがって、これはすべてのＤＮＡを回収し、定量化したという仮定を有する。ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ色素による総ＤＮＡの測定（ＵＶ測定値と比較して）は、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２では低く（６０％）、構築物ＩＩ ｄＰＢＳ製剤ではわずかに高く（１３１％）、スクロース製剤を含む構築物ＩＩ修飾ｄＰＢＳではさらに高い（１５２％）ことが明らかとなった。遊離ＤＮＡのｎｇ／μＬから割合への変換におけるこの変動は、報告される結果の範囲として捉えられた。トレンド分析には、生のｎｇ／μＬを使用することができ、または一貫した方法で測定した割合を使用することができる。
Ｄ． サイズ排除ＨＰＬＣ分析
ＳＥＣは、Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ Ａｒｃ機器ＩＤ０４４７（Ｃ３ＰＯ）で、パス長２５ｍｍのフローセルを用いて、Ｓｅｐａｘ ＳＲＴ ＳＥＣ－１０００ピークカラム（ＰＮ２１５９５０Ｐ－４６３０、ＳＮ：８Ａ１１９８２、ＬＮ：ＢＴ０９０、５μｍ １０００Ａ、４．６×３００ｍｍ）を使用して実施した。移動相は（２０ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ ＮａＣｌ、０．００５％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－６８、ｐＨ６．５－ＶＡ １５Ａｐｒ１９）であり、流速は０．３５ｍＬ／分で２０分間、カラムは周囲温度とした。データ収集は、２ポイント／秒のサンプリングレートと１．２ｎｍの解像度で実施し、２１４、２６０、及び２８０ｎｍで２５ポイントの平均平滑化を行った。理想的な標的負荷は１．５Ｅ１１ＧＣであった。ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２を５μＬ注入した。
Ｅ． 動的光散乱
動的光散乱（ＤＬＳ）を、試料量３０μＬのＣｏｒｎｉｎｇ３５４０ ３８４ウェルプレートを使用してＷｙａｔｔ ＤｙｎａＰｒｏＩＩＩで実施した。反復ごとに１０秒間にそれぞれ１０回の取得結果を収集し、試料ごとに３回の反復測定を実施した。ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２の溶媒を「ＰＢＳ」に設定した。データ品質基準（ベースライン、ＳＯＳ、ノイズ、適合）を満たさない結果を「マーク」して、分析から除外した。スクロース試料を含む修飾ｄＰＢＳの低遅延時間カットオフを１．４μｓから１０μｓに変更して、約１ｎｍでのスクロース賦形剤のピークが、人為的に低いキュムラント分析直径の結果をもたらすことに対して影響を及ぼすことを排除した。
Ｆ． 示差走査熱量測定
低温示差走査熱量測定（低温ＤＳＣ）を、ＴＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ＤＳＣ２５０を使用して実行した。約２０μＬの試料をＴｚｅｒｏ ｐａｎにロードし、Ｔｚｅｒｏ Ｈｅｒｍｅｔｉｃ ｌｉｄで圧着した。試料を２５℃で２分間平衡化し、次いで５℃／分で－６０℃に冷却し、２分間平衡化してから、次いで５℃／分で２５℃に加熱した。熱流データは、従来の様式で収集した。
ＶＩ． 結果
Ａ． 凍結融解試験の温度特性
製品の温度は、熱伝達の制限と凍結及び融解中の緩衝液の相転移のために、シェルフと正確に一致しなかった。全体の平均速度を計算するために、サイクルの代表的な部分について、製品が２５℃付近～－６０℃であった期間を使用して決定した平均速度を表７に要約する。
凍結中にエネルギーが放出されるため、およそ－１０℃において、シェルフ温度よりも製品がわずかに温かいという特徴的な温度上昇スパイクがあった。同様に、製品は、０℃付近で氷が溶けている間、シェルフに比べてわずかに低い温度であった。以下の節は、プローブ温度データを示す。さらに、シェルフ温度とプローブ温度の変化速度（すなわち、温度と時間の５ポイントの勾配）を、ＦＴ／ＦＴ及びＳＦ／ＳＦについて、低速と高速について達成された実際の速度の代表として示す。
高速凍結平均速度を約１℃／分に制限し、高速解凍平均速度を約０．８～１℃／分に制限した。
実際の製品温度の「高」速は、凍結の場合は約１時間、解凍の場合は１．５時間であった。「低」速は、凍結と解凍の両方について、約１１時間かけて０．１２℃／分であった。
表７． 凍結及び解凍サイクル中の実際の製品温度と速度
Figure 2022513034000009
Ｂ． 高速凍結／高速解凍（ＦＦ／ＦＴ）
図２９は、ＦＦ／ＦＴのシェルフとプローブの温度特性を示す。実験室のスケジューリングのために、いくつかのサイクルでより長い凍結保持を行った。
高速凍結平均速度を約１℃／分に制限し、高速解凍平均速度を約０．８～１℃／分に制限した。
第１のサイクルの凍結部分での温度スパイクは、機器のスパイクと思われる。第３のサイクルでの室温付近のスパイクは、サイクルを継続するためにシステムを手動リセットし、それに伴ってシェルフ温度設定が１０℃付近のデフォルトへ一時的に（数分間）低下したことによるものであった。
図３０は、シェルフと製品の両方の温度とその速度（２５分間の平均）の拡大図を示す。実際の速度は、製品とシェルフの平均温度が、プログラムされた高速でのこれらのプロセス中の非常に高速な凍結と融解、及び関連する熱伝達の制限によって影響を受けたことを示している。製品の融解により、シェルフから熱が抽出され、結果として、融解温度範囲中のシェルフ温度の速度が低下した。
Ｃ． 高速凍結／低速解凍（ＦＦ／ＳＴ）
図３１は、ＦＦ／ＳＴのシェルフとプローブの温度特性を示す。コンデンサーの負荷を減らすために、ＦＦ／ＳＴの第１のサイクルを２５℃から－５５℃まで実行し、再び２５℃に戻した。その後の４サイクルを－６０℃に設定した。凍結及び解凍の時間を更新しなかったため、目標速度を１．６℃／分（１．５℃／分から）及び０．１３℃／分（０．１２５℃／分から）に増加させた。この差は、当初の目標速度から１０％未満で無視することができる。第３のサイクルでの室温付近のスパイクは、サイクルを継続するためにシステムを手動リセットし、それに伴ってシェルフ温度設定が１０℃付近のデフォルトへ一時的に（数分間）低下したことによるものであった。
Ｄ． 低速凍結／高速解凍（ＳＦ／ＦＴ）
図３２は、ＳＦ／ＦＴのシェルフとプローブの温度特性を示す。実験室のスケジューリングのために、最終サイクルでより長い凍結保持を行った。
Ｅ． 低速凍結／低速解凍（ＳＦ／ＳＴ）
図３３は、ＦＦ／ＦＴのシェルフとプローブの温度特性を示す。実験室のスケジューリングのために、第３のサイクルでより長い凍結保持を行った。第３のサイクルでの室温付近のスパイクは、サイクルを継続するためにシステムを手動リセットし、それに伴ってシェルフ温度設定が１０℃付近のデフォルトへ一時的に（数分間）低下したことによるものであった。
図３４は、シェルフと製品の両方の温度とその速度（２５分間の平均）の拡大図を示す。速度は、平均製品温度が凍結及び融解プロセスの影響を受けたが、シェルフ温度の速度はこれらの低速で安定したままであることを示している（ＦＴ／ＦＴと比較して）。
ＶＩＩ． ｉｎ－ｖｉｔｒｏ相対効力
ｉｎ－ｖｉｔｒｏ相対効力（ＩＶＲＰ）の結果は、髄腔内製剤中のＡＡＶ９．ＣＢ７．ＨＣＬＮ２の凍結及び解凍の高速及び低速のすべての順列について、対照と同様であり、方法の変動性の範囲内であった（表８）。
表８． ＩＶＲＰの結果
Figure 2022513034000010
ＶＩＩＩ． ＳＹＢＲ色素結合とＳＥＣによる遊離ＤＮＡの結果
遊離ＤＮＡの全体的な結果の要約を表９に示す。ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ結合による遊離ＤＮＡについての範囲を提供し、これは１００％に対するＧＣ／ｍＬ（ＯＤ）値または１００％ベースに対する熱ストレス結果のいずれかに基づく割合を表す。
表９．ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄによる遊離ＤＮＡとＳＥＣ結果によるプレピーク
Figure 2022513034000011
 ａ．遊離ＤＮＡの範囲の割合は、８５℃、２０分の熱ストレス試料で検出した合計の割合として計算され、割合はＧＣ／ｍＬ（ＯＤ２６０ｎｍ）から計算される。「相対」は、ＧＣ／ｍＬ（ＯＤ）値を使用して、凍結対照と比較した凍結－解凍試料中の遊離ＤＮＡの比率である。ｂ．２６０ｎｍの波長チャネルに基づいて計算したＳＥＣの結果。
ＳＥＣ結果特性の拡大図を図３５に示す。２６０ｎｍ ＵＶチャネルを使用して、遊離ＤＮＡ（初期のピーク）といくつかのタンパク質（閉じたプレピーク）を表すプレピークの割合を決定した。ピークとその溶出位置のスペクトル分析は、プレピークが主に遊離ＤＮＡであったことを示している。メインピークの後のピークは、賦形剤に関連している。
ＩＸ． 動的光散乱の結果
ＤＬＳの結果を図３６に示す。キュムラントフィッティングの径の結果と正則化フィッティングによるメインピークを表１０に示す。
任意の凍結－解凍条件の後のＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２について、方法の変動性の範囲内で、サイズ分布に変化はなかった。キュムラント径は２７．１～２７．５ｎｍ（対照＝２７．５）の範囲であり、正則化フィッティングの結果は２８．２～２８．７ｎｍ（対照＝２８．４）の範囲であった。キュムラントデータの範囲は０．４ｎｍであり、正則化データの範囲は０．５ｎｍであった。反復測定の平均径の標準偏差は、キュムラントフィッティングで約０．２、正則化フィッティングで最大０．８ｎｍであった。
表１０． ＤＬＳ径の結果
Figure 2022513034000012
Ｘ． 製剤の熱特性
図３７に示す改質型エリオットＢ製剤緩衝液の低温ＤＳＣサーモグラムは、－２２．４℃にピークを有する共晶溶融と、それに続く氷の融解による大きな吸熱ピークを有する。他の遷移は観察されなかった。共晶溶融物は、塩化ナトリウム及び水共晶と一致している。
ＸＩ． 結論
この試験のこれらの結果は、髄腔内製剤中のＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２について、低速（０．１２℃／分または約１１時間超）及び／または高速（１℃／分または約１時間超）のいずれかで最大５回の凍結／解凍サイクルが許容可能な可動域であることを示した。
凍結／解凍速度は、ＢＤＳのボトルまたはＤＰのバイアルに対して、診療所で発生し得る予想速度がカバーされるように選択した。複数の可動域をサポートするために、複数のサイクルを適用して、診療所で発生し得る範囲を超えて試料にストレスをかけた。
効力の結果は、髄腔内製剤中のＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２の凍結及び解凍の高速及び低速のすべての順列について、対照と同様であり、方法の変動性の範囲内であった。
ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２髄腔内製剤について、方法の変動性の範囲内で、サイズ分布に変化はなかった。
凍結－解凍ストレスは、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２（ＡＡＶ９）の少数のキャプシドを破壊し、凍結防止添加剤なしで製剤化した場合に少量の遊離ＤＮＡを放出することが示された。
改質型エリオットＢ髄腔内製剤中のＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２の複数回の凍結／解凍後、１．１～最大１．７％の遊離ＤＮＡのごくわずかな増加が検出された。凍結と解凍の速度が高速の場合と低速の異なる速度の場合の結果にほとんど差はなかった。高速または低速の影響は同様であった。
実施例４：ｒＡＡＶを含む医薬組成物の試験
この実施例は、本明細書で提供するｒＡＡＶを含む医薬組成物の製剤を評価するために使用し得る方法、特に、製剤を参照組成物、例えば脳脊髄液（ＣＳＦ）と比較する方法を提供する。
製剤緩衝液（表５）は、電解質組成、グルコース含有量、及び脳脊髄液（ＣＳＦ）の浸透圧と厳密に一致していた。
製剤緩衝液は、少なくとも（１）製剤が重炭酸塩緩衝液を含まず；（２）製剤が、ｐＨ緩衝のための第一リン酸ナトリウム一水和物を含有する点で、ＣＳＦの組成とは異なっていた。全体的な溶液電解質含有量と浸透圧を維持するために、塩化ナトリウムのレベルを高めた。驚くべきことに、重曹の除去により、貯蔵時に製剤のｐＨを維持する際の頑健性が向上した。製剤はまた、少なくとも容器及び他の表面へのキャプシド粒子の吸着を軽減するために、０．００１％（ｗ／ｖ）のポロキサマー１８８の添加を含んでいた。
製剤緩衝液は、承認された薬剤においてＣＳＦに送達するために使用した特定の製剤とは異なっていた。例えば、Ｓｐｉｎｒａｚａ（登録商標）（ヌシネルセンナトリウム；髄腔内投与薬）及びＢｒｉｎｅｕｒａ（登録商標）（セリポナーゼα；同梱の電解質溶液は脳室内投与薬）の製剤には、デキストロースは含まれていない。驚くべきことに、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２製剤でデキストロースを使用すると、ＣＳＦとの適合性が向上し得る。驚くべきことに、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２製剤中のデキストロースは、凍結及び解凍中の塩の結晶化を阻害し得るため、出荷及び保管ロジスティクス中の製品の安定性が向上する。
製剤緩衝液とＣＳＦの比較可能性を表１１に要約する。
表１１． 電解質組成の比較（ｐＨ及び製剤緩衝液とＣＳＦの非電解成分）
Figure 2022513034000013
製剤緩衝液中のＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２の安定性は、５回の凍結／解凍サイクル（室温約２３℃～≦－６０℃）で確認された。低速（約１１時間超または０．１３℃／分）及び高速（約１時間超または０．８及び１℃／分）制御速度の順列を実行して、様々な凍結速度及び解凍速度に対するロバスト性を評価した。表１２に示すように、２～８℃及び≦－６０℃の間の５回の凍結／解凍サイクルのすべての順列の後、遊離ＤＮＡレベル、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ－ＨＰＬＣ）プレピーク、動的光散乱（ＤＬＳ）直径（すべての試料で単一のメインピークのみが検出された）、またはｉｎ ｖｉｔｒｏ効力に有意な変化は観察されなかった。
表１２． ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２を含む医薬組成物の凍結／解凍試験結果
Figure 2022513034000014
実施例５：製造
簡潔に述べると、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３浮遊細胞株を使用してＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２ベクターを作製し、剪断ヒトアデノウイルス５型ＤＮＡによって形質転換された永久株である（Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，１９７７）。マスターセルバンク（ＭＣＢ）由来のＨＥＫ２９３細胞に３つのプラスミドをトランスフェクトして、パッケージ化されたベクターゲノムを生成する：ＣＬＮ２発現カセットを含むプラスミド（ｃｉｓプラスミド）とＡＡＶ９キャプシドタンパク質及び複製エレメントをコードする２つのヘルパープラスミド（ｔｒａｎｓプラスミド及びアデノウイルスヘルパープラスミド）。
ｃｉｓプラスミドは、ｈＣＬＮ２発現カセットを含み、ｒＡＡＶベクターゲノムをコードする。ｈＣＬＮ２発現カセットには、ＡＡＶ２逆位末端配列（ＩＴＲ）が隣接し、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期エンハンサーとニワトリβアクチンプロモーターのハイブリッドであるＣＢ７プロモーターによって発現が駆動される。このプロモーターからの転写は、ニワトリβ－アクチンイントロン（ＣＩ）の存在によって増強される。発現カセットのポリアデニル化シグナルは、ウサギβ－グロビン（ｒＢＧ）遺伝子由来である。
ｔｒａｎｓプラスミド：パッケージング構築物、ｐＡＡＶ２９ＫａｎＲＧＸＲｅｐ２。このプラスミドは、ＡＡＶ９由来の４つの野生型ＡＡＶ２ ｒｅｐタンパク質及び３つの野生型ＡＡＶ ＶＰキャプシドタンパク質をコードする。新規ＡＡＶ配列は、アカゲザルの肝臓組織ＤＮＡから得られた。肝臓ＤＮＡから増幅したＡＡＶ９ ｃａｐ遺伝子のＰＣＲ断片を、プラスミドｐ５Ｅ１８のＡＡＶ２ ｃａｐ遺伝子の代わりとして挿入した。プラスミドバックボーンはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳに由来し、ｐＡＡＶ２９ＫａｎＲＧＸＲｅｐ２の製造において、アンピシリン耐性遺伝子がカナマイシン耐性遺伝子に置き換えられている。アンピシリン耐性遺伝子の置換で発見された改変型ＡＡＶ２ ＤＮＡ配列により、ＤＮＡのセグメントを制限酵素消化によって除去し、新規合成したＤＮＡ断片に置換したため、ｒｅｐ遺伝子は正しいＡＡＶ２ｒｅｐアミノ酸配列をコードしていた。プラスミドｐＡＡＶ２９ＫａｎＲＧＸＲｅｐ２キャプシド遺伝子の同一性を、Ｇｅｎｅｗｉｚによって実施されたＤＮＡプラスミド配列決定によって確認した。
アデノウイルスヘルパープラスミド：プラスミドｐＡｄＤｅｌｔａＦ６には、ＡＡＶ複製に重要なアデノウイルス（Ａｄ）ゲノムの領域、すなわち、Ｅ２Ａ、Ｅ４、及びウイルス関連（ＶＡ）ＲＮＡが含まれている。ｐＡｄＤｅｌｔａＦ６は、追加的なＡｄ複製または構造遺伝子をコードせず、複製に必要なＡｄ ＩＴＲなどのシスエレメントを含んでおらず；したがって、感染性のＡｄは生成されないと予想される。アデノウイルスＥ１必須遺伝子機能は、ｒＡＡＶベクターを産生するＨＥＫ２９３細胞によって供給される。
上記のシス、トランス及びヘルパープラスミドにはそれぞれカナマイシン耐性カセットが含まれているため、β－ラクタム系抗生物質は製造に使用しない。これにより、患者がβ－ラクタム系抗生物質に対して反応性を示すという懸念がなくなる（Ｍｉｇｎｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。
バルク原薬の製造プロセスは、図３８及び図３９に示すフロー図に要約されている。バルク原薬は、上記の３つのプラスミドを用いたＨＥＫ２９３細胞のポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介一過性トランスフェクションによって製造する。ベクターをＨＥＫ２９３細胞内で産生し、細胞から培養上清に放出させる。次いで、組換えＡＡＶを、いくつかの直交法を使用して精製し、濃縮する。
細胞培養及び回収物の製造プロセスは、４つの主要な製造工程を含む：１）バイアルの解凍、振盪フラスコ及び使い捨てバッグバイオリアクターでの細胞の播種及び増殖、２）一過性トランスフェクション、３）トランスフェクション後の培地フィード、及び４）粗細胞上清の回収。精製プロセスは、６つの主要な製造工程を含む：１）濾過によるベクター回収物の清澄化、２）タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）による濃縮とダイアフィルトレーション、３）アフィニティークロマトグラフィーによる精製、４）イオン交換クロマトグラフィーによる精製、５）中空糸ＴＦＦによる製剤緩衝液への濃縮及びバッファー交換、ならびに６）最終濾過、充填、及び凍結。
懸濁液：あるいは、社内の懸濁液マスターセルバンク（ＭＣＢ）は、無血清及び動物成分フリー培地を使用して細胞を浮遊培養に適応させることにより、確立され、特徴づけられた、接着性ＨＥＫ２９３ ＭＣＢに由来する。懸濁液ＨＥＫ２９３ ＭＣＢを、微生物及びウイルスの混入について広範囲に試験した。ヒト、サル、ウシ、及びブタ由来の一定範囲の特定の病原体が存在しないことを確認するために、追加の試験を実施した。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及び標準タンデムリピート（ＳＴＲ）プロファイリングによって、ＨＥＫ２９３ ＭＣＢのヒト起源を示した。ＭＣＢを、ＧＭＰベクターの作成に使用する。
種子繁殖法により、標的細胞密度を達成するために体積を増加させた。懸濁液の主要なバイオリアクタープロセスの実施の時間範囲は５～８日であった。その間、ｐＨ、溶存酸素及び温度レベルを制御した。下流の懸濁プロセスは、代替の細胞培養プロセスについて説明されている一連の操作に厳密に従う。
一過性トランスフェクション：生産バイオリアクターで目的の細胞密度まで数日間細胞を増殖させた後、ｐＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ＣＬＮ２．ＲＢＧ．ＫａｎＲベクターゲノムプラスミド、ｐＡｄＤｅｌｔａＦ６、ｐＡＡＶ２９ＫａｎＲＧＸＲｅｐ２ ＡＡＶプラスミド及びＰＥＩを使用した最適化されたポリエチレンイミン（ＰＥＩ）ベースのトランスフェクション法を使用して、細胞に３つの生産プラスミドをトランスフェクトする。混合した後、溶液を室温で数分放置し、次いで無血清培地に添加して反応をクエンチさせ、次いでバイオリアクターに加えた。細胞を３７℃で数日間インキュベートする。
ベクター回収：細胞培養物にＭｇＣｌ２を添加して最終濃度を数ｍＭ（ベンゾナーゼの補因子）にし、ベンゾナーゼヌクレアーゼを加える。回収物質を混合し、３７℃で数時間インキュベートして、トランスフェクション手順の結果として、回収物中に存在する残余の細胞ＤＮＡ及びプラスミドＤＮＡを酵素消化するのに十分な時間を与える。この工程を行って、最終ベクター製剤中の残存ＤＮＡの量を最小限にする。インキュベーション期間の後、ＮａＣｌを５００ｍＭの最終濃度まで添加して消化を終了させ、濾過及び下流のタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）時の生成物の回収を支援する。
ベクターの清澄化：フィルターを使用して、ベンゾナーゼ処理した回収物から細胞及び細胞破片を取り除く。バイオバーデン減少濾過は、フィルタートレインの終わりに下流の精製の前に、上流の製造プロセス中に潜在的に導入されるバイオバーデンを減少させる。
ベクター精製プロセス
精製プロセスは、以下に詳細に記載する４つの主要な製造工程を含む：ＴＦＦによる濃縮及びバッファー交換、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ならびにＴＦＦによる濃縮及びバッファー交換。
タンジェンシャルフロー濾過による濃縮及びバッファー交換：清澄化された生成物の体積減少（１０倍）は、カスタムの無菌閉鎖バイオプロセッシングチューブ、バッグ及びメンブレンセットを使用したＴＦＦによって達成される。ＴＦＦの原理は、適切な多孔度（１００ｋＤａ、またはそれより緊密）のメンブレンに平行な圧力下で溶液を流すことである。圧力差により、メンブレンの孔よりも大きな分子を保持する一方で、より小さいサイズの分子のメンブレン通過を駆動し、廃棄流れに効果的に移動させる。溶液を再循環させることにより、平行流がメンブレン表面を掃引し、メンブレン孔の汚れを防止する。適切なメンブレンの孔径及び表面積を選択することによって、所望の分子を保持及び濃縮する一方で、液体試料の体積を急速に減少させ得る。ＴＦＦの適用におけるダイアフィルトレーションは、液体がメンブレンを通って廃棄流れに通過するのと同じ速度で再循環試料に新しい緩衝液を添加することを包含する。ダイアフィルトレーションの量が増大するにつれて、漸増量の小分子を再循環試料から除去する。これは、清澄化された生成物の中程度の精製をもたらすが、その後のアフィニティーカラムクロマトグラフィー工程と適合するバッファー交換も達成される。
アフィニティークロマトグラフィー：その後、ダイアフィルトレートされた生成物を、ＡＡＶ９血清型を効率的に捕捉するアフィニティーマトリックスに適用する。これらのイオン条件下では、有意な割合の残余の細胞ＤＮＡ及びタンパク質がカラムを通って流れ、一方、ＡＡＶ９粒子が効率的に捕捉される。適用後、カラムを２つの緩衝液を使用して洗浄し、追加的なフィード不純物を除去した後、低ｐＨ工程で溶出する。中和緩衝液の添加により、溶出液を直ちに中和する。
イオン交換クロマトグラフィー：空のＡＡＶ粒子を含むインプロセスの不純物をさらに低減するために、イオン交換クロマトグラフィー工程を採用する。この工程では、アフィニティー溶出プールを複数倍に希釈してイオン強度を下げ、イオン交換マトリックスへの結合を可能にする。低塩洗浄後、複数カラム体積（ＣＶ）のＮａＣｌ直線塩勾配を用いてベクター産物を溶出する。この浅い塩勾配は、ベクターゲノムを含む粒子（完全な粒子）からベクターゲノムを伴わないキャプシド粒子（空の粒子）を分離し、完全なキャプシドに富む調製物をもたらす。
中空糸タンジェンシャルフロー濾過による濃縮及びバッファー交換：プールされたイオン交換中間体を濃縮し、ＴＦＦを使用してバッファー交換する。工程中に、製品は決定された目標濃度になる。この濃縮工程に続いて、複数の量の製剤緩衝液を用いたダイアフィルトレーションによってバッファー交換を達成する。０．２μｍの濾過後にＢＤＳ試験のために試料を取り出す。濃縮及びバッファー交換工程の処理時間は１日未満である。
充填及び保管：濾過とサンプリングの後、ＢＤＳをボトルに充填し、ＦＤＰ処理のためにリリースするまで、検疫場所で≦－６０℃で凍結保管する。
Figure 2022513034000015
解凍及びプーリング：ＢＤＳの凍結アリコートを室温で解凍する。複数のＢＤＳバッチをプールして、回旋により混合してもよい。解凍したＢＤＳは２～８℃で一晩保持してもよい。
ＴＦＦまたは希釈による任意選択の濃度：ＢＤＳは、中空糸ＴＦＦを使用して濃縮するか、製剤緩衝液で希釈して、目的の濃度（ＧＣ／ｍＬ）を達成してもよい。任意選択の濃縮工程は、ＢＤＳプロセスの中空糸ＴＦＦ濃縮工程と同じＴＦＦを使用して実施する。
無菌濾過：ＤＰ中間体のバイオバーデン試料を、濾過の直前に採取する。事前に滅菌した組立体を使用してＤＰを０．２２μｍフィルター処理する。０．２２μｍフィルターを製剤緩衝液で洗い流した後、液を切る。次いで、ＤＰ中間体を濾過し、ＤＰをバイアルに充填する前に、フィルターの製造元によって使用前の完全性を試験したフィルターの使用後の完全性を試験する。フィルターが使用後の完全性試験に不合格である場合、フィルター処理した中間体を、別のフィルターを使用して再フィルター処理してもよい。
充填、保管、及び輸送：濾過したＤＰを、蠕動ポンプを使用してＣＺバイアルに充填する。最初のバイアルは、試験用に最適化された容量で充填する（例えば、１０ｍＬバイアルに１ｍＬ）。これらを、無菌性、エンドトキシン、及びその他の放出または安定性試験に使用する。次のバイアルセットの充填量を増加させ（例えば、１０ｍＬバイアルに５ｍＬ）、それを診療所で使用する。バイアルの最終セットは、再び少量で充填し（例えば、１０ｍＬバイアルに１ｍＬ）、無菌性、エンドトキシン、及びその他の放出または安定性試験に使用する。重量チェックを、事前に定義された間隔で実施する。バイアルに蓋をして圧着し、１００％目視検査し、ラベルを付け、カートンに梱包し、－６０℃以下で凍結させる。
医薬品の提案された構成は、２ｍＬバイアルに含まれる１ｍＬの製剤緩衝液中のＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２ベクターの凍結溶液である。提案された製剤緩衝液は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１．２ｍＭ塩化マグネシウム、３ｍＭ塩化カリウム、１．４ｍＭ塩化カルシウム、１ｍＭリン酸ナトリウム、４．４ｍＭデキストロース、及び０．００１％ポロキサマー１８８、ｐＨ７．３である。医薬品の提案された定量的組成を以下の表１４に示す。
表１４：注射用ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２溶液の提案された定量組成、１ｍＬ／バイアル
Figure 2022513034000016
充填及び仕上げは、無菌製品の規制ガイドラインに従って無菌条件下で実施する。医薬品は、注射用の単回使用の無菌溶液として開発された無色透明の溶液である。ＩＣ注射により、医薬品を投与する。
臨床現場に出荷するために、以前にカートンに梱包されていたＦＤＰバイアルを、温度ロガーを備えた事前に認定された段ボール輸送ボックスに入れる。ボックスをドライアイスで満たし、出荷温度を－６０℃以下に維持する。出荷物を受け取ると、温度ロガーが読み取られ、出荷中に温度の変動がないことを確認する。
本明細書で引用するすべての公開文書は、２０１８年４月３日に出願された米国仮特許出願第６２／６５２，００６号、２０１７年１２月１８日に出願された米国仮特許出願第６２／５９９，８１６号、及び２０１７年５月１１日に出願された米国仮特許出願第６２／５０４，８１７号と同様に、参照により本明細書に援用される。同様に、本明細書中で参照し、添付の配列表に現れる配列番号は、参照により援用される。本発明を、特定の実施形態を参照して記載してきたが、本発明の趣旨から逸脱することなく、様々な変更を行い得ることは理解されたい。そのような修正は、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。
（配列表フリーテキスト）
数字の識別子＜２２３＞または＜２１３＞の下にフリーテキストを含む配列に対して、以下の情報を示す。
Figure 2022513034000017

Claims (67)

  1. 対象におけるＣＬＮ２バッテン病の治療方法であって、それを必要とする対象に第１の経路及び第２の経路を介して組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を投与することを含み、前記第１の経路及び前記第２の経路が、中枢神経（ＣＮＳ）への経路であり、前記第１の経路が、脳領域への経路であり、前記第２の経路が、脊髄領域への経路であり、そして
    前記組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）が、ＡＡＶキャプシド及びその内部にパッケージされたベクターゲノムを含み、前記ベクターゲノムが：
    （ａ）ＡＡＶ ５’逆位末端（ＩＴＲ）配列；
    （ｂ）プロモーター；
    （ｃ）ヒトＴＰＰ１をコードするＣＬＮ２コード配列；及び
    （ｄ）ＡＡＶ ３’ＩＴＲを含む、前記治療方法。
  2. 前記第１の経路が、脳室内（ＩＣＶ）または槽内（ＩＣ）である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記第２の経路が、腰部髄腔内（ＩＴ－Ｌ）である、請求項１～２のいずれか一項に記載の方法。
  4. 前記方法が、第３の経路を介して前記対象に前記ｒＡＡＶを投与することをさらに含み、前記第３の経路が、脳室内（ＩＣＶ）、槽内（ＩＣ）、腰部髄腔内、頭蓋内、静脈内、血管内、動脈内、筋肉内、眼内、皮下、及び皮内からなる群から選択される、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 対象におけるＣＬＮ２バッテン病の治療方法であって、それを必要とする対象に第１の経路及び第２の経路を介して組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を投与することを含み、前記第１の経路が、中枢神経（ＣＮＳ）への経路であり、前記第２の経路が、ｒＡＡＶを肝臓へ送達し、そして
    前記組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）が、ＡＡＶキャプシド及びその内部にパッケージされたベクターゲノムを含み、前記ベクターゲノムが：
    （ａ）ＡＡＶ ５’逆位末端（ＩＴＲ）配列；
    （ｂ）プロモーター；
    （ｃ）ヒトＴＰＰ１をコードするＣＬＮ２コード配列；及び
    （ｄ）ＡＡＶ ３’ＩＴＲを含む、前記治療方法。
  6. 前記第１の経路が、腰部髄腔内（ＩＴ－Ｌ）、脳室内（ＩＣＶ）または槽内（ＩＣ）である、請求項５に記載の方法。
  7. 前記第２の経路が、静脈内、血管内、動脈内、筋肉内、眼内、皮下、及び皮内からなる群から選択される、請求項５～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記第２の経路が静脈内である、請求項７に記載の方法。
  9. 前記方法が、前記第２の経路を介して前記ｒＡＡＶを投与すると同時に、前記第１の経路を介して前記ｒＡＡＶを投与することを含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記方法が、前記第２の経路を介して前記ｒＡＡＶを投与する前に、前記第１の経路を介して前記ｒＡＡＶを投与することを含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記方法が、前記第２の経路を介して前記ｒＡＡＶを投与した後に、前記第１の経路を介して前記ｒＡＡＶを投与することを含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記第１の経路を介した前記ｒＡＡＶの投与と、前記第２の経路を介した前記ｒＡＡＶの投与との間の間隔が、約０．５時間、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約１週間、約８日、約９日、約１０日、約１１日、約１２日、約１３日、約２週間、約３週間、約４週間、約５週間、約６週間、約７週間、約８週間、約９週間、約１０週間、約１１週間、約１２週間、約１か月、約２か月、約３か月、約４か月、約５か月、約６か月、またはそれ以上である、請求項１０～１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記方法が、前記対象の脊髄において、第２の対象の脊髄における参照ＴＰＰ１活性に比べて、少なくとも２％、３％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１２％、１５％、１７％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％高いＴＰＰ１活性をもたらし、前記脊髄における前記参照ＴＰＰ１活性が、前記第２の対象が前記方法を使用した治療を受けていない場合に測定され、前記第２の対象が、前記対象と同じであるかまたは異なっている、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記方法が、第２の対象の参照肝ＴＰＰ１活性に比べて、少なくとも２％、３％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１２％、１５％、１７％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％高い前記対象の肝ＴＰＰ１活性をもたらし、前記参照肝ＴＰＰ１活性が、前記第２の対象が前記方法を使用した治療を受けていない場合に測定され、前記第２の対象が、前記対象と同じであるかまたは異なっている、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記方法が、第２の対象の参照血清ＴＰＰ１活性に比べて、少なくとも２％、３％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１２％、１５％、１７％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％高い前記対象の血清ＴＰＰ１活性をもたらし、前記参照血清ＴＰＰ１活性が、前記第２の対象が前記方法を使用した治療を受けていない場合に測定され、前記第２の対象が、前記対象と同じであるかまたは異なっている、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 前記方法が、前記対象の皮質において、第２の対象の皮質における参照ミクログリア活性に比べて、少なくとも２％、３％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１２％、１５％、１７％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％低いミクログリア活性をもたらし、前記皮質における前記参照ミクログリア活性が、前記第２の対象が前記方法を使用した治療を受けていない場合に測定され、前記第２の対象が、前記対象と同じであるかまたは異なっている、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記方法が、前記対象の脳において、第２の対象の脳における参照ＴＰＰ１活性に比べて、少なくとも２％、３％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１２％、１５％、１７％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％高いＴＰＰ１活性をもたらし、前記脳における前記参照ＴＰＰ１活性が、前記第２の対象が前記方法を使用した治療を受けていない場合に測定され、前記第２の対象が、前記対象と同じであるかまたは異なっている、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記ｒＡＡＶを治療有効量で投与する、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 前記対象がヒトである、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記（ｃ）のコード配列が、配列番号２の天然ヒトコード配列に対して少なくとも７０％同一であるコドン最適化ヒトＣＬＮ２である、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記（ｃ）のコード配列が配列番号３である、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 前記ｒＡＡＶキャプシドが、ＡＡＶ９またはそのバリアントである、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。
  23. 前記プロモーターがニワトリβアクチン（ＣＢＡ）プロモーターである、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。
  24. 前記プロモーターが、ＣＢＡプロモーター配列とサイトメガロウイルスエンハンサーエレメントを含むハイブリッドプロモーターである、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。
  25. 前記ＡＡＶ ５’ＩＴＲ及び／またはＡＡＶ ３’ＩＴＲがＡＡＶ２由来である、請求項１～２４のいずれかに記載の方法。
  26. 前記ベクターゲノムがポリＡをさらに含む、請求項１～２５のいずれかに記載の方法。
  27. 前記ポリＡが、合成ポリＡであるか、またはウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ＳＶ４０、ウサギβ－グロビン（ＲＧＢ）、もしくは修飾ＲＧＢ（ｍＲＧＢ）由来である、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記ベクターゲノムがイントロンをさらに含む、請求項１～２７のいずれかに記載の方法。
  29. 前記イントロンが、ＣＢＡ、ヒトβグロビン、ＩＶＳ２、ＳＶ４０、ｂＧＨ、αグロブリン、βグロブリン、コラーゲン、オボアルブミン、またはｐ５３由来である、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記ベクターゲノムがエンハンサーをさらに含む、請求項１～２９のいずれかに記載の方法。
  31. 前記エンハンサーが、ＣＭＶエンハンサー、ＲＳＶエンハンサー、ＡＰＢエンハンサー、ＡＢＰＳエンハンサー、αｍｉｃ／ｂｉｋエンハンサー、ＴＴＲエンハンサー、ｅｎ３４、ＡｐｏＥである、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記ベクターゲノムのサイズが、約３キロベース～約５．５キロベースである、請求項１～３１のいずれかに記載の方法。
  33. 前記ベクターゲノムのサイズが約４キロベースである、請求項１～３２のいずれかに記載の方法。
  34. 前記ｒＡＡＶを産生することができる浮遊細胞株を浮遊培養で増殖させることを含む方法を使用して、前記ｒＡＡＶを製造する、請求項１～３３のいずれかに記載の方法。
  35. 前記浮遊細胞株がＨＥＫ２９３浮遊細胞株である、請求項３４に記載の方法。
  36. （ａ）組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）、
    （ｂ）塩化ナトリウム、
    （ｃ）塩化マグネシウム、
    （ｄ）塩化カリウム、
    （ｅ）デキストロース、
    （ｆ）ポロキサマー１８８、
    （ｇ）第一リン酸ナトリウム、及び
    （ｈ）第二リン酸ナトリウムを含む医薬組成物であって、
    前記組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）が、ＡＡＶキャプシド及びその内部にパッケージされたベクターゲノムを含み、前記ベクターゲノムが：（ｉ）ＡＡＶ ５’逆位末端（ＩＴＲ）配列；（ｉｉ）プロモーター；（ｉｉｉ）ヒトＴＰＰ１をコードするＣＬＮ２コード配列；及び（ｉｖ）ＡＡＶ ３’ＩＴＲを含む、前記医薬組成物。
  37. 塩化カルシウムをさらに含む、請求項３６に記載の医薬組成物。
  38. 前記塩化ナトリウム、前記塩化マグネシウム、前記塩化カリウム、前記デキストロース、前記ポロキサマー１８８、前記第一リン酸ナトリウム、前記第二リン酸ナトリウム、及び前記塩化カルシウムが、それぞれ、無水、一水和物、二水和物、３水和物、４水和物、５水和物、６水和物、７水和物、８水和物、９水和物、または１０水和物の形態である、請求項３７に記載の医薬組成物。
  39. （ａ）前記ｒＡＡＶ、
    （ｂ）約８．７７ｇ／Ｌの濃度の塩化ナトリウム、
    （ｃ）約０．２４４ｇ／Ｌの濃度の塩化マグネシウム６水和物、
    （ｄ）約０．２２４ｇ／Ｌの濃度の塩化カリウム、
    （ｅ）約０．２０６ｇ／Ｌの濃度の塩化カルシウム二水和物、
    （ｆ）約０．７９３ｇ／Ｌの濃度の無水デキストロース、
    （ｇ）約０．００１％（体積／体積）の濃度のポロキサマー１８８、
    （ｈ）約０．０２７８ｇ／Ｌの濃度の第一リン酸ナトリウム一水和物、及び
    （ｉ）約０．１１４ｇ／Ｌの濃度の第二リン酸ナトリウム無水物を含む、請求項３６～３８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  40. 前記医薬組成物のベクターゲノム濃度（ＶＧＣ）が、約１×１０１１ＧＣ／ｍＬ、約３×１０１１ＧＣ／ｍＬ、約６×１０１１ＧＣ／ｍＬ、約１×１０１２ＧＣ／ｍＬ、約３×１０１２ＧＣ／ｍＬ、約６×１０１２ＧＣ／ｍＬ、約１×１０１３ＧＣ／ｍＬ、約２×１０１３ＧＣ／ｍＬ、約３×１０１３ＧＣ／ｍＬ、約４×１０１３ＧＣ／ｍＬ、約５×１０１３ＧＣ／ｍＬ、約６×１０１３ＧＣ／ｍＬ、約７×１０１３ＧＣ／ｍＬ、約８×１０１３ＧＣ／ｍＬ、約９×１０１３ＧＣ／ｍＬ、または約１×１０１４ＧＣ／ｍＬ、約３×１０１４ＧＣ／ｍＬ、約６×１０１４ＧＣ／ｍＬ、または約１×１０１５ＧＣ／ｍＬである、請求項３６～３９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  41. 前記医薬組成物のｐＨが、約６．０～約９．０の範囲にある、請求項３６～４０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  42. 前記医薬組成物のｐＨが約７．４である、請求項４１に記載の医薬組成物。
  43. 前記ｒＡＡＶが、参照医薬組成物中の同じ組換えｒＡＡＶに比べて、凍結／解凍サイクルに対して、少なくとも２％、５％、７％、１０％、１２％、１５％、１７％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、１００％、２倍、３倍、５倍、１０倍、１００倍、または１０００倍安定である、請求項３６～４２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  44. 前記ｒＡＡＶの安定性が、
    （ａ）ｒＡＡＶの感染力、
    （ｂ）ｒＡＡＶの凝集レベル、または
    （ｃ）ｒＡＡＶによって放出された遊離ＤＮＡのレベルによって決定される、請求項４３に記載の医薬組成物。
  45. 前記医薬組成物が液体組成物である、請求項３６～４４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  46. 前記医薬組成物が凍結組成物である、請求項３６～４４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  47. 前記医薬組成物が、凍結乾燥組成物または再構成された凍結乾燥組成物である、請求項３６～４４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  48. 前記医薬組成物が、脳室内（ＩＣＶ）、槽内（ＩＣ）、腰部髄腔内、頭蓋内、静脈内、血管内、動脈内、筋肉内、眼内、筋肉内、皮下、または皮内投与に適した特性を有する、請求項３６～４７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  49. 前記（ｉｉｉ）のコード配列が、配列番号２の天然ヒトコード配列に対して少なくとも７０％同一であるコドン最適化ヒトＣＬＮ２である、請求項３６～４８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  50. 前記（ｉｉｉ）のコード配列が配列番号３である、請求項３６～４９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  51. 前記ｒＡＡＶキャプシドが、ＡＡＶ９またはそのバリアントである、請求項３６～５０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  52. 前記プロモーターがニワトリβアクチン（ＣＢＡ）プロモーターである、請求項３６～５１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  53. 前記プロモーターが、ＣＢＡプロモーター配列とサイトメガロウイルスエンハンサーエレメントを含むハイブリッドプロモーターである、請求項３６～５２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  54. 前記ＡＡＶ ５’ＩＴＲ及び／またはＡＡＶ ３’ＩＴＲがＡＡＶ２由来である、請求項３６～５３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  55. 前記ベクターゲノムがポリＡをさらに含む、請求項３６～５４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  56. 前記ポリＡが、合成ポリＡであるか、またはウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ＳＶ４０、ウサギβ－グロビン（ＲＧＢ）、もしくは修飾ＲＧＢ（ｍＲＧＢ）由来である、請求項３６～５５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  57. 前記ベクターゲノムがイントロンをさらに含む、請求項３６～５６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  58. 前記イントロンが、ＣＢＡ、ヒトβグロビン、ＩＶＳ２、ＳＶ４０、ｂＧＨ、αグロブリン、βグロブリン、コラーゲン、オボアルブミン、またはｐ５３由来である、請求項３６～５７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  59. 前記ベクターゲノムがエンハンサーをさらに含む、請求項３６～５８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  60. 前記エンハンサーが、ＣＭＶエンハンサー、ＲＳＶエンハンサー、ＡＰＢエンハンサー、ＡＢＰＳエンハンサー、αｍｉｃ／ｂｉｋエンハンサー、ＴＴＲエンハンサー、ｅｎ３４、ＡｐｏＥである、請求項３６～５９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  61. 前記ベクターゲノムのサイズが、約３キロベース～約５．５キロベースである、請求項３６～６０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  62. 前記ベクターゲノムのサイズが約４キロベースである、請求項３６～６１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  63. 前記ｒＡＡＶを産生することができる浮遊細胞株を浮遊培養で増殖させることを含む方法を使用して、前記ｒＡＡＶを製造する、請求項３６～６２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  64. 請求項３６～６３のいずれか一項に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、前記対象におけるＣＬＮ２バッテン病の治療方法。
  65. 前記医薬組成物を治療有効量で投与する、請求項６４に記載の方法。
  66. 前記対象がヒトである、請求項６４～６５のいずれか一項に記載の方法。
  67. １つ以上の容器及び使用説明書を含むキットであって、前記１つ以上の容器が、請求項３６～６３のいずれか一項に記載の医薬組成物を含む、前記キット。
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