JP2016535587A - Ａａｖ５カプシドタンパク質を含むアデノ随伴ウイルス（ａａｖ）を用いた神経学的疾患の処置 - Google Patents

Abstract

本発明は、アデノ随伴ウイルス５（ＡＡＶ５）カプシドタンパク質と、ＡＡＶ ＩＴＲに隣接する目的遺伝子産物と、を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）遺伝子治療ベクターを使用して、疾患、脳及び／又は脊髄に対する傷害に冒されている運動機能など、運動機能を冒す障害を処置するための方法に関する。特に、本発明の遺伝子治療ベクターは、脳脊髄液（ＣＳＦ）中への注射によって、好ましくは腰椎注射及び／又は大槽中への注射によって投与される。【選択図】なし

Description

発明の分野

本発明は、ウイルス学及び遺伝子治療の分野に関する。特に、本発明は、哺乳動物、好ましくはヒトにおける神経学的疾患を処置又は予防するための方法に関する。

発明の背景

中枢神経系（ＣＮＳ）は、脊椎動物の脳及び脊髄を含む複雑な系である。末梢神経系は、脳及び脊髄の外の神経系の一部である。脊髄は、感覚情報を末梢神経系から脳へ伝え、運動情報を脳から種々の効果器へ伝える。

ウイルスベクターを用いた遺伝子治療は、ＣＮＳに関する種々の障害を処置するための治療薬剤を送達するために研究されている。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、低毒性及び低免疫性、並びにＣＮＳにおける導入遺伝子の長期発現を含む多くの利点を有する（Ｋａｐｌｉｔｔ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ８：１４８−１５４； Ｂａｒｔｌｅｔｔ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ９：１１８１−１１８６； Ｐａｓｓｉｎｉ ｅｔ ａｌ． （２００２） Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２２：６４３７−６４４６）。したがって、ＡＡＶはＣＮＳの遺伝子治療のためにさらに研究されている。

筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）（運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）としても知られる。）などのＣＮＳ疾患の多くは、ＣＮＳの広域にわたって分布する皮質及び脊髄両方の運動ニューロンを冒す。ＣＮＳに注射したウイルスベクターが、必要とされる広域にではなく、注射部位近傍の細胞に形質導入されることがしばしば見られる。さらに、脳中への注射は、安全性が懸念される、外科的な侵襲的手技である。腰椎穿刺を用いた遺伝子治療を評価するために、いくつかの研究が行われている。当技術分野で報告されている欠点は、腰椎穿刺による遺伝子移入は、実質内注射しない限り、髄膜線維芽細胞に形質導入するにすぎず、神経組織には形質導入することができない（Ｆｉｎｅｇｏｌｄ （１９９９） Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １０：１２５１−１２５７； Ｍｉｌｌｉｇａｎ （２００５） Ｅｕｒ Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２１：２１３６−２１４８； Ｍｉｌｌｉｇａｎ （２００５） Ｍｏｌ Ｐａｉｎ １：９； Ｍｉｌｌｉｇａｎ （２００６） Ｐａｉｎ １２６：２９４−３０８）、２週間未満の導入遺伝子の発現という結果に終わり（Ｍｉｌｌｉｇａｎ （２００５） Ｅｕｒ Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２１：２１３６−２１４８； Ｍｉｌｌｉｇａｎ （２００５） Ｍｏｌ Ｐａｉｎ １：９； Ｌｉｎ （２００２） Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｌｅｔｔ ３１７：１−４； Ｌｉｎ （２００２） Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ９：１２４７−１２５３）、複数回注射が必要とされ（Ｍｉｌｌｉｇａｎ （２００６） Ｐａｉｎ １２６：２９４−３０８）、又は前処置が必要とされる（Ｖｕｌｃｈａｎｏｖａ （２０１０） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｉｎ ６：３１）ということである。

Ｓｔｏｒｅｋら（Ｓｔｏｒｅｋ （２００８） ＰＮＡＳ １０５（３）：１０５５−１０６０）は、従来の一本鎖ｒＡＡＶ２での導入遺伝子の発現は検出することができず、そのため、種々のｒＡＡＶベクターの改変、すなわち種々の血清型のカプシドでのシュードタイピング、及び二本鎖の自己相補的ｒＡＡＶを試験したことを開示している。具体的には、Ｓｔｏｒｅｋらは、自己相補的ＡＡＶ８は、髄腔内投与時、脳ではなく後根神経節における一次感覚ニューロンに効果的及び選択的に形質導入し、単一ベクターを投与した後、長期の遺伝子発現を確立したことを開示している。

よって、当技術分野において、哺乳動物における神経学的疾患の処置又は予防において使用することができる遺伝子移入の方法が依然として必要とされている。特に、上述の１つ又は複数の欠点を回避した、神経組織に形質導入するための遺伝子移入の方法が必要とされている。

発明の説明

発明の概要：
第一の態様において、本発明は、哺乳動物対象、好ましくはヒトにおける医薬としての使用のためのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）遺伝子治療ベクターであって、遺伝子治療ベクターは、ＡＡＶ血清型５カプシドタンパク質と、ＡＡＶ ＩＴＲに隣接する目的遺伝子産物（ｇｅｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ ｉｎｔｅｒｅｓｔ）と、を含み、遺伝子治療ベクターは腰部髄腔内投与により投与される、ＡＡＶ遺伝子治療ベクターに関する。

好ましい一実施形態において、腰部髄腔内投与は、Ｌ４〜Ｌ５、Ｌ３〜Ｌ４、Ｌ１〜Ｌ２、及びＬ２〜Ｌ３からなる群から選択される位置におけるものである。

好ましい一実施形態において、ＡＡＶ遺伝子治療ベクターは一本鎖ＡＡＶ遺伝子治療ベクター又はモノマーの二本鎖ベクターである。

好ましい一実施形態において、目的遺伝子産物は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、疼痛、ハンチントン病、アルツハイマー病、テイ−セイズ（Ｔａｙ−Ｓａｙｓ）病、フリードライヒ失調症、毛細血管拡張性運動失調症、脊髄小脳失調症１型、２型、及び３型、ニーマン・ピック病Ａ型、Ｂ型、及びＣ型、ドーパ反応性ジストニア、脆弱Ｘ染色体症候群、クラッベ病、糖原病２型（ポンペ）、原発性側索硬化症、ペリツェウス−メルツバッハー病、Ｘ連鎖性副腎白質ジストロフィー、巨大軸索ニューロパチー、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、近位型筋緊張性ミオパチー、神経セロイドリポフスチン症（バッテン病）、及び癌からなる群から選択される状態の処置又は予防における使用のためのものである。

好ましい一実施形態において、ＡＡＶ ＩＴＲはＡＡＶ血清型２ ＩＴＲである。

好ましい一実施形態において、目的遺伝子産物は、アスパルチルグルコサミニダーゼ、α−ガラクトシダーゼＡ、パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ、トリペプチジルペプチダーゼ、リソソーム膜貫通タンパク質、複数の遺伝子産物、システイントランスポーター、酸性セラミダーゼ、酸性α−Ｌ−フコシダーゼ、保護タンパク質／カテプシンＡ、酸性β−グルコシダーゼ又はグルコセレブロシダーゼ、酸性β−ガラクトシダーゼ、イズロン酸−２−スルファターゼ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、ガラクトセレブロシダーゼ、酸性α−マンノシダーゼ、酸性β−マンノシダーゼ、アリールスルファターゼＢ、アリールスルファターゼＡ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−硫酸スルファターゼ、酸性β−ガラクトシダーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−ホスホトランスフェラーゼ、酸性スフィンゴミエリナーゼ、ＮＰＣ−１、酸性α−グルコシダーゼ、β−ヘキソサミニダーゼＢ、ヘパランＮ−スルファターゼ、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、アセチル−ＣｏＡ：α−グルコサミニドＮ−アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−硫酸スルファターゼ、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、α−ノイラミダーゼ、β−グルクロニダーゼ、β−ヘキソサミニダーゼＡ、酸性リパーゼ、神経栄養因子、例えば、神経成長因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、ニューロトロフィン−４／５（ＮＴ−４／５）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、脳ドーパミン神経栄養因子（ＣＤＮＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、繊毛様神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、成長因子インスリン様成長因子（ＩＧＦ−１）、及び欠陥遺伝子のダウンレギュレーションのためのｍｉＲＮＡからなる群から選択される。

好ましい一実施形態において、目的遺伝子産物は、治療効果を得るのに十分な目的遺伝子産物の発現を生じさせるプロモーターを含む発現制御エレメントに作動可能に連結しており、プロモーターは、好ましくは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、ＣＡＧプロモーター（サイトメガロウイルス初期エンハンサーエレメント及びニワトリベータ−アクチンプロモーターの組合せ）、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター、シナプシン−１プロモーター、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、及びＧｅｎｅ Ｓｗｉｔｃｈ若しくはｔｅｔ−オペロンに由来するプロモーターなどの誘導プロモーターからなる群から選択される。

好ましい一実施形態において、遺伝子治療ベクターは、腰部髄腔内投与の前に、同時に、又は後に大槽中にさらに投与される。

好ましい一実施形態において、体重１キログラム当たり２×１０^１３〜２×１０^１５、より好ましくは８×１０^１３〜６×１０^１４ゲノムコピーが対象に投与される。

好ましい一実施形態において、対象は、ＡＡＶ遺伝子治療ベクターの腰部髄腔内投与前に静脈内マンニトール前処置を受けていない。

好ましい一実施形態において、ＡＡＶ遺伝子治療ベクターは自己相補的な遺伝子ベクターではない。

定義：
「核酸構築物」は、天然に存在する遺伝子から単離される、又はその他の点では天然に存在しない方法で組み合わされ、若しくは並置される核酸のセグメントを含むように改変されている核酸分子と規定する。核酸分子はヌクレオチド配列により表される。任意選択により、核酸構築物に存在するヌクレオチド配列は、１つ又は複数の制御配列に作動可能に連結され、制御配列は、細胞又は対象における上記ペプチド又はポリペプチドの産生又は発現を導く。

ある（組換え）核酸又はポリペプチドの分子とある宿主生物体又は宿主細胞との間の関係を示すのに使用される「同種の」の語は、自然界において核酸又はポリペプチドの分子が同じ種の宿主細胞又は生物体によって産生されることを意味するものと理解される。「異種の」の語は、自然界において核酸又はポリペプチドの分子が異なる種の宿主細胞又は生物体によって産生されることを示すのに使用され得る。

「発現制御配列」は、それに対して作動可能に連結しているヌクレオチド配列の発現を調節する核酸配列を意味する。発現制御配列が、ヌクレオチド配列の転写及び／又は翻訳を制御及び調節する場合、発現制御配列はヌクレオチド配列に「作動可能に連結している」。よって、発現制御配列は、プロモーター、エンハンサー、配列内リボソーム侵入部位（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ）（ＩＲＥＳ）、転写ターミネーター、タンパク質コード遺伝子の前の開始コドン、イントロンに対するスプライシングシグナル、及び終止コドンを含むことができる。「発現制御配列」の語は、少なくとも、その存在が発現に影響を及ぼすようにデザインされる配列を含むものとされ、また、有利な構成成分をさらに含むこともできる。例えば、リーダー配列及び融合パートナー配列は発現制御配列である。「発現制御配列」の語は、フレームの中及び外における望ましくない、潜在的な開始コドンを配列から除去するような核酸配列のデザインを含むこともできる。「発現制御配列」の語は、望ましくない、潜在的なスプライス部位を除去するような核酸配列のデザインを含むこともできる。「発現制御配列」の語は、ポリＡテイル（すなわち、ｍＲＮＡの３’終端の一連のアデニン残基であり、ポリＡ配列と呼ばれ得る。）の付加を導く配列又はポリアデニル化配列（ｐＡ）を含む。「発現制御配列」は、ｍＲＮＡの安定性を増強するようにデザインすることもできる。転写及び翻訳の安定性に影響を及ぼす発現制御配列、例えばプロモーター、及び翻訳を実行する配列、例えばＫｏｚａｋ配列（昆虫細胞における使用に適している。）は当業者によく知られている。発現制御配列は、低発現レベル又は高発現レベルが実現するように、それが作動可能に連結しているヌクレオチド配列を変調するような性質のものであってよい。

本明細書で使用される「プロモーター」又は「転写調節配列」の語は、１つ又は複数のコード配列の転写を制御するように機能し、コード配列の転写開始部位の転写の方向に関して上流に位置し、ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ、転写開始部位、及び任意の他のＤＮＡ配列に対する結合部位の存在によって構造的に同定される核酸フラグメントを意味し、それだけには限定されないが、転写因子結合部位、リプレッサー及びアクチベータタンパク質結合部位、並びにアテニュエータ又はエンハンサーだけでなくサイレンサーなども含む、プロモーターからの転写の量を調節するように直接又は間接的に作用することが当業者には知られている任意の他の配列のヌクレオチドが含まれる。「構成的」プロモーターは、大半の生理学的及び発生学的条件下、大半の組織で活性があるプロモーターである。「誘導」プロモーターは、化学的誘導物質の適用などにより生理学的又は発生学的に調節されるプロモーターである。「組織特異的」プロモーターは、特異的なタイプの組織又は細胞でのみ活性がある。

「３’ＵＴＲ」又は「３’非翻訳配列」（３’非翻訳領域又は３’終端ともしばしば呼ばれる。）は、遺伝子のコード配列の下流に見出される核酸配列を意味し、例えば、転写終結点及び（すべてではないが大半の真核生物のｍＲＮＡにおける）ポリアデニル化シグナル（例えば、ＡＡＵＡＡＡ又はそのバリアント）を含む。転写終結後、ｍＲＮＡ転写物は、ポリアデニル化シグナルの下流で切断されてもよく、ポリ（Ａ）テイルが付加されてもよく、ポリ（Ａ）テイルは、ｍＲＮＡの細胞質（ここでは翻訳が生じる。）への輸送に関与する。

「ベクター」は、パッセンジャー核酸配列（すなわちＤＮＡ又はＲＮＡ）を宿主細胞中に輸送するように働く核酸分子（典型的にＤＮＡ又はＲＮＡ）である。一般的な３タイプのベクターにはプラスミド、ファージ、及びウイルスが含まれる。ベクターはウイルスであることが好ましい。プロモーター、及びその中にポリヌクレオチドが作動可能に連結することができるクローニング部位の両方を含むベクターが、当技術分野ではよく知られている。このようなベクターはｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏでＲＮＡを転写することができ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）及びＰｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）などの供給源から市販されている。発現及び／又はｉｎ ｖｉｔｒｏの転写を最適化するために、クローンの５’及び／又は３’非翻訳ポーションを除去、付加、又は改変して、余分な、潜在的な、不適当な代替の翻訳開始コドン、又は転写若しくは翻訳レベルのいずれかで発現を妨害若しくは低減し得る他の配列を除去する必要があり得る。あるいは、コンセンサスリボソーム結合部位を、開始コドンのすぐ５’に挿入して発現を増強してもよい。

「ウイルスベクター」は、遺伝子産物をコードするウイルス遺伝子、制御配列、及びウイルスのパッケージ配列のうちのいくつか又はすべてを含むベクターを意味する。「パルボウイルスベクター」は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、又はｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれかで宿主細胞中に送達されるポリヌクレオチドを含む、組換えにより作製されたパルボウイルス又はパルボウイルス粒子と規定される。パルボウイルスベクターの例は、例えばアデノ随伴ウイルスベクターを含む。本明細書において、パルボウイルスベクター構築物は、ウイルスゲノム若しくはその一部及び導入遺伝子を含むポリヌクレオチドを意味する。

本明細書で使用される「プロモーター」又は「転写調節配列」の語は、１つ又は複数のコード配列の転写を制御するように機能し、コード配列の転写開始部位の転写の方向に関して上流に位置し、ＤＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼ、転写開始部位、及び任意の他のＤＮＡ配列（それだけには限定されないが、転写因子結合部位、リプレッサー及びアクチベータタンパク質結合部位、並びにプロモーターからの転写の量を直接又は間接的に調節するように作用することが当業者に知られている任意の他のヌクレオチドの配列を含む。）に対する結合部位の存在によって構造的に同定される核酸フラグメントを意味する。「構成的」プロモーターは、大半の生理学的及び発生学的条件下、大半の組織で活性があるプロモーターである。「誘導」プロモーターは、化学誘導物質の適用などにより生理学的又は発生学的に調節されるプロモーターである。「組織特異的」プロモーターは、特異的なタイプの組織又は細胞でのみ活性がある。

プロモーターは、変異の、切断された、及びハイブリッドのプロモーターを含む、細胞で転写活性を示す任意の好適なプロモーター配列であってもよく、細胞に対して同種（天然）又は異種（外来）いずれかの、細胞外又は細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得てもよい。

プロモーターは、発現させようとするコード配列と天然に関連しているプロモーターであってもよい。プロモーターはまた、発現させようとするコード配列に対して外来の、構成的又は誘導プロモーターであってもよい。哺乳動物細胞における使用のための適切なプロモーターの例には、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ （２００１） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （３^ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載されているものなどがある。イーストにおける使用のための適切なプロモーターの例には解糖のプロモーターなどが含まれる。

本明細書における、他のエレメント（複数可）に隣接する配列に関する「隣接する」の語は、配列に対して上流及び／又は下流に、すなわち５’及び／又は３’に１つ又は複数の隣接するエレメントが存在することを示す。「隣接する」の語は、配列が必然的に連続することを示すことは意図されていない。例えば、導入遺伝子をコードする核酸と隣接するエレメントとの間に介在配列があってもよい。２つの他のエレメント（例えばＩＴＲ）に「隣接する」配列とは、一方のエレメントがその配列に対して５’に位置し、他方がその配列に対して３’に位置することを示すが、それらの間に介在配列（複数）があってもよい。好ましい一実施形態において、（ｉ）のヌクレオチド配列はパルボウイルスの末端逆位ヌクレオチド配列にいずれかの側で隣接する。

「ポリヌクレオチド」及び「核酸」の語は本明細書において交換可能に使用され、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドいずれかの、任意の長さのポリマー形態のヌクレオチドを意味する。よって、この語には、それだけには限定されないが、一本鎖、二本鎖、又はマルチストランドのＤＮＡ又はＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、又はプリン塩基及びピリミジン塩基、又は他の天然の、化学的若しくは等化学的に（ｉｓｏｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ）改変されている、非天然の、若しくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーが含まれる。「オリゴヌクレオチド」は一般的に、約５〜約１００ヌクレオチドの間の一本鎖又は二本鎖ＤＮＡのポリヌクレオチドを意味する。しかし、本開示の目的に関してオリゴヌクレオチドの長さに上限はない。オリゴヌクレオチドは、オリゴマー又はオリゴとしても知られており、遺伝子から単離しても、又は当技術分野では知られている方法により化学合成してもよい。

本明細書で使用される「処置」、「処置する」などの語は、所望の薬理学的及び／又は生理学的効果を得ることを意味する。効果は、疾患若しくはその症状を完全に若しくは部分的に防止することに関して予防的でもよく、及び／又は疾患に対する部分的若しくは完全な治癒及び／又は疾患に起因し得る有害作用に関して治療的でもよい。本明細書で使用される「処置」は、哺乳動物、特にヒトにおける疾患の任意の処置をカバーし、下記を含む。
（ａ）疾患の素因となり得るが、それを有すると未だ診断されていない対象に疾患が生じるのを防ぐこと
（ｂ）疾患を阻害し、すなわち疾患の発生を抑止すること
（ｃ）疾患を軽減し、すなわち疾患の退行を引き起こすこと

「配列同一性」及び「配列類似性」は、２つのペプチド又は２つのヌクレオチド配列のアラインメントにより、２配列の長さに応じて包括的又は局所的なアラインメントアルゴリズムを用いて決定することができる。同様の長さの配列は、全体の長さにわたって配列を最適にアラインする包括的なアラインメントアルゴリズム（例えばＮｅｅｄｌｅｍａｎ Ｗｕｎｓｃｈ）を用いてアラインするのが好ましく、実質的に異なる長さの配列は、局所的なアラインメントアルゴリズム（例えばＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎ）を用いてアラインすることが好ましい。次いで、配列が（例えば、ＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴプログラムにより、デフォルトパラメータを用いて最適にアラインする場合）少なくともある最小パーセントの配列同一性（以下に規定）を共有する場合、配列は「実質的に同一」又は「本質的に類似」と言うことができる。ＧＡＰは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈの包括的アラインメントアルゴリズムを使用して、２配列をその全体の長さ（全長）にわたってアラインし、マッチ数を最大にし、ギャップ数を最小にする。２配列の長さが同様である場合、包括的アラインメントを適切に用いて配列同一性を決定する。一般的に、ＧＡＰデフォルトパラメータを用い、ギャップ挿入ペナルティ＝５０（ヌクレオチド）／８（タンパク質）、及びギャップ伸長ペナルティ＝３（ヌクレオチド）／２（タンパク質）である。ヌクレオチドでは、使用されるデフォルトスコアリングマトリクスはｎｗｓｇａｐｄｎａであり、タンパク質では、デフォルトスコアリングマトリクスはＢｌｏｓｕｍ６２である（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ＆ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ， １９９２， ＰＮＡＳ ８９， ９１５−９１９）。配列アラインメント及び配列同一性パーセントに対するスコアは、Ａｃｃｅｌｒｙｓ Ｉｎｃ．， ９６８５ Ｓｃｒａｎｔｏｎ Ｒｏａｄ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ ９２１２１−３７５２ ＵＳＡから入手できるＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ， Ｖｅｒｓｉｏｎ １０．３などのコンピュータプログラムを用いて、又は「ｎｅｅｄｌｅ」（包括的なＮｅｅｄｌｅｍａｎ Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを使用）若しくはＥｍｂｏｓｓＷＩＮ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．１０．０における「ｗａｔｅｒ」（ローカルＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用）というプログラムなどのオープンソースのソフトウエアを、上記のＧＡＰに対する同じパラメータを用いて、若しくはデフォルト設定を用いて決定してもよい（「ｎｅｅｄｌｅ」及び「ｗａｔｅｒ」の両方に対して、並びにタンパク質及びＤＮＡアラインメントの両方に対して、デフォルトのギャップ開始ペナルティは１０．０であり、デフォルトのギャップ伸長ペナルティは０．５であり、デフォルトスコアリングマトリクスは、タンパク質に対してＢｌｏｓｓｕｍ６２であり、ＤＮＡに対してＤＮＡＦｕｌｌである）。配列の全体の長さが実質的に異なる場合、ローカルアラインメント（例えば、Ｓｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用するもの）が好ましい。あるいは、パーセント類似性又は同一性を、公的なデータベースに対して検索することにより、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴなどのアルゴリズムを用いて決定してもよい。

発明の詳細な説明：
遺伝子のＣＮＳへの送達は、今まで、ＣＮＳのサイズ及び複雑さによって阻まれていた。脳実質中へ単回注射した後の導入遺伝子の発現は局所的であり、注入領域に主に制限されたままである。ウイルスベクターを送達するための方法としてＣＳＦを用いると、より広範な領域に到達することができる。本研究により、ＡＡＶ−５ベクターを用いると、ＣＮＳのより広範な領域に形質導入するというこの目的を達成できることが示される。有害な臨床徴候及び明らかなニューロンの喪失が観察されなかったため、処置は耐容性が良好であった。神経細胞及びグリア細胞の両方に、ユビキタスなＣＡＧプロモーターを用いて形質導入し、導入遺伝子の発現はＣＮＳの外に観察されなかった。ＧＦＡＰプロモーター又はシナプシン−１プロモーターなどの細胞特異的なプロモーターを用いて、特定の集団に対して発現を導くことができる。本発明者らは、皮質、小脳、及び脳室下帯の領域は、神経細胞及びグリア細胞の両方で導入遺伝子の発現を示すことを示した。脊髄では、運動ニューロンへの形質導入及び後根神経節におけるニューロンへの形質導入が優勢だった。これらの結果は、ＣＮＳ媒介性の送達方法を用いて、遺伝子治療アプローチ用に遺伝子を送達することができることを示す。これが補助となり得る適応症には、運動ニューロン疾患、感覚関連の適応症、及び他の種々の神経学的な適応症があり得る。

第１の態様において、本発明は、哺乳動物対象における医薬としての使用のためのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）遺伝子治療ベクターに関する。遺伝子治療ベクターは、ＡＡＶ血清型５カプシドタンパク質と、ＡＡＶ ＩＴＲに隣接する目的遺伝子産物と、を含むことが好ましい。より好ましくは、遺伝子治療ベクターは、脳脊髄液（ＣＳＦ）中に、好ましくは髄腔内投与及び／又は大槽中への投与によって、より好ましくは腰椎投与及び／又は大槽中への投与によって投与される。本発明は、医薬としての使用のための上述のＡＡＶ遺伝子治療ベクターに関する。すなわち、本発明は、治療によるヒト又は動物の身体の処置の方法における使用のための本発明のＡＡＶ遺伝子治療ベクターを提供する。本発明は、例えば、運動ニューロン疾患、感覚関連の適応症、及び他の種々の神経学的障害などの障害の処置における使用のための、上で規定されたＡＡＶ遺伝子治療ベクターにさらに関する。したがって、本発明は、本明細書でさらに規定される障害などの障害の処置の方法における使用のための医薬の調製における使用のための本発明のＡＡＶ遺伝子治療ベクターに関する。

パルボウイルス科のウイルスは、小型ＤＮＡ動物ウイルスである。パルボウイルス科は、脊椎動物に感染するパルボウイルス亜科、及び昆虫に感染するデンソウイルス亜科の２つの亜科間に分けることができる。パルボウイルス亜科のメンバーを本明細書ではパルボウイルスと呼び、ディペンドウイルス属が含まれる。これらの属名から推定することができる通り、ディペンドウイルスのメンバーは通常、細胞培養物中の増殖性感染にアデノウイルス又はヘルペスウイルスなどのヘルパーウイルスとの同時感染を必要とするという点で独特である。ディペンドウイルス属には、通常はヒト（例えば、血清型１、２、３Ａ、３Ｂ、４、５、及び６）又は霊長動物（例えば、血清型１及び４）に感染するＡＡＶ、並びに他の温血動物に感染する関連のウイルス（例えば、ウシ、イヌ、ウマ、及びヒツジのアデノ随伴ウイルス）が含まれる。パルボウイルス及びパルボウイルス科の他のメンバーに対するさらなる情報は、Ｋｅｎｎｅｔｈ Ｉ． Ｂｅｒｎｓ， “Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ： Ｔｈｅ Ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ”， Ｃｈａｐｔｅｒ ６９ ｉｎ Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ （３ｄ Ｅｄ． １９９６）に記載されている。

知られているすべてのＡＡＶ血清型のゲノム機構は極めて類似している。ＡＡＶのゲノムは、長さ約５０００ヌクレオチド（ｎｔ）未満の、直鎖状の一本鎖ＤＮＡ分子である。末端逆位配列（ＩＴＲ）は、非構造的複製（Ｒｅｐ）タンパク質及び構造（ＶＰ）タンパク質に対する独特なコードヌクレオチド配列に隣接する。ＶＰタンパク質（ＶＰ１、２、及び３）はカプシドを形成する。末端の１４５ｎｔは自己相補的であり、Ｔ形状のヘアピンを形成するエネルギー的に安定な分子内二本鎖を形成し得るように組織化される。これらのヘアピン構造は、ウイルスＤＮＡ複製のための開始点として機能し、細胞のＤＮＡポリメラーゼ複合体に対するプライマーとして働く。哺乳動物細胞において野生型（ｗｔ）ＡＡＶが感染した後、Ｒｅｐ遺伝子（すなわち、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２）がＰ５プロモーター及びＰ１９プロモーターからそれぞれ発現され、Ｒｅｐタンパク質は両方とも、ウイルスのゲノムの複製における機能を有する。ＲｅｐのＯＲＦにおけるスプライシングのイベントが、実際に４つのＲｅｐタンパク質（すなわち、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、及びＲｅｐ４０）の発現をもたらす。しかし、哺乳動物細胞における、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２タンパク質をコードするスプライシングされないｍＲＮＡは、ＡＡＶベクター産生に十分であることが示された。昆虫細胞でも、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２タンパク質はＡＡＶベクター産生に十分である。

本明細書における「組換えパルボウイルス又はＡＡＶのベクター」（又は「ｒＡＡＶベクター」）は、少なくとも１つのパルボウイルス若しくはＡＡＶ末端逆位配列（ＩＴＲ）に隣接する１つ又は複数の目的ポリヌクレオチド配列、目的遺伝子産物、目的遺伝子、又は「導入遺伝子」を含むベクターを意味する。このようなｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子産物（すなわちＡＡＶ Ｒｅｐ及びＣａｐタンパク質）を発現する昆虫の宿主細胞に存在する場合、複製され、感染性のウイルス粒子中にパッケージングされ得る。ｒＡＡＶベクターが、（例えば、染色体における、又はクローニング若しくはトランスフェクションに使用されるプラスミド若しくはバキュロウイルスなどの別のベクターにおける）より大型の核酸構築物中に組み入れられる場合、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶパッケージング機能及び必要なヘルパー機能の存在下、複製及びカプシド形成によって「レスキュー」され得る「プロベクター」と通常呼ばれる。目的遺伝子産物はいずれかの側でＡＡＶ ＩＴＲに隣接することが好ましい。ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８及び／又はＡＡＶ９からのＩＴＲを含む任意のＡＡＶ ＩＴＲを本発明の構築物において使用することができる。ＡＡＶ２のＩＴＲが最も好ましい。本発明の好ましい核酸構築物における使用のための好ましいＩＴＲ配列の例を配列番号１（左又は上流ＩＴＲ）及び配列番号２（右又は下流ＩＴＲ）に示す。

ＡＡＶは多くの哺乳動物細胞に感染することができる。例えば、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら（１９８５， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ５：３２５１−３２６０）及びＧｒｉｍｍら（１９９９， Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． １０：２４４５−２４５０）を参照されたい。しかし、ヒト滑液の線維芽細胞へのＡＡＶ形質導入は同様のマウス細胞におけるより著しく効率的であり（Ｊｅｎｎｉｎｇｓ ｅｔ ａｌ．， Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｅｓ， ３：１ （２００１））、ＡＡＶの細胞指向性は血清型間で異なる。例えば、哺乳動物ＣＮＳ細胞への指向性及び形質導入の効率に関してＡＡＶ２、ＡＡＶ４、及びＡＡＶ５間の違いを論じたＤａｖｉｄｓｏｎら（２０００， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９７：３４２８−３４３２）、及びＡＡＶの親和性を改変するためアプローチを論じたＧｏｎｃａｌｖｅｓ（２００５， Ｖｉｒｏｌ Ｊ． ２（１）：４３）を参照されたい。

本発明における使用のためのＡＡＶ遺伝子治療ベクターは、哺乳動物細胞又は昆虫細胞のいずれにおいても産生され得る。当技術分野では両方の方法が記載されている。例えば、Ｇｒｉｍｍら（２００３ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ７（６）：８３９−８５０）は、ヘルパーウイルスフリーかつ光学的に制御可能な様式でＡＡＶベクターを作製するための戦略を開示しており、この戦略は、２個のプラスミドのみを２９３Ｔ細胞中にトランスフェクションすることに基づく。Ｇｒｉｍｍらは、ＡＡＶ２ ＩＴＲ及びＡＡＶ５カプシドタンパク質を含むハイブリッドＡＡＶベクターの作製のための方法を開示している。この参考文献はその全体が本明細書に含まれる。さらなる情報は、Ｂｌｉｔｓら（２０１０年）（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ｍｅｔｈｏｄｓ １８５（２）：２５７−２６３）にも見出すことができる。「ハイブリッド」及び「シュードタイピングされた」の語は本明細書において交換可能に使用され、Ｒｅｐタンパク質、ＩＴＲ、及び／又はカプシドタンパク質が異なる血清型であるベクターを示すのに使用される。例えば、ＩＴＲ及びＲｅｐタンパク質はＡＡＶ２のものであり、カプシドタンパク質はＡＡＶ５のものである。「キメラの」の語は、本明細書において、例えばカプシドなどの単一の遺伝子が、異なる血清型に由来する少なくとも２つの配列から構成されていることを表現するのに使用される。

例えば、ＡＡＶ５は、それだけには限定されないが、以下の方法に従って哺乳動物細胞において産生させることができる。ベクターのゲノムは、ＡＡＶ血清型２に由来する２つの末端逆位配列（ＩＴＲ）に隣接する導入遺伝子の発現カセットを含んでいる。ウイルスベクターゲノムの全長は、効率的なパッケージング効率を維持するために、野生型ゲノムサイズ４．７ｋＢを超えなくてもよい。単一のカプシドは、１：１：１０の比のＶＰ１（６２ｋＤａ）、ＶＰ２（７３ｋＤａ）、又はＶＰ３（８７ｋＤａ）の６０個のウイルスタンパク質からなる。ＡＡＶベクターの製造プロセスは、回転ビン（表面積８５０ｃｍ^２）中、２つのプラスミドのヒト胚性腎生成細胞（ＨＥＫ２９３）中へのＣａ（ＰＯ４）２トランスフェクション、引き続く、ろ過及びクロマトグラフィー技術によるカプシド形成したベクターゲノムの精製に基づく。第１のプラスミドはウイルスベクタープラスミドであり、ＡＡＶ２ ＩＴＲに隣接する発現構築物を含む。第２のプラスミドはパッケージングプラスミドであり、所望の血清型のＡＡＶ ｒｅｐ２型及びｃａｐ５型遺伝子、並びにアデノウイルス初期ヘルパー遺伝子Ｅ２Ａ、ＶＡ、Ｅ４（ｐＤＰ５；配列番号３に開示するヌクレオチド配列）をコードする。生成細胞株のゲノムは、ヘルパー機能を提供するアデノウイルスＥ１を含む。２つのプラスミドを、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むイスコフ改変ダルベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）（ＩＭＤＭ）中でコトランスフェクションした後、細胞を、無血清ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で３日間インキュベートしてベクターを産生させる。回転ビン中のベクター産生により、平均して、細胞１個当たり３×１０^３ベクターゲノム又は回転ビン１本当たり４×１０^１１ベクターゲノムの収量がもたらされる（ｑＰＣＲにより定量）。引き続き、細胞培養物を、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００を含むバッファーにより溶解し、低速の遠心分離により細胞デブリを除去する。清澄化したバルクを、ＡＶＢセファロースアフィニティークロマトグラフィーにより精製し、４００ｋＤａ中空ファイバーモジュール（例えば、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓからのもの）を用いた濃縮及び透析ろ過によってＰＢＳ／５％ショ糖中に配合する。

あるいは、本発明における使用のためのＡＡＶ遺伝子治療ベクターは、Ｕｒａｂｅら（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２００６ ８０（４）：１８７４−１８８５）により先に記載されているように昆虫細胞において産生され得る。例えば、国際公開第２００７／０４６７０３号、国際公開第２００７／１４８９７１号、国際公開第２００９／０１４４４５号、国際公開第２００９／１０４９６４号、及び／又は国際公開第２０１１／１１２０８９号に開示されているものなど、以前に開示されている、Ｒｅｐ並びにＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３配列における改変も本発明において採用することができる。

昆虫細胞におけるｒＡＡＶベクターの産生のために本発明において使用され得るＡＡＶ ＩＴＲ及びＲｅｐ配列は、任意のＡＡＶ血清型のゲノムに由来したものであり得る。概して、ＡＡＶ血清型は、アミノ酸及び核酸のレベルでのホモロジーが顕著なゲノム配列を有する。これは、物理的及び機能的に本質的に同等であるビリオンを産生する、遺伝機能の同一セットを提供する。種々のＡＡＶ血清型のゲノム配列、及びゲノム類似性の概略に関しては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ８９７９０；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｊ０１９０１；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０４３３０３；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０８５７１６；Ｃｈｉｏｒｉｎｉら（１９９７， Ｊ． Ｖｉｒ． ７１：６８２３−３３）；Ｓｒｉｖａｓｔａｖａら（１９８３， Ｊ． Ｖｉｒ． ４５：５５５−６４）；Ｃｈｉｏｒｉｎｉら（１９９９， Ｊ． Ｖｉｒ． ７３：１３０９−１３１９）；Ｒｕｔｌｅｄｇｅら（１９９８， Ｊ． Ｖｉｒ． ７２：３０９−３１９）；及びＷｕら（２０００， Ｊ． Ｖｉｒ． ７４：８６３５−４７）を参照されたい。ｒＡＡＶ血清型１、２、３、４、及び５は、本発明の文脈における使用のためのＡＡＶヌクレオチド配列の好ましい供給源である。好ましくは、本発明の文脈における使用のためのＡＡＶ ＩＴＲ配列はＡＡＶ１、ＡＡＶ２、及び／又はＡＡＶ５に由来する。より好ましくは、本発明における使用のためのＩＴＲ配列はＡＡＶ２ ＩＴＲである。同様に、Ｒｅｐ（Ｒｅｐ７８／６８及びＲｅｐ５２／４０）コード配列は好ましくはＡＡＶ１、ＡＡＶ２、及び／又はＡＡＶ５に由来し、より好ましくはＡＡＶ２に由来する。

ＡＡＶ Ｒｅｐ及びＩＴＲ配列は多くの血清型間で特に保存されている。種々のＡＡＶ血清型のＲｅｐ７８タンパク質は例えば８９％を超えて同一であり、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、及びＡＡＶ６間のゲノムレベルの全ヌクレオチド配列同一性はおよそ８２％である（Ｂａｎｔｅｌ−Ｓｃｈａａｌ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ７３（２）：９３９−９４７）。さらに、多くのＡＡＶ血清型のＲｅｐ配列及びＩＴＲは、哺乳動物細胞におけるＡＡＶ粒子の産生において、他の血清型の対応する配列を効率的に交差補完する（ｃｒｏｓｓ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）（すなわち、機能的に置換する）ことが知られている。米国特許出願公開第２００３１４８５０６号は、ＡＡＶ Ｒｅｐ及びＩＴＲ配列も、昆虫細胞における他のＡＡＶ Ｒｅｐ及びＩＴＲ配列を効率的に交差補完することを報告している。

ＡＡＶ ＶＰタンパク質はＡＡＶビリオンの細胞指向性を決定することが知られている。ＶＰタンパク質をコードする配列は、異なるＡＡＶ血清型間での保存の程度がＲｅｐタンパク質及び遺伝子に比べて著しく低い。本発明の文脈における使用のためのウイルスタンパク質（ＶＰ）ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３カプシドタンパク質をコードする配列はＡＡＶ５に由来する。最も好ましくは、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３はＡＡＶ５ ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３である。あるいは、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３は、例えば、配列番号３（ヌクレオチド配列）及び配列番号４（アミノ酸配列）に示すものなど、野生型ＡＡＶ５配列である。他の血清型の対応する配列を交差補完するＲｅｐ及びＩＴＲ配列の能力により、ある血清型（例えばＡＡＶ５）のカプシドタンパク質及び別のＡＡＶ血清型（例えばＡＡＶ２）のＩＴＲ配列を含む、シュードタイピングされたｒＡＡＶ粒子の産生が可能である。このようなシュードタイピングされたｒＡＡＶ粒子は本発明の一部である。本明細書において、シュードタイピングされたｒＡＡＶ粒子は「ｘ／ｙ」型と称され得、ここで、「ｘ」はＩＴＲの供給源を示し、「ｙ」はカプシドの血清型を示し、例えば、２／５ｒＡＡＶ粒子はＡＡＶ２からのＩＴＲ及びＡＡＶ５からのカプシドを有する。

改変「ＡＡＶ」配列も、例えば、昆虫細胞におけるｒＡＡＶベクターの産生のために、本発明の文脈において使用することができる。このような改変配列は、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、又はＡＡＶ９ ＩＴＲ、Ｒｅｐ、又はＶＰに対して、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又はそれを超えるヌクレオチド及び／又はアミノ酸配列同一性を有する配列（例えば、約７５％〜約９９％のヌクレオチド配列同一性を有する配列）を含み、野生型ＡＡＶ ＩＴＲ、Ｒｅｐ、又はＶＰ配列の代わりに使用することができる。

ＡＡＶ５は、多くの点で他のＡＡＶ血清型に類似するものの、他のヒト及びサルのＡＡＶ血清型とは、他の知られているヒト及びサルの血清型よりも大きく異なる。それを考慮すると、昆虫細胞においてｒＡＡＶ５の産生は他の血清型の産生と異なり得る。本発明の方法をｒＡＡＶ５の産生に用いる場合、１つ又は複数の構築物が（複数の構築物の場合は集合的に）、ＡＡＶ５ ＩＴＲを含むヌクレオチド配列、ＡＡＶ５ Ｒｅｐコード配列を含むヌクレオチド配列（すなわち、ＡＡＶ５ Ｒｅｐ７８を含むヌクレオチド配列）、及び／又はＡＡＶ５ Ｃａｐコード配列を含むことが好ましい。このようなＩＴＲ、Ｒｅｐ、及びＣａｐ配列は、昆虫細胞におけるｒＡＡＶ５又はシュードタイピングされたｒＡＡＶ５ベクターの効率的な産生を得るために所望に応じて改変され得る。例えば、国際公開第２００７／０４６７０３号、国際公開第２００７／１４８９７１号、及び／又は国際公開第２００９／０１４４４５号に開示されているように、例えば、Ｒｅｐ配列の開始コドンを改変することができ、ＶＰスプライス部位を改変若しくは除去することができ、及び／又はＶＰ１開始コドンを改変して昆虫細胞におけるｒＡＡＶ５ベクターの産生を改善することができる。キメラＡＡＶ５カプシドであって、例えば、ＡＡＶ５のＶＰ１は、ＡＡＶ２に由来するＶＰ１によって部分的又は完全に置換されており、ＶＰ２及び３はＡＡＶ５に由来する、キメラＡＡＶ５カプシドも本発明に含まれる（Ｕｒａｂｅ ｅｔ ａｌ．， ２００６； ＷＯ２０００／０２８００４）。このようなキメラＡＡＶ５カプシドでは、少なくともＶＰ３はＡＡＶ５であるか又はＡＡＶ５に由来するべきであるが、ＶＰ１及びＶＰ２の一方又は両方は異なるＡＡＶ血清型であるか又は異なるＡＡＶ血清型に由来し得る。

好ましいアデノウイルスのベクターは、Ｒｕｓｓｅｌｌ（２０００， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ８１：２５７３−２６０４）によって概説されているように、又は米国特許出願公開第２００８０００８６９０号、並びにＺａｌｄｕｍｂｉｄｅ及びＨｏｅｂｅｎ（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２００８：２３９−２４６）によって記載されているように、宿主の応答を低減するように改変される。

配列番号５の核酸配列を有するＲｅｐ７８タンパク質、及び／又は配列番号６によるアミノ酸配列を本発明において使用し、配列番号７の核酸配列を有するＲｅｐ５２タンパク質を本発明において使用することが好ましい。

「髄腔内」投与は、髄腔内注射、すなわち脳脊髄軸の任意のレベルでの脳脊髄液内への投与を意味するのに使用され、脳室中への注射を含む（“Ｒｏｕｔｅ ｏｆ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ”． Ｄａｔａ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｍａｎｕａｌ． Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ（２０１１年３月１１日検索）も参照されたい）。これは、注射がＣＳＦに到達するように、脊髄の髄膜（ｔｈｅｃａ）を介したくも膜下腔中への注射である。この投与方法は、例えば、脊髄麻酔、化学療法、又は疼痛マネージメントの応用に有用である。この経路は、特に神経外科手術後の、ある種の感染症と戦う薬物を導入するのにも用いられる。髄腔内注射を介して投与する物質は、血液脳関門を通過する必要性を回避する。髄腔内に投与する薬物は、しばしば、静脈内注射用の医薬に時折見出される保存剤又は他の潜在的に有害な非活性成分を一切含まない。中枢神経系（ＣＮＳ）中への注入は複雑な脳手術を必要とするため、髄腔内の送達方法は、ＣＮＳ組織自体に注入するよりも侵襲性が低いと考えられている。髄腔内送達は、脳注射に特化したセンターを必要とせずに行うことができる。

脊椎の首領域は頸椎として知られている。この領域は７個の椎骨からなり、７個の椎骨はＣ１からＣ７（上から下へ）と略記される。これらの椎骨は脳幹及び脊髄を保護し、頭蓋を支え、頭部の広範囲の運動を可能にする。第一頸椎（Ｃ１）は環椎と呼ばれる。環椎は環状であり、頭蓋を支える。Ｃ２は軸椎と呼ばれる。軸椎の形状は輪状であり、上方に環椎に突出する鈍い歯様構造である（歯突起又は歯状突起と呼ばれる）。環椎及び軸椎は一緒になって、頭部の回旋及び回転を可能にする。他の頸椎（Ｃ３からＣ７）は、椎骨の背部から伸長する小型の棘突起（指様突出）のある箱様の形状である。最終の頸椎の真下には、椎骨１２個の胸椎がある。胸椎はＴ１からＴ１２（上から下）と略記される。Ｔ１は最小でＴ１２は最大の胸椎である。胸椎は、頸部の骨よりも大きく、棘突起が長い。棘突起が長いことに加えて、肋骨が付着していることで胸椎に強さが加わる。これらの構造により、胸椎は、頸部又は腰部の領域よりも安定になる。加えて、胸郭及び靭帯系は胸椎の運動範囲を制限し、多くの重要な器官を保護する。腰椎は、Ｌ１からＬ５（最大）と略記される椎骨を５個有する。各腰椎のサイズ及び形状は、体重の大部分を運搬するようにデザインされている。腰椎の各構造エレメントは、頸部及び胸部領域の同様の構成成分よりも大きく、広く、幅広い。腰椎は胸椎よりも運動範囲が大きいが、頸椎よりも小さい。腰部の椎間関節のため著しい屈曲及び進展の運動が可能になるが、回旋は制限される。仙骨は骨盤の背後に位置する。Ｓ１からＳ５と略記される５個の骨が三角形の形状に融合され、仙骨を形成する。仙骨は、脊椎を骨盤に接続する２個の寛骨間に嵌っている。最後の腰椎（Ｌ５）は仙骨とともに関節をなす（動く）。仙骨のすぐ下に５個のさらなる骨があり、一緒に融合して尾骨（テイルボーン）を形成する。

本発明の好ましい一実施形態において、遺伝子治療ベクターは腰椎投与により投与される。腰部髄腔内投与は、Ｌ４〜Ｌ５、Ｌ３〜Ｌ４、Ｌ１〜Ｌ２、及びＬ２〜Ｌ３からなる群から選択される位置におけるものであることがより好ましい。遺伝子治療ベクターは、Ｌ４とＬ５との間の髄腔内注射により投与されることが最も好ましい。好ましい一実施形態において、遺伝子治療ベクターは腰椎投与によってのみ投与される、すなわち他の部位における投与はない。

代替的に、又は本発明の前述の好ましい一実施形態と組み合わせて、本発明の好ましい一実施形態において、遺伝子治療ベクターは大槽中に投与される。好ましい一実施形態において、遺伝子治療ベクターは大槽中にのみ投与され、すなわち他の位置に対しては投与されない。大槽中への投与を、髄腔内投与と組み合わせて、又は換言すると、髄腔内投与の前に、同時に、又は後に行うことがより好ましい。

別の好ましい一実施形態において、大槽中への投与を腰椎投与と組み合わせて行い、それによって大槽中への投与を、腰椎投与の前に、同時に、又は後に行うことが好ましい。この実施形態において、腰椎投与が髄腔内領域であることが好ましい。

最も好ましい一実施形態において、遺伝子治療ベクターは、大槽中にのみ、腰椎投与と組み合わせて投与され、すなわち大槽及び腰椎以外の位置の投与はない。この実施形態において、腰椎投与が髄腔内領域であることが好ましい。

「大槽」又は「小脳延髄槽」は、脳の周囲の髄膜の、くも膜と軟膜層との間のくも膜下腔における３つの主な開口の１つである。開口は、集合的に槽と呼ばれる。大槽は、小脳と延髄の背側表面との間に位置する。第四脳室で生じる脳脊髄液は、外側口及び正中口を通じて大槽中に排出される。

本明細書で使用される、併用投与、又は髄腔内投与の「前、同時、又は後」の投与は、大槽及び髄腔内投与中への投与が、好ましくは２週間未満、１週間、４日、４８時間、２４時間、１２時間、６時間、４時間、２時間、１時間、３０分、２０分、１０分、又は５分の時間間隔以内になされることを意味する。

組換えＡＡＶベクターは一本鎖ＤＮＡ又は二本鎖ＤＮＡのいずれも有し得る。一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）のＡＡＶゲノムは、コードされた導入遺伝子の発現前に二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）に変換されなければならない。このステップは、自己相補的ベクター又はモノマーの二本鎖ベクターの使用により回避することができるが、モノマーの二本鎖ベクターは、ＤＮＡ合成又は複数のベクターゲノム間の塩基対形成を必要とせずにｄｓＤＮＡにフォールディングされる逆方向反復ベクターゲノムをパッケージングしており、それによりＡＡＶ媒介性遺伝子移入の効率が増大する。自己相補的ＡＡＶベクターの概説には、例えば、ＭｃＣａｒｔｙ， Ｄ．Ｍ． Ｍｏｌｅｃ． Ｔｈｅｒ． （２００８） １６：１６４８−１６５６を参照されたい。いわゆる自己相補的ＡＡＶベクター（ＷＯ２００１／０９２５５１）は、好ましくは末端分離部位（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｓｉｔｅ）（ｔｒｓ）の欠失により改変されている、少なくとも１つの改変ＩＴＲを含み、インタクトなＡＡＶ ＩＴＲのみを用いて作製することが可能になっているモノマーの二本鎖ＡＡＶベクター（ＷＯ２０１１／１２２９５０）とは概念的に異なる。好ましい一実施形態において、自己相補的ＡＡＶベクターは本発明の範囲内に入らない。対照的に、上述のモノマーの二本鎖ベクターは、自己相補的ベクターと配列が異なり、インタクトなＩＴＲ配列の他に、ＡＡＶベクターの野生型のサイズ（すなわち４．８ｋｂ）の半分のサイズ（１／２）又はそれ未満であるベクターゲノムに関わるため、本発明において有利に使用することができる。これは、多重の反復（発現単位の２、４、８、又はそれを超えた倍数のコンカテマー）をＡＡＶベクターにおいて構築し、モノマー（ｍｏｎｏ）、デュプロマー（ｄｕｐｌｏ）、クアドロマー（ｑｕａｄｒｏｍｅｒｉｃ）の二本鎖ベクターを生じることができるという利点を有する。このようなベクターにおける発現単位の一例は、ｓｈＲＮＡ又はｍｉＲＮＡを含むベクターであり得る。本発明では、脳組織への広範な形質導入を、一本鎖ＡＡＶ遺伝子治療ベクターを使用して腰椎注射後に得ることができることが示されている。したがって、ＡＡＶ遺伝子治療ベクターが一本鎖ＡＡＶ遺伝子治療ベクターであることは本発明の好ましい一実施形態である。

本発明のＡＡＶ遺伝子治療ベクターは、腰部髄腔内投与後に中枢神経系の広範な領域にわたって形質導入を実現する。ユビキタスなプロモーター（ＣＡＧプロモーター）を用いて、神経細胞及びグリア細胞の両方が、皮質、小脳、及び脳室下帯において形質導入された。加えて、脊髄では、運動ニューロンへの形質導入及び後根神経節におけるニューロンへの形質導入が優勢であった。したがって、本発明の処置方法はいくつかのＣＮＳ障害の処置において使用することができる。好ましい一実施形態において、本発明によるＡＡＶ遺伝子治療ベクターは、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、疼痛、リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）、ハンチントン病、アルツハイマー病、テイ−セイズ病、フリードライヒ失調症、毛細血管拡張性運動失調症、脊髄小脳失調症１型、２型、及び３型、ニーマン・ピック病Ａ型、Ｂ型、及びＣ型、ドーパ反応性ジストニア、脆弱Ｘ染色体症候群、クラッベ病、糖原病２型（ポンペ）、原発性側索硬化症、ペリツェウス−メルツバッハー病、Ｘ連鎖性副腎白質ジストロフィー、巨大軸索ニューロパチー、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、近位型筋緊張性ミオパチー、神経セロイドリポフスチン症（バッテン病）、及び種々の形態のＣＮＳの癌、例えば、原発性ＣＮＳリンパ腫、転移又は二次性脳腫瘍、原発性脊髄腫瘍からなる群から選択される状態の処置又は予防において使用することができる目的遺伝子産物を含む。ＣＮＳの癌には、例えば、グリオブラストーマ、アストロサイトーマ、オリゴデンドログリオーマ、上衣細胞腫、髄膜腫、髄芽腫、神経節膠腫、シュワン細胞腫、頭蓋咽頭腫、脊索腫、非ホジキンＣＮＳリンパ腫が含まれる。

リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）として知られる一群の代謝障害には、４０を超える遺伝障害が含まれ、その多くは種々のリソソームの加水分解酵素における遺伝的欠陥を伴う。代表的なリソソーム蓄積症及び関連の欠陥のある酵素を表１に列挙する。

表１：

別の好ましい一実施形態において、目的遺伝子産物は、運動ニューロン及び／又はＤＲＧにおけるニューロンに関連する状態の処置又は予防における使用のためのものである。これらの疾患には、それだけには限定されないが、疼痛、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、原発性側索硬化症（ＰＬＳ）、進行性筋萎縮（ＰＭＡ）、進行性球麻痺（ＰＢＰ）、及び仮性球麻痺が含まれる。

特に好ましい一実施形態において、本発明によるＡＡＶ遺伝子治療ベクターは、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、ハンチントン病、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、並びにファブリー病、小児型バッテン病（ＣＮＬ３）、ゴーシェ病１型、２型、及び３型、ハンター症候群、ポンペ病、サンフィリッポ症候群Ａ型及びサンフィリッポ症候群Ｂ型からなる群から選択されるリソソーム蓄積症からなる群から選択される状態の処置又は予防において使用することができる目的遺伝子産物を含む。

したがって、好ましい一実施形態において、目的遺伝子産物は、アスパルチルグルコサミニダーゼ、α−ガラクトシダーゼＡ、パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ、トリペプチジルペプチダーゼ、リソソーム膜貫通タンパク質、複数の遺伝子産物、システイントランスポーター、酸性セラミダーゼ、酸性α−Ｌ−フコシダーゼ、保護タンパク質／カテプシンＡ、酸性β−グルコシダーゼ又はグルコセレブロシダーゼ、酸性β−ガラクトシダーゼ、イズロン酸−２−スルファターゼ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、ガラクトセレブロシダーゼ、酸性α−マンノシダーゼ、酸性β−マンノシダーゼ、アリールスルファターゼＢ、アリールスルファターゼＡ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−硫酸スルファターゼ、酸性β−ガラクトシダーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−ホスホトランスフェラーゼ、酸性スフィンゴミエリナーゼ、ＮＰＣ−１、酸性α−グルコシダーゼ、β−ヘキソサミニダーゼＢ、ヘパランＮ−スルファターゼ、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、アセチル−ＣｏＡ：α−グルコサミニドＮ−アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−硫酸スルファターゼ、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、α−ノイラミダーゼ、β−グルクロニダーゼ、β−ヘキソサミニダーゼＡ、酸性リパーゼ、神経栄養因子、例えば、神経成長因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、ニューロトロフィン−４／５（ＮＴ−４／５）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、脳ドーパミン神経栄養因子（ＣＤＮＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、繊毛様神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、及び成長因子インスリン様成長因子（ＩＧＦ−１）からなる群から選択される。さらに、ｍｉＲＮＡ配列が、例えばハンチントン病の処置などにおいて、ある特定の遺伝子の発現をダウンレギュレートするために使用されてもよい。

本明細書で言及される疾患の大部分は、ハンチントン病を除いて、とりわけ欠陥のある遺伝子の修正バージョンの提供によって処置することができる。しかし、ハンチントン病は、ある特定の遺伝子、すなわちヒトでは第４染色体上に位置するハンチントン遺伝子（ＨＴＴ、ＨＤ、及びＩＴ１５としても知られる。）のダウンレギュレーションを必要とする。ハンチントン病に罹患している対象は、遺伝子の５’終端に、３６個を超えるトリヌクレオチドＣＡＧ反復を有するＨＴＴ遺伝子を保有する。ＲＮＡｉベースのハンチントン病治療法を開発するためのアプローチには、例えばエクソン１を標的化することによる、ＨＴＴ全体の（変異型及び野生型両方の遺伝子の）ノックダウンが含まれる。他のアプローチは、例えば、ＨＴＴエクソン１におけるＣＡＧ反復を標的化することによる、変異ＨＴＴのみに対するアレル特異的サイレンシング、及び例えばエクソン６７におけるＳＮＰを標的化することによる、変異ＨＴＴ発現に対するアレル特異的阻害である。

好ましい一実施形態において、目的遺伝子産物は、目的遺伝子産物が治療効果を得るのに十分な発現を生じさせるプロモーターを含む発現制御エレメントに作動可能に連結している。真核細胞における導入遺伝子発現のレベルは、導入遺伝子の発現カセット内の転写プロモーターによってほぼ決定される。長期の活性を示し、組織特異的及び細胞特異的でさえあるプロモーターがいくつかの実施形態において使用される。プロモーターの非限定的な例には、それだけには限定されないが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（Ｋａｐｌｉｔｔ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ．， ８：１４８−１６４）、ＣＭＶ／ヒトβ３−グロビンプロモーター（Ｍａｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．， １８：４２７１−４２８４）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、ＣＡＧプロモーター（サイトメガロウイルス初期エンハンサーエレメント及びニワトリベータ−アクチンプロモーターの組合せ）（Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ． （２００８） Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １６（１）：８９−９６； Ｓｈｅｖｔｓｏｖａ ｅｔ ａｌ． （２００４） Ｅｘｐ Ｐｈｙｓｉｏｌ ９０：５３−５９）、ＧＦＡＰプロモーター（Ｘｕ ｅｔ ａｌ． （２００１） Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．， ８：１３２３−１３３２； Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ． （２００８） Ｇｌｉａ ５６：４８１−４９３）、シナプシン−１プロモーター（Ｋｕｅｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ． （２００１） Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １７：７８−９６； Ｄｒｉｎｋｕｔ ｅｔ ａｌ． （２０１２） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０：５３４−５４３）、１．８−ｋｂニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター（Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｅｘｐ． Ｎｅｕｒｏｌ．， １５０：１８３−１９４）、ニワトリベータアクチン（ＣＢＡ）プロモーター（Ｍｉｙａｚａｋｉ （１９８９） Ｇｅｎｅ， ７９：２６９−２７７）、並びにβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）プロモーター（Ｓｈｉｐｌｅｙ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， １０：１００９−１０１８）が含まれる。発現を延長するために、他の調節エレメントが、例えばＷｏｏｄｃｈｕｃｋ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ Ｐｏｓｔ−Ｒｅｇｕｌａｂｏｒｙ Ｅｌｅｍｅｎｔ （ＷＰＲＥ）（Ｄｏｎｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ７２， ５０８５−５０９２）などの導入遺伝子に又はウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化部位にさらに作動可動に連結され得る。Ｄｒｉｎｋｕｔらは、グリアの（ＧＦＡＰ）プロモーターを応用してＧＤＮＦを発現させ、ニューロン特異的プロモーターからこれを発現させるより有益であったことを示した（Ｄｒｉｎｋｕｔ ｅｔ ａｌ．， ２０１２（上述））。代替的に、又は特異的プロモーターの使用に加えて、例えばＧｅｎｅ Ｓｗｉｔｃｈシステム（Ｍａｄｄａｌｅｎａ ｅｔ ａｌ． （２０１３） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ − Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ２：ｅ１０６）又はテトラサイクリンオペロンの誘導体（Ｇｏｓｓｅｎ ａｎｄ Ｂｕｊａｒｄ （１９９２） ＰＮＡＳ ８９：５５４７−５５５１）などの調節可能な発現エレメントを使用して、調節された発現を実現することができる。

本発明の好ましい一実施形態において、ＡＡＶ遺伝子治療ベクターは、ＡＡＶ５カプシドタンパク質、ＡＡＶ２ ＩＴＲ、及びＩＴＲ間に位置する目的遺伝子産物を含む。遺伝子治療ベクターは、腰椎注射により、おそらくは大槽中への注射と組み合わせて投与されることが好ましい。好ましい遺伝子産物、及びこの好ましいＡＡＶ遺伝子治療ベクターを用いて（処置又は予防のいずれかとして）処置される疾患は、ＡＬＳの処置のためのＧＤＮＦ又はＩＧＦ−１、ＳＭＡの処置のためのＧＤＮＦ又はＩＧＦ−１、ＳＭＡの処置のための不完全な脊髄運動ニューロン生存タンパク質（ＳＭＮ）遺伝子のダウンレギュレーションのためのｍｉＲＮＡ、ハンチントン病の処置のためにアレル特異的ダウンレギュレーション又はＨＴＴの両方のアレルのダウンレギュレーションを実現するｍｉＲＮＡ、ハンチントン病の処置のためのＧＤＮＦ、ＭＳＡの処置のためのＧＤＮＦ、ファブリー病の処置のためのα−ガラクトシダーゼＡ、小児型バッテン病（ＣＮＬ３）の処置のためのリソソーム膜貫通タンパク質、ゴーシェ病１型、２型、及び３型の処置のための酸性β−グルコシダーゼ又はグルコセレブロシダーゼ、ハンター症候群の処置のためのイズロン酸−２−スルファターゼ、ポンペ病の処置のための酸性α−グルコシダーゼ、サンフィリッポ症候群Ａ型の処置のためのヘパランＮ−スルファターゼ、及びサンフィリッポ症候群Ｂ型の処置のためのα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼからなる群から選択される。

治療有効量のＡＡＶ遺伝子治療ベクター又は本発明の医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することができる。

本発明のＡＡＶ遺伝子治療ベクターは、任意選択により、製薬上の担体、希釈剤、及び／又はアジュバントと組み合わせて、医薬組成物に含まれるのが典型的である。このような組成物には、所望の治療又は予防効果を提供するのに十分な有効量の核酸、核酸構築物、パルボウイルスのビリオン、又は医薬組成物、並びに薬学的に許容される担体又は賦形剤が含まれる。「有効量」には治療有効量又は予防有効量が含まれる。

「治療有効量」は、必要とされる用量及び期間で、障害の症状の向上など、所望の治療結果を実現するのに有効な量を意味する。核酸、核酸構築物、パルボウイルスのビリオン、又は医薬組成物の治療有効量は、個体の疾患状態、年齢、性別、及び体重；並びに核酸、核酸構築物、パルボウイルスのビリオン、又は医薬組成物が個体における所望の応答を誘発する能力などの要因によって変動し得る。用量レジメンを、最適の治療応答をもたらすように調整してもよい。治療有効量は、典型的に、核酸、核酸構築物、パルボウイルスのビリオン、又は医薬組成物の任意の毒性又は有害効果に治療上有益な効果が上回る量でもある。

「予防有効量」は、必要とされる用量及び期間で、種々の状態の防止又は阻害など、所望の予防結果を実現するのに有効な量を意味する。予防用量は疾患の前又は初期段階に対象に使用することができ、予防有効量は、場合により治療有効量より多くても又は少なくてもよい。

特定の実施形態において、ＡＡＶ遺伝子治療ベクター又は医薬組成物の治療又は予防有効量に対する範囲は、１×１０^１３〜１×１０^１６ゲノムコピー（ｇｃ）／ｋｇ、好ましくは２×１０^１３〜２×１０^１５、より好ましくは８×１０^１３〜６×１０^１４、さらに好ましくは約２×１０^１４ｇｃ／ｋｇ対象の体重であってもよい。用量の値は、軽減しようとする状態の重症度で変動し得ることに留意されたい。任意の特定の対象では、特定の用量レジメンを、個々の必要性、及び組成物を投与し、又は投与を監督する者の専門的な判断に従って経時的に調整してもよい。本明細書に記載する用量範囲は例示にすぎず、医療従事者が選択することができる用量範囲を制限するものではない。

ヒトの小児のＣＳＦ中に注入するための体積は約２０ｃｃ未満であり、ヒト成人では約３０ｃｃ未満であることが好ましい。非ヒト霊長動物では、６ｃｃを合計体積２０〜２５ｃｃのＣＳＦ中に安全に送達することができる。あるいは、注入しようとする体積の少なくとも半分を吸引し、本発明の遺伝子治療ベクターで置き換えて、最大約５０％の体積の置換に到達させる。

加えて、本発明のＡＡＶ遺伝子治療ベクターを、それだけには限定されないが、密度勾配遠心（例えば、ＣｓＣｌ、イオジキサノール）、透析、超遠心、イオン交換（ＩＥＸ）クロマトグラフィー（例えば、陰イオン、陽イオン）、ゲルろ過、アフィニティクロマトグラフィー、タンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）、スピンフィルターカラム（例えば、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）を含む、当技術分野では知られている標準方法によって濃縮された形態において投与することができる。また、例えば国際公開第２０１３／０３６１１８号に記載されているものなど、外来ウイルス又はヘルパーウイルスの除去を応用して、本発明において使用するＡＡＶ遺伝子治療ベクターの質を改善することができる。

本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」又は「賦形剤」には、生理学的に適合性である、あらゆる溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などが含まれる。薬学的に許容される担体には、無菌の水溶液又は分散物、及び無菌の注射用溶液又は分散物を即時調製するための無菌の粉末が含まれる。薬学的に活性な物質に対するこのような媒体及び薬剤の使用は当技術分野においてよく知られている。任意の従来の媒体又は薬剤が、有効成分及び／又は注射部位と不適合性ではない限り、本発明の医薬組成物におけるその使用が企図される。

また、補足の有効化合物が本発明の医薬組成物中に組み入れられてもよい。さらなる治療薬の同時投与に対する指導は、例えば、Ｃａｎａｄｉａｎ Ｐｈａｒｍａｃｉｓｔｓ ＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎのＣｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｓｐｅｃｉａｌｔｉｅｓ（ＣＰＳ）に見出すことができる。

例えば、Ｖｕｌｃｈａｎｏｖａ（２０１０ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｉｎ ６：３１）により示されているように、直接腰椎穿刺によるウイルスベクター投与では脊髄及びＤＲＧニューロンへの形質導入が認められないことが報告されている。したがって、Ｖｕｌｃｈａｎｏｖａらは、脊髄実質及びＤＲＧニューロンの細胞体に対するＡＡＶ５及びＡＡＶ８ベクターの浸透を増強するために、マンニトールによる前処置を推奨している。特に、脊髄においてレポーター遺伝子である緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現を得、サブセットのＤＲＧニューロンを選択するために、１ｋｇ当たり約４×１０^１２ベクターゲノムの用量のＡＡＶベクターをマウスに腰椎注射するには、ベクターを腰部髄腔内投与する前にマンニトールにより静脈内前処置することが必要とされる。

マンニトールによる前処置には、マンニトールが副作用を引き起こすことが知られているという欠点がある。特に、マンニトールの注入の間又は後に、より一般的に報告されている有害反応には、肺うっ血、液体及び電解質の平衡異常、アシドーシス、電解質喪失、口の渇き、口渇、顕著な多尿、尿閉、浮腫、頭痛、視朦、痙攣、悪心、嘔吐、鼻炎、腕痛、皮膚の壊死、血栓性静脈炎、悪寒、眩暈、蕁麻疹、脱水、低血圧、頻脈、発熱、及び狭心症様の胸痛が含まれる（Ｍａｎｎｉｔｏｌ ＩＶ ＦＤＡ Ｐｒｅｓｃｒｉｂｉｎｇ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）。

本発明の好ましい一実施形態において、対象は、ＡＡＶ遺伝子治療ベクターの投与前に前処置を受けていない。特に、対象は、頭蓋内圧を制御する、及び／又はＣＮＳ微小血管の内皮細胞間の細胞間タイトジャンクションを破壊し得る、及び／又は化学療法薬などの薬物のＣＮＳへの送達を促進する物質による前処置を受けていない。より好ましくは、対象は、ＡＡＶ遺伝子治療ベクターの投与前に浸透圧性薬剤による前処置を受けていない。浸透圧性薬剤には、それだけには限定されないが、尿素、グリセリン、糖、又は糖アルコール、例えば、マンニトールなどの多価アルコール、及び高張食塩水が含まれる。特に、対象は、ＡＡＶ遺伝子治療ベクターの腰部髄腔内投与前に静脈内マンニトール前処置などのマンニトールによる前処置を受けていない。

本発明の好ましい一実施形態において、哺乳動物対象には、それだけには限定されないが、マウス、ラット、サル、家畜、狩猟動物（ｓｐｏｒｔ ａｎｉｍａｌ）、ペット、及びヒトが含まれる。哺乳動物対象はヒトであることがより好ましい。

追加的な一態様において、本開示は、昆虫細胞において組換えパルボウイルス（例えばｒＡＡＶ）ビリオン（上で規定された組換えパルボウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを含む。）を産生させるための方法に関する。好ましくは、この方法は、（ａ）本明細書で規定される昆虫細胞を、組換えパルボウイルス（例えばｒＡＡＶ）ベクターが産生されるような条件下で培養するステップと、（ｂ）組換えパルボウイルス（例えばｒＡＡＶ）ベクターを回収するステップと、を含む。ここで、本方法で産生された組換えパルボウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターは、組換えパルボウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターの核酸を含む感染性のパルボウイルス又はＡＡＶのビリオンであることが好ましいことが理解される。培養中の昆虫細胞の増殖条件及び培養中の昆虫細胞における異種産物の産生は、当技術分野においてよく知られており、例えば、昆虫細胞の分子操作に対する上で引用した参考文献に記載されている。本発明のｒＡＡＶビリオンの作製のための好ましい方法及び構築物は、例えば、国際公開第２００７／０４６７０３号及び国際公開第２００７／１４８９７１号に開示されている。

組換えパルボウイルスビリオンを作製するための方法は、抗ＡＡＶ抗体、好ましくは固定化抗体を使用した組換えパルボウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター（を含むビリオン）のアフィニティ精製のステップをさらに含むことが好ましい。抗ＡＡＶ抗体はモノクローナル抗体であることが好ましい。特に適切な抗体は、例えば、ラクダ又はラマから入手できる、ラクダの単鎖抗体又はそのフラグメントである（例えば、Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ， ２００１， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ７４：２７７−３０２を参照されたい）。ｒＡＡＶをアフィニティ精製するための抗体は、ＡＡＶカプシドタンパク質上のエピトープに特異的に結合する抗体であるのが好ましく、それによってエピトープが１つを超えるＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質上に存在するエピトープであることが好ましい。例えば、抗体は、ＡＡＶ２カプシドに対する特異的な結合に基づいて作製又は選択してもよいが、同時に、抗体はＡＡＶ１、ＡＡＶ３、及びＡＡＶ５カプシドにも特異的に結合し得る。

本明細書及び請求項において、「含む」の動詞及びその活用形は、非限定的な意味で使用され、この語の前に記載される事項が含まれるが、特に言及されない事項は除外されないことを意味する。加えて、不定冠詞（“ａ”又は“ａｎ”）による要素への言及は、１つ及びたった１つの要素が存在することが文脈上明らかでない限り、１つを超える要素が存在する可能性を排除するものではない。よって、不定冠詞（“ａ”又は“ａｎ”）は「少なくとも１つ」を通常意味する。

本明細書に列挙する特許及び参考文献はすべて、参照によりその全体が本明細書に援用される。

以下の実施例は説明目的のみで提供するものであり、本発明の範囲を限定しようとするものではない。

図１（Ｆｉｇ．１）： ＡＡＶベクターのゲノムの模式図。ＧＯＩ（目的遺伝子（ｇｅｎｅ ｏｆ ｉｎｔｅｒｅｓｔ）又は目的遺伝子産物（ｇｅｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ ｉｎｔｅｒｅｓｔ））をコードする発現カセットはＣＡＧプロモーターの制御下にあり、Ｋｏｚａｋ配列（ｇｃｃａｃｃａｔｇ．．．）が先行し、ＢＧＨポリアデニル化シグナルによりポリアデニル化される。本実施例では、ＧＯＩは緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である。このカセットは２つの非コードＩＴＲ配列に隣接する。産生のための組換えバキュロウイルスを使用して、発現カセットをＡＡＶ−５カプシド中にパッケージングする。 図２（Ｆｉｇ．２）： 脳への形質導入の概要。代表的な切片Ａ〜Ｅを脳から取り、ＧＦＰに対して染色する。脳にわたって発現を観察する。 図３（Ｆｉｇ．３）： 高倍率の頭頂皮質。ニューロン及びグリア両方への形質導入を数層の深さに観察することができる。 図４（Ｆｉｇ．４）： 高倍率の後頭皮質。ニューロン及びグリア両方への形質導入を数層の深さに観察することができる。 図５（Ｆｉｇ．５）： 高倍率の小脳。多くの細胞がＧＦＰに陽性である。 図６（Ｆｉｇ．６）： 頸髄への形質導入。灰白質で終結する感覚線維、及び上行線維をドットとして見ることができる（ａ）。さらに、運動ニューロンのプールから出るＧＦＰ陽性の運動ニューロン線維（ｂ）を観察することができる（ｃ）。（ｄ）では、いくつかのグリア細胞もＧＦＰに陽性に染色されている。 図７（Ｆｉｇ．７）： 胸髄への形質導入。上行性の感覚線維を背側のカラム（ａ）に見ることができる。さらに、運動ニューロンのプールから出たＧＦＰ陽性の運動ニューロン線維（ｂ）を観察することができる（ｃ）。（ｄ）では、下行性又は上行性両方であり得るいくつかの線維が観察される。 図８（Ｆｉｇ．８）： 腰髄への形質導入。灰白質で終結する感覚線維が見える（ａ）。さらに、運動ニューロンのプールにおけるＧＦＰ陽性の運動ニューロンが脊髄の背側外側部分に存在する。これらの運動ニューロンは、その線維を、脊髄の腹側部を通じて前根中に突出する（ｄ）。 図９（Ｆｉｇ．９）： ヘマトキシリンで対比染色した、ＤＲＧのＧＦＰ染色切片。脊髄に沿って後根神経節への形質導入を見ることができる。頸部（Ａ、Ｂ）、胸部（Ｃ、Ｄ）、及び腰部（Ｅ、Ｆ）レベルのＤＲＧが形質導入される。高倍率では（右の写真、Ｂ、Ｄ、Ｆ）、後根における線維がＧＦＰの発現のために視認できる。ほとんどすべてのＤＲＧニューロンが形質導入されている。 図１０（Ｆｉｇ．１０）： ＧＦＰ及びニューロンのマーカーであるＮｅｕＮに対する小脳の二重染色。バーグマングリア細胞（Ｂｃ）はＧＦＰ発現を示し、その形態に基づいてプルキンエ細胞（Ｐｃ）も観察することができる。 図１１（Ｆｉｇ．１１）： ＧＦＰ及びＮｅｕＮに対する皮質の二重染色。矢じりは、皮質においてＧＦＰを発現するニューロンを指している。 図１２（Ｆｉｇ．１２）： ＧＦＰ及びアストロサイトのマーカーであるＧＦＡＰに対する皮質の二重染色。矢印は、ＧＦＰを発現するアストロサイトを指している。矢じりは、ニューロンに特有である細胞を指している。 図１３（Ｆｉｇ．１３）： 脳及び小脳の切片のヘマトキシリンエオシン染色。左上は小脳の外観である。右上は高倍率の小脳の分子層である。見事に整列しているのは、大型の丸型ニューロンである（挿入図も参照されたい）プルキンエ細胞である。全体的に、明らかな浸潤又は不規則さは観察されず、処置は耐容性が良好であることが示される。 図１４（Ｆｉｇ．１４）： 前角に大型ニューロンの導入遺伝子が存在することによって腰髄における運動ニューロンの用量依存的形質導入を示す、腰髄のＧＦＰ染色切片。５Ｅ１３（Ａ）、５Ｅ１４（Ｃ）、又は８Ｅ１４（Ｅ）ゲノムコピー（ＧＣ）を動物のＣＳＦ中に注入した。運動ニューロンが位置する前角については、高倍率の像を示す（Ｂ、Ｄ、及びＦ）。

実施例１：
本実施例では、ＣＡＧプロモーターの制御下で緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするＡＡＶ−５ベクターを、非ヒト霊長動物のＣＳＦ中に髄腔内注入した。注入４週間後、導入遺伝子の発現を調べた。ＧＦＰの発現が、運動ニューロン及び後根神経節（ＤＲＧ）に、すべての脊髄レベルで観察された。さらに、小脳では、多くのバーグマングリア、及びいくつかのプルキンエ細胞が形質導入された。脳では、皮質も、ニューロン及びグリアの両方でＧＦＰを発現した。脳室下帯（ＳＶＺ）に沿った細胞も形質導入された。全体的に、これらの結果は、この注射経路を用いると、ＣＮＳの広範な領域が網羅され、ＣＮＳに対する遺伝子治療が現実的な選択肢になることを示す。

１．１． 材料と方法
１．１．１． ベクターの調製
ｒＡＡＶ血清型５（ｒＡＡＶ−５）の発現カセットは、ヒトのｃＤＮＡ、増強された緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）のｃＤＮＡ遺伝子を含む。発現は、ＣＡＧプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサーエレメント及びニワトリベータ−アクチンプロモーターの組合せの制御下にある。ＧＦＰは、Ｋｏｚａｋ配列の下流に位置し、またウシ成長ホルモンポリアデニル化（ＢＧＨｐＡ）シグナルによってポリアデニル化される。カセット全体が、ＡＡＶ−２の２つの非コード末端逆位配列に隣接する（図１を参照されたい）。先に記載したものと同様のバキュロウイルス発現系を使用して、組換えＡＡＶ−５ベクターを調製した（Ｕｒａｂｅ ｅｔ ａｌ．， ２００２， Ｕｎｚｕ ｅｔ ａｌ．， ２０１１（Ｋｏｔｉｎ， ２０１１において概説））。簡潔に述べると、１つは複製及びパッケージング用にＲＥＰをコードし、１つはＡＡＶ−５のカプシド用にＣＡＰ−５をコードし、１つは発現カセットを有する、３つの組換えバキュロウイルスを使用して、ＳＦ９昆虫細胞に感染させた。ＡＶＢセファロース高速アフィニティーメディア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用して精製を行った。導入遺伝子に対するプライマー−プローブの組合せでＱ−ＰＣＲ法を用いてベクターを滴定し、力価を、１ｍｌ当たりのゲノムコピーとして表した（ＧＣ／ｍｌ）。ベクターの力価は１．４Ｅ１４ＧＣ／ｍｌであった。

１．１．２． 動物及び組織の収集
本研究では、およそ４ｋｇの雄カニクイザル（Ｃｙｎｏｌｍｏｌｇｕｓ ｍｏｎｋｅｙ）（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）を使用した。動物愛護を評価するために、毎日の健康観察及び周期的な体重測定を記録した。獣医師は研究期間を通じて異常症状を報告しなかった。手順はすべて、Ｖａｌｌｅｙ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓの動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）（Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）によって認可された。手順開始前、ＡＡＶに対する中和抗体の存在に対して動物を試験し、陰性であった（以下を参照されたい）。手順を行うために、動物を、ケタミン（Ｋｅｔａｓｅｔ，７ｍｇ／ｋｇ）及び塩酸デクスメデトミジン（Ｄｅｘｄｏｍｉｔｏｒ，０．０１５ｍｇ／ｋｇ）の混合物で麻酔した。手術後、全動物に筋肉内用量の塩酸アチパメゾール（Ａｎｔｉｓｅｄａｎ，０．１５ｍｇ／ｋｇ）を投与して麻酔を解除した。ＡＡＶ−５投与１か月後、動物を深麻酔し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）及びＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を経心的に潅流した。脳及び器官を収集し、組織学的分析用に加工した。

簡潔に述べると、脳、並びに脊髄の頸部、胸部、及び腰部を冠状にスライスして６ｍｍブロックにし、４％ＰＦＡ−ＰＢＳで一夜、後固定し、翌日３０％（ｗ／ｖ）ショ糖で凍結保護した。組織学的染色には、滑走式ミクロトーム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｍｉｃｒｏｍ ＨＭ ４５０； Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ）を使用して脳ブロックを４０−ｌｍの連続的な切片に切断した。次いで、切片を、使用するまで凍結保護溶液中に配置した。

１．１．３． ＡＡＶ送達
麻酔を導入した後、動物の頭部を定位フレーム（ｓｔｅｒｅｏｔａｃｔｉｃ ｆｒａｍｅ）に配置し、腹臥位に曲げ、頸部の背部をポビドン−ヨウ素及びアルコールで清浄にした。１インチの２３ゲージニードルを装着した３ｍｌシリンジをマイクロマニピュレータ上に搭載し、手操作でニードルを大槽中に導いた。腰椎部の嚢（ｌｕｍｂａｒ ｓａｃ）を、脊髄レベルＬ４〜５の間に同様に接近させた。小体積の脳脊髄液（ＣＳＦ）をシリンジ中に吸引し、次いでシリンジをマイクロマニピュレータに固定することによって浸透を検証した。次いで、シリンジ上の三方ストップコックを調整して、０．５ｍｌ／分のポンプ（３５００ Ｍｅｄｆｕｓｉｏｎ； Ｓｔｒａｔｅｇｉｃ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｌｉｂｅｒｔｙｖｉｌｌｅ，ＩＬ）でベクター３ｍｌを注入した。注入が完了した後、ラインを食塩水０．２ｍｌでフラッシュした。最後に、小体積のＣＳＦを吸引して、ニードルが依然としてＣＭにあることを検証した。検証後、ニードルをゆっくりと抜いた。こうして、各動物の大槽中に３ｍｌ、及び腰椎注射により３ｍｌを投与した。１．４Ｅ１４ＧＣ／ｍｌのＡＡＶ−５−ＣＡＧ−ＧＦＰを合計６ｍｌ注入した。

同様に、動物を同量及び同用量のＡＡＶ−５−ＣＡＧ−ＧＦＰで処置してもよく、脊髄レベルＬ４〜Ｌ５間の腰椎注射のみにより投与する（大槽中へ注射せず）。以下の量のＡＡＶ−５−ＣＡＧ−ＧＦＰを腰椎注射により投与した：５Ｅ１３（通常用量）、５Ｅ１４、及び８Ｅ１４ＧＣ（高用量）。

ＡＡＶ投与に対する通常用量はおよそ１Ｅ１２ＧＣ及び５Ｅ１３ＧＣである。例えば、Ｖｕｌｃｈａｎｏｖａ（上述）はマウス（２０ｇ）に対して１Ｅ１１ＧＣのＡＡＶ−５を使用し、これは５Ｅ１２／ｋｇに等しい。５ｋｇのサルでは、これは２．５Ｅ１３ＧＣに相当する。加えて、Ｇｒａｙら（２０１３， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ， ２０， ４５０−４５９）は、６ｋｇの動物１匹当たり２Ｅ１２ＧＣを用いている。したがって、投与用量５．０Ｅ１３ＧＣは、当技術分野では通常用量と考えることができ、用量５．０Ｅ１４及び８．４Ｅ１４は高用量と考えられる。

青色色素の腰椎注入は、大槽から穿刺除去される青色色素をもたらすため、遺伝子治療ベクターを腰椎のみに投与するのであれば、結果に違いがないことが予想される。

１．１．４． 免疫組織化学
発色及び免疫蛍光染色を、前頭前野から小脳及び脊髄まで交互に４つの６ｍｍブロックにわたって４０−ｌｍの冠状切片に対して行った。発色ＧＦＰ染色は、以前に記載されている通りに行った（Ｈａｄａｃｚｅｋ ｅｔ ａｌ．， ２００９）。簡潔に述べると、切片をＰＢＳ中で洗浄し、ＰＢＳ中１％Ｈ２Ｏ２−３０％エタノール中で内因性ペルオキシダーゼ活性に対してブロックし、ＰＢＳＴ（ＰＢＳプラス０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）中ですすいだ。次いで、切片をＢａｃｋｇｒｏｕｎｄ Ｓｎｉｐｅｒブロック溶液（ＢＳ９６６Ｇ； Ｂｉｏｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ， Ｃｏｎｃｏｒｄ， ＣＡ）中でインキュベートし、Ｄａ Ｖｉｎｃｉ Ｇｒｅｅｎ希釈液（ＰＤ９００； Ｂｉｏｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ）中でＧＦＰ（ウサギ抗ＧＦＰ，１：３０００希釈；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）に対する一次抗体と４℃で最高２４時間、インキュベートした。翌日、ＰＢＳＴ中で洗浄した後、切片を、ＧＦＰ染色に、Ｒａｂｂｉｔ Ｍａｃｈ ３ Ｐｏｌｙｍｅｒ ＨＲＰ（ＲＰ５３１Ｌ； Ｂｉｏｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ）中、周囲温度でインキュベートし、着色を３，３ｃ−ジアミノベンチジン（ＤＡＢ）（ＤＡＢペルオキシダーゼ基質キット，ＳＫ−４１００；Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）で発色させた。次いで、切片をスライド上に搭載し、脱水し、Ｓｈａｎｄｏｎ−Ｍｏｕｎｔ（カタログ番号１９００３３３；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と一緒にカバーガラスを被せた。

ＧＦＰ陽性細胞の表現型を決定するために、二重免疫蛍光染色を行った。脳切片をＰＢＳＴで洗浄し、２０％正常ウマ血清（ＮＨＳ；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）中で６０分間ブロックし、次いでミクログリア（抗Ｉｂａ１，ウサギポリクローナル，１：５００希釈；Ｂｉｏｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ）、ニューロン（抗ＮｅｕＮ，マウスモノクローナル，１：３００希釈；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、線維性星状膠細胞（抗グリア−線維性酸性タンパク質［ＧＦＡＰ］，マウスモノクローナル，１：５００希釈；Ｄａｋｏ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）のいずれかに特異的な抗体と一緒に、抗ＧＦＰ（ウサギ又はマウス，１：２００希釈；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）と４℃で一夜インキュベートした。抗体はすべて、Ｄａ Ｖｉｎｃｉ Ｇｒｅｅｎ希釈液（ＰＤ９００；Ｂｉｏｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ）で希釈した。一次抗体とインキュベートした後、切片をＰＢＳＴ中で洗浄し、対応する二次抗体（ＦＩＴＣコンジュゲート抗ウサギ［１：２００希釈；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ］又はＡｌｅｘａ ４８８コンジュゲート抗マウス［１：５００希釈；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ］及びＡｌｅｘａ５５５コンジュゲート抗マウス［１：５００希釈；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ］又はＡｌｅｘａ ５５５コンジュゲート抗ウサギ［１：５００希釈；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ］）のＰＢＳＴ中のカクテルと室温で２時間インキュベートし、ＰＢＳ中で洗浄し、つや消しのスライド上に湿潤搭載した。切片に、４ｃ，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）含有ハードセットメディア（ｈａｒｄ−ｓｅｔ ｍｅｄｉａ）と一緒にカバーガラスを被せて、核をすべて同定した（Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ Ｈ−１２００；Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。

１．１．５． ＮＨＰ中の抗ＡＡＶ５抗体の力価
ＡＡＶカプシドに対する抗体の力価を、ベクター投与前の血液試料に対してＥＬＩＳＡによって決定した。簡潔に述べると、１ｍＭ炭酸バッファー中ＡＡＶ５カプシド２Ｅ１０ＧＣ／ｍｌ溶液を９６ウェルタイタープレートに分注し、４℃で一夜インキュベートした。翌日、プレートを洗浄し、ＰＢＳＴ中５％無脂肪ミルク溶液でブロックした。血清を、１：５０〜１：６４００の範囲にわたって希釈し、室温で１時間インキュベートした。次いで、ウェルをＰＢＳＴで洗浄し、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）をコンジュゲートさせた抗サル二次抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）と室温で１時間インキュベートした。ウェルをＰＢＳＴ中で再び洗浄し、次いで３，３−５，５−テトラメチルベンチジン（ＴＭＢ）で発色させた。塩酸を加えることによって反応を停止させ、プレートリーダー上で４５０ｎｍの吸光度を読み取った（Ｂｅｖａｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１１）。

１．１．６． ＡＡＶの体内分布
投薬前：
成年カニクイザル（Ｃｙｎｏｌｍｏｌｇｕｓ ｍａｃａｑｕｅ）（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）から血液試料をスクリーニング用に採取し、血清抗ＡＡＶ−５抗体力価、血清臨床化学、及び血液学的評価について分析した。

ＣＳＦ注入：
動物をケタミン（１０ｍｇ／ｋｇ）ＩＭ及びメデトミジン（１５μｇ／ｋｇ）ＩＭで固定した。脊椎用針（ｓｐｉｎａｌ ｎｅｅｄｌｅ）を腰椎領域に配置し、動物のＣＳＦ中に（５分にわたり５ｍＬからなる）単回用量のＡＡＶ５−ＣＡＧ−ＧＦＰを注射した。これらの動物に異なる３つの用量を投与した（ＧＣ合計５Ｅ１４、５Ｅ１３、及び５Ｅ１２）。

組織の収集：
ＣＳＦ注入した動物を、注入８週間後に安楽死させた。各動物を、ケタミン（１０〜１５ｍｇ／ｋｇ，ＩＭ）及びメデトミジン（１５μｇ／ｋｇ）で深麻酔した。動物に安楽死溶液を投薬した。麻酔の深さ（ｄｅｅｐ ｐｌａｎｅ）（すなわち、爪先つまみ応答（ｔｏｅ ｐｉｎｃｈ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）、角膜反射、及び顎の緊張（ｊａｗ ｔｏｎｅ）の喪失）を検証した後、胸郭切開術を行い、肝臓の一断片を試料採取した。脳及び脊髄を収集し、組織パンチを分子（Ｑ−ＰＣＲ）分析用に採取した。組織の残りを、組織学的評価用にパラホルムアルデヒド中に貯蔵した。

Ｑ−ＰＣＲ分析：ＧＦＰ遺伝子に対するプライマーを用いて、組織を標準のＱ−ＰＣＲ法にかけた。結果を表２に示す。

１．２． 結果
動物は、手順を良好に耐容した。体重減少は観察されず、また獣医は臨床徴候を認めなかった。

５Ｅ１３ＧＣ、５Ｅ１４ＧＣ、及び８．４Ｅ１４ＧＣの、異なる３用量のＡＡＶを試験した。５Ｅ１３ＧＣを正規の用量と考えることができ、５Ｅ１４ＧＣ及び８．４Ｅ１４ＧＣは高用量となる。

図１４に示されるように、ＡＡＶ５の正規の用量（５Ｅ１３ＧＣ）の投与は、いかなる形質導入もほとんどもたらさず、ＡＡＶ５は、髄腔内投与後、神経細胞にはほんのわずかしか形質導入しないという当技術分野における共通認識が確認された。驚くべきことに、高用量のＡＡＶ５は、運動ニューロンへの著しい形質導入をもたらした。図１４は、より高用量を用いると、運動ニューロンがさらに形質導入されることを示す。後角では、いくつかの線維も観察され、ＤＲＧニューロンへの形質導入が示唆される。しかし、優勢な形質導入細胞型は、運動ニューロンである。さらに、ＡＡＶゲノムの存在が脊髄、脳、及び肝臓において確認された。特に、肝臓にＡＡＶが存在することは、ＣＮＳから末梢へのＡＡＶ５の漏出があることを示す。ＡＡＶベクターは、ＣＮＳ中に投与すると末梢中に漏出し得ることがよく知られている。例えば、Ｈａｕｒｉｇｏｔら（２０１３， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．， １２３：３２５４−３２７１）は、肝臓にも供給される頭蓋内注射で完全に身体を治すのに、ＡＡＶ９を使用している。興味深いことに、ＡＡＶ９などとは対照的に、ＡＡＶ５粒子の大部分は脊髄内にとどまり、脳に拡散する。ＡＡＶ５は肝臓に侵入しない（表２）。

表２：
ＣＳＦ注入後のＡＡＶ粒子の存在
＋＋＋ ＝ ＡＡＶゲノムの大量の存在； ＋＋ ＝ 多数のＡＡＶゲノム； ＋ ＝ ゲノムが存在； − 検出できるＡＡＶゲノムは存在せず

以下の観察は、８．４Ｅ１４ＧＣで行った実験に由来する：ＧＦＰ発現は、脳、小脳、及び脊髄を含むＣＮＳ全体にわたって観察された。神経細胞及びグリア細胞の両方で発現が観察された。特に、ＧＦＰ発現は運動ニューロンに優勢に観察された。Ｖｕｌｃｈａｎｏｖａらは、マンニトールによる前処置後、ＡＡＶ５での神経細胞への形質導入も観察している。しかし、Ｖｕｌｃｈａｎｏｖａらは、運動ニューロンに比べて、ＤＲＧニューロン（及び脊髄の後角中へ突出するＤＲＧニューロンの神経突起）への形質導入効率がはるかに高いことを認めている。よって、形質導入された運動ニューロン／ＤＲＧの比は、マンニトールを用いる場合はＤＲＧに偏り、及び高用量のＡＡＶ５を用いる場合は運動ニューロンに偏ることから、高用量のＡＡＶ５の投与は、運動ニューロン関連状態の処置及び／又は防止に特に適したものとなっている。

概括すると、脳全体にわたって、主に脳室壁の比較的近傍に、いくつかの脳のスライスが良好な発現を示した（図２を参照されたい）。頭頂皮質における発現は、皮質のいくつかの層を介した発現を示した。いくつかのアストロサイトも形質導入された（図３）。同じことが皮質の後頭部に当てはまる（図４）。小脳では、小脳の構造の屈曲が、形質導入された細胞の線によって明らかに示された（図５）。脳のこの部分でも、神経細胞及びグリア細胞両方への形質導入が観察される。

脊髄では、（すべてではないにしても）多くの運動ニューロンが、脊髄の全長にわたって形質導入された（図６〜８）。同様の観察が、ＤＲＧにおけるニューロンになされた（図９）。これらはやはり、強く形質導入されてＧＦＰを発現した。導入遺伝子を発現した細胞を同定するために、ニューロン及びアストロサイトのマーカーに対する二重染色を行った。この特異的なＣＡＧプロモーターを用いて、ニューロン及びアストロサイト両方への形質導入を実現した（図１０〜１２）。ニューロンの喪失が生じたか否かを調べるために、小脳の切片に対してＨ＆Ｅ染色を行った（図１３）。プルキンエ細胞層の残りの存在に基づくと、この特異的なアプローチを用いて神経毒性は観察されなかった。

１．３． 考察
遺伝子のＣＮＳへの送達は、今まで、ＣＮＳのサイズ及び複雑さによって阻まれていた。脳中に単回注射した後の導入遺伝子の発現は局所的であり、注入領域に主に制限されたままである。ウイルスベクターを送達するための方法としてＣＳＦを用いると、より広範な領域に到達することができる。本研究により、１Ｅ１４ＧＣ／ｋｇを超える比較的高用量のＡＡＶ−５ベクターを用いると、ＣＮＳの広範な領域に形質導入するというこの目標を達成ができることが示される。臨床徴候及び明らかなニューロンの喪失が観察されなかったため、処置は耐容性が良好であった。神経細胞及びグリア細胞の両方が、この特異的なＣＡＧプロモーターを用いて形質導入された。ＧＦＡＰプロモーター又はシナプシン−１プロモーターなどの細胞特異的なプロモーターを用いて、特定の集団に対して発現を導いてもよい。本発明者らは、皮質、小脳、及び脳室下帯の領域は、神経細胞及びグリア細胞の両方で導入遺伝子の発現を示すことを示した。脊髄では、運動ニューロンへの形質導入及び後根神経節におけるニューロンへの形質導入が優勢だった。これらの結果は、ＣＮＳ媒介性の送達方法を用いて、遺伝子治療アプローチ用に遺伝子を送達することができることを示す。これが補助となり得る適応症には、運動ニューロン疾患、例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、又は感覚関連の適応症、例えば疼痛があり得る。このようなアプローチが補助となり得る他の神経学的な適応症には、例えば、ハンチントン病、アルツハイマー病、テイ−セイズ病、フリードライヒ失調症、毛細血管拡張性運動失調症、脊髄小脳失調症（１型、２型、及び３型）、ニーマン・ピック病（Ａ型、Ｂ型、及びＣ型）、ドーパ反応性ジストニア、脆弱Ｘ染色体症候群、クラッベ病、糖原病２型（ポンペ）、原発性側索硬化症、ペリツェウス−メルツバッハー病、Ｘ連鎖性副腎白質ジストロフィー、巨大軸索ニューロパチー、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、近位型筋緊張性ミオパチー、及び神経セロイドリポフスチン症（バッテン病）がある。

原因である遺伝的欠陥は大部分が知られており、ＡＡＶ（−５）ベクター中に構築することができる。治療薬剤としてこの送達系を用いると、この送達系は遺伝子型、ひいては願わくは表現型を元に戻すことが想像できる。

さらに、脳手術は複雑な手術を必要とするため、髄腔内の送達方法は、ＣＮＳ自体への注入ほど侵襲的ではないと考えられている。髄腔内アプローチは、脳注射のための特別な中心を必要とせずに行うことができるという追加的な価値を有する。

１．４． 参考文献
Ｂａｎｔｅｌ−Ｓｃｈａａｌ Ｕ^１， Ｄｅｌｉｕｓ Ｈ， Ｓｃｈｍｉｄｔ Ｒ， ｚｕｒ Ｈａｕｓｅｎ Ｈ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ． １９９９ Ｆｅｂ；７３（２）：９３９−４７． Ｈｕｍａｎ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ５ ｉｓ ｏｎｌｙ ｄｉｓｔａｎｔｌｙ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｏｔｈｅｒ ｋｎｏｗｎ ｐｒｉｍａｔｅ ｈｅｌｐｅｒ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ．
Ｂａｒｔｌｅｔｔ ＪＳ^１， Ｓａｍｕｌｓｋｉ ＲＪ， ＭｃＣｏｗｎ ＴＪ． Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． １９９８ Ｍａｙ ２０；９（８）：１１８１−６． Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ａｎｄ ｒａｐｉｄ ｕｐｔａｋｅ ｏｆ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２ ｉｎ ｂｒａｉｎ．
Ｂｅｖａｎ ＡＫ， Ｄｕｑｕｅ Ｓ， Ｆｏｕｓｔ ＫＤ， Ｍｏｒａｌｅｓ ＰＲ， Ｂｒａｕｎ Ｌ， Ｓｃｈｍｅｌｚｅｒ Ｌ， Ｃｈａｎ ＣＭ， ＭｃＣｒａｔｅ Ｍ， Ｃｈｉｃｏｉｎｅ ＬＧ， Ｃｏｌｅｙ ＢＤ， Ｐｏｒｅｎｓｋｙ ＰＮ， Ｋｏｌｂ ＳＪ， Ｍｅｎｄｅｌｌ ＪＲ， Ｂｕｒｇｈｅｓ ＡＨ， Ｋａｓｐａｒ ＢＫ． Ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｉｎ ｌａｒｇｅ ｓｐｅｃｉｅｓ ｆｏｒ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ， ｂｒａｉｎ， ａｎｄ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｔｉｓｓｕｅｓ ｆｏｒ ｐｅｄｉａｔｒｉｃ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ． Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ． ２０１１ Ｎｏｖ；１９（１１）：１９７１−８０．
Ｂｌｉｔｓ Ｂ^１， Ｄｅｒｋｓ Ｓ， Ｔｗｉｓｋ Ｊ， Ｅｈｌｅｒｔ Ｅ， Ｐｒｉｎｓ Ｊ， Ｖｅｒｈａａｇｅｎ Ｊ． Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｍｅｔｈｏｄｓ． ２０１０ Ｊａｎ １５；１８５（２）：２５７−６３． Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ （ＡＡＶ）−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｄ ｎｕｃｌｅｕｓ ｏｆ ｔｈｅ ａｄｕｌｔ ｒａｔ ｂｒａｉｎ： ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｓｅｖｅｎ ＡＡＶ ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ ａｎｄ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ．
Ｃｈｉｏｒｉｎｉ ＪＡ^１， Ｙａｎｇ Ｌ， Ｌｉｕ Ｙ， Ｓａｆｅｒ Ｂ， Ｋｏｔｉｎ ＲＭ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ． １９９７ Ｓｅｐ；７１（９）：６８２３−３３． Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ４ （ＡＡＶ４） ａｎｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＡＡＶ４ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ．
Ｄａｔａ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｍａｎｕａｌ． “Ｒｏｕｔｅ ｏｆ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ”． Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ． Ｒｅｔｒｉｅｖｅｄ １１ Ｍａｒｃｈ ２０１１．
Ｄａｖｉｄｓｏｎ ＢＬ^１， Ｓｔｅｉｎ ＣＳ， Ｈｅｔｈ ＪＡ， Ｍａｒｔｉｎｓ Ｉ， Ｋｏｔｉｎ ＲＭ， Ｄｅｒｋｓｅｎ ＴＡ， Ｚａｂｎｅｒ Ｊ， Ｇｈｏｄｓｉ Ａ， Ｃｈｉｏｒｉｎｉ ＪＡ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． ２０００ Ｍａｒ ２８；９７（７）：３４２８−３２． Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２， ４， ａｎｄ ５ ｖｅｃｔｏｒｓ： ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｖａｒｉａｎｔ ｃｅｌｌ ｔｙｐｅｓ ａｎｄ ｒｅｇｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ．
Ｄｏｎｅｌｌｏ ＪＥ^１， Ｌｏｅｂ ＪＥ， Ｈｏｐｅ ＴＪ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ． １９９８ Ｊｕｎ；７２（６）：５０８５−９２． Ｗｏｏｄｃｈｕｃｋ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ ｃｏｎｔａｉｎｓ ａ ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ ｐｏｓｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔ．
Ｄｒｉｎｋｕｔ Ａ^１， Ｔｅｒｅｓｈｃｈｅｎｋｏ Ｙ， Ｓｃｈｕｌｚ ＪＢ， Ｂａｈｒ Ｍ， Ｋｕｇｌｅｒ Ｓ． Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ． ２０１２ Ｍａｒ；２０（３）：５３４−４３． Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｕｓｉｎｇ ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ ａｓ ｈｏｓｔｓ ｆｏｒ ｌｏｃａｌｉｚｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ．
Ｆｉｎｅｇｏｌｄ ＡＡ^１， Ｍａｎｎｅｓ ＡＪ， Ｉａｄａｒｏｌａ ＭＪ． Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． １９９９ Ｍａｙ １；１０（７）：１２５１−７． Ａ ｐａｒａｃｒｉｎｅ ｐａｒａｄｉｇｍ ｆｏｒ ｉｎ ｖｉｖｏ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｔｈｅ ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ： ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｃｈｒｏｎｉｃ ｐａｉｎ．
Ｇｏｎｃａｌｖｅｓ， ２００５， Ｖｉｒｏｌ Ｊ． ２（１）：４３ Ｔｒｏｐｉｓｍ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ａｎｄ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ．
Ｇｏｓｓｅｎ Ｍ^１， Ｂｕｊａｒｄ Ｈ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． １９９２ Ｊｕｎ １５；８９（１２）：５５４７−５１． Ｔｉｇｈｔ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ．
Ｇｒａｙ ＳＪ^１， Ｎａｇａｂｈｕｓｈａｎ Ｋａｌｂｕｒｇｉ Ｓ， ＭｃＣｏｗｎ ＴＪ， Ｊｕｄｅ Ｓａｍｕｌｓｋｉ Ｒ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ２０１３ Ａｐｒ；２０（４）：４５０−９． ｄｏｉ： １０．１０３８／ｇｔ．２０１２．１０１． Ｅｐｕｂ ２０１３ Ｊａｎ １０． Ｇｌｏｂａｌ ＣＮＳ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｎｄ ｅｖａｓｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉ−ＡＡＶ−ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂｙ ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ ＡＡＶ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｎｏｎ−ｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｔｅｓ．
Ｇｒｉｍｍ Ｄ^１， Ｋｌｅｉｎｓｃｈｍｉｄｔ ＪＡ． Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． １９９９ Ｏｃｔ １０；１０（１５）：２４４５−５０． Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２ ｖｅｃｔｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ： ｐｒｏｍｉｓｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ ｆｏｒ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｕｓｅ．
Ｇｒｉｍｍ Ｄ^１， Ｋａｙ ＭＡ， Ｋｌｅｉｎｓｃｈｍｉｄｔ ＪＡ． Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ． ２００３ Ｊｕｎ；７（６）：８３９−５０． Ｈｅｌｐｅｒ ｖｉｒｕｓ−ｆｒｅｅ， ｏｐｔｉｃａｌｌｙ ｃｏｎｔｒｏｌｌａｂｌｅ， ａｎｄ ｔｗｏ−ｐｌａｓｍｉｄ−ｂａｓｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｏｆ ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ １ ｔｏ ６．
Ｈａｄａｃｚｅｋ Ｐ^１， Ｆｏｒｓａｙｅｔｈ Ｊ， Ｍｉｒｅｋ Ｈ， Ｍｕｎｓｏｎ Ｋ， Ｂｒｉｎｇａｓ Ｊ， Ｐｉｖｉｒｏｔｔｏ Ｐ， ＭｃＢｒｉｄｅ ＪＬ， Ｄａｖｉｄｓｏｎ ＢＬ， Ｂａｎｋｉｅｗｉｃｚ ＫＳ． Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ２００９ Ｍａｒ；２０（３）：２２５−３７． Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｎｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｔｅ ｂｒａｉｎ ｗｉｔｈ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｓｅｒｏｔｙｐｅ １： ｖｅｃｔｏｒ ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ．
Ｊｅｎｎｉｎｇｓ Ｋ^１， Ｍｉｙａｍａｅ Ｔ， Ｔｒａｉｓｔｅｒ Ｒ， Ｍａｒｉｎｏｖ Ａ， Ｋａｔａｋｕｒａ Ｓ， Ｓｏｗｄｅｒｓ Ｄ， Ｔｒａｐｎｅｌｌ Ｂ， Ｗｉｌｓｏｎ ＪＭ， Ｇａｏ Ｇ， Ｈｉｒｓｃｈ Ｒ． Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ． ２００５ Ａｐｒ；１１（４）：６００−７． Ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｅｎｈａｎｃｅｓ ＡＡＶ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｓｙｎｏｖｉｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ．
Ｋａｐｌｉｔｔ ＭＧ^１， Ｌｅｏｎｅ Ｐ， Ｓａｍｕｌｓｋｉ ＲＪ， Ｘｉａｏ Ｘ， Ｐｆａｆｆ ＤＷ， Ｏ’Ｍａｌｌｅｙ ＫＬ， Ｄｕｒｉｎｇ ＭＪ． Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ． １９９４ Ｏｃｔ；８（２）：１４８−５４． Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｂｒａｉｎ．
Ｋｅｎｎｅｔｈ Ｉ． Ｂｅｒｎｓ， “Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ： Ｔｈｅ Ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ”， Ｃｈａｐｔｅｒ ６９ ｉｎ Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ （３ｄ Ｅｄ． １９９６）．
Ｋｌｅｉｎ ＲＬ^１， Ｍｅｙｅｒ ＥＭ， Ｐｅｅｌ ＡＬ， Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ Ｓ， Ｍｅｙｅｒｓ Ｃ， Ｍｕｚｙｃｚｋａ Ｎ， Ｋｉｎｇ ＭＡ． Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ． １９９８ Ａｐｒ；１５０（２）：１８３−９４． Ｎｅｕｒｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｔ ｓｅｐｔｏｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ｏｒ ｎｉｇｒｏｓｔｒｉａｔａｌ ｐａｔｈｗａｙ ｂｙ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ．
Ｋｌｅｉｎ ＲＬ^１， Ｄａｙｔｏｎ ＲＤ， Ｔａｔｏｍ ＪＢ， Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ ＫＭ， Ｈｅｎｎｉｎｇ ＰＰ． Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ． ２００８ Ｊａｎ；１６（１）：８９−９６． Ｅｐｕｂ ２００７ Ｏｃｔ ２３． ＡＡＶ８， ９， Ｒｈ１０， Ｒｈ４３ ｖｅｃｔｏｒ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｔ ｂｒａｉｎ： ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｓｅｒｏｔｙｐｅ， ｐｒｏｍｏｔｅｒ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ．
Ｋｏｔｉｎ ＲＭ． Ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ． Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ． ２０１１ Ａｐｒ １５；２０（Ｒ１）：Ｒ２−６．
Ｋｕｇｌｅｒ Ｓ^１， Ｍｅｙｎ Ｌ， Ｈｏｌｚｍｕｌｌｅｒ Ｈ， Ｇｅｒｈａｒｄｔ Ｅ， Ｉｓｅｎｍａｎｎ Ｓ， Ｓｃｈｕｌｚ ＪＢ， Ｂａｈｒ Ｍ． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ２００１ Ｊａｎ；１７（１）：７８−９６． Ｎｅｕｒｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ： ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ｉｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ．
Ｌｅｅ Ｙ^１， Ｍｅｓｓｉｎｇ Ａ， Ｓｕ Ｍ， Ｂｒｅｎｎｅｒ Ｍ． Ｇｌｉａ． ２００８ Ａｐｒ；５６（５）：４８１−９３． ＧＦＡＰ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｒｅｇｉｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｄ ａｓｔｒｏｃｙｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．
Ｌｉｎ ＣＲ^１， Ｙａｎｇ ＬＣ， Ｌｅｅ ＴＨ， Ｌｅｅ ＣＴ， Ｈｕａｎｇ ＨＴ， Ｓｕｎ ＷＺ， Ｃｈｅｎｇ ＪＴ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ２００２ Ｓｅｐ；９（１８）：１２４７−５３． Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｐａｉｎ−ｋｉｌｌｅｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｍｏｎｏｎｅｕｒｏｐａｔｈｉｃ ｒａｔｓ．
Ｌｉｎ ＣＲ^１， Ｔａｉ ＭＨ， Ｃｈｅｎｇ ＪＴ， Ｃｈｏｕ ＡＫ， Ｗａｎｇ ＪＪ， Ｔａｎ ＰＨ， Ｍａｒｓａｌａ Ｍ， Ｙａｎｇ ＬＣ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｌｅｔｔ． ２００２ Ｊａｎ ４；３１７（１）：１−４． Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｄｉｒｅｃｔ ｓｐｉｎａｌ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ ｒａｔｓ．
Ｍａｄｄａｌｅｎａ ｅｔ ａｌ． （２０１３） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ − Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ２：ｅ１０６．
Ｍａｄｄａｌｅｎａ Ａ^１， Ｔｅｒｅｓｈｃｈｅｎｋｏ Ｊ， Ｂａｈｒ Ｍ， Ｋｕｇｌｅｒ Ｓ． Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ． ２０１３ Ｊｕｌ １６；２：ｅ１０６． Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ， Ｍｉｆｅｐｒｉｓｔｏｎｅ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｂｒａｉｎ．
Ｍａｎｄｅｌ ＲＪ^１， Ｒｅｎｄａｈｌ ＫＧ， Ｓｐｒａｔｔ ＳＫ， Ｓｎｙｄｅｒ ＲＯ， Ｃｏｈｅｎ ＬＫ， Ｌｅｆｆ ＳＥ． Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １９９８ Ｊｕｎ １；１８（１１）：４２７１−８４． Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｒａｓｔｒｉａｔａｌ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ＧＴＰ−ｃｙｃｌｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ Ｉ ｉｎ ａ ｒａｔ ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ．
ＭｃＣａｒｔｙ ＤＭ． Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ． ２００８ Ｏｃｔ；１６（１０）：１６４８−５６． Ｓｅｌｆ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ＡＡＶ ｖｅｃｔｏｒｓ； ａｄｖａｎｃｅｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．
Ｍｉｌｌｉｇａｎ ＥＤ^１， Ｌａｎｇｅｒ ＳＪ， Ｓｌｏａｎｅ ＥＭ， Ｈｅ Ｌ， Ｗｉｅｓｅｌｅｒ−Ｆｒａｎｋ Ｊ， Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ Ｋ， Ｍａｒｔｉｎ Ｄ， Ｆｏｒｓａｙｅｔｈ ＪＲ， Ｍａｉｅｒ ＳＦ， Ｊｏｈｎｓｏｎ Ｋ， Ｃｈａｖｅｚ ＲＡ， Ｌｅｉｎｗａｎｄ ＬＡ， Ｗａｔｋｉｎｓ ＬＲ． Ｅｕｒ Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ２００５ Ａｐｒ；２１（８）：２１３６−４８． Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｐａｉｎ ｂｙ ａｄｅｎｏｖｉｒａｌｌｙ ｄｒｉｖｅｎ ｓｐｉｎａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｃｙｔｏｋｉｎｅ， ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１０．
Ｍｉｌｌｉｇａｎ ＥＤ^１， Ｓｌｏａｎｅ ＥＭ， Ｌａｎｇｅｒ ＳＪ， Ｃｒｕｚ ＰＥ， Ｃｈａｃｕｒ Ｍ， Ｓｐａｔａｒｏ Ｌ， Ｗｉｅｓｅｌｅｒ−Ｆｒａｎｋ Ｊ， Ｈａｍｍａｃｋ ＳＥ， Ｍａｉｅｒ ＳＦ， Ｆｌｏｔｔｅ ＴＲ， Ｆｏｒｓａｙｅｔｈ ＪＲ， Ｌｅｉｎｗａｎｄ ＬＡ， Ｃｈａｖｅｚ Ｒ， Ｗａｔｋｉｎｓ ＬＲ． Ｍｏｌ Ｐａｉｎ． ２００５ Ｆｅｂ ２５；１：９． Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｉｃ ｐａｉｎ ｂｙ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｄｒｉｖｅｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｃｙｔｏｋｉｎｅ， ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１０．
Ｍｉｌｌｉｇａｎ ＥＤ^１， Ｓｌｏａｎｅ ＥＭ， Ｌａｎｇｅｒ ＳＪ， Ｈｕｇｈｅｓ ＴＳ， Ｊｅｋｉｃｈ ＢＭ， Ｆｒａｎｋ ＭＧ， Ｍａｈｏｎｅｙ ＪＨ， Ｌｅｖｋｏｆｆ ＬＨ， Ｍａｉｅｒ ＳＦ， Ｃｒｕｚ ＰＥ， Ｆｌｏｔｔｅ ＴＲ， Ｊｏｈｎｓｏｎ ＫＷ， Ｍａｈｏｎｅｙ ＭＭ， Ｃｈａｖｅｚ ＲＡ， Ｌｅｉｎｗａｎｄ ＬＡ， Ｗａｔｋｉｎｓ ＬＲ． Ｐａｉｎ． ２００６ Ｄｅｃ １５；１２６（１−３）：２９４−３０８． Ｒｅｐｅａｔｅｄ ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１０ ｐｒｏｄｕｃｅ ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ ｒｅｖｅｒｓａｌ ｏｆ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｉｃ ｐａｉｎ．
Ｍｉｙａｚａｋｉ Ｊ^１， Ｔａｋａｋｉ Ｓ， Ａｒａｋｉ Ｋ， Ｔａｓｈｉｒｏ Ｆ， Ｔｏｍｉｎａｇａ Ａ， Ｔａｋａｔｓｕ Ｋ， Ｙａｍａｍｕｒａ Ｋ． Ｇｅｎｅ． １９８９ Ｊｕｌ １５；７９（２）：２６９−７７． Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｃｈｉｃｋｅｎ ｂｅｔａ−ａｃｔｉｎ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｄｉｒｅｃｔｓ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−５．
Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ Ｓ． Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２００１ Ｊｕｎ；７４（４）：２７７−３０２． Ｓｉｎｇｌｅ ｄｏｍａｉｎ ｃａｍｅｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｔａｔｕｓ．
Ｐａｓｓｉｎｉ ＭＡ^１， Ｌｅｅ ＥＢ， Ｈｅｕｅｒ ＧＧ， Ｗｏｌｆｅ ＪＨ． Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ２００２ Ａｕｇ １；２２（１５）：６４３７−４６． Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｌｙｓｏｓｏｍａｌ ｅｎｚｙｍｅ ｉｎ ｔｈｅ ａｄｕｌｔ ｂｒａｉｎ ｂｙ ａｘｏｎａｌ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ａｎｄ ｂｙ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ｔｈｅ ｒｏｓｔｒａｌ ｍｉｇｒａｔｏｒｙ ｓｔｒｅａｍ．
Ｒｕｓｓｅｌｌ ＷＣ． Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ． ２０００ Ｎｏｖ；８１（Ｐｔ １１）：２５７３−６０４． Ｕｐｄａｔｅ ｏｎ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ａｎｄ ｉｔｓ ｖｅｃｔｏｒｓ．
Ｒｕｔｌｅｄｇｅ ＥＡ^１， Ｈａｌｂｅｒｔ ＣＬ， Ｒｕｓｓｅｌｌ ＤＷ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ． １９９８ Ｊａｎ；７２（１）：３０９−１９． Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｃｌｏｎｅｓ ａｎｄ ｖｅｃｔｏｒｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ （ＡＡＶ） ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ ｏｔｈｅｒ ｔｈａｎ ＡＡＶ ｔｙｐｅ ２．
Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ （２００１） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．
Ｓｈｅｖｔｓｏｖａ Ｚ^１， Ｍａｌｉｋ ＪＭ， Ｍｉｃｈｅｌ Ｕ， Ｂａｈｒ Ｍ， Ｋｕｇｌｅｒ Ｓ． Ｅｘｐ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２００５ Ｊａｎ；９０（１）：５３−９． Ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ａｎｄ ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ： ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｔ ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ．
Ｓｈｉｐｌｅｙ ＪＭ^１， Ｍｉｌｌｅｒ ＲＤ， Ｗｕ ＢＭ， Ｇｒｕｂｂ ＪＨ， Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ＳＧ， Ｋｙｌｅ ＪＷ， Ｓｌｙ ＷＳ． Ｇｅｎｏｍｉｃｓ． １９９１ Ａｕｇ；１０（４）：１００９−１８． Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ５’ ｆｌａｎｋｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｂｅｔａ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ ｇｅｎｅ．
Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ Ａ， Ｌｕｓｂｙ ＥＷ， Ｂｅｒｎｓ ＫＩ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ． １９８３ Ｆｅｂ；４５（２）：５５５−６４． Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ２ ｇｅｎｏｍｅ．
Ｓｔｏｒｅｋ Ｂ^１， Ｒｅｉｎｈａｒｄｔ Ｍ， Ｗａｎｇ Ｃ， Ｊａｎｓｓｅｎ ＷＧ， Ｈａｒｄｅｒ ＮＭ， Ｂａｎｃｋ ＭＳ， Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ＪＨ， Ｂｅｕｔｌｅｒ ＡＳ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． ２００８ Ｊａｎ ２２；１０５（３）：１０５５−６０． Ｓｅｎｓｏｒｙ ｎｅｕｒｏｎ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｂｙ ｓｅｌｆ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ＡＡＶ８ ｖｉａ ｌｕｍｂａｒ ｐｕｎｃｔｕｒｅ ｆｏｒ ｃｈｒｏｎｉｃ ｐａｉｎ．
Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ＪＤ， Ｍｉｌｌｅｒ ＩＬ， Ｓｍｉｔｈ ＭＧ， Ｃａｒｔｅｒ ＢＪ． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １９８５ Ｎｏｖ；５（１１）：３２５１−６０． Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ ｈｉｇｈ−ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ， ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， ａｎｄ ｒｅｓｃｕｅ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ．
Ｕｎｚｕ Ｃ， Ｓａｍｐｅｄｒｏ Ａ， Ｍａｕｌｅｏｎ Ｉ， Ａｌｅｇｒｅ Ｍ， Ｂｅａｔｔｉｅ ＳＧ， ｄｅ Ｓａｌａｍａｎｃａ ＲＥ， Ｓｎａｐｐｅｒ Ｊ， Ｔｗｉｓｋ Ｊ， Ｐｅｔｒｙ Ｈ， Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ａｓｅｇｕｉｎｏｌａｚａ Ｇ， Ａｒｔｉｅｄａ Ｊ， Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｐｅｎａ ＭＳ， Ｐｒｉｅｔｏ Ｊ， Ｆｏｎｔａｎｅｌｌａｓ Ａ． Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ｒＡＡＶ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｌｉｖｅｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ａｇａｉｎｓｔ ｉｎｄｕｃｅｄ ｍｏｔｏｒ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ ｉｎ ａｃｕｔｅ ｐｏｒｐｈｙｒｉａ ｍｉｃｅ． Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ． ２０１１ Ｆｅｂ；１９（２）：２４３−５０．
Ｕｒａｂｅ Ｍ^１， Ｎａｋａｋｕｒａ Ｔ， Ｘｉｎ ＫＱ， Ｏｂａｒａ Ｙ， Ｍｉｚｕｋａｍｉ Ｈ， Ｋｕｍｅ Ａ， Ｋｏｔｉｎ ＲＭ， Ｏｚａｗａ Ｋ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ． ２００６ Ｆｅｂ；８０（４）：１８７４−８５． Ｓｃａｌａｂｌｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈ−ｔｉｔｅｒ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ５ ｉｎ ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌｓ．
Ｕｒａｂｅ， Ｍ， Ｄｉｎｇ， Ｃ ａｎｄ Ｋｏｔｉｎ， ＲＭ （２００２）． Ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌｓ ａｓ ａ ｆａｃｔｏｒｙ ｔｏ ｐｒｏｄｕｃｅ ａｄｅｎｏ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２ ｖｅｃｔｏｒｓ． Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １３：１９３５−１９４３．
ＵＳ２００８０００８６９０： ＡＡＶ ｖｉｒｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｕｓｅｓ ｔｈｅｒｅｆｏｒ
Ｖｕｌｃｈａｎｏｖａ Ｌ^１， Ｓｃｈｕｓｔｅｒ ＤＪ， Ｂｅｌｕｒ ＬＲ， Ｒｉｅｄｌ ＭＳ， Ｐｏｄｅｔｚ−Ｐｅｄｅｒｓｅｎ ＫＭ， Ｋｉｔｔｏ ＫＦ， Ｗｉｌｃｏｘ ＧＬ， ＭｃＩｖｏｒ ＲＳ， Ｆａｉｒｂａｎｋｓ ＣＡ． Ｍｏｌ Ｐａｉｎ． ２０１０ Ｍａｙ ２８；６：３１． ｄｏｉ： １０．１１８６／１７４４−８０６９−６−３１． Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｏ ｓｅｎｓｏｒｙ ｎｅｕｒｏｎｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｂｙ ｄｉｒｅｃｔ ｌｕｍｂａｒ ｐｕｎｃｔｕｒｅ．
ＷＯ２００７／０４６７０３： Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ａａｖ ｖｅｃｔｏｒｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌｓ
ＷＯ２００７／１４８９７１： Ｖｅｃｔｏｒｓ ｗｉｔｈ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｃｏｄｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａａｖ−ｒｅｐ７８ ｕｓｅｆｕｌ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａａｖ ｉｎ ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌｓ
ＷＯ２００９／０１４４４５： Ｂａｃｕｌｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ ｒｅｐｅａｔｅｄ ｃｏｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｃｏｄｏｎ ｂｉａｓｅｓ
ＷＯ２００９／１０４９６４： Ｏｐｔｉｍｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐａｒｖｏｖｉｒａｌ ｒｅｐ ａｎｄ ｃａｐ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌｓ
ＷＯ２０１１／１１２０８９： Ｍｕｔａｔｅｄ ｒｅｐ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｆｏｒ ｕｓｅ ｉｎ ａａｖ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
ＷＯ２０１３／０３６１１８： Ｒｅｍｏｖａｌ ｏｆ ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｎｇ ｖｉｒｕｓｅｓ ｆｒｏｍ ａａｖ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ
ＷＯ２００１／０９２５５１： Ｄｕｐｌｅｘｅｄ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ
ＷＯ２０１１／１２２９５０： Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ ｄｕｐｌｅｘ ａａｖ ｖｅｃｔｏｒｓ
Ｗｕ Ｐ^１， Ｘｉａｏ Ｗ， Ｃｏｎｌｏｎ Ｔ， Ｈｕｇｈｅｓ Ｊ， Ａｇｂａｎｄｊｅ−ＭｃＫｅｎｎａ Ｍ， Ｆｅｒｋｏｌ Ｔ， Ｆｌｏｔｔｅ Ｔ， Ｍｕｚｙｃｚｋａ Ｎ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ． ２０００ Ｓｅｐ；７４（１８）：８６３５−４７． Ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２ （ＡＡＶ２） ｃａｐｓｉｄ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＡＡＶ２ ｖｅｃｔｏｒｓ ｗｉｔｈ ａｌｔｅｒｅｄ ｔｒｏｐｉｓｍ．
Ｘｕ Ｒ^１， Ｊａｎｓｏｎ ＣＧ， Ｍａｓｔａｋｏｖ Ｍ， Ｌａｗｌｏｒ Ｐ， Ｙｏｕｎｇ Ｄ， Ｍｏｕｒａｖｌｅｖ Ａ， Ｆｉｔｚｓｉｍｏｎｓ Ｈ， Ｃｈｏｉ ＫＬ， Ｍａ Ｈ， Ｄｒａｇｕｎｏｗ Ｍ， Ｌｅｏｎｅ Ｐ， Ｃｈｅｎ Ｑ， Ｄｉｃｋｅｒ Ｂ， Ｄｕｒｉｎｇ ＭＪ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ２００１ Ｓｅｐ；８（１７）：１３２３−３２． Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｗｉｔｈ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ （ＡＡＶ−２） ｂｒａｉｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｅｎｅ ｃａｓｓｅｔｔｅｓ．
Ｚａｌｄｕｍｂｉｄｅ Ａ^１， Ｈｏｅｂｅｎ ＲＣ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ２００８ Ｆｅｂ；１５（４）：２３９−４６． Ｈｏｗ ｎｏｔ ｔｏ ｂｅ ｓｅｅｎ： ｉｍｍｕｎｅ−ｅｖａｓｉｏｎ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｉｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ．

Claims (15)

1. 哺乳動物対象における医薬としての使用のためのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）遺伝子治療ベクターであって、該遺伝子治療ベクターは、ＡＡＶ血清型５カプシドタンパク質と、ＡＡＶ ＩＴＲに隣接する目的遺伝子産物と、を含み、該遺伝子治療ベクターは腰部髄腔内投与により投与される、ＡＡＶ遺伝子治療ベクター。
2. 腰部髄腔内投与は、Ｌ４〜Ｌ５、Ｌ３〜Ｌ４、Ｌ１〜Ｌ２、及びＬ２〜Ｌ３からなる群から選択される位置におけるものである、請求項１に記載のＡＡＶ遺伝子治療ベクター。
3. 一本鎖ＡＡＶ遺伝子治療ベクター又はモノマーの二本鎖ベクターである、請求項１又は請求項２に記載のＡＡＶ遺伝子治療ベクター。
4. 目的遺伝子産物は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、疼痛、ハンチントン病、アルツハイマー病、テイ−セイズ病、フリードライヒ失調症、毛細血管拡張性運動失調症、脊髄小脳失調症１型、２型、及び３型、ニーマン・ピック病Ａ型、Ｂ型、及びＣ型、ドーパ反応性ジストニア、脆弱Ｘ染色体症候群、クラッベ病、糖原病２型（ポンペ）、原発性側索硬化症、ペリツェウス−メルツバッハー病、Ｘ連鎖性副腎白質ジストロフィー、巨大軸索ニューロパチー、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、近位型筋緊張性ミオパチー、神経セロイドリポフスチン症（バッテン病）、及び癌からなる群から選択される状態の処置又は予防における使用のためのものである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＡＡＶ遺伝子治療ベクター。
5. ＡＡＶ ＩＴＲはＡＡＶ血清型２ ＩＴＲである、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＡＡＶ遺伝子治療ベクター。
6. 目的遺伝子産物は、アスパルチルグルコサミニダーゼ、α−ガラクトシダーゼＡ、パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ、トリペプチジルペプチダーゼ、リソソーム膜貫通タンパク質、複数の遺伝子産物、システイントランスポーター、酸性セラミダーゼ、酸性α−Ｌ−フコシダーゼ、保護タンパク質／カテプシンＡ、酸性β−グルコシダーゼ又はグルコセレブロシダーゼ、酸性β−ガラクトシダーゼ、イズロン酸−２−スルファターゼ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、ガラクトセレブロシダーゼ、酸性α−マンノシダーゼ、酸性β−マンノシダーゼ、アリールスルファターゼＢ、アリールスルファターゼＡ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−硫酸スルファターゼ、酸性β−ガラクトシダーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−ホスホトランスフェラーゼ、酸性スフィンゴミエリナーゼ、ＮＰＣ−１、酸性α−グルコシダーゼ、β−ヘキソサミニダーゼＢ、ヘパランＮ−スルファターゼ、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、アセチル−ＣｏＡ：α−グルコサミニドＮ−アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−硫酸スルファターゼ、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、α−ノイラミダーゼ、β−グルクロニダーゼ、β−ヘキソサミニダーゼＡ、酸性リパーゼ、神経栄養因子、例えば、神経成長因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、ニューロトロフィン−４／５（ＮＴ−４／５）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、脳ドーパミン神経栄養因子（ＣＤＮＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、繊毛様神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、成長因子インスリン様成長因子（ＩＧＦ−１）、及び欠陥遺伝子のダウンレギュレーションのためのｍｉＲＮＡからなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載のＡＡＶ遺伝子治療ベクター。
7. 目的遺伝子産物は、運動ニューロン及び／又はＤＲＧにおけるニューロンに関連する状態の処置又は予防における使用のためのものである、請求項１〜６のいずれか一項に記載のＡＡＶ遺伝子治療ベクター。
8. 目的遺伝子産物は、治療効果を得るのに十分な目的遺伝子産物の発現を生じさせるプロモーターを含む発現制御エレメントに作動可能に連結しており、プロモーターは、好ましくは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、ＣＡＧプロモーター（サイトメガロウイルス初期エンハンサーエレメント及びニワトリベータ−アクチンプロモーターの組合せ）、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター、シナプシン−１プロモーター、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、及びＧｅｎｅ Ｓｗｉｔｃｈ若しくはｔｅｔ−オペロン由来プロモーターなどの誘導プロモーターからなる群から選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載のＡＡＶ遺伝子治療ベクター。
9. 腰部髄腔内投与の前に、同時に、又は後に大槽中にさらに投与される、請求項１〜８のいずれか一項に記載のＡＡＶ遺伝子治療ベクター。
10. 体重１キログラム当たり２×１０^１３〜２×１０^１５ゲノムコピーが対象に投与される、請求項１〜９のいずれか一項に記載のＡＡＶ遺伝子治療ベクター。
11. 体重１キログラム当たり８×１０^１３〜６×１０^１４ゲノムコピーが対象に投与される、請求項１０に記載のＡＡＶ遺伝子治療ベクター。
12. 前記対象は、頭蓋内圧を制御する、及び／又はＣＮＳ微小血管系の内皮細胞間の細胞間タイトジャンクションを破壊し得る、及び／又は化学療法薬などの薬物のＣＮＳへの送達を促進する物質による前処置を受けていない、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のＡＡＶ遺伝子治療ベクター。
13. 前記対象は、ＡＡＶ遺伝子治療ベクターの腰部髄腔内投与前に静脈内マンニトール前処置を受けていない、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のＡＡＶ遺伝子治療ベクター。
14. 哺乳動物対象はヒトである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のＡＡＶ遺伝子治療ベクター。
15. 自己相補的遺伝子ベクターではない、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のＡＡＶ遺伝子治療ベクター。

Images