KR20220009427A

KR20220009427A - 글리코시드 가수분해효소를 사용하는 망막 세포에 대한 유전자 치료 벡터의 개선된 전달

Info

Publication number: KR20220009427A
Application number: KR1020217040926A
Authority: KR
Inventors: 케이트린 크리스틴 메이어; 시비 릭하이트
Original assignee: 더 리서치 인스티튜트 앳 네이션와이드 칠드런스 하스피탈
Priority date: 2019-05-17
Filing date: 2020-04-15
Publication date: 2022-01-24
Also published as: EP3969060A1; EP3969059A1; AU2020278499A1; WO2020236352A1; JP2022533983A; JP2022533645A; CA3141020A1; TW202110486A; CA3141017A1; AU2020278960A1; AR118696A1; US20220226507A1; US20220233655A1; WO2020236351A1; CN114126667A

Abstract

본 개시내용은 뉴라미니다제(neuraminidase)와 같은 글리코시드 가수분해효소와 조합하여 최적화된 유전자 치료 벡터(optimized gene therapy vector)를 사용하여 망막 내의 특정 세포 유형을 표적화하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 개시내용은 망막 세포(retinal cell)를 특이적으로 표적화하기 위해 글리코시드 가수분해효소와 함께 투여되는 유전자 치료 벡터 및 시각 장애(visual impairment), 망막 변성(retinal degeneration) 및 시력 관련 장애(vision-related disorder)를 치료하는 방법을 제공한다.

Description

글리코시드 가수분해효소를 사용하는 망막 세포에 대한 유전자 치료 벡터의 개선된 전달

본 출원은 전문이 본 명세서에 참고로 포함된 2019년 5월 17일자로 출원된 미국 특허 출원 제62/849,794호에 대한 우선권을 주장한다.

전자 제출된 자료의 참조문헌으로 통합

본 개시내용의 일부인 서열 목록은 명세서와 함께 텍스트 파일로 제출된다. 서열 목록이 포함된 텍스트 파일의 이름은 " 55603_Seqlisting.txt"로 2020년 4월 13일에 생성되었으며 크기는 15,459바이트이다. 서열 목록의 내용은 그 전체가 참조로 본원에 포함된다.

기술 분야

본 개시내용은 글리코시드 가수분해효소 효소(glycoside hydrolase enzyme)와 조합하여 최적화된 유전자 치료 벡터(optimized gene therapy vector)를 사용하여 망막 내의 특정 세포 유형을 표적화하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 개시내용은 망막 세포(retinal cell)를 특이적으로 표적화하기 위한 유전자 치료 벡터 및 시각 장애(visual impairment), 망막 변성(retinal degeneration) 및 시력 관련 장애(vision-related disorders)를 치료하는 방법을 제공한다.

유전자 치료 벡터의 안구 투여는 눈 해부학에 잘 정의되었기 때문에 많은 이점이 있다. 특히 눈에 대한 접근이 용이하여 신속하고 점진적인 검사가 가능하다. 상대적으로 밀폐된 구조와 작은 크기의 눈은 전달을 위해 더 적은 양의 벡터를 필요로 한다. 혈액 망막 장벽은 벡터가 전신 순환으로 누출되는 것을 방지하여 상대적으로 면역이 유리한 환경을 유지한다. 특정 안구 장애에 주로 또는 부분적으로 관여하는 개별 또는 다중 유전자가 확인되었다.

유전자 치료 벡터의 안구 투여는 몇 가지 유망한 결과를 보여주었다. 현재 시력 상실 관련 질환을 대상으로 하는 임상 유전자 치료 시험이 많이 있으며, 이러한 임상 시험은 주로 유전성 망막 질환을 대상으로 한다. 예를 들어, 임상 시험에서 레베르 선천적 흑암증(LCA), 레베르 유전성 시신경병증 및 색소성 망막염을 조사하였다. 현재까지 AAV 벡터, 특히 AAV2 혈청형은 안구 유전자 요법에 가장 일반적으로 사용되었다. 문헌 [Lee et al., Progress in retinal and eye research 68: 31-53, 2019]를 참조한다.

신경세포 세로이드 리포푸신증 (NCL)은 심각한 신경퇴행성 질환의 군이고, 이는 통칭 바텐병으로 지칭된다. 이러한 장애는 신경계에 영향을 주며 전형적으로 예를 들어, 운동, 시력 및 사고 능력에서의 문제 악화를 유발한다. 다른 NCL은 유전적 원인으로 구분된다. 부분적 또는 완전한 시력 상실은 소아기에 바텐병이 있는 환자에서 종종 발생한다. 특히 바텐병을 앓고 있는 사람의 경우 리포푸신이 뇌와 망막을 비롯한 세포 내부에 축적된다. 리포푸신이 축적되면 망막, 시신경 및 시력을 처리하는 뇌 영역의 광수용기가 손상된다.

현재, 망막의 특정 세포 유형을 표적으로 하는 개선된 유전자 치료 방법이 필요하다. 더욱이, 현재 바텐병의 증상을 역전시킬 수 있는 치료법은 없다. 따라서, 바텐병에 대한 치료가 당업계에 필요하다.

본 개시내용은 특정 세포 유형, 예컨대 망막의 특정 세포 및 글리코시드 가수분해효소를 표적화하는 최적화된 유전자 치료 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다. 이러한 최적화된 유전자 치료 벡터는 글리코시드 가수분해효소의 투여와 조합하여 유리체 내 전달을 사용하여 특정 망막 세포에 이식유전자를 전달하는데 유용하다. 글리코시드 가수분해효소의 투여는 망막 내에서 유전자 치료 침투를 향상시켰다. 본 개시내용은 글리코시드 가수분해효소의 투여와 조합하여 유리체 내 전달을 사용하여 최적화된 유전자 치료 벡터를 투여하는 것을 포함하는 시력-관련 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 망막의 특정 세포 유형을 표적으로 하는 유전자 치료 방법은 시력 상실 관련 질병 치료에 이점이 있다.

본 개시내용은 유전자 치료 벡터 및 글리코시드 가수분해효소를 포함하는 조성물을 제공한다. 예를 들어, 글리코시드 가수분해효소는 뉴라미니다제, 락타제, 아밀라제, 키티나제, 셀룰라제, 수크라제, 말타제, 인버타제 또는 리소자임이다. 일부 실시양태에서, 유전자 치료 벡터는 AAV8, AA9 또는 Anc80이다.

예시적인 실시양태에서, 본 개시내용은 국소 정맥내 전달, 망막하 전달, 유리체내 전달, 뇌실내(intracerebroventricular) 또는 척수강내 전달을 위해 제형화된 조성물을 제공한다. 예를 들어, 본 개시내용은 유전자 치료 벡터 및 글리코시드 가수분해효소의 동시 투여를 위해 혼합된 것인 조성물을 제공한다.

또한, 본 개시내용은 유전자 치료 벡터 및 글리코시드 가수분해효소를 포함하는 대상체의 세포에 이식유전자를 전달하기 위한 키트(kit)를 제공한다. 예를 들어, 상기 세포는 망막 세포이다. 예시적인 실시양태에서, 글리코시드 가수분해효소 효소는 뉴라미니다제, 락타제, 아밀라제, 키티나제, 셀룰라제, 수크라제, 말타제, 인버타제, 또는 리소자임이다. 또한, 유전자 요법은 AAV8, AA9 또는 Anc80이다. 선택적으로, 키트는 유전자 치료 벡터 및 글리코시드 가수분해효소 효소를 대상체에게 전달하기 위한 설명서(instructions)를 포함한다.

본 개시내용은 i) 이식유전자를 코딩하는 유전자 치료 벡터 및 ii) 글리코시드 가수분해효소 효소를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체의 세포에 이식유전자를 전달하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 상기 세포는 망막 세포이다. 일부 실시양태에서, 글리코시드 가수분해효소 효소는 뉴라미니다제, 락타제, 아밀라제, 키티나제, 셀룰라제, 수크라제, 말타제, 인버타제 또는 리소자임이고/이거나 유전자 치료 벡터는 AAV8, AAV9 또는 Anc80이다. 본 개시내용은 유전자 치료 벡터 및/또는 글리코시드 가수분해효소가 국소 정맥내(IV) 전달, 망막하 전달, 유리체내 전달, 뇌실내 전달, 실질내 전달 또는 척수강내(뇌척수액) 전달을 사용하여 대상체에게 투여되는 방법을 제공한다. 예를 들어, 개시된 방법은 양극성 세포, 간상체 광수용체 세포, 원추형 광수용체 세포, 신경절 세포, 뮬러 신경교 세포, 미세아교 세포, 수평 세포 및/또는 무축삭 세포를 포함하나 이에 제한되지 않는 모든 망막 세포에 이식유전자를 전달하게 된다. 망막 세포로의 전달이 본원에 예시되어 있지만, 개시된 방법, 조성물 및 용도는 글리코시드 가수분해효소 효소가 세포막 상의 수용체를 제거하는 임의의 세포 유형을 표적으로 할 수 있다. 다른 세포 유형에는 근육 세포, 성상교세포, 뉴런, 희돌기교세포 및 백반 세포와 같은 신경 세포가 있다.

본 개시내용은 또한 대상체의 세포에 이식유전자를 전달하기 위한 조성물을 제공하며, 여기서 조성물은 i) 이식유전자를 코딩하는 유전자 치료 벡터 및 ii) 글리코시드 가수분해효소 효소를 포함한다. 예를 들어, 상기 세포는 망막 세포이다. 추가 실시양태에서, 본 개시내용은 이식유전자를 대상체의 망막 세포에 전달하기 위한 조성물을 제공하고, 여기서 조성물은 이식유전자를 코딩하는 유전자 치료 벡터를 포함하고, 여기서 조성물은 글리코시드 가수분해효소를 포함하는 제2 조성물과 함께 투여된다. 예를 들어, 조성물은 국소 정맥내 전달, 망막하 전달, 유리체내 전달, 수조내 주사(intracistermal injection), 뇌실내 전달, 근육내 전달 또는 척수강내 주사를 사용하여 유전자 치료 벡터를 투여하기 위해 제형화된다.

본 개시내용은 또한 대상체의 세포에 이식유전자를 전달하기 위한 의약의 제조를 위한 조성물의 용도를 제공하며, 여기서 조성물은 i) 이식유전자를 코딩하는 유전자 치료 벡터 및 ii) 글리코시드 가수분해효소 효소를 포함한다. 예를 들어, 상기 세포는 망막 세포이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 대상체의 망막 세포에 이식유전자를 전달하기 위한 의약의 제조를 위한 이식유전자를 코딩하는 유전자 치료 벡터의 용도를 제공하며, 여기서 의약은 글리코시드 가수분해효소를 포함하는 조성물과 함께 투여된다. 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 대상체의 망막 세포에 이식유전자를 전달하기 위한 의약의 제조를 위한 글리코시드 가수분해효소 효소의 용도를 제공하며, 여기서 의약은 이식유전자를 코딩하는 유전자 치료 벡터를 포함하는 조성물과 함께 투여된다. 예를 들어, 의약은 국소 정맥 내 전달, 망막하 전달, 유리체내 전달 또는 척수강내 전달을 사용하여 유전자 치료 벡터를 투여하기 위해 제형화된다.

본 개시내용은 또한 i) 이식유전자를 코딩하는 유전자 치료 벡터 및 ii) 글리코시드 가수분해효소 효소를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 시각 장애, 망막 변성 또는 시력 관련 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 글리코시드 가수분해효소 효소는 뉴라미니다제, 락타제, 아밀라제, 키티나제, 셀룰라제, 수크라제, 말타제, 인버타제 또는 리소자임이고/이거나 유전자 치료 벡터는 AAV8, AAV9 또는 Anc80이다. 본 개시내용은 유전자 치료 벡터 및/또는 글리코시드 가수분해효소가 국소 정맥내(IV) 전달, 망막하 전달, 유리체내 전달, 뇌실내 전달, 실질내 전달, 근육내 전달 또는 척수강내 전달을 사용하여 투여되는 방법을 제공한다.

본 개시내용은 또한 i) 이식유전자를 코딩하는 유전자 치료 벡터 및 ii) 글리코시드 가수분해효소 효소를 포함하는, 대상체의 시각 장애 또는 시력 관련 장애를 치료하기 위한 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 글리코시드 가수분해효소를 포함하는, 대상체의 시각 장애 또는 시력 관련 장애를 치료하기 위한 조성물을 제공하고, 여기서 조성물은 이식유전자를 코딩하는 유전자 치료 벡터를 포함하는 제2 조성물과 함께 투여된다. 예를 들어, 조성물은 국소 정맥내 전달, 망막하 전달, 유리체내 전달, 뇌실내 전달, 근육내 전달 또는 척수강내 전달을 사용하여 유전자 치료 벡터를 투여하기 위해 제형화된다.

추가 실시양태에서, 본 개시내용은 대상체에서 시각 장애 또는 시력 관련 장애를 치료하기 위한 의약 제조를 위한 조성물의 용도를 제공하며, 여기서 조성물은 이식유전자를 코딩하는 유전자 치료 벡터를 포함한다. 본 개시내용은 또한 대상체에서 시각 장애 또는 시력 관련 장애를 치료하기 위한 의약의 제조를 위한 이식유전자를 코딩하는 유전자 치료 벡터의 용도를 제공하며, 여기서 의약은 글리코시드 가수분해효소를 포함하는 조성물과 함께 투여된다. 또한, 본 개시내용은 대상체에서 시각 장애 또는 시력 관련 장애를 치료하기 위한 의약의 제조를 위한 글리코시드 가수분해효소의 용도를 제공하며, 여기서 의약은 이식유전자를 코딩하는 유전자 치료 벡터를 포함하는 조성물과 함께 투여된다. 예를 들어, 의약은 국소 정맥내 전달, 망막하 전달, 유리체내 전달, 뇌실내 전달, 근육내 전달 또는 척수강내 전달을 사용하여 유전자 치료 벡터를 투여하기 위해 제형화된다.

예를 들어, 시력 관련 장애는 바텐병, 선천 백내장, 선천 녹내장, 망막 변성, 시신경 위축, 눈 기형, 사시, 안구 정렬 불량(ocular misalignment), 녹내장, 습성 연령 관련 황반 변성(wet age-related macular degeneration), 건성 연령 관련 황반 변성(dry age-related macular degeneration), 색소성 망막염, 범맥락막위축(choroideremia), 레버 선천성 흑암시(Leber congenital amaurosis), 레버 유전성 시신경 병증, 조기 발병 망막 이영양증(early onset retinal dystrophy), 색맹, x-연관 망막층간분리(x-linked retinoschisis), 어셔 증후군 1B, 신생혈관 연령 관련 황반변성(neovascular age-related macular degeneration), 스타가르트 황반변성, 당뇨병성 황반변성 또는 당뇨병성 황반부종이다. 특정 실시양태에서, 시력-관련 장애는 CLN 바텐병, 예컨대 CLN1 질환, CLN2 질환, CLN3 질환, CLN4 질환, CLN5 질환, CLN6 질환 또는 CLN8 질환이다.

개시된 방법, 용도 또는 조성물 중 임의의 것에서, 이식유전자는 관심 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이거나, siRNA 또는 miRNA와 같은 관심 유전자의 발현을 억제, 방해 또는 침묵시키는 핵산이다. 예시적인 이식유전자는 RPE65, RPGR, ORF15, CNGA3, CMH, ND4, PDE6B, ChR2, MERTK, hRS1, hMYOJA, hABCA4, CD59, 항-hVEGF 항체, 엔도스타틴-안지오스타틴, sFLT01, 또는 sFLT-1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드이다. 추가의 예시적인 이식유전자는 RTP801에 대한 siRNA, VEGFR-1에 대한 siRNA, VEGF에 대한 siRNA, 또는 ADRB2에 대한 siRNA를 포함한다. 한 실시양태에서, 이식유전자는 CLN 폴리펩티드, 예컨대 CLN1, CLN2, CLN3, CLN4, CLN5, CLN6 또는 CLN8을 코딩한다.

본원에 개시된 방법, 조성물 또는 용도 중 임의의 것에서, 유전자 치료 벡터 및 글리코시드 가수분해효소는 동시에 또는 순차적으로 투여된다. 또한, 임의의 개시된 방법, 조성물 또는 용도에서, 유전자 치료 벡터 및 글리코시드 가수분해효소는 동일한 전달 방식을 사용하여 투여되거나 각각에 대해 투여되거나, 또는 각각에 대해 상이한 전달 방식을 사용하여 투여된다. 개시된 방법, 용도 또는 조성물 중 임의의 것에서, 유전자 치료 벡터 및 글리코시드 가수분해효소 효소는 단일 투여로 투여되며, 예를 들어 유전자 치료 벡터 및 글리코시드 가수분해효소가 혼합된다. 대안적으로, 유전자 치료 벡터와 글리코시드 가수분해효소는 별도로 투여된다. 일부 실시양태에서, 글리코시드 가수분해효소는 유전자 치료 벡터의 투여보다 적어도 약 30분 전에 투여된다.

개시된 방법, 용도 또는 조성물 중 임의의 것에서, 유전자 치료 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVRH10, AAVRH74, AAV11, AAV12, AAV13, AAVTT 또는 Anc80, AAV7m8 및 이들의 유도체이다.

개시된 방법, 용도 또는 조성물 중 임의의 것에서, 유전자 치료 벡터는 CMV 프로모터, p546, 또는 CB 프로모터를 포함한다.

또한, 개시된 방법, 용도 또는 조성물 중 임의의 것에서, 유전자 치료 벡터 및/또는 글리코시드 가수분해효소는 척수강내 전달을 사용하여 투여되고, 방법은 유전자 치료 벡터의 투여 후에 대상체를 트렌델렌버그 위치로 배치하는 것을 추가로 포함한다.

제공된 임의의 방법, 용도 및 조성물 중 임의의 것에서, 조성물은 비이온성, 저삼투압 조영제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 조성물은 이오비트리돌, 이오헥솔, 이오메프롤, 이오파미돌, 이오펜톨, 이오푸로미드, 이오베르솔, 이옥실란, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 비이온성 저삼투압 조영제를 포함할 수 있다.

도 1은 본 개시내용에서 시험된 벡터의 개략도를 제공한다.
도 2는 유리체내 전달 후 GFP 이식유전자의 망막 전달을 보여주고, 뉴라미니다제와의 조합 투여가 이식유전자의 침투를 향상시킴을 입증한다.
도 3은 8주 야생형 쥐에서 뉴라미니다제가 있거나 없는 유리체내 주사 타이밍을 자세히 설명하는 개략도를 제공한다.
도 4a-4c는 뉴라미니다제의 첨가가 양극성 세포의 바이러스 형질도입을 유의하게 증가시킨다는 것을 입증한다. 조직은 양극성 세포 특이적 마커인 GFP 및 Otx에 대해 염색되었다.

시력 관련 장애를 치료하기 위해 눈을 표적화하기 위한 AAV 유전자 치료의 최적화는 다양한 세포 유형의 특정 표적화를 필요로 한다. 본 개시내용은 쥐 및 비인간 영장류의 망막에서 특정 세포 유형으로의 이식유전자의 전달을 표적화하기 위한 최적의 유전자 치료 벡터를 결정하기 위해 상이한 유전자 치료 벡터, 프로모터 및 투여 경로를 비교하는 실험 데이터를 제공한다.

데이터는 AAV9 및 Anc80 벡터의 투여에 초점을 맞추지만, 본 개시내용은 망막 세포를 특이적으로 표적화하는 프로모터를 포함하는 임의의 유전자 치료 벡터를 사용하는 것을 고려하고, 이러한 최적화된 벡터는 국소 정맥내(IV) 전달, 망막하 전달, 유리체내 전달, 뇌실내 전달, 근육내 전달, 실질내 전달 또는 척수강내 전달을 사용하여 투여된다. 예를 들어, 데이터는 뇌실내 주사를 통해 뇌척수액에 직접 주사된 AAV9가 망막의 양극성 세포에서 이식유전자 발현을 표적화하는 데 효과적임을 입증하였다. 따라서, 척수강내 주사는 유전자 치료 벡터를 눈에 전달하기 위해, 특히 유전자 치료 벡터를 양극성 세포에 전달하기 위해 사용될 수 있다.

유전자 치료 벡터

아데노-관련 바이러스 (AAV)는 복제 결핍 파보바이러스(replication-deficient parvovirus)이며, 이의 단일 가닥 DNA 게놈은 2개의 145 뉴클레오티드 역전 말단 반복부 (ITR)를 포함하는 약 4.7 kb 길이이고, 그의 바이러스 또는 이들의 유도체에 대해 사용될 수 있다. 용어는 다르게 명시된 경우를 제외하고 모든 아류형 및 자연 발생형과 재조합 형을 모두 포함한다. AAV의 다중 혈청형이 존재한다. AAV의 혈청형은 각각 특정 클레드(clade)와 관련되며, 그 구성원은 혈청학적 및 기능적 유사성을 공유한다. 따라서, AAV는 클레드로 칭할 수도 있다. 예를 들어, AAV9 서열은 "클레드 F" 서열로 칭한다 (문헌 [Gao et al., J. Virol., 78: 6381-6388 (2004)]). 본 발명은 특정 클레드, 예를 들어 클레드 F 내의 임의의 서열의 사용을 고려한다. AAV 혈청형의 게놈의 뉴클레오티드 서열은 공지되어 있다. 예를 들어, AAV-1의 완전한 게놈은 GenBank Accession No. NC_002077에 제공되고; AAV-2의 완전한 게놈은 GenBank Accession No. NC_001401 및 문헌 [Srivastava et al., J. Virol., 45: 555-564 (1983)]에 제공되고; AAV-3의 완전한 게놈은 GenBank Accession No. NC_1829에 제공되고; AAV-4의 완전한 게놈은 GenBank Accession No. NC_001829에 제공되고; AAV-5 게놈은 GenBank Accession No. AF085716에 제공되고; AAV-6의 완전한 게놈은 GenBank Accession No. NC_00 1862에 제공되고; AAV-7 및 AAV-8 게놈의 적어도 일부는 각각 GenBank Accession Nos. AX753246 및 AX753249에 제공되고; AAV-9 게놈은 문헌 [Gao et al., J. Virol., 78: 6381-6388 (2004)]에 제공되고; AAV-10 게놈은 문헌 [Mol. Ther ., 13(1): 67-76 (2006)]에 제공되고; AAV-11 게놈은 문헌 [Virology, 330(2): 375-383 (2004)]에 제공되고; AAV-12 게놈의 일부는 Genbank Accession No. DQ813647에 제공되며; AAV-13 게놈의 일부는 Genbank Accession No. EU285562에 제공된다. AAV rh.74 게놈의 서열은 본원에 참조로 인용되는 미국 특허 제 9,434,928호에 제공된다. AAV-B1 게놈의 서열은 문헌 [Choudhury et al., Mol . Ther., 24(7): 1247-1257 (2016)]에 제공된다. Anc80은 AAV1, AAV2, AAV8 및 AAV9의 AAV 벡터이다. Anc80의 서열은 문헌 [Zinn et al., Cell Reports 12: 1056-1068, 2015, Vandenberghe et al], PCT/US2014/060163에서 제공되며, 이들 둘 모두는 전문이 본원에 참조로 포함되고 GenBank 수탁 번호 KT235804-KT235812이다.

바이러스 DNA 복제 (rep), 이입(encapsidation)/포장 및 숙주 세포 염색체 통합을 지시하는 시스-작용 서열이 ITR 내에 포함된다. 3개의 AAV 프로모터 (이들의 상대적 맵 위치에 대하여 p5, p19, 및 p40으로 명명됨)는 rep 및 cap 유전자를 코딩하는 2개의 AAV 내부 개방 판독 프레임의 발현을 구동한다. 단일 AAV 인트론 (뉴클레오티드 2107번 및 2227번)의 차등 스플라이싱과 결합된 2개의 rep 프로모터 (p5 및 p19)는 rep 유전자로부터 4개의 rep 단백질 (rep78, rep68, rep52 및 rep40)을 생성한다. Rep 단백질은 바이러스성 게놈 복제에 궁극적인 원인으로 작용하는 다중 효소 특성을 갖는다. cap 유전자는 p40 프로모터로부터 발현되며, 3개의 캡시드 단백질 VP1, VP2 및 VP3을 코딩한다. 대안적 스플라이싱 및 비-공통 번역 개시 부위는 세 가지 관련 캡시드 단백질의 제조에 관여한다. 단일 공통 폴리아데닐화 부위는 AAV 게놈의 맵 위치 95에 위치한다. AAV의 생애 주기 및 유전학은 문헌[Muzyczka, Current Topics in Microbiology and Immunology, 158: 97-129 (1992)]에서 검토된다.

AAV는 예를 들어, 유전자 치료에서 세포에 외래 DNA를 전달하기 위한 벡터로서 이를 매력적인 후보로 만드는 고유 특성을 갖는다. 배양 중인 세포의 AAV 감염은 비-세포변성성이며(noncytopathic), 인간과 기타 동물의 자연적 감염은 침묵성이고 무증상성이다. 더욱이, AAV는 생체내 다수의 상이한 조직을 표적화할 가능성이 존재하는 다수의 포유동물 세포를 감염시킨다. 더욱이, AAV는 분할 및 비분할 세포를 서서히 형질도입하고, 상기 세포의 생존 기간 동안 본질적으로 전사 활성 핵 에피솜 (염색체외 요소)으로서 유지할 수 있다. 천연(native) AAV 프로바이러스(proviral) 게놈은 재조합 게놈의 구축을 실현 가능하게 하는 플라스미드 내 클로닝된 DNA로서 감염성이다. 또한, AAV 복제, 게놈 이입 및 통합을 지시하는 신호가 AAV 게놈의 ITR 내에 포함되기 때문에, (복제 및 구조 캡시드 단백질, rep-cap을 코딩하는) 게놈의 내부 약 4.3kb의 일부 또는 전부가 외래 DNA, 예컨대 프로모터를 함유하는 유전자 카세트, 관심 DNA 및 폴리아데닐화 신호에 의해 대체될 수 있다. 일부 경우에, rep 단백질과 cap 단백질이 트랜스로 제공된다. AAV의 또 다른 중요한 특징은 이것이 매우 안정적이며 왕성한 바이러스라는 것이다. 이는 아데노바이러스를 비활성화시키는 데 사용되는 조건 (수 시간 동안 56°C 내지 65°C)을 용이하게 견딤으로써 AAV의 저온 보존의 중요성을 감소시킨다. AAV는 심지어 동결건조될 수 있다. 마지막으로, AAV-감염된 세포는 중복감염(superinfection)에 저항성이 아니다.

본원에 사용된 용어 "AAV"는 야생형 AAV 바이러스 또는 바이러스 입자를 지칭한다. 용어 "AAV", "AAV 바이러스" 및 "AAV 바이러스 입자"는 본원에서 상호 교환적으로 사용된다. 용어 "rAAV"는 재조합 AAV 바이러스 또는 재조합 감염성, 캡슐화 된 바이러스 입자를 지칭한다. 용어 "rAAV", "rAAV 바이러스" 및 "rAAV 바이러스 입자"는 본원에서 상호 교환적으로 사용된다.

용어 "rAAV 게놈"은 변형된 천연 AAV 게놈으로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 일부 실시양태에서, rAAV 게놈은 천연 cap 및 rep 유전자를 제거하도록 변형되었다. 일부 실시양태에서, rAAV 게놈은 내인성 5 '및 3' 역전 말단 반복부 (ITR)를 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 게놈은 AAV 게놈이 유래된 AAV 혈청형과 상이한 AAV 혈청형으로부터의 ITR을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 게놈은 역전 말단 반복부 (ITR)에 의해 5 '및 3' 말단에 인접한 관심 이식유전자를 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 게놈은 "유전자 카세트"를 포함한다.

용어 "scAAV"는 자가-보완적 게놈을 포함하는 rAAV 바이러스 또는 rAAV 바이러스 입자를 지칭한다. 용어 "ssAAV"는 단일 가닥 게놈을 포함하는 rAAV 바이러스 또는 rAAV 바이러스 입자를 지칭한다.

일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 rAAV 게놈은 이식유전자 폴리뉴클레오티드 서열에 인접한 하나 이상의 AAV ITR을 포함한다. 이식유전자 폴리뉴클레오티드 서열은 유전자 카세트를 형성하기 위한 표적 세포에서 기능적인 전사 조절 요소 (프로모터, 인핸서 및/또는 폴리아데닐화 신호 서열을 포함하지만 이에 한정되지는 않음)에 작동 가능하게 연결된다. 프로모터의 예는 CMV 프로모터, 치킨 β 액틴 프로모터 (CB), 및 P546 프로모터이다. 본원에서 고려되는 추가의 프로모터는, 유인원 바이러스 40(SV40) 초기 프로모터, 쥐 유방 종양 바이러스(MMTV), 인간 면역 결핍 바이러스(HIV) 긴 말단 반복부(LTR) 프로모터, MoMuLV 프로모터, 조류 백혈병 바이러스 프로모터, 엡스타인-바 바이러스 직접형 초기 프로모터, 라우스 육종 바이러스 프로모터 뿐만 아니라 인간 유전자 프로모터, 예컨대 비제한적으로 액틴 프로모터, 미오신 프로모터, 신장 인자-1a 프로모터, 헤모글로빈 프로모터, 및 크레아틴 키나제 프로모터를 포함하지만 이들로 제한되지는 않는다.

전사 촉진 활성을 발현하는 CMV, CB, 또는 P546 서열의 뉴클레오티드 서열에 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 프로모터 서열, CMV 프로모터 서열, CB 프로모터 서열, 및 P546 프로모터 서열이 본원에서 추가적으로 제공된다.

전사 조절 요소의 다른 예는 조직 특이적 조절 요소, 예를 들어 뉴런 내에서 또는 특히 성상교세포 내에서 특이적으로 발현을 허용하는 프로모터이다. 예는 뉴런 특이적 에놀라아제 및 신경교세포 섬유성 산성 단백질 프로모터를 포함한다. 유도성 프로모터가 또한 고려된다. 유도성 프로모터의 비제한적인 예는 메탈로티오닌 프로모터, 글루코코르티코이드 프로모터, 프로게스테론 프로모터, 및 테트라사이클린-조절 프로모터를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 상기 유전자 카세트는 또한 포유류 세포에서 발현될 때 이식유전자 RNA 전사체의 가공을 용이하게 하기 위한 인트론 서열을 포함할 수 있다. 그러한 인트론의 한 예는 SV40 인트론이다.

"포장"은 AAV 입자의 조립(assembly) 및 이입(encapsidation)을 초래하는 일련의 세포내 사건을 지칭한다. "제조"란 용어는 포장 세포에 의해 rAAV (감염성, 이입된 rAAV 입자)를 생성하는 과정을 지칭한다.

AAV "rep" 및 "cap" 유전자는 각각 아데노-관련 바이러스의 복제 및 이입 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. AAV rep 및 cap은 본원에서 AAV "포장 유전자"로 지칭된다.

AAV에 대한 "헬퍼 바이러스"는 AAV (예를 들어, 야생형 AAV)가 포유류 세포에 의해 복제되고 포장될 수 있게 하는 바이러스를 지칭한다. 아데노 바이러스, 헤르페스 바이러스 및 우두 바이러스와 같은 폭스 바이러스를 비롯한 AAV에 대한 다양한 헬퍼 바이러스가 당업계에 공지되어 있다. 서브그룹 C의 아데노바이러스 유형 5가 가장 보편적으로 사용되지만, 아데노바이러스는 다수의 상이한 서브그룹을 포함할 수 있다. 사람, 비인간 포유류, 및 조류 기원의 수 많은 아데노 바이러스가 공지되어 있고 ATCC와 같은 보관소에서 입수할 수 있다. 헤르페스 패밀리의 바이러스에는 예를 들어 헤르페스 심플렉스 바이러스 (HSV) 및 엡스타인-바 바이러스 (EBV)뿐만 아니라 거대 세포 바이러스 (CMV) 및 가성광견병 바이러스 (PRV)가 포함되고, 이들 또한 ATCC와 같은 보관소에서 입수할 수 있다.

"헬퍼 바이러스 기능(들)"이란 AAV 복제 및 포장을 (본원에 설명된 복제 및 포장에 대한 다른 요구 사항과 함께) 허용하는 헬퍼 바이러스 게놈에서 코딩된 기능(들)을 의미한다. 본원에 기재된 바와 같이, "헬퍼 바이러스 기능"은 헬퍼 바이러스를 제공하거나, 예를 들어 필요한 기능(들)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 트랜스로 제조 세포에 제공하는 것을 포함하는 많은 방법으로 제공될 수 있다.

본원에서 제공된 rAAV 게놈에는 AAV rep 및 cap DNA가 없다. 본원에서 고려되는 rAAV 게놈의 AAV DNA (예를 들어, ITR)는 AAV 혈청형 Anc80, AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11, AAV-12, AAV-13, AAV rh.74 및 AAV-B1를 포함하지만 이에 제한되지 않는 재조합 바이러스를 유래하기에 적합한 임의의 AAV 혈청형으로부터 온 것일 수 있다. 상기 언급한 바와 같이, 다양한 AAV 혈청형의 게놈의 뉴클레오티드 서열은 당업계에 공지되어 있다. 캡시드 돌연변이를 갖는 rAAV 또한 고려된다. 예를 들어 문헌 [Marsic et al., Molecular Therapy, 22(11): 1900-1909 (2014)]를 참조한다. 본원에서 변형된 캡시드가 또한 고려되고, 글리코실화 및 탈아미드화와 같은 다양한 번역 후 변형을 갖는 캡시드를 포함한다. 아스파라긴 잔기의 아스파트산 또는 이소아스파트산 잔기로의 전환, 및 글루타민의 글루탐산 또는 이소글루탐산으로의 전환을 초래하는 아스파라긴 또는 글루타민 측쇄의 탈아미드화가 본원에 제공된 rAAV 캡시드에서 고려된다. 예를 들어 문헌 [Giles et al., Molecular Therapy, 26(12): 2848-2862 (2018)]를 참조한다. 본원에서 변형된 캡시드는 또한 치료를 필요로 하는 영향 받은 조직(affected tissues) 및 기관으로 rAAV를 향하게 하는 표적화 서열을 포함하는 것으로 고려된다.

본원에서 제공된 DNA 플라스미드는 본원에 기술된 rAAV 게놈을 포함한다. DNA 플라스미드는 rAAV 게놈을 AAV9 캡시드 단백질을 갖는 감염성 바이러스 입자로 조립하기 위해 AAV의 헬퍼 바이러스 (예를 들어, 아데노 바이러스, E1-결실 아데노 바이러스 또는 헤르페스 바이러스)로의 감염 가능한 세포로 전달될 수 있다. 포장될 AAV 게놈, rep 및 cap 유전자, 및 헬퍼 바이러스 기능이 세포에 제공되는 rAAV 제조 기술은 당업계에서 표준이다. rAAV 입자의 제조는 하기의 구성 요소가 단일 세포 (본원에서는 포장 세포로서 지칭됨) 내에 존재할 것을 요구한다: rAAV 게놈, rAAV 게놈으로부터 분리된 (즉, 이의 내부에 존재하지 않음) AAV rep 및 cap 유전자, 및 헬퍼 바이러스 기능. AAV rep 및 cap 유전자는, 재조합 바이러스가 유도될 수 있는 임의의 AAV 혈청형으로부터 유래될 수 있고, rAAV 게놈 ITR과 상이한 AAV 혈청형으로부터 유래될 수 있다. 위형(pseudotyped) rAAV의 제조는 예를 들어, 이의 전체가 본원에 참조로 포함되는 WO 01/83692에 개시되어 있다. 다양한 실시양태에서, AAV 캡시드 단백질은 재조합 rAAV의 전달을 향상시키도록 변형될 수 있다. 캡시드 단백질에 대한 변형은 일반적으로 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 이들의 개시내용 전체가 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 제2005/0053922호 및 제2009/0202490호를 참조한다.

포장 세포를 생성하는 방법은 rAAV 제조에 필요한 모든 구성 요소를 안정적으로 발현하는 세포주를 제조하는 것이다. 예를 들어, AAV rep 및 cap 유전자가 결여된 rAAV 게놈, rAAV 게놈으로부터 분리된 AAV rep 및 cap 유전자, 및 선택 가능한 마커, 예컨대 네오마이신 내성 유전자를 포함하는 하나의 플라스미드 (또는 다수의 플라스미드)가 세포의 게놈 내에 통합될 수 있다. rAAV 게놈은 하기와 같은 절차에 의해 박테리아 플라스미드로 도입될 수 있다: GC 테일링 (문헌 [Samulski et al., 1982, Proc. Natl. Acad. S6. USA, 79:2077-2081)]), 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위를 함유하는 합성 링커의 부가 (문헌 [Laughlin et al., 1983, Gene, 23:65-73)]) 또는 직접, 블런트(blunt)-말단 결찰 (문헌 [Senapathy & Carter, 1984, J. Biol. Chem., 259:4661-4666)]). 포장 세포주는 이후 아데노바이러스와 같은 헬퍼 바이러스로 감염될 수 있다. 이 방법의 장점은 세포가 선택 가능하고 rAAV의 대규모 제조에 적합하다는 것이다. 적합한 방법의 다른 예는 rAAV 게놈 및/또는 rep 및 cap 유전자를 포장 세포로 도입하기 위해 플라스미드보다는 아데노바이러스 또는 바큘로바이러스를 이용한다.

rAAV 입자 제조의 일반 원칙은 예를 들어 문헌 [Carter, 1992, Current Opinions in Biotechnology, 1533-539; and Muzyczka, 1992, Curr. Topics in Microbial. and Immunol., 158:97-129)]에서 검토된다. 다양한 접근법이 문헌 [Ratschin et al., Mol. Cell. Biol. 4:2072 (1984); Hermonat et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6466 (1984); Tratschin et al., Mo1. Cell. Biol. 5:3251 (1985); McLaughlin et al., J. Virol., 62:1963 (1988); and Lebkowski et al., 1988 Mol. Cell. Biol., 7:349 (1988). Samulski et al. (1989, J. Virol., 63:3822-3828)]; 미국등록특허 5,173,414; WO 95/13365 및 상응하는 미국등록특허 5,658.776 ; WO 95/13392; WO 96/17947; PCT/US98/18600; WO 97/09441 (PCT/US96/14423); WO 97/08298 (PCT/US96/13872); WO 97/21825 (PCT/US96/20777); WO 97/06243 (PCT/FR96/01064); WO 99/11764; 문헌 [Perrin et al. (1995) Vaccine 13:1244-1250; Paul et al. (1993) Human Gene Therapy 4:609-615; Clark et al. (1996) Gene Therapy 3:1124-1132]; 미국등록특허 5,786,211; 미국등록특허 5,871,982; 및 미국등록특허 제 6,258,595호에 기재된다. 상기 문헌들은 rAAV 입자 제조와 관련된 문헌의 해당 부분이 특히 강조되어 이의 전체내용이 본원에서 참조로 포함된다.

감염성 rAAV 입자를 제조하는 포장 세포가 추가로 본원에 제공된다. 일 실시양태에서, 포장 세포는 HeLa 세포, 293 세포 및 PerC.6 세포 (동원 293 계열)와 같은 안정적으로 변형된 암세포일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 포장 세포는, 변형된 암 세포, 예컨대 낮은 계대 293 세포 (아데노바이러스의 E1로 변형된 인간 태아 신장 세포), MRC-5 세포 (인간 태아 섬유아세포), WI-38 세포 (인간 태아 섬유아세포), 베로 세포 (원숭이 신장 세포) 및 FRhL-2 세포 (레서스 태아 폐 세포)가 아닌 세포일 수 있다.

또한, 본 개시내용의 rAAV 게놈을 포함하는 rAAV (예를 들어, 감염성 이입된 rAAV 입자)가 본원에 제공된다. rAAV의 게놈은 AAV rep 및 cap DNA가 없으며, 즉 rAAV의 게놈의 ITR 사이에 AAV rep 또는 cap DNA가 없다. rAAV 게놈은 자가-상보적(sc) 게놈일 수 있다. sc 게놈을 갖는 rAAV는 본원에서 scAAV로 지칭된다. rAAV 게놈은 단일 가닥(ss) 게놈일 수 있다. 단일 가닥 게놈을 갖는 rAAV는 본원에서 ssAAV로 지칭된다.

rAAV는 칼럼 크로마토그래피 또는 염화 세슘 구배와 같은 당업계의 표준 방법에 의해 정제될 수 있다. 헬퍼 바이러스로부터 rAAV를 정제하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌 [Clark et al., Hum. Gene Ther ., 10(6): 1031-1039 (1999); Schenpp and Clark, Methods Mol . Med ., 69: 427-443 (2002)]; 미국 등록 특허 제 6,566,118호 및 국제 공개 WO 98/09657호에 기재된 방법을 포함할 수 있다.

rAAV를 포함하는 조성물도 제공된다. 조성물은 CLN6 폴리펩티드를 코딩하는 rAAV를 포함한다. 조성물은 관심있는 상이한 폴리펩티드를 코딩하는 두 개 이상의 rAAV를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, rAAV는 scAAV 또는 ssAAV이다.

본원에서 제공된 조성물은 rAAV 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함한다. 허용가능한 부형제는 수용체에게 비독성이며, 바람직하게는 사용된 투여량 및 농도에서 불활성이고, 인산염 [예를 들어, 인산 완충 생리식수염(PBS)], 시트르산 또는 다른 유기산과 같은 완충제; 아스코르브산과 같은 항산화제; 저분자량 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 라이신과 같은 아미노산; 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물, 예컨대 포도당, 만노오스 또는 덱스트린; EDTA와 같은 킬레이트제; 만니톨 또는 소르비톨과 같은 당 알콜; 나트륨과 같은 염-형성 대이온(counterion); 및/또는 트윈, 공중합체, 예컨대 폴록사머 188, 플루로닉스(예: 플루로닉 F68) 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 비이온성 계면 활성제를 포함하지만 이들로 제한되지는 않는다. 본원에서 제공되는 조성물은 비이온성 저삼투압 화합물, 예컨대 이오비트리돌, 이오헥솔, 이오메프롤, 이오파미돌, 이오펜톨, 이오프로미드, 이오베르솔, 또는 이옥실란을 함유하는 약학적으로 허용되는 수성 부형제를 포함하고, 상기 비이온성 저삼투압 화합물을 포함하는 수성 부형제는 약 180 mgI/mL, 약 322mOsm/kg 물의 증기압 삼투압, 약 273mOsm/L의 삼투압, 20 ℃에서 약 2.3cp 및 37 ℃에서 약 1.5cp의 절대 점도, 및 37 ℃에서 약 1.164의 특정 비중, 중 하나 이상의 특징을 가질 수 있다. 예시적인 조성물은 약 20 내지 40% 비이온성 저삼투압 화합물 또는 약 25% 내지 약 35% 비이온성 저삼투압 화합물을 포함한다. 예시적인 조성물은 20mM 트리스 (pH8.0), 1mM MgCl₂ _, 200mM NaCl, 0.001% 폴록사머 188 및 약 25% 내지 약 35% 비이온성 저삼투압 화합물로 제제화된 scAAV 또는 rAAV 바이러스 입자를 포함한다. 또 다른 예시적인 조성물은 1X PBS 및 0.001% 플루로닉 F68로 제제화된 scAAV를 포함한다.

본 개시내용의 방법에서 투여될 rAAV의 투여량은 예를 들어 특정 rAAV, 투여 방식, 투여 시간, 치료 목표, 개체, 및 표적화되는 세포 유형에 따라 달라질 것이며, 당업계의 표준 방법에 의해 결정될 수 있다. 투여량은 또한 바이러스 게놈 (vg)의 단위로 표현될 수 있다. 본원에서 고려되는 투여량은 약 1x10⁷, 1x10⁸, 1x10⁹ ,5x10⁹, 6 x10⁹, 7x10⁹, 8x10⁹, 9x10⁹, 1x10¹⁰, 2x10¹⁰, 3x10¹⁰, 4x10¹⁰, 5x10¹⁰,1x10¹¹, 약 1x10¹², 약 1x10¹³, 약 1.1x10¹³, 약 1.2x10¹³, 약 1.3x10¹³, 약 1.5x10¹³, 약 2 x10¹³, 약 2.5 x10¹³, 약 3 x 10¹³, 약 3.5 x 10¹³, 약 4x 10¹³, 약 4.5x 10¹³, 약 5 x 10¹³, 약 6x10¹³, 약 1x10¹⁴, 약 2 x10¹⁴, 약 3 x 10¹⁴, 약 4x 10¹⁴, 약 5x10¹⁴, 약 1x10¹⁵, 내지 약 1x10¹⁶, 또는 그 이상의 총 바이러스 게놈을 포함한다. 약 1x10⁹ 내지 약 1 x10¹⁰, 약 5x 10⁹ 내지 약 5 x10¹⁰, 약 1x10¹⁰ 내지 약 1x 10¹¹, 약 1x10¹¹ 내지 약 1x10¹⁵ vg, 약 1x10¹² 내지 약 1x10¹⁵ vg, 약 1x10¹² 내지 약 1x10¹⁴ vg, 약 1x10¹³ 내지 약 6x10¹⁴ vg, 및 약 6x10¹³ 내지 약 1.0x10¹⁴ vg의 투여량이 또한 고려된다. 본원에서 예시된 일 투여량은 6Х10¹³ vg이다. 본원에서 예시된 또 다른 투여량은 1.5x10¹³ vg이다.

rAAV로 표적 망막 세포를 형질도입하는 방법이 제공된다. 망막 세포는 양극성 세포, 간상체 광수용체 세포, 원추형 광수용체 세포, 신경절 세포, 뮬러 신경교 세포, 미세아교 세포, 수평 세포 또는 무축삭 세포를 포함한다.

용어 "형질도입"은, 수용체 세포에 의한 기능적 폴리펩티드의 발현을 초래하는 본 개시내용의 복제-결여 rAAV를 통한, 생체내 또는 시험관내에서 표적 세포로의 CLN6 폴리뉴클레오티드의 투여/전달을 지칭하기 위하여 사용된다. 본 개시내용의 rAAV로 세포를 형질 도입하면 rAAV에 의해 코딩된 폴리펩티드 또는 RNA가 지속적으로 발현된다. 따라서, 본 개시내용은 척수강내, 국부 IV 전달, 뇌실내, 근육내, 망막하 주사, 유리체내 전달 또는 실질 내 전달, 또는 이들의 임의의 조합에 의해 대상체에게 이식유전자 코딩된 폴리펩티드를 코딩하는 rAAV를 투여/전달하는 방법을 제공한다. 척수강 내 전달은 뇌 또는 척수의 거미 막 아래 공간으로의 전달을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 척수강 내 투여는 수조 내(intracisternal) 투여를 통한 것이다.

이식유전자

임의의 관심 이식유전자를 망막 세포에 전달하는 개시된 방법. 이식유전자는 관심 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이거나 siRNA 또는 miRNA와 같은 관심 유전자의 발현을 억제, 방해 또는 침묵시키는 핵산이다.

예시적인 이식유전자는 RPE65, RPGR, ORF15, CNGA3, CMH, ND4, PDE6B, ChR2, MERTK, hRS1, hMYOJA, hABCA4, CD59, 항-hVEGF 항체, 엔도스타틴-안지오스타틴, sFLT01, 또는 sFLT-1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드이다. 한 실시양태에서, 이식유전자는 CLN 폴리펩티드, 예컨대 CLN1, CLN2, CLN3, CLN4, CLN5, CLN6 또는 CLN8을 코딩한다. 추가의 예시적인 이식유전자는 RTP801에 대한 siRNA, VEGFR-1에 대한 siRNA, VEGF에 대한 siRNA, 또는 ADRB2에 대한 siRNA를 포함한다.

망막에서 발현되는 miRNA는 개시된 최적화된 유전자 치료 벡터에 포함되는 이식유전자로서 고려된다. miRNA의 예는 문헌 [Karali et al., Nucleic Acids Res. 2016 Feb 29; 44(4): 1525-1540]에서 제공되고, 이는 본원에 참조로 포함된다.

본원에 제공된 rAAV 게놈은 RPE65, RPGR, ORF15, CNGA3, CMH, ND4, PDE6B, ChR2, MERTK, hRS1, hMYOJA, hABCA4, CD59, PEDF, 엔도스타틴-안지오스타틴 유전자, sFLT-1, 항-hVEGF 항체를 코딩하는 유전자 중 어느 하나를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 이식유전자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 이식유전자에 의해 코딩된 폴리펩티드는 이식유전자 서열에 의해 코딩된 아미노산과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.

본원에서 제공되는 rAAV 게놈은 CLN1, CLN2, CLN3, CLN4, CLN5, CLN6 및 CLN8과 같은 CLN 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 폴리펩티드는 CLN 폴리펩티드 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하고, 이는 CLN 활성 (예를 들어, 리소좀 자동 형광 저장 물질의 제거 증가, ATP 합성 효소 서브 유닛 C의 리소좀 축적 감소, 및 예를 들어 치료 전 환자와 비교하여 치료될 때 환자에서 성상교세포 및 미세교세포의 활성화 감소 중 적어도 하나)을 갖는 폴리펩티드를 코딩한다.

본원에서 제공된 rAAV 게놈은 CLN 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 CLN 활성 (예를 들어, 리소좀 자동 형광 저장 물질의 제거 증가, ATP 신타제 서브 유닛 C의 리소좀 축적 감소, 및 예를 들어 치료 전 환자와 비교하여 치료될 때 환자의 성상교세포 및 미세교세포의 활성 감소 중 적어도 하나)을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

일부 실시양태에서, 본원에서 제공되는 rAAV 게놈은 원하는 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하고 엄격한 조건 하에 공지된 관심 이식유전자의 핵산 서열 중 어느 하나 또는 그의 상보체에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 이식유전자를 포함한다. 다른 실시양태에서, 본원에서 제공되는 rAAV 게놈은 CLN 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하고 엄격한 조건 하에 CLN 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열 중 어느 하나 또는 그의 상보체에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.

다음은 시각적 구성 요소에 중점을 둔 각 바텐병 하위 유형의 질병 특성을 간략하게 설명한다. "1차 영향을 받는 망막 세포" 열에 포함된 데이터는 쥐 망막에서 수집한 단일 세포 RNA 데이터를 기반으로 결정되었다. 이 데이터에 대한 조사는 여전히 진행 중이다.

용어 "엄격한"은 당업계에서 일반적으로 엄격한 것으로 이해되는 조건을 지칭하기 위해 사용된다. 혼성화 엄격성은 주로 온도, 이온 강도, 및 예컨대 포름아미드와 같은 변성제의 농도에 의해 결정된다. 혼성화 및 세척을 위한 엄격한 조건의 예는 65-68 ℃에서 0.015 M 염화나트륨, 0.0015 M 시트르산 나트륨, 또는 42 ℃에서 0.015 M 염화나트륨, 0.0015M 시트르산 나트륨, 및 50% 포름아미드를 포함하지만 이들로 제한되지는 않는다. 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, (Cold Spring Harbor, N.Y. 1989)]을 참고한다.

투여 방법

척수강내 투여가 본원에 예시된다. 척수강내 전달은 뇌 또는 척수의 거미 막 아래 공간으로의 전달을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 척수강내 투여는 수조내(intracisternal) 투여 또는 요추내(intralumbar) 투여를 통한 것이다. 이들 방법은 본원에 기술된 하나 이상의 rAAV와 함께 표적 세포를 형질 도입하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이식유전자를 포함하는 rAAV 바이러스 입자는 환자의 눈, 뇌 및/또는 척수에 투여되거나 전달된다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 뇌에 전달된다. 전달을 위해 고려되는 뇌의 영역은 운동 피질, 시각 피질, 소뇌 및 뇌간을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 척수에 전달된다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 하부 운동 뉴런에 전달된다. 폴리뉴클레오티드는 양극성 세포, 간상체 광수용체 세포, 원추형 광수용체 세포, 신경절 세포, 뮬러 신경교 세포, 미세아교 세포, 수평 세포 또는 무축삭 세포와 같은 망막 세포로 전달될 수 있다.

본원에서 제공된 방법의 일부 실시양태에서, 환자는 rAAV의 투여 후 (예를 들어, 약 5분, 약 10분, 약 15분 또는 약 20분 동안) 트렌델렌버그 체위 (헤드다운 자세)로 유지된다. 예를 들어, 환자는 약 1도 내지 약 30도, 약 15도 내지 약 30도, 약 30도 내지 약 60도, 약 60도 내지 약 90도, 또는 약 90도 내지 약 180 도로 기울어진 헤드 다운 자세일 수 있다.

망막하 투여의 경우, 30G 바늘과 같은 바늘로 눈의 후방에 또는 후방에서 적도까지 작은 공막 절개가 이루어진다. 바이러스 또는 비히클은 절개, 예를 들어 해밀턴 주사기에 튜브로 부착된 미세 유리 피펫 또는 30G 바늘 및 해밀턴 주사기를 통해 망막하로 전달된다. 예를 들어, 망막하 투여는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 임상적으로 훈련된 외과의에 의해 수행된다.

뇌실내 주사의 경우 바늘을 두개골에 삽입하고 액체를 뇌척수액이 들어 있는 심실에 주사한다. 예를 들어, 뇌실내 주사는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 임상적으로 훈련된 외과의에 의해 수행된다.

임의의 투여 방법에서, 조성물은 비이온성, 저삼투압 조영제를 포함 할 수 있다. 예를 들어, 상기 조성물은 이오비트리돌, 이오헥솔, 이오메프롤, 이오파미돌, 이오펜톨, 이오푸로미드, 이오베르솔, 이옥실란, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 비이온성 저삼투압 조영제를 포함할 수 있다.

본원에서 제공된 방법은 본원에 제공된 rAAV를 포함하는 조성물의 유효량 또는 유효 다중 투여량을 필요로 하는 대상체 (예를 들어 인간 환자를 포함하지만 이에 한정되지는 않는 동물)에게 투여하는 단계를 포함한다. 투약이 시력 관련 장애 증상의 발병 이전에 투여되는 경우, 투여는 예방적이다. 투약이 시력 관련 장애 증상의 발병 이후에 투여되는 경우, 투여는 치료적이다. 유효량은 시력 관련 장애와 관련된 적어도 하나의 증상을 경감 (제거 또는 감소)시키고, 장애의 진행을 늦추거나 예방하고, 장애의 범위를 감소시키고, 장애의 (부분 또는 전체) 차도를 유발하고/하거나 생존 및/또는 시력을 연장시키는, 용량이다. 치료 전의 대상체와 비교하여 또는 치료되지 않은 대상체와 비교하여, 본원에서 제공되는 방법은 안정화, 시력 상실 또는 망막 변성의 진행 감소, 또는 시력 또는 황반 변성의 개선을 초래한다.

시력 관련 장애가 CLN 바텐병일 때, 치료 전의 대상체와 비교하여 또는 치료되지 않은 대상체와 비교하여, 본원에서 제공되는 방법은 CLN 바텐병의 진행 및/또는 개선을 평가하는데 사용되는 하나 이상의 척도, 예를 들어 통합 바텐병 평가 시스템 (UBDRS) 또는 함부르그 운동 및 언어 척도에서의 안정화, 감소된 진행, 또는 개선을 초래한다. UBDRS 평가 척도는 (문헌 [Marshall et al., Neurology.2005 65(2):275-279]에 기재된 바와 같이) [CLN 바텐병의 진행 및/또는 개선을 평가하는 데 사용되는 UBDRS 물리적 척도 중 하나 이상, 예를 들어 UBDRS 또는 함부르크 운동 및 언어 척도를 포함한다. UBDRS 평가 척도는 (문헌 [Marshall et al., Neurology.2005 65(2):275-279]에 기재된 바와 같이) [UBDRS 물리적 평가 척도, UBDRS 발작 평가 척도, UBDRS 행동 평가 척도, UBDRS 능력 평가 척도, UBDRS 증상 발현 순서 및 UBDRS 임상적 세계 노출수 (CGI)]; 인생 척도의 소화기 질(Pediatric Quality of Life Scale) (PEDSQOL) 척도, 운동 기능, 언어 기능, 인지 기능, 및 생존을 포함한다. 치료 전의 대상체 또는 치료되지 않은 대상체와 비교하여, 본원에서 제공되는 방법은 자가 형광 저장 물질의 감소 또는 둔화된 리소좀 축적, ATP 합성효소 서브 유닛 C의 감소 또는 둔화된 리소좀 축적, 감소 또는 둔화된 신경교세포 활성화 (성상교세포 및/또는 미세교세포) 활성화; 감소 또는 둔화된 성상세포증 중 하나 이상을 초래할 수 있고, MRI로 측정한 뇌 용량 손실의 감소 또는 지연을 나타냈다.

글리코시드 가수분해효소

본 개시내용은 뉴라미니다제, 락타제, 아밀라제, 키티나제, 셀룰라제, 수크라제, 말타제, 인버타제 또는 리소자임과 같은 글리코시드 가수분해효소 효소와 조합하여 벡터에서 최적화된 유전자 요법을 투여하는 것을 제공한다. 엑소-글루코시다제는 글리칸 사슬에서 말단 시알산을 제거한다. 이러한 시알산은 모든 세포 유형의 글리칸 사슬의 가장 바깥쪽 끝과 대부분의 분비 단백질에서 발견된다. 글리코시드 가수분해효소는 세포막 잔류물을 제거하는 것으로 알려져 있으며, 이 제거는 더 큰 바이러스 수용체 표적화 및 세포 진입을 허용하는 것으로 여겨진다. 예를 들어, 뉴라미니다제 치료는 N-연결된 갈락토실 잔기를 제거함으로써 세포, 예를 들어 AAV9로의 진입을 위한 수용체로서 N-연결된 갈락토스 잔기를 사용하는 AAV의 침투를 향상시킨다 (문헌 [Shen et al. J. Biol. Chem. 286:13532- 13540, 2011]를 참조한다). 망막 세포로의 전달이 본원에 예시되어 있지만, 개시된 방법, 조성물 및 용도는 글리코시드 가수분해효소 효소가 세포막 상의 수용체를 제거하는 임의의 세포 유형을 표적으로 할 수 있다.

최적화된 유전자 치료 벡터를 포함하는 조합 요법도 제공된다. 용어 "병용 요법" 및 "병용 치료"는 효소와 같은 망막 세포에 대한 표적화를 개선하는 제제와 함께 개시된 최적화된 유전자 치료 벡터의 투여를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 방법은 글리코시드 가수분해효소를 유전자 치료 벡터의 투여와 조합하여 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 예를 들어, 글리코시드 가수분해효소는 뉴라미니다제, 락타제, 아밀라제, 키티나제, 셀룰라제, 수크라제, 말타제, 인버타제 또는 리소자임이다. 제제는 본원에 기재된 임의의 투여 경로에 의해 벡터와 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다.

본원에서 사용된 조합은 동시 치료 또는 순차 치료를 포함한다. 예를 들어, 유전자 치료 벡터와 글리코시드 가수분해효소는 동일한 투여 방식을 사용하여 동시에 투여되거나, 유전자 치료 벡터와 글리코시드 가수분해효소는 각각 다른 투여 방식을 사용하여 동시에 투여된다. 추가의 예에서, 유전자 치료 벡터 및 글리코시드 가수분해효소는 동일한 투여 방식을 사용하여 순차적으로 투여되거나, 유전자 치료 벡터 및 글리코시드 가수분해효소는 상이한 투여 방식을 사용하여 각각 순차적으로 투여된다. 본원에 기재된 방법과 표준 의학 치료법의 조합이 구체적으로 고려된다.

일부 실시양태에서, 최적화된 유전자 치료 벡터는 뉴라미니다제와 같은 글리코시드 가수분해효소와 동시에 투여된다. 다른 실시양태에서, 최적화된 유전자 치료 벡터는 뉴라미니다제와 같은 글리코시드 가수분해효소 직전 또는 직후에 투여된다. 다른 실시양태에서, 최적화된 유전자 치료 벡터는 뉴라미니다제와 같은 글리코시드 가수분해효소 투여 후 약 15분 이내, 약 20분 이내, 약 25분 이내, 약 30분 이내, 약 45분 이내, 1시간 이내, 2시간 이내, 3시간 이내, 4시간 이내, 5시간 이내, 6시간 이내, 7시간 이내, 8시간 이내, 9시간 이내, 12시간 이내, 24시간 이내, 36시간 이내, 또는 48시간 이내에 투여된다. 일부 실시양태에서, 글리코시드 가수분해효소는 최적화된 유전자 치료 벡터의 투여 전 또는 최적화된 유전자 치료 벡터의 투여 후에 투여된다.

일부 실시양태에서, 최적화된 유전자 치료 벡터 및 글리코시드 가수분해효소, 예컨대 뉴라미니다제는 단일 유리체내 주사로 투여된다. 그러나, 본 개시내용은 또한 개별 유리체내 주사에서 뉴라미니다제와 같은 글리코시드 가수분해효소와 최적화된 유전자 치료 벡터의 조합을 투여하는 것을 제공한다. 예를 들어, 글리코시드 가수분해효소, 예를 들어 뉴라미다제는 최적화된 유전자 치료 벡터의 투여 약 30분 전에 투여된다. 또한, 최적화된 유전자 치료 벡터 및 글리코시드 가수분해효소는 상이한 투여 방식을 사용하여 투여될 수 있다.

실시예

다음 실시예는 구체적인 실시양태를 기재하지만, 변화 및 변형이 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 일어날 것으로 이해된다. 따라서, 청구범위에 나타난 바와 같은 단지 이러한 제한은 본 발명에 포함되어야 한다.

실시예 1

scAAV9.GFP 및 Anc80.GFP의 제조

인간 GFP cDNA 클론은 Origene, Rockville, MD에서 입수했다. GFP cDNA를 하이브리드 치킨 β 액틴 프로모터(CB), CMV 인핸서-프로모터 또는 P546 프로모터 아래의 자가 상보적 AAV9 게놈 또는 Anc80 게놈에 추가로 서브클로닝하고 시험관 내 및 생체내에서 테스트하였다. AAV2 ITR 사이에 삽입된 GFP cDNA를 나타내는 플라스미드 구조체의 개략도가 도 1에 제공된다. 플라스미드 구조체는 또한 CB 프로모터, 유인원 바이러스 40 (SV40) 키메라 인트론과 같은 인트론 및 소 성장 호르몬 (BGH) 폴리아데닐화 신호 (BGH PolyA) 중 하나 이상을 포함하였다. 도 1의 구조체는 AAV9 게놈 또는 Anc80 게놈 (총괄하여 "AAV"로 지칭됨)으로 패키징되었다.

실시예 2

뉴라미니다제와 조합된 scAAV9.CB . GFP의 유리체내 주사

쥐는 상기 기재한 바와 같이 유리체내 주사를 위해 마취되었다. 30G 바늘로 요부와 공막 사이에 작은 절개를 하였다. 바이러스 또는 비히클은 튜브에 의해 해밀턴 주사기에 부착되거나 30G 바늘과 해밀턴 주사기를 통해 부착된 미세 유리 피펫을 사용하여 절개를 통해 유리체 공간으로 전달된다. 주사 전후에 옵타인과 베트로폴리신을 국소적으로 적용하고, 쥐를 표준 치료 (회복을 위해 가열된 케이지, 케이지 바닥의 음식, 긴 시퍼 튜브)를 통해 회복하도록 하고 안정될 때까지 모니터링하였다.

scAAV9.CB.GFP는 1회의 유리체내 주사를 통해 쥐 (1~5개월령)에 투여되었으며 발현은 2개월에 걸쳐 다양한 시점에서 모니터링되었다. AAV 및 Anc80은 9x10⁹ 및 3.2x10¹⁰ vg 범위의 용량으로 투여되었고, 이는 PBS로 희석하거나 스트레이트 rAAV 주사되었다. 또한, rAAV는 단일 유리체내 주사 내에서 뉴라미니다제와 동시에 또는 뉴라미니다제 없이 투여되었다. 동시 투여를 위해, 주사 직전에 rAAV를 뉴라미니다제와 혼합하고 단일 용액으로서 적용하였다. 도 2a에 도시된 바와 같이, 유리체내 주사는 망막에서 GFP의 발현을 초래한다. 또한, 뉴라미니다제와의 조합으로 scAAV9.CB.GFP의 투여는 망막의 외층으로의 이식유전자의 침투를 향상시켰다. 망막 염색 마커의 핵심은 다음과 같다:

칼레티닌은 수평세포 (적색염색)에 대한 마커이고 망막의 내부 핵층을 염색한다. 도 2b에 도시된 바와 같이, AAV9.CB.GFP 및 AAV9.CB.GFP의 유리체내 주사는 수평 세포에 이식유전자를 전달하고, 뉴라미니다제는 망막의 내부 핵층으로의 이식 유전자의 침투를 향상시켰다.

Otx2는 모든 양극성 세포 (적색 염색)에 대한 핵 마커이며 망막의 내부 핵층을 염색한다. 도 2c에 나타낸 바와 같이, AAV9.CB.GFP의 유리체내 주사는 이식유전자를 양극성 세포에 전달하고, 뉴라미니다제는 망막의 내부 핵층으로의 이식유전자의 침투를 향상시켰다.

Pax6은 무축삭 세포 (적색 염색)에 대한 마커(marker)이며 망막의 내부 핵층을 염색한다. 도 2d에 도시된 바와 같이, AAV9.CB.GFP의 유리체내 주사는 무축삭 세포에 이식유전자를 전달하였고, 뉴라미니다제는 망막의 내부 핵층으로의 이식유전자의 침투를 향상시켰다.

Sox2는 뮬러 신경교 세포 (적색염색)에 대한 마커이고 망막의 내층에 있는 모든 핵을 염색한다. 도 2e에 도시된 바와 같이, AAV9.CB.GFP의 유리체내 주사는 뮬러 신경교 세포에 이식유전자를 전달하고, 뉴라미니다제는 망막의 내부 핵층으로의 이식유전자의 침투를 향상시켰다.

실시예 3

8주령 야생형 쥐의 형질도입에 대한 뉴라미니다제의 효과를 추가로 조사하기 위해 도 3 에 도시된 바와 같이 뉴라미니다제가 있거나 없는 AAV9.CB.GFP의 유리체내 주사를 받았다. 2x10 ¹⁰ vg 이하의 AAV9.CB.GFP를 실시예 2에 상세히 기재된 바와 같이 쥐에 주사하였다. 도 4a 및 도 4b의 망막 조직은 이식유전자 GFP 및 양극성 세포 특이적 마커 Otx2에 대해 염색되었다. AAV 벡터의 유리체내 주사 전 또는 후에 뉴라미니다제의 첨가는 양극성 세포의 바이러스 형질도입을 상당히 증가시켰다 (도 4c 참조).

본 발명의 바람직한 실시양태가 도시되고 기술되었지만, 이러한 실시양태는 단지 예시로만 제공된다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명을 벗어나지 않고 당업자에게 다양한 변형, 변경 및 대체가 이루어질 것이다. 본원에 기술된 실시예에 대한 다양한 대안이 이용될 수 있음을 이해해야 한다. 하기 청구범위는 본 발명의 범위를 정의하고, 청구범위의 범위 내에 있는 방법 및 구조, 및 이들의 등가물에 의해 커버되는 것으로 의도된다.

본 출원에 언급된 모든 문헌은 이들의 전문이 본원에 참고문헌으로 인용된다.

참조문헌

SEQUENCE LISTING <110> Research Institute at Nationwide Children's Hospital <120> IMPROVED DELIVERY OF GENE THERAPY VECTORS TO RETINAL CELLS USING A GLYCOSIDE HYDROLASE ENZYME <130> 28335/55603 <150> US 62/849,794 <151> 2019-05-17 <160> 9 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1317 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atgggaggct gtgcaggctc gcggcggcgc ttttcggatt ccgaggggga ggagaccgtc 60 ccggagcccc ggctccctct gttggaccat cagggcgcgc attggaagaa cgcggtgggc 120 ttctggctgc tgggcctttg caacaacttc tcttatgtgg tgatgctgag tgccgcccac 180 gacatcctta gccacaagag gacatcggga aaccagagcc atgtggaccc aggcccaacg 240 ccgatccccc acaacagctc atcacgattt gactgcaact ctgtctctac ggctgctgtg 300 ctcctggcgg acatcctccc cacactcgtc atcaaattgt tggctcctct tggccttcac 360 ctgctgccct acagcccccg ggttctcgtc agtgggattt gtgctgctgg aagcttcgtc 420 ctggttgcct tttctcattc tgtggggacc agcctgtgtg gtgtggtctt cgctagcatc 480 tcatcaggcc ttggggaggt caccttcctc tccctcactg ccttctaccc cagggccgtg 540 atctcctggt ggtcctcagg gactggggga gctgggctgc 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Leu Leu Thr Ser Pro Glu Ala Gln Asp Pro Gly 225 230 235 240 Gly Glu Glu Glu Ala Glu Ser Ala Ala Arg Gln Pro Leu Ile Arg Thr 245 250 255 Glu Ala Pro Glu Ser Lys Pro Gly Ser Ser Ser Ser Leu Ser Leu Arg 260 265 270 Glu Arg Trp Thr Val Phe Lys Gly Leu Leu Trp Tyr Ile Val Pro Leu 275 280 285 Val Val Val Tyr Phe Ala Glu Tyr Phe Ile Asn Gln Gly Leu Phe Glu 290 295 300 Leu Leu Phe Phe Trp Asn Thr Ser Leu Ser His Ala Gln Gln Tyr Arg 305 310 315 320 Trp Tyr Gln Met Leu Tyr Gln Ala Gly Val Phe Ala Ser Arg Ser Ser 325 330 335 Leu Arg Cys Cys Arg Ile Arg Phe Thr Trp Ala Leu Ala Leu Leu Gln 340 345 350 Cys Leu Asn Leu Val Phe Leu Leu Ala Asp Val Trp Phe Gly Phe Leu 355 360 365 Pro Ser Ile Tyr Leu Val Phe Leu Ile Ile Leu Tyr Glu Gly Leu Leu 370 375 380 Gly Gly Ala Ala Tyr Val Asn Thr Phe His Asn Ile Ala Leu Glu Thr 385 390 395 400 Ser Asp Glu His Arg Glu Phe Ala Met Ala Ala Thr Cys Ile Ser Asp 405 410 415 Thr Leu Gly Ile Ser Leu Ser Gly Leu Leu Ala Leu Pro Leu His Asp 420 425 430 Phe Leu Cys Gln Leu 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Leu Tyr Tyr Tyr Asp Glu Tyr Leu 165 170 175 Gly His Cys Met Trp Tyr Ile Pro Phe Phe Leu Ile Leu Phe Met Tyr 180 185 190 Phe Ser Gly Cys Phe Thr Ala Ser Lys Ala Glu Ser Leu Ile Pro Gly 195 200 205 Pro Ala Leu Leu Leu Val Ala Pro Ser Gly Leu Tyr Tyr Trp Tyr Leu 210 215 220 Val Thr Glu Gly Gln Ile Phe Ile Leu Phe Ile Phe Thr Phe Phe Ala 225 230 235 240 Met Leu Ala Leu Val Leu His Gln Lys Arg Lys Arg Leu Phe Leu Asp 245 250 255 Ser Asn Gly Leu Phe Leu Phe Ser Ser Phe Ala Leu Thr Leu Leu Leu 260 265 270 Val Ala Leu Trp Val Ala Trp Leu Trp Asn Asp Pro Val Leu Arg Lys 275 280 285 Lys Tyr Pro Gly Val Ile Tyr Val Pro Glu Pro Trp Ala Phe Tyr Thr 290 295 300 Leu His Val Ser Ser Arg His 305 310 <210> 5 <211> 861 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 atgaatcctg cgagcgatgg gggcacatca gagagcattt ttgacctgga ctatgcatcc 60 tgggggatcc gctccacgct gatggtcgct ggctttgtct tctacttggg cgtctttgtg 120 gtctgccacc agctgtcctc ttccctgaat gccacttacc gttctttggt ggccagagag 180 aaggtcttct gggacctggc ggccacgcgt gcagtctttg 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Gln Gln 245 250 255 Leu Leu Asn Pro Val Asp Trp Asn Phe Ala Gln Pro Glu Ala Lys Ser 260 265 270 Arg Pro Glu Gly Asn Gly Gln Leu Leu Arg Lys Lys Arg Pro 275 280 285 <210> 7 <211> 270 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 ccacgttctg cttcactctc cccatctccc ccccctcccc acccccaatt ttgtatttat 60 ttatttttta attattttgt gcagcgatgg gggcgggggg gggggggggg cgcgcgccag 120 gcggggcggg gcggggcgag gggcggggcg gggcgaggcg gagaggtgcg gcggcagcca 180 atcagagcgg cgcgctccga aagtttcctt ttatggcgag gcggcggcgg cggcggccct 240 ataaaaagcg aagcgcgcgg cgggcgggag 270 <210> 8 <211> 280 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 60 gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca 120 atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc 180 aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta 240 catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac 280 <210> 9 <211> 546 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 gaacaacgcc aggctcctca 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Claims

유전자 치료 벡터(gene therapy vector) 및 글리코시드 가수분해효소(glycoside hydrolase enzyme)를 포함하는 조성물.
제1항에 있어서, 상기 글리코시드 가수분해효소는 뉴라미니다제(neuraminidase), 락타제, 아밀라제, 키티나제, 셀룰라제, 수크라제, 말타제, 인버타제(invertase) 또는 리소자임인 것인 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 유전자 치료 벡터가 AAV8, AA9 또는 Anc80인 것인 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 국소 정맥내 전달(local intravenous delivery), 망막하 전달(sub-retinal delivery), 유리체내 전달(intravitreal delivery) 또는 척수강내 전달(intrathecal delivery)을 위해 제형화되는 것인 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자 치료 벡터와 글리코시드 가수분해효소가 동시 투여를 위해 혼합되는 것인 조성물.
유전자 치료 벡터 및 글리코시드 가수분해효소를 포함하는 대상체의 망막 세포에 이식유전자를 전달하는 것을 포함하는 키트.
제6항에 있어서, 상기 글리코시드 가수분해효소는 뉴라미니다제, 락타제, 아밀라제, 키티나제, 셀룰라제, 수크라제, 말타제, 인버타제 또는 리소자임인 것인 키트.
제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 유전자 치료 벡터가 AAV8, AA9 또는 Anc80인 것인 키트.
i) 이식유전자를 코딩하는 유전자 치료 벡터, 및 ii) 글리코시드 가수분해효소를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체의 망막 세포에 이식유전자를 전달하는 방법.
i) 이식유전자를 코딩하는 유전자 치료 벡터, 및 ii) 글리코시드 가수분해효소를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체의 시각 장애(visual impairment) 또는 시력 관련 장애(vision-related disorder)를 치료하는 방법으로서, 상기 이식유전자의 전달은 시각 장애 또는 시력 관련 장애를 효과적으로 치료하는 것인, 방법.
제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 글리코시드 가수분해효소가 뉴라미니다제, 락타제, 아밀라제, 키티나제, 셀룰라제, 수크라제, 말타제, 인버타제 또는 리소자임인 것인 방법.
제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 망막 세포가 양극성 세포(bipolar cell), 간상체 광수용체 세포(rod photoreceptor cell), 원추형 광수용체 세포(cone photoreceptor cell), 신경절 세포(ganglion cell), 뮬러 신경교 세포(Mueller glia cell), 미세아교 세포(microglia cell), 수평 세포(horizontal cell) 또는 무축삭 세포(amacrine cell)인 것인 방법.
제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자 치료 벡터가 국소 정맥내 전달, 망막하 전달, 유리체내 전달 또는 척수강내 전달을 사용하여 대상체에게 투여되는 것인 방법.
제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이식유전자를 코딩하는 유전자 치료 벡터 및 글리코시드 가수분해효소가 대상체에 동시에 투여되는 것인 방법.
제14항에 있어서, 상기 유전자 치료 벡터 및 글리코시드 가수분해효소가 혼합되는 것인 방법.
제9항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자 치료 벡터 및 글리코시드 가수분해효소가 별도로 투여되는 것인 방법.
제10항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시력 관련 장애가 바텐병, 선천성 백내장, 선천성 녹내장, 망막 변성, 시신경 위축, 눈 기형, 사시, 안구 정렬 불량(ocular misalignment), 녹내장, 습성 연령 관련 황반 변성(wet age-related macular degeneration), 건성 연령 관련 황반 변성(dry age-related macular degeneration), 색소성 망막염, 범맥락막위축(choroideremia), 레버 선천성 흑암시(Leber congenital amaurosis), 레버 유전성 시신경 병증, 조기 발병 망막 이영양증(early onset retinal dystrophy), 색맹, x-연관 망막층간분리(x-linked retinoschisis), 어셔 증후군 1B, 신생혈관 연령 관련 황반변성(neovascular age-related macular degeneration), 스타가르트 황반변성, 당뇨병성 황반변성 또는 당뇨병성 황반부종인 것인 방법.
i) 이식유전자를 코딩하는 유전자 치료 벡터, 및 ii) 글리코시드 가수분해효소를 포함하는, 대상체의 망막 세포에 이식유전자를 전달하기 위한 조성물.
i) 이식유전자를 코딩하는 유전자 치료 벡터, 및 ii) 글리코시드 가수분해효소를 포함하는, 대상체의 시각 장애 또는 시력 관련 장애를 치료하기 위한 조성물.
이식유전자를 코딩하는 유전자 치료 벡터를 포함하고, 글리코시드 가수분해효소를 포함하는 제2 조성물과 함께 투여되는 것인, 이식유전자를 대상체의 망막 세포에 전달하기 위한 조성물.
이식유전자를 코딩하는 유전자 치료 벡터를 포함하고, 글리코시드 가수분해효소를 포함하는 제2 조성물과 함께 투여되는 것인, 대상체의 시각 장애 또는 시력 관련 장애를 치료하기 위한 조성물.
글리코시드 가수분해효소를 포함하고, 이식유전자를 코딩하는 유전자 치료 벡터를 포함하는 제2 조성물과 함께 투여되는 것인, 이식유전자를 대상체의 망막 세포에 전달하기 위한 조성물.
글리코시드 가수분해효소를 포함하고, 이식유전자를 코딩하는 유전자 치료 벡터를 포함하는 제2 조성물과 함께 투여되는 것인, 대상체의 시각 장애 또는 시력 관련 장애를 치료하기 위한 조성물.
제19항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 글리코시드 가수분해효소가 뉴라미니다제, 락타제, 아밀라제, 키티나제, 셀룰라제, 수크라제, 말타제, 인버타제 또는 리소자임인 것인 조성물.
제19항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 망막 세포가 양극성 세포, 간상체 광수용기 세포, 원추형 광수용기 세포, 신경절 세포, 뮬러 신경교 세포, 미세아교 세포, 수평 세포 또는 무축삭 세포인 것인 조성물.
제19항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 국소 정맥내 전달, 망막하 전달, 유리체내 전달 또는 척수강내 전달을 위해 제형화되는 것인 조성물.
제20항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물 및 제2 조성물이 대상체에게 동시에 투여되는 것인 조성물.
제20항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물 및 제2 조성물이 혼합되는 것인 조성물.
제20항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물 및 제2 조성물이 별도로 투여되는 것인 조성물.
제19항, 제21항 또는 제23항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시력 관련 장애가 바텐병, 선천성 백내장, 선천성 녹내장, 망막 변성, 시신경 위축, 눈 기형, 사시, 안구 정렬 불량, 녹내장, 습성 연령 관련 황반 변성, 건성 연령 관련 황반 변성, 색소성 망막염, 범맥락막위축, 레버 선천성 흑암시, 레버 유전성 시신경 병증, 조기 발병 망막 이영양증, 색맹, x-연관 망막층간분리, 어셔 증후군 1B, 신생혈관 연령 관련 황반변성, 스타가르트 황반변성, 당뇨병성 황반변성 또는 당뇨병성 황반부종인 것인 조성물.
대상체의 망막 세포에 이식유전자를 전달하기 위한 의약의 제조를 위한 조성물의 용도로서, 상기 조성물은 i) 이식유전자를 코딩하는 유전자 치료 벡터, 및 ii) 글리코시드 가수분해효소를 포함하는 것인, 용도.
대상체에서 시각 장애 또는 시력 관련 장애를 치료하기 위한 의약의 제조를 위한 조성물의 용도로서, 상기 조성물은 i) 이식유전자를 코딩하는 유전자 치료 벡터, 및 ii) 글리코시드 가수분해효소를 포함하는 것인, 용도.
대상체의 망막 세포에 이식유전자를 전달하기 위한 의약의 제조를 위한 이식유전자를 코딩하는 유전자 치료 벡터의 용도로서, 상기 의약은 글리코시드 가수분해효소를 포함하는 조성물과 함께 투여되는 것인, 용도.
대상체에서 시각 장애 또는 시력 관련 장애를 치료하기 위한 의약의 제조를 위한 이식유전자를 코딩하는 유전자 치료 벡터의 용도로서, 상기 의약은 글리코시드 가수분해효소를 포함하는 조성물과 함께 투여되는 것인, 용도.
대상체의 망막 세포에 이식유전자를 전달하기 위한 의약 제조를 위한 글리코시드 가수분해효소 효소의 용도로서, 상기 의약은 이식유전자를 코딩하는 유전자 치료 벡터를 포함하는 조성물과 함께 투여되는 것인, 용도.
대상체에서 시각 장애 또는 시력 관련 장애를 치료하기 위한 의약의 제조를 위한 글리코시드 가수분해효소 효소의 용도로서, 상기 의약은 이식유전자를 코딩하는 유전자 치료 벡터를 포함하는 조성물과 함께 투여되는 것인, 용도.
제32항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 글리코시드 가수분해효소가 뉴라미니다제, 락타제, 아밀라제, 키티나제, 셀룰라제, 수크라제, 말타제, 인버타제 또는 리소자임인 것인 용도.
제32항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 망막 세포가 양극성 세포, 간상체 광수용체 세포, 원추형 광수용체 세포, 신경절 세포, 뮬러 신경교 세포, 미세아교 세포, 수평 세포 또는 무축삭 세포인 것인 용도.
제32항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 의약이 국소 정맥내 전달, 망막하 전달, 유리체내 전달 또는 척수강내 전달을 위해 제형화되는 것인 용도.
제33항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 의약 및 조성물이 대상체에게 동시에 투여되는 것인 용도.
제33항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 의약 및 조성물이 혼합되는 것인 용도.
제33항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 의약 및 조성물이 별도로 투여되는 것인 용도.
제32항, 제34항 또는 제36항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시력-관련 장애가 바텐병, 선천성 백내장, 선천성 녹내장, 망막 변성, 시신경 위축, 눈 기형, 사시, 안구 정렬 불량, 녹내장, 습성 연령 관련 황반 변성, 건성 연령 관련 황반 변성, 색소성 망막염, 범맥락막위축, 레버 선천성 흑암시, 레버 유전성 시신경 병증, 조기 발병 망막 이영양증, 색맹, x-연관 망막층간분리, 어셔 증후군 1B, 신생혈관 연령과 관련된 황반변성, 스타가르트 황반변성, 당뇨병성 황반변성 또는 당뇨병성 황반부종인 것인 용도.