TW202110486A - 使用糖苷水解酶改善基因療法載體向視網膜細胞的遞送 - Google Patents

Abstract

本發明係關於使用經最佳化之基因療法載體與諸如神經胺糖酸苷酶之糖苷水解酶組合靶向特定細胞類型的方法。特定言之，本揭示案提供與糖苷水解酶一起投與以特異性靶向視網膜細胞之基因療法載體以及治療視力障礙、視網膜變性及視力相關病症之方法。

Description

使用糖苷水解酶改善基因療法載體向視網膜細胞的遞送

本申請案主張2019年5月17日申請之美國臨時申請案第62/849,794號之優先權，其以全文引用的方式併入本文中。以引用的方式併入以電子方式提交的材料

作為本揭示案之一部分的序列表與說明書同時提交為正文檔案。含有序列表之正文檔案的名稱為「55603_Seqlisting.txt」，其創建於2020年4月13日，大小為15,459位元組。序列表之主題以全文引用的方式併入本文中。領域

本發明係關於使用經最佳化之基因療法載體與糖苷水解酶組合來靶向視網膜內特定細胞類型的方法。特定言之，本揭示案提供特異性靶向視網膜細胞之基因療法載體以及治療視力障礙、視網膜變性及視力相關病症的方法。

由於眼睛的解剖結構清晰，眼部投與基因療法載體具有許多優勢。特定言之，眼睛的易接近性使得能夠進行快速及漸進的檢查；眼睛相對封閉的結構及小尺寸需要較低劑量之載體進行遞送；血液-視網膜屏障防止載體滲入體循環，維持相對免疫弱化之環境；且已鑑定出主要或部分參與特定眼部病症之單個或多個基因。

眼部投與基因療法載體已顯示出一些有前景的結果。當前，有許多針對視力喪失相關疾病之臨床基因療法試驗，且此等試驗主要針對遺傳性視網膜疾病。例如，臨床試驗已研究萊伯先天性黑蒙症（Leber congenital amaurosis，LCA）、萊伯遺傳性視神經病變及色素性視網膜炎。迄今為止，AAV載體，特別是AAV2血清型，已成為眼部基因療法中最常用的。參見Lee等人, 《視網膜及眼研究之進展（Progress in retinal and eye research）》 68: 31-53, 2019

神經元蠟樣脂褐質沈積症（NCL）為一組嚴重的神經退化性病症，統稱為巴藤病（Batten disease）。此等病症影響神經系統，通常會導致例如運動、視力及思維能力的惡化問題。不同的NCL以其遺傳原因來區分。在兒童時期有巴藤病的患者中經常會出現部分或完全的視力喪失。特定言之，在患有巴滕病之人中，脂褐質在細胞內積聚，包括大腦及視網膜的細胞。脂褐質的堆積會損害視網膜中的感光器、視神經及處理視力的大腦區域。

當前，需要靶向視網膜中特定細胞類型之改進的基因療法。此外，沒有可逆轉巴滕病症狀之療法。因此，在此項技術中需要巴滕病的治療。

本揭示案提供包含靶向特定細胞類型（諸如視網膜中之特定細胞）的經最佳化之基因療法載體及糖苷水解酶的組合物。此等經最佳化之基因療法載體可用於使用玻璃體內遞送與糖苷水解酶之投與組合將轉殖基因遞送至特定視網膜細胞。糖苷水解酶之投與增強基因療法在視網膜內的滲透。本揭示案提供治療視力相關病症之方法，其包含使用玻璃體內遞送與糖苷水解酶之投與組合來投與經最佳化之基因療法載體。靶向視網膜中特定細胞類型之基因療法具有治療視力喪失相關疾病之優勢。

本揭示案提供包含基因療法載體及糖苷水解酶之組合物。例如，糖苷水解酶為神經胺糖酸苷酶、乳糖酶、澱粉酶、殼質酶、纖維素酶、蔗糖酶、麥芽糖酶、轉化酶或溶菌酶。在一些實施例中，基因療法載體為AAV8、AA9或Anc80。

在例示性實施例中，本揭示案提供經調配用於局部靜脈內遞送、視網膜下遞送、玻璃體內遞送、腦室內或鞘內遞送之組合物。舉例而言，本揭示案提供基因療法載體及糖苷水解酶混合以同時投與之組合物。

另外，本揭示案提供用於將轉殖基因遞送至個體細胞之套組，其包含基因療法載體及糖苷水解酶。舉例而言，細胞為視網膜細胞。在例示性實施例中，糖苷水解酶為神經胺糖酸苷酶、乳糖酶、澱粉酶、殼質酶、纖維素酶、蔗糖酶、麥芽糖酶、轉化酶或溶菌酶。此外，基因療法為AAV8、AA9或Anc80。視情況，套組包含用於將基因療法載體及糖苷水解酶遞送至個體的說明書。

本揭示案提供將轉殖基因遞送至個體細胞之方法，其包含向個體投與i)編碼轉殖基因之基因療法載體及ii)糖苷水解酶。舉例而言，細胞為視網膜細胞。在一些實施例中，糖苷水解酶為神經胺糖酸苷酶、乳糖酶、澱粉酶、殼質酶、纖維素酶、蔗糖酶、麥芽糖酶、轉化酶或溶菌酶，及/或基因療法載體為AAV8、AAV9或Anc80。本揭示案提供其中使用局部靜脈內（IV）遞送、視網膜下遞送、玻璃體內遞送、腦室內遞送、腦實質內遞送或鞘內（腦脊髓液）遞送向個體投與基因療法載體及/或糖苷水解酶之方法。舉例而言，所揭示之方法使轉殖基因遞送至所有視網膜細胞，包括但不限於雙極細胞、視桿細胞、視錐細胞、神經節細胞、米勒神經膠質細胞（Mueller glia cell）、小神經膠質細胞、水平細胞及/或無軸突神經細胞。在本文中舉例說明向視網膜細胞的遞送，然而所揭示之方法、組合物及用途可靶向任何細胞類型，其中糖苷水解酶清除細胞膜上的受體。其他細胞類型包括肌肉細胞；神經細胞，諸如星形膠質細胞、神經元、寡樹突神經膠質細胞及許旺細胞（scwann cell）。

本揭示案亦提供用於將轉殖基因遞送至個體細胞之組合物，其中所述組合物包含i)編碼轉殖基因之基因療法載體及ii)糖苷水解酶。舉例而言，細胞為視網膜細胞。在另外的實施例中，本揭示案提供用於將轉殖基因遞送至個體之視網膜細胞的組合物，其中所述組合物包含編碼轉殖基因之基因療法載體，其中所述組合物與包含糖苷水解酶之第二組合物一起投與。舉例而言，組合物經調配以使用局部靜脈內遞送、視網膜下遞送、玻璃體內遞送、腦池內注射、腦室內遞送、肌肉內遞送或鞘內注射來投與基因療法載體。

本揭示案亦提供組合物在製備用於將轉殖基因遞送至個體細胞之藥物中的用途，其中所述組合物包含i)編碼轉殖基因之基因療法載體及ii)糖苷水解酶。舉例而言，細胞為視網膜細胞。在一些實施例中，本揭示案提供編碼轉殖基因之基因療法載體在製備用於將轉殖基因遞送至個體之視網膜細胞之藥物中的用途，其中所述藥物與包含糖苷水解酶之組合物一起投與。在其他實施例中，本揭示案提供糖苷水解酶在製備用於將轉殖基因遞送至個體之視網膜細胞之藥物中的用途，其中所述藥物與包含編碼轉殖基因之基因療法載體的組合物一起投與。舉例而言，藥物經調配以使用局部靜脈內遞送、視網膜下遞送、玻璃體內遞送或鞘內遞送來投與基因療法載體。

本揭示案亦提供治療個體視力障礙、視網膜變性或視力相關病症之方法，其包含向個體投與i)編碼轉殖基因之基因療法載體及ii)糖苷水解酶。在一些實施例中，糖苷水解酶為神經胺糖酸苷酶、乳糖酶、澱粉酶、殼質酶、纖維素酶、蔗糖酶、麥芽糖酶、轉化酶或溶菌酶，及/或基因療法載體為AAV8、AAV9或Anc80。本揭示案提供其中使用局部靜脈內（IV）遞送、視網膜下遞送、玻璃體內遞送、腦室內遞送、腦實質內遞送、肌肉內遞送或鞘內遞送投與基因療法載體及/或糖苷水解酶之方法。

本揭示案亦提供用於治療個體之視力障礙或視力相關病症的組合物，其中所述組合物包含i)編碼轉殖基因之基因療法載體及ii)糖苷水解酶。在一些實施例中，本揭示案提供用於治療個體之治療視力障礙或視力相關病症的組合物，其中所述組合物包含糖苷水解酶，其中所述組合物與包含編碼轉殖基因之基因療法載體的第二組合物一起投與。舉例而言，組合物經調配以使用局部靜脈內遞送、視網膜下遞送、玻璃體內遞送、腦室內遞送、肌肉內遞送或鞘內遞送來投與基因療法載體。

在另外的實施例中，本揭示案提供組合物在製備用於治療個體之視力障礙或視力相關病症之藥物中的用途，其中所述組合物包含編碼轉殖基因之基因療法載體。本揭示案亦提供編碼轉殖基因之基因療法載體在製備用於治療個體之視力障礙或視力相關病症之藥物中的用途，其中所述藥物與包含糖苷水解酶之組合物一起投與。另外，本揭示案提供糖苷水解酶在製備用於治療個體之治療視力障礙或視力相關病症之藥物中的用途，其中所述藥物與包含編碼轉殖基因之基因療法載體的組合物一起投與。舉例而言，藥物經調配以使用局部靜脈內遞送、視網膜下遞送、玻璃體內遞送、腦室內遞送、肌肉內遞送或鞘內遞送來投與基因療法載體。

舉例而言，視力相關病症為巴藤病、先天性白內障、先天性青光眼、視網膜變性、視神經萎縮、眼畸形。斜視、眼錯位、青光眼、年齡相關之濕性黃斑變性、年齡相關之乾性黃斑變性、色素性視網膜炎、無脈絡膜症、萊伯先天性黑蒙症、萊伯遺傳性視神經病變、早發性視網膜營養不良、色盲、x性聯視網膜劈裂症、尤塞氏症候群1B（Usher Syndrome 1B）、年齡相關之新生血管性黃斑變性、斯特格特氏黃斑變性（Stargardt's macular degeneration）、糖尿病性黃斑變性或糖尿病性黃斑水腫。在一個特定實施例中，視力相關病症為CLN巴藤病，諸如CLN1病、CLN2病、CLN3病、CLN4病、CLN5病、CLN6病或CLN8病。

在所揭示之方法、用途或組合物中之任一者中，轉殖基因為編碼所關注多肽之多核苷酸序列，或為抑制、干擾或沉默所關注基因表現之核酸，諸如siRNA或miRNA。例示性轉殖基因為編碼RPE65、RPGR、ORF15、CNGA3、CMH、ND4、PDE6B、ChR2、MERTK、hRS1、hMYOJA、hABCA4、CD59、抗hVEGF抗體、內皮抑素-血管抑制素、sFLT01或sFLT-1之多核苷酸。另外的例示性轉殖基因包括針對RTP801之siRNA、針對VEGFR-1之siRNA、針對VEGF之siRNA或針對ADRB2之siRNA。在一個實施例中，轉殖基因編碼CLN多肽，諸如CLN1、CLN2、CLN3、CLN4、CLN5、CLN6或CLN8。

在本文揭示之任何揭示的方法、組合物或用途中，基因療法載體及糖苷水解酶同時或依次投與。另外，在所揭示之方法、組合物或用途中之任一者中，基因療法載體及糖苷水解酶使用相同的遞送模式投與或各自使用不同的遞送模式投與。在所揭示之方法、用途或組合物中之任一者中，基因療法載體及糖苷水解酶以單次投與形式投與，例如將基因療法載體及糖苷水解酶混合。或者，基因療法載體及糖苷水解酶分開投與。在一些實施例中，糖苷水解酶酶在投與基因療法載體之前至少約30分鐘投與。

在所揭示之方法、用途或組合物中之任一者中，基因療法載體為AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVRH10、AAVRH74、AAV11、AAV12、AAV13、AAVTT或Anc80、AAV7m8及其衍生物。

在所揭示之方法、用途或組合物中之任一者中，基因療法載體包含CMV啟動子、p546或CB啟動子。

另外，在所揭示之方法、用途或組合物中之任一者中，使用鞘內遞送投與基因療法載體及/或糖苷水解酶，且所述方法進一步包含在投與基因療法載體後將個體置於特倫德倫伯臥位（Trendelenburg position）。

在所提供之方法、用途及組合物中之任一者中，組合物可包含非離子型低滲造影劑。舉例而言，組合物可包含非離子型低滲造影劑，其選自由以下組成之群組：碘比醇（iobitridol）、碘海醇（iohexol）、碘美普爾（iomeprol）、碘帕醇（iopamidol）、碘噴托（iopentol）、碘普羅胺（iopromide）、碘佛醇（ioversol）、碘昔蘭（ioxilan）及其組合。

靶向眼睛以治療視力相關病症之AAV基因療法的最佳化需要對不同細胞類型之特異性靶向。本揭示案提供比較不同基因療法載體、啟動子及投與途徑之實驗資料，以確定用於將轉殖基因靶向遞送至小鼠及非人類靈長類動物之視網膜中之特定細胞類型的最佳基因療法載體。

資料著重於AAV9及Anc80載體之投與，但本揭示案設想使用任何包含特異性靶向視網膜細胞之啟動子的基因療法載體，且此等經最佳化之載體係使用局部靜脈內（IV）遞送、視網膜下遞送、玻璃體內遞送、腦室內遞送、肌肉內遞送、腦實質內遞送或鞘內遞送來投與。舉例而言，資料表明經由腦室內注射直接注射至腦脊髓液中之AAV9有效靶向視網膜雙極細胞中之轉殖基因表現。因此，鞘內注射可用於將基因療法載體遞送至眼睛，且具體地用於將基因療法載體遞送至雙極細胞。基因療法載體

腺相關病毒（AAV）為複製缺陷型小病毒，其單股DNA基因組為約4.7 kb長，包括兩個145個核苷酸的反向末端重複序列（ITR），且可用於指病毒本身或其衍生物。除非另有說明，否則所述術語涵蓋所有亞型以及天然存在之形式及重組形式。AAV有多種血清型。AAV的血清型各與一個特定的進化枝相關，其成員共享血清學及功能相似性。因此，AAV亦可由進化枝指代。舉例而言，AAV9序列稱為「分枝系F」序列（Gao等人, 《病毒學雜誌（J. Virol.）》, 78: 6381-6388 (2004)。本揭示案設想使用特定進化枝例如進化枝F內之任何序列。AAV血清型之基因組的核苷酸序列為已知的。舉例而言，AAV-1之完整基因組提供於Genbank寄存編號NC_002077中；AAV-2之完整基因組提供於Genbank寄存編號NC_001401及Srivastava等人, 《病毒學雜誌》, 45: 555-564 (1983)中；AAV-3之完整基因組提供於Genbank寄存編號NC_1829中；AAV-4之完整基因組提供於Genbank寄存編號NC_001829中；AAV-5基因組提供於Genbank寄存編號AF085716中；AAV-6之完整基因組提供於Genbank寄存編號NC_00 1862中；AAV-7及AAV-8基因組之至少部分分別提供於GenBank寄存編號AX753246及AX753249中；AAV-9基因組提供於Gao等人, 《病毒學雜誌》, 78: 6381-6388 (2004)中；AAV-10基因組提供於《分子療法（Mol. Ther. ）》, 13 (1): 67-76 (2006)中；AAV-11基因組提供於《病毒學（Virology ）》, 330 (2): 375-383 (2004)中；AAV-12基因組之部分提供於Genbank寄存編號DQ813647中；AAV-13基因組之部分提供於Genbank寄存編號EU285562中。AAV rh.74基因組之序列參見美國專利9,434,928中所提供，所述專利以引用的方式併入本文中。AAV-B1基因組之序列提供於Choudhury等人, 《分子療法》, 24 (7): 1247-1257 (2016)中。Anc80為AAV1、AAV2、AAV8及AAV9之AAV載體。Anc80之序列提供於Zinn等人, 《細胞通訊（Cell Reports）》 12: 1056-1068, 2015，Vandenberghe等人, PCT/US2014/060163中，兩者之全部內容及GenBank寄存編號KT235804-KT235812以引用的方式併入本文中。

指導病毒DNA複製（rep）、衣殼化/封裝及宿主細胞染色體整合之順式作用序列包含在ITR內。三個AAV啟動子（因其相對圖譜位置命名為p5、p19及p40）驅動兩個編碼rep及cap基因之AAV內部開放閱讀框架的表現。兩個rep啟動子（p5及p19）結合單個AAV內含子之差異性剪接（在核苷酸2107及2227處），使得由rep基因產生四個rep蛋白（rep 78、rep 68、rep 52及rep 40）。Rep蛋白具有多種酶促特性，最終負責複製病毒基因組。cap基因係自p40啟動子表現，且其編碼三個衣殼蛋白VP1、VP2及VP3。替代性剪接及非共同轉譯起始位點負責產生三個相關的衣殼蛋白。單個共同聚腺苷酸化位點位於AAV基因組之圖譜位置95。AAV之生命週期和遺傳學綜述於Muzyczka, ，《微生物學和免疫學之當前主題（Current Topics in Microbiology and Immunology ）》, 158 : 97-129 (1992)。

AAV具有獨特特徵，使其例如在基因療法中作為將外來DNA遞送至細胞之載體而引人注目。培養物中細胞的AAV感染為非細胞病變的，且對人類及其他動物的自然感染為沉默及無症狀的。此外，AAV感染許多哺乳動物細胞，從而有可能活體內靶向許多不同的組織。此外，AAV轉導緩慢分裂及非分裂細胞，且可作為轉錄活性細胞核游離基因體（染色體外元件）在彼等細胞之生命週期中基本上持續存在。天然AAV前病毒基因組作為質體中之選殖DNA具有感染性，其使得重組基因組之構築變得可行。此外，由於指導AAV複製、基因組衣殼化及整合之信號包含在AAV基因組的ITR內，故基因組內部約4.3 kb中之一些或全部（編碼複製及結構性衣殼蛋白rep-cap）可經外來DNA置換，所述外來DNA諸如含有啟動子、所關注之DNA及聚腺苷酸化信號的基因卡匣。在一些情況下，rep及cap蛋白以反式提供。AAV之另一個顯著特徵在於其為極其穩定及充滿活力的病毒。其輕鬆承受用於滅活腺病毒之條件（56°至65℃數小時），從而使AAV的冷藏變得不那麼關鍵。AAV甚至可凍乾。最後，經AAV感染之細胞對重複感染不具有抵抗性。

如本文所用，術語「AAV」係指野生型AAV病毒或病毒顆粒。術語「AAV」、「AAV病毒」及「AAV病毒顆粒」在本文中可互換使用。術語「rAAV」係指重組AAV病毒或重組感染性囊封病毒顆粒。術語「rAAV」、「rAAV病毒」及「rAAV病毒顆粒」在本文中可互換使用。

術語「rAAV基因組」係指衍生自已經修飾之天然AAV基因組的多核苷酸序列。在一些實施例中，rAAV基因組已經修飾以移除天然的cap及rep基因。在一些實施例中，rAAV基因組包含內源性5'及3'反向末端重複序列（ITR）。在一些實施例中，rAAV基因組包含來自AAV血清型之ITR，所述AAV血清型不同於AAV基因組來源之AAV血清型。在一些實施例中，rAAV基因組包含在5'及3'端側接有反向末端重複序列（ITR）之所關注之轉殖基因。在一些實施例中，rAAV基因組包含「基因卡匣」。

術語「scAAV」係指包含自身互補基因組之rAAV病毒或rAAV病毒顆粒。術語「ssAAV」係指包含單股基因組之rAAV病毒或rAAV病毒顆粒。

在一些實施例中，本文所提供之rAAV基因組包含側接轉殖基因多核苷酸序列之一或多個AAV ITR。轉殖基因多核苷酸序列可操作地連接於在靶細胞中具有功能的轉錄控制元件（包括但不限於啟動子、強化子及/或聚腺苷酸化信號序列）以形成基因卡匣。啟動子之實例為CMV啟動子、雞β肌動蛋白啟動子（CB）及P546啟動子。在本文中涵蓋額外的啟動子，包括但不限於猿猴病毒40（SV40）早期啟動子、小鼠乳腺腫瘤病毒（MMTV）、人類免疫缺陷病毒（HIV）長末端重複序列（LTR）啟動子、MoMuLV啟動子、禽類白血病病毒啟動子、埃-巴二氏病毒（Epstein-Barr virus）即刻早期啟動子、勞斯肉瘤病毒（Rous sarcoma virus）啟動子以及人類基因啟動子，諸如但不限於肌動蛋白啟動子、肌凝蛋白啟動子、延伸因子-1a啟動子、血紅蛋白啟動子及肌酸激酶啟動子。

本文另外提供CMV啟動子序列、CB啟動子序列、P546啟動子序列及與CMV、CB或P546序列之核苷酸序列至少65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致且展現轉錄促進活性的啟動子序列。

轉錄控制元件之其他實例為組織特異性控制元件，例如允許在神經元內或星形膠質細胞內特異性表現的啟動子。實例包括神經元特異性烯醇酶及神經膠質原纖維酸性蛋白啟動子。亦考慮誘導型啟動子。誘導型啟動子之非限制性實例包括但不限於金屬硫蛋白啟動子、糖皮質激素啟動子、孕酮啟動子及四環素調節啟動子。當在哺乳動物細胞中表現時，基因卡匣亦可包括內含子序列以促進轉殖基因RNA轉錄物的加工。此類內含子之一個實例為SV40內含子。

「封裝」係指引起AAV顆粒之組裝及衣殼化的一系列細胞內事件。術語「產生」係指由封裝細胞產生rAAV（感染性囊封rAAV顆粒）的過程。

AAV「rep」及「cap」基因分別係指編碼腺相關病毒之複製及衣殼化蛋白的多核苷酸序列。AAV rep及cap在本文中稱為AAV「封裝基因」。

AAV之「輔助病毒」係指允許AAV（例如野生型AAV）由哺乳動物細胞複製及封裝的病毒。AAV之各種此類輔助病毒為此項技術中已知的，包括腺病毒、疱疹病毒及痘病毒，諸如牛痘。腺病毒可涵蓋許多不同的亞組，但亞組C的5型腺病毒最常用。人類、非人類哺乳動物及禽類來源的許多腺病毒為已知的，且可自諸如ATCC之保藏機構獲得。疱疹科病毒包括例如單純疱疹病毒（HSV）及埃-巴二氏病毒（EBV），以及巨細胞病毒（CMV）及假性狂犬病病毒（PRV）；其亦可自諸如ATCC之保藏機構獲得。

「輔助病毒功能」係指在輔助病毒基因組中編碼的功能，其允許AAV複製及封裝（結合本文所述之其他複製及封裝要求）。如本文所述，「輔助病毒功能」可以多種方式提供，包括藉由提供輔助病毒或以反式向生產細胞提供例如編碼必需功能的多核苷酸序列。

本文所提供之rAAV基因組沒有AAV rep及cap DNA。本文考慮之rAAV基因組中的AAV DNA（例如ITR）可來自適於衍生重組病毒之任何AAV血清型，包括但不限於AAV血清型Anc80、AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-11、AAV-12、AAV-13、AAV rh.74及AAV-B1。如上所述，各種AAV血清型基因組之核苷酸序列為此項技術中已知的。亦考慮具有衣殼突變之rAAV。參見例如Marsic等人, 《分子療法》,22 (11): 1900-1909 (2014)。亦考慮本文中經修飾之衣殼，其包括具有各種轉譯後修飾諸如糖基化及脫醯胺化之衣殼。在本文提供之rAAV衣殼中考慮天冬醯胺或麩醯胺酸側鏈的脫醯胺化，使得天冬醯胺殘基轉化為天冬胺酸或異天冬胺酸殘基，以及麩醯胺酸轉化為麩胺酸或異麩胺酸。參見例如Giles等人, 《分子療法》, 26(12): 2848-2862 (2018)。亦考慮本文中經修飾之衣殼，其包含將rAAV引導至需要治療之受影響組織及器官的靶向序列。

本文所提供之DNA質體包含本文所述之rAAV基因組。可將DNA質體轉移至容許用AAV之輔助病毒（例如腺病毒、E1缺失之腺病毒或疱疹病毒）感染的細胞，以便將rAAV基因組組裝成具有AAV9衣殼蛋白之感染性病毒顆粒。產生rAAV之技術為本領域中之標準技術，其中將待封裝之rAAV基因組、rep及cap基因以及輔助病毒功能提供至細胞。rAAV顆粒之產生要求在單個細胞（在本文中稱為封裝細胞）內存在以下組分：rAAV基因組，與rAAV基因組分離（亦即不在其中）之AAV rep及cap基因，以及輔助病毒功能。AAV rep及cap基因可來自可衍生重組病毒之任何AAV血清型，且可來自與rAAV基因組ITR不同的AAV血清型。假型化rAAV之產生揭示於例如WO 01/83692中，其以全文引用的方式併入本文中。在各種實施例中，AAV衣殼蛋白可經修飾以增強重組rAAV之遞送。對衣殼蛋白之修飾一般為此項技術中已知的。參見例如US 2005/0053922及US 2009/0202490，其揭示內容以全文引用的方式併入本文中。

產生封裝細胞之方法為產生穩定表現用於rAAV產生之所有必需組分的細胞株。舉例而言，可將包含缺少AAV rep及cap基因之rAAV基因組、與rAAV基因組分離之AAV rep及cap基因及可選標記（諸如新黴素抗性基因）的質體（或多個質體）整合至細胞之基因組中。rAAV基因組可藉由諸如GC拖尾（Samulski等人, 1982, 《美國國家科學院院刊（Proc. Natl. Acad.）》 S6. USA, 79:2077-2081）、添加含有限制性核酸內切酶切割位點之合成連接子（Laughlin等人, 1983, 《基因（Gene）》, 23:65-73）或藉由直接的平末端連接（Senapathy & Carter, 1984, 《生物化學雜誌（J. Biol. Chem.）》, 259:4661-4666）之程序引入細菌質體中。封裝細胞株可隨後經諸如腺病毒之輔助病毒感染。此方法之優勢在於所述細胞為可選的且適於大規模生產rAAV。適合方法之其他非限制性實例採用腺病毒或桿狀病毒而非質體，以將rAAV基因組及/或rep及cap基因引入封裝細胞中。

rAAV顆粒產生之一般原理綜述於例如Carter, 1992, 《生物技術之當前觀點（Current Opinions in Biotechnology）》, 1533-539；及Muzyczka, 1992, 《微生物學和免疫學之當前主題》, 158:97-129）中。各種方法描述於Ratschin等人, 《分子與細胞生物學（Mol. Cell.Biol.）》 4:2072 (1984)；Hermonat等人, 《美國國家科學院院刊》, 81:6466 (1984)；Tratschin等人, 《分子與細胞生物學》5:3251 (1985)；McLaughlin等人, 《病毒學雜誌》, 62:1963 (1988)；及Lebkowski等人, 1988 《分子與細胞生物學》, 7:349 (1988)。Samulski等人 (1989, 《病毒學雜誌》, 63:3822-3828)；美國專利第5,173,414號；WO 95/13365及相應的美國專利第5,658.776號；WO 95/13392；WO 96/17947；PCT/US98/18600；WO 97/09441 (PCT/US96/14423)；WO 97/08298 (PCT/US96/13872)；WO 97/21825 (PCT/US96/20777)；WO 97/06243 (PCT/FR96/01064)；WO 99/11764；Perrin等人 (1995) 《疫苗（Vaccine）》 13:1244-1250；Paul等人 (1993) 《人類基因療法（Human Gene Therapy）》 4:609-615；Clark等人 (1996) 《基因療法（Gene Therapy）》 3:1124-1132；美國專利第5,786,211號；美國專利第5,871,982號；及美國專利第6,258,595號。前述文件特此以全文引用的方式併入本文中，特別著重於文件中與rAAV顆粒產生相關之彼等部分。

本文進一步提供產生感染性rAAV顆粒之封裝細胞。在一個實施例中，封裝細胞可為經穩定轉型之癌細胞，諸如HeLa細胞、293細胞及PerC.6細胞（同源293株）。在另一個實施例中，封裝細胞可為並非經轉型癌細胞的細胞，諸如低傳代293細胞（用腺病毒之E1轉型的人類胚胎腎細胞）、MRC-5細胞（人類胚胎纖維母細胞）、WI-38細胞（人類胚胎纖維母細胞）、Vero細胞（猴腎細胞）及FRhL-2細胞（恆河猴胚胎肺細胞）。

本文亦提供包含本揭示案之rAAV基因組的rAAV（例如感染性衣殼化的rAAV顆粒）。rAAV之基因組缺少AAV rep及cap DNA，亦即，在rAAV基因組的ITR之間不存在AAV rep或cap DNA。rAAV基因組可為自互補（sc）基因組。具有sc基因組之rAAV在本文中稱為scAAV。rAAV基因組可為單股（ss）基因組。具有單股基因組之rAAV在本文中稱為ssAAV。

rAAV可藉由此項技術中標準的方法，諸如藉由管柱層析或氯化銫梯度來純化。自輔助病毒純化rAAV之方法為此項技術中已知的，且可包括例如Clark等人, 《人類基因療法（Hum. Gene Ther. ）》, 10(6): 1031-1039 (1999)；Schenpp及Clark, 《分子醫學方法（Methods Mol. Med. ）》, 69: 427-443 (2002)；美國專利第6,566,118號及WO 98/09657中所揭示之方法。

亦提供包含rAAV之組合物。組合物包含編碼CLN6多肽之rAAV。組合物可包括兩種或更多種編碼不同所關注多肽之rAAV。在一些實施例中，rAAV為scAAV或ssAAV。

本文所提供之組合物包含rAAV及一或多種醫藥學上可接受之賦形劑。可接受之賦形劑對接受者為無毒的，且較佳在所用劑量及濃度下為惰性的，包括但不限於緩衝劑，諸如磷酸鹽[例如磷酸鹽緩衝鹽水（PBS）]、檸檬酸鹽或其他有機酸；抗氧化劑，諸如抗壞血酸；低分子量多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、精胺酸或離胺酸；單糖、雙糖及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖醇，諸如甘露糖醇或山梨糖醇；成鹽相對離子，諸如鈉；及/或非離子型界面活性劑，諸如Tween，共聚物，諸如泊洛沙姆188、普朗尼克（例如Pluronic F68）或聚乙二醇（PEG）。本文所提供之組合物可包含醫藥學上可接受之水性賦形劑，其含有非離子型低滲化合物，諸如碘比醇、碘海醇、碘美普爾、碘帕醇、碘噴托、碘普羅胺、碘佛醇或碘昔蘭，其中含有非離子型低滲化合物之水性賦形劑可具有一或多個以下特徵：約180 mgI/mL，藉由蒸氣壓滲透壓測定法之重量莫耳滲透濃度為約322mOsm/kg水，容積莫耳滲透濃度為約273mOsm/L，絕對黏度在20℃下為約2.3cp且在37℃下為約1.5cp，及比重在37℃下為約1.164。例示性組合物包含約20至40%非離子型低滲化合物或約25%至約35%非離子型低滲化合物。一種例示性組合物包含調配於20 mM Tris（pH8.0）、1 mM MgCl₂ 、200 mM NaCl、0.001%泊洛沙姆188及約25%至約35%非離子型低滲化合物中之scAAV或rAAV病毒顆粒。另一種例示性組合物包含調配於1X PBS及0.001%Pluronic F68中之scAAV。

在本揭示案之方法中待投與之rAAV的劑量將視例如特定rAAV、投與模式、投與時間、治療目標、個體及所靶向之細胞類型而變化，且可藉由此項技術中標準之方法來確定。劑量可以病毒基因組（vg）為單位來表示。本文所考慮之劑量包括約1x10⁷ 、1x10⁸ 、1x10⁹ 、5x10⁹ 、6 x10⁹ 、7x10⁹ 、8x10⁹ 、9x10⁹ 、1x10¹⁰ 、2x10¹⁰ 、3x10¹⁰ 、4x10¹⁰ 、5x10¹⁰ 、1x10¹¹ 、約1x10¹² 、約1x10¹³ 、約1.1x10¹³ 、約1.2x10¹³ 、約1.3x10¹³ 、約1.5x10¹³ 、約2 x10¹³ 、約2.5 x10¹³ 、約3 x 10¹³ 、約3.5 x 10¹³ 、約4x 10¹³ 、約4.5x 10¹³ 、約5 x 10¹³ 、約6x10¹³ 、約1x10¹⁴ 、約2 x10¹⁴ 、約3 x 10¹⁴ 、約4x 10¹⁴ 、約5x10¹⁴ 、約1x10¹⁵ 至約1x10¹⁶ 或更多的總病毒基因組。亦考慮約1x10⁹ 至約1 x10¹⁰ 、約5x 10⁹ 至約5 x10¹⁰ 、約1x10₁₀ 至約1x 10¹¹ 、約1x10¹¹ 至約1x10¹⁵ vg、約1x10¹² 至約1x10¹⁵ vg、約1x10¹² 至約1x10¹⁴ vg、約1x10¹³ 至約6x10¹⁴ vg及約6x10¹³ 至約1.0x10¹⁴ vg之劑量。本文中例示的一種劑量為6x10¹³ vg。本文中例示的另一種劑量為1.5x10¹³ vg。

提供用rAAV轉導靶視網膜細胞之方法。視網膜細胞包括雙極細胞、視桿細胞、視錐細胞、神經節細胞、米勒神經膠質細胞、小神經膠質細胞、水平細胞或無軸突神經細胞。

術語「轉導」用於指經由本揭示案之複製缺陷型rAAV將CLN6多核苷酸活體內或活體外投與/遞送至靶細胞，使得受體細胞表現功能性多肽。用本揭示案之rAAV轉導細胞使得由rAAV編碼之多肽或RNA持續表現。本揭示案因此提供藉由鞘內、局部IV遞送、腦室內、肌肉內、視網膜下注射、玻璃體內遞送或腦實質內遞送或其任何組合向個體投與/遞送編碼轉殖基因編碼之多肽的rAAV的方法。鞘內遞送係指遞送至腦或脊髓之蜘蛛膜下的空間。在一些實施例中，鞘內投與係經由腦池內投與。轉殖基因

所揭示之方法將所關注之任何轉殖基因遞送至視網膜細胞。轉殖基因為編碼所關注之多肽的多核苷酸序列，或為抑制、干擾或沉默所關注基因表現之核酸，諸如siRNA或miRNA。

例示性轉殖基因為編碼RPE65、RPGR、ORF15、CNGA3、CMH、ND4、PDE6B、ChR2、MERTK、hRS1、hMYOJA、hABCA4、CD59、抗hVEGF抗體、內皮抑素-血管抑制素、sFLT01或sFLT-1之多核苷酸。在一個實施例中，轉殖基因編碼CLN多肽，諸如CLN1、CLN2、CLN3、CLN4、CLN5、CLN6或CLN8。另外的例示性轉殖基因包括針對RTP801之siRNA、針對VEGFR-1之siRNA、針對VEGF之siRNA或針對ADRB2之siRNA。

將在視網膜中表現之miRNA設想為轉殖基因以包括在所揭示之經最佳化之基因療法載體中。miRNA之實例提供於Karali等人, 《核酸研究（Nucleic Acids Res.）》 2016年2月29日; 44(4): 1525-1540中，其以引用的方式併入本文中。

本文所提供之rAAV基因組可包含編碼轉殖基因之多核苷酸，其包含編碼RPE65、RPGR、ORF15、CNGA3、CMH、ND4、PDE6B、ChR2、MERTK、hRS1、hMYOJA、hABCA4、CD59、PEDF、內皮抑素-血管抑制素基因、sFLT-1 、編碼抗hVEGF抗體之基因中之任一者的多核苷酸序列。舉例而言，由轉殖基因編碼之多肽包括具有與由轉基因序列編碼之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列的多肽。

本文所提供之rAAV基因組包含編碼CLN多肽之多核苷酸，所述CLN多肽諸如CLN1、CLN2、CLN3、CLN4、CLN5、CLN6及CLN8。多肽包括具有與CLN多肽胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列的多肽，且其編碼具有CLN活性（例如，與例如治療前之患者相比，在治療時患者之溶酶體自螢光存儲材料的清除率增加、ATP合成酶次單元C的溶酶體積聚減少以及星形膠質細胞及小神經膠質細胞的活化減少中之至少一者）之多肽。

在一些情況下，本文所提供之rAAV基因組包含編碼CLN多肽之多核苷酸或與編碼具有CLN活性（例如，與例如治療前之患者相比，在治療時患者之溶酶體自螢光存儲材料的清除率增加、ATP合成酶次單元C的溶酶體積聚減少以及星形膠質細胞及小神經膠質細胞的活化減少中之至少一者）之多肽的核苷酸序列至少65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的多核苷酸。

在一些實施例中，本文所提供之rAAV基因組包含轉殖基因，所述轉殖基因包含編碼具有所需活性之多肽且在嚴格條件下與已知所關注之轉殖基因的核酸序列或其互補序列中之任一者雜交的多核苷酸序列。在其他實施例中，本文所提供之rAAV基因組包含編碼具有CLN活性之多肽且在嚴格條件下與編碼CLN多肽之核酸序列或其互補序列中之任一者雜交的多核苷酸序列。

以下概述每種巴藤病亞型之疾病特徵，且著重於視覺成分。「主要受影響的視網膜細胞」行中所包括的資料係基於自小鼠視網膜彙集之單細胞RNA資料而確定。此資料的調查仍在進行中。

巴藤病	受影響的基因	擬議的基因功能	疾病發作	視力喪失發作	主要受影響的視網膜細胞
CLN1	PPT1	溶酶體酶	6 - 24 個月	2年	米勒神經膠質細胞，神經節細胞，水平細胞，無軸突神經細胞
CLN2	TPP1	溶酶體酶	2 - 4歲	4 - 6歲	米勒神經膠質細胞
CLN3	CLN3	跨膜蛋白	4 - 8歲	初期症狀	米勒神經膠質細胞
CLN4	DNAJC5	細胞質蛋白	〜30歲	罕見	在所有細胞類型中廣泛[高]表現
CLN5	CLN5	可溶性溶酶體蛋白	4.5 - 7歲	5 - 11歲	米勒神經膠質細胞
CLN6	CLN6	跨膜蛋白	18個月 - 8歲	初期症狀	視錐及視桿雙極細胞
CLN7	MFSD8	跨膜蛋白	2 - 7歲	初期症狀	在所有細胞類型中廣泛[低]表現
CLN8	CLN8	跨膜蛋白	2 - 6歲	2-10歲	米勒神經膠質細胞
CLN9	未知	未知	4 - 10歲	初期症狀	未知
CLN10	CTSD	溶酶體酶	出生時	由於早亡而無法表徵	在所有細胞類型中廣泛[高]表現
CLN11	GRN	分泌途徑蛋白	15 - 50歲	初期症狀	米勒神經膠質細胞，小神經膠質細胞
CLN12	ATP13A2	跨膜蛋白	〜8歲	沒有	在所有細胞類型中廣泛[中等-高]表現
CLN13	CTSF	溶酶體酶	〜30歲	無視力喪失	在所有細胞類型中廣泛[高]表現
CLN14	KCTD7	細胞質蛋白	8 - 24個月	各異；〜4 歲	在所有細胞類型中廣泛[低]表現

術語「嚴格」用於指此項技術中通常理解為嚴格的條件。雜交嚴格度主要由溫度、離子強度及諸如甲醯胺之變性劑的濃度決定。雜交及洗滌之嚴格條件的實例包括但不限於在65-68℃下之0.015 M氯化鈉、0.0015 M檸檬酸鈉，或在42℃下之0.015 M氯化鈉、0.0015M檸檬酸鈉及50%甲醯胺。參見例如Sambrook等人, 《分子選殖：實驗室手冊（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）》, 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory, (Cold Spring Harbor, N.Y. 1989)。投與方法

在本文中例示鞘內投與。鞘內遞送係指遞送至腦或脊髓之蜘蛛膜下的空間。在一些實施例中，鞘內投與係經由腦池內注射或腰椎內注射。此等方法包括用本文所述之一或多種rAAV轉導靶細胞。在一些實施例中，將包含轉殖基因之rAAV病毒顆粒投與或遞送至患者的眼睛、腦及/或脊髓。在一些實施例中，將多核苷酸遞送至腦。預期遞送的腦區包括但不限於運動皮質、視覺皮質、小腦及腦幹。在一些實施例中，將多核苷酸遞送至脊髓。在一些實施例中，將多核苷酸遞送至下運動神經元。可將多核苷酸遞送至視網膜細胞，諸如雙極細胞、視桿細胞、視錐細胞、神經節細胞、米勒神經膠質細胞、小神經膠質細胞、水平細胞或無軸突神經細胞。

在本文所提供之方法的一些實施例中，在投與rAAV後將患者保持在特倫德倫伯臥位（頭朝下的位置）（例如持續約5、約10、約15或約20分鐘）。舉例而言，患者可以頭朝下的位置傾斜約1度至約30度、約15至約30度、約30至約60度、約60至約90度或約90至約180度)。

對於視網膜下投與，用針頭（例如30G針頭）在眼睛赤道處或後部切一個小鞏膜切口。病毒或媒劑經由切口，例如藉由管道與Hamilton注射器相連的細玻璃移液管或經由30G針頭及Hamilton注射器進行視網膜下遞送。舉例而言，視網膜下投與係由經臨床訓練的外科醫生使用此項技術中已知的方法進行。

對於腦室內注射，將針頭插入顱骨，且將液體注射至含有腦脊髓液的腦室中。舉例而言，腦室內注射係由經臨床訓練的外科醫生使用此項技術中已知的方法進行。

在投與方法中之任一者中，組合物可包含非離子型低滲造影劑。舉例而言，組合物可包含非離子型低滲造影劑，其選自由以下組成之群組：碘比醇、碘海醇、碘美普爾、碘帕醇、碘噴托、碘普羅胺、碘佛醇、碘昔蘭及其組合。

本文所提供之方法包含向有需要之個體（例如動物，包括但不限於人類患者）投與有效劑量或有效多次劑量的包含本文所提供之rAAV的組合物的步驟。若在視力相關病症之症狀出現之前投與所述劑量，則投與為預防性的。若在視力相關病症之症狀出現之後投與所述劑量，則投與為治療性的。有效劑量為緩解（消除或減輕）與視力相關病症相關的至少一種症狀、減緩或防止病症進展、減輕病症程度、致使（部分或全部）病症緩解及/或延長生存期及/或視力的劑量。與治療前的個體相比或與未治療的個體相比，本文所提供之方法導致穩定，視力喪失或視網膜變性的進展減少，或視力或黃斑變性的改善。

當視力相關病症為CLN巴藤病時，與治療前的個體相比或與未治療的個體相比，本文所提供之方法導致穩定、進展減少或用於評估CLN巴藤病之進展及/或改善的一或多種量表，例如統一巴藤病評級系統（UBDRS）或漢堡運動及語言量表（Hamburg Motor and Language Scale）的改善。UBDRS評定量表（如Marshall等人, 《神經學（Neurology.）》2005 65(2):275-279中所述）[包括UBDRS身體用於評估CLN巴藤病之進展及/或改良的一或多種量表，例如統一巴藤病評級系統（UBDRS）或漢堡及語言量表。UBDRS評定量表（如Marshall等人, 《神經學》2005 65(2):275-279中所述）[包括UBDRS身體評定量表、UBDRS癲癇發作評定量表、UBDRS行為評定量表、UBDRS能力評定量表、UBDRS症狀發作順序及UBDRS臨床總體印象（CGI）]；小兒生活品質量表（PEDSQOL）量表、運動功能、語言功能、認知功能及生存率。與治療前的個體相比或與未治療的個體相比，本文所提供之方法可導致以下中之一或多者：自發螢光存儲材料之溶酶體積聚減少或減緩、ATP合成酶次單元C之溶酶體積聚減少或減緩、神經膠質細胞活化（星形膠質細胞及/或小神經膠質細胞）活化減少或減緩；星形膠質細胞增生減少或減緩，且顯示出藉由MRI量測之腦容量損失減少或延遲。糖苷水解酶

本揭示案提供與糖苷水解酶組合在載體中投與經最佳化之基因療法，所述糖苷水解酶諸如神經胺糖酸苷酶、乳糖酶、澱粉酶、殼質酶、纖維素酶、蔗糖酶、麥芽糖酶、轉化酶或溶菌酶。外切葡糖苷酶自聚醣鏈移除末端唾液酸。此等唾液酸存在於所有細胞類型之聚糖鏈的最外端及大多數分泌蛋白上。已知糖苷水解酶清除細胞膜殘留物，據認為，此清除作用可實現更大的病毒受體靶向及細胞進入。舉例而言，神經胺糖酸苷酶處理移除N-連接之半乳糖苷殘基，從而增強使用N-連接之半乳糖殘基作為受體進入細胞之AAV（例如AAV9）的滲透（參見Shen等人 《生物化學雜誌》 286:13532-13540, 2011）。在本文中舉例說明向視網膜細胞的遞送，然而所揭示之方法、組合物及用途可靶向任何細胞類型，其中糖苷水解酶清除細胞膜上的受體。

亦提供包含經最佳化之基因療法載體的組合療法。術語「組合療法」及「組合治療」係指將所揭示之經最佳化之基因療法載體與改善對視網膜細胞之靶向性的藥劑（諸如酶）一起投與。在一些實施例中，所述方法包含與基因療法載體之投與組合向個體投與糖苷水解酶。例如，糖苷水解酶為神經胺糖酸苷酶、乳糖酶、澱粉酶、殼質酶、纖維素酶、蔗糖酶、麥芽糖酶、轉化酶或溶菌酶。藥劑可藉由本文所述之任何投與途徑與載體同時或依次投與。

本文所用之組合包括同時治療或依次治療。舉例而言，基因療法載體及糖苷水解酶係使用相同的投與模式同時投與，或基因療法載體及糖苷水解酶各自使用不同的投與模式同時投與。在另一個實例中，基因療法載體及糖苷水解酶係使用相同的投與模式依次投與，或基因療法載體及糖苷水解酶各自使用不同的投與模式依次投與。特別考慮本文所述之方法與標準醫學治療之組合。

在一些實施例中，經最佳化之基因療法載體與諸如神經胺糖酸苷酶之糖苷水解酶同時投與。在其他實施例中，經最佳化之基因療法載體在諸如神經胺糖酸苷酶之糖苷水解酶之前或之後立即投與。在其他實施例中，經最佳化之基因療法載體在諸如神經胺糖酸苷酶之糖苷水解酶投與的約15分鐘內、約20分鐘內、約25分鐘內、約30分鐘內、約45分鐘內、1小時內、2小時內、3小時內、4小時內、5小時內、6小時內、7小時內、8小時內、9小時內、12小時內、24小時內、36小時內或48小時內投與。在一些實施例中，糖苷水解酶在投與經最佳化之基因療法載體之前或在投與經最佳化之基因療法載體之後投與。

在一些實施例中，經最佳化之基因療法載體及諸如神經胺糖酸苷酶之糖苷水解酶在單次玻璃體內注射中投與。然而，本揭示案亦提供在分開的玻璃體內注射中投與經最佳化之基因療法載體及諸如神經胺糖酸苷酶之糖苷水解酶的組合。舉例而言，糖苷水解酶，例如神經醯胺酶，在投與經最佳化之基因療法載體之前約30分鐘投與。另外，經最佳化之基因療法載體及糖苷水解酶可使用不同的投與模式投與。 實例

儘管以下實例描述具體實施例，但應理解，本領域中熟習此項技術者將想到各種變化及修改。因此，本發明應僅受如申請專利範圍中所呈現之此類限制的限制。實例 1 scAAV9.GFP 及 Anc80.GFP 之產生

人類GFP cDNA純系係自Origene, Rockville, MD獲得。將GFP cDNA進一步次選殖至自互補AAV9基因組或Anc80基因組中，處於雜交雞β-肌動蛋白啟動子（CB）、CMV強化子-啟動子或P546啟動子下，且進行活體外及活體內測試。圖 1 提供質體構築體之示意圖，顯示GFP cDNA插入於AAV2 ITR之間。質體構築體亦包括CB啟動子、諸如猿猴病毒40（SV40）嵌合內含子之內含子及牛生長激素（BGH）聚腺苷酸化信號（BGH PolyA）中之一或多者。將圖 1 中之構築體封裝至AAV9基因組或Anc80基因組（統稱為「AAV」）中。實例 2 scAAV9.CB.GFP 與神經胺糖酸苷酶組合之玻璃體內注射

如上所述將小鼠麻醉以進行玻璃體內注射。用30G針頭在腰與鞏膜之間切一個小切口。使用藉由管道與Hamilton注射器相連的細玻璃移液管經由切口或經由30G針頭及Hamilton注射器將病毒或媒劑遞送至玻璃體腔中。注射前後，局部塗覆奧輔賽因（ophthaine）及維托波欣（vetropolycin），經由護理標準（加熱的籠子進行恢復、食物在籠子底部、長吸管）使小鼠恢復，且進行監測直至穩定

經由一次玻璃體內注射將scAAV9.CB.GFP投與小鼠（1-5個月大），且經兩個月之過程在不同時間點監測表現。將AAV及Anc80以範圍介於9x10⁹ 及3.2x10¹⁰ vg之劑量投與，將其稀釋於PBS中或直接注射rAAV。另外，在單次玻璃體內注射中，rAAV與神經胺糖酸苷酶同時投與或不與神經胺糖酸苷酶同時投與。為了同時投與，在臨注射前將rAAV與神經胺糖酸苷酶混合且作為單一溶液施用。如圖 2A 中所示，玻璃體內注射導致GFP在視網膜中之表現。此外，scAAV9.CB.GFP與神經胺糖酸苷酶組合投與增強轉殖基因向視網膜外層中的滲透。視網膜染色標記之關鍵陳述如下：

視網膜細胞類型	視網膜層	抗體
雙極細胞（全部）	內核層（INL）	Otx2
雙極細胞（桿）	內核層	PKCα
米勒神經膠質細胞	INL中所有帶核的	Sox2
感光器（桿）	外核層	視紫紅質
無軸突神經細胞	內核層	Pax6
水平細胞	內核層	鈣網膜蛋白
小神經膠質細胞	內核層	Iba1

鈣網膜蛋白為水平細胞的標記（紅色染色劑），且將視網膜的內核層染色。如圖 2B 中所示，AAV9.CB.GFP之玻璃體內注射將轉殖基因遞送至水平細胞，且神經胺糖酸苷酶增強轉殖基因向視網膜內核層中的滲透。

Otx2為所有雙極細胞的核標記（紅色染色劑），且將視網膜的內核層染色。如圖 2C 中所示，AAV9.CB.GFP之玻璃體內注射將轉殖基因遞送至雙極細胞，且神經胺糖酸苷酶增強轉殖基因向視網膜內核層中的滲透。

Pax6為無軸突神經細胞的標記（紅色染色劑），且將視網膜的內核層染色。如圖 2D 中所示，AAV9.CB.GFP之玻璃體內注射將轉殖基因遞送至無軸突神經細胞，且神經胺糖酸苷酶增強轉殖基因向視網膜內核層中的滲透。

Sox2為米勒神經膠質細胞的標記（紅色染色劑），且將視網膜內層之所有細胞核染色。如圖 2E 中所示，AAV9.CB.GFP之玻璃體內注射將轉殖基因遞送至米勒神經膠質細胞，且神經胺糖酸苷酶增強轉殖基因向視網膜內核層中的滲透。實例 3

為了進一步研究神經胺糖酸苷酶對轉導之影響，如圖 3 中所描繪，8週齡野生型小鼠接受AAV9.CB.GFP與或不與神經胺糖酸苷酶之玻璃體內注射。如實例2中所詳述，將~2x10¹⁰ vg之AAV9.CB.GFP注入小鼠。對圖 4A 及圖 4B 中之視網膜組織進行轉殖基因GFP及雙極細胞特異性標記Otx2的染色。在玻璃體內注射AAV載體之前或之後添加神經胺糖酸苷酶顯著增加雙極細胞的病毒轉導（參見圖 4C ）。

儘管本文已展示及描述本發明之較佳實施例，但本領域中熟習此項技術者將明白，此類實施例僅藉助於實例提供。在不脫離本發明之情況下，本領域中熟習此項技術者現將想到許多變化、改變及取代。應理解，可採用本文所述之實施例的各種替代方案。預期以下申請專利範圍界定本發明之範圍，且因此涵蓋此等申請專利範圍及其等效物之範圍內的方法及結構。

本申請案中提及之所有文獻均以全文引用之方式併入本文中。參考文獻

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CLN3 胺基酸序列 （ SEQ ID NO: 2 ）

CLN6 核苷酸序列 （ SEQ ID NO: 3 ）

CLN6 胺基酸序列：（ SEQ ID NO: 4 ）

CLN8 核苷酸序列 （ SEQ ID NO: 5 ）

CLN8 胺基酸序列 （ SEQ ID NO: 6 ）

CB 啟動子 （ SEQ ID NO: 7 ）

CMV 啟動子 （ SEQ ID NO: 8 ）

P546 啟動子 （ SEQ ID NO: 9 ）

圖 1 提供在本揭示案中測試之載體的示意圖。

圖 2A-2E 顯示玻璃體內遞送後GFP轉殖基因之視網膜遞送，且表明與神經胺糖酸苷酶組合投與增強轉殖基因的滲透。

圖 3 提供詳細說明在8週齡野生型小鼠中進行有及沒有神經胺糖酸苷酶之玻璃體內注射之時序的示意圖。

圖 4A-4C 證明神經胺糖酸苷酶之添加顯著增加雙極細胞之病毒轉導。對組織進行GFP及Otx染色，Otx為雙極細胞特異性標記。

Claims (43)

1. 一種組合物，其包含基因療法載體及糖苷水解酶。
2. 如請求項1之組合物，其中所述糖苷水解酶為神經胺糖酸苷酶、乳糖酶、澱粉酶、殼質酶、纖維素酶、蔗糖酶、麥芽糖酶、轉化酶或溶菌酶。
3. 如請求項1或2之組合物，其中所述基因療法載體為AAV8、AA9或Anc80。
4. 如請求項1至3中任一項之組合物，其中所述組合物經調配用於局部靜脈內遞送、視網膜下遞送、玻璃體內遞送或鞘內遞送。
5. 如請求項1至4中任一項之組合物，其中將所述基因療法載體及所述糖苷水解酶混合以同時投與。
6. 一種套組，其包含用於將轉殖基因遞送至個體之視網膜細胞，所述套組包含基因療法載體及糖苷水解酶。
7. 如請求項6之套組，其中所述糖苷水解酶為神經胺糖酸苷酶、乳糖酶、澱粉酶、殼質酶、纖維素酶、蔗糖酶、麥芽糖酶、轉化酶或溶菌酶。
8. 如請求項6或7之組合物，其中所述基因療法載體為AAV8、AA9或Anc80。
9. 一種將轉殖基因遞送至個體之視網膜細胞的方法，其包含向所述個體投與i)編碼所述轉殖基因之基因療法載體及ii)糖苷水解酶。
10. 一種治療個體之視力障礙或視力相關病症的方法，其包含向所述個體投與i)編碼所述轉殖基因之基因療法載體及ii)糖苷水解酶，其中所述轉殖基因之遞送有效治療所述視力障礙或所述視力相關病症。
11. 如請求項9或10之方法，其中所述糖苷水解酶為神經胺糖酸苷酶、乳糖酶、澱粉酶、殼質酶、纖維素酶、蔗糖酶、麥芽糖酶、轉化酶或溶菌酶。
12. 如請求項9至11中任一項之方法，其中所述視網膜細胞為雙極細胞、視桿細胞、視錐細胞、神經節細胞、米勒神經膠質細胞、小神經膠質細胞、水平細胞或無軸突神經細胞。
13. 如請求項9至12中任一項之方法，其中所述基因療法載體係使用局部靜脈內遞送、視網膜下遞送、玻璃體內遞送或鞘內遞送投與所述個體。
14. 如請求項9至13中任一項之方法，其中所述編碼所述轉殖基因之基因療法載體及所述糖苷水解酶係同時投與所述個體。
15. 如請求項14之方法，其中將所述基因療法載體及所述糖苷水解酶混合。
16. 如請求項9至14中任一項之方法，其中所述基因療法載體及所述糖苷水解酶係分開投與。
17. 如請求項10至16中任一項之方法，其中所述視力相關病症為巴藤病、先天性白內障、先天性青光眼、視網膜變性、視神經萎縮、眼畸形。斜視、眼錯位、青光眼、年齡相關之濕性黃斑變性、年齡相關之乾性黃斑變性、色素性視網膜炎、無脈絡膜症、萊伯先天性黑蒙症、萊伯遺傳性視神經病變、早發性視網膜營養不良、色盲、x性聯視網膜劈裂症、尤塞氏症候群1B、年齡相關之新生血管性黃斑變性、斯特格特氏黃斑變性、糖尿病性黃斑變性或糖尿病性黃斑水腫。
18. 一種用於將轉殖基因遞送至個體之視網膜細胞的組合物，其中所述組合物包含i)編碼所述轉殖基因之基因療法載體及ii)糖苷水解酶。
19. 一種用於治療個體之視力障礙或視力相關病症的組合物，其中所述組合物包含i)編碼所述轉殖基因之基因療法載體及ii)糖苷水解酶。
20. 一種用於將轉殖基因遞送至個體之視網膜細胞的組合物，其中所述組合物包含編碼所述轉殖基因之基因療法載體，其中所述組合物與包含糖苷水解酶之第二組合物一起投與。
21. 一種用於治療個體之治療視力障礙或視力相關病症的組合物，其中所述組合物包含編碼所述轉殖基因之基因療法載體，其中所述組合物與包含糖苷水解酶之第二組合物一起投與。
22. 一種用於將轉殖基因遞送至個體之視網膜細胞的組合物，其中所述組合物包含糖苷水解酶，其中所述組合物與包含編碼所述轉殖基因之基因療法載體的第二組合物一起投與。
23. 一種用於治療個體之治療視力障礙或視力相關病症的組合物，其中所述組合物包含糖苷水解酶，其中所述組合物與包含編碼所述轉殖基因之基因療法載體的第二組合物一起投與。
24. 如請求項19至23中任一項之組合物，其中所述糖苷水解酶為神經胺糖酸苷酶、乳糖酶、澱粉酶、殼質酶、纖維素酶、蔗糖酶、麥芽糖酶、轉化酶或溶菌酶。
25. 如請求項19至24中任一項之組合物，其中所述視網膜細胞為雙極細胞、視桿細胞、視錐細胞、神經節細胞、米勒神經膠質細胞、小神經膠質細胞、水平細胞或無軸突神經細胞。
26. 如請求項19至25中任一項之組合物，其中所述組合物經調配用於局部靜脈內遞送、視網膜下遞送、玻璃體內遞送或鞘內遞送。
27. 如請求項20至26中任一項之組合物，其中所述組合物及所述第二組合物同時投與所述個體。
28. 如請求項20至27中任一項之組合物，其中所述組合物與所述第二組合物混合。
29. 如請求項20至27中任一項之組合物，其中所述組合物及所述第二組合物分開投與。
30. 如請求項19、21或23至29中任一項之組合物，其中所述視力相關病症為巴藤病、先天性白內障、先天性青光眼、視網膜變性、視神經萎縮、眼畸形。斜視、眼錯位、青光眼、年齡相關之濕性黃斑變性、年齡相關之乾性黃斑變性、色素性視網膜炎、無脈絡膜症、萊伯先天性黑蒙症、萊伯遺傳性視神經病變、早發性視網膜營養不良、色盲、x性聯視網膜劈裂症、尤塞氏症候群1B、年齡相關之新生血管性黃斑變性、斯特格特氏黃斑變性、糖尿病性黃斑變性或糖尿病性黃斑水腫。
31. 一種組合物在製備用於將轉殖基因遞送至個體之視網膜細胞之藥物中的用途，其中所述組合物包含i)編碼所述轉殖基因之基因療法載體及ii)糖苷水解酶。
32. 一種組合物在製備用於治療個體之視力障礙或視力相關病症之藥物中的用途，其中所述組合物包含i)編碼所述轉殖基因之基因療法載體及ii)糖苷水解酶。
33. 一種編碼轉殖基因之基因療法載體在製備用於將轉殖基因遞送至個體之視網膜細胞之藥物中的用途，其中所述藥物與包含糖苷水解酶之組合物一起投與。
34. 一種編碼轉殖基因之基因療法載體在製備用於治療個體之視力障礙或視力相關病症之藥物中的用途，其中所述藥物與包含糖苷水解酶之組合物一起投與。
35. 一種糖苷水解酶在製備用於將轉殖基因遞送至個體之視網膜細胞之藥物中的用途，其中所述藥物與包含編碼所述轉殖基因之基因療法載體的組合物一起投與。
36. 一種糖苷水解酶在製備用於治療個體之治療視力障礙或視力相關病症之藥物中的用途，其中所述藥物與包含編碼所述轉殖基因之基因療法載體的組合物一起投與。
37. 如請求項32至36中任一項之用途，其中所述糖苷水解酶為神經胺糖酸苷酶、乳糖酶、澱粉酶、殼質酶、纖維素酶、蔗糖酶、麥芽糖酶、轉化酶或溶菌酶。
38. 如請求項32至37中任一項之用途，其中所述視網膜細胞為雙極細胞、視桿細胞、視錐細胞、神經節細胞、米勒神經膠質細胞、小神經膠質細胞、水平細胞或無軸突神經細胞。
39. 如請求項32至38中任一項之用途，其中所述藥物經調配用於局部靜脈內遞送、視網膜下遞送、玻璃體內遞送或鞘內遞送。
40. 如請求項33至39中任一項之用途，其中所述藥物及所述組合物同時投與所述個體。
41. 如請求項33至39中任一項之用途，其中所述組合物與所述組合物混合。
42. 如請求項33至39中任一項之用途，其中所述藥物及所述組合物分開投與。
43. 如請求項32、34或36至42中任一項之用途，其中所述視力相關病症為巴藤病、先天性白內障、先天性青光眼、視網膜變性、視神經萎縮、眼畸形。斜視、眼錯位、青光眼、年齡相關之濕性黃斑變性、年齡相關之乾性黃斑變性、色素性視網膜炎、無脈絡膜症、萊伯先天性黑蒙症、萊伯遺傳性視神經病變、早發性視網膜營養不良、色盲、x性聯視網膜劈裂症、尤塞氏症候群1B、年齡相關之新生血管性黃斑變性、斯特格特氏黃斑變性、糖尿病性黃斑變性或糖尿病性黃斑水腫。

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