JP5634262B2 - 差次的コドンバイアスを有する反復コード配列を含むバキュロウイルスベクター - Google Patents

Description

本発明は、医学、分子生物学、及び遺伝子治療の分野に関する。本発明は、バキュロウイルスベクターにおいて反復コード配列が使用される昆虫細胞におけるタンパク質の産生に関する。特に、本発明は、遺伝子治療において使用できるパルボウイルスベクターの産生、及びパルボウイルスベクターの生産性を増大させるウイルスｒｅｐタンパク質の発現の改良に関する。

バキュロウイルス発現系は、真核生物クローニング及び発現ベクターとしてのその使用でよく知られている（Ｋｉｎｇ，Ｌ．Ａ．、とＲ．Ｄ．Ｐｏｓｓｅｅ、１９９２、「バキュロウイルス発現系（Ｔｈｅ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）」、ＣｈａｐｍａｎとＨａｌｌ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ；Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ，Ｄ．Ｒ．ら、１９９２．「バキュロウイルス発現ベクター（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ）」：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ．）。バキュロウイルス発現系の利点は、とりわけ、発現されたタンパク質がほとんどの場合可溶性であり、正しく折り畳まれ、生物学的に活性であることである。追加の利点には、高いタンパク質発現レベル、より迅速な産生、大きなタンパク質の発現に対する適合性、及び大規模生産に対する適合性が挙げられる。しかし、昆虫細胞バイオリアクター中でのバキュロウイルス発現系を使用した異種タンパク質の大規模又は連続生産においては、継代効果としても知られる産生レベルの不安定性が大きな障害となっている。この効果は、少なくとも一部は、バキュロウイルスＤＮＡ中の反復相同配列間での組換えに起因する。

バキュロウイルス発現系は、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの産生のためにも使用され成功を収めていた（Ｕｒａｂｅら、２００２、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１３：１９３５〜１９４３；ＵＳ６，７２３，５５１及びＵＳ２００４０１９７８９５）。ＡＡＶは、ヒト遺伝子治療のためのもっとも有望なウイルスベクターの１つであると見なすことができる。ＡＡＶには分裂ヒト細胞にも非分裂ヒト細胞にも効率よく感染する能力があり、ＡＡＶウイルスゲノムは宿主細胞ゲノム中の単一染色体部位に組み込まれ、もっとも重要なのは、ＡＡＶは、多くのヒトに存在していても、どんな疾患にも関連したことがない。これらの利点を考慮して、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）は、血友病Ｂ、悪性黒色腫、嚢胞性線維症、高リポ蛋白血症Ｉ型及び他の疾患に対する遺伝子治療臨床試験において評価されているところである。

ＡＡＶのための哺乳動物産生系に関する問題を克服するために、Ｕｒａｂｅら（２００２、上記を参照）は、昆虫細胞におけるＡＡＶ産生系を開発した。昆虫細胞においてＡＡＶを産生するためには、３種のＡＡＶカプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３）の正しい化学量論を達成するためにいくつかの改変が必要だったのであり、このためには２つのスプライスアクセプター部位の交互使用と昆虫細胞では正確に複製されないＶＰ２のＡＣＧ開始コドンの次の使用の組合せに利用している。昆虫細胞におけるカプシドタンパク質の正しい化学量論を再現するために、Ｕｒａｂｅら（２００２、上記を参照）は、スプライシングを必要とせずに３種のＶＰタンパク質すべてを発現することができ、一番上流の開始コドンが次の開始コドンＡＣＧで置き換えられている単一ポリシストロン性メッセンジャーに転写される構築物を使用している。国際公開第２００７／０４６７０３号は、昆虫細胞で産生されるＡＡＶカプシドタンパク質の化学量論の最適化による、バキュロウイルス産生ｒＡＡＶベクターベース産生の感染性のさらなる改良を開示している。

Ｕｒａｂｅら（２００２、上記を参照）により初めに開発されたＡＡＶ昆虫細胞発現系でのＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質の発現のために、２つの独立したＲｅｐ発現単位（１つはＲｅｐ７８用、１つはＲｅｐ５２用）であって、各々が、それぞれ△ＩＥ１とＰｏｌＨプロモーターという別個の昆虫細胞プロモーターの制御下にある発現単位を抱える組換えバキュロウイルス構築物を使用している。

しかし、Ｋｏｈｌｂｒｅｎｎｅｒら（２００５、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１２：１２１７〜２５；ＷＯ２００５／０７２３６４）は、Ｕｒａｂｅらが使用した２種のＲｅｐタンパク質の発現のためのバキュロウイルス構築物は、固有の不安定性を被ることを報告した。Ｕｒａｂｅの最初のベクター中の２種のＲｅｐ遺伝子のパリンドローム配向性を分割し、Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ７８を発現するための２種の別個のバキュロウイルスベクターを設計することによって、Ｋｏｈｌｂｒｅｎｎｅｒら（２００５、上記を参照）は、ベクターの継代安定性を高めた。しかし、少なくとも５継代にわたり昆虫細胞において２種の独立したバキュロウイルスＲｅｐ構築物からＲｅｐ７８及びＲｅｐ５２が一貫して発現されるが、ｒＡＡＶベクター収量は、Ｕｒａｂｅら（２００２、上記を参照）により設計された最初のバキュロウイルスＲｅｐ構築物と比べると５分の１〜１０分の１である。

ＷＯ２００７／１４８９７１において、本発明者らは、Ｒｅｐ７８とＲｅｐ５２タンパク質の単一コード配列であって、スキャンしているリボソームにより部分的に読み飛ばされるＲｅｐ７８タンパク質用に次の開始コドンを使用して、翻訳の開始がさらに下流のＲｅｐ５２タンパク質の開始コドンでも起きることを可能にする配列を使用することにより、昆虫細胞におけるｒＡＡＶベクター産生の安定性を著しく改良した。

しかし、昆虫細胞におけるｒＡＡＶベクターを含む異種タンパク質の大規模（商業的）生産にはさらなる改良の必要性が依然として存在する。したがって、異種タンパク質とパルボウイルスベクターの安定的高収量（大規模）生産を可能にする手段と方法を提供することが本発明の目的である。

定義
本明細書で使用するように、用語「作動可能に連結された」とは、ポリヌクレオチド（又はポリペプチド）エレメントを機能的関係で連結することである。核酸は、別の核酸配列と機能的関係におかれると「作動可能に連結される」ことになる。たとえば、転写調節配列は、それがコード配列の転写に影響を与える場合には、コード配列に作動可能に連結されていることになる。作動可能に連結されたとは、連結されているＤＮＡ配列が典型的には近接していること、及び必要ならば、２種のタンパク質コード領域を、近接して読み枠内で結合させることを意味する。

「発現制御配列」とは、それが作動可能に連結されているヌクレオチド配列の発現を調節する核酸配列のことである。発現制御配列は、それがヌクレオチド配列の転写及び／又は翻訳を制御し調節する場合には、ヌクレオチド配列に「作動可能に連結され」ていることになる。したがって、発現制御配列は、プロモーター、エンハンサー、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、転写終結配列、タンパク質コード遺伝子の前の開始コドン、イントロンのスプライシングシグナル、及び終止コドンを含むことができる。用語「発現制御配列」は、最小でも、その存在が発現に影響を与えるように設計されている配列を含むよう意図されており、追加の有利な成分も含むことができる。たとえば、リーダー配列及び融合パートナー配列は、発現制御配列である。前記用語は、枠内と枠外の望ましくない潜在的開始コドンがその配列から取り除かれるように、核酸配列を設計することも含むことができる。前記用語は、望ましくない潜在的スプライス部位が取り除かれるように核酸配列を設計することも含むことができる。前記用語は、ポリＡ尾部、すなわちｍＲＮＡの３’末端にある一続きのアデニン残基、ポリＡ配列と呼ばれる配列の付加を指示する配列又はポリアデニル化配列（ｐＡ）を含む。前記用語は、ｍＲＮＡ安定性を高めるように設計することもできる。転写と翻訳安定性に影響を与える発現制御配列、たとえば、プロモーターのほかにも翻訳をもたらす配列、たとえば、Ｋｏｚａｋ配列も、昆虫細胞では知られている。発現制御配列は、比較的低い発現レベル又は比較的高い発現レベルを達成するように、その配列が作動可能に連結されているヌクレオチド配列を調節するような性質を帯びることができる。

本明細書で使用するように、用語「プロモーター」又は「転写調節配列」とは、１つ又は複数のコード配列の転写を制御するように機能し、前記コード配列の転写開始部位の転写の方向に対して下流に位置しており、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合部位、転写開始部位並びに、転写因子結合部位、リプレッサーとアクチベータータンパク質結合部位及びプロモーターからの転写量を直接的に又は間接的に調節するように働く当業者に公知のヌクレオチドの他のあらゆる配列を含むが、これらに限定されるものではない、他のあらゆるＤＮＡ配列の存在により構造的に同定される核酸フラグメントのことである。「構成的」プロモーターは、大半の生理的及び発生的条件下で大半の組織において活性なプロモーターである。「誘導性」プロモーターは、たとえば、化学的誘導物質の適用により、生理的に及び発生学的に調節されるプロモーターである。「組織特異的」プロモーターは、特定種の組織又は細胞においてのみ活性である。

用語「実質的に同一の」、「実質的同一性」又は「基本的に類似する」若しくは「基本的類似性」は、２種のペプチド又は２種のヌクレオチド配列が、デフォルトパラメータを使用したプログラムＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴによりなどの最適に整列されると、本明細書の他の場所で定義された少なくとも一定の割合の配列同一性を有することを意味する。ＧＡＰはＮｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈグローバルアラインメントアルゴリズムを使用して２つの配列をその全長にわたって整列させ、適合数を最大にし、ギャップの数を最小にする。一般に、ＧＡＰデフォルトパラメータは、ギャップ生成ペナルティー＝５０（ヌクレオチド）／８（タンパク質）とギャップ伸長ペナルティー＝３（ヌクレオチド）／２（タンパク質）で使用される。ヌクレオチドでは、使用されるデフォルトスコアリングマトリックスはｎｗｓｇａｐｄｎａ、タンパク質では、デフォルトスコアリングマトリックスはＢｌｏｓｕｍ６２である（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、１９９２、ＰＮＡＳ８９、９１５〜９１９）。ＲＮＡ配列がＤＮＡ配列と基本的に類似している又は一定程度の配列同一性を有すると言われるとき、そのＤＮＡ配列中のチミン（Ｔ）はそのＲＮＡ配列中のウラシル（Ｕ）に等しいと見なされることは明白である。配列アラインメント及び割合配列同一性を表すスコアは、Ａｃｃｅｌｒｙｓ Ｉｎｃ．、９６８５ Ｓｃｒａｎｔｏｎ Ｒｏａｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ９２１２１−３７５２ ＵＳＡから入手できるＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ、１０．３版、又はオープンソースソフトウェアＥｍｂｏｓｓ ｆｏｒ Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）（現行版２．７．１−０７）などのコンピュータプログラムを使用して決定してもよい。代わりに、割合類似性又は同一性を、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ等などのデータベースに対して検索することにより決定してもよい。

本発明のパルボウイルスＲｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、中程度のハイブリダイゼーション条件下で、又は好ましくは厳密なハイブリダイゼーション条件下で、それぞれ配列番号１〜４のヌクレオチド配列とハイブリダイズする能力により定義してもよい。厳密なハイブリダイゼーション条件とは、少なくとも約２５、好ましくは約５０ヌクレオチド、７５又は１００及びもっとも好ましくは、約２００以上のヌクレオチドの核酸配列を、約１Ｍ塩、好ましくは６×ＳＳＣを含む溶液中、又は匹敵するイオン強度を有する他の任意の溶液中約６５℃の温度でハイブリダイズさせ、約０．１Ｍ塩、若しくはそれ以下の、好ましくは０．２×ＳＳＣを含む溶液中、又は匹敵するイオン強度を有する他の任意の溶液中６５℃で洗浄する条件として本明細書では定義されている。好ましくは、ハイブリダイゼーションは一晩、すなわち少なくとも１０時間実施し、好ましくは、洗浄は、洗浄液を少なくとも２回変えて少なくとも１時間実施する。これらの条件であれば、通常、約９０％以上の配列同一性を有する配列の特異的ハイブリダイゼーションが可能になる。

中程度の条件とは、少なくとも５０ヌクレオチド、好ましくは約２００以上のヌクレオチドの核酸配列を、約１Ｍ塩、好ましくは６×ＳＳＣを含む溶液中、又は匹敵するイオン強度を有する他の任意の溶液中、約４５℃の温度でハイブリダイズさせ、約１Ｍ塩、好ましくは６×ＳＳＣを含む溶液中、又は匹敵するイオン強度を有する他の任意の溶液中、室温で洗浄する条件として本明細書では定義されている。好ましくは、ハイブリダイゼーションは一晩、すなわち少なくとも１０時間実施し、好ましくは、洗浄は、洗浄液を少なくとも２回変えて少なくとも１時間実施する。これらの条件であれば、通常、最大５０％の配列同一性を有する配列の特異的ハイブリダイゼーションが可能になる。当業者であれば、同一性が５０％と９０％の間で変化する配列を特異的に同定するために、これらのハイブリダイゼーションを改変することができるであろう。

ｐＶＤ１８３の物理地図である。 バキュロウイルスＢａｃ．ＦＢＤＳＬＲ構築物の異なる継代に採取したバキュロウイルス試料中のＯＲＦ１６２９遺伝子とＲｅｐ遺伝子のゲノムコピーの比を示す図である（Ｕｒａｂｅら、２００２、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１３（１６）：１９３５〜４３）。ゲノムコピーはＱＰＣＲにより測定した。 本発明のバキュロウイルスｐＶＤ１８３構築物の異なる継代に採取したバキュロウイルス試料中のＯＲＦ１６２９遺伝子とＲｅｐ遺伝子のゲノムコピーの比を示す図である。ゲノムコピーはＱＰＣＲにより測定した。 ＢａｃＶＤ１８３でのｒＡＡＶ産生を示す図である。産生における下落は存在するバキュロウイルスの量の減少により引き起こされる。 Ｂａｃ．ＶＤ１８３の継代に関するＯＲＦ ＱＰＣＲを示す図である。 Ｂａｃ．ＶＤ１８３の数継代に対するウェスタンブロットＲｅｐ発現を示す図である。「８８」は、ＷＯ２００７／１４８９７１ではＲＥＰ−ＡＣＧ／ＰＳＣと呼ばれているＢａｃ．ＶＤ８８構築物を示しており、ここでは対照として使用されている。Ｒｅｐ発現の量はＢａｃ．ＶＤ１８３の濃度と関連している。 Ｒｅｐタンパク質用の３つの異なる構築物、すなわち、ＶＤ８８、ＶＤ１８３、及びＶＤ１８９を使用したｒＡＡＶ１産生からの未精製細胞バルク（ＣＬＢ）に関するＱ−ＰＣＲを示す図である。５：１：１は産生において使用される異なるバキュロウイルスの割合に言及しており、５はＢａｃ．ＶＤ８８、Ｂａｃ．ＶＤ１８３、又はＢａｃ．ＶＤ１８９に言及しており、最初の１はＢａｃ．ＶＤ８４（ＡＡＶ１カプシド遺伝子を含有する）に言及しており、第２の１はＩＴＲ構築物を含有するバキュロウイルス、Ｂａｃ．ＶＤ４３に言及している。 ３つの異なるｒＡＡＶ１産生からのＣＬＢが、ＡＡＶカプシドに特異的なラマカラムにおいて精製され、精製されたバッチでゲノムコピー及び全ｒＡＡＶ粒子が測定されたことを示す図である。Ｑ−ＰＣＲ数で全ｒＡＡＶ粒子を割ると、ここで言及されるトータル：フル比が得られる。５：１：１は産生において使用される異なるバキュロウイルスの比に言及しており、５はＢａｃ．ＶＤ８８、Ｂａｃ．ＶＤ１８３、又はＢａｃ．ＶＤ１８９に言及しており、最初の１はＢａｃ．ＶＤ８４（ＡＡＶ１カプシド遺伝子を含有する）に言及しており、第２の１はＩＴＲ構築物を含有するバキュロウイルス、Ｂａｃ．ＶＤ４３に言及している。 Ｒｅｐウェスタンブロットを示す図である。試料は、Ｂａｃ．ＶＤ８８又はＢａｃ．ＶＤ１８９バキュロウイルスの数継代で採取され、ウェスタンブロットが実施された。Ｒｅｐ７８量に対するＲｅｐ５２量は、Ｂａｃ．ＶＤ１８９では一貫して高い。 Ｒｅｐウェスタンブロットを示す図である。試料は、Ｂａｃ．ＶＤ１８３バキュロウイルス増幅の数継代で採取され、Ｒｅｐウェスタンブロットが実施された。Ｒｅｐ７８量に対するＲｅｐ５２量は、Ｂａｃ．ＶＤ１８３で、次にＢａｃ．ＶＤ１８９とＢａｃ．ＶＤ８８で、はるかに高い。

いくつかの態様では、本発明は、哺乳動物細胞における核酸の導入及び／又は発現用のベクターとして使用するための、動物パルボウイルス、特に感染性ヒト又はサルＡＡＶなどのディペンドウイルス及びその成分（たとえば、動物パルボウイルスゲノム）の使用に関する。特に、本発明は、昆虫細胞において産生される場合のそのようなパルボウイルスベクターの生産性の改良に関する。

バルボウイルス科のウイルスは小型ＤＮＡ動物ウイルスである。パルボウイルス科は２つの亜科、すなわち、脊椎動物に感染するパルボウイルス亜科と昆虫に感染するデンソウイルス亜科に分けることができる。パルボウイルス亜科のメンバーは、本明細書ではパルボウイルスと呼ばれ、ディペンドウイルス属を含む。その属という名称から推定されるように、ディペンドウイルスのメンバーは、細胞培養における増殖性感染のためには、アデノウイルス又はヘルペスウイルスなどのヘルパーウイルスとの同時感染を通常は必要とする点で他に類がない。ディペンドウイルス属には、通常ヒト（たとえば、血清型１、２、３Ａ、３Ｂ、４、５、及び６）又は霊長類（たとえば、血清型１及び４）に感染するＡＡＶ、並びに他の温血動物（たとえば、ウシ、イヌ、ウマ、及びヒツジアデノ随伴ウイルス）に感染する近縁ウイルスが含まれる。パルボウイルス及び他のパルボウイルス科のメンバーに関する追加の情報は、Ｋｅｎｎｅｔｈ Ｉ．Ｂｅｒｎｓ、「パルボウイルス科：ウイルス及びその複製（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ：Ｔｈｅ Ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）」、Ｃｈａｐｔｅｒ ６９ ｉｎ Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（第３版、１９９６）に記載されている。便宜上、本発明は、本明細書ではＡＡＶを参照することによりさらに例証され説明される。しかし、本発明はＡＡＶに限定されるものではなく、他のパルボウイルスにも等しく適用されると理解されている。

既知のＡＡＶ血清型すべてのゲノム機構は非常に類似している。ＡＡＶのゲノムは、長さが約５０００ヌクレオチド（ｎｔ）未満の直鎖状一本鎖ＤＮＡ分子である。逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）は、非構造複製（Ｒｅｐ）タンパク質と構造（ＶＰ）タンパク質の独特のコードヌクレオチド配列に隣接している。ＶＰタンパク質（ＶＰ１、−２及び−３）はカプシドを形成する。末端１４５ｎｔは自己相補的であり、Ｔ形ヘアピンを形成するエネルギー的に安定な分子内二本鎖が形成されるように組織化されている。これらのヘアピン構造体は、ウイルスＤＮＡ複製の開始点として機能し、細胞ＤＮＡポリメラーゼ複合体のためのプライマーとしての役割を果たす。哺乳動物細胞内でのｗｔＡＡＶ感染に続いて、Ｒｅｐ遺伝子（すなわち、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２）は、それぞれＰ５プロモーターとＰ１９プロモーターから発現され、Ｒｅｐタンパク質は両方ともウイルスゲノムの複製においてある役割を有している。Ｒｅｐ ＯＲＦでのスプライシング事象により、実際に４種のＲｅｐタンパク質（すなわち、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ４０）が発現される。しかし、哺乳動物細胞において、Ｒｅｐ７８とＲｅｐ５２タンパク質をコードするがスプライシングされていないｍＲＮＡは、ＡＡＶベクター産生には十分であることが明らかにされている。昆虫細胞においても、Ｒｅｐ７８とＲｅｐ５２タンパク質はＡＡＶベクター産生には十分である。

本明細書の「組換えパルボウイルス若しくはＡＡＶベクター」（又は「ｒＡＡＶベクター」）とは、パルボウイルス又はＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）が隣接している対象の１つ若しくは複数のポリヌクレオチド配列、対象の遺伝子又は「トランス遺伝子」を含むベクターのことである。そのようなｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子産物（すなわち、ＡＡＶ Ｒｅｐ及びＣａｐタンパク質）を発現している昆虫宿主細胞に存在する場合には、複製され、感染性ウイルス粒子にパッケージングすることができる。ｒＡＡＶベクターがもっと大きな核酸構築物（たとえば、染色体に又はクローニング若しくはトランスフェクションのために使用されるプラスミド若しくはバキュロウイルスなどの別のベクターに）組み込まれると、前記ｒＡＡＶベクターは、典型的には、ＡＡＶパッケージング機能及び必要なヘルパー機能の存在下で、複製及びキャプシド形成によって「救済」することができる「プロベクター」と呼ばれる。

第１の態様では、本発明は昆虫細胞に関する。前記昆虫細胞は、少なくとも、第１のアミノ酸配列をコードする第１のヌクレオチド配列及び第２のアミノ酸配列をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。好ましくは、第１と第２のアミノ酸配列は、それぞれ、第１と第２のアミノ酸配列間で少なくとも８０、８５、９０、９５、９８、９９又は１００％のアミノ酸同一性を有する少なくとも５０、８０、１００、２００、３００、３５０又は３９８アミノ酸の共通アミノ酸配列を含む。これとは対照的に、第１と第２のアミノ酸配列中の共通アミノ酸配列をコードする（それぞれ、第１と第２のヌクレオチド配列中に存在する）ヌクレオチド配列の同一性は、９５、９０、８９、８８．４、８５、８０、７５、７０、６５、６０又は５５％未満である。

通常、第１と第２のアミノ酸配列は、昆虫細胞には異種になるであろう。好ましくは、第１と第２のアミノ酸配列中の共通アミノ酸配列の少なくとも１つは天然に存在するアミノ酸配列である。さらに好ましくは、第１と第２のアミノ酸配列中の少なくとも１つは天然に存在するアミノ酸配列である。もっとも好ましくは、第１と第２のアミノ酸配列の両方が天然に存在するアミノ酸配列である。

好ましい実施形態では、第１のヌクレオチド配列中の共通アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、第２のヌクレオチド配列中の共通アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と比べると、昆虫細胞に対して改良されたコドン使用バイアスを有する。昆虫細胞に対するコドン使用バイアスに言及するときはいつでも、これには、特にオートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）感染細胞に対するコドン使用バイアスを含む、バキュロウイルス感染昆虫細胞に対するコドン使用バイアスが含まれると、本明細書では理解されている。共通アミノ酸配列をコードする第１のヌクレオチド配列のコドン使用は、好ましくは、昆虫宿主細胞のコドン使用に合わせて適合されている又は最適化されている。宿主細胞のコドン使用に合わせた共通アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の適合性は、コドン適合指数（ＣＡＩ）として表現してもよい。好ましくは、コドン使用は、第１と第２のヌクレオチド配列が存在する昆虫細胞に適合されている。通常、これはスポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）属の細胞、さらに好ましくは、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞になるであろう。したがって、コドン使用は、好ましくはスポドプテラ・フルギペルダに又はオートグラファ・カリフォルニカ核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）感染細胞に適合されている。コドン適合指数は、本明細書では、高度に発現された遺伝子のコドン使用に対する遺伝子のコドン使用の相対的適合性の測定値として定義されている。それぞれのコドンの相対的適合性（Ｗ）は、それぞれのコドンの使用の、同じアミノ酸に対するもっとも豊富なコドンの使用に対する比である。ＣＡＩ指数は、これらの相対的適合性値の相乗平均として定義されている。非同義コドン及び終止コドン（遺伝コードに依拠する）は除外されている。ＣＡＩ値は０から１まで変動し、高い値ほどもっとも豊富なコドンの割合が高いことを示している（ＳｈａｒｐとＬｉ、１９８７、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １５：１２８１〜１２９５参照；Ｋｉｍら、Ｇｅｎｅ．１９９７、１９９：２９３〜３０１；ｚｕｒ Ｍｅｇｅｄｅら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２０００，７４：２６２８〜２６３５も参照）。好ましい昆虫細胞では、第１と第２のヌクレオチド配列中の共通アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列間のＣＡＩの差は、少なくとも０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８である。好ましくは、さらに、第１のヌクレオチド配列中の共通アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列のＣＡＩは、少なくとも０．５、０．６、０．７、０．８、０．９又は１．０である。

第１のヌクレオチド配列中の共通アミノ酸配列をコードする好ましいヌクレオチド配列は、非共通コドン又は比較的共通ではないコドンの少なくとも５０、７５、９０、９５、９８又は９９％、好ましくはコドンのすべてが、表１において又は表２において概説する同一アミノ酸をコードする共通コドンで置き換えられているコード配列である。共通コドンは、表１に示す高度に発現されたスポドプテラ・フルギペルダ遺伝子において、又は表２に示される高度に発現された遺伝子オートグラファ・カリフォルニカＭＮＰＶ感染細胞において、特定のアミノ酸残基それぞれをコードするもっとも頻繁に使用されるコドンであると本明細書では理解されている。共通コドンと比較的共通ではないコドン以外のコドンはすべて「非共通コドン」である。非共通コドンには「２番目に高頻度のコドン」が含まれ、このコドンは、表１又は表２においてもっとも高頻度を除く頻度を有するコドンとして理解されている。好ましくは、第１のヌクレオチド配列中の共通アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、そのすべてが共通コドンである一続きの少なくとも２５、５０、１００、２００又は３００コドンを有する。コード配列は、ＷＯ２００４／０５９５５６に記載された方法により、及びＷＯ２００６／０１５７８９に記載されたコード配列のＣｐＧ含量を改変することにより、昆虫宿主細胞における発現が改良されるようにさらに適合させてもよい。そのような追加の適合は、第１のヌクレオチド配列中の共通アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列中のコドンのすべてが共通コドンというわけではないことの原因になる可能性があると理解されている。

昆虫細胞の好ましい実施形態では、第１のヌクレオチド配列中の共通アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列中のコドンのすべてが、表１又は２（のいずれか１つ）に従った共通コドンである。さらに好ましくは、そのような昆虫細胞では、第２のヌクレオチド配列中の共通アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列中のコドンのすべてが、表１又は２（のいずれか１つ）に従った２番目に高頻度のコドンであり、第１のヌクレオチド配列において共通コドンが表１に従っている場合には、第２のヌクレオチド配列中の２番目に高頻度のコドンも表１に従っている、又は、第１のヌクレオチド配列において共通コドンが表２に従っている場合には、第２のヌクレオチド配列中の２番目に高頻度のコドンも表２に従っていると理解されている。

コドン最適化は、コドン使用データベース（たとえば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／参照）に見られるスポドプテラ・フルギペルダ生物のコドン使用に基づいて実施してもよい。コドン最適化に適したコンピュータプログラムを当業者であれば利用することができる（たとえば、Ｊａｙａｒａｊら、２００５、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３３（９）：３０１１〜３０１６参照：及びインターネット上）。代わりに、最適化は、同一のコドン使用データベースを使用して手動で行うことができる。

本発明の昆虫細胞の一実施形態では、第２のヌクレオチド配列中の共通アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列中のコドンの少なくとも５０、６０、８０、９０又は１００％が、第１のヌクレオチド配列中の対応するコドンと比べて、第２のヌクレオチド配列のＡＴ又はＧＣ含量を最大化するように改変される。

したがって、本発明の好ましい実施形態では、ａ）共通アミノ酸配列をコードする第１のヌクレオチド配列のコドンバイアスを変化させる；ｂ）共通アミノ酸配列をコードする第２のヌクレオチド配列のコドンバイアスを変化させる；ｃ）共通アミノ酸配列をコードする第１のヌクレオチド配列のＧＣ含量を変化させる；及びｄ）共通アミノ酸配列をコードする第２のヌクレオチド配列のＧＣ含量を変化させることのうち１つ又は複数によって、共通アミノ酸配列をコードする第１と第２のヌクレオチド配列間のヌクレオチド配列の違いは最大化される（すなわち、ヌクレオチド同一性は最小化される）。

昆虫細胞の本発明の好ましい実施形態は、本発明の昆虫細胞におけるパルボウイルスタンパク質の産生に関する。特に、パルボウイルスタンパク質は、組換えパルボウイルスベクター、さらに好ましくは組換え動物パルボウイルスベクター、もっとも好ましくは組換えＡＡＶベクターを産生するという文脈において、昆虫細胞において産生される。したがって、本発明の昆虫細胞のこの好ましい実施形態では、第１のヌクレオチド配列はパルボウイルスＲｅｐ５２又は４０タンパク質のアミノ酸配列をコードしており、第２のヌクレオチド配列はパルボウイルスＲｅｐ７８又は６８タンパク質のアミノ酸配列をコードしている。しかし、第１のヌクレオチド配列がパルボウイルスＲｅｐ７８又は６８タンパク質のアミノ酸配列をコードしており、第２のヌクレオチド配列がパルボウイルスＲｅｐ５２又は４０タンパク質のアミノ酸配列をコードしている実施形態は本発明に明示的に含まれていると理解されている。便宜上、実施形態では、パルボウイルスＲｅｐ５２又は４０タンパク質をコードするヌクレオチド配列を第１ヌクレオチド配列として、パルボウイルスＲｅｐ７８又は６８タンパク質をコードするヌクレオチド配列を第２ヌクレオチド配列として使用するが、これらの実施形態の逆は本発明に明示的に含まれている。第１と第２のヌクレオチド配列にコードされている共通アミノ酸配列は、パルボウイルスＲｅｐ５２又は４０タンパク質の少なくとも２番目のアミノ酸からもっともＣ末端側のアミノ酸までのアミノ酸配列を含む又はそれからなる。好ましくは、共通アミノ酸配列はパルボウイルスＲｅｐ５２又は４０タンパク質の１番目のアミノ酸からもっともＣ末端側のアミノ酸までを含む又はそれからなる。パルボウイルス共通アミノ酸配列間のアミノ酸同一性は、共通アミノ酸配列に対して上に定義した通りである。好ましくは、昆虫細胞では、パルボウイルスＲｅｐタンパク質はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）Ｒｅｐタンパク質である。さらに好ましくは、第１と第２のヌクレオチド配列中にコードされるパルボウイルスＲｅｐタンパク質は同一血清型である。

パルボウイルスＲｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、Ｒｅｐ７８又はＲｅｐ６８及びＲｅｐ５２又はＲｅｐ４０タンパク質などの、昆虫細胞におけるパルボウイルスベクター産生に必要とされ十分である非構造Ｒｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列として本明細書では理解されている。動物パルボウイルスヌクレオチド配列は、好ましくは、ディペンドウイルス由来、さらに好ましくは、ヒト又はサルアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）由来、もっとも好ましくは、通常はヒト（たとえば、血清型１、２、３Ａ、３Ｂ、４、５、及び６）又は霊長類（たとえば、血清型１及び４）に感染するＡＡＶ由来である。動物パルボウイルスＲｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列の例は、配列番号７に与えられており、これはＲｅｐタンパク質をコードするＡＡＶ血清型２配列ゲノムの一部を描いている。Ｒｅｐ７８コード配列はヌクレオチド１１〜１８７６を含み、Ｒｅｐ５２コード配列はヌクレオチド６８３〜１８７６を含み、これも配列番号１及び５に別個に描かれている。Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２タンパク質の正確な分子量のほかに翻訳開始コドンの正確な位置も、異なるパルボウイルス間で異なることがあると理解されている。しかし、当業者であれば、ＡＡＶ−２以外のパルボウイルス由来のヌクレオチド配列中の対応する位置を同定する方法は分かっているであろう。

したがって、パルボウイルスＲｅｐ５２タンパク質をコードする（第１の）ヌクレオチド配列は、
ａ）配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも５０、６０、７０、８０、８８、８９、９０、９５、９７、９８、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする；
ｂ）配列番号１〜５及び１０のいずれか１つのヌクレオチド配列と少なくとも５０、６０、７０、８０、８１、８２、８５、９０、９５、９７、９８、又は９９％の配列同一性を有する；
ｃ）その相補鎖が、（ａ）又は（ｂ）の核酸分子配列にハイブリダイズする；
ｄ）その配列が、遺伝コードの縮重により（ｃ）の核酸分子の配列とは異なっている
ヌクレオチド配列として定義してもよい。

したがって、パルボウイルスＲｅｐ７８タンパク質をコードする（第２の）ヌクレオチド配列は、
ａ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも５０、６０、７０、８０、８８、８９、９０、９５、９７、９８、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする；
ｂ）配列番号７の１１〜１８７６位のヌクレオチド配列と少なくとも５０、６０、７０、８０、８１、８２、８５、９０、９５、９７、９８、又は９９％の配列同一性を有する；
ｃ）その相補鎖が、（ａ）又は（ｂ）の核酸分子配列にハイブリダイズする；
ｄ）その配列が、遺伝コードの縮重により（ｃ）の核酸分子の配列とは異なっている
ヌクレオチド配列として定義してもよい。好ましくは、前記ヌクレオチド配列は、昆虫細胞におけるパルボウイルスベクター産生に必要とされ十分である動物パルボウイルスＲｅｐタンパク質をコードしている。

昆虫細胞での適切な発現のための、たとえば、野生型パルボウイルス配列を含む、上に定義された第１と第２のコードヌクレオチド配列の種々の改変は、たとえば、ＳａｍｂｒｏｏｋとＲｕｓｓｅｌｌ（２００１）「分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （第３版）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載されているなどの公知の遺伝子工学技術を適用することにより実現される。コード領域の種々の追加の改変は、コード化タンパク質の収量を増大させることができる当業者には公知である。これらの改変は、本発明の範囲内である。

本発明の昆虫細胞では、第１と第２のヌクレオチド配列は、好ましくは、核酸構築物の一部である。昆虫細胞は、第１と第２のヌクレオチド配列のそれぞれに１つずつ、２つの別個の核酸構築物を含んでいてもよく、又は昆虫細胞は、第１と第２のヌクレオチド配列の両方を含む単一の核酸構築物を含んでいてもよい。

追加の態様では、本発明は、上で定義した共通アミノ酸配列を含む、それぞれ第１と第２のアミノ酸配列をコードする第１及び／又は第２のヌクレオチド配列を含む核酸構築物に関する。好ましくは、前記構築物中の第１及び／又は第２のヌクレオチド配列は、上で定義したパルボウイルスＲｅｐタンパク質をコードしている。好ましくは、前記構築物では、第１と第２のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、昆虫細胞での発現のための発現制御配列に作動可能に連結されている。これらの発現制御配列は、少なくとも、昆虫細胞において活性なプロモーターを含むことになる。昆虫宿主細胞における外来遺伝子の発現のための当業者に公知の技術を使用して、本発明を実行することができる。昆虫細胞でのポリペプチドの分子工学及び発現のための方法は、たとえば、ＳｕｍｍｅｒｓとＳｍｉｔｈ．１９８６．「バキュロウイルスベクター及び昆虫培養法のための方法のマニュアル（Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）」、Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌ．Ｎｏ．７５５５、Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｓｔａｔｉｏｎ、Ｔｅｘ．；Ｌｕｃｋｏｗ．１９９１．Ｐｒｏｋｏｐら、「バキュロウイルスベクター組換えＤＮＡ技術及び応用による昆虫細胞での異種遺伝子のクローニング及び発現（Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ Ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ’ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」、９７〜１５２；Ｋｉｎｇ，Ｌ．Ａ．とＲ．Ｄ．Ｐｏｓｓｅｅ、１９９２、「バキュロウイルス発現系（Ｔｈｅ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）」、ＣｈａｐｍａｎとＨａｌｌ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ；Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ，Ｄ．Ｒ．、Ｌ．Ｋ．Ｍｉｌｌｅｒ、Ｖ．Ａ．Ｌｕｃｋｏｗ、１９９２、「バキュロウイルス発現ベクター（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ）」：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｗ．Ｈ．ＦｒｅｅｍａｎとＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｃ．Ｄ．、１９９５、「バキュロウイルス発現プロトコル（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）」、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｌｕｍｅ３９；ＵＳ４，７４５，０５１；ＵＳ２００３１４８５０６；及びＷＯ０３／０７４７１４に記載されている。本発明の第１と第２のヌクレオチド配列の転写のための適切なプロモーターには、たとえば、ポリへドロン（ＰｏｌＨ）、ｐ１０、ｐ３５、ＩＥ−１又は△ＩＥ−１プロモーター及び上記の参考文献に記載された追加のプロモーターが挙げられる。哺乳動物細胞では、Ｒｅｐ５２と比べてＲｅｐ７８の比較的豊富でない発現は高ベクター収量に有利に働くことが知られているので（Ｌｉら、１９９７、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．７１：５２３６〜４３；Ｇｒｉｍｍら、１９９８、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９、２７４５〜２７６０）、好ましくは、Ｒｅｐ７８又は６８タンパク質の発現を推進するためには、Ｒｅｐ５２又は４０タンパク質の発現に使用されるプロモーターよりも弱いプロモーターが使用される。たとえば、Ｒｅｐ５２又は４０タンパク質の発現には比較的強いポリへドロンプロモーターを使用してもよく、Ｒｅｐ７８又は６８タンパク質の発現を推進するためにはＰｏｌＨプロモーターよりもはるかに弱いプロモーターである△ＩＥｌプロモーターを選んでもよい。好ましくは、それぞれＲｅｐ５２又は４０タンパク質及びＲｅｐ７８又は６８タンパク質用のプロモーターの選択は、昆虫細胞において、バキュロウイルス発現を使用して、好ましくは感染後約２０〜４０時間で、さらに好ましくは感染後約３０〜４０時間で、Ｒｅｐ７８／６８のＲｅｐ５２／４０に対するモル比を１：１０〜１０：１、１：５〜５：１、又は１：３〜３：１の範囲で、昆虫細胞内で産生するように行う。Ｒｅｐ７８とＲｅｐ５２のモル比は、好ましくはＲｅｐ７８／６８とＲｅｐ５２／４０両方の共通エピトープを認識するモノクローナル抗体を使用して、又は、たとえば、マウス抗Ｒｅｐ抗体（３０３．９、Ｐｒｏｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ；希釈１：５０）を使用して、ウェスタンブロッティングによって決定してもよい。

好ましくは、昆虫細胞における本発明の第１と第２のヌクレオチド配列の発現のための核酸構築物は、昆虫細胞適合性ベクターである。「昆虫細胞適合性ベクター」又は「ベクター」は、昆虫又は昆虫細胞の生産的形質転換又はトランスフェクションが可能な核酸分子であると理解されている。例となる生物学的ベクターには、プラスミド、直鎖状核酸分子及び組換えウイルスが挙げられる。どんなベクターも、それが昆虫細胞適合性である限り用いることができる。ベクターは昆虫細胞ゲノムに組み込まれてもよいが、ベクターはエピソーム性でもよい。昆虫細胞におけるベクターの存在は永久的である必要はなく、一時的エピソームベクターも含まれる。ベクターは、既知のどんな手段によっても、たとえば、細胞の化学的処理、エレクトロポレーション、又は感染によって導入することができる。好ましい実施形態では、ベクターは、バキュロウイルス、ウイルスベクター、又はプラスミドである。さらに好ましい実施形態では、ベクターはバキュロウイルス、すなわち、構築物はバキュロウイルスベクターである。バキュロウイルスベクター及びその使用方法は、昆虫細胞の分子工学に関する上に引用した参考文献に記載されている。

本発明の核酸構築物は、第１及び／又は第２のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の開始コドンの上流に、配列番号９の９ヌクレオチドの配列又は配列番号９に実質的に相同なヌクレオチド配列を含む発現制御配列をさらに含んでいてもよい。配列番号９のヌクレオチド配列に実質的に同一の、第１及び／又は第２のアミノ酸配列の発現を増加させるのに寄与することになる配列は、たとえば、配列番号９の９ヌクレオチドの配列に少なくとも６０％、７０％、８０％又は９０％の同一性を有する配列である。

昆虫細胞は、異種タンパク質の産生に適しているどんな細胞でもよい。好ましくは、昆虫細胞は、バキュロウイルスベクターの複製を可能にし、培養下で維持することができる。さらに好ましくは、昆虫細胞は、ｒＡＡＶベクターを含む組換えパルボウイルスベクターの複製も可能にする。たとえば、使用される細胞系は、スポドプテラ・フルギペルダ由来、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞系、又は蚊細胞系、たとえば、ヒトスジシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）由来細胞系でもよい。好ましい昆虫細胞又は細胞系は、たとえば、Ｓｅ３０１、ＳｅＩＺＤ２１０９、ＳｅＵＣＲ１、Ｓｆ９、Ｓｆ９００＋、Ｓｆ２１、ＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４、ＭＧ−１、Ｔｎ３６８、ＨｚＡｍｌ、Ｈａ２３０２、Ｈｚ２Ｅ５、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、ＣＡ、ＵＳＡ）及びｅｘｐｒｅｓＳＦ＋（登録商標）（ＵＳ６，１０３，５２６；Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐ．、ＣＴ、ＵＳＡ）を含む、バキュロウイルス感染に感受性の昆虫種由来の細胞である。

本発明に従った好ましい昆虫細胞は、組換えパルボウイルスベクターの産生用の昆虫細胞である。この昆虫細胞は、上記の「第１」と「第２」のヌクレオチド配列又は核酸構築物に加えて、第１と第２のヌクレオチド配列、
ａ）少なくとも１つのパルボウイルス逆方向末端反復（ＩＴＲ）ヌクレオチド配列を含む第３のヌクレオチド配列、及び
ｂ）昆虫細胞での発現のための発現制御配列に作動可能に連結されたパルボウイルスＣａｐタンパク質コード配列を含む第４のヌクレオチド配列
をさらに含む。

本発明の文脈では、「少なくとも１つのパルボウイルスＩＴＲヌクレオチド配列」は、「Ａ」、「Ｂ」、及び「Ｃ」領域とも呼ばれる大部分が相補的な対称的に配置された配列を含むパリンドローム配列を意味すると理解されている。ＩＴＲは、複製において「ｃｉｓ」の役割を有する部位、すなわち、たとえばパリンドロームとパリンドロームにとって内部の特定の配列を認識するＲｅｐ７８（又はＲｅｐ６８）などのトランス作動性複製タンパク質の認識部位である複製開始点として機能する。ＩＴＲ配列の対称性の１つの例外が、ＩＴＲの「Ｄ」領域である。「Ｄ」領域は独特である（１つのＩＴＲ内部に相補体をもたない）。一本鎖ＤＮＡのニッキングは、ＡとＤ領域間の接合部で起こる。そこは新しいＤＮＡ合成が開始する領域である。Ｄ領域は通常、パリンドロームの片側の方に位置し、核酸複製段階に方向性を与える。哺乳動物細胞で複製しているパルボウイルスは、典型的に２つのＩＴＲ配列を有する。しかし、結合部位がＡ領域の両方の鎖上にあり、Ｄ領域はパリンドロームのそれぞれの側に１つ、対称的に位置しているようにＩＴＲを工学的に操作することは可能である。二本鎖環状ＤＮＡ鋳型（たとえば、プラスミド）上で、次にＲｅｐ７８−又はＲｅｐ６８−補助核酸複製が両方向に進行し、単一ＩＴＲで環状ベクターのパルボウイルス複製のためには十分である。したがって、１つのＩＴＲヌクレオチド配列を本発明の文脈において使用することができる。しかし、好ましくは、２つの又は別の偶数の規則的なＩＴＲが使用される。もっとも好ましくは、２つのＩＴＲ配列が使用される。好ましいパルボウイルスＩＴＲはＡＡＶ ＩＴＲである。安全性の理由から、第２のＡＡＶの存在下での細胞への最初の導入後はさらに増殖することができない組換えパルボウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを構築するのが望ましい場合もある。レシピエントでの望ましくないベクター増殖を制限するためのそのような安全機構は、ＵＳ２００３１４８５０６に記載されたキメラＩＴＲと一緒にｒＡＡＶを使用することにより提供してもよい。

組換えパルボウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターの産生のために昆虫細胞内で用いられる核酸構築物の数は、本発明においては限定的なものではない。たとえば、本発明の方法に従えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又はそれよりも多い別個の構築物を用いて昆虫細胞内でｒＡＡＶを産生することができる。５つの構築物を用いる場合、１つの構築物がＡＡＶ ＶＰ１をコードし、もう１つの構築物がＡＶＶ ＶＰ２をコードし、さらにもう１つの構築物がＡＶＶ ＶＰ３をコードし、さらにもう１つの構築物が上で定義したＲｅｐタンパク質をコードし、最後の構築物が少なくとも１つのＡＡＶ ＩＴＲを含む。５未満の構築物を使用する場合、少なくとも１つのＡＡＶ ＩＴＲとＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３及びＲｅｐタンパク質コード配列の種々の組合せを含むことができる。

好ましくは、２つ、３つ又は４つの構築物が使用される。２つの構築物を使用する場合、好ましくは、昆虫細胞は、（Ａ）上で定義したＲｅｐタンパク質の発現のための第１の核酸構築物、この構築物は上の（ｂ）で定義された第４のヌクレオチド配列（昆虫細胞での発現のための少なくとも１つの発現制御配列に作動可能に連結されたパルボウイルスＣａｐタンパク質コード配列を含む；下も参照）をさらに含む、及び（Ｂ）上の（ａ）で定義された第３のヌクレオチド配列（少なくとも１つのパルボウイルス／ＡＡＶ ＩＴＲヌクレオチド配列を含む）を含む第３の核酸構築物を含む。３つの構築物が使用される場合、好ましくは、カプシドタンパク質の発現のためとＲｅｐタンパク質の発現のためとで別個の構築物が使用されること以外、２つの構築物で使用したのと同じ配置が使用される。４つの構築物が使用される場合、好ましくは、Ｒｅｐ７８／６８タンパク質の発現のためとＲｅｐ５２／４０タンパク質の発現のためとで別個の構築物が使用されること以外、３つの構築物で使用したのと同じ配置が使用される。それぞれの構築物上の配列は、互いに対していかなる順序でもよい。たとえば、１つの構築物が、ＩＴＲ及びＶＰカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＯＲＦを含む場合、ＶＰ ＯＲＦは、ＩＴＲ配列間のＤＮＡが複製されると、ＶＰ ＯＲＦが複製される又は複製されないように構築物上に位置することができる。別の例では、Ｒｅｐコード配列及び／又はＶＰカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＯＲＦは、構築物上でいかなる順序でもよい。第３、第４及び追加の核酸構築物（単数又は複数）も、好ましくは昆虫細胞適合性ベクターであり、好ましくは上で定義したバキュロウイルスベクターであると理解されている。代わりに、本発明の昆虫細胞においては、第１のヌクレオチド配列、第３のヌクレオチド配列、第４のヌクレオチド配列、及び第５のヌクレオチド配列並びに随意に追加のヌクレオチド配列のうち１つ又は複数が昆虫細胞のゲノムに安定的に組み込まれていてもよい。当業者であれば、ヌクレオチド配列を昆虫ゲノムに安定的に導入する方法、及びゲノムにそのようなヌクレオチド配列を有する細胞を同定する方法を承知している。ゲノムへの組込みは、たとえば、昆虫ゲノムの領域に高度に相同なヌクレオチド配列を含むベクターの使用により、支援してもよい。トランスポゾンなどの特定の配列の使用は、ヌクレオチド配列をゲノムに導入するもう１つの方法である。

本発明では、パルボウイルスカプシド（Ｃａｐ）タンパク質コード配列を含む第４のヌクレオチド配列は、本明細書では、３種のパルボウイルスカプシドタンパク質、ＶＰ１、−２及び−３のそれぞれをコードする配列を含むと理解されている。カプシドタンパク質コード配列を含む第４のヌクレオチド配列は、種々の形で存在していてもよい。たとえば、カプシドタンパク質ＶＰ１、−２及び−３のそれぞれに対する別個のコード配列であって、それぞれのコード配列が昆虫細胞での発現のための発現制御配列に作動可能に連結されているコード配列を使用してもよい。しかし、さらに好ましくは、第４のヌクレオチド配列は、動物パルボウイルス（ＡＡＶ）ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３カプシドタンパク質の３つすべてをコードする単一オープンリーディングフレームであって、ＶＰ１カプシドタンパク質の翻訳のための開始コドンが、たとえば、Ｕｒａｂｅら（２００２、上記を参照）により及びＷＯ２００７／０４６７０３に記載されたＡＴＧではない次の開始コドンである単一オープンリーディングフレームを含む。ＶＰ１カプシドタンパク質の次の開始コドンは、ＡＣＧ、ＴＴＧ、ＣＴＧ及びＧＴＧから選んでもよく、そのうちＣＴＧ及びＧＴＧがもっとも好ましい。カプシドタンパク質の発現のための第４のヌクレオチド配列は、ＷＯ２００７／０４６７０３に記載された少なくとも１つ又は複数の改変をさらに含んでいてもよい。

ＶＰ及びビリオンの収量を増大させる、又は改変されたトロピズムなどの他の望ましい効果を有する、又はビリオンの抗原性を減少させることができるＶＰコード領域の種々の追加の改変は、当業者には公知である。これらの改変は本発明の範囲内である。好ましくは、パルボウイルスカプシドタンパク質をコードする本発明のヌクレオチド配列は、少なくとも昆虫細胞で活性なプロモーターを含む、昆虫細胞での発現のための発現制御配列に作動可能に連結されている。そのような制御配列並びに昆虫細胞においてパルボウイルスカプシドタンパク質を発現するための追加の技術及び材料（たとえば、ベクター）は、すでにＲｅｐタンパク質に対して上で記載している。

本発明の好ましい実施形態では、本発明の昆虫細胞に存在する第３のヌクレオチド配列、すなわち、少なくとも１つのパルボウイルス（ＡＡＶ）ＩＴＲを含む配列は、対象の遺伝子産物をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列であって、好ましくは、対象の遺伝子産物をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列が昆虫細胞で産生される組換えパルボウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターのゲノムに組み込まれるヌクレオチド配列をさらに含む。好ましくは、対象の遺伝子産物をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列は、哺乳動物細胞での発現のための配列である。好ましくは、第３のヌクレオチド配列は、２つのパルボウイルス（ＡＡＶ）ＩＴＲヌクレオチド配列であって、対象の遺伝子産物をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列が、前記２つの配列の間に位置している２つのパルボウイルス（ＡＡＶ）ＩＴＲヌクレオチド配列を含む。好ましくは、（哺乳動物細胞での発現のための）対象の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、その配列が２つの規則的なＩＴＲの間に位置しているならば、又は２つのＤ領域で工学的に操作されたＩＴＲのどちらかの側に位置しているならば、昆虫細胞において産生される組換えパルボウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターに組み込まれることになる。

したがって、本明細書で上に定義する第３のヌクレオチド配列は、哺乳動物細胞での発現のための少なくとも１つの「対象の遺伝子産物」をコードし、昆虫細胞において複製された組換えパルボウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターに組み込まれるように位置するヌクレオチド配列を含んでいてもよい。本発明に従って産生された組換えパルボウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターでトランスフェクトされた哺乳動物細胞における後の発現のために、いかなるヌクレオチド配列も組み込むことができる。ヌクレオチド配列は、たとえば、タンパク質をコードしていてもよく、ＲＮＡｉ剤、すなわち、たとえば、ｓｈＲＮＡ（低分子ヘアピン型ＲＮＡ）又はｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）などのＲＮＡ干渉が可能であるＲＮＡ分子を発現してもよい。「ｓｉＲＮＡ」は、哺乳動物細胞において毒性のない短い二本鎖ＲＮＡである低分子干渉ＲＮＡを意味する（Ｅｌｂａｓｈｉｒら、２００１、Ｎａｔｕｒｅ ４１１：４９４〜９８；Ｃａｐｌｅｎら、２００１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９８：９７４２〜４７）。好ましい実施形態では、第３のヌクレオチド配列は、２つのヌクレオチド配列を含んでいてもよく、それぞれの配列が哺乳動物細胞での発現のための１つの対象の遺伝子産物をコードしている。対象の産物をコードする２つのヌクレオチド配列はそれぞれが、昆虫細胞において複製された組換えパルボウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターに組み込まれるように位置している。

哺乳動物細胞での発現のための対象の産物は、治療的遺伝子産物でもよい。治療的遺伝子産物は、ポリペプチド、又はＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡ）、又は、標的細胞で発現されると、たとえば、望ましくない活性の消失、たとえば感染細胞の消失、若しくは、たとえば、酵素活性の欠損を引き起こす遺伝子欠損の補完などの望ましい治療効果を提供する他の遺伝子産物でもよい。治療的ポリペプチド遺伝子産物の例には、ＣＦＴＲ、第ＩＸ因子、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ、好ましくはＬＰＬ Ｓ４４７Ｘ；ＷＯ０１／００２２０参照）、アポリポタンパク質Ａ１、ウリジン二リン酸グルクロノシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）、網膜色素変性症ＧＴＰアーゼレギュレーター相互作用タンパク質（ＲＰ−ＧＲＩＰ）、及びサイトカイン、又は、たとえば、ＩＬ−１０のようなインターロイキン、ポルフォビリノーゲン脱アミノ酵素（ＰＢＧＤ）、及びアラニン：グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼが挙げられる。

その代わりに、又はそれに加えて、第３の遺伝子産物として、本明細書で上に定義した第３のヌクレオチド配列は、細胞形質転換及び発現を評価するためのマーカータンパク質として役立つポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでいてもよい。この目的に適したマーカータンパク質は、たとえば、蛍光タンパク質ＧＦＰ、及び選択可能マーカー遺伝子ＨＳＶチミジンキナーゼ（ＨＡＴ培地上での選択のため）、細菌ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ハイグロマイシンＢ上での選択のため）、Ｔｎ５アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（Ｇ４１８上での選択のため）、並びにジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）（メトトレキサート上での選択のため）、ＣＤ２０、低親和性神経成長因子遺伝子である。これらのマーカー遺伝子を得るための供給源及びその使用法は、ＳａｍｂｒｏｏｋとＲｕｓｓｅｌ（２００１）「分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ（第３版）」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに提供されている。さらに、本明細書の上で定義した第３のヌクレオチド配列は、必要だと見なされる場合には、本発明の組換えパルボウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターで形質導入された細胞から被験者を治療させるフェイルセーフ機構として役立つ可能性のあるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでいてもよい。そのようなヌクレオチド配列は、多くの場合自殺遺伝子と呼ばれているが、プロドラッグをタンパク質が発現されているトランスジェニック細胞を死滅させることができる毒性物質に変換することが可能なタンパク質をコードしている。そのような自殺遺伝子の適切な例には、たとえば、大腸菌シトシンデアミナーゼ遺伝子又は単純ヘルペスウイルス（Ｈｅｒｐｅｓ Ｓｉｍｐｌｅｘ Ｖｉｒｕｓ）、サイトメガロウイルス（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）及び水痘帯状疱疹ウイルス（Ｖａｒｉｃｅｌｌａ−Ｚｏｓｔｅｒ ｖｉｒｕｓ）由来のチミジンキナーゼ遺伝子のうちの１つが挙げられ、この場合ガンシクロビルを被験者におけるトランスジェニック細胞を死滅させるためのプロドラッグとして使用してもよい（たとえば、Ｃｌａｉｒら、１９８７、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３１：８４４〜８４９を参照）。

別の実施形態では、対象の遺伝子産物の１つは、ＡＡＶタンパク質でよい。特に、Ｒｅｐ７８若しくはＲｅｐ６８などのＲｅｐタンパク質、又はその機能的フラグメントである。Ｒｅｐ７８及び／又はＲｅｐ６８をコードするヌクレオチド配列は、本発明の組換えパルボウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターのゲノム上に存在し、前記ベクターで形質導入された哺乳動物細胞で発現されている場合には、組換えパルボウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターの形質導入された哺乳動物細胞のゲノムへの組込みを可能にする。ｒＡＡＶ形質導入又は感染哺乳動物細胞においてＲｅｐ７８及び／又はＲｅｐ６８が発現されたら、ベクターにより細胞に導入される対象の他の任意の遺伝子産物の長期の又は永久的発現を可能にすることにより、組換えパルボウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターのある種の使用に利点を与えることができる。

本発明の組換えパルボウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターでは、哺乳動物細胞での発現のための対象の遺伝子産物をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列（単数又は複数）は、好ましくは、少なくとも１つの哺乳動物細胞適合性発現制御配列、たとえば、プロモーターに作動可能に連結されている。多くのそのようなプロモーターは当技術分野では公知である（ＳａｍｂｒｏｏｋとＲｕｓｓｅｌ、２００１、上記を参照）。ＣＭＶプロモーターなどの、多くの細胞型で広く発現される構成的プロモーターを使用してもよい。しかし、誘導性、組織特異的、細胞型特異的、又は細胞周期特異的なプロモーターのほうが好ましいであろう。たとえば、肝臓特異的な発現では、プロモーターは、α１抗トリプシン（ＡＡＴ）プロモーター、甲状腺ホルモン結合グロブリンプロモーター、アルブミンプロモーター、ＬＰＳ（チロキシン結合グロブリン）プロモーター、ＨＣＲ−ＡｐｏＣＩＩハイブリッドプロモーター、ＨＣＲ−ｈＡＡＴハイブリッドプロモーター、マウスアルブミン遺伝子エンハンサー（Ｅａｌｂ）エレメントと組み合わされたＡＡＴプロモーター及びアポリポタンパク質Ｅプロモーターから選択してもよい。他の例には、腫瘍選択的、及び、特に神経学的細胞腫瘍選択的発現のためのＥ２Ｆプロモーター（Ｐａｒｒら、１９９７、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．３：１１４５〜９）、又は単核血液細胞における使用のためのＩＬ−２プロモーター（Ｈａｇｅｎｂａｕｇｈら、１９９７、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ；１８５：２１０１〜１０）が挙げられる。

ＡＡＶはいくつかの哺乳動物細胞に感染することができる。たとえば、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、（１９８５、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．５：３２５１〜３２６０）及びＧｒｉｍｍら、（１９９９、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１０：２４４５〜２４５０）を参照されたい。しかし、ヒト滑膜線維芽細胞のＡＡＶ形質導入は、類似のマウス細胞におけるよりも有意に効率的であり、Ｊｅｎｎｉｎｇｓら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｅｓ，３：１（２００１）、及びＡＡＶの細胞トロピシティーは血清型間で異なる。たとえば、哺乳動物ＣＮＳ細胞トロピズム及び形質導入効率に関してＡＡＶ２、ＡＡＶ４及びＡＡＶ５間の違いを議論しているＤａｖｉｄｓｏｎら、（２０００、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９７：３４２８〜３４３２）を参照されたい。

昆虫細胞における組換えＡＡＶベクターの産生のために本発明において使用することができるＡＡＶ配列は、どんなＡＡＶ血清型のゲノムからも引き出すことができる。一般に、ＡＡＶ血清型は、アミノ酸及び核酸レベルに著しい相同性のあるゲノム配列を有し、同一セットの遺伝機能を提供し、基本的に物理的及び機能的に等価なビリオンを産生し、実質的に同一の機構によって複製し構築される。種々のＡＡＶ血清型のゲノム配列及びゲノム類似性の概要は、たとえば、ジェンバンク受託番号Ｕ８９７９０；ジェンバンク受託番号Ｊ０１９０１；ジェンバンク受託番号ＡＦ０４３３０３；ジェンバンク受託番号ＡＦ０８５７１６；Ｃｈｌｏｒｉｎｉら（１９９７、Ｊ．Ｖｉｒ．７１：６８２３〜３３）；Ｓｒｉｖａｓｔａｖａら（１９８３、Ｊ．Ｖｉｒ．４５：５５５〜６４）；Ｃｈｌｏｒｉｎｉら（１９９９、Ｊ．Ｖｉｒ．７３：１３０９〜１３１９）；Ｒｕｔｌｅｄｇｅら（１９９８、Ｊ．Ｖｉｒ．７２：３０９〜３１９）；及びＷｕら（２０００、Ｊ．Ｖｉｒ．７４：８６３５〜４７）を参照されたい。ＡＡＶ血清型１、２、３、４及び５は、本発明の文脈において使用するためのＡＡＶヌクレオチド配列の好ましい供給源である。好ましくは、本発明の文脈において使用するためのＡＡＶ ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、及び／又はＡＡＶ４から引き出される。同様に、Ｒｅｐ（Ｒｅｐ７８／６８及びＲｅｐ５２／４０）コード配列は、好ましくはＡＡＶ１、ＡＡＶ２、及び／又はＡＡＶ４から引き出される。しかし、本発明の文脈において使用するためのＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３カプシドタンパク質をコードする配列は、既知の４２の血清型のいずれからでも、さらに好ましくは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８若しくはＡＡＶ９、又は、たとえばカプシドシャッフリング技術及びＡＡＶカプシドライブラリーにより得られる新たに開発されたＡＡＶ様粒子から取ってもよい。

ＡＡＶ Ｒｅｐ及びＩＴＲ配列は、大部分の血清型間で特に保存されている。種々のＡＡＶ血清型のＲｅｐ７８タンパク質は、たとえば、８９％を超える同一性であり、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、及びＡＡＶ６間のゲノムレベルでの全ヌクレオチド配列同一性は約８２％である（Ｂａｎｔｅｌ−Ｓｃｈａａｌら、１９９９、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ、７３（２）：９３９〜９４７）。さらに、多くのＡＡＶ血清型のＲｅｐ配列及びＩＴＲは、哺乳動物細胞におけるＡＡＶ粒子の産生において他の血清型から対応する配列を効率よく交差補完する（すなわち、機能的に代わりをする）ことが知られている。ＵＳ２００３１４８５０６では、ＡＡＶ Ｒｅｐ及びＩＴＲ配列は昆虫細胞においても他のＡＡＶ Ｒｅｐ及びＩＴＲ配列を効率よく交差補完することが報告されている。

ＡＡＶ ＶＰタンパク質は、ＡＡＶビリオンの細胞トロピシティーを決定することが知られている。ＶＰタンパク質コード配列は、異なるＡＡＶ血清型間でＲｅｐタンパク質及び遺伝子ほど有意に保存されていない。Ｒｅｐ及びＩＴＲ配列が他の血清型の対応する配列を交差補完する能力のおかげで、血清型（たとえば、ＡＡＶ３）のカプシドタンパク質並びに別のＡＡＶ血清型（たとえば、ＡＡＶ２）のＲｅｐ及び／又はＩＴＲ配列を含む偽型ｒＡＡＶ粒子の産生が可能になる。そのような偽型ｒＡＡＶ粒子は本発明の一部である。

改変された「ＡＡＶ」配列は、本発明の文脈において、たとえば、昆虫細胞におけるｒＡＡＶベクターの産生に使用することもできる。そのような改変された配列は、たとえば、野生型ＡＡＶ ＩＴＲ、Ｒｅｐ、又はＶＰ配列に代わって使用することができるＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８若しくはＡＡＶ９ＩＴＲ、Ｒｅｐ又はＶＰに対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％若しくはそれより多いヌクレオチド及び／又はアミノ酸配列同一性を有する配列（たとえば、約７５〜９９％のヌクレオチド配列同一性を有する配列）を含む。

ＡＡＶ５は、多くの点で他のＡＡＶ血清型に類似しているが、他の既知のヒト及びサル血清型以上に他のヒト及びサルＡＡＶ血清型とは異なっている。それを考慮すると、ｒＡＡＶ５の産生は、昆虫細胞における他の血清型の産生とは異なる可能性がある。ｒＡＡＶ５を産生するのに本発明の方法が用いられる場合、１つ又は複数の構築物は、まとめると２つ以上の構築物の場合に、ＡＡＶ５ ＩＴＲを含むヌクレオチド配列、ＡＡＶ Ｒｅｐコード配列を含むヌクレオチド配列（すなわち、ＡＡＶ Ｒｅｐ７８を含むヌクレオチド配列）を含むことが好ましい。そのようなＩＴＲ及びＲｅｐ配列は、昆虫細胞におけるｒＡＡＶ５又は偽型ｒＡＡＶ５ベクターの効率的産生を得るように要望通りに改変することができる。たとえば、Ｒｅｐ配列の開始コドンを改変することができる、ＶＰスプライシング部位は改変する若しくは除去することができる、並びに／又はＶＰ１開始コドン及び近傍のヌクレオチドは昆虫細胞におけるｒＡＡＶ５ベクターの産生を改良するよう改変することができる。

別の態様では、本発明は、昆虫細胞における組換えパルボウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオン（上で定義した組換えパルボウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを含む）を産生するための方法に関する。好ましくは、前記方法は、（ａ）本明細書において上で定義した昆虫細胞を、組換えパルボウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターが産生されるような条件下で培養する段階と、（ｂ）その組換えパルボウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターの回収を含む。前記方法で産生される組換えパルボウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターは、好ましくは、組換えパルボウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター核酸を含む感染性パルボウイルス又はＡＡＶビリオンであると、本明細書では理解されている。培養中の昆虫細胞の増殖条件、及び培養中の昆虫細胞における異種産物の産生は、当技術分野では公知であり、たとえば、昆虫細胞の分子工学に関する上に引用する参考文献に記載されている（ＷＯ２００７／０４６７０３も参照）。

好ましくは、前記方法は、抗ＡＡＶ抗体、好ましくは固定化抗体を使用した組換えパルボウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター（を含むビリオン）のアフィニティー精製の段階をさらに含む。抗ＡＡＶ抗体は、好ましくは、モノクローナル抗体である。特に適切な抗体は、たとえば、ラクダ又はラマから得られる一本鎖ラクダ科動物抗体又はそのフラグメントである（たとえば、Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ、２００１、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７４：２７７〜３０２参照）。ｒＡＡＶのアフィニティー精製のための抗体は、好ましくは、ＡＡＶカプシドタンパク質上のエピトープであって、好ましくは、前記エピトープが２つ以上のＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質上に存在するエピトープに特異的に結合する抗体である。たとえば、前記抗体はＡＡＶ２カプシドに特異的に結合することに基づいて産生してもよいし選択してもよいが、同時に、前記抗体はＡＡＶ１、ＡＡＶ３及びＡＡＶ５カプシドにも特異的に結合してもよい。

さらに別の態様では、本発明は、本明細書において上で定義した第１の及び第２のヌクレオチド配列を含む核酸構築物に関する。

異なる態様では、本発明は、昆虫細胞において（上で定義した組換えパルボウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを含む）組換えパルボウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンを産生するための方法に関する。好ましくは、前記方法は、（ａ）組換えパルボウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターが産生されるような条件下で、本明細書において上で定義した昆虫細胞を培養する段階であって、昆虫細胞が、パルボウイルスＲｅｐ７８／６８及びＲｅｐ５２／４０タンパク質の発現のための（たとえば、本明細書において上で定義した第１と第２のヌクレオチド配列を含む核酸構築物などの）少なくとも１つの核酸構築物を含み、本明細書において上で定義した第３と第４のヌクレオチド配列をさらに含み、パルボウイルスＲｅｐ７８／６８及びＲｅｐ５２／４０タンパク質の発現のための前記核酸構築物（単数又は複数）が、昆虫細胞においてモル基準でＲｅｐ７８／６８発現レベルよりも高いＲｅｐ５２／４０発現レベルを生じさせる段階と、（ｂ）前記組換えパルボウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターの回収とを含む。好ましくは、前記方法では、昆虫細胞でのＲｅｐ５２／４０のＲｅｐ７８／６８タンパク質に対するモル比が１０：１、好ましくは少なくとも１１：１、１５：１、２０：１、３０：１、４０：１、５０：１又は６０：１よりも高い。昆虫細胞でのＲｅｐ５２／４０のＲｅｐ７８／６８タンパク質に対するモル比が１０：１よりも高ければ、フルビリオン（すなわち、ｒＡＡＶゲノムを含む）の空ビリオンに対する割合が有利によくなる（たとえば、図８参照）。しかし、Ｒｅｐ５２／４０のＲｅｐ７８／６８タンパク質に対するモル比が高すぎれば、遺伝子コピーの数により決定される産生されるｒＡＡＶの力価が低くなる可能性がある。したがって、一実施形態では、Ｒｅｐ５２／４０のＲｅｐ７８／６８タンパク質に対するモル比は、１００：１、８０：１、７０：１、６０：１、５０：１、４０：１、３０：１又は２０：１未満である。Ｒｅｐ７８／６８とＲｅｐ５２／４０タンパク質のモル比は、好ましくはＲｅｐ７８／６８とＲｅｐ５２／４０の両方の共通エピトープを認識するモノクローナル抗体を使用して、又はＷＯ２００７／１４８９７１に記載の抗体を使用して、ＷＯ２００７／１４８９７１に記載のウェスタンブロッティングにより決定してもよい。好ましくは、上記のＲｅｐ５２／４０とＲｅｐ７８／６８タンパク質の最小モル比は、バキュロウイルス又は類似の発現系を使用して、感染後約２０〜４０時間で、さらに好ましくは感染後約３０〜４０時間で実現される。

Ｒｅｐ７８／６８タンパク質の発現レベルと比べてＲｅｐ５２／４０タンパク質の相対的発現レベルを増加させるための種々の方法が存在する。Ｒｅｐ７８／６８とＲｅｐ５２／４０タンパク質の両方の発現のための単一転写単位が使用される場合には、１０：１よりも高い昆虫細胞におけるＲｅｐ５２／４０のＲｅｐ７８／６８タンパク質に対するモル比を得るために、Ｒｅｐ７８／６８及びＲｅｐ５２／４０タンパク質のコード配列を以下のように適合させてもよい。
ａ）ＷＯ２００７／１４８９７１に記載の通りに、Ｒｅｐ７８／６８タンパク質の翻訳開始コドンを次の開始コドン及び／又はその次のコンテキストに変えてもよい；
ｂ）好ましくは、ヌクレオチド配列における変化をイソコーディングすることにより、それぞれＲｅｐ７８／６８とＲｅｐ５２／４０遺伝子の翻訳開始点間に存在する１つ又は複数又はすべて（９）のＡＴＧ配列の除去。これは、たとえば、実施例３に及び配列番号１１に記載のｐＶＤ１８９Ｒｅｐコード配列において実現される；
ｃ）（Ｃｈａｎｇら、１９９９、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ２５９：３６９〜３８３に記載されている）鱗翅目細胞における有効な翻訳開始に最適な開始コンテキストの５’−ＮＮＮＮＮＮＡＵＧＡａ／ｃ／ｇＮ−３’に従ったＲｅｐ５２／４０タンパク質の翻訳開始コドンのコンテキストの最適化；
ｄ）Ｒｅｐ５２／４０タンパク質の開始コドンの上流に、配列番号９の９ヌクレオチドの配列、又は配列番号９に実質的に相同なヌクレオチド配列を含む発現制御配列を組み込む；
ｅ）（上に記載する）昆虫細胞における発現のためにＲｅｐ５２／４０タンパク質をコードするコード配列の一部のコドン使用バイアスを改良する；
ｆ）Ｒｅｐ７８／６８とＲｅｐ５２／４０タンパク質の翻訳開始点間のコード配列の一部のコドン使用バイアスを、それが（上に記載する）昆虫細胞における発現により適合されないように変化させる。ａ）からｆ）の組合せは本発明に含まれ、好ましくは、ａ）はｂ）からｆ）までの少なくとも１つと組み合わされる。

その代わりに、及び／又はそれに加えて、第２の転写単位をＲｅｐ５２／４０タンパク質の発現のために使用してもよい。この第２の転写単位からのＲｅｐ５２／４０タンパク質の発現は、
ａ）Ｒｅｐ７８／６８単位のプロモーターと比べてより強力なＲｅｐ５２／４０転写単位のプロモーターを使用すること（下記を参照）；
ｂ）Ｒｅｐ７８／６８単位のコピー数に比べて、Ｒｅｐ５２／４０転写単位のコピー数を増大させること；
ｃ）昆虫細胞での発現のためのＲｅｐ５２／４０タンパク質をコードするコード配列（上に記載されている、たとえば、配列番号２又は１０）のコドン使用バイアスを改良すること；
ｄ）（Ｃｈａｎｇらに記載されている、上記を参照）鱗翅目細胞における有効な翻訳開始に最適な開始コンテキストの５’−ＮＮＮＮＮＮＡＵＧＡａ／ｃ／ｇＮ−３’に従ったＲｅｐ５２／４０タンパク質の翻訳開始コドンのコンテキストの最適化；並びに
ｅ）Ｒｅｐ５２／４０タンパク質の開始コドンの上流に、配列番号９の９ヌクレオチドの配列、又は配列番号９に実質的に相同なヌクレオチド配列を含む発現制御配列を組み込むこと
のうち１つ又は複数によって増大させることができる。

Ｒｅｐ７８／６８とＲｅｐ５２／４０タンパク質のために２つの別個の転写単位が使用される構築物の例は、本明細書の実施例２及び３に記載されるｐＶＤ１８３構築物である。組換えパルボウイルスビリオンを産生するための方法において使用するための、（モル基準でＲｅｐ７８／６８発現レベルよりも高い昆虫細胞におけるＲｅｐ５２／４０発現レベルを生じさせる）核酸構築物は、本発明の追加の態様である。

前記方法で産生される組換えパルボウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターは、好ましくは、組換えパルボウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター核酸を含む感染性パルボウイルス又はＡＡＶビリオンであると、本明細書では理解されている。培養中の昆虫細胞の増殖条件、及び培養中の昆虫細胞における異種産物の産生は、当技術分野では公知であり、たとえば、昆虫細胞の分子工学に関して上で引用した参考文献に記載されている（ＷＯ２００７／０４６７０３も参照）。好ましくは、前記方法は、上記の抗ＡＡＶ抗体を使用した組換えパルボウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター（を含むビリオン）のアフィニティー精製の段階をさらに含む。

本発明において使用するための第２のプロモーターと等しい強さの又はそれよりも強い第１のプロモーターは、次の通りに定義される。プロモーターの強さは、本発明の方法において使用される条件下で得られる発現により決定してもよい。好ましい実施形態では、第１のプロモーター又は第２のプロモーターは、ＰｏｌＨプロモーター、ｐ１０プロモーター、塩基性タンパク質プロモーター、誘導性プロモーター、又はデルタＥ１プロモーター若しくはＥ１プロモーター、又は他の任意の後期若しくは最晩期バキュロウイルス遺伝子プロモーターからなる群から選択される。さらに好ましくは、第１のプロモーターは、ＰｏｌＨプロモーター、ｐ１０プロモーター又は塩基性タンパク質プロモーターからなる群から選択され、その場合、第２のプロモーターは、デルタＥ１プロモーター若しくはＥ１プロモーター、又は他の任意の初期若しくは後期バキュロウイルス遺伝子プロモーターである。好ましくは、本発明の核酸構築物の第１のプロモーターはｐ１０プロモーターであり、第２のプロモーターはＰｏｌＨプロモーター又は４ｘＨｓｐ２７ＥｃＲＥ＋最小Ｈｓｐ７０プロモーターである。別の実施形態では、本発明の核酸構築物の第１のプロモーターは４ｘＨｓｐ２７ＥｃＲＥ＋最小Ｈｓｐ７０プロモーターであり、第２のプロモーターはＰｏｌＨプロモーターである。さらに別の実施形態では、本発明の核酸構築物の第１のプロモーターはＰｏｌＨプロモーターであり、第２のプロモーターはｐ１０、デルタＥ１又はＥ１プロモーターである。さらに別の実施形態では、本発明の核酸構築物の第１のプロモーターはＰｏｌＨプロモーターであり、第２のプロモーターはデルタＥ１又はＥ１プロモーターである。さらに別の実施形態では、本発明の核酸構築物の第１のプロモーターはｐ１０プロモーターであり、第２のプロモーターはデルタＥ１又はＥ１プロモーターである。さらに別の実施形態では、本発明の核酸構築物の第１のプロモーターはＰｏｌＨプロモーターであり、第２のプロモーターはＰｏｌＨプロモーターである。もっとも好ましくは、本発明の核酸構築物の第１のプロモーターはＰｏｌＨプロモーターであり、第２のプロモーターはデルタＥ１プロモーターである。

「エンハンサーエレメント」又は「エンハンサー」は、プロモーターの活性を増強し（すなわち、プロモーターの下流の配列の転写速度を増加させる）、プロモーターとは対照的にプロモーター活性をもたず、通常はプロモーターに対するその位置とは無関係に（すなわち、プロモーターの上流でも下流でも）機能することができる配列を定義することを意図されている。エンハンサーエレメントは当技術分野では公知である。本発明において使用できると考えられるエンハンサーエレメント（又はその部分）の非限定的例には、バキュロウイルスエンハンサー及び昆虫細胞に存在するエンハンサーエレメントが挙げられる。エンハンサーエレメントは細胞内で、プロモーターが作動可能に連結されている遺伝子のｍＲＮＡ発現を、エンハンサーエレメントが不在の遺伝子のｍＲＮＡ発現に比べて、少なくとも２５％、さらに好ましくは少なくとも５０％、さらに好ましくは少なくとも１００％、もっとも好ましくは少なくとも２００％増加させることが好ましい。ｍＲＮＡ発現は、たとえば、定量的ＲＴ−ＰＣＲにより決定してもよい。

本明細書では、パルボウイルスＲｅｐタンパク質の発現を増強するためにエンハンサーエレメントを使用するのが好ましい。したがって、追加の好ましい実施形態では、第１の発現カセットは、少なくとも１つのバキュロウイルスエンハンサーエレメント及び／又は少なくとも１つのエクジソン応答性エレメントを含む。好ましくは、エンハンサーエレメントは、ｈｒ１、ｈｒ２、ｈｒ３、ｈｒ４及びｈｒ５からなる群から選択される。

本文書及びその特許請求の範囲では、動詞「含む」及びその活用は非限定的意味で使用されて、前記単語に続く項目が含まれるが、具体的に言及されていない項目は排除されていないことを意味する。さらに、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」により要素へ言及しても、文脈が、その要素がただ１つだけ存在することを明確に要求しない限り、その要素が２つ以上存在する可能性を排除しない。したがって、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」は通常、「少なくとも１つ」を意味する。

本明細書に引用する特許及び参考文献はすべて、これによって参照によりその全体を組み込まれているものとする。

以下の実施例は、説明の目的のみで提供され、決して本発明の範囲を限定することを意図していない。

（例１）
１．１ 材料及び方法
１．１．１ バキュロウイルスプラスミド構築
ｐＦＢＤＳＬＲ（Ｕｒａｂｅら、２００２、上記を参照）は、ＡＡＶ２ Ｒｅｐ７８とＲｅｐ５２タンパク質用の２つの別個の発現カセットを含むｐＦａｓｔＢａｃＤｕａｌ発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）であって、Ｒｅｐ５２タンパク質の発現はｐｏｌＨプロモーターによって推進され、Ｒｅｐ７８タンパク質の発現は△ＩＥプロモーターから推進される発現ベクターである。この構築物は、ＧｅｎｅＸｐｒｅｓｓ ＢａｃｕｌｏＫＩＴ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製）に適合性のプラスミドであるｐＰＳＣ１０にサブクローニングされている。

Ｒｅｐ５２発現カセット中の野生型Ｒｅｐ５２コード配列は、ｐＰＳＣ１０Ｒｅｐ−５２ＣＤを産生するために、配列番号２のコドン最適化Ｒｅｐ５２コード配列で置き換えられている。

ｐＰＳＣ１０Ｒｅｐ−５２ＣＤのＲｅｐ７８発現カセット中の野生型Ｒｅｐ５２コード配列は、ｐＰＳＣ１０Ｒｅｐ−５２ＣＤ／７８ＡＴを産生するために、配列番号３のＡＴ最適化Ｒｅｐ５２コード配列で置き換えられている。

ｐＰＳＣ１０Ｒｅｐ−５２ＣＤのＲｅｐ７８発現カセット中の野生型Ｒｅｐ５２コード配列は、ｐＰＳＣ１０Ｒｅｐ−５２ＣＤ／７８ＧＣを産生するために、配列番号４のＧＣ最適化Ｒｅｐ５２コード配列で置き換えられている。

１．１．２ 組換えバキュロウイルス産生
オートグラファ・カリフォルニカ核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）由来の組換えバキュロウイルスは、ＧｅｎｅＸｐｒｅｓｓ ＢａｃｕｌｏＫＩＴ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製）を使用して産生される。トランスフェクションは以下の通りに実施される。丸底型１４ｍｌ管で２００μｌＧＲＡＣＥ培地を６μｌｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）と混合し、エッペンドルフ管で２００μｌＧＲＡＣＥ培地を５０μｌウイルスＤＮＡ（ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）及び２μｌトランスファープラスミド（ＲＥＰ）と混合する。エッペンドルフ管の内容物を前記管に添加し、慎重に混合する。室温で３０分のインキュベーション時間の後、１３００μｌＧＲＡＣＥをトランスフェクション混合物に添加する。Ｔ２５フラスコ中の昆虫細胞はＧＲＡＣＥ培地で洗浄し、トランスフェクション混合物を細胞層に液滴で添加する。２８℃６時間のインキュベーション後、１０％ＦＢＳを補充したＳＦ９００ＩＩ血清を慎重に添加し、Ｔ２５フラスコを５日間２８℃温室に置き、その後組換えバキュロウイルスを回収する。

１．２ 結果
新たに設計されたｐＰＳＣ１０Ｒｅｐ−５２ＣＤ、ｐＰＳＣ１０Ｒｅｐ−５２ＣＤ／７８ＡＴ及びｐＰＳＣ１０Ｒｅｐ−５２ＣＤ／７８ＧＣ ｐＰＳＣ１０Ｒｅｐの性能は、Ｕｒａｂｅらの最初のＲｅｐ構築物ｐＦＢＤＳＬＲ（２００２、上記を参照）と比較される。４種の構築物はすべて継代５まで連続継代される。ＡＡＶ ＩＴＲ（ＡＡＶ−ＬＰＬ）間にレポーター遺伝子の哺乳動物発現カセットを含有するバキュロウイルス及びそれぞれ継代２、３、４及び５のＡＡＶ１−Ｃａｐ（ＡＡＶ−ｃａｐ）用の昆虫細胞発現カセットを含有するバキュロウイルスと組み合わせて、継代２、３、４、及び５Ｒｅｐ構築物を使用して、組換えＡＡＶ１産生実験を実施する。ここで使用されるＡＡＶ−ＬＰＬ及びＡＡＶ−Ｃａｐ組換えバキュロウイルスは、ＷＯ２００７／０４６７０３に記載されている。ＡＡＶ１−ＬＰＬ産生収量はＱＰＣＲにより決定される。Ｕｒａｂｅら、２００２により設計された最初のバキュロウイルス（最初のＲＥＰ／Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ）は、５継代にわたりＡＡＶ産生の急速な減少をもたらす。しかし、ｐＰＳＣ１０Ｒｅｐ−５２ＣＤ、ｐＰＳＣ１０Ｒｅｐ−５２ＣＤ／７８ＡＴ及びｐＰＳＣ１０Ｒｅｐ−５２ＣＤ／７８ＧＣのＲＥＰ発現単位をもつバキュロウイルスは、少なくとも５継代にわたり安定したＡＡＶ産生をもたらす。したがって、数継代（たとえば、２〜５）にわたるＡＡＶ−ＬＰＬの再現性のある産生収量は、ｐＰＳＣ１０Ｒｅｐ−５２ＣＤ、ｐＰＳＣ１０Ｒｅｐ−５２ＣＤ／７８ＡＴ及びｐＰＳＣ１０Ｒｅｐ−５２ＣＤ／７８ＧＣ構築物を含有するバキュロウイルスを使用してのみ得られる。

（例２）
ＡＡＶ Ｒｅｐ７８とＲｅｐ５２タンパク質用の２つの別個の発現カセットを含有するバキュロウイルス発現ベクターはバキュロウイルス中では遺伝的に不安定であることは以前すでに記載されている（たとえば、ＷＯ２００７／１４８９７１及びＫｏｈｌｂｒｅｎｎｅｒら、２００５、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．１２（６）：１２１７〜２５参照）。Ｒｅｐ５２とＲｅｐ７８コード配列の以前は同一であった部分間に組換え事象を減少させるに十分な変化を導入するために、Ｒｅｐ７８コード配列ではなくＲｅｐ５２コード配列のみの（オートグラファ・カリフォルニカ核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）コドン使用に対して）コドン使用最適化を適用することに我々はこの時点で着手した。実際これが事実であることを我々は今や明らかにしている。

２．１ クローニング
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製プラスミドｐＰＳＣ１０、ｐＶＤ４２中に最初の二重ｒｅｐ発現カセットを含有するプラスミドを改変した。ｐＶＤ４２は、最初のｐＦＢＤＳＬＲ構築物（Ｕｒａｂｅら、２００２、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１３（１６）１９３５〜４３）中のように、デルタＥ１プロモーターにより推進されるｒｅｐ７８遺伝子及びＰｏｌＨプロモーターにより推進されるｒｅｐ５２遺伝子を含有する。ｐＶＤ４２中のｒｅｐ５２コード配列は、そのコドン使用がオートグラファ・カリフォルニカ核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）コドン使用に適合された合成ｒｅｐ５２コード配列に置き換えられていた（表２；及びｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｓｈｏｗｃｏｄｏｎ．ｃｇｉ？ｓｐｅｃｉｅｓ＝４６０１５参照）。このＡｃＭＮＰＶコドン最適化ＡＡＶ２ ｒｅｐ５２コード配列は配列番号１０に描かれている。ＰｏｌＨプロモーターから推進されるＡｃＭＮＰＶコドン最適化ＡＡＶ２ ｒｅｐ５２コード配列及びデルタＥ１プロモーターから推進される野生型ＡＡＶ２ ｒｅｐ７８コード配列を含む、このようにして得られたプラスミドｐＶＤ１８３の物理地図は図１に示されている。

２．２ 結果
我々はｐＶＤ１８３プラスミドの組換えバキュロウイルスクローンを作製し、バキュロウイルスを１０回継代させてその遺伝的安定性を分析した。我々は、バキュロウイルスのゲノムに関してＱＰＣＲにより構築物の、並びにウェスタンブロットにより、及びバキュロウイルスのｒＡＡＶ産生効率により、Ｒｅｐ５２遺伝子の遺伝的安定性を分析した。同時に、最初のＢａｃ．ＶＤ４２バキュロウイルスを比較のために継代７まで継代させた。Ｂａｃ．ＶＤ４２（又は、Ｂａｃ．ＦＢＤＳＬＲ）の安定性についての以前のデータもＷＯ２００７／１４８９７１に言及されている（最初のＲＥＰ／Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃと呼ばれる）。

２．２．１ ＱＰＣＲ
バキュロウイルスゲノムに関してＱＰＣＲにより測定された安定性。バキュロウイルス複製に不可欠であり、ｐＶＤ１８３とＰｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製のバキュロウイルス骨格間のＯＲＦ１６２９及びＯＦＲ６０３での組換えによりｐＶＤ１８３からのＢａｃＶＤ１８３の産生のために使用される遺伝子のコピー数。ＯＲＦ１６２９（ＯＲＦ）は、ＱＰＣＲにより測定されており、Ｒｅｐ遺伝子のコピー数もＱＰＣＲにより測定された。これら２つの遺伝子間の比は、バキュロウイルスのそれに続く継代間同一のままであるはずである。図２は、Ｂａｃ．ＦＢＤＳＬＲがかなり不安定であることを比較のために示している。図３は、Ｂａｃ．ＶＤ１８３のほうが有意に安定していることを示している。ＱＰＣＲにおいて使用される２つのプライマーセットの効率は必ずしも等しくなく、したがって、１とは異なる比が得られることに我々は注目している。しかし、安定性のもっと重要な指標は、前記比は複数の継代中比較的一定のままのはずであることである。Ｂａｃ．ＦＢＤＳＬＲ由来の継代３は、前記比が約０．２５であり悪化するだけであるので、すでに最適以下である。Ｂａｃ．ＶＤ１８３も約０．３で開始するが、その比前後で変動し、安定な状況が存在することを示している。バキュロウイルスゲノムの欠損により、もっと迅速に増殖するバキュロウイルス、次に完全長ゲノムを有するバキュロウイルスが得られ、したがって、欠損が存在するときには、それらのクローンはその他のクローンよりも過増殖する。ＱＰＣＲ法の変形により、図３に見られる増減が生じることがある。

２．２．２ ｒＡＡＶ産生
図４は、安定なＢａｃ．ＶＤ１８３構築物を使用したｒＡＡＶの産生を示している。より高い継代での産生量の下落は、ｒＡＡＶ産生で使用されるバキュロウイルスの量の減少により引き起こされる（図５参照）。図５は、Ｂａｃ．ＶＤ１８３由来ＯＲＦに関するＱＰＣＲを示しており、これは試料中に存在するバキュロウイルスの量に直接関連している。ｒＡＡＶ産生で使用されるバキュロウイルスの量は、産生されるｒＡＡＶの量と相関する。

２．２．３ Ｒｅｐウェスタンブロット
図６は、ウェスタンブロットにより分析されたＢａｃ．ＶＤ１８３の継代中のｒｅｐタンパク質発現を示している。

（例３）
２つのｒＡＡＶ産生パラメータに対するＲｅｐ５２発現レベルの効果が決定された。特に、１）ｍｌ未精製細胞バルクあたりのゲノムコピーで表されるｒＡＡＶ産生レベル（ｇｃ／ｍＬ ＣＬＢ）；及び２）フルｒＡＡＶビリオンに対するトータルｒＡＡＶビリオンの比（フルｒＡＡＶビリオンはｒＡＡＶゲノムコピーを含むビリオンである）に対する、Ｒｅｐ７８の発現レベルと比べたＲｅｐ５２の相対的発現レベルの効果が決定された。これらのパラメータは、それぞれ異なるＲｅｐ発現レベル及びＲｅｐ５２とＲｅｐ７８レベル間の異なる比をもたらす３種の異なるｒＡＡＶＲｅｐ構築物に対して比較された。３種の構築物はｐＶＤ８８（ＷＯ２００７／１４８９７１ではＲＥＰ−ＡＣＧ／ＰＳＣと呼ばれる）、ｐＶＤ１８３（本明細書の上の例２に記載されている）、及びｐＶＤ１８９（下記を参照）であった。

３．１ ｐＶＤ１８９の構築
ｐＶＤ８８構築物は、Ｒｅｐ７８とＲｅｐ５２遺伝子の翻訳開始点間の９ＡＴＧ配列を取り除くことにより、及びＲｅｐ７８ＡＣＧ翻訳開始コドンをＣＴＧに変えることにより、再設計された。配列は下を参照されたい。Ｂａｓｅｃｌｅａｒ（Ｌｅｉｄｅｎ、ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）は、新しい遺伝子を合成し、それを既存のＲｅｐ遺伝子を置き換えるｐＶＤ８８にクローニングしてｐＶＤ１８９を得た。ｐＶＤ１８９中のＲｅｐコード配列のヌクレオチド配列は、配列番号１１に描かれている。

３．２ ｒＡＡＶの産生
バキュロウイルスは、ＶＤ８８、ＶＤ１８３、及びＶＤ１８９構築物を使用して作製され、これらはｒＡＡＶ１の産生のために使用された。ｒＡＡＶ産生におけるＶＤ８８、ＶＤ１８３、及びＶＤ１８９構築物の比較により、未精製細胞バルク（ＣＬＢ）中でのＱ−ＰＣＲにより測定されたより良好なｒＡＡＶ産生量（ゲノムコピー）がもたらされた。図７は、もっとも低い量のＲｅｐ５２（図９）をもたらす標準Ｒｅｐ構築物ＶＤ８８により、ＣＬＢ中で測定したほぼ４×１０^１０ＧＣ／ｍｌがもたらされることを示している。わずかに高いＲｅｐ５２量（図９）をもたらすＶＤ１８９は、ほぼ９．５×１０^１０ＧＣ／ｍｌのＣＬＢ中で測定されたｒＡＡＶ産生量をもたらした。明確により高いＲｅｐ５２量（図１０）をもたらすＶＤ１８３は、ほぼ６×１０^１０ＧＣ／ｍｌのＣＬＢ中で測定されたｒＡＡＶ産生量をもたらした。

きわめて重要な質のパラメータは、ｒＡＡＶバッチのトータル対フル比である。図８は、トータル（ビリオン）対フル（ビリオン）の最良比は、図９におけるＢａｃ．ＶＤ１８９及びＢａｃ．ＶＤ８８構築物と比べた、Ｒｅｐ７８量に対する最高のＲｅｐ５２量を示すＶＤ１８３構築物で得られることを示している。

３．２ 追加の構築物
以下の構築物が構築され、試験されるが、これは本発明の一部である。

１、２、４、５、８、及び９は、Ｒｅｐ７８と５２タンパク質の発現の１転写単位を有する。
３、６、及び７は、Ｒｅｐ７８と５２タンパク質の発現の２転写単位を有する。

ｒＡＡＶ産生中の異なる構築物に対するｒｅｐ７８とｒｅｐ５２タンパク質量及び比の概算（ｒｅｐ７８対ｒｅｐ５２）
７８ ：５２
１）１ ：１
２）１．５ ：２
３）１ ：２０
４）５ ：０．２５
５）１ ：５
６）０．５ ：３０
７）０．７５：３０
８）５ ：２０
９）１ ：１０

表１ １２７コード配列に基づくスポドプテラ・フルギペルダコドン頻度（３３０９８コドン）

コードＧＣ ５０．５８％ 第１文字ＧＣ ５３．４２％ 第２文字ＧＣ ３９．４０％ 第３文字ＧＣ ５８．９３％

表２ コドン使用表 ２７７コード配列に基づくオートグラファ・カリフォルニカ核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）（７７４８７コドン）

コードＧＣ ４１．８６％ 第１文字ＧＣ ４３．６０％ 第２文字ＧＣ ３２．６８％ 第３文字ＧＣ ４９．２９％

Claims (28)

1. 第１のアミノ酸配列をコードする第１のヌクレオチド配列、及び第２のアミノ酸配列をコードする第２のヌクレオチド配列を含む昆虫細胞であって、
   第１と第２のアミノ酸配列が、第１と第２のアミノ酸配列間で少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有する少なくとも１００アミノ酸の共通アミノ酸配列を含み、
   第１と第２のアミノ酸配列中の共通アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の同一性が９０％未満であり、
   第１のヌクレオチド配列がパルボウイルスＲｅｐ５２タンパク質のアミノ酸配列をコードし、第２のヌクレオチド配列がパルボウイルスＲｅｐ７８タンパク質のアミノ酸配列をコードし、
   前記共通アミノ酸配列がパルボウイルスＲｅｐ５２タンパク質の２番目のアミノ酸からもっともＣ末端側のアミノ酸までのアミノ酸配列を含み、
   第１のヌクレオチド配列中の共通アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が、第２のヌクレオチド配列中の共通アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と比べると昆虫細胞に対して改良されたコドン使用バイアスを有する、
   昆虫細胞。
2. 第１と第２のアミノ酸配列中の共通アミノ酸配列が、少なくとも９９％のアミノ酸同一性を有する、請求項１に記載の昆虫細胞。
3. 第１と第２のアミノ酸配列中の共通アミノ酸配列が、１００％のアミノ酸同一性を有する、請求項２に記載の昆虫細胞。
4. 第１と第２のヌクレオチド配列中の共通アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列間のコドン適合指数の差が少なくとも０．２である、請求項１に記載の昆虫細胞。
5. コドン使用バイアスが改良されたヌクレオチド配列中の共通アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が、そのすべてが表１又は表２に従った共通コドンである一続きの少なくとも２５コドンを含む、請求項１から４までのいずれか一項に記載の昆虫細胞。
6. 使用バイアスが改良されたヌクレオチド配列中の共通アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列中のすべてのコドンが表１又は表２に従った共通コドンである、請求項５に記載の昆虫細胞。
7. その他のヌクレオチド配列中の共通アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列中のすべてのコドンが表１又は表２に従った２番目に頻度の高いコドンである、請求項６に記載の昆虫細胞。
8. 第２のヌクレオチド配列中の共通アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列中のコドンの少なくとも５０％が、第２のヌクレオチド配列のＡＴ又はＧＣ含量を最大化するように、第１のヌクレオチド配列中の対応するコドンと比べて変化している、請求項１から５までのいずれか一項に記載の昆虫細胞。
9. 第１と第２のヌクレオチド配列が核酸構築物の一部であり、第１と第２のヌクレオチド配列がそれぞれ昆虫細胞での発現のための発現制御配列に作動可能に連結されている、請求項１から８までのいずれか一項に記載の昆虫細胞。
10. 第１と第２のヌクレオチド配列が単一の核酸構築物の一部である、請求項９に記載の昆虫細胞。
11. パルボウイルスＲｅｐタンパク質がアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）Ｒｅｐタンパク質である、請求項１から１０までのいずれか一項に記載の昆虫細胞。
12. 第１と第２のヌクレオチド配列にコードされているパルボウイルスＲｅｐタンパク質が同一の血清型である、請求項１１に記載の昆虫細胞。
13. 第１のヌクレオチド配列がパルボウイルスＲｅｐ５２タンパク質をコードし、
    ａ）配列番号６のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
    ｂ）配列番号１〜５及び１０のいずれか１つのヌクレオチド配列を有するヌクレオチド配列、
    ｃ）その相補鎖が（ａ）又は（ｂ）の核酸分子配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列、並びに
    ｄ）その配列が遺伝コードの縮重により（ｃ）の核酸分子の配列とは異なるヌクレオチド配列
    からなる群から選択され、第２のヌクレオチド配列がパルボウイルスＲｅｐ７８タンパク質をコードし、
    ａ）配列番号８のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
    ｂ）配列番号７の１１〜１８７６位のヌクレオチド配列を有するヌクレオチド配列、
    ｃ）その相補鎖が（ａ）又は（ｂ）の核酸分子配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列、
    ｄ）その配列が遺伝コードの縮重により（ｃ）の核酸分子の配列とは異なるヌクレオチド配列
    からなる群から選択される、請求項１から１２までのいずれか一項に記載の昆虫細胞。
14. ａ）少なくとも１つのパルボウイルス逆方向末端反復（ＩＴＲ）ヌクレオチド配列を含む第３のヌクレオチド配列と、
    ｂ）昆虫細胞での発現のための発現制御配列に作動可能に連結されたパルボウイルスカプシドタンパク質コード配列を含む第４のヌクレオチド配列と
    をさらに含む、請求項１から１３までのいずれか一項に記載の昆虫細胞。
15. 第１、第２、第３及び第４のヌクレオチド配列のうち１つ又は複数が、昆虫細胞適合性ベクターである核酸構築物の一部である、請求項１４に記載の昆虫細胞。
16. 昆虫細胞適合性ベクターがバキュロウイルスベクターである、請求項１５に記載の昆虫細胞。
17. 第３のヌクレオチド配列が、対象の遺伝子産物をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列をさらに含み、対象の遺伝子産物をコードする前記少なくとも１つのヌクレオチド配列が昆虫細胞で産生されるパルボウイルスベクターのゲノムに組み込まれる、請求項１４から１６までのいずれか一項に記載の昆虫細胞。
18. 第３のヌクレオチド配列が、２つのパルボウイルスＩＴＲヌクレオチド配列を含み、対象の遺伝子産物をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列が前記２つのパルボウイルスＩＴＲヌクレオチド配列の間に位置している、請求項１７に記載の昆虫細胞。
19. 第１、第２、第３及び第４のヌクレオチド配列の少なくとも１つが昆虫細胞のゲノムに安定的に組み込まれている、請求項１４から１８までのいずれか一項に記載の昆虫細胞。
20. パルボウイルスがＡＡＶである、請求項１４から１９までのいずれか一項に記載の昆虫細胞。
21. 昆虫細胞において組換えパルボウイルスビリオンを産生するための方法であって、
    ａ）請求項１４から２０までのいずれか一項に記載の昆虫細胞を、組換えパルボウイルスビリオンが産生されるような条件下で培養する段階と、
    ｂ）前記組換えパルボウイルスビリオンの回収と
    を含む方法。
22. 固定化抗パルボウイルス抗体を使用した前記ビリオンのアフィニティー精製の段階をさらに含む、請求項２１に記載の方法。
23. 前記抗体が一本鎖ラクダ科動物抗体又はそのフラグメントである、請求項２２に記載の方法。
24. 前記組換えパルボウイルスビリオンが組換えＡＡＶビリオンである、請求項２１から２３いずれか一項に記載の方法。
25. 請求項１から１３までのいずれか一項に記載の第１と第２のヌクレオチド配列を含む核酸構築物。
26. 昆虫細胞において組換えパルボウイルスビリオンを産生するための方法であって、
    ａ）組換えパルボウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターが産生されるような条件下で昆虫細胞を培養する段階であって、昆虫細胞が、パルボウイルスＲｅｐ７８タンパク質及びパルボウイルスＲｅｐ５２タンパク質の発現のための少なくとも１つの核酸構築物を含み、請求項１４から２０までに記載の第３と第４のヌクレオチド配列をさらに含み、パルボウイルスＲｅｐ７８タンパク質及びパルボウイルスＲｅｐ５２タンパク質の発現のための少なくとも１つの核酸構築物が昆虫細胞において１０：１よりも高いＲｅｐ５２タンパク質のＲｅｐ７８タンパク質に対するモル比を生じさせる段階と、
    （ｂ）前記組換えパルボウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターの回収と
    を含む方法。
27. パルボウイルスＲｅｐ７８タンパク質及びパルボウイルスＲｅｐ５２タンパク質の発現のための核酸構築物が、パルボウイルスＲｅｐ７８とパルボウイルスＲｅｐ５２タンパク質の両方の発現のための単一コード配列を含む核酸構築物であり、前記コード配列が以下の特徴：
    ａ）パルボウイルスＲｅｐ７８タンパク質の翻訳のための開始コドンが、昆虫細胞で発現すると部分的エキソンスキッピングをもたらす開始コドンであること；
    ｂ）Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２タンパク質の翻訳開始点間に存在するＡＴＧ配列の１つ、複数又はすべてが除去されていること；
    ｃ）Ｒｅｐ５２タンパク質の翻訳開始コドンのコンテキストが、鱗翅目細胞中における有効な翻訳開始に最適な開始コンテキストの５’−ＮＮＮＮＮＮＡＵＧＡａ／ｃ／ｇＮ−３’に従って最適化されていること；
    ｄ）配列番号９の９ヌクレオチドの配列又は配列番号９に実質的に相同なヌクレオチド配列を含む発現制御配列が、Ｒｅｐ５２タンパク質の開始コドンの上流に存在すること；並びに
    ｅ）Ｒｅｐ５２タンパク質をコードするコード配列の一部が、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２タンパク質の翻訳開始点間のコード配列の一部と比べて昆虫細胞のための改良されたコドン使用バイアスを有すること
    のうち１つ又は複数を含む、請求項２６に記載の方法。
28. 昆虫が、昆虫細胞においてコード配列の発現を推進するプロモーターに作動可能に連結されているパルボウイルスＲｅｐ５２タンパク質の追加のコード配列を含み、パルボウイルスＲｅｐ５２タンパク質のコード配列が以下の特徴：
    ａ）Ｒｅｐ７８タンパク質コード配列のプロモーターと比べてより強力なＲｅｐ５２タンパク質コード配列のプロモーター；
    ｂ）Ｒｅｐ７８タンパク質コード配列のコピー数と比べてより高いＲｅｐ５２タンパク質コード配列のコピー数；
    ｃ）昆虫細胞での発現のためのＲｅｐ５２タンパク質コード配列の改良されたコドン使用バイアス；
    ｄ）Ｒｅｐ５２タンパク質の翻訳開始コドンのコンテキストが、鱗翅目（ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ）細胞中における有効な翻訳開始に最適な開始コンテキストの５’−ＮＮＮＮＮＮＡＵＧＡａ／ｃ／ｇＮ−３’に従って最適化されていること；並びに
    ｅ）配列番号９の９ヌクレオチドの配列又は配列番号９に実質的に相同なヌクレオチド配列を含む発現制御配列が、Ｒｅｐ５２タンパク質の開始コドンの上流に存在すること
    のうち１つ又は複数を含む、請求項２６又は２７に記載の方法。