ES2602585T3 - Vectores de baculovirus que comprenden secuencias de codificación repetidas con sesgos de codones diferenciales - Google Patents

Vectores de baculovirus que comprenden secuencias de codificación repetidas con sesgos de codones diferenciales Download PDF

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Abstract

Una célula de insecto que comprende una primera secuencia de nucleótidos que codifica una primera secuencia de aminoácidos y una segunda secuencia de nucleótidos que codifica una segunda secuencia de aminoácidos, en la que: (a) la primera y la segunda secuencias de nucleótidos están cada una unida operativamente a secuencias de control de la expresión para la expresión en una célula de insecto; (b) la primera y la segunda secuencias de aminoácidos comprenden una secuencia de aminoácidos común de la cual al menos 100 aminoácidos tienen una identidad de aminoácidos de al menos un 90 % entre la primera y la segunda secuencias de aminoácidos; (c) las secuencias de nucleótidos que codifican la secuencia de aminoácidos común en la primera y la segunda secuencias de aminoácidos son menos del 90% idénticas; (d) el uso de codones de la primera secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos común está adaptado al uso de codones de la célula huésped de insecto; (e) la primera secuencia de nucleótidos codifica la secuencia de aminoácidos de una proteína Rep52 o 40 de parvovirus y la segunda secuencia de nucleótidos codifica la secuencia de aminoácidos de una proteína Rep78 o 68 de parvovirus; y (f) las secuencias de aminoácidos comunes comprenden las secuencias de aminoácidos del segundo aminoácido más C-terminal de la proteína Rep52 o 40 de parvovirus.

Description

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realizaciones se utilizará la secuencia de nucleótidos que codifica una proteína Rep52 o 40 de parvovirus como primera secuencia de nucleótidos y la secuencia de nucleótidos que codifica una proteína Rep78 o 68 de parvovirus como segunda secuencia de nucleótidos, pero la inversa de estas realizaciones se incluye expresamente en la invención. La secuencia de aminoácidos común codificada por la primera y segunda secuencias de nucleótidos comprenden o consisten en las secuencias de aminoácidos de al menos el segundo aminoácido al aminoácido más C-terminal de una proteína Rep52 o 40 de parvovirus. Preferentemente, las secuencias de aminoácidos comunes comprenden o consisten en el primer aminoácido al aminoácido más C-terminal de la proteína Rep52 o 40 de parvovirus. Las identidades de aminoácidos entre las secuencias de aminoácidos comunes de parvovirus son como se han definido anteriormente para las secuencias de aminoácidos comunes. Preferentemente, en la célula de insecto, las proteínas Rep de parvovirus son proteínas Rep de virus adenoasociados (VAA). Más preferentemente, las proteínas Rep de parvovirus codificadas en la primera y segunda secuencias de nucleótidos son del mismo serotipo.
Una secuencia de nucleótidos que codifica proteínas Rep de parvovirus, se entiende, en el presente documento, como una secuencia de nucleótidos que codifica las proteínas Rep no estructurales que son necesarias y suficientes para la producción de vectores de parvovirus en las células de insectos, tales como las proteínas Rep78 o Rep68, y Rep52 o Rep40. La secuencia de nucleótidos de parvovirus animales es, preferentemente, de un dependovirus, más preferentemente de virus adenoasociado (VAA) de ser humano o de simio y, lo más preferentemente, de un VAA que normalmente infecta a los seres humanos (por ejemplo, los serotipos 1, 2, 3A, 3B, 4, 5 y 6) o primates (por ejemplo, los serotipos 1 y 4). Un ejemplo de una secuencia de nucleótidos que codifica las proteínas Rep de parvovirus animales se da en la SEQ ID No.7, que representa una parte del genoma de la secuencia de serotipo 2 de VAA que codifica las proteínas Rep. La secuencia de codificación de Rep78 comprende los nucleótidos 11 a 1876 y la secuencia de codificación de Rep52 comprende los nucleótidos 683 -1876, también representados por separado en la SEQ ID No. 1 y 5. Se entiende que los pesos moleculares exactos de las proteínas Rep78 y Rep52, así como las posiciones exactas de los codones de iniciación de la traducción pueden diferir entre diferentes parvovirus. Sin embargo, el experto sabrá cómo identificar la posición correspondiente en la secuencia de nucleótidos de otros parvovirus distintos de VAA-2.
Una (primera) secuencia de nucleótidos que codifica una proteína Rep52 de parvovirus puede, por tanto, definirse como una secuencia de nucleótidos:
a) que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 50, 60, 70, 80, 88, 89, 90, 95, 97, 98, o 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 6; b) que tiene al menos 50, 60, 70, 80, 81, 82, 85, 90, 95, 97, 98, o 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de una cualquiera de las SEQ ID NO de 1 -. 5 y 10; c) la cadena complementaria de la que se hibrida a una secuencia de molécula de ácido nucleico de (a) o (b); d) secuencias de nucleótidos cuya secuencia difiere de la secuencia de una molécula de ácido nucleico de (c) debido a la degeneración del código genético.
Una (segunda) secuencia de nucleótidos que codifica una proteína Rep78 de parvovirus puede, por tanto, definirse como una secuencia de nucleótidos:
a) que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 50, 60, 70, 80, 88, 89, 90, 95, 97, 98, o 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 8; b) que tiene al menos 50, 60, 70, 80, 81, 82, 85, 90, 95, 97, 98, o 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de las posiciones 11-1876 de la SEQ ID NO de 7; c) la cadena complementaria de la que se hibrida a una secuencia de molécula de ácido nucleico de (a) o (b); d) secuencias de nucleótidos cuya secuencia difiere de la secuencia de una molécula de ácido nucleico de (c) debido a la degeneración del código genético.
Preferentemente, la secuencia de nucleótidos codifica las proteínas Rep de parvovirus humanos que son necesarias y suficientes para la producción de vectores de parvovirus en células de insecto.
Las diversas modificaciones de la primera y segunda secuencia de nucleótidos de codificación como se ha definido anteriormente, incluyendo, por ejemplo, las secuencias de parvovirus de tipo silvestre, para la expresión apropiada en células de insectos se consigue mediante la aplicación de técnicas de ingeniería genética bien conocidas, tales como se describe en, por ejemplo, Sambrook y Russell (2001) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (3ª edición), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York. El experto en la técnica conoce varias modificaciones adicionales de las regiones de codificación que podrían aumentar el rendimiento de las proteínas que codifican. Estás modificaciones están dentro del ámbito de la presente invención.
En las células de insecto de la invención. La primera y segunda secuencias de nucleótidos son, preferentemente, parte de una construcción de ácido nucleico. La célula de insecto puede comprender dos construcciones de ácido nucleico distintas, una para cada una de las primera y segunda secuencias de nucleótidos, o de la célula de insecto puede comprender un solo tipo de construcción de ácido nucleico que comprende tanto la primera como la segunda secuencias de nucleótidos.
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Una célula de insecto preferida de acuerdo con la invención es una célula de insecto para la producción de vectores de parvovirus recombinantes. Esta célula de insecto comprende adicionalmente, además de la "primera" y la "segunda" secuencias de nucleótidos o la primera y la segunda secuencias de nucleótidos de las construcciones de ácido nucleico:
a) una tercera secuencia de nucleótidos que comprende al menos una secuencia de nucleótidos de repetición terminal invertida (secuencia ITR) de parvovirus; y b) una cuarta secuencia de nucleótidos que comprende las secuencias de codificación de la proteína Cap de parvovirus unida operativamente a secuencias de control de la expresión para la expresión en una célula de insecto.
En el contexto de la invención se entiende que "al menos una secuencia de nucleótidos ITR de parvovirus" significa una secuencia palindrómica, que comprende secuencias principalmente complementarias y dispuestas simétricamente, también denominada regiones "A", "B" y "C". La ITR funciona como un origen de replicación, un sitio que tiene un papel "cis" en la replicación, es decir, es un sitio de reconocimiento para proteínas de replicación que actúan en trans, tales como, por ejemplo, Rep 78 (o Rep68) que reconocen el palíndromo y secuencias específicas internas del palíndromo. Una excepción a la simetría de la secuencia ITR es la región "D" de la ITR. Es única (no tiene una complementaria dentro de una ITR). La realización de muescas en el ADN monocatenario se produce en la unión entre las regiones A y D. Es la región en la que se inicia una nueva síntesis de ADN. La región D normalmente se encuentra a un lado del palíndromo y proporciona direccionalidad de la etapa de replicación del ácido nucleico. Un parvovirus que se replica en una célula de mamífero tiene típicamente dos secuencias ITR. Sin embargo, es posible diseñar una ITR de modo que los sitios de unión estén en ambas hebras de las regiones A y las regiones D están situadas simétricamente, una a cada lado del palíndromo. En un molde de ADN circular de doble cadena (por ejemplo, un plásmido), la replicación de ácidos nucleicos asistida por Rep78 o Rep68 procede en ambas direcciones y una sola ITR es suficiente para la replicación del parvovirus de un vector circular. Por lo tanto, una secuencia de nucleótidos ITR se puede utilizar en el contexto de la presente invención. Preferentemente, sin embargo, se utilizan dos u otro número par de ITR regulares. Lo más preferentemente, se utilizan dos secuencias ITR. Una ITR de parvovirus preferente es una ITR de VAA. Por razones de seguridad, puede ser deseable construir un vector de parvovirus recombinante (VAAr) que no es capaz de propagarse adicionalmente después de la introducción inicial en una célula en presencia de un segundo VAA. Tal mecanismo de seguridad para limitar la propagación de vectores indeseable en un receptor puede proporcionarse mediante el uso de VAAr con una ITR quimérica como se describe en el documento US2003148506.
El número de construcciones de ácido nucleico empleadas en la célula de insecto para la producción del vector de parvovirus recombinante (VAAr) no es limitante en la invención. Por ejemplo, uno, dos, tres, cuatro, cinco, o más construcciones distintas se pueden emplear para producir VAAr en células de insecto de acuerdo con los procedimientos de la presente invención. Si se emplean cinco construcciones, una construcción codifica VP 1 de VAA, otra construcción codifica VP2 de VAA, otra construcción más codifica VP3 de VAA, todavía otra construcción más codifica la proteína Rep como se ha definido anteriormente y una construcción final comprende al menos una ITR de VAA. Si se utilizan menos de cinco construcciones, las construcciones pueden comprender varias combinaciones de la al menos una ITR de VAA y las secuencias de codificación de VP1, VP2, VP3, y la proteína Rep.
Preferentemente, se utilizan dos, tres o cuatro construcciones. Si se utilizan dos construcciones, preferentemente la célula de insecto comprende: (A) una primera construcción de ácido nucleico para la expresión de las proteínas Rep como se ha definido anteriormente, construcción que comprende además la cuarta secuencia de nucleótidos como se define en (b) anteriormente (que comprende las secuencias de codificación de la proteína Cap de parvovirus unidas operativamente a al menos una secuencia de control de la expresión para la expresión en una célula de insecto; véase también más adelante); y (B) una tercera construcción de ácido nucleico que comprende la tercera secuencia de nucleótidos como se ha definido en (a) anterior (que comprende al menos una secuencia de nucleótidos de ITR de parvovirus/VAA). Si se utilizan tres construcciones, se usa, preferentemente, la misma configuración que se usa para dos construcciones, excepto porque se usan construcciones separadas para la expresión de las proteínas de la cápside y para la expresión de las proteínas Rep. Si se utilizan cuatro construcciones, se usa, preferentemente, la misma configuración que se usa para tres construcciones, excepto porque se usan construcciones separadas para la expresión de las proteínas Rep78/68 y para la expresión de las proteínas Rep 52/40. Las secuencias de cada construcción pueden estar en cualquier orden una respecto a la otra. Por ejemplo, si una construcción comprende ITR y un ORF que comprende secuencias de nucleótidos que codifican proteínas de la cápside VP, el ORF de VP puede estar ubicado en la construcción de manera que, tras la replicación del ADN entre las secuencias ITR, el ORF de VP está replicado o no replicado. Para otro ejemplo, las secuencias de codificación y/o el ORF de Rep que comprenden las secuencias de nucleótidos que codifican proteínas de la cápside VP pueden estar en cualquier orden en una construcción. Se entiende que también las construcciones de ácido nucleico tercera, cuarta y más son, preferentemente, vectores compatibles con una célula de insecto, preferentemente vectores de baculovirus como se ha descrito anteriormente. Como alternativa, en la célula de insecto de la invención, una o más de la primera secuencia de nucleótidos, la tercera secuencia de nucleótido, la cuarta secuencia de nucleótidos, y la quinta secuencia de nucleótidos y otras secuencias de nucleótidos opcionales pueden estar integradas de forma estable en el genoma de la célula de insecto. Un experto en la técnica sabe cómo introducir de manera estable una secuencia de nucleótidos en el genoma de insecto y cómo identificar una célula
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Figura 2 Relación de las copias genómicas del gen ORF 1629 y el gen Rep en las muestras de baculovirus tomadas en diferentes pases de la construcción de baculovirus Bac.FBDSLR (Urabe y col., 2002, Hum Gene Ther. 13(16):1935-43). Las copias genómicas se midieron por QPCR. Figura 3 Relación de las copias genómicas del gen ORF 1629 y el gen Rep en las muestras de baculovirus tomadas en diferentes pases de la construcción de baculovirus pVD183 de la invención. Las copias genómicas se midieron por QPCR. Figura 4. Producción de VAAr con BacVD183. La caída de la producción se debe a una reducción en la cantidad de baculovirus presentes. Figura 5 ORF QPCR en los pases de Bac.VD183. Figura 6. Transferencia de tipo Western para la expresión de varios pases de Bac.VD183. "88" indica la construcción Bac.VD88, que se denomina REP-ACG/PSC en el documento WO2007/148971, que se utiliza en el presente documento como control. La cantidad de expresión de Rep se relaciona con la concentración de Bac.VD183. Figura 7. Q-PCR sobre volumen celular bruto (CLB) de producciones de VAAr1 utilizando tres construcciones diferentes para las proteínas Rep: VD88, VD183 y VD189. 5: 1: 1 se refiere a la relación de los diferentes baculovirus utilizados en la producción, 5 se refiere a Bac.VD88, Bac.VD183, o Bac.VD189, el primer 1 se refiere a Bac.VD84 (que contiene el gen de la cápside de VAA1) y el segundo 1 se refiere al baculovirus que contiene la construcción de ITR, Bac.VD43. Figura 8. Los CLB de la producción de tres VAAr1 diferentes se purificaron en una columna de Llama específica para la cápside de VAA y en los lotes purificados se midieron las copias genómicas y las partículas de VAAr totales. La división de las partículas de VAAr totales por el número de Q-PCR da lugar a la relación total mencionada anteriormente. 5:1:1 se refiere a la relación de los diferentes baculovirus utilizados en la producción, 5 se refiere a Bac.VD88, Bac.VD183, o Bac.VD189, el primer 1 se refiere a Bac.VD84 (que contiene el gen de la cápside de VAA1) y el segundo 1 se refiere al baculovirus que contiene la construcción de ITR, Bac.VD43. Figura 9. Transferencia de tipo Western de Rep. Se tomaron muestras a varios pases del baculovirus Bac.VD88
o Bac.VD189 y se realizó una transferencia de tipo Western. La cantidad de Rep52 respecto a la cantidad de Rep78 es consistentemente superior para Bac.VD189. Figura 10. Transferencia de tipo Western de Rep. Se tomaron muestras a varios pases del baculovirus Bac.VD183 y se realizó amplificación y transferencia de tipo Western de Rep. La cantidad de Rep52 con respecto a la cantidad de Rep78 es mucho más alta para Bac.VD183 que para Bac.VD189 y Bac.VD88.
Ejemplos
1. Ejemplo 1
1.1. Materiales y procedimientos
1.1.1 Construcción del plásmido de baculovirus
pFBDSLR (Urabe y col., 2002, mencionado anteriormente) es un vector de expresión pFastBacDual (Invitrogen) que comprende 2 casetes de expresión separados para las proteínas Rep78 y Rep52 de VAA2, de modo que la expresión de las proteínas Rep52 está dirigida por el promotor Polh y la expresión de la proteína Rep78 a partir del promotor ΔIE. Esta construcción se ha subclonado en pPSC10, un plásmido que es compatible con el GenExpress BaculoKIT (Protein Sciences Corporation).
La secuencia de codificación de Rep52 de tipo salvaje en el casete de expresión de Rep 52 se reemplaza con el la secuencia de codificación de Rep52 optimizada por codones de la SEQ ID NO. 2 para producir pPSC10Rep-52CD.
La secuencia de codificación de Rep52 de tipo salvaje en el casete de expresión de Rep 78 de pPSC10Rep-52CD se reemplaza con la secuencia de codificación de Rep52 optimizada por AT de la SEQ ID NO. 3 para producir pPSC10Rep-52CD/78AT.
La secuencia de codificación de Rep52 de tipo salvaje en el casete de expresión de Rep 78 de pPSC10Rep-52CD se reemplaza con la secuencia de codificación de Rep52 optimizada por GC de la SEQ ID NO. 4 para producir pPSC10Rep-52CD/78GC.
1.1.2 Producción de baculovirus recombinante
Los baculovirus recombinantes derivados del virus de de la polihedrosis nuclear múltiple de Autographa californica (AcMNPV) se producen utilizando el GenExpress BaculoKIT (Protein Sciences Corporation). La transfección se lleva a cabo de la siguiente manera: En un tubo de 14 ml de fondo redondo se mezclan 200 µl de medio GRACE con 6 µl de cellfectine (Invitrogen) y en un tubo eppendorf, 200 µl de medio GRACE se mezclan con 50 µl de ADN viral (Protein Sciences) y 2 µg del plásmido de transferencia (REP). El contenido del tubo de eppendorf se añade al tubo y se mezcla cuidadosamente. Después de un período de incubación de 30 minutos a temperatura ambiente se añaden 1.300 µl de GRACE a la mezcla de transfección. Las células de insecto en un matraz T25 se lavan con medio GRACE y se añade la mezcla de transfección gota a gota a la capa de células. Después de una incubación de 6 horas a 28 ºC se añade suero SF900II suplementado con 10 % de SFB cuidadosamente y el matraz T25 se introdujo en una estufa de 28 ºC durante 5 días, después de lo cual se cosecha el baculovirus recombinante.
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1.2 Resultados
El rendimiento de pPSC10Rep-52CD, pPSC10Rep-52CD/78AT and pPSC10Rep-52CD/78GC pPSC10Rep recién diseñados se compara con las construcciones pFBDSLR de Rep originales de de Urabe y col., (2002, mencionado anteriormente). Las cuatro construcciones se pasan en serie hasta el paso 5. Se realizan experimentos de producción de VAA1 recombinante usando las construcciones de Rep de los pases 2, 3, 4 y 5 en combinación con un baculovirus que contiene un casete de expresión de mamífero de un gen indicador entre de las ITR de VAA (VAA-LPL) y un baculovirus que contiene un casete de expresión de células de insecto para el VAA1-Cap (VAA-cap) de los pases respectivos 2, 3, 4 y 5. Los baculovirus recombinantes de VAA-LPL y VAA-Cap, tal como se utilizan en el presente documento, se describen en el documento WO2007/046703. Se determinan los rendimientos de producción de VAA1-LPL mediante QPCR. El baculovirus original diseñado por Urabe y col., 2002 (REP/Bac-to-Bac original) se traduce en una disminución rápida de la producción de VAA en 5 pases. Sin embargo, el baculovirus con las unidades de expresión de REP de pPSC10Rep-52CD, pPSC10Rep-52CD/78AT y pPSC10Rep-52CD/s 78GC da lugar a la producción de VAA estable durante al menos 5 pases. Por lo tanto, los rendimientos de producción reproducibles de VAA-LPL en varios pases (por ejemplo, de 2 a 5), solo se obtienen usando baculovirus que contienen las construcciones pPSC10Rep-52CD, pPSC10Rep-52CD/78AT y pPSC10Rep-52CD/78GC.
2. Ejemplo 2
Previamente se ha descrito que los vectores de expresión de baculovirus que contiene de 2 casetes de expresión separados para las proteínas Rep78 and Rep52 de VAA son genéticamente inestables en los baculovirus (véase, por ejemplo, el documento WO2007/148971 y Kohlbrenner y col., 2005, Mol Ther-12(6):1217-25). Ahora, los inventores han establecido la aplicación de la optimización del uso de codones (con respecto al uso de codones del virus de la polihedrosis nuclear múltiple por Autographa californica (AcMNPV) de solo la secuencia de codificación de Rep52 y no la secuencia de codificación de Rep78 a fin de introducir cambios suficiente entre las partes anteriormente idénticas de las secuencias de codificación de Rep52 y Rep78 para reducir los acontecimientos de recombinación. A continuación, demostraron que realmente este era el caso.
2.1 Clonación
Un plásmido que contiene los casetes de expresión doble de Rep originales en el plásmido pPSC10, pVD42 de Protein Sciences Corporation se modificó. pVD42 contiene el gen de rep78 dirigido por el promotor deltaE1 y el gen de rep52 dirigido por el promotor PolH, como en la construcción pFBDSLR original (Urabe y col., 2002, Hum Gene Ther. 13(16):1935-43). La secuencia de codificación de rep52 en pVD42 se sustituyó por una secuencia de codificación de rep52 sintética cuyo uso de codones se adaptó al uso de codones del virus de la polihedrosis nuclear múltiple de Autographa california (AcMNPV) (véase la Tabla 2; y http://www.kazusa.or.jp/codon/cgibin/showcodon.cgi?species=46015). Esta secuencia de codificación de rep52 de VAA2 optimizada por codones se representa en la SEQ ID NO: 10. En la figura 1 se muestra un mapa físico del plásmido pVD183 resultante, que comprende el la secuencia de codificación de rep52 de VAA2 optimizada por codones dirigida desde el promotor Polh y la secuencia de codificación de rep78 del VAA2 dirigida desde el promotor deltaE1.
2.2 Resultados
Los inventores han realizado un clon de baculovirus recombinante del plásmido pVD183 y se pasó el baculovirus 10 veces para analizar su estabilidad genética. Los inventores analizaron la estabilidad genética de la construcción mediante QPCR en el genoma del baculovirus y el gen de Rep52 mediante transferencia de tipo Western y mediante la eficiencia de producción del VAAr del baculovirus. Al mismo tiempo, el baculovirus Bac.VD42 original se hizo pasar al pase 7 para la comparación. Los datos anteriores sobre la estabilidad del Bac.VD42(o Bac.FBDSLR) también se mencionan en el documento WO2007/148971 (denominado REPBac-to-Bac original).
2.2.1 QPCR
Estabilidad medida mediante QPCR en los genomas de baculovirus. El número de copias de un gen que es esencial para la replicación de baculovirus y que se utiliza para la producción de BacVD183 a partir de pVD183 mediante recombinación en ORF1629 y ORF603 entre el pVD183 y el esqueleto del baculovirus de Protein Sciences. El ORF 1629 (ORF) se ha medido mediante QPCR y el número de copias de los genes Rep también se ha medido mediante QPCR. La relación entre estos 2 genes debe permanecer igual durante los pases posteriores del baculovirus. La figura 2 muestra para la comparación que Bac.FBDSLR es más bien inestable. Figura 3 muestra que Bac.VD183 es significativamente más estable. Los inventores observaron que la eficiencia de los 2 conjuntos de cebadores utilizados en la QPCR no es necesariamente igual, por lo tanto, se puede obtener una relación diferente de 1. Sin embargo, un indicador más importante de la estabilidad es que la relación debe permanecer relativamente constante durante múltiples pases. El pase 3 del Bac.FBDSLR ya es subóptimo, dado que la relación es de aproximadamente 0,25 y solo empeora. Bac.VD183 también comienza alrededor de 0,3 pero fluctúa alrededor de esa relación, lo que indica que hay una situación estable. Las deleciones en el genoma de baculovirus da lugar a un baculovirus que crece más rápido que los baculovirus que tiene un genoma de longitud completa, por lo tanto, cuando se produce una deleción, esos clones crecerán más que los demás. Las variaciones en el procedimiento de QPCR pueden dar lugar a las fluctuaciones observadas en la Figura 3.
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2.2.2 Producción de VAAr
La Figura 4 muestra la producción de VAAr con la construcción Bac.VD183 estable. La caída en la producción en los pases más altos se debe a una reducción en la cantidad de baculovirus utilizados en la producción de VAAr (véase la Figura 5). La figura 5 muestra la QPCR en el ORF de Bac.VD183, que está directamente relacionado con la cantidad de baculovirus presentes en la muestra. La cantidad de baculovirus utilizados en la producción de VAAr se correlaciona con la cantidad de VAAr producido.
2.2.3 Transferencia de tipo Western de Rep
La Figura 6 muestra la expresión de la proteína Rep durante los pases de Bac.VD183 analizada mediante transferencia de tipo Western.
3. Ejemplo 3
El efecto del nivel de expresión de Rep52 se determinó en dos parámetros de producción de VAAr. En particular, el efecto del nivel de expresión relativo de Rep52 en comparación con el nivel de expresión de Rep78 en 1) el nivel de producción de VAAr como se expresa en las copias del genoma por ml de volumen celular bruto (g/m de CLB); y 2) la relación entre los viriones de VAAr totales y los viriones de VAAr completos (los viriones de VAAr completos son viriones que comprenden una copia del genoma de VAAr). Estos parámetros se compararon para tres diferentes construcciones de Rep de VAAr diferentes que dan lugar cada una a diferentes niveles de expresión de Rep52 y en proporción diferente entre los niveles de Rep52 y Rep78. Las tres construcciones fueron pVD88 (denominados REP-ACG/PSC en el documento WO2007/148971), pVD183 (descrito en el Ejemplo 2 en el presente documento anteriormente) y pVD189 (véase más adelante).
3.1 Construcción de pVD189
La construcción pVD88 se volvió a diseñar mediante la eliminación de 9 secuencias de ATG entre el inicio de la traducción de los genes de Rep78 y Rep 52 y cambiando el codón de iniciación de la traducción ACG de Rep78 a CTG. Véase la secuencia siguiente. Baseclear (Leiden, Países Bajos) sintetizó el nuevo gen y lo clonó en pVD88 reemplazando el gen Rep existente para obtener pVD189. La secuencia de nucleótidos de la secuencia de codificación de Rep en pVD189 se representa en la SEQ ID NO: 11.
3.2 Producción de VAAr
Los baculovirus se realizaron con las construcciones de VD88, VD183, y VD189 y estos se utilizaron para la producción de VAAr1. La comparación de las construcciones VD88, VD183 y VD189 en la producción de VAAr dio lugar a una producción de VAAr (copias del genoma) mejor, medida mediante Q-PCR en el volumen celular bruto (CLB). La Figura 7 muestra que la construcción de Rep estándar VD88, que da como resultado una cantidad menor de Rep52 (Figura 9) da como resultado aproximadamente 4 x 1010 de GC/ml medidos en el CLB. VD189 que conduce a una cantidad de Rep52 ligeramente mayor (Figura 9) dio como resultado una producción de VAAr medida en el CLB de aproximadamente 6 x 1010 de GC/ml. VD183 que conduce a una cantidad de Rep52 claramente mayor (Figura 10) dio como resultado una producción de VAAr medida en el CLB de aproximadamente 6 x 1010 de GC/ml.
Un parámetro de calidad muy importante es la relación total: completos del lote de VAAr. La Figura 8 muestra que la mejor relación de totales (viriones): completos (viriones) se obtiene con la construcción VD183 que muestra la cantidad de Rep52 más alta respecto a la cantidad de Rep78 en comparación con las construcciones Bac.VD189 y Bac.VD88 en la Figura 9.
3.2 Construcciones adicionales
Se construyen y se analizan siguientes construcciones, y parte de la invención:
Construcciones Promotor(es) Codones de iniciación y secuencias de codificación
1) VD88
PolH ACG-78---------------ATG-52------------*
2) VD189
PolH CTG-78-atg ATG-52 eliminado------------*
3) VD183
delta E1 ATG-78---------------------------------* +
PolH
ATG--52---SEQ ID NO: 10-----------*
4) VD196
PolH CTG-78---------------ATG-52------------*
5) VD197
PolH ACG -78-atg ATG-52 eliminado------------*
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