JP2010534472A - 差次的コドンバイアスを有する反復コード配列を含むバキュロウイルスベクター - Google Patents
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Abstract
Description
本明細書で使用するように、用語「作動可能に連結された」とは、ポリヌクレオチド(又はポリペプチド)エレメントを機能的関係で連結することである。核酸は、別の核酸配列と機能的関係におかれると「作動可能に連結される」ことになる。たとえば、転写調節配列は、それがコード配列の転写に影響を与える場合には、コード配列に作動可能に連結されていることになる。作動可能に連結されたとは、連結されているDNA配列が典型的には近接していること、及び必要ならば、2種のタンパク質コード領域を、近接して読み枠内で結合させることを意味する。
a)配列番号6のアミノ酸配列と少なくとも50、60、70、80、88、89、90、95、97、98、又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする;
b)配列番号1〜5及び10のいずれか1つのヌクレオチド配列と少なくとも50、60、70、80、81、82、85、90、95、97、98、又は99%の配列同一性を有する;
c)その相補鎖が、(a)又は(b)の核酸分子配列にハイブリダイズする;
d)その配列が、遺伝コードの縮重により(c)の核酸分子の配列とは異なっている
ヌクレオチド配列として定義してもよい。
a)配列番号8のアミノ酸配列と少なくとも50、60、70、80、88、89、90、95、97、98、又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする;
b)配列番号7の11〜1876位のヌクレオチド配列と少なくとも50、60、70、80、81、82、85、90、95、97、98、又は99%の配列同一性を有する;
c)その相補鎖が、(a)又は(b)の核酸分子配列にハイブリダイズする;
d)その配列が、遺伝コードの縮重により(c)の核酸分子の配列とは異なっている
ヌクレオチド配列として定義してもよい。好ましくは、前記ヌクレオチド配列は、昆虫細胞におけるパルボウイルスベクター産生に必要とされ十分である動物パルボウイルスRepタンパク質をコードしている。
a)少なくとも1つのパルボウイルス逆方向末端反復(ITR)ヌクレオチド配列を含む第3のヌクレオチド配列、及び
b)昆虫細胞での発現のための発現制御配列に作動可能に連結されたパルボウイルスCapタンパク質コード配列を含む第4のヌクレオチド配列
をさらに含む。
a)WO2007/148971に記載の通りに、Rep78/68タンパク質の翻訳開始コドンを次の開始コドン及び/又はその次のコンテキストに変えてもよい;
b)好ましくは、ヌクレオチド配列における変化をイソコーディングすることにより、それぞれRep78/68とRep52/40遺伝子の翻訳開始点間に存在する1つ又は複数又はすべて(9)のATG配列の除去。これは、たとえば、実施例3に及び配列番号11に記載のpVD189Repコード配列において実現される;
c)(Changら、1999、Virology259:369〜383に記載されている)鱗翅目細胞における有効な翻訳開始に最適な開始コンテキストの5’−NNNNNNAUGAa/c/gN−3’に従ったRep52/40タンパク質の翻訳開始コドンのコンテキストの最適化;
d)Rep52/40タンパク質の開始コドンの上流に、配列番号9の9ヌクレオチドの配列、又は配列番号9に実質的に相同なヌクレオチド配列を含む発現制御配列を組み込む;
e)(上に記載する)昆虫細胞における発現のためにRep52/40タンパク質をコードするコード配列の一部のコドン使用バイアスを改良する;
f)Rep78/68とRep52/40タンパク質の翻訳開始点間のコード配列の一部のコドン使用バイアスを、それが(上に記載する)昆虫細胞における発現により適合されないように変化させる。a)からf)の組合せは本発明に含まれ、好ましくは、a)はb)からf)までの少なくとも1つと組み合わされる。
a)Rep78/68単位のプロモーターと比べてより強力なRep52/40転写単位のプロモーターを使用すること(下記を参照);
b)Rep78/68単位のコピー数に比べて、Rep52/40転写単位のコピー数を増大させること;
c)昆虫細胞での発現のためのRep52/40タンパク質をコードするコード配列(上に記載されている、たとえば、配列番号2又は10)のコドン使用バイアスを改良すること;
d)(Changらに記載されている、上記を参照)鱗翅目細胞における有効な翻訳開始に最適な開始コンテキストの5’−NNNNNNAUGAa/c/gN−3’に従ったRep52/40タンパク質の翻訳開始コドンのコンテキストの最適化;並びに
e)Rep52/40タンパク質の開始コドンの上流に、配列番号9の9ヌクレオチドの配列、又は配列番号9に実質的に相同なヌクレオチド配列を含む発現制御配列を組み込むこと
のうち1つ又は複数によって増大させることができる。
1.1 材料及び方法
1.1.1 バキュロウイルスプラスミド構築
pFBDSLR(Urabeら、2002、上記を参照)は、AAV2 Rep78とRep52タンパク質用の2つの別個の発現カセットを含むpFastBacDual発現ベクター(Invitrogen社製)であって、Rep52タンパク質の発現はpolHプロモーターによって推進され、Rep78タンパク質の発現は△IEプロモーターから推進される発現ベクターである。この構築物は、GeneXpress BaculoKIT(Protein Sciences Corporation社製)に適合性のプラスミドであるpPSC10にサブクローニングされている。
オートグラファ・カリフォルニカ核多角体病ウイルス(AcMNPV)由来の組換えバキュロウイルスは、GeneXpress BaculoKIT(Protein Sciences Corporation社製)を使用して産生される。トランスフェクションは以下の通りに実施される。丸底型14ml管で200μlGRACE培地を6μlcellfectine(Invitrogen社製)と混合し、エッペンドルフ管で200μlGRACE培地を50μlウイルスDNA(protein sciences社製)及び2μlトランスファープラスミド(REP)と混合する。エッペンドルフ管の内容物を前記管に添加し、慎重に混合する。室温で30分のインキュベーション時間の後、1300μlGRACEをトランスフェクション混合物に添加する。T25フラスコ中の昆虫細胞はGRACE培地で洗浄し、トランスフェクション混合物を細胞層に液滴で添加する。28℃6時間のインキュベーション後、10%FBSを補充したSF900II血清を慎重に添加し、T25フラスコを5日間28℃温室に置き、その後組換えバキュロウイルスを回収する。
新たに設計されたpPSC10Rep−52CD、pPSC10Rep−52CD/78AT及びpPSC10Rep−52CD/78GC pPSC10Repの性能は、Urabeらの最初のRep構築物pFBDSLR(2002、上記を参照)と比較される。4種の構築物はすべて継代5まで連続継代される。AAV ITR(AAV−LPL)間にレポーター遺伝子の哺乳動物発現カセットを含有するバキュロウイルス及びそれぞれ継代2、3、4及び5のAAV1−Cap(AAV−cap)用の昆虫細胞発現カセットを含有するバキュロウイルスと組み合わせて、継代2、3、4、及び5Rep構築物を使用して、組換えAAV1産生実験を実施する。ここで使用されるAAV−LPL及びAAV−Cap組換えバキュロウイルスは、WO2007/046703に記載されている。AAV1−LPL産生収量はQPCRにより決定される。Urabeら、2002により設計された最初のバキュロウイルス(最初のREP/Bac−to−Bac)は、5継代にわたりAAV産生の急速な減少をもたらす。しかし、pPSC10Rep−52CD、pPSC10Rep−52CD/78AT及びpPSC10Rep−52CD/78GCのREP発現単位をもつバキュロウイルスは、少なくとも5継代にわたり安定したAAV産生をもたらす。したがって、数継代(たとえば、2〜5)にわたるAAV−LPLの再現性のある産生収量は、pPSC10Rep−52CD、pPSC10Rep−52CD/78AT及びpPSC10Rep−52CD/78GC構築物を含有するバキュロウイルスを使用してのみ得られる。
AAV Rep78とRep52タンパク質用の2つの別個の発現カセットを含有するバキュロウイルス発現ベクターはバキュロウイルス中では遺伝的に不安定であることは以前すでに記載されている(たとえば、WO2007/148971及びKohlbrennerら、2005、Mol Ther.12(6):1217〜25参照)。Rep52とRep78コード配列の以前は同一であった部分間に組換え事象を減少させるに十分な変化を導入するために、Rep78コード配列ではなくRep52コード配列のみの(オートグラファ・カリフォルニカ核多角体病ウイルス(AcMNPV)コドン使用に対して)コドン使用最適化を適用することに我々はこの時点で着手した。実際これが事実であることを我々は今や明らかにしている。
Protein Sciences Corporation社製プラスミドpPSC10、pVD42中に最初の二重rep発現カセットを含有するプラスミドを改変した。pVD42は、最初のpFBDSLR構築物(Urabeら、2002、Hum Gene Ther.13(16)1935〜43)中のように、デルタE1プロモーターにより推進されるrep78遺伝子及びPolHプロモーターにより推進されるrep52遺伝子を含有する。pVD42中のrep52コード配列は、そのコドン使用がオートグラファ・カリフォルニカ核多角体病ウイルス(AcMNPV)コドン使用に適合された合成rep52コード配列に置き換えられていた(表2;及びhttp://www.kazusa.or.jp/codon/cgi−bin/showcodon.cgi?species=46015参照)。このAcMNPVコドン最適化AAV2 rep52コード配列は配列番号10に描かれている。PolHプロモーターから推進されるAcMNPVコドン最適化AAV2 rep52コード配列及びデルタE1プロモーターから推進される野生型AAV2 rep78コード配列を含む、このようにして得られたプラスミドpVD183の物理地図は図1に示されている。
我々はpVD183プラスミドの組換えバキュロウイルスクローンを作製し、バキュロウイルスを10回継代させてその遺伝的安定性を分析した。我々は、バキュロウイルスのゲノムに関してQPCRにより構築物の、並びにウェスタンブロットにより、及びバキュロウイルスのrAAV産生効率により、Rep52遺伝子の遺伝的安定性を分析した。同時に、最初のBac.VD42バキュロウイルスを比較のために継代7まで継代させた。Bac.VD42(又は、Bac.FBDSLR)の安定性についての以前のデータもWO2007/148971に言及されている(最初のREP/Bac−to−Bacと呼ばれる)。
バキュロウイルスゲノムに関してQPCRにより測定された安定性。バキュロウイルス複製に不可欠であり、pVD183とProtein Sciences社製のバキュロウイルス骨格間のORF1629及びOFR603での組換えによりpVD183からのBacVD183の産生のために使用される遺伝子のコピー数。ORF1629(ORF)は、QPCRにより測定されており、Rep遺伝子のコピー数もQPCRにより測定された。これら2つの遺伝子間の比は、バキュロウイルスのそれに続く継代間同一のままであるはずである。図2は、Bac.FBDSLRがかなり不安定であることを比較のために示している。図3は、Bac.VD183のほうが有意に安定していることを示している。QPCRにおいて使用される2つのプライマーセットの効率は必ずしも等しくなく、したがって、1とは異なる比が得られることに我々は注目している。しかし、安定性のもっと重要な指標は、前記比は複数の継代中比較的一定のままのはずであることである。Bac.FBDSLR由来の継代3は、前記比が約0.25であり悪化するだけであるので、すでに最適以下である。Bac.VD183も約0.3で開始するが、その比前後で変動し、安定な状況が存在することを示している。バキュロウイルスゲノムの欠損により、もっと迅速に増殖するバキュロウイルス、次に完全長ゲノムを有するバキュロウイルスが得られ、したがって、欠損が存在するときには、それらのクローンはその他のクローンよりも過増殖する。QPCR法の変形により、図3に見られる増減が生じることがある。
図4は、安定なBac.VD183構築物を使用したrAAVの産生を示している。より高い継代での産生量の下落は、rAAV産生で使用されるバキュロウイルスの量の減少により引き起こされる(図5参照)。図5は、Bac.VD183由来ORFに関するQPCRを示しており、これは試料中に存在するバキュロウイルスの量に直接関連している。rAAV産生で使用されるバキュロウイルスの量は、産生されるrAAVの量と相関する。
図6は、ウェスタンブロットにより分析されたBac.VD183の継代中のrepタンパク質発現を示している。
2つのrAAV産生パラメータに対するRep52発現レベルの効果が決定された。特に、1)ml未精製細胞バルクあたりのゲノムコピーで表されるrAAV産生レベル(gc/mL CLB);及び2)フルrAAVビリオンに対するトータルrAAVビリオンの比(フルrAAVビリオンはrAAVゲノムコピーを含むビリオンである)に対する、Rep78の発現レベルと比べたRep52の相対的発現レベルの効果が決定された。これらのパラメータは、それぞれ異なるRep発現レベル及びRep52とRep78レベル間の異なる比をもたらす3種の異なるrAAVRep構築物に対して比較された。3種の構築物はpVD88(WO2007/148971ではREP−ACG/PSCと呼ばれる)、pVD183(本明細書の上の例2に記載されている)、及びpVD189(下記を参照)であった。
pVD88構築物は、Rep78とRep52遺伝子の翻訳開始点間の9ATG配列を取り除くことにより、及びRep78ACG翻訳開始コドンをCTGに変えることにより、再設計された。配列は下を参照されたい。Baseclear(Leiden、the Netherlands)は、新しい遺伝子を合成し、それを既存のRep遺伝子を置き換えるpVD88にクローニングしてpVD189を得た。pVD189中のRepコード配列のヌクレオチド配列は、配列番号11に描かれている。
バキュロウイルスは、VD88、VD183、及びVD189構築物を使用して作製され、これらはrAAV1の産生のために使用された。rAAV産生におけるVD88、VD183、及びVD189構築物の比較により、未精製細胞バルク(CLB)中でのQ−PCRにより測定されたより良好なrAAV産生量(ゲノムコピー)がもたらされた。図7は、もっとも低い量のRep52(図9)をもたらす標準Rep構築物VD88により、CLB中で測定したほぼ4×1010GC/mlがもたらされることを示している。わずかに高いRep52量(図9)をもたらすVD189は、ほぼ9.5×1010GC/mlのCLB中で測定されたrAAV産生量をもたらした。明確により高いRep52量(図10)をもたらすVD183は、ほぼ6×1010GC/mlのCLB中で測定されたrAAV産生量をもたらした。
以下の構築物が構築され、試験されるが、これは本発明の一部である。
1、2、4、5、8、及び9は、Rep78と52タンパク質の発現の1転写単位を有する。
3、6、及び7は、Rep78と52タンパク質の発現の2転写単位を有する。
78 :52
1)1 :1
2)1.5 :2
3)1 :20
4)5 :0.25
5)1 :5
6)0.5 :30
7)0.75:30
8)5 :20
9)1 :10
コードGC 50.58% 第1文字GC 53.42% 第2文字GC 39.40% 第3文字GC 58.93%
コードGC 41.86% 第1文字GC 43.60% 第2文字GC 32.68% 第3文字GC 49.29%
Claims (25)
- 第1のアミノ酸配列をコードする第1のヌクレオチド配列、及び第2のアミノ酸配列をコードする第2のヌクレオチド配列を含む昆虫細胞であって、第1と第2のアミノ酸配列が、第1と第2のアミノ酸配列間で少なくとも90%のアミノ酸同一性を有する少なくとも100アミノ酸の共通アミノ酸配列を含み、第1と第2のアミノ酸配列中の共通アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の同一性が90%未満であり、第1のヌクレオチド配列がパルボウイルスRep52又は40タンパク質のアミノ酸配列をコードし、第2のヌクレオチド配列がパルボウイルスRep78又は68タンパク質のアミノ酸配列をコードし、前記共通アミノ酸配列がパルボウイルスRep52又は40タンパク質の2番目のアミノ酸からもっともC末端側のアミノ酸までのアミノ酸配列を含む昆虫細胞。
- 第1と第2のアミノ酸配列中の共通アミノ酸配列が、少なくとも99%のアミノ酸同一性を、好ましくは100%のアミノ酸同一性を有する、請求項1に記載の昆虫細胞。
- 第1のヌクレオチド配列中の共通アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が、第2のヌクレオチド配列中の共通アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と比べると昆虫細胞に対して改良されたコドン使用バイアスを有する、又は第2のヌクレオチド配列中の共通アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が、第1のヌクレオチド配列中の共通アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と比べると昆虫細胞に対して改良されたコドン使用バイアスを有する、請求項1又は2に記載の昆虫細胞。
- 第1と第2のヌクレオチド配列中の共通アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列間のコドン適合指数の差が少なくとも0.2である、請求項3に記載の昆虫細胞。
- コドン使用バイアスが改良されたヌクレオチド配列中の共通アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が、そのすべてが表1又は表2に従った共通コドンである一続きの少なくとも25コドンを含む、請求項1から4までのいずれか一項に記載の昆虫細胞。
- 使用バイアスが改良されたヌクレオチド配列中の共通アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列中のすべてのコドンが表1又は表2に従った共通コドンであり、好ましくは、その他のヌクレオチド配列中の共通アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列中のすべてのコドンが表1又は表2に従った2番目に頻度の高いコドンである、請求項5に記載の昆虫細胞。
- 第2のヌクレオチド配列中の共通アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列中のコドンの少なくとも50%が、第2のヌクレオチド配列のAT又はGC含量を最大化するように、第1のヌクレオチド配列中の対応するコドンと比べて変化している、請求項1から5までのいずれか一項に記載の昆虫細胞。
- 第1と第2のヌクレオチド配列が核酸構築物の一部であり、第1と第2のヌクレオチド配列がそれぞれ昆虫細胞での発現のための発現制御配列に作動可能に連結されている、請求項1から7までのいずれか一項に記載の昆虫細胞。
- 第1と第2のヌクレオチド配列が単一の核酸構築物の一部である、請求項8に記載の昆虫細胞。
- パルボウイルスRepタンパク質がアデノ随伴ウイルス(AAV)Repタンパク質である、請求項1から9までのいずれか一項に記載の昆虫細胞。
- 第1と第2のヌクレオチド配列にコードされているパルボウイルスRepタンパク質が同一の血清型である、請求項10に記載の昆虫細胞。
- 第1のヌクレオチド配列がパルボウイルスRep52タンパク質をコードし、
a)配列番号6のアミノ酸配列に少なくとも50%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
b)配列番号1〜5及び10のいずれか1つのヌクレオチド配列に少なくとも50%の配列同一性を有するヌクレオチド配列、
c)その相補鎖が(a)又は(b)の核酸分子配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列、並びに
d)その配列が遺伝コードの縮重により(c)の核酸分子の配列とは異なるヌクレオチド配列
からなる群から選択され、第2のヌクレオチド配列がパルボウイルスRep78タンパク質をコードし、
a)配列番号8のアミノ酸配列に少なくとも50%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
b)配列番号7の11〜1876位のヌクレオチド配列に少なくとも50%の配列同一性を有するヌクレオチド配列、
c)その相補鎖が(a)又は(b)の核酸分子配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列、
d)その配列が遺伝コードの縮重により(c)の核酸分子の配列とは異なるヌクレオチド配列
からなる群から選択される、請求項1から11までのいずれか一項に記載の昆虫細胞。 - a)少なくとも1つのパルボウイルス逆方向末端反復(ITR)ヌクレオチド配列を含む第3のヌクレオチド配列と、
b)昆虫細胞での発現のための発現制御配列に作動可能に連結されたパルボウイルスカプシドタンパク質コード配列を含む第4のヌクレオチド配列と
をさらに含む、請求項1から12までのいずれか一項に記載の昆虫細胞。 - 第1、第2、第3及び第4のヌクレオチド配列のうち1つ又は複数が、昆虫細胞適合性ベクター、好ましくはバキュロウイルスベクターである核酸構築物の一部である、請求項13に記載の昆虫細胞。
- 第3のヌクレオチド配列が、対象の遺伝子産物をコードする少なくとも1つのヌクレオチド配列をさらに含み、対象の遺伝子産物をコードする前記少なくとも1つのヌクレオチド配列が昆虫細胞で産生されるパルボウイルスベクターのゲノムに組み込まれる、請求項13又は14に記載の昆虫細胞。
- 第3のヌクレオチド配列が、2つのパルボウイルスITRヌクレオチド配列を含み、対象の遺伝子産物をコードする少なくとも1つのヌクレオチド配列が前記2つのパルボウイルスITRヌクレオチド配列の間に位置している、請求項15に記載の昆虫細胞。
- 第1、第2、第3及び第4のヌクレオチド配列の少なくとも1つが昆虫細胞のゲノムに安定的に組み込まれている、請求項13から16までのいずれか一項に記載の昆虫細胞。
- パルボウイルスがAAVである、請求項13から17までのいずれか一項に記載の昆虫細胞。
- 昆虫細胞において組換えパルボウイルスビリオンを産生するための方法であって、
a)請求項13から18までのいずれか一項に記載の昆虫細胞を、組換えパルボウイルスビリオンが産生されるような条件下で培養する段階と、
b)前記組換えパルボウイルスビリオンの回収と
を含む方法。 - 固定化抗パルボウイルス抗体、好ましくは一本鎖ラクダ科動物抗体又はそのフラグメントを使用した前記ビリオンのアフィニティー精製の段階をさらに含む、請求項19に記載の方法。
- 前記組換えパルボウイルスビリオンが組換えAAVビリオンである、請求項19又は20に記載の方法。
- 請求項1から12までのいずれか一項に記載の第1と第2のヌクレオチド配列を含む核酸構築物。
- 昆虫細胞において組換えパルボウイルスビリオンを産生するための方法であって、
a)組換えパルボウイルス(rAAV)ベクターが産生されるような条件下で昆虫細胞を培養する段階であって、昆虫細胞が、パルボウイルスRep78又は68タンパク質及びパルボウイルスRep52又は40タンパク質の発現のための少なくとも1つの核酸構築物を含み、請求項13から18までに記載の第3と第4のヌクレオチド配列をさらに含み、パルボウイルスRep78又は68タンパク質及びパルボウイルスRep52又は40タンパク質の発現のための少なくとも1つの核酸構築物が昆虫細胞において10:1よりも高いRep52又は40タンパク質のRep78又は68タンパク質に対するモル比を生じさせる段階と、
(b)前記組換えパルボウイルス(rAAV)ベクターの回収と
を含む方法。 - パルボウイルスRep78又は68タンパク質及びパルボウイルスRep52又は40タンパク質の発現のための核酸構築物が、パルボウイルスRep78又は68とパルボウイルスRep52又は40タンパク質の両方の発現のための単一コード配列を含む核酸構築物であり、前記コード配列が以下の特徴:
a)パルボウイルスRep78又は68タンパク質の翻訳のための開始コドンが、昆虫細胞で発現すると部分的エキソンスキッピングをもたらす開始コドンであること;
b)Rep78又は68及びRep52又は40タンパク質の翻訳開始点間に存在するATG配列の1つ、複数又はすべてが除去されていること;
c)Rep52又は40タンパク質の翻訳開始コドンのコンテキストが、鱗翅目細胞中における有効な翻訳開始に最適な開始コンテキストの5’−NNNNNNAUGAa/c/gN−3’に従って最適化されていること;
d)配列番号9の9ヌクレオチドの配列又は配列番号9に実質的に相同なヌクレオチド配列を含む発現制御配列が、Rep52又は40タンパク質の開始コドンの上流に存在すること;並びに
e)Rep52又は40タンパク質をコードするコード配列の一部が、Rep78/68及びRep52/40タンパク質の翻訳開始点間のコード配列の一部と比べて昆虫細胞のための改良されたコドン使用バイアスを有すること
のうち1つ又は複数を含む、請求項23に記載の方法。 - 昆虫が、昆虫細胞においてコード配列の発現を推進するプロモーターに作動可能に連結されているパルボウイルスRep52又は40タンパク質の追加のコード配列を含み、パルボウイルスRep52又は40タンパク質のコード配列が以下の特徴:
a)Rep78又は68タンパク質コード配列のプロモーターと比べてより強力なRep52又は40タンパク質コード配列のプロモーター;
b)Rep78又は68タンパク質コード配列のコピー数と比べてより高いRep52又は40タンパク質コード配列のコピー数;
c)昆虫細胞での発現のためのRep52又は40タンパク質コード配列の改良されたコドン使用バイアス;
d)Rep52又は40タンパク質の翻訳開始コドンのコンテキストが、鱗翅目(lepidopteran)細胞中における有効な翻訳開始に最適な開始コンテキストの5’−NNNNNNAUGAa/c/gN−3’に従って最適化されていること;並びに
d)配列番号9の9ヌクレオチドの配列又は配列番号9に実質的に相同なヌクレオチド配列を含む発現制御配列が、Rep52又は40タンパク質の開始コドンの上流に存在すること
のうち1つ又は複数を含む、請求項23又は24に記載の方法。
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