CN113383010A - 具有经工程化改造的启动子的共济蛋白表达构建体及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及用于在体外和/或体内改变，例如增强共济蛋白(FXN)的表达的组合物和方法，包括但不限于经工程化改造的启动子的开发。此类组合物包括通过施用腺相关病毒(AAV)颗粒来递送。本公开的组合物和方法用于治疗诊断患有或怀疑患有由共济蛋白的量和/或功能缺乏引起的或与共济蛋白降低的表达或蛋白质水平有关的弗里德里希共济失调(Friedreich’s Ataxia)或另一种神经肌肉或神经性病况的受试者。

Description

具有经工程化改造的启动子的共济蛋白表达构建体及其使用 方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2018年9月28日提交的题为“共济蛋白组合物及其使用方法”的美国临时专利申请号62/738,519，以及于2019年9月17日提交的题为“具有经工程化改造的启动子的共济蛋白表达构建体及其使用方法”的美国临时专利申请号62/901,769的权益，其内容通过引用整体并入本文。
参考序列表
本申请与电子格式的序列表一起提交。序列表文件名为20571019PCTSEQLST.txt，所述文件创建于2019年9月27日，且大小为6,732,273字节。序列表的电子格式信息通过引用整体并入本文。
发明领域
本发明涉及基于共济蛋白的组合物和方法，所述组合物和方法涉及至少部分地通过采用新型经工程化改造的启动子来增强体外或体内共济蛋白(FXN)的表达。此类基于共济蛋白的组合物可以在腺相关病毒(AAV)载体中递送。在其他实施方案中，基于共济蛋白的组合物，诸如AAV-共济蛋白组合物，用于治疗需要其的受试者，诸如诊断患有由共济蛋白的量和/或功能不足引起的弗里德里希氏共济失调(Friedreich’s Ataxia)或其他神经性病况的人类受试者，或作为此类疾病或病况的细胞或动物模型中研究疾病或病况的研究工具。
背景技术
由德国医师尼古拉斯·弗里德里希(Nikolas Friedreich)在1860年代首次描述的弗里德里希氏共济失调是导致神经系统进行性损害的一种常染色体隐性遗传疾病。参见Parkinson等人,Journal of Neurochemistry,2013,126(Suppl.1),103-117,其内容通过引用整体并入本文。发病通常发生在青春期，并且几乎总是在25岁时。参见Campuzano等人,Science,271.5254(1996年3月8日):1423,其内容通过引用整体并入本文。FA通常是由于指导手臂和腿部肌肉运动的感觉神经元(通过与小脑的连接)中的线粒体蛋白共济蛋白(FXN)的减少的表达而导致的脊髓中神经组织变性引起的。参见Koeppen,Arnulf；J NeurolSci.,2011,April 15；303(1-2):1–12,其内容通过引用整体并入本文。脊髓变薄，周围神经细胞失去它们的髓鞘(myelin sheath)的部分，所述髓鞘是在某些神经细胞上的绝缘覆盖物，其有助于进行神经冲动。FA的最初症状包括协调不力，诸如步态障碍、平衡不佳、腿部无力、行走减慢、协调性受损、构音障碍(dysarthria)、眼球震颤(nystagmus)、感觉受损、脊柱后侧凸(kyphoscoliosis)和足部畸形。参见Parkinson等人,Journal of Neurochemistry,2013,126(Suppl.1),103-117。FA也与脊柱侧弯、心脏病和糖尿病有关。该疾病通常会进展直到需要轮椅用于行动。高加索人人群中FA的发病率在20,000人中约1人到50,000人中约1人之间，在欧洲人群中推算出的载体频率在120人中约1人。参见Nageshwaran和Festenstein,Frontiers in Neurology,第6卷,Art.262(2015)；Campuzano等人,Science,271.5254(1996年3月8日):1423，其内容通过引用整体并入本文。
FXN基因中固有的GAA三联重复(triplet repeat)的扩展是导致FA的共济蛋白表达减少的的遗传原因。参见Parkinson等人，Journal of Neurochemistry,2013,126(Suppl.1),103-117。随着时间的推移，缺乏导致前述症状，以及由于对细胞代谢的影响而导致的频繁疲劳。
硬化和变性最常见于背根神经节(dorsal root ganglia)、脊髓小脑束(spinocerebellar tract)、皮质脊髓侧束(lateral corticospinal tract)和后柱(posterior column)。参见Sandi等，Frontiers in Genetics,第5卷,Art.165(June2014),其内容通过引用整体并入本文。
背根神经节的进行性破坏会导致背根变薄、背柱变性、克拉克氏柱(Clarke′scolumn)和背脊髓小脑纤维(dorsal spinocerebellar fiber)中的神经细胞的跨突触萎缩(trans-synaptic atrophy)、薄束(gracile)和楔束核(cuneate nuclei)的萎缩以及感觉神经的神经病变。参见Koeppen,Arnulf；J Neurol Sci.,2011,4月15日；303(1-2):1–12，其内容通过引用整体并入本文。齿状核的病变由大的谷氨酸能神经元的进行性和选择性萎缩，以及含有γ-氨基丁酸(GABA)的皮质核突触末端的凝块变性(grumose degeneration)组成。小的GABA能神经元及其在齿状橄榄束(dentato-olivary tract)中的投射纤维得以幸存。Betz细胞和皮质脊髓束的萎缩构成了第二病变。目前，对于FA尚无有效的治疗，并且通常仅对患者进行症状管理的监测。
因此，在本领域中仍然存在开发用于治疗FXN相关病症以及减轻患有FA的患者中蛋白质缺乏的药物组合物和方法的长期的需求。
腺相关病毒(AAV)已经成为最广泛研究和利用的用于将治疗有效的多肽递送至哺乳动物细胞的病毒颗粒之一。参见，例如，Tratschin等人,Mol.Cell Biol.,5(11):3251-3260(1985)和Grimm等人,Hum.Gene Ther.,10(15):2445-2450(1999)，其内容通过引用整体并入本文。这样，这种方式非常适用于开发对于FA的治疗以及共济蛋白和共济蛋白相关的蛋白质和肽的递送。
发明概述
在一些方面，本公开提供了包含至少一个反向末端重复(ITR)和有效载荷区(payload region)的AAV病毒基因组，其中有效载荷区编码共济蛋白。在一些实施方案中，AAV病毒基因组包含5′ITR、经工程化改造的启动子、有效载荷区和3′ITR。编码的共济蛋白可以是人类(智人)共济蛋白、猕猴(cynomolgus monkey)(食蟹猴(Macaca fascicularis))共济蛋白或普通猕猴(rhesus monkey)(恒河猴(Macaca mulatta))共济蛋白、合成的(非天然存在的)共济蛋白或其衍生物，例如，保留了野生型共济蛋白的一个或多个功能的变体。在一些实施方案中，共济蛋白可以至少部分被人源化。
AAV病毒基因组的经工程化改造的启动子源自巨细胞病毒(CMV)启动子、鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子或共济蛋白(FXN)启动子。在一些实施方案中，经工程化改造的启动子是启动子变体或亲本启动子序列的衍生物。
在一些实施方案中，经工程化改造的启动子源自CMV启动子。
在一些实施方案中，经工程化改造的启动子源自CBA启动子。
在一些实施方案中，经工程化改造的启动子源自FXN启动子。
如本文所述的AAV病毒基因组的经工程化改造的启动子可以包含如SEQ ID NO:1734-1777中的任意一个所给出的序列。在一些实施方案中，经工程化改造的启动子包含与SEQ ID NO：1734-1777中的任意一个具有至少90％序列同一性的序列。在一些实施方案中，经工程化改造的启动子包含与SEQ ID NO：1734-1777中的任意一个具有至少95％序列同一性的序列。在一些实施方案中，经工程化改造的启动子包含与SEQ ID NO：1734-1777中的任意一个具有至少99％序列同一性的序列。在一些实施方案中，经工程化改造的启动子可以由SEQ ID NO：1734-1777中的任意一个组成。在一些实施方案中，经工程化改造的启动子源自CMV启动子，并且可以包含如SEQ ID NO:1743-1751、1767和1772-1774中的任意一个所给出的序列。在一些实施方案中，经工程化改造的启动子包含SEQ ID NO:1777。在一些实施方案中，经工程化改造的启动子源自CBA启动子，并且可以包含如SEQ ID NO：1734-1742、1760-1766、1768和1775-1776中的任意一个所给出的序列。在一些实施方案中，经工程化改造的启动子源自FXN启动子，并且可以包含如SEQ ID NO:1752-1759和1769-1770中的任意一个所给出的序列。
在一些实施方案中，经工程化改造的启动子包含如SEQ ID NO:1738所给出的序列。在一些实施方案中，经工程化改造的启动子包含与SEQ ID NO:1738具有至少90％序列同一性的序列。在一些实施方案中，经工程化改造的启动子包含与SEQ ID NO：1738具有至少95％序列同一性的序列。在一些实施方案中，经工程化改造的启动子包含与SEQ ID NO：1738具有至少99％序列同一性的序列。在一些实施方案中，经工程化改造的启动子由SEQID NO:1738组成。
在一些实施方案中，经工程化改造的启动子包含如SEQ ID NO:1740所给出的序列。在一些实施方案中，经工程化改造的启动子包含与SEQ ID NO:1740具有至少90％序列同一性的序列。在一些实施方案中，经工程化改造的启动子包含与SEQ ID NO:1740具有至少95％序列同一性的序列。在一些实施方案中，经工程化改造的启动子包含与SEQ ID NO：1740具有至少99％序列同一性的序列。在一些实施方案中，经工程化改造的启动子由SEQID NO：1740组成。
在一些实施方案中，经工程化改造的启动子包含如SEQ ID NO:1742所给出的序列。在一些实施方案中，经工程化改造的启动子包含与SEQ ID NO:1742具有至少90％序列同一性的序列。在一些实施方案中，经工程化改造的启动子包含与SEQ ID NO:1742具有至少95％序列同一性的序列。在一些实施方案中，经工程化改造的启动子包含与SEQ ID NO:1742具有至少99％序列同一性的序列。在一些实施方案中，经工程化改造的启动子由SEQID NO：1742组成。
在一些实施方案中，经工程化改造的启动子包含如SEQ ID NO:1750所给出的序列。在一些实施方案中，经工程化改造的启动子包含与SEQ ID NO:1750具有至少90％序列同一性的序列。在一些实施方案中，经工程化改造的启动子包含与SEQ ID NO:1750具有至少95％序列同一性的序列。在一些实施方案中，经工程化改造的启动子包含与SEQ ID NO:1750具有至少99％序列同一性的序列。在一些实施方案中，经工程化改造的启动子由SEQID NO:1750组成。
在一些实施方案中，经工程化改造的启动子包含如SEQ ID NO:1756所给出的序列。在一些实施方案中，经工程化改造的启动子包含与SEQ ID NO:1756具有至少90％序列同一性的序列。在一些实施方案中，经工程化改造的启动子包含与SEQ ID NO:1756具有至少95％序列同一性的序列。在一些实施方案中，经工程化改造的启动子包含与SEQ ID NO：1756具有至少99％序列同一性的序列。在一些实施方案中，经工程化改造的启动子由SEQID NO：1756组成。
如本文所述的经工程化改造的启动子，可以具有50-1400个核苷酸(nt)的长度。在一些实施方案中，经工程化改造的启动子源自CMV启动子且长度为50-700nt。在一些实施方案中，经工程化改造的启动子源自CMV启动子且长度为109nt。在一些实施方案中，经工程化改造的启动子源自CBA启动子且长度为100-700nt。在一些实施方案中，经工程化改造的启动子源自CBA启动子且长度为100-400nt。在一些实施方案中，经工程化改造的启动子源自CBA启动子且长度为100nt。在一些实施方案中，经工程化改造的启动子源自CBA启动子且长度为200-350nt。在一些实施方案中，经工程化改造的启动子源自CBA启动子且长度为260nt。在一些实施方案中，经工程化改造的启动子源自CBA启动子且长度为332nt。在一些实施方案中，经工程化改造的启动子源自FXN启动子且长度为200-1400nt。在一些实施方案中，经工程化改造的启动子长度为950-1150nt。在一些实施方案中，经工程化改造的启动子源自FXN启动子且长度为1060nt。
在一些实施方案中，经工程化改造的启动子包含增强子区。
可以将经工程化改造的启动子和编码共济蛋白的有效载荷区掺入AAV病毒基因组中。
在一些实施方案中，除了经工程化改造的启动子和有效载荷区之外，AAV病毒基因组包含5′ITR、增强子、内含子、至少一个miR结合位点(例如，一个、两个或三个miR结合位点)、polyA序列、填充物序列和3′ITR。在一些实施方案中，病毒基因组包含多个miR结合位点(“miR结合位点系列”)，其可以连续出现或被一个或多个核苷酸隔开。在一些实施方案中，5′ITR和/或3′ITR是AAV2 ITR。
在一些实施方案中，病毒基因组包含至少一个ITR序列。在一些实施方案中，ITR可以是AAV2 ITR。在一些实施方案中，5′ITR可以是AAV2 ITR。在一些实施方案中，3′ITR可以是AAV2 ITR。在一些实施方案中，5'ITR和/或3'ITR长度可以是141nt。在一些实施方案中，5'ITR包含与SEQ ID NO:1811至少95％、至少99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，3′ITR包含与SEQ ID NO:1812至少95％、至少99％或100％同一性的序列。
在一些实施方案中，ITR至ITR的序列包含内含子/外显子区域。在一些实施方案中，内含子/外显子区域可以是增强子序列。作为非限制性实例，增强子序列可包含两个或更多个亚组分，诸如但不限于ie1外显子(例如，外显子1)、ie1内含子(例如，内含子1)、人类β-珠蛋白内含子(例如，内含子2)和/或人类β珠蛋白外显子(例如，外显子3)或其片段。在一些实施方案中，内含子/外显子区域包含与如SEQ ID NO：1815-1821中的任意一个所给出的序列至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，增强子包含与如SEQ ID NO：1815-1821中的任意一个所给出的序列至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，增强子包含与SEQ ID NO:1777至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，内含子/外显子区域包含一个或多个人类β-球蛋白序列，例如，与SEQ ID NO：1820和/或1821至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，内含子可以包含如SEQ ID NO:1815-1821中的任意一个所给出的序列。在一些实施方案中，内含子具有与SEQ ID NO:1816至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，内含子可以由SEQ ID NO：1816组成。
在一些实施方案中，miR结合位点系列包含至少一个miR122结合位点序列。在一些实施方案中，至少一个miR122结合位点包含与SEQ ID NO:1827至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，至少一个miR122结合位点由SEQ ID NO：1827组成。在一些实施方案中，AAV载体基因组包含三个拷贝的miR122结合位点，例如，三个拷贝的SEQ ID NO：1827或具有至少90％序列同一性的其变体。在一些实施方案中，miR结合位点系列可以包含与SEQ ID NO:1826具有至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，miR结合位点系列可以由SEQ ID NO:1826组成。
在一些实施方案中，polyA序列是人类生长激素(hGH)polyA序列。在一些实施方案中，病毒基因组包含与SEQ ID NO:1828至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的hGHpolyA序列。在一些实施方案中，polyA序列由SEQ ID NO:1828组成。
在一些实施方案中，AAV病毒基因组进一步包含填充物序列，例如，白蛋白填充物序列。在一些实施方案中，填充物序列可以包含与如SEQ ID NO:1829-1842中的任意一个所给出的序列至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，填充物序列可以包含与SEQ ID NO：1838至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，填充物序列可以由SEQ ID NO：1838组成。在一些实施方案中，填充物序列可以包含与SEQ ID NO：1839至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，填充物序列可以由SEQ ID NO:1839组成。在一些实施方案中，填充物序列可以包含与SEQ ID NO：1840至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，填充物序列可以由SEQ ID NO:1840组成。在一些实施方案中，填充物序列可以包含与SEQ ID NO:1841至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，填充物序列可以由SEQ ID NO：1841组成。
在一些实施方案中，AAV病毒基因组可以包含如SEQ ID NO：1778-1810中的任意一个所给出的序列。在一些实施方案中，AAV病毒基因组包含与SEQ ID NO：1778-1810中的任意一个具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％序列同一性的序列。在一些实施方案中，AAV病毒基因组包含与SEQ ID NO:1778-1810中的任意一个具有80-85％、80-90％、80-95％、80-99％、80-100％、90-95％、90-99％或90-100％序列同一性的序列。其中编码的共济蛋白是食蟹猴(Cynomolgus sp.)共济蛋白的AAV病毒基因组可以包含如SEQID NO：1778-1795中的任意一个所给出的序列。在一些实施方案中，AAV病毒基因组包含与SEQ ID NO:1778-1795中的任意一个具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％序列同一性的序列。在一些实施方案中，AAV病毒基因组包含与SEQ ID NO:1778-1795中的任意一个具有80-85％、80-90％、80-95％、80-99％、80-100％、90-95％、90-99％或90-100％序列同一性的序列。其中编码的共济蛋白是人类共济蛋白的AAV病毒基因组可以包含如SEQ ID NO:1796-1810中的任意一个所给出的序列。在一些实施方案中，AAV病毒基因组包含与SEQ ID NO:1796-1810中的任意一个具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％序列同一性的序列。在一些实施方案中，AAV病毒基因组包含与SEQ ID NO:1796-1810中的任意一个具有80-85％、80-90％、80-95％、80-99％、80-100％、90-95％、90-99％或90-100％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，AAV病毒基因组可以包含与SEQ ID NO:1797至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，AAV病毒基因组可以由SEQ IDNO：1797组成。在一些实施方案中，AAV病毒基因组可以包含与SEQ ID NO:1801至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，AAV病毒基因组可以由SEQ IDNO:1801组成。在一些实施方案中，AAV病毒基因组可以包含与SEQ ID NO:1808至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，AAV病毒基因组可以由SEQ IDNO：1808组成。在一些实施方案中，AAV病毒基因组可以包含与SEQ ID NO：1809至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，AAV病毒基因组可以由SEQ IDNO:1809组成。
在一些实施方案中，编码共济蛋白的AAV载体基因组的有效载荷区包含与如SEQID NO:1822-1824中的任意一个所给出的序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，编码共济蛋白的AAV载体基因组的有效载荷区包含如SEQ ID NO：1822-1824中的任意一个所给出的核酸序列。在一些实施方案中，编码共济蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:1822。在一些实施方案中，编码共济蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:1823。在一些实施方案中，编码共济蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO：1824。在一些实施方案中，编码共济蛋白的核酸序列包含其中具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％序列同一性的SEQ ID NO:1728、1729或1730的片段或其变体。在一些实施方案中，编码共济蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:1728的片段。在一些实施方案中，编码共济蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:1728的的核酸221-853。
在一些实施方案中，AAV载体基因组的有效载荷区包含与SEQ ID NO:1725、1726或1727具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％序列同一性的编码共济蛋白多肽的核酸序列。在一些实施方案中，AAV载体基因组的有效载荷区包含编码SEQ ID NO:1725、1726或1727的共济蛋白多肽的核酸序列。在一些实施方案中，AAV载体基因组包括编码包含SEQ ID NO:1725的共济蛋白多肽的核酸序列。在一些实施方案中，AAV载体基因组的有效载荷区包含与SEQ ID NO:1731、1732或1733具有至少80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的编码共济蛋白多肽的核酸序列。在一些实施方案中，AAV载体基因组的有效载荷区包含编码SEQ ID NO:1731、1732或1733的共济蛋白多肽的核酸序列。
可以将包含经工程化改造的启动子或启动子变体的病毒基因组掺入AAV颗粒中，其中所述AAV颗粒包含病毒基因组和衣壳。在一些实施方案中，衣壳包含如表1所示的序列或选自下组：SEQ ID NO:1-1724。衣壳的非限制性实例包括AAV9、AAV9 K449R、AAVPHP.B、AAVPHP.N、VOY101(具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列和/或具有SEQ ID NO:1722的核酸序列)，和/或VOY201(具有SEQ ID NO：1724的氨基酸序列和/或具有SEQ ID NO:1723的核酸序列)。在一些实施方案中，衣壳由选自SEQ ID NO：4、135、1722和1723的核酸序列编码。在一些实施方案中，衣壳可以具有如SEQ ID NO：1、2、3、9、136或1724中的任意一个所给出的氨基酸序列。在一些实施方案中，衣壳包含如SEQ ID NO：136所给出的氨基酸序列。在一些实施方案中，衣壳包含由如SEQ ID NO:135所给出的核酸序列编码的氨基酸序列。在一些实施方案中，衣壳包含如SEQ ID NO:9所给出的氨基酸序列。在一些实施方案中，衣壳包含如SEQID NO:3所给出的氨基酸序列。在一些实施方案中，衣壳包含由如SEQ ID NO:4所给出的核酸序列编码的氨基酸序列。在一些实施方案中，衣壳包含如SEQ ID NO:2所给出的氨基酸序列。在一些实施方案中，衣壳包含如SEQ ID NO：1所给出的氨基酸序列。在一些实施方案中，衣壳包含由如SEQ ID NO：1722所给出的核酸序列编码的氨基酸序列。在一些实施方案中，衣壳包含由如SEQ ID NO：1723所给出的核酸序列编码的氨基酸序列。在一些实施方案中，衣壳包含如SEQ ID NO:1724所给出的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文所述的AAV颗粒可用于药物组合物中。在一些实施方案中，所述药物组合物包含氯化钠、磷酸钠、氯化钾、磷酸钾和泊洛沙姆188(poloxamer 188)。在一些实施方案中，所述药物组合物所包含192mM氯化钠、10mM磷酸钠、2.7mM氯化钾、2mM磷酸钾和0.001％泊洛沙姆188(v/v)。在一些实施方案中，所述组合物的磷酸钠是二碱价的(dibasic)。在一些实施方案中，所述组合物的磷酸钾是一碱价的(monobasic)。在一些实施方案中，所述药物组合物的pH在7.3-7.7之间。在一些实施方案中，所述药物组合物的pH是7.4。
在一些实施方案中，所述AAV颗粒可以包含如由SEQ ID NO:1797所给出的载体基因组和VOY101衣壳。在一些实施方案中，含有包括由SEQ ID NO:1797给出的载体基因组和VOY101衣壳的AAV颗粒的药物组合物，包含氯化钠、磷酸钠、氯化钾、磷酸钾和泊洛沙姆188；任选地，其中所述药物组合物包含192mM氯化钠、10mM磷酸钠、2.7mM氯化钾、2mM磷酸钾和0.001％泊洛沙姆188(v/v)，并且其中所述组合物的pH为7.4。
在一些实施方案中，所述AAV颗粒可以包含如由SEQ ID NO:1801所给出的载体基因组和VOY101衣壳。在一些实施方案中，含有包括由SEQ ID NO：1801给出的载体基因组和VOY101衣壳的AAV颗粒的药物组合物，包含氯化钠、磷酸钠、氯化钾、磷酸钾和泊洛沙姆188；任选地，其中所述药物组合物包含192mM氯化钠、10mM磷酸钠、2.7mM氯化钾、2mM磷酸钾和0.001％泊洛沙姆188(v/v)，并且其中所述组合物的pH为7.4。
在一些实施方案中，AAV颗粒可以包含由SEQ ID NO:1808给出的载体基因组和VOY101衣壳。在一些实施方案中，含有包括由SEQ ID NO：1808给出的载体基因组和VOY101衣壳的AAV颗粒的药物组合物，包含氯化钠、磷酸钠、氯化钾、磷酸钾和泊洛沙姆188；任选地，其中所述药物组合物包含192mM氯化钠、10mM磷酸钠、2.7mM氯化钾、2mM磷酸钾和0.001％泊洛沙姆188(v/v)，并且其中所述组合物的pH为7.4。
在一些实施方案中，所述AAV颗粒可以包含如由SEQ ID NO:1809所给出的载体基因组和VOY101衣壳。在一些实施方案中，含有包括由SEQ ID NO:1809给出的载体基因组和VOY101衣壳的AAV颗粒的药物组合物，包含氯化钠、磷酸钠、氯化钾、磷酸钾和泊洛沙姆188；任选地，其中所述药物组合物包含192mM氯化钠、10mM磷酸钠、2.7mM氯化钾、2mM磷酸钾和0.001％泊洛沙姆188(v/v)，并且其中所述组合物的pH为7.4。
本公开的药物组合物和/或AAV颗粒可以用于治疗神经性或神经肌肉病症，诸如但不限于弗里德里希氏共济失调。
在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒用于治疗与降低的共济蛋白表达或蛋白质水平相关的病症或病状。在一些实施方案中，与降低的共济蛋白表达或蛋白质水平相关的病症或病状是神经性或神经肌肉病症。在一些实施方案中，与降低的共济蛋白的蛋白质水平相关的病症或病状是FA或共济蛋白缺乏。在一些实施方案中，AAV颗粒的施用可以导致靶细胞中增强的共济蛋白表达至未患与共济蛋白水平降低相关的病症的正常受试者的等同的靶细胞中共济蛋白表达的水平0.5-3倍(0.5-3x)(例如，0.5-1倍、1-1.5倍、1.5-2倍、2-2.5倍、2.5-3倍)的。在一些实施方案中，AAV颗粒的施用可以导致靶细胞中济蛋白表达约5.5-32.8ng/mg蛋白质。
下面阐述本公开的各个方面或实施方案的细节。根据说明书和权利要求书，本公开的其他特征、目的和优点将是显而易见的。在说明书中，单数形式也包括复数，除非上下文另外明确指出。除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。在有冲突的情况下，以本说明书为准。
附图简述
如附图所示，根据本文中呈现的特定实施方案的以下描述，前述和其他目的、特征和优点将变得显而易见。附图不一定按比例绘制，而是将重点放在示出本文所述的各种实施方案的原理上。
图1A展示了显示对于心脏组织，由ELISA测得的共济蛋白表达水平(ng/mg)以及由定量PCR测得的AAV生物分布(VG/DC)的定量结果的图。图1B展示了显示对于小脑组织，由ELISA测得的共济蛋白表达水平(ng/mg)以及由定量PCR测得的AAV生物分布(VG/DC)的定量结果的图。图1C展示了显示对于背根神经节(DRG)，由ELISA测得的共济蛋白表达水平(ng/mg)以及由定量PCR测得的AAV生物分布(VG/DC)的定量结果的图。图1D展示了显示对于肝脏组织，由ELISA测得的共济蛋白表达水平(ng/mg)以及由定量PCR测得的AAV生物分布(VG/DC)的定量结果的图。
图2展示了显示对于本公开的某些启动子构建体，由ELISA测得的纹状体cFXN蛋白水平的定量结果的图。
图3A展示了显示对于腰椎DRG组织，由ELISA测得的共济蛋白表达水平(ng/mg)的定量结果的图。图3B展示了显示对于小脑组织，由ELISA测得的共济蛋白表达水平(ng/mg)的定量结果的图。
图4展示了显示与Pvalb cKO小鼠和野生型(WT)相比，用VOY101-CMV-D7-hFXN或用VOY101-CBA-D8-hFXN AAV颗粒静脉内处理Pvalb cKO动物的肌电图(H波强度)测量值的图。
图5展示了显示与Pvalb cKO小鼠和野生型(WT)相比，用VOY101-CMV-D7-hFXN或用VOY101-CBA-D8-hFXN AAV颗粒静脉内处理的Pvalb cKO小鼠，通过缺口杆试验(notched-bar test)的行为分析的图。
图6A展示了显示对于本公开的某些DRG组织，由ELISA测得的共济蛋白表达水平(ng/mg)的定量结果的图。图6B展示了图6A中对于具有SEQ ID NO:1808的hFXN13(CBA.D4)、具有SEQ ID NO:1809的hFXN14(CBA.D6)和具有SEQ ID NO:1797的hFXN2(CBA.D8)的定量结果的展开图。
图6C展示了显示对于本公开的某些心脏心室组织，由ELISA测得的共济蛋白表达水平(ng/mg)的定量结果的图。图6D展示了图6C中对于具有SEQ ID NO:1808的hFXN13(CBA.D4)、具有SEQ ID NO:1809的hFXN14(CBA.D6)和具有SEQ ID NO:1797的hFXN2(CBA.D8)的定量结果的展开图。
图7展示了显示对于本公开的启动子构建体，由萤光素酶表达(FXN：萤光素酶比率)测得的共济蛋白表达水平的定量结果的图。
发明详述
I.组合物
腺相关病毒(AAV)载体
细小病毒科家族(Parvoviridae family)的病毒是小的无包膜二十面体衣壳病毒，其特征是单链DNA基因组。细小病毒科家族病毒由两个亚家族组成：感染脊椎动物的细小病毒亚科(Parvovirinae)，以及感染无脊椎动物的浓病毒亚科(Densovirinae)。由于可以用标准分子生物学技术操作相对简单的结构，该病毒家族可以用作生物学工具。可以修饰病毒的基因组以含有用于组装功能性重组病毒或病毒颗粒的最少成分，所述功能性重组病毒或病毒颗粒装载有或经工程化改造以表达或递送所需的核酸构建体或有效载荷，例如，转基因、编码多肽的多核苷酸或FXN，其可以递送至靶细胞、组织或生物体。在一些实施方案中，靶细胞是CNS细胞。在一些实施方案中，靶组织是CNS组织。
细小病毒和细小病毒科家族的其他成员通常在Kenneth I.Berns,“Parvoviridae:The Viruses and Their Replication,”FIELDS VIROLOGY(第3版，1996)第69章中进行描述，其内容通过引用以其整体并入本文。
细小病毒科家族包含依赖病毒属(Dependovirus genus)，所述依赖病毒属包括能够在脊椎动物宿主中复制的腺相关病毒(AAV)，所述脊椎动物宿主包括但不限于人类、灵长类、牛、犬、马和绵羊物种。
腺相关病毒(AAV)是一种依赖的细小病毒(像其他细小病毒一样)，是一种单链无包膜DNA病毒，其具有长度为约5000个核苷酸的基因组，且所述基因组含有编码负责复制的蛋白质(Rep)和衣壳的结构蛋白(Cap)的两个开放阅读框。开放阅读框的侧翼为两个反向末端重复(ITR)序列，其充当病毒基因组的复制起点。野生型AAV病毒基因组包含两个开放阅读框的核苷酸序列，一个用于四种非结构Rep蛋白(由Rep基因编码的Rep78、Rep68、Rep52、Rep40)，一个用于三种衣壳或结构蛋白(由衣壳基因或Cap基因编码的VP1、VP2、VP3)。Rep蛋白对于复制和包装是重要的，而衣壳蛋白则被组装以产生AAV的蛋白壳或AAV衣壳。可变剪接和可选的起始密码子和启动子导致从单个开放阅读框产生四种不同的Rep蛋白，且从单个开放阅读框产生三种衣壳蛋白。尽管其随AAV血清型而变化，但作为非限制性实例，对于AAV9/hu.14(US 7,906,111的SEQ ID NO:123，其内容通过引用以其整体并入本文)，VP1是指氨基酸1-736，VP2是指氨基酸138-736，且VP3是指氨基酸203-736。换句话说，VP1是全长衣壳序列，而VP2和VP3是整体的较短组分。结果，VP3区域中序列的变化也是VP1和VP2的变化，然而，与亲本序列相比的百分比差异对于VP3将是最大的，因为它是三个序列中最短的序列。尽管在此关于氨基酸序列进行了描述，但是可以类似地描述编码这些蛋白质的核酸序列。这三个衣壳蛋白一起组装产生AAV衣壳蛋白。尽管不希望受到理论的束缚，但AAV衣壳蛋白通常包含VP1:VP2:VP3的1:1:10的摩尔比。如本文所用，“AAV血清型”主要由AAV衣壳定义。在一些情况下，ITR还通过AAV血清型(例如，AAV2/9)具体描述。
AAV载体通常需要共同辅助者(co-helper)(例如，腺病毒)以在受感染的细胞中进行产生性感染。在不存在此类辅助功能的情况下，AAV病毒粒子实际上会进入宿主细胞，但不会整合到细胞的基因组中。如本文所用，术语“AAV载体”或“AAV颗粒”包含衣壳和包含多核苷酸有效载荷的病毒基因组。如本文所用，“有效载荷”或“有效载荷区”是指由病毒基因组或此类多核苷酸或多核苷酸区域的表达产物编码的或在其内的一个或多个多核苷酸或多核苷酸区域，例如转基因，编码多肽或多个多肽的多核苷酸，例如FXN。
由于几种独特的特征，已经对AAV载体进行了研究以用于递送。特征的非限制性实例包括：(i)感染分裂细胞和非分裂细胞的能力；(ii)感染的广泛的宿主范围，包括人类细胞在内；(iii)野生型AAV尚未与任何疾病相关，也未显示可在受感染的细胞中复制；(iv)缺乏针对载体的细胞介导的免疫反应，以及(v)在宿主染色体中的非整合性质，从而降低了长期遗传改变的可能性。而且，用AAV载体感染对改变细胞基因表达的模式具有最小影响(Stilwell和Samulski等人，Biotechniques,2003,34,148，其内容通过引用以其整体并入本文)。
通常，用于FXN递送的AAV载体可以是复制缺陷的重组病毒载体，因为在病毒基因组内它们缺乏编码功能性Rep和Cap蛋白的序列。在某些情况下，缺陷的AAV载体可能缺乏大多数或全部编码序列，并且实际上仅含有一个或两个AAV ITR序列和一个有效载荷序列。在某些实施方案中，病毒基因组编码FXN。例如，病毒基因组编码人类FXN。
在一个实施方案中，本公开的AAV颗粒可以引入哺乳动物细胞中。
可以修饰AAV载体以增强递送效率。可以有效地包装本公开的此类经修饰的AAV载体，并且可以将其用于成功地以高频率和最小的毒性感染靶细胞。
在其他实施方案中，本公开的AAV颗粒可用于将FXN递送至中枢神经系统(参见，例如，美国专利号6,180,613；其内容通过引用以其整体并入本文)。
AAV血清型
本公开的AAV颗粒可以包含或源自任何天然或重组AAV血清型。根据本公开，AAV颗粒可以利用或基于血清型或包括选自以下任一种的肽：VOY101、VOY201、AAV9、AAV9 K449R、AAVPHP.B(PHP.B)、AAVPHP.A(PHP.A)、AAVG2B-26、AAVG2B-13、AAVTH1.1-32、AAVTH1.1-35、AAVPHP.B2(PHP.B2)、AAVPHP.B3(PHP.B3)、AAVPHP.N/PHP.B-DGT、AAVPHP.B-EST、AAVPHP.B-GGT、AAVPHP.B-ATP、AAVPHP.B-ATT-T、AAVPHP.B-DGT-T、AAVPHP.B-GGT-T、AAVPHP.B-SGS、AAVPHP.B-AQP、AAVPHP.B-QQP、AAVPHP.B-SNP(3)、AAVPHP.B-SNP、AAVPHP.B-QGT、AAVPHP.B-NQT、AAVPHP.B-EGS、AAVPHP.B-SGN、AAVPHP.B-EGT、AAVPHP.B-DST、AAVPHP.B-DST、AAVPHP.B-STP、AAVPHP.B-PQP、AAVPHP.B-SQP、AAVPHP.B-QLP、AAVPHP.B-TMP、AAVPHP.B-TTP、AAVPHP.S/G2A12、AAVG2A15/G2A3(G2A3)、AAVG2B4(G2B4)、AAVG2B5(G2B5)、PHP.S、AAV1、AAV2、AAV2G9、AAV3、AAV3a、AAV3b、AAV3-3、AAV4、AAV4-4、AAV5、AAV6、AAV6.1、AAV6.2、AAV6.1.2、AAV7、AAV7.2、AAV8、AAV9、AAV9.11、AAV9.13、AAV9.16、AAV9.24、AAV9.45、AAV9.47、AAV9.61、AAV9.68、AAV9.84、AAV9.9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV16.3、AAV24.1、AAV27.3、AAV42.12、AAV42-1b、AAV42-2、AAV42-3a、AAV42-3b、AAV42-4、AAV42-5a、AAV42-5b、AAV42-6b、AAV42-8、AAV42-10、AAV42-11、AAV42-12、AAV42-13、AAV42-15、AAV42-aa、AAV43-1、AAV43-12、AAV43-20、AAV43-21、AAV43-23、AAV43-25、AAV43-5、AAV44.1、AAV44.2、AAV44.5、AAV223.1、AAV223.2、AAV223.4、AAV223.5、AAV223.6、AAV223.7、AAV1-7/rh.48、AAV1-8/rh.49、AAV2-15/rh.62、AAV2-3/rh.61、AAV2-4/rh.50、AAV2-5/rh.51、AAV3.1/hu.6、AAV3.1/hu.9、AAV3-9/rh.52、AAV3-11/rh.53、AAV4-8/r11.64、AAV4-9/rh.54、AAV4-19/rh.55、AAV5-3/rh.57、AAV5-22/rh.58、AAV7.3/hu.7、AAV16.8/hu.10、AAV16.12/hu.11、AAV29.3/bb.1、AAV29.5/bb.2、AAV106.1/hu.37、AAV114.3/hu.40、AAV127.2/hu.41、AAV127.5/hu.42、AAV128.3/hu.44、AAV130.4/hu.48、AAV145.1/hu.53、AAV145.5/hu.54、AAV145.6/hu.55、AAV161.10/hu.60、AAV161.6/hu.61、AAV33.12/hu.17、AAV33.4/hu.15、AAV33.8/hu.16、AAV52/hu.19、AAV52.1/hu.20、AAV58.2/hu.25、AAVA3.3、AAVA3.4、AAVA3.5、AAVA3.7、AAVC1、AAVC2、AAVC5、AAV-DJ、AAV-DJ8、AAVF3、AAVF5、AAVH2、AAVrh.72、AAVhu.8、AAVrh.68、AAVrh.70、AAVpi.1、AAVpi.3、AAVpi.2、AAVrh.60、AAVrh.44、AAVrh.65、AAVrh.55、AAVrh.47、AAVrh.69、AAVrh.45、AAVrh.59、AAVhu.12、AAVH6、AAVLK03、AAVH-1/hu.1、AAVH-5/hu.3、AAVLG-10/rh.40、AAVLG-4/rh.38、AAVLG-9/hu.39、AAVN721-8/rh.43、AAVCh.5、AAVCh.5R1、AAVcy.2、AAVcy.3、AAVcy.4、AAVcy.5、AAVCy.5R1、AAVCy.5R2、AAVCy.5R3、AAVCy.5R4、AAVcy.6、AAVhu.1、AAVhu.2、AAVhu.3、AAVhu.4、AAVhu.5、AAVhu.6、AAVhu.7、AAVhu.9、AAVhu.10、AAVhu.11、AAVhu.13、AAVhu.15、AAVhu.16、AAVhu.17、AAVhu.18、AAVhu.20、AAVhu.21、AAVhu.22、AAVhu.23.2、AAVhu.24、AAVhu.25、AAVhu.27、AAVhu.28、AAVhu.29、AAVhu.29R、AAVhu.31、AAVhu.32、AAVhu.34、AAVhu.35、AAVhu.37、AAVhu.39、AAVhu.40、AAVhu.41、AAVhu.42、AAVhu.43、AAVhu.44、AAVhu.44R1、AAVhu.44R2、AAVhu.44R3、AAVhu.45、AAVhu.46、AAVhu.47、AAVhu.48、AAVhu.48R1、AAVhu.48R2、AAVhu.48R3、AAVhu.49、AAVhu.51、AAVhu.52、AAVhu.54、AAVhu.55、AAVhu.56、AAVhu.57、AAVhu.58、AAVhu.60、AAVhu.61、AAVhu.63、AAVhu.64、AAVhu.66、AAVhu.67、AAVhu.14/9、AAVhu.t 19、AAVrh.2、AAVrh.2R、AAVrh.8、AAVrh.8R、AAVrh.10、AAVrh.12、AAVrh.13、AAVrh.13R、AAVrh.14、AAVrh.17、AAVrh.18、AAVrh.19、AAVrh.20、AAVrh.21、AAVrh.22、AAVrh.23、AAVrh.24、AAVrh.25、AAVrh.31、AAVrh.32、AAVrh.33、AAVrh.34、AAVrh.35、AAVrh.36、AAVrh.37、AAVrh.37R2、AAVrh.38、AAVrh.39、AAVrh.40、AAVrh.46、AAVrh.48、AAVrh.48.1、AAVrh.48.1.2、AAVrh.48.2、AAVrh.49、AAVrh.51、AAVrh.52、AAVrh.53、AAVrh.54、AAVrh.56、AAVrh.57、AAVrh.58、AAVrh.61、AAVrh.64、AAVrh.64R1、AAVrh.64R2、AAVrh.67、AAVrh.73、AAVrh.74、AAVrh8R、AAVrh8R A586R突变体、AAVrh8R R533A突变体、AAAV、BAAV、山羊AAV、牛AAV、AAVhE1.1、AAVhEr1.5、AAVhER1.14、AAVhEr1.8、AAVhEr1.16、AAVhEr1.18、AAVhEr1.35、AAVhEr1.7、AAVhEr1.36、AAVhEr2.29、AAVhEr2.4、AAVhEr2.16、AAVhEr2.30、AAVhEr2.31、AAVhEr2.36、AAVhER1.23、AAVhEr3.1、AAV2.5T、AAV-PAEC、AAV-LK01、AAV-LK02、AAV-LK03、AAV-LK04、AAV-LK05、AAV-LK06、AAV-LK07、AAV-LK08、AAV-LK09、AAV-LK10、AAV-LK11、AAV-LK12、AAV-LK13、AAV-LK14、AAV-LK15、AAV-LK16、AAV-LK17、AAV-LK18、AAV-LK19、AAV-PAEC2、AAV-PAEC4、AAV-PAEC6、AAV-PAEC7、AAV-PAEC8、AAV-PAEC11、AAV-PAEC12、AAV-2-pre-miRNA-101、AAV-8h、AAV-8b、AAV-h、AAV-b、AAV SM 10-2、AAV改组(Shuffle)100-1、AAV改组100-3、AAV改组100-7、AAV改组10-2、AAV改组10-6、AAV改组10-8、AAV改组100-2、AAV SM 10-1、AAV SM 10-8、AAV SM 100-3、AAV SM 100-10、BNP61 AAV、BNP62 AAV、BNP63 AAV、AAVrh.50、AAVrh.43、AAVrh.62、AAVrh.48、AAVhu.19、AAVhu.11、AAVhu.53、AAV4-8/rh.64、AAVLG-9/hu.39、AAV54.5/hu.23、AAV54.2/hu.22、AAV54.7/hu.24、AAV54.1/hu.21、AAV54.4R/hu.27、AAV46.2/hu.28、AAV46.6/hu.29、AAV128.1/hu.43、真型AAV(ttAAV)、UPENN AAV 10、日本AAV 10血清型、AAV CBr-7.1、AAV CBr-7.10、AAV CBr-7.2、AAV CBr-7.3、AAV CBr-7.4、AAV CBr-7.5、AAV CBr-7.7、AAV CBr-7.8、AAVCBr-B7.3、AAV CBr-B7.4、AAV CBr-E1、AAV CBr-E2、AAV CBr-E3、AAV CBr-E4、AAV CBr-E5、AAV CBr-e5、AAV CBr-E6、AAV CBr-E7、AAV CBr-E8、AAV CHt-1、AAV CHt-2、AAV CHt-3、AAVCHt-6.1、AAV CHt-6.10、AAV CHt-6.5、AAV CHt-6.6、AAV CHt-6.7、AAV CHt-6.8、AAV CHt-P1、AAV CHt-P2、AAV CHt-P5、AAV CHt-P6、AAV CHt-P8、AAV CHt-P9、AAV CKd-1、AAV CKd-10、AAV CKd-2、AAV CKd-3、AAV CKd-4、AAV CKd-6、AAV CKd-7、AAV CKd-8、AAV CKd-B1、AAVCKd-B2、AAV CKd-B3、AAV CKd-B4、AAV CKd-B5、AAV CKd-B6、AAV CKd-B7、AAV CKd-B8、AAVCKd-H1、AAV CKd-H2、AAV CKd-H3、AAV CKd-H4、AAV CKd-H5、AAV CKd-H6、AAV CKd-N3、AAVCKd-N4、AAV CKd-N9、AAV CLg-F1、AAV CLg-F2、AAV CLg-F3、AAV CLg-F4、AAV CLg-F5、AAVCLg-F6、AAV CLg-F7、AAV CLg-F8、AAV CLv-1、AAV CLv1-1、AAV Clv1-10、AAV CLv1-2、AAVCLv-12、AAV CLv1-3、AAV CLv-13、AAV CLv1-4、AAV Clv1-7、AAV Clv1-8、AAV Clv1-9、AAVCLv-2、AAV CLv-3、AAV CLv-4、AAV CLv-6、AAV CLv-8、AAV CLv-D1、AAV CLv-D2、AAV CLv-D3、AAV CLv-D4、AAV CLv-D5、AAV CLv-D6、AAV CLv-D7、AAV CLv-D8、AAV CLv-E1、AAV CLv-K1、AAV CLv-K3、AAV CLv-K6、AAV CLv-L4、AAV CLv-L5、AAV CLv-L6、AAV CLv-M1、AAV CLv-M11、AAV CLv-M2、AAV CLv-M5、AAV CLv-M6、AAV CLv-M7、AAV CLv-M8、AAV CLv-M9、AAVCLv-R1、AAV CLv-R2、AAV CLv-R3、AAV CLv-R4、AAV CLv-R5、AAV CLv-R6、AAV CLv-R7、AAVCLv-R8、AAV CLv-R9、AAV CSp-1、AAV CSp-10、AAV CSp-11、AAV CSp-2、AAV CSp-3、AAVCSp-4、AAV CSp-6、AAV CSp-7、AAV CSp-8、AAV CSp-8.10、AAV CSp-8.2、AAV CSp-8.4、AAVCSp-8.5、AAV CSp-8.6、AAV CSp-8.7、AAV CSp-8.8、AAV CSp-8.9、AAV CSp-9、AAV.hu.48R3、AAV.VR-355、AAV3B、AAV4、AAV5、AAVF1/HSC1、AAVF11/HSC11、AAVF12/HSC12、AAVF13/HSC13、AAVF14/HSC14、AAVF15/HSC15、AAVF16/HSC16、AAVF17/HSC17、AAVF2/HSC2、AAVF3/HSC3、AAVF4/HSC4、AAVF5/HSC5、AAVF6/HSC6、AAVF7/HSC7、AAVF8/HSC8，和/或AAVF9/HSC9，及其变体或杂种/嵌合体/组合。
在一些实施方案中，用于本文公开的组合物中的AAV血清型可以是或包含如美国专利申请公开号US20030138772中所述的序列，其内容通过引用以其整体并入本文，诸如但不限于，AAV1(US20030138772的SEQ ID NO：6和64)、AAV2(US20030138772的SEQ ID NO:7和70)、AAV3(US20030138772的SEQ ID NO:8和71)、AAV4(US20030138772的SEQ ID NO:63)、AAV5(US20030138772的SEQ ID NO:114)、AAV6(US20030138772的SEQ ID NO:65)、AAV7(US20030138772的SEQ ID NO:1-3)、AAV8(US20030138772的SEQ ID NO:4和95)、AAV9(US20030138772的SEQ ID NO:5和100)、AAV10(US20030138772的SEQ ID NO:117)、AAV11(US20030138772的SEQ ID NO:118)、AAV12(US20030138772的SEQ ID NO:119)、AAVrh10(US20030138772的SEQ ID NO:81的氨基酸1至738)、AAV16.3(US20030138772 SEQ ID NO：10)、AAV29.3/bb.1(US20030138772 SEQ ID NO：11)、AAV29.4(US20030138772 SEQ ID NO:12)、AAV29.5/bb.2(US20030138772 SEQ ID NO:13)、AAV1.3(US20030138772 SEQ ID NO:14)、AAV13.3(US20030138772 SEQ ID NO:15)、AAV24.1(US20030138772 SEQ ID NO:16)、AAV27.3(US20030138772 SEQ ID NO:17)、AAV7.2(US20030138772SEQ ID NO:18)、AAVC1(US20030138772 SEQ ID NO:19)、AAVC3(US20030138772 SEQ ID NO:20)、AAVC5(US20030138772 SEQ ID NO:21)、AAVF1(US20030138772 SEQ ID NO:22)、AAVF3(US20030138772 SEQ ID NO:23)、AAVF5(US20030138772 SEQ ID NO:24)、AAVH6(US20030138772SEQ ID NO:25)、AAVH2(US20030138772 SEQ ID NO:26)、AAV42-8(US20030138772 SEQ ID NO:27)、AAV42-15(US20030138772 SEQ ID NO:28)、AAV42-5b(US20030138772 SEQ ID NO:29)、AAV42-1b(US20030138772SEQ ID NO:30)、AAV42-13(US20030138772 SEQ ID NO:31)、AAV42-3a(US20030138772 SEQ ID NO:32)、AAV42-4(US20030138772 SEQ ID NO:33)、AAV42-5a(US20030138772 SEQ ID NO:34)、AAV42-10(US20030138772SEQ ID NO:35)、AAV42-3b(US20030138772 SEQ ID NO:36)、AAV42-11(US20030138772 SEQ ID NO:37)、AAV42-6b(US20030138772 SEQ ID NO:38)、AAV43-1(US20030138772 SEQ ID NO:39)、AAV43-5(US20030138772SEQ ID NO:40)、AAV43-12(US20030138772 SEQ ID NO:41)、AAV43-20(US20030138772 SEQ ID NO:42)、AAV43-21(US20030138772 SEQ ID NO:43)、AAV43-23(US20030138772 SEQ ID NO:44)、AAV43-25(US20030138772SEQ ID NO:45)、AAV44.1(US20030138772 SEQ ID NO:46)、AAV44.5(US20030138772 SEQ ID NO:47)、AAV223.1(US20030138772 SEQ ID NO:48)、AAV223.2(US20030138772 SEQ ID NO:49)、AAV223.4(US20030138772SEQ ID NO:50)、AAV223.5(US20030138772 SEQ ID NO:51)、AAV223.6(US20030138772 SEQ ID NO:52)、AAV223.7(US20030138772 SEQ ID NO:53)、AAVA3.4(US20030138772 SEQ ID NO:54)、AAVA3.5(US20030138772SEQ ID NO:55)、AAVA3.7(US20030138772 SEQ ID NO:56)、AAVA3.3(US20030138772 SEQ ID NO:57)、AAV42.12(US20030138772 SEQ ID NO:58)、AAV44.2(US20030138772 SEQ ID NO:59)、AAV42-2(US20030138772SEQ ID NO:9)，或其变体或杂种/嵌合体/组合。
在一些实施方案中，AAV血清型可以是或包含如美国专利申请公开号US20150159173中所述的序列，其内容通过引用以其整体并入本文，诸如但不限于，AAV2(US20150159173的SEQ ID NO:7和23)、rh20(US20150159173的SEQ ID NO:1)、rh32/33(US20150159173的SEQ ID NO:2)、rh39(US20150159173的SEQ ID NO:3、20和36)、rh46(US20150159173的SEQ ID NO:4和22)、rh73(US20150159173的SEQ ID NO:5)、rh74(US20150159173的SEQ ID NO:6)、AAV6.1(US20150159173的SEQ ID NO:29)、rh.8(US20150159173的SEQ ID NO:41)、rh.48.1(US20150159173的SEQ ID NO:44)、hu.44(US20150159173的SEQ ID NO:45)、hu.29(US20150159173的SEQ ID NO：42)、hu.48(US20150159173的SEQ ID NO:38)、rh54(US20150159173的SEQ ID NO：49)、AAV2(US20150159173的SEQ ID NO:7)、cy.5(US20150159173的SEQ ID NO：8和24)、rh.10(US20150159173的SEQ ID NO:9和25)、rh.13(US20150159173的SEQ ID NO：10和26)、AAV1(US20150159173的SEQ ID NO：11和27)、AAV3(US20150159173的SEQ ID NO:12和28)、AAV6(US20150159173的SEQ ID NO:13和29)、AAV7(US20150159173的SEQ ID NO:14和30)、AAV8(US20150159173的SEQ ID NO:15和31)、hu.13(US20150159173的SEQ ID NO:16和32)、hu.26(US20150159173的SEQ ID NO:17和33)、hu.37(US20150159173的SEQ ID NO:18和34)、hu.53(US20150159173的SEQ ID NO：19和35)、rh.43(US20150159173的SEQ ID NO:21和37)、rh2(US20150159173的SEQ ID NO：39)、rh.37(US20150159173的SEQ ID NO:40)、rh.64(US20150159173的SEQ ID NO:43)、rh.48(US20150159173的SEQ ID NO:44)、ch.5(US20150159173的SEQ ID NO 46)、rh.67(US20150159173的SEQ ID NO:47)、rh.58(US20150159173的SEQ ID NO:48)或其变体，包括但不限于Cy5R1、Cy5R2、Cy5R3、Cy5R4、rh.13R、rh.37R2、rh.2R、rh.8R、rh.48.1、rh.48.2、rh.48.1.2、hu.44R1、hu.44R2、hu.44R3、hu.29R、ch.5R1、rh64R1、rh64R2、AAV6.2、AAV6.1、AAV6.12、hu.48R1、hu.48R2或hu.48R3，或其变体或杂种/嵌合体/组合。
在一些实施方案中，AAV血清型可以是或包含如美国专利号US 7198951中所述的序列，其内容通过引用以其整体并入本文，诸如但不限于，AAV9(US 7198951的SEQ ID NO：1-3)、AAV2(US 7198951的SEQ ID NO:4)、AAV1(US 7198951的SEQ ID NO:5)、AAV3(US7198951的SEQ ID NO:6)或AAV8(US7198951的SEQ ID NO:7)，或其变体或杂种/嵌合体/组合。
在一些实施方案中，AAV血清型可以是如由N Pulicherla等人(MolecularTherapy 19(6):1070-1078(2011)，其内容通过引用整体并入本文)所述的AAV9序列，或者可以是其变体，诸如但不限于AAV9.9、AAV9.11、AAV9.13、AAV9.16、AAV9.24、AAV9.45、AAV9.47、AAV9.61、AAV9.68或AAV9.84。
在一些实施方案中，AAV血清型可以是或包含如美国专利号US 6156303中所述的序列，其内容通过引用整体并入本文，诸如但不限于AAV3B(US6156303的SEQ ID NO:1和10)、AAV6(US 6156303的SEQ ID NO:2,7和11)、AAV2(US 6156303的SEQ ID NO:3和8)、AAV3A(US 6156303的SEQ ID NO:4和9)，或其衍生物或变体或杂种/嵌合体/组合。
在一些实施方案中，AAV血清型可以是或包含如美国专利申请公开号US20140359799中所述的序列，其内容通过引用整体并入本文，诸如但不限于AAV8(US20140359799的SEQ ID NO:1)、AAVDJ(US20140359799的SEQ ID NO:2和3)或其变体。
在一些实施方案中，血清型可以是AAVDJ或其变体，诸如AAVDJ8(或AAV-DJ8)，如由Grimm等(Journal of Virology 82(12):5887-5911(2008)，其通过引用整体并入本文)所述。AAVDJ8的氨基酸序列可以包含两个或更多个突变以有效去除肝素结合结构域(HBD)。作为非限制性实例，在美国专利号7,588,772(其内容通过引用整体并入本文)中描述为SEQID NO：1的AAV-DJ序列可以包含两个突变：(1)R587Q，其中氨基酸587处的精氨酸(R；Arg)变为谷氨酰胺(Q；Gln)和(2)R590T，其中氨基酸590处的精氨酸(R；Arg)变为苏氨酸(T；Thr)。作为另一个非限制性实例，在美国专利号7,588,772中描述的AAV-DJ可包含三个突变：(1)K406R，其中氨基酸406处的赖氨酸(K；Lys)变为精氨酸(R；Arg)，(2)R587Q，其中氨基酸587处的精氨酸(R；Arg)变为谷氨酰胺(Q；Gln)，和(3)R590T，其中氨基酸590处的精氨酸(R；Arg)变为苏氨酸(T；Thr)。
在一些实施方案中，AAV血清型可以是或包含如国际公开号WO1998011244(其内容通过引用整体并入本文)中所述的AAV4序列，诸如但不限于AAV4(WO1998011244的SEQ IDNO:1-20)。
在一些实施方案中，AAV血清型可以是或包含AAV2序列中的突变以产生如国际公开号WO2014144229中所述的AAV2G9，其通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，AAV血清型可以是或包含如国际公开号WO2005033321(其内容通过引用整体并入本文)中所述的序列，诸如但不限于AAV3-3(WO2005033321的SEQ ID NO：217)、AAV1(WO2005033321的SEQ ID NO：219和202)、AAV106.1/hu.37(WO2005033321的SEQID No：10)、AAV114.3/hu.40(WO2005033321的SEQ ID No:11)、AAV127.2/hu.41(WO2005033321的SEQ ID NO:6和8)、AAV128.3/hu.44(WO2005033321的SEQ ID No:81)、AAV130.4/hu.48(WO2005033321的SEQ ID NO:78)、AAV145.1/hu.53(WO2005033321的SEQID No：176和177)、AAV145.6/hu.56(WO2005033321的SEQ ID NO：168和192)、AAV16.12/hu.11(WO2005033321的SEQ ID NO：153和57)、AAV16.8/hu.10(WO2005033321的SEQ ID NO:156和56)、AAV161.10/hu.60(WO2005033321的SEQ ID No：170)、AAV161.6/hu.61(WO2005033321的SEQ ID No:174)、AAV1-7/rh.48(WO2005033321的SEQ ID NO:32)、AAV1-8/rh.49(WO2005033321的SEQ ID NOs:103和25)、AAV2(WO2005033321的SEQ ID NO:211和221)、AAV2-15/rh.62(WO2005033321的SEQ ID No:33和114)、AAV2-3/rh.61(WO2005033321的SEQ ID NO:21)、AAV2-4/rh.50(WO2005033321的SEQ ID No：23和108)、AAV2-5/rh.51(WO2005033321的SEQ ID NO:104和22)、AAV3.1/hu.6(WO2005033321的SEQ ID NO:5和84)、AAV3.1/hu.9(WO2005033321的SEQ ID NO:155和58)、AAV3-11/rh.53(WO2005033321的SEQID NO:186和176)、AAV3-3(WO2005033321的SEQ ID NO:200)、AAV33.12/hu.17(WO2005033321的SEQ ID NO:4)、AAV33.4/hu.15(WO2005033321的SEQ ID No：50)、AAV33.8/hu.16(WO2005033321的SEQ ID No:51)、AAV3-9/rh.52(WO2005033321的SEQ IDNO:96和18)、AAV4-19/rh.55(WO2005033321的SEQ ID NO:117)、AAV4-4(WO2005033321的SEQ ID NO：201和218)、AAV4-9/rh.54(WO2005033321的SEQ ID NO：116)、AAV5(WO2005033321的SEQ ID NO:199和216)、AAV52.1/hu.20(WO2005033321的SEQ ID NO：63)、AAV52/hu.19(WO2005033321的SEQ ID NO:133)、AAV5-22/rh.58(WO2005033321的SEQ IDNo：27)、AAV5-3/rh.57(WO2005033321的SEQ ID NO:105)、AAV5-3/rh.57(WO2005033321的SEQ ID No：26)、AAV58.2/hu.25(WO2005033321的SEQ ID No:49)、AAV6(WO2005033321的SEQ ID NO:203和220)、AAV7(WO2005033321的SEQ ID NO：222和213)、AAV7.3/hu.7(WO2005033321的SEQ ID No:55)、AAV8(WO2005033321的SEQ ID NO:223和214)、AAVH-1/hu.1(WO2005033321的SEQ ID No:46)、AAVH-5/hu.3(WO2005033321的SEQ ID No：44)、AAVhu.1(WO2005033321的SEQ ID NO:144)、AAVhu.10(WO2005033321的SEQ ID NO:156)、AAVhu.11(WO2005033321的SEQ ID NO：153)、AAVhu.12(WO2005033321 SEQ ID NO:59)、AAVhu.13(WO2005033321的SEQ ID NO:129)、AAVhu.14/AAV9(WO2005033321的SEQ ID NO:123和3)、AAVhu.15(WO2005033321的SEQ ID NO:147)、AAVhu.16(WO2005033321的SEQ IDNO:148)、AAVhu.17(WO2005033321的SEQ ID NO：83)、AAVhu.18(WO2005033321的SEQ IDNO:149)、AAVhu.19(WO2005033321的SEQ ID NO:133)、AAVhu.2(WO2005033321的SEQ IDNO:143)、AAVhu.20(WO2005033321的SEQ ID NO:134)、AAVhu.21(WO2005033321的SEQ IDNO：135)、AAVhu.22(WO2005033321的SEQ ID NO:138)、AAVhu.23.2(WO2005033321的SEQ IDNO:137)、AAVhu.24(WO2005033321的SEQ ID NO:136)、AAVhu.25(WO2005033321的SEQ IDNO:146)、AAVhu.27(WO2005033321的SEQ ID NO:140)、AAVhu.29(WO2005033321的SEQ IDNO:132)、AAVhu.3(WO2005033321的SEQ ID NO:145)、AAVhu.31(WO2005033321的SEQ IDNO:121)、AAVhu.32(WO2005033321的SEQ ID NO:122)、AAVhu.34(WO2005033321的SEQ IDNO:125)、AAVhu.35(WO2005033321的SEQ ID NO:164)、AAVhu.37(WO2005033321的SEQ IDNO:88)、AAVhu.39(WO2005033321的SEQ ID NO：102)、AAVhu.4(WO2005033321的SEQ ID NO:141)、AAVhu.40(WO2005033321的SEQ ID NO:87)、AAVhu.41(WO2005033321的SEQ ID NO：91)、AAVhu.42(WO2005033321的SEQ ID NO：85)、AAVhu.43(WO2005033321的SEQ ID NO:160)、AAVhu.44(WO2005033321的SEQ ID NO：144)、AAVhu.45(WO2005033321的SEQ ID NO:127)、AAVhu.46(WO2005033321的SEQ ID NO：159)、AAVhu.47(WO2005033321的SEQ ID NO:128)、AAVhu.48(WO2005033321的SEQ ID NO:157)、AAVhu.49(WO2005033321的SEQ ID NO:189)、AAVhu.51(WO2005033321的SEQ ID NO:190)、AAVhu.52(WO2005033321的SEQ ID NO：191)、AAVhu.53(WO2005033321的SEQ ID NO:186)、AAVhu.54(WO2005033321的SEQ ID NO：188)、AAVhu.55(WO2005033321的SEQ ID NO：187)、AAVhu.56(WO2005033321的SEQ ID NO:192)、AAVhu.57(WO2005033321的SEQ ID NO:193)、AAVhu.58(WO2005033321的SEQ ID NO：194)、AAVhu.6(WO2005033321的SEQ ID NO：84)、AAVhu.60(WO2005033321的SEQ ID NO:184)、AAVhu.61(WO2005033321的SEQ ID NO:185)、AAVhu.63(WO2005033321的SEQ ID NO:195)、AAVhu.64(WO2005033321的SEQ ID NO：196)、AAVhu.66(WO2005033321的SEQ ID NO:197)、AAVhu.67(WO2005033321的SEQ ID NO:198)、AAVhu.7(WO2005033321的SEQ ID NO：150)、AAVhu.8(WO2005033321 SEQ ID NO:12)、AAVhu.9(WO2005033321的SEQ ID NO:155)、AAVLG-10/rh.40(WO2005033321的SEQ ID No:14)、AAVLG-4/rh.38(WO2005033321的SEQ IDNO：86)、AAVLG-4/rh.38(WO2005033321的SEQ ID No:7)、AAVN721-8/rh.43(WO2005033321的SEQ ID NO:163)、AAVN721-8/rh.43(WO2005033321的SEQ ID No:43)、AAVpi.1(WO2005033321 SEQ ID NO:28)、AAVpi.2(WO2005033321 SEQ ID NO:30)、AAVpi.3(WO2005033321SEQ ID NO:29)、AAVrh.38(WO2005033321的SEQ ID NO:86)、AAVrh.40(WO2005033321的SEQ ID NO:92)、AAVrh.43(WO2005033321的SEQ ID NO:163)、AAVrh.44(WO2005033321 SEQ ID NO:34)、AAVrh.45(WO2005033321SEQ ID NO:41)、AAVrh.47(WO2005033321 SEQ ID NO:38)、AAVrh.48(WO2005033321的SEQ ID NO：115)、AAVrh.49(WO2005033321的SEQ ID NO:103)、AAVrh.50(WO2005033321的SEQ ID NO:108)、AAVrh.51(WO2005033321的SEQ ID NO：104)、AAVrh.52(WO2005033321的SEQ ID NO:96)、AAVrh.53(WO2005033321的SEQ ID NO:97)、AAVrh.55(WO2005033321 SEQ ID NO:37)、AAVrh.56(WO2005033321的SEQ ID NO:152)、AAVrh.57(WO2005033321的SEQ ID NO:105)、AAVrh.58(WO2005033321的SEQ ID NO:106)、AAVrh.59(WO2005033321 SEQ ID NO:42)、AAVrh.60(WO2005033321 SEQ ID NO:31)、AAVrh.61(WO2005033321的SEQ ID NO:107)、AAVrh.62(WO2005033321的SEQ ID NO:114)、AAVrh.64(WO2005033321的SEQ ID NO:99)、AAVrh.65(WO2005033321SEQ ID NO:35)、AAVrh.68(WO2005033321 SEQ ID NO:16)、AAVrh.69(WO2005033321 SEQ ID NO:39)、AAVrh.70(WO2005033321 SEQ ID NO:20)、AAVrh.72(WO2005033321 SEQ ID NO:9)或其变体，包括但不限于AAVcy.2、AAVcy.3、AAVcy.4、AAVcy.5、AAVcy.6、AAVrh.12、AAVrh.17、AAVrh.18、AAVrh.19、AAVrh.21、AAVrh.22、AAVrh.23、AAVrh.24、AAVrh.25、AAVrh.25/42 15、AAVrh.31、AAVrh.32、AAVrh.33、AAVrh.34、AAVrh.35、AAVrh.36、AAVrh.37或AAVrh14。变体的非限制性实例包括WO2005033321(其内容通过引用整体并入本文)的SEQ ID NO:13、15、17、19、24、36、40、45、47、48、51、52、53、54、60、61、62、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、79、80、82、89、90、93、94、95、98、100、101、109，110、111、112、113、118、119、120、124、126、131、139、142、151、154、158、161、162、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、202、204、205、206、207、208、209、210、211、212、215、219、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235或236。
在一些实施方案中，AAV血清型可以是或包含如国际公开号WO2015168666(其内容通过引用整体并入本文)中所述的序列，诸如但不限于AAVrh8R(WO2015168666的SEQ IDNO:9)、AAVrh8R A586R突变体(WO2015168666的SEQ ID NO:10)、AAVrh8R R533A突变体(WO2015168666的SEQ ID NO:11)或其变体。
在一些实施方案中，AAV血清型可以是或包含如美国专利号US9233131(其内容通过引用整体并入本文)中所述的序列，诸如但不限于AAVhE1.1(US9233131的SEQ ID NO:44)、AAVhEr1.5(US9233131的SEQ ID NO:45)、AAVhER1.14(US9233131的SEQ ID NO:46)、AAVhEr1.8(US9233131的SEQ ID NO:47)、AAVhEr1.16(US9233131的SEQ ID NO:48)、AAVhEr1.18(US9233131的SEQ ID NO:49)、AAVhEr1.35(US9233131的SEQ ID NO:50)、AAVhEr1.7(US9233131的SEQ ID NO:51)、AAVhEr1.36(US9233131的SEQ ID NO:52)、AAVhEr2.29(US9233131的SEQ ID NO:53)、AAVhEr2.4(US9233131的SEQ ID NO:54)、AAVhEr2.16(US9233131的SEQ ID NO:55)、AAVhEr2.30(US9233131的SEQ ID NO:56)、AAVhEr2.31(US9233131的SEQ ID NO:58)、AAVhEr2.36(US9233131的SEQ ID NO:57)、AAVhER1.23(US9233131的SEQ ID NO:53)、AAVhEr3.1(US9233131的SEQ ID NO:59)、AAV2.5T(US9233131的SEQ ID NO:42)或其变体。
在一些实施方案中，AAV血清型可以是或包含如美国专利申请公开号US20150376607(其内容通过引用整体并入本文)中所述的序列，诸如但不限于AAV-PAEC(US20150376607的SEQ ID NO:1)、AAV-LK01(US20150376607的SEQ ID NO:2)、AAV-LK02(US20150376607的SEQID NO:3)、AAV-LK03(US20150376607的SEQ ID NO:4)、AAV-LK04(US20150376607的SEQ IDNO:5)、AAV-LK05(US20150376607的SEQ ID NO:6)、AAV-LK06(US20150376607的SEQ ID NO:7)、AAV-LK07(US20150376607的SEQ ID NO:8)、AAV-LK08(US20150376607的SEQ ID NO:9)、AAV-LK09(US20150376607的SEQ ID NO:10)、AAV-LK10(US20150376607的SEQ ID NO:11)、AAV-LK11(US20150376607的SEQ ID NO:12)、AAV-LK12(US20150376607的SEQ ID NO:13)、AAV-LK13(US20150376607的SEQ ID NO:14)、AAV-LK14(US20150376607的SEQ ID NO:15)、AAV-LK15(US20150376607的SEQ ID NO:16)、AAV-LK16(US20150376607的SEQ ID NO:17)、AAV-LK17(US20150376607的SEQ ID NO:18)、AAV-LK18(US20150376607的SEQ ID NO:19)、AAV-LK19(US20150376607的SEQ ID NO:20)、AAV-PAEC2(US20150376607的SEQ ID NO:21)、AAV-PAEC4(US20150376607的SEQ ID NO:22)、AAV-PAEC6(US20150376607的SEQ ID NO:23)、AAV-PAEC7(US20150376607的SEQ ID NO:24)、AAV-PAEC8(US20150376607的SEQ IDNO:25)、AAV-PAEC11(US20150376607的SEQ ID NO:26)、AAV-PAEC12(US20150376607的SEQID NO:27)或其变体。
在一些实施方案中，AAV血清型可以是或包含如美国专利号US9163261(其内容通过引用整体并入本文)中所述的序列，诸如但不限于AAV-2-pre-miRNA-101(SEQ ID NO:1US9163261)或其变体。
在一些实施方案中，AAV血清型可以是或具有如美国专利申请公开号US20150376240(其内容通过引用整体并入本文)中所述的序列，诸如但不限于AAV-8h(US20150376240的SEQ ID NO:6)、AAV-8b(US20150376240的SEQ ID NO:5)、AAV-h(US20150376240的SEQ ID NO:2)、AAV-b(US20150376240的SEQ ID NO:1)或其变体。
在一些实施方案中，AAV血清型可以是或具有如美国专利申请公开号US20160017295(其内容通过引用整体并入本文)中所述的序列，诸如但不限于AAV SM 10-2(US20160017295的SEQ ID NO:22)、AAV改组100-1(US20160017295的SEQ ID NO:23)、AAV改组100-3(US20160017295的SEQ ID NO:24)、AAV改组100-7(US20160017295的SEQ ID NO:25)、AAV改组10-2(US20160017295的SEQ ID NO:34)、AAV改组10-6(US20160017295的SEQID NO:35)、AAV改组10-8(US20160017295的SEQ ID NO:36)、AAV改组100-2(US20160017295的SEQ ID NO：37)、AAV SM 10-1(US20160017295的SEQ ID NO：38)、AAV SM 10-8(US20160017295的SEQ ID NO:39)、AAV SM 100-3(US20160017295的SEQ ID NO:40)、AAVSM 100-10(US20160017295的SEQ ID NO：41)或其变体。
在一些实施方案中，AAV血清型可以是或包含如美国专利公开号US20150238550(其内容通过引用整体并入本文)中所述的序列，诸如但不限于BNP61 AAV(US20150238550的SEQ ID NO:1)、BNP62AAV(US20150238550的SEQ ID NO:3)、BNP63 AAV(US20150238550的SEQ ID NO:4)或其变体。
在一些实施方案中，AAV血清型可以是或可以包含如美国专利公开号US20150315612(其内容通过引用整体并入本文)中所述的序列，诸如但不限于AAVrh.50(US20150315612的SEQ ID NO:108)、AAVrh.43(US20150315612的SEQ ID NO:163)、AAVrh.62(US20150315612的SEQ ID NO:114)、AAVrh.48(US20150315612的SEQ ID NO:115)、AAVhu.19(US20150315612的SEQ ID NO:133)、AAVhu.11(US20150315612的SEQ IDNO:153)、AAVhu.53(US20150315612的SEQ ID NO:186)、AAV4-8/rh.64(US20150315612的SEQID NO:15)、AAVLG-9/hu.39(US20150315612的SEQ ID NO:24)、AAV54.5/hu.23(US20150315612的SEQ ID NO:60)、AAV54.2/hu.22(US20150315612的SEQ ID NO:67)、AAV54.7/hu.24(US20150315612的SEQ ID NO:66)、AAV54.1/hu.21(US20150315612的SEQIDNO:65)、AAV54.4R/hu.27(US20150315612的SEQ ID NO:64)、AAV46.2/hu.28(US20150315612的SEQ ID NO:68)、AAV46.6/hu.29(US20150315612的SEQ ID NO:69)、AAV128.1/hu.43(US20150315612的SEQ ID NO:80)或其变体。
在一些实施方案中，AAV血清型可以是或包含如国际公开号WO2015121501(其内容通过引用整体并入本文)中所述的序列，诸如但不限于真型AAV(ttAAV)(WO2015121501的SEQID NO:2)、“UPenn AAV10”(WO2015121501的SEQ ID NO:8)、“日本AAV10”(WO2015121501的SEQ ID NO:9)或其变体。
根据本公开，AAV衣壳血清型选择或用途可以来自多种物种。在一个实施方案中，AAV可以是禽类(avian)AAV(AAAV)。AAAV血清型可以是或具有如美国专利号US 9238800(其内容通过引用整体并入本文)中所述的序列，诸如但不限于AAAV(US 9238800的SEQ ID NO:1、2、4、6、8、10、12或14)或其变体。
在一个实施方案中，AAV可以是牛AAV(BAAV)。BAAV血清型可以是或具有如美国专利号US 9,193,769(其内容通过引用整体并入本文)中所述的序列，诸如但不限于BAAV(US9193769的SEQ ID NO:1和6)或其变体。BAAV血清型可以是或具有如美国专利号US7427396(其内容通过引用整体并入本文)中所述的序列，诸如但不限于BAAV(US7427396的SEQ ID NO:5和6)或其变体。
在一些实施方案中，AAV可以是山羊AAV。山羊AAV血清型可以是或具有如美国专利号US7427396(其内容通过引用整体并入本文)中所述的序列，诸如但不限于山羊AAV(US7427396的SEQ ID NO:3)或其变体。
在一些实施方案中，AAV可以是经工程化改造为来自两种或更多种亲本血清型的杂合AAV。在一个实施方案中，AAV可以是AAV2G9，其包含来自AAV2和AAV9的序列。AAV2G9AAV血清型可以是或具有如美国专利申请公开号US20160017005(其内容通过引用整体并入本文)中所述的序列。
在某些实施方案中，AAV可以是由氨基酸390-627(VP1编号)中具有突变的AAV9衣壳文库产生的血清型，如Pulicherla等(Molecular Therapy19(6):1070-1078(2011)(其内容通过引用整体并入本文)所述。血清型以及相应的核苷酸和氨基酸取代可以是但不限于AAV9.1(G1594C；D532H)、AAV6.2(T1418A和T1436X；V473D和I479K)、AAV9.3(T1238A；F413Y)、AAV9.4(T1250C和A1617T；F417S)、AAV9.5(A1235G、A1314T、A1642G、C1760T；Q412R、T548A、A587V)、AAV9.6(T1231A；F411I)、AAV9.9(G1203A、G1785T；W595C)、AAV9.10(A1500G、T1676C；M559T)、AAV9.11(A1425T、A1702C、A1769T；T568P、Q590L)、AAV9.13(A1369C、A1720T；N457H、T574S)、AAV9.14(T1340A、T1362C、T1560C、G1713A；L447H)、AAV9.16(A1775T；Q592L)、AAV9.24(T1507C、T1521G；W503R)、AAV9.26(A1337G、A1769C；Y446C、Q590P)、AAV9.33(A1667C；D556A)、AAV9.34(A1534G、C1794T；N512D)、AAV9.35(A1289T、T1450A、C1494T、A1515T、C1794A、G1816A；Q430L、Y484N、N98K、V606I)、AAV9.40(A1694T、E565V)、AAV9.41(A1348T、T1362C；T450S)、AAV9.44(A1684C、A1701T、A1737G；N562H、K567N)、AAV9.45(A1492T、C1804T；N498Y、L602F)、AAV9.46(G1441C、T1525C、T1549G；G481R、W509R、L517V)、9.47(G1241A、G1358A、A1669G、C1745T；S414N、G453D、K557E、T582I)、AAV9.48(C1445T、A1736T；P482L、Q579L)、AAV9.50(A1638T、C1683T、T1805A；Q546H、L602H)、AAV9.53(G1301A、A1405C、C1664T、G1811T；R134Q、S469R、A555V、G604V)、AAV9.54(C1531A、T1609A；L511I、L537M)、AAV9.55(T1605A；F535L)、AAV9.58(C1475T、C1579A；T492I、H527N)、AAV.59(T1336C；Y446H)、AAV9.61(A1493T；N498I)、AAV9.64(C1531A、A1617T；L511I)、AAV9.65(C1335T、T1530C、C1568A；A523D)、AAV9.68(C1510A；P504T)、AAV9.80(G1441A；G481R)、AAV9.83(C1402A、A1500T；P468T、E500D)、AAV9.87(T1464C、T1468C；S490P)、AAV9.90(A1196T；Y399F)、AAV9.91(T1316G、A1583T、C1782G、T1806C；L439R、K528I)、AAV9.93(A1273G、A1421G、A1638C、C1712T、G1732A、A1744T、A1832T；S425G、Q474R、Q546H、P571L、G578R、T582S、D611V)、AAV9.94(A1675T；M559L)或AAV9.95(T1605A；F535L)。
在一些实施方案中，AAV血清型可以是或包含如国际公开号WO2016049230(其内容通过引用整体并入本文)中所述的序列，诸如但不限于AAVF1/HSC1(WO2016049230的SEQ IDNO:2和20)、AAVF2/HSC2(WO2016049230的SEQ ID NO:3和21)、AAVF3/HSC3(WO2016049230的SEQ ID NO:5和22)、AAVF4/HSC4(WO2016049230的SEQ ID NO:6和23)、AAVF5/HSC5(WO2016049230的SEQ ID NO:11和25)、AAVF6/HSC6(WO2016049230的SEQ ID NO:7和24)、AAVF7/HSC7(WO2016049230的SEQ ID NO:8和27)、AAVF8/HSC8(WO2016049230的SEQ ID NO:9和28)、AAVF9/HSC9(WO2016049230的SEQ ID NO:10和29)、AAVF11/HSC11(WO2016049230的SEQ ID NO:4和26)、AAVF12/HSC12(WO2016049230的SEQ ID NO:12和30)、AAVF13/HSC13(WO2016049230的SEQ ID NO:14和31)、AAVF14/HSC14(WO2016049230的SEQ ID NO:15和32)、AAVF15/HSC15(WO2016049230的SEQ ID NO:16和33)、AAVF16/HSC16(WO2016049230的SEQ ID NO:17和34)、AAVF17/HSC17(WO2016049230的SEQ ID NO:13和35)或其变体或衍生物。
在一些实施方案中，AAV血清型可以是或包含如美国专利号US8734809(其内容通过引用整体并入本文)中所述的序列，诸如但不限于AAV CBr-E1(US8734809的SEQ ID NO:13和87)、AAV CBr-E2(US8734809的SEQ ID NO:14和88)、AAV CBr-E3(US8734809的SEQIDNO:15和89)、AAV CBr-E4(US8734809的SEQ ID NO:16和90)、AAV CBr-E5(US8734809的SEQID NO:17和91)、AAV CBr-e5(US8734809的SEQ ID NO:18和92)、AAV CBr-E6(US8734809的SEQ ID NO:19和93)、AAV CBr-E7(US8734809的SEQ ID NO:20和94)、AAV CBr-E8(US8734809的SEQ ID NO:21和95)、AAV CLv-D1(US8734809的SEQ ID NO:22和96)、AAVCLv-D2(US8734809的SEQ ID NO:23和97)、AAV CLv-D3(US8734809的SEQ ID NO:24和98)、AAVCLv-D4(US8734809的SEQ ID NO:25和99)、AAV CLv-D5(US8734809的SEQ ID NO:26和100)、AAV CLv-D6(US8734809的SEQ ID NO:27和101)、AAV CLv-D7(US8734809的SEQ IDNO:28和102)、AAV CLv-D8(US8734809的SEQ ID NO:29和103)、AAV CLv-E1(US8734809的SEQ IDNO:13和87)、AAV CLv-R1(US8734809的SEQ ID NO:30和104)、AAV CLv-R2(US8734809的SEQID NO:31和105)、AAV CLv-R3(US8734809的SEQ ID NO:32和106)、AAVCLv-R4(US8734809的SEQ ID NO:33和107)、AAV CLv-R5(US8734809的SEQ ID NO:34和108)、AAV CLv-R6(US8734809的SEQ ID NO:35和109)、AAV CLv-R7(US8734809的SEQ IDNO:36和110)、AAVCLv-R8(US8734809的SEQ ID NO:37和111)、AAV CLv-R9(US8734809的SEQID NO:38和112)、AAV CLg-F1(US8734809的SEQ ID NO:39和113)、AAV CLg-F2(US8734809的SEQ ID NO:40和114)、AAV CLg-F3(US8734809的SEQ ID NO:41和115)、AAV CLg-F4(US8734809的SEQ IDNO:42和116)、AAV CLg-F5(US8734809的SEQ ID NO:43和117)、AAVCLg-F6(US8734809的SEQID NO:43和117)、AAV CLg-F7(US8734809的SEQ ID NO:44和118)、AAV CLg-F8(US8734809的SEQ ID NO:43和117)、AAV CSp-1(US8734809的SEQ ID NO:45和119)、AAV CSp-10(US8734809的SEQ ID NO:46和120)、AAV CSp-11(US8734809的SEQID NO：47和121)、AAVCSp-2(US8734809的SEQ ID NO：48和122)、AAV CSp-3(US8734809的SEQ ID NO:49和123)、AAV CSp-4(US8734809的SEQ ID NO:50和124)、AAV CSp-6(US8734809的SEQ ID NO:51和125)、AAV CSp-7(US8734809的SEQ ID NO：52和126)、AAVCSp-8(US8734809的SEQ ID NO：53和127)、AAV CSp-9(US8734809的SEQ ID NO：54和128)、AAV CHt-2(US8734809的SEQ IDNO:55和129)、AAV CHt-3(US8734809的SEQ ID NO:56和130)、AAV CKd-1(US8734809的SEQID NO:57和131)、AAV CKd-10(US8734809的SEQ ID NO:58和132)、AAV CKd-2(US8734809的SEQ ID NO:59和133)、AAV CKd-3(US8734809的SEQ IDNO:60和134)、AAV CKd-4(US8734809的SEQ ID NO:61和135)、AAV CKd-6(US8734809的SEQID NO:62和136)、AAV CKd-7(US8734809的SEQ ID NO:63和137)、AAV CKd-8(US8734809的SEQ ID NO:64和138)、AAVCLv-1(US8734809的SEQ ID NO:35和139)、AAV CLv-12(US8734809的SEQ ID NO:66和140)、AAV CLv-13(US8734809的SEQ ID NO:67和141)、AAVCLv-2(US8734809的SEQ ID NO:68和142)、AAV CLv-3(US8734809的SEQ ID NO:69和143)、AAV CLv-4(US8734809的SEQ ID NO:70和144)、AAV CLv-6(US8734809的SEQ ID NO:71和145)、AAV CLv-8(US8734809的SEQ IDNO:72和146)、AAV CKd-B1(US8734809的SEQ ID NO:73和147)、AAV CKd-B2(US8734809的SEQ ID NO:74和148)、AAV CKd-B3(US8734809的SEQID NO:75和149)、AAV CKd-B4(US8734809的SEQ ID NO:76和150)、AAV CKd-B5(US8734809的SEQ ID NO:77和151)、AAVCKd-B6(US8734809的SEQ ID NO:78和152)、AAV CKd-B7(US8734809的SEQ ID NO：79和153)、AAV CKd-B8(US8734809的SEQ ID NO:80和154)、AAVCKd-H1(US8734809的SEQ ID NO：81和155)、AAV CKd-H2(US8734809的SEQ ID NO:82和156)、AAV CKd-H3(US8734809的SEQID NO:83和157)、AAV CKd-H4(US8734809的SEQ IDNO：84和158)、AAV CKd-H5(US8734809的SEQ ID NO：85和159)、AAV CKd-H6(US8734809的SEQ ID NO:77和151)、AAV CHt-1(US8734809的SEQ ID NO：86和160)、AAV CLv1-1(US8734809的SEQ ID NO：171)、AAV CLv1-2(US8734809的SEQ ID NO：172)、AAV CLv1-3(US8734809的SEQ ID NO:173)、AAV CLv1-4(US8734809的SEQ ID NO：174)、AAV Clv1-7(US8734809的SEQ ID NO：175)、AAV Clv1-8(US8734809的SEQ ID NO:176)、AAV Clv1-9(US8734809的SEQ ID NO:177)、AAV Clv1-10(US8734809的SEQ ID NO：178)、AAV.VR-355(US8734809的SEQ ID NO:181)、AAV.hu.48R3(US8734809的SEQ ID NO:183)或其变体或衍生物。
在一些实施方案中，AAV血清型可以是或包含如国际公开号WO2016065001(其内容通过引用整体并入本文)中所述的序列，诸如但不限于AAV CHt-P2(WO2016065001的SEQIDNO:1和51)、AAV CHt-P5(WO2016065001的SEQ ID NO:2和52)、AAV CHt-P9(WO2016065001的SEQ ID NO:3和53)、AAV CBr-7.1(WO2016065001的SEQ ID NO:4和54)、AAV CBr-7.2(WO2016065001的SEQ ID NO:5和55)、AAV CBr-7.3(WO2016065001的SEQ ID NO：6和56)、AAV CBr-7.4(WO2016065001的SEQ ID NO:7和57)、AAV CBr-7.5(WO2016065001的SEQIDNO:8和58)、AAV CBr-7.7(WO2016065001的SEQ ID NO:9和59)、AAV CBr-7.8(WO2016065001的SEQ ID NO:10和60)、AAV CBr-7.10(WO2016065001的SEQ ID NO:11和61)、AAV CKd-N3(WO2016065001的SEQ ID NO:12和62)、AAV CKd-N4(WO2016065001的SEQID NO:13和63)、AAV CKd-N9(WO2016065001的SEQ ID NO:14和64)、AAV CLv-L4(WO2016065001的SEQ IDNO:15和65)、AAV CLv-L5(WO2016065001的SEQ ID NO:16和66)、AAV CLv-L6(WO2016065001的SEQ ID NO：17和67)、AAV CLv-K1(WO2016065001的SEQ IDNO:18和68)、AAV CLv-K3(WO2016065001的SEQ ID NO:19和69)、AAV CLv-K6(WO2016065001的SEQ ID NO:20和70)、AAV CLv-M1(WO2016065001的SEQ ID NO:21和71)、AAV CLv-M11(WO2016065001的SEQ IDNO:22和72)、AAV CLv-M2(WO2016065001的SEQ ID NO：23和73)、AAV CLv-M5(WO2016065001的SEQ ID NO：24和74)、AAV CLv-M6(WO2016065001的SEQ IDNO：25和75)、AAV CLv-M7(WO2016065001的SEQ ID NO：26和76)、AAV CLv-M8(WO2016065001的SEQ ID NO:27和77)、AAV CLv-M9(WO2016065001的SEQ ID NO：28和78)、AAV CHt-P1(WO2016065001的SEQ IDNO：29和79)、AAV CHt-P6(WO2016065001的SEQ ID NO：30和80)、AAV CHt-P8(WO2016065001的SEQ ID NO:31和81)、AAV CHt-6.1(WO2016065001的SEQ IDNO：32和82)、AAV CHt-6.10(WO2016065001的SEQ ID NO:33和83)、AAV CHt-6.5(WO2016065001的SEQ ID NO：34和84)、AAV CHt-6.6(WO2016065001的SEQ ID NO：35和85)、AAV CHt-6.7(WO2016065001的SEQ IDNO:36和86)、AAV CHt-6.8(WO2016065001的SEQ IDNO：37和87)、AAV CSp-8.10(WO2016065001的SEQ ID NO:38和88)、AAV CSp-8.2(WO2016065001的SEQ ID NO:39和89)、AAV CSp-8.4(WO2016065001的SEQ ID NO：40和90)、AAV CSp-8.5(WO2016065001的SEQ IDNO:41和91)、AAV CSp-8.6(WO2016065001的SEQ IDNO：42和92)、AAV CSp-8.7(WO2016065001的SEQ ID NO:43和93)、AAV CSp-8.8(WO2016065001的SEQ ID NO:44和94)、AAV CSp-8.9(WO2016065001的SEQ ID NO：45和95)、AAV CBr-B7.3(WO2016065001的SEQ IDNO：46和96)、AAV CBr-B7.4(WO2016065001的SEQ IDNO:47和97)、AAV3B(WO2016065001的SEQ ID NO：48和98)、AAV4(WO2016065001的SEQ IDNO:49和99)、AAV5(WO2016065001的SEQID NO:50和100)或其变体或衍生物。
在一些实施方案中，AAV颗粒可以是包含选自表1中列出的那些中的任意一个的血清型。
在一些实施方案中，AAV颗粒可以包含表1中任意序列的序列、片段或变体。
在一些实施方案中，AAV颗粒可以由表1中任意序列的序列、片段或变体编码。
本文引用和/或描述的DNA和RNA序列中，单字母符号具有以下描述：A为腺嘌呤；C为胞嘧啶；G为鸟嘌呤；T为胸腺嘧啶；U为尿嘧啶；W为弱碱基(weak base)，例如腺嘌呤或胸腺嘧啶；S为强核苷酸，例如胞嘧啶和鸟嘌呤；M为氨基核苷酸，如腺嘌呤和胞嘧啶；K为酮核苷酸，如鸟嘌呤和胸腺嘧啶；R为嘌呤腺嘌呤和鸟嘌呤；Y为嘧啶胞嘧啶和胸腺嘧啶；B为任何非A的碱基(例如胞嘧啶、鸟嘌呤和胸腺嘧啶)；D为任何非C的碱基(例如腺嘌呤、鸟嘌呤和胸腺嘧啶)；H为任何非G的碱基(例如腺嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶)；V为任何非T的碱基(例如腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤)；N为任何核苷酸(非空位)；Z为零。
在本文引用和/或描述的任何氨基酸序列中，单字母符号具有以下描述：G(Gly)为甘氨酸；A(Ala)为丙氨酸；L(Leu)为亮氨酸；M(Met)为蛋氨酸；F(Phe)为苯丙氨酸；W(Trp)为色氨酸；K(Lys)为赖氨酸；Q(Gln)为谷氨酰胺；E(Glu)为谷氨酸；S(Ser)为丝氨酸；P(Pro)为脯氨酸；V(Val)为缬氨酸；I(Ile)为异亮氨酸；C(Cys)为半胱氨酸；Y(Tyr)为酪氨酸；H(His)为组氨酸；R(Arg)为精氨酸；N(Asn)为天冬酰胺；D(Asp)为天冬氨酸；T(Thr)为苏氨酸；B(Asx)为天冬氨酸或天冬酰胺；J(Xle)为亮氨酸或异亮氨酸；O(Pyl)为吡咯赖氨酸；U(Sec)为硒代半胱氨酸(Selenocysteine)；X(Xaa)为任何氨基酸；Z(Glx)为谷氨酰胺或谷氨酸。
表1.代表性的AAV血清型
Figure BDA0003088012730000341
Figure BDA0003088012730000351
Figure BDA0003088012730000361
Figure BDA0003088012730000371
Figure BDA0003088012730000381
Figure BDA0003088012730000391
Figure BDA0003088012730000401
Figure BDA0003088012730000411
Figure BDA0003088012730000421
Figure BDA0003088012730000431
Figure BDA0003088012730000441
Figure BDA0003088012730000451
Figure BDA0003088012730000461
Figure BDA0003088012730000471
Figure BDA0003088012730000481
Figure BDA0003088012730000491
Figure BDA0003088012730000501
Figure BDA0003088012730000511
Figure BDA0003088012730000521
Figure BDA0003088012730000531
Figure BDA0003088012730000541
Figure BDA0003088012730000551
Figure BDA0003088012730000561
Figure BDA0003088012730000571
Figure BDA0003088012730000581
Figure BDA0003088012730000591
Figure BDA0003088012730000601
Figure BDA0003088012730000611
Figure BDA0003088012730000621
表1中列出的每个专利、申请和/或出版物的内容均通过引用整体并入本文。
在某些实施方案中，AAV血清型可以是或可以包含如国际专利公开WO2015038958(其内容通过引用整体并入本文)中所述的序列，例如但不限于AAV9(WO2015038958的SEQID NO:2和11或本文中SEQ ID NO:135和136)、PHP.B(WO2015038958的SEQ ID NO:8和9，本文中SEQ ID NO:3和4)、G2B-13(WO2015038958的SEQID NO:12，本文中SEQ ID NO:5)、G2B-26(WO2015038958的SEQ ID NO:13或本文中SEQ IDNO:3)、TH1.1-32(WO2015038958的SEQID NO：14或本文中SEQ ID NO:6)、TH1.1-35(WO2015038958的SEQ ID NO:15或本文中SEQID NO:7)或其变体。此外，WO2015038958中所述的任何“靶向肽”或“氨基酸插入物”(本文可互换使用是指可以插入AAV衣壳序列以促进向CNS组织递送的序列)可以插入任何亲本AAV血清型中，例如但不限于AAV9(DNA序列的SEQ ID NO：135和氨基酸序列的SEQ ID NO：136)。在一些实施方案中，氨基酸插入物插入亲本AAV(例如AAV9)的氨基酸586-592之间。在一些实施方案中，氨基酸插入物插入亲本AAV序列的氨基酸588-589之间。氨基酸插入物可以是但不限于任何以下氨基酸序列：TLAVPFK(WO2015038958的SEQ ID NO:1；本文中SEQ ID NO:1260)、KFPVALT(WO2015038958的SEQ ID NO:3；本文中SEQ ID NO:1261)、LAVPFK(WO2015038958的SEQ ID NO:31；本文中SEQ ID NO:1262)、AVPFK(WO2015038958的SEQ IDNO:32；本文中SEQ ID NO:1263)、VPFK(WO2015038958的SEQ ID NO:33；本文中SEQ ID NO:1264)、TLAVPF(WO2015038958的SEQ ID NO:34；本文中SEQ ID NO:1265)、TLAVP(WO2015038958的SEQ ID NO:35；本文中SEQ ID NO:1266)、TLAV(WO2015038958的SEQ IDNO：36；本文中SEQ ID NO:1267)、SVSKPFL(WO2015038958的SEQ ID NO:28；本文中SEQ IDNO：1268)、FTLTTPK(WO2015038958的SEQ ID NO:29；本文中SEQ ID NO:1269)、MNATKNV(WO2015038958的SEQ ID NO:30；本文中SEQ ID NO:1270)、QSSQTPR(WO2015038958的SEQID NO:54；本文中SEQ ID NO：1271)、ILGTGTS(WO2015038958的SEQ ID NO:55；本文中SEQID NO:1272)、TRTNPEA(WO2015038958的SEQ ID NO:56；本文中SEQ ID NO:1273)、NGGTSSS(WO2015038958的SEQ ID NO:58；本文中SEQ ID NO:1274)或YTLSQGW(WO2015038958的SEQID NO：60；本文中SEQ ID NO：1275)。可以编码氨基酸插入物的核苷酸序列的非限制性实例包括但不限于以下：AAGTTTCCTGTGGCGTTGACT(WO2015038958的SEQ ID NO:3；本文中SEQ IDNO:1276)、ACTTTGGCGGTGCCTTTTAAG(WO201503895的SEQ ID NO：24和498；本文中SEQ IDNO:1277)、AGTGTGAGTAAGCCTTTTTTG(WO2015038958的SEQ ID NO:25；本文中SEQ ID NO：1278)、TTTACGTTGACGACGCCTAAG(WO2015038958的SEQ ID NO:26；本文中SEQ ID NO:1279)、ATGAATGCTACGAAGAATGTG(WO2015038958的SEQ ID NO：27；本文中SEQ ID NO：1280)、CAGTCGTCGCAGACGCCTAGG(WO2015038958的SEQ ID NO:48；本文中SEQ ID NO:1281)、ATTCTGGGGACTGGTACTTCG(WO2015038958的SEQ ID NO:50和52；本文中SEQ ID NO：1282)、ACGCGGACTAATCCTGAGGCT(WO2015038958的SEQ ID NO:51；本文中SEQ ID NO:1283)、AATGGGGGGACTAGTAGTTCT(WO2015038958的SEQ ID NO:53；本文中SEQ ID NO:1284)或TATACTTTGTCGCAGGGTTGG(WO2015038958的SEQ ID NO:59；本文中SEQ ID NO:1285)。
在一些实施方案中，AAV血清型可以是或可以包含如国际专利公开WO2017100671(其内容通过引用整体并入本文)中所述的序列，例如但不限于AAV9 K449R(WO2017100671的SEQ ID NO:45，本文中SEQ ID NO:9)、PHP.N(WO2017100671的SEQ ID NO:46，本文中SEQID NO:2)、PHP.S(WO2017100671的SEQ ID NO:47，本文中SEQ ID NO:8)或其变体。此外，WO2017100671中所述的任何靶向肽或氨基酸插入物可以插入任何亲本AAV血清型中，例如但不限于AAV9(SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:136)。在一些实施方案中，氨基酸插入物插入亲本AAV(例如AAV9)的氨基酸586-592之间。在一些实施方案中，氨基酸插入物插入亲本AAV序列的氨基酸588-589之间。氨基酸插入物可以是但不限于任何以下氨基酸序列：AQTLAVPFKAQ(WO2017100671的SEQ ID NO:1；本文中SEQ ID NO:1286)、AQSVSKPFLAQ(WO2017100671的SEQ ID NO:2；本文中SEQ ID NO:1287)、AQFTLTTPKAQ(WO2017100671序列表中的SEQ ID NO:3；本文中SEQ ID NO:1288)、DGTLAVPFKAQ(WO2017100671序列表中的SEQID NO:4；本文中SEQ ID NO:1289)、ESTLAVPFKAQ(WO2017100671的SEQ ID NO:5；本文中SEQID NO:1290)、GGTLAVPFKAQ(WO2017100671的SEQ ID NO:6；本文中SEQ ID NO:1291)、AQTLATPFKAQ(WO2017100671的SEQ ID NO:7和33；本文中SEQ ID NO:1292)、ATTLATPFKAQ(WO2017100671的SEQ ID NO:8；本文中SEQ ID NO：1293)、DGTLATPFKAQ(WO2017100671的SEQ ID NO:9；本文中SEQ ID NO:1294)、GGTLATPFKAQ(WO2017100671的SEQ ID NO:10；本文中SEQ ID NO:1295)、SGSLAVPFKAQ(WO2017100671的SEQ ID NO:11；本文中SEQ ID NO:1296)、AQTLAQPFKAQ(WO2017100671的SEQ ID NO:12；本文中SEQ ID NO：1297)、AQTLQQPFKAQ(WO2017100671的SEQ ID NO:13；本文中SEQ ID NO:1298)、AQTLSNPFKAQ(WO2017100671的SEQ ID NO：14；本文中SEQ ID NO:1299)、AQTLAVPFSNP(WO2017100671的SEQ ID NO:15；本文中SEQ ID NO:1300)、QGTLAVPFKAQ(WO2017100671的SEQ ID NO:16；本文中SEQ ID NO:1301)、NQTLAVPFKAQ(WO2017100671的SEQ ID NO:17；本文中SEQ ID NO:1302)、EGSLAVPFKAQ(WO2017100671的SEQ ID NO:18；本文中SEQ ID NO：1303)、SGNLAVPFKAQ(WO2017100671的SEQ ID NO:19；本文中SEQ ID NO:1304)、EGTLAVPFKAQ(WO2017100671的SEQ ID NO:20；本文中SEQ ID NO:1305)、DSTLAVPFKAQ(WO2017100671的表1中的SEQ ID NO:21；本文中SEQ ID NO:1306)、AVTLAVPFKAQ(WO2017100671的SEQ IDNO:22；本文中SEQ ID NO:1307)、AQTLSTPFKAQ(WO2017100671的SEQ ID NO:23；本文中SEQID NO:1308)、AQTLPQPFKAQ(WO2017100671的SEQ ID NO:24和32；本文中SEQ ID NO:1309)、AQTLSQPFKAQ(WO2017100671的SEQ ID NO:25；本文中SEQ ID NO：1310)、AQTLQLPFKAQ(WO2017100671的SEQ ID NO：26；本文中SEQ ID NO：1311)、AQTLTMPFKAQ(WO2017100671的SEQ ID NO:27和34和WO2017100671的序列表中SEQ ID NO：35；本文中SEQ ID NO：1312)、AQTLTTPFKAQ(WO2017100671的SEQ ID NO:28；本文中SEQ ID NO:1313)、AQYTLSQGWAQ(WO2017100671的SEQ ID NO：29；本文中SEQ ID NO：1314)、AQMNATKNVAQ(WO2017100671的SEQ ID NO:30；本文中SEQ ID NO：1315)、AQVSGGHHSAQ(WO2017100671的SEQ ID NO:31；本文中SEQ ID NO:1316)、AQTLTAPFKAQ(WO2017100671的表1中的SEQ ID NO：35；本文中SEQID NO：1317)、AQTLSKPFKAQ(WO2017100671的SEQ ID NO：36；本文中SEQ ID NO:1318)、QAVRTSL(WO2017100671的SEQ ID NO：37；本文中SEQ ID NO：1319)、YTLSQGW(WO2017100671的SEQ ID NO:38；本文中SEQ ID NO:1275)、LAKERLS(WO2017100671的SEQ ID NO:39；本文中SEQ ID NO：1320)、TLAVPFK(WO2017100671的序列表中的SEQ ID NO:40；本文中SEQ IDNO：1260)、SVSKPFL(WO2017100671的SEQ ID NO:41；本文中SEQ ID NO：1268)、FTLTTPK(WO2017100671的SEQ ID NO：42；本文中SEQ ID NO：1269)、MNSTKNV(WO2017100671的SEQID NO：43；本文中SEQ ID NO：1321)、VSGGHHS(WO2017100671的SEQ ID NO：44；本文中SEQID NO：1322)、SAQTLAVPFKAQAQ(WO2017100671的SEQ ID NO:48；本文中SEQ ID NO：1323)、SXXXLAVPFKAQAQ(WO2017100671的SEQ ID NO：49，其中X可以是任何氨基酸；本文中SEQ IDNO：1324)、SAQXXXVPFKAQAQ(WO2017100671的SEQ ID NO：50，其中X可以是任何氨基酸；本文中SEQ ID NO：1325)、SAQTLXXXFKAQAQ(WO2017100671的SEQ ID NO：51，其中X可以是任何氨基酸；本文中SEQ ID NO:1326)、SAQTLAVXXXAQAQ(WO2017100671的SEQ ID NO:52，其中X可以是任何氨基酸；本文中SEQ ID NO:1327)、SAQTLAVPFXXXAQ(WO2017100671的SEQ ID NO:53，其中X可以是任何氨基酸；本文中SEQ ID NO:1328)、TNHQSAQ(WO2017100671的SEQ IDNO:65；本文中SEQ ID NO：1329)、AQAQTGW(WO2017100671的SEQ ID NO:66；本文中SEQ IDNO：1330)、DGTLATPFK(WO2017100671的SEQ ID NO：67；本文中SEQ ID NO:1331)、DGTLATPFKXX(WO2017100671的SEQ ID NO:68，其中X可以是任何氨基酸；本文中SEQ ID NO:1332)、LAVPFKAQ(WO2017100671的SEQ ID NO:80；本文中SEQ ID NO：1333)、VPFKAQ(WO2017100671的SEQ ID NO:81；本文中SEQ ID NO:1334)、FKAQ(WO2017100671的SEQ IDNO：82；本文中SEQ ID NO：1335)、AQTLAV(WO2017100671的SEQ ID NO:83；本文中SEQ IDNO：1336)、AQTLAVPF(WO2017100671的SEQ ID NO:84；本文中SEQ ID NO:1337)、QAVR(WO2017100671的SEQ ID NO:85；本文中SEQ ID NO:1338)、AVRT(WO2017100671的SEQ IDNO：86；本文中SEQ ID NO：1339)、VRTS(WO2017100671的SEQ ID NO:87；本文中SEQ ID NO：1340)、RTSL(WO2017100671的SEQ ID NO：88；本文中SEQ ID NO：1341)、QAVRT(WO2017100671的SEQ ID NO:89；本文中SEQ ID NO：1342)、AVRTS(WO2017100671的SEQ IDNO:90；本文中SEQ ID NO:1343)、VRTSL(WO2017100671的SEQ ID NO：91；本文中SEQ ID NO：1344)、QAVRTS(WO2017100671的SEQ ID NO：92；本文中SEQ ID NO：1345)或AVRTSL(WO2017100671的SEQ ID NO：93；本文中SEQ ID NO：1346)。
可以编码氨基酸插入物的核苷酸序列的非限制性实例包括以下：GATGGGACTTTGGCGGTGCCTTTTAAGGCACAG(WO2017100671的SEQ ID NO：54；本文中SEQ ID NO：1347)、GATGGGACGTTGGCGGTGCCTTTTAAGGCACAG(WO2017100671的SEQ ID NO：55；本文中SEQ ID NO：1348)、CAGGCGGTTAGGACGTCTTTG(WO2017100671的SEQ ID NO:56；本文中SEQ ID NO:1349)、CAGGTCTTCACGGACTCAGACTATCAG WO2017100671的SEQ ID NO:57和78；本文中SEQ ID NO:1350)、CAAGTAAAACCTCTACAAATGTGGTAAAATCG(WO2017100671的SEQ ID NO:58；本文中SEQID NO:1351)、ACTCATCGACCAATACTTGTACTATCTCTCTAGAAC(WO2017100671的SEQ ID NO:59；本文中SEQ ID NO:1352)、GGAAGTATTCCTTGGTTTTGAACCCA(WO2017100671的SEQ ID NO:60；本文中SEQ ID NO:1353)、GGTCGCGGTTCTTGTTTGTGGAT(WO2017100671的SEQ ID NO：61；本文中SEQ ID NO：1354)、CGACCTTGAAGCGCATGAACTCCT(WO2017100671的SEQ ID NO:62；本文中SEQ ID NO:1355)、GTATTCCTTGGTTTTGAACCCAACCGGTCTGCGCCTGTGCMNNMNNMNNMNNMNNMNNMNNTTGGGCACTCTGGTGGTTTGTC(WO2017100671的SEQ ID NO:63，其中N可以是A、C、T或G；本文中SEQ ID NO：1356)、GTATTCCTTGGTTTTGAACCCAACCGGTCTGCGCMNNMNNMNNAAAAGGCACCGCCAAAGTTTG(WO2017100671的SEQ ID NO:69，其中N可以是A、C、T或G；本文中SEQ ID NO:1357)、GTATTCCTTGGTTTTGAACCCAACCGGTCTGCGCCTGTGCMNNMNNMNNCACCGCCAAAGTTTGGGCACT(WO2017100671的SEQ ID NO：70，其中N可以是A、C、T或G；本文中SEQ ID NO:1358)、GTATTCCTTGGTTTTGAACCCAACCGGTCTGCGCCTGTGCCTTAAAMNNMNNMNNCAAAGTTTGGGCACTCTGGTGG(WO2017100671的SEQ ID NO:71，其中N可以是A、C、T或G；本文中SEQ ID NO:1359)、GTATTCCTTGGTTTTGAACCCAACCGGTCTGCGCCTGTGCCTTAAAAGGCACMNNMNNMNNTTGGGCACTCTGGTGGTTTGTG(WO2017100671的SEQ ID NO:72，其中N可以是A、C、T或G；本文中SEQ ID NO:1360)、ACTTTGGCGGTGCCTTTTAAG(WO2017100671的SEQ ID NO:74；本文中SEQ ID NO:1277)、AGTGTGAGTAAGCCTTTTTTG(WO2017100671的SEQ ID NO:75；本文中SEQ ID NO:1278)、TTTACGTTGACGACGCCTAAG(WO2017100671的SEQ ID NO:76；本文中SEQ ID NO:1279)、TATACTTTGTCGCAGGGTTGG(WO2017100671的SEQ ID NO:77；本文中SEQ ID NO:1285)或CTTGCGAAGGAGCGGCTTTCG(WO2017100671的SEQ ID NO:79；本文中SEQ ID NO：1361)。
在一些实施方案中，AAV血清型可以是或可以包含如美国专利号US9624274(其内容通过引用整体并入本文)中所述的序列，例如但不限于AAV1(US9624274的SEQ ID NO:181)、AAV6(US9624274的SEQ ID NO:182)、AAV2(US9624274的SEQ ID NO:183)、AAV3b(US9624274的SEQ ID NO:184)、AAV7(US9624274的SEQ ID NO:185)、AAV8(US9624274的SEQID NO:186)、AAV10(US9624274的SEQ ID NO:187)、AAV4(US9624274的SEQ ID NO:188)、AAV11(US9624274的SEQ ID NO:189)、bAAV(US9624274的SEQ ID NO:190)、AAV5(US9624274的SEQID NO:191)、GPV(US9624274的SEQ ID NO:192；本文中SEQ ID NO:992)、B19(US9624274的SEQ ID NO:193；本文中SEQ ID NO:993)、MVM(US9624274的SEQ ID NO:194；本文中SEQ IDNO:994)、FPV(US9624274的SEQ ID NO:195；本文中SEQ ID NO:995)、CPV(US9624274的SEQID NO:196；本文中SEQ ID NO:996)或其变体。此外，美国专利号US9624274中所述的任何结构蛋白插入物可以插入但不限于任何亲本AAV血清型的I-453和I-587，例如但不限于AAV2(US9624274的SEQ ID NO:183)。氨基酸插入物可以是但不限于任何以下氨基酸序列：VNLTWSRASG(US9624274的SEQ ID NO:50；本文中SEQ ID NO:1362)、EFCINHRGYWVCGD(US9624274的SEQ ID NO:55；本文中SEQ ID NO:1363)、EDGQVMDVDLS(US9624274的SEQ ID NO:85；本文中SEQ ID NO:1364)、EKQRNGTLT(US9624274的SEQ IDNO:86；本文中SEQ ID NO:1365)、TYQCRVTHPHLPRALMR(US9624274的SEQ ID NO:87；本文中SEQ ID NO:1366)、RHSTTQPRKTKGSG(US9624274的SEQ ID NO:88；本文中SEQ ID NO：1367)、DSNPRGVSAYLSR(US9624274的SEQ ID NO:89；本文中SEQ ID NO:1368)、TITCLWDLAPSK(US9624274的SEQ ID NO:90；本文中SEQ ID NO:1369)、KTKGSGFFVF(US9624274的SEQ IDNO:91；本文中SEQ ID NO:1370)、THPHLPRALMRS(US9624274的SEQ ID NO:92；本文中SEQ IDNO:1371)、GETYQCRVTHPHLPRALMRSTTK(US9624274的SEQ ID NO：93；本文中SEQ ID NO：1372)、LPRALMRS(US9624274的SEQ ID NO:94；本文中SEQ ID NO：1373)、INHRGYWV(US9624274的SEQ ID NO:95；本文中SEQ ID NO：1374)、CDAGSVRTNAPD(US9624274的SEQ IDNO:60；本文中SEQ ID NO:1375)、AKAVSNLTESRSESLQS(US9624274的SEQ ID NO：96；本文中SEQ ID NO：1376)、SLTGDEFKKVLET(US9624274的SEQ ID NO:97；本文中SEQ ID NO:1377)、REAVAYRFEED(US9624274的SEQ ID NO:98；本文中SEQ ID NO:1378)、INPEIITLDG(US9624274的SEQ ID NO:99；本文中SEQ ID NO:1379)、DISVTGAPVITATYL(US9624274的SEQID NO:100；本文中SEQ ID NO:1380)、DISVTGAPVITA(US9624274的SEQ ID NO:101；本文中SEQ ID NO:1381)、PKTVSNLTESSSESVQS(US9624274的SEQ ID NO:102；本文中SEQ ID NO:1382)、SLMGDEFKAVLET(US9624274的SEQ ID NO：103；本文中SEQ ID NO:1383)、QHSVAYTFEED(US9624274的SEQ ID NO:104；本文中SEQ ID NO:1384)、INPEIITRDG(US9624274的SEQ ID NO:105；本文中SEQ ID NO:1385)、DISLTGDPVITASYL(US9624274的SEQ ID NO:106；本文中SEQ ID NO：1386)、DISLTGDPVITA(US9624274的SEQ ID NO:107；本文中SEQ ID NO:1387)、DQSIDFEIDSA(US9624274的SEQ ID NO：108；本文中SEQ ID NO：1388)、KNVSEDLPLPTFSPTLLGDS(US9624274的SEQ ID NO：109；本文中SEQ ID NO:1389)、KNVSEDLPLPT(US9624274的SEQ ID NO：110；本文中SEQ ID NO:1390)、CDSGRVRTDAPD(US9624274的SEQ ID NO：111；本文中SEQ ID NO:1391)、FPEHLLVDFLQSLS(US9624274的SEQID NO：112；本文中SEQ ID NO：1392)、DAEFRHDSG(US9624274的SEQ ID NO:65；本文中SEQID NO:1393)、HYAAAQWDFGNTMCQL(US9624274的SEQ ID NO:113；本文中SEQ ID NO:1394)、YAAQWDFGNTMCQ(US9624274的SEQ ID NO:114；本文中SEQ ID NO:1395)、RSQKEGLHYT(US9624274的SEQ ID NO：115；本文中SEQ ID NO：1396)、SSRTPSDKPVAHWANPQAE(US9624274的SEQ ID NO:116；本文中SEQ ID NO:1397)、SRTPSDKPVAHWANP(US9624274的SEQ ID NO:117；本文中SEQ ID NO:1398)、SSRTPSDKP(US9624274的SEQ ID NO:118；本文中SEQ ID NO:1399)、NADGNVDYHMNSVP(US9624274的SEQ ID NO:119；本文中SEQ ID NO:1400)、DGNVDYHMNSV(US9624274的SEQ ID NO:120；本文中SEQ ID NO:1401)、RSFKEFLQSSLRALRQ(US9624274的SEQ ID NO:121；本文中SEQ ID NO:1402)；FKEFLQSSLRA(US9624274的SEQ IDNO:122；本文中SEQ ID NO:1403)或QMWAPQWGPD(US9624274的SEQ ID NO:123；本文中SEQID NO:1404)。
在一些实施方案中，AAV血清型可以是或可以具有如美国专利号US9475845(其内容通过引用整体并入本文)中所述的序列，例如但不限于AAV衣壳蛋白，其包含天然AAV2衣壳蛋白的氨基酸585至590位的一个或多个氨基酸的修饰。此外，修饰可以导致但不限于氨基酸序列RGNRQA(US9475845的SEQ ID NO:3；本文中SEQ ID NO：1405)、SSSTDP(US9475845的SEQ ID NO:4；本文中SEQ ID NO：1406)、SSNTAP(US9475845的SEQ ID NO:5；本文中SEQID NO：1407)、SNSNLP(US9475845的SEQ ID NO:6；本文中SEQ ID NO:1408)、SSTTAP(US9475845的SEQ ID NO:7；本文中SEQ ID NO：1409)、AANTAA(US9475845的SEQ ID NO:8；本文中SEQ ID NO:1410)、QQNTAP(US9475845的SEQ ID NO:9；本文中SEQ ID NO:1411)、SAQAQA(US9475845的SEQ ID NO：10；本文中SEQ ID NO:1412)、QANTGP(US9475845的SEQ IDNO：11；本文中SEQ ID NO：1413)、NATTAP(US9475845的SEQ ID NO:12；本文中SEQ ID NO：1414)、SSTAGP(US9475845的SEQ ID NO：13和20；本文中SEQ ID NO：1415)、QQNTAA(US9475845的SEQ ID NO:14；本文中SEQ ID NO：1416)、PSTAGP(US9475845的SEQ ID NO:15；本文中SEQ ID NO：1417)、NQNTAP(US9475845的SEQ ID NO:16；本文中SEQ ID NO:1418)、QAANAP(US9475845的SEQ ID NO:17；本文中SEQ ID NO:1419)、SIVGLP(US9475845的SEQ ID NO:18；本文中SEQ ID NO:1420)、AASTAA(US9475845的SEQ ID NO:19和27；本文中SEQ ID NO:1421)、SQNTTA(US9475845的SEQ ID NO:21；本文中SEQ ID NO:1422)、QQDTAP(US9475845的SEQ ID NO：22；本文中SEQ ID NO:1423)、QTNTGP(US9475845的SEQ ID NO：23；本文中SEQ ID NO：1424)、QTNGAP(US9475845的SEQ ID NO:24；本文中SEQ ID NO:1425)、QQNAAP(US9475845的SEQ ID NO:25；本文中SEQ ID NO:1426)或AANTQA(US9475845的SEQ ID NO:26；本文中SEQ ID NO:1427)。在一些实施方案中，氨基酸修饰是天然AAV2衣壳蛋白中的氨基酸位置262到265或另一种AAV的衣壳蛋白中的相应位置处用靶向序列的取代。靶向序列可以是但不限于任何以下氨基酸序列：NGRAHA(US9475845的SEQ ID NO:38；本文中SEQ ID NO：1428)、QPEHSST(US9475845的SEQ ID NO:39和50；本文中SEQ ID NO:1429)、VNTANST(US9475845的SEQ ID NO:40；本文中SEQ ID NO:1430)、HGPMQKS(US9475845的SEQ ID NO:41；本文中SEQ ID NO：1431)、PHKPPLA(US9475845的SEQ ID NO:42；本文中SEQ ID NO:1432)、IKNNEMW(US9475845的SEQ ID NO:43；本文中SEQ ID NO：1433)、RNLDTPM(US9475845的SEQ ID NO：44；本文中SEQ ID NO:1434)、VDSHRQS(US9475845的SEQ ID NO:45；本文中SEQ ID NO:1435)、YDSKTKT(US9475845的SEQ ID NO:46；本文中SEQ ID NO:1436)、SQLPHQK(US9475845的SEQ ID NO：47；本文中SEQ ID NO:1437)、STMQQNT(US9475845的SEQ ID NO:48；本文中SEQ ID NO：1438)、TERYMTQ(US9475845的SEQ ID NO:49；本文中SEQ ID NO：1439)、DASLSTS(US9475845的SEQ ID NO：51；本文中SEQ ID NO:1440)、DLPNKKT(US9475845的SEQ ID NO:52；本文中SEQ ID NO:1441)、DLTAARL(US9475845的SEQ ID NO：53；本文中SEQ ID NO:1442)、EPHQFNY(US9475845的SEQ ID NO：54；本文中SEQ ID NO：1443)、EPQSNHT(US9475845的SEQ ID NO：55；本文中SEQ ID NO:1444)、MSSWPSQ(US9475845的SEQ ID NO:56；本文中SEQ ID NO:1445)、NPKHNAT(US9475845的SEQ ID NO：57；本文中SEQ ID NO:1446)、PDGMRTT(US9475845的SEQ ID NO:58；本文中SEQ ID NO：1447)、PNNNKTT(US9475845的SEQ ID NO:59；本文中SEQ ID NO:1448)、QSTTHDS(US9475845的SEQ ID NO:60；本文中SEQ ID NO:1449)、TGSKQKQ(US9475845的SEQ ID NO:61；本文中SEQ ID NO:1450)、SLKHQAL(US9475845的SEQ ID NO：62；本文中SEQ ID NO：1451)、SPIDGEQ(US9475845的SEQ ID NO：63；本文中SEQ ID NO:1452)、WIFPWIQL(US9475845的SEQ ID NO:64和112；本文中SEQ ID NO：1453)、CDCRGDCFC(US9475845的SEQ ID NO：65；本文中SEQ ID NO:1454)、CNGRC(US9475845的SEQ ID NO:66；本文中SEQ ID NO：1455)、CPRECES(US9475845的SEQ IDNO:67；本文中SEQ ID NO:1456)、CTTHWGFTLC(US9475845的SEQ ID NO：68和123；本文中SEQID NO：1457)、CGRRAGGSC(US9475845的SEQ ID NO：69；本文中SEQ ID NO:1458)、CKGGRAKDC(US9475845的SEQ ID NO:70；本文中SEQ ID NO:1459)、CVPELGHEC(US9475845的SEQ IDNO:71和115；本文中SEQ ID NO:1460)、CRRETAWAK(US9475845的SEQ ID NO:72；本文中SEQ IDNO：1461)、VSWFSHRYSPFAVS(US9475845的SEQ ID NO:73；本文中SEQ ID NO:1462)、GYRDGYAGPILYN(US9475845的SEQ ID NO:74；本文中SEQ ID NO:1463)、XXXYXXX(US9475845的SEQ ID NO:75；本文中SEQ ID NO:1464)、YXNW(US9475845的SEQ ID NO:76；本文中SEQID NO:1465)、RPLPPLP(US9475845的SEQ ID NO：77；本文中SEQ ID NO:1466)、APPLPPR(US9475845的SEQ ID NO：78；本文中SEQ ID NO：1467)、DVFYPYPYASGS(US9475845的SEQ IDNO:79；本文中SEQ ID NO:1468)、MYWYPY(US9475845的SEQ ID NO:80；本文中SEQ ID NO:1469)、DITWDQLWDLMK(US9475845的SEQ ID NO：81；本文中SEQ ID NO:1470)、CWDDXWLC(US9475845的SEQ ID NO:82；本文中SEQ ID NO：1471)、EWCEYLGGYLRCYA(US9475845的SEQID NO:83；本文中SEQ ID NO:1472)、YXCXXGPXTWXCXP(US9475845的SEQ ID NO:84；本文中SEQ ID NO:1473)、IEGPTLRQWLAARA(US9475845的SEQ ID NO：85；本文中SEQ ID NO：1474)、LWXXX(US9475845的SEQ ID NO:86；本文中SEQ ID NO：1475)、XFXXYLW(US9475845的SEQ IDNO：87；本文中SEQ ID NO：1476)、SSIISHFRWGLCD(US9475845的SEQ ID NO:88；本文中SEQID NO:1477)、MSRPACPPNDKYE(US9475845的SEQ ID NO:89；本文中SEQ ID NO:1478)、CLRSGRGC(US9475845的SEQ ID NO:90；本文中SEQ ID NO:1479)、CHWMFSPWC(US9475845的SEQ ID NO:91；本文中SEQ ID NO:1480)、WXXF(US9475845的SEQ ID NO:92；本文中SEQ IDNO:1481)、CSSRLDAC(US9475845的SEQ ID NO:93；本文中SEQ ID NO:1482)、CLPVASC(US9475845的SEQ ID NO：94；本文中SEQ ID NO:1483)、CGFECVRQCPERC(US9475845的SEQID NO：95；本文中SEQ ID NO：1484)、CVALCREACGEGC(US9475845的SEQ ID NO:96；本文中SEQ ID NO：1485)、SWCEPGWCR(US9475845的SEQ ID NO：97；本文中SEQ ID NO:1486)、YSGKWGW(US9475845的SEQ ID NO:98；本文中SEQ ID NO:1487)、GLSGGRS(US9475845的SEQID NO：99；本文中SEQ ID NO:1488)、LMLPRAD(US9475845的SEQ ID NO：100；本文中SEQ IDNO：1489)、CSCFRDVCC(US9475845的SEQ ID NO:101；本文中SEQ ID NO：1490)、CRDVVSVIC(US9475845的SEQ ID NO:102；本文中SEQ ID NO:1491)、MARSGL(US9475845的SEQ ID NO:103；本文中SEQ ID NO:1492)、MARAKE(US9475845的SEQ ID NO：104；本文中SEQ ID NO：1493)、MSRTMS(US9475845的SEQ ID NO：105；本文中SEQ ID NO:1494)、KCCYSL(US9475845的SEQ ID NO:106；本文中SEQ ID NO：1495)、MYWGDSHWLQYWYE(US9475845的SEQ ID NO:107；本文中SEQ ID NO:1496)、MQLPLAT(US9475845的SEQ ID NO:108；本文中SEQ ID NO:1497)、EWLS(US9475845的SEQ ID NO:109；本文中SEQ ID NO:1498)、SNEW(US9475845的SEQID NO:110；本文中SEQ ID NO:1499)、TNYL(US9475845的SEQ ID NO：111；本文中SEQ IDNO:1500)、WDLAWMFRLPVG(US9475845的SEQ ID NO：113；本文中SEQ ID NO:1501)、CTVALPGGYVRVC(US9475845的SEQ ID NO:114；本文中SEQ ID NO:1502)、CVAYCIEHHCWTC(US9475845的SEQ ID NO:116；本文中SEQ ID NO:1503)、CVFAHNYDYLVC(US9475845的SEQID NO:117；本文中SEQ ID NO:1504)、CVFTSNYAFC(US9475845的SEQ ID NO:118；本文中SEQID NO:1505)、VHSPNKK(US9475845的SEQ ID NO:119；本文中SEQ ID NO:1506)、CRGDGWC(US9475845的SEQ ID NO:120；本文中SEQ ID NO:1507)、XRGCDX(US9475845的SEQ ID NO:121；本文中SEQ ID NO:1508)、PXXX(US9475845的SEQ ID NO:122；本文中SEQ ID NO:1509)、SGKGPRQITAL(US9475845的SEQ ID NO:124；本文中SEQ ID NO:1510)、AAAAAAAAAXXXXX(US9475845的SEQ ID NO:125；本文中SEQ ID NO:1511)、VYMSPF(US9475845的SEQ ID NO:126；本文中SEQ ID NO：1512)、ATWLPPR(US9475845的SEQ ID NO:127；本文中SEQ ID NO:1513)、HTMYYHHYQHHL(US9475845的SEQ ID NO:128；本文中SEQ IDNO:1514)、SEVGCRAGPLQWLCEKYFG(US9475845的SEQ ID NO:129；本文中SEQ ID NO:1515)、CGLLPVGRPDRNVWRWLC(US9475845的SEQ ID NO:130；本文中SEQ ID NO:1516)、CKGQCDRFKGLPWEC(US9475845的SEQ ID NO:131；本文中SEQ ID NO:1517)、SGRSA(US9475845的SEQ ID NO:132；本文中SEQ ID NO：1518)、WGFP(US9475845的SEQ ID NO:133；本文中SEQ ID NO：1519)、AEPMPHSLNFSQYLWYT(US9475845的SEQ ID NO：134；本文中SEQ ID NO：1520)、WAYXSP(US9475845的SEQ ID NO:135；本文中SEQ ID NO：1521)、IELLQAR(US9475845的SEQ ID NO:136；本文中SEQ ID NO:1522)、AYTKCSRQWRTCMTTH US9475845的SEQ ID NO：137；本文中SEQ ID NO:1523)、PQNSKIPGPTFLDPH(US9475845的SEQ ID NO:138；本文中SEQ ID NO:1524)、SMEPALPDWWWKMFK(US9475845的SEQ ID NO:139；本文中SEQ IDNO:1525)、ANTPCGPYTHDCPVKR(US9475845的SEQ ID NO:140；本文中SEQ ID NO:1526)、TACHQHVRMVRP(US9475845的SEQ ID NO:141；本文中SEQ ID NO:1527)、VPWMEPAYQRFL(US9475845的SEQ ID NO:142；本文中SEQ ID NO：1528)、DPRATPGS(US9475845的SEQ IDNO:143；本文中SEQ ID NO:1529)、FRPNRAQDYNTN(US9475845的SEQ ID NO：144；本文中SEQID NO:1530)、CTKNSYLMC(US9475845的SEQ ID NO:145；本文中SEQ ID NO:1531)、CXXTXXXGXGC(US9475845的SEQ ID NO:146；本文中SEQ ID NO:1532)、CPIEDRPMC(US9475845的SEQ ID NO:147；本文中SEQ ID NO:1533)、HEWSYLAPYPWF(US9475845的SEQID NO：148；本文中SEQ ID NO:1534)、MCPKHPLGC(US9475845的SEQ ID NO:149；本文中SEQID NO：1535)、RMWPSSTVNLSAGRR(US9475845的SEQ ID NO：150；本文中SEQ ID NO:1536)、SAKTAVSQRVWLPSHRGGEP(US9475845的SEQ ID NO：151；本文中SEQ ID NO:1537)、KSREHVNNSACPSKRITAAL(US9475845的SEQ ID NO：152；本文中SEQ ID NO:1538)、EGFR(US9475845的SEQ ID NO:153；本文中SEQ ID NO:1539)、AGLGVR(US9475845的SEQ ID NO:154；本文中SEQ ID NO：1540)、GTRQGHTMRLGVSDG(US9475845的SEQ ID NO：155；本文中SEQID NO:1541)、IAGLATPGWSHWLAL(US9475845的SEQ ID NO:156；本文中SEQ ID NO：1542)、SMSIARL(US9475845的SEQ ID NO：157；本文中SEQ ID NO：1543)、HTFEPGV(US9475845的SEQID NO:158；本文中SEQ ID NO:1544)、NTSLKRISNKRIRRK(US9475845的SEQ ID NO:159；本文中SEQ ID NO:1545)、LRIKRKRRKRKKTRK(US9475845的SEQ ID NO:160；本文中SEQ ID NO:1546)、GGG、GFS、LWS、EGG、LLV、LSP、LBS、AGG、GRR、GGH或GTV。
在一些实施方案中，AAV血清型可以是或可以具有如美国专利申请公开号US20160369298(其内容通过引用整体并入本文)中所述的序列，例如但不限于AAV2的位点特异性突变的衣壳蛋白(US 20160369298的SEQ ID NO:97；本文中SEQ ID NO:1547)或其变体，其中特异性突变位点是选自VP1或其片段的位点R447、G453、S578、N587、N587+1、S662中的至少一个位点。
此外，US 20160369298中所述的任何突变序列可以是或者可以具有但不限于任何以下序列：SDSGASN(US20160369298的SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:231；本文中SEQ ID NO：1548)、SPSGASN(US20160369298的SEQ ID NO:2；本文中SEQ ID NO:1549)、SHSGASN(US20160369298的SEQ ID NO:3；本文中SEQ ID NO:1550)、SRSGASN(US20160369298的SEQID NO:4；本文中SEQ ID NO:1551)、SKSGASN(US20160369298的SEQ ID NO:5；本文中SEQIDNO：1552)、SNSGASN(US20160369298的SEQ ID NO:6；本文中SEQ ID NO：1553)、SGSGASN(US20160369298的SEQ ID NO:7；本文中SEQ ID NO:1554)、SASGASN(US20160369298的SEQID NO:8、175、和221；本文中SEQ ID NO：1555)、SESGTSN(US20160369298的SEQ ID NO:9；本文中SEQ ID NO:1556)、STTGGSN(US20160369298的SEQ ID NO：10；本文中SEQ ID NO：1557)、SSAGSTN(US20160369298的SEQ ID NO：11；本文中SEQ ID NO：1558)、NNDSQA(US20160369298的SEQ ID NO：12；本文中SEQ ID NO:1559)、NNRNQA(US20160369298的SEQID NO:13；本文中SEQ ID NO:1560)、NNNKQA(US20160369298的SEQ ID NO：14；本文中SEQID NO：1561)、NAKRQA(US20160369298的SEQ ID NO：15；本文中SEQ ID NO:1562)、NDEHQA(US20160369298的SEQ ID NO:16；本文中SEQ ID NO：1563)、NTSQKA(US20160369298的SEQID NO：17；本文中SEQ ID 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NO:1578)、SKTEADNNNSEYSWTG(US20160369298的SEQ ID NO：32；本文中SEQ ID NO:1579)、SKTPADNNNSEYSWTG(US20160369298的SEQ ID NO:33；本文中SEQ ID NO：1580)、SKTHADNNNSEYSWTG(US20160369298的SEQ ID NO:34；本文中SEQ ID NO:1581)、SKTQADNNNSEYSWTG(US20160369298的SEQ ID NO：35；本文中SEQ ID NO:1582)、SKTIADNNNSEYSWTG(US20160369298的SEQ ID NO:36；本文中SEQ ID NO：1583)、SKTMADNNNSEYSWTG(US20160369298的SEQ ID NO：37；本文中SEQ ID NO：1584)、SKTRADNNNSEYSWTG(US20160369298的SEQ ID NO：38；本文中SEQ ID NO：1585)、SKTNADNNNSEYSWTG(US20160369298的SEQ ID NO：39；本文中SEQ ID NO:1586)、SKTVGRNNNSEYSWTG(US20160369298的SEQ ID NO:40；本文中SEQ ID NO：1587)、SKTADRNNNSEYSWTG(US20160369298的SEQ ID NO：41；本文中SEQ ID NO：1588)、SKKLSQNNNSKYSWQG(US20160369298的SEQ ID NO：42；本文中SEQ ID NO：1589)、SKPTTGNNNSDYSWPG(US20160369298的SEQ ID NO：43；本文中SEQ ID NO：1590)、STQKNENNNSNYSWPG(US20160369298的SEQ ID NO:44；本文中SEQ ID NO:1591)、HKDDEGKF(US20160369298的SEQ ID NO:45；本文中SEQ ID NO:1592)、HKDDNRKF(US20160369298的SEQ ID NO：46；本文中SEQ ID NO:1593)、HKDDTNKF(US20160369298的SEQ ID NO：47；本文中SEQ ID NO：1594)、HEDSDKNF(US20160369298的SEQ ID NO：48；本文中SEQ ID NO：1595)、HRDGADSF(US20160369298的SEQ ID NO:49；本文中SEQ ID NO：1596)、HGDNKSRF(US20160369298的SEQ ID NO:50；本文中SEQ ID NO:1597)、KQGSEKTNVDFEEV(US20160369298的SEQ ID NO:51；本文中SEQ ID NO：1598)、KQGSEKTNVDSEEV(US20160369298的SEQ ID NO:52；本文中SEQ ID NO:1599)、KQGSEKTNVDVEEV(US20160369298的SEQ ID NO:53；本文中SEQ ID NO:1600)、KQGSDKTNVDDAGV(US20160369298的SEQ ID NO:54；本文中SEQ ID NO:1601)、KQGSSKTNVDPREV(US20160369298的SEQ ID NO:55；本文中SEQ ID NO：1602)、KQGSRKTNVDHKQV(US20160369298的SEQ ID NO:56；本文中SEQ ID NO:1603)、KQGSKGGNVDTNRV(US20160369298的SEQ ID NO:57；本文中SEQ ID NO:1604)、KQGSGEANVDNGDV(US20160369298的SEQ ID NO:58；本文中SEQ ID NO:1605)、KQDAAADNIDYDHV(US20160369298的SEQ ID NO:59；本文中SEQ ID NO：1606)、KQSGTRSNAAASSV(US20160369298的SEQ ID NO:60；本文中SEQ ID NO:1607)、KENTNTNDTELTNV(US20160369298的SEQ ID NO：61；本文中SEQ ID NO：1608)、QRGNNVAATADVNT(US20160369298的SEQ ID NO:62；本文中SEQ ID NO:1609)、QRGNNEAATADVNT(US20160369298的SEQ ID NO：63；本文中SEQ ID NO：1610)、QRGNNPAATADVNT(US20160369298的SEQ 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NO:1683)、YFLSRTNGEAGSATLSELRFSQAG(US20160369298的SEQ ID NO：227；本文中SEQ ID NO:1684)、HGDDADRF(US20160369298的SEQ ID NO：229和SEQ ID NO：254；本文中SEQ ID NO:1685)、KQGAEKSDVEVDRV(US20160369298的SEQ ID NO：230和SEQ ID NO：255；本文中SEQIDNO:1686)、KQDSGGDNIDIDQV(US20160369298的SEQ ID NO:235；本文中SEQ ID NO：1687)、SDAGASN(US20160369298的SEQ ID NO：236；本文中SEQ ID NO：1688)、YFLSRTNTEGGHDTQSTLRFSQAG(US20160369298的SEQ ID NO：237；本文中SEQ ID NO:1689)、KEDGGGSDVAIDEV(US20160369298的SEQ ID NO:240；本文中SEQ ID NO:1690)、SNAGASN(US20160369298的SEQ ID NO:246；本文中SEQ ID NO:1691)、和YFLSRTNGEAGSATLSELRFSQPG(US20160369298的SEQ ID NO：252；本文中SEQ ID NO：1692)。可以编码氨基酸突变位点的核苷酸序列的非限制性实例包括以下：AGCVVMDCAGGARSCASCAAC(US20160369298的SEQ ID NO:97；本文中SEQ ID NO:1693)、AACRACRRSMRSMAGGCA(US20160369298的SEQ ID NO:98；本文中SEQ ID NO:1694)、CACRRGGACRRCRMSRRSARSTTT(US20160369298的SEQ ID NO:99；本文中SEQ ID NO:1695)、TATTTCTTGAGCAGAACAAACRVCVVSRSCGGAMNCVHSACGMHSTCAVVSCTTVDSTT TTCTCAGSBCRGSGCG(US20160369298的SEQ ID NO:100；本文中SEQ ID NO:1696)、TCAAMAMMAVNSRVCSRSAACAACAACAGTRASTTCTCGTGGMMAGGA(US20160369298的SEQ ID NO:101；本文中SEQ ID NO:1697)、AAGSAARRCRSCRVSRVARVCRATRYCGMSNHCRVMVRSGTC(US20160369298的SEQ ID NO:102；本文中SEQ ID NO：1698)、CAGVVSVVSMRSRVCVNSGCAGCTDHCVVSRNSGTCVMSACA(US20160369298的SEQ ID NO：103；本文中SEQ ID NO：1699)、AACTWCRVSVASMVSVHSDDTGTGSWSTKSACT(US20160369298的SEQ ID NO：104；本文中SEQ ID NO:1700)、TTGTTGAACATCACCACGTGACGCACGTTC(US20160369298的SEQ ID NO:256；本文中SEQ ID NO:1701)、TCCCCGTGGTTCTACTACATAATGTGGCCG(US20160369298的SEQ ID NO：257；本文中SEQIDNO:1702)、TTCCACACTCCGTTTTGGATAATGTTGAAC(US20160369298的SEQ ID NO：258；本文中SEQ ID NO：1703)、AGGGACATCCCCAGCTCCATGCTGTGGTCG(US20160369298的SEQ ID NO:259；本文中SEQ ID NO:1704)、AGGGACAACCCCTCCGACTCGCCCTAATCC(US20160369298的SEQID NO:260；本文中SEQ ID NO:1705)、TCCTAGTAGAAGACACCCTCTCACTGCCCG(US20160369298的SEQID NO：261；本文中SEQ ID NO：1706)、AGTACCATGTACACCCACTCTCCCAGTGCC(US20160369298的SEQ ID NO：262；本文中SEQ ID NO:1707)、ATATGGACGTTCATGCTGATCACCATACCG(US20160369298的SEQ ID NO：263；本文中SEQ ID NO:1708)、AGCAGGAGCTCCTTGGCCTCAGCGTGCGAG(US20160369298的SEQ ID NO:264；本文中SEQID NO:1709)、ACAAGCAGCTTCACTATGACAACCACTGAC(US20160369298的SEQ ID NO:265；本文中SEQID NO:1710)、CAGCCTAGGAACTGGCTTCCTGGACCCTGTTACCGCCAGCAGAGAGTCTCAAMAMMAVNSRVCSRSAACAACAACAGTRASTTCTCCTGGMMAGGAGCTACCAAGTACCACCTCAATGGCAGAGACTCTCTGGTGAATCCCGGACCAGCTATGGCAAGCCACRRGGACRRCRMSRRSARSTTTTTTCCTCAGAGCGGGGTTCTCATCTTTGGGAAGSAARRCRSCRVSRVARVCRATRYCGMSNHCRVMVRSGTCATGATTACAGACGAAGAGGAGATCTGGAC(US20160369298的SEQ ID NO:266；本文中SEQ ID NO：1711)、TGGGACAATGGCGGTCGTCTCTCAGAGTTKTKKT(US20160369298的SEQ ID NO：267；本文中SEQ ID NO：1712)、AGAGGACCKKTCCTCGATGGTTCATGGTGGAGTTA(US20160369298的SEQ ID NO:268；本文中SEQ ID NO:1713)、CCACTTAGGGCCTGGTCGATACCGTTCGGTG(US20160369298的SEQ ID NO:269；本文中SEQ ID NO:1714)、和TCTCGCCCCAAGAGTAGAAACCCTTCSTTYYG(US20160369298的SEQ ID NO:270；本文中SEQ ID NO:1715)。
在一些实施方案中，AAV血清型可以包含如国际专利公开WO2016134375(其内容通过引用整体并入本文)中所述的眼细胞靶向肽，例如但不限于WO2016134375的SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10。此外，WO2016134375中所述的任何眼细胞靶向肽或氨基酸可以插入任何亲本AAV血清型中，例如但不限于AAV2(WO2016134375的SEQ ID NO:8；本文中SEQ ID NO:1716)，或AAV9(WO2016134375的SEQ ID NO:11；本文中SEQ ID NO：1717)。在一些实施方案中，在AAV2蛋白中在P34-A35、T138-A139、A139-P140、G453-T454、N587-R588、和/或R588-Q589处进行修饰，诸如插入。在某些实施方案中，在AAV9的D384、G385、1560、T561、N562、E563、E564、E565、N704和/或Y705处进行插入。眼细胞靶向肽可以是但不限于任何以下氨基酸序列：GSTPPPM(WO2016134375的SEQ ID NO:1；本文中SEQ ID NO:1718)或GETRAPL(WO2016134375的SEQ ID NO:4；本文中SEQ ID NO:1719)。
在一些实施方案中，AAV血清型可以进行修饰，如美国专利申请公开号US20170145405(其内容通过引用整体并入本文)中所述。AAV血清型可以包括经修饰的AAV2(例如Y444F、Y500F、Y730F和/或S662V处的修饰)、经修饰的AAV3(例如Y705F、Y731F和/或T492V处的修饰)和经修饰的AAV6(例如S663V和/或T492V处的修饰)。
在一些实施方案中，AAV血清型可以进行修饰，如国际公开号WO2017083722(其内容通过引用整体并入本文)中所述。AAV血清型可以包括AAV1(Y705+731F+T492V)、AAV2(Y444+500+730F+T491V)、AAV3(Y705+731F)、AAV5、AAV 5(Y436+693+719F)、AAV6(VP3变体Y705F/Y731F/T492V)、AAV8(Y733F)、AAV9、AAV9(VP3变体Y731F)和AAV10(Y733F)。
在一些实施方案中，如国际专利公开号WO2017015102(其内容通过引用整体并入本文)所述，AAV血清型可以包含经工程化改造的表位，其包含氨基酸SPAKFA(WO2017015102的SEQ IDNO:24；本文中SEQ ID NO:1720)或NKDKLN(WO2017015102的SEQ ID NO:2；本文中SEQ IDNO:1721)。表位可以插入基于AAV8的VP1衣壳编号(WO2017015102的SEQ ID NO:3)的氨基酸665至670和/或AAV3B(SEQ ID NO:3)的残基664至668的区域中。
在一些实施方案中，AAV血清型可以是或者可以具有如国际专利公开号WO2017058892(其内容通过引用整体并入本文)中所述的序列，例如但不限于具有衣壳蛋白的AAV变体，所述衣壳蛋白可以包含AAV1的氨基酸残基262-268、370-379、451-459、472-473、493-500、528-534、547-552、588-597、709-710、716-722(以任何组合)或AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAVrh32.33、牛AAV或禽类AAV中的等同氨基酸残基中的一处或多处(例如2、3、4、5、6或7)的取代。氨基酸取代可以是但不限于WO2017058892中所述的任何氨基酸序列。在一些实施方案中，AAV可以包含AAV1(WO2017058892的SEQ ID NO:l)的残基256L、258K、259Q、261S、263A、264S、265T、266G、272H、385S、386Q、S472R、V473D、N500E 547S、709A、710N、716D、717N、718N、720L、A456T、Q457T、N458Q、K459S、T492S、K493A、S586R、S587G、S588N、T589R和/或722T(以任何组合)处的氨基酸取代、AAV5(WO2017058892的SEQ ID NO:5)的244N、246Q、248R、249E、250I、251K、252S、253G、254S、255V、256D、263Y、377E、378N、453L、456R、532Q、533P、535N、536P、537G、538T、539T、540A、541T、542Y、543L、546N、653V、654P、656S、697Q、698F、704D、705S、706T、707G、708E、709Y和/或710R(以任何组合)处的氨基酸取代、AAV5(WO2017058892的SEQID NO:5)的248R、316V、317Q、318D、319S、443N、530N、531S、532Q 533P、534A、535N、540A、541T、542Y、543L、545G、546N、697Q、704D、706T、708E、709Y和/或(以任何组合)处的氨基酸取代、AAV6(SEQ ID NO:6WO2017058892)的264S、266G、269N、272H、457Q、588S和/或589I(以任何组合)处的氨基酸取代、AAV8(WO2017058892的SEQ ID NO:8)处的457T、459N、496G、499N、500N、589Q、590N和/或592A(以任何组合)处的氨基酸取代、AAV9(SEQ ID NO：9WO2017058892)的451I、452N、453G、454S、455G、456Q、457N和/或458Q(以任何组合)处的氨基酸取代。
在一些实施方案中，AAV可以包括VP1的155、156和157位或VP2的17、18、19和20位的氨基酸序列，如国际公开号WO 2017066764(其内容通过引用整体并入本文)中所述。氨基酸序列可以是但不限于N-S-S、S-X-S、S-S-Y、N-X-S、N-S-Y、S-X-Y和N-X-Y，其中N、X和Y是但不限于独立地非丝氨酸或非苏氨酸氨基酸，其中AAV可以是但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11或AAV12。在一些实施方案中，AAV可以包括VP1的位置156、157或158处或VP2的位置19、20或21处的至少一个氨基酸的缺失，其中AAV可以是但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11或AAV12。
在一些实施方案中，AAV可以是Deverman等(Nature Biotechnology34(2):204-209(2016)),Chan et al.,(Nature Neuroscience 20(8):1172-1179(2017))和国际专利申请公开号WO2015038958和WO2017100671中所述的基于Cre重组的AAV靶向进化(CREATE)产生的血清型，每一篇文献内容均通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，与不以这种方式产生的AAV血清型相比，以这种方式产生的AAV血清型改善了CNS转导和/或神经元和星形细胞向性。作为非限制性实例，AAV血清型可包括靶向肽，例如但不限于PHP.B、PHP.B2、PHP.B3、PHP.A、PHP.S、PHP.N、G2A12、G2A15、G2A3、G2B4和G2B5。在一些实施方案中，这些AAV血清型可以是在氨基酸588和589之间具有氨基酸插入物的AAV9(SEQ ID NO:136)或AAV9K449R(SEQ ID NO:9)的衍生物。这些氨基酸插入物的非限制性实例包括TLAVPFK(PHP.B；SEQ ID NO:1260)、SVSKPFL(PHP.B2；SEQ ID NO:1268)、FTLTTPK(PHP.B3；SEQ ID NO:1269)、YTLSQGW(PHP.A；SEQ ID NO:1275)、QAVRTSL(PHP.S；SEQ ID NO:1319)、LAKERLS(G2A3；SEQ ID NO:1320)、MNSTKNV(G2B4；SEQ ID NO:1321)、VSGGHHS(G2B5；SEQ ID NO:1322)和/或DGTLAVPFKAQ(PHP.N；SEQ ID NO:1289)。
在一些实施方案中，AAV血清型可以如Jackson等(Frontiers in MolecularNeuroscience 9:154(2016))所述，其内容通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，AAV血清型是AAV9(SEQ ID NO:135或136)。在一些实施方案中，AAV血清型是具有肽插入物的AAV9。
在一些实施方案中，AAV血清型是K449R AAV9变体(SEQ ID NO:9)。AAV9 K449R具有与野生型AAV9相同的功能。在一些实施方案中，AAV血清型是具有肽插入物的AAV9K449R。
在一些实施方案中，AAV血清型是PHP.B(例如，如WO2015038958中所述)。在一些实施方案中，与使用更遍在启动子(ubiquitous promoter)(即CBA或CMV)相比，AAV血清型与突触蛋白启动子配对以增强神经元转导。
在一些实施方案中，AAV血清型是PHP.N(例如，如WO2017100671中所述)。
在一些实施方案中，AAV血清型是包含AAVPHP.N(PHP.N)肽或其变体的血清型。
在一些实施方案中，AAV血清型是包含AAVPHP.B(PHP.B)肽或其变体的血清型。
在一些实施方案中，AAV血清型是包含AAVPHP.A(PHP.A)肽或其变体的血清型。
在一些实施方案中，AAV血清型是包含PHP.S肽或其变体的血清型。
在一些实施方案中，AAV血清型是包含PHP.B2肽或其变体的血清型。
在一些实施方案中，AAV血清型是包含PHP.B3肽或其变体的血清型。
在一些实施方案中，AAV血清型是包含G2B4肽或其变体的血清型。
在一些实施方案中，AAV血清型是包含G2B5肽或其变体的血清型。
在一些实施方案中，AAV血清型是VOY101或其变体。在一些实施方案中，VOY101包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在一些实施方案中，衣壳序列包含SEQ ID NO.：1722的核酸序列。
在一些实施方案中，AAV血清型是VOY201或其变体。在一些实施方案中，VOY201包含SEQ ID NO：1724的氨基酸序列。在一些实施方案中，衣壳序列包含SEQ ID NO：1723的核酸序列。
在一些实施方案中，AAV衣壳在静脉内施用后允许血脑屏障渗透。此类AAV衣壳的非限制性实例包括AAV9、AAV9 K449R、VOY101、VOY201或包含肽插入物的AAV衣壳，例如但不限于AAVPHP.N(PHP.N)、AAVPHP.B(PHP.B)、PHP.S、G2A3、G2B4、G2B5、G2A12、G2A15、PHP.B2、PHP.B3、or AAVPHP.A(PHP.A)。
在一些实施方案中，AAV血清型可包含与上述那些中的任何一种具有50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的衣壳氨基酸序列。在一些实施方案中，AAV血清型包含与SEQ ID NO:1、2、3、9、136或1724至少80％相同的衣壳氨基酸序列。在一些实施方案中，AAV血清型包含与SEQ ID NO:1、2、3、9、136或1724至少85％相同的衣壳氨基酸序列。在一些实施方案中，AAV血清型包含与SEQ ID NO:1、2、3、9、136或1724至少90％相同的衣壳氨基酸序列。在一些实施方案中，AAV血清型包含与SEQ ID NO:1、2、3、9、136或1724至少95％相同的衣壳氨基酸序列。在一些实施方案中，AAV血清型包含与SEQ ID NO:1、2、3、9、136或1724至少99％相同的衣壳氨基酸序列。在一些实施方案中，AAV血清型包含SEQ ID NO:1、2、3、9、136或1724的衣壳氨基酸序列。
在一些实施方案中，AAV血清型可以由与上述那些中的任何一种具有50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的衣壳核酸序列编码。在一些实施方案中，AAV血清型包含与SEQ ID NO:4、135、1722或1723至少80％相同的衣壳核酸序列。在一些实施方案中，AAV血清型包含与SEQ ID NO:4、135、1722或1723至少85％相同的衣壳核酸序列。在一些实施方案中，AAV血清型包含与SEQ ID NO：4、135、1722或1723至少90％相同的衣壳核酸序列。在一些实施方案中，AAV血清型包含与SEQ ID NO:4、135、1722或1723至少95％相同的衣壳核酸序列。在一些实施方案中，AAV血清型包含与SEQ ID NO：4、135、1722或1723至少99％相同的衣壳核酸序列。在一些实施方案中，AAV血清型包含SEQ ID NO:4、135、1722或1723的衣壳核酸序列。
在一些实施方案中，用于AAV VP1衣壳蛋白翻译的起始密码子可以是CTG、TTG或GTG，如美国专利号US8163543所述，其内容通过引用整体并入本文。
本公开涉及由壳体(Cap)基因编码的结构壳体蛋白(包括VP1、VP2和VP3)。这些壳体蛋白形成病毒载体如AAV的外部蛋白结构壳(即壳体)。由Cap多核苷酸合成的VP壳体蛋白通常在肽序列(Met1)中包括甲硫氨酸作为第一氨基酸，其与相应Cap核苷酸序列中的起始密码子(AUG或ATG)相关。然而，通常在多肽合成之后或期间由蛋白质加工酶如Met-氨肽酶将第一个甲硫氨酸(Met1)残基或通常任何第一个氨基酸(AA1)切割。该“Met/AA-剪切(clipping)”加工通常与多肽序列中第二个氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、丝氨酸、苏氨酸等)的相应乙酰化相关。Met剪切通常发生在VP1和VP3壳体蛋白，但也可能发生在VP2壳体蛋白。
当Met/AA剪切不完全时，可能会产生包含病毒壳体的一种或多种(一个，两个或三个)VP壳体蛋白的混合物，其中一些可能包括Met1/AA1氨基酸(Met+/AA+)，并且其中一些由于Met/AA剪切(Met-/AA-)而可能缺少Met1/AA1氨基酸。有关壳体蛋白中Met/AA剪切的进一步讨论，参见Jin,et al.Direct Liquid Chromatography/Mass Spectrometry Analysisfor Complete Characterization of Recombinant Adeno-Associated Virus CapsidProteins.Hum Gene Ther Methods.2017Oct.28(5):255-267；Hwang,et al.N-TerminalAcetylation of Cellular Proteins Creates Specific DegradationSignals.Science.2010February 19.327(5968):973–977；每一篇的内容均通过引用整体并入本文。
根据本公开，提及壳体蛋白不限于剪切(Met-/AA-)的或未剪切(Met+/AA+)的序列，并且在上下文中可以指独立的壳体蛋白，包含壳体蛋白混合物的病毒壳体，和/或编码、描述、产生或得到本公开的壳体蛋白的多核苷酸序列(或其片段)。直接提及“壳体蛋白”或“壳体多肽”(如VP1、VP2或VP2)还可以包含：包括Met1/AA1氨基酸(Met+/AA+)的VP壳体蛋白，以及由于Met/AA剪切(Met-/AA-)而缺少Met1/AA1氨基酸的相应VP壳体蛋白。
进一步根据本公开，提及分别包含或编码一种或多种包括Met1/AA1氨基酸(Met+/AA+)的壳体蛋白的特定SEQ ID NO:(无论是蛋白质还是核酸)，应当理解为教导在检查序列时缺少Met1/AA1氨基酸的VP壳体蛋白，显而易见的是，仅缺少第一个列出的氨基酸(无论是否是甲硫氨酸)的任何序列。。
作为非限制性实例，提及长度为736个氨基酸且包括由AUG/ATG起始密码子编码的“Met1”氨基酸(Met+)的VP1多肽序列，也可以理解为教导长度为735个氨基酸且不包括第736个氨基酸Met+序列的“Met1”氨基酸(Met-)的VP1多肽序列。作为第二个非限制性实例，提及长度为736个氨基酸且包括由任何NNN起始密码子编码的“AA1”氨基酸(AA1+)的VP1多肽序列，也可以理解为教导长度为735个氨基酸且不包括第736个氨基酸AA1+序列的“AA1”氨基酸(AA1-)的VP1多肽序列。
提及由VP壳体蛋白形成的病毒壳体(例如提及特定的AAV壳体血清型)，可以掺入包括Met1/AA1氨基酸(Met+/AA1+)的VP壳体蛋白，由于Met/AA1-剪切(Met-/AA1-)而缺少Met1/AA1氨基酸的相应VP壳体蛋白，及其组合(Met+/AA1+和Met-/AA1-)。
作为非限制性实例，AAV壳体血清型可以包括VP1(Met+/AA1+)、VP1(Met-/AA1-)或者VP1(Met+/AA1+)和VP1(Met-/AA1-)的组合。AAV壳体血清型还可以包括VP3(Met+/AA1+)、VP3(Met-/AA1-)或者VP3(Met+/AA1+)和VP3(Met-/AA1-)的组合；并且还可以包括VP2(Met+/AA1)和VP2(Met-/AA1-)的类似可选组合。
表达载体
在一些方面，本公开的AAV颗粒充当编码FXN的表达载体。表达载体不限于AAV，并且可以是腺病毒、逆转录病毒、慢病毒、质粒、载体或其任何变体。
在一些实施方案中，AAV颗粒表达载体可以包含5'至3'所述的从ITR至ITR，ITR、启动子、内含子、编码FXN的核酸序列、polyA序列和ITR。
反向末端重复(ITR)
本公开的AAV颗粒包含具有至少一个ITR区和编码FXN的有效载荷区的病毒基因组。如本文中所用，“病毒基因组”或“载体基因组”是包含至少一个反向末端ITR和至少一个编码的有效载荷的多核苷酸。在一个实施方案中，病毒基因组具有两个ITR。这两个ITR位于5'和3'端的有效载荷区的侧翼。ITR发挥包含复制识别位点的复制起点功能。ITR包含可以互补和对称排列的序列区。掺入本公开的病毒基因组中的ITR可以由天然存在的多核苷酸序列或重组衍生的多核苷酸序列组成。
ITR可以源自与壳体相同的血清型，选自表1中列出的任何血清型或其衍生物。ITR可以是与壳体不同的血清型。在一些实施方案中，AAV颗粒具有超过一个ITR。在一些实施方案中，AAV颗粒具有包含两个ITR的病毒基因组。在一些实施方案中，ITR具有彼此相同的血清型。在一些实施方案中，ITR具有不同的血清型。非限制性实例包括具有与壳体相同血清型的ITR中的0、1或2个。在一些实施方案中，AAV颗粒的病毒基因组的两个ITR均为AAV2ITR。
独立地，每个ITR的长度可以是约100个核苷酸至约150个核苷酸。ITR的长度可以是约100-105个核苷酸、长度为106-110个核苷酸、长度为111-115个核苷酸、长度为116-120个核苷酸、长度为121-125个核苷酸、长度为126-130个核苷酸、长度为131-135个核苷酸、长度为136-140个核苷酸、长度为141-145个核苷酸或长度为146-150个核苷酸。在一些实施方案中，ITR的长度为140-142个核苷酸。ITR长度的非限制性实例是长度为102、105、119、130、140、141、142或145个核苷酸，以及与它们具有至少95％同一性的核苷酸。
在一些实施方案中，一个或多个ITR是AAV2 ITR或其片段或变体。在一些实施方案中，5′ITR和3′ITR二者是AAV2 ITR或其片段或变体。在一些实施方案中，一个或多个ITR长度为141个核苷酸。在一些实施方案中，5′ITR和3′ITR二者长度为141个核苷酸。在一些实施方案中，5′ITR包含与SEQ ID NO:1811至少95％、至少99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，3'ITR包含与SEQ ID NO:1812至少95％、至少99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，5'ITR包含与SEQ ID NO:1811至少95％、至少99％或100％相同的序列且3'ITR包含与SEQ ID NO:1812至少95％、至少99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，病毒基因组包含如上所述的5'和3'ITR，以及编码共济蛋白的有效载荷区，例如编码SEQ ID NO:1725或具有至少90％序列同一性的其变体。在一些实施方案中，病毒基因组包含如上所述的5'和3'ITR，以及编码共济蛋白的有效载荷区，例如包含SEQ ID NO:1824或具有至少90％序列同一性的其变体的有效载荷区，例如，保留野生型共济蛋白的一种或多种功能特性的变体。
启动子
本领域技术人员可以认识到，靶细胞可以需要特异性启动子，包括但不限于物种特异性、诱导型、组织特异性或细胞周期特异性的启动子(Parr etal.,Nat.Med.3:1145-9(1997)；其内容通过引用整体并入本文)。
在一些实施方案中，AAV颗粒至中枢神经系统(例如实质)的细胞的递送包含组合物，其中AAV基因组还包含细胞特异性启动子区。在一些实施方案中，递送包含其中AAV基因组还包含遍在启动子(ubiquitous promoter)区的组合物。
在一些实施方案中，启动子有效驱动有效载荷或转基因的表达。在一些实施方案中，启动子有效驱动FXN的表达。
在一些实施方案中，FXN启动子用于编码FXN或其变体的AAV颗粒的病毒基因组中。某些实施方案提供了FXN启动子经工程化改造用于最佳的FXN表达。
在一些实施方案中，启动子是在靶标组织(例如但不限于神经系统组织(例如，CNS组织))中持续一段时间表达有效负载(例如FXN)的弱启动子。表达可以持续1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、1day,2天、3天、4天、5天、6天、1周、8天、9天、10天、11天、12天、13天、2周、15天、16天、17天、18天、19天、20天、3周、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、31天、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、13个月、14个月、15个月、16个月、17个月、18个月、19个月、20个月、21个月、22个月、23个月、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年或超过10年。表达可以持续1-5小时、1-12小时、1-2天、1-5天、1-2周、1-3周、1-4周、1-2个月、1-4个月、1-6个月、2-6个月、3-6个月、3-9个月、4-8个月、6-12个月、1-2年、1-5年、2-5年、3-6年、3-8年、4-8年或5-10年。在一些实施方案中，启动子是用于在神经组织中持续表达有效载荷的弱启动子。
在一些实施方案中，启动子可以是大小小于1kb的启动子。启动子可以具有长度50、55、100、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、332、340、350、360、361、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、505、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800或超过800个核苷酸。启动子可以具有长度在50-100、100-150、150-200、200-300、200-400、200-500、200-600、200-700、200-800、300-400、300-500、300-600、300-700、300-800、400-500、400-600、400-700、400-800、500-600、500-700、500-800、600-700、600-800或700-800个核苷酸之间。
在一些实施方案中，启动子可以是两种或更多种组分的组合，例如但不限于CMV和CBA。每个组分可以具有长度200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800或超过800个核苷酸。每个组分可以具有长度在200-300、200-400、200-500、200-600、200-700、200-800、300-400、300-500、300-600、300-700、300-800、400-500、400-600、400-700、400-800、500-600、500-700、500-800、600-700、600-800、或700-800个核苷酸之间。在一些实施方案中，启动子是382个核苷酸的CMV-增强子序列和260个核苷酸的CBA-启动子序列的组合。在一些实施方案中，启动子是380个核苷酸的CMV-增强子序列和260个核苷酸的CBA-启动子序列的组合。
在一些实施方案中，载体基因组包含增强FXN的靶标特异性和表达的至少一种元件(参见，例如Powell et al.Viral Expression Cassette Elements to EnhanceTransgene Target Specificity and Expression in Gene Therapy,2015；其内容通过引用整体并入本文)。增强表达的元件的非限制性实例包括启动子、内源性miRNA、转录后调控元件(PRE)、聚腺苷酸化(PolyA)信号序列、上游增强子(USE)、CMV增强子和/或内含子。在某些实施方案中，用于增强FXN的靶标特异性和/或表达的元件作为“增强子”或“增强子序列”提及。在一些实施方案中，启动子可以包含增强子序列。在一些实施方案中，增强子可以是病毒基因组中与启动子不同的单独组分。在一些实施方案中，增强子可以是病毒基因组中启动子序列的5′端。在一些实施方案中，增强子可以是病毒基因组中启动子序列的3′端。在一些实施方案中，增强子包含SEQ ID NO：1777或由其组成。
如本文所用，“内含子”或“内含子序列”涵盖全长内含子或其片段。如本文所用，“外显子”或“外显子序列”涵盖全长外显子或其片段。在一些实施方案中，增强子可以包含至少一个内含子或外显子序列。在一些实施方案中，增强子可以包含至少一个内含子序列。在一些实施方案中，增强子可以包含至少一个外显子序列。在一些实施方案中，增强子包含一个内含子序列和一个外显子序列。在一些实施方案中，增强子序列包含两个内含子序列。在一些实施方案中，增强子序列包含两个外显子序列。在一些实施方案中，增强子序列包含两个内含子序列和两个外显子序列。在一些实施方案中，增强子包含SEQ ID NO：1818。在一些实施方案中，增强子可以包含两个内含子序列和两个外显子序列。在一些实施方案中，增强子可包含ie1外显子(例如，外显子1)、ie1内含子(例如，内含子1)、人类β-珠蛋白内含子(例如，内含子2)和人类β-珠蛋白外显子(例如，外显子3)。在一些实施方案中，增强子可以包含5′至3’的SEQ ID NO:1817、1819、1820、1821。在一些实施方案中，增强子可以包含SEQID NO：1816。
在大多数组织中促进表达的启动子包括但不限于人延伸因子1α亚基(EF1α)、立即早期巨细胞病毒(CMV)、鸡β-肌动蛋白(CBA)及其衍生物CAG、β葡糖醛酸苷酶(βglucuronidase)(GUSB)或泛素C(UBC)。组织特异性表达元件可用于将表达限制于某些细胞类型，例如但不限于神经系统启动子，其可用于将表达限于神经元、星形胶质细胞或少突胶质细胞。神经元的组织特异性表达元件的非限制性实例包括神经元特异性烯醇化酶(NSE)、血小板衍生的生长因子(PDGF)、血小板衍生的生长因子B链(PDGF-β)、突触蛋白(Syn)、甲基CpG结合蛋白2(MeCP2)、CaMKII、mGluR2、NFL、NFH、nβ2、PPE、Enk和EAAT2启动子。星形胶质细胞的组织特异性表达元件的非限制性实例包括神经胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillaryacidic protein)(GFAP)和EAAT2启动子。少突胶质细胞的组织特异性表达元件的非限制性实例包括髓磷脂碱性蛋白(myelin basic protein)(MBP)启动子。
在一些实施方案中，病毒基因组包含遍在启动子。遍在启动子的非限制性实例包括H1、U6、CMV、CBA(包括衍生物CAG、CBh等)、EF-1α、PGK、UBC、GUSB(hGBp)和UCOE(HNRPA2B1-CBX3的启动子)。Yu等(Molecular Pain 2011,7:63；其内容通过引用整体并入本文)使用慢病毒载体评估大鼠DRG细胞和原代DRG细胞中在CAG、EFIα、PGK和UBC启动子下eGFP的表达并发现UBC显示比其他3个启动子更弱的表达，并且对于所有启动子看到仅10-12％胶质表达。Soderblom等(E.Neuro 2015；其内容通过引用整体并入本文)研究了在运动皮层中注射后在具有CMV和UBC启动子的AAV8中和在具有CMV启动子的AAV2中的eGFP的表达。鼻内施用含有UBC或EFIα启动子的质粒显示持续气道表达大于具有CMV启动子的表达(参见例如Gillet al.,Gene Therapy 2001,Vol.8,1539-1546；其内容通过引用整体并入本文)。Husain等(Gene Therapy 2009；其内容通过引用整体并入本文)评估了具有hGUSB启动子、HSV-1LAT启动子和NSE启动子的HβH构建体，并且发现HβH构建体在小鼠脑中显示出比NSE弱的表达。Passini和Wolfe(J.Virol.2001,12382-12392，其内容通过引用整体并入本文)评估了新生小鼠中心室内注射后的HβH载体的长期作用，并发现表达持续至少1年。Xu等(Gene Therapy2001,8,1323-1332；其内容通过引用整体并入本文)发现当与CMV-lacZ、CMV-luc、EF、GFAP、hENK、nAChR、PPE、PPE+wpre、NSE(0.3kb)、NSE(1.8kb)和NSE(1.8kb+wpre)相比使用NF-L和NF-H启动子时在所有脑区域中的低表达。Xu等发现启动子活性的降序是NSE(1.8kb)、EF、NSE(0.3kb)、GFAP、CMV、hENK、PPE、NFL和NFH。NFL是650个核苷酸的启动子，且NFH是920个核苷酸的启动子，两者在肝脏中都不存在，但NFH在感觉本体感受神经元、脑和脊髓中是丰富的，并且NFH存在于心脏中。Scn8a是470个核苷酸的启动子，其在整个DRG、脊髓和脑中表达，在海马神经元和小脑浦肯野细胞(cerebellar Purkinje cell)、皮质、丘脑和下丘脑中看到特别高的表达(参见例如Drews et al.2007and Raymond et al.2004；其各自内容通过引用整体并入本文)。
在一些实施方案中，载体基因组包含UBC启动子。UBC启动子可以具有大小300-350个核苷酸。在一些实施方案中，UBC启动子长度为332个核苷酸。
在一些实施方案中，载体基因组包含GUSB启动子。GUSB启动子可以具有大小350-400个核苷酸。在一些实施方案中，GUSB启动子长度为378个核苷酸。在一些实施方案中，构建体可以是AAV-启动子-CMV/珠蛋白内含子-FXN-RBG，其中AAV可以是自互补的，并且AAV可以是AAV6、AAVrh10或AAVDJ血清型。
在一些实施方案中，载体基因组包含NFL启动子。NFL启动子可以具有大小600-700个核苷酸。在一些实施方案中，NFL启动子长度为650个核苷酸。
在一些实施方案中，载体基因组包含NFH启动子。NFH启动子可以具有大小900-950个核苷酸。在一些实施方案中，NFH启动子长度为920个核苷酸。
在一些实施方案中，载体基因组包含scn8a启动子。scn8a启动子可以具有大小450-500个核苷酸。在一些实施方案中，scn8a启动子长度为470个核苷酸。
在一些实施方案中，载体基因组包含FXN启动子。
在一些实施方案中，载体基因组包含PGK启动子。
在一些实施方案中，载体基因组包含CBA启动子。
在一些实施方案中，载体基因组包含CMV启动子。
在一些实施方案中，载体基因组包含H1启动子。
在一些实施方案中，载体基因组包含U6启动子。
在一些实施方案中，载体基因组包含肝脏或骨骼肌启动子。肝脏启动子的非限制性实例包括hAAT和TBG。骨骼肌启动子的非限制性实例包括肌间线蛋白(Desmin)、MCK和C5-12。
在一些实施方案中，AAV载体包含增强子元件、启动子和/或5’UTR内含子。增强子可以是但不限于CMV增强子，启动子可以是但不限于CMV、CBA、FXN、UBC、GUSB、NSE、突触蛋白、MeCP2或GFAP启动子；5’UTR/内含子可以是但不限于SV40和CBA-MVM。在一些实施方案中，组合使用的增强子、启动子和/或内含子可以是：(1)CMV增强子、CMV启动子、SV40 5’UTR内含子；(2)CMV增强子、CBA启动子、SV 40 5’UTR内含子；(3)CMV增强子、CBA启动子、CBA-MVM 5’UTR内含子；(4)UBC启动子；(5)GUSB启动子；(6)NSE启动子；(7)突触蛋白启动子；(8)MeCP2启动子；(9)GFAP启动子；(10)H1启动子；和/或(11)U6启动子。
在一些实施方案中，AAV载体具有经工程化改造的启动子。
在一些实施方案中，AAV载体包含启动子，所述启动子包含与选自SEQ ID NO:1734-1777的序列具有至少90％、至少95％、至少99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，启动子为CMV启动子或源自CMV启动子，且包含与选自SEQ ID NO:1743-1751、1767、1772-1774和1777的序列具有至少90％、至少95％、至少99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，启动子为CBA启动子或源自CBA启动子，且包含与选自SEQ ID NO：1734-1742、1760-1766、1768和1775-1776的序列具有至少90％、至少95％、至少99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，启动子为FXN启动子或源自FXN启动子，且包含与选自SEQ ID NO:1752-1759和1769-1770的序列具有至少90％、至少95％、至少99％或100％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，启动子包含与SEQ ID NO:1738具有至少90％、至少95％、至少99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，启动子为SEQ ID NO:1738。在一些实施方案中，AAV载体基因组包含与SEQ ID NO:1738具有至少90％序列同一性的启动子序列和编码与SEQ ID NO:1725具有至少90％相同的氨基酸序列的共济蛋白多肽的有效载荷区(例如，包含与SEQ ID NO：1824至少90％相同的核酸序列的有效载荷区)。在一些实施方案中，AAV载体基因组包含与SEQ ID NO：1738具有至少95％序列同一性的启动子序列和编码与SEQ ID NO:1725具有至少95％相同的氨基酸序列的共济蛋白多肽的有效载荷区(例如，包含与SEQ ID NO:1824至少95％相同的核酸序列的有效载荷区)。在一些实施方案中，AAV载体基因组包含SEQ ID NO:1738的启动子序列和编码具有SEQ ID NO:1725的氨基酸序列的共济蛋白多肽的有效载荷区(例如，包含SEQ ID NO：1824的有效载荷区)和/或进一步包含如表5-11中所提供的一个或多个序列或其95％相同的变体。在一些实施方案中，共济蛋白多肽由包含SEQ ID NO:1728或其片段的核酸序列，任选地SEQ ID NO：1728的核苷酸221-853编码。在一些实施方案中，共济蛋白多肽由包含SEQ ID NO：1822、1823或1824的核酸序列编码。
在一些实施方案中，启动子包含与SEQ ID NO:1738具有至少90％、至少95％、至少99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，启动子为SEQ ID NO：1740。在一些实施方案中，AAV载体基因组包含与SEQ ID NO:1740具有至少90％序列同一性的启动子序列和编码与SEQ ID NO:1725具有至少90％相同的氨基酸序列的共济蛋白多肽的有效载荷区(例如，包含与SEQ ID NO:1824至少90％相同的核酸序列的有效载荷区)。在一些实施方案中，AAV载体基因组包含与SEQ ID NO:1740具有至少95％序列同一性的启动子序列和编码与SEQ ID NO:1725具有至少95％相同的氨基酸序列的共济蛋白多肽的有效载荷区(例如，包含与SEQ ID NO:1824至少95％相同的核酸序列的有效载荷区)。在一些实施方案中，AAV载体基因组包含SEQ ID NO:1740的启动子序列和编码具有SEQ ID NO:1725的氨基酸序列的共济蛋白多肽的有效载荷区(例如，包含SEQ ID NO:1824的有效载荷区)和/或进一步包含如表5-11中所提供的一个或多个序列或其95％相同的变体。在一些实施方案中，共济蛋白多肽由包含SEQ ID NO:1728或其片段的核酸序列，任选地SEQ ID NO:1728的核苷酸221-853编码。在一些实施方案中，共济蛋白多肽由包含SEQ ID NO：1822、1823或1824的核酸序列编码。
在一些实施方案中，启动子包含与SEQ ID NO:1742具有至少90％、至少95％、至少99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，启动子为SEQ ID NO:1742。在一些实施方案中，AAV载体基因组包含与SEQ ID NO:1742具有至少90％序列同一性的启动子序列和编码与SEQ ID NO:1725具有至少90％相同的氨基酸序列的共济蛋白多肽的有效载荷区(例如，包含与SEQ ID NO:1824至少90％相同的核酸序列的有效载荷区)。在一些实施方案中，AAV载体基因组包含与SEQ ID NO:1742具有至少95％序列同一性的启动子序列和编码与SEQ ID NO:1725具有至少95％相同的氨基酸序列的共济蛋白多肽的有效载荷区(例如，包含与SEQ ID NO:1824至少95％相同的核酸序列的有效载荷区)。在一些实施方案中，AAV载体基因组包含SEQ ID NO:1742的启动子序列和编码具有SEQ ID NO:1725的氨基酸序列的共济蛋白多肽的有效载荷区(例如，包含SEQ ID NO:1824的有效载荷区)和/或进一步包含如表5-11中所提供的一个或多个序列或其95％相同的变体。在一些实施方案中，共济蛋白多肽由包含SEQ ID NO:1728或其片段的核酸序列，任选地SEQ ID NO:1728的核苷酸221-853编码。在一些实施方案中，共济蛋白多肽由包含SEQ ID NO:1822、1823或1824的核酸序列编码。
在一些实施方案中，启动子包含与SEQ ID NO:1750具有至少90％、至少95％、至少99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，启动子为SEQ ID NO:1750。在一些实施方案中，AAV载体基因组包含与SEQ ID NO:1750具有至少90％序列同一性的启动子序列和编码与SEQ ID NO:1725具有至少90％相同的氨基酸序列的共济蛋白多肽的有效载荷区(例如，包含与SEQ ID NO:1824至少90％相同的核酸序列的有效载荷区)。在一些实施方案中，AAV载体基因组包含与SEQ ID NO:1750具有至少95％序列同一性的启动子序列和编码与SEQ ID NO:1725具有至少95％相同的氨基酸序列的共济蛋白多肽的有效载荷区(例如，包含与SEQ ID NO:1824至少95％相同的核酸序列的有效载荷区)。在一些实施方案中，AAV载体基因组包含SEQ ID NO:1750的启动子序列和编码具有SEQ ID NO:1725的氨基酸序列的共济蛋白多肽的有效载荷区(例如，包含SEQ ID NO:1824的有效载荷区)和/或进一步包含如表5-11中所提供的一个或多个序列或其95％相同的变体。在一些实施方案中，共济蛋白多肽由包含SEQ ID NO:1728或其片段的核酸序列，任选地SEQ ID NO:1728的核苷酸221-853编码。在一些实施方案中，共济蛋白多肽由包含SEQ ID NO：1822、1823或1824的核酸序列编码。
在一些实施方案中，病毒基因组包含增强子，例如立即早期的“ie”增强子或CMV/珠蛋白增强子。在一些实施方案中，增强子包含ie1外显子1和ie1内含子1或其片段。在一些实施方案中，增强子包含ie1外显子1、ie1内含子1或其片段、人类β-珠蛋白内含子2和人类β-珠蛋白外显子3。在一些实施方案中，增强子包含与如SEQ ID NO:1815-1821中的任意一个所给出的序列至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，增强子包含与如SEQ ID NO:1816所给出的序列至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，病毒基因组包含如上所述的增强子和编码共济蛋白的有效载荷区，例如编码SEQ ID NO:1725或具有至少90％序列同一性的其变体，或包含核酸序列SEQID NO:1824或具有至少90％序列同一性的其变体。
内含子
在一些实施方案中，载体基因组包含至少一个内含子或其片段或衍生物。在一些实施方案中，至少一个内含子可以增强FXN的表达(参见，例如Powell et al.ViralExpression Cassette Elements to Enhance Transgene Target Specificity andExpression in Gene Therapy,2015；其内容通过引用整体并入本文)。内含子的非限制性实例包括MVM(67-97bp)、F.IX截短的内含子1(300bp)、β-球蛋白SD/免疫球蛋白重链剪接受体(250bp)、腺病毒剪接供体/免疫球蛋白剪接受体(500bp)、SV40晚期剪接供体/剪接受体(19S/16S)(180bp)和杂交腺病毒剪接供体/IgG剪接受体(230bp)。
在一些实施方案中，内含子的长度可以是100-500个核苷酸。内含子可以具有长度80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490或500个核苷酸。内含子可以具有长度在80-100、80-120、80-140、80-160、80-180、80-200、80-250、80-300、80-350、80-400、80-450、80-500、200-300、200-400、200-500、300-400、300-500或400-500个核苷酸之间。
在一些实施方案中，AAV载体可以包含SV40内含子或其片段或变体。在一些实施方案中，启动子可以是CMV。在一些实施方案中，启动子可以是CBA。在一些实施方案中，启动子可以是H1。
在一些实施方案中，AAV载体可以包含一个或多个β-珠蛋白内含子或其片段或变体。在一些实施方案中，内含子包含一个或多个人类β-珠蛋白序列(例如，包括其片段/变体)。在一些实施方案中，内含子包含与如SEQ ID NO：1815-1821中的任意一个所给出的序列至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，病毒基因组包含如上所述的内含子和编码共济蛋白的有效载荷区，例如编码SEQ ID NO：1725或具有至少90％序列同一性的其变体，或包含核酸序列SEQ ID NO：1824或具有至少90％序列同一性的其变体。在一些实施方案中，启动子可以是CMV。在一些实施方案中，启动子可以是CBA。在一些实施方案中，启动子可以是H1。
在一些实施方案中，编码的FXN可以位于表达载体中内含子的下游，例如但不限于SV40内含子或β珠蛋白内含子或本领域已知的其他内含子。此外，编码的FXN还可以位于表达载体中聚腺苷酸化序列的上游。在一些实施方案中，编码的FXN可以位于表达载体中具有内含子的启动子的下游和/或聚腺苷酸化序列的上游的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或多于30个核苷酸内。在一些实施方案中，编码的FXN可以位于表达载体中内含子的下游和/或聚腺苷酸化序列的上游的1-5、1-10、1-15、1-20、1-25、1-30、5-10、5-15、5-20、5-25、5-30、10-15、10-20、10-25、10-30、15-20、15-25、15-30、20-25、20-30或25-30个核苷酸内。在一些实施方案中，编码的FXN可能位于表达载体中内含子的下游和/或聚腺苷酸化序列的上游的前1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％或多于25％的核苷酸内。在一些实施方案中，编码的FXN可能位于表达载体中内含子的下游和/或聚腺苷酸化序列的上游的前1-5％、1-10％、1-15％、1-20％、1-25％、5-10％、5-15％、5-20％、5-25％、10-15％、10-20％、10-25％、15-20％、15-25％、或20-25％的序列内。
在某些实施方案中，内含子序列不是增强子序列。
在某些实施方案中，内含子序列不是启动子序列的亚组分。
非翻译区(UTR)
根据定义，基因的野生型非翻译区(UTR)被转录但不翻译。通常，5’UTR在转录起始位点开始并在起始密码子处终止，而3’UTR在终止密码子后立即开始并持续直到转录终止信号为止。
通常在特定靶器官的大量表达的基因中发现的特征可以被工程化改造为UTR以增强稳定性和蛋白质产生。作为非限制性实例，来自肝脏中正常表达的mRNA(例如白蛋白、血清淀粉样蛋白A、载脂蛋白A/B/E、转铁蛋白、α甲胎蛋白、促红细胞生成素或因子VIII)的5’UTR可用于本公开的AAV颗粒的病毒基因组以增强在肝细胞系或肝脏中的表达。
尽管不希望受到理论的束缚，野生型5’非翻译区(UTR)包括在翻译起始中起作用的特征。通常已知参与核糖体启动许多基因翻译的过程的Kozak序列通常包括在5’UTR中。Kozak序列具有共有的CCR(A/G)CCAUGG，其中R是起始密码子(ATG)上游三个碱基的嘌呤(腺嘌呤或鸟嘌呤)，其后是另一个′G′。
在一些实施方案中，病毒基因组中的5’UTR包括Kozak序列。
在一些实施方案中，病毒基因组中的5’UTR不包括Kozak序列。
尽管不希望受到理论的束缚，但是已知野生型3’UTR具有在其中嵌入的腺苷和尿苷区段。这些富含AU的标签在具有高周转率的基因中特别普遍。基于其序列特征和功能特性，可将富含AU的元件(ARE)分为三类(Chen等人，1995，其内容通过引用整体并入本文)：I类ARE，例如但不限于c-Myc和MyoD，在富含U的区域内含有数个AUUUA基序的分散拷贝。II类ARE，例如但不限于GM-CSF和TNF-a，拥有两个或更多个重叠的UUAUUUA(U/A)(U/A)九聚体。III类ARES的定义不太明确，例如但不限于c-Jun和肌细胞生成素(Myogenin)。这些富含U的区域不含AUUUA基序。已知大多数与ARE结合的蛋白质都会使信使去稳定化，而ELAV家族的成员(最显著是HuR)已被证明增加mRNA的稳定性。HuR结合到所有三个类别的ARE。将HuR特异性结合位点工程化改造到核酸分子的3’UTR中将导致HuR结合，从而使体内信息稳定化。
引入、除去或修饰3’UTR的富含AU的元件(ARE)可用于调节多核苷酸的稳定性。当工程化改造特定的多核苷酸，例如病毒基因组的有效载荷区时，可以引入一个或多个拷贝的ARE，以使多核苷酸的稳定性降低，从而缩减翻译并降低所得蛋白质的产量。类似地，可以鉴定并除去或突变ARE，以增加细胞内稳定性，从而增加所得蛋白质的翻译和产量。
在一些实施方案中，病毒基因组的3’UTR可以包括寡聚(dT)序列，用于模板化添加poly-A尾。
可以将来自本领域已知的任何基因的任何UTR掺入AAV颗粒的病毒基因组中。这些UTR或其部分可以以与选择它们的基因中相同的方向放置，或者可以改变方向或位置。在一些实施方案中，可以将AAV颗粒的病毒基因组中使用的UTR颠倒、缩短、延长，或用本领域已知的一种或多种其他5’UTR或3’UTR制备。如本文所用，术语“改变的”在它涉及UTR时表示相对于参考序列已经以某种方式改变UTR。例如，3’或5’UTR可以通过如上所教导的方向或位置的改变相对于野生型或天然UTR改变，或者可以通过包含额外的核苷酸、核苷酸的缺失、核苷酸的交换或转座来改变。
在一些实施方案中，AAV颗粒的病毒基因组包含至少一种人工UTR，其不是野生型UTR的变体。
在一些实施方案中，AAV颗粒的病毒基因组包含UTR，其已经从转录物家族选择，所述转录物的蛋白质共享共同的功能、结构、特征或特性。
miRNA靶位点
在一些实施方案中，病毒基因组可以包括至少一个miRNA结合位点。microRNA(或miRNA或miR)是19-25个核苷酸的非编码RNA，其与核酸靶标的位点结合并通过降低核酸分子稳定性或通过抑制翻译来下调基因表达。在一些实施方案中，病毒基因组的3′UTR可以工程化改造以包括至少一个miRNA结合位点。
在一些实施方案中，病毒基因组包含编码miRNA靶位点的至少一个序列，以降低特定组织中转基因的表达。MiRNA及其靶组织在本领域中是众所周知的。在一些实施方案中，可以在病毒基因组中编码miR-122miRNA靶位点(miR-122TS)或相同的串联拷贝，以减少miR-122丰富表达的肝脏中病毒基因组的表达。
在一些实施方案中，病毒基因组包含至少一个miR122结合位点。在一些实施方案中，miR122结合位点包含与SEQ ID NO:1827具有至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，AAV载体基因组包含三个拷贝的miR122结合位点，例如，三个拷贝的SEQ ID NO:1827或具有至少90％序列同一性的其变体。在一些实施方案中，miR122结合位点系列包含与SEQ ID NO:1826具有至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，病毒基因组包含如上所述的一个、两个或三个miR122结合位点和编码共济蛋白的有效载荷区，例如编码SEQ ID NO:1725或具有至少90％序列同一性的其变体，或包含核酸序列SEQ ID NO:1824或具有至少90％序列同一性的其变体。在一些实施方案中，病毒基因组包含如上所述的三个miR122结合位点和编码共济蛋白的有效载荷区，例如编码SEQ ID NO:1725或具有至少90％序列同一性的其变体，或包含核酸序列SEQ ID NO:1824或具有至少90％序列同一性的其变体。
主链
在某些实施方案中，诸如载体主链的顺式元件掺入到编码FXN的病毒颗粒中。主链序列可以在病毒产生期间调节转录。主链序列可有助于FXN表达的稳定性。主链序列可有助于FXN的表达水平，可以将其克隆到pAAVsc或pcDNA3.1载体主链中。
聚腺苷酸化序列
在某些实施方案中，本公开的AAV颗粒的病毒基因组包含至少一个聚腺苷酸化序列。AAV颗粒的病毒基因组可以在有效载荷编码序列的3’端与3’ITR的5’端之间包含聚腺苷酸化序列。
在一些实施方案中，聚腺苷酸化序列或“poly A序列”的长度范围可以从不存在到约500个核苷酸。聚腺苷酸化序列的长度可以是但不限于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499或500个核苷酸。
在一些实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度是50-100个核苷酸。
在一些实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度是50-150个核苷酸。
在一些实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度是50-160个核苷酸。
在一些实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度是50-200个核苷酸。
在一些实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度是60-100个核苷酸。
在一些实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度是60-150个核苷酸。
在一些实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度是60-160个核苷酸。
在一些实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度是60-200个核苷酸。
在一些实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度是70-100个核苷酸。
在一些实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度是70-150个核苷酸。
在一些实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度是70-160个核苷酸。
在一些实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度是70-200个核苷酸。
在一些实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度是80-100个核苷酸。
在一些实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度是80-150个核苷酸。
在一些实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度是80-160个核苷酸。
在一些实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度是80-200个核苷酸。
在一些实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度是90-100个核苷酸。
在一些实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度是90-150个核苷酸。
在一些实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度是90-160个核苷酸。
在一些实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度是90-200个核苷酸。
在一些实施方案中，编码的FXN可以位于表达载体中聚腺苷酸化序列的上游。此外，编码的FXN可以位于表达载体或其片段(例如，本文公开的一个)中的启动子的下游，所述启动子例如但不限于具有SV40内含子的CMV、U6、CBA或CBA启动子。在一些实施方案中，编码的FXN可以位于表达载体中启动子的下游和/或聚腺苷酸化序列的上游的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或多于30个核苷酸内。在一些实施方案中，编码的FXN可以位于表达载体中内含子的下游和/或聚腺苷酸化序列的上游的1-5、1-10、1-15、1-20、1-25、1-30、5-10、5-15、5-20、5-25、5-30、10-15、10-20、10-25、10-30、15-20、15-25、15-30、20-25、20-30或25-30个核苷酸内。在一些实施方案中，编码的FXN可能位于表达载体中启动子的下游和/或聚腺苷酸化序列的上游的前1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％或多于25％的核苷酸内。在一些实施方案中，编码的FXN可能位于表达载体中启动子的下游和/或聚腺苷酸化序列的上游的前1-5％、1-10％、1-15％、1-20％、1-25％、5-10％、5-15％、5-20％、5-25％、10-15％、10-20％、10-25％、15-20％、15-25％或20-25％内。
在一些实施方案中，病毒基因组包含人类生长激素(hGH)polyA序列。在一些实施方案中，病毒基因组包含与SEQ ID NO：1828至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的polyA序列。在一些实施方案中，病毒基因组包含如上所述的hGH polyA和编码共济蛋白的有效载荷区，例如编码SEQ ID NO:1725或具有至少90％序列同一性的其变体，或包含核酸序列SEQ ID NO:1824或具有至少90％序列同一性的其变体。
填充物序列
在一些实施方案中，病毒基因组包含一个或多个填充物序列。填充物序列可以是野生型序列或经工程化改造的序列。填充物序列可以是野生型序列的变体。在一个实施方案中，填充物序列是人类白蛋白的衍生物。
在一些实施方案中，病毒基因组包含一个或多个填充物序列以使病毒基因组的长度为包装的最佳大小。在一些实施方案中，病毒基因组包含至少一个填充物序列以使病毒基因组的长度为约2.3kb。在一些实施方案中，病毒基因组包含至少一个填充物序列以使病毒基因组的长度为约4.6kb。
在一些实施方案中，病毒基因组是单链(ss)病毒基因组，并包含一个或多个填充物序列，独立或共同具有长度约0.1kb-3.8kb之间，例如但不限于0.1kb、0.2kb、0.3kb、0.4kb、0.5kb、0.6kb、0.7kb、0.8kb、0.9kb、1kb、1.1kb、1.2kb、1.3kb、1.4kb、1.5kb、1.6kb、1.7kb、1.8kb、1.9kb、2kb、2.1kb、2.2kb、2.3kb、2.4kb、2.5kb、2.6kb、2.7kb、2.8kb、2.9kb、3kb、3.1kb、3.2kb、3.3kb、3.4kb、3.5kb、3.6kb、3.7kb或3.8kb。在一些实施方案中，载体基因组中的全长填充物序列为3.1kb。在一些实施方案中，载体基因组中的全长填充物序列为2.7kb。在一些实施方案中，载体基因组中的全长填充物序列为0.8kb。在一些实施方案中，载体基因组中的全长填充物序列为0.4kb。在一些实施方案中，载体基因组中每个填充物序列的长度为0.8kb。在一些实施方案中，载体基因组中每个填充物序列的长度为0.4kb。
在一些实施方案中，病毒基因组是自身互补(sc)病毒基因组，并包含一个或多个填充物序列，独立或共同具有长度约0.1kb-1.5kb之间，例如但不限于0.1kb、0.2kb、0.3kb、0.4kb、0.5kb、0.6kb、0.7kb、0.8kb、0.9kb、1kb、1.1kb、1.2kb、1.3kb、1.4kb或1.5kb。在一些实施方案中，载体基因组中的全长填充物序列为0.8kb。在一些实施方案中，载体基因组中的全长填充物序列为0.4kb。在一些实施方案中，载体基因组中每个填充物序列的长度为0.8kb。在一些实施方案中，载体基因组中每个填充物序列的长度为0.4kb。
在一些实施方案中，病毒基因组包含填充物序列的任何部分。病毒基因组可包含填充物序列的1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。
在一些实施方案中，病毒基因组是单链(ss)病毒基因组，并包含一个或多个填充物序列以使病毒基因组的长度为约4.6kb。在一些实施方案中，病毒基因组包含至少一个填充物序列，并且填充物序列位于5’ITR序列的3’。在一些实施方案中，病毒基因组包含至少一个填充物序列，并且该填充物序列位于启动子序列的5’。在一些实施方案中，病毒基因组包含至少一个填充物序列，并且该填充物序列位于聚腺苷酸化信号序列的3’。在一些实施方案中，病毒基因组包含至少一个填充物序列，并且该填充物序列位于3’ITR序列的5’。在一些实施方案中，病毒基因组包含至少一个填充物序列，并且该填充物序列位于两个内含子序列之间。在一些实施方案中，病毒基因组包含至少一个填充物序列，并且该填充物序列位于内含子序列内。在一些实施方案中，病毒基因组包含两个填充物序列，并且第一填充物序列位于5’ITR序列的3’，并且第二填充物序列位于聚腺苷酸化信号序列的3’。在一些实施方案中，病毒基因组包含两个填充物序列，并且第一填充物序列位于启动子序列的5’，而第二填充物序列位于聚腺苷酸化信号序列的3’。在一些实施方案中，病毒基因组包含两个填充物序列，并且第一填充物序列位于5’ITR序列的3’，并且第二填充物序列位于5’ITR序列的5’。
在一些实施方案中，病毒基因组是自身互补(sc)病毒基因组，并包含一个或多个填充物序列以使病毒基因组的长度为约2.3kb。在一些实施方案中，病毒基因组包含至少一个填充物序列，并且填充物序列位于5’ITR序列的3’。在一些实施方案中，病毒基因组包含至少一个填充物序列，并且该填充物序列位于启动子序列的5’。在一些实施方案中，病毒基因组包含至少一个填充物序列，并且该填充物序列位于聚腺苷酸化信号序列的3’。在一些实施方案中，病毒基因组包含至少一个填充物序列，并且该填充物序列位于3’ITR序列的5’。在一些实施方案中，病毒基因组包含至少一个填充物序列，并且该填充物序列位于两个内含子序列之间。作为非限制性实例，病毒基因组包含至少一个填充物序列，并且该填充物序列位于内含子序列内。在一些实施方案中，病毒基因组包含两个填充物序列，并且第一填充物序列位于5’ITR序列的3’，并且第二填充物序列位于聚腺苷酸化信号序列的3’。在一些实施方案中，病毒基因组包含两个填充物序列，并且第一填充物序列位于启动子序列的5’，而第二填充物序列位于聚腺苷酸化信号序列的3’。在一些实施方案中，病毒基因组包含两个填充物序列，并且第一填充物序列位于5’ITR序列的3’，并且第二填充物序列位于5’ITR序列的5’。
在一些实施方案中，病毒基因组可以在病毒基因组的多个区域之一之间包含一个或多个填充物序列。在一些实施方案中，填充物区可以位于诸如但不限于有效载荷区、反向末端重复(ITR)、启动子区、内含子区、增强子区、聚腺苷酸化信号序列区和/或外显子区等区域之前。在一些实施方案中，填充物区可以位于诸如但不限于有效载荷区、反向末端重复(ITR)、启动子区、内含子区、增强子区、聚腺苷酸化信号序列区和/或外显子区等区域之后。在一些实施方案中，填充物区可以位于诸如但不限于有效载荷区、反向末端重复(ITR)、启动子区、内含子区、增强子区、聚腺苷酸化信号序列区和/或外显子区等区域之前和之后。
在一些实施方案中，病毒基因组可包含一个或多个将病毒基因组的至少一个区域分叉(bifurcate)的填充物序列。病毒基因组的分叉区域可包含填充物序列区5’的区域的1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。在一些实施方案中，填充物序列可以分叉至少一个区域，使得该区域的10％位于填充物序列的5’并且该区域的90％位于填充物序列的3’。在一些实施方案中，填充物序列可以分叉至少一个区域，使得该区域的20％位于填充物序列的5’并且该区域的80％位于填充物序列的3’。在一些实施方案中，填充物序列可以分叉至少一个区域，使得该区域的30％位于填充物序列的5’并且该区域的70％位于填充物序列的3’。在一些实施方案中，填充物序列可以分叉至少一个区域，使得该区域的40％位于填充物序列的5’并且该区域的60％位于填充物序列的3’。在一些实施方案中，填充物序列可以分叉至少一个区域，使得该区域的50％位于填充物序列的5’并且该区域的50％位于填充物序列的3’。在一些实施方案中，填充物序列可以分叉至少一个区域，使得该区域的60％位于填充物序列的5’并且该区域的40％位于填充物序列的3’。在一些实施方案中，填充物序列可以分叉至少一个区域，使得该区域的70％位于填充物序列的5’并且该区域的30％位于填充物序列的3’。在一些实施方案中，填充物序列可以分叉至少一个区域，使得该区域的80％位于填充物序列的5’并且该区域的20％位于填充物序列的3’。在一些实施方案中，填充物序列可以分叉至少一个区域，使得该区域的90％位于填充物序列的5’并且该区域的10％位于填充物序列的3’。
在一些实施方案中，病毒基因组在5’ITR之后包含填充物序列。
在一些实施方案中，病毒基因组在启动子区之后包含填充物序列。在一些实施方案中，病毒基因组在有效载荷区之后包含填充物序列。在一些实施方案中，病毒基因组在内含子区之后包含填充物序列。在一些实施方案中，病毒基因组在增强子区之后包含填充物序列。在一些实施方案中，病毒基因组在聚腺苷酸化信号序列区之后包含填充物序列。在一些实施方案中，病毒基因组在外显子区之后包含填充物序列。
在一些实施方案中，病毒基因组在启动子区之前包含填充物序列。在一些实施方案中，病毒基因组在有效载荷区之前包含填充物序列。在一些实施方案中，病毒基因组在内含子区之前包含填充物序列。在一些实施方案中，病毒基因组在增强子区之前包含填充物序列。在一些实施方案中，病毒基因组在聚腺苷酸化信号序列区之前包含填充物序列。在一些实施方案中，病毒基因组在外显子区之前包含填充物序列。
在一些实施方案中，病毒基因组在3’ITR之前包含填充物序列。
在一些实施方案中，填充物序列可以位于两个区域之间，例如但不限于5’ITR和启动子区。在一些实施方案中，填充物序列可以位于两个区域之间，例如但不限于5’ITR和有效载荷区。在一些实施方案中，填充物序列可以位于两个区域之间，例如但不限于5’ITR和内含子区。在一些实施方案中，填充物序列可以位于两个区域之间，例如但不限于5’ITR和增强子区。在一些实施方案中，填充物序列可以位于两个区域之间，例如但不限于5’ITR和聚腺苷酸化信号序列区。
在一些实施方案中，填充物序列可以位于两个区域之间，例如但不限于5’ITR和外显子区。
在一些实施方案中，填充物序列可以位于两个区域之间，例如但不限于启动子区和有效载荷区。在一些实施方案中，填充物序列可以位于两个区域之间，例如但不限于启动子区和内含子区。在一些实施方案中，填充物序列可以位于两个区域之间，例如但不限于启动子区和增强子区。在一些实施方案中，填充物序列可以位于两个区域之间，例如但不限于启动子区和聚腺苷酸化信号序列区。在一些实施方案中，填充物序列可以位于两个区域之间，例如但不限于启动子区和外显子区。在一些实施方案中，填充物序列可以位于两个区域之间，例如但不限于启动子区和3’ITR。
在一些实施方案中，填充物序列可以位于两个区域之间，例如但不限于有效载荷区和内含子区。在一些实施方案中，填充物序列可以位于两个区域之间，例如但不限于有效载荷区和增强子区。在一些实施方案中，填充物序列可以位于两个区域之间，例如但不限于有效载荷区和聚腺苷酸化信号序列区。在一些实施方案中，填充物序列可以位于两个区域之间，例如但不限于有效载荷区和外显子区。
在一些实施方案中，填充物序列可以位于两个区域之间，例如但不限于有效载荷区和3’ITR。
自互补和单链载体
在一些实施方案中，本公开中使用的AAV载体是单链载体(ssAAV)。
在一些实施方案中，AAV载体可以是自互补AAV载体(scAAV)。参见，例如，美国专利号7,465,583。scAAV载体含有两个DNA链，退火在一起形成双链DNA。通过跳过第二链合成，scAAV允许在细胞中快速表达。
在一些实施方案中，本公开中使用的AAV载体是SCAAV。
用于生产和/或修饰AAV载体的方法是本领域中公开的，如假型化(pseudotyped)AAV载体(国际PCT专利公开号WO200028004；WO200123001；WO2004112727；WO 2005005610和WO2005072364，其各自的内容通过引用整体并入本文)。
基因组大小
在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒的病毒基因组可以是单链或双链。载体基因组的大小可以是小、中、大或最大大小。
在一些实施方案中，包含本文描述的编码FXN的核酸序列，可以是小的单链载体基因组。小的单链载体基因组大小可以为约2.7kb至约3.5kb，例如大小约2.7、约2.8、约2.9、约3.0、约3.1、约3.2、约3.3、约3.4、或约3.5kb。在一些实施方案中，小的单链载体基因组的大小可以是3.2kb。
在一些实施方案中，包含本文描述的编码FXN的核酸序列的载体基因组可以是小的双链载体基因组。小的双链载体基因组的大小可以为约1.3至约1.7kb，例如大小为约1.3、约1.4、约1.5、约1.6、或约1.7kb。在一些实施方案中，小双链载体基因组的大小可以是1.6kb。
在一些实施方案中，包含本文描述的编码FXN的核酸序列的载体基因组可以是中等单链载体基因组。中等单链载体基因组的大小可以为约3.6至约4.3kb，例如约3.6、约3.7、约3.8、约3.9、约4.0、约4.1、约4.2、或约4.3kb。。在一些实施方案中，中等单链载体基因组的大小可以为4.0kb。
在一些实施方案中，包含本文描述的编码FXN的核酸序列的载体基因组可以是中等单双链载体基因组。中等单双链载体基因组大小可以为约1.8至约2.1kb，例如约1.8、约1.9、约2.0、或约2.1kb。在一些实施方案中，中等单双链载体基因组大小可以为2.0kb。另外，载体基因组可包含启动子和polyA尾。在一个实施方案中，包含本文描述的编码FXN的核酸序列的载体基因组可以是大单链载体基因组。大单链载体基因组大小可以是4.4至6.0kb，例如大小约4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9和6.0kb。作为非限制性实例，大单链载体基因组大小可以是4.8kb。作为另一个非限制性实例，大单链载体基因组的大小可以是6.0kb。
在一个实施方案中，包含本文描述的编码FXN的核酸序列的载体基因组可以是大的双链载体基因组。大的双链载体基因组的大小可以为2.2至3.0kb，例如大小约2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9和3.0kb。作为非限制性实例，大的双链载体基因组的大小可以是2.4kb。
有效载荷
在一些实施方案中，本公开提供了允许改善由基因治疗载体递送的FXN表达的构建体。
在一些方面，本公开涉及含有或包含编码共济蛋白(FXN)或其功能片段的核酸序列的组合物及其在人类和/或动物模型疾病中在体外或体内施用这些组合物的方法。
本公开的AAV颗粒可包括编码至少一个“有效载荷”的核酸序列。如本文所用，“有效载荷”或“有效载荷区域”是指由病毒基因组或病毒基因组内编码的一个或多个多核苷酸或多核苷酸区，或此类多核苷酸或多核苷酸区的表达产物，例如转基因，编码多肽的多核苷酸或多-多肽的多核苷酸，例如FXN或其变型。有效载荷可包括本领域已知的任何核酸，其可用于在转导或接触携带有效载荷的AAV颗粒的靶细胞中表达FXN(通过补充蛋白质产物或使用调节性核酸替代基因)。
有效载荷构建体可包括编码和非编码核酸序列的组合。
病毒基因组和其中的任何段、片段或全部，有效载荷构建体可以是经密码子优化的。
在一些实施方案中，AAV粒子的核酸序列可以是包括编码FXN的至少一部分的有效载荷构建体。
在一些实施方案中，有效载荷构建体编码多于一个有效载荷。作为非限制性实例，可以将编码多于一个有效载荷的有效载荷构建体复制并将其包装成病毒粒子。用包含多于一个有效载荷的病毒颗粒转导的靶细胞可以在单个细胞中表达每个有效载荷。
在一些实施方案中，有效载荷构建体可以编码编码或非编码RNA。在某些实施方案中，腺相关病毒载体颗粒还包含选自由Kozak序列、主链序列和内含子序列组成的至少一种顺式元件。
在一些实施方案中，有效载荷是可以是肽或蛋白质的多肽。由有效载荷构建体编码的蛋白质可包含分泌的蛋白质、细胞内蛋白质、细胞外蛋白质和/或膜蛋白。编码的蛋白质可以是结构或功能的。由有效载荷构建体编码的蛋白质包括但不限于哺乳动物蛋白质。在某些实施方案中，AAV颗粒含有编码FXN或其变体的病毒基因组。编码有效载荷的AAV颗粒可能在人类疾病、兽医应用和各种体内和体外设置的领域中是有用的。
在一些实施方案中，有效载荷可包含用作标记物蛋白以评估细胞转化和表达的多肽、融合蛋白、具有所需生物活性的多肽、可以补充遗传缺陷的基因产物、RNA分子、转录因子和与调节和/或表达有关的其他基因产物。在一些实施方案中，有效载荷可以包括核苷酸序列，其提供所需的效果或调节功能(例如，转座子、转录因子)。
编码的有效载荷可包括基因治疗产品。基因治疗产品可包括但不限于多肽、RNA分子或其他基因产物，当在靶细胞中表达时，提供所需的治疗效果。在一些实施方案中，基因治疗产品可包含无功能基因或不存在的，表达量不足或突变的基因的替代物。在一些实施方案中，基因治疗产品可包含非功能性蛋白质或多肽或不存在、表达量不足、折叠错误，降解速度过快或突变的蛋白质或多肽的替代物。例如，基因治疗产品可包含以治疗FXN缺乏或FA的FXN多肽或编码FXN多肽的多核苷酸。
在一些实施方案中，有效载荷编码信使RNA(mRNA)。如本文所用，术语“信使RNA”(mRNA)是指编码感兴趣的多肽的任何多核苷酸，并且能够被翻译成在体外、体内、原位或离体产生的编码的多肽。某些实施方案为mRNA提供编码FXN或其变体。
mRNA的组分包括但不限于编码区、5′-UTR(未翻译区)、3′-UTR、5′-帽和poly-A尾。在一些实施方案中，编码的mRNA或AAV基因组的任何部分可以是经密码子优化的。
在一些实施方案中，由编码FXN的有效载荷构建体或其变体编码的蛋白质或多肽的长度违约50和约4500个氨基酸残基之间(在此上下文中，“X氨基酸长度”是指X氨基酸残基)。在一些实施方案中，编码的蛋白质或多肽的长度为50-2000个氨基酸。在一些实施方案中，编码的蛋白质或多肽的长度为50-1000个氨基酸。在一些实施方案中，编码的蛋白质或多肽的长度为50-1500个氨基酸。在一些实施方案中，编码的蛋白质或多肽的长度为50-1000个氨基酸。在一些实施方案中，编码的蛋白质或多肽的长度为50-800个氨基酸。在一些实施方案中，编码的蛋白质或多肽的长度为50-600个氨基酸。在一些实施方案中，编码的蛋白质或多肽的长度为50-400个氨基酸。在一些实施方案中，编码的蛋白质或多肽的长度为50-200个氨基酸。在一些实施方案中，编码的蛋白质或多肽的长度为50-100个氨基酸。
编码有效载荷的有效载荷构建体可以包含或编码选择性标记物。选择性标记物可包含基因序列或通过在宿主细胞中表达的基因序列编码的蛋白质或多肽，允许从可能表达或可能不表达选择性标记物的细胞群中鉴定、选择和/或纯化宿主细胞。在一些实施方案中，选择性标记物提供抗性以存活选择过程，否则将杀死宿主细胞，例如用抗生素治疗。在一些实施方案中，抗生素选择性标记物可包含一种或多种抗生素抗性因子，包括但不限于新霉素抗性(例如，Neo)、潮霉素抗性、卡那霉素抗性和/或嘌呤霉素抗性。
在一些实施方案中，编码蛋白质或多肽的任何核酸序列可以用作包括由特异性抗体识别的选择性标记物。
在一些实施方案中，编码有效载荷的有效载荷构建体可包括选择性标记物，包括但不限于β-内酰胺酶、荧光素酶、β-半乳糖苷酶或该术语在本领域中可以理解的任何其他报告基因，包括细胞表面标记物，如CD4或截短的神经生长因子(NGFR)(用于GFP，参见WO96/23810；Heim et al.,Current Biology 2:178-182(1996)；Heim et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1995)；or Heim et al.,Science 373:663-664(1995)；forβ-lactamase,see WO 96/30540)；每个的内容通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，编码选择性标记物的有效载荷构建体可包含荧光蛋白。如本文所述的荧光蛋白可包含任何荧光标记物，包括但不限于绿色、黄色和/或红色荧光蛋白(GFP、YFP和/或RFP)。在一些实施方案中，编码选择性标记物的有效负载构建体可包含人类流感血凝素(HA)标签。
在某些实施方案中，将在靶细胞中表达有效载荷的核酸掺入病毒基因组中并位于两个ITR序列之间。
有效载荷：共济蛋白
在一些实施方案中，有效载荷是共济蛋白。如本文所用，术语“共济蛋白”或“FXN蛋白”可与“共济蛋白多肽”或“FXN多肽”互换使用，并涵盖野生型FXN以及其功能变体。功能变体是一种变体，其保留其野生型对应物的一些或全部活性，以达到所需的治疗效果。例如，在一些实施方案中，功能变体可有效地用于基因疗法以治疗病症或病况，例如FXN缺乏或FA。除非另有说明，否则如本文所述的FXN的变体(例如，在本公开的上下文的构建体、载体、基因组、方法、试剂盒、组合物等)是功能变体。
弗里德里希共济失调(FA)是一种常染色体隐性病症，当共济蛋白(FXN)基因含有扩展的固有的GAA重复时发生(三核苷酸重复扩展(expansion)的实例)。参见Parkinson etal.,Journal of Neurochemistry,2013,126(Suppl.1),103-117,其内容通过引用整体并入本文。在基因内GAA重复扩展导致FXN蛋白质水平降低。FXN是一种铁结合蛋白，负责形成铁-硫簇。FXN蛋白缺乏的一个结果是线粒体铁过载，这可能会对许多蛋白质造成损伤。参见Nageshwaran和Festenstein,Frontiers in Neurology,Vol.6,Art.262(2015)，其内容通过引用整体并入本文。FXN基因位于9号染色体上。参见Sandi et al.,Frontiers inGenetics,Vol.5,Art.165(June 2014)，其内容通过引用整体并入本文。
突变基因在第一内含子中含有扩展的GAA三联重复，并且在几种情况下，已经检测到点突变。因为缺陷位于内含子中(从转录和翻译之间的mRNA转录物中除去)，因此该突变不会导致异常的FXN蛋白质产生。参见Nageshwaran和Festenstein,Frontiers inNeurology,Vol.6,Art.262(2015)。相反，突变通过异源染色质结构的诱导以类似于位置效应变异(position-effect variegation)的方式导致基因沉默(即，突变降低了基因的转录)。除了降低FXN蛋白的表达之外，在体内酵母研究中，长束的GAA重复诱导染色体断裂。
低水平的FXN蛋白导致线粒体电子传输和功能性顺乌头酸酶(aconitase)组装所需的铁-硫簇的生物合成不足，以及整个细胞的铁代谢失调。参见Nageshwaran andFestenstein,Frontiers in Neurology,Vol.6,Art.262(2015)。在正常的个体中，FXN基因编码线粒体基质FXN蛋白。这种球状蛋白质由两种α螺旋和七个β链组成，并且是高度保守的，发生在所有真核生物和一些原核生物中。FXN蛋白质具有各种已知功能；最值得注意的是，它有助于电子传输链中的铁-硫蛋白合成以最终产生三磷酸腺苷(ATP)，所述三磷酸腺苷(ATP)为细胞中进行代谢功能所需的能量流通。FXN蛋白还调节线粒体中的铁转移，以提供适量的活性氧(ROS)以维持正常过程。没有FXN蛋白，线粒体中的能量失去，并且过量的铁引起额外的ROS产生，导致进一步的细胞损伤。
最终可能发现中枢神经系统的其他病症与FXN蛋白的数量或功能的异常表达或缺乏有关。此类病症可包括但不限于神经性或神经肌肉病症，如阿尔茨海默氏病、亨廷顿氏疾病(Huntington’s disease)、自闭症(autism)、帕金森病、脊髓肌肉萎缩，或本文所述的其他神经性或神经肌病疾病、病症或病况。
如本文所用，“与降低的共济蛋白水平相关”或“与降低的表达相关”是指由靶组织中或在生物流体如血液中低于正常的共济蛋白水平中引起的一种或多种症状。与降低的共济蛋白水平或表达相关的疾病或病症可能是中枢神经系统的病症。此类疾病或病况可能是神经肌肉或神经性病症或病况。例如，与降低的共济蛋白水平相关的疾病可以是FA，或者可以是本文所述的另一种神经性或神经肌肉病症。
本公开通过提供用于治疗FA的通过基于AAV的组合物和复合物递送的FXN相关治疗来解决新技术的需求。
在AAV环境中举例说明递送，而其他病毒载体、非病毒载体、纳米颗粒或脂质体可以类似地用于递送治疗性FXN，且包括但不限于任何AAV血清型的载体基因组，或其他病毒递送媒介物或慢病毒等。观察和教导延伸到任何大分子结构，包括以本文所述的方式引入CNS中的经修饰的细胞。
在表2中给出的是共济蛋白的代表性多核苷酸和多肽序列的序列标示符，其可用于本文公开的病毒基因组并且可以构成共济蛋白有效载荷。还可以使用功能变体，例如，保留与表2中所示的序列至少约90％或至少95％序列同一性的那些。还可以使用密码子优化的和编码相同或基本相同的FXN氨基酸序列的其他变体(例如，具有至少约90％氨基酸序列同一性的那些)。
表2.代表性的共济蛋白序列
Figure BDA0003088012730001141
在一些实施方案中，病毒基因组包含编码共济蛋白的有效载荷区。编码的共济蛋白可以源自自任何物种，例如但不限于人类、非人类灵长类动物或啮齿动物。
在一些实施方案中，病毒基因组包含编码人类(智人)共济蛋白的有效载荷区或其变体。
本公开的各种实施方案提供了包含病毒基因组的腺相关病毒(AAV)颗粒，病毒基因组包含至少一个反向末端重复区和编码与人类共济蛋白(hFXN)序列SEQ ID NO:1725、1726和/或7271或其变体具有至少90％序列同一性的多肽的核酸序列。
在一些实施方案中，AAV病毒基因组包含至少一个反向末端重复区和编码与SEQID NO:1725具有至少90％序列同一性的多肽的核酸序列。在一些实施方案中，AAV病毒基因组包含至少一个反向末端重复区和编码与SEQ ID NO:1725具有至少95％序列同一性的多肽的核酸序列。在一些实施方案中，AAV病毒基因组包含至少一个反向末端重复区和编码与SEQ ID NO：1725具有至少98％序列同一性的多肽的核酸序列。在一些实施方案中，AAV病毒基因组包含至少一个反向末端重复区和编码与SEQ ID NO:1725具有至少99％序列同一性的多肽的核酸序列。在一些实施方案中，AAV病毒基因组包含至少一个反向末端重复区和编码SEQ ID NO：1725的核酸序列。
在一些实施方案中，AAV病毒基因组包含至少一个反向末端重复区和与SEQ IDNO：1728或其片段具有至少90％序列同一性的核酸序列。在一些实施方案中，AAV病毒基因组包含至少一个反向末端重复区和与SEQ ID NO：1728或其片段具有至少95％序列同一性的核酸序列。在一些实施方案中，AAV病毒基因组包含至少一个反向末端重复区和与SEQ IDNO:1728或其片段具有至少98％序列同一性的核酸序列。在一些实施方案中，AAV病毒基因组包含至少一个反向末端重复区和与SEQ ID NO：1728或其片段具有至少99％序列同一性的核酸序列。在一些实施方案中，AAV病毒基因组包含至少一个反向末端重复区和SEQ IDNO：1728或其片段的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:1728的片段包含SEQ ID NO：1728的核苷酸221-853。
在一些实施方案中，AAV病毒基因组包含至少一个反向末端重复区和与SEQ IDNO：1823或其片段具有至少90％序列同一性的核酸序列。在一些实施方案中，AAV病毒基因组包含至少一个反向末端重复区和与SEQ ID NO:1823或其片段具有至少95％序列同一性的核酸序列。在一些实施方案中，AAV病毒基因组包含至少一个反向末端重复区和与SEQ IDNO:1823或其片段具有至少98％序列同一性的核酸序列。在一些实施方案中，AAV病毒基因组包含至少一个反向末端重复区和与SEQ ID NO:1823或其片段具有至少99％序列同一性的核酸序列。在一些实施方案中，AAV病毒基因组包含至少一个反向末端重复区和SEQ IDNO:1823或其片段的核酸序列。在一些实施方案中，核酸序列进一步包含终止密码子。
在一些实施方案中，AAV病毒基因组包含至少一个反向末端重复区和与SEQ IDNO:1824或其片段具有至少90％序列同一性的核酸序列。在一些实施方案中，AAV病毒基因组包含至少一个反向末端重复区和与SEQ ID NO:1824或其片段具有至少95％序列同一性的核酸序列。在一些实施方案中，AAV病毒基因组包含至少一个反向末端重复区和与SEQ IDNO:1824或其片段具有至少98％序列同一性的核酸序列。在一些实施方案中，AAV病毒基因组包含至少一个反向末端重复区和与SEQ ID NO:1824或其片段具有至少99％序列同一性的核酸序列。在一些实施方案中，AAV病毒基因组包含至少一个反向末端重复区和SEQ IDNO:1824或其片段的核酸序列。
在一些实施方案中，FXN多肽衍生自非人类灵长类动物的FXN序列，例如猕猴，食蟹猴(cynoFXN)。某些实施方案提供FXN多肽作为食蟹猴(HcynoFXN)序列的人源化版本。在一些实施方案中，FXN多肽序列与本领域可接受的规范的人类FXN氨基酸序列SEQ ID NO:1725具有至少约90％的序列同一性，其可以由SEQ ID NO：1728的核酸序列编码。在一些实施方案中，FXN多肽序列与本领域可接受的规范的人类FXN氨基酸序列SEQ ID NO：1726具有至少约90％的序列同一性，其由SEQ ID NO：1729的核酸序列编码。在一些实施方案中，FXN多肽序列与本领域可接受的规范的人类FXN氨基酸序列SEQ ID NO：1727具有至少约90％的序列同一性，其由SEQ ID NO:1730的核酸序列编码。
在一些实施方案中，病毒基因组包含编码食蟹猴或食蟹(长尾)猕猴(食蟹猴)共济蛋白或其变体的有效载荷区。
在一些实施方案中，病毒基因组包含编码恒河猴(rhesus macaque)(恒河猴(Macaca mulatta))共济蛋白或其变体的有效载荷区。
在一些实施方案中，AAV病毒基因组包含至少一个反向末端重复区和与SEQ IDNO:1822或其片段具有至少90％序列同一性的核酸序列。
在一些实施方案中，AAV病毒基因组包含至少一个反向末端重复区和与SEQ IDNO:1822或其片段具有至少95％序列同一性的核酸序列。在一些实施方案中，AAV病毒基因组包含至少一个反向末端重复区和与SEQ ID NO：1822或其片段具有至少98％序列同一性的核酸序列。在一些实施方案中，AAV病毒基因组包含至少一个反向末端重复区和与SEQ IDNO:1822或其片段具有至少99％序列同一性的核酸序列。在一些实施方案中，AAV病毒基因组包含至少一个反向末端重复区和SEQ ID NO:1822或其片段的核酸序列。
在一些实施方案中，共济蛋白多肽可包含与上述那些中的任何一种具有50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，共济蛋白多肽可以由与上述那些中的任何一种具有50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核酸序列编码。
病毒基因组：启动子
在一些实施方案中，病毒基因组的有效载荷区包含增强或调控有效载荷表达的元件，例如但不限于启动子。启动子可以是野生型或经工程化改造的启动子，或其组合。在一些实施方案中，病毒基因组包含至少一种启动子。在一些实施方案中，病毒基因组包含多于一种启动子。
在一些实施方案中，启动子是野生型共济蛋白启动子，或其衍生物(例如，截短或变体)。野生型共济蛋白启动子的合适衍生物是功能性的那些，例如，在至少一种微小可检测的水平中表达有效载荷是有效的。
在一些实施方案中，启动子是经工程化改造的共济蛋白启动子。本文包括共济蛋白启动子的较短变体。共济蛋白启动子的长度可以是200-1400nt或之间的任何长度。在一些实施方案中，共济蛋白启动子变体可以是长度223、363、534、747、906、1060、1226或1353个核苷酸。由于在启动子序列的任何区域中的缺失，例如但不限于启动子序列的5'端，启动子序列的3'末端，或在启动子序列内，共济蛋白启动子变体可能比野生型共济蛋白启动子序列短。
在一些实施方案中，启动子是本文所述任何启动子中的一种或多种的组合。在一些实施方案中，启动子与增强子序列一起使用。在一些实施方案中，增强子序列可以衍生自巨细胞病毒立即早期基因(CMVie)。在一些实施方案中，增强子可以位于启动子上游(5')。在一些实施方案中，增强子包含SEQ ID NO:1777。
在一些实施方案中，启动子是CBA启动子，或其衍生物(例如，截短或变体)。应当理解，CBA启动子的合适衍生物是功能性的，例如，表达有效载荷是有效的。
在一些实施方案中，CBA启动子包含CMVie增强子、主链序列和CB启动子序列，当叙述5'至3'时。三种组分(CMVie增强子、主链和CB序列)中的每一种可以是变体中的不同长度。
在一些实施方案中，CBA启动子包含骨架序列和CB启动子序列，当叙述5'至3'时。
在一些实施方案中，CBA启动子包含CB启动子序列。
在一些实施方案中，CBA启动子的长度可以是100-700nt或之间的任何长度。在一些实施方案中，CBA启动子变体可以是长度100、180、260、270、332、412、492或572个核苷酸。由于在增强子、主链或启动子序列的任何区域中的缺失，例如但不限于启动子序列的5′端，启动子序列的3′末端，或在启动子序列内，CBA启动子变体可能比野生型CBA启动子序列短。
在一些实施方案中，启动子是CMV启动子，或其衍生物(例如，截短或变体)。应当理解，CMV启动子的合适衍生物是功能性的，例如，表达有效载荷是有效的。CMV启动子可包含CMV增强子和CMV启动子序列，或仅包含CMV启动子序列。CMV增强子和CMV启动子序列在启动子变体之间可以是不同的长度。
在一些实施方案中，CMV启动子的长度可以是50-700nt或之间的任何长度。在一些实施方案中，CMV启动子变体可以是长度55、109、163、217、289、361、433或505个核苷酸。由于在增强子或启动子序列的任何区域中的缺失，例如但不限于启动子序列的5′端，启动子序列的3′末端，或在启动子序列内，CMV启动子变体可能比野生型CMV启动子序列短。
在一些实施方案中，启动子是亲本启动子序列的缺失变体，其中已经从亲本序列中除去了一个或多个核苷酸。
在一些实施方案中，启动子是亲本启动子序列的插入变体，其中将一个或多个核苷酸加入到亲本序列中。
在一些实施方案中，与亲本启动子序列相比，启动子包含一种或多种突变。
在一些实施方案中，以一种或多种方式修饰启动子(例如，缺失、突变和/或插入)以产生启动子变体。
在一些实施方案中，启动子可包含表3中的任意序列的序列、片段或其变体。例如，启动子可包含与选自由SEQ ID NO:1734-1777组成的序列具有至少90％、至少95％、至少99％或100％序列同一性的序列，例如，具有指定百分比同一性并提供与选自由SEQ ID NO:1734-1777组成的序列部分或全部相同功能的序列。在一些实施方案中，启动子为CMV启动子或源自CMV启动子，且包含与选自SEQ ID NO:1743-1751、1767、1772-1772和1777的序列具有至少90％、至少95％、至少99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，启动子为CBA启动子或源自CBA启动子，且包含与选自SEQ ID NO:1734-1742、1760-1766、1768和1775-1776的序列具有至少90％、至少95％、至少99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，启动子为FXN启动子或源自FXN启动子，且包含与选自SEQ ID NO：1752-1759和1769-1770的序列具有至少90％、至少95％、至少99％或100％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，启动子可包含表3中列出的那些中的任一种的多于一个序列的组合。在一些实施方案中，启动子序列可以进一步包含如表6中给出的至少一种内含子/外显子序列。
在一些实施方案中，启动子包含与SEQ ID NO:1738具有至少90％、至少95％、至少99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，启动子为SEQ ID NO:1738。在一些实施方案中，AAV载体基因组包含与SEQ ID NO:1738具有至少90％序列同一性的启动子序列和编码与SEQ ID NO:1725具有至少90％相同的氨基酸序列的共济蛋白多肽的有效载荷区(例如，包含与SEQ ID NO:1824至少90％相同的核酸序列的有效载荷区)。在一些实施方案中，AAV载体基因组包含与SEQ ID NO:1738具有至少95％序列同一性的启动子序列和编码与SEQ ID NO:1725具有至少95％相同的氨基酸序列的共济蛋白多肽的有效载荷区(例如，包含与SEQ ID NO:1824至少95％相同的核酸序列的有效载荷区)。在一些实施方案中，AAV载体基因组包含SEQ ID NO:1738的启动子序列和编码具有SEQ ID NO:1725的氨基酸序列的共济蛋白多肽的有效载荷区(例如，包含SEQ ID NO:1824的有效载荷区)。在一些实施方案中，共济蛋白多肽由包含SEQ ID NO:1728或其片段的核酸序列，任选地SEQ ID NO:1728的核苷酸221-853编码。在一些实施方案中，共济蛋白多肽由包含SEQ ID NO:1822、1823或1824的核酸序列编码。
在一些实施方案中，启动子包含与SEQ ID NO:1740具有至少90％、至少95％、至少99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，启动子为SEQ ID NO:1740。在一些实施方案中，AAV载体基因组包含与SEQ ID NO:1740具有至少90％序列同一性的启动子序列和编码与SEQ ID NO:1725具有至少90％相同的氨基酸序列的共济蛋白多肽的有效载荷区(例如，包含与SEQ ID NO:1824至少90％相同的核酸序列的有效载荷区)。在一些实施方案中，AAV载体基因组包含与SEQ ID NO:1740具有至少95％序列同一性的启动子序列和编码与SEQ ID NO:1725具有至少95％相同的氨基酸序列的共济蛋白多肽的有效载荷区(例如，包含与SEQ ID NO:1824至少95％相同的核酸序列的有效载荷区)。在一些实施方案中，AAV载体基因组包含SEQ ID NO:1740的启动子序列和编码具有SEQ ID NO:1725的氨基酸序列的共济蛋白多肽的有效载荷区(例如，包含SEQ ID NO:1824的有效载荷区)。在一些实施方案中，共济蛋白多肽由包含SEQ ID NO:1728或其片段的核酸序列，任选地SEQ ID NO:1728的核苷酸221-853编码。在一些实施方案中，共济蛋白多肽由包含SEQ ID NO:1822、1823或1824的核酸序列编码。
在一些实施方案中，启动子包含与SEQ ID NO:1742具有至少90％、至少95％、至少99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，启动子为SEQ ID NO：1742。在一些实施方案中，AAV载体基因组包含与SEQ ID NO:1742具有至少90％序列同一性的启动子序列和编码与SEQ ID NO:1725具有至少90％相同的氨基酸序列的共济蛋白多肽的有效载荷区(例如，包含与SEQ ID NO:1824至少90％相同的核酸序列的有效载荷区)。在一些实施方案中，AAV载体基因组包含与SEQ ID NO:1742具有至少95％序列同一性的启动子序列和编码与SEQ ID NO:1725具有至少95％相同的氨基酸序列的共济蛋白多肽的有效载荷区(例如，包含与SEQ ID NO:1824至少95％相同的核酸序列的有效载荷区)。在一些实施方案中，AAV载体基因组包含SEQ ID NO:1742的启动子序列和编码具有SEQ ID NO:1725的氨基酸序列的共济蛋白多肽的有效载荷区(例如，包含SEQ ID NO：1824的有效载荷区)。在一些实施方案中，共济蛋白多肽由包含SEQ ID NO:1728或其片段的核酸序列，任选地SEQ ID NO:1728的核苷酸221-853编码。在一些实施方案中，共济蛋白多肽由包含SEQ ID NO:1822、1823或1824的核酸序列编码。
在一些实施方案中，启动子包含与SEQ ID NO:1750具有至少90％、至少95％、至少99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，启动子为SEQ ID NO:1750。在一些实施方案中，AAV载体基因组包含与SEQ ID NO:1750具有至少90％序列同一性的启动子序列和编码与SEQ ID NO:1725具有至少90％相同的氨基酸序列的共济蛋白多肽的有效载荷区(例如，包含与SEQ ID NO：1824至少90％相同的核酸序列的有效载荷区)。在一些实施方案中，AAV载体基因组包含与SEQ ID NO:1750具有至少95％序列同一性的启动子序列和编码与SEQ ID NO：1725具有至少95％相同的氨基酸序列的共济蛋白多肽的有效载荷区(例如，包含与SEQ ID NO：1824至少95％相同的核酸序列的有效载荷区)。在一些实施方案中，AAV载体基因组包含SEQ ID NO：1750的启动子序列和编码具有SEQ ID NO:1725的氨基酸序列的共济蛋白多肽的有效载荷区(例如，包含SEQ ID NO:1824的有效载荷区)。在一些实施方案中，共济蛋白多肽由包含SEQ ID NO：1728或其片段的核酸序列，任选地SEQ ID NO：1728的核苷酸221-853编码。在一些实施方案中，共济蛋白多肽由包含SEQ ID NO:1822、1823或1824的核酸序列编码。
在一些实施方案中，在本文公开的病毒基因组中使用的启动子包含表3中的任何一种启动子序列。在表3中，CMV代表“巨细胞病毒”。CBA代表“鸡β-肌动蛋白”，其可具有CMVIE(“立即早期”)增强子区和启动子区；CAG代表CMV增强子，CBA启动子和兔β-珠蛋白剪接受体位点；FXN代表“共济蛋白”，mCBA代表使用PCR产生的CBA启动子的变体。
表3.代表性的启动子
启动子名称 起始启动子 启动子的长度 启动子的SEQ ID NO
CBA CBA 652 1734
CBA-D1 CBA 572 1735
CBA-D2 CBA 492 1736
CBA-D3 CBA 412 1737
CBA-D4 CBA 332 1738
CBA-D5 CBA 270 1739
CBA-D6 CBA 260 1740
CBA-D7 CBA 180 1741
CBA-D8 CBA 100 1742
CMV CMV 588 1743
CMV-D1 CMV 505 1744
CMV-D2 CMV 433 1745
CMV-D3 CMV 361 1746
CMV-D4 CMV 289 1747
CMV-D5 CMV 217 1748
CMV-D6 CMV 163 1749
CMV-D7 CMV 109 1750
CMV-D8 CMV 55 1751
FXNpro223 FXN 223 1752
FXNpro363 FXN 363 1753
FXNpro534 FXN 534 1754
FXNpro907 FXN 907 1755
FXNpro1060 FXN 1060 1756
FXNpro1226 FXN 1226 1757
FXNpro1353 FXN 1353 1758
FXNproN1336 FXN 1336 1759
mCBA mCBA 610 1760
mCBA-D1 mCBA 526 1761
mCBA-D2 mCBA 441 1762
mCBA-D3 mCBA 366 1763
mCBA-D4 mCBA 286 1764
mCBA-D5 mCBA 224 1765
mCBA-D6 mCBA 214 1766
CMV-80 CMV 80 1767
CBA-90 CBA 90 1768
FXN-150 FXN 150 1769
FXN-200 FXN 198 1770
CAG CAG 1715 1771
CMV-205 CMV 205 1772
CMV-299 CMV 299 1773
CMV-380 CMV 380 1774
CBAmin CBA 283 1775
CBA-654 CBA 654 1776
CMV增强子 CMV 383 1777
在一些实施方案中，启动子用于调控靶细胞中共济蛋白表达。在某些实施方案中，启动子可用于将靶细胞中的共济蛋白表达增加至大于正常内源性共济蛋白表达的水平。在某些实施方案中，启动子可用于诱导靶细胞中共济蛋白表达至接近或相当于正常内源性共济蛋白表达的水平。
在一些实施方案中，接合序列可以与本文所述的启动子组合使用，例如但不限于表3中列出的那些。在某些实施方案中，接合序列可以位于病毒基因组中的启动子5′。在某些实施方案中，接合序列可以位于病毒基因组中的启动子3′。在某些实施方案中，病毒基因组可包括多于一个接合序列。作为非限制性实例，病毒基因组可包含接合序列，所述接合序列在启动子的5′端和在启动子的3'端。接合序列可以是相同的序列、两种不同的序列或在启动子序列的任一侧分开(split)的序列。在某些实施方案中，接合序列包含SEQ SEQ IDNO:1813。在某些实施方案中，接合序列包含SEQ SEQ ID NO：1814。
在一些实施方案中，使用启动子增强靶细胞(例如，神经系统或心脏组织)中的共济蛋白表达。对于该靶细胞，共济蛋白表达可以增加0.01至100(0.01-100x)倍的内源性共济蛋白表达。在一些实施方案中，在靶细胞中使用启动子以维持共济蛋白表达在0.5-3x(例如，0.5-1x、1-1.5x、1.5-2x、2-2.5x、2.5-3x)的内源性共济蛋白(即，正常人类水平或约5.5-32.8ng/mg蛋白质)。
在一些实施方案中，启动子，例如表3中的启动子，被用于AAV载体基因组中，所述AAV载体基因组进一步包含编码共济蛋白多肽序列(例如人类共济蛋白多肽序列)的序列。在一些实施方案中，启动子包含与SEQ ID NO：1742具有至少90％、至少95％、至少99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，启动子为SEQ ID NO：1742。在一些实施方案中，AAV载体基因组包含与SEQ ID NO：1742具有至少90％序列同一性的启动子序列和编码与SEQ ID NO：1725具有至少90％相同的氨基酸序列的共济蛋白多肽的有效载荷区(例如，包含与SEQ ID NO：1824至少90％相同的核酸序列的有效载荷区)。在一些实施方案中，AAV载体基因组包含与SEQ ID NO:1742具有至少95％序列同一性的启动子序列和编码与SEQID NO:1725具有至少95％相同的氨基酸序列的共济蛋白多肽的有效载荷区(例如，包含与SEQ ID NO:1824至少95％相同的核酸序列的有效载荷区)。在一些实施方案中，AAV载体基因组包含SEQ ID NO:1742的启动子序列和编码具有SEQ ID NO:1725的氨基酸序列的共济蛋白多肽的有效载荷区(例如，包含SEQ ID NO:1824的有效载荷区)和/或进一步包含如表5-11中所提供的一个或多个序列或其95％相同的变体。在一些实施方案中，共济蛋白多肽由包含SEQ ID NO:1728或其片段的核酸序列，任选地SEQ ID NO:1728的核苷酸221-853编码。在一些实施方案中，共济蛋白多肽由包含SEQ ID NO:1822、1823或1824的核酸序列编码。
在一些实施方案中，启动子包含与SEQ ID NO:1750具有至少90％、至少95％、至少99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，启动子为SEQ ID NO:1750。在一些实施方案中，AAV载体基因组包含与SEQ ID NO:1750具有至少90％序列同一性的启动子序列和编码与SEQ ID NO:1725具有至少90％相同的氨基酸序列的共济蛋白多肽的有效载荷区(例如，包含与SEQ ID NO:1824至少90％相同的核酸序列的有效载荷区)。在一些实施方案中，AAV载体基因组包含与SEQ ID NO:1750具有至少95％序列同一性的启动子序列和编码与SEQ ID NO:1725具有至少95％相同的氨基酸序列的共济蛋白多肽的有效载荷区(例如，包含与SEQ ID NO：1824至少95％相同的核酸序列的有效载荷区)。在一些实施方案中，AAV载体基因组包含SEQ ID NO：1750的启动子序列和编码具有SEQ ID NO：1725的氨基酸序列的共济蛋白多肽的有效载荷区(例如，包含SEQ ID NO:1824的有效载荷区)和/或进一步包含如表5-11中所提供的一个或多个序列或其95％相同的变体。在一些实施方案中，共济蛋白多肽由包含SEQ ID NO:1728或其片段的核酸序列，任选地SEQ ID NO:1728的核苷酸221-853编码。在一些实施方案中，共济蛋白多肽由包含SEQ ID NO:1822、1823或1824的核酸序列编码。
在一些实施方案中，启动子包含与SEQ ID NO:1738具有至少90％、至少95％、至少99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，启动子为SEQ ID NO:1738。在一些实施方案中，AAV载体基因组包含与SEQ ID NO:1738具有至少90％序列同一性的启动子序列和编码与SEQ ID NO:1725具有至少90％相同的氨基酸序列的共济蛋白多肽的有效载荷区(例如，包含与SEQ ID NO：1824至少90％相同的核酸序列的有效载荷区)。在一些实施方案中，AAV载体基因组包含与SEQ ID NO:1738具有至少95％序列同一性的启动子序列和编码与SEQ ID NO：1725具有至少95％相同的氨基酸序列的共济蛋白多肽的有效载荷区(例如，包含与SEQ ID NO：1824至少95％相同的核酸序列的有效载荷区)。在一些实施方案中，AAV载体基因组包含SEQ ID NO:1738的启动子序列和编码具有SEQ ID NO：1725的氨基酸序列的共济蛋白多肽的有效载荷区(例如，包含SEQ ID NO：1824的有效载荷区)和/或进一步包含如表5-11中所提供的一个或多个序列或其95％相同的变体。在一些实施方案中，共济蛋白多肽由包含SEQ ID NO：1728或其片段的核酸序列，任选地SEQ ID NO:1728的核苷酸221-853编码。在一些实施方案中，共济蛋白多肽由包含SEQ ID NO:1822、1823或1824的核酸序列编码。
在一些实施方案中，启动子包含与SEQ ID NO:1740具有至少90％、至少95％、至少99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，启动子为SEQ ID NO:1740。在一些实施方案中，AAV载体基因组包含与SEQ ID NO:1740具有至少90％序列同一性的启动子序列和编码与SEQ ID NO:1725具有至少90％相同的氨基酸序列的共济蛋白多肽的有效载荷区(例如，包含与SEQ ID NO:1824至少90％相同的核酸序列的有效载荷区)。在一些实施方案中，AAV载体基因组包含与SEQ ID NO:1740具有至少95％序列同一性的启动子序列和编码与SEQ ID NO:1725具有至少95％相同的氨基酸序列的共济蛋白多肽的有效载荷区(例如，包含与SEQ ID NO：1824至少95％相同的核酸序列的有效载荷区)。在一些实施方案中，AAV载体基因组包含SEQ ID NO：1740的启动子序列和编码具有SEQ ID NO：1725的氨基酸序列的共济蛋白多肽的有效载荷区(例如，包含SEQ ID NO:1824的有效载荷区)和/或进一步包含如表5-11中所提供的一个或多个序列或其95％相同的变体。在一些实施方案中，共济蛋白多肽由包含SEQ ID NO:1728或其片段的核酸序列，任选地SEQ ID NO:1728的核苷酸221-853编码。在一些实施方案中，共济蛋白多肽由包含SEQ ID NO:1822、1823或1824的核酸序列编码。
在各种实施方案中，可将本文公开的任何启动子(例如来自表3的启动子或与其具有90％或更大同源性的启动子)与表5-11中公开的一个或多个组分或与其具有90％或更大同源性的组分，单独或与其他序列(例如，填充物序列)组合在AAV病毒载体基因组中配对。在一些实施方案中，AAV载体基因组可包含本文所述的一种或多种病毒基因组组分的多个拷贝(例如，两个，三个或更多个拷贝)。在一些实施方案中，病毒基因组包含两个miR结合位点(例如，两个miR122结合位点)。在一些实施方案中，病毒基因组包含三个miR结合位点(例如，三个miR122结合位点)。在一些实施方案中，病毒基因组包含本文公开的任何启动子(例如来自表3的启动子或与其具有90％或更大同源性的启动子)，以及在表5-11中任一个提供的一个或多个组分或以其他方式在本文中描述，在表4、12、13、14、15、16或17任一个中所示以5′至3′顺序。在一些实施方案中，病毒基因组包含表3提供的启动子以及在表5-11中任一个提供的一个或多个组分或以其他方式在本文中描述，在表4、12、13、14、15、16或17任一个中所示以5'至3'顺序。在一些实施方案中，病毒基因组包含表4、12、13、14、15、16或17任一个所示的所有组分并以5'至3'顺序。
例如，包含SEQ ID NO:1742的启动子，或与其具有90％或更大同源性的启动子可以与表5-11中的任何组分(或与其具有90％或更大同源性的组分)在AAV载体基因组中配对，例如，启动子位于5’ITR序列和ie1外显子1之间(例如，直接接触两种其他组分或通过一个或多个非编码序列分离)。在一些实施方案中，病毒基因组包含三个miR122结合位点。在一些实施方案中，病毒基因组进一步包含有效载荷区，例如，编码共济蛋白的有效载荷区。
在另一个实例中，包含SEQ ID NO：1750的启动子，或与其具有90％或更大同源性的启动子可以与表5-11中的任何组分(或与其具有90％或更大同源性的组分)在AAV载体基因组中配对，例如，启动子位于5’ITR序列和ie1外显子1之间(例如，直接接触两种其他组分或通过一个或多个非编码序列分离)。在一些实施方案中，病毒基因组包含三个miR122结合位点。在一些实施方案中，病毒基因组进一步包含有效载荷区，例如，编码共济蛋白的有效载荷区。
例如，包含SEQ ID NO:1738的启动子，或与其具有90％或更大同源性的启动子可以与表5-11中的任何组分(或与其具有90％或更大同源性的组分)在AAV载体基因组中配对，例如，启动子位于5’ITR序列和ie1外显子1之间(例如，直接接触两种其他组分或通过一个或多个非编码序列分离)。在一些实施方案中，病毒基因组包含三个miR122结合位点。在一些实施方案中，病毒基因组进一步包含有效载荷区，例如，编码共济蛋白的有效载荷区。
在另一个实例中，包含SEQ ID NO：1740的启动子，或与其具有90％或更大同源性的启动子可以与表5-11中的任何组分(或与其具有90％或更大同源性的组分)在AAV载体基因组中配对，例如，启动子位于5’ITR序列和ie1外显子1之间(例如，直接接触两种其他组分或通过一个或多个非编码序列分离)。在一些实施方案中，病毒基因组包含三个miR122结合位点。在一些实施方案中，病毒基因组进一步包含有效载荷区，例如，编码共济蛋白的有效载荷区。
在一些实施方案中，启动子为CBA启动子或源自CBA启动子。CBA启动子可以驱动有效载荷在受试者的各种组织中表达。作为非限制性示例，共同拥有的国际专利申请号PCT/US2019/032387(其内容通过引用整体并入本文)的实施例4，包括表16-28显示了使用CBA启动子(启动子以SEQ ID NO：1776提供，ITR到ITR以SEQ ID NO：1778提供)表达FXN。共同拥有的国际专利申请号PCT/US2019/032387的表16显示了IV注射后在小鼠中FXN的表达，其中在具有带有CBA启动子的VOY101颗粒的皮质、腰椎脊髓、腰背根神经节、三叉神经节、心脏和肝脏中看到表达。共同拥有的国际专利申请号PCT/US2019/032387的表18中显示了IV注射后在NHP中FXN的表达，其中在具有带有CBA启动子的VOY101颗粒的脑干、颈部脊髓、胸部脊髓、腰椎脊髓、颈椎DRG、胸部DRG、腰椎/骶骨DRG、心室、心房、肝脏、比目鱼肌(soleus)和空肠中看到表达。共同拥有的国际专利申请号PCT/US2019/032387的表19中显示了以不同剂量(6.3×1011VG/kg、2×1012VG/kg或2×1013VG/kg)IV注射后在NHP中FXN的表达，其中在具有带有CBA启动子的VOY201颗粒的脑干、脑干、颈部脊髓、胸部脊髓、腰椎脊髓、颈椎DRG、胸部DRG、腰椎/骶骨DRG、心室、心房、肝脏、肾、肺、比目鱼肌和/或脾脏中看到表达。共同拥有的国际专利申请号PCT/US2019/032387的表20中显示了以不同剂量(6.7×1012VG/kg或4.89×1013VG/kg)IV注射后在NHP中FXN的表达，其中在具有带有CBA启动子的VOY101颗粒的脑干、小脑、皮质、颈部脊髓、胸部脊髓、腰椎脊髓、颈椎DRG、胸部DRG、腰椎/骶骨DRG、心室、心房、肝脏、肾、比目鱼肌、交感性胸链神经节和/或肾上腺中看到表达。共同拥有的国际专利申请号PCT/US2019/032387的表17中显示了小鼠中IV注射后载体基因组的分布，其中在具有带有CBA启动子的VOY101和AAV9颗粒的皮质、腰椎脊髓、胸背根神经节、三叉神经节、心脏和肝脏中看到分布。共同拥有的国际专利申请号PCT/US2019/032387的表18中显示了IV注射后在NHP中载体基因组的分布，其中在具有带有CBA启动子的VOY101颗粒的额叶皮层、纹状体、脑干、小脑、颈部脊髓、胸部脊髓、颈背根神经节、胸背根神经节、腰椎/骶骨背根神经节、心室、心房、肝脏、肾、肺、比目鱼肌、空肠和脾脏中看到分布。共同拥有的国际专利申请号PCT/US2019/032387的表19中显示了以不同剂量(6.3×1011VG/kg、2×1012VG/kg或2×1013VG/kg)IV注射后在NHP中载体基因组的分布，其中在具有带有CBA启动子的VOY201颗粒的额叶皮层、纹状体、脑干、小脑、颈部脊髓、胸部脊髓、腰椎脊髓、颈椎DRG、胸部DRG、腰椎/骶骨DRG、心室、心房、肝脏、肾、肺、比目鱼肌、空肠和/或脾脏中看到分布。共同拥有的国际专利申请号PCT/US2019/032387的表20中显示了以不同剂量(6.7×1012VG/kg或4.89×1013VG/kg)IV注射后在NHP中载体基因组的分布，其中在具有带有CBA启动子的VOY101颗粒的运动皮层、感觉运动皮层、纹状体、脑干、小脑皮层、颈部脊髓、胸部脊髓、腰椎脊髓、胸部脊髓、颈椎DRG、胸部DRG、腰椎/骶骨DRG、心室、心房、肝脏、肾、比目鱼肌、空肠、脾脏、交感性胸链神经节和/或肾上腺中看到分布
在一些实施方案中，启动子是包括CMVie增强子、CBA、CMV、共济蛋白启动子、截短的CBA和/或截短的CMV启动子的启动子或衍生自其的启动子。启动子可以驱动有效载荷在受试者的各种组织中表达。作为非限制性实例，如共同拥有的国际专利申请号PCT/US2019/032387(其内容通过引用整体并入本文)的实施例5中所示，可以使用弗里德里希共济失调的小鼠模型用于评估具有FXN的VOY101颗粒的IV给药的体内分布、表达和功效。在某些实施方案中，如共同拥有的国际专利申请号PCT/US2019/032387的实施例5概述的，可以评估诸如但不限于表3中的启动子驱动小鼠中的FXN的表达。作为另一非限制性实例，在共同拥有的国际专利申请号PCT/US2019/032387(其内容通过引用整体并入本文)的实施例5中所示，弗里德里希共济失调的NHP模型用于评估具有FXN的VOY101颗粒的IV给药的体内分布和表达。在某些实施方案中，如共同拥有的国际专利申请号PCT/US2019/032387的实施例5概述的，可以评估诸如但不限于表3中的启动子驱动NHP中的FXN的表达。
在一些实施方案中，启动子是或衍生自CBA启动子，其可以驱动在受试者中各种组织中的有效载荷的表达。作为非限制性示例，共同拥有的国际专利申请号PCT/US2019/032387(其内容通过引用整体并入本文)的实施例14，包括表33-34显示了使用CBA启动子(启动子以SEQ ID NO：1776提供，ITR到ITR以SEQ ID NO：1778提供)表达FXN。共同拥有的国际专利申请号PCT/US2019/032387的表33显示了IV注射后在小鼠中FXN的表达，其中在具有带有CBA启动子的VOY101、VOY801和/或VOY1101颗粒的皮质、纹状体、海马、脑干、胸部脊髓、胸部DRG、心脏和/或肝脏中看到表达。共同拥有的国际专利申请号PCT/US2019/032387的表34中显示了小鼠中IV注射后载体基因组的分布，其中在具有带有CBA启动子的VOY101、VOY801和/或VOY1101颗粒的皮质、纹状体、海马、脑干、胸部脊髓、心脏和肝脏中看到分布。作为另一非限制性示例，共同拥有的临时专利申请号62/839,889(其内容通过引用整体并入本文)的实施例14，包括表35-36显示了在VOY701和VOY101衣壳中使用CBA启动子(启动子以SEQ ID NO：1776提供，ITR到ITR以SEQ ID NO：1778提供)表达FXN。共同拥有的临时专利申请号62/839,889的表35中显示了小鼠中IV注射后FXN的表达，其中在具有带有CBA启动子的VOY701和/或VOY101颗粒的皮质、纹状体、海马、脑干、胸腔脊髓和/或肝脏中看到表达。共同拥有的临时专利申请号62/839,889的表36中显示了小鼠中IV注射后载体基因组的分布，其中在具有带有CBA启动子的VOY701和/或VOY101颗粒的皮质、纹状体、海马、脑干、胸腔脊髓和/或肝脏中看到分布。
在一些实施方案中，本文所述的AAV颗粒包含具有编码共济蛋白的有效载荷区的病毒基因组。病毒基因组可以经过程化改造以优化靶细胞中的共济蛋白表达。
病毒基因组：包括共济蛋白有效载荷的ITR到ITR序列
本文所述的任何组分可用于设计和优化病毒基因组的ITR序列，以用于所需的共济蛋白表达。病毒基因组可包含任意数量的组分，例如但不限于一个或多个ITR、增强子、启动子、内含子、UTR、有效载荷区、标签或选择性标记物、miR结合位点或靶位点、主链区、polyA序列和/或填充物序列。在给定的病毒基因组中，这些组分中的每一个可以存在零、一、两次或超过次。
ITR、增强子、启动子、内含子、外显子、有效载荷、标签、miR结合位点、PolyA和/或填充物组分中的每一种可以从表3和5-11中提供的序列中独立地或以任何组合选择。
在一些实施方案中，AAV病毒基因组包含5′ITR、增强剂、内含子、有效载荷区、可选标签、多至三个miR结合位点、PolyA序列、可选的填充物序列和3′ITR。在一些实施方案中，5'ITR是AAV2 ITR。在一些实施方案中，5’ITR包含与SEQ ID NO:1811至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，增强子包含ie1外显子1和ie1内含子1或其片段。在一些实施方案中，增强子包含与SEQ ID NOs：1817和/或1819至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，增强子包含一个或多个人类β-球蛋白序列，例如，与SEQ ID NO:1816、1820和/或1821至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，增强子包含SEQ ID NO:1817、1819、1820和1821。在一些实施方案中，增强子包含SEQ ID NO:1816。
在一些实施方案中，有效载荷区包含编码与SEQ ID NO:1725、1726、1727、1731、1732或1733具有至少90％、至少95％、至少99％或100％的序列同一性的多肽的核酸序列，例如与SEQ ID NO：1725具有至少90％、至少95％、至少99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，有效载荷区包含与SEQ ID NO:1728、1729、1730或其片段具有至少90％、至少95％、至少99％或100％的序列同一性的核酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:1728的片段包含SEQ ID NO:1728的核苷酸221-853。在一些实施方案中，共济蛋白多肽由包含SEQID NO:1822、1823或1824的核酸序列编码。在一些实施方案中，标签是缺失的。在一些实施方案中，标签是存在的，并且是人类流感血凝素HA标签。在一些实施方案中，HA标签包含SEQID NO:1825。在一些实施方案中，miR结合位点是缺失的。在一些实施方案中，存在至少一个miR结合位点并包含miR122结合位点。在一些实施方案中，miR122结合位点包含与SEQ IDNO:1827具有至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，AAV载体基因组包含三个拷贝的miR122结合位点，例如，三个拷贝的SEQ ID NO：1827或具有至少90％序列同一性的其变体。在一些实施方案中，包含三个拷贝的miR122结合位点的miR结合位点系列包括SEQ ID NO：1826。在一些实施方案中，病毒基因组包含人类生长激素polyA序列。在一些实施方案中，病毒基因组包括包含与SEQ ID NO:1828至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的polyA序列。在一些实施方案中，AAV病毒基因组进一步包含填充物序列，例如，白蛋白填充物序列。在一些实施方案中，填充物序列包含由SEQ ID NO:1829-1842所给出的那些中的任一个。在一些实施方案中，3′ITR是AAV2 ITR。在一些实施方案中，3′ITR子包含与SEQ ID NO:1812至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的序列。
在某些实施方案中，AAV颗粒包含至少一种顺式元件，包括但不限于Kozak序列、主链序列和/或内含子序列。某些实施方案提供AAV颗粒还包含启动子区域。例如，启动子可包括来自CBA、CMV、FXN和/或SV40基因或其变体中的任何一种。在表4中描述了包含具有编码共济蛋白的有效载荷区的病毒基因组的AAV颗粒的ITR至ITR序列的非限制性实例。
在表4中，cFXN表示猕猴(食蟹猴)共济蛋白，hFXN表示人类(智人)共济蛋白，Hβ珠蛋白表示人类β-珠蛋白，HA表示人类流感血凝素HA标签，HGH表示人类生长激素。ALB表示白蛋白。alb后的数量表示白蛋白填充物的长度。MiR-122BS是miR-122结合位点。“–”标志表示构建体没有组分或序列。“+”标志表示构建体具有组分或序列。
表4.代表性的ITR到ITR序列
Figure BDA0003088012730001311
Figure BDA0003088012730001321
在一些实施方案中，AAV颗粒包含病毒基因组，其包含与SEQ ID NO：1778-1810中的任一种具有百分比同一性的序列。病毒基因组可以与SEQ ID NO:1778-1810中的任一种具有1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性。病毒基因组可以与SEQ ID NO:1778-1810中的任一种具有1-10％、10-20％、30-40％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-99％、50-100％、60-70％、60-80％、60-90％、60-99％、60-100％、70-80％、70-90％、70-99％、70-100％、80-85％、80-90％、80-95％、80-99％、80-100％、90-95％、90-99％、或90-100％同一性。在一些实施方案中，病毒基因组包含与SEQID NO：1778-1810中的任一种具有至少80％同一性的序列。在一些实施方案中，病毒基因组包含与SEQ ID NO：1778-1810中的任一种具有至少85％同一性的序列。在一些实施方案中，病毒基因组包含与SEQ ID NO：1778-1810中的任一种具有至少90％同一性的序列。
在一些实施方案中，病毒基因组包含与SEQ ID NO：1778-1810中的任一种具有至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，病毒基因组包含与SEQ ID NO：1778-1810中的任一种具有至少99％同一性的序列。
在一些实施方案中，病毒基因组包含与SEQ ID NO:1797具有至少95％序列同一性的序列。在一些实施方案中，病毒基因组包含SEQ ID NO:1797。在一些实施方案中，病毒基因组包含与SEQ ID NO:1801具有至少95％序列同一性的序列。在一些实施方案中，病毒基因组包含SEQ ID NO:1801。在一些实施方案中，病毒基因组包含与SEQ ID NO:1808具有至少95％序列同一性的序列。在一些实施方案中，病毒基因组包含SEQ ID NO:1808。在一些实施方案中，病毒基因组包含与SEQ ID NO:1809具有至少95％序列同一性的序列。在一些实施方案中，病毒基因组包含SEQ ID NO：1809。在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒的病毒基因组可包含在表2-11中所述的序列区域的任意组合，或以其他方式在本文中描述，封装在表1所列或本文所述的任何衣壳中。
在一些实施方案中，AAV颗粒病毒基因组可包含如表2-11中所述的至少一个序列区域。该区域可以位于本文所述的任何其他序列区域之前或之后。病毒基因组可进一步包含如表2-11中所述的一种或多种序列区域的多于一个拷贝。
病毒基因组：反向末端重复(ITR)
在一些实施方案中，AAV颗粒病毒基因组可包含至少一个反向末端重复(ITR)区。ITR区可以独立地具有长度，例如但不限于75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174和175个核苷酸。病毒基因组的ITR区的长度可以是75-80、75-85、75-100、80-85、80-90、80-105、85-90、85-95、85-110、90-95、90-100、90-115、95-100、95-105、95-120、100-105、100-110、100-125、105-110、105-115、105-130、110-115、110-120、110-135、115-120、115-125、115-140、120-125、120-130、120-145、125-130、125-135、125-150、130-135、130-140、130-155、135-140、135-145、135-160、140-145、140-150、140-165、145-150、145-155、145-170、150-155、150-160、150-175、155-160、155-165、160-165、160-170、165-170、165-175和170-175个核苷酸。作为非限制性实例，病毒基因组包含5′ITR，其长度为约141个核苷酸。作为非限制性实例，病毒基因组包含5′ITR，其长度为约141个核苷酸。作为非限制性实例，病毒基因组包含5′ITR，其长度为约130个核苷酸。作为非限制性实例，病毒基因组包含5′ITR，其长度为约119个核苷酸。作为非限制性实例，病毒基因组包含3′ITR，其长度为约141个核苷酸。作为非限制性实例，病毒基因组包含3′ITR，其长度为约130个核苷酸。作为非限制性实例，病毒基因组包含3'ITR，其长度为约119个核苷酸。作为非限制性实例，5'ITR和3'ITR可以包含相同的长度和/或相同的序列。作为另一非限制性实例，5'ITR和3'ITR在长度和/或序列上是不同的。
在一些实施方案中，AAV颗粒病毒基因组包含至少一个反向末端重复序列区。ITR序列区的非限制性示例在表5中描述。
表5.代表性的反向末端重复(ITR)序列区
Figure BDA0003088012730001341
在一些实施方案中，AAV颗粒病毒基因组可以具有包含ITR1的ITR。在一些实施方案中，AAV颗粒病毒基因组可以具有包含ITR2的ITR。在一些实施方案中，AAV颗粒病毒基因组可以具有两个ITR。作为非限制性实例，两个ITR可以是ITR1和ITR2。
病毒基因组：有效载荷区的内含子和外显子序列
在一些实施方案中，AAV颗粒病毒基因组包含至少一个内含子和/或外显子序列区。内含子和外显子序列区的非限制性实例描述于表6中。
表6.代表性内含子和外显子序列区
序列区名称 序列长度 SEQ ID NO
内含子 1016 1815
hB珠蛋白内含子/外显子 566 1816
ie1外显子1 134 1817
CMV/珠蛋白内含子 379 1818
ie1内含子1(部分) 32 1819
hB珠蛋白内含子2 347 1820
hB珠蛋白外显子3 53 1821
在一些实施方案中，AAV颗粒病毒基因组可包含至少一个内含子序列区。
内含子序列区可以独立地具有长度，例如但不限于10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350和多于350个核苷酸。病毒基因组的内含子序列区的长度可以是25-35、25-50、35-45、45-55、50-75、55-65、65-75、75-85、75-100、85-95、95-105、100-125、105-115、115-125、125-135、125-150、135-145、145-155、150-175、155-165、165-175、175-185、175-200、185-195、195-205、200-225、205-215、215-225、225-235、225-250、235-245、245-255、250-275、255-265、265-275、275-285、275-300、285-295、295-305、300-325、305-315、315-325、325-335、325-350、和335-345个核苷酸。作为非限制性实例，病毒基因组包含内含子序列区，其长度为约32个核苷酸。作为非限制性实例，病毒基因组包含内含子序列区，其长度为约53个核苷酸。作为非限制性实例，病毒基因组包含内含子序列区，其长度为约134个核苷酸。作为非限制性实例，病毒基因组包含内含子序列区，其长度为约347个核苷酸。作为非限制性实例，病毒基因组包含内含子序列区，其长度为约379个核苷酸。作为非限制性实例，病毒基因组包含内含子序列区，其长度为约566个核苷酸。作为非限制性实例，病毒基因组包含内含子序列区，其长度为约1016个核苷酸。作为非限制性实例，病毒基因组包含内含子序列区，其长度为多于约1016个核苷酸。在一些实施方案中，AAV颗粒病毒基因组包含两个内含子序列区。在一些实施方案中，AAV颗粒病毒基因组包含三个内含子序列区。在一些实施方案中，AAV颗粒病毒基因组包含超过三个内含子序列区。
在一些实施方案中，AAV颗粒病毒基因组可包含至少一个外显子序列区。外显子序列区可以独立地具有长度，例如但不限于10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350和多于350个核苷酸。病毒基因组的外显子序列区的长度可以是25-35、25-50、35-45、45-55、50-75、55-65、65-75、75-85、75-100、85-95、95-105、100-125、105-115、115-125、125-135、125-150、135-145、145-155、150-175、155-165、165-175、175-185、175-200、185-195、195-205、200-225、205-215、215-225、225-235、225-250、235-245、245-255、250-275、255-265、265-275、275-285、275-300、285-295、295-305、300-325、305-315、315-325、325-335、325-350和335-345个核苷酸。作为非限制性实例，病毒基因组包含外显子区，其长度为约32个核苷酸。作为非限制性实例，病毒基因组包含显子序列区，其长度为约53个核苷酸。作为非限制性实例，病毒基因组包含显子序列区，其长度为约134个核苷酸。作为非限制性实例，病毒基因组包含显子序列区，其长度为约347个核苷酸。作为非限制性实例，病毒基因组包含显子序列区，其长度为约379个核苷酸。作为非限制性实例，病毒基因组包含显子序列区，其长度为约566个核苷酸。作为非限制性实例，病毒基因组包含显子序列区，其长度为约1016个核苷酸。作为非限制性实例，病毒基因组包含外显子序列区，其长度为多于约1016个核苷酸。
在一些实施方案中，AAV颗粒病毒基因组包含两个外显子序列区。在一些实施方案中，AAV颗粒病毒基因组包含三个外显子序列区。在一些实施方案中，AAV颗粒病毒基因组包含超过三个外显子序列区。
在一些实施方案中，AAV颗粒病毒基因组包含杂合内含子/外显子序列区，其包含至少一个内含子和至少一个外显子。在一些实施方案中，杂合内含子/外显子序列区包含一个内含子和一个外显子。在一些实施方案中，杂合内含子/外显子序列区包含两个内含子和两个外显子。在一些实施方案中，内含子或外显子序列可包含全长内含子或外显子。在一些实施方案中，内含子或外显子序列可包含内含子或外显子序列的片段或变体。
杂合内含子/外显子序列区可以独立地具有，例如但不限于15-100、100-200、200-300、300-400、400-500、500-600、600-700、700-800、800-900、900-1000、1000-1100、1100-1200和多于1200个核苷酸。作为非限制性实例，病毒基因组包含杂合内含子/外显子序列区，其长度为约379个核苷酸。作为非限制性实例，病毒基因组包含杂合内含子/外显子序列区，其长度为约566个核苷酸。作为非限制性实例，病毒基因组包含杂合内含子/外显子区，其长度为约379个核苷酸。
在一些实施方案中，内含子/外显子序列区是增强子序列。在一些实施方案中，内含子/外显子序列区不是增强子序列。
在一些实施方案中，内含子/外显子序列区是启动子序列的组分。在某些实施方案中，内含子/外显子序列区不是启动子序列的组分。
病毒基因组：共济蛋白有效载荷
在一些实施方案中，有效载荷可以包含表7中给出的任意序列。
表7.代表性的共济蛋白有效载荷序列
序列区名称 序列长度 SEQ ID NO
cFXN 630 1822
hFXN 630 1823
hFXN+终止 633 1824
在一些实施方案中，有效载荷序列编码衍生自猕猴(食蟹猴)的共济蛋白或其变体。在一些实施方案中，有效载荷序列编码衍生自猕猴(食蟹猴)的共济蛋白，但相差至少一个氨基酸。在一些实施方案中，有效载荷序列编码衍生自猕猴(食蟹猴)的共济蛋白，但与野生型相差至少一个氨基酸。在一些实施方案中，有效载荷序列编码衍生自猕猴(食蟹猴)的共济蛋白，但与野生型相差至少两个氨基酸。
在一些实施方案中，有效载荷序列编码衍生自人类(智人)的共济蛋白或其变体。在一些实施方案中，有效载荷序列包含终止密码子。
病毒基因组：标签序列
在一些实施方案中，AAV颗粒病毒基因组可包含至少一个标签序列区。如本文所用，术语“标签”表示附加到有效载荷的多核苷酸序列，一旦表达可用于鉴定所表达的有效载荷。或者，术语“标签”可以表示附加到有效载荷的多核苷酸序列，其信号用于保留所表达的有效载荷在细胞的特定区域中(例如，内质网)。标签序列区可以独立地具有长度，例如但不限于10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或多于30个核苷酸。病毒基因组的标签序列区的长度可以是10-15、15-20、20-25、25-30或多于30个核苷酸。作为非限制性实例，病毒基因组包含标签序列区，其长度为约27个核苷酸。
在一些实施方案中，AAV颗粒病毒基因组包含至少一个标签序列区。表8中显示了标签序列区的非限制性示例。
表8.代表性的标签序列区
序列区名称 序列长度 SEQ ID NO
HA 27 1825
在一些实施方案中，AAV颗粒病毒基因组包含一个标签序列区。在一些实施方案中，标签序列区是人类流感血凝素(HA)标签。
在一些实施方案中，AAV颗粒病毒基因组包含超过一个标签序列区。在一个实施方案中，AAV颗粒病毒基因组包含两个标签序列区。在一个实施方案中，AAV颗粒病毒基因组包含三个标签序列区。在一个实施方案中，AAV颗粒病毒基因组包含超过三个标签序列区。
病毒基因组：microRNA(即miR)结合位点
在一些实施方案中，AAV颗粒病毒基因组可包含至少一个miR结合位点。miR结合位点序列区的非限制性实例示于表9中。
表9.代表性的miR结合位点序列区
Figure BDA0003088012730001401
在一些实施方案中，AAV颗粒病毒基因组包含单个miR结合位点序列。作为非限制性实例，miR结合位点序列可以是miR-122结合位点。
在一些实施方案中，病毒基因组可包含多于一种miR结合位点序列。作为非限制性实例，病毒基因组可包含两种、三种、四种或五种miR结合位点序列。
在一些实施方案中，病毒基因组可包含miR结合位点系列(SEQ ID NO：1826)，其包含三种单一miR结合位点序列(SEQ ID NO：1827)。
miR结合位点序列区可以具有长度，例如但不限于10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124或125个核苷酸。
病毒基因组：polyA信号
在一些实施方案中，AAV颗粒病毒基因组可包含至少一种多腺苷酸化(PolyA)序列区。多腺苷酸化序列区可以独立地具有长度，例如但不限于4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599和600个核苷酸。病毒基因组的多腺苷酸化序列区的长度可以是4-10、10-20、10-50、20-30、30-40、40-50、50-60、50-100、60-70、70-80、80-90、90-100、100-110、100-150、110-120、120-130、130-140、140-150、150-160、150-200、160-170、170-180、180-190、190-200、200-210、200-250、210-220、220-230、230-240、240-250、250-260、250-300、260-270、270-280、280-290、290-300、300-310、300-350、310-320、320-330、330-340、340-350、350-360、350-400、360-370、370-380、380-390、390-400、400-410、400-450、410-420、420-430、430-440、440-450、450-460、450-500、460-470、470-480、480-490、490-500、500-510、500-550、510-520、520-530、530-540、540-550、550-560、550-600、560-570、570-580、580-590和590-600个核苷酸。在一些实施方案中，病毒基因组包括多腺苷酸化序列区，其长度为约477个核苷酸。
在一些实施方案中，AAV颗粒病毒基因组包含至少一种polyA序列区。在表10中描述了PolyA序列区的非限制性实例。
表10.代表性的PolyA序列区
序列区名称 序列长度 SEQ ID NO
hGHpA 477 1828
在一些实施方案中，AAV颗粒病毒基因组包含一种polyA序列区。作为非限制性实例，polyA序列包含人类生长激素聚腺苷酸化序列。
在一个实施方案中，AAV颗粒病毒基因组包含多于一种polyA序列区。
病毒基因组：填充物(或填充物(stuffer))序列
在一个实施方案中，AAV颗粒病毒基因组可包含至少一个或多个填充物序列区。填充物区可以独立地具有长度，例如但不限于50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、635、636、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、693、694、695、696、697、698、699、700、701、702、703、704、705、706、707、708、709、710、711、712、713、714、715、716、717、718、719、720、721、722、723、724、725、726、727、728、729、730、731、732、733、734、735、736、737、738、739、740、741、742、743、744、745、746、747、748、749、750、751、752、753、754、755、756、757、758、759、760、761、762、763、764、765、766、767、768、769、770、771、772、773、774、775、776、777、778、779、780、781、782、783、784、785、786、787、788、789、790、791、792、793、794、795、796、797、798、799、800、801、802、803、804、805、806、807、808、809、810、811、812、813、814、815、816、817、818、819、820、821、822、823、824、825、826、827、828、829、830、831、832、833、834、835、836、837、838、839、840、841、842、843、844、845、846、847、848、849、850、851、852、853、854、855、856、857、858、859、860、861、862、863、864、865、866、867、868、869、870、871、872、873、874、875、876、877、878、879、880、881、882、883、884、885、886、887、888、889、890、891、892、893、894、895、896、897、898、899、900、901、902、903、904、905、906、907、908、909、910、911、912、913、914、915、916、917、918、919、920、921、922、923、924、925、926、927、928、929、930、931、932、933、934、935、936、937、938、939、940、941、942、943、944、945、946、947、948、949、950、951、952、953、954、955、956、957、958、959、960、961、962、963、964、965、966、967、968、969、970、971、972、973、974、975、976、977、978、979、980、981、982、983、984、985、986、987、988、989、990、991、992、993、994、995、996、997、998、999、1000、1001、1002、1003、1004、1005、1006、1007、1008、1009、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1016、1017、1018、1019、1020、1021、1022、1023、1024、1025、1026、1027、1028、1029、1030、1031、1032、1033、1034、1035、1036、1037、1038、1039、1040、1041、1042、1043、1044、1045、1046、1047、1048、1049、1050、1051、1052、1053、1054、1055、1056、1057、1058、1059、1060、1061、1062、1063、1064、1065、1066、1067、1068、1069、1070、1071、1072、1073、1074、1075、1076、1077、1078、1079、1080、1081、1082、1083、1084、1085、1086、1087、1088、1089、1090、1091、1092、1093、1094、1095、1096、1097、1098、1099、1100、1101、1102、1103、1104、1105、1106、1107、1108、1109、1110、1111、1112、1113、1114、1115、1116、1117、1118、1119、1120、1121、1122、1123、1124、1125、1126、1127、1128、1129、1130、1131、1132、1133、1134、1135、1136、1137、1138、1139、1140、1141、1142、1143、1144、1145、1146、1147、1148、1149、1150、1151、1152、1153、1154、1155、1156、1157、1158、1159、1160、1161、1162、1163、1164、1165、1166、1167、1168、1169、1170、1171、1172、1173、1174、1175、1176、1177、1178、1179、1180、1181、1182、1183、1184、1185、1186、1187、1188、1189、1190、1191、1192、1193、1194、1195、1196、1197、1198、1199、1200、1201、1202、1203、1204、1205、1206、1207、1208、1209、1210、1211、1212、1213、1214、1215、1216、1217、1218、1219、1220、1221、1222、1223、1224、1225、1226、1227、1228、1229、1230、1231、1232、1233、1234、1235、1236、1237、1238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、2239、2240、2241、2242、2243、2244、2245、2246、2247、2248、2249、2250、2251、2252、2253、2254、2255、2256、2257、2258、2259、2260、2261、2262、2263、2264、2265、2266、2267、2268、2269、2270、2271、2272、2273、2274、2275、2276、2277、2278、2279、2280、2281、2282、2283、2284、2285、2286、2287、2288、2289、2290、2291、2292、2293、2294、2295、2296、2297、2298、2299、2300、2301、2302、2303、2304、2305、2306、2307、2308、2309、2310、2311、2312、2313、2314、2315、2316、2317、2318、2319、2320、2321、2322、2323、2324、2325、2326、2327、2328、2329、2330、2331、2332、2333、2334、2335、2336、2337、2338、2339、2340、2341、2342、2343、2344、2345、2346、2347、2348、2349、2350、2351、2352、2353、2354、2355、2356、2357、2358、2359、2360、2361、2362、2363、2364、2365、2366、2367、2368、2369、2370、2371、2372、2373、2374、2375、2376、2377、2378、2379、2380、2381、2382、2383、2384、2385、2386、2387、2388、2389、2390、2391、2392、2393、2394、2395、2396、2397、2398、2399、2400、2401、2402、2403、2404、2405、2406、2407、2408、2409、2410、2411、2412、2413、2414、2415、2416、2417、2418、2419、2420、2421、2422、2423、2424、2425、2426、2427、2428、2429、2430、2431、2432、2433、2434、2435、2436、2437、2438、2439、2440、2441、2442、2443、2444、2445、2446、2447、2448、2449、2450、2451、2452、2453、2454、2455、2456、2457、2458、2459、2460、2461、2462、2463、2464、2465、2466、2467、2468、2469、2470、2471、2472、2473、2474、2475、2476、2477、2478、2479、2480、2481、2482、2483、2484、2485、2486、2487、2488、2489、2490、2491、2492、2493、2494、2495、2496、2497、2498、2499、2500、2501、2502、2503、2504、2505、2506、2507、2508、2509、2510、2511、2512、2513、2514、2515、2516、2517、2518、2519、2520、2521、2522、2523、2524、2525、2526、2527、2528、2529、2530、2531、2532、2533、2534、2535、2536、2537、2538、2539、2540、2541、2542、2543、2544、2545、2546、2547、2548、2549、2550、2551、2552、2553、2554、2555、2556、2557、2558、2559、2560、2561、2562、2563、2564、2565、2566、2567、2568、2569、2570、2571、2572、2573、2574、2575、2576、2577、2578、2579、2580、2581、2582、2583、2584、2585、2586、2587、2588、2589、2590、2591、2592、2593、2594、2595、2596、2597、2598、2599、2600、2601、2602、2603、2604、2605、2606、2607、2608、2609、2610、2611、2612、2613、2614、2615、2616、2617、2618、2619、2620、2621、2622、2623、2624、2625、2626、2627、2628、2629、2630、2631、2632、2633、2634、2635、2636、2637、2638、2639、2640、2641、2642、2643、2644、2645、2646、2647、2648、2649、2650、2651、2652、2653、2654、2655、2656、2657、2658、2659、2660、2661、2662、2663、2664、2665、2666、2667、2668、2669、2670、2671、2672、2673、2674、2675、2676、2677、2678、2679、2680、2681、2682、2683、2684、2685、2686、2687、2688、2689、2690、2691、2692、2693、2694、2695、2696、2697、2698、2699、2700、2701、2702、2703、2704、2705、2706、2707、2708、2709、2710、2711、2712、2713、2714、2715、2716、2717、2718、2719、2720、2721、2722、2723、2724、2725、2726、2727、2728、2729、2730、2731、2732、2733、2734、2735、2736、2737、2738、2739、2740、2741、2742、2743、2744、2745、2746、2747、2748、2749、2750、2751、2752、2753、2754、2755、2756、2757、2758、2759、2760、2761、2762、2763、2764、2765、2766、2767、2768、2769、2770、2771、2772、2773、2774、2775、2776、2777、2778、2779、2780、2781、2782、2783、2784、2785、2786、2787、2788、2789、2790、2791、2792、2793、2794、2795、2796、2797、2798、2799、2800、2801、2802、2803、2804、2805、2806、2807、2808、2809、2810、2811、2812、2813、2814、2815、2816、2817、2818、2819、2820、2821、2822、2823、2824、2825、2826、2827、2828、2829、2830、2831、2832、2833、2834、2835、2836、2837、2838、2839、2840、2841、2842、2843、2844、2845、2846、2847、2848、2849、2850、2851、2852、2853、2854、2855、2856、2857、2858、2859、2860、2861、2862、2863、2864、2865、2866、2867、2868、2869、2870、2871、2872、2873、2874、2875、2876、2877、2878、2879、2880、2881、2882、2883、2884、2885、2886、2887、2888、2889、2890、2891、2892、2893、2894、2895、2896、2897、2898、2899、2900、2901、2902、2903、2904、2905、2906、2907、2908、2909、2910、2911、2912、2913、2914、2915、2916、2917、2918、2919、2920、2921、2922、2923、2924、2925、2926、2927、2928、2929、2930、2931、2932、2933、2934、2935、2936、2937、2938、2939、2940、2941、2942、2943、2944、2945、2946、2947、2948、2949、2950、2951、2952、2953、2954、2955、2956、2957、2958、2959、2960、2961、2962、2963、2964、2965、2966、2967、2968、2969、2970、2971、2972、2973、2974、2975、2976、2977、2978、2979、2980、2981、2982、2983、2984、2985、2986、2987、2988、2989、2990、2991、2992、2993、2994、2995、2996、2997、2998、2999、3000、3001、3002、3003、3004、3005、3006、3007、3008、3009、3010、3011、3012、3013、3014、3015、3016、3017、3018、3019、3020、3021、3022、3023、3024、3025、3026、3027、3028、3029、3030、3031、3032、3033、3034、3035、3036、3037、3038、3039、3040、3041、3042、3043、3044、3045、3046、3047、3048、3049、3050、3051、3052、3053、3054、3055、3056、3057、3058、3059、3060、3061、3062、3063、3064、3065、3066、3067、3068、3069、3070、3071、3072、3073、3074、3075、3076、3077、3078、3079、3080、3081、3082、3083、3084、3085、3086、3087、3088、3089、3090、3091、3092、3093、3094、3095、3096、3097、3098、3099、3100、3101、3102、3103、3104、3105、3106、3107、3108、3109、3110、3111、3112、3113、3114、3115、3116、3117、3118、3119、3120、3121、3122、3123、3124、3125、3126、3127、3128、3129、3130、3131、3132、3133、3134、3135、3136、3137、3138、3139、3140、3141、3142、3143、3144、3145、3146、3147、3148、3149、3150、3151、3152、3153、3154、3155、3156、3157、3158、3159、3160、3161、3162、3163、3164、3165、3166、3167、3168、3169、3170、3171、3172、3173、3174、3175、3176、3177、3178、3179、3180、3181、3182、3183、3184、3185、3186、3187、3188、3189、3190、3191、3192、3193、3194、3195、3196、3197、3198、3199、3200、3201、3202、3203、3204、3205、3206、3207、3208、3209、3210、3211、3212、3213、3214、3215、3216、3217、3218、3219、3220、3221、3222、3223、3224、3225、3226、3227、3228、3229、3230、3231、3232、3233、3234、3235、3236、3237、3238、3239、3240、3241、3242、3243、3244、3245、3246、3247、3248、3249和3250个核苷酸。病毒基因组的任意填充物区的长度可以是50-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-350、350-400、400-450、450-500、500-550、550-600、600-650、650-700、700-750、750-800、800-850、850-900、900-950、950-1000、1000-1050、1050-1100、1100-1150、1150-1200、1200-1250、1250-1300、1300-1350、1350-1400、1400-1450、1450-1500、1500-1550、1550-1600、1600-1650、1650-1700、1700-1750、1750-1800、1800-1850、1850-1900、1900-1950、1950-2000、2000-2050、2050-2100、2100-2150、2150-2200、2200-2250、2250-2300、2300-2350、2350-2400、2400-2450、2450-2500、2500-2550、2550-2600、2600-2650、2650-2700、2700-2750、2750-2800、2800-2850、2850-2900、2900-2950、2950-3000、3000-3050、3050-3100、3100-3150、3150-3200和3200-3250个核苷酸。作为非限制性实例，病毒基因组包含填充物区，其长度为约450个核苷酸。作为非限制性实例，病毒基因组包含填充物区，其长度为约570个核苷酸。作为非限制性实例，病毒基因组包含填充物区，其长度为约1313个核苷酸。作为非限制性实例，病毒基因组包含填充物区，其长度为约1384个核苷酸。作为非限制性实例，病毒基因组包含填充物区，其长度为约1785个核苷酸。作为非限制性实例，病毒基因组包含填充物区，其长度为约1790个核苷酸。作为非限制性实例，病毒基因组包含填充物区，其长度为约1856个核苷酸。作为非限制性实例，病毒基因组包含填充物区，其长度为约1868个核苷酸。作为非限制性实例，病毒基因组包含填充物区，其长度为约1870个核苷酸。作为非限制性实例，病毒基因组包含填充物区，其长度为约2012个核苷酸。作为非限制性实例，病毒基因组包含填充物区，其长度为约2014个核苷酸。作为非限制性实例，病毒基因组包含填充物区，其长度为约2034个核苷酸。作为非限制性实例，病毒基因组包含填充物区，其长度为约2106个核苷酸。作为非限制性实例，病毒基因组包含填充物区，其长度为约2264个核苷酸。作为非限制性实例，病毒基因组包含填充物区，其长度为约2266个核苷酸。作为非限制性实例，病毒基因组包含填充物区，其长度为约2335个核苷酸。
在一些实施方案中，AAV颗粒病毒基因组包含至少一个填充物序列区。填充物序列区的非限制性实例在表11中描述。
表11.代表性的填充物序列区
Figure BDA0003088012730001521
Figure BDA0003088012730001531
在一些实施方案中，AAV颗粒病毒基因组包括包含人类白蛋白序列的填充物序列区。在一些实施方案中，AAV颗粒病毒基因组包含填充物序列区Alb450。在一些实施方案中，AAV颗粒病毒基因组包含填充物序列区Alb570。在一些实施方案中，AAV颗粒病毒基因组包含填充物序列区Alb1313。在一些实施方案中，AAV颗粒病毒基因组包含填充物序列区Alb1384。在一些实施方案中，AAV颗粒病毒基因组包含填充物序列区Alb1785。在一些实施方案中，AAV颗粒病毒基因组包含填充物序列区Alb1790。在一些实施方案中，AAV颗粒病毒基因组包含填充物序列区Alb1856。在一些实施方案中，AAV颗粒病毒基因组包含填充物序列区Alb1870。在一些实施方案中，AAV颗粒病毒基因组包含填充物序列区Alb2014。在一些实施方案中，AAV颗粒病毒基因组包含填充物序列区Alb2034。在一些实施方案中，AAV颗粒病毒基因组包含填充物序列区Alb2106。在一些实施方案中，AAV颗粒病毒基因组包含填充物序列区Alb2264。在一些实施方案中，AAV颗粒病毒基因组包含填充物序列区Alb2266。在一些实施方案中，AAV颗粒病毒基因组包含填充物序列区Alb2335。
病毒基因组：接合序列
在一些实施方案中，接合序列可以与本文所述的任何病毒基因组组分组合使用，例如但不限于表5-11中列出的那些。在某些实施方案中，接合序列可以位于病毒基因组中病毒基因组分(例如，启动子、增强子、内含子/外显子、miR结合位点、标签、polyA)的5'。在某些实施方案中，接合序列可以位于病毒基因组中病毒基因组分(例如，启动子、增强子、内含子/外显子、miR结合位点、标签、polyA)的3′。在某些实施方案中，病毒基因组可包括多于一个接合序列。作为非限制性实例，病毒基因组可包含在病毒基因组组分的5′末端和病毒基因组组分的3'末端上的接合序列。接合序列可以是相同的序列，两种不同的序列或病毒基因组组分的任一侧分开的序列。在某些实施方案中，接合序列包含SEQ ID NO：1813。在某些实施方案中，接合序列包含SEQ ID NO：1814。
病毒基因组：ITR至ITR模块化
在一些实施方案中，病毒基因组的ITR至ITR可包含表12-17中给出的任何序列。
表12.ITR至ITR序列的代表性序列区
Figure BDA0003088012730001541
在一些实施方案中，AAV颗粒基因组包含SEQ ID NO：1778(cFXN1)，其包含5′反向末端重复(ITR)序列区和3'ITR序列区、CBA启动子区、包含ie1外显子1区、ie1内含子1区的人类β珠蛋白内含子/外显子区、人类β-珠蛋白内含子区、人类β-珠蛋白外显子区、猕猴共济蛋白有效载荷区、HA标签序列和人类生长激素多腺苷酸化序列。
在一些实施方案中，AAV颗粒基因组包含SEQ ID NO：1779(cFXN2)，其包含5'反向末端重复(ITR)序列区和3'ITR序列区、CBA启动子区、包含ie1外显子1区、ie1内含子1区的人类β珠蛋白内含子/外显子区、人类β-珠蛋白内含子区、人类β-珠蛋白外显子区、猕猴共济蛋白有效载荷区、HA标签序列、包含单个miR122结合位点序列的三个重复的miR结合位点系列和人类生长激素多腺苷酸化序列。
在一些实施方案中，AAV颗粒基因组包含SEQ ID NO：1780(cFXN3)，其包含5'反向末端重复(ITR)序列区和3'ITR序列区、CBA-D4启动子区、接合序列、包含ie1外显子1区、ie1内含子1区的人类β珠蛋白内含子/外显子区、人类β-珠蛋白内含子区、人类β-珠蛋白外显子区、猕猴共济蛋白有效载荷区、HA标签序列、包含单个miR122结合位点序列的三个重复的miR结合位点系列和人类生长激素多腺苷酸化序列。
在一些实施方案中，AAV颗粒基因组包含SEQ ID NO：1781(cFXN4)，其包含5′反向末端重复(ITR)序列区和3'ITR序列区、CBA-D6启动子区、接合序列、包含ie1外显子1区、ie1内含子1区的人类β珠蛋白内含子/外显子区、人类β-珠蛋白内含子区、人类β-珠蛋白外显子区、猕猴共济蛋白有效载荷区、HA标签序列、包含单个miR122结合位点序列的三个重复的miR结合位点系列和人类生长激素多腺苷酸化序列。
在一些实施方案中，AAV颗粒基因组包含SEQ ID NO：1782(cFXN5)，其包含5′反向末端重复(ITR)序列区和3'ITR序列区、CBA-D6启动子区、接合序列、包含ie1外显子1区、ie1内含子1区的人类β珠蛋白内含子/外显子区、人类β-珠蛋白内含子区、人类β-珠蛋白外显子区、猕猴共济蛋白有效载荷区、HA标签序列、包含单个miR122结合位点序列的三个重复的miR结合位点系列、人类生长激素多腺苷酸化序列和白蛋白填充物序列。
在一些实施方案中，AAV颗粒基因组包含SEQ ID NO：1783(cFXN6)，其包含5′反向末端重复(ITR)序列区和3′ITR序列区、CBA-D8启动子区、接合序列、包含ie1外显子1区、ie1内含子1区的人类β珠蛋白内含子/外显子区、人类β-珠蛋白内含子区、人类β-珠蛋白外显子区、猕猴共济蛋白有效载荷区、HA标签序列、包含单个miR122结合位点序列的三个重复的miR结合位点系列和人类生长激素多腺苷酸化序列。
表13.ITR至ITR序列的代表性序列区
Figure BDA0003088012730001551
Figure BDA0003088012730001561
在一些实施方案中，AAV颗粒基因组包含SEQ ID NO：1784(cFXN7)，其包含5'反向末端重复(ITR)序列区和3'ITR序列区、CBA-D8启动子区、接合序列、包含ie1外显子1区、ie1内含子1区的人类β珠蛋白内含子/外显子区、人类β-珠蛋白内含子区、人类β-珠蛋白外显子区、猕猴共济蛋白有效载荷区、HA标签序列、包含单个miR122结合位点序列的三个重复的miR结合位点系列、人类生长激素多腺苷酸化序列和白蛋白填充物序列。
在一些实施方案中，AAV颗粒基因组包含SEQ ID NO：1785(cFXN8)，其包含5'反向末端重复(ITR)序列区和3'ITR序列区、mCBA启动子区、接合序列、包含ie1外显子1区、ie1内含子1区的人类β珠蛋白内含子/外显子区、人类β-珠蛋白内含子区、人类β-珠蛋白外显子区、猕猴共济蛋白有效载荷区、HA标签序列、包含单个miR122结合位点序列的三个重复的miR结合位点系列和人类生长激素多腺苷酸化序列。
在一些实施方案中，AAV颗粒基因组包含SEQ ID NO：1786(cFXN9)，其包含5′反向末端重复(ITR)序列区和3′ITR序列区、mCBA-D1启动子区、接合序列、包含ie1外显子1区、ie1内含子1区的人类β珠蛋白内含子/外显子区、人类β-珠蛋白内含子区、人类β-珠蛋白外显子区、猕猴共济蛋白有效载荷区、HA标签序列、包含单个miR122结合位点序列的三个重复的miR结合位点系列和人类生长激素多腺苷酸化序列。
在一些实施方案中，AAV颗粒基因组包含SEQ ID NO：1787(cFXN10)，其包含5′反向末端重复(ITR)序列区和3'ITR序列区、mCBA-D2启动子区、接合序列、包含ie1外显子1区、ie1内含子1区的人类β珠蛋白内含子/外显子区、人类β-珠蛋白内含子区、人类β-珠蛋白外显子区、猕猴共济蛋白有效载荷区、HA标签序列、包含单个miR122结合位点序列的三个重复的miR结合位点系列和人类生长激素多腺苷酸化序列。
在一些实施方案中，AAV颗粒基因组包含SEQ ID NO：1788(cFXN11)，其包含5'反向末端重复(ITR)序列区和3'ITR序列区、CMV增强子和启动子区、包含ie1外显子1区、ie1内含子1区的人类β珠蛋白内含子/外显子区、人类β-珠蛋白内含子区、人类β-珠蛋白外显子区、猕猴共济蛋白有效载荷区、HA标签序列和人类生长激素多腺苷酸化序列。
在一些实施方案中，AAV颗粒基因组包含SEQ ID NO：1789(cFXN12)，其包含5′反向末端重复(ITR)序列区和3'ITR序列区、CMV增强子和启动子区、包含ie1外显子1区、ie1内含子1区的人类β珠蛋白内含子/外显子区、人类β-珠蛋白内含子区、人类β-珠蛋白外显子区、猕猴共济蛋白有效载荷区、HA标签序列、包含单个miR122结合位点序列的三个重复的miR结合位点系列和人类生长激素多腺苷酸化序列。
表14.ITR至ITR序列的代表性序列区
Figure BDA0003088012730001571
在一些实施方案中，AAV颗粒基因组包含SEQ ID NO：1790(cFXN13)，其包含5'反向末端重复(ITR)序列区和3′ITR序列区、CMV-D1启动子区、包含ie1外显子1区、ie1内含子1区的人类β珠蛋白内含子/外显子区、人类β-珠蛋白内含子区、人类β-珠蛋白外显子区、猕猴共济蛋白有效载荷区、HA标签序列、包含单个miR122结合位点序列的三个重复的miR结合位点系列和人类生长激素多腺苷酸化序列。
在一些实施方案中，AAV颗粒基因组包含SEQ ID NO：1791(cFXN14)，其包含5′反向末端重复(ITR)序列区和3′ITR序列区、CMV-D3启动子区、包含ie1外显子1区、ie1内含子1区的人类β珠蛋白内含子/外显子区、人类β-珠蛋白内含子区、人类β-珠蛋白外显子区、猕猴共济蛋白有效载荷区、HA标签序列、包含单个miR122结合位点序列的三个重复的miR结合位点系列和人类生长激素多腺苷酸化序列。
在一些实施方案中，AAV颗粒基因组包含SEQ ID NO：1792(cFXN15)，其包含5′反向末端重复(ITR)序列区和3′ITR序列区、CMV-D7启动子区、包含ie1外显子1区、ie1内含子1区的人类β珠蛋白内含子/外显子区、人类β-珠蛋白内含子区、人类β-珠蛋白外显子区、猕猴共济蛋白有效载荷区、HA标签序列、包含单个miR122结合位点序列的三个重复的miR结合位点系列和人类生长激素多腺苷酸化序列。
在一些实施方案中，AAV颗粒基因组包含SEQ ID NO：1793(cFXN16)，其包含5′反向末端重复(ITR)序列区和3′ITR序列区、CMV-D7启动子区、包含ie1外显子1区、ie1内含子1区的人类β珠蛋白内含子/外显子区、人类β-珠蛋白内含子区、人类β-珠蛋白外显子区、猕猴共济蛋白有效载荷区、HA标签序列、包含单个miR122结合位点序列的三个重复的miR结合位点系列、人类生长激素多腺苷酸化序列和白蛋白填充物序列。
在一些实施方案中，AAV颗粒基因组包含SEQ ID NO：1794(cFXN17)，其包含5′反向末端重复(ITR)序列区和3′ITR序列区、共济蛋白启动子区、包含ie1外显子1区、ie1内含子1区的人类β珠蛋白内含子/外显子区、人类β-珠蛋白内含子区、人类β-珠蛋白外显子区、猕猴共济蛋白有效载荷区、HA标签序列、包含单个miR122结合位点序列的三个重复的miR结合位点系列和人类生长激素多腺苷酸化序列。
在一些实施方案中，AAV颗粒基因组包含SEQ ID NO：1795(cFXN18)，其包含5′反向末端重复(ITR)序列区和3′ITR序列区、共济蛋白启动子区、包含ie1外显子1区、ie1内含子1区的人类β珠蛋白内含子/外显子区、人类β-珠蛋白内含子区、人类β-珠蛋白外显子区、猕猴共济蛋白有效载荷区、HA标签序列、包含单个miR122结合位点序列的三个重复的miR结合位点系列和人类生长激素多腺苷酸化序列。
表15.ITR至ITR序列的代表性序列区
Figure BDA0003088012730001581
Figure BDA0003088012730001591
在一些实施方案中，AAV颗粒基因组包含SEQ ID NO：1796(hFXN1)，其包含5′反向末端重复(ITR)序列区和3′ITR序列区、CBA启动子区、包含ie1外显子1区、ie1内含子1区的人类β珠蛋白内含子/外显子区、人类β-珠蛋白内含子区、人类β-珠蛋白外显子区、人类共济蛋白有效载荷区、HA标签序列、包含单个miR122结合位点序列的三个重复的miR结合位点系列和人类生长激素多腺苷酸化序列。
在一些实施方案中，AAV颗粒基因组包含SEQ ID NO：1797(hFXN2)，其包含5'反向末端重复(ITR)序列区和3'ITR序列区、CBA-D8启动子区、接合序列、包含ie1外显子1区、ie1内含子1区的人类β珠蛋白内含子/外显子区、人类β-珠蛋白内含子区、人类β-珠蛋白外显子区、人类共济蛋白有效载荷序列、包含单个miR122结合位点序列的三个重复的miR结合位点系列、人类生长激素多腺苷酸化序列和白蛋白填充物序列。
在一些实施方案中，AAV颗粒基因组包含SEQ ID NO：1798(hFXN3)，其包含5'反向末端重复(ITR)序列区和3'ITR序列区、CBA-D8启动子区、接合序列、包含ie1外显子1区、ie1内含子1区的人类β珠蛋白内含子/外显子区、人类β-珠蛋白内含子区、人类β-珠蛋白外显子区、人类共济蛋白有效载荷序列、人类生长激素多腺苷酸化序列和白蛋白填充物序列。
在一些实施方案中，AAV颗粒基因组包含SEQ ID NO：1799(hFXN4)，其包含5'反向末端重复(ITR)序列区和3′ITR序列区、CMV增强子和启动子区、包含ie1外显子1区、ie1内含子1区的人类β珠蛋白内含子/外显子区、人类β-珠蛋白内含子区、人类β-珠蛋白外显子区、人类共济蛋白有效载荷序列、包含单个miR122结合位点序列的三个重复的miR结合位点系列、人类生长激素多腺苷酸化序列和白蛋白填充物序列。
在一些实施方案中，AAV颗粒基因组包含SEQ ID NO：1800(hFXN5)，其包含5′反向末端重复(ITR)序列区和3′ITR序列区、CMV增强子和启动子区、包含ie1外显子1区、ie1内含子1区的人类β珠蛋白内含子/外显子区、人类β-珠蛋白内含子区、人类β-珠蛋白外显子区、人类共济蛋白有效载荷序列、人类生长激素多腺苷酸化序列和白蛋白填充物序列。
表16.ITR至ITR序列的代表性序列区
Figure BDA0003088012730001601
在一些实施方案中，AAV颗粒基因组包含SEQ ID NO：1801(hFXN6)，其包含5′反向末端重复(ITR)序列区和3′ITR序列区、CMV-D7启动子区、包含ie1外显子1区、ie1内含子1区的人类β珠蛋白内含子/外显子区、人类β-珠蛋白内含子区、人类β-珠蛋白外显子区、人类共济蛋白有效载荷序列、包含单个miR122结合位点序列的三个重复的miR结合位点系列、人类生长激素多腺苷酸化序列和白蛋白填充物序列。
在一些实施方案中，AAV颗粒基因组包含SEQ ID NO：1802(hFXN7)，其包含5′反向末端重复(ITR)序列区和3′ITR序列区、CMV-D7启动子区、包含ie1外显子1区、ie1内含子1区的人类β珠蛋白内含子/外显子区、人类β-珠蛋白内含子区、人类β-珠蛋白外显子区、人类共济蛋白有效载荷序列、人类生长激素多腺苷酸化序列和白蛋白填充物序列。
在一些实施方案中，AAV颗粒基因组包含SEQ ID NO：1803(hFXN8)，其包含5'反向末端重复(ITR)序列区和3'ITR序列区、共济蛋白启动子区、包含ie1外显子1区、ie1内含子1区的人类β珠蛋白内含子/外显子区、人类β-珠蛋白内含子区、人类β-珠蛋白外显子区、人类共济蛋白有效载荷序列、包含单个miR122结合位点序列的三个重复的miR结合位点系列、人类生长激素多腺苷酸化序列和白蛋白填充物序列。
在一些实施方案中，AAV颗粒基因组包含SEQ ID NO：1804(hFXN9)，其包含5′反向末端重复(ITR)序列区和3′ITR序列区、共济蛋白启动子区、包含ie1外显子1区、ie1内含子1区的人类β珠蛋白内含子/外显子区、人类β-珠蛋白内含子区、人类β-珠蛋白外显子区、人类共济蛋白有效载荷序列、人类生长激素多腺苷酸化序列和白蛋白填充物序列。
在一些实施方案中，AAV颗粒基因组包含SEQ ID NO：1805(hFXN10)，其包含5′反向末端重复(ITR)序列区和3′ITR序列区、包含CMV启动子区和CBA启动子区的CAG启动子区、内含子、人类共济蛋白有效载荷序列、包含单个miR122结合位点序列的三个重复的miR结合位点系列、人类生长激素多腺苷酸化序列和白蛋白填充物序列。
表17.ITR至ITR序列的代表性序列区
Figure BDA0003088012730001611
在一些实施方案中，AAV颗粒基因组包含SEQ ID NO：1806(hFXN11)，其包含5′反向末端重复(ITR)序列区和3′ITR序列区、CMV-D1启动子区、包含ie1外显子1区、ie1内含子1区的人类β珠蛋白内含子/外显子区、人类β-珠蛋白内含子区、人类β-珠蛋白外显子区、人类共济蛋白有效载荷序列、包含单个miR122结合位点序列的三个重复的miR结合位点系列、人类生长激素多腺苷酸化序列和白蛋白填充物序列。
在一些实施方案中，AAV颗粒基因组包含SEQ ID NO：1807(hFXN12)，其包含5'反向末端重复(ITR)序列区和3'ITR序列区、CMV-D3启动子区、包含ie1外显子1区、ie1内含子1区的人类β珠蛋白内含子/外显子区、人类β-珠蛋白内含子区、人类β-珠蛋白外显子区、人类共济蛋白有效载荷序列、包含单个miR122结合位点序列的三个重复的miR结合位点系列、人类生长激素多腺苷酸化序列和白蛋白填充物序列。
在一些实施方案中，AAV颗粒基因组包含SEQ ID NO：1808(hFXN13)，其包含5′反向末端重复(ITR)序列区和3'ITR序列区、CBA-D4启动子区、接合序列、包含ie1外显子1区、ie1内含子1区的人类β珠蛋白内含子/外显子区、人类β-珠蛋白内含子区、人类β-珠蛋白外显子区、人类共济蛋白有效载荷序列、包含单个miR122结合位点序列的三个重复的miR结合位点系列、人类生长激素多腺苷酸化序列和白蛋白填充物序列。
在一些实施方案中，AAV颗粒基因组包含SEQ ID NO：1809(hFXN14)，其包含5′反向末端重复(ITR)序列区和3'ITR序列区、CBA-D6启动子区、包含ie1外显子1区、ie1内含子1区的人类β珠蛋白内含子/外显子区、人类β-珠蛋白内含子区、人类β-珠蛋白外显子区、人类共济蛋白有效载荷序列、包含单个miR122结合位点序列的三个重复的miR结合位点系列、人类生长激素多腺苷酸化序列和白蛋白填充物序列。
在一些实施方案中，AAV颗粒基因组包含SEQ ID NO：1810(hFXN15)，其包含5′反向末端重复(ITR)序列区和3′ITR序列区、包含CMV区和CBA区的启动子区、包含ie1外显子1区、ie1内含子1区的人类β珠蛋白内含子/外显子区、人类β-珠蛋白内含子区、人类β-珠蛋白外显子区、人类共济蛋白有效载荷序列、包含单个miR122结合位点序列的三个重复的miR结合位点系列、人类生长激素多腺苷酸化序列和白蛋白填充物序列。某些实施方案提供如封装在具有选自表1血清型的衣壳中的病毒基因组。例如，衣壳血清型可以选自以下VOY101、VOY102、AAVPHP.B、AAVPHP.N、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV9.47、AAV9(hu14)、AAV9 K449R、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAVDJ和AAVDJ8或其任何变体。在一些实施方案中，衣壳血清型是AAVPHP.B、AAV9、AAV6、AAVrh10和/或AAVDJ。
在一些实施方案中，将在表4、12、13、14、15、16或17中任一个提供的病毒基因组包装成AAV衣壳以产生AAV颗粒。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO:1797的病毒基因组和VOY101衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO:1797的病毒基因组和VOY201衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO：1797的病毒基因组和AAV9衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO：1797的病毒基因组和AAV9 K449R衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO:1797的病毒基因组和AAVPHP.B衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO:1797的病毒基因组和AAVPHP.N衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO:1797的病毒基因组和包含SEQ ID NO:1的衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO:1797的病毒基因组和由包含SEQ IDNO:1722的核酸序列编码的衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO:1797的病毒基因组和包含SEQ ID NO：1724的衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ IDNO：1797的病毒基因组和由包含SEQ ID NO:1723的核酸序列编码的衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO：1797的病毒基因组和包含SEQ ID NO:136的衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO:1797的病毒基因组和由包含SEQ ID NO：135的核酸序列编码的衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO:1797的病毒基因组和包含SEQ ID NO：3的衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO:1797的病毒基因组和由包含SEQ ID NO:4的核酸序列编码的衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO:1797的病毒基因组和包含SEQ ID NO：2的衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO:1797的病毒基因组和包含SEQ ID NO：9的衣壳。
在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO:1801的病毒基因组和VOY101衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO:1801的病毒基因组和VOY201衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO:1801的病毒基因组和AAV9衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO:1801的病毒基因组和AAV9 K449R衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO:1801的病毒基因组和AAVPHP.B衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO:1801的病毒基因组和AAVPHP.N衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO:1801的病毒基因组和包含SEQ ID NO:1的衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO:1801的病毒基因组和由包含SEQ ID NO:1722的核酸序列编码的衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO:1801的病毒基因组和包含SEQ ID NO：1724的衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO：1801的病毒基因组和由包含SEQ ID NO:1723的核酸序列编码的衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO:1801的病毒基因组和包含SEQ ID NO:136的衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO:1801的病毒基因组和由包含SEQ ID NO:135的核酸序列编码的衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO：1801的病毒基因组和包含SEQ ID NO:3的衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO：1801的病毒基因组和由包含SEQ IDNO:4的核酸序列编码的衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO:1801的病毒基因组和包含SEQ ID NO:2的衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO：1801的病毒基因组和包含SEQ ID NO:9的衣壳。
在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO：1808的病毒基因组和VOY101衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO:1808的病毒基因组和VOY201衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO：1808的病毒基因组和AAV9衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO:1808的病毒基因组和AAV9 K449R衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO:1808的病毒基因组和AAVPHP.B衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO:1808的病毒基因组和AAVPHP.N衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO:1808的病毒基因组和包含SEQ ID NO:1的衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO：1808的病毒基因组和由包含SEQ ID NO：1722的核酸序列编码的衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO:1808的病毒基因组和包含SEQ ID NO：1724的衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO：1808的病毒基因组和由包含SEQ ID NO:1723的核酸序列编码的衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO：1808的病毒基因组和包含SEQ ID NO:136的衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO:1808的病毒基因组和由包含SEQ ID NO:135的核酸序列编码的衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO:1808的病毒基因组和包含SEQ ID NO:3的衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO:1808的病毒基因组和由包含SEQ IDNO:4的核酸序列编码的衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO:1808的病毒基因组和包含SEQ ID NO:2的衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO：1808的病毒基因组和包含SEQ ID NO:9的衣壳。
在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO：1809的病毒基因组和VOY101衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO:1809的病毒基因组和VOY201衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO：1809的病毒基因组和AAV9衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO：1809的病毒基因组和AAV9 K449R衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO：1809的病毒基因组和AAVPHP.B衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO:1809的病毒基因组和AAVPHP.N衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO:1809的病毒基因组和包含SEQ ID NO:1的衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO：1809的病毒基因组和由包含SEQ ID NO：1722的核酸序列编码的衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO:1809的病毒基因组和包含SEQ ID NO:1724的衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO:1809的病毒基因组和由包含SEQ ID NO:1723的核酸序列编码的衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO:1809的病毒基因组和包含SEQ ID NO:136的衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO：1809的病毒基因组和由包含SEQ ID NO:135的核酸序列编码的衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO：1809的病毒基因组和包含SEQ ID NO：3的衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO：1809的病毒基因组和由包含SEQ IDNO:4的核酸序列编码的衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO:1809的病毒基因组和包含SEQ ID NO:2的衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO：1809的病毒基因组和包含SEQ ID NO:9的衣壳。
在一些实施方案中，将在表4、12、13、14、15、16或17中任一个提供的病毒基因组包装成AAV衣壳以产生AAV颗粒。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO:1797的病毒基因组和VOY101衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO:1797的病毒基因组和VOY201衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO：1797的病毒基因组和AAV9衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO:1797的病毒基因组和AAV9 K449R衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO:1797的病毒基因组和AAVPHP.B衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO：1797的病毒基因组和AAVPHP.N衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO:1797的病毒基因组和包含SEQ ID NO:1的衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO:1797的病毒基因组和由包含SEQ IDNO:1722的核酸序列编码的衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO：1797的病毒基因组和包含SEQ ID NO：1724的衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ IDNO:1797的病毒基因组和由包含SEQ ID NO:1723的核酸序列编码的衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO：1797的病毒基因组和包含SEQ ID NO:136的衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO：1797的病毒基因组和由包含SEQ ID NO:135的核酸序列编码的衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO：1797的病毒基因组和包含SEQ ID NO:3的衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO:1797的病毒基因组和由包含SEQ ID NO:4的核酸序列编码的衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO:1797的病毒基因组和包含SEQ ID NO：2的衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO：1797的病毒基因组和包含SEQ ID NO：9的衣壳。
在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO：1801的病毒基因组和VOY101衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO:1801的病毒基因组和VOY201衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO:1801的病毒基因组和AAV9衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO:1801的病毒基因组和AAV9 K449R衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO：1801的病毒基因组和AAVPHP.B衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO:1801的病毒基因组和AAVPHP.N衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO:1801的病毒基因组和包含SEQ ID NO:1的衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO:1801的病毒基因组和由包含SEQ ID NO：1722的核酸序列编码的衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO:1801的病毒基因组和包含SEQ ID NO:1724的衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO:1801的病毒基因组和由包含SEQ ID NO:1723的核酸序列编码的衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO:1801的病毒基因组和包含SEQ ID NO:136的衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO:1801的病毒基因组和由包含SEQ ID NO:135的核酸序列编码的衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO:1801的病毒基因组和包含SEQ ID NO:3的衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO：1801的病毒基因组和由包含SEQ IDNO:4的核酸序列编码的衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO：1801的病毒基因组和包含SEQ ID NO:2的衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO：1801的病毒基因组和包含SEQ ID NO:9的衣壳。
在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO：1808的病毒基因组和VOY101衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO:1808的病毒基因组和VOY201衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO：1808的病毒基因组和AAV9衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO:1808的病毒基因组和AAV9 K449R衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO:1808的病毒基因组和AAVPHP.B衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO:1808的病毒基因组和AAVPHP.N衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO:1808的病毒基因组和包含SEQ ID NO:1的衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO:1808的病毒基因组和由包含SEQ ID NO:1722的核酸序列编码的衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO：1808的病毒基因组和包含SEQ ID NO:1724的衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO:1808的病毒基因组和由包含SEQ ID NO：1723的核酸序列编码的衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO:1808的病毒基因组和包含SEQ ID NO:136的衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO:1808的病毒基因组和由包含SEQ ID NO:135的核酸序列编码的衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO:1808的病毒基因组和包含SEQ ID NO:3的衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO：1808的病毒基因组和由包含SEQ IDNO:4的核酸序列编码的衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO:1808的病毒基因组和包含SEQ ID NO:2的衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO:1808的病毒基因组和包含SEQ ID NO:9的衣壳。
在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO:1809的病毒基因组和VOY101衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO:1809的病毒基因组和VOY201衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO:1809的病毒基因组和AAV9衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO：1809的病毒基因组和AAV9 K449R衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO:1809的病毒基因组和AAVPHP.B衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO:1809的病毒基因组和AAVPHP.N衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO:1809的病毒基因组和包含SEQ ID NO:1的衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO:1809的病毒基因组和由包含SEQ ID NO：1722的核酸序列编码的衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO：1809的病毒基因组和包含SEQ ID NO：1724的衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO：1809的病毒基因组和由包含SEQ ID NO：1723的核酸序列编码的衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO：1809的病毒基因组和包含SEQ ID NO：136的衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO：1809的病毒基因组和由包含SEQ ID NO：135的核酸序列编码的衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO：1809的病毒基因组和包含SEQ ID NO：3的衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO:1809的病毒基因组和由包含SEQ IDNO：4的核酸序列编码的衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO：1809的病毒基因组和包含SEQ ID NO：2的衣壳。在一些实施方案中，AAV颗粒包括包含SEQ ID NO:1809的病毒基因组和包含SEQ ID NO:9的衣壳。
在一些实施方案中，将包含如表4、12、13、14、15、16或17中任一个所给出的病毒基因组的AAV颗粒和衣壳配制在适于施用的溶液中，例如，包含一种或多种盐和一种或多种表面活性剂的制剂。
在一些实施方案中，所述制剂包含氯化钠、磷酸钠、氯化钾、磷酸钾和普朗尼克F-68中的一种或多种，pH值为约7-8。在一些实施方案中，所述制剂包含192mM氯化钠、10mM磷酸钠(二碱价的)、2.7mM氯化钾、2mM磷酸钾(一碱价的)和0.001％普朗尼克F-68(v/v)，pH7.4(在本公开中的制剂1)。在一些实施方案中，将包括包含SEQ ID NO:1797的病毒基因组和VOY101衣壳的AAV颗粒配制在以下溶液中：包含192mM氯化钠、10mM磷酸钠(二碱价的)、2.7mM氯化钾、2mM磷酸钾(一碱价的)和0.001％普朗尼克F-68(v/v)，pH 7.4。在一些实施方案中，将包括包含SEQ ID NO:1797的病毒基因组和VOY201衣壳的AAV颗粒配制在以下溶液中：包含192mM氯化钠、10mM磷酸钠(二碱价的)、2.7mM氯化钾、2mM磷酸钾(一碱价的)和0.001％普朗尼克F-68(v/v)，pH 7.4。在一些实施方案中，将包括包含SEQ ID NO:1797的病毒基因组AAV9衣壳的AAV颗粒配制在以下溶液中：包含192mM氯化钠、10mM磷酸钠(二碱价的)、2.7mM氯化钾、2mM磷酸钾(一碱价的)和0.001％普朗尼克F-68(v/v)，pH 7.4。在一些实施方案中，将包括包含SEQ ID NO：1797的病毒基因组和AAV9 K449R衣壳的AAV颗粒配制在以下溶液中：包含192mM氯化钠、10mM磷酸钠(二碱价的)、2.7mM氯化钾、2mM磷酸钾(一碱价的)和0.001％普朗尼克F-68(v/v)，pH 7.4。在一些实施方案中，将包括包含SEQ ID NO：1797的病毒基因组和AAVPHP.B衣壳的AAV颗粒配制在以下溶液中：包含192mM氯化钠、10mM磷酸钠(二碱价的)、2.7mM氯化钾、2mM磷酸钾(一碱价的)和0.001％普朗尼克F-68(v/v)，pH7.4。在一些实施方案中，将包括包含SEQ ID NO:1797的病毒基因组和AAVPHP.N衣壳的AAV颗粒配制在以下溶液中：包含192mM氯化钠、10mM磷酸钠(二碱价的)、2.7mM氯化钾、2mM磷酸钾(一碱价的)和0.001％普朗尼克F-68(v/v)，pH 7.4。在一些实施方案中，将包括包含SEQID NO:1797的病毒基因组和包含SEQ ID NO：1的衣壳的AAV颗粒配制在以下溶液中：包含192mM氯化钠、10mM磷酸钠(二碱价的)、2.7mM氯化钾、2mM磷酸钾(一碱价的)和0.001％普朗尼克F-68(v/v)，pH 7.4。在一些实施方案中，将包括包含SEQ ID NO：1797的病毒基因组和由包含SEQ ID NO：1722的核酸序列编码的衣壳的AAV颗粒配制在以下溶液中：包含192mM氯化钠、10mM磷酸钠(二碱价的)、2.7mM氯化钾、2mM磷酸钾(一碱价的)和0.001％普朗尼克F-68(v/v)，pH 7.4。在一些实施方案中，将包括包含SEQ ID NO:1797的病毒基因组和包含SEQID NO:1724的衣壳的AAV颗粒配制在以下溶液中：包含192mM氯化钠、10mM磷酸钠(二碱价的)、2.7mM氯化钾、2mM磷酸钾(一碱价的)和0.001％普朗尼克F-68(v/v)，pH 7.4。
在一些实施方案中，将包括包含SEQ ID NO:1797的病毒基因组和由包含SEQ IDNO：1723的核酸序列编码的的衣壳的AAV颗粒配制在以下溶液中：包含192mM氯化钠、10mM磷酸钠(二碱价的)、2.7mM氯化钾、2mM磷酸钾(一碱价的)和0.001％普朗尼克F-68(v/v)，pH7.4。在一些实施方案中，将包括包含SEQ ID NO:1797的病毒基因组和包含SEQ ID NO：136的衣壳的AAV颗粒配制在以下溶液中：包含192mM氯化钠、10mM磷酸钠(二碱价的)、2.7mM氯化钾、2mM磷酸钾(一碱价的)和0.001％普朗尼克F-68(v/v)，pH 7.4。在一些实施方案中，将包括包含SEQ ID NO：1797的病毒基因组和由包含SEQ ID NO：135的核酸序列编码的衣壳的AAV颗粒配制在以下溶液中：包含192mM氯化钠、10mM磷酸钠(二碱价的)、2.7mM氯化钾、2mM磷酸钾(一碱价的)和0.001％普朗尼克F-68(v/v)，pH 7.4。在一些实施方案中，将包括包含SEQ ID NO:1797的病毒基因组和包含SEQ ID NO:3的衣壳的AAV颗粒配制在以下溶液中：包含192mM氯化钠、10mM磷酸钠(二碱价的)、2.7mM氯化钾、2mM磷酸钾(一碱价的)和0.001％普朗尼克F-68(v/v)，pH 7.4。在一些实施方案中，将包括包含SEQ ID NO：1797的病毒基因组和由包含SEQ ID NO：4的核酸序列编码的的衣壳的AAV颗粒配制在以下溶液中：包含192mM氯化钠、10mM磷酸钠(二碱价的)、2.7mM氯化钾、2mM磷酸钾(一碱价的)和0.001％普朗尼克F-68(v/v)，pH 7.4。在一些实施方案中，将包括包含SEQ ID NO:1797的病毒基因组和包含SEQ ID NO：2的衣壳的AAV颗粒配制在以下溶液中：包含192mM氯化钠、10mM磷酸钠(二碱价的)、2.7mM氯化钾、2mM磷酸钾(一碱价的)和0.001％普朗尼克F-68(v/v)，pH 7.4。在一些实施方案中，将包括包含SEQ ID NO:1797的病毒基因组和包含SEQ ID NO:9的衣壳的AAV颗粒配制在以下溶液中：包含192mM氯化钠、10mM磷酸钠(二碱价的)、2.7mM氯化钾、2mM磷酸钾(一碱价的)和0.001％普朗尼克F-68(v/v)，pH 7.4。
在一些实施方案中，将包括包含SEQ ID NO：1801的病毒基因组和VOY101衣壳的AAV颗粒配制在以下溶液中：包含192mM氯化钠、10mM磷酸钠(二碱价的)、2.7mM氯化钾、2mM磷酸钾(一碱价的)和0.001％普朗尼克F-68(v/v)，pH 7.4。在一些实施方案中，将包括包含SEQ ID NO:1801的病毒基因组和VOY201衣壳的AAV颗粒配制在以下溶液中：包含192mM氯化钠、10mM磷酸钠(二碱价的)、2.7mM氯化钾、2mM磷酸钾(一碱价的)和0.001％普朗尼克F-68(v/v)，pH 7.4。在一些实施方案中，将包括包含SEQ ID NO：1801的病毒基因组和AAV9衣壳的AAV颗粒配制在以下溶液中：包含192mM氯化钠、10mM磷酸钠(二碱价的)、2.7mM氯化钾、2mM磷酸钾(一碱价的)和0.001％普朗尼克F-68(v/v)，pH 7.4。在一些实施方案中，将包括包含SEQ ID NO:1801的病毒基因组和AAV9 K449R衣壳的AAV颗粒配制在以下溶液中：包含192mM氯化钠、10mM磷酸钠(二碱价的)、2.7mM氯化钾、2mM磷酸钾(一碱价的)和0.001％普朗尼克F-68(v/v)，pH 7.4。在一些实施方案中，将包括包含SEQ ID NO：1801的病毒基因组和AAVPHP.B衣壳的AAV颗粒配制在以下溶液中：包含192mM氯化钠、10mM磷酸钠(二碱价的)、2.7mM氯化钾、2mM磷酸钾(一碱价的)和0.001％普朗尼克F-68(v/v)，pH 7.4。在一些实施方案中，将包括包含SEQ ID NO:1801的病毒基因组和AAVPHP.N衣壳的AAV颗粒配制在以下溶液中：包含192mM氯化钠、10mM磷酸钠(二碱价的)、2.7mM氯化钾、2mM磷酸钾(一碱价的)和0.001％普朗尼克F-68(v/v)，pH 7.4。在一些实施方案中，将包括包含SEQ ID NO:1801的病毒基因组和包含SEQ ID NO:1的衣壳的AAV颗粒配制在以下溶液中：包含192mM氯化钠、10mM磷酸钠(二碱价的)、2.7mM氯化钾、2mM磷酸钾(一碱价的)和0.001％普朗尼克F-68(v/v)，pH7.4。在一些实施方案中，将包括包含SEQ ID NO:1801的病毒基因组和由包含SEQ ID NO:1722的核酸序列编码的衣壳的AAV颗粒配制在以下溶液中：包含192mM氯化钠、10mM磷酸钠(二碱价的)、2.7mM氯化钾、2mM磷酸钾(一碱价的)和0.001％普朗尼克F-68(v/v)，pH 7.4。在一些实施方案中，将包括包含SEQ ID NO：1801的病毒基因组和包含SEQ ID NO:1724的衣壳的AAV颗粒配制在以下溶液中：包含192mM氯化钠、10mM磷酸钠(二碱价的)、2.7mM氯化钾、2mM磷酸钾(一碱价的)和0.001％普朗尼克F-68(v/v)，pH 7.4。在一些实施方案中，将包括包含SEQ ID NO：1801的病毒基因组和由包含SEQ ID NO：1723的核酸序列编码的的衣壳的AAV颗粒配制在以下溶液中：包含192mM氯化钠、10mM磷酸钠(二碱价的)、2.7mM氯化钾、2mM磷酸钾(一碱价的)和0.001％普朗尼克F-68(v/v)，pH 7.4。一些实施方案中，将包括包含SEQ ID NO：1801的病毒基因组和包含SEQ ID NO:136的衣壳的AAV颗粒配制在以下溶液中：包含192mM氯化钠、10mM磷酸钠(二碱价的)、2.7mM氯化钾、2mM磷酸钾(一碱价的)和0.001％普朗尼克F-68(v/v)，pH 7.4。在一些实施方案中，将包括包含SEQ ID NO：1801的病毒基因组和由包含SEQ ID NO：135的核酸序列编码的的衣壳的AAV颗粒配制在以下溶液中：包含192mM氯化钠、10mM磷酸钠(二碱价的)、2.7mM氯化钾、2mM磷酸钾(一碱价的)和0.001％普朗尼克F-68(v/v)，pH 7.4。在一些实施方案中，将包括包含SEQ ID NO:1801的病毒基因组和包含SEQ ID NO:3的衣壳的AAV颗粒配制在以下溶液中：包含192mM氯化钠、10mM磷酸钠(二碱价的)、2.7mM氯化钾、2mM磷酸钾(一碱价的)和0.001％普朗尼克F-68(v/v)，pH 7.4。在一些实施方案中，将包括包含SEQ ID NO:1801的病毒基因组和由包含SEQ ID NO：4的核酸序列编码的的衣壳的AAV颗粒配制在以下溶液中：包含192mM氯化钠、10mM磷酸钠(二碱价的)、2.7mM氯化钾、2mM磷酸钾(一碱价的)和0.001％普朗尼克F-68(v/v)，pH 7.4。在一些实施方案中，将包括包含SEQ ID NO：1801的病毒基因组和包含SEQ ID NO:2的衣壳的AAV颗粒配制在以下溶液中：包含192mM氯化钠、10mM磷酸钠(二碱价的)、2.7mM氯化钾、2mM磷酸钾(一碱价的)和0.001％普朗尼克F-68(v/v)，pH 7.4。在一些实施方案中，将包括包含SEQ ID NO：1801的病毒基因组和包含SEQ ID NO:9的衣壳的AAV颗粒配制在以下溶液中：包含192mM氯化钠、10mM磷酸钠(二碱价的)、2.7mM氯化钾、2mM磷酸钾(一碱价的)和0.001％普朗尼克F-68(v/v)，pH 7.4。
在一些实施方案中，将包括包含SEQ ID NO:1808的病毒基因组和VOY101衣壳的AAV颗粒配制在以下溶液中：包含192mM氯化钠、10mM磷酸钠(二碱价的)、2.7mM氯化钾、2mM磷酸钾(一碱价的)和0.001％普朗尼克F-68(v/v)，pH 7.4。在一些实施方案中，将包括包含SEQ ID NO：1808的病毒基因组和VOY201衣壳的AAV颗粒配制在以下溶液中：包含192mM氯化钠、10mM磷酸钠(二碱价的)、2.7mM氯化钾、2mM磷酸钾(一碱价的)和0.001％普朗尼克F-68(v/v)，pH 7.4。在一些实施方案中，将包括包含SEQ ID NO:1808的病毒基因组和AAV9衣壳的AAV颗粒配制在以下溶液中：包含192mM氯化钠、10mM磷酸钠(二碱价的)、2.7mM氯化钾、2mM磷酸钾(一碱价的)和0.001％普朗尼克F-68(v/v)，pH 7.4。在一些实施方案中，将包括包含SEQ ID NO:1808的病毒基因组和AAV9 K449R衣壳的AAV颗粒配制在以下溶液中：包含192mM氯化钠、10mM磷酸钠(二碱价的)、2.7mM氯化钾、2mM磷酸钾(一碱价的)和0.001％普朗尼克F-68(v/v)，pH 7.4。在一些实施方案中，将包括包含SEQ ID NO:1808的病毒基因组和AAVPHP.B衣壳的AAV颗粒配制在以下溶液中：包含192mM氯化钠、10mM磷酸钠(二碱价的)、2.7mM氯化钾、2mM磷酸钾(一碱价的)和0.001％普朗尼克F-68(v/v)，pH 7.4。在一些实施方案中，将包括包含SEQ ID NO:1808的病毒基因组和AAVPHP.N衣壳的AAV颗粒配制在以下溶液中：包含192mM氯化钠、10mM磷酸钠(二碱价的)、2.7mM氯化钾、2mM磷酸钾(一碱价的)和0.001％普朗尼克F-68(v/v)，pH 7.4。在一些实施方案中，将包括包含SEQ ID NO:1808的病毒基因组和包含SEQ ID NO:1的衣壳的AAV颗粒配制在以下溶液中：包含192mM氯化钠、10mM磷酸钠(二碱价的)、2.7mM氯化钾、2mM磷酸钾(一碱价的)和0.001％普朗尼克F-68(v/v)，pH7.4。在一些实施方案中，将包括包含SEQ ID NO:1808的病毒基因组和由包含SEQ ID NO：1722的核酸序列编码的衣壳的AAV颗粒配制在以下溶液中：包含192mM氯化钠、10mM磷酸钠(二碱价的)、2.7mM氯化钾、2mM磷酸钾(一碱价的)和0.001％普朗尼克F-68(v/v)，pH 7.4。在一些实施方案中，将包括包含SEQ ID NO：1808的病毒基因组和包含SEQ ID NO:1724的衣壳的AAV颗粒配制在以下溶液中：包含192mM氯化钠、10mM磷酸钠(二碱价的)、2.7mM氯化钾、2mM磷酸钾(一碱价的)和0.001％普朗尼克F-68(v/v)，pH 7.4。在一些实施方案中，将包括包含SEQ ID NO:1808的病毒基因组和由包含SEQ ID NO：1723的核酸序列编码的的衣壳的AAV颗粒配制在以下溶液中：包含192mM氯化钠、10mM磷酸钠(二碱价的)、2.7mM氯化钾、2mM磷酸钾(一碱价的)和0.001％普朗尼克F-68(v/v)，pH 7.4。在一些实施方案中，将包括包含SEQ ID NO:1808的病毒基因组和包含SEQ ID NO：136的衣壳的AAV颗粒配制在以下溶液中：包含192mM氯化钠、10mM磷酸钠(二碱价的)、2.7mM氯化钾、2mM磷酸钾(一碱价的)和0.001％普朗尼克F-68(v/v)，pH 7.4。在一些实施方案中，将包括包含SEQ ID NO:1808的病毒基因组和由包含SEQ ID NO：135的核酸序列编码的衣壳的AAV颗粒配制在以下溶液中：包含192mM氯化钠、10mM磷酸钠(二碱价的)、2.7mM氯化钾、2mM磷酸钾(一碱价的)和0.001％普朗尼克F-68(v/v)，pH 7.4。在一些实施方案中，将包括包含SEQ ID NO:1808的病毒基因组和包含SEQ ID NO:3的衣壳的AAV颗粒配制在以下溶液中：包含192mM氯化钠、10mM磷酸钠(二碱价的)、2.7mM氯化钾、2mM磷酸钾(一碱价的)和0.001％普朗尼克F-68(v/v)，pH 7.4。在一些实施方案中，将包括包含SEQ ID NO:1808的病毒基因组和由包含SEQ ID NO：4的核酸序列编码的的衣壳的AAV颗粒配制在以下溶液中：包含192mM氯化钠、10mM磷酸钠(二碱价的)、2.7mM氯化钾、2mM磷酸钾(一碱价的)和0.001％普朗尼克F-68(v/v)，pH 7.4。在一些实施方案中，将包括包含SEQ ID NO:1808的病毒基因组和包含SEQ ID NO:2的衣壳的AAV颗粒配制在以下溶液中：包含192mM氯化钠、10mM磷酸钠(二碱价的)、2.7mM氯化钾、2mM磷酸钾(一碱价的)和0.001％普朗尼克F-68(v/v)，pH 7.4。在一些实施方案中，将包括包含SEQ ID NO：1808的病毒基因组和包含SEQ ID NO:9的衣壳的AAV颗粒配制在以下溶液中：包含192mM氯化钠、10mM磷酸钠(二碱价的)、2.7mM氯化钾、2mM磷酸钾(一碱价的)和0.001％普朗尼克F-68(v/v)，pH 7.4。在一些实施方案中，将包括包含SEQ ID NO：1809的病毒基因组和VOY101衣壳的AAV颗粒配制在以下溶液中：包含192mM氯化钠、10mM磷酸钠(二碱价的)、2.7mM氯化钾、2mM磷酸钾(一碱价的)和0.001％普朗尼克F-68(v/v)，pH 7.4。
在一些实施方案中，将包括包含SEQ ID NO:1809的病毒基因组和VOY201衣壳的AAV颗粒配制在以下溶液中：包含192mM氯化钠、10mM磷酸钠(二碱价的)、2.7mM氯化钾、2mM磷酸钾(一碱价的)和0.001％普朗尼克F-68(v/v)，pH 7.4。在一些实施方案中，将包括包含SEQ ID NO:1809的病毒基因组和AAV9衣壳的AAV颗粒配制在以下溶液中：包含192mM氯化钠、10mM磷酸钠(二碱价的)、2.7mM氯化钾、2mM磷酸钾(一碱价的)和0.001％普朗尼克F-68(v/v)，pH 7.4。在一些实施方案中，将包括包含SEQ ID NO：1809的病毒基因组和AAV9K449R衣壳的AAV颗粒配制在以下溶液中：包含192mM氯化钠、10mM磷酸钠(二碱价的)、2.7mM氯化钾、2mM磷酸钾(一碱价的)和0.001％普朗尼克F-68(v/v)，pH 7.4。在一些实施方案中，将包括包含SEQ ID NO:1809的病毒基因组和AAVPHP.B衣壳的AAV颗粒配制在以下溶液中：包含192mM氯化钠、10mM磷酸钠(二碱价的)、2.7mM氯化钾、2mM磷酸钾(一碱价的)和0.001％普朗尼克F-68(v/v)，pH 7.4。在一些实施方案中，将包括包含SEQ ID NO:1809的病毒基因组和AAVPHP.N衣壳的AAV颗粒配制在以下溶液中：包含192mM氯化钠、10mM磷酸钠(二碱价的)、2.7mM氯化钾、2mM磷酸钾(一碱价的)和0.001％普朗尼克F-68(v/v)，pH 7.4。在一些实施方案中，将包括包含SEQ ID NO:1809的病毒基因组和包含SEQ ID NO:1的衣壳的AAV颗粒配制在以下溶液中：包含192mM氯化钠、10mM磷酸钠(二碱价的)、2.7mM氯化钾、2mM磷酸钾(一碱价的)和0.001％普朗尼克F-68(v/v)，pH 7.4。。在一些实施方案中，将包括包含SEQID NO:1809的病毒基因组和由包含SEQ ID NO：1722的核酸序列编码的衣壳的AAV颗粒配制在以下溶液中：包含192mM氯化钠、10mM磷酸钠(二碱价的)、2.7mM氯化钾、2mM磷酸钾(一碱价的)和0.001％普朗尼克F-68(v/v)，pH 7.4。在一些实施方案中，将包括包含SEQ ID NO：1809的病毒基因组和包含SEQ ID NO：1724的衣壳的AAV颗粒配制在以下溶液中：包含192mM氯化钠、10mM磷酸钠(二碱价的)、2.7mM氯化钾、2mM磷酸钾(一碱价的)和0.001％普朗尼克F-68(v/v)，pH 7.4。在一些实施方案中，将包括包含SEQ ID NO:1809的病毒基因组和由包含SEQ ID NO：1723的核酸序列编码的的衣壳的AAV颗粒配制在以下溶液中：包含192mM氯化钠、10mM磷酸钠(二碱价的)、2.7mM氯化钾、2mM磷酸钾(一碱价的)和0.001％普朗尼克F-68(v/v)，pH 7.4。在一些实施方案中，将包括包含SEQ ID NO：1809的病毒基因组和由包含SEQID NO：136的核酸序列编码的的衣壳的AAV颗粒配制在以下溶液中：包含192mM氯化钠、10mM磷酸钠(二碱价的)、2.7mM氯化钾、2mM磷酸钾(一碱价的)和0.001％普朗尼克F-68(v/v)，pH7.4。在一些实施方案中，将包括包含SEQ ID NO：1809的病毒基因组和由包含SEQ ID NO：135的核酸序列编码的衣壳的AAV颗粒配制在以下溶液中：包含192mM氯化钠、10mM磷酸钠(二碱价的)、2.7mM氯化钾、2mM磷酸钾(一碱价的)和0.001％普朗尼克F-68(v/v)，pH 7.4。在一些实施方案中，将包括包含SEQ ID NO：1809的病毒基因组和包含SEQ ID NO：3的衣壳的AAV颗粒配制在以下溶液中：包含192mM氯化钠、10mM磷酸钠(二碱价的)、2.7mM氯化钾、2mM磷酸钾(一碱价的)和0.001％普朗尼克F-68(v/v)，pH 7.4。在一些实施方案中，将包括包含SEQ ID NO:1809的病毒基因组和由包含SEQ ID NO：4的核酸序列编码的的衣壳的AAV颗粒配制在以下溶液中：包含192mM氯化钠、10mM磷酸钠(二碱价的)、2.7mM氯化钾、2mM磷酸钾(一碱价的)和0.001％普朗尼克F-68(v/v)，pH 7.4。在一些实施方案中，将包括包含SEQID NO:1809的病毒基因组和由包含SEQ ID NO：2的核酸序列编码的的衣壳的AAV颗粒配制在以下溶液中：包含192mM氯化钠、10mM磷酸钠(二碱价的)、2.7mM氯化钾、2mM磷酸钾(一碱价的)和0.001％普朗尼克F-68(v/v)，pH 7.4。在一些实施方案中，将包括包含SEQ ID NO:1809的病毒基因组和由包含SEQ ID NO：9的核酸序列编码的的衣壳的AAV颗粒配制在以下溶液中：包含192mM氯化钠、10mM磷酸钠(二碱价的)、2.7mM氯化钾、2mM磷酸钾(一碱价的)和0.001％普朗尼克F-68(v/v)，pH 7.4。
在一些实施方案中，病毒基因组是单链的。在一些实施方案中，病毒基因组是自身互补的。本公开的某些实施方案的AAV颗粒包含两个反向末端重复(ITR)区。在一些实施方案中，ITR是AAV2 ITR。在一些实施方案中，一个ITR包含SEQ ID NO：1811，另一个ITR包含SEQ ID NO：1812。某些实施方案提供一种病毒基因组，其包含相对于多核苷酸序列位于5′的第一ITR区，以及相对于多核苷酸序列位于3'的第二反向末端重复区。
II.病毒产生
通用病毒产生过程
在一些实施方案中，用于产生AAV，例如rAAV颗粒的细胞可以包含哺乳动物细胞(例如HEK293细胞)和/或昆虫细胞(例如Sf9细胞)。
在各种实施方案中，AAV产生包括用于产生AAV颗粒和载体的过程和方法，所述AAV颗粒和载体可以接触靶细胞以递送有效载荷(payload)，例如，重组病毒构建体，其包含编码有效载荷分子的核苷酸。在某些实施方案中，病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体，例如重组腺相关病毒(rAAV)载体。在某些实施方案中，AAV颗粒是腺相关病毒(AAV)颗粒，例如重组腺相关病毒(rAAV)颗粒。
在各种实施方案中，本文提供了通过以下方式产生AAV颗粒或载体的方法：(a)使病毒产生细胞与编码至少一种AAV衣壳蛋白的一种或多种病毒表达构建体以及编码有效载荷分子的一种或多种有效载荷构建体接触，其可以选自：转基因，编码蛋白质的多核苷酸和调节性核酸；(b)在这样的条件下培养病毒产生细胞，使得产生至少一种AAV颗粒或载体，和(c)从产生流中分离AAV颗粒或载体。
在这些方法中，病毒表达构建体可以编码至少一种结构蛋白和/或至少一种非结构蛋白。结构蛋白可包括任何天然或野生型衣壳蛋白VP1、VP2和/或VP3，或其嵌合蛋白。非结构蛋白可包括任何天然或野生型Rep78、Rep68、Rep52和/或Rep40蛋白或其嵌合蛋白。
在某些实施方案中，通过瞬时转染、病毒转导和/或电穿孔发生接触。
在某些实施方案中，病毒产生细胞选自哺乳动物细胞和昆虫细胞。在某些实施方案中，昆虫细胞包括草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)昆虫细胞。在某些实施方案中，昆虫细胞包括Sf9昆虫细胞。在某些实施方案中，昆虫细胞包括Sf21昆虫细胞。
在各种实施方案中，本公开的有效载荷构建体载体可以包括至少一个反向末端重复序列(ITR)，并且可以包括哺乳动物DNA。
还提供了根据本文描述的方法产生的AAV颗粒和病毒载体。
在各种实施方案中，本公开的AAV颗粒可以配制成具有一种或多种可接受的赋形剂的药物组合物。
在某些实施方案中，可以通过本文描述的方法产生AAV颗粒或病毒载体。
在某些实施方案中，可以通过使病毒产生细胞(例如，昆虫细胞或哺乳动物细胞)与编码至少一种衣壳蛋白的至少一种病毒表达构建体和至少一种有效载荷构建体载体接触来产生AAV颗粒。病毒产生细胞可以通过瞬时转染、病毒转导和/或电穿孔来接触。有效载荷构建体载体可以包括编码有效载荷分子的有效载荷构建体，所述有效载荷分子例如但不限于转基因、编码蛋白质的多核苷酸和调节性核酸。可以在这样的条件下培养病毒产生细胞，使得产生、分离(例如，使用温度诱导的裂解、机械裂解和/或化学裂解)和/或纯化(例如，使用过滤、色谱法和/或免疫亲和纯化)至少一种AAV颗粒或载体。作为非限制性实例，有效载荷构建体载体可以包括哺乳动物DNA。
在某些实施方案中，使用本文所述的方法在昆虫细胞(例如，草地贪夜蛾(Sf9)细胞)中产生AAV颗粒。作为非限制性实例，使用病毒转导接触昆虫细胞，所述病毒转导可包括杆状病毒转导。
在某些实施方案中，使用本文所述的方法在哺乳动物细胞(例如，HEK293细胞)中产生AAV颗粒。作为非限制性实例，使用病毒转导接触哺乳动物细胞，所述病毒转导可包括多质粒瞬时转染(例如三质粒瞬时转染)。
在某些实施方案中，本文所述的AAV颗粒产生方法在病毒产生细胞中产生大于101、大于102、大于103、大于104或大于105的AAV颗粒。
在某些实施方案中，本公开的过程包括使用病毒产生系统在病毒产生细胞中生产病毒颗粒，所述病毒产生系统包括至少一种病毒表达构建体和至少一种有效载荷构建体。所述至少一种病毒表达构建体和至少一种有效载荷构建体可以被共转染(例如双重转染、三重转染)进入病毒产生细胞。使用本领域技术人员已知和常规进行的标准分子生物学技术完成转染。病毒产生细胞提供表达蛋白质所必需的细胞机器和产生AAV颗粒所必需的其他生物材料，包括复制有效载荷构建体的Rep蛋白和组装以形成包围复制的有效载荷构建体的衣壳的Cap蛋白。从病毒产生细胞中提取所得的AAV颗粒，并将其加工成用于施用的药物制剂。
在各种实施方案中，一旦施用，本文公开的AAV颗粒可以不受理论的束缚而接触靶细胞并进入例如内体(endosome)中的细胞。AAV颗粒，例如从内体释放的那些，可以随后接触靶细胞的核以递送有效载荷构建体。有效载荷构建体，例如重组病毒构建体可以被递送至靶细胞的细胞核，其中可以表达由有效载荷构建体编码的有效载荷分子。
在某些实施方案中，用于产生病毒颗粒的过程利用病毒产生细胞的种子培养物，其包括一种或多种杆状病毒(例如，已被病毒表达构建体和有效载荷构建体载体转染的杆状病毒表达载体(BEV)或杆状病毒感染的昆虫细胞(BIIC))。在某些实施方案中，收集种子培养物，分成等分试样并冷冻，并且可以在以后的时间点来引发感染产生细胞的初始群(
Figure BDA0003088012730001781
population)。
在一些实施方案中，AAV颗粒的大规模产生利用生物反应器。不受理论的束缚，生物反应器的使用可以允许精确测量和/或控制支持病毒产生细胞生长和活性的变量，例如质量、温度、混合条件(喷射器RPM或波振荡)、CO2浓度、O2浓度、气体喷射速率和体积、气体覆盖速率和体积、pH、活细胞密度(VCD)、细胞活力、细胞直径和/或光密度(OD)。在某些实施方案中，生物反应器用于批量生产，其中在实验确定的时间点收集整个培养物，并纯化AAV颗粒。在一些实施方案中，生物反应器用于连续生产，其中在实验确定的时间点收集一部分培养物用于纯化AAV颗粒，并且用额外的生长培养基组分刷新(refresh生物反应器中的剩余培养物。
在各个实施方案中，可以在包括细胞裂解、澄清、灭菌和纯化的过程中从病毒产生细胞中提取AAV病毒颗粒。细胞裂解包括破坏病毒产生细胞结构，由此释放AAV颗粒的任何过程。在某些实施方案中，细胞裂解可以包括热激、化学或机械裂解方法。澄清可以包括裂解细胞、培养基组分和AAV颗粒混合物的粗纯化。在某些实施方案中，澄清包括离心和/或过滤，包括但不限于深度端、切向流和/或中空纤维过滤。
在各种实施方案中，病毒产生的最终结果是AAV颗粒的纯化集合，其包括两个组分：(1)有效载荷构建体(例如重组AAV载体基因组构建体)和(2)病毒衣壳。
在某些实施方案中，本公开的病毒产生系统或过程包括使用病毒产生细胞(VPC)和质粒构建体产生杆状病毒感染的昆虫细胞(BIIC)的步骤。解冻并扩增来自细胞库(CB)的病毒产生细胞(VPC)，以提供目标工作体积和VPC浓度。所得的VPC池分为Rep/Cap VPC池和有效载荷VPC池。将一种或多种Rep/Cap质粒构建体(病毒表达构建体)加工成Rep/CapBacmid多核苷酸并转染到Rep/Cap VPC池中。将一种或多种有效载荷质粒构建体(有效载荷构建体)加工成有效载荷Bacmid多核苷酸并转染到有效载荷VPC池中。孵育两个VPC池以产生P1 Rep/Cap杆状病毒表达载体(BEV)和P1有效载荷BEV。将两个BEV池扩展为噬菌斑集合，并选择一个噬菌斑用于克隆噬斑(CP)纯化(也称为单一噬菌斑扩展)。该过程可以包括单个CP纯化步骤，或者可以包括串联或由其他加工步骤分开的多个CP纯化步骤。一个或多个(one-or-more)CP纯化步骤提供CP Rep/Cap BEV池和CP有效载荷BEV池。然后可以存储这两个BEV池并将其用于将来的产生步骤中，或者然后可以将它们转染到VPC中以产生Rep/CapBIIC池和有效载荷BIIC池。
在某些实施方案中，本公开的病毒产生系统或过程包括使用病毒产生细胞(VPC)和杆状病毒感染的昆虫细胞(BIIC)产生AAV颗粒的步骤。解冻并扩增来自细胞库(CB)的病毒产生细胞(VPC)，以提供目标工作体积和VPC浓度。将病毒产生细胞的工作体积接种到生产生物反应器中，并可以进一步扩展至200-2000L的工作体积，并具有用于BIIC感染的目标VPC浓度。然后，将生产生物反应器中的VPC的工作体积与Rep/Cap BIIC和有效载荷BIIC共感染，并达到目标VPC：BIIC比例和目标BIIC：BIIC比例。VCD感染也可以利用BEV。将共感染的VPC在生产生物反应器中孵育并扩展，以产生AAV颗粒和VPC的大量收集物。
病毒表达构建体
在各种实施方案中，本公开的病毒产生系统包括可以被转染/转导到病毒产生细胞中的一种或多种病毒表达构建体。在某些实施方案中，本公开的病毒表达构建体或有效载荷构建体可以是bacmid，也被称为杆状病毒质粒或重组杆状病毒基因组。在某些实施方案中，病毒表达包括蛋白质编码核苷酸序列和至少一个表达控制序列，用于在病毒产生细胞中表达。在某些实施方案中，病毒表达包括可操作地连接至少一个表达控制序列以在病毒产生细胞中表达的蛋白质编码核苷酸序列。在某些实施方案中，病毒表达构建体包含在一个或多个启动子控制下的细小病毒(parvoviral)基因。细小病毒基因可以包括编码非结构性AAV复制蛋白的核苷酸序列，例如编码Rep52、Rep40、Rep68或Rep78蛋白的Rep基因。细小病毒基因可以包括编码结构性AAV蛋白的核苷酸序列，例如编码VP1、VP2和VP3蛋白的Cap基因。
本公开的病毒表达构建体可以包括生物或化学的任何化合物或制剂，其有助于用核酸转化、转染或转导细胞。示例性的生物病毒表达构建体包括质粒、线性核酸分子和重组病毒，包括杆状病毒。示例性的化学载体包括脂质复合物。根据本公开，病毒表达构建体用于将核酸序列掺入病毒复制细胞中。(O'Reilly,David R.,Lois K.Miller,和VerneA.Luckow.Baculovirus expression vectors:a laboratory manual.Oxford UniversityPress,1994.)；Maniatis等人,编辑Molecular Cloning.CSH Laboratory,NY,N.Y.(1982)；以及,Philiport和Scluber,编辑Liposomes as tools in Basic Research andIndustry.CRC Press,Ann Arbor,Mich.(1995)，与病毒表达构建体及其用途有关的其每一个的内容通过引用整体并入本文。
在某些实施方案中，病毒表达构建体是AAV表达构建体，其包括编码非结构性AAV复制蛋白、结构性AAV衣壳蛋白或其组合的一个或多个核苷酸序列。
在某些实施方案中，本公开的病毒表达构建体可以是质粒载体。在某些实施方案中，本公开的病毒表达构建体可以是杆状病毒构建体。
本公开不受用于产生AAV颗粒或病毒载体的病毒表达构建体的数量的限制。在某些实施方案中，根据本公开，可以采用一种、两种、三种、四种、五种、六种或更多种病毒表达构建体来在病毒产生细胞中产生AAV颗粒。在本公开的某些实施方案中，病毒表达构建体可以用于在昆虫细胞中产生AAV颗粒。在某些实施方案中，可以对衣壳和/或rep基因的野生型AAV序列进行修饰，例如以改善病毒颗粒的特性，例如增加的感染性或特异性，或提高产量。
在某些实施方案中，病毒表达构建体可含有包括起始密码子区域的核苷酸序列，例如编码包括一个或多个起始密码子区域的AAV衣壳蛋白的序列。在某些实施方案中，起始密码子区域可以在表达控制序列内。起始密码子可以是ATG或非ATG密码子(即，次优起始密码子，其中AAV VP1衣壳蛋白的起始密码子是非ATG)。
在某些实施方案中，用于AAV产生的病毒表达构建体可以含有编码AAV衣壳蛋白的核苷酸序列，其中AAV VP1衣壳蛋白的起始密码子是非ATG，即次优起始密码子，允许在生产系统中以修饰的比例表达病毒衣壳蛋白，以提高宿主细胞的感染力。在非限制性实例中，病毒构建体载体可以含有核酸构建体，该核酸构建体包含编码AAV VP1、VP2和VP3衣壳蛋白的核苷酸序列，其中用于AAV VP1衣壳蛋白翻译的起始密码子是CTG、TTG或GTG，如美国专利号US 8,163,543中所述，与AAV衣壳蛋白及其产生有关的其内容通过引用整体并入本文。
在某些实施方案中，本发明的病毒表达构建体可以是质粒载体或杆状病毒构建体，其编码细小病毒rep蛋白用于在昆虫细胞中表达。在某些实施方案中，将单个编码序列用于Rep78和Rep52蛋白，其中用于Rep78蛋白翻译的起始密码子是次优起始密码子，其选自由ACG、TTG、CTG和GTG组成的组，其在昆虫细胞中表达时影响部分外显子跳跃，如在美国专利号8,512,981中所述，其内容通过引用整体并入本文，例如与Rep52相比促进Rep78的丰富表达减少，其可以促进高载体产量。
在某些实施方案中，VP编码区编码特定AAV血清型的一种或多种AAV衣壳蛋白。VP编码区的AAV血清型可以相同或不同。在某些实施方案中，可以对VP编码区进行密码子优化。在某些实施方案中，可以针对哺乳动物细胞对VP编码区或核苷酸序列进行密码子优化。在某些实施方案中，可以针对昆虫细胞对VP编码区或核苷酸序列进行密码子优化。在某些实施方案中，可以针对草地贪夜蛾细胞对VP编码区或核苷酸序列进行密码子优化。在某些实施方案中，可以针对Sf9或Sf21细胞系对VP编码区或核苷酸序列进行密码子优化。
在某些实施方案中，可以对编码一种或多种VP衣壳蛋白的核苷酸序列进行密码子优化，以使其与参考核苷酸序列的核苷酸同源性小于100％。在某些实施方案中，密码子优化的VP核苷酸序列与参考VP核苷酸序列之间的核苷酸同源性小于100％、小于99％、小于98％、小于97％、小于96％、小于95％、小于94％、小于93％、小于92％、小于91％、小于90％、小于89％、小于88％、小于87％、小于86％、小于85％、小于84％、小于83％、小于82％、小于81％、小于80％、小于78％、小于76％、小于74％、小于72％、小于70％、小于68％、小于66％、小于64％、小于62％、小于60％、小于55％、小于50％和小于40％。
在某些实施方案中，本公开的病毒表达构建体或有效载荷构建体可以是bacmid，也被称为杆状病毒质粒或重组杆状病毒基因组。在某些实施方案中，本公开的病毒表达构建体或有效载荷构建体(例如bacmid)可以包括通过本领域技术人员已知和执行的标准分子生物学技术通过同源重组(转座子供体/受体系统)掺入bacmid中的多核苷酸。
在某些实施方案中，掺入bacmid的多核苷酸(即多核苷酸插入物)可包括可操作地连接蛋白质编码核苷酸序列的表达控制序列。在某些实施方案中，掺入bacmid的多核苷酸可以包括表达控制序列，其包括启动子，例如p10或polh，并且其可操作地连接编码结构性AAV衣壳蛋白(例如VP1、VP2、VP3或其组合)的核苷酸序列。在某些实施方案中，掺入bacmid的多核苷酸可包括表达控制序列，其包括启动子，例如p10或polh，并且其可操作地连接编码非结构AAV衣壳蛋白(例如Rep78、Rep52，或其组合)的核苷酸序列。
本公开的方法不受限于特定表达控制序列的使用。但是，当达到一定的VP产品化学计量比时(VP1、VP2和VP3分别接近1：1：10)，并且还当Rep52或Rep40的水平(也称为p19Reps)明显高于Rep78或Rep68(也称为p5 Reps)时，可以在生产细胞(例如昆虫细胞)中获得提高的AAV产量。在某些实施方案中，p5/p19比例低于0.6，低于0.4或低于0.3，但总是至少0.03。这些比例可以在蛋白质水平上测量，或者可以从特定mRNA的相对水平暗示。
在某些实施方案中，在病毒产生细胞(例如哺乳动物或昆虫细胞)中产生AAV颗粒，其中所有三种VP蛋白均以接近、约或1:1:10(VP1:VP2:VP3)；2:2:10(VP1:VP2:VP3)；2:0:10(VP1:VP2:VP3)；1-2:0-2:10(VP1:VP2:VP3)；1-2：1-2：10(VP1:VP2:VP3)；2-3:0-3:10(VP1:VP2:VP3)；2-3:2-3:10(VP1:VP2:VP3)；3:3:10(VP1:VP2:VP3)；3-5:0-5:10(VP1:VP2:VP3)；或3-5:3-5:10(VP1:VP2:VP3)的化学计量表达。
在某些实施方案中，将表达控制区经工程化改造以产生VP1：VP2：VP3的比例，该比例选自：约或恰好1:0:10；约或恰好1:1:10；约或恰好2:1:10；约或恰好2:1:10；约或恰好2:2:10；约或恰好3:0:10；约或恰好3:1:10；约或恰好3:2:10；约或恰好3:3:10；约或恰好4:0:10；约或恰好4:1:10；约或恰好4:2:10；约或恰好4:3:10；约或恰好4:4:10；约或恰好5:5:10；约或恰好1-2:0-2:10；约或恰好1-2:1-2:10；约或恰好1-3:0-3:10；约或恰好1-3:1-3:10；约或恰好1-4:0-4:10；约或恰好1-4:1-4:10；约或恰好1-5:1-5:10；约或恰好2-3:0-3:10；约或恰好2-3:2-3:10；约或恰好2-4:2-4:10；约或恰好2-5:2-5:10；约或恰好3-4:3-4:10；约或恰好3-5:3-5:10；和约或恰好4-5:4-5:10。
在本公开的某些实施方案中，从杆状病毒衍生的多面体启动子(polh)转录Rep52或Rep78。Rep52或Rep78也可以从较弱的启动子转录，例如ie-1启动子的缺失突变体，即Δie-1启动子，其具有该ie-1启动子的转录活性的约20％。可以使用与Δie-1启动子基本同源的启动子。关于启动子，认为至少50％、60％、70％、80％、90％或更高的同源性是基本上同源的启动子。
哺乳动物细胞
本文公开的本公开的病毒产生描述了用于产生与靶细胞接触以递送有效载荷构建体例如重组AAV颗粒或病毒构建体(其包含编码有效载荷分子的核苷酸)的AAV颗粒或病毒载体的过程和方法。病毒产生细胞可以选自任何生物，包括原核(例如，细菌)细胞，和真核细胞，包括昆虫细胞、酵母细胞和哺乳动物细胞。
在某些实施方案中，本公开的AAV颗粒可以在包括哺乳动物细胞的病毒产生细胞中产生。病毒产生细胞可包含哺乳动物细胞，例如A549、WEH1、3T3、10T1/2、BHK、MDCK、COS1、COS 7、BSC 1、BSC 40、BMT 10、VERO、W138、HeLa、HEK293、HEK293T(293T)、Saos、C2C12、L细胞、HT1080、Huh7、HepG2、C127、3T3、CHO、HeLa细胞、KB细胞、BHK和衍生自哺乳动物的原代成纤维细胞、肝细胞和成肌细胞。病毒产生细胞可包括衍生自任何哺乳动物物种的细胞，包括但不限于人、猴、小鼠、大鼠、兔和仓鼠或细胞类型，包括但不限于成纤维细胞、肝细胞、肿瘤细胞、细胞系转化细胞等。
通常用于产生重组AAV颗粒的AAV病毒产生细胞包括但不限于如美国专利号6,156,303、5,387,484、5,741,683、5,691,176、6,428,988和5,688,676；美国专利申请2002/0081721，以及国际专利公开号WO 00/47757、WO 00/24916和WO 96/17947中描述的其他哺乳动物细胞系，将其内容通过引用整体并入本文，因为它们的内容与本公开不冲突。在某些实施方案中，AAV病毒产生细胞是反式互补包装细胞系，其提供从复制缺陷性辅助病毒，例如HEK293细胞或其他Ea反式互补细胞中缺失的功能。
在某些实施方案中，包装细胞系293-10-3(ATCC登录号PTA-2361)可用于产生AAV颗粒，如美国专利号US 6,281,010中所述，其内容通过引用整体并入本文，与293-10-3包装细胞系和其用途相关。
在某些实施方案中，在本公开的用于在磷酸甘油激酶(phosphoglyceratekinase)(PGK)启动子的控制下编码腺病毒E1a和腺病毒E1b的细胞系(例如HeLa细胞系)，其用于反式互补E1缺失的腺病毒载体，所述细胞系用于AAV颗粒产生，如美国专利No.6365394中描述的，作为与Hela细胞系相关的内容及其应用通过引用整体并入本文。
在某些实施方案中，AAV颗粒使用多个瞬时转染方法(例如三质粒瞬时转染)在哺乳动物细胞中产生。在某些实施方案中，多质粒瞬时转染方法包括转染以下三种不同的构建体：(i)有效载荷构建体，(ii)rep/cap构建体(Parvoviral rep和parvoviral帽)和(iii)辅助构建体。在某些实施方案中，AAV颗粒产量的三种组分的三重转染方法可用于产生小量病毒，用于包括转导效率、靶组织(向性)评估和稳定性的测定。在某些实施方案中，AAV颗粒产生的三种组分的三重转染方法可用于产生临床或商业应用的大量材料。
待配制的AAV颗粒可以通过三重转染或杆状病毒介导的病毒产生生产，或本领域已知的任何其他方法。可以采用本领域已知的任何合适的允许或包装细胞来产生载体。在某些实施方案中，使用反式互补包装细胞系，其提供从复制缺陷辅助病毒的功能缺失，例如293细胞或其他E1A反式互补细胞。
基因盒可含有一些或全部细小病毒(例如，AAV)帽和rep基因。在某些实施方案中，通过将编码衣壳和/或Rep蛋白的包装载体引入细胞中，在反式中提供一些或全部帽和rep功能。在某些实施方案中，基因盒不编码衣壳或Rep蛋白。或者，使用包装细胞系，其稳定地转化以表达帽和/或rep基因。
重组AAV病毒颗粒在某些实施方案中，根据如US2016/0032254中所述的过程从培养上清液中产生和纯化，与重组AAV病毒颗粒的生产和加工相关的内容通过引用整体并入本文。生产还可以涉及本领域已知的方法，包括使用293T细胞，三重转染或任何合适的生产方法。
在某些实施方案中，哺乳动物病毒产生细胞(例如293T细胞)可以是粘附/粘附状态(例如，利用磷酸钙)或悬浮状态(例如，用聚乙烯亚胺(PEI))。用AAV的产生所需的质粒转染哺乳动物病毒产生细胞(即AAV rep/cap构建体，腺病毒辅助构建体和/或ITR侧翼有效载荷构建体)。在某些实施方案中，转染过程可包括任选的培养基变化(例如，以粘合形式细胞的培养基变化，以spension形式的细胞没有培养基变化，如果需要，以悬浮形式的细胞培养基变化)。在某些实施方案中，转染过程可包括转染培养基，例如DMEM或F17。在某些实施方案中，转染培养可包括血清或可以是无血清的(例如，具有磷酸钙和血清的粘附状态的细胞，具有PEI和没有血清的悬浮状态细胞)。
随后可以通过刮擦(粘附形式)和/或造粒(pelleting)(悬浮形式和刮擦粘附形式)来收集细胞并转移到容器中。可以根据需要重复收集步骤以进行完整的搜集产生的细胞。接下来，可以通过连续的冻融循环(-80℃至37℃)，化学裂解(例如添加洗涤剂triton)、机械裂解或通过允许细胞培养在达到
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0％的活力后降解来实现细胞裂解。通过离心和/或深度过滤除去细胞碎片。通过DNA qPCR通过DNase抗性基因组滴定来定量AAV颗粒样品。
根据基因组拷贝数(每毫升基因组颗粒)测量AAV颗粒滴度。基因组颗粒浓度基于如前所报道的载体DNA的DNAqPCR(Clark et al.(1999)Hum.Gene Ther.,10:1031-1039；Veldwijk et al.(2002)Mol.Ther.,6:272-278，与颗粒浓度的测量有关的内容通过引用并入本文。
昆虫细胞
本公开的病毒产生包括用于产生与靶细胞接触的AAV颗粒或病毒载体的过程和方法，以递送有效载荷构建体，例如重组病毒构建体，其包括编码有效载荷分子的核苷酸。在某些实施方案中，本公开的AAV颗粒或病毒载体可以在包括昆虫细胞的病毒生产细胞中产生。
培养中昆虫细胞的生长条件以及培养中昆虫细胞中的异源产物的产生在本领域中是众所周知的，参见美国专利号6,204,059，与病毒生产中昆虫细胞的生长和使用相关的内容相关，通过引用整体并入本文。
可以根据本公开使用允许细小病毒复制和可以维持在培养物中的任何虫细胞。通常用于制备重组AAV颗粒的AAV病毒生产细胞包括但不限于草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)，包括但不限于Sf9或Sf21细胞系，果蝇细胞系或蚊虫细胞系，例如AEDESAlbopictus衍生的细胞系。用昆虫细胞用于表达异源蛋白质很好的证明，以及将核酸如载体，例如昆虫细胞相容载体引入这种细胞和在培养中维持这些细胞的方法。参见，例如，Methods in Molecular Biology,ed.Richard,Humana Press,NJ(1995)；O′Reilly etal.,Baculovirus Expression Vectors,ALaboratory Manual,Oxford Univ.Press(1994)；Samulski et al.,J.Vir.63：3822-8(1989)；Kajigaya et al.,Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 88:4646-50(1991)；Ruffing et al.,J.Vir.66:6922-30(1992)；Kimbauer et al.,Vir.219：37-44(1996)；Zhao et al.,Vir.272：382-93(2000)；andSamulski et al.,U.S.Pat.No.6,204,059,与使用昆虫细胞在病毒性生产中有关，所有内容物通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，使用WO2015/191508中描述的方法进行AAV颗粒，其内容通过引用整体并入本文，因为它们与本公开不冲突。
在某些实施方案中，可以使用昆虫宿主细胞系统(例如，如Luckow et al.,Bio/Technology 6:47(1988)所述)组合。在某些实施方案中，用于制备嵌合肽的表达系统是Trichoplusia ni,Tn 5B1-4昆虫细胞/杆状病毒系统(baculoviral system)，其可用于高水平的蛋白质，如美国专利No.6660521中所述，其内容通过引用并入整体本文，如与生物颗粒的产生相关。
昆虫细胞的扩增、培养、转染、感染和储存可以在本领域已知的任何细胞培养基、细胞转染培养基或储存介质中进行，包括HycloneTM SFX-InsectTM Cell Culture Media、Expression System ESF AFTM Insect Cell Culture Medium、ThermoFisher Sf-900IITMmedia,ThermoFisher Sf-900IIITM media或ThermoFisher Grace’s Insect Media。本公开的昆虫细胞混合物还可包括本公开内容中描述的任何配方添加剂或元素，包括(但不限于)盐、酸、碱、缓冲剂、表面活性剂(例如泊洛昔洛克188/普朗尼克F-68)和其他已知的培养基元素。配方添加剂可以逐渐掺入或作为“峰(spikes)”(在短时间内掺入大量)。
杆状病毒-生产系统
在某些实施方案中，本公开的方法可以包括使用病毒表达构建体和有效载荷构建体载体的杆状病毒系统中的AAV颗粒或病毒载体的生产。在某些实施方案中，杆状病毒系统包括杆状病毒表达载体(BEV)和/或杆状病毒感染昆虫细胞(BIIC)。在某些实施方案中，本公开的病毒表达构建体或病毒表达构建体或有效载荷构建体可以是杆粒(bacmid)，也称为杆状病毒质粒或重组杆状病毒基因组。在某些实施方案中，本公开的病毒表达构建体或有效载荷构建体可以是通过同源重组(转座子供体/受体系统)掺入杆粒的多核苷酸。单独的病毒复制细胞群体的转染产生两组或更多组(例如二，三)的杆状病毒(BEV)，一或多组可包括病毒表达构建体(表达BEV)，以及一个或多个可包括有效载荷构建体(有效载荷BEV)。杆状病毒可用于感染用于产生AAV颗粒或病毒载体的病毒生产细胞。
在某些实施方案中，该方法包括转染单一病毒复制细胞群，以产生包括病毒表达构建体和有效载荷构建体的单个杆状病毒(BEV)组。这些杆状病毒可用于感染用于产生AAV颗粒或病毒载体的病毒生产细胞。
在某些实施方案中，使用Bacmid转染剂，例如
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WFI水或ThermoFisher
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II Reagent试剂制备BEV。在某些实施方案中，在病毒生产细胞中产生并扩增BEV，例如昆虫细胞。
在某些实施方案中，该方法利用包括一种或多种BEV的病毒生产细胞的种子培养物，包括杆状病毒感染昆虫细胞(BIIC)。已经转染/转染/被感染的种子BIEC，其表达式BEV包括病毒表达构造，以及包括有效载荷构建的有效载荷BEV。在某些实施方案中，将种子培养物收获，分为等分试样并冷冻，并且可以在稍后的时间中使用以引发产生细胞的幼稚群的转染/转导/感染。在某些实施方案中，将一组种子BIIC储存在-80℃或LN2蒸汽中。
杆状病毒是由几种基本蛋白质制成的，这对于杆状病毒的功能和复制是必不可少的，例如复制蛋白质，包膜蛋白和衣壳蛋白。因此，杆状病毒基因组包括编码基本蛋白质的几个基因基因核苷酸序列。作为非限制性实例，基因组可包括基因基因区域，其包括编码杆状病毒构建体的必需蛋白质的基本基因核苷酸序列。基本蛋白质可包括：GP64杆状病毒囊蛋白，VP39杆状病毒囊泡蛋白，或用于杆状病毒构建体的其他类似必需的蛋白质。
用于在昆虫细胞中生产AAV颗粒的杆状病毒表达载体(BEV)，包括但不限于烟草蛋白酶葡萄鱼(Sf9)细胞，提供了病毒载体产物的高滴度。编码病毒表达构建体和有效载荷构建体的重组杆状病毒引发了病毒载体复制细胞的生产感染。从初级感染中释放的感染性杆状病毒颗粒分别感染培养物中的额外细胞，指数地感染了许多感染循环中的整个细胞培养群，这是初始传染性感染的函数，参见Urabe,M.et al.J Virol.2006Feb；80(4):1874-85,，其内容通过引用整体并入本文，与生产和使用BeV和病毒颗粒相关。
在昆虫细胞系统中产生杆状病毒的AAV颗粒可以解决已知的杆状病毒遗传和物理不稳定。
在某些实施方案中，本公开的生产系统通过利用无滴度(titerless)感染细胞保存和扩展系统来解决多个通道上的杆状病毒不稳定性。用编码AAV颗粒的结构和/或非结构组分的病毒表达构建体转染病毒产生细胞的小规模种子培养物。将杆状病毒感染的病毒生产细胞收获到可以在液氮中冷冻保存的等分试样；等分试样保留了对大规模病毒产生细胞培养物感染的活力和感染性。Wasilko DJ et al.Protein Expr Purif.2009Jun；65(2):122-32,，其内容通过引用整体并入本文，与生产和使用BeV和病毒颗粒相关。
遗传稳定的杆状病毒可用于制备用于在无脊椎细胞中产生AAV颗粒的一种或多种组分的来源。在某些实施方案中，有缺陷的杆状病毒表达载体可以在昆虫细胞中映异组保持。在这样的实施方案中，相应的杆粒载体被设计为复制控制元素，包括但不限于启动子，增强子和/或细胞周期调节的复制元件。
在某些实施方案中，将杆状病毒感染允许的稳定的病毒产生细胞具有至少一个稳定的AAV复制和载体产生所需的元件的稳定集成副本，包括但不限于整个AAV基因组，Rep和Cap基因，Rep基因，Cap基因，每种Rep蛋白作为单独的转录盒，每个VP蛋白作为单独的转录盒，AAP(组装活化蛋白)，或至少一种具有天然或非天然启动子的杆状病毒辅助基因。
在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒可以在昆虫细胞(例如，Sf9细胞)中产生。
在一些实施方案中，可以使用三重转染来生产本公开的AAV颗粒。
在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒可以在哺乳动物细胞中产生。
在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒可以通过哺乳动物细胞中的三重转染来产生。
在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒可以通过HEK293细胞中的三重转染来产生。
编码本文所述的脱脂蛋白的AAV病毒基因组可用于人类疾病，兽医应用和各种体内和体外设置的领域。本公开的AAV颗粒可用于治疗，预防，痛苦或神经学或神经肌肉疾病和/或病症的改善的药物领域。在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒用于预防和/或治疗弗里德希共济失调。
本发明的各种实施方案提供了包含本文所述AAV颗粒和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
本文本发明的各种实施方案提供了一种治疗有此需要的受试者的方法，包括给予受试者给予治疗有效量的本文所述的药物组合物。
该方法的某些实施方案提供了受试者由选自的药物组合物的给药途径治疗：静脉内、intracerebroventricular、intraparenchymal、鞘内、软膜和肌肉内或其组合。该方法的某些实施方案提供了对受试者被治疗为Friedreich的共济失调和/或其他神经障碍因缺乏缺陷的呋喃妥的数量或功能而产生的。在该方法的一个方面，弗里德雷希的共济失调或其他神经疾病的病理特征被缓解和/或弗里德雷希的共济失调或其他神经障碍的进展被停止，减缓，改善或逆转。
本发明的各种实施方案描述了一种提高有需要的受试者的中枢神经系统中脱脂蛋白水平的方法，包括通过输注给予所述受试者，有效量的本文所述的药物组合物。
本文还描述了用于设计，制备，制造和/或AAV颗粒制剂的组合物，方法，工艺，试剂盒和装置。在一些实施方案中，有效载荷，例如但不限于FXN，可以通过有效载荷构建体来编码或包含在质粒或载体或重组腺相关病毒(AAV)中。
本公开还提供载体和病毒颗粒的给药和/或递送方法，例如AAV颗粒，用于治疗或改善弗里德里希共济失调。这些方法可能涉及基因替代或基因活化。通过利用本文所教导的方法和组合物来实现这种结果。
III.药物组合物
本发明还提供了一种治疗与哺乳动物受试者中的脱脂蛋白的功能或表达相关的FA和疾病的方法，包括向受试者施用本文所述的AAV多核苷酸或AAV基因组(即“载体基因组”，“病毒基因组”或“VG”)或向受试者施用，或给受试者施用包含所述AAV多核苷酸或AAV基因组的颗粒，或给予受试者的任何所述组合物，包括药物组合物。
如本文所用，术语“组合物”包含AAV多核苷酸或AAV基因组或AAV颗粒和至少一种赋形剂。
如本文所用，术语“药物组合物”包含AAV多核苷酸或AAV基因组或AAV颗粒和一种或多种药学上可接受的赋形剂。
尽管药物组合物的描述，例如包括编码待递送的FXN构建体的有效载荷的AAV，但本文主要针对适于对人类给予的药物组合物，所以通过本领域技术人员将理解的是这种组合物通常是适用于任何其他动物，例如非人类动物，例如非人类哺乳动物。适用于给予人类的药物组合物的修饰为了使适于给予各种动物的组合物，得到很好的理解，并且通常熟练的兽医药物学家可以仅用普通的，如果有的话，可以使用/或进行这种修饰，如果有的话，可以进行这种改性。预期药物组合物给药的受试者包括但不限于人和/或其他灵长类动物；哺乳动物，包括商业相关的哺乳动物，如牛，猪，马，羊，猫，狗，小鼠和/或大鼠；和/或鸟类，包括商业相关的鸟类，如家禽，鸡，鸭，鹅和/或火鸡。
在一些实施方案中，组合物给人类，人类患者或受试者施用。
在一些实施方案中，本文所述的AAV颗粒制剂可含有编码至少一个有效载荷的核酸。在一些实施方案中，制剂可含有编码1,2,3,4或5个有效载荷的核酸。在一些实施方案中，制剂可含有编码从类别中选择的蛋白质的有效载荷构建蛋白质，但不限于人类蛋白质，兽药，细菌蛋白质，生物蛋白质，抗体，免疫原性蛋白质，治疗肽和蛋白质的核酸分泌的蛋白质，血浆膜蛋白，细胞质蛋白质，细胞骨架蛋白，细胞内膜结合蛋白，核蛋白，与人类疾病相关的蛋白质，和/或与非人类疾病相关的蛋白质。在一些实施方案中，制剂含有至少三种编码蛋白质的有效负载构建体。某些实施例提供了至少一个有效载荷是FXN或其变体。
可以制备根据本公开的药物组合物，包装，包装和/或在体积中作为单个单位剂量和/或作为多个单个单位剂量来制备，包装和/或销售。如本文所用，“单位剂量”是指包含预定量的活性成分的药物组合物的离散量。活性成分的量通常等于活性成分的剂量，其将被施用于受试者和/或方便的这种剂量的级分，例如例如这种用量的一半或三分之一。
IV.配方
本文所述的AAV药物组合物的制剂可以通过在药理学领域中已知或下文中已知的任何方法制备。通常，这种预备方法包括使活性成分与赋形剂和/或一种或多种其他辅助成分带来的步骤，然后，如必要和/或期望，将产品分成，整理，将产品包装成一个所需的单剂量或多剂量单位。
根据本公开内容的药物组合物中的活性成分，药学上可接受的赋形剂和/或任何另外的成分的相对量将根据治疗受试者的身份，尺寸和/或条件而变化，并且进一步取决于途径由组合物施用。
例如，组合物可包含0.1％至99％(w/w)的活性成分。举例来说，该组合物可包含0.1％至100％，例如，在5-50％之间、1-30％之间、在5-80％之间或至少80％(w/w)活性成分。
本公开的AAV颗粒可以使用一种或多种赋形剂来配制：(1)增加稳定性；(2)增加细胞转染或转导；(3)允许持续或延迟释放；(4)改变生物分布(例如，将病毒颗粒靶向特定组织或细胞类型)；(5)增加体内编码蛋白的翻译；(6)改变体内和/或(7)中编码蛋白的释放曲线，允许不适用于有效载荷的表达。
本公开的制剂可以包括但不限于盐水，脂质醇，脂质体，脂质纳米粒子，聚合物，脂质体，核壳纳米颗粒，肽，蛋白质，用病毒载体转染的细胞(例如，用于移植到受试者中)，纳米颗粒模拟物及其组合。此外，本公开的病毒载体可以使用自组装核酸纳米颗粒配制。
在一些实施方案中，可以配制编码FXN的病毒载体以优化小心和/或渗透压。在一些实施方案中，可以优化制剂的小心和/或渗透压，以确保中枢神经系统的最佳药物分布或中枢神经系统的区域或组分。
在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒可以在PBS用0.001％pluronic酸F-68配制在PBS中，其pH值为约7.0。
在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒可以在PBS中配制，与环氧乙烷/环氧丙烷共聚物(也称为Pluronic或泊洛沙姆)组合。
在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒可以配制在具有0.001％pluronic酸(F-68)(Poloxamer 188)的PBS中，pH约7.0的。
在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒可以配制在具有0.001％pluronic酸(F-68)(Poloxamer 188)的PBS中，pH约7.3。
在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒可以配制在具有0.001％pluronic酸(F-68)(Poloxamer 188)的PBS中，pH约7.4。
在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒可以配制在包含氯化钠，磷酸钠和环氧乙烷/环氧丙烷共聚物的溶液中。
在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒可以配制在包含氯化钠，磷酸钠，氯化钠，磷酸钾，磷酸钾和泊洛沙姆188/pluronic酸(F-68)中的溶液中配制。
在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒可以在包含192mM氯化钠，10mM磷酸钠(二元碱)，2.7mM氯化钾，2mM磷酸钾(一元碱)和0.001％Pluronic F-68(v/v)，pH 7.4。该制剂在本公开中被称为制剂1。
在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒可以在包含约192mM氯化钠，约10mM磷酸钠和约0.001％泊洛沙姆188的溶液中配制在约7.3的溶液中。最终溶液中氯化钠的浓度可以是150mm-200mm。作为非限制性实例，最终溶液中氯化钠的浓度可以是150mm，160mm，170mm，180mm，190mm或200mm。最终溶液中磷酸钠浓度可以是1mm-50mm。作为非限制性实例，最终溶液中的磷酸钠浓度可以是1mm，2mm，3mm，4mm，5mm，6mm，7mm，8mm，9mm，10mm，15mm，20毫米，25毫米，30毫米，40毫米或50毫米。泊洛沙姆188的浓度(pluronic acid酸(F-68))可以是0.0001％-1％。作为非限制性实例，泊洛沙姆188的浓度(plowonat酸(F-68))可以为0.0001％，0.0005％，0.001％，0.005％，0.01％，0.05％，0.1％，0.5％或1％。最终溶液可具有6.8-7.7的pH。最终溶液的pH的非限制性实例包括pH为6.8,6.9,7.0,7.1,7.2,7.3,7.4,7.5,7.6或7.7。
在一个实施方案中，本公开的AAV颗粒可以在包含约1.05％氯化钠，约0.212％的磷酸钠，庚酸钠，约0.025％磷酸钠单水溶液，一水合物和0.001％泊洛沙姆188的溶液中配制在包含约1.05％氯化钠，约0.025％磷酸钠188的溶液中。约7.4。作为非限制性实例，该配方溶液中AAV颗粒的浓度可以为约0.001％。最终溶液中氯化钠的浓度可以是0.1-2.0％，但非限制性实施例为0.1％，0.25％，0.5％，0.75％，0.95％，0.96％，0.97％，0.98％，0.99％，1.00％，1.01％，1.02％，1.03％，1.04％，1.05％，1.06％，1.07％，1.08％，1.09％，1.10％，1.25％，1.5％，1.75％或2％。最终溶液中的磷酸钠浓度可以为0.100-0.300％，非限制性实施例包括0.100％，0.125％，0.150％，0.175％，0.200％，0.210％，0.211％，0.212％，0.213％，0.214％，0.215％，0.225％，0.250％，0.275％，0.300％。在最终溶液中磷酸钠单钾的浓度可以是0.010-0.050％，但非限制性实施例为0.010％，0.015％，0.020％，0.021％，0.022％，0.023％，0.024％，0.025％，0.026％，0.027％，0.028％，0.029％，0.030％，0.035％，0.040％，0.045％或0.050％。泊洛沙姆188的浓度(pluronic acid酸(F-68))可以是0.0001％-1％。作为非限制性实例，泊洛沙姆188的浓度(plowonat酸(F-68))可以为0.0001％，0.0005％，0.001％，0.005％，0.01％，0.05％，0.1％，0.5％或1％。最终溶液可具有6.8-7.7的pH。最终溶液的pH的非限制性实例包括pH为6.8,6.9,7.0,7.1,7.2,7.3,7.4,7.5,7.6或7.7。
赋形剂
本公开的制剂可包括一种或多种赋形剂，每种赋形剂，每种赋形剂，它们一起增加AAV颗粒的稳定性，增加了病毒颗粒的细胞转染或转导，增加了病毒颗粒编码蛋白的表达，和/或改变了病毒颗粒编码蛋白的表达，和/或改变AAV粒子编码蛋白的释放谱。在一些实施方案中，药学上可接受的赋形剂可以是至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％纯净。在一些实施方案中，赋予赋形剂被批准用于人类和兽医使用。在一些实施方案中，赋形剂可以通过美国食品和药物施用来批准。在一些实施方案中，赋形剂可以是药物级。在一些实施例中，赋形剂可以符合美国药典(USP)，欧洲药典(EP)，英国药典和/或国际药典的标准。
如本文所用，赋形剂包括但不限于任何和所有溶剂，分散介质，稀释剂或其他液体车辆，分散体或悬浮液，表面活性剂，等渗剂，增稠剂或乳化剂，防腐剂，等等，适合所需的特定剂型。用于制定药物组合物的各种赋形剂和制备组合物的技术是本领域已知的(见雷切顿：药房的科学和实践，21st版，Ar Gennaro，Lippincott，Williams&Wilkins，Baltimore，MD，MD，2006年的内容在此通过引用整体并入本文。在本公开的范围内可以考虑使用常规赋形剂培养基，除非任何常规的赋形剂介质可以与物质或其衍生物不相容，例如通过产生任何不希望的生物学效果或以其他方式以有害的方式互动与药物组合物的任何其他组分。
非活性组分
在一些实施方案中，AAV制剂可包含至少一种是无活性成分的赋形剂。如本文所用，术语“无活性成分”是指对制剂中包含的药物组合物的活性没有贡献的一种或多种试剂。在一些实施方案中，可以通过美国食品和药物施用(FDA)批准可用于本公开的制剂中的所有情况下，无活性成分。
本文公开的AAV颗粒的制剂可包括阳离子或阴离子。在一个实施方案中，制剂包括金属阳离子，例如但不限于Zn2+，Ca 2+，Cu 2+，Mg+或其组合。在一些实施方案中，制剂可包括与金属阳离子络合的聚合物或多核苷酸(参见，例如，美国专利No.4,522,517。No.6,265,389和6,555,525，其上的每种内容物通过引用整体并入本文。
V.使用和应用
本文的组合物可以施用于受试者或用于制备用于给予缺乏FXN的缺乏或患有FXN的受试者的受试者的受试者，或者具有与降低的FXN表达相关的疾病或病症。在一些实施方案中，该疾病是FA。在某些实施方案中，可以将包括FXN的AAV颗粒施用于治疗FA的受试者。在一些实施方案中，施用包含编码FXN的病毒基因组的AAV颗粒可以保护来自变性的中央途径。
在一些实施方案中，由AAV颗粒携带的有效载荷是编码具有至少90％序列同一性的FXN多肽的多核苷酸，所述SEQ ID NO：1725-1727的人FXN序列。在一些实施方案中，Frataxin多肽具有非人类的灵长类动物。在一些实施方案中，非人类灵长类动物的多肽是Cynomolgus猴麦克饼筋膜(CynofxN或CFXN)的FXN或恒河猴(Macaca Mulatta)。在一些实施方案中，非人灵长类动物的脱脂多肽至少部分是人源化。在一些实施方案中，由AAV颗粒承载的有效载荷是编码具有至少90％序列同一性的FXN多肽的多核苷酸与SEQ ID NO：1731-1733中任一项所述的序列具有至少90％的序列同一性。
在一些实施方案中，AAV颗粒的递送可以停止或缓慢F Friedreich的共济失调的进展，相对于比较组通过MFARS/SARA测量50％。在某些实施方案中，AAV颗粒的递送增加了功能性FXN的存在，改善和稳定的步态，改善过度的心脏病，降低了耗尽的感觉，并治疗糖尿病等代谢障碍。
在一些实施方案中，本公开包括与可以改善其生物利用度，减少和/或改变其新陈代谢的药物的药物，预防，诊断或成像组合物的递送，以及改变其在体内的分布。
在某些实施方案中，本文所述的药物组合物用作研究工具，特别是在体外研究中使用人体细胞系，例如HEK293T，在人类临床试验之前发生的非人的灵长类动物。
CNS疾病
本公开提供了一种治疗哺乳动物受试者中的疾病，病症和/或病症的方法，包括人类受试者，包括给予产生FXN的AAV，AAV颗粒或AAV基因组的受试者中的任何病毒颗粒在此(即病毒基因组或“Vg”)或向受试者施用包含所述AAV颗粒或AAV基因组的颗粒，或向受试者施用任何所描述的组合物，包括药物组合物。
在一些实施例中，本公开的AAV颗粒通过递送功能有效载荷，该功能有效载荷包括包含其FXN或其变体的治疗产品，其可以调节CNS中基因产物的基因产物的水平或功能。
功能有效载荷可以缓解或减少由有需要的受试者的基因产物(例如，蛋白质不存在或缺陷)的异常水平和/或函数产生的症状，或者以其他方式赋予CNS障碍的益处有需要的主题。
作为非限制性实例，由本公开的AAV颗粒递送的伴随或组合治疗产物可包括但不限于生长和营养因素，细胞因子，激素，神经递质，酶，抗凋亡因子，血管生成因子，FXN多肽和已知在病理疾病中突变的任何蛋白质(例如，脑特异性miR-128a，参见Adlakha andSaini,Molecular cancer,2014,13：33,通过引用整体并入本文)。
在一些实施方案中，神经退行性疾病是Frestreich的共济失调，这是由于在FXN基因中膨胀的肠道Gaa三联体重复而导致的，这减少了线粒体蛋白质脱脂蛋白的表达，这导致神经系统对神经系统的逐渐损害。
在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒可用于治疗与CNS的生长和发育的损伤相关的疾病，即神经发育障碍。在一些方面，这种神经发育障碍可能是由基因突变引起的。
在一些实施方案中，神经障碍可以是具有在CNS中具有神经源性的电动机和/或感觉症状的功能性神经障碍。作为非限制性实例，功能性神经障碍可能是慢性疼痛，癫痫发作，言语问题，非自愿运动或睡眠障碍。
在一些实施方案中，神经学或神经肌肉疾病，病症和/或条件是FriedreichAtaxia。在一些实施方案中，AAV颗粒的递送可能会停止或减缓F Friedreich Ataxia的疾病进展10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％或者使用已知的分析方法和比较器组以超过95％的Friedreich Ataxia。作为非限制性示例，AAV颗粒的递送可以停止或缓慢Friedreich Ataxia的进展，如mFARS/SARA相对于比较组测量50％。
在一些实施方案中，编码有效载荷的AAV粒子可以将组织中的FXN量增加1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，97％，99％，超过100％。在一些实施例中，编码有效载荷的AAV粒子可以增加组织中的FXN的量与健康受试者的相应组织中的FXN大致相同的量相当。在一些实施方案中，编码有效载荷的AAV粒子可以增加有效的组织中的FXN的量，以减少与FXN的数量和/或功能下降相关的疾病的一种或多种疾病的一种或多种症状，例如FA。
VI.给药和施用
施用
在一些方面，本公开内容提供了用于预防，治疗或改善CNS的疾病或疾病的疾病或其变异的载体和病毒颗粒的给药和/或递送方法。例如，施用编码FXN的AAV颗粒，其防止，治疗或改善FA。
本公开的AAV颗粒可以通过任何导致治疗有效结果的任何途径给药。这些包括但不限于肠内(进入肠道)，肠胃外，硬膜外(进入Dura物质)，口服(通过口腔)，透皮，羽流，脑内(进入大脑)，脑内(进入)脑室)，颅内(颅骨)，皮质(施用到皮肤上)，皮内，(进入皮肤本身)，皮下(皮肤下)，鼻腔给药(通过鼻子)，静脉内(进入静脉)，静脉注射推注，静脉内滴注，眼内(进入动脉)，肌肉内(肌肉)，心内(进入心脏)，骨内输注(进入骨髓)，鞘内(进入物质)，鞘内(进入脊柱)，腹膜内，(输注或注射到腹膜中)，膀胱内输注，玻璃体内，(通过眼睛)，内部注射(进入病理腔)内部(阴茎底部)，阴道内给药，宫内，颈静脉内一种Dministration，透皮(扩散通过完整的皮肤用于全身分布)，肿瘤(通过粘膜的扩散)，经阴道，灌注(怠速)，舌下，子叶，灌肠，眼滴(上膜上)，耳滴，耳滴(在耳朵或耳朵上)，颊(针对脸颊)，结膜，皮肤，牙齿(牙齿或牙齿)，电渗透，内泌染性，内骨，内切片，体外，血液透析，浸润，间质，内腹部，羊膜内，关节内，内部，Intrabronnial，脑室，肝内(软骨内)，脑内(Cisterna MagnaCerebellomedularis内，脑内)，牙科intoracoral，Intracoronary(在冠状动脉内)，Intrancorpororus脉络膜(阴茎Cavernosa的稀释空间内)，体内(椎间盘内)，内部内部(在GLA的管道内nd)，内部(Duodenum内)，内部(Dura内或Dura下)，脑内食管(对食管)，肠内食管(对食管)，胃内(胃内)，病情(内部在牙龈内)，Intaileral(内小肠的远端部分)，内部(内部或直接引入局部病变)，腔内(管腔内的腔内)，腹腔内(淋巴内)，intramency(在骨髓内)，intamenceal(在脑膜内)，眼内(眼内)，术中(卵巢内)，颅内(心包内)，腹膜内(在胸膜内)，脑内(在前列腺内)，血管内(肺部内或其支气管内))血管内(鼻腔或鼻内鼻窦)，脊柱脊柱内(在椎体内)，interAnovial(在关节滑膜内)，肠球(在肌腱内)，内部内(在睾丸内)，鞘内(机智)(机智Hin脑脊液在脑脊轴的任何水平上)，胸腔内(胸部内)，肠道管(在器官小管内)，肿瘤内(在肿瘤内)，尿道瘤(在Aurus媒体内)，血管内(在血管内或血管)，脑内(在心室内)，离子电渗疗法(通过电流的电流，其中可溶性盐的离子迁移到身体的组织中)，灌溉(沐浴或冲洗或冲洗开放的伤口或体腔)，喉部(直接在喉部)，鼻胃(通过鼻子进入胃)，闭塞敷料技术(局部途径给药，然后被遮挡该区域的敷料覆盖)，眼科(到外眼)，口咽(直接到嘴巴和咽部))，肠胃外，经皮，面膜，羽毛，危险，牙周，直肠，呼吸(通过吸入口服或鼻子内的呼吸道内，用于局部或全身效应)，Retrobulbar(在PON后面或后面他的眼球)，软组织，蛛网膜下腔，副疗效，粘膜，子页面，局部，移植(通过或穿过胎盘)，Transtracheal(穿过气管壁)，调节(穿过或通过鼓膜腔)，输尿管(到输尿管)，尿道(对尿道)，阴道，尾部块，诊断，神经梗阻，胆汁灌注，心脏灌注，光学灌注或脊柱。
在一些实施方案中，施用本公开的AAV颗粒以递送至靶细胞或组织。虽然不希望受理论束缚，但递送到目标小区导致FXN表达。靶细胞可以是其中认为期望增加FXN表达水平的任何细胞。靶细胞可以是CNS细胞。这种细胞和/或组织的非限制性实例包括背根神经节和背塔，癌症柱，涂丝粒子，克拉克柱，涂丝核，皮质脊髓和包含相同，β细胞和细胞的细胞心脏。
在一些实施方案中，组合物可以以允许它们穿过血脑屏障，血管屏障或其他上皮屏障的方式施用。
在一些实施方案中，通过腺相关病毒(AAV)颗粒向中枢神经系统(例如，薄壁组织)的细胞递送FXN，包括输注到脑脊液(CSF)中。CSF由专门的突突细胞产生，其包含位于脑的心室中的脉络膜丛。脑内产生的CSF然后循环并围绕包括脑和脊髓的中枢神经系统。CSF在中枢神经系统周围不断循环，包括脑和脊髓围绕脑和脊髓的脑和蛛网膜下腔空间的心室，同时保持生产和重吸收的稳态平衡到血管系统中。CSF的整个体积被每天大约替换为大约4次或每四个小时大约一次，尽管个人的值可能会有所不同。
在一些实施例中，AAV颗粒可以通过系统递送来递送。在一些实施方案中，全身递送可以是血管内给药。在一些实施方案中，全身递送可以是通过静脉内给药。
在一些实施方案中，AAV颗粒可以通过静脉内递送递送。
在一些实施方案中，AAV颗粒可以通过注射到CSF途径中来递送。向CSF途径的递送的非限制性实例包括鞘内和颅内腔内给药。
在一些实施方案中，AAV颗粒可以通过丘脑递送来递送。
在一些实施方案中，AAV颗粒可以通过脑递送来递送。
在一些实施方案中，AAV颗粒可以通过心内递送来递送。
在一些实施方案中，AAV颗粒可以通过颅内递送来递送。
在一些实施方案中，AAV颗粒可以通过直接(颅内细胞)注射到器官中(例如，CNS(脑或脊髓))递送。在一些实施方案中，颅内能递送可以是脑或CNS的任何区域，例如脑内。
在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒可以施用于脑的心室。
在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒可以通过脑室递送给予脑的心室。
在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒可以通过肌内递送给药。
在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒通过上述多于一种途径施用。作为非限制性实例，AAV颗粒可以通过静脉内递送和丘脑递送给药。
在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒通过上述多于一种途径施用。作为非限制性实例，AAV颗粒可以通过静脉内递送和脑内递送给药。
在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒通过上述多于一种途径施用。作为非限制性实例，AAV颗粒可以通过静脉内递送和颅内递送给药。
在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒通过上述多于一种途径施用。在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒可以通过鞘内和颅内腔内给药来递送。
在一些实施方案中，AAV颗粒可以递送至受试者以改善和/或矫正线粒体功能障碍。
在一些实施方案中，AAV颗粒可以递送至受试者以保护神经元。神经元可以是初级和/或次级感觉神经元。在一些实施方案中，将AAV颗粒递送至背根神经节和/或其神经元。
在一些实施方案中，AAV颗粒的给药可以在感觉途径中保持和/或校正功能。
在一些实施方案中，AAV颗粒可以通过静脉内(IV)，脑内腔内(ICV)，细胞内联和/或鞘内(IT)输注，并且治疗剂也可以通过肌肉内(IM)肢体输注递送至受试者为了将治疗剂递送至骨骼肌。通过血管内肢体输注编码至少一个FXN或其变体的AAV的递送是由Gruntmanand Flotte,Human Gene Therapy Clinical Development,2015,26(3),159-164所述，其内容通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，根据本公开内容的病毒载体药物组合物的递送到中枢神经系统(例如，实验)包含由Vg/小时＝ml/小时*Vg/ml限定的递送速率，其中Vg是病毒基因组，Vg/ml是组合物浓度，ML/小时是输注速率。
在一些实施方案中，根据本公开内容向中枢神经系统的细胞(例如，实体薄膜)递送AAV颗粒药物组合物，包括输注多达1mL。在一些实施方案中，根据本公开内容的病毒载体药物组合物的递送至中枢神下神经系统(例如，实质)的细胞可包含0.0001,0.0002,0.001,0.002,0.003,0.004,0.005,0.008,0.010,0.015,0.020,0.025,0.030,0.040,0.050,0.060,0.070,0.080,0.090,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8或0.9mL。
在一些实施方案中，根据本公开的AAV颗粒药物组合物递送至中枢神经系统的细胞(例如，实体薄膜)，包括输注约1ml至约120ml。在一些实施方案中，根据本公开的病毒载体药物组合物的递送至中枢神经系统(例如，实质)的细胞可包含0.1,1,1.1,1.2,1.3,1.4,1.5,1.6,1.7,1.8,1.9,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90,91,92,93,94,95,96,97,98,99,100,101,102,103,104,105,106,107,108,109,110,111,112,113,114,115,116,117,118,119或120mL的输注。在一些实施方案中，将AAV颗粒递送至中枢神经系统(例如，实质)的细胞，包括输注至少3mL。在一个实施方案中，将AAV颗粒递送至中枢神经系统(例如，实体薄膜)的细胞包括输注3mL。在一个实施方案中，将AAV颗粒递送至中枢神经系统(例如，实质)的细胞，包括输注至少10mL。在一些实施方案中，将AAV颗粒递送至中枢神经系统(例如，实体薄膜)的细胞包括输注10mL。
在一些实施方案中，将受试者的中枢神经系统(例如，薄壁症)的AAV颗粒药物组合物的体积为2μl,20μl,50μl,80μl,100μl,200μl,300μl,400μl,500μl,600μl,700μl,800μl,900μl,1000μl,1100μl,1200μl,1300μl,1400μl,1500μl,1600μl,1700μl,1800μl,1900μl,2000μl,或超过2000μl。
在一些实施方案中，将递送至受试者脑的两半的区域的AAV颗粒药物组合物的体积为2μl,20μl,50μl,80μl,100μl,200μl,300μl,400μl,500μl,600μl,700μl,800μl,900μl,1000μl,1100μl,1200μl,1300μl,1400μl,1500μl,1600μl,1700μl,1800μl,1900μl,2000μl或超过2000μl。在一些实施方案中，递送到两个半球中的区域的体积为200μL。作为另一个非限制性示例，递送到两个半球中的区域的体积为900μL。作为另一个非限制性示例，递送到两个半球中的区域的体积为1800μl。
在某些实施方案中，根据本发明的AAV颗粒或病毒载体药物组合物可以在约10至约600μl/位点，约50至约500μl/位点，约100至约400μl/位点施用约120约300μl/位点，约140至约200μl/位点，或约160μl/位点。
在一些实施方案中，递送给受试者的总体积可以在例如一个或多个给药位点之间分离，例如，1,2,3,4,5或超过5位点。在一些实施方案中，总体积在给药到左右半球之间分裂。
递送AAV颗粒
在一些实施方案中，可以使用用于治疗美国专利No.8,999,948或国际公开号WO2014178863的治疗疾病的方法给药或递送本公开的AAV颗粒或药物组合物，其内容通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，可以使用本公开的AAV颗粒或药物组合物使用如美国申请号20150126590中所述的阿尔茨海默病或其他神经变性条件，其内容通过他们整体参考。
在一些实施方案中，可以使用如美国专利号6,436,708和8,946,152,和国际公开号WO201516866中所述的使用方法给药或递送本公开的AAV颗粒或药物组合物用于递送CNS基因治疗，其中在此通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒可以使用用于递送欧洲专利申请No.EP1857552中描述的AAV病毒粒子的方法给药或递送，其内容通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，可以使用欧洲专利申请No.EP2678433中描述的AAV载体递送蛋白质的方法给药或递送本公开的AAV颗粒或药物组合物，其内容通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，编码FXN的病毒载体可以使用使用美国专利号US5858351中描述的AAV载体的方法施用或递送，其内容通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，可以使用将DNA递送到美国专利No.US 6,211,163中所述的血液中所述的方法给药或递送本公开的AAV颗粒或药物组合物，其内容通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，编码FXN的病毒载体可以使用用于递送美国专利No.US6325998中描述的AAV病毒群的方法给药或递送，其内容通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，可以使用将DNA递送到美国专利US 6335011中描述的肌肉细胞的方法给予或递送病毒载体或递送，其内容通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，可以使用用于将DNA递送至美国专利No.US 6610290中描述的肌细胞和组织的方法给药或递送病毒载体或递送，其内容通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，可以使用用于将DNA递送到美国专利No.US 7704492中描述的肌肉细胞的方法给药或递送病毒载体或递送，其内容通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，可以使用用于将有效载荷传递给美国专利No.US 7112321中描述的骨骼肌的方法来施用或递送病毒载体或递送，其内容通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，可以使用用于将有效载荷递送到美国专利No.US 7,588,757中描述的中枢神经系统的方法给药或递送本公开的AAV颗粒或药物组合物，其内容通过引用并入本文中他们整体。
在一些实施方案中，可以使用该方法给予或递送本公开的AAV颗粒或药物组合物，其使用用于在美国专利号US 8,283,151中描述的有效载荷，其内容通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，编码FXN的病毒载体可以使用用于递送有效载荷的方法给予或递送用于治疗美国专利号US 8318687中描述的阿尔茨海默病，其内容通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，可以使用用于在国际专利公开号.WO2012144446中描述的有效载荷的方法来施用或递送病毒载体或递送，其内容通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，可以使用在国际专利公开号WO2001089583中描述的谷氨酸脱羧酶(GAD)递送载体来施用或递送本公开的AAV颗粒或药物组合物，其内容这里通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，可以使用用于将有效载荷递送到国际专利公开NoWO2012057363中描述的神经细胞的方法给药或递送本公开的AAV颗粒或药物组合物，其内容通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，可以使用用于在国际专利公开号WO2001096587中描述的有效载荷的方法来施用或递送病毒载体编码或递送，其内容通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，编码FXN的病毒载体可以使用用于将有效载荷输送到国际专利公开号WO2002014487中描述的肌肉组织的方法给药或递送，其内容通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，导管可用于施用AAV颗粒。在某些实施方案中，导管或套管可以位于脊柱的多于一个位点以进行多场递送。编码FXN的病毒颗粒可以在连续和/或推注输注中递送。每个递送部位可以是不同的给药方案，或者可以用于每个递送部位的同一剂量方案。在一些实施方案中，递送部位可以是宫颈和腰部区域。在一些实施方案中，递送位点可以在宫颈区域中。在一些实施方案中，递送部位可以在腰部区域中。
在一些实施方案中，可以在递送编码本文所述的AAV颗粒之前分析对受试者进行脊柱解剖学和病理学。作为非限制性实例，与没有脊柱侧凸的受试者相比，具有脊柱侧凸的受试者可以具有不同的剂量方案和/或导管位置。
在一些实施方案中，选择递送方法和持续时间以在脊髓中提供宽的转导。在一些实施方案中，鞘内递送用于沿着脊髓的脊髓柱尾部提供宽泛的转导。在一些实施方案中，多部位输注沿着脊髓的脊髓柱尾部的柱状长度提供更均匀的转导。
递送至细胞
在一些方面，本公开提供了一种方法，其递送到细胞或组织中任何上述AAV颗粒，包括使细胞或组织与所述AAV颗粒接触或使细胞或组织与包含所述AAV颗粒的制剂接触，或与包含药物组合物中的任何所述组合物接触细胞或组织。可以在体外，离体或体内递送到细胞或组织中的AAV颗粒的方法。
递送至受试者
在一些方面，本发明还提供了递送到包括哺乳动物受试者的受试者的方法，其中任何上述AAV颗粒包括向受试者所述AAV颗粒施用，或给予受试者包含所述AAV颗粒的制剂，或向受试者施用任何所述组合物，包括药物组合物。
在一些实施方案中，可以递送AAV颗粒以绕过解剖堵塞，例如但不限于血脑屏障。
在一些实施方案中，可以通过途径将AAV颗粒配制并通过增加药物效果速度的途径将其递送至受试者。
在一些实施方案中，AAV颗粒可以通过方法递送，以提供脊髓和背根神经节(DRG)的均匀转导。在一些实施方案中，可以使用鞘内输注来递送AAV颗粒。
在一些实施方案中，可以使用推注输注施用本文所述的AAV颗粒的受试者。如本文所用，“推注输注”是指物质或组合物的单一且快速输注。
在一些实施方案中，编码FXN的AAV颗粒可以以连续和/或推注输注递送。每个递送部位可以是不同的给药方案，或者可以用于每个递送部位的同一剂量方案。作为非限制性示例，递送部位可以在宫颈和腰部区域中。作为另一个非限制性示例，递送部位可以在宫颈区域中。作为另一个非限制性示例，递送部位可以在腰部区域中。
在一些实施方案中，AAV颗粒可以通过单一途径给药递送至受试者。
在一些实施方案中，AAV颗粒可以通过多现场给药途径递送给受试者。例如，受试者可以在2,3,4,5或超过5位点施用AAV颗粒。
在一些实施方案中，可以使用在分钟，小时或天的时间内使用持续递送给予对象的AAV颗粒。可以根据本领域中已知的受试者，分布，配方或其他递送参数来改变输液速率。
在一些实施方案中，如果使用AAV颗粒的连续递送(连续输注)，则连续输注可以是1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时或超过24小时。
在一些实施方案中，可以在给药之前进行颅内压。可以基于受试者的颅骨压力来优化途径，体积，AAV颗粒浓度，输注持续时间和/或载体滴度。
在一些实施例中，AAV颗粒可以通过系统递送来递送。在一些实施方案中，全身递送可以是血管内给药。
在一些实施方案中，AAV颗粒可以通过注射到CSF途径中来递送。向CSF途径的递送的非限制性实例包括鞘内和颅内腔内给药。
在一些实施方案中，AAV颗粒可以通过直接(intraparenchymal)注射到器官的物质中递送，例如脑的一个或多个区域。
在一些实施方案中，AAV颗粒可以通过子页面注入脊髓来递送。例如，可以将受试者置于脊柱固定装置中。可以进行背部层压切除术以暴露脊髓。引导管和XYZ操纵器可用于辅助导管放置。通过从引导管前进导管，可以通过导管(Miyanohara et al.,Mol TherMethods Clin Dev.2016；3:16046)注入子管。在一些情况下，可以将AAV颗粒注入宫颈缺点。在一些情况下，可以将AAV颗粒注入胸腔子空间。
在一些实施方案中，与内源水平相比，AAV颗粒可以递送至受试者以增加背根神经节(DRG)中的FXN蛋白水平。与内源水平相比，增加可以是0.1倍(x)至5x,0.5x至5x,1x至5x,2x至5x,3x至5x,4x至5x,0.1x至4x,0.5x至4x,1x至4x,2x至4x,3x至4x,0.1x至3x,0.5x至3x,1x至3x,2x至3x,0.1x至2x,0.5x至2x,0.1x至1x,0.5x至1x,0.1x至0.5x,1x至2x,0.1x,0.2x,0.3x,0.4x,0.5x,0.6x,0.7x,0.8x,0.9x,1.0x,1.1x,1.2x,1.3x,1.4x,1.5x,1.6x,1.7x,1.8x,1.9x,2.0x,2.1x,2.2x,2.3x,2.4x,2.5x,2.6x,2.7x,2.8x,2.9x,3.0x,3.1x,3.2x,3.3x,3.4x,3.5x,3.6x,3.7x,3.8x,3.9x,4.0x,4.1x,4.2x,4.3x,4.4x,4.5x,4.6x,4.7x,4.8x,4.9x或超过5倍。在脊柱的宫颈，胸腔和/或腰部区域中可以看到增加。作为非限制性示例，DRG中FXN的增加可以大于0.5倍的内源水平。作为非限制性示例，与内源水平相比，DRG中的FXN的增加可以在0.5x-3x之间。
在一些实施方案中，可以通过在宫颈，胸腔和/或腰椎区域中转换大DRG神经元来将AAV颗粒递送至受试者以增加背根神经节(DRG)中的FXN蛋白水平。转导也可以称为阳性的DRG的量。转导可能大于或等于1％,5％,10％,15％,20％,25％,30％,35％,40％,45％,50％,55％,60％,65％,70％,75％,80％,85％,90％,95％或99％。作为非限制性示例，宫颈，胸腔和/或腰部区域中的大DRG神经元的转导可以大于或等于15％。作为非限制性实例，宫颈，胸腔和/或腰部区域中的大DRG神经元的转导可以大于或等于20％。作为非限制性示例，宫颈，胸腔和/或腰部区域中的大DRG神经元的转导可以大于或等于25％。作为非限制性示例，宫颈，胸腔和/或腰部区域中的大DRG神经元的转导可以大于或等于30％。作为非限制性示例，宫颈，胸腔和/或腰部区域中的大DRG神经元的转导可以大于或等于35％。作为非限制性示例，在宫颈，胸腔和/或腰部区域中的大DRG神经元的转导可以大于或等于40％。作为非限制性示例，宫颈，胸腔和/或腰部区域中的大DRG神经元的转导可以大于或等于45％。作为非限制性示例，宫颈，胸腔和/或腰部区域中的大DRG神经元的转导可以大于或等于50％。作为非限制性示例，宫颈，胸腔和/或腰部区域中的大DRG神经元的转导可以大于或等于55％。作为非限制性示例，宫颈，胸腔和/或腰部区域中的大DRG神经元的转导可以大于或等于60％。作为非限制性示例，宫颈，胸腔和/或腰部区域中的大DRG神经元的转导可以大于或等于65％。作为非限制性示例，宫颈，胸腔和/或腰部区域中的大DRG神经元的转导可以大于或等于70％。
在一些实施方案中，与内源水平相比，AAV颗粒可以递送至受试者以增加背根神经节(DRG)中的FXN蛋白水平并将大DRG神经元转换在颈椎，胸腔和/或腰椎中的大DRG神经元地区。与宫颈，胸腔和/或腰椎区域中的内源水平相比，DRG中的FXN蛋白水平可以增加0.5倍至3x，并且可以转导宫颈，胸腔和/或腰椎区域中的大DRG神经元至少20％。
在一些实施方案中，AAV颗粒可以递送至受试者，以便缩短小脑牙齿核的大神经元。转导也可以被称为阳性的大神经元的数量。转导可能大于或等于1％,5％,10％,15％,20％,25％,30％,35％,40％,45％,50％,55％,60％,65％,70％,75％,80％,85％,90％,95％或99％。作为非限制性举例，大脑牙齿核的大神经元的转导可以大于或等于15％。作为非限制性实例，小脑齿状核的大神经元的转导可以大于或等于20％。作为非限制性实例，小脑齿状核的大神经元的转导可以大于或等于25％。作为非限制性实例，小脑齿状核的大神经元的转导可以大于或等于30％。作为非限制性实例，小脑齿状核的大神经元的转导可以大于或等于35％。作为非限制性实例，小脑齿状核的大神经元的转导可以大于或等于40％。作为非限制性实例，小脑齿状核的大神经元的转导可以大于或等于45％。作为非限制性实例，小脑齿状核的大神经元的转导可以大于或等于50％。作为非限制性示例，小脑齿状核的大神经元的转导可以大于或等于55％。作为非限制性示例，小脑牙齿核的大神经元的转导可以大于或等于60％。作为非限制性示例，小脑齿状核的大神经元的转导可以大于或等于65％。作为非限制性实例，小脑齿状核的大神经元的转导可以大于或等于70％。
在一些实施方案中，可以将AAV颗粒递送至受试者，以便将克拉克柱的神经元转导。转导也可以称为正的神经元数。转导可能大于或等于1％,5％,10％,15％,20％,25％,30％,35％,40％,45％,50％,55％,60％,65％,70％,75％,80％,85％,90％,95％或99％。作为非限制性示例，克拉克柱的神经元的转导可以大于或等于15％。作为非限制性实例，Clarke柱的神经元的转导可以大于或等于20％。作为非限制性示例，Clarke柱的神经元的转导可以大于或等于25％。作为非限制性举例，Clarke柱的神经元的转导可以大于或等于30％。作为非限制性举例，Clarke柱的神经元的转导可以大于或等于35％。作为非限制性示例，Clarke柱的神经元的转导可以大于或等于40％。作为非限制性实例，Clarke柱神经元的转导可以大于或等于45％。作为非限制性示例，Clarke柱的神经元的转导可以大于或等于50％。作为非限制性举例，Clarke柱的神经元的转导可以大于或等于55％。作为非限制性实例，Clarke柱的神经元的转导可以大于或等于60％。作为非限制性举例，Clarke柱的神经元的转导可以大于或等于65％。作为非限制性示例，Clarke柱的神经元的转导可以大于或等于70％。
在一些实施方案中，可以将AAV颗粒递送至受试者，以便将综合核细胞核的神经元转导。转导也可以称为正的神经元数。转导可能大于或等于1％,5％,10％,15％,20％,25％,30％,35％,40％,45％,50％,55％,60％,65％,70％,75％,80％,85％,90％,95％或99％。作为非限制性实例，涂液核的神经元的转导可以大于或等于15％。作为非限制性实例，涂液核的神经元的转导可以大于或等于20％。作为非限制性实例，涂液核的神经元的转导可以大于或等于25％。作为非限制性实例，涂液核的神经元的转导可以大于或等于30％。作为非限制性实例，涂液核的神经元的转导可以大于或等于35％。作为非限制性实例，涂液核的神经元的转导可以大于或等于40％。作为非限制性实例，涂液核的神经元的转导可以大于或等于45％。作为非限制性实例，涂液核的神经元的转导可以大于或等于50％。作为非限制性实例，涂液核的神经元的转导可以大于或等于55％。作为非限制性实例，涂液核的神经元的转导可以大于或等于60％。作为非限制性实例，涂液核的神经元的转导可以大于或等于65％。作为非限制性实例，涂液核的神经元的转导可以大于或等于70％。
在一些实施方案中，AAV颗粒可以递送至受试者，以便将楔形核的神经元转染。转导也可以称为正的神经元数。转导可能大于或等于1％，5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或99％。作为非限制性实例，楔形核的神经元的转导可以大于或等于15％。作为非限制性实例，楔形核的神经元的转导可以大于或等于20％。作为非限制性实例，楔形核的神经元的转导可以大于或等于25％。作为非限制性实例，楔形核的神经元的转导可以大于或等于30％。作为非限制性实例，楔形核的神经元的转导可以大于或等于35％。作为非限制性实例，楔形核的神经元的转导可以大于或等于40％。作为非限制性实例，楔形核的神经元的转导可以大于或等于45％。作为非限制性实例，楔形核的神经元的转导可以大于或等于50％。作为非限制性实例，楔形核的神经元的转导可以大于或等于55％。作为非限制性实例，楔形核的神经元的转导可以大于或等于60％。作为非限制性实例，楔形核的神经元的转导可以大于或等于65％。作为非限制性实例，楔形核的神经元的转导可以大于或等于70％。
在一些实施方案中，可以将AAV颗粒递送至受试者，以便与内源水平相比，以增加心脏中的FXN蛋白水平。增加可以是0.1x至5x,0.5x至5x,1x至5x,2x至5x,3x至5x,4x至5x,0.1x至4x,0.5x至4x,1x至4x,2x至4x,3x至4x,0.1x至3x,0.5x至3x,1x至3x,2x至3x,0.1x至2x,0.5x至2x,0.1x至1x,0.5x至1x,0.1x至0.5x,1x至2x,0.1x,0.2x,0.3x,0.4x,0.5x,0.6x,0.7x,0.8x,0.9x,1.0x,1.1x,1.2x,1.3x,1.4x,1.5x,1.6x,1.7x,1.8x,1.9x,2.0x,2.1x,2.2x,2.3x,2.4x,2.5x,2.6x,2.7x,2.8x,2.9x,3.0x,3.1x,3.2x,3.3x,3.4x,3.5x,3.6x,3.7x,3.8x,3.9x,4.0x,4.1x,4.2x,4.3x,4.4x,4.5x,4.6x,4.7x,4.8x,4.9x或更多5倍与内源水平相比。作为非限制性示例，心脏中FXN的增加可能大于0.5倍的内源水平。作为非限制性示例，与内源水平相比，心脏中FXN的增加可以在0.5x-3x之间。
在一些实施方案中，AAV颗粒可以将其递送至受试者，以便通过转换心肌细胞来增加FXN蛋白水平。转导也可以称为阳性的心肌细胞的数量。转导可能大于或等于1％，5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或99％。作为非限制性实例，心肌细胞的转导可以大于或等于15％。作为非限制性实例，心肌细胞的转导可以大于或等于20％。作为非限制性实例，心肌细胞的转导可以大于或等于25％。作为非限制性实例，心肌细胞的转导可以大于或等于30％。作为非限制性实例，心肌细胞的转导可以大于或等于35％。作为非限制性的例子，心肌细胞的转导可以大于或等于40％。作为非限制性实例，心肌细胞的转导可以大于或等于45％。作为非限制性实例，心肌细胞的转导可以大于或等于50％。作为非限制性实例，心肌细胞的转导可以大于或等于55％。作为非限制性实例，心肌细胞的转导可以大于或等于60％。作为非限制性实例，心肌细胞的转导可以大于或等于65％。作为非限制性实例，心肌细胞的转导可以大于或等于70％。
在一些实施方案中，可以将AAV颗粒递送至受试者，以便与内源水平相比，在心脏中增加FXN蛋白水平并转移心肌细胞。与内源水平相比，心脏的FXN蛋白水平可以增加0.5倍至3倍，并且/或心肌细胞可以转导至少30％。
在一些实施方案中，将包含本文所述的病毒基因组的AAV颗粒递送到背根神经节(DRG)中的感觉神经元，升高脊髓感觉束和小脑中将导致FXN的表达增加。增加的表达可能导致改善各种细胞类型的存活率和功能。
具体地，在一些实施方案中，呋妥的表达增加可能导致增强的共济失调(平衡)和步态，感官能力，运动和强度的协调，功能容量和/或生命质量。
给药
在一些方面，本公开内容提供了根据本公开对有此需要的受试者施用病毒载体及其有效载荷的方法。病毒载体药物，成像，诊断或预防性组合物可以使用任何量和任何给药途径给予受试者，该途径有效地用于预防，治疗，诊断或成像疾病，病症和/或病症(例如，a疾病，疾病和/或病症与FXN表达减少或FXN的数量和/或功能的缺乏相关。在一些实施方案中，疾病，病症和/或病症是FA。所需的确切金额因受试者的受试者而异，取决于物种，年龄和一般情况，疾病的严重程度，特定组合物，其给药方式，其活性模式等。根据本公开的组合物通常以单位剂型配制，以便于给药和均匀性的剂量。然而，将理解，本公开的组合物的每日总用途可以由主治医生决定在声音医学判断的范围内。任何特定患者的特异性治疗有效，预防性有效或适当的成像剂量水平将取决于各种因素，包括治疗的病症和病症的严重程度；所用特定化合物的活性；所用的具体组合物；年龄，体重，一般健康，性别和饮食；管理时间，行政管理途径以及所雇用的具体FXN的排泄速度；治疗的持续时间；用雇用的特定化合物组合使用或巧合的药物；和医疗艺术中众所周知的因素。
在某些实施方案中，根据本发明的AAV颗粒药物组合物可以以足以将FXN递送至约约0.0001mg/kg至约100mg/kg,从约0.001mg/kg至约0.05mg/kg,从约0.005mg/kg至约0.05mg/kg,从约0.001mg/kg至约0.005mg/kg,从约0.05mg/kg至约0.5mg/kg,从约0.01mg/kg至约50mg/kg,从约0.1mg/kg至约40mg/kg,从约0.5mg/kg至约30mg/kg,从约0.01mg/kg至约10mg/kg,从约0.1mg/kg至约10mg/kg,or从约1mg/kg至约25mg/kg,的剂量水平给药。，每天受试者体重，每天一次或多次，得到所需的治疗，诊断，预防或成像效果。应当理解，上述计量浓度可以转化为每kg的Vg或病毒基因组或通过本领域技术人员施用的总病毒基因组。
在某些实施方案中，可以使用多个施用(例如，二，三，四，五，六个，七，八个，九，十，十一，十二，十三，十四或更多主管部)递送所需的剂量。当使用多个主管部门时，可以使用诸如本文所述的分裂剂量方案。如本文所用，“分裂剂量”是单个单位剂量或总日剂量分为两种或多种剂量，例如单个单位剂量的两种或更多种。如本文所用，“单个单位剂量”是一种剂量的任何治疗组合物，一次/单一的途径/单途径/单点接触点，即单个给药事件。在一些实施方案中，单个单位剂量被提供为离散剂型(例如，片剂，胶囊，贴剂，装载注射器，小瓶等)。如本文所用，“总日剂量”是在24小时内给出或处方的量。它可以作为单个单位剂量施用。病毒颗粒可以仅在缓冲液中或在本文所述的制剂中配制。
本文所述的药物组合物可以配制成本文所述的剂型，例如局部，鼻内，肺癌，肿瘤内或可注射的(例如，静脉内，眼内，玻璃体内，肌肉内，心内，腹膜内，腹膜内和/或皮下)。
在一些实施方案中，本文所述的AAV颗粒的递送导致由于AAV颗粒的输送而导致最小的严重不良事件(SAES)。
在一些实施方案中，根据本公开的AAV颗粒药物组合物的递送至中枢神经系统(例如，实质)的细胞可包含约1×106Vg/ml和约1×1016Vg/ml的总浓度。在一些实施方案中，递送可包含约1x106,2x106,3x106,4x106,5x106,6x106,7x106,8x106,9x106,1x107,2x107,3x107,4x107,5x107,6x107,7x107,8x107,9x107,1x108,2x108,3x108,4x108,5x108,6x108,7x108,8x108,9x108,1x109,2x109,3x109,4x109,5x109,6x109,7x109,8x109,9x109,1x1010,2x1010,3x1010,4x1010,5x1010,6x1010,7x1010,8x1010,9x1010,1x1011,1.6x1011,1.8x1011,2x1011,3x1011,4x1011,5x1011,5.5x1011,6x1011,7x1011,8x1011,9x1011,0.8x1012,0.83x1012,1x1012,1.1x1012,1.2x1012,1.3x1012,1.4x1012,1.5x1012,1.6x1012,1.7x1012,1.8x1012,1.9x1012,2x1012,2.1x1012,2.2x1012,2.3x1012,2.4x1012,2.5x1012,2.6x1012,2.7x1012,2.8x1012,2.9x1012,3x1012,3.1x1012,3.2x1012,3.3x1012,3.4x1012,3.5x1012,3.6x1012,3.7x1012,3.8x1012,3.9x1012,4x1012,4.1x1012,4.2x1012,4.3x1012,4.4x1012,4.5x1012,4.6x1012,4.7x1012,4.8x1012,4.9x1012,5x1012,6x1012,7x1012,8x1012,9x1012,1x1013,2x1013,2.3x1013,3x1013,4x1013,5x1013,6x1013,7x1013,8x1013,9x1013,1x1014,1.9x1014,2x1014,3x1014,4x1014,5x1014,6x1014,7x1014,8x1014,9x1014,1x1015,2x1015,3x1015,4x1015,5x1015,6x1015,7x1015,8x1015,9x1015,或1x1016Vg/ml。在一些实施方案中，组合物中病毒载体的浓度为1×1013Vg/mL。在一些实施方案中，组合物中病毒载体的浓度为1.1×1012Vg/mL。在一些实施方案中，组合物中病毒载体的浓度为3.7×1012Vg/ml。在一些实施方案中，组合物中病毒载体的浓度为8×1011Vg/mL。在一些实施方案中，组合物中病毒载体的浓度为2.6×1012Vg/ml。在一些实施方案中，组合物中病毒载体的浓度为4.9x1012Vg/ml。在一些实施方案中，组合物中病毒载体的浓度为0.8×1012Vg/mL。在一些实施方案中，组合物中病毒载体的浓度为0.83×1012Vg/mL。在一个实施方案中，组合物中病毒载体的浓度是可以含有在小瓶中的最大终剂量。在一些实施方案中，组合物中病毒载体的浓度为1.6×1011Vg/mL。在一些实施方案中，组合物中病毒载体的浓度为5×1011Vg/mL。在一些实施方案中，组合物中病毒载体的浓度为2.3×1013Vg/mL。在一些实施方案中，组合物中病毒载体的浓度为1.9×1014Vg/mL。
在一些实施方案中，根据本公开的AAV颗粒药物组合物的递送至中枢神经系统(例如，薄壁症)的细胞可包含每对受试者的总浓度为约1×106Vg和约1×1016Vg。在一些实施方案中，递送可包含约1x106,2x106,3x106,4x106,5x106,6x106,7x106,8x106,9x106,1x107,2x107,3x107,4x107,5x107,6x107,7x107,8x107,9x107,1x108,2x108,3x108,4x108,5x108,6x108,7x108,8x108,9x108,1x109,2x109,3x109,4x109,5x109,6x109,7x109,8x109,9x109,1x1010,2x1010,3x1010,4x1010,5x1010,6x1010,7x1010,8x1010,9x1010,1x1011,1.6x1011,2x1011,2.1x1011,2.2x1011,2.3x1011,2.4x1011,2.5x1011,2.6x1011,2.7x1011,2.8x1011,2.9x1011,3x1011,4x1011,4.6x1011,5x1011,6x1011,7x1011,7.1x1011,7.2x1011,7.3x1011,7.4x1011,7.5x1011,7.6x1011,7.7x1011,7.8x1011,7.9x1011,8x1011,9x1011,1x1012,1.1x1012,1.2x1012,1.3x1012,1.4x1012,1.5x1012,1.6x1012,1.7x1012,1.8x1012,1.9x1012,2x1012,2.3x1012,3x1012,4x1012,4.1x1012,4.2x1012,4.3x1012,4.4x1012,4.5x1012,4.6x1012,4.7x1012,4.8x1012,4.9x1012,5x1012,6x1012,7x1012,8x1012,8.1x1012,8.2x1012,8.3x1012,8.4x1012,8.5x1012,8.6x1012,8.7x1012,8.8x1012,8.9x1012,9x1012,1x1013,2x1013,3x1013,4x1013,5x1013,6x1013,7x1013,8x1013,9x1013,1x1014,2x1014,3x1014,4x1014,5x1014,6x1014,7x1014,8x1014,9x1014,1x1015,2x1015,3x1015,4x1015,5x1015,6x1015,7x1015,8x1015,9x1015,或1x1016Vg/受试者。在一些实施方案中，组合物中病毒载体的浓度为2.3×1011Vg/受试者。在一些实施方案中，组合物中病毒载体的浓度为7.2×1011Vg/受试者。在一些实施方案中，组合物中病毒载体的浓度为7.5×1011Vg/受试者。在一些实施方案中，组合物中病毒载体的浓度为1.4×1012Vg/受试者。在一些实施方案中，组合物中病毒载体的浓度为4.8×1012Vg/受试者。在一些实施方案中，组合物中病毒载体的浓度为8.8×1012Vg/受试者。在一些实施方案中，组合物中病毒载体的浓度为2.3×1012Vg/受试者。在一些实施方案中，组合物中病毒载体的浓度为2×1010Vg/受试者。在一些实施方案中，组合物中病毒载体的浓度为1.6×1011Vg/受试者。在一些实施方案中，组合物中病毒载体的浓度为4.6×1011Vg/受试者。
在一些实施方案中，将AAV颗粒递送至中枢神经系统(例如，实质)的细胞可包含约1×106Vg和约1×1016Vg的总剂量。在一些实施方案中，递送可包含约1×106,2×106,3×106,4×106,5×106,6×106,7×106,8×106,9×106,1×107,2×107,3×107,4×107,5×107,6×107,7×107,8×107,9×107,1×108,2×108,3×108,4×108,5×108,6×108,7×108,8×108,9×108,1×109,2×109,3×109,4×109,5×109,6×109,7×109,8×109,9×109,1×1010,1.9×1010,2×1010,3×1010,3.73×1010,4×1010,5×1010,6×1010,7×1010,8×1010,9×1010,1×1011,2×1011,2.5×1011,3×1011,4×1011,5×1011,6×1011,7×1011,8×1011,9×1011,1×1012,2×1012,3×1012,4×1012,5×1012,6×1012,7×1012,8×1012,9×1012,1×1013,2×1013,3×1013,4×1013,5×1013,6×1013,7×1013,8×1013,9×1013,1×1014,2×1014,3×1014,4×1014,5×1014,6×1014,7×1014,8×1014,9×1014,1×1015,2×1015,3×1015,4×1015,5×1015,6×1015,7×1015,8×1015,9×1015,或1×1016VG。在一些实施方案中，总剂量为1×1013Vg。在一些实施方案中，总剂量为3×1013Vg。在一些实施方案中，总剂量为3.73×1010Vg。在一些实施方案中，总剂量为1.9×1010Vg。在一些实施方案中，总剂量为2.5×1011Vg。在一些实施方案中，总剂量为5×1011Vg。在一些实施方案中，总剂量为1×1012Vg。在一些实施方案中，总剂量为5×1012Vg。
组合物
AAV颗粒可以与一种或多种其他治疗，预防，诊断或成像剂组合使用。短语“与”结合“并不意图要求该试剂必须同时施用和/或配方一起递送，尽管这些递送方法在本公开的范围内。组合物可以在其上或之后或之后同时给药，或之后的一种或多种其他所需的治疗剂或医疗程序。通常，每种试剂将以剂量和/或根据该试剂确定的时间调度给药。在一些实施方案中，本公开包括与可以改善其生物利用度，减少和/或改变其新陈代谢的药物，预防，诊断或成像组合物的递送，以及改变其在体内的分布。
表达的测量
来自病毒基因组的FXN的表达可以使用本领域已知的各种方法确定，例如但不限于免疫化学(例如，IHC)，酶联免疫吸附试验(ELISA)，亲和力ELISA，ELISPOT，流式细胞术，免疫细胞学，表面等离子体共振分析，动力排阻测定，液相色谱-质谱(LCMS)，高性能液相色谱(HPLC)，BCA测定，免疫电流，Western印迹，SDS-PAGE，蛋白质免疫沉淀，PCR和/或原位杂交(ISH)。在一些实施方案中，编码在不同AAV衣壳中递送的FXN的转基因可以在背根神经节(DRG)中具有不同的表达水平。
在某些实施方案中，FXN多肽通过蛋白质印迹可检测。
VII.试剂盒和设备
试剂盒
在一些方面，本公开提供了各种试剂盒，用于方便地和/或有效地实施本公开的方法。通常，套件将包括足够的量和/或数量的组件，以允许用户执行对象和/或执行多个实验的多种处理。
本公开的任何载体，构建体或FXN可以包括在试剂盒中。在一些实施方案中，试剂盒还可包括试剂和/或用于产生和/或合成本公开的化合物和/或组合物的指令。在一些实施例中，套件还可以包括一个或多个缓冲器。在一些实施方案中，本公开的试剂盒可包括制备蛋白质或核酸阵列或文库的组分，因此可以包括例如固体载体。
在一些实施方案中，试剂盒组分可以在含水介质中或冻干形式包装。套件的容器装置通常包括至少一个小瓶，试管，瓶，瓶子，注射器或其他容器装置，该组分可以放置，并且适当地等分。在存在多个套件组分的情况下，(标记试剂和标签可以包装在一起)，套件通常也可以包含第二，第三或其他附加容器，其可以单独放置附加组件。在一些实施方案中，试剂盒还可包括用于含有无菌的药学上可接受的缓冲液和/或其他稀释剂的第二容器装置。在一些实施方案中，组分的各种组合可以包含在一个或多个小瓶中。本公开的试剂盒通常还可包括用于含有本公开的化合物和/或组合物的装置，例如蛋白质，核酸和任何其他试剂容器，密切禁止商业销售。这种容器可以包括注射或吹塑塑料容器，所需的小瓶被保留在该塑料容器中。
在一些实施方案中，试剂盒组分以一个和/或多种液体溶液提供。在一些实施方案中，液体溶液是水溶液，特别使用无菌水溶液。在一些实施方案中，套件组分可以作为干粉提供。当试剂和/或组分作为干粉提供时，可以通过加入合适的溶剂来重构这种粉末。在一些实施方案中，设想溶剂也可以在另一个容器装置中提供。在一些实施方案中，将标记染料作为干粉提供。在一些实施例中，在本公开的试剂盒中提供可以考虑10,20,30,40,50,60,70,80,90,100,120,120,130,140,150,160,170,180,190,200,300,400,500,600,700,800,900,1000，400,500,600,700,800,900,700,800,900,000,800,800,900,100,00微克或至少或最多的干染料。在这样的实施方案中，然后可以将染料重悬于任何合适的溶剂(例如DMSO)中。
在一些实施方案中，试剂盒可以包括用于使用试剂盒组分的指令，以及使用不包括在试剂盒中的任何其他试剂的使用。指令可以包括可以实现的变型。
设备
在一些实施方案中，本公开的化合物和/或组合物可以与涂覆或嵌入装置上。装置可包括但不限于牙科植入物，支架，骨更换，人造接头，阀门，起搏器和/或其他可植入治疗装置。
本公开提供了可以包含编码一种或多种FXN分子的病毒载体的装置。这些装置含有稳定的制剂，该病毒载体可以立即递送至有此需要的受试者，例如人类患者。
可以使用用于给药的装置根据本文教导的单个，多或分裂剂量的调节剂递送编码本公开的FXN的病毒载体。
本领域已知的用于多次施用细胞，器官和组织的方法和装置，用于结合本文公开的方法和组合物作为本公开的实施方案。
VIII.定义
在本说明书中的各个地方，本公开化合物的取代基以基团或范围公开。具体旨在本公开包括这些组和范围的每个组件的每个和每个单独的子组合。以下是术语定义的非限制性列表。
腺相关病毒：本文所用的术语“腺相关病毒”或“AAV”是指包含任何颗粒，序列，基因，蛋白质或其组分的依赖性属性的成员。本文所用的术语“AAV颗粒”包含衣壳和称为AAV基因组或病毒(或载体)基因组(Vg)的多核苷酸。AAV颗粒可以来自本文所述的任何血清型或本领域已知的，包括血清型(即“假型”AAV)或来自各种基因组的组合(例如，单链或自互补)。另外，AAV粒子可以是复制缺陷和/或靶向的。
活性成分：如本文所用，术语“活性成分”是指在其生物学活性和负责产生生物效应的分子或其复合物的分子或复合物。药物组合物中的活性成分可以称为活性药物成分。出于本公开的目的，短语“活性成分”通常是指承载有效载荷或由如本文所述的病毒颗粒递送的有效载荷(或其基因产物)的病毒颗粒。相反，“无活性成分”是指在生物学上惰性的物质。赋形剂是无活性成分的实例。
活性：如本文所用，术语“活动”是指事物正在发生或正在进行的条件。本公开的组合物可以具有活性，并且该活性可能涉及一种或多种生物事件。
组合施用：如本文所用，术语“组合施用”或“组合”或“组合给药”的术语是指在同一时间或在间隔内施用的两种或更多种药剂(例如，AAV)的暴露受试者处于暴露于两个药剂的某个时间点和/或使得每种试剂对患者的影响重叠。在一些实施方案中，至少一种剂量的一种或多种试剂在约24小时，12小时，6小时，3小时，1小时，30分钟，15分钟，10分钟，5分钟或1分钟内施用一剂一剂一个或多种其他药剂。在一些实施方案中，施用发生在重叠的剂量方案中。如本文所用，术语“剂量方案”是指在时间间隔开的多个剂量。这些剂量可以定期发生，或者可以包括给药中的一种或多种异位。在一些实施方案中，如本文所述，施用本公开的一种或多种化合物和/或组合物的施用，如本文所述地间隔在一起，使得实现组合(例如，协同)效应。
改善：如本文所用，术语“改善”或“改善”是指减少至少一个病症或疾病指标的严重程度。例如，在神经变性障碍的背景下，改善包括神经元损失的减少或稳定。
动物：如本文所用，术语“动物”是指动物王国的任何成员。在一些实施方案中，“动物”是指任何发育阶段的人。在一些实施方案中，“动物”是指在任何发育阶段的非人动物。在某些实施方案中，非人动物是哺乳动物(例如，啮齿动物，小鼠，大鼠，兔子，猴子，狗，猫，绵羊，牛，灵长类动物或猪)。在一些实施方案中，动物包括但不限于哺乳动物，鸟类，爬行动物，两栖动物，鱼和蠕虫。在一些实施方案中，动物是转基因动物，遗传工程动物或克隆。
大约：如本文所用，术语“大致”或“约”，其应用于一个或多个感兴趣的价值，是指类似于所述参考值的值。在某些实施方案中，术语“约”或“约”是指下降的一系列值在25％以内，20％，19％，18％，17％，16％，15％，14％，13％，12％，11％，10％，9％，8％，7％，6％，5％，4％，3％，2％，1％，0.5％，0.25％，0.1％，或更低的任一向(除非在上下文中另有说明或以其他方式明显，否则大于或小于)所述参考价值(除非这些数量超过可能值的100％)。
生物活性：如本文所用，短语“生物活性”是指在生物系统和/或生物体中具有或上具有活动的任何物质(例如，AAV)的特征。例如，在给予生物体时具有对该生物体的生物学作用的一种物质被认为是生物学活性的。在特定的实施方案中，如果甚至一部分是生物学活性或模拟所认为是生物学相关的活动，则可以认为本公开的化合物和/或本公开的组合物可以被认为是生物活性的。在一些实施方案中，生物活性是指诱导脱脂蛋白或其变体的表达。在一些实施方案中，生物活性是指预防和/或治疗与脱脂蛋白的数量和/或功能下降相关的疾病。在一些实施方案中，生物活性是指预防和/或治疗Friedreich的共济失调。
生物系统：如本文所用，术语“生物学系统”是指一组器官，组织，细胞，细胞内组分，蛋白质，核酸，分子(包括，但不限于生物分子)，该分子在一起来执行某种生物学细胞膜内的任务，细胞室，细胞，组织，器官，器官系统，多细胞生物或任何生物实体。在一些实施方案中，生物学系统是包含细胞内和/或细胞外电池信号传导生物分子的细胞信号传导途径。在一些实施方案中，生物学系统包括细胞外/细胞基质和/或细胞核桃内的生长因子信号传导事件。
衣壳：如本文所用，术语“衣壳”是指病毒的蛋白质壳。它由几种衣壳(例如，VP1，VP2和/或AAV的VP3)组成。衣壳包围病毒的遗传物质。衣壳可以是野生型衣壳或重组或工程化衣壳。
中枢神经系统或CNS：如本文所用，“中枢神经系统”或“CNS”是指神经系统的两个主要细分之一，其在脊椎动物中包括脑和脊髓。中枢神经系统协调整个神经系统的活动。
颈部区域：如本文所用，“颈部区域”是指脊髓的区域，包括颈椎C1，C2，C3，C4，C5，C6，C7和C8。
顺式元件：如本文所用，顺式元件或同义词术语“顺式调节元件”是指非编码DNA的区域调节附近基因的转录。拉丁语前缀“CIS”转换为“在这方面”。它们在基因的附近或基因中发现了顺式元素。顺式元件的实例包括Kozak序列，SV40内含子或骨架的一部分。
CNS组织：如本文所用，“CNS组织”或“CNS组织”是指中枢神经系统的组织，其在脊椎动物中，包括脑和脊髓及其副结构。
CNS结构：如本文所用，“CNS结构”是指中枢神经系统的结构和其子结构。脊髓中结构的非限制性实例可包括腹侧喇叭，背角，白种和神经系统途径或核。大脑中结构的非限制性实例包括，前脑，中脑，后脑，Diencephalon，Telencephalon，Myelencephalon，雌雄同体，中脑，勘察疗法，菱形，皮质，前叶，椎管瓣，颞叶，枕叶，大脑，丘脑，下丘脑，TECTUM，TEGMENTUM，小脑，PONS，METULLA，AMYGDALA，海马，基底神经节，语料库，垂体腺，腐败，纹状体，心室和子结构。
CNS细胞：如本文所用，“CNS细胞”是指中枢神经系统的细胞和其子结构。CNS细胞的非限制性实例包括，神经元和子类型，胶质叶，小胶质细胞，少突胶质细胞，外膜细胞和星形胶质细胞。神经元的非限制性实例包括感觉神经元，运动神经元，互核，单极细胞，双极细胞，多极体细胞，假脉瓣细胞，锥体细胞，篮子细胞，星状细胞，紫癜细胞，β细胞，氨基细胞，颗粒细胞，卵形细胞，中的大天神神经元和大汗的神经元。
密码子优化：如本文所用，术语“密码子优化”是指以这样的方式改变给定基因的密码子的过程，即由基因编码的多肽序列保持相同，而改变的密码子改善了表达的过程多肽序列。例如，如果多肽是人蛋白质序列并在大肠杆菌中表达，则如果在DNA序列上进行密码子优化以将人密码子改变为在大肠杆菌中表达更有效的密码子进行密码子优化，则通常会改善表达。。
组合物：如本文所用，术语“组合物”包含AAV多核苷酸，AAV基因组或AAV颗粒和至少一种赋形剂。
化合物：如本文所用，术语“化合物”是指不同的化学实体。在一些实施方案中，特定化合物可以以一种或多种异构或同位素形式存在(包括但不限于立体异构体，几何异构体和同位素)。在一些实施方案中，仅提供或仅在单一的这种形式提供或使用化合物。在一些实施方案中，将化合物提供或用于两种或多种这些形式的混合物(包括但不限于立体异构体的外消旋混合物)。本领域技术人员欣赏，一些化合物以不同的这种形式存在，显示出不同的性质和/或活性(包括但不限于生物活性)。在这种情况下，它在本领域中的普通技术方案中选择或避免根据本公开使用的化合物的特定形式。例如，含有不对称取代的碳原子的化合物可以以光学活性或外消旋形式分离。关于如何从光学活性原料制备光学活性形式的方法在本领域中是已知的，例如通过分离外消旋混合物或立体选择性合成。
保守的：如本文所用，术语“保守”是指多核苷酸或多肽序列的核苷酸或氨基酸残基，即在比较两个或更多个序列的相同位置发生的那些。相对保守的核苷酸或氨基酸是在比序列中其他地方出现的核苷酸或氨基酸在更多相关序列中被保守的核苷酸或氨基酸。
在一些实施方案中，如果它们彼此相同100％，则据说两个或更多个序列是“完全保守的”。在一些实施方案中，如果它们是至少70％相同的，至少80％相同，至少90％相同，或者彼此相同的至少90％，则“高度保守”是“高度保守的”。在一些实施方案中，如果它们相同约70％，则“高度保守”是“高度保守的”，约为80％相同，约95％，约95％，约98％，或约99％相同的序列。在一些实施方案中，如果它们是至少30％相同的，至少40％相同，至少50％相同，至少60％相同，则至少为50％，至少为70％相同，至少70％相同，至少70％相同的序列是“保守的”。80％相同，至少90％相同，或者至少95％相同。在一些实施方案中，如果它们是“保守”，如果它们相同约30％，相同约40％相同，约60％相同，约70％相同，约为80％，则其两种或更多种序列是“保守的”。％相同，约95％相同，约98％相同，或彼此相同约99％。序列的守恒可以适用于寡核苷酸或多肽的整个长度，或者可以施加到其一部分，区域或特征上。
在一个实施例中，保守的序列不连续。本领域技术人员能够理解如何在序列之间存在连续对准中的间隙时如何实现对准，并使相应的残留物对准当存在的插入或删除。
递送：如本文所用，“递送”是指递送细小病毒的动作或方式，例如，AAV化合物，物质，实体，部分，货物或有效载荷到目标。这种靶标可以是细胞，组织，器官，生物体或系统(无论是生物还是生产)。
递送剂：如本文所用，“递送剂”是指至少部分地促进一种或多种物质(包括但不限于本公开的化合物和/或组合物)的任何试剂，例如，病毒颗粒或AAV载体)至靶向细胞。
递送途径：如本文所用，术语“递送途径”和同义词术语“给药途径”是指向受试者提供治疗剂的任何不同方法。给药途径通常由应用物质的位置分类，并且还可以基于行动目标的位置进行分类。实例包括但不限于：静脉内给药，皮下给药，口服给药，肠胃外给药，肠内给药，局部给药，舌下给药，吸入给药和注射施用，或本文所述的其他给药途径。
衍生物：如本文所用，术语“衍生物”是指衍生自母体组合物的组合物(例如，例如序列，化合物，制剂等)，或者在母体组合物中获得其基础。母体组合物的非限制性实例包括野生型或原始氨基酸或核酸序列，或未稀释的制剂。在一些实施方案中，衍生物是母体组合物的变体。衍生物与母体组合物的差异小于约1％，小于约5％，小于约10％，小于约15％，小于约20％，小于约25％，小于约30％，小于约35％，小于约40％，小于约45％，或小于约50％。在某些实施方案中，衍生物可以与母体组合物不同超过约50％。在某些实施方案中，衍生物可以与母体组合物不同超过约75％。在一些实施方案中，衍生物可以是母体氨基酸或核苷酸序列的片段或截短。作为非限制性实例，与亲本核酸或氨基酸序列(例如，与AAV9相比，氨基酸序列相比，衍生物可以是具有核苷酸或肽插入物的序列(例如，AAVP.B)。
有效量：如本文所用，药剂的术语“有效量”是足以实现有益或期望的结果的量，例如，在单一或多剂量给予受试者或细胞上，固化，缓解，缓解或改善病症的一种或多种症状，因此“有效量”取决于其应用的背景。例如，在给予治疗Fa的试剂的上下文中，与在不施用药剂的响应相比，有效量的药剂是例如，足以实现本文所定义的治疗的量。
经工程化改造的：如本文所用，当它们被设计成具有特征或性质的特征或化学物质，本公开的实施例是从起点，野生型或本地分子变化的特征或性质时。因此，设计和/或生产的设计和/或实体包括人类手的行为。
表达：如本文所用，核酸序列的“表达”是指以下事件中的一种或多种：(1)从DNA序列(例如，通过转录)产生RNA模板；(2)处理RNA转录物(例如，通过拼接，编辑，5'帽形成和/或3'末端处理)；(3)将RNA翻译成多肽或蛋白质；(4)折叠多肽或蛋白质；和/或(5)多肽或蛋白质的翻译后修饰。
赋形剂：如本文所用，术语“赋形剂”是指用作活性药剂或其他活性物质的载体或培养基的惰性物质。
制剂：如本文所用，“配方”包括本公开的至少一种化合物和/或组合物(例如，载体，AAV颗粒等)和递送剂。
片段：本文所用的“片段”，指整体的连续部分。例如，蛋白质的片段可包含通过消化从培养细胞分离的全长蛋白质获得的多肽。在一些实施方案中，蛋白质的片段包括至少3,4,5,6,7,8,9,10,11,11,11,13,15,16,17,18,19,20,25,30,35,40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90,95,100,150,200,250或更多氨基酸。片段还可以指核酸的蛋白质或截短(例如，在5'和/或3'端)的截短(例如，N-末端和/或C-末端截短)。通过表达截短的核酸可以获得蛋白质片段，使得核酸编码一部分全长蛋白质。
基因表达：术语“基因表达”是指核酸序列经历成功转录的过程，并且在大多数情况下翻译以产生蛋白质或肽。为了清楚起见，当对“基因表达”的测量进行参考时，应该理解为意味着测量可以是转录的核酸产物，例如RNA或mRNA或翻译的氨基酸产物，例如多肽或肽。测量RNA，mRNA，多肽和肽的量或水平的方法是本领域熟知的。
同源性：如本文所用，术语“同源性”是指聚合物分子之间的整体关联性，例如，核酸分子(例如DNA分子和/或RNA分子)之间和/或在多肽分子之间。在一些实施方案中，如果聚合物分子序列至少25％,30％,35％,40％,45％,50％,55％,60％,65％,70％,75％,80％,85％,90％,95％或99％相同或相似，则认为彼此之间是“同源的”。术语“同源的”必然是指至少两个序列(多核苷酸或多肽序列)之间的比较。根据本公开，如果两个多核苷酸序列编码的多肽对于在至少约20个氨基酸的至少一段至少约50％,60％,70％,80％,90％,95％,或甚至99％相同，则认为两个多核苷酸序列是同源的。在一些实施方案中，同源多核苷酸序列的特征在于能够编码至少4-5个独特指定氨基酸的片段。对于长度少于60个核苷酸的多核苷酸序列，同源性通常取决于编码至少4-5个独特指定氨基酸的片段的能力。对于长度少于60个核苷酸的多核苷酸序列，根据本公开，同源性通常是如果两个蛋白质对于至少约20个氨基酸的至少一段至少约50％,60％,70％,80％,或90％相同，则认为两个蛋白质序列是同源的。在许多实施方案中，同源蛋白在至少一个至少3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,25,30,35,40,45,50,或更多氨基酸的短片段上可能显示出较高的整体程度同源性和较高的同源性。在许多实施方案中，同源蛋白共享一个或多个特征序列元件。如本文所用，术语“特征序列元件”是指存在于相关蛋白质中的基序。在一些实施方案中，此类基序的存在与特定活性(例如生物学活性)相关。
人源化：如本文所用，术语“人源化”是指已经改变的多核苷酸或多肽的非人序列，以增加其与其相应的人序列的相似性。
同一性：如本文所用，术语“同一性”是指聚合物分子(例如，寡核苷酸分子(例如DNA分子和/或RNA分子)和/或多肽分子之间的总相关性。例如，可以通过对准两个序列以进行最佳比较目的来进行两种多核苷酸序列的百分比的计算(例如，可以在第一和第二核酸序列中的一个或两个中引入间隙以获得最佳对准和非定义序列可以被忽略进行比较目的)。在某些实施方案中，用于比较目的的序列的长度为至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少90％至少95％，或引用序列长度的100％。然后比较相应的核苷酸位置处的核苷酸。当第一序列中的位置被与第二序列中的相应位置相同的核苷酸占据时，则分子在该位置相同。两种序列之间的百分比是序列共享的相同位置的数量的函数，考虑到间隙的数量，以及每个间隙的长度，需要引入两个序列的最佳对准。可以使用数学算法来完成序列的比较和两个序列之间的百分比同一性。例如，可以使用诸如Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.,ed.,Oxford University Press,NewYork,1988；Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.,ed.,Academic Press,New York,1993；Sequence Analysis in Molecular Biology,vonHeinje,G.,Academic Press,1987；Computer Analysis of Sequence Data,Part I,Griffin,A.M.,and Griffin,H.G.,eds.,Humana Press,New Jersey,1994；and SequenceAnalysis Primer,Gribskov,M.and Devereux,J.,eds.,M Stockton Press,New York,1991所述；每个全部内容通过引用并入本文。例如，可以确定两个核苷酸序列之间的百分比，例如使用Meyers和Miller(CABIOS,1989,4:11-17)的算法，该算法已经使用PAM120纳入对准程序(2.0版)重量残留表，间隙长度损失为12和间隙罚分4.两个核苷酸序列之间的百分比可以使用NWSGAPDNA.CMP矩阵使用GCG软件包中的间隙程序来确定。通常用于确定序列之间的百分比的方法包括但不限于Carillo,H.,and Lipman,D.,SIAM J Applied Math.,48:1073(1988)；通过引用整体并入本文。用于确定身份的技术在公开可用的计算机程序中编码。用于在两个序列之间确定同源性的计算机软件包括但不限于GCG程序包，Devereux,J.,et al.,Nucleic Acids Research,12(1),387(1984)),BLASTP,BLASTN,and FASTAAltschul,S.F.et al.,J.Molecular Biol.,215,403(1990))。
体外：如本文所用，术语“体外”是指在人工环境中发生的事件，例如在测试管或反应容器中，细胞培养物，培养皿等，而不是在生物体内(例如，动物，植物或微生物)。
体内：如本文所用，术语“体内”是指在生物体(例如动物，植物或微生物或细胞或组织中)发生的事件。
分离的：如本文所用，术语“分离的”是“分离”的同义，但是与人类的手进行分离的推断是同义。术语“分离”和“基本上分离”的术语在本文中可互换使用。分离的物质或实体是从中与先前相关的至少一些组分部分或完全分离的物质(无论是本质上还是在实验环境中)。分离的物质可能具有不同水平的纯度，参考它们与之相关的物质。分离的物质和/或实体可以分离为至少约10％，约20％，约30％，约40％，约50％，约60％，约70％，约80％，约90％或更多它们最初关联的其他组件的内容。在一些实施方案中，分离剂大于约80％，约85％，约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％约97％，98％，约99％，或超过约99％纯的。
腰部区域：如本文所用，术语“腰部区域”是指包含腰椎L1，L2，L3，L4和L5的脊髓区域。
经修饰的：如本文所用，术语“修饰”是指与亲本或参考分子或实体相比的分子或实体的改变状态或结构。分子可以以多种方式进行修饰，包括化学，在结构上和功能上。在一些实施方案中，通过引入非天然氨基酸或非天然核苷酸来改变本公开的化合物和/或组合物。
突变：如本文所用，术语“突变”是指变化和/或改变。在一些实施方案中，突变可以是蛋白质(包括肽和多肽)和/或核酸(包括多核酸)的变化和/或改变。在一些实施方案中，突变包括对蛋白质和/或核酸序列的变化和/或改变。这种变化和/或改变可包括添加，取代和或缺失一种或多种氨基酸(在蛋白质和/或肽)和/或核苷酸(在核酸和或多核酸的情况下)。在其中突变包括氨基酸和/或核苷酸的添加和/或取代的实施方案中，这种添加和/或取代可包含1个或更多个氨基酸和/或核苷酸残基，并且可以包括改性氨基酸和/或核苷酸。一个或多个突变可能导致“突变体”，“衍生物”或“变体”，例如，核酸序列或多肽或蛋白质序列。
天然存在：如本文所用，“天然存在”或“野生型”意味着在没有人工助剂的情况下存在于无论如何，或者手中的人的参与。“天然存在”或“野生型”可以指生物分子，序列或实体的本地形式。
非人类脊椎动物：如本文所用，“非人脊椎动物”包括除同性恋和野生和驯养物种之外的所有脊椎动物。非人脊椎动物的实例包括但不限于哺乳动物，如羊驼，苍白，野牛，骆驼，猫，牛，鹿，狗，驴，奶牛，山羊，豚鼠，马，骆驼，骡子，猪，兔子，驯鹿，羊水水牛和牦牛。
核酸：如本文所用，术语“核酸”，“多核苷酸”和“寡核苷酸”是指由聚氧化氧核苷酸(含有2-脱氧-D-核糖)或多核苷酸(含有D-核糖)组成的任何核酸聚合物(含有D-核糖或者或任何其他类型的多核苷酸，其是嘌呤或嘧啶碱的n糖苷，或改性嘌呤或嘧啶碱基。术语“核酸”之间的长度没有意义的区别，“核酸”，“多核苷酸”和“寡核苷酸”，这些术语将可互换使用。这些术语仅指分子的主要结构。因此，这些术语包括双链和单链DNA，以及双链和单链RNA。
可操作地连接：如本文所用，短语“可操作地连接”是指两种或多种分子，构建体，转录物，实体，部分等的功能连接。
颗粒：如本文所用，“颗粒”是由至少两种组分，蛋白质衣壳和封装在衣壳内的多核苷酸序列组成的病毒。
患者：如本文所用，“患者”是指可能寻求或需要治疗的受试者，需要治疗，正在接受治疗，将接受治疗，或受训练有素(例如，许可)专业的护理人员的受试者对于特定疾病或病症。
有效载荷：如本文所用，“有效载荷”或“有效载荷区域”是指由病毒基因组或这种多核苷酸或多核苷酸区域的表达产物编码的一个或多个多核苷酸或多核苷酸区域，例如转基因，编码A的多核苷酸多肽。
有效载荷构建体：如本文所用，“有效载荷构造”是编码的一个或多个多核苷酸区域，或者包括通过反相终端重复(ITR)序列在一个或两侧上侧翼的有效载荷。有效载荷构建体是在病毒生产细胞中复制的模板，以产生病毒基因组。
有效载荷构建体载体：如本文所用，“有效载荷构造载体”是矢量编码或包含有效载荷构建体，以及用于在细菌细胞中复制和表达的调节区域。有效载荷构建体载体还可包含用于病毒复制细胞中病毒表达的组分。
肽：如本文所用，术语“肽”是指小于或等于约50个氨基酸的氨基酸链，例如约5,10,15,20,25,30,35,40，45，或50个氨基酸长。
药学上可接受的：本文使用的短语“药学上可接受”是指在声音医学判断范围内的那些化合物，材料，组合物和/或剂型，适用于与人类组织接触动物没有过度毒性，刺激，过敏反应或其他问题或并发症，与合理的益处/风险比相称。
药学上可接受的赋形剂：如本文所用，本文所用的术语“药学上可接受的赋形剂”是指除了在药物组合物中存在的活性剂(例如，如本文所述)以外的任何成分，并具有基本上无毒和非毒性的性质受试者的炎症。在一些实施方案中，药学上可接受的赋形剂是能够悬浮和/或溶解活性剂的载体。赋形剂可包括，例如：抗替代剂，抗氧化剂，粘合剂，涂料，压缩助剂，崩解剂，染料(颜色)，润肤剂，乳化剂，填料(稀释剂)，薄膜成型剂或涂料，味道，香味，助流剂(流量增强剂)，润滑剂，防腐剂，印刷油墨，吸附剂，悬浮或分散剂，甜味剂和水化水分。赋形剂包括但不限于：丁基化羟基甲苯(BHT)，碳酸钙，磷酸钙(二元)，硬脂酸钙，Croscarlose，交联聚乙烯吡咯烷酮，柠檬酸，Crospovidone，半胱氨酸，乙基纤维素，明胶，羟丙基纤维素，羟丙基甲基纤维素，乳糖，硬脂酸镁，麦芽糖醇，甘露醇，甲硫氨酸，甲基甲纤维素，甲基羟甲酰胺，微晶纤维素，聚乙二醇，聚乙烯吡咯烷酮，聚乙二醇，预胶化淀粉，丙基，视黄糖棕榈酸酯，虫胶，二氧化硅，羧甲基纤维素钠，柠檬酸钠，淀粉乙醇酸钠，山梨糖醇，淀粉(玉米)，硬脂酸，蔗糖，滑石，二氧化钛，维生素A，维生素E，维生素C和/或木糖醇。
药学上可接受的盐：本文所述的化合物的药学上可接受的盐是所公开的化合物的形式，其中酸或碱部分处于其盐形式(例如，通过使游离碱基与合适的有机酸反应而产生)。药学上可接受的盐的实例包括，但不限于碱性残留物如胺的矿物质或有机酸盐；碱性或有机盐等酸性残基，如羧酸；就像。代表性酸加成盐包括乙酸盐，己二酸盐，藻酸盐，抗坏血酸，天冬氨酸，苯磺酸盐，苯甲酸盐，双硫酸盐，硼酸盐，丁酸盐，混凝簇，樟脑酸盐，柠檬酸盐，环戊烷，Digluconate，十二烷基硫酸盐，乙磺酸盐，富马酸盐，葡糖酚酸盐，甘油磷酸盐，半硫酸盐，野生素，己酸酯，己酸酯，氢溴酸盐，盐酸盐，氢碘酸盐，二羟基磺酸盐，乳酸盐酸盐，乳酸盐，月桂酸盐，苹果酸盐，马来酸，丙二酸酯，甲磺酸盐，2-萘磺酸盐，硝酸硝酸盐，硝酸盐，油酸，草酸盐，棕榈酸酯，酰胺，果胶，过硫酸盐，3-苯基丙酸盐，磷酸盐，纤维酸盐，戊酸盐，丙酸盐，硬脂酸盐，琥珀酸盐，硫酸盐，酒石酸酯，硫氰酸酯，甲苯磺酸盐，未赤烷酸盐，戊酸盐等。代表性的碱或碱土金属盐包括钠，锂，钾，钙，镁等，以及无毒铵，季铵和胺阳离子，包括但不限于铵，四甲基，四乙基铵，甲胺，二甲基氨铵，三甲胺，三乙胺，乙胺等。药学上可接受的盐包括例如来自无毒无机或有机酸的常规无毒盐。在一些实施方案中，药学上可接受的盐由母体化合物制备，所述母体化合物通过常规化学方法含有碱性或酸性部分。通常，这种盐可以通过使这些化合物的游离酸或基础形式与水中的化学计量量或水中的化学计量量或水中或在有机溶剂中反应，或者在两者的混合物中来制备；通常，使用非水介质，如乙醚，乙酸乙酯，乙醇，异丙醇或乙腈。在Remington’s Pharmaceutical Sciences,17th ed.,Mack Publishing Company,Easton,Pa.,1985,p.1418,Pharmaceutical Salts：Properties,Selection,and Use,P.H.Stahl and C.G.Wermuth(eds.),Wiley-VCH,2008,and Berge et al.,Journal of Pharmaceutical Science,66,1-19(1977)，其内容通过引用整体并入本文。
药物组合物：如本文所用，术语“药物组合物”或药学上可接受的组合物“包含AAV多核苷酸，AAV基因组或AAV颗粒和一种或多种药学上可接受的赋形剂，溶剂，佐剂和/等。
多肽：如本文所用，术语“多肽”是指由在链中键合在一起的大量氨基酸残基组成的有机聚合物。单体蛋白质分子是多肽。
预防：如本文所用，术语“防止”是指部分或完全延迟感染，疾病，病症和/或条件的发作；部分或完全延迟特定感染，疾病，疾病和/或条件的一种或多种症状，特征或临床表现的一部分或多种症状，特征或临床表现；部分或完全延迟特定感染，疾病，疾病和/或病症的一种或多种症状，特征或表现形式；部分或完全延迟感染，特定疾病，病症和/或病症的进展；和/或降低与感染，疾病，疾病和/或病症相关的发育病理学的风险。
启动子：如本文所用，术语“促进剂”是指聚合酶酶将结合转录(DNA至RNA)或逆转录(RNA至DNA)的核酸部位。
感兴趣的蛋白质：如本文所用，术语“感兴趣的蛋白质”或“所需蛋白质”包括本文提供的那些，以及其片段，突变体，变体或其改变。
纯化的：如本文所用，术语“纯化”是指从一个或多个不需要的组分，材料污秽，混合物或缺陷的基本上纯的或清楚的。“净化”是指纯净的状态。“纯化”是指制造纯化的过程。如本文所用，如果基本上不含(基本上分离)一种或多种组分，例如在本地上下文中发现的一种或多种组分，则物质是“纯”。
区域：如本文所用，术语“区域”是指区域或一般区域。在一些实施方案中，当提及蛋白质或蛋白质模块时，区域可包括沿蛋白质或蛋白质模块的氨基酸的线性序列，或者可以包含三维区域，表位和/或表位簇。在一些实施例中，区域包括终端区域。如本文所用，术语“终端区域”是指位于给定试剂的端部或末端的区域。当提及蛋白质时，终端区域可包括N-和/或C-Termini。N-Termini参考包含具有游离氨基的氨基酸的蛋白质的末端。C-Termini参考包含具有游离羧基的氨基酸的蛋白质的末端。N-和/或C末端区域可包含N-和/或C-末端以及周围氨基酸。在一些实施方案中，N-和/或C-末端区域包含约3个氨基酸至约30个氨基酸，约5个氨基酸至约40个氨基酸，约10个氨基酸至约50个氨基酸，从约20氨基酸至约100个氨基酸和/或至少100个氨基酸。在一些实施方案中，N-末端区域可包括N-末端的任何长度的氨基酸，但不包括C-末端。在一些实施方案中，C末端区域可包括任何长度的氨基酸，其包括C-末端，但不包含N-末端。
在一些实施方案中，当参考多核苷酸时，区域可以包括沿着多核苷酸的核酸的线性序列，或者可以包括三维区域，二级结构或三级结构。在一些实施例中，区域包括终端区域。如本文所用，术语“终端区域”是指位于给定试剂的端部或末端的区域。当提及多核苷酸时，终端区域可以包括5'和3'末端。5'末端指的是包含核酸的多核苷酸的末端，其具有自由磷酸基团。3'末端指包含含有游离羟基的多核苷酸的末端。5'和3'区可以包含5'和3'末端以及周围的核酸。在一些实施方案中，5'和3'末端区域包含约90个核酸至约90核酸，约15个核酸至约120核酸，约30个核酸至约150个核酸，从约60核酸到约60个核酸约300核酸和/或至少300个核酸。在一些实施方案中，5'区可包含任何包含5′末端的核酸的任何长度，但不包括3′末端。在一些实施方案中，3′区可包括任何长度的核酸，其包括3'末端，但不包含5'末端。
RNA或RNA分子：如本文所用，术语“RNA”或“RNA分子”或“核糖核酸分子”是指核糖核苷酸的聚合物；术语“DNA”或“DNA分子”或“脱氧核糖核酸分子”是指脱氧核糖核苷酸的聚合物。DNA和RNA可以自然地合成，例如，通过DNA复制和DNA的转录；或者化学合成。DNA和RNA可以是单链(即，SSRNA或SSDNA)或多链(例如，双链，即DSRNA和DSDNA)。如本文所用，术语“mRNA”或“信使RNA”是指编码一种或多种多肽链的氨基酸序列的单链RNA。
样品：如本文所用，术语“样品”是指从源和/或提供分析或加工的等分试样或部分。在一些实施方案中，样品来自生物源，例如组织，细胞或组分部分(例如体液，包括但不限于血液，粘液，淋巴液，滑膜液，脑脊液，唾液，羊水，羊水，羊水脐带血，尿液，阴道液和精液)。在一些实施方案中，样品可以是或包含由整个生物体或其组织，细胞或组分部分的副本或其组织，细胞或组分的子集或其组织或部分的均质，包括但不限于例如等离子体，血清，脊髓液，淋巴液，皮肤外部部分，呼吸道，肠道和泌尿道，泪水，唾液，牛奶，血细胞，肿瘤，器官。在一些实施方案中，样品是或包含培养基，例如营养肉汤或凝胶，其可含有细胞组分，例如蛋白质或核酸分子。在一些实施方案中，“初级”样品是源的等分试样。在一些实施方案中，对初级样品进行一次或多种处理(例如，分离，纯化等)步骤以制备用于分析或其他用途的样品。
血清型：如本文所用，术语“血清型”是指基于表面抗原的AAV囊泡的不同变化，其允许子种类水平的AAV的流行病学分类。
信号序列：如本文所用，短语“信号序列”是指可以指导传输或定位的序列。
单个单位剂量：如本文所用，“单个单位剂量”是一种剂量的任何治疗剂，一次剂量/单一的途径/单个途径/单点接触点，即单个给药事件。在一些实施方案中，单个单位剂量被提供为离散剂型(例如，片剂，胶囊，贴剂，装载注射器，小瓶等)。
相似性：如本文所用，术语“相似性”是指聚合物分子之间的总相关性，例如，例如，在多核苷酸分子(例如DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间。除了在本领域理解的情况下，可以以与百分比的计算相同的方式进行聚合物分子彼此相同的百分比的计算，除了在本领域中理解的视觉保守取代的计算。
稳定：如本文所用，“稳定”是指的化合物或实体，其具有足够稳健的以存活与反应混合物的有用纯度，并且能够配制成有效的治疗剂。
稳定的：如本文所用，术语“稳定”，“稳定”，“稳定区域”是指制造或变得稳定的。在一些实施例中，相对于绝对值测量稳定性。在一些实施方案中，相对于参考化合物或实体测量稳定性。
受试者：如本文所用，术语“受试者”或“患者”是指可以施用根据本公开的组合物的任何生物，例如，用于实验，诊断，预防和/或治疗目的。同样，“受试者”或“患者”是指可能要求的人，他们可能需要接受，谁是接受，或者将接受治疗或由培训的专业人员对特定疾病或病症进行治疗的人。典型的受试者包括动物(例如，哺乳动物，例如小鼠，大鼠，兔，非人类灵长类动物和人类)。在某些实施方案中，受试者或患者可能易于或怀疑具有Friedreich的共济失调。在某些实施方案中，可以诊断受试者或患者患有Friedreich的共济失调。
基本上：如本文所用，术语“基本上”是指在表现出总计或接近总范围的定性条件或感兴趣的特征或性质。生物艺术的普通技术人员将理解，如果有的话，生物学和化学现象很少，转到完整和/或进行完整性或实现或避免绝对结果。因此，术语“基本上”在本文中用于捕获许多生物和化学现象中固有的潜在缺乏完整性。
基本相等：如本文所用，因为它涉及剂量之间的时间差异，术语方式加上/减去2％。
基本上同时：如本文所用，并且当它涉及多个剂量时，术语通常在约2秒内意味着。
患有：“患有”疾病，疾病和/或病症的人被诊断出或显示疾病，疾病和/或病症的一种或多种症状。
易患：“易受”疾病，疾病和/或病症的个体尚未被诊断出患有和/或可能不会表现出疾病，疾病和/或病症的症状，但遗产倾向于发展疾病或其症状。在一些实施方案中，易患疾病，病症和/或条件(例如，癌症)的个体可以通过以下一种或多种来表征：(1)与疾病的发展相关的基因突变，和/或条件；(2)与疾病，病症和/或病症的发展相关的遗传多态性；(3)增加和/或降低与疾病，病症和/或病症相关的蛋白质和/或核酸的表达和/或活性；(4)与疾病，疾病和/或病症的发展相关的习惯和/或生活方式；(5)疾病，疾病和/或病症的家族史；(6)用微生物接触和/或感染与疾病，疾病和/或病症的发育相关的微生物。在一些实施方案中，易患疾病，病症和/或病症的个体将产生疾病，疾病和/或病症。在一些实施方案中，易患疾病，病症和/或病症的个体不会产生疾病，病症和/或病症。
合成：由人手制备，制备和/或制造的术语“合成”是指由人手制备的，制备和/或制造。本公开的多核苷酸或多肽或其他分子的合成可以是化学或酶的。
靶向：如本文所用，“靶向”是指将与靶核酸杂交的核酸序列的设计和选择的过程，并诱导所需效果。
靶向细胞：如本文所用，“靶细胞”或“靶细胞”是指感兴趣的任何一种或多种细胞。可以在体外，体内，原位或组织或器官中发现细胞。生物体可以是动物，哺乳动物，人和/或患者。靶细胞可以是CNS组织中的CNS细胞或细胞。
治疗剂：术语“治疗剂”是指的任何药剂，当给受试者施用于受试者时具有治疗，诊断和/或预防效果和/或引发所需的生物和/或药理学效应。
治疗有效量：如本文所用，术语“治疗有效量”是指在给药时足够的待递送的药剂的量(例如，核酸，药物，治疗剂，诊断剂，预防剂等)对于患有或易受感染，疾病，疾病和/或病症的受试者，治疗，改善诊断，预防和/或延迟感染，疾病，疾病和/或病症的症状。在一些实施方案中，在单剂量中提供治疗有效量。在一些实施方案中，治疗有效量在包含多个剂量的剂量方案中施用。本领域技术人员将理解，在一些实施方案中，如果其包含作为这种剂量方案的一部分施用时，则可以认为单位剂型包括治疗有效量的特定剂或实体。
治疗有效的结果：如本文所用，术语“治疗有效结果”是指在患有或易受感染，疾病，病症和/或病症的受试者中足够的结果，以治疗，改善诊断症状，预防和/或延迟感染，疾病，疾病和/或病症的发生。
胸部区域：如本文所用，“胸部区域”是指脊髓的区域，包括胸椎椎骨T1，T2，T3，T4，T5，T6，T7，T8，T9，T10，T11和T12。
治疗：如本文所用，术语“处理”是指部分或完全缓解，改善，改善，改善，缓解，逆转，延迟发作，抑制进展，降低严重程度和/或减少一种或多种症状或特征的发生率特定的感染，疾病，疾病和/或病症。治疗可以施用于未表现出疾病，病症和/或病症的迹象的受试者和/或患者仅具有疾病，疾病和/或条件的早期征象的受试者，以降低风险开发与疾病，病症和/或病症相关的病理学。
未修饰：如本文所用，“未改性”是指在以任何方式改变之前的任何物质，化合物或分子。未经修改的5月，但并不总是指的是生物分子或实体的野生型或本地形式。分子或实体可以经历一系列修饰，其中每个改性产品可以用作随后改性的“未改性”起始分子或实体。
载体：如本文所用，“载体”是传输，转换或以其他方式作为异源分子的载体的任何分子或部分。本公开的载体可以重组产生，并且可以基于和/或可以包括腺相关病毒(AAV)父母或参考序列。这种父母或参考AAV序列可以用作工程向量的原始，第二，第三或后续序列。在非限制性实例中，这种父母或参考AAV序列可包含以下序列中的任何一种或多种：编码多肽或多多肽的多核苷酸序列，其具有可以是野生型或从野生型修饰的序列的序列哪种序列可以编码蛋白质，蛋白质结构域或其FXN的一个或多个亚基的全长或部分序列和其变体；编码FXN的多核苷酸和其变体，其具有野生型或从野生型改性的序列；和编码可以或可能不从野生型序列修改的FXN和变体的转基因。
病毒构建体载体：如本文所用，“病毒构建体载体”是包含一个或多个编码或包含批准和或帽蛋白的多核苷酸区域的载体。病毒构建体载体还可包含一种或多种多核苷酸区域编码或包含用于病毒复制细胞中病毒表达的组分。
病毒基因组：如本文所用，“病毒基因组”或“载体基因组”是包含至少一个倒末端重复(ITR)和至少一个编码有效载荷的多核苷酸。病毒基因组编码至少一个有效载荷副本。
野生型：如本文所用，“野生型”是生物分子，序列或实体的天然形式。
本文描述的是用于设计，制备，制备和/或制剂AAV颗粒的组合物，方法，工艺，试剂盒和装置。
本公开的一个或多个实施例的细节阐述在下面的附表中。尽管在本公开的实践或测试中可以使用类似或等同于本文所述的任何材料和方法，但现在描述材料和方法。
通过以下非限制性实施例进一步说明本公开。
IX.实施例
实施例1.启动子变体的设计
A.启动子
先前的研究已经表明，CMV启动子驱动最高水平的共济蛋白表达，而CBA在驱动表达中显示较低效力。PGK和FXN启动子已显示是用于驱动蛋白表达的甚至更弱的启动子。产生了CMV、CBA和FXN启动子的变体以确定哪些启动子将导致有效载荷(例如共济蛋白或荧光素酶)的最高表达。将启动子插入表达萤光素酶的载体中，所述载体使用标准分子克隆技术构建。
设计的启动子在以上表3中描述。在表3中，CMV代表“巨细胞病毒”，CBA代表可能具有CMV IE增强子区和启动子区的“鸡β-肌动蛋白”，CAG代表CMV增强子，CBA启动子和兔β-珠蛋白剪接受体位点，FXN代表“共济蛋白”，mCBA代表使用PCR生成的CBA启动子的变体。
每个经工程化改造的启动子变体均通过凝胶电泳进行分析，消化(Sac1和HindIII)，验证并测序。
B.启动子的体外评估
评估了七个共济蛋白启动子变体、15个CBA启动子变体和8个CMV启动子变体的体外表达活性。将HEK293细胞铺入96孔板中(3.0x104个细胞/孔，每孔具有0.3ul
Figure BDA0003088012730002303
转染试剂)，并利用包含来自表3的启动子和萤光素酶有效载荷(萤火虫(firefly)(～75ng)或海肾(renilla)(25ng))的质粒一式两份或一式三份转染(5次转染)。转染后48小时，使用
Figure BDA0003088012730002301
荧光素酶测定系统确定荧光素酶的活性和表达。简而言之，将等体积的
Figure BDA0003088012730002302
荧光素酶试剂直接添加到生长培养基中的细胞中，温育10分钟，然后测量萤火虫荧光素酶的表达。然后添加相同体积的试剂以淬灭萤火虫发光(firefly luminescence)，并在10分钟后测量海肾荧光素酶活性。使用pGL3-基础无启动子载体的对照作为对照。
由萤火虫和海肾荧光素酶表达确定的启动子变体的活性显示于表18-20中，以相对光单位(RLU)定量。表18显示了初始FXN、CBA和CMV启动子变体的数据，而表19显示了第二代(second generation)PCR产生的CBA启动子变体的数据。表20显示了所有一起运行的启动子变体的数据。
表18.萤光素酶活性；FXN、CBA和CMV启动子
Figure BDA0003088012730002311
Figure BDA0003088012730002321
表19.萤光素酶活性:CBA启动子
Figure BDA0003088012730002322
Figure BDA0003088012730002331
表20.萤光素酶活性:FXN、CBA和CMV启动子
Figure BDA0003088012730002332
Figure BDA0003088012730002341
与对照相比，启动子的活性增加了从0.4到125倍。这是最低表达的启动子与导致最高表达的启动子之间活性的321倍差异。CMV(SEQ ID NO:1743)启动子提供了最大的活性，CBA(SEQ ID NO:1734)、mCBA(SEQ ID NO:1760)、CMV-D2(SEQ ID NO：1745)、CBA-D1(SEQID NO:1735)、CBA-D2(SEQ ID NO:1736)、CMV-D6(SEQ ID NO:1749)、mCBA-D1(SEQ ID NO:1761)和CMV-D4(SEQ ID NO:1747)启动子在诱导荧光素酶表达中每个显示降低的效力。启动子变体的总体活性等级如下，以具有最高表达的启动子到具有最小活性的启动子的顺序列出：CMV(SEQ ID NO:1743)、mCBA(SEQ ID NO:1760)、CBA(SEQ ID NO:1734)、CMV-D2(SEQID NO:1745)、CMV-D1(SEQ ID NO:1744)、CBA-D1(SEQ ID NO:1735)、CBA-D2(SEQ ID NO:1736)、CMV-D6(SEQ ID NO:1749)、mCBA-D1(SEQ ID NO；1761)、CMV-D4(SEQ ID NO：1747)、CMV-D5(SEQ ID NO：1748)、CMV-D3(SEQ ID NO:1746)、mCBA-D3(SEQ ID NO：1763)、mCBA-D2(SEQ ID NO:1762)、CBA-D5(SEQ ID NO：1739)、CBA-D6(SEQ ID NO:1740)、mCBA-D6(SEQ IDNO：1766)、CBA-D3(SEQ ID NO：1737)、mCBA-D5(SEQ ID NO：1765)、mCBA-D4(SEQ ID NO：1764)、CBA-D4(SEQ ID NO:1738)、CBA-D7(SEQ ID NO:1741)、CMV-D7(SEQ ID NO:1750)、CMV-D8(SEQ ID NO:1751)、CBA-D8(SEQ ID NO：1742)、pGL3-FXNpro1336(SEQ ID NO:1759)、pGL3-FXNpro1060(SEQ ID NO:1756)、pGL3-FXNpro1226(SEQ ID NO:1757)、pGL3-FXNpro534(SEQ ID NO：1754)、pGL3-FXNpro363(SEQ ID NO：1753)、pGL3-FXNpro223(SEQID NO:1752)和pGL3-基础。
基于这些发现，选择了12个启动子变体用于进一步研究。这些包括CMV(SEQ IDNO：1743)、CBA(SEQ ID NO：1734)、CMV-D1(SEQ ID NO:1744)、mCBA-D1(SEQ ID NO：1761)、CMV-D3(SEQ ID NO:1746)、mCBA-D2(SEQ ID NO:1762)、CBA-D6(SEQ ID NO:1740)、CBA-D4(SEQ ID NO:1738)、CMV-D7(SEQ ID NO：1750)、CBA-D8(SEQ ID NO：1742)、pGL3-FXNpro1060(SEQ ID NO:1756)和pGL3-FXNpro534(SEQ ID NO:1754)。选择显示低、中和高表达的启动子。
实施例2.编码共济蛋白的有效载荷构建体的设计
有效载荷构建体设计为最少包含编码共济蛋白的核酸序列。使用标准分子克隆技术构建有效载荷构建体。将FXN标签转基因克隆到AAV表达载体中，并对所得克隆进行进一步测序，以确认所有元件(诸如ITR、启动子和标签)的正确性。
为了构建食蟹猴共济蛋白(cFXN)有效载荷构建体，将血凝素(HA)标记的cFXN转基因克隆到含有源自AAV2基因组的5′和3′ITR序列(141个核苷酸)、CBA、CMV或FXN启动子、hβ珠蛋白内含子区域、hGH poly(A)信号和用于肝脏脱靶(liver-detargeting)的三个miR-122结合位点(miR-122BS)的质粒中。评估了CBA、CMV或FXN启动子的缺失变体。在三个构建体中测试了450bp的人白蛋白序列(Alb450)作为填充物序列(参见表4；ITR至ITR序列)。
为构建具有不同构型的人共济蛋白(hFXN)有效载荷构建体，利用包含源自AAV2基因组的5′和3′ITR序列(141个核苷酸)、CBA启动子、hβ珠蛋白内含子区域、hFXN基因和hGHpoly(A)信号的起始构建体。源自起始构建体的随后的有效载荷构建体含有以下四个启动子缺失变体之一：CBA-D8、CMV、CMV-D7和FXNpro1060。为了具有完整的基因组大小，选择了人白蛋白作为填充物(Alb1384、Alb1856、Alb450、Alb2266、Alb2335、Alb1785、Alb2264或Alb1313)，并将其添加到随后的有效载荷构建物中。构建含有填充物序列的人类共济蛋白构建体，其具有或不具有用于肝脏脱靶的miR-122结合位点(miR-122BS)(参见表4)。
含有有效载荷构建体的质粒在表4中描述。这些有效载荷构建体包含载体主链、源自AAV2基因组的5′和3′ITR序列(141个核苷酸)、人类β-珠蛋白(hβ珠蛋白)内含子区域、人类生长激素(hGH)poly(A)信号，且还可以包含以下组分：CBA、mCBA、CMV或FXN启动子或其缺失变体；食蟹猴共济蛋白(cFXN)或人类共济蛋白(hFXN)基因；血凝素(HA)标签；三个miR-122结合位点(BS)；以及源自人类白蛋白基因的各种长度的填充物序列。hβ珠蛋白内含子区域包含一个立即早期蛋白1(immediate-early protein 1)(ie1)外显子1、部分ie1内含子、hβ珠蛋白内含子2和hβ珠蛋白外显子3。ITR序列之间的组分从5'到3'在表4中展示。
通过测序确认构建体ITR至ITR序列，并以SEQ ID NO：1778-1804给出。
实施例3.cFXN构建体及其组分的验证
A.启动子变体和hβ珠蛋白内含子的鉴定
为了验证由CMV、CBA和FXN启动子变体驱动的经工程化改造的cFXN构建体中的启动子和hβ珠蛋白内含子区域，用高保真限制性内切酶MluI-HF和AgeI-HF消化该构建体。双重消化产生由启动子和hβ珠蛋白内含子区域组成的切割产物。消化的样品通过琼脂糖凝胶电泳进行分析。测试的变体包括cFXN1-cFXN18(SEQ ID NO:1778-1795)。凝胶显示出具有与启动子变体的大小相对应的样式的条带。
B.miR-122和hGH poly(A)的鉴定
为了验证由CMV、CBA和FXN启动子变体驱动的经工程化改造的cFXN构建体中的miR-122和hGH poly(A)区域，用限制性内切酶XhoI和ClaI消化该构建体。双重消化产生由miR-122结合位点、hGH poly(A)序列以及在某些情况下的填充物序列组成的切割产物。经消化的样品通过琼脂糖凝胶电泳分析。测试的变体包括cFXN1-cFXN18(SEQ ID NO:1778-1795)。在大多数构建体中检测到与miR-122和hGH poly(A)区域相对应的条带。与具有miR-122序列的构建体相比，缺少miR-122序列的变体表现出较低的条带。具有填充物序列的变体表现出较高的条带，证实了填充物的存在。
C.ITR的鉴定
为了验证由CMV、CBA和FXN启动子变体驱动的经工程化改造的cFXN构建体中的反向末端重复(ITR)，单独用限制性内切酶XmaI或MscI消化该构建体。XmaI和MscI二者均可在ITR内以及构建体的另一个位点切割。经消化的样品通过琼脂糖凝胶电泳分析。测试的变体包括cFXN1-cFXN18(SEQ ID NO：1778-1795)。两种凝胶均显示出所有构建体中的三个切割产物，证实了ITR的存在。
实施例4.在哺乳动物细胞中产生cFXN构建体
cFXN构建体(SEQ ID NO：1778-1795)用于转染HEK-293T或Huh7细胞。转染以每孔约1.5x105个细胞在12孔板中进行。将细胞与1.0μg cFXN构建体、1.0μg含有EGFP基因的对照质粒，以及4.0μl
Figure BDA0003088012730002371
转染试剂(Promega，麦迪逊，威斯康星州)一起温育。转染后72小时，通过荧光显微镜分析细胞的EGFP表达。单独用EGFP质粒转染的细胞显示荧光并用作阳性对照，而未转染的细胞用作阴性对照且不显示任何荧光。各种构建体显示出相似的EGFP表达水平，证明了有效的转染。然后将细胞进行RNA和蛋白质提取，用于随后的分析。
实施例5.hβ珠蛋白内含子剪接的检测
使用正向引物和反向引物从cFXN构建体中扩增覆盖hβ珠蛋白内含子和cFXN-HA转基因序列的片段。进行PCR反应，并通过琼脂糖凝胶电泳分析产物。所有构建体均显示出与保留hβ珠蛋白内含子的片段相对应的相同条带。
通过从经转染的HEK-293T或Huh7细胞提取的RNA进行逆转录合成cDNA。用cDNA模板重复PCR反应，并通过琼脂糖凝胶电泳分析产物。与直接从构建体扩增的片段相比，cDNA反应产生更小的片段。大小差异与ie1内含子和hβ珠蛋白内含子2的长度相一致。结果表明，转染后hβ珠蛋白内含子的成功剪接。
实施例6.在HEK-293T和Huh7细胞中cFXN蛋白的表达
A.HEK-293T细胞
通过蛋白质印迹检测在引入不同的cFXN构建体之后，HEK293T细胞中cFXN的表达(SEQ ID NO:1778-1795)。从利用包括cFXN1-cFXN18(SEQ ID NO:1778-1795)的不同cFXN构建体转染的HEK-293T细胞中提取总蛋白。对于每个样品上样总共10μg蛋白质。GAPDH充当内部对照。蛋白质印迹显示了cFXN蛋白的三种不同种类，即前体蛋白(～25KDa)、中间体蛋白(～20KDa)和成熟蛋白(～15KDa)。仅用EGFP转染的细胞未检测到cFXN蛋白。除了cFXN17(SEQ ID NO：1794)和cFXN18(SEQ ID NO：1795)、cFXN11(SEQ ID NO：1788)、cFXN12(SEQ IDNO：1789)、cFXN13(SEQ ID NO：1790)、cFXN14(SEQ ID NO:1791)具有最高的表达之外，几乎所有构建体均显示出cFXN蛋白的强烈表达。
通过酶联免疫吸附测定(ELISA)定量表达的cFXN蛋白的量。每组使用总共20ng蛋白质。cFXN构建体以不同水平表达cFXN，并且cFXN表达水平与CBA/CMV/FXN启动子变体的启动子活性高度一致。表21列出了HEK-293T细胞中由不同的cFXN构建体表达的cFXN蛋白浓度。
表21.HEK-293T细胞中cFXN蛋白浓度
Figure BDA0003088012730002381
Figure BDA0003088012730002391
B.Huh7细胞
通过蛋白质印迹检测在引入不同的cFXN构建体之后，Huh7细胞中cFXN的表达。从利用包括cFXN1-cFXN18(SEQ ID NO:1778-1795)的不同cFXN构建体转染的Huh7细胞中提取总蛋白。对于每个样品上样总共10μg蛋白质。GAPDH充当内部对照。蛋白质印迹显示了cFXN蛋白的三种不同种类，即前体蛋白(25KDa)、中间体蛋白(20KDa)和成熟蛋白(15KDa)。仅用EGFP转染的细胞未检测到cFXN蛋白。在用含有miR-122结合位点的构建体转染的细胞中看到一条亮条带，表明miR-122有效降低了肝细胞中cFXN蛋白表达。
通过酶联免疫吸附测定(ELISA)定量所表达的cFXN蛋白的量。
每个构建体使用总共20ng蛋白质。cFXN构建体以不同水平表达cFXN，并且cFXN表达水平与CBA/CMV/FXN启动子变体的启动子活性高度一致。与用无miR-122构建体转染的细胞相比，用含有miR-122结合位点的构建体转染的细胞显示出明显更低水平的cFXN蛋白。
表22列出了Huh7细胞中由不同的cFXN构建体表达的cFXN蛋白浓度。
表22.Huh7细胞中cFXN蛋白浓度
Figure BDA0003088012730002392
实施例7.hFXN1构建体的体外测试
将hFXN1(SEQ ID NO:1796)与AAV PHP.B包装质粒共转染到HEK-293T细胞中。使用四盘已转染细胞来纯化AAV颗粒。通过碘克沙醇梯度超速离心法(iodixanol gradientultracentrifugation)纯化AAV颗粒。经纯化的样品含有1E12vg/ml AAV颗粒。样品在十二烷基硫酸钠(SDS)凝胶上运行，然后通过银染色以可视化转基因条带并检查杂质。凝胶显示了经共纯化的hFXN蛋白，证实了将转基因成功包装到AAV中。
利用三种不同的AAV感染复数(MOI)来转染HEK-293T细胞，即5x105、1x105和2x104。转染后，从细胞中提取蛋白质，并通过进行蛋白质印迹来检测表达。hFXN的表达与转染的MOI成正比。对于用最高MOI 5x105转染的细胞，看到了强烈的hFXN表达。对于用MOI 2x104转染的HEK-293T细胞，未检测到hFXN蛋白，而对于用MOI 1x105转导的HEK-293T细胞，则检测到了hFXN蛋白。
使用变性琼脂糖凝胶电泳分析AAV病毒基因组的大小。检测到单个条带，其对应于预期的基因组大小(2881bp)。
实施例8.人类hFXN构建体的产生
A.编码hFXN1的构建体的可选的启动子设计
将hFXN1(SEQ ID NO:1796)构建体用作起始模板，通过交换启动子来产生四个中间质粒。产生的四个中间质粒各自含有以下启动子之一：FXNpro1060(SEQ ID NO:1756)、CMV(SEQ ID NO:1743)、CMV-D7(SEQ ID NO:1750)和CBA-D8(SEQ ID NO:1742)。通过使用MluI和Hind3限制位点将四个启动子序列亚克隆到hFXN1模板中来产生中间质粒。将连接产物转化到细菌细胞中，并使用标准的小规模制备实验方案(miniprep protocol)纯化质粒。通过用MluI/Hind3或MluI/AgeI限制性消化，然后进行琼脂糖凝胶电泳，验证经纯化的质粒。
B.人类白蛋白(Alb)填充物序列的插入
为了确保完整的基因组大小，选择了人类白蛋白DNA充当填充物。从HEK-297T和HeLa细胞中分离出人类白蛋白的基因组DNA。进行PCR反应以扩增8种不同大小的白蛋白DNA，即1313bp(SEQ ID NO:1831)、1384bp(SEQ ID NO:1832)、1785bp(SEQ ID NO：1833)、1856bp(SEQ ID NO:1835)、2264bp(SEQ ID NO:1840)、2266bp(SEQ ID NO：1841)和2335bp(SEQ ID NO:1842)。用在miR-122结合位点和3′ITR之间切割的一个限制性内切酶AvrII或切除含有miR-122结合位点的片段的两个限制性内切酶AvrII和BspEI消化这四个中间质粒。通过Gibson Assembly将8种白蛋白PCR产物与经酶消化的质粒连接，所述质粒具有或不具有miR-122结合位点。将连接产物转化到细菌细胞中，并使用标准的小规模制备实验方案纯化质粒。通过用XbaI/KpnI限制性消化，然后进行琼脂糖凝胶电泳，验证经纯化的质粒。
将具有基因组大小为4.6kb的最后8个构建体从反向末端重复(ITR)到ITR进行测序，以确认序列完整性。
实施例9.在HEK-293T细胞中hFXN蛋白的表达
将hFXN构建体转染到HEK-293T细胞中，并通过蛋白质印迹和ELISA评估hFXN蛋白表达。如前所述进行转染。GFP质粒用作内部对照。对于每个样品上样总共10μg蛋白质。蛋白质印迹检测到了三种形式的hFXN蛋白：前体、中间和成熟的hFXN。构建体hFXN4和hFXN5(SEQID NO:1799和1800)具有最强的hFXN表达，而hFXN2、hFXN3、hFXN6和hFXN7(SEQ ID NO:1797、1798、1801和1802)显示出有限的表达，hFXN8-hFXN9(SEQ ID NO:1803-1804)具有弱至不能检测的表达。
通过ELISA定量hFXN蛋白和GFP表达的量。在hFXN构建体中，hFXN4(SEQ ID NO:1799)和hFXN5(SEQ ID NO:1800)表现出最高的hFXN蛋白浓度，相对hFXN表达比其他高多于20倍。表23列出了HEK-293T细胞中的hFXN蛋白浓度和GFP表达。相对hFXN表达以hFXN/GFP比率计算，显示出与内源的hFXN对照相比的倍数变化。
表23.hFXN蛋白浓度
Figure BDA0003088012730002411
Figure BDA0003088012730002421
实施例10.体内启动子选择研究
将包含启动子的ITR到ITR序列包装到AAV6衣壳中，并通过纹状体内注射以1x1010VG的剂量递送给Sprague Dawley大鼠。在第3周或第10周收集组织样品，并定量共济蛋白的蛋白质水平。构建体cFXN2(SEQ ID NO:1779)、cFXN3(SEQ ID NO:1780)、cFXN4(SEQID NO：1781)、cFXN13(SEQ ID NO:1790)、cFXN14(SEQ ID NO:1791)、cFXN17(SEQ ID NO:1794)、cFXN18(SEQ ID NO:1795)、hFXN2(SEQ ID NO:1797)、hFXN4(SEQ ID NO:1799)、hFXN5(SEQ I DNO:1800)和hFXN6(SEQ ID NO:1801)用于这些研究。
基于共济蛋白表达的定量，选择与cFXN2相比展示3倍(hFXN4；SEQ ID NO:1799)、5倍(hFXN8；SEQ ID NO:1803)、8倍(hFXN2；SEQ ID NO:1797)和25倍(hFXN6；SEQ ID NO:1801)更弱表达的构建体用于进一步研究。
含有野生型CBA和CMV启动子的构建体(例如，cFXN1；SEQ ID NO:1778)用作对照。将病毒基因组包装到衣壳VOY201(SEQ ID NO:1724)中，并以6.3x1012或2x1013VG/kg的剂量通过静脉内递送施用于Sprague Dawley大鼠。28天或90天后，收集组织样品并进行处理，用于共济蛋白表达的定量(ng/mg)。
与其他构建体相比，启动子CMV-D7(SEQ ID NO:1750)和CBA-D8(SEQ ID NO:1742)表现出靶标中等的共济蛋白表达，因此选择用于进一步研究。
为测试由CMV-D7(SEQ ID NO:1750)和CBA-D8(SEQ ID NO:1742)启动子驱动的共济蛋白表达的耐久性和持久性，进行了时间进程研究。包含CMV-D7(SEQ ID NO:1750)、CBA-D8(SEQ ID NO:1742)、CBA(SEQ ID NO:1734)或CMV(SEQ ID NO:1743)启动子以及共济蛋白有效载荷序列的病毒基因组包装到VOY101(SEQ ID NO:1)衣壳中以产生AAV颗粒。这些AAV颗粒以两种剂量(6.3x1012或2x1013)中之一通过尾静脉静脉内递送施用于雄性SpragueDawley大鼠。施用后28、90或180天，收集组织样品(心脏、肝脏、小脑、胸部(thoracic)DRG和腰椎DRG)并处理，基于抗共济蛋白SimpleStep ELISA来定量每个二倍体细胞的载体基因组和共济蛋白表达水平。数据示于以下的表24和25、图1A、图1B、图1C和图1D。
表24.共济蛋白表达(ng/mg)
Figure BDA0003088012730002431
表25.载体基因组/二倍体细胞(VG/dc)
Figure BDA0003088012730002432
在从心室收集的组织中，使用CMV-D7(SEQ ID NO:1750)启动子驱动共济蛋白表达增强了共济蛋白表达0.2-2.5倍，而使用CBA-D8(SEQ ID NO:1742)启动子驱动共济蛋白表达增强了共济蛋白表达0.3-7.8倍。作为比较，与正常共济蛋白表达相比，CBA(SEQ ID NO:1734)启动子增强了共济蛋白表达41.2-70倍，而CMV(SEQ ID NO:1743)启动子增强了共济蛋白表达297倍。
在从小脑收集的组织中，使用CMV-D7(SEQ ID NO:1750)启动子驱动共济蛋白表达增强了共济蛋白表达0.01-0.31倍，而使用CBA-D8(SEQ ID NO:1742)启动子驱动共济蛋白表达增强了共济蛋白表达0.01-0.28倍。作为比较，与正常共济蛋白表达相比，CBA(SEQ IDNO:1734)启动子增强了共济蛋白表达0.0-0.9倍，而CMV(SEQ ID NO:1743)启动子增强了共济蛋白表达0.21倍。
在从腰椎DRG收集的组织中，使用CMV-D7(SEQ ID NO:1750)启动子驱动共济蛋白表达增强了共济蛋白表达1.6-6.2倍，而使用CBA-D8(SEQ ID NO:1742)启动子驱动共济蛋白表达增强了共济蛋白表达1.1-5.2倍。作为比较，与正常共济蛋白表达相比，CBA(SEQ IDNO：1734)启动子增强了共济蛋白表达0.0-5.4倍，而CMV(SEQ ID NO：1743)启动子增强了共济蛋白表达0.5倍。
对收集的AAV颗粒施用后28天的30μm组织样本进行免疫组织化学分析。使用了抗hFXN抗体(1/50,000)。在处理的大鼠的齿状核中检测到由CMV-D7(SEQ ID NO:1750)和CBA-D8(SEQ ID NO:1742)启动子驱动的共济蛋白表达。
CMV-D7(SEQ ID NO:1750)、CBA-D8(SEQ ID NO:1742)和CBA(SEQ ID NO:1734)启动子中的每一个在DRG和脑中均显示出相似的分布和表达模式。在心脏中，CMV-D7和CBA-D8启动子产生FXN表达比CBA驱动的共济蛋白表达低约50-260倍。
在施用AAV颗粒后180天，CMV-D7(SEQ ID NO:1750)和CBA-D8(SEQ ID NO：1742)启动子二者均驱动小脑、心脏和DRG中的共济蛋白表达。在此时间点，小脑中的表达比使用参考CBA启动子获得的表达高约3倍，表明CMV-D7和CBA-D8启动子在小脑的靶细胞中具有活性。
实施例11.在大鼠中纹状体内(intra-striatal)施用包含可选的启动子变体的病 毒基因组后体内cFXN表达水平。
为了测试由可选的启动子变异体驱动的共济蛋白表达，包含选自任意以下启动子中的一个启动子：CMV-D1(SEQ ID NO:1744)、CMV-D3(SEQ ID NO:1746)、CBA-D4(SEQ IDNO:1738)和CBA-D6(SEQ ID NO:1740)(如表3中所示)、AAV2野生型ITR、具有HA标签的食蟹猴共济蛋白(cynoFXN或cFXN)、miR-122靶标的三个重复和人类生长激素聚腺苷酸化序列的病毒基因组包装到AAV6衣壳中，并以1x1010VG/kg的剂量通过纹状体内注射递送至SpragueDawley大鼠，除非另有说明。作为对照，使用来自病毒基因组并包装到AAV6衣壳中的FXNpro534(SEQ ID NO：1754)、FXNpro1060(SEQ ID NO：1756)、CMV(SEQ ID NO：1743)、CBA(SEQ ID NO：1734)启动子或其变体来驱动cFXN表达。注射后3周收集组织样品，并通过ELISA定量纹状体cFXN蛋白水平。数据在以下表26和图2中显示。
表26.在大鼠中由可选的启动子驱动的体内cFXN表达(ng/mg)。
Figure BDA0003088012730002451
由FXNpro534(SEQ ID NO:1754)启动子驱动的纹状体cFXN表达与内源的共济蛋白水平相当，而FXNpro1060(SEQ ID NO：1756)启动子导致6.6x的内源的FXN水平。作为对照，分别通过CMV.miR122(24.4x)、CBA.miR122(34.7x)或CBA(86x)启动子实现高水平的cFXN表达。分别由CMV-D7(SEQ ID NO:1750)或CBA-D8(SEQ ID NO:1742)启动子驱动的中等表达水平的cFXN在1.4x和4.2x观察到，其在由两个FXN启动子变体驱动的那些范围内。可选的启动子变体CMV-D1(SEQ ID NO：1744)、CMV-D3(SEQ ID NO：1746)、CBA-D4(SEQ ID NO：1738)和CBA-D6(SEQ ID NO:1749)导致相比于CMV-D7(SEQ ID NO：1750)或CBA-D8(SEQ ID NO：1742)更高的cFXN表达，但仍比CMV.miR122低得多。总之，这些数据表明额外的启动子变体有效诱导大鼠纹状体中cFXN表达。
实施例12.在丘脑内(intrathalamic)施用VOY101-cFXN-HA AAV载体后，体内cFXN 表达和载体基因组生物分布
为实现在小脑深核(deep cerebellar nuclei)中cFXN的广泛表达以及在脊髓和背根神经节中相关的cFXN水平，通过双侧丘脑内注射将VOY101-cFXN-HA(SEQ ID NO:1778)载体施用于Sprague Dawley大鼠。
将包含CBA启动子和cFXN-HA序列的单链病毒基因组包装到VOY101颗粒中，并以5x1010vg/注射的剂量丘脑内注射。注射体积和注射速度分别为12μl/min和0.5μl/min。一只大鼠用媒介物对照处理。处理六周后，使用抗HA免疫染色法进行免疫组织化学分析，以评估在小脑的齿状核和脊髓中cFXN-HA的表达。与媒介物对照相比，在所有已处理的动物中，遍及小脑的整个齿状核均观察到强的HA染色。此外，广泛的cFXN表达在注射部位远端的颈部脊髓、胸部脊髓和腰脊髓的脊柱(dorsal column)、中央管(central canal)、腹角(ventralhorn)和克拉克氏柱(Clarke’s column)中是明显的。这些结果共同表明，丘脑内注射VOY101-CBA-cFXN载体可引起深层小脑核和脊髓神经元的有效转导，并驱动FXN蛋白的表达。
实施例13.用VOY101-CMV-D7-hFXN或VOY101-CBA-D8-hFXN AAV颗粒静脉内施用 Pvalb cKO小鼠后，hFXN的转基因表达水平
弗里德里希共济失调(Friedreich’s Ataxia)(FA)是由共济蛋白基因中基因内内在的(intronic)GAA扩展引起的，其显著降低了线粒体中FXN表达。弗里德里希共济失调早期的患者由于在外围背根神经节(DRG)中大的本体感觉神经元的丧失，显示出行走困难并失去平衡。随后，由于增加的脊髓小脑神经元损伤，躯干和手臂功能恶化。患者变为束缚于轮椅并失去行动能力(incapacitated)，导致降低的平均寿命约40岁。为了模拟FA中神经元丧失的选择性性质，产生了一种转基因小鼠，其中通过Cre Lox系统在小白蛋白(parvalbumin)表达细胞(Pvalb cKO小鼠)中去除了FXN表达(Piguet等人.2018)。PvalbcKO小鼠在出生后数周内显示出本体感觉功能丧失和进行性共济失调。
包含CMV-D7-hFXN(SEQ ID NO：1801)或CBA-D8-hFXN(SEQ ID NO：1797)的病毒基因组用于产生具有衣壳血清型VOY101(SEQ ID NO:1)的AAV颗粒。通过HEK293细胞的三重转染将包含启动子(CMV-D7或CBA-D8)、两个AAV2 ITR、hFXN、miR-122靶标的三个重复和人类生长激素聚腺苷酸化序列的病毒基因组包装到VOY101 AAV颗粒中。纯化AAV颗粒，并在具有0.001％F-68的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中配制，然后以2X1013VG/kg的剂量静脉内施用于小鼠。
为了测试静脉内施用了单链VOY101-CMV-D7-hFXN或VOY101-CBA-D8-hFXN AAV颗粒的Pvalb cKO动物中的hFXN表达水平，将颗粒以6.32×1012VG/kg或2.0x1013VG/kg的三剂剂量之一静脉内施用于7.5周龄的Pvalb cKO小鼠。以7.0×1012VG/kg用AAV9-hFXN颗粒静脉内处理一组Pvalb cKO小鼠。也用媒介物对照施用于WT或Pvalb cKO小鼠。
施用4周后，对11.5周龄的小鼠进行安乐死。收集小脑和腰椎DRG组织并进行处理，用于hFXN表达水平的定量。hFXN蛋白水平通过ELISA测量，并以ng hFXN/mg总蛋白表示。计算了相对于WT内源的FXN水平，小脑或腰椎DRG中hFXN表达的倍数变化。数据示于表27、图3A和图3B中。
表27.Pvalb cKO小鼠的小脑和腰椎DRG中的hFXN表达
Figure BDA0003088012730002481
在从腰椎DRG收集的组织中，在递送后4周与WT内源的FXN水平相比，在Pvalb cKO动物中静脉内施用VOY101-CMV-D7-hFXN(SEQ ID NO：1801)颗粒增强了2.8-6.4倍的hFXN表达。在递送后4周在Pvalb cKO动物中静脉内施用VOY101-CBA-D8-hFXN(SEQ ID NO:1797)颗粒增强了0.8-2.6倍的hFXN表达。
在从小脑收集的组织中，在递送后4周与WT内源的FXN水平相比，在Pvalb cKO动物中静脉内施用VOY101-CMV-D7-hFXN(SEQ ID NO:1801)颗粒增强了10.3-24.3倍的hFXN表达。在递送后4周与WT内源的FXN水平相比，在Pvalb cKO动物中静脉内施用VOY101-CBA-D8-hFXN(SEQ ID NO:1797)颗粒增强了6.4-18.8倍的hFXN表达。
总之，Pvalb cKO动物的小脑和腰椎DRG中的高hFXN表达水平表明VOY101-CMV-D7-hFXN(SEQ ID NO:1801)或VOY101-CBA-D8-hFXN(SEQ ID NO：1797)颗粒能够转导这些组织。
实施例14.在Pvalb cKO小鼠中静脉内施用VOY101-CMV-D7-hFXN或VOY101-CBA- D8-hFXN AAV颗粒后本体感觉缺陷(proprioceptive deficit)的校正以及运动功能和肌肉 功能的恢复。
为了评估VOY101-CMV-D7-hFXN(SEQ ID NO：1801)或VOY101-CBA-D8-hFXN(SEQ IDNO:1797)载体的治疗效果，以6.32×1012VG/kg或2.0x1013VG/kg的剂量在这些载体静脉内(IV)递送后，通过肌电图分析测试Pvalb cKO小鼠中本体感觉缺陷的恢复。
将单链VOY101-CMV-D7-hFXN(SEQ ID NO:1801)或VOY101-CBA-D8-hFXN(SEQ IDNO:1797)颗粒纯化并配制在具有0.001％普朗尼克酸(pluronic acid)(普朗尼克F-68)的192mM氯化钠、2.7mM氯化钾、2mM磷酸钾(一碱价的)和10mM磷酸钠(二碱价的)中，pH为7.4，并以6.32×1012VG/kg或2.0x1013VG/kg的单剂量通过静脉内注射施用于7.5周龄的成年Pvalb cKO小鼠。对照组以7x1012VG/kg的剂量接受静脉内注射AAV9-hFXN颗粒。
使用Natus UltraProS100仪器(Mag2Health，法国)进行肌电图分析。使用氯胺酮(ketamine)/甲苯噻嗪(xylazine)(130/13mg/kg)IP注射麻醉Pvalb cKO小鼠。在整个电生理评估中，将动物维持在37℃。坐骨神经刺激(0.1ms和8mA强度)后，在足底后爪肌肉(plantar hind paw muscle)中记录脊椎体感诱发的响应(H波)的潜伏期和幅度。根据Piguet等人，依据小鼠的年龄，从6.5周龄开始，进行肌电图分析，每周、两周或三周记录脊髓体感诱发的响应(H波)。
如图4所示，与WT小鼠相比，在6.5周龄的Pvalb cKO小鼠中H波强度显著降低。在注射后一周的8.5周龄的cKO小鼠中，H波水平不再可测量。相反，在给药一周内静脉内注射VOY101-CMV-D7-hFXN(SEQ ID NO：1801)或VOY101-CBA-D8-hFXN(SEQ ID NO：1797)颗粒几乎将H波强度完全恢复到与WT动物中看到的那些相当的水平，表明Pvalb cKO小鼠的本体感觉缺陷逆转。使用任一AAV颗粒以2.0x1013VG/kg的高剂量4周后，观察到完全恢复。
这些结果证明IV VOY101-CMV-D7-hFXN(SEQ ID NO:1801)或VOY-CBA-D8-hFXN(SEQ ID NO:1797)对脊髓体感诱发的响应的剂量依赖性作用，尤其是11.5周龄的小鼠中从6.32×1012VG/kg至2.00×1013VG/kg的IV剂量。
为了在静脉内递送VOY101-CMV-D7-hFXN(SEQ ID NO:1801)或VOY101-CBA-D8-hFXN(SEQ ID NO:1797)颗粒后测试Pvalb cKO动物中运动和肌肉功能的恢复，如前所述(Piguet等人.2018)，在7.5、8.5、9.5和11.5周龄的cKO动物中进行了缺口杆试验(上肢或下肢滑动-“跌落”得分数)。如上所述，通过IV注射将VOY101颗粒施用于cKO动物(7.5周龄)。
如图5所示，Pvalb cKO小鼠从7.5周到11.5周迅速形成共济失调。相反，以6.3x1012或2.0x1013VG/kg的剂量静脉内施用VOY101-CMV-D7-hFXN(SEQ ID NO:1801)或VOY101CBA-D8-hFXN(SEQ ID NO:1797)颗粒注射后1周后迅速逆转共济失调表型。处理后4周，在cKO动物中恢复作用仍持续。
实施例15.在非人类灵长类动物(NHP)中静脉内给药VOY101-CMV-D7或VOY101- CBA-D8-hFXN AAV颗粒后，体内hFXN表达和载体基因组生物分布
将包含两个AAV2 ITR、一个启动子(CMV-D7或CBA-D8)、hFXN cDNA序列、miR-122靶标的三个重复、人类生长激素polyA序列、作为填充物序列的人类白蛋白片段的单链病毒基因组包装到VOY101衣壳中，通过三重转染产生，纯化并配制到具有0.001％F-68的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。
使用LEC2 nAb体外测定法和IgG ELISA预先筛选低抗AAVVoy101抗体的大约2.7-5.8岁的三组成年食蟹猴(每组3只动物)，将以5x1013VG/kg(滴度1.0x1013VG/ml)的剂量通过静脉内注射接受媒介物(具有0.001％F-的PBS 68)、VOY101-CMV-D7-hFXN(SEQ ID NO：1801)或VOY101-CBA-D8-hFXN(SEQ ID NO：1797)。注射速度将为3ml/min，剂量体积将为5mL/kg(～17.5mL/动物)。
为了测试VOY101-CMV-D7-hFXN(SEQ ID NO:1801)或VOY101-CBA-D8-hFXN(SEQ IDNO:1797)在NHP中的分布和表达，可以使用本领域已知的任何测试。hFXN蛋白和mRNA表达将通过ELISA、PCR、免疫组织化学、原位杂交(ISH)和液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)进行评估。不同组织中的载体基因组水平将使用PCR和ISH进行定量。
可以收集以下样本：颈部DRG、胸部DRG和/或腰椎DRG、颈部脊髓、胸部脊髓和/或腰椎脊髓、额叶皮层、运动皮层、海马、纹状体、小脑、脑干、肝脏、心脏、心房、心室。使用ELISA和LC-MS和数字微滴式PCR(digital droplet PCR)，DRG、心室、下腰椎脊髓、上腰椎脊髓、额叶皮层、小脑和肝脏的组织将用于来确定靶组织中的hFXN表达，以定量载体基因组/二倍体细胞。将通过原位杂交(ISH)测量在DRG、小脑齿状核、克拉克氏柱、薄束核(gracilenuclei)和楔束核(cuneate nuclei)和心脏的细胞中hFXN的表达和分布。所得数据将用于确认非人类灵长类动物中VOY101-CMV-D7-hFXN(SEQ ID NO:1801)或VOY101-CBA-D8-hFXN(SEQ ID NO：1797)AAV颗粒的预期组织生物分布和转基因hFXN表达。
实施例16.在非人类灵长类动物(NHP)中的体内启动子选择研究
具有包含启动子变体序列的病毒基因组的选定的AAV颗粒将在非人类灵长类动物中进行测试，以确定在靶细胞和组织中的共济蛋白表达。将使用选自表4的hFXN ITR-到-ITR构建体，包括hFXN2(SEQ ID NO：1797)、hFXN3(SEQ ID NO：1798)、hFXN6(SEQ ID NO：1801)、hFXN7(SEQ ID NO：1802)、hFXN13(SEQ ID NO：1808)和hFXN14(SEQ ID NO：1809)。
VOY101衣壳中包括选择的hFXN ITR-到-ITR构建体的AAV颗粒将通过使用根据本公开的哺乳动物HEK293细胞通过三重转染产生。将纯化所得的AAV颗粒，然后将其配制到制剂1(具有0.001％普朗尼克酸(普朗尼克F-68)的192mM氯化钠、2.7mM氯化钾、2mM磷酸钾(一碱价的)和10mM磷酸钠(二碱价的)，pH为7.4)中。
将为待测试的每个hFXN ITR-到-ITR构建体选择一组幼年(juvenile)食蟹猴(中国血统，使用Nab测定法预筛选低抗AAVVoy101抗体)(每组两只雌性和一只雄性)。食蟹猴将根据表28的测试参数通过静脉内注射(隐静脉(saphenous))接受AAV颗粒。
表28.用于测试hFXN启动子变体的研究设计
Figure BDA0003088012730002521
所选hFXN构建体的最终分布和表达将在各种组织中进行测试，包括以下一种或多种：颈部DRG、胸部DRG、腰椎DRG、颈部脊髓、胸部脊髓、腰椎脊髓、额叶皮层、运动皮层、海马、纹状体、小脑、脑干、肝脏、心脏、心房、心室。
将从测试受试者中测量并收集以下主要读数：全血细胞计数(CBC)、血清化学、血清细胞因子蛋白、笼侧观察(cage-side observation)、体重、AAV载体基因组(VG)分布、hFXN蛋白分布和hFXN蛋白表达。这些主要读数将根据本领域已知的各种方法进行测试和测量，包括ELISA、PCR、免疫组织化学、原位杂交(ISH)和液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)。
实施例17.测试具有可选的衣壳的启动子构建体
包含来自表4的选择启动子变体构建体的病毒基因组(例如，hFXN2；SEQ ID NO：1797,hFXN6；SEQ ID NO：1801)将被掺入具有选自表1的可选的衣壳的AAV颗粒中。对于VP1翻译这些衣壳可以具有次佳或非规范起始密码子，诸如但不限于CTG。通过经由尾静脉静脉内注射，此类AAV颗粒将用于递送共济蛋白至小鼠中的靶细胞。将对23只雄性C57BL/6J小鼠给予2x1013VG/kg剂量的AAV颗粒组合物。递送后第十四天，小鼠将用冷的1x PBS进行常规灌注(transcardiac perfusion)，并收集组织样品。
将收集任何或所有以下组织样品。颈部DRG、胸部DRG和/或腰椎DRG、颈部脊髓、胸部脊髓和/或腰椎脊髓、额叶皮层、运动皮层、海马、纹状体、小脑、脑干、肝脏、心脏、心房、心室和/或腓肠肌。腰椎DRG、心室、下腰椎脊髓、额叶皮层和小脑的组织将用于ELISA，以确定靶标组织中的共济蛋白表达。胸部DRG、心室、上腰椎脊髓、额叶皮层、小脑和/或肝脏将用于数字微滴式PCR以定量载体基因组/二倍体细胞。所得数据将用于确认预期的组织生物分布和转导。
预期与VOY101、VOY201和/或AAV9或其变体相比，可选的衣壳的使用将导致相似的生物分布和转导(如果不是更好的生物分布和转导)。
实施例18.在大鼠中的体内启动子选择研究
在大鼠中测试了具有包含启动子变体序列的病毒基因组的选定AAV颗粒，以确定靶标细胞和组织中共济蛋白的表达。使用了选自表4的以下hFXN ITR-到-ITR构建体：hFXN2(SEQ ID NO:1797)、hFXN10(SEQ ID NO:1805)、hFXN11(SEQ ID NO:1806)、hFXN12(SEQ IDNO:1807)、hFXN13(SEQ ID NO:1808)、hFXN14(SEQ ID NO:1809)和hFXN15(SEQ ID NO:1810)。通过使用根据本公开的哺乳动物HEK293细胞的三重转染，产生了在VOY101衣壳中包括选择的hFXN ITR-到-ITR构建体的AAV颗粒。纯化所得的AAV颗粒，然后配制到具有0.001％普朗尼克酸(普朗尼克F-68)的192mM氯化钠、2.7mM氯化钾和10mM磷酸钠(二碱价的)，含0.001％的丙酮酸(Pluronic F-68)，pH为7.4中。
通过尾静脉静脉内递送施用AAV颗粒至雄性Sprague Dawley大鼠(每组5只)，剂量为以下两种剂量之一：6.3x1012vg/kg或2x1013vg/kg(5ml/kg以上1hour)。施用后第28天，收集组织样品(心室和DRG)，并根据抗-共济蛋白SimpleStep ELISA分析共济蛋白表达水平。数据示于图6A、图6B、图6C和图6D。
与hFXN10、hFXN11、hFXN12和hFXN15相比，在DRG和心室组织两者中具有低表达水平的hFXN13(CBA.D4)、hFXN14(CBA.D6)和hFXN2(CBA.D8)在6.3x1012vg/kg或2x1013vg/kg下是具有良好的耐受性的。
实施例19.启动子变体的体外评估
在HEK293细胞中评估了包括hFXN2(SEQ ID NO：1797)、hFXN6(SEQ ID NO:1801)、hFXN10(SEQ ID NO:1805)、hFXN11(SEQ ID NO:1806)、hFXN12(SEQ ID NO:1807)、hFXN13(SEQ ID NO:1808)和hFXN14(SEQ ID NO:1809)的七个启动子变体构建体的体外表达活性。CMV和CBA启动子构建体用作对照。用包含hFXN构建体或对照之一和荧光素酶有效负载的质粒转染细胞。使用萤光素酶测定系统确定萤光素酶的活性和表达。239T细胞用作阴性对照。
通过荧光素酶表达确定的启动子变体的活性在图7中示出。
X.等同物和范围
仅使用常规实验，本领域技术人员将认识到或能够确定根据本文描述的公开内容的特定实施方案的许多等同方案。本公开的范围不旨在限于以上描述，而是如所附权利要求书中所述。
在权利要求中，诸如“一个(a)”，“一种(an)”和“该(the)”的冠词可以表示一个或多个，除非从上下文中相反地指出或另外看出。如果在给定的产品或过程中存在、采用或以其他方式与之相关的一个、多个或所有组成员，则包括在组中一个或多个成员之间的“或”的要求或描述将被认为是满足需要的，除非从上下文中相反地指出或另外看出。本公开内容包括实施方案，其中恰好该组的一个成员存在于、采用或以其他方式与给定的产品或过程有关。本公开包括这样的实施方案，其中一个以上或整个组成员存在于、采用或以其他方式与给定的产品或过程有关。
还应注意，术语“包含”旨在是开放的，并且允许但不要求包括额外的元件或步骤。当本文中使用术语“包含”时，因此也涵盖和公开了术语“由...组成”。
在给出范围的地方，包括端点。此外，应理解，除非另外指出或从上下文和本领域普通技术人员的理解中显而易见，否则在本公开的不同实施方案中，表示为范围的值可以假定为所述范围内的任何特定值或子范围，除非上下文另有明确规定，否则不得超过范围下限的十分之一单位。
另外，应当理解，落入现有技术范围内的本公开的任何特定实施例可以明确地从权利要求中的任何一项或多项中排除。由于此类实施例被认为是本领域普通技术人员已知的，因此即使在此未明确提出排除，也可以将其排除。出于任何原因，不论与现有技术的存在是否有关的本公开的组合物的任何特定实施方案(例如，任何抗生素、治疗或活性成分；任何生产方法；任何使用方法；等等)都可以从任何一项或多项权利要求中排除。
应当理解，已经使用的词语是描述性的词语而不是限制性的，并且可以在所附权利要求的范围内进行改变，而在其更广泛的方面不脱离本公开的真实范围和精神。
相对于几个所描述的实施方案，尽管已经以一定长度和以某种特性描述了本公开，但是并不意图将本公开限于任何此类细节或实施方案或任何特定的实施方案，而是应参照所附权利要求来解释，以便鉴于现有技术提供对此类权利要求最广泛的可能解释，并因此有效地涵盖了本公开的预期范围。

Claims (171)

1.腺相关病毒(AAV)载体基因组，其包含：5'反向末端重复(ITR)、经工程化改造的启动子、有效载荷区(payload region)和3'ITR；其中所述有效载荷区编码共济蛋白(frataxin)(FXN)。
2.权利要求1的AAV载体基因组，其中所述经工程化改造的启动子源自选自以下一种或多种的启动子：巨细胞病毒(CMV)启动子、鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子和FXN启动子。
3.权利要求1的AAV载体基因组，其中所述经工程化改造的启动子源自CMV启动子。
4.权利要求1的AAV载体基因组，其中所述经工程化改造的启动子源自CBA启动子。
5.权利要求1的AAV载体基因组，其中所述经工程化改造的启动子源自FXN启动子。
6.权利要求1-5中任一项的AAV载体基因组，其中所述经工程化改造的启动子包含与选自SEQ ID NO:1734-1777的序列具有至少90％序列同一性的序列。
7.权利要求1-5中任一项的AAV载体基因组，其中所述经工程化改造的启动子包含与选自SEQ ID NO：1734-1777的序列具有至少95％序列同一性的序列。
8.权利要求1-5中任一项的AAV载体基因组，其中所述经工程化改造的启动子包含与选自SEQ ID NO:1734-1777的序列具有至少99％序列同一性的序列。
9.权利要求1的AAV载体基因组，其中所述经工程化改造的启动子包含选自SEQ ID NO:1734-1777的序列。
10.权利要求1的AAV载体基因组，其中所述经工程化改造的启动子源自CMV启动子，并且其中所述经工程化改造的启动子的长度为50-700个核苷酸。
11.权利要求10的AAV载体基因组，其中所述经工程化改造的启动子的长度为109个核苷酸。
12.权利要求1的AAV载体基因组，其中所述经工程化改造的启动子包含选自SEQ IDNO:1743-1751、1767和1772-1774的序列。
13.权利要求1的AAV载体基因组，其中所述经工程化改造的启动子包含SEQ ID NO:1777。
14.权利要求1的AAV载体基因组，其中所述经工程化改造的启动子包含与SEQ ID NO:1750具有至少90％序列同一性的序列。
15.权利要求1的AAV载体基因组，其中所述经工程化改造的启动子包含与SEQ ID NO:1750具有至少95％序列同一性的序列。
16.权利要求1的AAV载体基因组，其中所述经工程化改造的启动子包含与SEQ ID NO:1750具有至少99％序列同一性的序列。
17.权利要求1的AAV载体基因组，其中所述经工程化改造的启动子包含SEQ ID NO:1750。
18.权利要求1的AAV载体基因组，其中所述经工程化改造的启动子由SEQ ID NO：1750组成。
19.权利要求1的AAV载体基因组，其中所述经工程化改造的启动子源自CBA启动子，并且其中所述经工程化改造的启动子的长度为100-700个核苷酸。
20.权利要求19的AAV载体基因组，其中所述经工程化改造的启动子的长度为100-400个核苷酸，任选地长度为约100个核苷酸。
21.权利要求19的AAV载体基因组，其中所述经工程化改造的启动子的长度为200-350个核苷酸，任选地长度为约260个核苷酸。
22.权利要求19的AAV载体基因组，其中所述经工程化改造的启动子的长度为约332个核苷酸。
23.权利要求1的AAV载体基因组，其中所述经工程化改造的启动子包含选自SEQ IDNO:1734-1742、1760-1766、1768和1775-1776的序列。
24.权利要求1的AAV载体基因组，其中所述经工程化改造的启动子包含与SEQ ID NO:1738具有至少90％序列同一性的序列。
25.权利要求1的AAV载体基因组，其中所述经工程化改造的启动子包含与SEQ ID NO：1738具有至少95％序列同一性的序列。
26.权利要求1的AAV载体基因组，其中所述经工程化改造的启动子包含与SEQ ID NO:1738具有至少99％序列同一性的序列。
27.权利要求1的AAV载体基因组，其中所述经工程化改造的启动子包含SEQ ID NO:1738。
28.权利要求1的AAV载体基因组，其中所述经工程化改造的启动子由SEQ ID NO:1738组成。
29.权利要求1的AAV载体基因组，其中所述经工程化改造的启动子包含与SEQ ID NO:1740具有至少90％序列同一性的序列。
30.权利要求1的AAV载体基因组，其中所述经工程化改造的启动子包含与SEQ ID NO:1740具有至少95％序列同一性的序列。
31.权利要求1的AAV载体基因组，其中所述经工程化改造的启动子包含与SEQ ID NO:1740具有至少99％序列同一性的序列。
32.权利要求1的AAV载体基因组，其中所述经工程化改造的启动子包含SEQ ID NO:1740。
33.权利要求1的AAV载体基因组，其中所述经工程化改造的启动子由SEQ ID NO：1740组成。
34.权利要求1的AAV载体基因组，其中所述经工程化改造的启动子包含与SEQ ID NO:1742具有至少90％序列同一性的序列。
35.权利要求1的AAV载体基因组，其中所述经工程化改造的启动子包含与SEQ ID NO:1742具有至少95％序列同一性的序列。
36.权利要求1的AAV载体基因组，其中所述经工程化改造的启动子包含与SEQ ID NO：1742具有至少99％序列同一性的序列。
37.权利要求1的AAV载体基因组，其中所述经工程化改造的启动子包含SEQ ID NO:1742。
38.权利要求1的AAV载体基因组，其中所述经工程化改造的启动子由SEQ ID NO：1742组成。
39.权利要求1的AAV载体基因组，其中所述经工程化改造的启动子源自FXN启动子，并且其中所述经工程化改造的启动子的长度为200-1400个核苷酸。
40.权利要求39的AAV载体基因组，其中所述经工程化改造的启动子的长度为950-1150个核苷酸，任选地长度为约1060个核苷酸。
41.权利要求1的AAV载体基因组，其中所述经工程化改造的启动子包含选自SEQ IDNO：1752-1759和1769-1770的序列。
42.权利要求1的AAV载体基因组，其中所述经工程化改造的启动子包含与SEQ ID NO:1756具有至少90％序列同一性的序列。
43.权利要求1的AAV载体基因组，其中所述经工程化改造的启动子包含与SEQ ID NO:1756具有至少95％序列同一性的序列。
44.权利要求1的AAV载体基因组，其中所述经工程化改造的启动子包含与SEQ ID NO:1756具有至少99％序列同一性的序列。
45.权利要求1的AAV载体基因组，其中所述经工程化改造的启动子包含SEQ ID NO:1756。
46.权利要求1的AAV载体基因组，其中所述经工程化改造的启动子由SEQ ID NO:1756组成。
47.权利要求1-46中任一项的AAV载体基因组，其中所述共济蛋白是人类(智人)共济蛋白。
48.权利要求47的AAV载体基因组，其中所述共济蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO：1725、1726或1727具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％序列同一性。
49.权利要求47的AAV载体基因组，其中所述共济蛋白的氨基酸序列选自SEQ ID NO:1725、1726和1727。
50.权利要求47的AAV载体基因组，其中所述共济蛋白的氨基酸序列包含SEQ ID NO:1725。
51.权利要求47的AAV载体基因组，其中编码所述共济蛋白的核酸序列与SEQ ID NO:1728、1729或1730，或其片段具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％序列同一性。
52.权利要求47的AAV载体基因组，其中编码所述共济蛋白的核酸序列选自SEQ ID NO:1728、1729和1730，或其片段。
53.权利要求47的AAV载体基因组，其中编码所述共济蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO：1728或其片段。
54.权利要求47的AAV载体基因组，其中编码所述共济蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO：1728的核酸221-853或由其组成。
55.权利要求47的AAV载体基因组，其中编码所述共济蛋白的核酸序列与SEQ ID NO:1823或1824具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％序列同一性。
56.权利要求47的AAV载体基因组，其中编码所述共济蛋白的核酸序列选自SEQ ID NO:1823或1824。
57.权利要求47的AAV载体基因组，其中编码所述共济蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:1823。
58.权利要求47的AAV载体基因组，其中编码所述共济蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:1824。
59.权利要求1-46中任一项的AAV载体基因组，其中所述共济蛋白是猕猴(cynomolgus)(食蟹猴(Macaca fascicularis))共济蛋白。
60.权利要求1-46中任一项的AAV载体基因组，其中所述共济蛋白是普通猕猴(rhesusmacaque)(恒河猴(Macaca mulatta))共济蛋白。
61.权利要求59-60中任一项的AAV载体基因组，其中所述共济蛋白至少部分地人源化。
62.权利要求55-57中任一项的AAV载体基因组，其中所述共济蛋白的氨基酸序列与SEQID NO:1731、1732或1733至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同。
63.权利要求55-56中任一项的AAV载体基因组，其中所述共济蛋白的氨基酸序列包含SEQ ID NO:1731、1732或1733。
64.权利要求1-63中任一项的AAV载体基因组，其中所述5'ITR是AAV2 ITR。
65.权利要求1-64中任一项的AAV载体基因组，其中所述5′ITR的长度为141个核苷酸。
66.权利要求1-65中任一项的AAV载体基因组，其中所述3′ITR是AAV2 ITR。
67.权利要求1-66中任一项的AAV载体基因组，其中所述3′ITR的长度为141个核苷酸。
68.权利要求1-67中任一项的AAV载体基因组，其中所述5′ITR包含与SEQ ID NO:1811具有至少95％序列同一性的序列。
69.权利要求1-68中任一项的AAV载体基因组，其中所述3′ITR包含与SEQ ID NO:1812具有至少95％序列同一性的序列。
70.权利要求1-69中任一项的AAV载体基因组，其中所述AAV载体基因组包含以下组分中的一种或多种(例如全部)：内含子(例如，包含增强子或由增强子组成)、microRNA(miR)结合位点、聚腺苷酸化(polyA)序列或填充物序列(filler sequence)。
71.权利要求70的AAV载体基因组，其中所述内含子包含选自SEQ ID NO:1815-1821的序列。
72.权利要求70的AAV载体基因组，其中所述内含子包含与SEQ ID NO:1816具有至少90％序列同一性的序列。
73.权利要求70的AAV载体基因组，其中所述内含子包含与SEQ ID NO:1816具有至少95％序列同一性的序列。
74.权利要求70的AAV载体基因组，其中所述内含子包含与SEQ ID NO:1816具有至少99％序列同一性的序列。
75.权利要求70的AAV载体基因组，其中所述内含子包含SEQ ID NO:1816。
76.权利要求70的AAV载体基因组，其中所述内含子由SEQ ID NO:1816组成。
77.权利要求70的AAV载体基因组，其中所述microRNA(miR)结合位点包含与SEQ IDNO:1827具有至少90％序列同一性的序列。
78.权利要求70的AAV载体基因组，其中所述microRNA(miR)结合位点包含与SEQ IDNO:1827具有至少95％序列同一性的序列。
79.权利要求70的AAV载体基因组，其中所述microRNA(miR)结合位点包含与SEQ IDNO:1827具有至少99％序列同一性的序列。
80.权利要求70的AAV载体基因组，其中所述microRNA(miR)结合位点包含SEQ ID NO:1827。
81.权利要求70的AAV载体基因组，其中所述microRNA(miR)结合位点由SEQ ID NO:1827组成。
82.权利要求70的AAV载体基因组，其中所述AAV载体基因组包含miR结合位点(miR结合位点系列)的三个拷贝。
83.权利要求82的AAV载体基因组，其中所述miR结合位点系列包含与SEQ ID NO:1826具有至少90％序列同一性的序列。
84.权利要求82的AAV载体基因组，其中所述miR结合位点系列包含与SEQ ID NO:1826具有至少95％序列同一性的序列。
85.权利要求82的AAV载体基因组，其中所述miR结合位点系列包含与SEQ ID NO:1826具有至少99％序列同一性的序列。
86.权利要求82的AAV载体基因组，其中所述miR结合位点系列包含SEQ ID NO:1826。
87.权利要求82的AAV载体基因组，其中所述miR结合位点系列由SEQ ID NO:1826组成。
88.权利要求70的AAV载体基因组，其中所述聚腺苷酸化序列包含与SEQ ID NO:1828具有至少90％序列同一性的序列。
89.权利要求70的AAV载体基因组，其中所述聚腺苷酸化序列包含与SEQ ID NO:1828具有至少95％序列同一性的序列。
90.权利要求70的AAV载体基因组，其中所述聚腺苷酸化序列包含与SEQ ID NO:1828具有至少99％序列同一性的序列。
91.权利要求70的AAV载体基因组，其中所述聚腺苷酸化序列包含SEQ ID NO:1828。
92.权利要求70的AAV载体基因组，其中所述聚腺苷酸化序列由SEQ ID NO:1828组成。
93.权利要求70的AAV载体基因组，其中所述填充物包含选自SEQ ID NO:1829-1842的序列。
94.权利要求93的AAV载体基因组，其中所述填充物包含与SEQ ID NO：1838具有至少90％序列同一性的序列。
95.权利要求93的AAV载体基因组，其中所述填充物包含与SEQ ID NO:1838具有至少95％序列同一性的序列。
96.权利要求93的AAV载体基因组，其中所述填充物包含与SEQ ID NO：1838具有至少99％序列同一性的序列。
97.权利要求93的AAV载体基因组，其中所述填充物包含SEQ ID NO：1838。
98.权利要求93的AAV载体基因组，其中所述填充物由SEQ ID NO:1838组成。
99.权利要求93的AAV载体基因组，其中所述填充物包含与SEQ ID NO:1839具有至少90％序列同一性的序列。
100.权利要求93的AAV载体基因组，其中所述填充物包含与SEQ ID NO:1839具有至少95％序列同一性的序列。
101.权利要求93的AAV载体基因组，其中所述填充物包含与SEQ ID NO:1839具有至少99％序列同一性的序列。
102.权利要求93的AAV载体基因组，其中所述填充物包含SEQ ID NO:1839。
103.权利要求93的AAV载体基因组，其中所述填充物由SEQ ID NO:1839组成。
104.权利要求93的AAV载体基因组，其中所述填充物包含与SEQ ID NO:1840具有至少90％序列同一性的序列。
105.权利要求93的AAV载体基因组，其中所述填充物包含与SEQ ID NO:1840具有至少95％序列同一性的序列。
106.权利要求93的AAV载体基因组，其中所述填充物包含与SEQ ID NO:1840具有至少99％序列同一性的序列。
107.权利要求93的AAV载体基因组，其中所述填充物包含SEQ ID NO:1840。
108.权利要求93的AAV载体基因组，其中所述填充物由SEQ ID NO:1840组成。
109.权利要求93的AAV载体基因组，其中所述填充物包含与SEQ ID NO:1841具有至少90％序列同一性的序列。
110.权利要求93的AAV载体基因组，其中所述填充物包含与SEQ ID NO:1841具有至少95％序列同一性的序列。
111.权利要求93的AAV载体基因组，其中所述填充物包含与SEQ ID NO:1841具有至少99％序列同一性的序列。
112.权利要求93的AAV载体基因组，其中所述填充物包含SEQ ID NO:1841。
113.权利要求93的AAV载体基因组，其中所述填充物由SEQ ID NO:1841组成。
114.权利要求1的AAV载体基因组，其中所述AAV载体基因组包含与选自SEQ ID NO:1778-1810的序列具有至少80％序列同一性的序列。
115.权利要求1的AAV载体基因组，其中所述AAV载体基因组包含与选自SEQ ID NO:1778-1810的序列具有至少85％序列同一性的序列。
116.权利要求1的AAV载体基因组，其中所述AAV载体基因组包含与选自SEQ ID NO:1778-1810的序列具有至少90％序列同一性的序列。
117.权利要求1的AAV载体基因组，其中所述AAV载体基因组包含与选自SEQ ID NO:1778-1810的序列具有至少95％序列同一性的序列。
118.权利要求1的AAV载体基因组，其中所述AAV载体基因组包含与选自SEQ ID NO:1778-1810的序列具有至少99％序列同一性的序列。
119.权利要求1的AAV载体基因组，其中所述AAV载体基因组包含选自SEQ ID NO:1778-1810的序列。
120.权利要求1的AAV载体基因组，其中所述AAV载体基因组包含选自SEQ ID NO:1778-1795的序列。
121.权利要求1的AAV载体基因组，其中所述AAV载体基因组包含选自SEQ ID NO:1796-1810的序列。
122.权利要求1的AAV载体基因组，其中所述AAV载体基因组包含与SEQ ID NO:1797具有至少90％序列同一性的序列。
123.权利要求1的AAV载体基因组，其中所述AAV载体基因组包含与SEQ ID NO:1797具有至少95％序列同一性的序列。
124.权利要求1的AAV载体基因组，其中所述AAV载体基因组包含与SEQ ID NO:1797具有至少99％序列同一性的序列。
125.权利要求1的AAV载体基因组，其中所述AAV载体基因组包含SEQ ID NO：1797。
126.权利要求1的AAV载体基因组，其中所述AAV载体基因组由SEQ ID NO：1797组成。
127.权利要求1的AAV载体基因组，其中所述AAV载体基因组包含与SEQ ID NO：1801具有至少90％序列同一性的序列。
128.权利要求1的AAV载体基因组，其中所述AAV载体基因组包含与SEQ ID NO:1801具有至少95％序列同一性的序列。
129.权利要求1的AAV载体基因组，其中所述AAV载体基因组包含与SEQ ID NO:1801具有至少99％序列同一性的序列。
130.权利要求1的AAV载体基因组，其中所述AAV载体基因组包含SEQ ID NO:1801。
131.权利要求1的AAV载体基因组，其中所述AAV载体基因组由SEQ ID NO:1801组成。
132.权利要求1的AAV载体基因组，其中所述AAV载体基因组包含与SEQ ID NO:1808具有至少90％序列同一性的序列。
133.权利要求1的AAV载体基因组，其中所述AAV载体基因组包含与SEQ ID NO:1808具有至少95％序列同一性的序列。
134.权利要求1的AAV载体基因组，其中所述AAV载体基因组包含与SEQ ID NO:1808具有至少99％序列同一性的序列。
135.权利要求1的AAV载体基因组，其中所述AAV载体基因组包含SEQ ID NO:1808。
136.权利要求1的AAV载体基因组，其中所述AAV载体基因组由SEQ ID NO:1808组成。
137.权利要求1的AAV载体基因组，其中所述AAV载体基因组包含与SEQ ID NO:1809具有至少90％序列同一性的序列。
138.权利要求1的AAV载体基因组，其中所述AAV载体基因组包含与SEQ ID NO:1809具有至少95％序列同一性的序列。
139.权利要求1的AAV载体基因组，其中所述AAV载体基因组包含与SEQ ID NO:1809具有至少99％序列同一性的序列。
140.权利要求1的AAV载体基因组，其中所述AAV载体基因组包含SEQ ID NO：1809。
141.权利要求1的AAV载体基因组，其中所述AAV载体基因组由SEQ ID NO:1809组成。
142.AAV颗粒，其包含权利要求1-141中任一项的AAV载体基因组和衣壳。
143.权利要求142的AAV颗粒，其中所述衣壳包括氨基酸序列，所述氨基酸序列包含选自SEQ ID NO：1-1724的序列或由选自SEQ ID NO：1-1724的序列编码。
144.权利要求142的AAV颗粒，其中所述衣壳含有包括SEQ ID NO：136的氨基酸序列。
145.权利要求142的AAV颗粒，其中所述衣壳含有由包括SEQ ID NO:135的核酸序列编码的氨基酸序列。
146.权利要求142的AAV颗粒，其中所述衣壳含有包括SEQ ID NO：9的氨基酸序列。
147.权利要求142的AAV颗粒，其中所述衣壳含有包括SEQ ID NO：3的氨基酸序列。
148.权利要求142的AAV颗粒，其中所述衣壳含有由包括SEQ ID NO：4的核酸序列编码的氨基酸序列。
149.权利要求142的AAV颗粒，其中所述衣壳含有包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
150.权利要求142的AAV颗粒，其中所述衣壳含有包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
151.权利要求142的AAV颗粒，其中所述衣壳含有由包括SEQ ID NO：1722的核酸序列编码的氨基酸序列。
152.权利要求142的AAV颗粒，其中所述衣壳含有包括SEQ ID NO：1724的氨基酸序列。
153.权利要求142的AAV颗粒，其中所述衣壳含有由包括SEQ ID NO：1723的核酸序列编码的氨基酸序列。
154.药物组合物，其包含权利要求142-153中任一项的AAV颗粒。
155.权利要求154的药物组合物，其中所述药物组合物包含氯化钠、磷酸钠、氯化钾、磷酸钾和泊洛沙姆188(poloxamer 188)。
156.权利要求154的药物组合物，其中所述药物组合物包含192mM氯化钠、10mM磷酸钠、2.7mM氯化钾、2mM磷酸钾和0.001％泊洛沙姆188(v/v)。
157.权利要求155-156中任一项的药物组合物，其中所述磷酸钠是二碱价的(dibasic)，并且其中所述磷酸钾是一碱价的(monobasic)。
158.权利要求155-157中任一项的药物组合物，其中所述组合物的pH在7.3-7.7之间。
159.权利要求155-157中任一项的药物组合物，其中所述组合物的pH为7.4。
160.AAV颗粒，其包含AAV载体基因组和衣壳；其中所述AAV载体基因组包含SEQ ID NO：1797；并且其中所述衣壳为VOY 101。
161.药物组合物，其包含权利要求160的AAV颗粒，其中所述药物组合物包含氯化钠、磷酸钠、氯化钾、磷酸钾和泊洛沙姆188；任选地，其中所述药物组合物包含192mM氯化钠、10mM磷酸钠、2.7mM氯化钾、2mM磷酸钾和0.001％泊洛沙姆188(v/v)，并且其中所述组合物的pH为7.4。
162.AAV颗粒，其包含AAV载体基因组和衣壳；其中所述AAV载体基因组包含SEQ ID NO:1801；并且其中所述衣壳为VOY 101。
163.药物组合物，其包含权利要求162的AAV颗粒，其中所述药物组合物包含氯化钠、磷酸钠、氯化钾、磷酸钾和泊洛沙姆188；任选地，其中所述药物组合物包含192mM氯化钠、10mM磷酸钠、2.7mM氯化钾、2mM磷酸钾和0.001％泊洛沙姆188(v/v)，并且其中所述组合物的pH为7.4。
164.AAV颗粒，其包含AAV载体基因组和衣壳；其中所述AAV载体基因组包含SEQ ID NO:1808；并且其中所述衣壳为VOY 101。
165.药物组合物，其包含权利要求164的AAV颗粒，其中所述药物组合物包含氯化钠、磷酸钠、氯化钾、磷酸钾和泊洛沙姆188；任选地，其中所述药物组合物包含192mM氯化钠、10mM磷酸钠、2.7mM氯化钾、2mM磷酸钾和0.001％泊洛沙姆188(v/v)，并且其中所述组合物的pH为7.4。
166.AAV颗粒，其包含AAV载体基因组和衣壳；其中所述AAV载体基因组包含SEQ ID NO:1809；并且其中所述衣壳为VOY 101。
167.药物组合物，其包含权利要求166的AAV颗粒，其中所述药物组合物包含氯化钠、磷酸钠、氯化钾、磷酸钾和泊洛沙姆188；任选地，其中所述药物组合物包含192mM氯化钠、10mM磷酸钠、2.7mM氯化钾、2mM磷酸钾和0.001％泊洛沙姆188(v/v)，并且其中所述组合物的pH为7.4。
168.治疗神经性或神经肌肉病症的方法，所述方法包括向受试者施用权利要求154-159、161、163、165或167中任一项的药物组合物。
169.权利要求168的方法，其中所述神经性或神经肌肉病症是弗里德里希氏共济失调(Friedreich’s Ataxia)。
170.权利要求168的方法，其中所述神经性或神经肌肉病症是与共济蛋白水平降低相关的病症。
171.权利要求168-170中任一项的方法，其中与未患与共济蛋白水平降低相关的病症的受试者中等同的靶细胞中共济蛋白表达相比，所述药物组合物的施用导致所述受试者的靶细胞中的共济蛋白表达增加0.5倍-3.0倍(0.5x-3.0x)。
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