CN117624311A - 可提高aav病毒神经靶向性的衣壳蛋白突变体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了可提高AAV病毒神经靶向性的衣壳蛋白突变体及其应用。通过TDGNLANPFK、SEGTLAQPFK、SAGTIAQPFK或QAGTLQQPFK替换使用将野生型AAV9病毒衣壳蛋白的586‑588位氨基酸，得到的衣壳蛋白突变体可以有效提高AAV病毒神经靶向性，从根本上解决AAV9穿透血脑屏障后表达的效率问题，为开发神经疾病基因治疗制剂或构建神经疾病相关动物模型提供了新的工具。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及可提高AAV病毒神经靶向性的衣壳蛋白突变体及其应用。
背景技术
腺相关病毒(AAV)是一种广泛应用于基因治疗的递送载体，其原理是通过基因工程方法将AAV基因组ITR之间序列替换成目的基因序列，经细胞感染传递到靶细胞，达到基因治疗目的。基于重组AAV具有安全性、高效性、稳定性、持续性、特异性、低整合性等特点，使得AAV成为基因治疗领域主要递送手段之一。目前已发现12种人类AAV 血清型（AAV1至AAV12），不同AAV血清型具有不同的衣壳蛋白空间结构、序列和组织特异性，因而其识别与结合的细胞表面受体有很大差别，这就导致不同血清型感染的组织类型、细胞类型和感染效率也各不相同。其中，AAV9血清型因其强的神经嗜性和理想的安全性越来越多的被运用到基因治疗中。但AAV9基因治疗仍然需更多疾病分子靶点，对于提高基因表达的靶向性，动力学和有效性的调控、释放以及感染效率等方面仍需要进一步研究。衣壳改造生产是创建新型AAV衣壳的瓶颈，因为大多数突变的衣壳蛋白不能组装或包装它们的基因组。
基于AAV载体的不足之处，研究人员正在采用一系列方法来改造AAV，通过改造病毒载体的基因结构、扩大其载体容量、提高病毒产率以及对不同组织细胞的转染效率，以使AAV载体更加符合不同疾病的需求。
野生型AAV衣壳蛋白，特别是野生型AAV9衣壳蛋白缺少对神经的特异性，不适用于神经相关疾病应用，特别是难以穿过脑血屏障。CN114480440A公开了靶向中枢神经系统的嵌合AAV衣壳，包含所述嵌合AAV衣壳的病毒载体，和使用所述载体以靶向中枢神经系统的方法。CN107532173A公开了靶向中枢神经系统的嵌合AAV衣壳，包含所述嵌合AAV衣壳的病毒载体，和使用所述载体以靶向中枢神经系统的方法。这些现有技术对AAV的衣壳蛋白进行了较大的修改，主要针对中枢神经系统，有待进一步的改进。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的至少一个不足，提供可提高AAV病毒神经靶向性的衣壳蛋白突变体及其应用。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供：
一种AAV病毒衣壳蛋白突变体，与野生型AAV9病毒衣壳蛋白相比，野生型AAV9病毒衣壳蛋白的586-588位氨基酸被多肽序列TDGNLANPFK、SEGTLAQPFK、SAGTIAQPFK或QAGTLQQPFK替换。
在一些AAV病毒衣壳蛋白突变体的实例中，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3至SEQ IDNO.6任一条所示。
本发明的第二个方面，提供：
编码本发明第一个方面所述AAV病毒衣壳蛋白突变体的基因。
在一些基因的实例中，其根据宿主的不同进行密码子优化。
本发明的第一个方面，提供：
一种表达体系，其可表达本发明第一个方面所述AAV病毒衣壳蛋白突变体，或含有本发明第二个方面所述的基因。
在一些表达体系的实例中，所述表达体系为重组AAV载体，所述重组AAV载体通过对AAV载体插入或替换改造得到。
在一些表达体系的实例中，所述AAV选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9或AAV10及其突变体中的任意一种。
在一些表达体系的实例中，所述表达体系还包括编码功能性基因产物的核酸分子。
在一些表达体系的实例中，所述功能性基因产物作用于神经，特别的，作用于脑神经。
本发明的第四个方面，提供：
一种组合物，包括本发明第三个方面所述表达体系及可接受的载体。
本发明的第五个方面，提供：
本发明第四个方面所述组合物在制备基因治疗制剂或转基因制剂中的应用。
在一些应用的实例中，所述基因治疗制剂靶向神经，特别是脑神经。
在一些应用的实例中，所述转基因制剂用于治疗神经相关疾病，或用于构建神经相关疾病动物模型。
本发明的有益效果是：
本发明的一些实例的衣壳蛋白突变体PM166、PM167、PM170、PM171，可以有效提高AAV病毒神经靶向性，从根本上解决AAV9穿透血脑屏障后表达的效率问题，为开发神经疾病基因治疗制剂或构建神经疾病相关动物模型提供了新的工具。
附图说明
图1是本发测试例中所构建的突变质粒的琼脂糖凝胶电泳鉴定图。
图2是本发明实施例中pAAV9包装质粒图谱。
图3是本发明实施例中pAAV-PHP.eB包装质粒图谱。
图4是本发明实施例中构建得到的pAAV9-PM166包装质粒图谱。
图5是本发明实施例中构建得到的pAAV9-PM167包装质粒图谱。
图6是本发明实施例中构建得到的pAAV9-PM170包装质粒图谱。
图7是本发明实施例中构建得到的pAAV9-PM171包装质粒图谱。
图8是本发明实施例中病毒包装三质粒系统的pAAV-CAG-Luc表达质粒图谱。
图9是本发明实施例中病毒包装三质粒系统的pAAV-CAG-EGFP表达质粒图谱。
图10是本发明实施例中病毒包装三质粒系统的pHelper辅助质粒图谱。
图11是本发测试例中的本发明方案制备得到的腺相关病毒变体和对照组野生型腺相关病毒小鼠神经靶向性能的活体成像统计图，显示不同AAV9变体所带Luc在小鼠脑内的表达总量。
图12～15是本发测试例中的本发明方案制备得到的腺相关病毒变体和对照组野生型腺相关病毒小鼠神经靶向性能的荧光照片，显示不同AAV9变体所带EGFP蛋白在不同脑区的表达量，其中，图12为皮层的荧光照片，图13为胼胝体的荧光照片，图14为海马的荧光照片，图15为中脑的荧光照片。
图16是本发明实施例的野生型、PHP.eB和AAV9-PM166、PM167、PM170、PM171氨基酸序列比对图。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1
本实施例基于AI设计和过往研究提供了多种腺相关病毒变体（AAV9-PM153～PM171），所述腺相关病毒变体的制备包括以下步骤：
表1 AAV9-WT及其突变体Cap586-588氨基酸序列信息
1、质粒构建
通过基因合成（迪赢生物科技有限公司）PM166、PM167、PM170、PM171氨基酸序列（如表1所示）对应的核酸序列，将合成得到的序列通过现有方法克隆至pAAV9质粒，将CAP9586-588氨基酸替换成突变序列，构建pAAV9-PM突变质粒载体；连接产物转化大肠杆菌感受态Top10，挑取单菌落提取质粒进行测序验证与酶切验证，经琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果如图1所示，突变质粒构建成功。图2是本发明实施例中pAAV9包装质粒图谱。图3是本发明实施例中pAAV-PHP.eB包装质粒图谱。图4是本发明实施例中构建得到的pAAV9-PM166包装质粒图谱。图5是本发明实施例中构建得到的pAAV9-PM167包装质粒图谱。图6是本发明实施例中构建得到的pAAV9-PM170包装质粒图谱。图7是本发明实施例中构建得到的pAAV9-PM171包装质粒图谱。图8是本发明实施例中病毒包装三质粒系统的pAAV-CAG-Luc表达质粒图谱。图9是本发明实施例中病毒包装三质粒系统的pAAV-CAG-EGFP表达质粒图谱。图10是本发明实施例中病毒包装三质粒系统的pHelper辅助质粒图谱。
2、病毒包装及纯化包括以下几个步骤
2.1细胞培养
2.1.1 从液氮罐中取出一管HEK293T细胞，将冻存管迅速放入37℃水浴中，轻轻晃动，使细胞迅速解冻，200×g离心5 min，弃上清，用10 ml DMEM+10% FBS完全培养基重悬，置于10 cm培养皿，在37℃，5％的CO2中培养；
2.1.2 培养2-3天，当细胞汇合度达80%左右，可对细胞进行传代培养；
2.1.3 弃培养上清，用5 ml PBS缓冲液洗涤细胞1次，加入1.5 ml TrypLESelect（1×）消化液，37℃消化3-5 min，加入4.5 ml DMEM完全培养基终止消化；
2.1.4 吹打细胞形成细胞悬液，按1：4-1：5的比例进行传代，接种至T300瓶中培养。
2.2细胞转染
2.2.1 传代2-3次后，细胞培养48 h，细胞汇合度达80%-90%，可对细胞进行转染；
2.2.2 每瓶细胞为1组进行转染，取1 mL 无血清DMEM培养基于离心管中，依次加入包装质粒、pHelper、pAAV-CAG-Luc或pAAV-CAG-EGFP表达质粒 共60 μg，混匀，静置5min，即为“质粒稀释液”；
2.2.3 另取1 ml DMEM培养基于新离心管中，加入180 ug PEI混匀，静置5 min，即为“PEI稀释液”；
2.2.4 将“PEI稀释液”倒入“质粒稀释液”中，快速混匀，室温静置25-30分钟，形成转染复合物；将转染复合物加入80 ml DMEM培养基中，轻晃混匀；
2.2.5 取出T300细胞培养瓶，弃培养上清，加入含用转染复合物的培养基；
2.2.6 在37℃，5％的CO2中培养。
2.3病毒收获
2.3.1 转染后细胞继续培养72小时，开始进行病毒收获；
2.3.2 将各组培养上清混合收集于离心瓶中，200g离心5 min，收集上清；向每毫升上清中加入0.245 mL的50% PEG8000溶液（含0.5mol/L NaCl)，充分混匀，2-8℃静置过夜；
2.3.3 向培养瓶中细胞加入5ml 0.5%TritonX-100细胞裂解缓冲液（含全能核酸酶），37 ℃处理1-2 h，然后加入0.55 ml的5mol/L NaCl至终浓度为0.5 mol/L ，充分混匀后4℃、3000 g离心15 min，收集上清，暂存于2-8℃；
2.3.4将PEG8000深沉后的上清4℃、3000 g离心15 min，去上清，加入2ml 0.5%TritonX-100细胞裂解缓冲液（含全能核酸酶），37 ℃处理1-2 h，然后加入0.22 ml的5mol/L NaCl至终浓度为0.5 mol/L，充分混匀后，3000 g离心15 min，收集上清。将步骤2.3.3中的上清与之并入一个离心管，即为“病毒粗提液。
2.4 病毒纯化
2.4.1取一支超速离心管，用不锈钢针在每个超速离心管中从底部依次缓慢加入“病毒粗提液”15 ml，15 %碘克沙醇9 ml、25 %碘克沙醇6 ml、40 %碘克沙醇5 ml和60 %碘克沙醇5 ml；用细胞裂解液配平封口；
2.4.2 超速离心机，340,000 g，16℃，离心2 h；
2.4.3取一支超滤管，用4 mL PBS缓冲液浸润滤膜；
2.4.4 用注射器小心抽取超速离心管40% Iodixanol- 60% Iodixanol中间液层，转移到超滤管；
2.4.5 加入适量PBS缓冲液吹打均匀，3000 g离心3-5 min，重复至少5次去除碘克沙醇；
2.4.6 加入1 mL PBS缓冲液吹打40～50下成病毒悬液，转移到EP管中；
2.4.7 用1 mL注射器吸取EP管中病毒悬液0.22 μm过滤器过滤，收取20 μL病毒液做检测样品后，剩余病毒以100 μL每管分装，得到AAV-CAG-Luc或pAAV-CAG-EGFP病毒库。
3、病毒产量检测
3.1病毒裂解
取病毒库样品20 μL， 分别加入10% SDS、0.5 mol/L EDTA、proteinaseK各1 μL，混匀；56℃孵育1小时，然后90℃孵育10 min；将裂解后的病毒样品稀释1000倍 ，即为“病毒稀释液”。
3.2 PCR扩增
用步骤（1）中的“病毒稀释液”作为DNA模板，按照表2加样体系，与Q5高保真混合液、正向引物：5’- cggagtcctatggacaagtggccacaaaccaccag-3’（SEQ ID NO.26）、反向引物：5’- ccttggttttgaacccagccggtctgcgcctgt-3’（SEQ ID NO.27）和去离子水混合。
表2、PCR扩增加样体系
PCR反应的程序为：98℃，3 min，1个循环；98℃, 15 s 、 60℃， 20 s 、 72℃，24s，25个循环；72℃，2 min，1个循环。
3.3 PCR产物胶回收
将PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统观察，切取条带正确的胶块，用胶回收试剂盒进行胶回收。
对比例1
本对比例提供了一种野生型腺相关病毒（AAV9-WT），与AAV9突变体按实施例1的制备方法制备，其区别仅在于腺相关病毒衣壳蛋白的序列采用野生型AAV9衣壳蛋白序列。
对比例2
本对比例提供了一种已在动物实验中验证神经靶向性较好的AAV9腺相关病毒突变体（AAV-PHP.eB），与AAV9-突变体按实施例1的制备方法制备，其区别仅在于腺相关病毒衣壳蛋白序列采用突变体AAV-PHP.eB衣壳蛋白序列（SEQ ID NO.2）。
小鼠神经靶向感染性能测试
1、病毒注射：取AAV- CAG-Luc病毒库，尾静脉注射，每只小鼠注射3E11 VG病毒（体积200 µl），常规饲养，每天观察生存情况。
2、活体成像：用DPBS配置荧光底物D-Luciferin（15 mg/mL），0.2 μm滤膜无菌过滤后，给每只小鼠腹腔注射10 μL/g。荧光底物注射后7 min开始拍摄。
结果如图11所示，PM167大脑向性最强，约为野生型AAV9的18倍；所选变体均优于野生型AAV9，为其感染能力的8倍至16倍。
小鼠神经靶向感染性能测试
1、 病毒注射：取AAV-CAG-EGFP病毒库，尾静脉注射，每只小鼠注射5E11 VG病毒（体积200 µl），常规饲养，每天观察生存情况。
2、取材
2.1将麻醉好的小鼠固定，于纵隔下横剪开皮肤，暴露内脏，左右横向剪开，充分暴露；剪破胸部横膈膜，迅速暴露心脏，左手拇指、食指固定心脏，灌注针自心尖部进针，经左心室进入主动脉，用血管钳固定灌注针，剪破右心室；
2.2先用0.9%生理盐水灌注，大约200 ml (50 ml针筒推注，要迅速）；再用4%多聚甲醛灌注，输液器调节流速，前100 ml快速，后150 ml减慢速度；
2.3断头取脑，将脑组织浸泡在4%多聚甲醛中24 h；
2.4将脑组织浸入20%蔗糖至组织沉底2天（每天更换蔗糖）；
2.5将脑组织浸入30%蔗糖至组织沉底2天（每天更换蔗糖）；
2.6取出脑组织，根据所需脑区修整（参考大鼠图谱定位），用OCT胶固定于载物台上，快速冻于-70℃。冰冻切片机上进行冠状切片（片厚10 μm），切好的脑片立即用0.01M的PBS漂洗三次。将脑片平整贴在载玻片上，每个脑片滴10 μl含DAPI的抗荧光猝灭剂，用盖玻片封片在荧光显微镜下拍摄。
结果如图12～15所示，PM167大脑向性最强，所选变体均优于野生型AAV9，与Luc活体成像结果一致。
综上所述，本发明方案制备得到的腺相关病毒变体相较野生型能够显著增强AAV9病毒的神经靶向感染性能。
腺相关病毒变体衣壳蛋白的序列PM166、PM167、PM170、PM171 和野生型AAV9衣壳蛋白(SEQ ID NO.1)的序列比对结果图如图16所示。所述腺相关病毒变体衣壳蛋白的序列相对于野生型AAV9衣壳蛋白的区别在于，野生型衣壳蛋白第586至588氨基酸序列被PM166、PM167、PM170、PM171 的氨基酸序列（如SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.6所示）替换。野生型腺相关病毒AAV9衣壳蛋白CAP9的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
相应的氨基酸序列如下：
AAV9腺相关病毒野生型衣壳蛋白CAP9的氨基酸序列：MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPQPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSAGIGKSGAQPAKKRLNFGQTGDTESVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTMASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNDGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYEFENVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSKTINGSGQNQQTLKFSVAGPSNMAVQGRNYIPGPSYRQQRVSTTVTQNNNSEFAWPGASSWALNGRNSLMNPGPAMASHKEGEDRFFPLSGSLIFGKQGTGRDNVDADKVMITNEEEIKTTNPVATESYGQVATNHQSAQAQAQTGWVQNQGILPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGMKHPPPQILIKNTPVPADPPTAFNKDKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSNNVEFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL（SEQ ID NO.1）。
AAV9腺相关病毒突变体衣壳蛋白CAP9-AAV-PHP.eB的氨基酸序列：MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPQPKVSLWDPCFLSPSFLWLSSCHRKGISNRVQFRMGNRRMIASVWKSQDRFSFFYLLFITIVFFCLILAFFFFLLRNFYYYTCLNIVYNKRKYLDTLSNLKKNFTQSAYITIWNICVLICIFIISLLYFLLFLIDTSLYIFMGSVMFYVYTYPNQGNFAFVILKNAFFFYTFLFILFLILSLISFFQGNNDTMYHASLHHSKEQFLGGNSNISAYKYFCIIVTDVRGFILLIAATIQLPFCFYFMVGIRLDYSESKLGPFANHVHTSYLPPTGKSTTSRQRSRSCASGLQIPWTRQRTRQGGAGQRSRRGGPRARQGLRPAAQGRRQPVPQVQPRRRRVPGAAQRRYVFWGQPRASSLPGQKEASTSWSGGSGDGSWKEEACRAVSSGTGLLRGYWQIGCTARKETQFRSDWRHRVSPRPSTNRRTSRSPLRCGISYNGFRWWRTSGRQRRCRWSGFLGKLALRFPMAGGQSHHHQHPNLGPAHLQQSPLQANLQQHIWRIFKQRLLRLQHPLGVFLQQIPLPLLTTLAATHQQQLGIPAATQLQALQHSGQRGYGQQWSQDHRQPYQHGPGLHGLRLSAPVRARVGSRGLPPAVPSGRFHDSSVRVSDAWKPGRGSFVLLLPGIFPVANAKNGQLPVQLRVERTFPQLRSQPKPGPTNESTHRPILVLSLNYRFWTESTNAKIQCGRTQQHGCPGKKLHTWTQLPTTTCLNHCDSKQQQRICLAWSFFLGSQWTLDESWTCYGQPQRRRGPFLSFVWIFNFWQTRYRQRQRGCGQSHDNQRRRNNYPGSNGVLW-TSGHKPPEWDFGGAFGTGADRLGSKPRNTSGYGLAGQRCVPARTHLGQNSSHGRQLSPFSADGRVWNEAPASSDPHQKHTCTCGSSNGLQQGQAELFHHPVFYWPSQRGDRVGAAEGKQQALEPGDPVHFQLLQVCICCYRCITPPHWHQIPDSSV（SEQ ID NO.2）。
AAV9腺相关病毒突变体衣壳蛋白CAP9-AAV-PM166的氨基酸序列：MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPQPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSAGIGKSGAQPAKKRLNFGQTGDTESVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTMASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNDGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYEFENVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSKTINGSGQNQQTLKFSVAGPSNMAVQGRNYIPGPSYRQQRVSTTVTQNNNSEFAWPGASSWALNGRNSLMNPGPAMASHKEGEDRFFPLSGSLIFGKQGTGRDNVDADKVMITNEEEIKTTNPVATESYGQVATNHQ TDGNLANPFK AQAQTGWVQNQGILPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGMKHPPPQILIKNTPVPADPPTAFNKDKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSNNVEFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL（SEQ ID NO.3）。
AAV9腺相关病毒突变体衣壳蛋白CAP9-AAV-PM167的氨基酸序列：MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPQPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSAGIGKSGAQPAKKRLNFGQTGDTESVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTMASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNDGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGN-NFQFSYEFENVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSKTINGSGQNQQTLKFSVAGPSNMAVQGRNYIPGPSYRQQRVSTTVTQNNNSEFAWPGASSWALNGRNSLMNPGPAMASHKEGEDRFFPLSGSLIFGKQGTGRDNVDADKVMITNEEEIKTTNPVATESYGQVATNHQ SEGTLAQPFK AQAQTGWVQNQGILPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGMKHPPPQILIKNTPVPADPPTAFNKDKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSNNVEFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL（SEQ ID NO.4）。
AAV9腺相关病毒突变体衣壳蛋白CAP9-AAV-PM170的氨基酸序列：MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPQPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSAGIGKSGAQPAKKRLNFGQTGDTESVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTMASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNDGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYEFENVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSKTINGSGQNQQTLKFSVAGPSNMAVQGRNYIPGPSYRQQRVSTTVTQNNNSEFAWPGASSWALNGRNSLMNPGPAMASHKEGEDRFFPLSGSLIFGKQGTGRDNVDADKVMITNEEEIKTTNPVATESYGQVATNHQ SAGTIAQPFK AQAQTGWVQNQGILPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGMKHPPPQILIKNTPVPADPPTAFNKDKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSNNVEFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL（SEQ ID NO.5）。
AAV9腺相关病毒突变体衣壳蛋白CAP9-AAV-PM171的氨基酸序列：MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPQPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSAGIGKSGAQPAKKRLNFGQTGDTESVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTMASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNDGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYEFENVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSKTINGSGQNQQTLKFSVAGPSNMAVQGRNYIPGPSYRQQRVSTTVTQNNNSEFAWPGASSWALNGRNSLMNPGPAMASHKEGEDRFFPLSGSLIFGKQGTGRDNVDADKVMITNEEEIKTTNPVATESYGQVATNHQ QAGTLQQPFK AQAQTGWVQNQGILPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGMKHPPPQILIKNTPVPADPPTAFNKDKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSNNVEFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL（SEQ ID NO.6）。
以上是对本发明所作的进一步详细说明，不可视为对本发明的具体实施的局限。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的简单推演或替换，都在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种AAV病毒衣壳蛋白突变体，其特征在于，与野生型AAV9病毒衣壳蛋白相比，野生型AAV9病毒衣壳蛋白的586-588位氨基酸被多肽序列TDGNLANPFK、SEGTLAQPFK、SAGTIAQPFK或QAGTLQQPFK替换。
2.根据权利要求1所述的AAV病毒衣壳蛋白突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQID NO.3至SEQ ID NO.6任一条所示。
3.编码权利要求1或2所述AAV病毒衣壳蛋白突变体的基因。
4.一种表达体系，其特征在于，其可表达权利要求1或2所述AAV病毒衣壳蛋白突变体，或含有权利要求3所述的基因。
5.根据权利要求4所述的表达体系，其特征在于，所述表达体系为重组AAV载体，所述重组AAV载体通过对AAV载体插入或替换改造得到。
6.根据权利要求5所述的表达体系，其特征在于，所述AAV选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9或AAV10及其突变体中的任意一种。
7.根据权利要求4～6任一项所述的表达体系，其特征在于，所述表达体系还包括编码功能性基因产物的核酸分子。
8.根据权利要求7所述的表达体系，其特征在于，所述功能性基因产物作用于神经。
9.一种组合物，包括权利要求4～8任一项所述表达体系及可接受的载体。
10.权利要求9所述组合物在制备基因治疗制剂或转基因制剂中的应用。
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