CN104937100A - Aav变体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了包含具有选自序列表的SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 24和SEQ ID NO: 30氨基酸序列的腺伴随病毒（AAV）衣壳蛋白质的AAV颗粒；编码该衣壳蛋白质的核酸；含有该核酸的DNA；含有该DNA的细胞；和生产该细胞的方法。

Description

AAV变体
技术领域
本发明涉及编码腺伴随病毒（AAV）衣壳蛋白质变体的核酸、包含衣壳蛋白质变体的AAV颗粒和通过使用所述颗粒生产基因转导细胞的方法。
领域背景
AAV是具有4.7 kb的线性单链DNA基因组的病毒，其包括两种基因rep和cap的开放读码框。rep基因编码基因组复制所需的四种蛋白质（Rep78、Rep68、Rep52和Rep40）。cap基因表达装配用于病毒衣壳形成的三种衣壳蛋白质（VP1、VP2、VP3）和装配激活蛋白质（assembly-activating protein）（AAP）。AAV的复制实质上依赖于辅助病毒，诸如腺病毒或疱疹病毒的存在。在不存在辅助病毒的情况下，AAV的基因组维持在附加体状态或整合至宿主的染色体中，所以AAV是以潜伏状态存在。目前鉴定了AAV的超过100种血清型和分化体（clade）（非专利文献1）。特别地，基于AAV2的用于基因递送的载体的发展是先进的。
在1989年，首次开发了基于AAV2的基因递送载体系统。已经发现基于AAV的载体具有很多优点。因为野生型AAV是非致病的，并且不具有与任何已知疾病的病原关系，相信基于AAV的载体是极其安全的。此外，AAV具有高基因转导效率。
AAV颗粒的施用能够长期并且稳定的将基因转导至多种靶器官和靶细胞中。到目前为止，已经报道了对骨骼肌、肝脏（肝细胞）、心脏（心肌细胞）、神经细胞、胰腺细胞和胰岛细胞的高效率基因转导。此外，AAV已经被用于人临床试验。在另一方面，已经进行了通过改造AAV衣壳蛋白质以改变AAV细胞嗜性（cell tropism）的尝试和通过中和抗体避免AAV颗粒移除的尝试。例如，已经建立了对特定器官和细胞，诸如神经胶质细胞、呼吸道上皮细胞、冠状动脉血管内皮细胞（coronary artery vascular endothelial cell）和肺具有嗜性的AAV衣壳，以及对肿瘤细胞，诸如成胶质细胞瘤细胞、黑素瘤细胞、肺癌细胞和乳腺癌细胞具有嗜性的AAV衣壳（非专利文献2）。
引用列表
非专利文献
非专利文献1：Gao 等人, J.Virology, Vol.78, pp. 6381-6388,2004
非专利文献2： Adachi K. 等人, Gene Ther. Regul. Vol. 5,pp. 31-55, 2010。
发明概述
通过本发明解决的问题
本发明的目的包括提供对心脏和免疫器官，特别地，对淋巴结具有嗜性的AAV衣壳蛋白质，并且提供将基因高效率地导入淋巴结的方法。
对问题的解决
本发明为解决上文描述的问题进行了集中地努力，并且结果建立了包括具有选自序列表SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：30的氨基酸序列的AAV衣壳蛋白质。因此完成本发明。
本发明一般性涉及：
[1]编码腺伴随病毒（AAV）衣壳蛋白质变体的核酸，所述变体包含具有选自序列表SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：30的氨基酸序列的肽；
[2]根据[1]的所述核酸，其中AAV衣壳蛋白质来源于AAV2；
[3]根据[1]的所述核酸，其中所述肽位于AAV2的VP1中氨基酸编号588后接的位置处；
[4]包括根据[1]至[3]中任一项所述核酸的重组DNA；
[5]包括根据[1]至[3]中任一项所述核酸或根据[4]的所述重组DNA的细胞；
[6]包括AAV衣壳蛋白质变体的AAV颗粒，所述变体包含具有选自序列表SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：30的氨基酸序列的肽；
[7]根据[6]的所述AAV颗粒，其中AAV衣壳蛋白质来源于AAV2；
[8]根据[6]的所述AAV颗粒，其中肽位于AAV2的VP1中氨基酸编号588后接的位置处；
[9]生产基因转导细胞的方法，所述方法包括将包括AAV衣壳蛋白质变体的AAV颗粒与细胞接触的步骤，所述变体包含具有选自序列表SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：30的氨基酸序列的肽；
[10]根据[9]的方法，其中AAV衣壳蛋白质来源于AAV2；并且
[11]根据[9]的方法，其中所述肽位于AAV2的VP1中氨基酸编号588后接的位置处。
本发明效果
根据本发明，提供了可用于转导入心脏和免疫器官基因的基因转导系统。本发明的AAV颗粒对免疫器官，特别地，对淋巴结具有高细胞嗜性，并且通过AAV颗粒转导的基因可以强烈表达。
附图简述
图1显示了生产能够使衣壳蛋白质含有随机肽的核酸构建体的方法。
实施本发明的模式
如在本文中使用的，“腺伴随病毒”指的是属于依赖病毒属（Dependovirus）的小病毒，其属于细小病毒科（Parvovirdiae），并且能够感染灵长类动物（包括人）和其它哺乳动物。在下文中，将腺伴随病毒缩写为AAV。AAV具有正二十面体的无包膜外壳（衣壳）和在壳中的线性单链DNA。如在本文中使用的，除非另有说明，AAV包括野生型病毒及其衍生物，并且包括AAV的全部血清型和分化体。
如在本文中使用的“载体”意指用于介导多核苷酸对细胞递送的分子或缔合分子（associated molecule），并且其包括多核苷酸或与多核苷酸缔合。除非另有说明，载体的实例包括载体DNA，诸如质粒载体和噬菌体载体，病毒载体颗粒、脂质体和其它用于基因递送的载体。
如在本文中使用的“衣壳蛋白质”意指通过存在于AAV基因组中的cap基因编码并且构成AAV衣壳的蛋白质。野生型AAV基因组编码三种衣壳蛋白质，并且它们是VP1、VP2和VP3。如在本文中使用的，衣壳蛋白质包括VP1、VP2和VP3。
（1）编码AAV衣壳蛋白质变体的核酸
本发明的核酸编码AAV衣壳蛋白质的变体，所述变体包含具有选自序列表SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：30的氨基酸序列的肽。
通过本发明核酸编码的AAV衣壳蛋白质变体可以通过将所述肽插入至任何AAV（诸如AAV类型1（AAV1）、AAV类型2（AAV2）、AAV类型3（AAV3）、AAV类型4（AAV4）AAV类型5（AAV5）、AAV类型6（AAV6）、AAV类型7（AAV7）、AAV类型8（AAV8）、AAV类型9（AAV9）、AAV类型10（AAV10）、AAV类型11（AAV11）、禽AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV或羊AAV）的AAV衣壳蛋白质，或使用所述肽替换部分AAV衣壳蛋白质氨基酸序列（换而言之，通过产生包含所述肽的AAV衣壳蛋白质）制备。在本发明中，优选地使用AAV2的衣壳蛋白质。
对于本发明的核酸，使AAV衣壳蛋白质含有的肽具有选自序列表SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：30的氨基酸序列。此外，可以向肽的N端和/或C端添加间隔序列（spacer sequence）。间隔序列优选地由1至5个氨基酸残基组成。组成间隔序列的氨基酸残基是特别限制的。例如，间隔序列可以包括选自丙氨酸和丝氨酸的氨基酸。
对于被制成含有所述肽的AAV衣壳蛋白质，可以使用AAV VP1、VP2或VP3。可以仅VP1、VP2和VP3中任意一种被制成含有所述肽，或可以VP1、VP2和VP3的全部被制成含有所述肽。此外，两种衣壳蛋白质，诸如VP1和VP2、VP2和VP3或VP1和VP3可以被制成含有所述肽。通过AAV基因组中的cap基因区域编码VP1至VP3。在本发明的一个实施方案中，由VP1至VP3共享的区域被制成含有所述肽，因此可以将突变导入至全部VP1至VP3中。在本发明的另一个实施方案中，编码VP1、VP2或VP3的基因从AAV的cap基因分别制备，并且将突变导入至所述基因。在该情况中，可以执行处理，所述处理抑制由其中已插入突变的基因编码的衣壳蛋白质对应的衣壳蛋白质从AAV cap区域的表达。
在使用AAV2 VP1的情况下，通过本发明的核酸编码的AAV衣壳蛋白质变体优选地含有位于氨基酸编号第588号后的肽，也就是，位于氨基酸编号588后的位置。AAV2 VP1的氨基酸编号588对应AAV2 VP2的氨基酸编号451和AAV2 VP3的氨基酸编号386。本领域技术人员可以容易地鉴定AAV2之外的AAV血清型和分化体的衣壳蛋白质的氨基酸（其对应于在AAV2 VP1氨基酸编号588的氨基酸）。例如，见在Gao等人Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.99, No.18, pp. 11854-11859, 2002中显示的VP1的氨基酸序列对比。例如，AAV2 VP1的氨基酸编号588对应AAV1的氨基酸编号589、AAV7的氨基酸编号590和AAV8的氨基酸编号591。
通过本发明核酸编码的AAV衣壳蛋白质变体可以是被修改以保留选自序列表SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：30的氨基酸序列的野生型AAV衣壳蛋白质，并且可以进一步包括插入、添加、替换或缺失一个至数个氨基酸或多于一个氨基酸。
本发明的核酸可以操作地连接至合适的对照序列。对照序列的实例包括启动子序列、聚腺苷酸化信号、转录终止序列、上游调节域、复制起始位点、内部核糖体进入位点（IRES）和增强子。启动子序列的实例包括诱导型启动子序列和组成型启动子序列。对照序列可以是衣壳蛋白质来源的AAV的内源性或外源性序列、天然序列或合成的序列。本发明还包括能够表达AAV衣壳蛋白质变体的重组DNA。
本发明的重组DNA可用于在体外、先体外后体内或在体内递送本发明的核酸至细胞，并且赋予细胞表达AAV衣壳蛋白质变体的能力。随后，被递送本发明核酸的细胞可用于生产AAV颗粒。重组DNA可以特别地用于将本发明的核酸递送或导入至动物细胞（优选地哺乳动物细胞）中。
在本发明中，本发明的重组DNA可以通过将DNA用作保留本发明核酸的载体进行制备。例如，可以使用质粒DNA、噬菌体DNA、转座子、粘粒DNA、附加体DNA或病毒基因组。
（2）含有本发明核酸的细胞
本发明还提供了宿主细胞，例如分离的宿主细胞，其含有本发明的核酸，特别地在上文（1）中描述的重组DNA。分离的细胞是，例如，在体外维持的细胞系。如下文解释的，本发明的宿主细胞可用于本发明的AAV颗粒的生产。当本发明的宿主细胞被用于AAV颗粒的生产时，宿主细胞可以称为“包装细胞”或“生产者细胞（producer cell）”。本发明的宿主细胞可以包括如上文（1）中描述的整合至基因组中的本发明的重组DNA，或在细胞中保留重组DNA从而瞬时表达AAV衣壳蛋白质变体。
本发明的重组DNA至宿主细胞的导入可以通过已知方法执行。例如，可以使用电穿孔、磷酸钙沉淀、直接显微注射至细胞中、脂质体介导的基因转染或使用高速颗粒基因枪的核酸递送。当使用病毒载体时，可以选择适合用于载体的感染方法。通过使用这样的已建立的技术，本发明的重组DNA被稳定地导入至宿主细胞的染色体中或暂时进入宿主细胞的细胞质中。为了稳定的转染，可以将选择性标记，例如，熟知的选择性标记诸如新霉素抗性基因（编码新霉素磷酸转移酶）或潮霉素B抗性基因（编码氨基糖苷磷酸转移酶（APH））连接至本发明的重组DNA。
作为宿主细胞，可以使用多种细胞，例如，哺乳动物细胞，包括小鼠细胞和灵长类动物细胞（例如，人细胞）或昆虫细胞。合适的哺乳动物细胞的实例包括，但不限于灵长类动物和细胞系。合适的细胞系的实例包括293细胞、COS细胞、Hela细胞、Vero细胞、3T3小鼠成纤维细胞、C3H10T1/2成纤维细胞、CHO细胞和衍生自它们的细胞。
（3）AAV颗粒，所述AAV颗粒包括含有通过本发明核酸编码的氨基酸的AAV衣壳蛋白质
本发明的AAV颗粒是包括包含具有选自序列表SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：30的氨基酸序列的肽的AAV衣壳蛋白质变体的AAV颗粒。AAV颗粒可以从上文（2）中描述的宿主细胞中生产。本发明的AAV颗粒具有对心脏（心肌细胞）和免疫器官（免疫细胞），特别是淋巴结的嗜性，并且可用于将基因导入主动脉旁淋巴结和/或股淋巴结中。通过本发明的AAV颗粒导入的基因在上文提及的组织、器官和细胞中强烈表达。
为了AAV颗粒的生产，可以将包括AAV颗粒生产所需的一些元件的细胞用作包装细胞。第一元件是用于重组AAV的载体基因组（也称为表达载体），其可以在宿主细胞中复制并且包装在AAV颗粒中。重组AAV载体基因组包括目标异源多核苷酸，和位于目标异源多核苷酸每一侧，即5'-和3'-侧的AAV末端反向重复（ITR）序列。目标异源多核苷酸可以具有用于表达的对照序列。ITR序列的核苷酸序列是已知的。例如，对于AAV2-ITR序列，见Human Gene Therapy, Vol.5, pp. 793-801, 1994。作为AAV ITR序列，可以使用来源于任意多种AAV血清型的ITR序列，所述AAV血清型包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV7等。在本发明中使用的ITR序列可以来源于野生型AAV或可以通过插入、缺失或替换一个或多个核苷酸而被修改。ITR序列能够在Rep蛋白质存在下复制重组AAV载体基因组，并且使得能够在AAV颗粒的形成中将重组AAV载体基因组并入衣壳颗粒。
可以在本发明的AAV颗粒中含有的目标异源多核苷酸的大小通常小于约5千个碱基（kb）。目标异源多核苷酸可以是，例如，编码受体缺少或丢失的目标蛋白质的基因、编码具有期望的生物学或治疗活性（例如，抗微生物、抗病毒或抗肿瘤活性）的蛋白质的基因、编码抑制或减少有害的或不期望的蛋白质的生产的RNA的期望的核苷酸序列或编码抗原蛋白质的核苷酸序列。可以根据目的合适地选择目标异源多核苷酸。
在本发明的一个实施方案中，重组AAV载体基因组缺少cap基因区域和/或rep基因区域。在该实施方案中，包装了重组AAV载体基因组的AAV颗粒不能在感染的细胞中单独复制以再次形成AAV颗粒。
生产AAV颗粒所需的第二元件是提供AAV辅助功能的构建体。编码AAV来源基因的构建体提供了AAV颗粒形成所需要的AAV基因产物。换而言之，所述构建体包括主要AAV ORF的一个或两者（rep基因区域和cap基因区域的编码区域）。为了本发明的AAV颗粒的生产，至少将编码包含具有选自序列表SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：30的氨基酸序列的肽的AAV衣壳蛋白质变体的核酸作为cap基因使用。可以将上文（2）中描述的本发明的宿主细胞（其能够表达所述变体）用于AAV颗粒的生产。AAV颗粒具有由很多衣壳蛋白质构成的壳。全部衣壳蛋白质可以是变体，或部分衣壳蛋白质可以是变体并且其它的可以是野生型衣壳蛋白质。本发明的AAV颗粒可以包括一种衣壳蛋白质变体或数种衣壳蛋白质变体。
AAV的rep基因包含于rep基因的编码区域中，并且包括编码复制蛋白Rep78、Rep68、Rep52和Rep40的基因。这些Rep表达产物显示出具有很多功能，包括识别、结合和缺刻AAV基因组的DNA复制起点，DNA解旋酶活性和通过AAV-源启动子调制转录。
生产AAV颗粒所需的第三元件是用于AAV复制的辅助病毒功能（也称为附属功能）。为导入辅助功能，通常使用腺病毒。然而，还可以使用其它病毒诸如单纯疱疹病毒（herpes simplex virus）类型-1或类型-2和牛痘病毒。当使用病毒时，使用作为辅助病毒的病毒感染宿主细胞。例如，因为包装AAV颗粒只需要腺病毒早期基因的表达，可以使用不展示晚期基因表达的腺病毒。还可以使用缺少晚期基因表达（例如，ts100K或ts149腺病毒变体）的腺病毒变体。还可以通过使用从辅助病毒分离的辅助病毒功能所需的核酸制备提供辅助病毒功能的核酸构建体，并且随后可以将其导入至宿主细胞中。提供辅助病毒功能的结构包括提供一种或多种辅助病毒功能的核苷酸序列，并且是以质粒、噬菌体、转座子、粘粒或其它病毒的形式提供至宿主细胞。
为了生产AAV颗粒，执行（a）将第一元件，重组AAV载体基因组导入至宿主细胞的步骤，（b）将第二元件，提供AAV辅助功能的构建体导入至宿主细胞的步骤，和（c）将第三元件，辅助病毒功能导入至宿主细胞的步骤。步骤（a）至（c）的顺序可以是任何顺序。当第一至第三元件被导入至宿主细胞时，rep基因表达产物切除并且复制重组载体基因组。表达的衣壳蛋白质形成衣壳，并且将重组载体基因组包装至衣壳中以生产AAV颗粒。当宿主细胞表达AAV衣壳蛋白质变体时，生产的AAV颗粒的壳包括AAV衣壳蛋白质变体。
AAV颗粒可以从宿主细胞的培养上清液或裂解产物通过多种提纯方法（诸如CaCl密度梯度离心）分离和纯化。例如，当病毒在上文描述的步骤（c）中使用时，可以添加将AAV颗粒（基于它们的大小）从辅助病毒分离的步骤。AAV颗粒还可以基于对肝素的亲和性的差异从辅助病毒分离。此外，可以通过已知方法使剩余的辅助病毒失活。例如，可用过在约60℃加热例如，20分钟或以上使腺病毒失活。因为AAV颗粒对热非常稳定，上文描述的处理对作为辅助病毒使用的腺病毒的选择性移除是有效的。
（4） 生产本发明的基因转导细胞的方法
通过上文（3）获得的本发明的AAV颗粒被用于为了基因治疗目的或其它目的将目标异源多核苷酸递送至细胞。AAV颗粒通常在体内或在体外导入至细胞中。对于在体外导入，将AAV颗粒与从活体获得的细胞接触。随后，所述细胞也可以被移植至活体中。对于将细胞导入至活体，可以将细胞配制为药物组合物，并且可以使用多种技术，诸如肌内、静脉内、皮下和腹膜内施用。对于在体内转导，将AAV颗粒配制为药物组合物，并且通常地，肠道外地施用（例如，通过肌内、皮下、瘤内、经皮肤或脊柱内途径施用）。包括AAV颗粒的药物组合物含有药物可接受的载体和，必要的，其它试剂、药物、稳定剂、载体、佐剂、稀释剂等。
实施例
制备实施例1：pAAV-AsRed2的构建
将pAsRed2-C1载体（由Clontech Laboratories, Inc.生产）作为模板经历PCR，以获得约1.6 kb片段，其中将限制性内切酶NotI的识别位点添加在CMV启动子上游和聚腺苷酸（polyA）信号下游。使用NotI（由TAKARA BIO Inc.生产）消化该PCR产物以获得插入DNA。使用NotI消化pAAV-MCS表达载体（由CELL BIOLABS, Inc.生产）以制备约2.9 kb片段。将该片段作为载体使用。在该载体中，使用DNA连接试剂盒<Mighty Mix>（由TAKARA BIO Inc.生产）连接插入DNA。将大肠杆菌（E. coli） HST08优质感受态细胞（由TAKARA BIO Inc.生产）用载体转化。从这样获得的克隆提取质粒DNA，并且将以该顺序插入CMV 启动子-AsRed2-MCS-聚腺苷酸信号的质粒DNA命名为 pAAV-AsRed2。
实施例1：AAV2随机肽质粒文库的制备
将携带AAV2基因组的质粒载体pAV1（ATCC号：37215）从分布宿主（distribution host）大肠杆菌（Escherichia coli）HB101提取。从提取的质粒，使用限制性内切酶BgIII（由TAKARA BIO Inc.生产）将AAV2的基因组DNA（约4.7 kb）切除。将该基因组DNA插入至pUC118 BamHI/BAP（由TAKARA BIO Inc.生产）中。将这样获得DNA的质粒命名为AAV2WG/pUC118。
使用限制性内切酶ScaI（由TAKARA BIO Inc.生产）将AAV2WG/pUC118消化以获得含有cap基因第1190至第2017核苷酸的约0.8 kb 片段。将该片段插入至pUC118 HincII/BAP （由TAKARA BIO Inc.生产）中。将这样获得的质粒命名为Cap-ScaI/pUC118。随后，Cap-ScaI/pUC118经历PCR以执行一系列的改造，其中将Cap-ScaI/pUC118中组成Cap基因第1759至1761核苷酸的AAC（N） 核苷酸序列转换为CAG（Q），将由GGC作为间隔区、CAAG作为填充片段和GCC作为间隔区组成的10个核苷酸插入至第1764核苷酸和第1765核苷酸之间，并且将由第1765至1773核苷酸组成的核苷酸序列CAA（Q） GCA（A） GCT（A）转换为CAG（Q） GCG（A） GCC（A），其中在括号中的字母显示了编码的氨基酸。因此，插入了限制性内切酶SfiI的两个识别位点和在SfiI识别位点之间的间隔区、填充片段和间隔区。图1显示了在Cap基因的第1756至1773核苷酸转换之前和之后的核苷酸序列。转换之前的核苷酸序列通过序列表SEQ ID NO: 1显示。转换之后的核苷酸序列通过序列表SEQ ID NO: 2显示。将包括转换的核苷酸序列的质粒DNA命名为Cap-ScaI-S4/pUC118。对于 in-fusion克隆，通过PCR将Cap-ScaI-S4/pUC118中的Cap基因部分扩增以获得约0.8 kb片段。将该片段作为插入DNA使用。
AAV2WG/pUC118经历PCR从而将突变导入至氨苄青霉素抗性基因中的限制性内切酶ScaI的识别位点和在Rep基因中的限制性内切酶SfiI的识别位点中，从而使这些识别位点转换为不能通过限制性内切酶识别的序列。对于Scal识别位点，由氨苄青霉素抗性基因第304至306核苷酸组成的核苷酸序列GAG（E）被转换为GAA（E）。转换之前的序列由SEQ ID NO: 3显示并且转换后的序列由SEQ ID NO: 4显示。对于SfiI识别位点，由Rep基因第217至219核苷酸组成的核苷酸序列GCC（A）被转换为GCA（A）。转换之前的序列由SEQ ID NO: 5显示并且转换后的序列由SEQ ID NO: 6显示。将这样获得质粒DNA使用ScaI （由TAKARA BIO Inc.生产）消化以获得缺少约0.8 kb（其是Cap基因的一部分）的线性载体。其作为线性载体用于 in-fusion克隆。
使用In-Fusion（注册商标） HD克隆试剂盒（由Clontech Laboratories, Inc.生产）和克隆增强子（由Clontech Laboratories, Inc.生产）将插入DNA插入至线性载体中，并且从而执行定向克隆。将这样获得的质粒DNA命名为AAV2WG-Cap-ScaI-S4/pUC118Sx。
通过人工合成产生包括编码7个氨基酸的随机肽的核苷酸序列的寡聚DNA（SEQ ID NO: 7）。通过与引物（SEQ ID NO: 8）和克列诺片段（由TAKARA BIO Inc.生产）在37℃反应3小时从寡聚DNA制备双链DNA。使用核苷酸移除试剂盒（由QIAGEN生产）将双链DNA纯化并且随后使用限制性内切酶BglI （由TAKARA BIO Inc.生产）消化。使用DNA连接试剂盒<Mighty Mix> （由TAKARA BIO Inc.生产）将该DNA插入至使用SfiI消化的AAV2WG-Cap-ScaI-S4/pUC118Sx中。将这样获得的质粒命名为AAV2WG-RPL/pUC118Sx，并且作为AAV2随机肽质粒文库使用。
实施例2：AAV2随机肽病毒文库的制备
（1） 接种AAV293细胞
收集培养的AAV293细胞（由Stratagene Corp.生产），并且随后以5 x 104 个细胞/mL悬浮在含有10% FBS和2 mM L-谷氨酸钠的DMEM（由Sigma生产）中。将含有AAV293细胞的40 ml悬液放置在用于细胞培养的T225 cm2摇瓶（由Corning Incorporated生产）中，并且随后在CO2 温箱中以37 ℃培养72小时。
（2）将质粒导入AAV293细胞
使用400ng 在实施例1中获得的AAV2WG-RPL/pUC118Sx和40 μg pHELP（由CELL BIOLABS, Inc.生产）通过一般的磷酸钙方法转染AAV293细胞。在转染6小时后，将培养基完全移除。在添加含有2% FBS和2 mM L-谷氨酸钠的40 ml DMEM后，将细胞在CO2 温箱中以37 ℃培养48小时。
（3） AAV2随机肽病毒文库的收集
向孵育的T225 cm2摇瓶中添加0.5 ml 0.5 M EDTA，随后静置数分钟。随后，通过移液器吹吸将AAV293细胞剥落并收集至50 ml管中，并且以300 x g离心10分钟。随后，将上清液移除。每摇瓶细胞在2 ml TBS（Tris-缓冲盐溶液）中重悬，并且随后经历三次连续处理，所述处理由使用乙醇/干冰冷冻15分钟，在37 ℃水浴解冻，并且涡旋1分钟组成，以收集含有AAV-随机肽病毒文库的细胞裂解产物。向细胞裂解产物添加5 μL的每1 ml TBS5 1 M的 MgCl2和终浓度为200 U/ml的Benzonase（注册商标）核酸酶（由Merck KGaA生产），随后在37 ℃反应30分钟。随后，通过对每1 ml TBS添加6.5 μL 0.5 M EDTA终止反应。以10000 rpm在4 ℃将细胞裂解产物离心10分钟，并且随后将上清液作为AAV载体溶液收集。
（4） 通过实时PCR的AAV载体溶液的滴度定量
向2 μL AAV载体溶液添加2 μL 10 X DNaseI 缓冲剂、15.2 μL 注射用水 （由Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.生产） 和 0.8 μL DNaseI （由TAKARA BIO Inc.生产） ，并且将混合物在37 ℃孵育1小时以移除游离的基因组DNA和质粒DNA。为了使DNaseI失活，将混合物在99℃加热10分钟。随后，添加15 μL 注射用水、4 μL 10 X ProK 缓冲剂 [0.1 M Tris-HCl （pH 7.8）、0.1 M EDTA、5% SDS] 和 1 μL  ProK （由TAKARA BIO Inc.生产），并且将混合物在55 ℃孵育1小时。随后，为了使ProK失活，将混合物在95℃加热10分钟。根据试剂盒附加的说明书使用SYBR （注册商标） Premix ExTaq2 （由TAKARA BIO Inc.生产） 和引物（SEQ ID NO: 9和SEQ ID NO: 10） 对该样品进行AAV滴度定量。使用注射用水将样品稀释50倍，并且将2 μL稀释溶液用于滴度定量。将通过限制性内切酶消化pAV1获得的线性DNA作为标准品使用。
实施例3：AAV随机肽病毒文库的纯化
（1） 通过氯化铯密度梯度离心的纯化1
在用于超速离心的40PA管（由HITACHI-KOKI Co., Ltd.生产）中，4 mL 调节至密度为1.5的氯化铯溶液、4 mL 调节至密度为1.25的氯化铯溶液和实施例2-（4）制备的28 mLAAV载体溶液从底部按该顺序分层堆放。所述管由超速离心机HIMAC （由HITACHI-KOKI Co., Ltd.生产）以25000 rpm在16 ℃离心3小时。离心后，将28 ml溶液从管的顶部移除，并且随后从顶部将溶液的0.7 ml等分试样连续地收集至1.5 ml管中。以按照实施例2-（4）的相同方式，定量在每个收集的溶液中含有的AAV载体的滴度。
（2） 通过氯化铯密度梯度离心的纯化2
向在实施例3-（1）中显示具有高滴度的数个级分添加密度调节至1.39的氯化铯溶液以达到10.5 ml的总体积。将这样获得溶液放置于用于超速离心的13PA管（由HITACHI-KOKI Co., Ltd.）中，并且随后以38000 rpm在18 ℃离心16小时。离心后，从管的顶部将溶液的0.7 ml等分试样连续地收集。以按照实施例2-（4）的相同方式，定量在每个收集的溶液中含有的AAV载体的滴度。
（3） 通过脱盐透析
将在实施例3-（2）中显示具有高滴度的数个级分混合并且随后添加至Slide-A-lyzer透析盒（由Pierce生产）。通过使用1 L 磷酸盐缓冲液（PBS）在4 ℃透析3小时两次并且使用500 mL PBS/5% 山梨醇溶液在4 ℃过夜透析将纯化的AAV溶液脱盐。随后，收集溶液，使用0.22 μm 过滤器（由Millipore生产）除菌，并且贮存于 -80 ℃至使用前。分别地，以按照实施例2-（4）相同的方式定量纯化的AAV溶液的滴度。
实施例4：AAV2随机肽文库的筛选
（1） 对小鼠的尾静脉施用
将在实施例3-（3）中获得的纯化的AAV溶液通过尾静脉以1 x 1013 病毒基因组（VG）/kg施用至BALB/c小鼠。在施用后72小时，收集股淋巴结（inguinal lymph node）和主动脉旁淋巴结（para-aortic lymph node），并且通过使用NucleoSpin（注册商标）组织（由MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG生产）提取基因组DNA（第1轮）。
（2） 通过PCR的随机肽序列的再克隆
使用实施例4-（1）中提取的基因组DNA作为模板，和PrimeSTAR （注册商标） GXL DNA 聚合酶 （由TAKARA BIO Inc.生产）扩增编码随机肽序列的DNA。使用正向引物（SEQ ID NO: 11）和反向引物1 （SEQ ID NO: 12）作为引物。PCR通过30次循环执行，并且每次PCR循环由98 ℃ 10秒、55 ℃ 15秒和 68 ℃ 40秒组成。随后，将PCR反应溶液的第25部分、正相引物2（SEQ ID NO: 13）和反向引物2（SEQ ID NO: 14）用于制备如之前相同量的反应混合物。所述反应混合物经历PCR的30次循环，其中每次循环由98 ℃ 10 秒、55 ℃ 15秒和68 ℃ 15秒组成。对这样获得的溶液，通过使用 Nucleospin extract II （由MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG生产）纯化DNA，并且使用限制性内切酶BglI消化。电泳之后，通过Nucleospin extract II （由MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG生产）纯化消化产物，并且通过使用DNA连接试剂盒 <Mighty Mix> （由TAKARA BIO Inc.生产）将其再克隆至按实施例1中制备的AAV2WG-Cap-ScaI-S4/pUC118Sx中。
（3） AAV2随机肽病毒文库的生产和纯化
通过与那些在实施例2和实施例3中描述的相同方法，使用在实施例4-（2）中获得的质粒执行AAV2随机肽病毒文库的生产和纯化。
（4） 筛选
以按照实施例4-（1）中相同的方式执行筛选并且提取基因组DNA（第2轮）。此外，使用提取的基因组DNA再克隆、生产和纯化文库，并且再次执行筛选，并且提取基因组DNA（第3轮）。
（5） 随机肽的测序
在每个筛选阶段（第1轮至第3轮），九十几个克隆经历了AAV随机肽质粒文库的测序。在表1中（对从主动脉旁淋巴结收集的克隆）显示和在表2中（对从股淋巴结收集的克隆）显示在克隆中出现超过1次的肽序列和其出现频率。
如在表1和表2中显示的，特异的肽在靶组织中积累。特别地，VEEGRRGQ （SEQ ID NO: 15） 和GGDATRG （SEQ ID NO: 16） 趋向于在主动脉旁淋巴结积累，并且GDDGTRG （SEQ ID NO: 30）趋向于在股淋巴结积累。在主动脉旁淋巴结和股淋巴结两者中，均发现了GAMGGSV （SEQ ID NOs: 24和34）的积累。因此，其暗示这些肽序列趋向于感染淋巴结。
实施例5：具有获得的肽序列的AAV载体的嗜性的评估
（1） pRC-GDDGTRG的构建
将具有按照实施例4-（5）获得的序列GDDGTRG的AAV2WG-Cap-ScaI-S4/pUC118Sx克隆使用限制性内切酶SnaBI （由TAKARA BIO Inc.生产）和HindIII （由TAKARA BIO Inc.生产）消化以获得片段。通过DNA连接试剂盒<Mighty Mix> （由TAKARA BIO Inc.生产） 将片段连接至通过使用SnaBI和HindIII消化pAAVRC2载体（由CELL BIOLABS, Inc.生产）获得的载体片段，以获得辅助质粒pRC-GDDGTRG。
（2） AAV2-AsRed2衣壳变体的生产和纯化
通过一般磷酸钙方法，使用在制备实施例1中制备的25 μg pAAV-AsRed2、25 μg pHELP和在实施例5 -（1）中制备的25 μg pRC-GDDGTRG转染在T255 cm2上接种的AAV293。使用携带野生型衣壳的pAAVRC2载体代替pRC-GDDGTRG作为对照执行转染。转染6小时后，将培养基完全移除，向细胞添加40ml 含有2% FBS和 2mM L-谷氨酸钠的DMEM，并且将细胞在CO2温箱中以37 ℃培养48小时。随后，通过在实施例2-（3）和实施例3中描述的方法生产和纯化两种不同的AAV-AsRed2载体。随后，通过实施例2-（4）中描述的方法定量AAV载体的滴度。
（3） 对小鼠施用AAV纯化的溶液
将在实施例5-（2）中获得的纯化的AAV溶液以每只小鼠1 x 1013 VG/kg通过尾静脉施用至小鼠。
（4）从淋巴结和其它组织制备基因组DNA和定量AAV基因组
将在实施例5-（3）中施用AAV的小鼠在施用1周或6周后进行安乐死，并且收集每个组织。通过使用NucleoSpin 组织（由MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG生产）将基因组DNA从每个组织提取。将提取的基因组DNA作为样品经历实时PCR以确定在每个组织中含有的AAV载体基因组的量。表3显示了在每个组织中每1 μg总基因组DNA中AAV基因组DNA分子的数量。
如可以从表3中看到的，包括具有序列GDDGTRG的衣壳的AAV载体趋向于转移至淋巴结中，并且甚至在施用6周后AAV基因组仍能维持。
（5） 从淋巴结和其它组织提取RNA和定量AsRed2表达
将实施例5-（4）中获得的每个组织以4 ℃在RNAlater（由QIAGEN生产）中反应过夜。随后，将组织与BioMasher II（由Nippi, Inc.生产）匀浆，并且通过使用Nucleospin RNA II（由MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG生产）提取RNA。通过使用Onestep SYBR PrimeScript RT-PCR 试剂盒 （由TAKARA BIO Inc.生产），定量AsRed2基因的表达（具有序列SEQ ID NOs: 38和39的引物）和用于校正的小鼠GAPDH基因的表达（具有序列SEQ ID NOs: 40和41的引物）。基于GAPDH表达量校正的AsRed2表达量在表4中显示。
如可以在上文的结果中看到的，当使用包括插入序列GDDGTRG的衣壳变体的AAV载体时，相比于包括野生型衣壳的AAV载体，在多个淋巴结和心脏中发现了高表达效率。
实施例6：通过携带IL-12基因的AAV2变体评估抗瘤活性
（1） pAAV2-IL12的构建
pAAV2-IL12的构建
通过使用mIL12a-fwd 引物 （SEQ ID NO: 42）和mIL12a-rev 引物 （SEQ ID NO: 43）、从小鼠脾脏制备的cDNA作为模板和PrimeSTAR MAX DNA聚合酶 （由TAKARA BIO Inc.生产）扩增小鼠IL-12a-p35基因（GenBank登记号: NM_008351） 。通过使用In-Fusion HD克隆试剂盒（由Clontech Laboratories, Inc.生产）将这样获得的扩增片段连接至通过使用EcoRI （由TAKARA BIO Inc.生产）和BamHI （由TAKARA BIO Inc.生产）消化的pAAV-MCS表达载体（由CELL BIOLABS, Inc.生产）获得的载体片段以获得pAAV2-mIL12a。随后，通过使用mIL12b-fwd引物（SEQ ID NO: 44）和mIL12b-rev引物（SEQ ID NO: 45）（其中将T2A序列掺入引物中）、从小鼠脾脏制备的cDNA作为模板和PrimeSTAR MAX DNA聚合酶 （由TAKARA BIO Inc.生产）扩增小鼠IL-12b-p40 基因 （GenBank登记号: NM_008352）。通过使用In-Fusion HD克隆试剂盒（由Clontech Laboratories, Inc.生产）将这样获得的扩增片段连接至通过使用BamHI和HindIII消化的pAAV2-mIL12a获得的载体片段以获得pAAV2-mIL12。换句话说，pAAV2-mIL12以IL-12a-p35基因、T2A和IL-12b-p40基因的连接顺序保持多核苷酸，并且生产成熟的IL 12蛋白质。
（2） AAV2-IL12病毒载体的生产和纯化
通过一般磷酸钙方法使用25 μg在实施例6-（1）中制备的pAAV2-mIL12、25 μg pHELP和在25 μg实施例5-（1）中制备的pRC-GDDGTRG转染在T255 cm2上接种的AAV293细胞。使用pAAV-AsRed2代替pAAV2-mIL12执行转染作为对照。转染6小时后，将培养基完全移除，向细胞添加20 mL含有2% FBS和2 mM L-谷氨酸钠的DMEM，并且将细胞在CO2温箱以37 ℃培养48小时。随后，通过实施例2-（3）和实施例3中描述的方法生产并纯化AAV载体。随后，通过实施例2-（4）中描述的方法定量AAV载体的滴度。
（3） 对小鼠尾静脉施用纯化的AAV溶液和皮下施用CT26肿瘤细胞
将纯化的AAV溶液以每只小鼠5 x 1013 VG/kg通过尾静脉施用至小鼠。施用2周后，将CT26肿瘤细胞系以每只小鼠1 x 106个细胞皮下地施用至小鼠背部。随后，连续定量肿瘤大小。每个测量日期中的平均肿瘤大小在表5中显示。
如在表5中显示的，包括GDDGTRG 衣壳变体的AAV2-IL12具有抗瘤活性。
实施例7：具有获得的肽序列的AAV载体的嗜性的评估-2
（1） pRC-GGDATRG和pRC-GAMGGSV的构建
通过按照实施例4-（5）获得的具有序列GGDATRG （SEQ ID NO: 16）或GAMGGSV （SEQ ID NO: 24）的AAV2WG-Cap-ScaI-S4/pUC118Sx克隆，以按照实施例5-（1）的相同方式获得辅助质粒pRC-GGDATRG和pRC-GAMGGSV。
（2） 生产和纯化AAV2-AsRed2衣壳变体
通过实施例5-（2）中描述的方法将在实施例7-（1）中制备的pRC-GGDATRG和pRC-GAMGGSV用于生产和纯化具有各自衣壳变体的AAV-AsRed2载体。随后通过实施例2-（4）中描述的方法定量AAV载体滴度。
（3） 对小鼠施用纯化的AAV溶液
纯化的AAV溶液以每只小鼠1 x 1011 VG/kg通过尾静脉施用至小鼠。分别地，将具有野生型或在实施例5-（2）中制备的GDDGTRG变体的AAV载体施用至小鼠。
（4） 从淋巴结和其它组织提取RNA和定量AsRed2表达
将实施例7-（3）中施用AAV的小鼠在施用6周后进行安乐死，并且收集每个组织。每个组织在RNAlater（由QIAGEN生产）中以4 ℃过夜。随后，以按照实施例5-（5）的相同方式制备RNA。通过使用Onestep SYBR PrimeScript PLUS RT-PCR 试剂盒 （由TAKARA BIO Inc.生产），定量 AsRed2基因（具由序列SEQ ID NOs: 38和39的引物）的表达和用于校正的小鼠GAPDH基因（具由序列SEQ ID NOs: 40和41的引物）的表达。基于GAPDH表达量校正的AsRed2表达量在表6中显示。
如在上文结果中可以看到的，相比于包括野生型衣壳的AAV载体，即使当使用包括GGDATRG或GAMGGSV衣壳变体的AAV载体时，在多个淋巴结和心脏中也发现具有高表达效率。
此外，正如可以从上文结果中看到的，当在每个筛选阶段（第1轮至第3轮）的九十几个克隆经历质粒文库测序时，显示出多于一次的肽序列具有对淋巴结和心脏的高嗜性。
工业实用性
根据本发明，提供了对心脏和免疫器官（特别地对淋巴结）具有嗜性的衣壳蛋白质变体，并且提供了将基因有效导入至淋巴结的方法。
序列表自由文本
SEQ ID NO:1: AAV2 衣壳 586-591编码序列
SEQ ID NO:2: 转换的 AAV2 衣壳编码序列
SEQ ID NO:3: 转换前的氨苄青霉素抗性基因
SEQ ID NO:4: 转换后的氨苄青霉素抗性基因
SEQ ID NO:5: 转换前的AAV2 rep基因
SEQ ID NO:6: 转换后的AAV2 rep基因
SEQ ID NO:7: 编码随机肽的DNA序列
SEQ ID NO:8: 用于合成双链DNA的引物
SEQ ID NO:9: 用于AAV滴度定量的正向引物
SEQ ID NO:10: 用于AAV滴度定量的反向引物
SEQ ID NO:11:  用于随机肽编码区域扩增的正向引物1
SEQ ID NO:12: 用于随机肽编码区域扩增的反向引物1
SEQ ID NO:13:  用于随机肽编码区域扩增的正向引物2
SEQ ID NO:14:  用于随机肽编码区域扩增的反向引物2
SEQ ID NO:15: 包括AAV衣壳蛋白质突变体的肽序列
SEQ ID NO:16: 包括AAV衣壳蛋白质突变体的肽序列
SEQ ID NO:17: 包括AAV衣壳蛋白质突变体的肽序列
SEQ ID NO:18: 包括AAV衣壳蛋白质突变体的肽序列
SEQ ID NO:19: 包括AAV衣壳蛋白质突变体的肽序列
SEQ ID NO:20: 包括AAV衣壳蛋白质突变体的肽序列
SEQ ID NO:21: 包括AAV衣壳蛋白质突变体的肽序列
SEQ ID NO:22: 包括AAV衣壳蛋白质突变体的肽序列
SEQ ID NO:23: 包括AAV衣壳蛋白质突变体的肽序列
SEQ ID NO:24: 包括AAV衣壳蛋白质突变体的肽序列
SEQ ID NO:25: 包括AAV衣壳蛋白质突变体的肽序列
SEQ ID NO:26: 包括AAV衣壳蛋白质突变体的肽序列
SEQ ID NO:27: 包括AAV衣壳蛋白质突变体的肽序列
SEQ ID NO:28: 包括AAV衣壳蛋白质突变体的肽序列
SEQ ID NO:29: 包括AAV衣壳蛋白质突变体的肽序列
SEQ ID NO:30: 包括AAV衣壳蛋白质突变体的肽序列
SEQ ID NO:31: 包括AAV衣壳蛋白质突变体的肽序列
SEQ ID NO:32: 包括AAV衣壳蛋白质突变体的肽序列
SEQ ID NO:33: 包括AAV衣壳蛋白质突变体的肽序列
SEQ ID NO:34: 包括AAV衣壳蛋白质突变体的肽序列
SEQ ID NO:35: 包括AAV衣壳蛋白质突变体的肽序列
SEQ ID NO:36: 包括AAV衣壳蛋白质突变体的肽序列
SEQ ID NO:37: 包括AAV衣壳蛋白质突变体的肽序列
SEQ ID NO:38: 用于AsRed2扩增的正向引物
SEQ ID NO:39: 用于AsRed2扩增的反向引物
SEQ ID NO:40: 用于小鼠 GAPDH扩增的正向引物
SEQ ID NO:41: 用于小鼠 GAPDH扩增的反向引物
SEQ ID NO:42: mIL12a-fwd 引物
SEQ ID NO:43: mIL12a-rev 引物
SEQ ID NO:44: mIL12b-fwd 引物
SEQ ID NO:45: mIL12b-rev 引物
                         序列表
 
<110>  TAKARA BIO INC.
 
<120>  腺伴随病毒突变体
<130>  671820
 
<150>  JP 2012-280485
<151>  2012-12-25
 
<160>  45   
 
<170>  PatentIn version 3.5
 
<210>  1
<211>  18
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  AAV2衣壳586-591编码序列
<400>  1
gccaacagac aagcagct                                                    18
 
 
<210>  2
<211>  28
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  转换的AAV2衣壳编码序列
 
<400>  2
ggccagagag gccaaggccc aggcggcc                                         28
 
 
<210>  3
<211>  45
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  转换前的氨苄青霉素抗性基因
 
<400>  3
tattctcaga atgacttggt tgagtactca ccagtcacag aaaag                      45
 
 
<210>  4
<211>  45
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  转换后的氨苄青霉素抗性基因
 
<400>  4
tattctcaga atgacttggt tgaatactca ccagtcacag aaaag                      45
 
 
<210>  5
<211>  45
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<220>
<223>   转换前的AAV2 rep基因
 
<400>  5
gaatggcgcc gtgtgagtaa ggccccggag gcccttttct ttgtg                      45
 
 
<210>  6
<211>  45
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<220>
<223>   转换后的AAV2 rep基因
 
<400>  6
gaatggcgcc gtgtgagtaa ggcaccggag gcccttttct ttgtg                      45
 
 
<210>  7
<211>  56
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  编码随机肽的DNA序列
 
 
<220>
<221>  尚未归类特征
<222>  (18)..(19)
<223>  n是 a, c, g或t
 
<220>
<221>  尚未归类特征
<222>  (21)..(22)
<223>  n是 a, c, g或t
 
<220>
<221>  尚未归类特征
<222>  (24)..(25)
<223>  n是 a, c, g或t
 
<220>
<221>  尚未归类特征
<222>  (27)..(28)
<223>  n是 a, c, g或t
 
<220>
<221>  尚未归类特征
<222>  (30)..(31)
<223>  n是 a, c, g或t
 
<220>
<221>  尚未归类特征
<222>  (33)..(34)
<223>  n是 a, c, g或t
 
<220>
<221>  尚未归类特征
<222>  (36)..(37)
<223>  n是 a, c, g或t
 
<400>  7
cagtcggcca gagaggcnnk nnknnknnkn nknnknnkgc ccaggcggct gacgag          56
 
 
<210>  8
<211>  16
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  用于合成双链DNA的引物
 
<400>  8
ctcgtcagcc gcctgg                                                      16
 
 
<210>  9
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  用于定量AAV滴度的正向引物
 
<400>  9
atcatatgcc aagtacgccc                                                  20
 
 
<210>  10
<211>  19
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  用于定量AAV滴度的反向引物
 
<400>  10
ccaaaaccgc atcaccatg                                                   19
 
 
<210>  11
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  用于随机肽编码区域扩增的正向引物1
 
<400>  11
aaacactcca agtggaacca ccac                                             24
 
 
<210>  12
<211>  22
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  用于随机肽编码区域扩增的反向引物1
 
<400>  12
ctgtcccgtg gagtactgtg tg                                               22
 
 
<210>  13
<211>  26
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  用于随机肽编码区域扩增的正向引物2
 
<400>  13
cagacgaaga ggaaatcagg acaacc                                           26
 
 
<210>  14
<211>  23
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  用于随机肽编码区域扩增的反向引物2
 
<400>  14
gcccctgaag gtacacatct ctg                                              23
 
 
<210>  15
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  包括AAV衣壳蛋白质突变体的肽序列
 
<400>  15
 
Val Glu Glu Gly Arg Arg Gly Gln   
1               5              
 
 
<210>  16
<211>  7
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<220>
<223> 包括AAV衣壳蛋白质突变体的肽序列
 
<400>  16
 
Gly Gly Asp Ala Thr Arg Gly    
1               5          
 
 
<210>  17
<211>  7
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  包括AAV衣壳蛋白质突变体的肽序列
 
<400>  17
 
Gly Gly Gly Arg Val Ala Glu      
1               5          
 
 
<210>  18
<211>  7
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  包括AAV衣壳蛋白质突变体的肽序列
 
<400>  18
 
Asp Trp Gly Gly Ala Trp Glu     
1               5          
 
 
<210>  19
<211>  7
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  包括AAV衣壳蛋白质突变体的肽序列
 
<400>  19
 
Gly Gln Ala Gly Gly Ala Ala
1               5          
 
 
<210>  20
<211>  7
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  包括AAV衣壳蛋白质突变体的肽序列
 
<400>  20
 
Gly Gly Trp Gly Gly Ser Ala 
1               5          
 
 
<210>  21
<211>  7
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  包括AAV衣壳蛋白质突变体的肽序列
 
<400>  21
 
Gly Pro Val Asn Gly Gly Gly
1               5          
 
 
<210>  22
<211>  7
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  包括AAV衣壳蛋白质突变体的肽序列
 
<400>  22
 
Ala Gly Gly Gly Leu Gly Gly
1               5          
 
 
<210>  23
<211>  6
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  包括AAV衣壳蛋白质突变体的肽序列
 
<400>  23
 
Ala Arg Gly Gly Gly Trp
1               5      
 
 
<210>  24
<211>  7
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  包括AAV衣壳蛋白质突变体的肽序列
 
<400>  24
 
Gly Ala Met Gly Gly Ser Val
1               5          
 
 
<210>  25
<211>  7
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  包括AAV衣壳蛋白质突变体的肽序列
 
<400>  25
 
Ala Val Leu Cys Gly Ala Ala
1               5          
 
 
<210>  26
<211>  7
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  包括AAV衣壳蛋白质突变体的肽序列
 
<400>  26
 
Gly Glu Arg Thr Ser Gly Pro
1               5           
 
 
<210>  27
<211>  7
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  包括AAV衣壳蛋白质突变体的肽序列
 
<400>  27
 
Gly Ser Gly Gly Ala Glu Asp 
1               5          
 
 
<210>  28
<211>  7
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  包括AAV衣壳蛋白质突变体的肽序列
 
<400>  28
 
Gly Val Ala Arg Gly Ala Ala
1               5          
 
 
<210>  29
<211>  7
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  包括AAV衣壳蛋白质突变体的肽序列
 
<400>  29
 
Val Gly Gly Ser Leu Val Ser
1               5          
 
 
<210>  30
<211>  7
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  包括AAV衣壳蛋白质突变体的肽序列
 
<400>  30
 
Gly Asp Asp Gly Thr Arg Gly 
1               5           
 
 
<210>  31
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  包括AAV衣壳蛋白质突变体的肽序列
 
<400>  31
 
Val Glu Glu Gly Arg Arg Gly Gln
1               5              
 
 
<210>  32
<211>  7
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  包括AAV衣壳蛋白质突变体的肽序列
 
<400>  32
 
Val Ala Ser Val Trp Arg Glu
1               5          
 
 
<210>  33
<211>  7
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  包括AAV衣壳蛋白质突变体的肽序列
 
<400>  33
 
Gly Thr Ala Ser Ser Gly Gly
1               5          
 
 
<210>  34
<211>  7
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  包括AAV衣壳蛋白质突变体的肽序列
 
<400>  34
 
Gly Ala Met Gly Gly Ser Val
1               5          
 
 
<210>  35
<211>  7
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  包括AAV衣壳蛋白质突变体的肽序列
 
<400>  35
 
Ala Ser Ala Gly Gly Tyr Gln  
1               5          
 
 
<210>  36
<211>  7
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  包括AAV衣壳蛋白质突变体的肽序列
 
<400>  36
 
Gly Ala Ser Gly Leu Val Ala
1               5          
 
 
<210>  37
<211>  7
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  包括AAV衣壳蛋白质突变体的肽序列
 
<400>  37
 
Gly Thr Ala Ser Ser Gly Gly  
1               5          
 
 
<210>  38
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  用于AsRed2扩增的正向引物
 
<400>  38
cccaggagat gaagatcgag                                                  20
 
 
<210>  39
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  用于AsRed2扩增的反向引物
 
<400>  39
gcttgaagta gtcggggatg                                                  20
 
 
<210>  40
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  用于小鼠GAPDH扩增的正向引物
 
<400>  40
gcaccgtcaa ggctgagaac                                                  20
 
 
<210>  41
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  用于小鼠GAPDH扩增的反向引物
 
<400>  41
atggtggtga agacgccagt                                                  20
 
 
<210>  42
<211>  45
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  mIL12a-fwd引物
 
<400>  42
aacatcgatt gaattcaacg ccgccatgtg tcaatcacgc tacct                      45
 
 
<210>  43
<211>  35
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  mIL12a-rev引物
 
<400>  43
cgactctaga ggatccggcg gagctcagat agccc                                 35
 
 
<210>  44
<211>  97
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  mIL12b-fwd引物
 
<400>  44
gagctccgcc ggatccgagg gcagaggcag cctgctgacc tgcggcgacg tggaggaaaa      60
 
ccctggccct agatctatgt gtcctcagaa gctaacc                               97
 
 
<210>  45
<211>  36
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  mIL12b-rev引物
 
<400>  45
tgctcgaggc aagcttctag gatcggaccc tgcagg                                36

Claims (11)

1.编码腺伴随病毒（AAV）衣壳蛋白质变体的核酸，所述变体含有具有选自序列表的SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：30的氨基酸序列的肽。
2.根据权利要求1的所述核酸，其中所述AAV衣壳蛋白质来源于AAV2。
3.根据权利要求1的所述核酸，其中所述肽位于AAV2的VP1中氨基酸编号588后接的位置处。
4.包含根据权利要求1至3中任一项所述核酸的重组DNA。
5.包含根据权利要求1至3中任一项所述核酸或根据权利要求4的重组DNA的细胞。
6.包括AAV衣壳蛋白质变体的AAV颗粒，所述变体包含具有选自序列表的SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：30的氨基酸序列的肽。
7.根据权利要求6的所述AAV颗粒，其中所述AAV衣壳蛋白质来源于AAV2。
8.根据权利要求6的所述AAV颗粒，其中所述肽位于AAV2的VP1中氨基酸编号588后接的位置处。
9.生产基因转导的细胞的方法，所述方法包括使包含AAV衣壳蛋白质变体的AAV颗粒与细胞接触的步骤，所述变体包含具有选自序列表的SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：30的氨基酸序列的肽。
10.根据权利要求9的所述方法，其中所述AAV衣壳蛋白质来源于AAV2。
11.根据权利要求9的所述方法，其中所述肽位于AAV2的VP1中氨基酸编号588后接的位置处。
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