WO2014103957A1 - Ａａｖ変異体 - Google Patents

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WO2014103957A1
WO2014103957A1 PCT/JP2013/084336 JP2013084336W WO2014103957A1 WO 2014103957 A1 WO2014103957 A1 WO 2014103957A1 JP 2013084336 W JP2013084336 W JP 2013084336W WO 2014103957 A1 WO2014103957 A1 WO 2014103957A1
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seq
capsid protein
peptide
aav2
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PCT/JP2013/084336
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敏和 西江
扶有子 高島
榎　竜嗣
峰野　純一
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タカラバイオ株式会社
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    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Definitions

  • the present invention relates to a nucleic acid encoding a variant of an adeno-associated virus (AAV) capsid protein, an AAV particle containing the capsid protein variant, and a method for producing a transgenic cell using the particle.
  • AAV adeno-associated virus
  • AAV is a virus whose genome is a 4.7 kb single-stranded DNA containing two open reading frame rep genes and a cap gene.
  • the rep gene encodes four types of proteins (Rep78, Rep68, Rep52, and Rep40) necessary for genome replication
  • the cap gene consists of three types of capsid proteins (VP1, VP2, VP3) assembled for viral capsid formation.
  • AAP Assembly-Activating Protein
  • AAV replication in nature depends on the presence of helper viruses such as adenovirus and herpes virus. In the absence of helper virus, AAV is maintained in its episome or integrated into the host chromosome and becomes latent. At present, more than 100 AAV serotypes and clades (Non-patent Document 1) have been identified, but AAV2 is being developed as a gene delivery vector.
  • AAV-based vectors have been shown to have many advantages. Since wild-type AAV is non-pathogenic and has no pathogenic relationship with any known disease, AAV-based vectors are said to be extremely safe. In addition, AAV has a high efficiency of gene transfer.
  • AAV ⁇ By long-term stable gene transfer to various target organs and target cells by administration of AAV particles.
  • genes can be introduced into skeletal muscle, liver (hepatocytes), heart (cardiomyocytes), nerve cells, pancreatic gland cells, and islet cells with high efficiency.
  • AAV has a track record of use in human clinical trials.
  • attempts have been made to modify the AAV capsid protein to change AAV cell tropism and to avoid removal of AAV particles by neutralizing antibodies.
  • AAV capsids that are directed to specific organs and cells such as glial cells, airway epithelial cells, coronary artery endothelial cells or lungs, and directed to tumor cells such as glioblastoma, melanoma, lung cancer or breast cancer
  • An AAV capsid having a slag has been prepared (Non-patent Document 2).
  • An object of the present invention is to provide an AAV capsid protein mutant having directivity to the heart and immune organs, particularly lymph nodes, and to provide a method for efficiently introducing genes into the lymph nodes.
  • an AAV capsid protein having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 24, and SEQ ID NO: 30 in the sequence listing.
  • AAV particles containing them were made to complete the present invention.
  • AAV adeno-associated virus
  • a recombinant DNA comprising the nucleic acid according to any one of [1] to [3], [5] A cell comprising the nucleic acid according to any one of [1] to [3] or the recombinant DNA according to [4], [6] AAV particles comprising an AAV capsid protein variant containing a peptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 24 and SEQ ID NO: 30 in the sequence listing; [7] The AAV particle according to [6], wherein the AAV capsid protein is derived from AAV2.
  • AAV particles containing an AAV capsid protein variant containing a peptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 24 and SEQ ID NO: 30 in the sequence listing are brought into contact with cells.
  • a method for producing a transgenic cell comprising the step of: [10] The method according to [9], wherein the AAV capsid protein is derived from AAV2.
  • the method according to [9] wherein the peptide is contained at a position following amino acid number 588 of VP1 of AAV2.
  • the present invention provides a gene transfer system useful for gene transfer into the heart and immune organs.
  • the AAV particles of the present invention are highly cell-oriented to immune organs, particularly lymph nodes, and can strongly express the introduced gene.
  • Adeno-associated virus refers to small viruses that infect primate animals including humans and other mammals belonging to the Parvoviridae family and the Dependovirus genus.
  • Adeno Associated Virus is abbreviated as AAV.
  • AAV has an icosahedral outer shell (capsid) having no envelope and one single-stranded DNA inside thereof.
  • AAV includes wild type viruses and derivatives thereof, and includes all serotypes and clades except where specifically noted.
  • vector refers to a molecule or an association of molecules that can be used to mediate delivery of a polynucleotide to a cell, including or associated with a polynucleotide.
  • examples include vector DNA such as plasmid vectors and phage vectors, viral vector particles, liposomes, and other gene delivery vehicles, all of which are included in the vectors unless otherwise specified.
  • the “capsid protein” is a protein encoded by a cap gene existing in the AAV genome and means a protein constituting the AAV capsid.
  • the wild type AAV genome encodes three types of capsid proteins, and VP1, VP2 and VP3 exist. In the present specification, any of VP1, VP2 and VP3 is included in the capsid protein.
  • nucleic acid encoding AAV capsid protein variant contains a peptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 24 and SEQ ID NO: 30 in the sequence listing A nucleic acid encoding a mutant AAV capsid protein.
  • the AAV capsid protein variants encoded by the nucleic acids of the present invention are type 1 AAV (AAV1), type 2 AAV (AAV2), type 3 AAV (AAV3A, AAV3B, etc.), type 4 AAV (AAV4), type 5 AAV (AAV5) ), 6 type AAV (AAV6), 7 type AAV (AAV7), 8 type AAV (AAV8), 9 type AAV (AAV9), 10 type AAV (AAV10), 11 type AAV (AAV11), avian AAV, bovine AAV, Inserting the peptide into any AAV capsid protein, such as canine AAV, horse AAV, sheep AAV, or replacing part of the amino acid sequence of the AAV capsid protein with a peptide (ie, including the peptide in the AAV capsid protein) Can be prepared.
  • the AAV2 capsid protein can be particularly preferably used.
  • the peptide contained in the AAV capsid protein has an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 24 and SEQ ID NO: 30 in the sequence listing.
  • a spacer sequence may be added to the N-terminus and / or C-terminus of the peptide.
  • the spacer sequence is preferably 1 to 5 amino acid residues.
  • the amino acid of the spacer sequence is not particularly limited, but for example, an amino acid selected from the group consisting of glycine, alanine and serine can be used.
  • AAV's VP1, VP2, and VP3 can be used as the AAV capsid protein containing the peptide. Only VP1, VP2 or VP3 may contain the peptide, and all capsid proteins of VP1 to VP3 may contain the peptide. Furthermore, you may make it contain in two types of capsid proteins like the combination of VP1 and VP2, VP2 and VP3, VP1 and VP3. VP1 to VP3 are encoded in the cap gene region of the AAV genome. As one embodiment of the present invention, a mutation can be introduced into all of VP1 to VP3 by containing a peptide in a region common to VP1 to VP3.
  • a gene encoding VP1, VP2, or VP3 can be prepared separately from the cap gene region of AAV, and a mutation can be introduced into this gene.
  • treatment may be performed so that the capsid protein corresponding to the capsid protein encoded by the gene into which the mutation has been introduced is not expressed from the cap gene region of AAV.
  • the position containing the peptide is preferably a position following amino acid number 588, that is, after amino acid number 588 in the case of VP1 of AAV2.
  • the amino acid number 588 of AAV2 VP1 corresponds to amino acid number 451 of VP2 of AAV2 and amino acid number 386 of VP3 of AAV2.
  • those skilled in the art can easily identify the amino acids of serotypes other than AAV2 and the capsid protein of clade AAV corresponding to the amino acid number 588 of VP1 of VP1 of AAV2.
  • amino acid number 588 of VP1 of AAV2 is number 589 for AAV1, number 590 for AAV7, and number 591 for AAV8.
  • the AAV capsid protein variant encoded by the nucleic acid of the present invention has an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 24 and SEQ ID NO: 30 in the wild type AAV capsid protein.
  • it may be a protein in which one to several amino acids are inserted, added, substituted or deleted.
  • control sequences include promoter sequences, polyadenylation signals, transcription termination sequences, upstream regulatory domains, origins of replication, internal ribosome entry sites (IRES), enhancers and the like.
  • Promoter sequences include inducible promoter sequences and constitutive promoter sequences.
  • the control sequence may be unique or exogenous to AAV from which the capsid protein is derived, and may be a natural sequence or a synthetic sequence. Such recombinant DNA capable of expressing an AAV capsid protein variant is also encompassed by the present invention.
  • the recombinant DNA of the present invention is useful for delivering the nucleic acid of the present invention to cells in vitro, in vitro and in vivo, and conferring the ability to express the AAV capsid protein variant on the cells.
  • the cells to which the nucleic acid of the present invention has been delivered are useful for producing AAV particles.
  • Such recombinant DNA can in particular be used to deliver or introduce the nucleic acids of the invention into animal cells, more preferably mammalian cells.
  • the recombinant DNA of the present invention can be prepared by retaining the nucleic acid of the present invention in DNA used as a vector.
  • DNA used as a vector for example, plasmid DNA, phage DNA, transposon, cosmid DNA, episomal DNA, and viral genome can be used.
  • the present invention also provides a host cell containing the nucleic acid of the present invention, specifically the recombinant DNA of the above (1), for example, an isolated host cell. Isolated cells are, for example, cell lines maintained in vitro.
  • the host cell of the present invention is useful for producing the AAV particle of the present invention as described below. When the host cell of the invention is used to produce AAV particles, it may be referred to as “packaging cell” or “producer cell”.
  • the recombinant DNA of the present invention described in (1) above may be integrated into the genome, and the recombinant DNA is intracellularly expressed so as to transiently express the AAV capsid protein mutant. May be held.
  • Introduction of the recombinant DNA of the present invention into a host cell can be performed by a known method. For example, electroporation, calcium phosphate precipitation, direct microinjection into cells, liposome-mediated gene transfer, nucleic acid delivery using a high-speed particle gun, and the like can be used.
  • electroporation calcium phosphate precipitation
  • direct microinjection into cells liposome-mediated gene transfer
  • nucleic acid delivery using a high-speed particle gun and the like
  • an infection method suitable for the vector may be selected.
  • the recombinant DNA of the present invention is stably introduced into the host cell chromosome or transiently introduced into the host cell cytoplasm.
  • selection markers such as selection markers such as neomycin resistance gene (encoding neomycin phosphotransferase), hygromycin B resistance gene (encoding aminoglycoside phosphotransferase (APH))can be ligated to the recombinant DNA of the present invention.
  • Suitable mammalian cells include, but are not limited to, primary cells and cell lines. Suitable cell lines include 293 cells, COS cells, HeLa cells, Vero cells, 3T3 mouse fibroblasts, C3H10T1 / 2. Examples include fibroblasts, CHO cells, and cells derived from these cells.
  • AAV particles containing an AAV capsid protein containing the amino acid sequence encoded by the nucleic acid of the present invention are derived from SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 24 and SEQ ID NO: 30 in the sequence listing.
  • the AAV particles can be produced by the host cell described in (2) above.
  • the AAV particles of the present invention are directed to the heart (myocardium), immune organs (immune cells), particularly lymph nodes, and are useful for gene transfer into para-aortic and / or femoral lymph nodes.
  • the gene introduced by the AAV particles of the present invention is strongly expressed in the tissues, organs and cells.
  • AAV particles can be produced using cells containing several components necessary for the production of AAV particles as packaging cells.
  • the first component is a recombinant AAV vector genome (also called an expression vector) that can be replicated and packaged into AAV particles in a host cell.
  • the recombinant AAV vector genome contains the desired heterologous polynucleotide and an AAV inverted terminal repeat (ITR) sequence on each side, ie, 5 'and 3'.
  • the desired heterologous polynucleotide can have regulatory sequences for its expression.
  • the base sequence of the ITR sequence is known. For example, for the ATR sequence of AAV2, Kotin R.I. Reference can be made to M et al., Human Gene Therapy, Volume 5, pages 793-801, 1994.
  • an ITR sequence an ITR sequence derived from any of various AAV serotypes such as AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5 and AAV7 can be used.
  • the ITR sequence used in the present invention may be a sequence derived from wild-type AAV, and may be altered by nucleotide insertion, deletion or substitution.
  • the ITR sequence allows replication of the recombinant AAV vector genome in the presence of the Rep protein, allowing integration into the capsid particle during AAV particle formation.
  • Desired heterologous polynucleotides that can be loaded on the AAV particles of the present invention are generally less than about 5 kilobases (kb) in size, eg, genes encoding desired proteins that are missing or lost to the recipient, desired A desired nucleotide sequence encoding a gene encoding a protein having a biological or therapeutic action (eg, antibacterial, antiviral or antitumor action), an RNA inhibiting or reducing the production of harmful or undesirable proteins, antigen
  • the nucleotide sequence encoding the sex protein can be appropriately set according to the purpose.
  • the recombinant AAV vector genome lacks the cap gene region and / or the rep gene region, and the AAV particles packaged with the recombinant AAV vector genome of this embodiment are infected cells. In the AAV particle alone by itself.
  • the second component necessary for the production of AAV particles is a construct that provides the AAV helper function.
  • This construct encodes an AAV-derived gene that provides the AAV gene product necessary for the formation of AAV particles. That is, it includes one or both of the rep gene region and the cap gene region which are major AAV ORFs.
  • AAV capsid protein mutation containing a peptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 24 and SEQ ID NO: 30 in the sequence listing for producing the AAV particles of the present invention
  • the nucleic acid encoding the body is used as the cap gene.
  • the host cell of the present invention described in (2) above having the ability to express this mutant can be used for the production of AAV particles.
  • AAV particles have an outer shell composed of a large number of capsid proteins, but all capsid proteins may be mutants, some of which may be mutants and the rest may be wild-type capsid proteins. Furthermore, the capsid protein variant contained in the AAV particles of the present invention may be one type of variant or multiple types of variants.
  • the AAV rep gene is contained in the rep gene coding region, and includes genes encoding the replication proteins Rep 78, Rep 68, Rep 52, and Rep 40. These Rep expression products have been shown to have many functions, including recognition of AAV genomic DNA origins of replication, binding and nicking, DNA helicase activity and transcriptional changes of AAV-derived promoters.
  • helper virus function also called an accessory function
  • Adenovirus is generally used for introduction of the helper function, but viruses such as type 1 or type 2 herpes simplex virus and vaccinia virus can also be used.
  • viruses such as type 1 or type 2 herpes simplex virus and vaccinia virus can also be used.
  • the host cell is infected with the virus as a helper virus.
  • adenoviruses that do not exhibit late gene expression may be used because only adenovirus early gene expression is required for AAV particle packaging.
  • Adenovirus mutants that lack late gene expression eg, ts100K or ts149 adenovirus mutants) can be used.
  • nucleic acid construct that provides a helper virus function can be prepared and introduced into a host cell using a nucleic acid necessary for the helper virus function isolated from the helper virus.
  • a construct that provides helper virus function comprises a nucleotide sequence that provides one or more helper virus functions and is provided to the host cell in the form of a plasmid, phage, transposon, cosmid or other virus.
  • AAV particles In order to produce AAV particles, (a) the step of introducing the vector genome of recombinant AAV, which is the first component, into a host cell, and (b) the construct that provides the AAV helper function, which is the second component, A step of introducing into a cell; and (c) a step of introducing a helper virus function as a third component into a host cell. These steps may be performed simultaneously or sequentially. The order of (a) to (c) may be any order.
  • the expression product of the rep gene excises and replicates the vector genome of the recombinant AAV.
  • the expressed capsid protein forms a capsid, and the vector genome of recombinant AAV is packaged into the capsid to produce AAV particles. And when this host cell expresses an AAV capsid protein variant, the AAV capsid protein variant is contained in the outer shell of the produced AAV particle.
  • AAV particles can be isolated and purified from host cell culture supernatants and cell lysates using various purification methods such as CsCl density gradient centrifugation.
  • a virus for example, a step of separating AAV particles and helper virus based on size may be added.
  • AAV particles can also be separated from helper virus based on the difference in affinity for heparin.
  • the remaining helper virus can be inactivated using a known method.
  • adenovirus can be inactivated by heating at a temperature of about 60 ° C., for example for 20 minutes or longer. Since AAV particles are extremely heat-stable, this treatment is effective for selective removal of adenovirus used as a helper virus.
  • AAV particle of the present invention obtained by the above (3) is used for delivering a desired heterologous polynucleotide to cells for gene therapy and other purposes.
  • AAV particles are introduced into cells either in vivo or in vitro. When introducing in vitro, AAV particles are introduced into contact with cells obtained from a living body. These cells can also be transplanted into a living body. When cells are introduced into a living body, various techniques such as intramuscular, intravenous, subcutaneous and intraperitoneal administration can be used by formulating as a pharmaceutical composition.
  • AAV particles are formulated as a pharmaceutical composition and generally administered parenterally (eg, administered by intramuscular, subcutaneous, intratumoral, transdermal, intrathecal, etc. route of administration).
  • a pharmaceutical composition comprising AAV particles includes a pharmaceutically acceptable carrier and optionally other drugs, pharmaceutical agents, stabilizers, buffers, carriers, adjuvants, diluents, and the like.
  • Preparation Example 1 Construction of pAAV-AsRed2 Using the pAsRed2-C1 Vector (manufactured by Clontech) as a template, a fragment of about 1.6 kb with a restriction enzyme NotI recognition site added upstream of the CMV promoter and downstream of the polyA signal Obtained by. This PCR product was treated with NotI (Takara Bio Inc.) to obtain insert DNA. On the other hand, pAAV-MCS Expression Vector (manufactured by CELL BIOLABS) was treated with NotI to prepare a fragment of about 2.9 kb, which was used as a vector.
  • the insert DNA was ligated to this vector using DNA Ligation Kit ⁇ Mighty Mix> (manufactured by Takara Bio Inc.). Coli HST08 Premium Competent Cells (manufactured by Takara Bio Inc.) were transformed. Among the plasmid DNAs extracted from the obtained clones, pAAV-AsRed2 was inserted from the upstream in the order of CMV promoter-AsRed2-MCS-polyA signal.
  • a plasmid vector pAV1 (ATCC Number: 37215) carrying the AAV2 genome was extracted from Escherichia coli HB101 of a general purpose host (Distribution host).
  • AAV2 genomic DNA (about 4.7 kb) was excised from the extracted plasmid with restriction enzyme BglII (Takara Bio Inc.). This genomic DNA was inserted into pUC118 BamHI / BAP (manufactured by Takara Bio Inc.), and the resulting plasmid DNA was designated as AAV2WG / pUC118.
  • AAV2WG / pUC118 was treated with a restriction enzyme ScaI (manufactured by Takara Bio Inc.) to obtain a fragment of about 0.8 kb containing the 1190th to 2017th bases of the cap gene. This fragment was inserted into pUC118 HincII / BAP (manufactured by Takara Bio Inc.), and the resulting plasmid DNA was designated as Cap-ScaI / pUC118.
  • the 1759th to 1761th base sequence AAC (N) of the Cap gene of Cap-ScaI / pUC118 is converted into CAG (Q) using PCR, and GGC is used as a spacer between the 1764th and 1765th bases.
  • CAAG as the stuffer
  • 10 bases of GCC as the spacer
  • CAA (Q) GCA (A) GCT (A) are converted to CAG (Q) GCG (A) GCC (A), (A letter in parentheses indicates an encoded amino acid).
  • SfiI and spacers two recognition sites for the restriction enzyme SfiI and spacers, stuffers and spacers sandwiched between the SfiI recognition sites were inserted.
  • the base sequence before and after the 1756th to 1773th conversion of the Cap gene is shown in FIG. 1, the base sequence before conversion is shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, and the base sequence after conversion is shown in SEQ ID NO: 2.
  • Cap-ScaI-S4 / pUC118 The plasmid DNA after the base sequence conversion was named Cap-ScaI-S4 / pUC118.
  • the Cap gene portion of Cap-ScaI-S4 / pUC118 was amplified by PCR for In-Fusion Cloning to obtain a fragment of about 0.8 kb, which was used as insert DNA.
  • the base sequence before conversion is shown in SEQ ID NO: 5, and the base sequence after conversion is shown in SEQ ID NO: 6.
  • the plasmid DNA thus obtained was treated with ScaI (manufactured by Takara Bio Inc.) to obtain a linear vector lacking about 0.8 kb, which is a part of the Cap gene. This was used as a linear vector for In-Fusion Cloning.
  • insert DNA was inserted into the linear vector using In-Fusion (registered trademark) HD Cloning Kit (Clontech) and Cloning Enhancer (Clontech), and directional cloning was performed.
  • the plasmid DNA thus obtained was designated as AAV2WG-Cap-ScaI-S4 / pUC118Sx.
  • oligo DNA (SEQ ID NO: 7) containing a base sequence encoding a 7-amino acid random peptide was prepared by artificial synthesis, and was used for 3 hours at 37 ° C. with a primer (SEQ ID NO: 8) and Klenow Fragment (manufactured by Takara Bio Inc.). Double-stranded DNA was prepared from the oligo DNA by reaction. Double-stranded DNA purified using Nucleotide removal kit (Qiagen) was digested with restriction enzyme BglI (Takara Bio).
  • AAV2WG-RPL / pUC118Sx is a plasmid in which this DNA is inserted into AAV2WG-Cap-ScaI-S4 / pUC118Sx digested with SfiI using DNA ligation kit ⁇ Mighty Mix> (manufactured by TAKARA BIO INC.). Used as.
  • Example 2 Preparation of AAV2 Random Peptide Virus Library (1) Inoculation of AAV293 Cells After culturing AAV293 cells (Stratagene) was collected, 5% was obtained with DMEM (Sigma) containing 10% FBS and 2 mM L-glutamate. It suspended so that it might become * 10 ⁇ 4 > cell / mL. 40 mL of a solution containing AAV293 cells was added to a T225 cm 2 flask (manufactured by Corning) for cell culture, and cultured in a CO 2 incubator at 37 ° C. for 72 hours.
  • AAV2WG-RPL / pUC118Sx 400 ng obtained in Example 1 and 40 ⁇ g of pHELP (manufactured by cellbiolabs) were each transfected into AAV293 cells using a general calcium phosphate method.
  • the medium was completely removed, 40 mL of DMEM containing 2% FBS and 2 mM sodium L-glutamate was added, and the cells were cultured in a CO 2 incubator at 37 ° C. for 48 hours.
  • AAV2 Random Peptide Virus Library 0.5 mL of 0.5M EDTA was added to a T225 cm 2 flask during culture and allowed to stand for several minutes. Thereafter, AAV293 cells were detached by pipetting and collected in a 50 mL tube. After centrifugation at 300 ⁇ g for 10 minutes, the supernatant was removed. After resuspending cells in 2 mL of TBS (Tris-buffered saline) per flask, repeat a series of treatments 3 times with ethanol / dry ice for 15 minutes, 37 ° C water bath for 15 minutes, and vortex for 1 minute. The cell disruption solution containing the AAV-random peptide virus library was collected.
  • TBS Tris-buffered saline
  • Example 3 Purification of AAV2 Random Peptide Virus Library (1) Purification by cesium chloride density gradient centrifugation 1 In a 40 PA tube for ultracentrifugation (manufactured by HITACHI-KOKI), 4 mL of cesium chloride solution prepared at a specific gravity of 1.5 from the bottom, 4 mL of cesium chloride solution prepared at a specific gravity of 1.25, Example 2- (4) The AAV vector solution prepared in (1) was layered in the order of 28 mL, and centrifuged at 25000 rpm, 16 ° C. for 3 hours in an ultracentrifuge HIMAC (manufactured by HITACHI KOKI).
  • Example 2- (4) After centrifugation, 28 mL of the solution was removed from the top, and then 0.7 mL of each solution was collected from the top and collected in a 1.5 mL tube. In the same manner as in Example 2- (4), the titer of the AAV vector contained in each recovered solution was quantified.
  • Example 3 Purification by cesium chloride density gradient centrifugation 2
  • a cesium chloride solution prepared with a specific gravity of 1.39 was added and filled up to 10.5 mL. This solution was added to a 13PA tube for ultracentrifugation (manufactured by HITACHI-KOKI), and centrifuged with an ultracentrifuge at 38000 rpm, 18 ° C. for 16 hours. After centrifugation, 0.7 mL was collected in order from the top of the tube, and the contents were collected. The titer of the AAV vector in each recovered solution was quantified in the same manner as in Example 2- (4).
  • Example 3- (2) Desalination by dialysis Several fractions having high titers in Example 3- (2) were mixed and added to a Slide-A-lyzer dialysis cassette (Pierce).
  • the purified AAV solution was desalted by dialysis twice at 4 ° C. for 3 hours with 1 L of phosphate buffered saline (PBS) and overnight at 4 ° C. with 500 mL of PBS / 5% sorbitol solution. Thereafter, the solution was collected, sterilized with a 0.22 ⁇ m filter (Millipore), and stored at ⁇ 80 ° C. until use.
  • the titer of the purified AAV solution was quantified in the same manner as in Example 2- (4).
  • Example 4 Screening of AAV2 Random Peptide Library (1) Tail Vein Administration to Mice
  • the purified AAV solution obtained in Example 3- (3) was adjusted to 1 ⁇ 10 13 viral genome (VG) / kg.
  • NucleoSpin registered trademark
  • PCR was performed 30 cycles, with 98 ° C. for 10 seconds, 55 ° C. for 15 seconds, and 68 ° C. for 15 seconds.
  • DNA was purified using Nucleospin extract II (manufactured by Machalai Nagel) and cleaved using restriction enzyme BglI. After electrophoresis, the product was purified using Nucleospin extract II (manufactured by Machalai Nagel) and AAV2WG-Cap-ScaI-S4 prepared in Example 1 using DNA ligation kit ⁇ Mighty Mix> (manufactured by Takara Bio). Recloned into / pUC118Sx.
  • VEEGRRGQ SEQ ID NO: 15
  • GGDATRG SEQ ID NO: 16
  • GDDTRG SEQ ID NO: 30
  • GAMGSV SEQ ID NO: 24 and 34
  • Example 5 Evaluation of directionality of AAV vector having acquired peptide sequence
  • Construction of pRC-GDDTRG The AAV2WG-Cap-ScaI-S4 / pUC118Sx clone having the GDDTRG sequence obtained in Example 4- (5) was used as a restriction enzyme DNA fragmentation kit ⁇
  • the helper plasmid pRC-GDDTGRG was obtained by ligation using Mighty Mix> (manufactured by Takara Bio Inc.).
  • Example 5- (2) Administration of AAV Purified Solution to Mice
  • the purified AAV solution obtained in Example 5- (2) was administered from the mouse tail vein so that the mouse was 1 ⁇ 10 13 VG / kg.
  • Table 3 shows that the AAV vector of the capsid having the GDDTRG sequence easily migrates to the lymph nodes, and that the AAV genome is maintained even 6 weeks after administration.
  • SYBR PrimeScript RT-PCR Kit manufactured by Takara Bio Inc.
  • the expression level of the AsRed2 gene primer having the sequences of SEQ ID NOs: 38 and 39
  • the mouse GAPDH gene SEQ ID NOs: 40 and 41
  • Example 6 Evaluation of Antitumor Activity Using IL-12 Gene-Loaded AAV2 Mutant (1) Construction of pAAV2-IL12 Mouse IL-12a-p35 gene (GenBank Accession No .: NM_008351) was expressed as mIL12a-fwd primer (SEQ ID NO: 42) And cDNA prepared from mouse spleen using mIL12a-rev primer (SEQ ID NO: 43) as a template and amplified by PrimeSTAR MAX DNA Polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.).
  • the obtained amplified fragment and a vector fragment obtained by digesting pAAV-MCS Expression Vector (CELL BIOLABS) with EcoRI (Takara Bio) and BamHI (Takara Bio) were used as an In-Fusion HD Cloning Kit ( Was used to obtain pAAV2-mIL12a.
  • the mouse IL-12b-p40 gene (GenBank Accession No .: NM_008352) was prepared from the mouse spleen with the mIL12b-fwd primer (SEQ ID NO: 44) and the mIL12b-rev primer (SEQ ID NO: 45) incorporating the T2A sequence.
  • Amplification was performed using PrimeSTAR MAX DNA Polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.) using cDNA as a template.
  • the obtained amplified fragment and a vector fragment obtained by digesting pAAV2-mIL12a with BamHI and HindIII were ligated using In-Fusion HD Cloning Kit (Clontech) to obtain pAAV2-mIL12. That is, pAAV2-mIL12 retains a polynucleotide linked in the order of IL-12a-p35 gene, T2A, and IL-12b-p40 gene, and produces mature IL12 protein.
  • pAAV-AsRed2 was transfected instead of pAAV2-mIL12 and used as a control.
  • the medium was completely removed, 20 mL of DMEM containing 2% FBS and 2 mM sodium L-glutamate was added, and the cells were cultured in a CO 2 incubator at 37 ° C. for 48 hours. Thereafter, AAV vectors were produced and purified by the methods shown in Example 2- (3) and Example 3. Thereafter, the titer of the AAV vector was quantified by the method shown in Example 2- (4).
  • AAV2-IL12 having a GDDTRG mutant capsid was shown to have antitumor activity.
  • Example 7 Evaluation of Directivity of AAV Vector Having Acquired Peptide Sequence-2
  • GGDATRG sequence SEQ ID NO: 16
  • GAMGGSV sequence SEQ ID NO: 24
  • Example 7- (1) Production and purification of AAV2-AsRed2 capsid mutants Using pRC-GGDATRG or pRC-GAMGGSV prepared in Example 7- (1), each capsid mutation was carried out according to the method described in Example 5- (2). AAV-AsRed2 vector having Thereafter, the titer of the AAV vector was quantified by the method shown in Example 2- (4).
  • an AAV capsid protein mutant having directivity for the heart and immune organs, particularly lymph nodes, is provided, and a method for efficiently introducing genes into the lymph nodes is provided.
  • SEQ ID NO: 1 AAV2 capsid 586-591 coding sequence
  • SEQ ID NO: 2 Converted AAV2 capsid coding sequence
  • SEQ ID NO: 3 Ampicillin resistance gene before conversion
  • SEQ ID NO: 4 Ampicillin resistance gene after conversion
  • SEQ ID NO: 5 AAV2 rep gene before conversion
  • SEQ ID NO: 6 AAV2 rep gene after conversion
  • SEQ ID NO: 7 DNA sequence coding random peptide
  • SEQ ID NO: 8 Primer for synthesizing double strand DNA
  • SEQ ID NO: 10 Reverse primer for quantitation of AAV titer
  • SEQ ID NO: 11 Forward primer1 for amplification of random peptide coding region
  • SEQ ID NO: 12 Reverse primer1 for amplification of random peptide coding region
  • SEQ ID NO: 13 Forward primer2 for amplification of random peptide coding region
  • SEQ ID NO: 14

Abstract

　本発明は、配列表の配列番号１５、配列番号１６、配列番号２４及び配列番号３０からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドタンパク質を含むＡＡＶ粒子、該キャプシドタンパク質をコードする核酸、該核酸を含有するＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する細胞、該細胞の製造方法を提供する。

Description

ＡＡＶ変異体
　本発明はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドタンパク質の変異体をコードする核酸、当該キャプシドタンパク質の変異体を含むＡＡＶ粒子及び当該粒子を使用する遺伝子導入細胞の製造方法に関する。
　ＡＡＶは、ふたつのオープンリーディングフレームｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子を含む４．７ｋｂの１本鎖ＤＮＡをゲノムとするウイルスである。ｒｅｐ遺伝子は、ゲノム複製に必要な４種のタンパク質（Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、及びＲｅｐ４０）をコードし、ｃａｐ遺伝子は、ウイルスキャプシド形成のために集成する３種のキャプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３）及びＡｓｓｅｍｂｌｙ－Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　（ＡＡＰ）を発現する。自然界でのＡＡＶの複製はアデノウイルス、ヘルペスウイルスなどのヘルパーウイルスの存在に左右される。ヘルパーウイルスが存在しない場合、ＡＡＶは、そのゲノムがエピソームに維持されるか、又は宿主染色体に組込まれ潜伏状態となる。現在、１００を超えるＡＡＶ血清型、クレード（非特許文献１）が同定されているが、特にＡＡＶ２が遺伝子送達ベクターとして開発が進められている。
　１９８９年にＡＡＶ２を基に遺伝子送達ベクターシステムが初めて開発されている。ＡＡＶを基にしたベクターは、多くの利点を有することが示されている。野生型ＡＡＶは非病原性であり、いずれの既知の疾患とも病原学的関係を有さないので、ＡＡＶを基にしたベクターは極めて安全だと言われている。加えてＡＡＶは、効率の高い遺伝子導入能を有する。
　ＡＡＶ粒子の投与でさまざまな標的臓器、標的細胞に長期的に安定した遺伝子導入が可能である。現在までに、骨格筋、肝臓（肝細胞）、心臓（心筋細胞）、神経細胞、膵腺細胞、膵島細胞に高い効率で遺伝子を導入することが示されている。更にＡＡＶは、ヒト臨床試験において使用された実績を有する。一方で、ＡＡＶのキャプシドタンパク質を改変してＡＡＶの細胞指向性を変化させる試みや、中和抗体によるＡＡＶ粒子の除去を回避する試みが行われている。例えば、神経膠細胞、気道上皮細胞、冠動脈血管内皮細胞又は肺などの特定の臓器や細胞に指向性を有するＡＡＶキャプシドの作製や、膠芽腫、メラノーマ、肺がん又は乳がんなどの腫瘍細胞に指向性を有するＡＡＶキャプシドの作製が行われてきた（非特許文献２）。
Ｇａｏ他、ジャーナル　オブ　ウイロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、第７８巻、６３８１－６３８８頁、２００４年 Ａｄａｃｈｉ　Ｋ他、ジーン　セラピー　アンド　レギュレーション（Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ．Ｒｅｇｕｌ．）、第５巻、３１－５５頁、２０１０年
　本発明の目的は、心臓や免疫器官、特にリンパ節に指向性を有するＡＡＶキャプシドタンパク質変異体を提供し、リンパ節に効率的に遺伝子を導入する方法を提供することにある。
　本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意努力した結果、配列表の配列番号１５、配列番号１６、配列番号２４及び配列番号３０からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶ粒子を作製し、本発明を完成させた。
　すなわち本発明を概説すれば、
［１］配列表の配列番号１５、配列番号１６、配列番号２４及び配列番号３０からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドを含有させたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドタンパク質変異体をコードする核酸、
［２］ＡＡＶキャプシドタンパク質がＡＡＶ２由来である［１］記載の核酸、
［３］ＡＡＶ２のＶＰ１のアミノ酸番号５８８番に続く位置に前記ペプチドを含有させた［１］記載の核酸、
［４］［１］～［３］のいずれか１項に記載の核酸を含む組換えＤＮＡ、
［５］［１］～［３］のいずれか１項に記載の核酸又は［４］記載の組換えＤＮＡを含む細胞、
［６］配列表の配列番号１５、配列番号１６、配列番号２４及び配列番号３０からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドを含有させたＡＡＶキャプシドタンパク質変異体を含むＡＡＶ粒子、
［７］ＡＡＶキャプシドタンパク質がＡＡＶ２由来である［６］記載のＡＡＶ粒子、
［８］ＡＡＶ２のＶＰ１のアミノ酸番号５８８番に続く位置に前記ペプチドを含有させた［６］記載のＡＡＶ粒子、
［９］配列表の配列番号１５、配列番号１６、配列番号２４及び配列番号３０からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドを含有させたＡＡＶキャプシドタンパク質変異体を含むＡＡＶ粒子を細胞に接触させる工程を含む、遺伝子導入細胞の製造方法、
［１０］ＡＡＶキャプシドタンパク質がＡＡＶ２由来である［９］記載の方法、
［１１］ＡＡＶ２のＶＰ１のアミノ酸番号５８８番に続く位置に前記ペプチドを含有させた［９］記載の方法、に関する。
　本発明により、心臓や免疫器官への遺伝子導入に有用な遺伝子導入システムが提供される。本発明のＡＡＶ粒子は免疫器官、特にリンパ節に対し高い細胞指向性を有し、導入した遺伝子を強く発現させることができる。
キャプシドタンパク質にランダムペプチドを含有させる核酸構築物の作製方法を示す図である。
　本明細書において「アデノ随伴ウイルス」は、パルボウイルス科、ディペンドウイルス属に属する、ヒトを含む霊長目の動物やその他の哺乳類に感染する小型のウイルスを示す。以下、Ａｄｅｎｏ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　Ｖｉｒｕｓを省略してＡＡＶと記載する。ＡＡＶはエンベロープを持たない正２０面体の外殻（キャプシド）とその内部に１本の１本鎖ＤＮＡを有する。本明細書において、ＡＡＶは野生型ウイルス及びその派生物を含み、特に記載する場合を除き全ての血清型及びクレードを含む。
　本明細書において「ベクター」は、ポリヌクレオチドを含む又はポリヌクレオチドに会合して、ポリヌクレオチドの細胞への送達を媒介するために使用することができる分子又は分子の会合体を意味する。例えば、プラスミドベクターやファージベクターなどのベクターＤＮＡ、ウイルスベクター粒子、リポソーム、及び他の遺伝子送達ビヒクルが挙げられ、これらは特に記載する場合を除き全てベクターに含まれる。
　本明細書において「キャプシドタンパク質」は、ＡＡＶのゲノムに存在するｃａｐ遺伝子にコードされるタンパク質で、ＡＡＶのキャプシドを構成するタンパク質を意味する。野生型ＡＡＶゲノムは３種類のキャプシドタンパク質をコードし、ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３が存在する。本明細書においては、ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３のいずれもがキャプシドタンパク質に含まれる。
（１）ＡＡＶキャプシドタンパク質変異体をコードする核酸
　本発明の核酸は、配列表の配列番号１５、配列番号１６、配列番号２４及び配列番号３０からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドを含有させたＡＡＶキャプシドタンパク質変異体をコードする核酸である。
　本発明の核酸がコードするＡＡＶキャプシドタンパク質変異体は、１型ＡＡＶ（ＡＡＶ１）、２型ＡＡＶ（ＡＡＶ２）、３型ＡＡＶ（ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂなど）、４型ＡＡＶ（ＡＡＶ４）、５型ＡＡＶ（ＡＡＶ５）、６型ＡＡＶ（ＡＡＶ６）、７型ＡＡＶ（ＡＡＶ７）、８型ＡＡＶ（ＡＡＶ８）、９型ＡＡＶ（ＡＡＶ９）、１０型ＡＡＶ（ＡＡＶ１０）、１１型ＡＡＶ（ＡＡＶ１１）、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、ヒツジＡＡＶなど、任意のＡＡＶキャプシドタンパク質にペプチドを挿入するか、又はＡＡＶキャプシドタンパク質のアミノ酸配列の一部をペプチドで置換する（すなわち、ＡＡＶキャプシドタンパク質にペプチドを含有させる）ことにより調製することができる。本発明においては、ＡＡＶ２のキャプシドタンパク質が特に好適に使用できる。
　本発明の核酸において、ＡＡＶキャプシドタンパク質に含有させるペプチドは、配列表の配列番号１５、配列番号１６、配列番号２４及び配列番号３０からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。さらに、前記のペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端にスペーサー配列を付加させてもよい。スペーサー配列は１～５アミノ酸残基が好適である。スペーサー配列のアミノ酸は特に限定は無いが、例えばグリシン、アラニン及びセリンからなる群より選択されるアミノ酸が使用できる。
　ペプチドを含有させるＡＡＶキャプシドタンパク質は、ＡＡＶのＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３のいずれもが使用できる。ＶＰ１のみ、ＶＰ２のみ又はＶＰ３のみにペプチドを含有させても良く、ＶＰ１～ＶＰ３の全てのキャプシドタンパク質にペプチドを含有させても良い。さらに、ＶＰ１及びＶＰ２、ＶＰ２及びＶＰ３、ＶＰ１及びＶＰ３の組合せのように、２種類のキャプシドタンパク質に含有させても良い。ＶＰ１～ＶＰ３は、ＡＡＶゲノムのｃａｐ遺伝子領域にコードされている。本発明の一態様として、ＶＰ１～ＶＰ３に共通した領域にペプチドを含有させて、ＶＰ１～ＶＰ３の全てに変異を導入することができる。また、別の態様として、ＡＡＶのｃａｐ遺伝子領域とは別に、ＶＰ１、ＶＰ２又はＶＰ３をコードする遺伝子を準備し、この遺伝子に変異を導入することができる。この場合、変異を導入した遺伝子にコードされるキャプシドタンパク質に対応するキャプシドタンパク質がＡＡＶのｃａｐ遺伝子領域から発現しないような処置を行っても良い。
　本発明の核酸がコードするＡＡＶキャプシドタンパク質変異体においてペプチドを含有する位置は、ＡＡＶ２のＶＰ１の場合、アミノ酸番号５８８番に続く位置、すなわちアミノ酸番号５８８番の後ろが好ましい。ＡＡＶ２　ＶＰ１のアミノ酸番号５８８番は、ＡＡＶ２のＶＰ２のアミノ酸番号４５１番、ＡＡＶ２のＶＰ３のアミノ酸番号３８６番に相当する。さらに、ＡＡＶ２のＶＰ１のアミノ酸番号５８８番のアミノ酸に対応する、ＡＡＶ２以外の血清型、クレードのＡＡＶのキャプシドタンパク質のアミノ酸を、当業者は容易に特定することができる。例えば、Ｇａｏら、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ　Ｓ　Ａ．）、第９９巻、第１８号、１１８５４－１１８５９頁、２００２年に記載されるＶＰ１のアミノ酸配列のアライメントを参照することができる。例えば、ＡＡＶ２のＶＰ１のアミノ酸番号５８８番は、ＡＡＶ１では５８９番、ＡＡＶ７では５９０番、ＡＡＶ８では５９１番である。
　本発明の核酸がコードするＡＡＶキャプシドタンパク質変異体は、野生型のＡＡＶキャプシドタンパク質に、配列表の配列番号１５、配列番号１６、配列番号２４及び配列番号３０からなる群より選択されるアミノ酸配列が保持されている以外に、１～数個または複数のアミノ酸が挿入、付加、置換又は欠失されたタンパク質であっても良い。
　本発明の核酸は、適切な制御配列と作動可能に連結してもよい。制御配列には、プロモーター配列、ポリアデニル化シグナル、転写終止配列、上流の調節ドメイン、複製起点、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、エンハンサーなどが含まれる。プロモーター配列には、誘導性プロモーター配列、構成的プロモーター配列が含まれる。制御配列はキャプシドタンパク質の由来となるＡＡＶに固有のものであっても外来性のものであってもよく、天然配列であっても合成配列であってもよい。このような、ＡＡＶキャプシドタンパク質変異体を発現可能な組換えＤＮＡも本発明に包含される。
　本発明の組換えＤＮＡは、試験管内、生体外及び生体内の細胞へ本発明の核酸を送達し、当該細胞にＡＡＶキャプシドタンパク質変異体を発現する能力を付与するのに有用である。そして、本発明の核酸が送達された細胞はＡＡＶ粒子を製造するのに有用である。当該組換えＤＮＡは特に、動物細胞、より好ましくは哺乳類細胞へ本発明の核酸を送達又は導入するのに用いることができる。
　本発明では、ベクターとして使用されているＤＮＡに本発明の核酸を保持させて本発明の組換えＤＮＡを作製することができる。例えば、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ、トランスポゾン、コスミドＤＮＡ、エピソーマルＤＮＡ、ウイルスゲノムが使用できる。
（２）本発明の核酸を含む細胞
　本発明はまた、本発明の核酸、具体的には前記（１）の組換えＤＮＡを含む宿主細胞、例えば単離された宿主細胞を提供する。単離された細胞は、例えばインビトロで維持されている細胞株である。本発明の宿主細胞は、以下に説明するように本発明のＡＡＶ粒子の製造に有用である。本発明の宿主細胞がＡＡＶ粒子を製造するために使用される場合、これは「パッケージング細胞」又は「プロデューサー細胞」と称することがある。本発明の宿主細胞は、前記（１）記載の本発明の組換えＤＮＡがゲノムに組み込まれても良く、ＡＡＶキャプシドタンパク質変異体を一過性に発現するように前記の組換えＤＮＡが細胞内に保持されていても良い。
　宿主細胞への本発明の組換えＤＮＡの導入は、公知の方法により実施することができる。例えば、電気穿孔法、リン酸カルシウム沈殿法、細胞への直接的微量注入法、リポソーム媒介型遺伝子導入法、高速微粒子銃を使用する核酸送達法などを使用できる。また、ウイルスベクターを使用する場合には、当該ベクターに適した感染法を選択すればよい。このような確立された技術を用いて、本発明の組換えＤＮＡは宿主細胞の染色体に安定的に、又は宿主細胞の細胞質に一過性に導入される。安定した形質転換のために、選択マーカー、例えばネオマイシン耐性遺伝子（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼをコードしている）、ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子（アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）をコードしている）などの周知の選択マーカーを本発明の組換えＤＮＡに連結することができる。
　宿主細胞には、例えば、マウス細胞、及び霊長類細胞（例えば、ヒト細胞）などを含む哺乳類細胞、昆虫細胞などの、様々な細胞が使用できる。適当な哺乳類細胞は、初代細胞及び細胞株を含むがこれらに限定されるものではなく、適当な細胞株として、２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、３Ｔ３マウス線維芽細胞、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２線維芽細胞、ＣＨＯ細胞やこれらの細胞から派生した細胞などが挙げられる。
（３）本発明の核酸にコードされるアミノ酸配列を含有させたＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶ粒子
　本発明のＡＡＶ粒子は、配列表の配列番号１５、配列番号１６、配列番号２４及び配列番号３０からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドを含有させたＡＡＶキャプシドタンパク質変異体を含むＡＡＶ粒子である。当該ＡＡＶ粒子は、前記（２）に記載される宿主細胞により製造することができる。本発明のＡＡＶ粒子は、心臓（心筋）、免疫器官（免疫細胞）、特にリンパ節に指向性を有し、傍大動脈リンパ節及び／又は大腿リンパ節への遺伝子導入に有用である。本発明のＡＡＶ粒子により導入された遺伝子は、前記組織、器官及び細胞で強く発現される。
　ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ粒子の製造に必要ないくつかの成分を含む細胞をパッケージング細胞として利用して製造することができる。第１の成分は、宿主細胞内で複製及びＡＡＶ粒子にパッケージングされ得る組換えＡＡＶのベクターゲノム（発現ベクターとも呼ばれる）である。組換えＡＡＶのベクターゲノムは、所望の異種ポリヌクレオチドと、その両側に、すなわち５’及び３’側にそれぞれＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列が位置する。所望の異種ポリヌクレオチドは、その発現のための制御配列を有しうる。ＩＴＲ配列の塩基配列は公知であり、例えば、ＡＡＶ２のＩＴＲ配列については、Ｋｏｔｉｎ　Ｒ．Ｍら、ヒューマン　ジーン　セラピー（Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ）、第５巻、７９３－８０１頁、１９９４年を参照することができる。さらに、ＩＴＲ配列として、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７など、様々なＡＡＶ血清型のいずれかに由来するＩＴＲ配列を使用することができる。本発明において使用されるＩＴＲ配列は、野生型ＡＡＶ由来の配列でも良く、ヌクレオチドの挿入、欠失又は置換により変更されていても良い。ＩＴＲ配列は、Ｒｅｐタンパク質の存在下で、組換えＡＡＶのベクターゲノムの複製を可能にし、ＡＡＶ粒子形成の際にキャプシド粒子内への組込みを可能にする。
　本発明のＡＡＶ粒子に搭載可能な所望の異種ポリヌクレオチドは、一般にサイズが約５キロベース（ｋｂ）未満であり、例えばレシピエントに欠損した又は失われた所望のタンパク質をコードする遺伝子、所望の生物学的又は治療的作用（例えば、抗菌、抗ウイルス又は抗腫瘍作用）を有するタンパク質をコードする遺伝子、有害な又は望ましくないタンパク質の産生を阻害又は低下するＲＮＡをコードする所望のヌクレオチド配列、抗原性タンパク質をコードするヌクレオチド配列など、目的に応じて適宜設定することができる。
　本発明の一態様として、組換えＡＡＶのベクターゲノムは、ｃａｐ遺伝子領域及び／又はｒｅｐ遺伝子領域を欠いており、この態様の組換えＡＡＶのベクターゲノムがパッケージングされたＡＡＶ粒子は、感染した細胞内で単独で再度ＡＡＶ粒子に複製されない。
　ＡＡＶ粒子の製造に必要な第２の成分は、ＡＡＶヘルパー機能を提供する構築物である。この構築物は、ＡＡＶ粒子の形成のために必要なＡＡＶ遺伝子産物を提供するＡＡＶ由来の遺伝子をコードしている。すなわち、主要なＡＡＶ　ＯＲＦであるｒｅｐ遺伝子領域及びｃａｐ遺伝子領域のコード領域の一方又は両方を含む。本発明のＡＡＶ粒子を製造するために、少なくとも配列表の配列番号１５、配列番号１６、配列番号２４及び配列番号３０からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドを含有させたＡＡＶキャプシドタンパク質変異体をコードする核酸をｃａｐ遺伝子として使用する。この変異体を発現する能力を有している、前記（２）に記載される本発明の宿主細胞をＡＡＶ粒子の製造に使用することができる。ＡＡＶ粒子は多数のキャプシドタンパク質から構成される外殻を有するが、全てのキャプシドタンパク質が変異体であっても良く、その一部が変異体で残りが野生型のキャプシドタンパク質でもあっても良い。さらに、本発明のＡＡＶ粒子に含まれるキャプシドタンパク質変異体は１種類の変異体であっても良く、複数種の変異体であっても良い。
　ＡＡＶのｒｅｐ遺伝子は、ｒｅｐ遺伝子コード領域に含まれ、複製タンパク質Ｒｅｐ　７８、Ｒｅｐ　６８、Ｒｅｐ　５２及びＲｅｐ　４０をコードする遺伝子を含む。これらのＲｅｐ発現産物は、ＡＡＶゲノムＤＮＡ複製起点の認識、結合及びニッキング、ＤＮＡヘリカーゼ活性及びＡＡＶ由来プロモーターの転写の変更を含む、多くの機能を有することが示されている。
　ＡＡＶ粒子の製造に必要な第３の成分は、ＡＡＶ複製のためのヘルパーウイルス機能（アクセサリー機能とも呼ばれる）である。ヘルパー機能の導入には一般にアデノウイルスが使用されるが、例えば１型又は２型単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルスなどのウイルスも使用することができる。ウイルスを使用する場合は、宿主細胞にウイルスをヘルパーウイルスとして感染させる。例えば、アデノウイルスの初期遺伝子の発現のみがＡＡＶ粒子のパッケージングに必要なので、後期遺伝子発現を呈さないアデノウイルスを用いてもよい。後期遺伝子発現を欠損するアデノウイルス変異体（例えばｔｓ１００Ｋ又はｔｓ１４９アデノウイルス変異体）を使用することができる。あるいは、ヘルパーウイルスから単離したヘルパーウイルス機能に必要な核酸を使用し、ヘルパーウイルス機能を提供する核酸構築物を作製して宿主細胞に導入することができる。ヘルパーウイルス機能を提供する構築物は、１種又は複数のヘルパーウイルス機能を提供するヌクレオチド配列を含み、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド又は他のウイルスの形で宿主細胞に提供される。
　ＡＡＶ粒子を製造するために、前記（ａ）第１の成分である組換えＡＡＶのベクターゲノムを宿主細胞に導入する工程、（ｂ）第２の成分であるＡＡＶヘルパー機能を提供する構築物を宿主細胞に導入する工程、（ｃ）第３の成分であるヘルパーウイルス機能を宿主細胞に導入する工程、を実施する。これらの工程は同時に実施されても良く、順番に実施されても良い。（ａ）～（ｃ）の順番はどのような順番であっても良い。宿主細胞に第１～第３の成分が導入されることにより、ｒｅｐ遺伝子の発現産物は、組換えＡＡＶのベクターゲノムを切出し、複製する。発現されたキャプシドタンパク質はキャプシドを形成し、組換えＡＡＶのベクターゲノムがキャプシドにパッケージングされてＡＡＶ粒子が産生される。そして、この宿主細胞がＡＡＶキャプシドタンパク質変異体を発現する場合、産生されたＡＡＶ粒子の外殻にはＡＡＶキャプシドタンパク質変異体が含まれている。
　ＡＡＶ粒子は、宿主細胞の培養上清やその細胞溶解物から、ＣｓＣｌ密度勾配遠心分離のような様々な精製法を用いてＡＡＶ粒子を単離、精製することができる。前記（ｃ）工程にウイルスが使用される場合、例えば、ＡＡＶ粒子とヘルパーウイルスとを、サイズに基づいて分離する工程を加えてもよい。また、ヘパリンに対する親和性の差に基づいて、ＡＡＶ粒子をヘルパーウイルスから分離することもできる。さらに、残存するヘルパーウイルスは、公知の方法を用いて失活することができる。例えばアデノウイルスは、約６０℃の温度で、例えば２０分間又はそれ以上加熱することにより失活することができる。ＡＡＶ粒子は熱に極めて安定であるため、この処置はヘルパーウイルスとして使用したアデノウイルスの選択的除去に有効である。
（４）本発明の遺伝子導入細胞の製造方法
　前記（３）により得られる本発明のＡＡＶ粒子は、遺伝子治療やその他の目的で、所望の異種ポリヌクレオチドの細胞への送達のために使用される。一般にＡＡＶ粒子は、インビボ又はインビトロのいずれかで細胞へ導入される。インビトロで導入する場合、生体より取得された細胞にＡＡＶ粒子を接触させることにより導入する。この細胞を生体に移植することもできる。細胞を生体に導入する場合は、薬学的組成物として製剤化し、筋肉内、静脈内、皮下及び腹腔内投与などの様々な技術を利用できる。インビボで形質導入する場合は、ＡＡＶ粒子を薬学的組成物として製剤化し、一般に非経口投与する（例えば、筋肉内、皮下、腫瘍内、経皮、髄腔内などの投与経路により投与する）。ＡＡＶ粒子を含む薬学的組成物は、薬剤として許容される担体、及び必要に応じて他の薬剤、医薬品、安定化剤、緩衝液、担体、アジュバント、希釈液などを含む。
調製例１　ｐＡＡＶ－ＡｓＲｅｄ２の構築
　ｐＡｓＲｅｄ２－Ｃ１　Ｖｅｃｔｏｒ（クロンテック社製）を鋳型として、ＣＭＶプロモーターの上流、及びｐｏｌｙＡシグナルの下流に制限酵素ＮｏｔＩの認識部位を付加した約１．６ｋｂの断片をＰＣＲ法によって得た。このＰＣＲ産物をＮｏｔＩ（タカラバイオ社製）で処理してインサートＤＮＡとした。一方ｐＡＡＶ－ＭＣＳ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｖｅｃｔｏｒ（ＣＥＬＬ　ＢＩＯＬＡＢＳ社製）をＮｏｔＩで処理して約２．９ｋｂの断片を調製して、これをベクターとした。このベクターにインサートＤＮＡをＤＮＡ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ＜Ｍｉｇｈｔｙ　Ｍｉｘ＞（タカラバイオ社製）を用いてライゲーションし、これを用いてＥ．Ｃｏｌｉ　ＨＳＴ０８　Ｐｒｅｍｉｕｍ　Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｃｅｌｌｓ（タカラバイオ社製）を形質転換した。得られたクローンから抽出したプラスミドＤＮＡのうち、上流からＣＭＶプロモーター－ＡｓＲｅｄ２－ＭＣＳ－ｐｏｌｙＡシグナルの順に挿入されたものをｐＡＡＶ－ＡｓＲｅｄ２とした。
実施例１　ＡＡＶ２ランダムペプチドプラスミドライブラリーの作製
　ＡＡＶ２のゲノムを搭載したプラスミドベクターｐＡＶ１（ＡＴＣＣ　Ｎｕｍｂｅｒ：３７２１５）を汎用宿主（Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　ｈｏｓｔ）のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１より抽出した。抽出したプラスミドから制限酵素ＢｇｌＩＩ（タカラバイオ社製）によりＡＡＶ２のゲノムＤＮＡ（約４．７ｋｂ）を切り出した。このゲノムＤＮＡをｐＵＣ１１８　ＢａｍＨＩ／ＢＡＰ（タカラバイオ社製）に挿入し、得られたプラスミドＤＮＡをＡＡＶ２ＷＧ／ｐＵＣ１１８とした。
　ＡＡＶ２ＷＧ／ｐＵＣ１１８を制限酵素ＳｃａＩ（タカラバイオ社製）で処理し、ｃａｐ遺伝子の１１９０番目から２０１７番目の塩基を含む約０．８ｋｂの断片を得た。この断片をｐＵＣ１１８　ＨｉｎｃＩＩ／ＢＡＰ（タカラバイオ社製）に挿入し、得られたプラスミドＤＮＡをＣａｐ－ＳｃａＩ／ｐＵＣ１１８とした。次に、ＰＣＲ法を用いてＣａｐ－ＳｃａＩ／ｐＵＣ１１８のＣａｐ遺伝子の１７５９番目から１７６１番目の塩基配列ＡＡＣ（Ｎ）をＣＡＧ（Ｑ）に変換、１７６４番目と１７６５番目の塩基の間にスペーサーとしてＧＧＣ、スタッファーとしてＣＡＡＧ、さらにスペーサーとしてＧＣＣの１０塩基を挿入、１７６５番目から１７７３番目の塩基ＣＡＡ（Ｑ）ＧＣＡ（Ａ）ＧＣＴ（Ａ）をＣＡＧ（Ｑ）ＧＣＧ（Ａ）ＧＣＣ（Ａ）に変換、という一連の改変を実施した（カッコ内の文字はコードするアミノ酸を示す）。これによりに制限酵素ＳｆｉＩの認識部位が２か所とそのＳｆｉＩ認識部位に挟まれたスペーサー、スタッファー、スペーサーが挿入された。Ｃａｐ遺伝子の１７５６番目から１７７３番目の変換前後の塩基配列を図１に示し、変換前の塩基配列を配列表の配列番号１に、変換後の塩基配列を配列番号２に示す。塩基配列を変換した後のプラスミドＤＮＡをＣａｐ－ＳｃａＩ－Ｓ４／ｐＵＣ１１８とした。Ｃａｐ－ＳｃａＩ－Ｓ４／ｐＵＣ１１８のＣａｐ遺伝子部分をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＣｌｏｎｉｎｇのためにＰＣＲ法により増幅し、約０．８ｋｂの断片を得、これをインサートＤＮＡとした。
　ＡＡＶ２ＷＧ／ｐＵＣ１１８のアンピシリン耐性遺伝子内の制限酵素ＳｃａＩの認識部位、及びＲｅｐ遺伝子内にある制限酵素ＳｆｉＩの認識部位を、ＰＣＲ法によって塩基配列に変異を導入することにより、これら制限酵素が認識しない配列に改変した。ＳｃａＩ認識部位についてはアンピシリン耐性遺伝子の３０４番目から３０６番目の塩基配列ＧＡＧ（Ｅ）をＧＡＡ（Ｅ）に変換した。変換前の塩基配列を配列番号３に、変換後の塩基配列を配列番号４に示す。ＳｆｉＩの認識部位についてはＲｅｐ遺伝子の２１７番目～２１９番目の塩基配列ＧＣＣ（Ａ）をＧＣＡ（Ａ）に変換した。変換前の塩基配列を配列番号５に、変換後の塩基配列を配列番号６に示す。こうして得られたプラスミドＤＮＡをＳｃａＩ（タカラバイオ社製）で処理し、Ｃａｐ遺伝子の一部である約０．８ｋｂが欠落した線状のベクターを得た。これをＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　Ｃｌｏｎｉｎｇのための線状ベクターとした。
　次にＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（クロンテック社製）とＣｌｏｎｉｎｇ　Ｅｎｈａｎｃｅｒ（クロンテック社製）を用いて前記の線状ベクターにインサートＤＮＡを挿入し、ディレクショナルクローニングを行った。こうして得られたプラスミドＤＮＡをＡＡＶ２ＷＧ－Ｃａｐ－ＳｃａＩ－Ｓ４／ｐＵＣ１１８Ｓｘとした。
　７アミノ酸のランダムペプチドをコードする塩基配列を含むオリゴＤＮＡ（配列番号７）を人工合成により作製し、プライマー（配列番号８）及びＫｌｅｎｏｗ　Ｆｒａｇｍｅｎｔ（タカラバイオ社製）を用いて、３７℃で３時間反応させることでオリゴＤＮＡから二本鎖ＤＮＡを調製した。Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｒｅｍｏｖａｌ　ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて精製した二本鎖ＤＮＡを制限酵素ＢｇｌＩ（タカラバイオ社製）を用いて消化した。このＤＮＡをＤＮＡ　ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｋｉｔ＜Ｍｉｇｈｔｙ　Ｍｉｘ＞（タカラバイオ社製）を用いてＳｆｉＩで消化したＡＡＶ２ＷＧ－Ｃａｐ－ＳｃａＩ－Ｓ４／ｐＵＣ１１８Ｓｘに挿入したプラスミドをＡＡＶ２ＷＧ－ＲＰＬ／ｐＵＣ１１８Ｓｘとし、ＡＡＶ２ランダムペプチドプラスミドライブラリーとして使用した。
実施例２　ＡＡＶ２ランダムペプチドウイルスライブラリーの作製
（１）ＡＡＶ２９３細胞の播種
　培養したＡＡＶ２９３細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を回収後、１０％ＦＢＳ及び２ｍＭ　Ｌ－グルタミン酸ナトリウムを含むＤＭＥＭ（シグマ社製）で５×１０４細胞／ｍＬとなるように懸濁した。細胞培養用Ｔ２２５ｃｍ２フラスコ（コーニング社製）にＡＡＶ２９３細胞を含む溶液を４０ｍＬ添加し、３７℃のＣＯ２インキュベーターで７２時間培養した。
（２）ＡＡＶ２９３細胞へのプラスミド導入
　実施例１で得たＡＡＶ２ＷＧ－ＲＰＬ／ｐＵＣ１１８Ｓｘ　４００ｎｇ及びｐＨＥＬＰ（ｃｅｌｌｂｉｏｌａｂｓ社製）を４０μｇずつを、一般的なリン酸カルシウム法を用いてＡＡＶ２９３細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションの６時間後、培地を完全に除去し、２％ＦＢＳ及び２ｍＭ　Ｌ－グルタミン酸ナトリウムを含むＤＭＥＭ　４０ｍＬを添加し、３７℃のＣＯ２インキュベーターで４８時間培養した。
（３）ＡＡＶ２ランダムペプチドウイルスライブラリーの回収
　培養中のＴ２２５ｃｍ２フラスコに、０．５Ｍ　ＥＤＴＡを０．５ｍＬ添加して数分間静置した。その後、ピペッティングでＡＡＶ２９３細胞を剥離させて５０ｍＬチューブに回収し、３００×ｇ、１０分間遠心後、上清を除去した。フラスコ１枚あたり２ｍＬのＴＢＳ（トリス緩衝生理食塩水）に細胞を再懸濁後、エタノール／ドライアイスで１５分間、３７℃のウォーターバスで１５分間、ボルテックス１分間の一連の処理を３回繰り返し、ＡＡＶ－ランダムペプチドウイルスライブラリーを含む細胞破砕液を回収した。この溶液に、ＴＢＳ１ｍＬあたり、１Ｍ　ＭｇＣｌ２を５μＬ、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）ヌクレアーゼ（メルク社製）を終濃度２００Ｕ／ｍＬとなるように添加し、３７℃で３０分間反応させた。その後、０．５Ｍ　ＥＤＴＡをＴＢＳ１ｍＬあたり６．５μＬ添加して反応を停止させた。この細胞破砕液を１００００ｒｐｍ、４℃、１０分間遠心後、上清を回収しＡＡＶベクター溶液とした。
（４）ＡＡＶベクター溶液のリアルタイムＰＣＲによる力価定量
　ＡＡＶベクター溶液２μＬに、１０×ＤＮａｓｅＩバッファー２μＬ、注射用水（大塚製薬社製）１５．２μＬ、ＤＮａｓｅＩ（タカラバイオ社製）０．８μＬを添加し、３７℃で１時間インキュベートし、遊離のゲノムＤＮＡやプラスミドＤＮＡを除去した。ＤＮａｓｅＩを不活化するために９９℃、１０分間の熱処理後、注射用水１５μＬ、１０×ＰｒｏＫバッファー［０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　（ｐＨ７．８）、０．１Ｍ　ＥＤＴＡ、５％　ＳＤＳ］４μＬ、ＰｒｏＫ（タカラバイオ社製）１μＬを添加し、５５℃で１時間インキュベートした。その後、ＰｒｏＫを不活化するために９５℃１０分間処理した。このサンプルに対し、ＳＹＢＲ（登録商標）　Ｐｒｅｍｉｘ　ＥｘＴａｑ２（タカラバイオ社製）及びプライマー（配列番号９及び配列番号１０）を用いて、キットに添付の説明書に従いＡＡＶの力価定量を行った。なおサンプルは、注射用水で５０倍希釈した溶液を２μＬ用いた。また、標準品として、ｐＡＶ１を制限酵素で消化し、線状化したＤＮＡを用いた。
実施例３　ＡＡＶ２ランダムペプチドウイルスライブラリーの精製
（１）塩化セシウム密度勾配遠心分離による精製１
　超遠心用の４０ＰＡチューブ（ＨＩＴＡＣＨＩ－ＫＯＫＩ社製）に、底から比重１．５に調製した塩化セシウム溶液を４ｍＬ、比重１．２５に調製した塩化セシウム溶液を４ｍＬ、実施例２－（４）で調製したＡＡＶベクター溶液を２８ｍＬの順に重層し、超遠心機ＨＩＭＡＣ（ＨＩＴＡＣＨＩ　ＫＯＫＩ社製）で２５０００ｒｐｍ、１６℃、３時間遠心した。遠心後、上から２８ｍＬの溶液を除き、続いて上から０．７ｍＬずつ溶液を採取して１．５ｍＬチューブにそれぞれ回収した。実施例２－（４）と同様の方法で、各回収液に含まれるＡＡＶベクターの力価を定量した。
（２）塩化セシウム密度勾配遠心分離による精製２
　実施例３－（１）で力価の高かった数フラクションに、比重１．３９に調製した塩化セシウム溶液を加えて、１０．５ｍＬにフィルアップした。この溶液を超遠心用１３ＰＡチューブ（ＨＩＴＡＣＨＩ－ＫＯＫＩ社製）に添加し、超遠心機で３８０００ｒｐｍ、１８℃、１６時間遠心した。遠心後、チューブの上から順に０．７ｍＬずつ採取して内容液を回収した。各回収液のＡＡＶベクターの力価を実施例２－（４）と同様の方法で定量した。
（３）透析による脱塩
　実施例３－（２）で力価の高かった数フラクションを混合し、Ｓｌｉｄｅ－Ａ－ｌｙｚｅｒ透析カセット（Ｐｉｅｒｃｅ社製）に添加した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）１Ｌにより４℃で３時間の透析を２回、ＰＢＳ／５％ソルビトール溶液５００ｍＬにより４℃で一晩透析を行うことで精製ＡＡＶ溶液の脱塩を行った。その後、溶液を回収し、０．２２μｍフィルター（ミリポア社製）で滅菌後、使用するまで－８０℃で保存した。また別途、精製ＡＡＶ溶液の力価を実施例２－（４）と同様の方法で定量した。
実施例４　ＡＡＶ２ランダムペプチドライブラリーのスクリーニング
（１）マウスへの尾静脈投与
　実施例３－（３）で得られた精製ＡＡＶ溶液を、１×１０１３ウイルスゲノム（ＶＧ）／ｋｇとなるように、ＢＡＬＢ／ｃマウスの尾静脈から投与した。投与７２時間後に鼠径リンパ節及び傍大動脈リンパ節を回収し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）　ｔｉｓｓｕｅ（マッハライ・ナーゲル社製）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した（ラウンド１）。
（２）ＰＣＲによるランダムペプチド配列のリクローニング
　実施例４－（１）で抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）　ＧＸＬ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いてランダムペプチド配列をコードするＤＮＡを増幅した。プライマーはフォワードプライマー１（配列番号１１）及びリバースプライマー１（配列番号１２）を用いた。ＰＣＲを９８℃１０秒、５５℃１５秒、６８℃４０秒を１サイクルとして３０サイクル繰り返した。続いて、この反応液の１／２５量を用いてフォワードプライマー２（配列番号１３）及びリバースプライマー２（配列番号１４）を用いて同量の反応液を調製した。ＰＣＲを９８℃１０秒、５５℃１５秒、６８℃１５秒を１サイクルとして３０サイクル実施した。この反応液からＮｕｃｌｅｏｓｐｉｎ　ｅｘｔｒａｃｔ　ＩＩ（マッハライ・ナーゲル社製）を用いてＤＮＡを精製し、制限酵素ＢｇｌＩを用いて切断した。電気泳動後、Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ　ｅｘｔｒａｃｔ　ＩＩ（マッハライ・ナーゲル社製）を用いて精製し、ＤＮＡ　ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｋｉｔ＜Ｍｉｇｈｔｙ　Ｍｉｘ＞（タカラバイオ社製）を用いて、実施例１で調製したＡＡＶ２ＷＧ－Ｃａｐ－ＳｃａＩ－Ｓ４／ｐＵＣ１１８Ｓｘにリクローニングした。
（３）ＡＡＶ２ランダムペプチドウイルスライブラリーの製造と精製
　実施例４－（２）で得たプラスミドを使用し、実施例２及び実施例３と同様の方法で、ＡＡＶ２ランダムペプチドウイルスライブラリーの製造と精製を行った。
（４）スクリーニング
　実施例４－（１）と同様の方法でスクリーニングを行い、ゲノムＤＮＡを抽出した（ラウンド２）。さらに、抽出したゲノムＤＮＡを使用して、再度リクローニング、ライブラリー製造と精製及びスクリーニングを行いゲノムＤＮＡを抽出した（ラウンド３）。
（５）ランダムペプチドのシークエンス
　各スクリーニング段階（ラウンド１～ラウンド３）のＡＡＶランダムペプチドプラスミドライブラリーのシークエンスを９０数クローンずつ行った。そのうち複数回出現したクローンのペプチド配列と出現回数を、傍大動脈リンパ節から回収したクローンについて表１に、大腿リンパ節から回収したクローンについて表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表１及び表２に示すように、両標的組織共に特定のペプチド配列が集積していることがわかった。特に傍大動脈リンパ節ではＶＥＥＧＲＲＧＱ（配列番号１５）及びＧＧＤＡＴＲＧ（配列番号１６）、大腿リンパ節ではＧＤＤＧＴＲＧ（配列番号３０）が集積しやすく、また両リンパ節でＧＡＭＧＧＳＶ（配列番号２４及び３４）が確認され、これらはリンパ節に感染しやすい配列であることが示唆された。
実施例５　取得ペプチド配列を持つＡＡＶベクターの指向性評価
（１）ｐＲＣ－ＧＤＤＧＴＲＧの構築
　実施例４－（５）で得られたＧＤＤＧＴＲＧ配列を持つＡＡＶ２ＷＧ－Ｃａｐ－ＳｃａＩ－Ｓ４／ｐＵＣ１１８Ｓｘクローンを制限酵素ＳｎａＢＩ（タカラバイオ社製）とＨｉｎｄＩＩＩ（タカラバイオ社製）で消化して得た断片と、ｐＡＡＶＲＣ２ベクター（ＣＥＬＬ　ＢＩＯＬＡＢＳ社製）をＳｎａＢＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化して得たベクター断片を、ＤＮＡ　ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｋｉｔ＜Ｍｉｇｈｔｙ　Ｍｉｘ＞（タカラバイオ社製）により連結し、ヘルパープラスミドｐＲＣ－ＧＤＤＧＴＲＧを得た。
（２）ＡＡＶ２－ＡｓＲｅｄ２キャプシド変異体の製造と精製
　調製例１で作製したｐＡＡＶ－ＡｓＲｅｄ２、ｐＨＥＬＰ及び実施例５－（１）で調製したｐＲＣ－ＧＤＤＧＴＲＧとをそれぞれ２５μｇずつを、一般的なリン酸カルシウム法を用いてＴ２２５ｃｍ２に播種しておいたＡＡＶ２９３細胞にトランスフェクションした。なお、ｐＲＣ－ＧＤＤＧＴＲＧの代わりに野生型キャプシドを搭載したｐＡＡＶＲＣ２ベクターをトランスフェクションし、対照とした。トランスフェクションの６時間後、培地を完全に除去し、２％ＦＢＳ及び２ｍＭ　Ｌ－グルタミン酸ナトリウムを含むＤＭＥＭ４０ｍＬを添加し、３７℃のＣＯ２インキュベーターで４８時間培養した。その後、実施例２－（３）、実施例３に示した方法で、２種類のＡＡＶ－ＡｓＲｅｄ２ベクターを製造・精製した。その後、実施例２－（４）に示した方法で、ＡＡＶベクターの力価を定量した。
（３）ＡＡＶ精製溶液のマウスへの投与
　マウス一匹当たり１×１０１３ＶＧ／ｋｇとなるように、マウス尾静脈から実施例５－（２）で得た精製ＡＡＶ溶液を投与した。
（４）リンパ節及びその他組織からのゲノムＤＮＡ調製及びＡＡＶゲノムの定量
　実施例５－（３）でＡＡＶを投与したマウスを、１週間後、又は６週間後に安楽死させ、各組織を回収した。ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ　ｔｉｓｓｕｅ（マッハライ・ナーゲル社製）を用いて、各組織からゲノムＤＮＡを抽出した。抽出したゲノムＤＮＡをサンプルとしてリアルタイムＰＣＲを実施し、各組織中に含まれるＡＡＶベクターゲノム量を定量した。各組織中の全ゲノムＤＮＡ１μｇ当たりのＡＡＶゲノムＤＮＡの分子数を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表３から、ＧＤＤＧＴＲＧの配列を有するキャプシドのＡＡＶベクターはリンパ節に移行しやすく、また、投与６週間後においてもＡＡＶゲノムが維持されていることが示された。
（５）リンパ節及びその他組織からのＲＮＡ抽出及びＡｓＲｅｄ２発現量の定量
　実施例５－（４）で得た各組織をＲＮＡ　ｌａｔｅｒ（キアゲン社製）に浸して４℃で一晩反応させた。その後、バイオマッシャーＩＩ（ニッピ社製）を用いてホモジナイズを行い、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ　ＲＮＡ　ＩＩ（マッハライ・ナーゲル社製）でＲＮＡを抽出した。Ｏｎｅｓｔｅｐ　ＳＹＢＲ　ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ　ＲＴ－ＰＣＲ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて、ＡｓＲｅｄ２遺伝子（配列番号３８及び３９の配列を有するプライマー）の発現量及び補正用としてマウスＧＡＰＤＨ遺伝子（配列番号４０及び４１の配列を有するプライマー）の発現量を定量した。ＡｓＲｅｄ２発現量をＧＡＰＤＨ発現量で補正した結果を表４に記載する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　上記の結果から、ＧＤＤＧＴＲＧが挿入された変異体キャプシドを持つＡＡＶベクターを用いると、野生型キャプシドを持つＡＡＶベクターと比較し、種々のリンパ節及び心臓で高い遺伝子発現効率が得られることが示された。
実施例６　ＩＬ－１２遺伝子搭載ＡＡＶ２変異体による抗腫瘍活性の評価
（１）ｐＡＡＶ２－ＩＬ１２の構築
　マウスＩＬ－１２ａ－ｐ３５遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．：ＮＭ＿００８３５１）をｍＩＬ１２ａ－ｆｗｄプライマー（配列番号４２）及びｍＩＬ１２ａ－ｒｅｖプライマー（配列番号４３）により、マウス脾臓より調製したｃＤＮＡを鋳型にして、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　ＭＡＸ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）により増幅した。得られた増幅断片と、ｐＡＡＶ－ＭＣＳ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｖｅｃｔｏｒ（ＣＥＬＬ　ＢＩＯＬＡＢＳ社製）をＥｃｏＲＩ（タカラバイオ社製）とＢａｍＨＩ（タカラバイオ社製）で消化し得たベクター断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（クロンテック社製）を用いて連結し、ｐＡＡＶ２－ｍＩＬ１２ａを得た。続いてマウスＩＬ－１２ｂ－ｐ４０遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．：ＮＭ＿００８３５２）を、Ｔ２Ａ配列を組み込んだｍＩＬ１２ｂ－ｆｗｄプライマー（配列番号４４）及びｍＩＬ１２ｂ－ｒｅｖプライマー（配列番号４５）により、マウス脾臓より調製したｃＤＮＡを鋳型にして、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　ＭＡＸ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）により増幅した。得られた増幅断片と、ｐＡＡＶ２－ｍＩＬ１２ａをＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し得たベクター断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（クロンテック社製）を用いて連結しｐＡＡＶ２－ｍＩＬ１２を得た。すなわち、ｐＡＡＶ２－ｍＩＬ１２はＩＬ－１２ａ－ｐ３５遺伝子、Ｔ２Ａ、ＩＬ－１２ｂ－ｐ４０遺伝子の順に連結されたポリヌクレオチドを保持しており、成熟型ＩＬ１２タンパクを産生する。
（２）ＡＡＶ２－ＩＬ１２ウイルスベクターの製造・精製
　実施例６－（１）で調製したｐＡＡＶ２－ｍＩＬ１２、ｐＨＥＬＰ及び実施例５－（１）で調製したｐＲＣ－ＧＤＤＧＴＲＧのそれぞれ２５μｇずつを、一般的なリン酸カルシウム法を用いて、Ｔ２２５ｃｍ２に播種しておいたＡＡＶ２９３細胞にトランスフェクションした。なお、ｐＡＡＶ２－ｍＩＬ１２の代わりにｐＡＡＶ－ＡｓＲｅｄ２をトランスフェクションし、コントロールとした。トランスフェクション６時間後、培地を完全に除去し、２％ＦＢＳ及び２ｍＭ　Ｌ－グルタミン酸ナトリウムを含むＤＭＥＭ　２０ｍＬを添加し、３７℃のＣＯ２インキュベーターで４８時間培養した。その後、実施例２－（３）、実施例３に示した方法で、ＡＡＶベクターを製造・精製した。その後、実施例２－（４）に示した方法で、ＡＡＶベクターの力価を定量した。
（３）マウスへの精製ＡＡＶ溶液の尾静脈投与及びＣＴ２６腫瘍細胞の皮下投与
　マウス一匹当たり５×１０１３ＶＧ／ｋｇとなるように、マウス尾静脈から精製ＡＡＶ溶液を投与した。投与の２週間後、マウス背部皮下にＣＴ２６腫瘍細胞株をマウス一匹あたり１×１０６細胞投与した。その後、継時的に腫瘍サイズを定量した。各測定日における腫瘍サイズの平均値を表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　表５に記載したとおり、ＧＤＤＧＴＲＧ変異キャプシドを持つＡＡＶ２－ＩＬ１２は抗腫瘍活性を持つことが示された。
実施例７　取得ペプチド配列を持つＡＡＶベクターの指向性評価－２
（１）ｐＲＣ－ＧＧＤＡＴＲＧ、ｐＲＣ－ＧＡＭＧＧＳＶの構築
　実施例４－（５）で得られたＧＧＤＡＴＲＧ配列（配列番号１６）あるいはＧＡＭＧＧＳＶ配列（配列番号２４）を持つＡＡＶ２ＷＧ－Ｃａｐ－ＳｃａＩ－Ｓ４／ｐＵＣ１１８Ｓｘクローンから、実施例５－（１）と同様の方法によりヘルパープラスミドｐＲＣ－ＧＧＤＡＴＲＧ及びｐＲＣ－ＧＡＭＧＧＳＶを得た。
（２）ＡＡＶ２－ＡｓＲｅｄ２キャプシド変異体の製造と精製
　実施例７－（１）で調製したｐＲＣ－ＧＧＤＡＴＲＧあるいはｐＲＣ－ＧＡＭＧＧＳＶを用いて、実施例５－（２）で示した方法によりそれぞれのキャプシド変異を持つＡＡＶ－ＡｓＲｅｄ２ベクターを製造・精製した。その後、実施例２－（４）に示した方法で、ＡＡＶベクターの力価を定量した。
（３）精製ＡＡＶ溶液のマウスへの投与
　マウス一匹当たり１×１０１１ＶＧとなるように、マウス尾静脈から精製ＡＡＶ溶液を投与した。この際、実施例５－（２）で調製した野生型あるいはＧＤＤＧＴＲＧ変異を持つＡＡＶベクターを投与した群を設定した。
（４）リンパ節及びその他組織からのＲＮＡ抽出及びＡｓＲｅｄ２発現量の定量
　実施例７－（３）でＡＡＶを投与したマウスを、６週間後に安楽死させ、各組織を回収し、ＲＮＡ　ｌａｔｅｒ（キアゲン社製）に浸して４℃で一晩反応させた。その後、実施例５－（５）と同様の方法によりＲＮＡを調製し、Ｏｎｅｓｔｅｐ　ＳＹＢＲ　ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ　ＰＬＵＳ　ＲＴ－ＰＣＲ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて、ＡｓＲｅｄ２遺伝子（配列番号３８及び３９の配列を有するプライマー）の発現量及び補正用としてマウスＧＡＰＤＨ遺伝子（配列番号４０及び４１の配列を有するプライマー）の発現量を定量した。ＡｓＲｅｄ２発現量をＧＡＰＤＨ発現量で補正した結果を表６に記載する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　上記の結果から、ＧＧＤＡＴＲＧあるいはＧＡＭＧＧＳＶ変異体キャプシドを持つＡＡＶベクターを用いても、野生型キャプシドを持つＡＡＶベクターと比較し、種々のリンパ節及び心臓で高い遺伝子発現効率が得られることが示された。
　また、上記の結果から、各スクリーニング段階（ラウンド１～３）で、プラスミドライブラリーのシークエンスを９０数クローン行い、複数回出現したペプチド配列は、リンパ節又は心臓に高い指向性を有することが確認された。
　本発明により、心臓及び免疫器官、特にリンパ節に指向性を有するＡＡＶキャプシドタンパク質変異体を提供され、リンパ節に効率的に遺伝子を導入する方法が提供される。
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Claims (11)

  1. 　配列表の配列番号１５、配列番号１６、配列番号２４及び配列番号３０からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドを含有させたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドタンパク質変異体をコードする核酸。
  2. 　ＡＡＶキャプシドタンパク質がＡＡＶ２由来である請求項１記載の核酸。
  3. 　ＡＡＶ２のＶＰ１のアミノ酸番号５８８番に続く位置に前記ペプチドを含有させた請求項１記載の核酸。
  4. 　請求項１～３のいずれか１項に記載の核酸を含む組換えＤＮＡ。
  5. 　請求項１～３のいずれか１項に記載の核酸又は請求項４記載の組換えＤＮＡを含む細胞。
  6. 　配列表の配列番号１５、配列番号１６、配列番号２４及び配列番号３０からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドを含有させたＡＡＶキャプシドタンパク質変異体を含むＡＡＶ粒子。
  7. 　ＡＡＶキャプシドタンパク質がＡＡＶ２由来である請求項６記載のＡＡＶ粒子。
  8. 　ＡＡＶ２のＶＰ１のアミノ酸番号５８８番に続く位置に前記ペプチドを含有させた請求項６記載のＡＡＶ粒子。
  9. 　配列表の配列番号１５、配列番号１６、配列番号２４及び配列番号３０からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドを含有させたＡＡＶキャプシドタンパク質変異体を含むＡＡＶ粒子を細胞に接触させる工程を含む、遺伝子導入細胞の製造方法。
  10. 　ＡＡＶキャプシドタンパク質がＡＡＶ２由来である請求項９記載の方法。
  11. 　ＡＡＶ２のＶＰ１のアミノ酸番号５８８番に続く位置に前記ペプチドを含有させた請求項９記載の方法。
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Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017197355A2 (en) 2016-05-13 2017-11-16 4D Molecular Therapeutics Inc. Adeno-associated virus variant capsids and methods of use thereof
WO2018139634A1 (ja) 2017-01-30 2018-08-02 学校法人日本医科大学 アデノ随伴ウイルス（ａａｖ）キャプシドタンパク質の変異体
WO2019060454A2 (en) 2017-09-20 2019-03-28 4D Molecular Therapeutics Inc. CAPSID VARIANT ADENO-ASSOCIATED VIRUSES AND METHODS OF USE
WO2019104279A1 (en) 2017-11-27 2019-05-31 4D Molecular Therapeutics Inc. Adeno-associated virus variant capsids and use for inhibiting angiogenesis
WO2020174369A2 (en) 2019-02-25 2020-09-03 Novartis Ag Compositions and methods to treat bietti crystalline dystrophy
WO2020174368A1 (en) 2019-02-25 2020-09-03 Novartis Ag Compositions and methods to treat bietti crystalline dystrophy
WO2020218419A1 (ja) * 2019-04-24 2020-10-29 タカラバイオ株式会社 脳に指向性を有するａａｖ変異体
RU2809389C2 (ru) * 2019-04-24 2023-12-11 Такара Байо Инк. Мутант aav, обладающий способностью нацеливаться на головной мозг

Families Citing this family (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8663624B2 (en) 2010-10-06 2014-03-04 The Regents Of The University Of California Adeno-associated virus virions with variant capsid and methods of use thereof
SG10202110919YA (en) 2011-04-22 2021-11-29 Univ California Adeno-associated virus virions with variant capsid and methods of use thereof
US11136557B2 (en) 2013-05-31 2021-10-05 The Regents Of The University Of California Adeno-associated virus variants and methods of use thereof
US10000741B2 (en) 2014-03-17 2018-06-19 Adverum Biotechnologies, Inc. Compositions and methods for enhanced gene expression in cone cells
EP3151866B1 (en) 2014-06-09 2023-03-08 Voyager Therapeutics, Inc. Chimeric capsids
EP3215191A4 (en) 2014-11-05 2018-08-01 Voyager Therapeutics, Inc. Aadc polynucleotides for the treatment of parkinson's disease
CN114717264A (zh) 2014-11-14 2022-07-08 沃雅戈治疗公司 治疗肌萎缩性侧索硬化(als)的组合物和方法
JP6863891B2 (ja) 2014-11-14 2021-04-21 ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッドＶｏｙａｇｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． 調節性ポリヌクレオチド
US11697825B2 (en) 2014-12-12 2023-07-11 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the production of scAAV
JP7095994B2 (ja) 2015-03-02 2022-07-05 アドヴェラム バイオテクノロジーズ， インコーポレイテッド ポリヌクレオチドを網膜錐体に硝子体内送達するための組成物及び方法
AU2016235163B2 (en) 2015-03-24 2022-03-24 The Regents Of The University Of California Adeno-associated virus variants and methods of use thereof
US10983110B2 (en) 2015-12-02 2021-04-20 Voyager Therapeutics, Inc. Assays for the detection of AAV neutralizing antibodies
US11299751B2 (en) 2016-04-29 2022-04-12 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions for the treatment of disease
EP3448874A4 (en) 2016-04-29 2020-04-22 Voyager Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS FOR TREATING A DISEASE
BR112018073384A2 (pt) 2016-05-18 2019-03-06 Voyager Therapeutics, Inc. polinucleotídeos moduladores
WO2017201258A1 (en) 2016-05-18 2017-11-23 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods of treating huntington's disease
KR20230039779A (ko) 2016-07-29 2023-03-21 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 변이체 캡시드를 갖는 아데노-관련된 바이러스 비리온 및 이의 사용 방법
EP3506817A4 (en) 2016-08-30 2020-07-22 The Regents of The University of California METHOD FOR BIOMEDICAL TARGETING AND RELEASE, AND DEVICES AND SYSTEMS FOR IMPLEMENTING THEM
CA3040179A1 (en) 2016-10-19 2018-04-26 Adverum Biotechnologies, Inc. Modified aav capsids and uses thereof
US11752181B2 (en) 2017-05-05 2023-09-12 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods of treating Huntington's disease
WO2018204786A1 (en) 2017-05-05 2018-11-08 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods of treating amyotrophic lateral sclerosis (als)
JOP20190269A1 (ar) 2017-06-15 2019-11-20 Voyager Therapeutics Inc بولي نوكليوتيدات aadc لعلاج مرض باركنسون
MX2019010910A (es) * 2017-06-30 2019-11-07 Univ California Viriones de virus adenoasociados con capsides variantes y metodos para su uso.
JP7229989B2 (ja) 2017-07-17 2023-02-28 ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッド 軌道アレイガイドシステム
US11680249B2 (en) 2017-08-28 2023-06-20 The Regents Of The University Of California Adeno-associated virus capsid variants and methods of use thereof
WO2019079240A1 (en) 2017-10-16 2019-04-25 Voyager Therapeutics, Inc. TREATMENT OF AMYOTROPHIC LATERAL SCLEROSIS (ALS)
US20200237799A1 (en) 2017-10-16 2020-07-30 Voyager Therapeutics, Inc. Treatment of amyotrophic lateral sclerosis (als)
US10610606B2 (en) 2018-02-01 2020-04-07 Homology Medicines, Inc. Adeno-associated virus compositions for PAH gene transfer and methods of use thereof
EP3755795A4 (en) 2018-02-19 2022-07-20 Homology Medicines, Inc. ADENO-ASSOCIATED VIRUS COMPOSITIONS FOR RECOVERING F8 GENE FUNCTION AND METHODS OF USE THEREOF
CA3166374A1 (en) * 2019-12-31 2021-07-08 Swanbio Therapeutics Limited Improved aav-abcd1 constructs and use for treatment or prevention of adrenoleukodystrophy (ald) and/or adrenomyeloneuropathy (amn)
TW202140791A (zh) 2020-01-13 2021-11-01 美商霍蒙拉奇醫藥公司 治療苯酮尿症之方法
US20230203102A1 (en) 2020-05-13 2023-06-29 Voyager Therapeutics, Inc. Redirection of tropism of aav capsids
CN111850045B (zh) * 2020-07-16 2022-03-08 四川大学 靶向心脏血管内皮的腺相关病毒载体及其应用
CN113754727B (zh) * 2020-09-30 2022-07-12 广州派真生物技术有限公司 腺相关病毒突变体及其应用
CN114057840B (zh) * 2021-10-14 2022-09-20 和元生物技术（上海）股份有限公司 包含变异的aav9衣壳蛋白的重组腺相关病毒颗粒

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005512569A (ja) * 2001-12-21 2005-05-12 メディジーン・アクチェンゲゼルシャフト 目的とする細胞指向性をもつウイルスクローンの同定に有用な修飾した構造遺伝子またはキャプシド修飾した粒子のライブラリー

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001064835A2 (en) * 2000-02-28 2001-09-07 Hyseq, Inc. Novel nucleic acids and polypeptides
EP1212075A4 (en) * 1999-08-26 2005-11-23 Keith M Skubitz PEPTIDES CAPABLE OF MODULATING THE FUNCTION OF MEMBERS OF THE CD66 FAMILY (CEACAM)
US7749492B2 (en) * 2001-01-05 2010-07-06 Nationwide Children's Hospital, Inc. AAV vectors and methods
US20040002159A1 (en) * 2002-04-05 2004-01-01 Weidong Xiao Methods for the production of chimeric adeno-associated virus (AAV) vectors, compositions of chimeric AAV vectors, and methods of use thereof
ES2634118T3 (es) * 2009-02-11 2017-09-26 The University Of North Carolina At Chapel Hill Vectores de virus modificados y métodos para fabricar y utilizar los mismos
US8927514B2 (en) * 2010-04-30 2015-01-06 City Of Hope Recombinant adeno-associated vectors for targeted treatment

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005512569A (ja) * 2001-12-21 2005-05-12 メディジーン・アクチェンゲゼルシャフト 目的とする細胞指向性をもつウイルスクローンの同定に有用な修飾した構造遺伝子またはキャプシド修飾した粒子のライブラリー

Non-Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ADACHI K. ET AL., GENEN THER. REGUL., vol. 5, 2010, pages 31 - 55
GAO ET AL., J. VIROLOGY, vol. 78, 2004, pages 6381 - 6388
GAO ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 99, no. 18, 2002, pages 11854 - 11859
GIROD, A. ET AL.: "Genetic capsid modifications allow efficient re-targeting of adeno-associated virus type 2.", NAT. MED., vol. 5, no. 9, 1999, pages 1052 - 1056, XP002128040 *
GRIFMAN, M. ET AL.: "Incorporation of tumor-targeting peptides into recombinant adeno-associated virus capsids.", MOL. THER., vol. 3, no. 6, 2001, pages 964 - 975, XP002235294 *
HUMAN GENE THERAPY, vol. 5, 1994, pages 793 - 801
MULLER, O. J. ET AL.: "Random peptide libraries displayed on adeno-associated virus to select for targeted gene therapy vectors.", NAT. BIOTECHNOL., vol. 21, no. 9, 2003, pages 1040 - 1046, XP002297275 *
NAUMER, M. ET AL.: "Development and validation of novel AAV2 random libraries displaying peptides of diverse lengths and at diverse capsid positions.", HUM. GENE THER., vol. 23, 2012, pages 492 - 507, XP055255147 *
See also references of EP2940131A4
WATERKAMP, D. A. ET AL.: "Isolation of targeted AAV2 vectors from novel virus display libraries.", J. GENE MED., vol. 8, 2006, pages 1307 - 1319, XP002596752 *
WU, P. ET AL.: "Mutational analysis of the adeno-associated virus type 2 (AAV2) capsid gene and construction of AAV2 vectors with altered tropism.", J. VIROL., vol. 74, no. 18, 2000, pages 8635 - 8647, XP001028219 *

Cited By (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4209501A1 (en) 2016-05-13 2023-07-12 4D Molecular Therapeutics Inc. Adeno-associated virus variant capsids and methods of use thereof
US11179477B2 (en) 2016-05-13 2021-11-23 4D Molecular Therapeutics Inc. Method of using adeno-associated virus with variant capsid
WO2017197355A2 (en) 2016-05-13 2017-11-16 4D Molecular Therapeutics Inc. Adeno-associated virus variant capsids and methods of use thereof
EP4206216A1 (en) 2016-05-13 2023-07-05 4D Molecular Therapeutics Inc. Adeno-associated virus variant capsids and methods of use thereof
JP2019518458A (ja) * 2016-05-13 2019-07-04 ４ディー モレキュラー セラピューティクス インコーポレイテッド アデノ関連ウイルス変異キャプシドおよびその使用方法
US11419949B2 (en) 2016-05-13 2022-08-23 4D Molecular Therapeutics Inc. Adeno-associated virus variant capsids and methods of use thereof
US11364308B2 (en) 2016-05-13 2022-06-21 4D Molecular Therapeutics Inc. Adeno-associated virus variant capsids and methods of use thereof
US11167041B2 (en) 2016-05-13 2021-11-09 4D Molecular Therapeutics Inc. Adeno-associated virus variant capsids and methods of use thereof
KR20190111966A (ko) 2017-01-30 2019-10-02 각꼬호우징 닛뽄 이까다이가꾸 아데노 관련 바이러스(aav) 캡시드 단백질의 돌연변이체
WO2018139634A1 (ja) 2017-01-30 2018-08-02 学校法人日本医科大学 アデノ随伴ウイルス（ａａｖ）キャプシドタンパク質の変異体
US11028131B2 (en) 2017-01-30 2021-06-08 Nippon Medical School Foundation Mutant of adeno-associated virus (AAV) capsid protein
WO2019060454A2 (en) 2017-09-20 2019-03-28 4D Molecular Therapeutics Inc. CAPSID VARIANT ADENO-ASSOCIATED VIRUSES AND METHODS OF USE
EP4218828A2 (en) 2017-09-20 2023-08-02 4D Molecular Therapeutics Inc. Adeno-associated virus variant capsids and methods of use thereof
EP4219695A2 (en) 2017-11-27 2023-08-02 4D Molecular Therapeutics Inc. Adeno-associated virus variant capsids and use for inhibiting angiogenesis
WO2019104279A1 (en) 2017-11-27 2019-05-31 4D Molecular Therapeutics Inc. Adeno-associated virus variant capsids and use for inhibiting angiogenesis
EP4272728A2 (en) 2017-11-27 2023-11-08 4D Molecular Therapeutics Inc. Adeno-associated virus variant capsids and use for inhibiting angiogenesis
WO2020174368A1 (en) 2019-02-25 2020-09-03 Novartis Ag Compositions and methods to treat bietti crystalline dystrophy
WO2020174369A2 (en) 2019-02-25 2020-09-03 Novartis Ag Compositions and methods to treat bietti crystalline dystrophy
RU2809389C2 (ru) * 2019-04-24 2023-12-11 Такара Байо Инк. Мутант aav, обладающий способностью нацеливаться на головной мозг
WO2020218419A1 (ja) * 2019-04-24 2020-10-29 タカラバイオ株式会社 脳に指向性を有するａａｖ変異体

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