JP2005512569A - 目的とする細胞指向性をもつウイルスクローンの同定に有用な修飾した構造遺伝子またはキャプシド修飾した粒子のライブラリー - Google Patents

Abstract

本発明は、真核細胞ウイルス、好ましくはパルボウイルスに由来する多数の発現可能な構造遺伝子、好ましくはｃａｐ遺伝子を含む核酸ライブラリーに関する。

Description

本発明は、予め定めた細胞タイプに形質導入しうる、パルボウイルスキャプシドの同定に有用な修飾したパルボウイルスｃａｐ遺伝子を含むライブラリー、およびその作製方法に関する。

ベクターの指向性（ｔｒｏｐｉｓｍ）（再ターゲッティング、ｒｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ）の制御は、遺伝子療法のためのウイルス遺伝子伝達系を開発する際に、療法遺伝子を効率的にターゲット細胞へ伝達でき、かつ目的外の細胞タイプへの形質導入を避けるために、重要な問題である。これらの目標を達成する努力により、特定の細胞性受容体と相互作用する能力をもつビリオンを得るための幾つかの方法が報告された。これらの方法のひとつには、ウイルス粒子を受容体結合分子に結合させることが含まれ、これによって改良された特異性をもつ再ターゲティッドベクターが得られる。しかしこの方法の大きな欠点は、これらの再ターゲッティング分子がキャプシドから離脱してそのビリオンの自然の指向性が再生することである。

ある別の方法は、ウイルスのキャプシドまたはエンベロープタンパク質を部位特異的変異形成、ほとんどは挿入型変異形成により、遺伝子修飾することにある。
これらの方法すべてについて重要な工程は、機能性再ターゲッティング分子の選択である。この問題は、幾つかの研究において、多数のペプチドを特定の受容体または細胞タイプへの目的とする結合能についてスクリーニングするファージディプレイ技術を利用することにより対処された。しかし、ベクターの外部構造レベルで外来分子を導入すると、ウイルス粒子の統合性が撹乱されて低力価または無効なウイルス調製物が得られる可能性がある。さらに、これらのリガンドペプチドは、ベクター構造に導入されると目標受容体に対するそれらの親和性を完全にまたは部分的に喪失することがある。この問題に対する明快な解決策が、アデノウイルスについて提唱された（Ｐｅｒｅｂｏｅｖ Ａ．ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ Ｖｉｒｏ ７５（１５），７１０７−１３）。この報文には、Ａｄ ファイバーノブ（Ａｄ ｆｉｂｅｒ ｋｎｏｂ）をｐＪｕＦｏファージの表面に発現させることが記載されており、これにより目標ベクターのミクロ環境を模倣した状況でポリペプチドランダム化配列を表示させることができる。しかし、ファージベースライブラリーの生理学的制限を克服することはできない。すなわち、分子をそれらの結合能だけに基づいて選択することはできるが、細胞内へのウイルス粒子の取込みおよびプロセシングの最適化を追求することはできない。

パルボウイルス、特にアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、それらの非病原性、低い免疫原性、ならびに分裂細胞と非分裂細胞の両方に対する感染能、および長期間の療法遺伝子発現能のため、遺伝子療法のベクターとして次第に注目されるようになってきた。さらにＡＡＶは、いずれの細胞機能にも損傷を与えずに感染細胞のゲノムに部位特異的に組み込むことが可能である。

パルボウイルスその他のウイルスを遺伝子療法に使用することの大きな利点は、これらのウイルスは特定の細胞タイプだけに効率的に形質導入可能であり、他のタイプの細胞はパルボウイルス感染に抵抗性であるという事実である。特にＡＡＶ２は、その表面にヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）をもつ細胞にだけ形質導入できる（Ｇｉｒｏｄ Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ５−９，１０５２−５６）。前記のように、療法遺伝子を効率的にターゲット細胞へ伝達し、目的外の細胞タイプへの形質導入を阻止するためには、ウイルス指向性の制御が重要である。

Ｇｉｒｏｄらの報文（（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ５−９，１０５２−５６）において、野生型ウイルスが認識しない細胞性受容体との相互作用能をキャプシドに付与するために、アデノ随伴ウイルスの外部構造を修飾しうることが最近証明された。この方法は、キャプシドの外面に提示されているウイルスキャプシドタンパク質の特定部位レベルにリガンド配列を挿入することにより実施できる。適切な遺伝子座のひとつとして、ＡＡＶ２の主ウイルスキャプシドタンパク質（ＶＰ１）のアミノ酸位置５８７が同定された。この部位に、Ｌ１４配列、すなわちＲＧＤモチーフを含むペプチド（ラミニンフラグメントＰ１の一部）を挿入すると、こうして得られる変異ＡＡＶ（Ｌ１４−ＡＡＶ）はＢ１６Ｆ１０細胞に対する感染能を備えていた。Ｂ１６Ｆ１０細胞はインテグリンを発現し、細胞外膜にヘパラン硫酸プロテオグリカンを発現しないので、野生型ＡＡＶ２感染に対しては抵抗性である。

現在のところ、ある細胞タイプに感染できるが他の細胞タイプには感染しない変異ウイルス、特にパルボウイルスを迅速に同定できる系はない。遺伝子療法に用いる細胞タイプ特異的なパルボウイルスを得るために、そのような系が強く求められている。

したがって本発明の目的は、対応する野生型ウイルスが感染する細胞以外の細胞タイプに感染しうるウイルス、特にパルボウイルス変異体を同定するための系を提供することである。さらに本発明の目的は、そのような系を調製する方法を提供することである。

したがって本発明は第１態様において、少なくとも１つの真核細胞ウイルスに由来する多数の発現可能な構造遺伝子を含む核酸ライブラリーの調製方法であって、
ａ）それぞれが真核細胞ウイルス由来の構造遺伝子を少なくとも１つコードし、かつ適切なパッケージング配列を含む、一組の核酸を用意し、そして
ｂ）第１挿入配列（１）を該構造遺伝子に挿入する
工程を含む方法に関する。

本発明によれば、”構造遺伝子”という表現は、無エンベロープもしくは有エンベロープウイルスのウイルスキャプシドの１以上のタンパク質、好ましくは構造タンパク質をコードする遺伝子、または有エンベロープウイルスのウイルスシェルの１以上のタンパク質、好ましくは構造タンパク質をコードする遺伝子に関する。

本発明はさらに、前記方法により得られる、少なくとも１つの真核細胞ウイルスに由来する多数の発現可能な構造遺伝子を含む核酸ライブラリーに関する。
本発明のライブラリーは、異なる細胞タイプに対する指向性を備えた感染性ウイルス粒子を形成するために、発現可能な異なる構造遺伝子をもつ多数の核酸を含む。したがって、特定の細胞タイプがあれば、その特定の細胞タイプに感染しうる変異ウイルス、特にパルボウイルスについて、そのライブラリーをスクリーニングすることができる。

本発明によれば、用語”キャプシドタンパク質”はｃａｐ遺伝子がコードするタンパク質を意味し、一方”機能性キャプシドタンパク質”は少なくとも１つの宿主細胞に感染しうるウイルスのキャプシドタンパク質を意味する。

ＡＡＶの場合、キャプシドタンパク質はＶＰ１、ＶＰ２またはＶＰ３であり、他のパルボウイルスについてはキャプシドタンパク質の名称や数が異なるであろう。
本発明によれば”パッケージング配列”という用語は、核酸をウイルスキャプシド中へパッケージングするのを仲介するシス作用核酸配列を意味する。たとえばパルボウイルスについては、線状ウイルスゲノムの５’および３’末端に位置するいわゆる”逆方向末端反復配列”（ＩＴＲ）がこの機能をもつことが当技術分野で知られている。

好ましい態様によれば、構造遺伝子は有エンベロープウイルス、たとえばレトロウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、たとえばＨＳＶ１、ＨＳＶ２、ＥＢＶ、水痘帯状疱疹ウイルス、ヒトヘルペスウイルス１、２、３、４、７または８に由来する。

他の好ましい態様によれば、構造遺伝子は好ましくは無エンベロープウイルス、たとえばパルボウイルスまたはアデノウイルスに由来するｃａｐ遺伝子である。この場合、ｃａｐ遺伝子は１以上のキャプシドタンパク質をコードする。

本発明によれば”ｃａｐ遺伝子”という表現は、無エンベロープウイルスまたは有エンベロープウイルスの１以上のウイルスキャプシドタンパク質をコードする遺伝子に関する。

より好ましくは、ｃａｐ遺伝子は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）、ＭＶＭ、Ｂ１９、Ｈ１、ＡＡＡＶ（トリＡＡＶ）またはＧＰＶ（ガチョウパルボウイルス）よりなる群から選択されるパルボウイルスに由来する。

最も好ましくは、ｃａｐ遺伝子はＡＡＶ、たとえばＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５およびＡＡＶ６に由来する。
好ましい態様において本発明方法により得ることができるライブラリーは、１０^２より多い、好ましくは１０^５より多い、特に１０^６より多い多数のウイルス変異体をもち、他の好ましい態様においては、１０^２より多い、好ましくは１０^５より多い、特に１０^６より多い多数の発現可能な構造遺伝子、好ましくはｃａｐ遺伝子をもつ。

好ましい態様において、一組の核酸は１つの核酸に由来する。この場合、ライブラリーは挿入配列を別としてほとんど同一の多数の核酸から構成される。しかし、一組の核酸が異なる構造遺伝子コード核酸に由来するものも本発明に含まれる。この場合、それらの核酸は１つのウイルスに由来することが好ましい。

好ましい態様によれば、１つの挿入配列（１）を構造遺伝子に挿入する。しかし、１より多い挿入配列（１）を挿入することも本発明に含まれる。好ましくは２、３または最高６つの挿入配列（１）を構造遺伝子に挿入する。この挿入により、挿入部位に応じて１以上の構造タンパク質、好ましくはキャプシドタンパク質、たとえばＡＡＶの場合はＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３に、アミノ酸が挿入される。これに関して、パルボウイルスの場合、パルボウイルスキャプシドタンパク質は重複読み枠により１つのｃａｐ遺伝子のみによってコードされることを留意すべきである。

本発明の好ましい態様においては、挿入配列（１）により構造遺伝子のある配列が除去される。
さらに好ましい態様において、除去される配列は工程（ａ）の前に構造遺伝子に挿入された挿入配列（２）を含むか、あるいはその一部である。

好ましい態様として、本発明方法はさらに、構造遺伝子が非機能性になるように構造遺伝子を修飾する初期工程を含む。これは、挿入配列（２）の挿入により行うことができる。本発明方法の工程ａ）において挿入配列（２）を挿入配列（１）で置換することにより、潜在的に機能性の構造遺伝子が形成されるであろう。パルボウイルスの場合、この追加工程により、挿入配列（１）を含まないウイルスキャプシドタンパク質から構築されたキャプシドをもつパルボウイルスビリオンの数が減少し、したがって高い力価をもつライブラリーを形成することができる。

したがって、より好ましい態様において、挿入配列（２）は好ましくは終止コドンを含むことにより機能性構造タンパク質、好ましくはキャプシドタンパク質の形成を阻止する。さらに、挿入配列（２）はオープンリーディングフレームをシフトさせ、あるいはいずれかの後続工程で機能性キャプシドの形成または感染の生態を撹乱する追加アミノ酸を導入することができる。

好ましい態様において、挿入配列（１）および／または挿入配列（２）はさらに少なくとも２つの制限部位を、好ましくはその３’末端に１つ、そしてその５’末端に１つ含む。

好ましい態様によれば、挿入配列（２）は少なくとも部分的に挿入配列（１）で置換され、これにより機能性キャプシド形成の阻止が−少なくとも若干のキャプシドについては−無効となる。これは、好ましい態様においては終止コドンの除去による。

好ましい態様によれば、挿入配列（１）および／または挿入配列（２）の、好ましくは挿入配列（１）および挿入配列（２）のヌクレオチド数が３または３の倍数である。
好ましい態様によれば、挿入配列（１）はキャプシドタンパク質の表面にあるアミノ酸をコードするｃａｐ遺伝子領域に挿入される。

好ましい態様において、ウイルスはＡＡＶ２であり、挿入配列（１）は、キャプシドタンパク質ＶＰ１の第１アミノ末端アミノ酸１〜５０内の部位に対応する核酸、あるいはアミノ酸位置２６１、３８１、４４７、５３４、５７３および／または５８７、好ましくはアミノ酸位置４４７または５８７に対応する核酸の後に挿入される。

他の好ましい態様において、挿入配列（１）は前記に示した挿入位置の隣接５アミノ酸に対応する核酸中に挿入される。これらの範囲のアミノ酸はＡＡＶ２−キャプシドのループであり、したがってキャプシドタンパク質の表面に位置するからである。当業者は、他のパルボウイルスについて対応するループおよび挿入部位を、既知の方法、たとえば配列アラインメント、三次元構造解析、タンパク質フォールディング、疎水性分析により同定することができる（Ｇｉｒｏｄ Ａ ｅｔ ａｌ．，１９９９，前掲）。

特に好ましい挿入部位は、下記のアミノ酸（ａａ）からなる範囲内である：
ｉ）ａａ２６１〜２７０、特にａａ２６９、
ｉｉ）ａａ３２４〜３３１、
ｉｉｉ）ａａ３８０〜３８３、特にａａ３８１、
ｉｖ）ａａ４４７〜４６０、特にａａ４４７および４５１〜４６０、
ｖ）ａａ４８４〜５０３、好ましくはａａ４８４〜４９９、特にａａ４８４、４８７またはａａ４９４〜４９９、
ｖｉ）ａａ５０７〜５１４、特にａａ５０７、５０９または５１４、
ｖｉｉ）ａａ５２７〜５３４、特にａａ５２７〜５２９、５３２または５３４、
ｖｉｉｉ）ａａ５４８〜５５６、
ｉｘ）ａａ５７２〜５７５、特に５７３、
ｘ）ａａ５８１〜５９５、特に５８５、５８７、５８８または５９４。

上記のアミノ酸番号はＡＡＶ２のＶＰ１タンパク質に関するものである（Ｇｉｒｏｄ Ａ．ｅｔ ａｌ．，１９９９，前掲）。
範囲ｖ）およびｖｉ）が特に好ましい。

核酸に挿入される挿入配列（１）は、挿入配列（１）が挿入されるすべての構造遺伝子について同一であってもよい。しかし、挿入配列（１）は挿入配列（１）が挿入されるすべての構造遺伝子について異なるか、または少なくとも部分的に異なることが好ましい。

好ましい態様において、挿入配列（１）はランダムに、または部分的にランダムに形成される。これは、ある構造遺伝子に導入された挿入配列（１）が他の構造遺伝子に導入された挿入配列（１）と異なる可能性があることを意味するが、２つの挿入配列（１）が同一であることも理論的には可能である。

挿入核酸配列がランダムに形成される場合、好ましい態様においてはコドンＮＮＮ、ＮＮＢまたはＮＮＫ（Ｎ＝Ａ、Ｃ、ＧまたはＴ；Ｂ＝Ｃ、ＧまたはＴ；Ｋ＝ＧまたはＴ）が用いられる。さらに、挿入核酸配列は、特に１、２または３個の固定ヌクレオチドを用いて部分的にランダムに形成することができる。そのような挿入配列の長さは、好ましくは少なくとも３ヌクレオチド、好ましくは少なくとも９、特に少なくとも１８ヌクレオチドであってよい。

好ましい態様において挿入配列（１）は、ランダムまたは部分的にランダムに形成された配列のほかに、さらにランダムまたは部分的にランダムな核酸挿入配列の上流および／または下流に少なくとも１つのコドン、好ましくはＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ａｓｐおよび／またはＡｒｇをコードする１、２または３つのコドンの範囲、特にランダムまたは部分的にランダムな核酸配列の上流にＡｌａに対する３つのコドンおよび下流にＡｌａに対する２つのコドンの挿入配列を含むことができる。

好ましい態様において、挿入配列（１）は終止コドンを含まない。これは、挿入配列（１）のコドンの第３位置にＡまたはＧをもたないことにより達成できる。
さらに、本発明方法により得られるライブラリーは、少なくとも１つの真核細胞ウイルスに由来する多数の発現可能な構造遺伝子を含む核酸ライブラリーについて以下に定める特色をもつことができる。

さらに本発明は、真核細胞ウイルス、好ましくはパルボウイルス、特にディペンドウイルス、たとえばアデノ随伴ウイルスまたはイヌパルボウイルス（ＣＰＶ）、および自律性パルボウイルス、たとえばＨ１、ＭＶＭ（ｍｉｎｕｔｅ ｖｉｒｕｓ ｏｆ ｍｉｃｅ、マウス微小ウイルス）もしくはＢ１９、ＡＡＡＶまたはＧＰＶに由来する多数の発現可能な構造遺伝子、好ましくはｃａｐ遺伝子を含む核酸ライブラリーに関する。

本発明の核酸ライブラリーは、ビリオンの外部構造および／または対応する（コードする）遺伝情報が多数修飾された真核細胞ウイルスをコードすることができる。このライブラリーは、１０^２より多い、好ましくは１０^５より多い、特に１０^６より多い、好ましい多数のウイルス変異体をもつ。

他の態様において核酸ライブラリーは、１０^２より多い、好ましくは１０^５より多い、特に１０^６より多い多数の発現可能な構造遺伝子、好ましくはｃａｐ遺伝子をもつ。
ライブラリーは、線状核酸、プラスミド、ウイルス粒子またはウイルスベクター、たとえば組換えＡＡＶ、アデノウイルスまたは単純ヘルペスウイルスベクターの形であってよい。

好ましい態様において、核酸はさらに、パッケージング配列（たとえばＡＡＶ ＩＴＲ）、ならびにビリオンの複製およびパッケージングに必要な機能を付与する少なくとも１つの発現可能な遺伝子（たとえばパルボウイルスの非構造遺伝子、たとえばＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子）を含むことができる。

これらの配列、遺伝子または機能を、シス（パッケージング配列およびキャプシドタンパク質をコードする遺伝子と同一構築体上にあることを意味する）またはトランス（異なる構築体上にあることを意味する）に付与することができる。ただし、パッケージング配列はシスに付与しなければならない。

好ましい態様において、核酸はＤＮＡである。
好ましい態様において、ｃａｐ遺伝子、ならびにパッケージング配列、たとえばＩＴＲ、ならびにビリオンの複製およびパッケージングに必要な機能を付与する遺伝子、たとえばｒｅｐ遺伝子は、パルボウイルス、好ましくはディペンドウイルス、たとえばＡＡＶまたはＣＰＶ、特にＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５およびＡＡＶ６よりなる群からのＡＡＶ血清型の１つ、または自律性パルボウイルス、たとえばＨ１、ＭＶＭ、Ｂ１９、ＡＡＡＶまたはＧＰＶに由来する。

他の好ましい態様は、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子が、プラスミドｐＷＴ９９ｏｅｎ中に組み込まれたＡＡＶ ｃａｐ遺伝子に由来するライブラリーに関する（図１および実施例１参照）。

構造遺伝子、好ましくはｃａｐ遺伝子の少なくとも１つの部位に多数の核酸配列を挿入し、その際、挿入ヌクレオチドの数は３または３の倍数である。好ましい態様によれば、構造遺伝子、好ましくはｃａｐ遺伝子の１、２または３つの部位に多数の核酸配列を挿入する。

挿入核酸配列は、特にＮＮＮコドン、ＮＮＢコドンまたはＮＮＫコドン（Ｎ＝Ａ、Ｃ、ＧまたはＴ；Ｂ＝Ｃ、ＧまたはＴ；Ｋ＝ＧまたはＴ）を用いてランダムに形成されることが好ましい。さらに、挿入核酸配列は特に１、２または３個の固定ヌクレオチドを用いて部分的にランダムに形成される。

他の好ましい態様において、２番目またはそれ以上の挿入配列（１）は、選択したアミノ酸範囲に対する非ランダム化コドンを含んでもよい。これは、ランダム化挿入配列（１）および１以上の追加挿入配列（１）を異なる部位に挿入して発現可能な構造遺伝子の特性を変化させることにより、目的特性を備えた発現可能な構造遺伝子を同時にスクリーニングできるという利点をもつ。

たとえば、ペプチドをコードし、再ターゲティッドベクターまたは他の目的特性を備えたベクターを生じる挿入配列（１）が既に同定されている場合、この挿入配列を特定部位に用い、ランダム化挿入配列（１）を他の部位に用いて、他の特性が増強されたベクターをスクリーニングすることができる。数個または全部の既知の挿入可能部位について、この操作を反復できる。

さらに、好ましくは既知または推定エピトープにおいて、ランダム化挿入配列（１）の挿入と追加の固定挿入配列（１）の挿入を組み合わせて、ベクターの免疫原性を変化させることができる。本発明の範囲において、ランダム化挿入配列（１）を用いて特定の細胞タイプに対する感染性または特異性の増大したベクターをスクリーニングすることにより（ｒＡＡＶ−５８７／Ｍｅｃ、実施例７）、あるいは固定挿入配列を挿入することにより（ｒＡＡＶ−５８７／Ｌ１４、実施例７）、抗体の中和作用を消失または低下させうることが示された。したがって本発明は、抗体（モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体／血清）への結合が低下したベクターおよび／または中和抗体を回避する能力をもつため患者における免疫反応を回避できるベクターの作製またはスクリーニングにも使用できる。

好ましい態様において、そのような挿入核酸配列の長さは少なくとも３ヌクレオチド、好ましくは少なくとも９、特に少なくとも１８ヌクレオチドである。
挿入核酸配列は、標準的な制限エンドヌクレアーゼ、組換え系、たとえばゲートウェイもしくはｃｒｅ／ｌｏｘ組換え系、またはたとえば変性プライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応法により挿入できる。

挿入核酸配列により、少なくとも１つのウイルスキャプシドタンパク質、たとえばＡＡＶの場合はＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３構造タンパク質の、好ましくはビリオンのキャプシド表面に位置する部位にアミノ酸が挿入される。

挿入核酸配列は、ＶＰ１の第１アミノ末端アミノ酸１〜５０に対応するいずれかの部位、ＶＰ１のアミノ酸位置２６１、３８１、４４７、５３４、５７３および／または５８７に対応する部位の後、好ましくはアミノ酸位置４４７または５８７に対応する部位の後に挿入できる。アミノ酸の番号はＶＰ１内の位置に関するものである。誤解を避けるために、ＶＰ２およびＶＰ３の対応する部位はもちろん異なる番号をもつ。

ＡＡＶについて、これは挿入核酸配列をＶＰ１の第１アミノ末端アミノ酸１〜５０内のいずれかの部位に対応する核酸、あるいはＶＰ１のアミノ酸位置２６１、３８１、４４７、５３４、５７３および／または５８７、好ましくはアミノ酸位置４４７または５８７に対応する核酸の後に挿入できることを意味する。アミノ酸の番号はＶＰ１内の位置に関するものである。誤解を避けるために、ＶＰ２およびＶＰ３の対応する部位はもちろん異なる番号をもつ。

他の好ましい態様において、挿入配列（１）は前記に示した挿入位置の隣接５アミノ酸に対応する核酸中に挿入される。これらの範囲のアミノ酸はＡＡＶ２−キャプシドのループであり、したがってキャプシドタンパク質の表面に位置するからである。当業者は、他のパルボウイルスについて対応するループおよび挿入部位を、既知の方法、たとえば配列アラインメント、三次元構造解析、タンパク質フォールディング、疎水性分析により同定することができる（Ｇｉｒｏｄ Ａ．ｅｔ ａｌ．，１９９９，前掲）。

好ましい態様によれば、ｃａｐ遺伝子はさらに少なくとも１つの変異、たとえば少なくとも１つの点変異、少なくとも１つの、内部における１個または数個のアミノ酸の欠失、挿入および／または置換、あるいは少なくとも１つの、Ｎ末端またはＣ末端における１個または数個のアミノ酸の欠失、挿入および／または置換、あるいはこれらの変異の組合わせを生じる変異、好ましくはヘパラン硫酸プロテオグリカン、インテグリンおよび／または線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）への結合を阻害する変異をもつ。これらの付加的な特定の変異は、その多数の自然宿主細胞に対するビリオンの感染性を低下させるので、特に有利である。

そのような追加変異は下記のために使用できる：Ｃａｐタンパク質／ビリオンの感染性を追加修飾する；ＡＡＶが仲介するものではない感染症を、たとえば細胞性受容体に対する結合の低下または消失によって軽減する；あるいは抗体に対する親和性を低下または消失させることにより、特に中和抗体から回避することにより、Ｃａｐタンパク質／ビリオンの免疫原性を変化させる。

さらに、そのようなｃａｐ遺伝子は、ランダム化核酸配列の挿入部位の上流および／または下流にさらに少なくとも１つのコドン、好ましくはＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ａｓｐおよび／またはＡｒｇをコードする１、２または３つのコドンの定常挿入配列、特に挿入部位の上流に３つのＡｌａおよび下流に２つのＡｌａの挿入配列をもつことができる。

さらに本発明は、キャプシドタンパク質が修飾されたビリオン、特にパルボウイルスビリオンのライブラリーに関する。
本発明の好ましい態様において、ビリオンのライブラリーはウイルス子孫の生成に必要な遺伝情報を含む粒子を含む。

好ましい態様は、各粒子がウイルス子孫の生成に必要な遺伝情報を含む、ビリオンのライブラリーである。
本発明の特に好ましい態様において、ビリオンのライブラリーは前記のいずれかの核酸を用いて作製される。

本発明の他の態様は、ｃａｐ遺伝子内の、好ましくはＶＰ１のアミノ酸位置５８７の後に、例えばゲートウェイまたはｃｒｅ／ｌｏｘ系に対する少なくとも１つの組換え部位を含むｃａｐ遺伝子コード核酸であって、挿入核酸配列が、ＶＰ１の第１アミノ末端アミノ酸１〜５０に対応するいずれかの部位、ＶＰ１のアミノ酸位置２６１、３８１、４４７、５３４、５７３および／または５８７に対応する部位の後、好ましくはアミノ酸位置４４７または５８７に対応する部位の後に挿入された核酸である。

特に好ましい挿入部位は、下記のアミノ酸（ａａ）からなる範囲内である：
ｉ）ａａ２６１〜２７０、特にａａ２６９、
ｉｉ）ａａ３２４〜３３１、
ｉｉｉ）ａａ３８０〜３８３、特にａａ３８１、
ｉｖ）ａａ４４７〜４６０、特にａａ４４７および４５１〜４６０、
ｖ）ａａ４８４〜５０３、好ましくはａａ４８４〜４９９、特にａａ４８４、４８７またはａａ４９４〜４９９、
ｖｉ）ａａ５０７〜５１４、特にａａ５０７、５０９または５１４、
ｖｉｉ）ａａ５２７〜５３４、特にａａ５２７〜５２９、５３２または５３４、
ｖｉｉｉ）ａａ５４８〜５５６、
ｉｘ）ａａ５７２〜５７５、特に５７３、
ｘ）ａａ５８１〜５９５、特に５８５、５８７、５８８または５９４。

アミノ酸の番号はＡＡＶ２のＶＰ１タンパク質に関するものである（Ｇｉｒｏｄ Ａ．ｅｔ ａｌ．，１９９９，前掲）。
範囲ｖ）およびｖｉ）が特に好ましい。

これは、本発明の他の対象が、ｃａｐ遺伝子内に、好ましくはゲートウェイまたはｃｒｅ／ｌｏｘ系に対する少なくとも１つの組換え部位を含む、ｃａｐ遺伝子であることを意味する。ＡＡＶについては、組換え部位をＶＰ１の第１アミノ末端アミノ酸１〜５０内のいずれかの部位に対応する核酸、あるいはＶＰ１のアミノ酸位置２６１、３８１、４４７、５３４、５７３および／または５８７、好ましくはアミノ酸位置４４７または５８７に対応する核酸の後に挿入できる。これらのアミノ酸の番号はＶＰ１内の位置に関するものである。誤解を避けるために、ＶＰ２およびＶＰ３の対応する部位はもちろん異なる番号をもつ。本発明のｃａｐ遺伝子は、パルボウイルスライブラリーを調製するための本発明方法の出発物質として使用できる。

さらに前記ｃａｐ遺伝子は、それぞれの野生型遺伝子に存在しない少なくとも１つのエンドヌクレアーゼ制限部位またはポリリンカーなど挿入に有用な部位を含むことができ、それらはＶＰ１の第１アミノ末端アミノ酸１〜５０内のいずれか、ＶＰ１のアミノ酸位置２６１、３８１、４４７、５３４、５７３および／または５８７、好ましくはアミノ酸位置４４７または５８７に対応する部位の後に挿入される。

これは、前記ｃａｐ遺伝子が、それぞれの野生型遺伝子に存在しない少なくとも１つのエンドヌクレアーゼ制限部位またはポリリンカーを含みうることを意味する。ＡＡＶ２の場合、制限部位をＶＰ１の第１アミノ末端アミノ酸１〜５０内のいずれかの部位に対応する核酸、あるいはＶＰ１のアミノ酸位置２６１、３８１、４４７、５３４、５７３および／または５８７、好ましくはアミノ酸位置４４７または５８７に対応する核酸の後に挿入できる。

好ましい態様において、エンドヌクレアーゼ制限部位またはポリリンカーはさらに終止コドンを含むことができる。
これにより翻訳終止シグナルをもつ挿入配列を含まないｃａｐ遺伝子が得られ、これは欠損キャプシドタンパク質を生成し、したがってライブラリー調製中に野生型ウイルスを産生することはないであろう。

好ましい態様において、本発明のｃａｐ遺伝子はさらに少なくとも１つの変異、たとえば少なくとも１つの点変異、少なくとも１つの、内部における１個または数個のアミノ酸の欠失、挿入および／または置換、あるいは少なくとも１つの、Ｎ末端またはＣ末端における１個または数個のアミノ酸の欠失、挿入および／または置換、あるいはこれらの変異の組合わせを生じる変異を含むことができる。

さらに、前記ｃａｐ遺伝子は、ランダム化核酸配列の挿入部位の上流および／または下流に少なくとも１つのコドン、好ましくはＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ａｓｐおよび／またはＡｒｇをコードする１、２または３つのコドンの定常挿入配列、特に挿入部位の上流に３つのＡｌａおよび下流に２つのＡｌａの挿入配列をさらに含むことができる。

他の好ましい態様において、ｃａｐ遺伝子は選択したアミノ酸範囲に対する非ランダム化コドンを含んでもよい。これは、ランダム化挿入配列および１以上の追加挿入配列を異なる部位に挿入してそのような発現可能な構造遺伝子の特性を変化させることにより、目的特性を備えた発現可能な構造遺伝子を同時にスクリーニングできるという利点をもつ。

たとえば、ペプチドをコードし、再ターゲティッドベクターまたは他の目的特性を備えたベクターを生じる挿入配列が既に同定されている場合、この挿入配列を特定部位に用い、ランダム化挿入配列を他の部位に用いて、他の特性が増強されたベクターをスクリーニングすることができる。数個または全部の既知の挿入可能部位について、この操作を反復できる。

さらに、好ましくは既知または推定エピトープにおいて、ランダム化挿入配列の挿入と追加の固定挿入配列の挿入を組み合わせて、ベクターの免疫原性を変化させることができる。本発明の範囲において、ランダム化挿入配列を用いて特定の細胞タイプに対する感染性または特異性の増大したベクターをスクリーニングすることにより（ｒＡＡＶｏ−５８７／Ｍｅｃ、実施例７）、あるいは固定挿入配列を挿入することにより（ｒＡＡＶ−５８７／Ｌ１４、実施例７）、抗体の中和作用を消失または低下させうることが示された。したがって本発明は、抗体（モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体／血清）への結合が低下したベクターおよび／または中和抗体を回避する能力をもつため患者における免疫反応を回避できるベクターの作製またはスクリーニングにも使用できる。

したがって、最も好ましい態様において本発明のｃａｐ遺伝子は、下記のものをもつ挿入配列を含む：
ａ）制限部位または組換え部位；
ｂ）追加アミノ酸、好ましくはＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ａｓｐおよび／またはＡｒｇをコードする１以上ののコドン；ならびに
ｃ）機能性キャプシドタンパク質の形成を阻害する配列範囲、好ましくは終止コドン。

本発明の他の対象は、プラスミドｐＷＴ９９ｏｅｎの配列を含むｃａｐ遺伝子コード核酸である（図１、提示した配列、および実施例１）。
本発明の他の対象は、ｃａｐ遺伝子コード核酸であって、ｃａｐ遺伝子がＲＧＤまたはＤＤＤモチーフ、好ましくはＲＧＤＸＰまたはＤＤＤＸＰモチーフ、特にヒトタンパク質中に存在しないＲＧＤモチーフを含む追加アミノ酸、ただし挿入配列ＡＧＴＦＡＬＲＧＤＮＰＱＧ以外のものを生じる挿入配列を有する核酸である。そのようなｃａｐ遺伝子は、アミノ酸ＲＧＤＸＸＸＸ、ＲＧＤＸＰＸＸ、ＤＤＤＸＰＸＸ、ＲＧＤＡＶＧＶもしくはＲＧＤＴＰＴＳ、ＧＫＬＦＶＤＲ、ＲＤＮＡＶＶＰ、ＧＥＮＱＡＲＳ、ＲＳＮＧＶＶＰ、ＲＳＮＡＶＶＰまたはＮＳＶＲＡＰＰに対応する挿入配列をもつことができる。

本発明はさらに、本発明の前記ｃａｐ遺伝子がコードするＣａｐタンパク質に関する。
本発明の他の態様は、ｃａｐ遺伝子コード核酸であって、ｃａｐ遺伝子がヌクレオチド配列ＧＡＮＧＡＮＮＡＣＮＮＮＮＣＮＡＮＮＡＮＮ（Ｎ＝Ａ、Ｃ、ＧまたはＴ）の挿入配列またはその配列を含む挿入配列をもつ核酸である。

挿入核酸配列は、ＶＰ１の第１アミノ末端アミノ酸１〜５０に対応するいずれかの部位、ＶＰ１のアミノ酸位置２６１、３８１、４４７、５３４、５７３および／または５８７に対応する部位の後、好ましくはアミノ酸位置４４７または５８７に対応する部位の後に挿入できる。

これは、ＡＡＶ２の場合、挿入核酸配列は、ＶＰ１の第１アミノ末端アミノ酸１〜５０内のいずれかに対応する核酸、あるいはＶＰ１のアミノ酸位置２６１、３８１、４４７、５３４、５７３および／または５８７、好ましくはアミノ酸位置４４７または５８７に対応する核酸の後に挿入できることを意味する。

好ましい態様において、本発明のｃａｐ遺伝子は少なくとも１つの変異、好ましくは少なくとも１つの点変異、少なくとも１つの、内部における１個または数個のアミノ酸の欠失、挿入および／または置換、あるいは少なくとも１つの、Ｎ末端またはＣ末端における１個または数個のアミノ酸の欠失、挿入および／または置換、あるいはこれらの変異の組合わせを生じる変異をもつ。

他の好ましい態様において、前記ｃａｐ遺伝子はさらに、ランダム化核酸配列の挿入部位の上流および／または下流に少なくとも１つのコドン、好ましくはＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ａｓｐおよび／またはＡｒｇをコードする１、２または３つのコドンの定常挿入配列、好ましくは挿入部位の上流に３つのＡｌａおよび下流に２つのＡｌａの挿入配列をもつことができる。

本発明はさらに、少なくとも１つの真核細胞ウイルス、好ましくはパルボウイルスに由来する多数の発現可能なｃａｐ遺伝子を含む核酸ライブラリーの調製における、本発明のｃａｐ遺伝子コード核酸の使用に関する。

本発明の他の態様は、前記ｃａｐ遺伝子または構築体のいずれかを含むベクター構築体、細菌または細胞である。
本発明の他の態様は、特定の細胞タイプに対する感染性または特異性の増大した組換えビリオンを選択する方法であって、
ｉ）少なくとも１つの第１細胞に、本発明のライブラリーからの少なくとも１つの核酸およびビリオンのパッケージングに必要な第２核酸（特にパッケージング配列、たとえばＡＡＶ ＩＴＲ、ならびに複製およびパッケージングなど非構造性機能、たとえばＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質の機能を付与する１以上の遺伝子）を含むベクター構築体を付与し；
ｉｉ）必要ならば、第１細胞にビリオンのパッケージングに必要な細胞性、ウイルス性、物理的および／または化学的ヘルパー機能を付与し；
ｉｉｉ）第１細胞をビリオンのパッケージングに適した条件下でインキュベートし、第１細胞が産生したビリオンを採集し；
ｉｖ）少なくとも１つの第２細胞に採集したビリオンを感染させ；
ｖ）第２細胞に、ビリオンのパッケージングに必要な細胞性、ウイルス性、物理的および／または化学的ヘルパー機能を付与し；
ｖｉ）第２細胞をビリオンのパッケージングに適した条件下でインキュベートし、第２細胞が産生したビリオンを採集する
工程を含み、工程ｉｖ）〜ｖｉ）を数回反復することができる方法である。

非構造性機能、たとえばＲｅｐタンパク質を、シスまたはトランスに付与することができる。
さらに、第１細胞と第２細胞は同一の種類またはタイプであってもよい。

本発明の他の態様は、特定の細胞タイプに対する感染性または特異性が増大し、同時に他の細胞タイプに対する感染性が低下した、または感染性をもたない、組換えビリオンを選択する方法である。このような負の選択を行うために、前記方法はさらに、下記の工程を含む：
ｖｉｉ）少なくとも１つの第３細胞に採集したビリオンを感染させ、その際、第３細胞はこれらのビリオンに許容性でなく；
ｖｉｉｉ）第３細胞に感染しなかったビリオンを採集する。

これらの追加工程を用いると、あるビリオンはそのような第３細胞に感染して細胞に侵入できるが、細胞の非許容性のためこれらの細胞内で複製しない。したがって、それらのビリオンはライブラリーから枯渇する。これらの工程も同一または異なる細胞タイプについて反復できる。

そのような第３細胞に、ビリオンのパッケージングに必要なすべての細胞性、ウイルス性、物理的および／または化学的機能を付与しないことにより、ヘルパー依存性およびヘルパー非依存性ビリオンの両方に対する非許容細胞を得ることができる。ウイルスの複製および／またはパッケージングを阻害するが、感染を阻害しない薬物、たとえばＨＳＶに対するアシロビル（ａｃｉｌｏｖｉｒ）を用いることもできる。さらに、変異により複製不能にされているため再び許容性になるには細胞が特定の機能を備えなければならないビリオンを使用できる。

さらに本発明は、特定の細胞タイプに対する感染性または特異性が増大したビリオンを生じる変異ｃａｐ遺伝子を同定する方法であって、前記の各工程およびさらにそのビリオンのｃａｐ遺伝子（１以上）の核酸をクローニングする工程を含む方法に関する。

好ましい態様において、本発明の組換えビリオンの選択方法は、さらにビリオンを選択する追加工程、好ましくはビリオンのアフィニティー結合工程（例えば、ビーズまたは樹脂に結合していてもよい既知の受容体または結合モチーフへの結合、たとえばアフィニティークロマトグラフィーによる）、イオン交換クロマトグラフィー工程（そのようなビリオンの精製能を改善するために）または免疫選択工程（患者からの潜在的な免疫反応を回避するために、たとえば抗体を用いる免疫枯渇による）を含む。

他の好ましい態様において、本発明は受容体結合モチーフの選択方法であって、前記の各工程を含み、第２細胞が各ベクターに対して許容性である方法に関する。
そのような受容体を、既知の組換え法により組換え発現、好ましくは過剰発現させることができる。

本発明の他の態様は、特定の細胞タイプに感染しうる組換えビリオンをインビボ選択する方法であって、
ｉ）少なくとも１つの第１細胞に、前記ライブラリーからの少なくとも１つの核酸、ならびにパッケージング配列、たとえばＡＡＶ ＩＴＲ、ならびにビリオンのパッケージングに必要な複製およびパッケージングなどの非構造機能、たとえばＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質の機能を付与する１以上の遺伝子を含む、ベクター構築体を付与し；
ｉｉ）必要ならば、第１細胞にビリオンのパッケージングに必要な細胞性またはウイルス性ヘルパー機能を付与し；
ｉｉｉ）第１細胞をビリオン、好ましくはＡＡＶのパッケージングに適した条件下でインキュベートし、そのような第１細胞が産生したビリオン、好ましくはＡＡＶを採集し；
ｉｖ）動物にこれらのビリオンを感染させる
工程を含む。

この方法は、そのような動物細胞タイプからｃａｐ遺伝子（１以上）の核酸をクローニングする工程の追加により、特定の細胞タイプに対する感染性または特異性の増大したビリオンを生じる変異ｃａｐ遺伝子を同定するために使用できる。

本発明の他の態様は、修飾された免疫原性を有する組換えビリオンを選択する方法であって、
ｉ）少なくとも１つの第１細胞に、本発明のライブラリーからの少なくとも１つの核酸およびビリオンのパッケージングに必要な第２核酸（特にＡＡＶ ＩＴＲなどの配列、ならびに複製およびパッケージングなど非構造性機能、たとえばＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質の機能を付与する１以上の遺伝子）を含むベクター構築体を付与し；
ｉｉ）必要ならば、第１細胞にビリオンのパッケージングに必要な細胞性、ウイルス性、物理的および／または化学的ヘルパー機能を付与し；
ｉｉｉ）第１細胞をビリオンのパッケージングに適した条件下でインキュベートし、第１細胞が産生したビリオンを採集し；
ｉｖ）産生されたビリオンに免疫選択工程を施し；
ｖ）少なくとも１つの第２細胞に採集したビリオンを感染させ；
ｖｉ）第２細胞に、ビリオンのパッケージングに必要な細胞性、ウイルス性、物理的および／または化学的ヘルパー機能を付与し；
ｖｉｉ）第２細胞をビリオンのパッケージングに適した条件下でインキュベートし、第１または第２細胞が産生したビリオンを採集する
工程を含み、工程ｉｖ）〜ｖｉｉ）を数回反復することができる方法である。

非構造性機能、たとえばＲｅｐタンパク質を、シスまたはトランスに付与することができる。
さらに、第１細胞と第２細胞は同一の種類またはタイプであってもよい。

免疫選択工程は当技術分野で周知である。第２細胞によるビリオンの結合または取込みを阻害するために、抗体またはこれに類する分子、たとえばＦ_ＡＢフラグメントまたは一本鎖抗体を使用するための種々の方法を考慮できる。たとえば産生されたビリオンをモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体と共にプレインキュベートすることができる。抗体がビリオンの感染に関与する重要な部位に結合すると、その結果、その抗体が認識するビリオンに対する負の選択が行われる。既知のモノクローナル抗体、または免疫陽性哺乳動物、特にヒトからの血清を使用できる。この血清に含まれるポリクローナル抗体は、抗体を単離せずに、中和抗体を回避する種々のビリオンの負の選択を行うことができるという利点をもつ。好ましい他の免疫選択工程は、抗体カラムによるアフィニティークロマトグラフィーを用いた免疫枯渇反応である。ＣＮＢｒ活性化セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）などのカラム材料を用いて、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を結合させることができる。次いで、産生されたビリオンをそれらの抗体カラムと共にインキュベートすると、結合性ビリオンが枯渇したカラム溶出液を得ることができる。

本発明はさらに、配列ＲＧＤＡＶＧＶ、ＲＧＤＴＰＴＳ、ＧＫＬＦＶＤＲ、ＲＤＮＡＶＶＰ、ＧＥＮＱＡＲＳ、ＲＳＮＧＶＶＰ、ＲＳＮＡＶＶＰまたはＮＳＶＲＡＰＰをもつペプチドを含むポリペプチドに関する。

好ましい態様において、本発明のポリペプチドは、配列ＲＧＤＡＶＧＶ、ＲＧＤＴＰＴＳ、ＧＫＬＦＶＤＲ、ＲＤＮＡＶＶＰ、ＧＥＮＱＡＲＳ、ＲＳＮＧＶＶＰ、ＲＳＮＡＶＶＰまたはＮＳＶＲＡＰＰの配列をもつペプチドから構成される。

好ましい態様において、本発明のポリペプチドはＣａｐポリペプチド、好ましくはパルボウイルス、特にＡＡＶに由来するものである。
本発明はさらに、真核細胞ウイルス、好ましくはパルボウイルス、特にＡＡＶの再ターゲッティングのための、前記に定めたポリペプチド、または配列ＲＧＤＸＸＸＸ、ＲＧＤＸＰＸＸもしくはＤＤＤＸＰＸＸを有するペプチドを含む、またはそれから構成される、ＡＧＴＦＡＬＲＧＤＮＰＱＧ以外のポリペプチドの使用に関する。

さらに、同定したすべてのペプチドを、非ウイルスベクターのターゲッティングに使用できる。前記ペプチドの他の潜在用途は、たとえば単離ペプチドを各受容体に結合させることにより起きる受容体の活性化または阻害による、細胞経路の起動または遮断である。前記ペプチドは、他のペプチドまたは選択した他のいずれか適切な分子との融合体としても使用できる。前記ペプチドをこの様式で用い、たとえば細胞の染色、標識、ソーティングまたは致死の目的で、それらの融合体を細胞表面に結合させることができる。

前記ペプチドは、それぞれの受容体をビーズに結合させてそのような結合ビーズに融合体／ビリオンを結合させることにより、前記ペプチドを含む融合体またはビリオンの精製にも使用できる（アフィニティークロマトグラフィー）。したがって、そのような選択したビリオンは、変化した細胞特異性だけでなく、それらに特異的な受容体を用いてアフィニティークロマトグラフィーにより精製できるという利点も備えている。

ペプチドＲＧＤＡＶＧＶおよびＲＧＤＴＰＴＳならびにＲＧＤＸＸＸＸ、ＲＧＤＸＰＸＸおよびＤＤＤＸＰＸＸは、ＲＧＤ結合インテグリンを発現する細胞と組み合わせた場合に有用である。ＲＧＤ結合インテグリンは、真核細胞に広く発現する受容体である（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ Ｅ（１９９６）Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １２，６９７−７１５；Ａｕｍａｉｌｅｙ Ｍ ｅｔ ａｌ．（１９９０）：ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ １２：２６２（１）：８２−６）。ＲＧＤモチーフを結合するインテグリンの一例は、α_ｖβ_５およびα_ｖβ_１インテグリンである。そのような細胞はたとえば巨核球、たとえばスクリーニングに用いられる細胞系、Ｍ−０７ｅである。

ペプチドＧＫＬＦＶＤＲ、ＲＤＮＡＶＶＰ、ＧＥＮＱＡＲＳ、ＲＳＮＧＶＶＰ、ＲＳＮＡＶＶＰまたはＮＳＶＲＡＰＰは、Ｂ−ＣＬＬ細胞およびＭｅｃ１細胞に有用である。これらのペプチドは、これまで同定されていない１以上の細胞性受容体に結合する。これら１以上の細胞性受容体を発現する細胞または細胞系はそれぞれ、これらのペプチドのターゲットとなる可能性がある。前記ペプチドのいずれかが細胞表面に結合しうるかについて細胞または細胞系を試験する方法は、当技術分野で知られている。これらのペプチドは造血細胞に対してライブラリーをスクリーニングすることにより同定されたので、他の多数の造血細胞、たとえばＢ細胞がこれらのペプチドを結合するであろうと推定するのが妥当である。

本発明はさらに、組換えビリオン選択のための本発明方法により得られる組換えビリオンに関する。
さらに本発明は、変異ｃａｐ遺伝子同定のための本発明方法により得られる変異ｃａｐ遺伝子に関する。

さらに本発明は、本発明の変異ｃａｐ遺伝子がコードするＣａｐタンパク質に関する。
さらに本発明は、本発明のＣａｐタンパク質を含むビリオンに関する。
さらに本発明は、本発明のビリオン、ｃａｐ遺伝子、またはＣａｐタンパク質を含む、癌、自己免疫疾患、感染症または遺伝子欠損を伴う患者を処置するための医薬に関する。

さらに本発明は、本発明のビリオン、ｃａｐ遺伝子、またはＣａｐタンパク質を患者に投与することを含む、癌、自己免疫疾患、感染症または遺伝子欠損を伴う患者を処置する方法に関する。

本明細書においては、引用した文献すべての内容を援用する。
以下の実施例および図面は本発明を詳細に説明するためのものであり、限定ではない。
実施例
実施例１：方法
プラスミドおよびウイルスの調製
プラスミドｐＷＴ．ｏｅｎを構築するために、プラスミドｐＥＧＦＰＣ−１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カリフォルニア州パロアルト）中のＨＣＭＶプロモーター／エンハンサーカセットおよびＧＦＰオープンリーディングフレームを、プラスミドｐＵＣ−ＡＶ２の野生型ＡＡＶ−２ゲノムコードフラグメントで置換した（Ｇｉｒｏｄ Ａ．ｅｔ ａｌ．，１９９９，前掲）。アミノ酸ＡＡＡｓｔｏｐＡをコードするＤＮＡフラグメントならびに制限部位ＮｏｔＩおよびＡｓｃＩを、アミノ酸位置５８７と５８８の間に、ＰＣＲ変異形成により挿入した。ＡＡＶプラスミドのライブラリー（ｐ５８７Ｌｉｂ７）を調製するために、下記の一本鎖ＤＮＡ分子のプールを合成し：

（Ｎ＝Ａ／Ｇ／Ｃ／Ｔ，Ｖ＝Ａ／Ｇ／Ｃ（Ｔではない））
ＨＰＬＣ精製した（Ｍｅｔａｂｉｏｎ ＧｍｂＨ、ドイツ国マルチンスリード）。二本鎖分子の合成のために、５’−ＣＴＣＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＧＣ−３’プライマーを用いた。二本鎖ＤＮＡ分子をプラスミドｐＷＴ．ｏｅｎのＡｓｃＩ−ＮｏｔＩラージフラグメント中へクローニングし、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ（Ｂｉｏｒａｄ、カリフォルニア州ハーキュレス）を用いるエレクトロポレーションによりｐ５８７Ｌｉｂ７を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α株へ導入し、増幅したＤＮＡを精製した。試料を少量ずつ接種することにより形質転換効率を制御した。プライマー４０６６Ｂａｃｋ（５’−ＡＴＧＴＣＣＧＴＣＣＧＴＧＴＧＴＧＧ−３’）を用いるシーケンシングにより、２０を超えるクローンのＤＮＡが制御された。プラスミドｐＲＣ、ｐＸＸ６（Ｊ．Ｓａｍｕｌｓｋｉから入手、ノースカロライナ州チャペルヒル）およびｐｓｕｂ／ＣＥＰ４／ＥＧＦＰは先に記載されている（Ｇｉｒｏｄ Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９９）前掲；Ｘｉａｏ Ｘ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２，２２２４−３２）。ウイルス産生のために、１５０ｍｍペトリ皿１５個の８０％周密状態の２９３細胞を、３７．５μｇのＤＮＡで同時トランスフェクションした。ＡＡＶライブラリー調製のために、細胞をモル比１：１のｐ５８７Ｌｉｂ７およびプラスミドｐＸＸ６で同時トランスフェクションした。ｒＡＡＶ−ｗｔ産生のために、細胞をモル比１：１：１のベクタープラスミドｐｓｕｂ／ＣＥＰ４／ＥＧＦＰ、パッケージングプラスミドｐＲＣおよびアデノウイルスプラスミドｐＸＸ６で同時トランスフェクションした。キャプシド修飾したＧＦＰ発現ｒＡＡＶ変異体の作製のためには、適宜なＮｏｔＩ−ＡｓｃＩ再ターゲッティング挿入配列を含むように修飾したｐＲＣプラスミドを用いた。ｐＲＣの代わりにプラスミドｐＩ−５８７を用いて、Ｌ１４−ＡＡＶを作製した（Ｇｉｒｏｄ Ａ．ｅｔ ａｌ．，前掲）。４８時間後、遠心分離により細胞を採集およびペレット化した。細胞を１５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）に再懸濁し、数回凍結融解し、ベンゾナーゼ（Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ）（５０Ｕ／ｍｌ）により３７℃で３０分間処理した。細胞屑を遠心分離により除去し、記載に従って上清をイオディキサノール（ｉｏｄｉｘａｎｏｌ）密度勾配に装填し、６９０００ｒｐｍで１８℃において１時間処理した（Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．６，９７３−８５）。次いでビリオンを４０％イオディキサノール相から収穫し、ＤＮＡドットブロットハイブリダイゼーションにより力価測定した（Ｇｉｒｏｄ Ａ．ｅｔ ａｌ．，前掲）。

組織培養
ＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頸類上皮細胞癌、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）、Ｍ−０７ｅ細胞、すなわちヒト巨核球白血球系（Ｊａｍｅｓ Ｄ．Ｇｒｉｆｆｉｎから入手、マサチュセッツ州ボストン）、Ｍｅｃ１、すなわち前リンパ球トランスフォーメーションしたＢ−ＣＬＬ患者由来細胞系（Ｆｅｄｅｒｉｃｏ Ｃａｌｉｇａｒｉｓ−Ｃａｐｐｉｏから入手、イタリア国トリノ）、ＣＯ−１１５細胞（ヒト大腸癌）および２９３細胞（ヒト胎児腎臓）は、ダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（ＨｅＬａおよび２９３）、ＤＭＥＭ／ＮＵＴ．Ｍｉｘ．Ｆ−１２培地（ＣＯ−１１５）、ＲＰＭＩ培地（Ｍ−０７ｅ）またはアイソコブ（Ｉｓｏｃｏｖｅ）の培地（Ｍｅｃ１）［１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）ならびにＬ−グルタミン（２ｍＭ）を補充］に、３７℃および５％ＣＯ_２で維持された。Ｍ−０７ｅ細胞については１０ｎｇ／ｍｌのインターロイキン３（ＩＬ−３）を培地に添加した。

抹消血は、Ｂ−ＣＬＬの診断が確定した患者４人からインフォームドコンセントを得て採取した。単球は、Ｆｉｃｏｌｌ／Ｈｙｐａｑｕｅ（Ｓｅｒｏｍｅｄ、ドイツ国ベルリン）密度勾配上での遠心分離により単離され、プラスチック製組織培養フラスコに付着させて単球を分離し、Ｍｅｃ１の場合と同様に補充したアイソコブの培地で培養された。フローサイトメトリーにより評価して９８％を超える単離細胞がＣＤ５およびＣＤ１９を同時発現したので、非悪性Ｂ細胞は単離したこの全細胞のうち有意画分を占めてはいなかった。患者は未処置であるか、または試験前少なくとも１カ月間は細胞減少治療を受けておらず、臨床的に安定しており、合併感染症を伴っていなかった。

形質導入効率の測定
細胞を９６または２４ウェルプレート（Ｎｕｎｃ、ドイツ国ヴィースバーデン）に接種し、ｒＡＡＶ−ＧＦＰクローンを感染させ、感染後４８時間で収穫し、洗浄し、１ｍｌのＰＢＳに再懸濁した。ＧＦＰ発現細胞の％を、Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｅｐｉｃｓ ＸＬ−ＭＣＬ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、ドイツ国クレフェルド）でフローサイトメトリーにより測定した。各試料につき最低５０００個の細胞を分析した。再ターゲティッド変異体の感染性を、種々の濃度のＧＲＧＤＴＰもしくはＧＲＧＥＳペプチド（Ｂａｃｈｅｍ、スイス国ブーベンドルフ）または５Ｉ．Ｕ．／μｌの可溶性ヘパリン（Ｂｒａｕｎ、ドイツ国メルスンゲン）の存在下または不存在で測定した。

ＡＡＶ−２再ターゲティッド変異体の選択
１０^７個のターゲット細胞に１０００ゲノムライブラリー粒子／細胞とＭＯＩ ２０のアデノウイルスを重感染させ、３７℃でインキュベートした。感染の２時間後、細胞を遠心分離し、新鮮な培地に再懸濁し、３７℃でインキュベートした。感染の４８時間後、細胞を５ｍｌのＰＢＳですすぎ、５ｍｌの細胞溶解緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのトリス／ＨＣｌ、ｐＨ８．５）に再懸濁し、３サイクルの凍結／融解により細胞溶解した。細胞屑を遠心分離により除去し、上清を次のバッチのターゲット細胞の感染（第２ラウンドの感染）に用いた。各選択ラウンド後、ウイルスＤＮＡを１００μｌアリコートの粗溶解物からフェノール／クロロホルム抽出により精製し、５８７領域の配列を決定した（プライマー４０６６−ｂａｃｋ）。

実施例２：Ｍ−０７ｅおよびＭｅｃ１細胞に対するＡＡＶ−２再ターゲティッド変異体の選択
７アミノ酸のランダム挿入配列を位置５８７に保有するキャプシド修飾ウイルス粒子４×１０^６個のライブラリーを調製した（図２および実施例１）。このキャプシド変異体のプールを、感染とターゲット細胞からのウイルス子孫収穫のサイクルで反復処理した（図３）。感染の２時間後に培地を交換することにより、細胞への侵入能力に欠陥のあるビリオンを除去した。感染の４８時間後、凍結／融解サイクルによりウイルス子孫を細胞から抽出し、新たな選択ラウンドで新たなターゲット細胞バッチの感染に用いた。各収穫の後、小アリコート（１００／ｔｌ）の粗溶解物をウイルスＤＮＡ抽出に用いた。このＤＮＡの力価測定および５８７領域の配列決定により、ライブラリーの進化をモニターすることができた（図４）。培養環境が及ぼす選択負荷により、感染プロセスの各工程、すなわち結合、取込み、脱外被、核の転座、複製および遺伝子発現の工程を達成する能力による選択が行われた。

このＡＡＶディスプレイ系が再ターゲティッド変異体を生成する可能性を、野生型ＡＡＶ−２感染に対して抵抗性である２細胞系において試験した。
Ｍ−０７ｅはヒト巨核細胞系である（Ａｖａｎｚｉ ＧＣ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．６９，３５９−６６）。ＡＡＶ−２はこれらの細胞に感染できないためこの細胞系を陰性対照として使用できることが、報告された幾つかのＡＡＶ−２感染実験で保証されている（Ｂａｒｔｌｅｔｔ ＪＳ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７，１８１−１８６；Ｐｏｎｎａｚｈａｇａｎ Ｓ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｇｅｎ，Ｖｉｒｏｌ．７７，１１１１−２２）。

Ｍｅｃ１は、前リンパ球トランスフォーメーションしたＢ細胞性慢性リンパ球性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）細胞由来の細胞系であり（Ｓｔａｃｃｈｉｎｉ Ａ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｌｅｕｋ．Ｒｅｓ．２３，１２７−３６）、同様に野生型ＡＡＶ−２感染に対して抵抗性である。

代表的な選択を図４に示す。粗溶解物中に検出されたウイルスＤＮＡの量および配列分析により、回収ビリオン数は各ラウンド後に増加し、一方、プールの不均一性は漸減していることが示された。５ラウンド後、ウイルス子孫には単一クローンのみが存在していた。このライブラリーをＭ−０７ｅ細胞に付与すると、ＲＧＤＡＶＧＶ配列を５８７部位に保有するクローンが選択された（図４）。並行した実験で、ＲＧＤＴＰＴＳ配列を保有するクローンを単離した。興味深いことに、Ｍ−０７ｅ細胞から単離した両クローンとも、ＲＧＤモチーフを選択していた。このモチーフは幾つかのタイプの細胞性インテグリンに結合することが知られている（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ Ｅ（１９９６）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１２，６９７−７１５）。Ｍｅｃ１細胞を用いて行った同様な実験では、それぞれＧＥＮＱＡＲＳ、ＧＫＬＦＶＤＲ、ＮＳＶＲＡＰＰおよびＲＳＮＡＶＶＰ／ＲＳＮＧＶＶＰペプチドを保有するクローンを同定した（データは示されていない）。

実施例３：選択した変異体のクローニング
増強緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするキャプシド修飾された組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターの作製に適したプラスミド中へ、選択したＤＮＡ配列をクローニングした。対応するＧＦＰ発現−再ターゲティッドベクターｒＡＡＶ−Ｍ０７Ａ（ＲＧＤＡＶＧＶ挿入配列）、ｒＡＡＶ−Ｍ０７Ｔ（ＲＧＤＴＰＴＳ挿入配列）、ｒＡＡＶ−ＭｅｃＡ（ＧＥＮＱＡＲＳ挿入配列）およびｒＡＡＶ−ＭｅｃＢ（ＲＳＮＡＶＶＰ挿入配列）を作製し（実施例１参照）、ゲノム力価をドットブロットアッセイにより測定した。選択した変異体のゲノム力価は、非修飾キャプシドを含むＡＡＶベクター（ｒＡＡＶ−ｗｔ）の力価に匹敵するか、またはそれより高かった（表１）。

実施例４：再ターゲティッドベクターの形質導入効率
選択したキャプシド変異体がＭ−０７ｅ細胞に形質導入される能力を試験した（図５ａ）。ゲノム粒子／細胞比２×１０^４で、変異体ｒＡＡＶ−Ｍ０７ＡおよびｒＡＡＶ−Ｍ０７Ｔは、それぞれ５０±２．５％および４７±２．７％のＭ−０７ｅ細胞に形質導入された。これは、ｒＡＡＶ−ｗｔ形質導入効率（０．５±０．０１％）と比較して１００倍および９４倍の増強である。これに対し、ｒＡＡＶ−ＭｅｃＡおよびｒＡＡＶ−ＭｅｃＢは、Ｍ−０７ｅ細胞に８．１±１．５％および１６±２％の効率で形質導入されたにすぎない。ＲＧＤモチーフを位置５８７に挿入したベクターｒＡＡＶ−Ｌ１４（Ｇｉｒｏｄ Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９９）前掲）も同様に比較した。興味深いことに、ｒＡＡＶ−Ｌ１４は、１０±０．７％のＭ−０７ｅ細胞に形質導入されたにすぎない。これは、選択した変異体ｒＡＡＶ−Ｍ０７ＡおよびｒＡＡＶ−Ｍ０７Ｔより５倍低い効率であった。これは、単純な外因性配列の挿入と比較したコンビナトリアル法の利点を明瞭に示す。

実施例５：再ターゲティッドベクターの指向性
次いで、ｒＡＡＶ−Ｍ０７ＡおよびｒＡＡＶ−Ｍ０７ＴベクターによるＭ−０７ｅ細胞への形質導入が、位置５８７に挿入されたアミノ酸によって特異的に仲介されるかを調べた。野生型ＡＡＶのキャプシドにおいて、位置５８７付近の領域は、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）への結合に関与する（Ｎｉｃｋｌｉｎ ＳＡ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．４，１７４−８１；Ｗｕ Ｐ．ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４，８６３５−４７）。ＨＳＰＧはＡＡＶ−２の一次受容体である（Ｓｕｍｍｅｒｆｏｒｄ Ｃ ａｎｄ Ｓａｍｕｌｓｋｉ Ｊ（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２，１４３８−４５）。ＨＳＰＧ類似体であり、かつ競合体である可溶性ヘパリンと共にプレインキュベートすると、ｒＡＡＶ−ＭｅｃＢによるＭ−０７ｅ細胞への形質導入は阻害されたが、ｒＡＡＶ−Ｍ０７Ａ、ｒＡＡＶ−Ｍ０７ＴおよびｒＡＡＶ−ＭｅｃＡによる形質導入は阻害されなかった（図５ａ）。これは、この部位に適宜なヘテロロガスアミノ酸を挿入すると、ＡＡＶが貫膜侵入するための一次受容体としてＨＳＰＧを用いる必要性が失われることを示した。これと著しく対照的に、競合する可溶性ＧＲＧＤＴＰペプチド（４５０μＭ）と共にＭ−０７ｅ細胞をプレインキュベートすると、ｒＡＡＶ−Ｍ０７ＡおよびｒＡＡＶ−Ｍ０７ＴによるＭ−０７ｅ細胞への形質導入が完全に阻害された（図５ａ）。この効果は濃度依存性であった（図５ｂ）。不活性（ＧＲＧＥＳ）ペプチド（４５０μＭ）と共にプレインキュベートしても影響はなかった（図５ａ）。これらの結果を合わせると、ｒＡＡＶ−Ｍ０７ＡおよびｒＡＡＶ−Ｍ０７Ｔは、ウイルスキャプシド上に提示された選択したＲＧＤモチーフとターゲット細胞表面に発現したインテグリン受容体との特異的相互作用により、ターゲット細胞に形質導入されることが証明される。

ＨＳＰＧを発現し、野生型ＡＡＶ−２感染に対して許容性である細胞に対しても、選択した変異体を試験した。ヒト大腸癌ＣＯ−１１５細胞（Ｃａｒｒｅｌ Ｓ ｅｔ ａｌ．（１９７６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．３６，３９７８−８４）において、ウイルス変異体ｒＡＡＶ−Ｍ０７Ａ、ｒＡＡＶ−Ｍ０７Ｔ、ｒＡＡＶ−ＭｅｃＡおよびｒＡＡＶ−ＭｅｃＢの形質導入効率は、野生型ＡＡＶ−２と比較してそれぞれ５０、４３、１２および３１％低下した（図５ｃ）が、ＨｅＬａ細胞においては野生型ＡＡＶ−２と類似していた（図５ｄ）。両細胞系において、変異体ｒＡＡＶ−Ｍ０７ＡおよびｒＡＡＶ−Ｍ０７Ｔによる形質導入は、ＧＲＧＤＴＰペプチドによってほぼ完全に遮断されたが、ＧＲＧＥＳペプチドまたはヘパリンよっては遮断されなかった。これと対照的に、ｒＡＡＶ−ｗｔおよびｒＡＡＶ−ＭｅｃＢによる形質導入はヘパリンにより阻害されたが、ＧＲＧＤＴＰペプチドによって阻害されなかった（図５ｃおよびｄ）。さらに、インテグリン受容体を発現しない細胞は、変異体ｒＡＡＶ−Ｍ０７ＡおよびｒＡＡＶ−Ｍ０７Ｔによる形質導入に対して許容性ではなかった（データは示されていない）。これらの結果を合わせると、ｒＡＡＶ−Ｍ０７ＡおよびｒＡＡＶ−Ｍ０７Ｔキャプシド上のＲＧＤペプチドを認識するインテグリン受容体が、ＣＯ−１１５細胞およびＨｅＬａ細胞上にも発現していることが証明される。したがって、選択したキャプシド変異体の指向性は造血細胞系に限定されず、インテグリン受容体に限定され、これは広く発現していると思われる。

選択した変異体がＭｅｃ１細胞を効率的に再ターゲッティングすることを図５ｅに示す。ｒＡＡＶ−ｗｔによるＭｅｃ１細胞への形質導入は検出できなかったが、変異体ｒＡＡＶ−ＭｅｃＡおよびｒＡＡＶ−ＭｅｃBは、ゲノム粒子／細胞比４×１０^４で最高２３％のこれらの細胞に形質導入された。次いで、ＡＡＶディスプレイ法の臨床寄与の可能性を探索するために、ｒＡＡＶ−ＭｅｃＡを用いて初代白血病細胞における形質導入効率を調べた。初代Ｂ−ＣＬＬ細胞は、ＡＡＶを含めて現在得られる大部分のウイルスベクター系による形質導入に対して抵抗性である（Ｃａｎｔｗｅｌｌ ＭＪ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｂｌｏｏｄ ８８，４６７６−８３；Ｒｏｈｒ ＵＰ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｂｌｏｏｄ ９４，１８１ａ）。非修飾キャプシドを含むベクターと著しく対照的に、ｒＡＡＶ−ＭｅｃＡ（ゲノム粒子／細胞比８×１０^４）は、４人のＢ−ＣＬＬ患者から単離した初代白血病細胞にそれぞれ５４、４９、２３および２１％の効率で形質導入された（図５ｆ）。これと対照的に、ｒＡＡＶ−Ｍ０７ＡおよびｒＡＡＶ−Ｍ０７Ｔは初代Ｂ−ＣＬＬ細胞に形質導入されなかった（データは示されていない）。これらの結果は、前記の修飾ベクターがＡＡＶベースのＢ−ＣＬＬ遺伝子療法に有用である可能性を示す（Ｃａｎｔｗｅｌｌ Ｍ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．３，９８４−８９；Ｗｉｅｒｄａ ＷＧ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｂｌｏｏｄ ９６，２９１７−２４）。

ヒト体細胞遺伝子療法のためにウイルスを分子工学的に操作する試みの成功は、適切な細胞内プロセシングに必要な主機能を保持した再ターゲッティングベクターを作製できるかに依存するであろう。本発明者らの知見は、これに大きく寄与すると思われる。ウイルス−細胞相互作用は複雑なので、多少の知識に基づく推測によって限定された数のウイルスバリアントを作製するより、大規模ライブラリーから適切なウイルス変異体を選択する方がきわめて有利である。選択法の微妙な点は分かっていなかったので、なお若干の制限はあった；すなわちキャプシド変異体は受容体特異性を示したが、細胞特異性は示さなかった。しかし、ウイルス指向性がさらに制限されたウイルスクローンを作製するという目標は、目的外の細胞タイプに感染する可能性をもつクローンを枯渇させる工程をスクリーニングプロセスに追加することにより達成されるはずである。この技術の追加改良は、キャプシドの多数部位にランダム化挿入配列をもつＡＡＶライブラリーの調製であろう。さらにウイルスディスプレイ法は、ヒト抗体または免疫エフェクター細胞による認識効率がより低いキャプシドバリアントの同定にも利用できる。最終的に、再ターゲッティングクローンの作製に用いて有効であった挿入配列が短かいことは、この技術を他のウイルス系に適用できることを示唆する。

実施例６
２つの完全に独立した実験で、Ｍ０７ｅ細胞（野生型ＡＡＶ−２感染に対して抵抗性）に対する５ラウンドの選択の後、得られた配列は挿入部位においてもはやランダム化特色を示さず、配列ＲＧＤＡＶＧＶおよびＲＧＤＴＰＴＳを含む相同性の高い２つのＲＧＤモチーフを解明できた。

これらのペプチド配列をコードするオリゴヌクレオチドをＧＦＰ−ＡＡＶプラスミド中へクローニングした。対応する変異体をパッケージングしてＭ０７ｅ細胞の感染に用いた。両変異体について、Ｍ０７ｅ細胞に２０００ゲノム粒子／細胞を感染させると、８６％を超える形質導入率が得られた（野生型ＡＡＶ−２の形質導入率は６％未満であった）。

前リンパ球トランスフォーメーションしたＢ−ＣＬＬ細胞由来の細胞系（Ｍｅｃ１）に対して行った選択ラウンドにより、これらの細胞タイプに対する改良された感染効率をＡＡＶキャプシドに付与する数種類の配列が同定された。特に配列ＧＥＮＱＡＲＳは、Ｍｅｃ１細胞において最高２０％、初代Ｂ−ＣＬＬにおいて最高５５％の形質導入率を、ＧＦＰ−ＡＡＶビリオンに付与した（両細胞タイプとも野生型ＡＡＶ感染に対して非許容性である）。

ＡＡＶライブラリーの調製
クローニング方式を図２に示す。プラスミドｐＷＴ９９ｏｅｎ（図１に配列を示す）を用い、ランダムに形成した長さ２１塩基のオリゴヌクレオチドをアミノ酸位置５８７に対応するゲノム部位にクローニングすることにより、再ターゲティッドクローン選択のためのＡＡＶコンビナトリアルライブラリーを調製した。

挿入配列は、終止コドンの確率を５０％低下させるために、７回反復ＮＮＢコドン（Ｎ＝Ａ、Ｃ、ＧまたはＴ；Ｂ＝Ｃ、ＧまたはＴ）からなっていた。
５８７位置をフランキングする野生型アミノ酸はすべて保持されていたが、挿入ペプチドの融通性を高め、かつ天然キャプシド構造のコンホメーション応力を少なくするために、このランダム化配列の上流および下流にそれぞれ３つおよび２つのＡｌａ配列を工学的に挿入した。

ランダムに形成した挿入配列を含む約５×１０^７のプラスミドを得た。クローニング結果を制御するために、これらのプラスミド２０以上の配列を決定した；配列決定したプラスミドはすべて、２１塩基のランダム化挿入配列を適正な位置に含んでいた。

このプラスミドプールを、ＡＡＶビリオンのパッケージングに必要なアデノウイルス遺伝子含有ヘルパープラスミドと同時に、２９３パッケージング細胞中へトランスフェクションした。

ウイルス子孫を、標準精製プロトコルによりイオディキサノール不連続密度勾配上で収穫した（Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．）。
ウイルス調製物のゲノム力価および感染力価を、抗ｒｅｐ抗体を用いるドットブロットおよび免疫蛍光分析により測定し、それぞれ４×１０^１１ビリオン／ｍｌおよび６×１０^８／ｍｌと定量された。

ウイルスタンパク質をプロテイナーゼＫにより消化し、フェノール／クロロホルム抽出した後に得た配列を図４に示す。５８７部位における挿入配列のランダム性が確認される。

ターゲット細胞に対する効率的な感染性変異体の選択
より良好な感染能をもつクローンを選択するためにＭ０７ｅおよびＭｅｃ１細胞（両細胞系とも、野生型ＡＡＶ感染に対してほぼ完全に抵抗性である）に対して数ラウンドの感染および収穫を行って、コンビナトリアル選択法の有効性を証明した。これは、ターゲット細胞に対して感染／収穫サイクルを反復実施することにより、簡単に達成された。この方法の概念図を図３に示す。ＭＯＩ １００のアデノウイルスをＡＡＶ複製のヘルパーとして用いた。

この系においては、培養環境がウイルスクローンの結合、侵入、複製およびパッケージング能に同時に強い選択負荷を及ぼす。感染細胞におけるウイルス複製自体が、生存可能な変異体の数を補充するのに必要な増幅工程をもたらす。これらの変異体を収穫して後続の選択ラウンドに用いる。

感染の２時間後、培地を交換して非感染性変異体を除去した。感染の４８時間後、細胞を遠心分離し、ＰＢＳですすぎ、５ｍｌの細胞溶解緩衝液に再懸濁し、３サイクルの凍結／融解を行い、子孫ビリオンを溶液中へ拡散させた。５０００ｇでの遠心により細胞屑を分離した。

各ラウンドの感染／収穫の後、少量の粗溶解調製物を調製物のゲノム力価測定および各ウイルス集団の配列決定に用いた。残りの調製物を次のバッチのターゲット細胞の感染に用いた。

Ｍ０７ｅ細胞を再ターゲッティングする変異体の同定および特性解明
Ｍ０７ｅ細胞系は野生型ＡＡＶ−２感染に対して抵抗性である。この特性はＡＡＶ−２に対する推定一次受容体（ヘパラン硫酸プロテオグリカン）を発現しないことに起因するとされ、報告された多くのＡＡＶ−２感染実験でこの細胞系を陰性対照として用いる理由が説明される。

図４に、このターゲット細胞に対するＡＡＶプールの５ラウンドの感染／収穫の結果を示す。粗溶解調製物において、ラウンド毎にわずかなＡＡＶゲノム力価上昇がみられた（ドットブロット分析により評価）。同時に、シーケンス−反応チャートのランダム挿入部分のピークが選択操作中に次第に高くなり、第５サイクルではシーケンシング反応から固定配列を読み取ることが可能になった。

この選択操作を２つの独立した実験で行い、それぞれＲＧＤＡＶＧＶおよびＲＧＤＴＰＴＳペプチドをコードする２つのＤＮＡ配列が同定された。図４は、ＲＧＤＡＶＧＶ配列を生成した実験のみを示す。

選択したＤＮＡ配列を、増強緑色蛍光タンパク質をコードするキャプシド修飾した組換えＡＡＶベクター（ｒＡＡＶ−ＧＦＰ）の作製に適したプラスミド中へクローニングした。標準ｒＡＡＶ作製プロトコルにより、ＧＦＰ発現型のこれらの再ターゲティッドクローン（ＲＧＤＡＶＧＶ配列を含むｒＡＡＶ−Ｍ０７ＡおよびＲＧＤＴＰＴＳ配列を含むｒＡＡＶ−Ｍ０７Ｔ）を作製した。

変異体ｒＡＡＶ−Ｍ０７ＡおよびｒＡＡＶ−Ｍ０７ＴがＭ０７ｅ細胞に形質導入される能力を、非修飾キャプシドをもつベクター（ｒＡＡＶ−ｗｔ）および５８７部位にＬ１４配列を発現するベクター（ｒＡＡＶ−Ｌ１４）の効率と比較した。Ｍ０７ｅ細胞に同一ゲノム粒子／細胞比で感染させた（図５）。再ターゲティッド変異体を用いた場合は形質導入率は８８％より高く、非修飾キャプシド変異体を用いた場合は６％、ｒＡＡＶ−Ｌ１４を用いた場合は１８％であった。

選択した変異体と同様に、ｒＡＡＶ−Ｌ１４は５８７部位に挿入されたＲＧＤモチーフ含有配列（ラミニンフラグメントＰ１）を保有する。本発明者らのディスプレイシステムにより作製した変異体の効率の方がｒＡＡＶ−Ｌ１４と比較して５倍以上高いことは、これまでに知られている再ターゲッティング配列の単純な挿入と比較して、ベクターコンテストにおいて直接に効率により修飾体を選択するコンビナトリアルディスプレイ法の利点を明瞭に示す。

感染プロセスの特異性および受容体仲介性を証明するために、ウイルスクローンのＭ０７ｅ細胞形質導入率を、競合性ＲＧＤＳペプチドまたは不活性ＲＧＥＳペプチドの存在下で測定した。感染前にターゲット細胞を１００ｕＭのＲＧＤＳペプチドと共にインキュベートすると、形質導入効率が５０％以上低下した。細胞をＲＧＥＳペプチドと共にプレインキュベートしても、感染は阻害されなかった（図５Ａ）。

Ｂ−ＣＬＬ細胞を再ターゲッティングする変異体の同定および特性解明
Ｍｅｃ１は、前リンパ球トランスフォーメーションしたＢ細胞性慢性リンパ球性白血病細胞由来の細胞系であり（Ｓｔａｃｃｈｉｎｉ ｅｔ ａｌ．）、野生型ＡＡＶ−２感染に対して抵抗性である。

Ｍｅｃ１細胞に対する３ラウンドの選択の後、５８７部位に挿入したＧＡＮＧＡＮＮＡＣＮＮＮＮＣＮＡＮＮＡＮＮヌクレオチド配列が読取り可能になった。
このタイプの細胞に対する他の設定の選択操作において、５ラウンド後に、ペプチドＧＫＬＦＶＤＲ、ＧＥＮＱＡＲＳ、ＲＳＮＧＶＶＰまたはＮＳＶＲＡＰＰをコードする挿入配列を含むウイルスクローンを単離できた。

ＧＥＮＱＡＲＳ配列を、増強緑色蛍光タンパク質をコードするキャプシド修飾した組換えＡＡＶベクター（ｒＡＡＶ−ＧＦＰ）の作製に適したプラスミド中へクローニングした。標準ｒＡＡＶ作製プロトコルにより、この再ターゲティッドクローンのＧＦＰ発現ウイルス粒子（ｒＡＡＶ−Ｍｅｃ１）を作製した。

Ｍｅｃ１細胞にｒＡＡＶ−Ｍｅｃ１（２００００ゲノム粒子／細胞）を感染させると約２０％の形質導入率が得られたが、ｒＡＡＶ−ｗｔはこれらの細胞に２％以上形質導入できなかった（図５Ｂ）。

初代Ｂ−ＣＬＬ細胞は、ＡＡＶを含めて現在得られる大部分のウイルスベクター系による形質導入に対して抵抗性であり、これまでの報文は３％を超えるＡＡＶベクター形質導入率を示すことができなかった（Ｄａｖｉｄの報文から引用）。ｒＡＡＶ−Ｍｅｃ１は、４人のＢ−ＣＬＬ患者から得た初代細胞に付与した場合、５４、４９、２１および２３％の形質導入率を示した（図５Ｃ）。これらの形質導入率であれば、Ｂ細胞性慢性リンパ球性白血病の治癒のためのＡＡＶベースの遺伝子療法がここで初めて可能になる。さらに、これらの初代細胞がＡＡＶベクターに対してもつ患者固有の許容性の差がこれらの結果から示唆され、他のデータによって確認される（Ｗｅｎｄｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．、報文提出）。ウイルスディスプレイ技術は患者特異的ベクターの作製の範囲を広げる。再ターゲティッド変異体の選択に関するプロトコルを初代Ｂ−ＣＬＬ細胞に対して直接最適化すると、この目標が達成されるはずであり、この方向での試みが本発明者らの研究室で現在行われている。

実施例７
ｒＡＡＶ−５８７／Ｌ１４によるＨｅＬａ細胞への形質導入はヒト血清試料中の既存の中和抗体により阻害されない
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシド上の主免疫原ドメインを詳細に理解することは、ウイルスへの血清抗体の結合とそれに続く免疫系による中和に関してだけでなく、ＡＡＶベクターによるターゲット細胞の感染を直接阻害する中和抗体の存在に関しても重要である。種々のヒト抗血清によるＡＡＶ形質導入の妨害を分析するために、ＧＦＰをコードし、Ｌ１４リガンドを位置５８７に保有する組換えＡＡＶベクター（ｒＡＡＶ−５８７／Ｌ１４）を用いて、この修飾体がヒト抗血清の中和能を遮断するかを判定した。

まず、ヒト血清試料中の中和抗体の存在を調べた。ＡＡＶ抗体（Ａｂ）に関して陽性の血清試料４３個を、ＧＦＰをコードする野生型ＡＡＶキャプシド保有ＡＡＶベクター（ｒＡＡＶ）により、中和アッセイ法で試験した。ｒＡＡＶを血清試料の系列希釈液と共にインキュベートした後、ＨｅＬａ細胞に形質導入した。次いでＧＦＰ発現細胞数をＦＡＣＳ分析により評価した。形質導入を５０％低下させた血清希釈度（Ｎ_５０）として中和抗体価を定義した。Ｎ_５０が１：３２０以上の場合、血清試料を中和性であるとみなした。４３個の血清試料中３１個（７２％）がＡＡＶに対する中和Ａｂを含有していた。これは、先に発表されたデータ（Ｅｒｌｅｓ Ｋ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ Ｍｅｄ Ｖｉｒｏｌ ５９：４０６−１１）と一致する。

これら３１個の血清試料中１５個を後続の分析のためにランダムに選択した。これらの血清試料がｒＡＡＶ−５８７／Ｌ１４によるＨｅＬａ細胞への形質導入に及ぼす影響を、ｒＡＡＶと比較して判定した（図６Ａ）。そのほか、中和モノクローナル抗体Ｃ３７−Ｂ（Ｗｏｂｕｓ ＣＥ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７４：９２８１−９３）および抗Ｌ１４血清（Ｌ１４リガンドに対して産生）を試験した。これらの実験には、同数の形質導入粒子ｒＡＡＶ−５８７／Ｌ１４およびｒＡＡＶを用いた。両ベクターを中和血清試料の系列希釈液と共にインキュベートした後、ＨｅＬａ細胞に形質導入した。試験したすべての血清試料について、ｒＡＡＶ−５８７／Ｌ１４による形質導入の低下は、ｒＡＡＶによる形質導入より８倍ないし最高６４倍（平均１５倍）低かった。１５個の血清試料中１３個において、ｒＡＡＶ−５８７／Ｌ１４による形質導入はわずかに損なわれたにすぎず、中和抗体価は１：８０以下であった。これは、ｒＡＡＶ−５８７／Ｌ１４が中和抗体の作用を回避できることを証明する（図６Ａ）。意外にも、ｒＡＡＶ−５８７／Ｌ１４は血清Ｐ４７のいかなる試験希釈度においても中和抗体を回避できた。血清試料Ｐ１７、Ｐ３１およびＰ３７は１：２０の希釈度でようやく形質導入を低下させた；これらの場合は非特異的相互作用を排除できなかった。図６Ｂおよび６Ｃは血清Ｐ３５を用いた代表的な１実験を示す；この場合、１：８０の希釈度でｒＡＡＶによる形質導入は完全に阻害された（図６Ｂ）。これと著しく対照的に、ｒＡＡＶ−５８７／Ｌ１４による形質導入は影響を受けなかった（図６Ｃ）。２つの血清試料（Ｐ１６およびＰ４８）だけは、１：３２０のＮ_５０でｒＡＡＶ−５８７／Ｌ１４形質導入効率を中和できた。本発明者らは、これはこれらの血清試料がもつ高い中和抗体含量によるものと推定する。ｒＡＡＶ−５８７／Ｌ１４による形質導入は、ｒＡＡＶによる形質導入より依然として低い影響のままだったからである。他の対照として、モノクローナル抗体Ｃ３７−Ｂを試験した。Ｃ３７−Ｂは、宿主細胞へのＡＡＶの結合を阻害する中和抗体である（Ｗｏｂｕｓ ＣＥ ｅｔ ａｌ．，前掲）。これは、ＥＬＩＳＡにおいてｒＡＡＶ−５８７／Ｌ１４を結合できなかった（データは示されていない）ので、ｒＡＡＶ−５８７／Ｌ１４の形質導入を妨害するはずはない。予想どおり、ｒＡＡＶ−５８７／Ｌ１４の形質導入はＣ３７−Ｂにより中和されず、一方、ｒＡＡＶの形質導入はこの抗体によって完全に阻害された（データは示されていない）。これと著しく対照的に、Ｌ１４リガンドに対して産生された抗Ｌ１４血清は、ｒＡＡＶ−５８７／Ｌ１４の形質導入を１：１６０の希釈度で完全に中和し、一方、ｒＡＡＶの形質導入は影響されないままであった（図６Ａ）。これらの所見がｒＡＡＶおよびｒＡＡＶ−５８７／Ｌ１４について用いた物理的な粒子数の相異によるものである可能性を排除するために、さらに対照実験を行い、両ＡＡＶベクターについて物理的に同数の粒子を用いて中和アッセイを実施した。これらの実験によっても同じ結果が得られた（データは示されていない）。

これらの結果を合わせると、変異体ｒＡＡＶ−５８７／Ｌ１４はヒト血清試料中の既存の中和抗体を回避できることが証明される。
中和血清はＢ１６Ｆ１０細胞へのＬ１４仲介によるｒＡＡＶ−５８７／Ｌ１４の指向性を妨害しない
インテグリン特異的Ｌ１４ペプチドを５８７に挿入すると、非許容性Ｂ１６Ｆ１０細胞へのＡＡＶの指向性が拡大する（Ｇｉｒｏｄ Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｎａｔ Ｍｅｄ ５：１０５２−６）。ｒＡＡＶ−５８７／Ｌ１４が挿入リガンドＬ１４によりターゲット細胞系Ｂ１６Ｆ１０に感染する能力を中和抗血清の存在下で保持できるかを判定するために、選択した血清試料を用いて追加実験を行った。ｒＡＡＶ−５８７／Ｌ１４をＰ３５血清の系列希釈液と共にインキュベートした後、照射Ｂ１６Ｆ１０細胞に形質導入した。７２時間後にＧＦＰ発現を測定すると、ｒＡＡＶ−５８７／Ｌ１４は希釈度１：８０のＰ３５と共にインキュベートしたにもかかわらず効率的にＢ１６Ｆ１０に形質導入され、一方、抗Ｌ１４血清はこの希釈度で完全に形質導入を阻害した（図７Ｂおよび７Ｃ）。Ｐ３７およびＰ２６を試験した場合、ＨｅＬａ細胞について測定されたものと同じ中和抗体価が得られた（データは示されていない）。これらの所見は、ＡＡＶ Ｌ１４ターゲッティングベクターが、その再ターゲッティング能を維持したままヒト血清中の中和抗体を回避できることを示した。

ｒＡＡＶ−５８７が中和血清を回避する能力は挿入Ｌ１４リガンドに依存しない
中和抗血清からの回避が特異的リガンドによるものである可能性を排除するために、７アミノ酸リガンド（ＧＥＮＱＡＲＳ）を位置５８７に保有する他の挿入変異体ｒＡＡＶ−５８７／ＭｅｃＡを試験した。この変異体はＭｅｃ１細胞におけるＡＡＶディスプレイにより選択され、Ｂ細胞性慢性リンパ球性白血病患者に由来するＭｅｃ１細胞および初代Ｂ細胞に効率的かつ受容体特異的に形質導入する（前記）。ｒＡＡＶ−５８７／ＭｅｃＡおよびｒＡＡＶを血清Ｐ３５と共にインキュベートした後、Ｍｅｃ１細胞に感染させた。ｒＡＡＶ−５８７／ＭｅｃＡによるＭｅｃ１への形質導入は、血清Ｐ３５（希釈度１：８０）の中和抗体により影響されなかった。これに対し、ｒＡＡＶの形質導入はほぼ完全にこの血清により阻害された（図８）。他の中和血清試料を用いた実験でも同じ結果が得られた（データは示されていない）。ＨｅＬａ細胞と同様に、Ａ２０はｒＡＡＶ−５８７／ＭｅｃＡの形質導入を阻害できたが、Ｃ３７−Ｂは影響されなかった（データは示されていない）。

これらの結果を合わせると、種々のヘテロロガスリガンドを位置５８７に挿入すると、既存の中和抗体から回避できることが証明される。これらのベクターのターゲッティング特性は、中和抗血清の存在下ですら、これらのキャプシド変異体において保持される。

考察
本明細書は、細胞タイプ特異的ウイルス遺伝子送達ベクターを同定するための真核細胞ウイルスコンビナトリアルライブラリーの調製および利用についての最初の記述である。記載した実験において、この方法の利用により、野生型ＡＡＶ感染に対して抵抗性である細胞への高い形質導入効率をもつ数種類の新規なＡＡＶ変異体を得た。

本明細書に記載するすべての変異体が特異的であり、ＲＧＤＳペプチド競合実験が証明するように、５８７部位における挿入配列により決定される指向特性を示す（図５Ａ）。これらのクローンは、ＡＡＶの天然一次受容体であるヘパラン硫酸プロテオグリカンとの相互作用も示さなかった（表１）。キャプシド構造に他の修飾を導入することにより、たとえば再ターゲッティング配列の挿入と、５６１〜５６５ ＤＥＥＥＩ−ＡＡＡＡＩ置換などの修飾（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．）および／またはヌクレオチド部位３７６１におけるＡＩＳＰ挿入（Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．）とを組み合わせることにより、ビリオンに追加特異性を付与することができる。

ベクターの特異性を高めるための他の可能性は、サブトラクション選択ラウンドの導入、すなわち感染させたくない細胞を感染させて非感染ビリオンを含有する上清を回収する方法、またはアフィニティーカラムを用いて前記ウイルス集団をカラム結合クローンから分離する方法である。

系を改良するために本発明者らの研究室で行われている他の方法は、多重キャプシドタンパク質部位レベルでランダム化挿入配列をもつＡＡＶライブラリーの調製である。
最高５５％のＢ−ＣＬＬ初代細胞形質導入率を示した変異体ＧＥＮＱＡＲＳの記載は、この悪性疾患の遺伝子療法に直ちに寄与する。これらの細胞タイプにＡＡＶベースのベクターを形質導入する従来の試みでは、３％を超える効率を達成できなかった。本発明者らの結果は、患者特異的ベクターを作製するためのプロトコルの確立が重要であることも示唆する。ＡＡＶディスプレイ技術によりこれが可能となった。

ランダム選択変異体とＬ１４変異体の感染効率を比較すると、ＲＧＤ配列の特定位置およびそのフランキングアミノ酸の重要性が証明され、したがってベクターの構造に関して直接に再ターゲッティング修飾体を選択する利点が示唆される。

本明細書にアデノ随伴ウイルスに関して記載した技術は、いかなるウイルス系にも適用できる。
遺伝子送達系という目標のほか、ＡＡＶディスプレイ法は、興味深い生物学的特性をもつペプチドの解明および特異的リガンド−受容体相互作用の研究のためにこのウイルスの生物学的特性を理解するのに用いる道具としても有用であろう。

表１．キャプシド修飾したｒＡＡＶ−ＧＦＰ変異体の特性解明および特異性
ゲノム力価をドットブロットアッセイにより測定した。ＨｅＬａ、Ｍ０７ｅおよびＭｅｃ１細胞に同一のゲノム粒子／細胞比で感染させた後、これらの細胞に対するこの変異体の感染性をＦＡＣＳ分析により測定した。各細胞系について、形質導入率を太字の数値に対応する変異体についての１００％に対して正規化した。ウイルス調製物を可溶性ヘパリンと共にプレインキュベートすることにより、可溶性ヘパリンがＨｅＬａ細胞の感染を阻害する能力を評価した。

プラスミドｐＷＴ９９ｏｅｎの概念地図である。 ＡＡＶ−２キャプシド修飾粒子のライブラリーの構築方法を示す。ランダムに形成したオリゴヌクレオチドのプールを、ＡＡＶ−２ゲノムコードプラスミドのキャプシドタンパク質ＶＰ１のアミノ酸部位５８７に対応する部位にクローニングした。得られたプラスミドプールを２９３細胞中へトランスフェクションした。標準ウイルス産生プロトコルに従って、約１０^８のキャプシド修飾ＡＡＶ−２クローンのライブラリーを調製した。 再ターゲティッド変異体を選択するためのＡＡＶディスプレイスクリーニング法を示す。ターゲット細胞にキャプシド修飾ＡＡＶ−２クローンのライブラリーおよびアデノウイルス（ＡＡＶ複製のヘルパー）を感染させた。感染の２時間後、洗浄工程により非感染性ビリオンを除去する。感染の４８時間後に採集したウイルス子孫を、次の選択ラウンドに用いた。各ラウンド後のＡＡＶ集団の進化を力価測定と配列決定によりモニターした。 Ｍ０７ｅ細胞における６ラウンドの選択に際してのウイルス集団の進化の例である。（Ａ）各感染サイクル後に収穫したウイルス子孫のドットブロットアッセイ定量。（Ｂ）ｃａｐ遺伝子のランダム挿入配列を含む領域の配列決定により、各選択ラウンド後に採集したウイルス集団の不均一性の漸減が示される。５ラウンド後、ウイルス子孫中に単一クローン（図示したＲＧＤＡＶＧＶ挿入配列を保有する例において）を検出できた。 形質導入効率を示す。選択したｒＡＡＶ−ＧＦＰ変異体について、ＦＡＣＳ分析により二重試験法で測定した形質導入効率±標準偏差（黒色棒）。ウイルス調製物を可溶性ヘパリンと共にプレインキュベーションした後（白色棒）、または細胞を競合するＧＲＧＤＴＰと共に（灰色棒）および不活性ＧＲＧＥＳペプチドと共に（チェック模様棒）プレインキュベーションした後に、同様に形質導入率を評価した。ａ）Ｍ−０７ｅ細胞； ｂ）ｒＡＡＶ／Ｍ０７Ａ（白丸）およびｒＡＡＶ／Ｍ０７Ｔ（黒丸）によるＲＧＤＴＰ仲介Ｍ−０７ｅ細胞形質導入阻害の濃度依存性；ｃ）ＣＯ−１１５細胞；ｄ）ＨｅＬａ細胞；ｅ）Ｍｅｃ１細胞；ｆ）４人の異なる患者から得た初代Ｂ−ＣＬＬ細胞。 ＨｅＬａ細胞における中和アッセイを示す。（Ａ）ｒＡＡＶおよびｒＡＡＶ−５８７／Ｌ１４に対する中和抗体価。１５個の中和ヒト血清試料（Ｐ３〜Ｐ６５）の系列希釈液（１：１０〜１：１２００）をＨｅＬａ細胞において分析した。対照として、挿入Ｌ１４−リガンドに対して形成されたウサギ血清（α−Ｌ１４）を試験した。中和抗体価（Ｎ_５０）は、陽性対照と比較して形質導入が５０％低下した希釈度として表わされる。ｒＡＡＶ（Ｂ）およびｒＡＡＶ−５８７／Ｌ１４（Ｃ）を、ＨｅＬａ細胞感染前に血清Ｐ３５（１：８０）と共にインキュベートした。感染の４８時間後に、ＧＦＰの発現を蛍光顕微鏡検査によりモニターした。 Ｂ１６Ｆ１０細胞における中和アッセイを示す。照射Ｂ１６Ｆ１０細胞に、ｒＡＡＶ−５８７／Ｌ１４のみを（Ａ）、またはＰ３５血清（Ｃ）もしくは抗−Ｌ１４血清（Ｄ）（１：８０の血清希釈液）との同時インキュベーション後に、感染させた。７２時間後に、細胞をＧＦＰ発現について蛍光顕微鏡検査により分析した。 ｒＡＡＶ−５８７／ＭｅｃＡ形質導入に対する中和抗血清の作用。（Ａ）アデノウイルス感染後、Ｍｅｃ１細胞に、ｒＡＡＶのみ（上列）およびｒＡＡＶ−５８７／ＭｅｃＡのみ（下列）を（陽性対照）、または希釈度１：８０の血清Ｐ３５との同時インキュベーション後に（＋血清Ｐ３５）、感染させた。ｒＡＡＶについては同様な形質導入を達成するために、より多量の物理的粒子を用いたことを留意されたい。（Ｂ）血清Ｐ３５と共にインキュベートした（灰色の線）ｒＡＡＶ（上列）およびｒＡＡＶ−５８７／ＭｅｃＡ（下列）のＦＡＣＳ分析を、それらの陽性対照（黒色の線）と比較したもの。感染の４８時間後に、ＧＦＰ発現を測定した。

Claims (76)

1. 少なくとも１つの真核細胞ウイルスに由来する多数の発現可能な構造遺伝子を含む核酸ライブラリーの調製方法であって、
   ａ）それぞれが真核細胞ウイルス由来の構造遺伝子を少なくとも１つコードし、かつ適切なパッケージング配列を含む、一組の核酸を用意し、そして
   ｂ）第１挿入配列（１）を該構造遺伝子に挿入する
   工程を含む方法。
2. 構造遺伝子が、有エンベロープウイルス、たとえばレトロウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、たとえばＨＳＶ１、ＨＳＶ２、ＥＢＶ、水痘帯状疱疹ウイルス、ヒトヘルペスウイルス１、２、３、４、７または８に由来する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
3. 構造遺伝子が、無エンベロープウイルス、たとえばパルボウイルスまたはアデノウイルスに由来するｃａｐ遺伝子である、請求項１に記載の方法。
4. ｃａｐ遺伝子が、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）、ＭＶＭ、Ｂ１９、Ｈ１、ＡＡＡＶまたはＧＰＶよりなる群から選択されるパルボウイルスに由来する、請求項３に記載の方法。
5. ｃａｐ遺伝子がＡＡＶに由来する、請求項４に記載の方法。
6. 一組の核酸が１つの核酸に由来する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
7. 挿入配列（１）の挿入により構造遺伝子のある配列が除去される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
8. 除去された配列が、工程（ａ）の前に構造遺伝子に挿入された挿入配列（２）を含むか、またはその一部である、請求項７に記載の方法。
9. 挿入配列（２）が、好ましくは終止コドンを含有することにより機能性キャプシドタンパク質の形成を阻害する、請求項８に記載の方法。
10. 挿入配列（１）の挿入により終止コドンが除去される、請求項９に記載の方法。
11. 挿入配列（１）および／または挿入配列（２）の、好ましくは挿入配列（１）および挿入配列（２）のヌクレオチド数が３または３の倍数である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
12. 挿入配列（１）が、構造タンパク質の表面にあるアミノ酸をコードするｃａｐ遺伝子領域に挿入される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
13. ウイルスがＡＡＶであり、挿入配列（１）がキャプシドタンパク質ＶＰ１の第１アミノ末端アミノ酸１〜５０内のいずれかの部位に対応する核酸、あるいはアミノ酸位置２６１、３８１、４４７、５３４、５７３および／または５８７、好ましくはアミノ酸位置４４７または５８７に対応する核酸の後に挿入される、請求項１２に記載の方法。
14. 挿入配列（１）がランダムまたは部分的にランダムに形成された、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
15. 挿入配列（１）が終止コドンを含まない、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
16. ライブラリーが、１０^２より多い、好ましくは１０^５より多い、特に１０^６より多い多数のウイルス変異体を有する、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
17. パルボウイルス、より好ましくはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）、ＭＶＭ、Ｂ１９、Ｈ１、ＡＡＡＶまたはＧＰＶに由来する多数の発現可能な構造遺伝子、好ましくはｃａｐ遺伝子を含む、核酸ライブラリー。
18. 多数の発現可能な構造遺伝子、好ましくはｃａｐ遺伝子が、１０^２より多い、好ましくは１０^５より多い、特に１０^６より多い、請求項１７に記載のライブラリー。
19. ライブラリーが、１０^２より多い、好ましくは１０^５より多い、特に１０^６より多い多数のウイルス変異体を有する、請求項１７または１８に記載のライブラリー。
20. 核酸が線状核酸、プラスミド、ウイルス粒子またはウイルスベクター、たとえば組換えＡＡＶ、アデノウイルスまたは単純ヘルペスウイルスベクターである、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載のライブラリー。
21. 核酸がさらに、パッケージング配列、たとえばＡＡＶ ＩＴＲ、ならびにビリオンの複製およびパッケージングに必要な機能、たとえばＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質を供給する少なくとも１つの発現可能な遺伝子を含む、請求項１７〜２０のいずれか１項に記載のライブラリー。
22. 核酸がＤＮＡである、請求項１７〜２１のいずれか１項に記載のライブラリー。
23. ｃａｐ遺伝子が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５およびＡＡＶ６よりなる群からのＡＡＶ血清型の１つに由来する、請求項１７〜２２のいずれか１項に記載のライブラリー。
24. ｃａｐ遺伝子が、プラスミドｐＷＴ９９ｏｅｎ中に組み込まれたｃａｐ遺伝子に由来する、請求項１７〜２３のいずれか１項に記載のライブラリー。
25. 構造遺伝子、好ましくはｃａｐ遺伝子の少なくとも１つの部位に多数の核酸配列が挿入され、挿入ヌクレオチドの数が３または３の倍数である、請求項１７〜２４のいずれか１項に記載のライブラリー。
26. 挿入核酸配列が、特にＮＮＮコドン、ＮＮＢコドンまたはＮＮＫコドンを用いてランダムに形成されたものである、請求項２５に記載のライブラリー。
27. 挿入核酸配列が、特に１、２または３個の固定ヌクレオチドを用いて部分的にランダムに形成されたものである、請求項２５に記載のライブラリー。
28. 挿入核酸配列が、少なくとも３ヌクレオチド、好ましくは少なくとも９、特に少なくとも１８ヌクレオチドの長さをもつ、請求項２５〜２７のいずれか１項に記載のライブラリー。
29. 挿入核酸配列が、標準的な制限エンドヌクレアーゼ、または組換え系、好ましくはゲートウェイもしくはｃｒｅ／ｌｏｘ組換え系、または好ましくは変性プライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応法により挿入された、請求項２５〜２８のいずれか１項に記載のライブラリー。
30. 挿入核酸配列により、ＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３構造タンパク質の、好ましくはキャプシド表面に位置する部位に、アミノ酸が挿入される、請求項２５〜２９のいずれか１項に記載のライブラリー。
31. 挿入核酸配列が、ＶＰ１の第１アミノ末端アミノ酸１〜５０内のいずれかの部位に対応する核酸、あるいはＶＰ１のアミノ酸位置２６１、３８１、４４７、５３４、５７３および／または５８７、好ましくはアミノ酸位置４４７または５８７に対応する核酸の後に挿入された、請求項２５〜３０のいずれか１項に記載のライブラリー。
32. 構造遺伝子、好ましくはｃａｐ遺伝子がさらに少なくとも１つの変異、たとえば少なくとも１つの点変異、少なくとも１つの、内部における１個または数個のアミノ酸の欠失、挿入および／または置換、あるいは少なくとも１つの、Ｎ末端またはＣ末端における１個または数個のアミノ酸の欠失、挿入および／または置換、あるいはこれらの変異の組合わせを生じる変異、好ましくはヘパラン硫酸プロテオグリカンへの結合、インテグリンおよび／または線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）への結合を阻害する変異を有する、請求項１７〜３１のいずれか１項に記載のライブラリー。
33. 構造遺伝子、好ましくはｃａｐ遺伝子がさらに、挿入核酸配列の挿入部位の上流および／または下流に少なくとも１つのコドン、好ましくはＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ａｓｐおよび／またはＡｒｇをコードする１、２または３つのコドンの定常挿入配列、特に挿入部位の上流に３つのＡｌａおよび下流に２つのＡｌａの挿入配列を有する、請求項１７〜３２のいずれか１項に記載のライブラリー。
34. 請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法により得られる、少なくとも１つの真核細胞ウイルスに由来する多数の発現可能な構造遺伝子を含む、核酸ライブラリー。
35. 請求項１７〜３３のいずれか１項に定める特色を有する、請求項３４に記載の核酸ライブラリー。
36. キャプシドタンパク質修飾体を含むビリオン、特にパルボウイルスビリオンのライブラリー。
37. ウイルス子孫の生成に必要な遺伝情報を含む粒子を含む、請求項３６に記載のビリオンのライブラリー。
38. 各粒子がウイルス子孫の生成に必要な遺伝情報を含む、請求項３７に記載のビリオンのライブラリー。
39. 請求項１〜３５のいずれか１項に定める核酸を用いて作製された、請求項３６〜３８のいずれか１項に記載のビリオンのライブラリー。
40. 請求項１〜３５のいずれか１項に定めるライブラリーの核酸を発現させることにより得られる、請求項３６〜３９のいずれか１項に記載のビリオンのライブラリー。
41. ｃａｐ遺伝子内の、好ましくはＶＰ１のアミノ酸位置５８７の後に、好ましくはゲートウェイまたはｃｒｅ／ｌｏｘ系に対する少なくとも１つの組換え部位を含むｃａｐ遺伝子コード核酸であって、挿入核酸配列が、ＶＰ１の第１アミノ末端アミノ酸１〜５０内のいずれかの部位に対応する核酸、あるいはＶＰ１のアミノ酸位置２６１、３８１、４４７、５３４、５７３および／または５８７、好ましくはアミノ酸位置４４７または５８７に対応する核酸の後に挿入された核酸。
42. それぞれの野生型遺伝子に存在しない少なくとも１つのエンドヌクレアーゼ制限部位またはポリリンカーを含み、それらがＶＰ１の第１アミノ末端アミノ酸１〜５０内のいずれかの部位に対応する核酸、あるいはＶＰ１のアミノ酸位置２６１、３８１、４４７、５３４、５７３および／または５８７、好ましくはアミノ酸位置４４７または５８７に対応する核酸の後に挿入された、ｃａｐ遺伝子コード核酸。
43. 組換え部位、エンドヌクレアーゼ制限部位またはポリリンカーが、さらに終止コドンを含む、請求項４１または４２に記載のｃａｐ遺伝子コード核酸。
44. ｃａｐ遺伝子が少なくとも１つの変異、たとえば少なくとも１つの点変異、少なくとも１つの、内部における１個または数個のアミノ酸の欠失、挿入および／または置換、あるいは少なくとも１つの、Ｎ末端またはＣ末端における１個または数個のアミノ酸の欠失、挿入および／または置換、あるいはこれらの変異の組合わせを生じる変異を有する、請求項４１〜４３のいずれか１項に記載のｃａｐ遺伝子コード核酸。
45. ｃａｐ遺伝子がさらに、挿入核酸配列の挿入部位の上流および／または下流に少なくとも１つのコドン、好ましくはＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ａｓｐおよび／またはＡｒｇをコードする１、２または３つのコドンの定常挿入配列、特に挿入部位の上流に３つのＡｌａおよび下流に２つのＡｌａの挿入配列を有する、請求項４１〜４４のいずれか１項に記載のｃａｐ遺伝子コード核酸。
46. プラスミドｐＷＴ９９ｏｅｎの配列を含むｃａｐ遺伝子コード核酸。
47. ｃａｐ遺伝子が、ＲＧＤまたはＤＤＤモチーフ、好ましくはＲＧＤＸＰまたはＤＤＤＸＰモチーフ、特にヒトタンパク質中に存在しないＲＧＤモチーフを含むアミノ酸、ただし挿入配列ＡＧＴＦＡＬＲＧＤＮＰＱＧ以外のものを生じる挿入配列を有する、ｃａｐ遺伝子コード核酸。
48. ｃａｐ遺伝子が、アミノ酸ＲＧＤＸＸＸＸ、ＲＧＤＸＰＸＸ、ＤＤＤＸＰＸＸ、ＲＧＤＡＶＧＶ、ＲＧＤＴＰＴＳ、ＲＳＮＡＶＶＰ、ＲＤＮＡＶＶＰ、ＧＫＬＦＶＤＲ、ＧＥＮＱＡＲＳ、ＲＳＮＧＶＶＰまたはＮＳＶＲＡＰＰを生じる挿入配列を有する、ｃａｐ遺伝子コード核酸。
49. ｃａｐ遺伝子が、挿入ヌクレオチド配列ＧＡＮＧＡＮＮＡＣＮＮＮＮＣＮＡＮＮＡＮＮ（Ｎ＝Ａ、Ｃ、ＧまたはＴ）またはその配列を含む挿入配列を有する、ｃａｐ遺伝子コード核酸。
50. 挿入核酸配列が、ＶＰ１の第１アミノ末端アミノ酸１〜５０に対応するいずれかの部位、ＶＰ１のアミノ酸位置２６１、３８１、４４７、５３４、５７３および／または５８７に対応する部位の後、好ましくはアミノ酸位置４４７または５８７に対応する部位の後に挿入された、請求項４７〜４９のいずれか１項に記載の核酸。
51. ｃａｐ遺伝子が少なくとも１つの変異、たとえば少なくとも１つの点変異、少なくとも１つの、内部における１個または数個のアミノ酸の欠失、挿入および／または置換、あるいは少なくとも１つの、Ｎ末端またはＣ末端における１個または数個のアミノ酸の欠失、挿入および／または置換、あるいはこれらの変異の組合わせを生じる変異を有する、請求項４７〜５０のいずれか１項に記載の核酸。
52. ｃａｐ遺伝子がさらに、挿入核酸配列の挿入部位の上流および／または下流に少なくとも１つのコドン、好ましくはＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ａｓｐおよび／またはＡｒｇをコードする２または３つのコドンの定常挿入配列、好ましくは挿入部位の上流に３つのＡｌａおよび下流に２つのＡｌａの挿入配列を有する、請求項４７〜５１のいずれか１項に記載の核酸。
53. 少なくとも１つの真核細胞ウイルス、好ましくはパルボウイルスに由来する多数の発現可能なｃａｐ遺伝子を含む核酸ライブラリーの調製における、請求項４１〜５２のいずれか１項に記載のｃａｐ遺伝子コード核酸の使用。
54. 請求項４１〜５２のいずれか１項に記載の核酸を含む、ベクター構築体。
55. 請求項４１〜４５のいずれか１項に記載の核酸および／または請求項５４に記載のベクター構築体を含む、細菌または細胞。
56. 特定の細胞タイプに対する感染性または特異性の増大した組換えビリオンを選択する方法であって、
    ｉ）少なくとも１つの第１細胞に、請求項１７〜４０のいずれか１項に記載のライブラリーからの少なくとも１つの核酸、ならびにＩＴＲ、およびビリオンのパッケージングに必要なＲｅｐタンパク質の機能を付与する遺伝子を含む、ベクター構築体を付与し；
    ｉｉ）第１細胞に、ビリオンのパッケージングに必要な細胞性、ウイルス性、物理的および／または化学的ヘルパー機能を付与し；
    ｉｉｉ）第１細胞をビリオンのパッケージングに適した条件下でインキュベートし、第１細胞が産生したビリオンを採集し；
    ｉｖ）少なくとも１つの第２細胞にこれらのビリオンを感染させ；
    ｖ）第２細胞に、ビリオンのパッケージングに必要な細胞性、ウイルス性、物理的および／または化学的ヘルパー機能を付与し；
    ｖｉ）第２細胞をビリオンのパッケージングに適した条件下でインキュベートし、第２細胞が産生したビリオンを採集する
    工程を含み、工程ｉｖ）〜ｖｉ）を数回反復することができる方法。
57. さらに、
    ｖｉｉ）少なくとも１つの第３細胞に採集したビリオンを感染させ、その際、第３細胞はこれらのビリオンに許容性でなく；
    ｖｉｉｉ）第３細胞に感染しなかったビリオンを採集する
    工程を含む、請求項５６に記載の方法。
58. 修飾された免疫原性を有する組換えビリオンを選択する方法であって、
    ｉ）少なくとも１つの第１細胞に、本発明のライブラリーからの少なくとも１つの核酸およびビリオンのパッケージングに必要な第２核酸を含む、ベクター構築体を付与し；
    ｉｉ）必要ならば、第１細胞に、ビリオンのパッケージングに必要な細胞性、ウイルス性、物理的および／または化学的ヘルパー機能を付与し；
    ｉｉｉ）第１細胞をビリオンのパッケージングに適した条件下でインキュベートし、第１細胞が産生したビリオンを採集し；
    ｉｖ）産生されたビリオンに免疫選択工程を施し；
    ｖ）少なくとも１つの第１または第２細胞に採集したビリオンを感染させ；
    ｖｉ）第１または第２細胞に、ビリオンのパッケージングに必要な細胞性、ウイルス性、物理的および／または化学的ヘルパー機能を付与し；
    ｖｉｉ）第１または第２細胞をビリオンのパッケージングに適した条件下でインキュベートし、第１または第２細胞が産生したビリオンを採集する
    工程を含み、工程ｉｖ）〜ｖｉｉ）を数回反復することができる方法。
59. 免疫選択工程が、産生されたビリオンとモノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体とのプレインキュベーション、または免疫枯渇反応である、請求項５８に記載の方法。
60. 請求項５６もしくは５７または請求項５８もしくは５９に記載の工程、ならびにさらに
    ｉｘ）ビリオンのｃａｐ遺伝子（１以上）の核酸をクローニングする
    工程を含む、変異ｃａｐ遺伝子の同定方法。
61. さらに、ビリオンを選択する工程、たとえばビリオンのアフィニティー結合工程、イオン交換クロマトグラフィー工程または免疫選択工程を含む、請求項５６〜６０のいずれか１項に記載の方法。
62. 請求項５６〜６１のいずれか１項に記載の工程を含み、第２細胞が各受容体を発現する、受容体結合モチーフの選択方法。
63. 第２細胞が受容体を組換え発現または過剰発現する、請求項６２に記載の方法。
64. 特定の細胞タイプに感染しうる組換えビリオンをインビボ選択する方法であって、
    ｉ）少なくとも１つの第１細胞に、請求項１７〜４０のいずれか１項に記載のライブラリーからの少なくとも１つの核酸、ならびにＩＴＲ、およびビリオンのパッケージングに必要なＲｅｐタンパク質の機能を付与する遺伝子を含む、ベクター構築体を付与し；
    ｉｉ）第１細胞に、ビリオンのパッケージングに必要な細胞性またはウイルス性ヘルパー機能を付与し；
    ｉｉｉ）第１細胞をビリオンのパッケージングに適した条件下でインキュベートし、第１細胞が産生したビリオンを採集し；
    ｉｖ）動物にこれらのビリオンを感染させる
    工程を含む方法。
65. 特定の細胞タイプに対する感染性または特異性の増大したビリオンを生じる変異ｃａｐ遺伝子を同定するための方法であって、請求項６４に記載の工程、およびさらに
    ｖ）そのような動物細胞タイプからｃａｐ遺伝子（１以上）の核酸をクローニングする
    工程を含む方法。
66. 請求項４７または４８に記載の核酸がコードするＣａｐタンパク質。
67. 配列ＲＧＤＡＶＧＶ、ＲＧＤＴＰＴＳ、ＧＫＬＦＶＤＲ、ＲＤＮＡＶＶＰ、ＧＥＮＱＡＲＳ、ＲＳＮＧＶＶＰ、ＲＳＮＡＶＶＰまたはＮＳＶＲＡＰＰを有するペプチドを含むポリペプチド。
68. 配列ＲＧＤＡＶＧＶ、ＲＧＤＴＰＴＳ、ＧＫＬＦＶＤＲ、ＲＤＮＡＶＶＰ、ＧＥＮＱＡＲＳ、ＲＳＮＧＶＶＰ、ＲＳＮＡＶＶＰまたはＮＳＶＲＡＰＰを有するペプチドから構成される、請求項６７に記載のポリペプチド。
69. ポリペプチドがＣａｐポリペプチド、好ましくはパルボウイルス、特にＡＡＶに由来するものである、請求項６７または６８に記載のポリペプチド。
70. 真核細胞ウイルス、好ましくはパルボウイルス、特にＡＡＶの再ターゲッティングのための、請求項６７〜６９のいずれか１項に記載のポリペプチド、または配列ＲＧＤＸＸＸＸ、ＲＧＤＸＰＸＸもしくはＤＤＤＸＰＸＸを有するペプチドを含む、またはそれから構成される、ＡＧＴＦＡＬＲＧＤＮＰＱＧ以外のポリペプチドの使用。
71. 請求項５６〜５９または６１〜６４のいずれか１項に記載の方法により得られる組換えビリオン。
72. 請求項６０〜６３または６５のいずれか１項に記載の方法により得られる変異ｃａｐ遺伝子。
73. 請求項７２に記載の変異ｃａｐ遺伝子がコードするＣａｐタンパク質。
74. 請求項７３に記載のＣａｐタンパク質を含むビリオン。
75. 請求項７１もしくは７４に記載のビリオン、請求項７２に記載のｃａｐ遺伝子、または請求項７３に記載のＣａｐタンパク質を含む、癌、自己免疫疾患、感染症または遺伝子欠損を伴う患者を処置するための医薬。
76. 請求項７１もしくは７４に記載のビリオン、請求項７２に記載のｃａｐ遺伝子、または請求項７３に記載のＣａｐタンパク質を患者に投与することを含む、癌、自己免疫疾患、感染症または遺伝子欠損を伴う患者を処置する方法。

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