CN109952114A - 用于治疗醛脱氢酶缺乏的基因疗法 - Google Patents

Abstract

一种载体，其包含启动子，所述启动子与编码人醛脱氢酶的核酸序列可操作地连接；和一种包含所述载体的组合物，以及使用所述载体治疗醛脱氢酶缺乏、或预防或治疗以醛脱氢酶缺乏为特征的疾病的方法。

Description

用于治疗醛脱氢酶缺乏的基因疗法

对相关申请的交叉引用

本专利申请要求2016年7月26日提交的美国临时专利申请号62/367,012的权益，其在此参考并入。

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与本申请同时提交的可机读核苷酸/氨基酸序列表通过引用整体并入本申请，并且标识如下：2016年7月26日创建的一个名为“725826_ST25.TXT”的13,873字节的ASCII(文本)文件。

发明背景

醛脱氢酶(ALDH)属于在内源和外源性的醛类代谢中起关键作用的酶类超家族。已经在人类基因组中鉴定出了具有生理学和毒理学功能的19种功能性ALDH基因(EdenbergHJ,Alcohol Res Health 2007,30(1):5-13；Steinmetz CG et al.,Structure 1997,15:5(5):701-11)。醛脱氢酶2(ALDH2)是一种氧化乙醛的关键酶，对酒精代谢至关重要。人ALDH2的遗传多态性已在多个种族群体中得到了很好的研究(Eriksson CJ,Alcohol Clin ExpRes 2001,15S-32S；Yoshida et al.,Proc.Natl.Acad.Sci 1984,81(1):258–261)。最相关的ALDH2变体是ALDH2*2等位基因，其存在于约35–45％的东亚人中(Yoshida et al.,Proc.Natl.Acad.Sci 1984,81(1):258–261；Li H et al.,Ann Hum Genet 2009,73:335-345)。世界人口中大约有5.6亿(8％)的人口具有这种突变，这使得ALDH2*2成为了最常见的人酶缺乏症，超过其他熟知的人酶病和血红蛋白病(Brooks PJ et al.,PLoS Med 2009,6(3):e50；Chen CH et al.,Physiol Rev 2014,94(1):1-34)。各种研究已经显示，ALDH2的功能障碍与多种人类疾病相关，包括呼吸消化道癌症、心血管疾病、糖尿病和神经退行性疾病(Mandel S et al.,Ann NY Acad Sci 2005,1053:356–375；Kamino K et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun 2000,273:192–96；Wang B et al.,J.Neurol.Sci 2008,268:172–75；Murata C et al.,Alcohol.Clin.Exp Res 2000,24:5S–11S；Xu F et al.,Hypertens.Res 2010,33:49–55；Yokoyama A et al.,Cancer Epidemiol.BiomarkersPrev 1996,5:99–102；Oze I et al.,Jpn.J.Clin.Oncol 2011,41:677–92；Takagi S etal.,Hypertens.Res 2002,25:677–81；Jo SA et al.,Clin.Chim.Acta 2007,382:43–47；Xu F et al.,J.Cell.Mol.Med 2011,15:1955–62；Takeuchi F et al.,Eur.J.Hum.Genet2012,20:333–40；Wang Q et al.,DNA Cell Biol 2013,32:393–99；Asakage T et al.,Carcinogenesis 2007,28:865–874；Ding JH,et al.,World J Gastroenterol 2009,15:2395–2400；Cui R et al.,Gastroenterology 2009,137:1768–75；Li Y et al.,J ClinInvest 2006,116:506–511；Chen Z et al.,Proc Natl Acad Sci 2005,102:12159–12164；Mackenzie IS et al.,Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol 2005,25:1891–95；KatoN et al.,Nat Genet 2011,43:531–538；Chen CH et al.,Cardiovasc Res 2010,88(1):51-7)。

酒精潮红综合症是由ALDH2活性降低而表现出的乙醛积累引起的，其特征为在饮酒后出现面部潮红、头痛、恶心、头晕和心悸，通常发生于东亚人群中(Eriksson et al.,Clin.Exp.Res.,2001 15S-32S)。ALDH2*2个体中的这种乙醇诱导的综合征是由ALDH2基因的外显子12中G到A的点突变引起的。该突变导致了人ALDH2蛋白中第487位的谷氨酸突变为赖氨酸(E487K)(Yoshida et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,1984,81(1):258-261)。ALDH2基因中常见的E478K(谷氨酸至赖氨酸)的遗传多态性可导致其乙醛代谢能力显著降低(Yoshida et al.,Proc.Natl.Acad.Sci 1984,81(1):258–261；Baan R et al.,LancetOncol.2007,8(4):292–293)。杂合个体具有的酶活性低于野生型酶活性的50％，并且ALDH2*2的纯合子小于野生型活性的1-4％(Farres et al.,J.Biol.Chem.,1994,269(19):13854-13860)。

除了亚洲人的面部潮红反应之外，ALDH2酶的缺乏与上呼吸消化道癌症(包括口腔癌、咽癌、喉癌和食道癌)之间也存在明确的联系(Asakage T et al.,Carcinogenesis2007,28:865–874；Ding JH,et al.,World J Gastroenterol 2009,15:2395–2400；Hashibe M et al.,Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2006,15(4):696-703)。与具有完全活性的ALDH2的个体相比，缺乏ALDH2的个体因饮酒而患食道癌(特别是鳞状细胞癌)的风险更高(Yokoyama A et al.,Cancer Epidemiol.Biomarkers Prev 1996,5:99–102；OzeI et al.,Jpn.J.Clin.Oncol 2011,41:677–92；Ding JH,et al.,World J Gastroenterol2009,15:2395–2400；Cui R et al.,Gastroenterology 2009,137:1768–75；Hashibe M etal.,Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2006,15(4):696-703)。饮酒加上吸烟会显著升高患这些癌症的风险(Lee CH et al.,Int J Cancer 2009,125:1134–1142；Morita M etal.,Int J Clin Oncol 2010,15:126–134)。ALDH2是最常见的涉及消化道恶性肿瘤的遗传多态性，并且ALDH2*2携带者会是最年轻的食管癌患者。与其各自的野生型ALDH2对照相比，酗酒和不酗酒的ALDH2*2携带者患食道癌的风险增加了7至12倍(Yokoyama A et al.,Cancer Epidemiol.Biomarkers Prev 1996,5:99–102)。香烟烟雾也是乙醛的一种来源，既酗酒又抽烟的ALDH2*2基因型个体患癌的风险最大(Lee CH et al.,Int J Cancer 2009,125:1134–1142；Morita M et al.,Int J Clin Oncol 2010,15:126–134)。当给予同等量的乙醇时，吸烟者体内的乙醛浓度比非吸烟者高两倍。此外，在同时进行吸烟和饮酒的条件下，吸烟者唾液中的乙醛浓度比不吸烟者高7倍(Salaspuro V et al.,Int J Cancer2004,111:480–483)。与不吸烟不喝酒的野生型ALDH2受试者相比，在携带有ALDH2*2基因型的受试者中，大量地喝酒和抽烟构成了已知的癌症最高风险之一(比值比为50.1)，并且癌症的发生提前了高达25年(45岁vs 70岁)(Brooks PJ et al.,PLoS Med 2009,6(3):e50；Lee CH et al.,Int J Cancer 2009,125:1134–1142；Morita M et al.,Int J ClinOncol 2010,15:126–134)。

因此，需要开发出能增加ALDH2活性和治疗与ALDH2缺乏相关的疾病的组合物和方法。本发明提供了这样的组合物和方法。根据本申请提供的详细描述，本发明的这个优点以及其他优点将变得显而易见。

发明简述

本发明提供了一种载体，其包含启动子，所述启动子与编码人醛脱氢酶的核酸序列可操作地连接。本发明还提供了一种包含所述载体的组合物，以及使用所述载体治疗哺乳动物中的醛脱氢酶缺乏、或治疗或预防哺乳动物中以醛脱氢酶缺乏为特征的疾病或其任何症状的方法。

附图简述

图1A为AAVrh.10hC1EI载体的示意图，其描绘了AAV2反向末端重复序列(ITR)、衣壳化信号(ψ)、CMV增强子/鸡β-肌动蛋白(CAG)启动子、优化的人ALDH2(hALDH2)cDNA、血凝素(HA)标签和兔β-球蛋白多腺苷酸化信号。

图1B为Western印迹图像，其描绘了由AAV-hALDH2质粒编码的hALDH2在HEK293T细胞中的表达。

图1C为Western印迹图像，其描绘了由AAVrh.10hALDH2载体编码的hALDH2在HEK293T-orf6细胞中形成hALDH2四聚体。

图2A显示了在将AAVrh.10hALDH2载体单次静脉内施用于C57Bl/6小鼠(n＝4/组)后，hALDH2的长期体内mRNA表达。

图2B显示了在将AAVrh.10hALDH2载体单次静脉内施用于C57Bl/6小鼠(n＝4/组)后，hALDH2的长期体内蛋白质表达。

图3描绘了用AAVrh.10hALDH2处理ALDH2*2小鼠的效应。对纯合的ALDH2*2小鼠(n＝2,1M/1F/组)静脉内施用10¹¹gc的AAVrh.10-hALDH2或10¹¹gc的AAVrh.10-GFP(无治疗的对照)。在载体施用后两周，通过胃内管饲法用4g/kg乙醇水溶液攻击(challenge)小鼠，并且在乙醇攻击之前以及之后24小时测量摔落之前在平衡梁上的时间量(最多60秒)。每个点代表单只小鼠。

发明详述

本发明提供了一种载体，其包含启动子，基本上由启动子组成或由启动子组成，所述启动子与编码人醛脱氢酶的核酸序列可操作地连接。当本发明所述载体基本上由与编码人醛脱氢酶的核酸序列可操作地连接的启动子组成时，可以包括对所述载体没有实质影响的其他组分(例如，遗传元件，如多聚(A)序列或有助于在体外操作载体的限制性酶位点)。当所述载体由与编码人醛脱氢酶的核酸序列可操作地连接的启动子组成时，所述载体不包含任何其他组分(即，对所述载体而言不是内源性的并且不需要用来影响核酸序列表达从而提供蛋白质的组分)。

本发明所述载体可以包括与所述编码人醛脱氢酶的核酸序列一起的本领域已知的任何基因转移载体，基本上由所述基因转移载体组成或由所述基因转移载体组成。此类载体的实例包括腺相关病毒(AAV)载体、腺病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体和质粒。在优选的实施方案中，所述载体是AAV载体。

腺相关病毒是细小病毒科(Parvoviridae)家族的成员，并且包含具有少于约5,000个核苷酸的线性单链DNA基因组。AAV需要辅助病毒(即，腺病毒或疱疹病毒)的共感染或辅助基因的表达才能进行有效复制。用于施用治疗性核酸的AAV载体通常有约96％的亲本基因组发生了缺失，使得仅保留了反向末端重复序列(ITR)，其包含用于DNA复制和包装的识别信号。这消除了由于病毒基因的表达而引起的免疫或毒副作用。另外，如果需要的话，通过将特异性AAV蛋白质递送至生产细胞能使包含AAV ITR的AAV载体整合到细胞基因组的特定区域中(参见，例如，美国专利6,342,390和6,821,511)。包含了整合后的AAV基因组的宿主细胞在细胞生长或形态方面没有显示出变化(参见，例如，美国专利4,797,368)。

所述AAV ITR位于仅针对非结构复制(Rep)蛋白和结构衣壳(Cap)蛋白(也称为病毒粒子蛋白(VP))的编码核苷酸序列的侧翼。末端的145个核苷酸是自身互补的，并且被组织成使得可以形成能量稳定的分子内双链体，所述分子内双链体形成T形发夹。这些发夹结构通过充当针对细胞DNA聚合酶复合物的引物而起到病毒DNA复制的起源的作用。Rep基因编码Rep78、Rep68、Rep52和Rep40等Rep蛋白。Rep78和Rep68由p5启动子转录而成，Rep 52和Rep40由p19启动子转录而成。Rep78和Rep68蛋白是多功能的DNA结合蛋白，其在生产性复制期间发挥解旋酶和切口酶的功能，从而允许AAV末端的拆分(参见，例如，Im et al.,Cell,61:447-57(1990))。这些蛋白质还调节来自内源性AAV启动子和辅助病毒内的启动子的转录(参见，例如，Pereira et al.,J.Virol.,71:1079-1088(1997))。其他Rep蛋白修饰Rep78和Rep68的功能。cap基因编码衣壳蛋白VP1、VP2和VP3。所述cap基因由p40启动子转录而来。

可以使用本领域已知的任何AAV血清型来产生本发明所述的AAV载体。已经从腺病毒原种或人或非人灵长类动物组织中分离出了几种AAV血清型和超过100种AAV变体(综述于，例如，Wu et al.,Molecular Therapy,14(3):316-327(2006)中)。通常，AAV血清型具有在核酸序列和氨基酸序列水平上拥有显著同源性的基因组序列，从而使得不同的血清型具有相同的一组遗传功能，能产生在物理和功能方面基本等同的病毒粒子，并且以实际上相同的机制进行复制和组装。AAV血清型1-5和7-9被定义为是“真实的”血清型，因为它们不能与特异性针对所有其他现有的和表征过的血清型的中和性血清有效地进行交叉反应。相反，AAV血清型6、10(也称为Rh10)和11被认为是“变体的”血清型，因为它们不符合“真实的”血清型的定义。AAV血清型2(AAV2)由于其缺乏致病性和大范围的感染性，并且能够建立起长期的转基因表达，因此已被广泛用于基因治疗的应用(参见，例如Carter,B.J.,Hum.GeneTher.,16:541-550(2005)；和Wu et al.，同上)。各种AAV血清型的基因组序列及其比较公开于，例如，GenBank登录号U89790、J01901、AF043303和AF085716；Chiorini et al.,J.Virol.,71:6823-33(1997)；Srivastava et al.,J.Virol.,45:555-64(1983)；Chioriniet al.,J.Virol.,73:1309-1319(1999)；Rutledge et al.,J.Virol.,72:309-319(1998)；和Wu et al.,J.Virol.,74:8635-47(2000)中。

AAV的rep和ITR序列在大多数AAV血清型中是特别保守的。例如，据报道，AAV2、AAV3A、AAV3B、AAV4和AAV6的Rep78蛋白质具有约89-93％的同一性(参见Bantel-Schaal etal.,J.Virol.,73(2):939-947(1999))。据报道，AAV血清型2、3A、3B和6在基因组水平上具有约82％的总核苷酸序列同一性(Bantel-Schaal et al.，同上)。此外，已知许多AAV血清型的rep序列和ITR能够在哺乳动物细胞产生AAV颗粒期间与来自其他血清型的相应序列有效地交叉互补(即，功能上替代所述相应序列)。

通常，在各种不同的AAV血清型之间，确定AAV颗粒的细胞向性的cap蛋白以及相关的cap蛋白编码序列的保守性显著地低于Rep基因。鉴于Rep和ITR序列与其他血清型的相应序列的交叉互补能力，AAV载体可以包含各种血清型的混合，因此是“嵌合的”或“假型的”AAV载体。嵌合的AAV载体通常包含衍生自两种或更多种(例如，2、3、4种等)不同AAV血清型的AAV衣壳蛋白。相反，假型的AAV载体包含一种AAV血清型的一种或多种ITR，所述一种AAV血清型被包装在另一种AAV血清型的衣壳中。嵌合的和假型的AAV载体进一步描述于，例如，美国专利6,723,551，Flotte,Mol.Ther.,13(1):1-2(2006)；Gao et al.,J.Virol.,78:6381-6388(2004)；Gao et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,99:11854-11859(2002)；De etal.,Mol.Ther.,13:67-76(2006)；以及Gao et al.,Mol.Ther.,13:77-87(2006)中。

在一个实施方案中，使用感染人的AAV(例如，AAV2)产生所述AAV载体。在优选的实施方案中，所述感染人的AAV载体是AAV8或AAV9。或者，使用感染非人灵长类动物的AAV产生所述AAV载体，所述非人灵长类动物包括例如，大猩猩(例如，黑猩猩)、旧世界猴(例如，猕猴)和新世界猴(例如，绒猴)。优选地，使用感染非人灵长类动物的AAV产生所述AAV载体，其中所述感染非人灵长类动物的AAV用感染人的AAV进行了假型化。此类假型的AAV载体的实例公开在，例如，Cearley et al.,Molecular Therapy,13:528-537(2006)中。在一个实施方案中，可以产生这样的AAV载体：其包含来自于从恒河猴分离得到的AAV的衣壳蛋白，并且所述AAV用AAV2反向末端重复片段(ITR)进行了假型化。例如，本发明所述AAV载体可以包含来自AAV10的衣壳蛋白(也称为“AAVrh.10”)，其能感染恒河猴并且用AAV2ITR进行了假型化(参见，例如，Watanabe et al.,Gene Ther.,17(8):1042-1051(2010)；和Mao et al.,Hum.Gene Therapy,22:1525-1535(2011))。在另一个实施方案中，本发明所述AAV载体是非天然存在的AAV载体。

本发明所述载体包含启动子，所述启动子与编码人醛脱氢酶的核酸序列可操作地连接。当DNA区域在功能上彼此相关时，它们是“可操作地连接”的。如果启动子控制编码序列的转录，则它与所述序列是“可操作地连接”的。

“启动子”是启动特定基因转录的DNA区域。来自各种不同来源的许多启动子是本领域熟知的。启动子的代表性来源包括，例如，病毒、哺乳动物、昆虫、植物、酵母和细菌，并且来自这些来源的合适的启动子是比较容易获得的，或者可以基于例如，来自存储库(如ATCC)以及其他商业或个人来源的可以公开获得的序列合成制得。启动子可以是单向的(即，在一个方向上启动转录)或双向的(即，在3'或5'方向上启动转录)。任选地，所述启动子还可以包含增强子元件(例如，包括了增强子的嵌合启动子)。

所述载体还可以包含增强子元件。本申请使用的术语“增强子元件”(也简称为“增强子”)是指这样的DNA序列：其能提升例如与其可操作地连接的核酸序列的转录。增强子可以离所述核酸序列的编码区数千碱基远，并且可以介导调节因子的结合、DNA甲基化的模式或DNA结构的变化。来自各种不同来源的许多增强子是本领域公知的，并且可以以克隆多核苷酸的形式或者以在克隆多核苷酸内的形式获得(从，例如，ATCC等存储库以及其他商业或个体来源获得)。所述载体可以包含与所述启动子分开的或作为启动子的一部分的增强子序列。具有组合后的增强子元件的启动子在本领域中被称为“嵌合启动子”。增强子可以位于编码序列的上游、内部或下游。(参见，例如，Niwa et al.,Gene,108:193-199(1991)；Daly et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,96:2296-2300(1999)；和Sondhi et al.,Mol.Ther.,15:481-491(2007))。

本发明所述载体的启动子可以包含本领域已知的任何启动子(包括嵌合启动子)，基本上由本领域已知的任何启动子(包括嵌合启动子)组成或由本领域已知的任何启动子(包括嵌合启动子)组成。这种类别的启动子的实例包括具有组成型活性的启动子(例如，人β-肌动蛋白、鸡β-肌动蛋白、巨细胞病毒(CMV)和SV40)、细胞类型特异性启动子(例如，CD19基因启动子、CaMKIIa和UAS)、或诱导型启动子(例如，Tet系统(美国专利5,464,758和5,814,618)、Ecdysone诱导型系统(No et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,93:3346-3351(1996))、T-REX^TM系统(Invitrogen，Carlsbad，CA)、Cre-ERT他莫昔芬诱导型重组酶系统(Indra et al.,Nuc.Acid.Res.,27:4324-4327(1999)；Nuc.Acid.Res.,28:e99(2000)；美国专利7,112,715；和Kramer&Fussenegger,Methods Mol.Biol.,308:123-144(2005))和LACSWITCH^TM系统(Stratagene，San Diego，CA))。在本发明的一个实施方案中，所述启动子是组成型活性启动子、诱导型启动子或细胞类型特异性启动子。启动子的一个实例是鸡β-肌动蛋白启动子。所述“鸡-β-肌动蛋白启动子”(也称为“CAG启动子”)包含CMV立即/早期增强子、鸡β-肌动蛋白启动子和第一外显子剪接供体、以及兔β球蛋白剪接受体。在本发明的一个实施方案中，编码所述醛脱氢酶的所述核酸序列可以与鸡β-肌动蛋白启动子可操作地连接。

“核酸序列”旨在涵盖DNA或RNA的聚合物，即，多核苷酸，其可以是单链的或双链的并且其可以含有非天然的或改变的核苷酸。本申请使用的术语“核酸”和“多核苷酸”是指任意长度的核苷酸聚合形式，既可以是核糖核苷酸(RNA)也可以是脱氧核糖核苷酸(DNA)。这些术语是指分子的一级结构，因此包括双链和单链DNA，以及双链和单链RNA。所述术语包括等同物形式的由核苷酸类似物制得的RNA或DNA类似物，以及经修饰的多核苷酸，例如但不限于，甲基化的和/或封端的多核苷酸。

与所述启动子可操作地连接的所述核酸序列可以包含编码人醛脱氢酶的任何核酸序列。优选地，所述核酸序列编码人醛脱氢酶2(ALDH2)，其可以是对密码子进行过了优化。用于密码子优化的技术在本领域中是已知的。所述核酸序列还可以编码融合蛋白，所述融合蛋白包括活性蛋白质(例如，ALDH2)和第二部分(通常为蛋白质)，所述第二部分能改善所述活性蛋白质的性质(例如功效、溶解度或半衰期)。所述第二部分的实例是本领域已知的，包括，例如，免疫球蛋白的Fc结构域以及聚乙二醇(PEG)。

醛脱氢酶是一类在内源和外源醛的代谢中发挥作用的酶。醛脱氢酶2(ALDH2)能氧化乙醛，参与酒精的代谢。人ALDH2基因位于染色体12q24，长度为44K碱基对，包括13个编码性的外显子。合成出的ALDH2为具有517个氨基酸的前体蛋白质，其中在n末端的17个氨基酸充当线粒体定位序列，其能将所述前体蛋白质靶向至线粒体。所述具有17个氨基酸的线粒体定位序列会在线粒体中被切割下来，留下具有500个氨基酸的成熟的ALDH2蛋白单体，其与其他单体组合，在线粒体中形成具有相同的56kDa亚基的四聚体。ALDH2的氨基酸和核苷酸序列的实例包括，例如，SEQ ID NO:1(成熟的500aa蛋白质)；SEQ ID NO:2(编码成熟的500aa蛋白质的核苷酸序列)；SEQ ID NO:3(包括信号序列的未成熟的517aa蛋白质；还有GenBank NP_000681.2和AAA51693.1)和SEQ ID NO:4(包括信号序列的未成熟的517aa蛋白质的编码核酸；还有GenBank NM_000690.3和AH002599.2)，还可以对这些核酸序列进行密码子优化。

可以使用本领域已知的方法产生所述编码人醛脱氢酶的核酸序列和包含其的载体。例如，可以使用标准的重组DNA方法以重组的方式产生核酸序列、多肽和蛋白质(参见，例如，Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd ed.,ColdSpring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY,2001；和Ausubel et al.,CurrentProtocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates和John Wiley&Sons,NY,1994)。此外，可以从诸如细菌、昆虫或哺乳动物(如大鼠、人等)等来源分离和/或纯化出合成产生的编码人醛脱氢酶的核酸序列。分离和纯化的方法在本领域中是熟知的。或者，可以商业合成本申请所描述的核酸序列。从这方面来说，所述核酸序列可以是合成的、重组的、分离的和/或纯化的。可以进一步优化所述序列以增加mRNA的稳定性并降低突变mRNA导致的反式抑制的可能性。

除了与编码人醛脱氢酶的核酸序列可操作地连接的启动子之外，所述载体还可以包含其他表达控制序列，例如增强子、多腺苷酸化信号、转录终止子、内部核糖体进入位点(IRES)、5'和3'非翻译区、内含子等，其使得所述核酸序列在宿主细胞中得到表达。示例性的表达控制序列是本领域已知的并且描述于，例如，Goeddel,Gene ExpressionTechnology:Methods in Enzymology,Vol.185,Academic出版社,San Diego,CA.(1990)中。

所述载体还可以包含编码信号肽的核苷酸序列，所述核苷酸序列与编码人醛脱氢酶的核酸序列可操作地连接。当所述编码信号肽的核苷酸序列存在时，它会位于启动子序列的下游，使得被编码的信号肽和醛脱氢酶彼此连接。所述载体可以编码适于跨线粒体膜转运的任何信号肽(线粒体定位序列)，其中所述信号肽被切割下来以提供成熟的蛋白质。所述信号肽应带正电荷并形成螺旋。在优选的实施方案中，所述信号肽是线粒体定位序列。所述线粒体定位序列可以包括，例如，SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。

还提供了一种组合物，其包含上述载体和药学上可接受的(例如生理学上可接受的)运载体，基本上由上述载体和药学上可接受的(例如生理学上可接受的)运载体组成，或由上述载体和药学上可接受的(例如生理学上可接受的)运载体组成。当所述组合物基本上由本发明所述载体和药学上可接受的运载体组成时，可以包括对所述组合物没有实质影响的其他组分(例如，佐剂、缓冲剂、稳定剂、抗炎剂、增溶剂、防腐剂等)。当所述组合物由本发明所述载体和所述药学上可接受的运载体组成时，除指定的以外，所述组合物不包含任何其他组分。可以在本发明的上下文中使用任何合适的运载体，并且这种运载体在本领域中是公知的。运载体的选择将部分地根据所述组合物可施用的特定部位和用于施用所述组合物的特定方法来确定。组合物任选地可以是无菌的，但本申请描述的载体除外。可将所述组合物冷冻或冻干进行储存，并在使用前在合适的无菌运载体中重构。可以按照，例如，Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第21版,Lippincott Williams&Wilkins,Philadelphia,PA(2001)中所描述的常规技术产生所述组合物。

适合于所述组合物的制剂包括水性和非水性溶液、等渗无菌溶液(其可以含有抗氧化剂、缓冲剂和抑菌剂)，以及水性和非水性无菌悬浮液(其可以包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂)。所述制剂可以以单位剂量或多剂量密封在容器(例如安瓿和小瓶)中，并且可以在冷冻干燥(冻干)的条件下储存，仅需要在使用前立即添加无菌的液体运载体(例如，水)即可。可以将无菌粉末、颗粒和片剂等前述类型制备成临时溶液和悬浮液。优选地，所述运载体是缓冲盐溶液。更优选地，在组合物中施用本发明所述载体，所述组合物被配制成用以在施用前保护本发明所述载体免于损伤并增强转导效率。例如，可以将所述组合物配制成减少所述载体在用于制备、储存或施用所述载体的装置(例如玻璃器皿、注射器或针头)上的损失。可以将所述组合物配制成降低所述载体的光敏感性和/或温度敏感性。为此，所述组合物优选地包含药学上可接受的液体运载体(例如，如上面所述的液体运载体)以及稳定剂，所述稳定剂选自下组：聚山梨醇酯80、L-精氨酸、聚乙烯吡咯烷酮、海藻糖、及其组合。使用这种组合物将延长所述载体的保质期，方便施用，并提高本发明所述方法的效率。含有载体的组合物的制剂进一步描述于，例如，Wright et al.,Curr.Opin.DrugDiscov.Devel.,6(2):174-178(2003)和Wright et al.,Molecular Therapy,12:171-178(2005))中。

此外，本领域普通技术人员应当理解，本发明所述载体可以与其他治疗剂或生物活性剂一起存在于组合物中。例如，所述组合物中的一部分可以是控制炎症的因子(例如，布洛芬或类固醇)，以减少与体内施用所述载体相关的肿胀和炎症。可以存在抗生素(即，杀微生物剂和杀真菌剂)以治疗已有的感染和/或降低未来感染(例如，与基因转移程序相关的感染)的风险。

本发明提供了一种治疗哺乳动物中的醛脱氢酶缺乏(特别是ALDH2缺乏)、或治疗或预防以醛脱氢酶缺乏为特征的疾病或其任何症状的方法。所述方法包括向所述哺乳动物施用本申请所述的载体，于是表达所述核酸以产生醛脱氢酶蛋白，从而治疗所述醛脱氢酶缺乏和/或治疗或预防与其相关的疾病或症状。

所述哺乳动物可以是具有醛脱氢酶缺乏的任何哺乳动物，例如在编码醛脱氢酶蛋白的基因中具有突变的哺乳动物，所述突变导致蛋白质的不存在、非功能性蛋白质、或与野生型蛋白质相比功能降低的蛋白质。所述哺乳动物可以是人，特别是缺乏人ALDH2的人。在一个具体的实施方案中，所述人对于ALDH2*2等位基因是杂合的或纯合的(即，在人ALDH2蛋白的第487位(E487K)或在未成熟序列的第504位(E504K)处的谷氨酸被赖氨酸取代)(Yoshida et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,1984,81(1):258-261))。

在一些实施方案中，所述方法还可以包括通过鉴定编码醛脱氢酶蛋白的基因中的功能丧失突变来选择患者进行治疗。所述方法可以包括，例如，分析氨基酸序列或编码ALDH2的核酸序列，并确定成熟的含有500个氨基酸的人ALDH2蛋白的第487位残基(或者含有517个氨基酸的前体ALDH2蛋白中相应的第504位氨基酸)是谷氨酰胺还是某些其他的氨基酸(例如，赖氨酸)。当成熟的ALDH2蛋白的第487位残基(或前体ALDH2蛋白的第504位残基)处的氨基酸不是谷氨酰胺(即，已经突变成任何其他氨基酸，特别是赖氨酸)时，则将受试者选为具有ALDH2缺乏(并作为治疗的合适候选者)。

所述哺乳动物可以患有以醛脱氢酶缺乏(特别是ALDH2缺乏)为特征的症状或疾病，或者例如，由于缺乏醛脱氢酶而有发生这种症状或疾病的风险。与醛脱氢酶缺乏相关的疾病的实例包括乙醇中毒、上呼吸道/消化道癌症(例如，口腔癌、咽癌、喉癌和食道癌)、骨质疏松症、放射性皮炎、鳞状细胞癌、范可尼贫血、糖尿病并发症、帕金森病、阿尔茨海默病、中风、高血压、心律失常、心肌梗塞和硝酸甘油不耐受。醛脱氢酶缺乏(特别是ALDH2缺乏)的症状可以包括通常与前述疾病相关的症状中的任一种。例如，ALDH2缺乏的症状是在饮酒后肝脏和/或血液中乙醛的积累，以及面部潮红、头痛、恶心、头晕和/或心悸。

治疗醛脱氢酶缺乏包括将醛脱氢酶的活性或蛋白质水平增加任何的量。治疗以缺乏醛脱氢酶为特征的疾病或其症状包括将由所述疾病引起的任何生理应答或症状的进展改善或减缓至任意程度。预防以缺乏醛脱氢酶为特征的疾病或其症状包括以任意的量延迟由所述疾病引起的任何生理应答或症状的发作。

可以使用任何施用途径将所述组合物递送至哺乳动物。实际上，虽然可以使用一种以上的途径来施用所述组合物，但是特定的途径可以提供比另一种途径更直接和更有效的应答。优选地，经由肌肉内注射来施用所述组合物。还可以将一剂组合物敷至或滴注到体腔中，通过皮肤进行吸收(例如，通过透皮贴剂)，吸入、摄入、局部施用于组织，或经由例如静脉内、腹膜内、口内、皮内、皮下或动脉内的给药途径进行肠胃外施用。

可以在允许受控或持续释放的装置之中或之上施用所述组合物，所述装置为例如海绵、生物相容性网状物、机械储器或机械植入物。植入物(参见，例如，美国专利5,443,505)、装置(参见例如美国专利4,863,457)，例如可植入装置(例如，包含聚合物组合物的机械储器或植入物或装置)，特别适用于施用所述AAV载体。所述组合物还可以以缓释制剂的形式进行施用(参见，例如，美国专利5,378,475)，所述缓释制剂包含，例如，凝胶泡沫、透明质酸、明胶、硫酸软骨素、多磷酸酯(例如，双-2-羟乙基-对苯二甲酸酯(BHET))和/或聚乳酸-乙醇酸。

施用给所述哺乳动物的组合物中载体的剂量取决于多种因素，包括所述哺乳动物的大小(质量)、任何副作用的程度、特定的给药途径等。优选地，本发明所述方法包括施用“治疗有效量”的包含本申请描述的本发明所述载体的组合物。“治疗有效量”是指在必要的剂量和时间段内能有效实现想要的治疗结果的量。治疗有效量可以根据因素而变化，所述因素包括例如过敏原敏感程度、个体的年龄、性别和体重，以及所述载体在所述个体中引发所需应答的能力。“预防有效量”是指在必要的剂量和时间段内能有效实现想要的预防结果的量(例如，预防由ALDH2缺乏所诱导的乙醇中毒或上呼吸道/消化道癌)。

可在治疗或预防性治疗期间多次施用和/或采用多种给药途径(如肌肉内和皮下途径)施用所述编码醛脱氢酶的载体，以确保细胞充分暴露于所述组合物。例如，可以在治疗或预防性治疗期间向哺乳动物施用所述组合物两次或更多次(例如，2、3、4、5、6、7、8、9或10次或更多次)。然而，根据本发明的优选方面，单次施用本申请所述的载体(或包含所述载体的组合物)就足以确保能够在治疗或预防水平上延长哺乳动物中的醛脱氢酶表达。优选地，在施用了所述载体或包含所述载体的组合物后，所述治疗水平能在所述哺乳动物中表达约30天或更长(例如，约45天或更长、约60天或更长、约75天或更长、约90天或更长、约4个月或更长、约6个月或更长、约10个月或更长、或甚至约12个月或更长)。因此，在一些实施方案中，所述方法包括在约30天内向所述哺乳动物施用所述载体不超过一次、在约45天内施用不超过一次、在约60天内施用不超过一次、在约75天内施用不超过一次、或甚至在约90天内施用不超过一次(例如，在约4个月、约5个月、约6个月、约10个月或约12个月内不超过一次)。

所述组合物中为了实现特定的治疗或预防效应所需的载体剂量通常以以下单位进行施用：每个细胞的载体基因组拷贝数(gc/细胞)或载体基因组拷贝数/每千克体重(gc/kg)。基于这些以及本领域熟知的其他因素，本领域普通技术人员可以容易地确定用以治疗具有特定免疫应答的患者的合适的载体剂量范围。

本发明还包括一种产生本发明所述AAV载体的方法。在一个实施方案中，所述方法包括将所述AAV-ALDH2载体和质粒一起共转染进细胞中，所述质粒携带有载体复制所需的衍生自AAV血清型的AAV Rep蛋白，AAV病毒结构蛋白VP1、2和3(其定义所产生的AAV载体的血清型)，以及E2、E4和VA RNA的腺病毒辅助功能。AAV Rep蛋白和AAV结构蛋白的氨基酸序列可以来自本领域已知的任何AAV。在优选的实施方案中，所述AAV Rep蛋白来自AAV2，并且所述AAV结构蛋白来自AAVrh.10。转染有所述载体和质粒的细胞可以是本领域已知的任何细胞。在优选的实施方案中，所述细胞是贴壁细胞。在特别优选的实施方案中，所述细胞是人胚肾(HEK)293细胞。在另一个实施方案中，本发明所述AAV载体在杆状病毒系统中产生。

以下实施例进一步说明本发明，但很显然不应被解释成以任何方式限制其范围。

实施例1

本实施例证实开发出了载体，所述载体包含与编码人醛脱氢酶的核酸序列可操作地连接的启动子。

表达盒由AAV2反向末端重复序列(ITR)、衣壳化信号(ψ)、与人ALDH2 cDNA序列可操作地连接的巨细胞病毒(CMV)增强子鸡-β-肌动蛋白启动子(CAG启动子)以及兔β-球蛋白多腺苷酸化信号组成(图1A)。用c-末端血凝素(HA)标签构建了ALDH2 cDNA序列，以区分ADLH2 cDNA和小鼠ALDH2蛋白。对ALDH2 cDNA进行了优化，以增加mRNA的稳定性并降低由突变体mRNA导致反式抑制的可能性。使用人偏倚密码子对ALDH2 cDNA进行了序列优化并去除了：mRNA不稳定性元件；含有较低的(<30％)或富含(>80％)GC的区域；编码区内的翻译起始序列；以及潜在的剪接信号。用最佳Kozak共有序列合成了优化的ALDH2 cDNA。

合成了优化的全长ALDH2 cDNA序列，并在CAG启动子的控制下将其克隆到pAAV质粒中。通过将pAAV质粒与携带有以下的质粒共转染进人胚肾293T细胞(HEK 293T；美国典型培养物保藏中心)中来生产AAV-hALDH2质粒：载体复制所需的衍生自AAV2的AAV Rep蛋白，AAVrh.10病毒结构(Cap)蛋白VP1、2和3(其定义所产生的AAV载体的血清型)；以及E2、E4和VA RNA的腺病毒辅助功能。通过碘克沙醇梯度和QHP阴离子交换层析纯化AAV-hALDH2-HA载体(称为“AAVrh.10hALDH2”)。通过定量TaqMan实时PCR分析确定载体基因组的滴度。将编码无关蛋白质的载体作为对照用于某些表达研究。

为了在体外评估由AAVr.10hALDH2引导的人ALDH2蛋白的表达，用AAV-hALDH2质粒转染HEK 293T细胞或仅用转染试剂进行转染，72小时后收获上清液。通过SDS-PAGE以及用抗HA抗体进行的Western分析评估上清液中人ALDH2的表达。如图1B所示，在细胞培养上清液中检测到了人ALDH2。本实施例的结果显示了来自AAV载体的ALDH2的表达。

为了在体外评估来自于AAVr.10hALDH2引导的人ALDH2蛋白表达的ALDH2四聚体的形成，用AAVrh.10hALDH2载体或对照AAVrh.10-hα1AT载体感染HEK 293T细胞，72小时后收获上清液。通过SDS-PAGE以及用抗HA抗体进行的Western分析评估上清液中人ALDH2四聚体的形成。如图1C所示，在细胞培养上清液中检测到了人ALDH2的四聚体。本实施例的结果显示，来自AAV载体的ALDH2的表达能导致ALDH2四聚体的形成。

实施例2

本实施例证实了载体的长期体内表达，所述载体包含与编码人醛脱氢酶的核酸序列可操作地连接的启动子。

为了评估在用AAVrh.10hALDH2载体单次处理后，人ALDH2的长期体内血清表达，通过以约100μl的体积静脉内注射10¹¹个基因组拷贝(gc)，向C57Bl/6雄性和雌性小鼠施用了AAVrh.10hALDH2载体、AAVrh.10-hα1AT载体(对照载体)、或磷酸盐缓冲盐水(PBS)(n＝4/组)。在载体施用后两周，从肝匀浆中分离出总RNA和蛋白质，并通过qPCR分析hALDH2的mRNA表达，并使用抗HA抗体通过Western分析蛋白质表达。

如图2A和2B所示，在接受了AAVrh.10hALDH2的动物中检测到了高水平的hALDH2mRNA(每μg总RNA中有6.58±2.2x10⁴(雄性)和1.25±5.4x10⁴(雌性)个mRNA拷贝)和高水平的hALDH2蛋白。

这些数据表明，AAV-载体介导的ALDH2表达使得从单次施用获得长期的ALDH2表达。

实施例3

本实施例证实，通过在ALDH2缺乏小鼠模型中施用AAVrh.10hALDH2，能发挥针对乙醇相关毒性的保护作用。

为了评估从AAVrh.10hALDH2载体表达的ALDH2的体内活性，将单次静脉内注射10¹¹个基因组拷贝(gc)的AAVrh.10hALDH2或单次静脉内注射10¹¹个基因组拷贝的AAVrh.10-GFP(对照)施用给具有E487K突变的ALDH2*2小鼠，所述E487K突变等同于人ALDH2*2等位基因(Zambelli et al.,Sci Trans Med.,6:251ra118(2014)；Jin et al.,PNAS,112:9088-9093(2015))(n＝2，1个雄性/1个雌性/组)。

在施用载体后两周，通过胃内管饲法用乙醇(4g/kg)攻击小鼠。在攻击后6小时，小鼠显示出了很高的血液酒精含量，其在24小时后降至接近背景水平(数据未显示)。在攻击后24小时，通过平衡梁试验(摔落前经历的时间)评估了行为(Carter et al.,CurrentProtocols Neuroscience,第8章:第8单元(2001))。

如图3所示，经AAVrh.10hALDH2处理的雄性和雌性小鼠在整个分配时间(即60秒)中都保持在梁上，而施用了对照载体的小鼠则在较早时间就从梁上摔落了下来。

这些数据表明，从AAVrh.10hALDH2载体表达的ALDH2在体内具有活性，并且能够针对乙醇相关的毒性发挥保护作用。

本申请引用的所有参考文献(包括出版物、专利申请和专利)均通过引用并入本申请，其程度等同于每个参考文献被单独且具体地指出通过引用并入，并且在本申请中完整地阐述。

在描述本发明的上下文中(特别是在以下权利要求的上下文中)，术语“一”和“一种”和“所述”和“至少一个”以及类似的指代的使用应被解释成除非本申请另有说明或明确与上下文相矛盾，否则涵盖单数和复数。除非本申请另有说明或明确与上下文相矛盾，否则使用的术语“至少一个”后跟一个或多个项目的列表(例如，“A和B中的至少一个”)应被解释成表示从所列的项目中选择的一个项目(A或B)或所列的项目中两个或更多个的任何组合(A和B)。除非另有说明，否则术语“包含”，“具有”，“包括”和“含有”应被解释成是开放式术语(即，表示“包括，但不限于，”)。除非本申请另有说明，否则本申请中对数值范围的描述仅旨在用作单独提及落入该范围内的每个单独值的简便方法，并且每个单独的值都并入本说明书中，如同其在本申请中被单独引用一样。除非本申请另有说明或上下文明显矛盾，否则本申请描述的所有方法均可以以任何合适的顺序进行。除非有另外声明，否则对本申请提供的任何及所有实施例或示例性语言(如，“例如”)的使用仅旨在更好地说明本发明，而并非对本发明的范围进行限制。说明书中的任何语言都不应被解释成指示对于本发明的实践来说必不可少的任何未被要求保护的要素。

本申请描述了本发明的优选实施方案，包括发明人已知的实施本发明的最佳方式。在阅读了前面的描述后，那些优选实施方案的变型对于本领域普通技术人员来说会变得显而易见。发明人期望熟练的技术人员适当地采用这些变型，并且发明人希望本发明以不同于本申请具体描述的方式进行实施。因此，本发明包括所附权利要求中所述主题的适用法律所允许的所有修改和等同物。此外，除非本申请另有说明或上下文明显矛盾，否则本发明涵盖上述元件的所有可能变型的任何组合。

序列表

<110> 康奈尔大学

阿德夫拉姆生物技术股份有限公司

<120> 用于治疗醛脱氢酶缺乏的基因疗法

<130> 725826

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 500

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的成熟的500 aa蛋白质

<400> 1

Ser Ala Ala Ala Thr Gln Ala Val Pro Ala Pro Asn Gln Gln Pro Glu

1 5 10 15

Val Phe Cys Asn Gln Ile Phe Ile Asn Asn Glu Trp His Asp Ala Val

20 25 30

Ser Arg Lys Thr Phe Pro Thr Val Asn Pro Ser Thr Gly Glu Val Ile

35 40 45

Cys Gln Val Ala Glu Gly Asp Lys Glu Asp Val Asp Lys Ala Val Lys

50 55 60

Ala Ala Arg Ala Ala Phe Gln Leu Gly Ser Pro Trp Arg Arg Met Asp

65 70 75 80

Ala Ser His Arg Gly Arg Leu Leu Asn Arg Leu Ala Asp Leu Ile Glu

85 90 95

Arg Asp Arg Thr Tyr Leu Ala Ala Leu Glu Thr Leu Asp Asn Gly Lys

100 105 110

Pro Tyr Val Ile Ser Tyr Leu Val Asp Leu Asp Met Val Leu Lys Cys

115 120 125

Leu Arg Tyr Tyr Ala Gly Trp Ala Asp Lys Tyr His Gly Lys Thr Ile

130 135 140

Pro Ile Asp Gly Asp Phe Phe Ser Tyr Thr Arg His Glu Pro Val Gly

145 150 155 160

Val Cys Gly Gln Ile Ile Pro Trp Asn Phe Pro Leu Leu Met Gln Ala

165 170 175

Trp Lys Leu Gly Pro Ala Leu Ala Thr Gly Asn Val Val Val Met Lys

180 185 190

Val Ala Glu Gln Thr Pro Leu Thr Ala Leu Tyr Val Ala Asn Leu Ile

195 200 205

Lys Glu Ala Gly Phe Pro Pro Gly Val Val Asn Ile Val Pro Gly Phe

210 215 220

Gly Pro Thr Ala Gly Ala Ala Ile Ala Ser His Glu Asp Val Asp Lys

225 230 235 240

Val Ala Phe Thr Gly Ser Thr Glu Ile Gly Arg Val Ile Gln Val Ala

245 250 255

Ala Gly Ser Ser Asn Leu Lys Arg Val Thr Leu Glu Leu Gly Gly Lys

260 265 270

Ser Pro Asn Ile Ile Met Ser Asp Ala Asp Met Asp Trp Ala Val Glu

275 280 285

Gln Ala His Phe Ala Leu Phe Phe Asn Gln Gly Gln Cys Cys Cys Ala

290 295 300

Gly Ser Arg Thr Phe Val Gln Glu Asp Ile Tyr Asp Glu Phe Val Glu

305 310 315 320

Arg Ser Val Ala Arg Ala Lys Ser Arg Val Val Gly Asn Pro Phe Asp

325 330 335

Ser Lys Thr Glu Gln Gly Pro Gln Val Asp Glu Thr Gln Phe Lys Lys

340 345 350

Ile Leu Gly Tyr Ile Asn Thr Gly Lys Gln Glu Gly Ala Lys Leu Leu

355 360 365

Cys Gly Gly Gly Ile Ala Ala Asp Arg Gly Tyr Phe Ile Gln Pro Thr

370 375 380

Val Phe Gly Asp Val Gln Asp Gly Met Thr Ile Ala Lys Glu Glu Ile

385 390 395 400

Phe Gly Pro Val Met Gln Ile Leu Lys Phe Lys Thr Ile Glu Glu Val

405 410 415

Val Gly Arg Ala Asn Asn Ser Thr Tyr Gly Leu Ala Ala Ala Val Phe

420 425 430

Thr Lys Asp Leu Asp Lys Ala Asn Tyr Leu Ser Gln Ala Leu Gln Ala

435 440 445

Gly Thr Val Trp Val Asn Cys Tyr Asp Val Phe Gly Ala Gln Ser Pro

450 455 460

Phe Gly Gly Tyr Lys Met Ser Gly Ser Gly Arg Glu Leu Gly Glu Tyr

465 470 475 480

Gly Leu Gln Ala Tyr Thr Glu Val Lys Thr Val Thr Val Lys Val Pro

485 490 495

Gln Lys Asn Ser

500

<210> 2

<211> 1503

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的编码成熟的500 aa蛋白质的核苷酸序列

<400> 2

tcagccgccg ccacccaggc cgtgcctgcc cccaaccagc agcccgaggt cttctgcaac 60

cagattttca taaacaatga atggcacgat gccgtcagca ggaaaacatt ccccaccgtc 120

aatccgtcca ctggagaggt catctgtcag gtagctgaag gggacaagga agatgtggac 180

aaggcagtga aggccgcccg ggccgccttc cagctgggct caccttggcg ccgcatggac 240

gcatcacaca ggggccggct gctgaaccgc ctggccgatc tgatcgagcg ggaccggacc 300

tacctggcgg ccttggagac cctggacaat ggcaagccct atgtcatctc ctacctggtg 360

gatttggaca tggtcctcaa atgtctccgg tattatgccg gctgggctga taagtaccac 420

gggaaaacca tccccattga cggagacttc ttcagctaca cacgccatga acctgtgggg 480

gtgtgcgggc agatcattcc gtggaatttc ccgctcctga tgcaagcatg gaagctgggc 540

ccagccttgg caactggaaa cgtggttgtg atgaaggtag ctgagcagac acccctcacc 600

gccctctatg tggccaacct gatcaaggag gctggctttc cccctggtgt ggtcaacatt 660

gtgcctggat ttggccccac ggctggggcc gccattgcct cccatgagga tgtggacaaa 720

gtggcattca caggctccac tgagattggc cgcgtaatcc aggttgctgc tgggagcagc 780

aacctcaaga gagtgacctt ggagctgggg gggaagagcc ccaacatcat catgtcagat 840

gccgatatgg attgggccgt ggaacaggcc cacttcgccc tgttcttcaa ccagggccag 900

tgctgctgtg ccggctcccg gaccttcgtg caggaggaca tctatgatga gtttgtggag 960

cggagcgttg cccgggccaa gtctcgggtg gtcgggaacc cctttgatag caagaccgag 1020

caggggccgc aggtggatga aactcagttt aagaagatcc tcggctacat caacacgggg 1080

aagcaagagg gggcgaagct gctgtgtggt gggggcattg ctgctgaccg tggttacttc 1140

atccagccca ctgtgtttgg agatgtgcag gatggcatga ccatcgccaa ggaggagatc 1200

ttcgggccag tgatgcagat cctgaagttc aagaccatag aggaggttgt tgggagagcc 1260

aacaattcca cgtacgggct ggccgcagct gtcttcacaa aggatttgga caaggccaat 1320

tacctgtccc aggccctcca ggcgggcact gtgtgggtca actgctatga tgtgtttgga 1380

gcccagtcac cctttggtgg ctacaagatg tcggggagtg gccgggagtt gggcgagtac 1440

gggctgcagg catacactga agtgaaaact gtcacagtca aagtgcctca gaagaactca 1500

taa 1503

<210> 3

<211> 517

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的包括信号序列的未成熟的517 aa蛋白质

<400> 3

Met Leu Arg Ala Ala Ala Arg Phe Gly Pro Arg Leu Gly Arg Arg Leu

1 5 10 15

Leu Ser Ala Ala Ala Thr Gln Ala Val Pro Ala Pro Asn Gln Gln Pro

20 25 30

Glu Val Phe Cys Asn Gln Ile Phe Ile Asn Asn Glu Trp His Asp Ala

35 40 45

Val Ser Arg Lys Thr Phe Pro Thr Val Asn Pro Ser Thr Gly Glu Val

50 55 60

Ile Cys Gln Val Ala Glu Gly Asp Lys Glu Asp Val Asp Lys Ala Val

65 70 75 80

Lys Ala Ala Arg Ala Ala Phe Gln Leu Gly Ser Pro Trp Arg Arg Met

85 90 95

Asp Ala Ser His Arg Gly Arg Leu Leu Asn Arg Leu Ala Asp Leu Ile

100 105 110

Glu Arg Asp Arg Thr Tyr Leu Ala Ala Leu Glu Thr Leu Asp Asn Gly

115 120 125

Lys Pro Tyr Val Ile Ser Tyr Leu Val Asp Leu Asp Met Val Leu Lys

130 135 140

Cys Leu Arg Tyr Tyr Ala Gly Trp Ala Asp Lys Tyr His Gly Lys Thr

145 150 155 160

Ile Pro Ile Asp Gly Asp Phe Phe Ser Tyr Thr Arg His Glu Pro Val

165 170 175

Gly Val Cys Gly Gln Ile Ile Pro Trp Asn Phe Pro Leu Leu Met Gln

180 185 190

Ala Trp Lys Leu Gly Pro Ala Leu Ala Thr Gly Asn Val Val Val Met

195 200 205

Lys Val Ala Glu Gln Thr Pro Leu Thr Ala Leu Tyr Val Ala Asn Leu

210 215 220

Ile Lys Glu Ala Gly Phe Pro Pro Gly Val Val Asn Ile Val Pro Gly

225 230 235 240

Phe Gly Pro Thr Ala Gly Ala Ala Ile Ala Ser His Glu Asp Val Asp

245 250 255

Lys Val Ala Phe Thr Gly Ser Thr Glu Ile Gly Arg Val Ile Gln Val

260 265 270

Ala Ala Gly Ser Ser Asn Leu Lys Arg Val Thr Leu Glu Leu Gly Gly

275 280 285

Lys Ser Pro Asn Ile Ile Met Ser Asp Ala Asp Met Asp Trp Ala Val

290 295 300

Glu Gln Ala His Phe Ala Leu Phe Phe Asn Gln Gly Gln Cys Cys Cys

305 310 315 320

Ala Gly Ser Arg Thr Phe Val Gln Glu Asp Ile Tyr Asp Glu Phe Val

325 330 335

Glu Arg Ser Val Ala Arg Ala Lys Ser Arg Val Val Gly Asn Pro Phe

340 345 350

Asp Ser Lys Thr Glu Gln Gly Pro Gln Val Asp Glu Thr Gln Phe Lys

355 360 365

Lys Ile Leu Gly Tyr Ile Asn Thr Gly Lys Gln Glu Gly Ala Lys Leu

370 375 380

Leu Cys Gly Gly Gly Ile Ala Ala Asp Arg Gly Tyr Phe Ile Gln Pro

385 390 395 400

Thr Val Phe Gly Asp Val Gln Asp Gly Met Thr Ile Ala Lys Glu Glu

405 410 415

Ile Phe Gly Pro Val Met Gln Ile Leu Lys Phe Lys Thr Ile Glu Glu

420 425 430

Val Val Gly Arg Ala Asn Asn Ser Thr Tyr Gly Leu Ala Ala Ala Val

435 440 445

Phe Thr Lys Asp Leu Asp Lys Ala Asn Tyr Leu Ser Gln Ala Leu Gln

450 455 460

Ala Gly Thr Val Trp Val Asn Cys Tyr Asp Val Phe Gly Ala Gln Ser

465 470 475 480

Pro Phe Gly Gly Tyr Lys Met Ser Gly Ser Gly Arg Glu Leu Gly Glu

485 490 495

Tyr Gly Leu Gln Ala Tyr Thr Glu Val Lys Thr Val Thr Val Lys Val

500 505 510

Pro Gln Lys Asn Ser

515

<210> 4

<211> 1554

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的包括信号序列的未成熟的517 aa蛋白质编码核酸

<400> 4

atgttgcgcg ctgccgcccg cttcgggccc cgcctgggcc gccgcctctt gtcagccgcc 60

gccacccagg ccgtgcctgc ccccaaccag cagcccgagg tcttctgcaa ccagattttc 120

ataaacaatg aatggcacga tgccgtcagc aggaaaacat tccccaccgt caatccgtcc 180

actggagagg tcatctgtca ggtagctgaa ggggacaagg aagatgtgga caaggcagtg 240

aaggccgccc gggccgcctt ccagctgggc tcaccttggc gccgcatgga cgcatcacac 300

aggggccggc tgctgaaccg cctggccgat ctgatcgagc gggaccggac ctacctggcg 360

gccttggaga ccctggacaa tggcaagccc tatgtcatct cctacctggt ggatttggac 420

atggtcctca aatgtctccg gtattatgcc ggctgggctg ataagtacca cgggaaaacc 480

atccccattg acggagactt cttcagctac acacgccatg aacctgtggg ggtgtgcggg 540

cagatcattc cgtggaattt cccgctcctg atgcaagcat ggaagctggg cccagccttg 600

gcaactggaa acgtggttgt gatgaaggta gctgagcaga cacccctcac cgccctctat 660

gtggccaacc tgatcaagga ggctggcttt ccccctggtg tggtcaacat tgtgcctgga 720

tttggcccca cggctggggc cgccattgcc tcccatgagg atgtggacaa agtggcattc 780

acaggctcca ctgagattgg ccgcgtaatc caggttgctg ctgggagcag caacctcaag 840

agagtgacct tggagctggg ggggaagagc cccaacatca tcatgtcaga tgccgatatg 900

gattgggccg tggaacaggc ccacttcgcc ctgttcttca accagggcca gtgctgctgt 960

gccggctccc ggaccttcgt gcaggaggac atctatgatg agtttgtgga gcggagcgtt 1020

gcccgggcca agtctcgggt ggtcgggaac ccctttgata gcaagaccga gcaggggccg 1080

caggtggatg aaactcagtt taagaagatc ctcggctaca tcaacacggg gaagcaagag 1140

ggggcgaagc tgctgtgtgg tgggggcatt gctgctgacc gtggttactt catccagccc 1200

actgtgtttg gagatgtgca ggatggcatg accatcgcca aggaggagat cttcgggcca 1260

gtgatgcaga tcctgaagtt caagaccata gaggaggttg ttgggagagc caacaattcc 1320

acgtacgggc tggccgcagc tgtcttcaca aaggatttgg acaaggccaa ttacctgtcc 1380

caggccctcc aggcgggcac tgtgtgggtc aactgctatg atgtgtttgg agcccagtca 1440

ccctttggtg gctacaagat gtcggggagt ggccgggagt tgggcgagta cgggctgcag 1500

gcatacactg aagtgaaaac tgtcacagtc aaagtgcctc agaagaactc ataa 1554

<210> 5

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的信号肽

<400> 5

Met Leu Arg Ala Ala Ala Arg Phe Gly Pro Arg Leu Gly Arg Arg Leu

1 5 10 15

Leu

Claims (25)

1.一种载体，其包含启动子，所述启动子与编码人醛脱氢酶的核酸序列可操作地连接。

2.根据权利要求1所述的载体，其中所述载体选自下组：腺相关病毒(AAV)、腺病毒、慢病毒、逆转录病毒和质粒。

3.根据权利要求2所述的载体，其中所述载体是AAV载体。

4.根据权利要求3所述的载体，其中所述AAV载体是非人腺相关病毒。

5.根据权利要求4所述的载体，其中所述非人腺相关病毒是恒河猴腺相关病毒。

6.根据权利要求5所述的载体，其中所述恒河猴腺相关病毒是腺相关病毒血清型rh.10。

7.根据权利要求1所述的载体，其中所述启动子是组成型活性启动子。

8.根据权利要求1所述的载体，其中所述启动子是细胞类型特异性启动子。

9.根据权利要求1所述的载体，其中所述启动子是诱导型启动子。

10.根据权利要求7所述的载体，其中所述具有组成型活性的启动子是鸡β-肌动蛋白启动子。

11.根据权利要求1所述的载体，其中所述人醛脱氢酶为人醛脱氢酶2(ALDH2)。

12.根据权利要求1所述的载体，其中所述载体进一步包含编码线粒体定位序列的核酸序列，所述核酸序列与所述编码人醛脱氢酶序列的核酸序列可操作地连接。

13.根据权利要求1所述的载体，其中所述载体编码SEQ ID NO:1。

14.根据权利要求12所述的载体，其中所述载体编码SEQ ID NO:3。

15.一种组合物，其包含权利要求1-14中任一项所述的载体以及药学上可接受的运载体。

16.一种治疗哺乳动物中醛脱氢酶缺乏，或治疗或预防哺乳动物中以醛脱氢酶缺乏为特征的疾病或其任何症状的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用权利要求1-14中任一项所述的载体。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述哺乳动物是人。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述哺乳动物对于ALDH2*2等位基因是杂合的或纯合的。

19.根据权利要求16-18中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物患有以缺乏醛脱氢酶为特征的疾病，所述疾病选自下组：乙醇中毒、上呼吸道/消化道癌、骨质疏松症、鳞状细胞癌、范可尼贫血、帕金森病、阿尔茨海默病、中风、高血压、心律失常、心肌梗塞和硝酸甘油不耐受。

20.根据权利要求16-19中任一项所述的方法，其中在约30天内向所述哺乳动物施用所述载体不超过一次。

21.根据权利要求16-20中任一项所述的方法，其中所述载体通过口内、肌肉内、透皮、静脉内、动脉内、皮下、皮内或腹膜内的给药途径进行施用。

22.根据权利要求16-21中任一项所述的方法，其进一步包括分析所述哺乳动物的氨基酸序列或核酸序列，并且如果所述哺乳动物中ALDH2蛋白的第487位残基不是谷氨酰胺的话，选择所述哺乳动物进行治疗。

23.根据权利要求22所述的方法，其中当第487位残基处的氨基酸是赖氨酸时，选择所述受试者进行治疗。

24.根据权利要求1-14中任一项所述的载体，或根据权利要求15所述的组合物，所述载体或组合物用于治疗哺乳动物中的醛脱氢酶缺乏，或治疗或预防哺乳动物中以醛脱氢酶缺乏为特征的疾病或其任何症状。

25.根据权利要求1-14中任一项所述的载体或根据权利要求15所述的组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗哺乳动物中的醛脱氢酶缺乏，或治疗或预防哺乳动物中以醛脱氢酶缺乏为特征的疾病或其任何症状。