CN101511373B - 用于基因治疗的修饰的因子ⅷ和因子ⅸ基因和载体 - Google Patents

用于基因治疗的修饰的因子ⅷ和因子ⅸ基因和载体 Download PDF

Info

Publication number
CN101511373B
CN101511373B CN200780029324.6A CN200780029324A CN101511373B CN 101511373 B CN101511373 B CN 101511373B CN 200780029324 A CN200780029324 A CN 200780029324A CN 101511373 B CN101511373 B CN 101511373B
Authority
CN
China
Prior art keywords
gene
fix
sequence
cell
viral vector
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN200780029324.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN101511373A (zh
Inventor
理查德·J·萨姆尔斯基
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Asklepios Biopharmaceutical Inc
Original Assignee
Asklepios Biopharmaceutical Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Asklepios Biopharmaceutical Inc filed Critical Asklepios Biopharmaceutical Inc
Publication of CN101511373A publication Critical patent/CN101511373A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN101511373B publication Critical patent/CN101511373B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/644—Coagulation factor IXa (3.4.21.22)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2799/00—Uses of viruses
    • C12N2799/02—Uses of viruses as vector
    • C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid
    • C12N2799/025—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid where the vector is derived from a parvovirus

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明涉及用于包含在嵌合病毒载体中的修饰和优化因子VIII或因子IX核酸。使用这种核酸可用于血友病的治疗。

Description

用于基因治疗的修饰的因子Ⅷ和因子Ⅸ基因和载体
与相关申请的交叉参考
本申请要求2006年6月19日提交的美国临时专利申请序号60/760,465、2006年9月1日提交的美国临时专利申请序号60/824,338和2006年9月26日提交的美国临时专利申请序号60/847,337的优先权；它们的内容在此以其全文引为参考。
发明背景
发明领域
本发明涉及修饰的因子VIII(FVIII)和因子XI(FIX)基因、包含修饰基因的核酸载体、包含修饰基因的优化病毒衣壳，以及在FVIII和FIX缺陷例如A型血友病和B型血友病的治疗中使用修饰基因的方法。
相关技术讨论
血友病是血液不能充分凝结的血液疾病。当血友病患者受伤时，凝血不足导致出血过多。血友病是遗传性凝血疾病，其特征为凝血不足和出血过多。几种类型的遗传性血友病以受影响的凝血因子区分。A型血友病由缺乏凝血因子VIII(FVIII)引起。B型血友病由缺乏凝血因子IX(FIX)引起。
B型血友病是X连锁的疾病，每30000个男性中大约有1人患有这种疾病。重型B型血友病(占B型血友病人群的大约60％)可能致命。关节和肌肉中的自发性出血可能导致永久性残疾。
基因治疗已经被提议作为治疗模式，用于在血友病患者中补充缺乏的凝血因子。但是，与基因治疗的许多领域一样，理论远比成功有效的应用简单。在以前设计适合治疗人类的FVIII或FIX构建物的尝试中，已经遇到了许多困难。
例如，Manno等报道，在I期研究中向人类对象的肝脏以AAV2介导投送FIX，导致生物活性FIX水平的表达(Manno等，Blood，(2006)，pp.)。Connelly等报道，用编码人类FVIII的腺病毒载体治疗FVIII缺陷小鼠，导致生物活性人类FVIII的表达(Connelly等，Blood，Vol.91，No.9(1998)，pp.3273-3281)。Sarker等报道，使用AAV8血清型与FVIII的组合在小鼠模型中校正了血浆FVIII活性(Sarkar等，Blood，Vol.103，No.4(2004)，pp.1253-1260)。
但是，与基因治疗的许多领域相同，理论远比成功有效的实现简单。实现基因治疗技术的困难包括在使用病毒作为基因载体中遇到的难题。尽管因为病毒可用于转导细胞，导致蛋白在体内表达，从而可有效用作基因载体，但是包被病毒粒子的蛋白可能激活身体的免疫系统。
因此，对于有效表达足够量靶蛋白以将所需病毒载体的剂量减少到可耐受水平的系统，存在着需求。
发明简述
本发明提供了修饰的因子VIII(FVIII)和因子XI(FIX)基因、包含修饰基因的核酸载体、包含修饰基因的优化病毒衣壳、以及在FVIII和FIX缺陷例如A型血友病和B型血友病的治疗中使用修饰基因的方法。
一方面，本发明提供了在人类对象中治疗血友病的优化FVIII或FIX基因，其中该优化基因已经被修饰，增加了CG序列并减少了顺式基序。优选优化基因包含序列SEQIDNO：7、12或15。
另一方面，本发明提供了在人类对象中治疗血友病的含有优化FVIII或FIX基因的嵌合病毒载体，其中优化基因已经被修饰，增加了CG序列并减少了顺式基序。优选嵌合病毒载体包括旁侧带有AAVTRS例如SEQIDNO.2和SEQIDNO.9的SEQIDNO.7或其互补序列，其中SEQIDNO.2的序列位于其5′末端，SEQIDNO.9位于其3′末端。嵌合病毒载体可以包含SEQIDNO.1的核苷酸序列。
另一方面，本发明提供了在对象中治疗血友病的方法，该方法包括：
a.提供至少一个重组病毒载体，其含有用于包含修饰的FVIII或FIX基因的核苷酸序列；以及
b.在使所述FVIII或FIX核苷酸序列以在对象中产生治疗有效量FVIII或FIX水平进行表达的条件下，给对象施用该重组病毒载体。
另一方面，本发明提供了用修饰的FVIII或FIX基因转导肌细胞或肝细胞的方法，该方法包括将肝细胞与重组生物纳米颗粒(BNP)病毒载体相接触，该载体含有包含SEQIDNO.7序列的优化FIX基因，或包含SEQIDNO：12或15序列的优化FVIII基因。
基因转移在了解疾病状态和为疾病状态提供治疗中有显著的潜在应用。有许多遗传疾病，其中缺陷的基因是已知的并已被克隆。总的来说，上述疾病状态可归为两类：缺陷状态，通常是酶，一般以隐性方式遗传；以及不平衡状态，可能涉及调控或结构蛋白，典型以显性方式遗传。对于缺陷状态的疾病来说，基因转移可以用于将正常的基因带入患病组织进行替代治疗，以及使用反义突变产生疾病的动物模型。对于不平衡疾病状态来说，基因转移可以用于在模型系统中产生疾病状态，然后可以使用它来致力于抵消疾病状态。因此，本发明的方法允许治疗遗传疾病。在本文中使用时，通过部分或完全纠正引起疾病或使疾病更加严重的缺陷或不平衡，来治疗疾病状态。
因此，本发明的另一方面提供了治疗血友病的疗法，包括：基于施用优化FVIII或FIX基因的编码核苷酸序列的基因治疗。
另一方面，本发明提供了含有编码优化FVIII或FIX基因或其片段的多核苷酸的表达载体。在一个实施方案中，表达载体是包含AAV2衣壳2.5的序列(SEQIDNO.17)的AVV病毒载体。
另一方面，本发明提供了用编码本发明的优化FVIII或FIX肽的多核苷酸感染的重组宿主细胞。
另一方面，本发明考虑了制备优化FVIII或FIX肽或其片段的方法，包括：
a.用编码FVIII或FIX肽或其片段的多核苷酸转染细胞以产生转化的宿主细胞；以及
b.将转化的宿主细胞维持在足以表达肽的生物学条件下。
另一方面，本发明涉及本发明的优化FVIII或FIX肽或其片段在用于治疗血友病的药物中的应用。
本发明还提供了药物组合物，其含有用于在人类对象中治疗血友病的优化FVIII或FIX基因并与可药用的载体组合，其中优化基因已经被修饰，增加了CG序列并减少了顺式基序。优化基因可以包含序列SEQIDNO：7、12或15。
从下面的具体说明、附图和权利要求书，本发明的其它特点和优点将更加显见。
附图简述
图1显示了体外GFP转导1×109vg(病毒基因组)HPMC530,000个细胞。
图2显示了单链和双链基因组的体外GFP剂量响应。
图3显示了原代和人类原代骨骼肌细胞系的表达水平。
图4显示了感染后24小时，1×109vg/滴度感染的APTTHPMC体外裂解物。
图5显示了hFIX体外HPMC细胞裂解物表达。
图6显示了R333Q模型感染后6周，针对ssBNP2.5vs.ssAAV2(6A(1，2和3))和dsBNP2.5vs.ssAAV2(6B(1，2和3))的FIX体内数据。
图7显示了在C57Blk6中使用带有FIX转基因的ssAAV2、dsBNP-1.1和dsBNP2.5进行门静脉给药的结果。
图8显示了优化hFIX的密码子序列。
图9显示了野生型vs.优化hFIX编码序列的体外表达。
图10显示了hFIX的表达以及Avigen病毒(4×1011vg/kg)与AAV2dshFIX和优化hFIX的比较。
图11显示了hFIX的表达，比较了Avigen病毒(8×1010vg/kg)与AAV2dshFIX和优化hFIX。
图12显示了使用AAV1、AAV2和BNP-2.5的体外中和抗体滴度水平。
图13显示了使用AAV1、AAV2和BNP-2.5的体内中和抗体滴度水平。
图14显示了本发明的优选载体。
图15显示了图14的载体的序列(SEQIDNO1)，并显示了粗斜体大写字母：左突变ITR(SEQIDNO：2)；粗体小写字母：TTR启动子(SEQIDNO：3)；正常小写字母：填充序列(SEQIDNO：4)；粗体下划线小写字母：MVM内含子(SEQIDNO：5)；正常小写字母：填充序列(SEQIDNO：6)；粗斜体下划线大写字母：优化hFIXcDNA(SEQIDNO：7)；粗体小写字母：牛激素多聚A(SEQIDNO：8)和粗斜体大写字母：右ITR(SEQIDNO：9)。
图16显示了相对于SEQIDNO：19(未优化)和SEQIDNO：12(优化)，归于某种质量(quality)级别的序列密码子的百分率。
图17显示了SEQIDNO：12相对于未优化者(SEQIDNO：19)的密码子质量加强。
图18显示了GC含量从未优化时(SEQIDNO：19)的44％增加到优化后(SEQIDNO：12)的60％。
图19显示了与SEQIDNO：15有关的密码子质量。
图20显示了SEQIDNO：19的密码子质量图。
图21显示了修改的SEQIDNO：15的GC含量图，其为62％。
图22显示了修改的FVIII基因SEQIDNO：10的核苷酸序列，包括SEQIDNO：11、SEQIDNO：12(修改的FVIIIcDNA)和SEQIDNO：13。
图23显示了修改的FVIII基因SEQIDNO：14的核苷酸序列，包括SEQIDNO：15(修改的FVIIIcDNA)和SEQIDNO：16。
图24显示了本发明的野生型FIX序列(SEQIDNO：18)(Blast中的质询行)和优化序列(SEQIDNO：7)(Blast中的对象行)之间GC含量的比较。
发明具体说明
定义
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语都与本发明所属技术领域中普通专业人员通常理解的意义相同。本文使用的术语仅仅是出于描述具体实施方案的目的，并不打算限制本发明。在本发明的说明书和所附的权利要求书中使用的单数形式″a″、″an″和″the″旨在同样包含复数形式，除非上下文明确表明不是。下列术语具有给定的意义：
“AAVCap”是指AAVCap蛋白，VP1、VP2和VP3及其类似物。
“AAVRep”是指AAVRep蛋白及其类似物。
“AAVTR”是指回文序列，包含大部分互补、对称排列的序列，并包括天然AAVTRS的类似物及其类似物。
“生物学有效的”对于病毒载体的量来说，是足以导致靶细胞中的感染(或转导)和转入基因表达的量。
“顺式基序”包括保守的序列，例如在基因组序列的末端处或附近发现并被识别用于启动复制的序列；在内部位置可能用于转录起始或终止的隐蔽的启动子或序列。
“嵌合的”对于病毒衣壳或粒子来说，是指衣壳或粒子包含了来自不同细小病毒、优选为不同AAV血清型的序列，如Rabinowitz等在2002年12月10日授权的题为“重组细小病毒载体及其制备方法(Recombinantparvovirusvectorsandmethodofmaking)”的美国专利6,491,907所述，其公开内容在此以其全文引为参考。特别优选的嵌合病毒衣壳是AAV2.5衣壳，其具有的AAV2衣壳的序列带有下列突变：263Q→A；265插入T；705N→A；708V→A；以及716T→N。其中表达这样的衣壳的核苷酸序列被定义为SEQIDNO：17。其它优选的嵌合病毒衣壳描述在共同待审的PCT申请No.PCT/US07/01668中，其公开内容在此以其全文引为参考。
“旁侧的”对于旁侧带有其它元件的序列来说，表明相对于序列来说，在上游和/或下游，即5′和/或3′，存在一个或多个旁侧元件。术语“旁侧的”不打算表明序列必需是紧邻的。例如，在编码转基因的核酸和旁侧元件之间可以存在间插序列。序列(例如转基因)“旁侧”带有两个其它元件(例如TR)，表明一个元件位于序列的5′，另一个位于序列的3′；但是，在它们之间可以存在间插序列。
“多核苷酸”是指由磷酸二酯键连接的核苷酸序列。本文中多核苷酸以5’到3’的方向表示。本发明的多核苷酸可以是脱氧核糖核酸(DNA)分子或核糖核酸(RNA)分子。当多核苷酸是DNA分子时，该分子可以是基因或cDNA分子。在本文中核苷酸碱基以单字母编码标明：腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、次黄嘌呤(I)和尿嘧啶(U)。本发明的多核苷酸可以使用本技术领域的专业人员熟知的标准技术来制备。
用病毒“转导”细胞是指存在DNA或RNA从病毒粒子向细胞的转移。
细胞的“转染“是指出于对细胞进行遗传修饰的目的，将遗传物质导入到细胞中。转染可以通过本技术领域已知的各种不同方法来完成，例如转导或电穿孔。
除非另有指明，“多肽“涵盖了肽和蛋白。
“转基因”在广义上使用是指掺入到病毒载体中的任何用于在靶细胞中表达的异源核苷酸序列，以及相关的表达控制序列例如启动子。本技术领域的专业人员会认识到表达控制序列可以根据在靶细胞中启动转基因表达的能力来选择。转基因的例子是编码治疗性多肽的核酸。
“载体”是指含有将在体外或在体内被投送到宿主细胞中的多核苷酸的重组质粒或病毒。
“重组体”是指不同于自然界中普遍发现的遗传实体。当用于多核苷酸或基因时，它是指多核苷酸是克隆、限制和/或连接步骤以及导致产生不同于自然界中发现的多核苷酸的构建物的其它程序的各种不同组合的产物。
“基本上同源”或“基本上相似”当指称核酸或其片段时，表示当将适当的核苷酸插入或缺失片段与另一个核酸(或其互补链)进行最优比对时，在至少大约95到99％的序列中存在核苷酸序列同一性。
“重组病毒载体”是指含有一个或多个异源序列(即不是病毒来源的多核苷酸序列)的重组多核苷酸载体。在重组细小病毒载体的情况下，重组多核苷酸旁侧带有至少一个、优选两个反向末端重复序列(ITR)。
对于载体或病毒衣壳来说，“血清型”是由基于衣壳蛋白序列和衣壳结构的独特的免疫学情况定义的。
“肽”、“多肽”和“蛋白”可以互换使用，表示至少两个氨基酸通过酰胺键共价连接的序列聚合物。
“同源的”用于指称肽时，是指两个肽之间的氨基酸序列相似性。当这两种肽中的氨基酸位置被同样的氨基酸占据时，它们在该位置同源。因此，“基本上同源”是指氨基酸序列很大程度上、但不是完全同源，并且它保留了与它同源的序列的大部分或所有的活性。本文中使用的“基本上同源的”用在这里是指序列与参比肽至少50％一致、优选至少75％、更优选95％同源。其它的肽序列修饰也包括在内，例如本文公开的序列的氨基酸序列的少量改变、缺失、取代或衍生，只要肽的活性或功能与未修饰的肽基本相同即可。氨基酸的衍生物可以包括但不限于三氟亮氨酸、六氟亮氨酸、5，5，5-三氟异亮氨酸、4，4，4-三氟缬氨酸、对-氟苯丙氨酸、邻-氟酪氨酸、间-氟酪氨酸、2，3-二氟酪氨酸、4-氟组氨酸、2-氟组氨酸、2，4-二氟组氨酸、氟代脯氨酸、二氟脯氨酸、4-羟基脯氨酸、硒代甲硫氨酸、碲代甲硫氨酸、硒代半胱氨酸、硒代色氨酸、4-氨基色氨酸、5-氨基色氨酸、5-羟基色氨酸、7-氮杂色氨酸、4-氟色氨酸、5-氟色氨酸、6-氟色氨酸、同型烯丙基甘氨酸、同型丙炔基甘氨酸、2丁炔基甘氨酸、顺巴豆基甘氨酸、烯丙基甘氨酸、脱氢亮氨酸、脱氢脯氨酸、2-氨基-3-甲基-4-戊烯酸、叠氮基高丙氨酸、叠氮基丙氨酸、叠氮基正亮氨酸、对-乙炔基苯丙氨酸、对-叠氮基苯丙氨酸、对-溴苯丙氨酸、对-乙酰基苯丙氨酸和苯并呋喃基丙氨酸。重要的是，修饰的肽将保留与未修饰的肽相关的活性或功能，修饰的肽一般将具有与未修饰序列的氨基酸序列“基本上同源的”氨基酸序列。
本发明提供了编码FVIII或FIX的修饰核酸。本发明还提供了核酸构建物，其包含编码FVIII或FIX的修饰核酸作为其序列的一部分。例如，本发明包括的质粒和/或其它载体含有修饰的FVIII或FIX序列以及其它元件例如调控元件。此外，本发明提供了包装的基因投送介质，例如包含有修饰的FVIII或FIX序列的病毒衣壳。本发明还包括通过将修饰的序列以及在细胞中启动表达所需的元件投送到细胞中来表达FVIII或FIX的方法。本发明还提供了基因治疗方法，其中修饰的FVIII或FIX序列作为例如载体的组分和/或包装成病毒基因投送载体的组分给对象对用。治疗可以例如有效地在对象中增强凝血和/或治疗对象中FVIII或FIX的缺乏。本发明的这些方面的每一方面将在后续的部分中进一步讨论。
用于表达FVIII或FIX的修饰的核酸
本发明提供了编码FVIII或FIX的修饰的序列。修饰的序列包括的天然FVIII或FIX序列含有一个或多个优化性修饰。优化性修饰的例子包括消除一个或多个顺式作用基序并导入一个或多个Kozak序列。在一个实施方案中，一个或多个顺式作用基序被消除，并导入了一个或多个Kozak序列。
可以被消除的顺式作用基序的例子包括内部TATA-盒，chi位点，核糖体进入位点，富含AT和/或富含GC的序列段，ARE、INS和/或CRS序列元件，重复序列和/或RNA二级结构，(隐蔽的)剪接供体和/或受体位点、分支点，以及Sail。优选，相对于野生型因子FVIII或FIX，提高GC含量，并除去一个或多个顺式作用基序。GC含量优选比野生型基因高至少30％到90％。此外，密码子适应指数优选＞75、＞80、＞85、＞90或＞95。
修饰的FVIII或FIX序列也可以包含旁侧限制性位点，以便于亚克隆到表达载体中。
本发明还包括编码功能活性片段FIX的SEQIDNO7序列的片段。此外，本发明包括修饰版本的SEQIDNO：7，它编码具有FIX凝血活性的FIX类似物。此外，本申请包括FVIII的修饰的序列，包含SEQIDNO：12和15。
本发明包括的核酸载体含有修饰的FVIII或FIX序列以及各种不同的调控元件。可用于基因表达的调控元件的准确性质在生物体与生物体之间变化。一般来说，它们包括在目的细胞中指导RNA转录起始的启动子。启动子可以是组成型的或被调控的。组成型启动子是导致可操作连接的基因基本上在所有时间都表达的启动子。被调控的启动子是可以被激活或失活的启动子。被调控的启动子包括可诱导启动子，它们通常是“关闭的”但是可以被诱导“打开”，以及“可抑制的”启动子，它们通常是“打开的”但是可以被“关闭”。已知有许多不同的调控物，包括温度、激素、细胞因子、重金属和调控蛋白。区别不是绝对的；组成型启动子通常可以被调控到某种程度。在某些情况下，可以利用内源途径来提供对转基因表达的调控，例如使用当病理状况改善时被自然下调的启动子。
适合的启动子的例子包括腺病毒启动子、例如腺病毒主要晚期启动子，异源启动子例如巨细胞病毒(CMV)启动子，呼吸道合胞病毒启动子，劳氏(Rous)肉瘤病毒(RSV)启动子，白蛋白启动子，诱导型启动子例如小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子，金属硫蛋白启动子，热休克启动子，α-1-抗胰蛋白酶启动子，乙肝表面抗原启动子，转铁蛋白启动子，载脂蛋白A-1启动子，人类FVIII启动子，以及人类FIX启动子。启动子可以是组织特异性启动子，例如在肝脏细胞中有活性的小鼠白蛋白启动子，以及运甲状腺素蛋白启动子(TTR)。
包装的修饰的FVIII或FIX序列
修饰的FVIII或FIX序列也可以提供为包装的病毒载体的组分。一般来说，包装的病毒载体包括包装在衣壳中的病毒载体。病毒载体和病毒衣壳将在随后部分中讨论。
病毒载体
按照本发明的方法产生的包装的病毒载体的病毒载体组分包括至少一个修饰的FVIII或FIX序列，以及用于控制修饰的FVIII或FIX序列表达的相关表达控制序列。病毒载体可以包含足以能够使其保持游离形式的顺式作用功能，或通过包括将修饰的FVIII或FIX序列整合到靶细胞基因组中的机制。
在优选实施方案中，病毒载体包含细小病毒基因组的一部分，例如删除了rep和cap并替换成修饰的hFVIII或hFIX序列及其相关表达控制序列的AAV基因组。修饰的FVIII或FIX序列通常插入到一个或两个(即旁侧带有的)适合病毒复制的AAVTRS或TR元件附近；Xiao等，JVirol71；2：941-948(1997)，以代替病毒的rep和capORF。也可以包含其它适合促进修饰的hFVIII或hFIX序列在靶细胞中的组织特异性表达的调控序列。
病毒载体可以是任何适合的核酸构建物，例如DNA或RNA构建物，可以是单链的、双链的或双链体。
病毒衣壳
包装的病毒载体的病毒衣壳组分可以是细小病毒衣壳。AAVCap和嵌合衣壳是优选的。适合的细小病毒病毒衣壳组分的例子是来自细小病毒科的衣壳组分，例如自主细小病毒或依赖病毒。例如，病毒衣壳可以是AAV衣壳(例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11或AAV12衣壳；本技术领域的专业人员将了解，可能有其它尚未鉴定的变异体能执行相同或相似功能)，或可以包含来自两种或多种AAV衣壳的组分。完整的一套AAVCap蛋白包括VP1、VP2和VP3。含有编码AAVVP衣壳蛋白的核苷酸序列的ORF可以包含少于一整套AAVCap蛋白，或者也可以提供一整套AAVCap蛋白。
一种或多种AAVCap蛋白可以是嵌合蛋白，包括来自两种或多种病毒、优选为两种或多种AAV的AAVCap氨基酸序列，如Rabinowitz等于2002年12月10日被授权的题为“重组细小病毒载体及其制备方法(Recombinantparvovirusvectorsandmethodofmaking)”的美国专利6,491,907中所述，其全部公开内容在此引为参考。例如，嵌合病毒衣壳可以包含AAV1Cap蛋白或亚基以及至少一个AAV2Cap或亚基。嵌合衣壳可以，例如，包含具有一个或多个B19Cap亚基的AAV衣壳，例如AAVCap蛋白或亚基可以被B19Cap蛋白或亚基代替。例如，在优选实施方案中，AAV衣壳的Vp3亚基可以被B19的Vp2亚基代替。
包装的病毒载体的生产
本发明包括可以被培养以产生本发明的包装的病毒载体的包装细胞。本发明的包装细胞一般包括具有异源的(1)病毒载体功能，(2)包装功能，以及(3)辅助功能的细胞。这些组分功能的每一种将在后面部分中讨论。
病毒载体功能
本发明的包装细胞包含病毒载体功能以及包装和载体功能。病毒载体功能通常包含一部分细小病毒基因组，例如AAV基因组，其中rep和cap被删除并用修饰的FVIII或FIX序列及其相关表达控制序列代替。病毒载体功能包含充分的表达控制序列，导致用于包装的病毒载体的复制。典型地，病毒载体包含一部分细小病毒基因组，例如AAV基因组，其中rep和cap被删除并用转基因及其相关表达控制序列代替。转基因一般旁侧带有两个AAVTRS，代替被删除的病毒rep和capORF。包含了适合的表达控制序列，例如组织特异性启动子和适合用于促进转基因在靶细胞中组织特异性表达的其它调控序列。转基因通常是可以表达产生治疗性多肽或标记物多肽的核酸序列。病毒载体可以是任何适合的核酸构建物，例如DNA或RNA构建物，可以是单链的、双链的或双链体。
病毒载体功能可以适当地提供为双链体载体模板，如Samulski等的美国专利公布No.2004/0029106中所述(出于其讲授关于双链体载体，其全部公开内容在此引为参考)。双链体载体是二聚的自身互补的(sc)多核苷酸(典型为DNA)。例如，可以选择双链体载体的DNA，以便由链内碱基配对形成双链发夹结构。双链体DNA载体的两条链都可以包装在病毒衣壳中。双链体载体提供了与双链DNA病毒载体相当的功能，并可以减少靶细胞合成与通常被病毒包裹的单链基因组互补的DNA的需要。
在病毒载体中选用的TR(可解离的和不可解离的)优选为AAV序列，其中优选血清型1、2、3、4、5和6。可解离的AAVTRS不需具有野生型TR序列(例如，可以通过插入、缺失、截短或错义突变来改变野生型序列)，只要TR介导所需的功能例如病毒包装、整合和/或前病毒拯救等即可。TR可以是用作AAV反向末端重复的合成序列，例如Samulski等的美国专利No.5,478,745中描述的“双D序列”，其全部公开内容以其全文引为参考。通常，但不是必需的，TR来自同样的细小病毒，例如两个TR序列都来自AAV2。
包装功能包括衣壳组分。衣壳组分优选来自细小病毒衣壳，例如AAV衣壳或嵌合AAV衣壳功能。适合的细小病毒病毒衣壳组分的例子是来自细小病毒科的衣壳组分，例如自主细小病毒或依赖病毒。例如，衣壳组分可以选自AAV衣壳，例如AAV1-AAV12，以及其它尚未被鉴定的新衣壳或来自非人类灵长动物来源的衣壳。衣壳组分可以包含来自两个或多个AAV衣壳的组分。
在更优选的实施方案中，一种或多种VP衣壳蛋白是嵌合蛋白，包含来自两种或多种病毒、优选为两种或多种AAV的氨基酸序列，如Rabinowitz等在2002年12月10日授权的题为“重组细小病毒载体及其制备方法(Recombinantparvovirusvectorsandmethodofmaking)”的美国专利6,491,907中所述，其全部公开内容在此以其全文引为参考。
例如，嵌合病毒衣壳可以包含来自腺相关病毒(AAV)的衣壳区和来自B19病毒的至少一个衣壳区。嵌合衣壳可以，例如，包含具有一个或多个B19衣壳亚单位的AAV衣壳，例如AAV衣壳亚单位可以被B19衣壳亚单位代替。例如，在优选实施方案中，AAV衣壳的VP1、VP2或VP3亚单位可以被B19的VP1、VP2或VP3亚单位替换。在另一个例子中，嵌合衣壳可以包含2型AAV衣壳，其中2型VP1亚单位已经被来自1、3、4、5或6型AAV衣壳、优选3、4或5型衣壳的VP1亚单位替换。或者，嵌合的细小病毒具有2型AAV衣壳，其中2型VP2亚单位已经被来自1、3、4、5或6型AAV衣壳、优选3、4或5型衣壳的VP2亚单位替换。同样地，优选的细小病毒中来自1、3、4、5或6型AAV(更优选3、4或5型)的VP3亚单位取代了2型AAV衣壳的VP3亚单位的嵌合。作为另一种可选方案，其中两个2型AAV亚单位被来自不同血清型AAV(例如1、3、4、5或6型AAV)的亚单位取代的嵌合细小病毒是优选的。在本实施方案的示例性嵌合细小病毒中，2型AAV衣壳的VP1和VP2、或VP1和VP3、或VP2和VP3亚单位被不同血清型AAV(例如1、3、4、5或6型AAV)的相应亚单位取代。同样地，在另一个优选实施方案中，嵌合细小病毒具有1、3、4、5或6型AAV衣壳(优选2、3或5型衣壳)，其中一个或两个亚单位已经被来自不同血清型AAV的亚单位所取代，如上面对于2型AAV的描述。
包装的病毒载体一般包含修饰的FVIII或FIX序列和旁侧带有TR元件的表达控制序列，足以导致载体DNA的包装以及随后修饰的FVIII或FIX序列在转导细胞中的表达。病毒载体的功能可以，例如，作为质粒或扩增子的组分提供给细胞。病毒载体功能可以在细胞系内存在于染色体外，和/或可以整合到细胞的染色体DNA中。
将带有病毒载体功能的核苷酸序列导入用于复制和包装的细胞宿主中的任何方法都可以使用，包括但不限于电穿孔、磷酸钙沉淀、微注射、阳离子或阴离子脂质体、以及脂质体与核定位信号的组合。在病毒载体功能通过用病毒载体转染来提供的实施方案中，可以使用产生病毒感染的标准方法。
包装功能
包装功能包括病毒载体复制和包装的基因。因此，例如，如果需要，包装功能可以包括病毒基因表达、病毒载体复制、病毒载体从整合状态的拯救、病毒基因表达、以及将病毒载体包装到病毒粒子中所必需的功能。包装功能可以使用遗传构建物例如质粒或扩增子，与包装细胞一起或分开提供。包装功能可以在包装细胞内存在于染色体外，但优选整合到细胞的染色体DNA中。例子包括编码AAVRep和Cap蛋白的基因。
辅助功能
辅助功能包括建立包装细胞的活性感染所需的辅助病毒元件，包装细胞的活性感染是启动病毒载体的包装所需的。例子包括源自于腺病毒、杆状病毒和/或疱疹病毒的、足以导致病毒载体包装的功能。例如，腺病毒辅助功能典型包括腺病毒组分E1a、E1b、E2a、E4和VARNA。包装功能可以通过用所需病毒感染包装细胞来提供。包装功能可以使用遗传构建物例如质粒或扩增子，与包装细胞一起或分开提供。包装功能可以在包装细胞内存在于染色体外，但优选整合到细胞的染色体DNA中。
可以使用任何适合的辅助病毒功能。例如，当包装细胞是昆虫细胞时，杆状病毒可以用作辅助病毒。在AAV包装方法中，疱疹病毒也可以用作辅助病毒。编码AAVRep蛋白的杂合疱疹病毒可以有利地促进可以更具规模的AAV载体生产计划。
将带有辅助功能的核苷酸序列导入用于复制和包装的细胞宿主的任何方法都可以使用，包括但不限于电穿孔、磷酸钙沉淀、微注射、阳离子或阴离子脂质体、以及脂质体与核定位信号的组合。在辅助功能通过使用病毒载体转染或使用辅助病毒感染来提供的实施方案中，可以使用产生病毒感染的标准方法。
包装细胞
本技术领域已知的任何适合的允许细胞或包装细胞都可用于生产包装的病毒载体。优选哺乳动物细胞或昆虫细胞。可用于在本发明的实践中生产包装细胞的细胞例子包括，例如，人类细胞系，例如VERO、WI38、MRC5、A549、293细胞、B-50或任何其它的HeLa细胞、HepG2、Saos-2、HuH7以及HT1080细胞系。
优选用作包装细胞的细胞系是昆虫细胞系。允许AAV复制并可以在培养中维持的任何昆虫细胞都可用于本发明。例子包括草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)例如Sf9或Sf21细胞系，果蝇属物种(Drosophilaspp.)的细胞系，或蚊子的细胞系，例如白纹伊蚊(Aedesalbopictus)衍生的细胞系。优选的细胞系是草地夜蛾Sf9细胞系。下面的参考文献出于它们讲授使用昆虫细胞表达异源多肽、将核酸导入这种细胞的方法、以及将这种细胞维持在培养中的方法的考虑而合并在此：MethodsinMolecularBiology，《分子生物学方法》，Richard主编，HumanaPress，NJ(1995)；O′Reilly等，BaculovirusExpressionVectors：ALaboratoryManual，《杆状病毒表达载体：实验室手册》，OxfordUniv.Press(1994)；Samulski等，J.Vir.63：3822-8(1989)；Kajigaya等，Proc.NatlAcad.Sci.USA88：4646-50(1991)；Ruffing等，J.Vir.66：6922-30(1992)；Kimbauer等，Vir.219：37-44(1996)；Zhao等，Vir.272：382-93(2000)；以及Samulski等，美国专利No.6,204,059。
在生产过程中，包装细胞一般包含一种或多种病毒载体功能以及辅助功能和包装功能，足以导致病毒载体的复制和包装。这些各种不同的功能可以使用遗传构建物例如质粒或扩增子，与包装细胞一起或分开提供，并且它们可以在包装细胞内存在于染色体外，或整合到细胞的染色体中。
可以提供其中已经引入了任何一种或多种所述功能的细胞，例如具有引入到染色体外或整合到细胞染色体DNA中的一种或多种载体功能的细胞系，具有引入到染色体外或整合到细胞染色体DNA中的一种或多种包装功能的细胞系，或具有引入到染色体外或整合到细胞染色体DNA中的辅助功能的细胞系。
治疗方法
修饰的FVIII或FIX基因可用于与FVIII或FIX相关疾病、例如A型或B型血友病的基因治疗。由于FVIII或FIX基因的调控区和/或编码序列中的一个或多个突变，造成FVIII或FIX表达不合适，例如具有不正确的氨基酸序列、或在错误的组织中或在错误的时间表达、低表达或过表达，因此个体可能需要基因治疗。修饰的FVIII或FIX基因可用作基因疗法，以在需要增强凝血的对象中增强凝血。
本发明的载体的靶细胞是能够表达具有FVIII或FIX活性的多肽的细胞，例如哺乳动物的肝脏系统的细胞、内皮细胞、以及其它具有适合的细胞机制进行前体加工以产生具有FVIII或FIX活性的蛋白的细胞。在一个实施方案中，细胞是在体外培养的正常细胞。靶细胞可以是，例如，人类细胞或其它哺乳动物的细胞，特别是非人类灵长动物或啮齿目(小鼠、大鼠、兔和仓鼠)、食肉目(猫和狗)和偶蹄目(牛、猪、绵羊、山羊和马)的哺乳动物。任何细胞类型都可以作为靶。在某些情况下，除了肌细胞之外的任何细胞类型都可以作为靶。
在具体的实施方案中，本发明提供了在可药用载体和/或其它医药用、药剂、载体、佐剂、稀释剂等中含有本发明载体的药物组合物，所述载体包含FVIII或FIX的修饰基因。对于注射来说，载体通常是液体。对于其它给药方法来说，载体可以是固体或液体。对于吸入给药来说，载体将是可吸入的，并优选是固体或液体微粒的形式。对于注射介质来说，优选使用含有可用于注射溶液的添加剂例如稳定剂、盐或盐水和/或缓冲液的水。
示例性的可药用载体包括无菌无热原的水和无菌无热原的磷酸盐缓冲液。生理可接受的载体包括可药用载体。可药用载体不是生物学或其它方面有害的载体，即材料可以施用于对象，而引起的有害生物学效应不会超过材料的有利生物学效应。
药物组合物可以用于，例如，细胞的离体(exvivo)转染，或将病毒载体或细胞直接给对象施用。
含有FVIII或FIX的修饰基因的重组病毒载体优选以生物学有效量施用于细胞。如果病毒载体在体内施用于细胞(例如按照下面的描述将病毒施用于对象)，则病毒载体的生物学有效量是足以导致转基因在靶细胞中转导和表达的量。
用病毒载体转导的细胞优选以“治疗有效量”与药物载体组合施用于对象。本技术领域的专业人员将会认识到，治疗效果不必须是完全的或治愈性的，只要给对象提供某些益处即可。
施用于对象的细胞剂量将根据对象的年龄、病症和物种、细胞类型、细胞所表达的核酸、给药方式等变化。通常，每剂施用至少大约102到108、优选大约103到108个细胞。优选细胞以治疗有效量施用。
本发明的另一方面是以含有修饰基因的载体体内治疗对象的方法。将载体施用于需要它的人类对象或动物，可以通过本技术领域已知的任何施用病毒载体的方法。
示例性的施用方式包括直肠、经粘膜、局部、经皮、吸入、肠胃外(例如静脉内、皮下、真皮内、肌内和关节内)给药等，以及组织或器官直接注射，可选为鞘内、直接肌内、心室内、静脉内、腹膜内、鼻内或眼内注射。注射剂可以常规形式制备，作为液体溶液或悬浮液、适合在注射前溶解或悬浮在液体中的固体形式，或作为乳液。或者，人们可以以局部而不是全身性方式施用病毒，例如储存或缓释制剂。
在其它优选实施方案中，含有修饰的FVIII或FIX基因的本发明载体通过肌内给药，更优选通过肌肉注射或通过局部给药。本文公开的载体可以通过任何适合的方法施用于对象的肺部，但是优选通过施用供对象吸入的含有本发明细小病毒载体的可吸入颗粒气溶胶悬浮剂来给药。可吸入颗粒可以是液体或固体。含有本发明细小病毒载体的液体颗粒的气溶胶可以通过任何适合的方式产生，例如使用本技术领域的专业人员已知的压力驱动的气溶胶喷雾器或超声波喷雾器。参见例如美国专利No.4,501,729。
带有修饰的FVIII或FIX基因的本发明病毒载体的剂量取决于给药方式、待治疗的疾病或病症、个体对象的状况、具体的病毒载体、以及要投送的基因，并且可以以常规方式确定。用于获得治疗效果的示例性剂量是病毒滴度为至少大约105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015转导单位或更高，优选大约108-1013转导单位，更优选为1012转导单位。
修饰的FVIII或FIX基因可以作为有适合在靶细胞中表达的调控元件的DNA分子组分施用给药。修饰的FVIII或FIX基因可以作为病毒质粒、例如rAAV载体的组分给药。病毒粒子可以作为病毒粒子单独给药，或者体内直接投送到门脉系统，或者离体治疗，离体治疗包括将载体病毒粒子体外施用于来自接受治疗的动物的细胞，然后将转导的细胞引回到供体中。
实施例
该啮齿类动物可行性研究的结果，证实了双链载体以及比使用AAV2的人类临床实验中确立的安全剂量低10到100倍的剂量进行的肝脏介导的FIX基因治疗的优越性。
AAV2和BNP2.5感染原代人类骨骼肌
图1显示了使用包含AAV2的不同载体和具有SEQIDNO.17中显示的序列的嵌合病毒载体BNP2.5体外GFP转导1×109vgHPMC530,000个细胞。免疫荧光测试原代人类骨骼肌细胞的vWF/因子IX、平滑肌α-肌动蛋白和横纹肌肌球蛋白以确保纯度(即分别为阴性、阴性和阳性)。只有对细菌、真菌、支原体、HIVDNA以及乙肝和丙肝DNA均为阴性的细胞才被考虑用于载体转导。这些细胞在第二次传代分离后在trans-well组织培养条件中建立起来，以促进横纹肌的良好分化。将60％到80％汇合的细胞单层用从每个细胞MOI为1到100/细胞(总共1×104)的渐增剂量和GFP报告转基因进行感染(图1)。
图2显示了单链vs.双链基因组的体外GFP剂量反应。随时间监测细胞，并将与对照比较的阳性百分率制表。将这些GFP结果与作为阳性对照的在同样条件下转导的原代小鼠骨骼肌细胞进行比较。这里标出的阳性转导(图2)显示出人类骨骼肌细胞允许病毒感染。
从原代人类骨骼肌分泌载体表达的转基因
这些研究的关键是确定人类FIX转基因是否能够从原代人类骨骼肌分泌的能力。使用了两种方法来确定在施用载体后人类FIX转基因是否成功地从靶细胞分泌。ELISA用于确定FIX抗原的总量，活化部分凝血酶时间(APTT)用于确定功能活性。在转化的组织培养细胞中，FIX峰表达被确定出现在载体转导后24小时。每24小时取出细胞培养基并分析FIX，直到转基因的表达达到平台。
对原代小鼠和人类原代骨骼肌细胞系上清液中的表达水平进行了比较(图3)，并测量了转基因的功能活性(图4)。这些阳性结果支持了人类骨骼肌可以分泌载体衍生的FIX转基因的结论。
图4显示了在感染后24小时1×109vg/滴度感染的APTTHPMC体外裂解物。BNP2.5从原代人类骨骼肌表达高出2倍的分泌的FIX水平。
图5显示了hFIX体外HPMC细胞裂解物表达。每24小时使用ELISA评估BNP2.5，检测上述的载体转导后人类骨骼肌的人类FIX转基因的表达增加(图5)。这些阳性结果显示出人类骨骼肌可以分泌载体衍生的FIX转基因，并且在人类和小鼠原代细胞中BNP2.5都比AAV2更有效。
在血友病小鼠模型R333Q中AAV2vs.BNPdsFIX的转基因表达水平和时程
最近开发的B型血友病基因敲除小鼠模型(FIXKO小鼠)再现了人类B型血友病的出血表型，但是因为这些模型不产生FIX，它们不能再现人类显性表型。此外，用表达FIX转基因的载体治疗这些小鼠通常导致发展出抗体，使得不可能进行长期效能研究。最近教堂山(ChapelHill)的北卡罗来纳大学(UniversityofNorthCarolina)开发出的人类FIX小鼠模型R333Q-hFIX，产生了模拟在人类中观察到的突变(错义突变)的模型。这些动物表达mRNA转录物，并在整个发育过程中可检测到的循环人类FIX，但是FIX活性低于1％。选择R333Q突变是因为已经有数据报道了几位患有严重B型血友病的患者表现出该突变。此外，这些CRM+患者具有接近正常的FIX抗原水平，它们的凝血活性通常低于1％。R333Q-hFIX小鼠在形态上与野生型小鼠没有区别。如果不发生受伤，它们存活得很好，并每窝产仔4-8只，性别比例大约1∶1。这些动物表现出与在人类中观察到的相同的出血表型，使得它们成为研究B型血友病缺陷的基因治疗方式的理想模型。此外，人类FIXR333Q基因表达为Ala148Thr二型现象中的丙氨酸形式。因为A-1抗体与148位残基是苏氨酸的FIX结合良好而与丙氨酸同种型结合弱，因此表达苏氨酸同种型的载体容易被检测出。
本研究使用了8-10周龄的动物(图6)，其中试验了三种载体剂量。R333Q小鼠(n＝5/组)和正常亲代动物C57BL6肌内注射表达hFIX的AAV2和BNP2.5ds(图6)。在设计中加入了一组BNP2.5(ss)-FIX-CMV，以评估载体衣壳向性的重要性。按照Jin等，Blood2004中的描述，随时间测量FIX蛋白表达水平和转基因活性水平。在施用载体后每两周的时间点进行测量，共进行6周。APTT分析被用于测定载体投送的转基因的活性，并与对照进行比较。对亚组动物进行了Bethesda抑制分析，指出缺乏抗体形成。
图6显示了ssBNP2.5vs.ssAAV2(图6A(1，2和3))和dsBNP2.5vs.ssAAV2(图6B(1，2和3))注射后6周，R333Q模型的FIX表达体内数据。
测定肝脏转导后BNPFIX的性能
尽管这种可行性研究的最初主要焦点是确定BNP在骨骼肌中的转导以用于FIX表达，但显示AAV2在肝脏中转导的类似的一期临床研究已经产生了争论性结果。AAV2载体在8×1010到4×1011/kg的剂量范围内是安全的，但没有治疗水平的转基因表达。FIX的治疗水平可以在2×1012/kg时获得，但FIX转基因表达是短暂的(4周)。尽管对于FIX蛋白在转导的肝脏中短暂的表达水平还没有得到正式的理解，但推测提示高载体剂量可能激起对转导的肝脏细胞的免疫应答，这支持了下面的结论，即通过使用采用双链载体模板的AAV载体，本发明提供的FIX基因转移的安全剂量(1010或1011剂量)同时也是有效的(10-15％的FIX水平)(图7)。小鼠研究使用BNP在w/C57B16小鼠体内进行。这些实验采用3个组，每组4只动物；测试带有FIX转基因的(ss)AAV2、(ds)BNP-1.1和(ds)BNP-2.5，通过门静脉给药施用于肝脏，并监测FIX水平四周以上。从这些实验得出的数据指出的结论是：(i)(ds)BNP比传统的ssAAV2载体明显更为有效；(ii)肝脏中载体转导和FIX表达的效率明显改善，超过肌肉(培养的原代人类肌原细胞和R333Q体内结果均如此)；以及(iii)这些新的试剂理想地适合用比肌肉介导的FIX基因转移甚至更低的剂量来达到类似的蛋白表达水平。
其它的肝脏数据(优化转基因)
C57B16小鼠中FIX可行性肝脏数据表明，施用到肝脏中的双链基因转移的安全和有效的剂量，在以前在患者中显示为安全但不能表达足够hFIX的载体水平下，是治疗性的。为了进一步详细阐述这一点，我们完成了另外的研究，其中我们开发并使用了转基因密码子优化hFIX。当将最优密码子选择的计算机程序用于“野生型”hFIX基因时，我们在编码序列中观察到了大量稀有密码子(图8)。此外，hFIX基因基因含有低GC含量(图9)，该特点已知是促进mRNA转换。此外，发现了几个负性顺式作用基序，它们在哺乳动物中可能阻碍表达。同样地，合成了其中密码子选择已经被修改成更接近近似于哺乳动物的最优密码子偏倚性的hFIX基因。
根据计算机分析，我们除去了负性顺式作用基序(例如剪接位点，不想要的多聚A信号等)，它们可能对蛋白表达有负面影响。此外，增加了GC含量以延长mRNA的半衰期(图8)。密码子选择按照智人的偏倚性改编，产生了高的密码子适应指数(CAI)值。在这些修改的基础上，我们预测优化基因将允许在哺乳动物中更高和更稳定的表达速率。使用带有优化vs.野生型的hFIX编码序列的AAV2，我们在体外进行了并行的表达分析(图9)。根据这些研究，显然，当以同样的剂量投送时，优化FIX基因比野生型编码序列表达了明显更多的蛋白产物/细胞。
密码子优化后，在C57BL6小鼠中进行了肝脏介导的AAV2临床实验载体与双链和双链+密码子优化转基因盒的体内载体表达的并行比较。在较早的临床实验中显示的选用的剂量是亚治疗性但安全的(4×1011vg/kg)。8-10周龄的动物接受单次门静脉注射(n＝4/血清型/剂量)。当施用临床实验载体时，结果是临床实验的反映，AAV2载体在所有动物体内是亚治疗性的。在同样的载体剂量下，具有双链盒的AAV2在注射后四周表达了治疗水平的hFIX，并将这些水平维持过16周，而具有双链的优化转基因盒的AAV2，从第一周到16周都表达出治疗水平，与临床实验载体相比hFIXng/ml水平高达70倍(图10、11)。
在预先暴露于AAV的动物中对BNP2.5的免疫应答
因为BNP2.5带有大部分AAV2的衣壳骨架以及少量来自AAV1的氨基酸，因此进行了研究以确定该嵌合载体的免疫情况是与亲本供体AAV2相同、介于AAV1和AAV2之间、还是截然不同。如果嵌合载体表现出与亲本载体不同的免疫情况，这可能表明在预先暴露于AAV1或AAV2的患者中施用载体没有限制BNP载体转导的速度。如果数据表明BNP具有与亲本载体相同的免疫情况，那么有可能与文献中确立的研究相同，预先暴露于野生型AAV将对BNP有影响。
这些实验在体外和体内进行。在体外实验中，C57B16动物被预先暴露于AAV1、AAV2或BNP2.5载体。肌内注射后4周，收集血清，将1ml含有10％FBS的DMEM中密度为1×105个细胞/孔的293细胞接种到24孔板中。细胞在37℃培养2-3小时，使其与孔粘附。除去培养基，然后加入1×106个腺病毒d1309粒子，终体积为200μl/孔。将细胞在37℃继续温育1小时，然后清洗两次。将AAV-GFP载体(1×108个粒子)与用PBS连续稀释的人类血清在4℃温育2小时，总体积为25μl(12.5μl连续稀释的血清样品加上12.5μl含有1×108个粒子的AAV/GFP载体)。将混合物加入到细胞中，总体积为200μl，并在37℃温育过夜。在荧光显微镜下对表达GFP的细胞计数。计算无血清样品的抑制百分数作为参比。使用最高稀释度计算中和抗体滴度(图12)，GFP表达细胞的百分率比没有血清的对照低50％。
体内实验使用同样的已经用AAV1、AAV2和BNP2.5致敏的C57B16小鼠来进行。4周后，小鼠用BNP载体肌肉内注射进行激惹，所述载体带有Luc报告基因并带有图14中显示的具有图15提出的序列的载体，并使用实时成像进行分析(图13)。在未接触过抗原的动物中使用同样剂量的BNP作为对照实验。
结果
在施用剂量为1×1011vg/kg的优化载体后6周后，表达水平表明了FIX表达从组织培养到体内的相对翻译。rAAV2提供了基线并测量最低的FIX表达。BNP2.5(ss)和BNP2.5(ds)都显示出了超过rAAV2的增加，其中单链BNP2.5测量到FIX的3-6倍增加，双链BNP2.5导致循环FIX的8-12倍的增加(图6)。这里描述的工作显示出含有FIX基因的BNP双链“BNP(ds)”载体可以转导鼠和牛的横纹肌和肝细胞，导致FIX基因表达和蛋白分泌到外周血中。
开发了修饰的密码子FVIII(hFVIII)序列和旁侧序列(分别为SEQIDNO：12和15，图22和23)，使用计算机程序合成了其中密码子选择已经被修改成更接近近似于哺乳动物的最优密码子偏倚性的hFIX基因，包括了GC含量以及顺式作用基序的优化。
根据计算机分析，除去了负性顺式作用元件(例如剪接位点，不想要的多聚A信号等)，它们可能对蛋白表达有负面影响。此外，增加了GC含量以延长mRNA半衰期。密码子选择按照智人的偏倚性改编，产生了高的密码子适应指数(CAI)值。在这些修改的基础上，修饰的基因可能允许在哺乳动物细胞、特别是人类细胞或人类来源的细胞中更高和更稳定的表达速度。
对于SEQIDNO：10来说，图16的柱形图显示了序列密码子的百分数，它们属于某个质量级别中。在所需表达系统中给定氨基酸的最常用密码子的质量值被设定为100，剩余的密码子相应分级(也参见Sharp，P.M.，Li，W.H.，NucleicAcidsRes.15(3)，1987)。图17显示了急剧增加的密码子质量。图18显示了GC含量从44％(野生型基因SEQIDNO：19)增加到66％用于优化(SEQIDNO.12)。
修饰的基序包括下列：
原核抑制性基序 16 0
多聚A位点 3 0
共有的(隐蔽的)剪接供体位点 2(9) 0
RNA不稳定性基序(ARE) 11 0
对于SEQIDNO：14来说，图19显示了序列密码子的百分数，它们属于某个质量级别。密码子适应指数是0.96。图21显示了密码子质量图。图21显示了GC含量图；GC含量为62％。
野生型基因以高频率使用稀有密码子，GC含量相当低，这便于mRNA的快速转换。优化是成功的：不存在可能对表达有负面影响的负性顺式作用位点(例如剪接位点，多聚A信号等)。GC含量增加以延长mRNA的半衰期并改进载体包装的效率。密码子选择按照智人的偏倚性改编，产生了高CAI*值(0.98)。因此，优化基因将允许在智人或其它哺乳动物细胞中高而稳定的表达速率。
为了证实这种增加的表达速率，在C57BL6小鼠中进行了肝脏介导的AAV2临床实验载体vs.双链和双链+密码子修改的转基因盒(包括SEQIDNO：12或15)的载体表达的并行比较。选择的剂量是已经显示出是亚治疗但安全的剂量(4×1011vg/kg)。8-10周龄的动物将接受单次门静脉注射(n＝4/血清型/剂量)。
这些实验在体外和体内进行。在体外实验中，C57B16动物被预先暴露于AAV1、AAV2、BNP2.5载体、或任何其它适合的细小病毒载体。肌内注射后4周，收集血清，将1ml含有10％FBS的DMEM中密度为1×105个细胞/孔的293细胞接种到24孔板中。细胞在37℃培养2-3小时，使其与孔附着。除去培养基，然后加入1×106个腺病毒d1309粒子，终体积为200μl/孔。将细胞在37℃继续温育1小时，然后清洗两次。将AAV-GFP载体(1×108个粒子)与用PBS连续稀释的人类血清在4℃温育2小时，总体积为25μl(12.5μl连续稀释的血清样品加上12.5μl含有1×108个粒子的AAV/GFP载体)。将混合物加入到细胞中，总体积为200μl，并在37℃温育过夜。在荧光显微镜下对GFP表达细胞计数。计算无血清样品的抑制百分数作为对照。使用最高稀释度计算中和性抗体滴度，其中GFP表达细胞的百分率比没有血清的对照低50％。
体内实验使用已经用AAV1、AAV2、BNP2.5或任何其它适合的细小病毒载体致敏的同样的C57B16小鼠来进行。4周后，将小鼠用带有Luc报告基因的BNP载体肌内注射进行激惹，并使用实时成像进行分析。在未接触过抗原的动物中使用同样剂量的BNP作为对照实验。
所有在本文中提到的出版物、专利申请、专利和其它参考文献以其全文引为参考。
序列表
<110>阿斯克肋匹奥生物制药公司
<120>用于基因治疗的修饰的因子VIII和因子IX基因和载体
<130>SCT085565-00
<150>60/760,465
<151>2006-06-19
<150>60/824,338
<151>2006-09-01
<150>60/847,337
<151>2006-09-26
<160>19
<170>PatentInversion3.3
<210>1
<211>2453
<212>DNA
<213>ArtificialSequence
<220>
<223>Syntheticconstruct
<400>1
ctggcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgacctt60
tggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggaattcgagctcga120
gcttgggctgcaggtcgagggcactgggaggatgttgagtaagatggaaaactactgatg180
acccttgcagagacagagtattaggacatgtttgaacaggggccgggcgatcagcaggta240
gctctagaggatccccgtctgtctgcacatttcgtagagcgagtgttccgatactctaat300
ctccctaggcaaggttcatatttgtgtaggttacttattctccttttgttgactaagtca360
ataatcagaatcagcaggtttggagtcagcttggcagggatcagcagcctgggttggaag420
gagggggtataaaagccccttcaccaggagaagccgtcacacagatccacaagctcctga480
caggaagctctaggtgactctcttaaggtagccttgcagaagttggtcgtgaggcactgg540
ctagccctaaggtaagttggcgccgtttaagggatggttggttggtggggtattaatgtt600
taattaccttttttacaggcctgaagatctccaccatgcagcgcgtgaacatgatcatgg660
ccgagagccctggcctgatcaccatctgcctgctgggctacctgctgagcgccgagtgca720
ccgtgttcctggaccacgagaacgccaacaagatcctgaaccggcccaagagatacaaca780
gcggcaagctggaggagttcgtgcagggcaacctggagagggagtgcatggaggagaagt840
gcagcttcgaggaggccagggaagtgttcgagaacaccgagcggaccaccgagttctgga900
agcagtacgtggacggcgaccagtgcgagagcaacccttgcctgaacggcggcagctgca960
aggacgacatcaacagctacgagtgctggtgccctttcggcttcgagggcaagaactgcg1020
agctggacgtgacctgcaacatcaagaacggccgctgcgagcagttctgcaagaacagcg1080
ccgacaacaaagtggtgtgtagctgcaccgagggctacagactggccgagaaccagaaga1140
gctgcgagcccgccgtgcccttcccctgcggcagagtgagcgtgtcccagaccagcaagc1200
tgaccagagccgagaccgtgttccccgacgtggactacgtgaatagcaccgaggccgaga1260
ccatcctggacaacatcacccagagcacccagtccttcaacgacttcaccagagttgtgg1320
gcggcgaggacgccaagcccggccagttcccctggcaggtggtgctgaacggcaaagtgg1380
atgccttctgcggcggcagcatcgtgaacgagaagtggatcgtgacagccgcccactgcg1440
tggagaccggcgtgaagatcaccgtggtggccggcgaacacaatatcgaggagaccgagc1500
acaccgagcagaagcggaacgtcatccggattatcccccaccacaactacaacgccgcca1560
tcaacaagtacaaccacgacatcgccctgctggagctggacgagcctctggtgctgaata1620
gctacgtgacccccatctgcatcgccgacaaggagtacaccaacatcttcctgaagttcg1680
gcagcggctacgtgtccggctggggcagagtgttccacaagggcagaagcgccctggtgc1740
tgcagtacctgagagtgcccctggtggacagagccacctgcctgaggagcaccaagttca1800
ccatctacaacaacatgttctgcgccggcttccacgagggcggcagagacagctgccagg1860
gcgacagcggcggaccccacgtgaccgaagtggagggcaccagcttcctgaccggcatca1920
tcagctggggcgaggagtgcgccatgaagggcaagtacggcatctacaccaaagtgagcc1980
ggtacgtgaactggatcaaggagaaaaccaagctgacctgatgagcatgcctagagctcg2040
ctgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgt2100
gccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaat2160
tgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacag2220
caagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggaaagcttcagctagagcat2280
ggctacgtagataagtagcatggcgggttaatcattaactacaaggaacccctagtgatg2340
gagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtc2400
gcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcag2453
<210>2
<211>116
<212>DNA
<213>ArtificialSequence
<220>
<223>Syntheticconstruct
<400>2
ctggcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgacctt60
tggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggaattcgagc116
<210>3
<211>373
<212>DNA
<213>ArtificialSequence
<220>
<223>Syntheticconstruct
<400>3
tcgagcttgggctgcaggtcgagggcactgggaggatgttgagtaagatggaaaactact60
gatgacccttgcagagacagagtattaggacatgtttgaacaggggccgggcgatcagca120
ggtagctctagaggatccccgtctgtctgcacatttcgtagagcgagtgttccgatactc180
taatctccctaggcaaggttcatatttgtgtaggttacttattctccttttgttgactaa240
gtcaataatcagaatcagcaggtttggagtcagcttggcagggatcagcagcctgggttg300
gaaggagggggtataaaagccccttcaccaggagaagccgtcacacagatccacaagctc360
ctgacaggaagct373
<210>4
<211>51
<212>DNA
<213>ArtificialSequence
<220>
<223>SyntheticConstruct
<400>4
ctaggtgactctcttaaggtagccttgcagaagttggtcgtgaggcactgg51
<210>5
<211>86
<212>DNA
<213>ArtificialSequence
<220>
<223>Syntheticconstruct
<400>5
ctagccctaaggtaagttggcgccgtttaagggatggttggttggtggggtattaatgtt60
taattaccttttttacaggcctgaag86
<210>6
<211>9
<212>DNA
<213>ArtificialSequence
<220>
<223>SyntheticConstruct
<400>6
atctccacc9
<210>7
<211>2024
<212>DNA
<213>ArtificialSequence
<220>
<223>SyntheticConstruct
<400>7
ctggcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgacctt60
tggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggaattcgagctcga120
gcttgggctgcaggtcgagggcactgggaggatgttgagtaagatggaaaactactgatg180
acccttgcagagacagagtattaggacatgtttgaacaggggccgggcgatcagcaggta240
gctctagaggatccccgtctgtctgcacatttcgtagagcgagtgttccgatactctaat300
ctccctaggcaaggttcatatttgtgtaggttacttattctccttttgttgactaagtca360
ataatcagaatcagcaggtttggagtcagcttggcagggatcagcagcctgggttggaag420
gagggggtataaaagccccttcaccaggagaagccgtcacacagatccacaagctcctga480
caggaagctctaggtgactctcttaaggtagccttgcagaagttggtcgtgaggcactgg540
ctagccctaaggtaagttggcgccgtttaagggatggttggttggtggggtattaatgtt600
taattaccttttttacaggcctgaagatctccaccatgcagcgcgtgaacatgatcatgg660
ccgagagccctggcctgatcaccatctgcctgctgggctacctgctgagcgccgagtgca720
ccgtgttcctggaccacgagaacgccaacaagatcctgaaccggcccaagagatacaaca780
gcggcaagctggaggagttcgtgcagggcaacctggagagggagtgcatggaggagaagt840
gcagcttcgaggaggccagggaagtgttcgagaacaccgagcggaccaccgagttctgga900
agcagtacgtggacggcgaccagtgcgagagcaacccttgcctgaacggcggcagctgca960
aggacgacatcaacagctacgagtgctggtgccctttcggcttcgagggcaagaactgcg1020
agctggacgtgacctgcaacatcaagaacggccgctgcgagcagttctgcaagaacagcg1080
ccgacaacaaagtggtgtgtagctgcaccgagggctacagactggccgagaaccagaaga1140
gctgcgagcccgccgtgcccttcccctgcggcagagtgagcgtgtcccagaccagcaagc1200
tgaccagagccgagaccgtgttccccgacgtggactacgtgaatagcaccgaggccgaga1260
ccatcctggacaacatcacccagagcacccagtccttcaacgacttcaccagagttgtgg1320
gcggcgaggacgccaagcccggccagttcccctggcaggtggtgctgaacggcaaagtgg1380
atgccttctgcggcggcagcatcgtgaacgagaagtggatcgtgacagccgcccactgcg1440
tggagaccggcgtgaagatcaccgtggtggccggcgaacacaatatcgaggagaccgagc1500
acaccgagcagaagcggaacgtcatccggattatcccccaccacaactacaacgccgcca1560
tcaacaagtacaaccacgacatcgccctgctggagctggacgagcctctggtgctgaata1620
gctacgtgacccccatctgcatcgccgacaaggagtacaccaacatcttcctgaagttcg1680
gcagcggctacgtgtccggctggggcagagtgttccacaagggcagaagcgccctggtgc1740
tgcagtacctgagagtgcccctggtggacagagccacctgcctgaggagcaccaagttca1800
ccatctacaacaacatgttctgcgccggcttccacgagggcggcagagacagctgccagg1860
gcgacagcggcggaccccacgtgaccgaagtggagggcaccagcttcctgaccggcatca1920
tcagctggggcgaggagtgcgccatgaagggcaagtacggcatctacaccaaagtgagcc1980
ggtacgtgaactggatcaaggagaaaaccaagctgacctgatga2024
<210>8
<211>239
<212>DNA
<213>ArtificialSequence
<220>
<223>SyntheticConstruct
<400>8
gcatgcctagagctcgctgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttg60
tttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcct120
aataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtg180
gggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggaa239
<210>9
<211>190
<212>DNA
<213>ArtificialSequence
<220>
<223>SyntheticConstruct
<400>9
agcttcagctagagcatggctacgtagataagtagcatggcgggttaatcattaactaca60
aggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgagg120
ccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagc180
gagcgcgcag190
<210>10
<211>4428
<212>DNA
<213>ArtificialSequence
<220>
<223>SyntheticConstruct
<400>10
ggtaccgccaccatgcagatcgagctgtccacatgcttttttctgtgcctgctgcggttc60
tgcttcagcgccacccggcggtactacctgggcgccgtggagctgtcctgggactacatg120
cagagcgacctgggcgagctgcccgtggacgcccggttcccccccagagtgcccaagagc180
ttccccttcaacaccagcgtggtgtacaagaaaaccctgttcgtggagttcaccgtgcac240
ctgttcaacatcgccaagcccaggcccccctggatgggcctgctgggccccaccatccag300
gccgaggtgtacgacaccgtggtgatcaccctgaagaacatggccagccaccccgtgagc360
ctgcacgccgtgggcgtgagctactggaaggcctccgagggcgccgagtacgacgaccag420
accagccagcgggagaaagaggacgacaaagtctttcctggcggcagccacacctacgtg480
tggcaggtcctgaaagaaaacggccccatggcctccgaccccctgtgcctgacctacagc540
tacctgagccacgtggacctggtgaaggacctgaacagcgggctgattggggccctgctg600
gtctgccgggagggcagcctggccaaagagaaaacccagaccctgcacaagttcatcctg660
ctgttcgccgtgttcgacgagggcaagagctggcacagcgagaccaagaacagcctgatg720
caggaccgggacgccgcctctgccagagcctggcccaagatgcacaccgtgaacggctac780
gtgaacagaagcctgcccggcctgattggctgccaccggaagagcgtgtactggcacgtg840
atcggcatgggcaccacacccgaggtgcacagcatctttctggaagggcacacctttctg900
gtgcggaaccaccggcaggccagcctggaaatcagccctatcaccttcctgaccgcccag960
acactgctgatggacctgggccagttcctgctgttttgccacatcagctctcaccagcac1020
gacggcatggaagcctacgtgaaggtggactcctgccccgaggaaccccagctgcggatg1080
aagaacaacgaggaagccgaggactacgacgacgacctgaccgacagcgagatggacgtg1140
gtgcggttcgacgacgacaacagccccagcttcatccagatcagaagcgtggccaagaag1200
caccccaagacctgggtgcactacatcgccgccgaggaagaggactgggactacgccccc1260
ctggtgctggcccccgacgacagaagctacaagagccagtacctgaacaatggcccccag1320
cggatcggccggaagtacaagaaagtgcggttcatggcctacaccgacgagaccttcaag1380
acccgggaggccatccagcacgagagcggcatcctgggccccctgctgtacggcgaagtg1440
ggcgacacactgctgatcatcttcaagaaccaggccagccggccctacaacatctacccc1500
cacggcatcaccgacgtgcggcccctgtacagcaggcggctgcccaagggcgtgaagcac1560
ctgaaggacttccccatcctgcccggcgagatcttcaagtacaagtggaccgtgaccgtg1620
gaggacggccccaccaagagcgaccccagatgcctgacccggtactacagcagcttcgtg1680
aacatggaacgggacctggcctccgggctgatcggacctctgctgatctgctacaaagaa1740
agcgtggaccagcggggcaaccagatcatgagcgacaagcggaacgtgatcctgttcagc1800
gtgttcgatgagaaccggtcctggtatctgaccgagaacatccagcggtttctgcccaac1860
cctgccggggtgcagctggaagatcccgagttccaggccagcaacatcatgcactccatc1920
aatggctacgtgttcgacagcctgcagctgtccgtgtgtctgcacgaggtggcctactgg1980
tacatcctgagcatcggcgcccagaccgacttcctgagcgtgttcttcagcggctacacc2040
ttcaagcacaagatggtgtacgaggacaccctgaccctgttccctttcagcggcgagacc2100
gtgttcatgagcatggaaaaccccggcctgtggatcctgggctgccacaacagcgacttc2160
cggaaccggggcatgaccgccctgctgaaggtgtccagctgcgacaagaacaccggcgac2220
tactacgaggacagctacgaggatatcagcgcctacctgctgtccaagaacaacgccatc2280
gagcccagaagcttcagccagaacagccggcaccccagcacccggcagaagcagttcaac2340
gccaccccccctgtgctgaagcggcaccagagagagatcacccggaccaccctgcagtcc2400
gaccaggaagagatcgattacgacgacaccatcagcgtggagatgaaaaaagaagatttc2460
gacatctacgacgaggacgagaaccagagcccccggtccttccagaagaaaacccggcac2520
tactttatcgccgccgtggagcggctgtgggactacggcatgagcagcagcccccacgtg2580
ctgcggaaccgggcccagagcggcagcgtgccccagttcaagaaagtggtgttccaggaa2640
ttcaccgacggcagcttcacccagcccctgtaccggggcgagctgaacgagcacctgggg2700
ctgctggggccctacatcagggccgaagtggaggacaacatcatggtgaccttccggaat2760
caggccagcagaccctactccttctacagcagcctgatcagctacgaagaggaccagcgg2820
cagggcgctgaaccccggaagaacttcgtgaagcccaatgagaccaagacctacttctgg2880
aaagtgcagcaccacatggcccccaccaaggacgagttcgactgcaaggcctgggcctac2940
ttcagcgacgtggatctggaaaaggacgtgcactctggactgattggccctctgctggtg3000
tgccacaccaacaccctgaaccccgcccacggccggcaggtgaccgtgcaggaattcgcc3060
ctgttcttcaccatcttcgacgagaccaagtcctggtacttcaccgagaatatggaacgg3120
aactgcagagccccctgcaacatccagatggaagatcctaccttcaaagagaactaccgg3180
ttccacgccatcaacggctacatcatggacaccctgcctggcctggtgatggcccaggac3240
cagaggatccggtggtatctgctgtccatgggcagcaacgagaatatccacagcatccac3300
ttcagcggccacgtgttcaccgtgaggaagaaagaagagtacaagatggccctgtacaac3360
ctgtaccccggcgtgttcgagaccgtggagatgctgcccagcaaggccggcatctggcgg3420
gtggagtgtctgatcggcgagcacctgcatgccgggatgagcaccctgtttctggtgtac3480
agcaacaagtgccagacccccctgggcatggccagcggccacatccgggacttccagatc3540
accgcctccggccagtacggccagtgggcccccaagctggcccggctgcactacagcggc3600
agcatcaacgcctggtccaccaaagagcccttcagctggatcaaggtggacctgctggcc3660
cctatgatcatccacggcattaagacccagggcgccaggcagaagttcagcagcctgtac3720
atcagccagttcatcatcatgtacagcctggacggcaagaagtggcagacctaccggggc3780
aacagcaccggcaccctgatggtgttcttcggcaacgtggacagcagcggcatcaagcac3840
aacatcttcaacccccccatcatcgcccggtacatccggctgcaccccacccactacagc3900
atcagatccaccctgcggatggaactgatgggctgcgacctgaactcctgcagcatgcct3960
ctgggcatggaaagcaaggccatcagcgacgcccagatcacagccagcagctacttcacc4020
aacatgttcgccacctggtccccctccaaggccaggctgcacctgcagggccggtccaac4080
gcctggcggcctcaggtgaacaaccccaaagaatggctgcaggtggactttcagaaaacc4140
atgaaggtgaccggcgtgaccacccagggcgtgaaaagcctgctgaccagcatgtacgtg4200
aaagagtttctgatcagcagcagccaggacggccaccagtggaccctgttctttcagaac4260
ggcaaggtgaaagtgttccagggcaaccaggactccttcacccccgtggtgaactccctg4320
gacccccccctgctgacccgctacctgcggatccacccccagtcttgggtgcaccagatc4380
gccctgaggatggaagtgctgggatgtgaggcccaggatctgtactga4428
<210>11
<211>12
<212>DNA
<213>ArtificialSequence
<220>
<223>SyntheticConstruct
<400>11
ggtaccgccacc12
<210>12
<211>4428
<212>DNA
<213>ArtificialSequence
<220>
<223>Syntheticconstruct
<400>12
ggtaccgccaccatgcagatcgagctgtccacatgcttttttctgtgcctgctgcggttc60
tgcttcagcgccacccggcggtactacctgggcgccgtggagctgtcctgggactacatg120
cagagcgacctgggcgagctgcccgtggacgcccggttcccccccagagtgcccaagagc180
ttccccttcaacaccagcgtggtgtacaagaaaaccctgttcgtggagttcaccgtgcac240
ctgttcaacatcgccaagcccaggcccccctggatgggcctgctgggccccaccatccag300
gccgaggtgtacgacaccgtggtgatcaccctgaagaacatggccagccaccccgtgagc360
ctgcacgccgtgggcgtgagctactggaaggcctccgagggcgccgagtacgacgaccag420
accagccagcgggagaaagaggacgacaaagtctttcctggcggcagccacacctacgtg480
tggcaggtcctgaaagaaaacggccccatggcctccgaccccctgtgcctgacctacagc540
tacctgagccacgtggacctggtgaaggacctgaacagcgggctgattggggccctgctg600
gtctgccgggagggcagcctggccaaagagaaaacccagaccctgcacaagttcatcctg660
ctgttcgccgtgttcgacgagggcaagagctggcacagcgagaccaagaacagcctgatg720
caggaccgggacgccgcctctgccagagcctggcccaagatgcacaccgtgaacggctac780
gtgaacagaagcctgcccggcctgattggctgccaccggaagagcgtgtactggcacgtg840
atcggcatgggcaccacacccgaggtgcacagcatctttctggaagggcacacctttctg900
gtgcggaaccaccggcaggccagcctggaaatcagccctatcaccttcctgaccgcccag960
acactgctgatggacctgggccagttcctgctgttttgccacatcagctctcaccagcac1020
gacggcatggaagcctacgtgaaggtggactcctgccccgaggaaccccagctgcggatg1080
aagaacaacgaggaagccgaggactacgacgacgacctgaccgacagcgagatggacgtg1140
gtgcggttcgacgacgacaacagccccagcttcatccagatcagaagcgtggccaagaag1200
caccccaagacctgggtgcactacatcgccgccgaggaagaggactgggactacgccccc1260
ctggtgctggcccccgacgacagaagctacaagagccagtacctgaacaatggcccccag1320
cggatcggccggaagtacaagaaagtgcggttcatggcctacaccgacgagaccttcaag1380
acccgggaggccatccagcacgagagcggcatcctgggccccctgctgtacggcgaagtg1440
ggcgacacactgctgatcatcttcaagaaccaggccagccggccctacaacatctacccc1500
cacggcatcaccgacgtgcggcccctgtacagcaggcggctgcccaagggcgtgaagcac1560
ctgaaggacttccccatcctgcccggcgagatcttcaagtacaagtggaccgtgaccgtg1620
gaggacggccccaccaagagcgaccccagatgcctgacccggtactacagcagcttcgtg1680
aacatggaacgggacctggcctccgggctgatcggacctctgctgatctgctacaaagaa1740
agcgtggaccagcggggcaaccagatcatgagcgacaagcggaacgtgatcctgttcagc1800
gtgttcgatgagaaccggtcctggtatctgaccgagaacatccagcggtttctgcccaac1860
cctgccggggtgcagctggaagatcccgagttccaggccagcaacatcatgcactccatc1920
aatggctacgtgttcgacagcctgcagctgtccgtgtgtctgcacgaggtggcctactgg1980
tacatcctgagcatcggcgcccagaccgacttcctgagcgtgttcttcagcggctacacc2040
ttcaagcacaagatggtgtacgaggacaccctgaccctgttccctttcagcggcgagacc2100
gtgttcatgagcatggaaaaccccggcctgtggatcctgggctgccacaacagcgacttc2160
cggaaccggggcatgaccgccctgctgaaggtgtccagctgcgacaagaacaccggcgac2220
tactacgaggacagctacgaggatatcagcgcctacctgctgtccaagaacaacgccatc2280
gagcccagaagcttcagccagaacagccggcaccccagcacccggcagaagcagttcaac2340
gccaccccccctgtgctgaagcggcaccagagagagatcacccggaccaccctgcagtcc2400
gaccaggaagagatcgattacgacgacaccatcagcgtggagatgaaaaaagaagatttc2460
gacatctacgacgaggacgagaaccagagcccccggtccttccagaagaaaacccggcac2520
tactttatcgccgccgtggagcggctgtgggactacggcatgagcagcagcccccacgtg2580
ctgcggaaccgggcccagagcggcagcgtgccccagttcaagaaagtggtgttccaggaa2640
ttcaccgacggcagcttcacccagcccctgtaccggggcgagctgaacgagcacctgggg2700
ctgctggggccctacatcagggccgaagtggaggacaacatcatggtgaccttccggaat2760
caggccagcagaccctactccttctacagcagcctgatcagctacgaagaggaccagcgg2820
cagggcgctgaaccccggaagaacttcgtgaagcccaatgagaccaagacctacttctgg2880
aaagtgcagcaccacatggcccccaccaaggacgagttcgactgcaaggcctgggcctac2940
ttcagcgacgtggatctggaaaaggacgtgcactctggactgattggccctctgctggtg3000
tgccacaccaacaccctgaaccccgcccacggccggcaggtgaccgtgcaggaattcgcc3060
ctgttcttcaccatcttcgacgagaccaagtcctggtacttcaccgagaatatggaacgg3120
aactgcagagccccctgcaacatccagatggaagatcctaccttcaaagagaactaccgg3180
ttccacgccatcaacggctacatcatggacaccctgcctggcctggtgatggcccaggac3240
cagaggatccggtggtatctgctgtccatgggcagcaacgagaatatccacagcatccac3300
ttcagcggccacgtgttcaccgtgaggaagaaagaagagtacaagatggccctgtacaac3360
ctgtaccccggcgtgttcgagaccgtggagatgctgcccagcaaggccggcatctggcgg3420
gtggagtgtctgatcggcgagcacctgcatgccgggatgagcaccctgtttctggtgtac3480
agcaacaagtgccagacccccctgggcatggccagcggccacatccgggacttccagatc3540
accgcctccggccagtacggccagtgggcccccaagctggcccggctgcactacagcggc3600
agcatcaacgcctggtccaccaaagagcccttcagctggatcaaggtggacctgctggcc3660
cctatgatcatccacggcattaagacccagggcgccaggcagaagttcagcagcctgtac3720
atcagccagttcatcatcatgtacagcctggacggcaagaagtggcagacctaccggggc3780
aacagcaccggcaccctgatggtgttcttcggcaacgtggacagcagcggcatcaagcac3840
aacatcttcaacccccccatcatcgcccggtacatccggctgcaccccacccactacagc3900
atcagatccaccctgcggatggaactgatgggctgcgacctgaactcctgcagcatgcct3960
ctgggcatggaaagcaaggccatcagcgacgcccagatcacagccagcagctacttcacc4020
aacatgttcgccacctggtccccctccaaggccaggctgcacctgcagggccggtccaac4080
gcctggcggcctcaggtgaacaaccccaaagaatggctgcaggtggactttcagaaaacc4140
atgaaggtgaccggcgtgaccacccagggcgtgaaaagcctgctgaccagcatgtacgtg4200
aaagagtttctgatcagcagcagccaggacggccaccagtggaccctgttctttcagaac4260
ggcaaggtgaaagtgttccagggcaaccaggactccttcacccccgtggtgaactccctg4320
gacccccccctgctgacccgctacctgcggatccacccccagtcttgggtgcaccagatc4380
gccctgaggatggaagtgctgggatgtgaggcccaggatctgtactga4428
<210>13
<211>240
<212>DNA
<213>ArtificialSequence
<220>
<223>Syntheticconstruct
<400>13
ctcgaggggtggccactgcagcacctgccactgccgtcacctctccctcctcagctccag60
ggcagtgtccctccctggcttgccttctacctttgtgctaaatcctagcagacactgcct120
tgaagcctcctgaattaactatcatcagtcctgcatttctttggtggggggccaggaggg180
tgcatccaatttaacttaactcttacctattttctgcaggggatctcagtcgacgagctc240
<210>14
<211>4656
<212>DNA
<213>ArtificialSequence
<220>
<223>Syntheticconstruct
<400>14
atgcagatcgagctgagtacctgctttttcctctgcctgctgcggttctgcttcagcgcc60
acccggcggtactacctgggcgccgtggagctgagttgggactacatgcagagcgacctg120
ggcgagctgcccgtggacgcccggttcccccctcgggtgcccaagagcttccccttcaac180
accagcgtggtgtacaagaaaaccctgttcgtggagttcaccgtgcacctgttcaacatc240
gccaagcccaggcccccctggatgggcctgctgggccccaccatccaggccgaggtgtac300
gacaccgtggtgatcaccctgaagaacatggccagccaccccgtgagcctgcacgccgtg360
ggcgtgagctactggaaggccagtgagggcgccgagtacgacgaccagaccagccagcgg420
gagaaagaggacgacaaggttttccctggcggcagccacacctacgtgtggcaggtcctg480
aaagaaaacggccccatggcctccgaccccctgtgcctgacctacagctacctgagccac540
gtggacctggtcaaggacctgaacagcggcctgatcggcgcgctgctggtctgccgggag600
ggcagcctggccaaagagaaaacccagaccctgcacaagttcatcctgctgttcgctgtg660
ttcgacgagggcaagagctggcacagcgagaccaagaacagcctgatgcaggaccgggac720
gccgccagcgctcgcgcctggcccaagatgcacaccgtgaacggatacgtgaaccggtcc780
ctgcccgggctgatcggctgccaccggaagagcgtgtactggcacgtgatcggcatgggc840
accacgcccgaggtgcacagcatcttcctcgagggccacaccttcctcgtgcggaaccac900
cggcaggccagcctcgagatcagccccatcaccttcctcaccgcccagacgctgctgatg960
gacctgggccagttcctgctcttctgccacatcagctcgcaccagcacgacggcatggaa1020
gcctacgtgaaggtggacagttgccccgaggaaccccagctgcggatgaagaacaacgag1080
gaagccgaggattacgacgacgacctgaccgacagcgagatggacgtggtgcggttcgac1140
gacgacaacagccccagcttcatccagatccggtccgtggccaagaagcaccccaagacc1200
tgggtgcactacatcgccgccgaggaagaggactgggactacgcccccctggtgctggcc1260
cccgacgaccggtcctacaagagccagtacctgaacaacgggccccagcggatcggccgg1320
aagtacaagaaagtgcggttcatggcctacaccgacgagaccttcaagacccgggaggcc1380
atccagcacgagagcggcatcctgggccccctgctgtacggcgaggtcggcgacaccctg1440
ctgatcatcttcaagaaccaggccagccggccctacaacatctacccccacggcatcacc1500
gacgtgcggcccctgtacagcaggcggctgcccaagggcgtgaagcacctgaaggacttc1560
cccatcctgcccggcgagatcttcaagtacaagtggaccgtgaccgtggaggacggcccc1620
accaagagcgacccccgctgcctcacccggtactacagcagcttcgtgaacatggagcgg1680
gacctggcctccggcctcatcgggcccctgctcatctgctacaaagaaagcgtggaccag1740
cggggcaaccagatcatgagcgacaagcggaacgtgatcctgttctcggtgttcgacgag1800
aaccggagttggtatctgacggagaacatccagcggttcctccccaaccctgccggcgtg1860
cagctcgaggaccccgagttccaggccagcaacatcatgcactccatcaatggctacgtg1920
ttcgacagcctgcagctgtccgtgtgcctccacgaggtggcctactggtacatcctgagc1980
atcggcgcccagaccgacttcctgagcgtgttcttcagcggctacaccttcaagcacaag2040
atggtgtacgaggacaccctgaccctgttcccgttcagcggcgagaccgtgttcatgagc2100
atggaaaaccccggcctgtggatcctgggctgccacaacagcgacttccggaaccggggc2160
atgaccgccctgctgaaggtgtccagctgcgacaagaacaccggcgactactacgaggac2220
agctacgaggacatcagcgcctacctgctgtccaagaacaacgccatcgagccccggtcc2280
ttcagccagaacagccggcaccccagcacccggcagaagcagttcaacgccaccccccct2340
gtgctgaagcggcaccagcgcgagatcacccggaccaccctgcagtccgaccaggaagag2400
atcgactacgacgacaccatcagcgtggagatgaagaaagaggacttcgacatctacgac2460
gaggacgagaaccagagcccccgcagcttccagaagaaaacccggcactacttcatcgcc2520
gcggtggagcggctgtgggactacggcatgagcagcagcccccacgtgctgcggaaccgg2580
gcccagagcggcagcgtgccccagttcaagaaagtggtgttecaggaattcaccgacggc2640
agcttcacccagcccctgtaccggggcgagctgaacgagcacctggggctgctggggccc2700
tacatccgcgcggaggtggaggacaacatcatggtgaccttccggaaccaggcctcccgc2760
ccctactccttctacagcagcctgatcagctacgaagaggaccagcggcagggcgcggag2820
ccccggaagaacttcgtgaagcccaacgagaccaagacctacttctggaaggtgcagcac2880
cacatggcccccaccaaggacgagttcgactgcaaggcctgggcctacttcagcgacgtg2940
gacctcgagaaggacgtgcactccgggctcatcggcccgctcctcgtgtgccacaccaac3000
accctgaaccccgcccacggccggcaggtgaccgtgcaggaattcgccctgttcttcacc3060
atcttcgacgagaccaagtcgtggtacttcaccgagaacatggaacgcaactgcagggcc3120
ccctgcaacatccagatggaagatcccaccttcaaagagaactaccggttccacgccatc3180
aacggctacatcatggacaccctgcccggcctggtgatggcccaggaccagcgcatccgg3240
tggtatctgctgtccatgggcagcaacgagaacatccacagcatccacttcagcggccac3300
gtgttcaccgtccggaagaaagaagagtacaagatggccctgtacaacctgtaccccggc3360
gtgttcgagaccgtggagatgctgcccagcaaggccggcatctggcgggtggagtgcctg3420
atcggggagcacctccacgccggcatgtccaccctgttcctcgtgtacagcaacaagtgc3480
cagacccccctgggcatggccagcggccacatccgggacttccagatcaccgcctccggc3540
cagtacggccagtgggcccccaagctggcccggctgcactacagcggcagcatcaacgcc3600
tggtccaccaaagagcccttcagctggatcaaggtggacctgctcgcccccatgatcatc3660
cacgggatcaagacccagggcgccaggcagaagttcagcagcctgtacatcagccagttc3720
atcatcatgtacagcctggacggcaagaagtggcagacctaccggggcaacagcaccggc3780
accctgatggtgttcttcggcaacgtggacagcagcggcatcaagcacaacatcttcaac3840
ccccccatcatcgcccggtacatccggctgcaccccacccactacagcatccggtccacc3900
ctgcggatggaactgatgggctgcgacctgaactcctgcagcatgcccctggggatggaa3960
agcaaggccatcagcgacgcccagatcacggccagcagctacttcaccaacatgttcgcc4020
acctggtccccctccaaggcccgcctgcacctgcagggccggtccaacgcctggcggcct4080
caggtcaacaaccccaaagagtggctgcaggttgacttccagaaaaccatgaaggtgacc4140
ggcgtgaccacccagggggtgaagagcctgctgaccagcatgtacgtgaaagagttcctc4200
atcagcagcagccaggacggccaccagtggacgctgttcttccagaacggcaaggtcaag4260
gtgttccagggcaaccaggacagtttcacgcccgtggtgaactccctggacccccccctg4320
ctgacccgctacctgcggatccacccccagagctgggtccaccagatcgccctgcgcatg4380
gaagtcctcggctgcgaggcgcaggacctgtactgactcgaggggtggccactgcagcac4440
ctgccactgccgtcacctctccctcctcagctccagggcagtgtccctccctggcttgcc4500
ttctacctttgtgctaaatcctagcagacactgccttgaagcctcctgaattaactatca4560
tcagtcctgcatttctttggtggggggccaggagggtgcatccaatttaacttaactctt4620
acctattttctgcaggggatctcagtcgacgagctc4656
<210>15
<211>4416
<212>DNA
<213>ArtificialSequence
<220>
<223>Syntheticconstruct
<400>15
atgcagatcgagctgagtacctgctttttcctctgcctgctgcggttctgcttcagcgcc60
acccggcggtactacctgggcgccgtggagctgagttgggactacatgcagagcgacctg120
ggcgagctgcccgtggacgcccggttcccccctcgggtgcccaagagcttccccttcaac180
accagcgtggtgtacaagaaaaccctgttcgtggagttcaccgtgcacctgttcaacatc240
gccaagcccaggcccccctggatgggcctgctgggccccaccatccaggccgaggtgtac300
gacaccgtggtgatcaccctgaagaacatggccagccaccccgtgagcctgcacgccgtg360
ggcgtgagctactggaaggccagtgagggcgccgagtacgacgaccagaccagccagcgg420
gagaaagaggacgacaaggttttccctggcggcagccacacctacgtgtggcaggtcctg480
aaagaaaacggccccatggcctccgaccccctgtgcctgacctacagctacctgagccac540
gtggacctggtcaaggacctgaacagcggcctgatcggcgcgctgctggtctgccgggag600
ggcagcctggccaaagagaaaacccagaccctgcacaagttcatcctgctgttcgctgtg660
ttcgacgagggcaagagctggcacagcgagaccaagaacagcctgatgcaggaccgggac720
gccgccagcgctcgcgcctggcccaagatgcacaccgtgaacggatacgtgaaccggtcc780
ctgcccgggctgatcggctgccaccggaagagcgtgtactggcacgtgatcggcatgggc840
accacgcccgaggtgcacagcatcttcctcgagggccacaccttcctcgtgcggaaccac900
cggcaggccagcctcgagatcagccccatcaccttcctcaccgcccagacgctgctgatg960
gacctgggccagttcctgctcttctgccacatcagctcgcaccagcacgacggcatggaa1020
gcctacgtgaaggtggacagttgccccgaggaaccccagctgcggatgaagaacaacgag1080
gaagccgaggattacgacgacgacctgaccgacagcgagatggacgtggtgcggttcgac1140
gacgacaacagccccagcttcatccagatccggtccgtggccaagaagcaccccaagacc1200
tgggtgcactacatcgccgccgaggaagaggactgggactacgcccccctggtgctggcc1260
cccgacgaccggtcctacaagagccagtacctgaacaacgggccccagcggatcggccgg1320
aagtacaagaaagtgcggttcatggcctacaccgacgagaccttcaagacccgggaggcc1380
atccagcacgagagcggcatcctgggccccctgctgtacggcgaggtcggcgacaccctg1440
ctgatcatcttcaagaaccaggccagccggccctacaacatctacccccacggcatcacc1500
gacgtgcggcccctgtacagcaggcggctgcccaagggcgtgaagcacctgaaggacttc1560
cccatcctgcccggcgagatcttcaagtacaagtggaccgtgaccgtggaggacggcccc1620
accaagagcgacccccgctgcctcacccggtactacagcagcttcgtgaacatggagcgg1680
gacctggcctccggcctcatcgggcccctgctcatctgctacaaagaaagcgtggaccag1740
cggggcaaccagatcatgagcgacaagcggaacgtgatcctgttctcggtgttcgacgag1800
aaccggagttggtatctgacggagaacatccagcggttcctccccaaccctgccggcgtg1860
cagctcgaggaccccgagttccaggccagcaacatcatgcactccatcaatggctacgtg1920
ttcgacagcctgcagctgtccgtgtgcctccacgaggtggcctactggtacatcctgagc1980
atcggcgcccagaccgacttcctgagcgtgttcttcagcggctacaccttcaagcacaag2040
atggtgtacgaggacaccctgaccctgttcccgttcagcggcgagaccgtgttcatgagc2100
atggaaaaccccggcctgtggatcctgggctgccacaacagcgacttccggaaccggggc2160
atgaccgccctgctgaaggtgtccagctgcgacaagaacaccggcgactactacgaggac2220
agctacgaggacatcagcgcctacctgctgtccaagaacaacgccatcgagccccggtcc2280
ttcagccagaacagccggcaccccagcacccggcagaagcagttcaacgccaccccccct2340
gtgctgaagcggcaccagcgcgagatcacccggaccaccctgcagtccgaccaggaagag2400
atcgactacgacgacaccatcagcgtggagatgaagaaagaggacttcgacatctacgac2460
gaggacgagaaccagagcccccgcagcttccagaagaaaacccggcactacttcatcgcc2520
gcggtggagcggctgtgggactacggcatgagcagcagcccccacgtgctgcggaaccgg2580
gcccagagcggcagcgtgccccagttcaagaaagtggtgttccaggaattcaccgacggc2640
agcttcacccagcccctgtaccggggcgagctgaacgagcacctggggctgctggggccc2700
tacatccgcgcggaggtggaggacaacatcatggtgaccttccggaaccaggcctcccgc2760
ccctactccttctacagcagcctgatcagctacgaagaggaccagcggcagggcgcggag2820
ccccggaagaacttcgtgaagcccaacgagaccaagacctacttctggaaggtgcagcac2880
cacatggcccccaccaaggacgagttcgactgcaaggcctgggcctacttcagcgacgtg2940
gacctcgagaaggacgtgcactccgggctcatcggcccgctcctcgtgtgccacaccaac3000
accctgaaccccgcccacggccggcaggtgaccgtgcaggaattcgccctgttcttcacc3060
atcttcgacgagaccaagtcgtggtacttcaccgagaacatggaacgcaactgcagggcc3120
ccctgcaacatccagatggaagatcccaccttcaaagagaactaccggttccacgccatc3180
aacggctacatcatggacaccctgcccggcctggtgatggcccaggaccagcgcatccgg3240
tggtatctgctgtccatgggcagcaacgagaacatccacagcatccacttcagcggccac3300
gtgttcaccgtccggaagaaagaagagtacaagatggccctgtacaacctgtaccccggc3360
gtgttcgagaccgtggagatgctgcccagcaaggccggcatctggcgggtggagtgcctg3420
atcggggagcacctccacgccggcatgtccaccctgttcctcgtgtacagcaacaagtgc3480
cagacccccctgggcatggccagcggccacatccgggacttccagatcaccgcctccggc3540
cagtacggccagtgggcccccaagctggcccggctgcactacagcggcagcatcaacgcc3600
tggtccaccaaagagcccttcagctggatcaaggtggacctgctcgcccccatgatcatc3660
cacgggatcaagacccagggcgccaggcagaagttcagcagcctgtacatcagccagttc3720
atcatcatgtacagcctggacggcaagaagtggcagacctaccggggcaacagcaccggc3780
accctgatggtgttcttcggcaacgtggacagcagcggcatcaagcacaacatcttcaac3840
ccccccatcatcgcccggtacatccggctgcaccccacccactacagcatccggtccacc3900
ctgcggatggaactgatgggctgcgacctgaactcctgcagcatgcccctggggatggaa3960
agcaaggccatcagcgacgcccagatcacggccagcagctacttcaccaacatgttcgcc4020
acctggtccccctccaaggcccgcctgcacctgcagggccggtccaacgcctggcggcct4080
caggtcaacaaccccaaagagtggctgcaggttgacttccagaaaaccatgaaggtgacc4140
ggcgtgaccacccagggggtgaagagcctgctgaccagcatgtacgtgaaagagttcctc4200
atcagcagcagccaggacggccaccagtggacgctgttcttccagaacggcaaggtcaag4260
gtgttccagggcaaccaggacagtttcacgcccgtggtgaactccctggacccccccctg4320
ctgacccgctacctgcggatccacccccagagctgggtccaccagatcgccctgcgcatg4380
gaagtcctcggctgcgaggcgcaggacctgtactga4416
<210>16
<211>240
<212>DNA
<213>ArtificialSequence
<220>
<223>Syntheticconstruct
<400>16
ctcgaggggtggccactgcagcacctgccactgccgtcacctctccctcctcagctccag60
ggcagtgtccctccctggcttgccttctacctttgtgctaaatcctagcagacactgcct120
tgaagcctcctgaattaactatcatcagtcctgcatttctttggtggggggccaggaggg180
tgcatccaatttaacttaactcttacctattttctgcaggggatctcagtcgacgagctc240
<210>17
<211>2211
<212>DNA
<213>ArtificialSequence
<220>
<223>Syntheticsequence
<400>17
atggctgccgatggttatcttccagattggctcgaggacactctctctgaaggaataaga60
cagtggtggaagctcaaacctggcccaccaccaccaaagcccgcagagcggcataaggac120
gacagcaggggtcttgtgcttcctgggtacaagtacctcggacccttcaacggactcgac180
aagggagagccggtcaacgaggcagacgccgcggccctcgagcacgacaaagcctacgac240
cggcagctcgacagcggagacaacccgtacctcaagtacaaccacgccgacgcggagttt300
caggagcgccttaaagaagatacgtcttttgggggcaacctcggacgagcagtcttccag360
gcgaaaaagagggttcttgaacctctgggcctggttgaggaacctgttaagacggctccg420
ggaaaaaagaggccggtagagcactctcctgtggagccagactcctcctcgggaaccgga480
aaggcgggccagcagcctgcaagaaaaagattgaattttggtcagactggagacgcagac540
tcagtacctgacccccagcctctcggacagccaccagcagccccctctggtctgggaact600
aatacgatggctacaggcagtggcgcaccaatggcagacaataacgagggcgccgacgga660
gtgggtaattcctcgggaaattggcattgcgattccacatggatgggcgacagagtcatc720
accaccagcacccgaacctgggccctgcccacctacaacaaccacctctacaaacaaatt780
tccagcgcttcaacgggagcctcgaacgacaatcactactttggctacagcaccccttgg840
gggtattttgacttcaacagattccactgccacttttcaccacgtgactggcaaagactc900
atcaacaacaactggggattccgacccaagagactcaacttcaagctctttaacattcaa960
gtcaaagaggtcacgcagaatgacggtacgacgacgattgccaataaccttaccagcacg1020
gttcaggtgtttactgactcggagtaccagctcccgtacgtcctcggctcggcgcatcaa1080
ggatgcctcccgccgttcccagcagacgtcttcatggtgccacagtatggatacctcacc1140
ctgaacaacgggagtcaggcagtaggacgctcttcattttactgcctggagtactttcct1200
tctcagatgctgcgtaccggaaacaactttaccttcagctacacttttgaggacgttcct1260
ttccacagcagctacgctcacagccagagtctggaccgtctcatgaatcctctcatcgac1320
cagtacctgtattacttgagcagaacaaacactccaagtggaaccaccacgcagtcaagg1380
cttcagttttctcaggccggagcgagtgacattcgggaccagtctaggaactggcttcct1440
ggaccctgttaccgccagcagcgagtatcaaagacatctgcggataacaacaacagtgaa1500
tactcgtggactggagctaccaagtaccacctcaatggcagagactctctggtgaatccg1560
ggcccggccatggcaagccacaaggacgatgaagaaaagttttttcctcagagcggggtt1620
ctcatctttgggaagcaaggctcagagaaaacaaatgtggacattgaaaaggtcatgatt1680
acagacgaagaggaaatcaggacaaccaatcccgtggctacggagcagtatggttctgta1740
tctaccaacctccagagaggcaacagacaagcagctaccgcagatgtcaacacacaaggc1800
gttcttccaggcatggtctggcaggacagagatgtgtaccttcaggggcccatctgggca1860
aagattccacacacggacggacattttcacccctctcccctcatgggtggattcggactt1920
aaacaccctcctccacagattctcatcaagaacaccccggtacctgcgaatccttcgacc1980
accttcagtgcggcaaagtttgcttccttcatcacacagtactccacgggacaggtcagc2040
gtggagatcgagtgggagctgcagaaggaaaacagcaaacgctggaatcccgaaattcag2100
tacacttccaactacgccaagtctgtcaatgtggactttactgtggacaataatggcgtg2160
tattcagagcctcgccccattggcaccagatacctgactcgtaatctgtaa2211
<210>18
<211>1395
<212>DNA
<213>ArtificialSequence
<220>
<223>SyntheticConstruct
<400>18
atgcagcgcgtgaacatgatcatggcagaatcaccaggcctcatcaccatctgcctttta60
ggatatctactcagtgctgaatgtacagtttttcttgatcatgaaaacgccaacaaaatt120
ctgaatcggccaaagaggtataattcaggtaaattggaagagtttgttcaagggaacctt180
gagagagaatgtatggaagaaaagtgtagttttgaagaagcacgagaagtttttgaaaac240
acggaaagaacaactgaattttggaagcagtatgttgatggtgaccagtgtgagtccaat300
ccatgtttaaatggcggcagttgcaaggatgacattaattcctatgaatgttggtgtccc360
tttggatttgaaggaaagaactgtgagctcgatgtaacatgtaacattaagaatggcaga420
tgcgagcagttttgtaaaaatagtgctgataacaaggtggtttgctcctgtactgaggga480
tatcgacttgcagaaaaccagaagtcctgtgaaccagcagtgccatttccatgcggccgc540
gtttctgtttcacaaacttctaagctcacccgtgctgagactgtttttcctgatgtggac600
tatgtaaattctactgaagctgaaaccattttggataacatcactcaaagcacccaatca660
tttaatgacttcactcgggttgttggtggagaagatgccaaaccaggtcaattcccttgg720
caggttgttttgaatggtaaagttgatgcattctgtggaggctctatcgttaatgaaaaa780
tggattgtaactgctgcccactgtgttgaaactggtgttaaaattacagttgtcgcaggt840
gaacataatattgaggagacagaacatacagagcaaaagcgaaatgtgattcgaattatt900
cctcaccacaactacaatgcagctattaataagtacaaccatgacattgcccttctggaa960
ctggacgaacccttagtgctaaacagctacgttacacctatttgcattgctgacaaggaa1020
tacacgaacatcttcctcaaatttggatctggctatgtaagtggctggggaagagtcttc1080
cacaaagggagatcagctttagttcttcagtaccttagagttccacttgttgaccgagcc1140
acatgtcttcgatctacaaagttcaccatctataacaacatgttctgtgctggcttccat1200
gaaggaggtagagattcatgtcaaggagatagtgggggaccccatgttactgaagtggaa1260
gggaccagtttcttaactggaattattagctggggtgaagagtgtgcaatgaaaggcaaa1320
tatggaatatataccaaggtatcccggtatgtcaactggattaaggaaaaaacaaagctc1380
acttaatgagcatgc1395
<210>19
<211>4650
<212>DNA
<213>ArtificialSequence
<220>
<223>SyntheticConstruct
<400>19
atgcaaatagagctctccacctgcttctttctgtgccttttgcgattctgctttagtgcc60
accagaagatactacctgggtgcagtggaactgtcatgggactatatgcaaagtgatctc120
ggtgagctgcctgtggacgcaagatttcctcctagagtgccaaaatcttttccattcaac180
acctcagtcgtgtacaaaaagactctgtttgtagaattcacggttcaccttttcaacatc240
gctaagccaaggccaccctggatgggtctgctaggtcctaccatccaggctgaggtttat300
gatacagtggtcattacacttaagaacatggcttcccatcctgtcagtcttcatgctgtt360
ggtgtatcctactggaaagcttctgagggagctgaatatgatgatcagaccagtcaaagg420
gagaaagaagatgataaagtcttccctggtggaagccatacatatgtctggcaggtcctg480
aaagagaatggtccaatggcctctgacccactgtgccttacctactcatatctttctcat540
gtggacctggtaaaagacttgaattcaggcctcattggagccctactagtatgtagagaa600
gggagtctggccaaggaaaagacacagaccttgcacaaatttatactactttttgctgta660
tttgatgaagggaaaagttggcactcagaaacaaagaactccttgatgcaggatagggat720
gctgcatctgctcgggcctggcctaaaatgcacacagtcaatggttatgtaaacaggtct780
ctgccaggtctgattggatgccacaggaaatcagtctattggcatgtgattggaatgggc840
accactcctgaagtgcactcaatattcctcgaaggtcacacatttcttgtgaggaaccat900
cgccaggcgtccttggaaatctcgccaataactttccttactgctcaaacactcttgatg960
gaccttggacagtttctactgttttgtcatatctcttcccaccaacatgatggcatggaa1020
gcttatgtcaaagtagacagctgtccagaggaaccccaactacgaatgaaaaataatgaa1080
gaagcggaagactatgatgatgatcttactgattctgaaatggatgtggtcaggtttgat1140
gatgacaactctccttcctttatccaaattcgctcagttgccaagaagcatcctaaaact1200
tgggtacattacattgctgctgaagaggaggactgggactatgctcccttagtcctcgcc1260
cccgatgacagaagttataaaagtcaatatttgaacaatggccctcagcggattggtagg1320
aagtacaaaaaagtccgatttatggcatacacagatgaaacctttaagactcgtgaagct1380
attcagcatgaatcaggaatcttgggacctttactttatggggaagttggagacacactg1440
ttgattatatttaagaatcaagcaagcagaccatataacatctaccctcacggaatcact1500
gatgtccgtcctttgtattcaaggagattaccaaaaggtgtaaaacatttgaaggatttt1560
ccaattctgccaggagaaatattcaaatataaatggacagtgactgtagaagatgggcca1620
actaaatcagatcctcggtgcctgacccgctattactctagtttcgttaatatggagaga1680
gatctagcttcaggactcattggccctctcctcatctgctacaaagaatctgtagatcaa1740
agaggaaaccagataatgtcagacaagaggaatgtcatcctgttttctgtatttgatgag1800
aaccgaagctggtacctcacagagaatatacaacgctttctccccaatccagctggagtg1860
cagcttgaggatccagagttccaagcctccaacatcatgcacagcatcaatggctatgtt1920
tttgatagtttgcagttgtcagtttgtttgcatgaggtggcatactggtacattctaagc1980
attggagcacagactgacttcctttctgtcttcttctctggatataccttcaaacacaaa2040
atggtctatgaagacacactcaccctattcccattctcaggagaaactgtcttcatgtcg2100
atggaaaacccaggtctatggattctggggtgccacaactcagactttcggaacagaggc2160
atgaccgccttactgaaggtttctagttgtgacaagaacactggtgattattacgaggac2220
agttatgaagatatttcagcatacttgctgagtaaaaacaatgccattgaaccaagaagc2280
ttctcccagaattcaagacaccctagcactaggcaaaagcaatttaatgccaccccacca2340
gtcttgaaacgccatcaacgggaaataactcgtactactcttcagtcagatcaagaggaa2400
attgactatgatgataccatatcagttgaaatgaagaaggaagattttgacatttatgat2460
gaggatgaaaatcagagcccccgcagctttcaaaagaaaacacgacactattttattgct2520
gcagtggagaggctctgggattatgggatgagtagctccccacatgttctaagaaacagg2580
gctcagagtggcagtgtccctcagttcaagaaagttgttttccaggaatttactgatggc2640
tcctttactcagcccttataccgtggagaactaaatgaacatttgggactcctggggcca2700
tatataagagcagaagttgaagataatatcatggtaactttcagaaatcaggcctctcgt2760
ccctattccttctattctagccttatttcttatgaggaagatcagaggcaaggagcagaa2820
cctagaaaaaactttgtcaagcctaatgaaaccaaaacttacttttggaaagtgcaacat2880
catatggcacccactaaagatgagtttgactgcaaagcctgggcttatttctctgatgtt2940
gacctggaaaaagatgtgcactcaggcctgattggaccccttctggtctgccacactaac3000
acactgaaccctgctcatgggagacaagtgacagtacaggaatttgctctgtttttcacc3060
atctttgatgagaccaaaagctggtacttcactgaaaatatggaaagaaactgcagggct3120
ccctgcaatatccagatggaagatcccacttttaaagagaattatcgcttccatgcaatc3180
aatggctacataatggatacactacctggcttagtaatggctcaggatcaaaggattcga3240
tggtatctgctcagcatgggcagcaatgaaaacatccattctattcatttcagtggacat3300
gtgttcactgtacgaaaaaaagaggagtataaaatggcactgtacaatctctatccaggt3360
gtttttgagacagtggaaatgttaccatccaaagctggaatttggcgggtggaatgcctt3420
attggcgagcatctacatgctgggatgagcacactttttctggtgtacagcaataagtgt3480
cagactcccctgggaatggcttctggacacattagagattttcagattacagcttcagga3540
caatatggacagtgggccccaaagctggccagacttcattattccggatcaatcaatgcc3600
tggagcaccaaggagcccttttcttggatcaaggtggatctgttggcaccaatgattatt3660
cacggcatcaagacccagggtgcccgtcagaagttctccagcctctacatctctcagttt3720
atcatcatgtatagtcttgatgggaagaagtggcagacttatcgaggaaattccactgga3780
accttaatggtcttctttggcaatgtggattcatctgggataaaacacaatatttttaac3840
cctccaattattgctcgatacatccgtttgcacccaactcattatagcattcgcagcact3900
cttcgcatggagttgatgggctgtgatttaaatagttgcagcatgccattgggaatggag3960
agtaaagcaatatcagatgcacagattactgcttcatcctactttaccaatatgtttgcc4020
acctggtctccttcaaaagctcgacttcacctccaagggaggagtaatgcctggagacct4080
caggtgaataatccaaaagagtggctgcaagtggacttccagaagacaatgaaagtcaca4140
ggagtaactactcagggagtaaaatctctgcttaccagcatgtatgtgaaggagttcctc4200
atctccagcagtcaagatggccatcagtggactctcttttttcagaatggcaaagtaaag4260
gtttttcagggaaatcaagactccttcacacctgtggtgaactctctagacccaccgtta4320
ctgactcgctaccttcgaattcacccccagagttgggtgcaccagattgccctgaggatg4380
gaggttctgggctgcgaggcacaggacctctactgactcgaggggtggccactgcagcac4440
ctgccactgccgtcacctctccctcctcagctccagggcagtgtccctccctggcttgcc4500
ttctacctttgtgctaaatcctagcagacactgccttgaagcctcctgaattaactatca4560
tcagtcctgcatttctttggtggggggccaggagggtgcatccaatttaacttaactctt4620
acctattttctgcaggggatctcagtcgac4650

Claims (18)

1.用于增加hFIX表达的分离的优化基因，其中所述优化基因已经被修饰，相对于野生型FIX基因增加CG序列并减少顺式基序，其中优化基因是SEQIDNO:7的核苷酸序列。
2.权利要求1的优化基因，其中CG序列相对于野生型基因增加至少40％。
3.权利要求1的优化基因，其包含在病毒载体中。
4.权利要求3的优化基因，其中所述病毒载体是嵌合病毒载体，含有选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11和AAV12衣壳的衣壳组分。
5.权利要求4的优化基因，其中所述嵌合病毒载体包含SEQIDNO:17或其互补序列。
6.权利要求1的优化基因，其中所述优化基因旁侧带有AAVTRs。
7.权利要求3的优化基因，其中所述病毒载体包含SEQIDNO.1的核苷酸序列。
8.权利要求1的分离的优化基因在制备通过下列方法用于增加对象中hFIX表达的试剂中的应用，所述方法包括：
提供至少一种含有权利要求1的优化FIX基因的编码核苷酸序列的重组病毒载体，其中优化基因已经被修饰，相对于野生型FIX基因增加CG序列并减少顺式基序；以及
在使优化FIX核苷酸序列的表达水平在对象中产生增加量的FIX的条件下，给所述对象施用重组病毒载体。
9.权利要求8的应用，其中CG序列相对于野生型基因增加至少40％。
10.权利要求8的应用，其中重组病毒载体是嵌合病毒载体。
11.权利要求10的应用，其中所述嵌合病毒载体含有选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11和AAV12衣壳的衣壳组分。
12.权利要求10的应用，其中所述嵌合病毒载体包含SEQIDNO:17或其互补序列。
13.权利要求8的应用，其中优化基因旁侧带有AAVTRs。
14.权利要求10的应用，其中重组病毒载体包含SEQIDNO.1的核苷酸序列。
15.表达FIX肽的体外方法，包括：
用权利要求1的优化基因转染细胞以产生转化的宿主细胞，其中优化FIX基因已经被修饰，相对于野生型FIX基因增加CG序列并减少顺式基序；以及将转化的宿主细胞维持在足以表达所述肽的生物学条件下。
16.权利要求15的应用，其中CG序列相对于野生型多核苷酸增加至少40％。
17.权利要求15的方法，其中所述细胞是肝细胞或肌细胞。
18.药物组合物，其含有权利要求1的分离的优化基因；以及可药用载体。
CN200780029324.6A 2006-06-19 2007-06-19 用于基因治疗的修饰的因子ⅷ和因子ⅸ基因和载体 Active CN101511373B (zh)

Applications Claiming Priority (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US80517106P 2006-06-19 2006-06-19
US60/805,171 2006-06-19
US82433806P 2006-09-01 2006-09-01
US60/824,338 2006-09-01
US84733706P 2006-09-26 2006-09-26
US60/847,337 2006-09-26
PCT/US2007/071553 WO2007149852A2 (en) 2006-06-19 2007-06-19 Modified factor viii and factor ix genes and vectors for gene therapy
US12/305,508 US8198421B2 (en) 2006-06-19 2007-06-19 Modified factor VIII and factor IX genes and vectors for gene therapy

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410158202.9A Division CN104087591A (zh) 2006-06-19 2007-06-19 用于基因治疗的修饰的因子viii和因子ix基因和载体

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN101511373A CN101511373A (zh) 2009-08-19
CN101511373B true CN101511373B (zh) 2015-12-09

Family

ID=38834307

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410158202.9A Pending CN104087591A (zh) 2006-06-19 2007-06-19 用于基因治疗的修饰的因子viii和因子ix基因和载体
CN200780029324.6A Active CN101511373B (zh) 2006-06-19 2007-06-19 用于基因治疗的修饰的因子ⅷ和因子ⅸ基因和载体

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410158202.9A Pending CN104087591A (zh) 2006-06-19 2007-06-19 用于基因治疗的修饰的因子viii和因子ix基因和载体

Country Status (5)

Country Link
US (3) US8198421B2 (zh)
EP (2) EP2037892B1 (zh)
CN (2) CN104087591A (zh)
ES (1) ES2535877T3 (zh)
WO (1) WO2007149852A2 (zh)

Families Citing this family (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TR201813067T4 (tr) 2008-09-15 2018-09-21 Uniqure Biopharma B V Faktör IX polipeptit mutantı, bunun kullanımları ve bunu üretmeye yönelik bir yöntem.
GB0911870D0 (en) * 2009-07-08 2009-08-19 Ucl Business Plc Optimised coding sequence and promoter
JP6141021B2 (ja) 2010-02-05 2017-06-07 ザ・ユニヴァーシティ・オヴ・ノース・キャロライナ・アト・チャペル・ヒル パルボウイルスの形質導入を増強するための組成物および方法
CA3004695C (en) * 2012-04-30 2020-08-04 Biocon Limited Targeted/immunomodulatory fusion proteins and methods for making same
GB201210357D0 (en) 2012-06-12 2012-07-25 Ucl Business Plc Factor VIII sequences
DK2911687T3 (da) 2012-10-26 2019-05-13 Univ Brussel Vrije Vektor til levermålrettet genterapi af hæmofili og fremgangsmåder og anvendelse deraf
US10398787B2 (en) * 2012-10-26 2019-09-03 Vrije Universiteit Brussel Vectors for liver-directed gene therapy of hemophilia and methods and use thereof
ES2959747T3 (es) 2013-02-15 2024-02-28 Bioverativ Therapeutics Inc Gen del factor VIII optimizado
WO2014164427A1 (en) * 2013-03-12 2014-10-09 Biocon Ltd. Fusion immunomodulatory proteins and methods for making same
EP2968612B1 (en) 2013-03-14 2018-02-14 Asklepios Biopharmaceutical, Inc. Modified soluble vegf receptor-1 genes and vectors for gene therapy
WO2015148454A1 (en) * 2014-03-28 2015-10-01 Asklepios Biopharmaceutical, Inc. Optimized and modified factor viii genes for gene therapy
EP3160478A4 (en) * 2014-06-30 2018-05-16 Bioverativ Therapeutics Inc. Optimized factor ix gene
SG11201701033QA (en) * 2014-08-13 2017-03-30 Philadelphia Children Hospital An improved expression cassette for packaging and expression of variant factor viii for the treatment of hemostasis disorders
BR112017009497A2 (pt) 2014-11-05 2018-02-06 Voyager Therapeutics, Inc. polinucleotídeos de aadc para o tratamento da doença de parkinson
GB201420139D0 (en) 2014-11-12 2014-12-24 Ucl Business Plc Factor IX gene therapy
EP3611186A1 (en) * 2015-02-06 2020-02-19 The University of North Carolina at Chapel Hill Optimized human clotting factor viii gene expression cassettes and their use
JP6879486B2 (ja) * 2015-03-17 2021-06-02 フリーイェ・ユニヴェルシテイト・ブリュッセルＶｒｉｊｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｅｉｔ Ｂｒｕｓｓｅｌ Ｆｖｉｉｉおよびｆｉｘ用の最適化された肝臓特異的発現系
US10058624B2 (en) * 2015-04-16 2018-08-28 Emory University Recombinant promoters and vectors for protein expression in liver and use thereof
JP6831779B2 (ja) * 2015-06-23 2021-02-17 ザ・チルドレンズ・ホスピタル・オブ・フィラデルフィアＴｈｅ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’Ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｏｆ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ 修飾された第ｉｘ因子、並びに、細胞、器官及び組織への遺伝子導入のための組成物、方法及び使用
WO2017024198A1 (en) * 2015-08-06 2017-02-09 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Glp-1 and use thereof in compositions for treating metabolic diseases
TWI777175B (zh) 2015-11-13 2022-09-11 日商武田藥品工業股份有限公司 用於ａ型血友病基因治療之編碼表現增加之重組ｆｖｉｉｉ變異體之病毒載體
CN105506106A (zh) * 2015-12-30 2016-04-20 杭州艾迪康医学检验中心有限公司 检测fix基因全外显子的方法和引物
LT3411478T (lt) 2016-02-01 2022-09-26 Bioverativ Therapeutics Inc. Optimizuoti viii faktoriaus genai
CA3019425A1 (en) 2016-04-15 2017-10-19 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Gene therapy for treating hemophilia a
GB201614462D0 (en) * 2016-08-24 2016-10-05 Univ Sheffield Clotting factor
US10550405B2 (en) 2017-03-15 2020-02-04 The University Of North Carolina At Chapel Hill Rational polyploid adeno-associated virus vectors and methods of making and using the same
CA3064450A1 (en) * 2017-05-31 2018-12-06 The University Of North Carolina At Chapel Hill Optimized human clotting factor ix gene expression cassettes and their use
JOP20190269A1 (ar) 2017-06-15 2019-11-20 Voyager Therapeutics Inc بولي نوكليوتيدات aadc لعلاج مرض باركنسون
JP2020530307A (ja) 2017-06-30 2020-10-22 インティマ・バイオサイエンス，インコーポレーテッド 遺伝子治療のためのアデノ随伴ウイルスベクター
CN117535247A (zh) * 2018-05-07 2024-02-09 北卡罗来纳-查佩尔山大学 合理的多倍体腺相关病毒载体及其制造和使用方法
US10842885B2 (en) 2018-08-20 2020-11-24 Ucl Business Ltd Factor IX encoding nucleotides
TW202039546A (zh) 2019-01-16 2020-11-01 美商巴克斯歐塔公司 用於a型血友病基因治療之編碼表現增加之重組fviii變異體的病毒載體
TW202045529A (zh) 2019-02-15 2020-12-16 美商聖加莫治療股份有限公司 用於生產重組aav之組合物及方法
KR20210149702A (ko) * 2019-03-13 2021-12-09 제너레이션 바이오 컴퍼니 비바이러스성 dna 벡터 및 페닐알라닌 히드록실라아제(pah) 치료제 발현을 위한 이의 용도
CN111647625A (zh) * 2019-12-25 2020-09-11 深圳三智医学科技有限公司 一种提高人凝血因子ix表达水平的方法
EP4347798A2 (en) * 2021-06-02 2024-04-10 uniQure biopharma B.V. Insect cell production of parvoviral vectors with modified capsid proteins
CN113736824B (zh) * 2021-08-19 2023-12-26 中南大学 一种重组载体及其制备方法和应用
CN116350801A (zh) * 2022-11-22 2023-06-30 四川至善唯新生物科技有限公司 一种重组腺相关病毒载体的药物组合物及其用途

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6924365B1 (en) * 1998-09-29 2005-08-02 Transkaryotic Therapies, Inc. Optimized messenger RNA

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4501729A (en) 1982-12-13 1985-02-26 Research Corporation Aerosolized amiloride treatment of retained pulmonary secretions
US5436146A (en) 1989-09-07 1995-07-25 The Trustees Of Princeton University Helper-free stocks of recombinant adeno-associated virus vectors
US6268213B1 (en) 1992-06-03 2001-07-31 Richard Jude Samulski Adeno-associated virus vector and cis-acting regulatory and promoter elements capable of expressing at least one gene and method of using same for gene therapy
US5478745A (en) 1992-12-04 1995-12-26 University Of Pittsburgh Recombinant viral vector system
US6204059B1 (en) 1994-06-30 2001-03-20 University Of Pittsburgh AAV capsid vehicles for molecular transfer
CA2287478C (en) 1997-04-14 2007-06-19 Richard J. Samulski Methods for increasing the efficiency of recombinant aav product
US6410300B1 (en) 1998-01-12 2002-06-25 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods and formulations for mediating adeno-associated virus (AAV) attachment and infection and methods for purifying AAV
US6491907B1 (en) 1998-11-10 2002-12-10 The University Of North Carolina At Chapel Hill Recombinant parvovirus vectors and method of making
WO2002064799A2 (en) * 1999-09-28 2002-08-22 Transkaryotic Therapies, Inc. Optimized messenger rna
US6627617B1 (en) 1999-10-01 2003-09-30 University Of North Carolina At Chapel Hill Temperature-sensitive regulation of viral vector production
DE60139471D1 (de) 2000-06-01 2009-09-17 Univ North Carolina Verfahren und zusammensetzungen zur kontrollierter abgabe von rekombinant parvovirus vektoren
DE60117550T2 (de) 2000-06-01 2006-12-07 University Of North Carolina At Chapel Hill Doppelsträngige parvovirus-vektoren
CA2467959C (en) 2001-11-09 2009-03-10 Robert M. Kotin Production of adeno-associated virus in insect cells
US6723551B2 (en) 2001-11-09 2004-04-20 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Production of adeno-associated virus in insect cells
US20050106558A1 (en) 2001-12-21 2005-05-19 Luca Perabo Library of modified structural genes or capsid modified particles useful for the identification of viral clones with desired cell tropism
US20030223998A1 (en) 2002-02-27 2003-12-04 Lamb Lawrence S. Targeted immunotherapy of acute lymphoblastic leukemia (ALL)
US20040002159A1 (en) * 2002-04-05 2004-01-01 Weidong Xiao Methods for the production of chimeric adeno-associated virus (AAV) vectors, compositions of chimeric AAV vectors, and methods of use thereof
US7220577B2 (en) 2002-08-28 2007-05-22 University Of Florida Research Foundation, Inc. Modified AAV
DE602004021472D1 (en) * 2003-02-20 2009-07-23 Smithkline Beecham Corp Pyrimiidinverbindungen
GB0325379D0 (en) * 2003-10-30 2003-12-03 Oxford Biomedica Ltd Vectors
CN101124328A (zh) 2004-12-15 2008-02-13 北卡罗来纳查佩尔山大学 嵌合载体
DK2359867T3 (en) * 2005-04-07 2015-01-05 Univ Pennsylvania A method for increasing an AAV vector function

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6924365B1 (en) * 1998-09-29 2005-08-02 Transkaryotic Therapies, Inc. Optimized messenger RNA

Also Published As

Publication number Publication date
US20130004462A1 (en) 2013-01-03
US8632765B2 (en) 2014-01-21
US9506052B2 (en) 2016-11-29
WO2007149852A2 (en) 2007-12-27
EP2848253A1 (en) 2015-03-18
US8198421B2 (en) 2012-06-12
CN101511373A (zh) 2009-08-19
EP2037892A2 (en) 2009-03-25
WO2007149852A3 (en) 2009-02-26
ES2535877T3 (es) 2015-05-18
US20140193880A1 (en) 2014-07-10
CN104087591A (zh) 2014-10-08
US20100284971A1 (en) 2010-11-11
EP2037892A4 (en) 2009-12-23
EP2037892B1 (en) 2015-03-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101511373B (zh) 用于基因治疗的修饰的因子ⅷ和因子ⅸ基因和载体
AU2020200976B2 (en) Modified friedreich ataxia genes and vectors for gene therapy
CA2827375C (en) Improved aav8 vector with enhanced functional activity and methods of use thereof
CN107295802B (zh) 用于高效基因组编辑的腺相关病毒载体变异体和其方法
US20190016759A1 (en) Capsid-modified raav vector compositions and methods therefor
BR112019019158A2 (pt) composições e métodos para expressão genética melhorada
KR102625470B1 (ko) 최적화된 인간 응고 인자 ix 유전자 발현 카세트 및 이의 사용
JP2018515096A (ja) 神経成長因子シグナルペプチド及び副甲状腺ホルモンを含むａａｖ分離株及び融合タンパク質
CN104937100A (zh) Aav变体
JP2009532025A (ja) アデノ関連ウイルスベクターからの組換えタンパク質の制御された発現
JP2022544004A (ja) 操作された核酸調節エレメントならびにその使用方法
KR20210008561A (ko) 합성 간-향성 아데노-연관 바이러스 캡시드 및 그의 용도
US20210403947A1 (en) Miniaturized dystrophins and uses thereof
WO2024060463A1 (zh) 改进的人凝血因子viii基因表达盒及其应用
US20230136849A1 (en) Capsid-modified raav vector compositions and methods therefor
US20230049066A1 (en) Novel aav3b variants that target human hepatocytes in the liver of humanized mice
US20230304033A1 (en) Modified adeno-associated virus vectors that evade neutralizing antibodies and uses thereof
Class et al. Patent application title: CAPSID-MODIFIED RAAV VECTOR COMPOSITIONS AND METHODS THEREFOR Inventors: Arun Srivastava (Gainesville, FL, US) Arun Srivastava (Gainesville, FL, US) George V. Aslanidi (Gainesville, FL, US) Sergei Zolotukhin (Gainesville, FL, US) Sergei Zolotukhin (Gainesville, FL, US) Mavis Agbandje-Mckenna (Gainesville, FL, US) Kim M. Van Vliet (Gainesville, FL, US) Li Zhong (Boxborough, MA, US) Lakshmanan Govindasamy (Gainesville, FL, US) Assignees: University of Florida Research Foundation Inc.
AU2016202153A1 (en) Vectors with modified initiation codon for the translation of AAV-Rep78 useful for production of AAV in insect cells

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant