CN113736824B - 一种重组载体及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种治疗A型血友病的重组载体、诱导性多能干细胞及其制备方法。本发明使用非病毒载体对诱导性多能干细胞进行基因打靶，将血小板特异性启动子启动的F8表达框靶入诱导性多能干细胞中。避免了使用病毒元件可能存在的随机插入和免疫原性的风险。诱导性多能干细胞可定向分化形成造血祖细胞，所得造血祖细胞的转录水平F8基因表达量和FⅧ蛋白表达量均明显高于正常人细胞的转录水平F8基因表达量和FⅧ蛋白表达量。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及外源基因靶向治疗遗传疾病。
背景技术
A型血友病(Hemophilia A)是由F8基因突变引起的X连锁隐性遗传病。在出生男婴中的发病率约为1/5000。HA的临床症状主要为自发性或创伤性出血，尤其是肌肉和关节出血、血肿，常可致残，甚至可能因颅内出血而危及生命[1]。目前尚无根治的方法，传统的治疗方式是补充富含人FⅧ的血浆制品行替代治疗，早期的血浆制品从血浆中进行分离，存在病毒污染(HIV、HBV等)等问题，而后期重组的FⅧ制品价格昂贵，由于FⅧ在血浆中的半衰期仅为12小时，因此HA患者常需终身反复输注，这给患者及其家庭带来了沉重的经济和心理负担。另外，相当一部分HA患者会由于反复输注而产生FⅧ抑制性抗体，导致替代治疗无效[2]。
基因治疗的兴起，为类似血友病这样的单基因遗传病治疗带来了新的希望，由于仅需1％-5％的正常血浆FⅧ水平就可以明显改善HA患者临床出血症状，因此血友病一直被学术界认为是最有可能实现基因治疗的遗传病之一[3]。常见基因治疗策略包括基因替代和基因修复。基因替代是指将带有启动子的外源治疗基因随机或者定点整合到缺陷细胞中，外源基因表达从而达到治疗的目的。血友病A基因F8有多种致病突变类型，因此基因替代策略是对有不同致病突变类型的血友病A最理想的治疗方式；除此之外常见的另一策略是原位修复，即在缺陷基因的原位点通过同源重组的途径进行精确的基因修复，这样的修复方式保留了基因的完整性，但对技术要求较高，且针对每一种突变要采取不同的修复方式，过程繁琐且耗费人力物力，因此目前进行的绝大部分基因治疗研究都是采用基因替代策略。
F8基因于1984年被成功克隆[4]，该基因长达186kb，包含26个外显子，是已克隆的最大基因之一。其cDNA长达9kb，即使是广泛使用的B区缺失F8，编码序列也有约4.5kb[5]。F8的突变类型非常多，至今人类突变数据库(The Human Gene Mutation Database，HGMD)记录的突变种类已有3067种，包括错义突变、无义突变、小片段缺失与插入等[6]，常见的突变类型包括22号内含子倒位、1号内含子倒位和点突变。F8 基因编码含2351个氨基酸的前体多肽，经过一系列修饰加工后去除由19个氨基酸组成的信号肽形成一个2332个氨基酸组成的FⅧ成熟蛋白。FⅧ由肝脏分泌，主要是在肝血窦内皮细胞中以A1-A2-B-A3-C1-C2的单链形式合成(如图1)，随后进入血液循环，在血浆中与血管性血友病因子(vWF)结合为异二聚体形式，在组织血管损伤时参与凝血。研究表明，B区缺失的FⅧ(B domain deletion FⅧ,BDD-F8编码产生)不影响其活性[7]。
早期基因治疗血友病方法是将特定载体递送至特定靶组织，但是多数试验都没有使凝血因子在治疗中的长期表达[8,9]，即使人类对于FⅧ的正常生理水平要求很低，1％-5％的正常血浆FⅧ水平就可以预防和改善危及生命的出血症状[10]，但想要达到我们所期望的1％-5％FⅧ水平具有相当大的难度[11]。
为了克服不能长期表达这一特点，后期研究人员利用病毒载体转导造血干细胞(haematopoietic stem cell，HSC)[12]和其他干细胞，或直接体内转导具有较长寿命的有丝分裂后细胞类型，包括CNS中的细胞，视网膜[13]，骨骼肌，心肌和肝脏[14]。前一种策略在体外修饰细胞，将能够表达FⅧ的自体细胞输入体内；后者是直接将病毒载体输入体内。但无论采用哪种策略，由于病毒元件的使用都可能造成病毒整合的载体存在随机插入[15]和免疫原性。这可能在治疗后期阻碍FⅧ的长期表达，甚至导致更严重的免疫系统疾病[16]。
因此免疫反应一直是血友病基因治疗中遇到的重要难题。无论是原位修复或基因添加、病毒载体体外转导修饰治疗细胞后再自体化移植或病毒载体体内治疗，都不能解决患者因先天缺乏FⅧ而产生的免疫应答问题。Shi Q.等用慢病毒载体转导小鼠骨髓细胞后移植入血友病A模型鼠，可以在移植后小鼠血小板裂解物中检测到功能性FⅧ[17]。随后该团队用慢病毒体外转导人脐带血细胞，再移植入免疫受损的小鼠，实验结果也证实该方法显著改善了血友病小鼠的出血症状[18]。Lily M.Du等利用在模型犬的实验也在2.5 年内避免了严重出血的症状[19]。这些研究目前都以慢病毒为载体，病毒元件的使用会因其免疫原性造成基因转导效率低，也会因其整合性导致基因随机插入造成不可预知的后果；目前使用的来源于模型动物体内分离骨髓细胞的方法在人体难以应用，病人自体脐带血细胞的应用在现阶段可能性也很低。并且该方法采用慢病毒转导后的细胞无法通过筛选来提高转基因细胞的比例。
先前研究中我们将携带了F9与BDD-F8的rDNA区打靶载体分别进行人胚胎干细胞系H9和病人特异性iPSCs的打靶，获得了稳定表达hFIX与hFⅧ的定点整合细胞[21,23]。相比较，使用特异性启动子将FⅧ异位表达于血小板是一种非常有效的血友病A治疗手段。该方法只有在当人体血管发生破损时，体内的血小板聚集到受损部位，破裂并释放FⅧ对受损血管发挥凝血作用[19]，可以避开FⅧ在体内的循环而产生抗体的问题，同时血小板在出血部位聚集可以使该部位达到高FⅧ浓度，而不依赖于患者体内血浆中 FⅧ的水平。但其FⅧ的分泌水平还不足够高。
在临床细胞遗传学上已经证明，rDNA区的基因添加或减少均不会引起任何异常表型，并能向子代稳定的遗传。rDNA区的转录活跃，染色质松散，更易于同源重组的发生[21]。Nakai等通过分析小鼠中347个重组腺相关病毒的整合位点，结果发现重组腺相关病毒最突出的整合热点即为rDNA基因重复区[24]。另一项报道发现rDNA簇在人个体间表现出显著的可变长度，且在有丝分裂和减数分裂期间显示出重组不稳定性，提示在rDNA位点可能高效地发生位点特异性的同源重组[25]。在人类基因组中有600-800个拷贝的核糖体RNA基因分布在五对D、G组染色体(13、14、15、21、22号)的短臂，平均每条染色体上以大约80个43kb的拷贝头尾相接，形成长度大约为3000kb的基因簇[26]。如此庞大的拷贝数为同源重组提供大量的重组位点，本课题组在前期对ESCs打靶的研究[国家自然科学基金研究面上项目《外源基因定点靶入人胚胎干细胞技术的建立》(No.31071301)]中发现，在稳定整合的克隆中，有50％以上的克隆有多拷贝整合情况的发生[23]。
同时，人工核酸酶的发展为外源基因的靶入提供了更多可能。人工核酸酶能使DNA产生双链断裂(double strand break,DSB)，DSB可以激活位点附近的同源重组(homologous recombination,HR)活性，在打靶载体存在的情况下，可提高基因打靶效率达3个数量级之多。目前三大人工核酸酶基因编辑技术已经得到广泛的应用。
由于细胞修复DSB也会通过不精确的非同源末端连接(non-homologous endjoining, NHEJ)机制修复，这可能会导致该位置的基因失去功能，并且由于我们的靶位点rDNA区多拷贝特性，大量的DSB会对细胞产生较大的细胞毒性，导致细胞凋亡[27]。为了克服这一缺点，在前期工作中，我们自主设计研发了转录激活因子样效应物切口酶(transcription activator-like effector nickases,TALENickases)。TALENickases是指对原有 TALEN进行改造，将其中一边切割结构域FokI进行诱变，使其失去切割活性，但诱变后的FokI保留了与野生型FokI形成二聚体的能力，能够定点切割DNA单链，形成单链断裂(single strand break,SSB)。SSB同样可以促进断裂点附近的HDR效率，而且一般认为SSB不会通过NHEJ途径进行修复的，所以不会在靶位点或者脱靶位点形成indels，从而大大增加了使用的安全性。同时也有研究表明，在rDNA区的单链断裂相较于双链断裂，能够更有效的促进同源重组效率[23,27]。
虽然血友病的治疗与管理在过去的十几年取得了巨大的进步，特别是近些年来的血友病基因治疗取得了较大的进展，但是对于产生抑制物的基因治疗的疗效持久性仍然是临床及经济上的潜在挑战。基于此，新型的有效治疗方法及药物制剂有待开发。
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发明内容
本发明提供了一种治疗A型血友病非病毒载体的基因药物，一种含血小板特异性启动子和F8基因片段的重组载体和诱导性多能干细胞。所述诱导性多能干细胞能定向分化形成造血祖细胞，可以异位表达FⅧ蛋白，多能干细胞具有长期增殖保存的优点，非常适合A型血友病的治疗。
本发明的发明内容如下：
一种重组载体，包含血小板特异性启动子及其驱动的BDD-F8基因表达框共表达的表达盒。
优选的，所述BDD-F8基因表达框的序列如SEQ ID NO.2所示。
优选的，所述血小板特异性启动子包括血小板糖蛋白αⅡb启动子、血小板糖蛋白Ⅰb启动子、血小板因子4启动子。
进一步优选地，所述血小板特异性启动子为血小板糖蛋白αⅡb启动子ITGA2B，
其序列如SEQ ID NO.1所示。
优选地，所述血小板特异性启动子通过PCR方式扩增得到，PCR扩增的引物如下所示：F：TCTAGAGTGCTCAATGCTGTGCCTACGTG(SEQ ID NO.5)；
R：GATATCGGGCCAGCTCCTCCTCCTT(SEQ ID NO.6)。
优选的，所述重组载体的序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明还要求保护所述重组质粒的构建方法，包括：使用连接酶分别将血小板特异性启动子和BDD-F8基因表达框连接至载体骨架mini-pHrneo的限制性内切酶位点。
优选的，所述载体骨架mini-pHrneo的序列如SEQ ID NO.3所示。
所述mini-pHrneo为现有技术中(刘博.人iPSCs核糖体基因区IL24基因打靶及其分化MSCs的抗肿瘤研究[D].长沙：中南大学，2017：19-25)中公开的人核糖体DNA (hrDNA)靶向载体mini-pHrneo，区别在于原有pHrneo打靶载体(庞佳伦.外源F8定点整合至血友病A病人iPSCs核糖体基因区的研究[D].长沙：中南大学，2016)，在筛选表达框neo两侧加了LOXP位点，同时缩短了同源臂。所述rDNA区打靶载体 minipHrneo-2bF8的示意图如图2所示。这样改进质粒骨架的原因是为了后续能够将筛选表达框NEO切掉，同时缩小供体质粒的大小，从而提高基因打靶效率，实验也证实这种改造是打靶效率提高了3倍。(打靶效率对比如表3)
优选的，将血小板特异性启动子连接至载体骨架mini-pHrneo的BamH1限制性内切酶位点、ClaⅠ限制性内切酶位点、EcoRⅤ限制性内切酶位点中的任意一个位点。
载体骨架插入位点附件酶切位点示意图如图14，ClaⅠ、EcoRⅤ、BmtⅠ限制性内切酶位点均可以使用，其余显示出的酶切位点在启动子和BDD-F8有存在，所以不能使用。
优选的，将BDD-F8基因表达框连接至mini-pHrneo的Nhe1限制性内切酶位点、BamH1限制性内切酶位点、ClaⅠ限制性内切酶位点、EcoRⅤ限制性内切酶位点中的任意一个位点。
优选的，所述连接酶为T4连接酶Thermo 15224041。
优选的，所述重组载体的序列如SEQ ID NO.4所示。
一种诱导性多能干细胞，包含血小板特异性启动子及其驱动的BDD-F8基因表达框共表达的表达盒。
优选的，所述诱导性多能干细胞的保藏号为CCTCC NO:C2021179，保藏时间为2021年7月28 日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏地点为中国武汉，武汉大学。在本发明中，保藏的诱导性多能干细胞命名为诱导的多潜能人干细胞2bF8-iPS。
本发明还要求保护上述诱导性多能干细胞的制备方法，包括以下步骤：
(1)构建血友病A病人特异性iPSCs；
(2)利用TALENickase与上述重组载体对血友病A病人特异性iPSCs打靶，获得定点整合克隆的诱导性多能干细胞。
优选的，构建血友病A病人特异性iPSCs的步骤包括：收集血友病A病人尿液细胞，离心、培养底部细胞，诱导为血友病A病人特异性iPSCs。
一种造血祖细胞2bF8-HPC，由上述诱导性多能干细胞定向分化而成。
本发明还要求保护上述重组载体、上述重组载体中的表达盒、上述诱导性多能干细胞或所述造血祖细胞在表达BDD FVIII基因或制备治疗A型血友病药物和/或试剂中的应用。
本发明还要求保护一种试剂盒，包括上述重组载体、上述重组载体中的表达盒、上述诱导性多能干细胞或所述造血祖细胞中的任意一种或者多种。
本发明还要求保护所述试剂盒在在表达BDD FVIII基因或制备治疗A型血友病药物和/或试剂中的应用。
下面对本发明做进一步的解释：
本发明选用A型血友病病人的细胞重编程为诱导多潜能干细胞作为转染细胞，减少免疫系统疾病风险；选用缺失B区的F8基因片段(缺失B区表达的FⅧ蛋白不影响其活性)，减小基因区的大小以增强FⅧ蛋白的表达能力；引入血小板特异性启动子，使 FⅧ蛋白可以异位表达于血小板，避开了FⅧ蛋白在体内循环而产生抗体的问题；选用靶向人核糖体DNA的非病毒的载体骨架(mini-pHrneo)，在原有打靶载体pHrneo骨架的基础上筛选表达框NEO两侧增加了LOXP位点，缩短同源臂，将有助于提高打靶效率，避开随机插入和免疫原性的风险。
(1)本发明的优势为：选用A型血友病病人的细胞诱导形成多能干细胞作为转染细胞，选用非病毒载体体外编辑，避免了现有技术使用病毒造成的随机插入和免疫原性的风险；体外编辑的病人特异性多能干细胞可以通过筛选获得100％纯度的整合细胞，相比现有技术病毒感染大大提高。
(2)引入血小板特异性启动子，FⅧ蛋白可以异位表达于血小板，相比现有细胞治疗技术避开了FⅧ蛋白在体内循环而产生抗体的问题，并在造血祖细胞中检测到高于通用型启动子在间充质干细胞中的FⅧ表达(结果对比见图12、13)。本发明造血祖细胞阶段FVIII分泌水平比现有技术应用过程中使用的MSC细胞分泌FVIII水平有着显著提高。
(3)诱导性多能干细胞可长期增殖保存，实用性强，适应性高。并且可定向分化，得到含血小板特异性启动子和BDD-F8基因片段的造血祖细胞用于治疗应用。
附图说明
图1为FⅧ的结构示意图；
图2为打靶载体(minipHrneo-2bF8)示意图；
图3为本发明的实验方案流程图；
图4为rDNA区添加BDD-F8打靶示意图；
图5为鉴定的PCR流程图；
图6为打靶后细胞的单克隆形态图；
图7为PCR测序电泳图；
图8为Southern印记杂交鉴定结果；
图9为诱导性多能干细胞克隆定向分化成造血祖细胞的细胞形态图；初始接种细胞团块形态(Day0)；分化流程中形态图(Day3)；分化完成时细胞形态图(Day 12)；
图10为定向分化后造血祖细胞的细胞流式分析结果；
图11为QRT-PCR检测F8基因转录水平表达情况；
图12为Elisa检测细胞裂解液中FⅧ蛋白情况；
图13为Elisa检测通用型启动子驱动BDD-F8基因在间充质肝细胞中表达FⅧ蛋白情况；
图14为多克隆位点图。
具体实施方式
实施例1
本发明的实验方案的流程图如图4所示。按照图4的流程，下面对本发明做具体的介绍，但以下实施例仅是举例参考，并不能限定本发明的保护范围。
1.建立血友病A病人特异性iPSCs
收集病人尿液细胞，在无菌环境下以400g的离心力离心，10min，弃上清液，用培养基将底部细胞重悬，接种在孔板中。培养3-5天，观察细胞形态和生长速度，当细胞培养到一定汇合度时，将细胞消化传代，状态良好的细胞为单一形态的上皮样。当细胞传至P2代时即可进行诱导，得到诱导性多能干细胞(iPSCs)。该部分参见已公开的学位论文(庞佳伦.外源F8定点整合至血友病A病人iPSCs核糖体基因区的研究[D].长沙：中南大学，2016)。
2.构建rDNA区打靶载体minipHrneo-2bF8
2.1以改造后的非病毒的人核糖体DNA(hrDNA)靶向载体mini-pHrneo为骨架，具体改造过程为：
在非病毒的人核糖体DNA(hrDNA)靶向载体pHrneo的筛选表达框NEO两侧加了LOXP位点，同时缩短了同源臂，以缩小供体质粒的大小。(参考已公开的学位论文(刘博.人iPSCs核糖体基因区IL24基因打靶及其分化MSCs的抗肿瘤研究[D].长沙：中南大学，2017：19-25)
2.2PCR扩增巨核细胞特异性启动子ITGA2B：
1)启动子序列为889bp，其序列如SEQ ID NO.1所示，按照启动子序列设计扩增引物：
F：TCTAGAGTGCTCAATGCTGTGCCTACGTG(SEQ ID NO.5)；
R：GATATCGGGCCAGCTCCTCCTCCTT(SEQ ID NO.6)。
2)使用2×Phanta Max Master Mix(Vazyme，P515-01)进行PCR扩增，得到目的启动子，反应体系如下：
2.3通过酶切连接方式将巨核细胞特异性启动子ITGA2B及BDD-F8基因表达框插入到mini-pHrneo的适当限制位点：
1)使用限制性内切酶BamHⅠ对载体骨架mini-pHrneo和ITGA2B启动子进行酶切，5ug质粒使用2uL BamHⅠ酶，放置于37℃培养箱中，6-8h；
2)酶切产物纯化后，使用T4连接酶，22℃反应过夜；
3)使用DH5α(天根)感受态对连接产物进行大肠杆菌转化，通过涂板挑取单克隆菌落；
4)将测序鉴定后连接成功的目的菌落进行扩增，37℃摇床摇菌过夜，抽提目的质粒。
5)使用限制性内切酶NheⅠ对载上述已连接ITGA2B启动子的载体和BDD-F8片段所在原质粒进行酶切，5ug质粒使用2uL NheⅠ酶，放置于37℃培养箱中，6-8h；
6)同第2-4步，得到目的质粒minipHrneo-2bF8，其序列如SEQ ID NO.4所示。获得的打靶载体的示意图见图2；打靶过程的示意图如图3所示。
3.联合TALENickase与minipHrneo-2bF8打靶HA-iPSCs
用仅有单链切割活性的转录激活因子样效应物切口酶(TALENickase)与minipHrneo-2bF8打靶载体对血友病病人特异性iPSCs进行基因打靶，得到含BDD-F8 基因的iPSCs(2bF8-iPSCs)。其中TALENickase的制备参照已发表的文章Wu,Y.,et al.,TALEnickase mediates high efficient targeted transgene integration at the humanmulti-copy ribosomal DNAlocus.Biochem Biophys Res Commun,2014.446(1):p.261-6.PMID:24589733。基因打靶包括，细胞核转、筛选和测序分析，具体步骤如下：
3.1细胞核转
1)将状态良好的待打靶iPSCs接种于Matrigel(Corning,354277)包被的6孔板中，使用mTeSR(StemCell Technologies,85850)培养基培养，每天换液；
2)待细胞长至汇合度80％-90％，在打靶前2小时给细胞换含有10uM Y-27632(StemCell Technologies,72304)的mTeSR培养基，放入温箱继续培养；
3)换液2小时后，吸弃培养基，加入1mL DPBS(Thermo Fisher Scientific,C14190500BT)轻轻冲洗，重复两遍，再加入1mLTrypLETMExpress(Thermo FisherScientific,12604021)，放入温箱中37℃消化3分钟；
4)吸弃消化液，用培养基将细胞吹下成单细胞悬液，收集到15mL离心管中，使用血球计数板计数，根据计数的浓度取适量细胞悬液1000rpm室温离心5min，取150 万细胞准备核转；
5)与此同时，取出Human Stem CellKit 2(Lonza,VPH-5022)核转染试剂盒，将上述试剂盒中的82μLSolution II与18μL的supplement I混合后置于室温平衡温度；
6)在上述100μL平衡后的核转液中，加入打靶载体以及TALENickase，三个质粒用量均为5μg，轻轻混匀；
7)细胞离心后弃上清，吸净残液，用上述加入载体后的核转液重悬细胞，动作轻柔的将细胞悬液加入到核转杯中，注意不要产生气泡；
8)将核转仪(Lonza NucleofectorTM 2b Device)事先调至B016程序，细胞加入核转杯后盖好盖子立即放入核转仪中启动程序，核转过程大概持续5秒；
9)核转完成后，立即像核转杯中加入500uL mTeSR培养基，随后放入温箱中待细胞适应5分钟；
10)取出用Matrigel 37℃包被过夜的培养板，用核转试剂盒中配置的吸管轻轻将细胞从核转杯中吸出接种到孔板中，重复向核转杯加入500uL mTeSR培养基，再次用吸管吸出加入孔板中；
11)向孔板中加入终浓度为10uM Y-27632，轻轻摇匀细胞，放入培养箱中培养。
3.2定点整合细胞的筛选
1)核转后的细胞用mTeSR每天换液培养，待细胞长至汇合度80％-90％时，吸弃培养基，用1ml 0.5mM EDTA(InvitrogenTM,AM9260G)吹洗两遍，再加入1ml室温放置 3分钟，消化结束后吸弃消化液，用mTeSR培养基将细胞吹下，按照1：2或1：3的比例传代至新的包被后的孔板中；
2)待细胞增殖状态良好，细胞汇合度达70％左右时，向mTeSR培养基中加入终浓度为50μg/ml新霉素(Thermo Fisher Scientific,10131035)筛选2-3天，保持每天换液；
3)停止新霉素筛选后，维持培养3-4天，待细胞正常增殖后，吸弃培养基，加入1mlDPBS轻轻冲洗，重复两遍，再加入1mL TrypLETMExpress，放入温箱中37℃消化 3分钟；
4)吸弃消化液，用培养基将细胞吹下成单细胞悬液，收集到15mL离心管中，使用血球计数板计数，根据计数的浓度取适量细胞悬液1000rpm室温离心5min，取1000 个细胞准备单细胞接种；
5)将细胞接种在提前包被了Matrigel的6cm培养皿，加入终浓度为10uM Y-27632，轻轻摇匀细胞，放入培养箱中培养；
6)大概培养8-10天后，待单细胞克隆增长至显微镜10倍镜视野大小时，使用巴氏玻璃管将克隆化成小块，用中枪头将细胞团块吸出至事先包被好的24孔板中培养；
7)待挑取的单克隆汇合度80％-90％时传代至两个24孔板的孔中，其中一个孔接种1/3细胞维持长期培养，剩余一个孔接种2/3细胞，待其汇合度90％时，抽提DNA进行单克隆分子鉴定。
3.3单克隆细胞整合结果鉴定：DNA提取，PCR测序，Southern印记杂交鉴定
3.3.1细胞DNA的抽提
1)将EDTA消化后的细胞直接吹下，收集到EP管中，800g离心5分钟；
2)提前配置细胞核裂解液，将1M TrisHCl 3mL、4M NaCl 25mL、0.5M EDTA2.5 mL用双蒸水定容至250mL，室温长期保存使用；
3)弃上清，加入0.5mL细胞核裂解液，重悬细胞，加入1uL RNase1和终浓度为200ng/mL的蛋白酶K，混匀后加入70uL 10％SDS溶液，放入摇床中37℃，90转过夜；
4)将裂解充分的细胞采用苯酚-氯仿方法手工提取，在细胞裂解液中加入等体积的苯酚溶液，上下颠倒混匀100次后，13000rpm室温离心10分钟；
5)离心同时准备新的EP管，做好标记，将大枪头剪掉尖锐的部分，以防将DNA 破坏；
6)将离心后EP管取出，可看到液体分为两层，慢慢的将上层水相吸至新EP管中，加入等体积的苯酚和氯仿1：1混合液，再次上下颠倒混匀100次，13000rpm室温离心 10分钟；
7)重复将上层水相转移至新的EP管中，加入2倍体积-20℃预冷的无水乙醇，轻柔的颠倒混匀，可见絮状DNA沉淀析出，13000rpm 4℃离心10分钟，注意EP管放入离心机时的方向，方便离心后观察沉淀；
8)离心后观察沉淀位置，小心吸弃上清，加入0.5mL 70％乙醇洗涤一次，13000rpm4℃离心5分钟；
9)重复吸弃上清，点离后用中枪头尽量洗干净残留液体，注意不要吸到沉淀；
10)将EP管放置于超净工作台中风干，待彻底风干后DNA沉淀应变为无色透明状；
11)加入适量的无菌双蒸水溶解DNA过夜，4℃保存待用。
3.3.2PCR测序
1)在打靶位点两端设计鉴定引物，要求产物包含同源臂以外的rDNA区片段和目的靶入基因片段，上下同源臂各一对；
表1鉴定引物
2)将抽提的细胞DNA作为模板进行鉴定PCR；
PCR体系为：
PCR循环条件如图5所示。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察是否有目的条带；
3)挑选出上下游鉴定都有目的条带的细胞，重复PCR过程，将产物送测序。
4)分析测序结果，靶入位点上下游是否与理论序列匹配，挑选出完全匹配的细胞进行后续实验。
得到的PCR测序的电泳条带如图7所示，挑选的18个细胞单克隆中有12个PCR 阳性。
打靶后的细胞经过新霉素筛选，于ClonR中接种培养单细胞，单细胞的形态图如图6所示。
在12个PCR鉴定阳性细胞中，随机挑选了8个细胞DNA进行Southern印记杂交鉴定。
3.3.3Southern印记杂交鉴定
1)用Xho I酶于37℃酶切10μg上述阳性细胞提取的gDNA至少16h以上。待酶切完全，回收酶切产物；
2)制作0.7cm宽梳齿孔的0.8％琼脂糖凝胶，更换现配的TBE于电泳槽中，将10μg每个样品的酶切gDNA加入琼脂糖胶孔中，使用DNAMolecular Weight Marker II,Digoxigenin-labeled(Roche，11218590910)为电泳Marker，以150V电压电泳时间2h，具体时间视目的条带大小适当调整。电泳时可开始准备折叠吸水纸，交叉叠放10cm厚压平压紧备用；
3)电泳结束后小心取出琼脂糖凝胶正面朝上置于漂洗盒中用双蒸水漂洗3次，然后加入TS变性液(20g NaOH和87.7g Nacl溶于1L双蒸水中)中浸泡并于脱色摇床上温和地漂洗15min。随后，更换新TS变性液并继续漂洗20min；
4)漂洗琼脂糖凝胶的同时准备尼龙膜。用刀裁剪出一张长度与宽度均比琼脂糖凝胶略小的尼龙膜，并剪出正反面标记。将膜水平浸泡于转膜液中至少5min；
5)将玻璃板架在转膜槽上，板上平铺两层滤纸，多余长度折下转膜槽中。用转膜液浸湿滤纸后，用玻璃棒碾平并赶出气泡。将琼脂糖凝胶正面朝上置于下层滤纸中央，同时也将尼龙膜正面朝下置于琼脂糖凝胶上方，再裁剪一张长宽都略小的滤纸浸湿后盖于膜上方，用玻璃棒碾平赶出气泡。随后用封口膜封紧四周，让液体只能通过尼龙膜中通过。将预先折叠的吸水纸放在滤纸最上方，并用200g重物压正，虹吸法转膜过夜；
6)转膜完毕后，将膜取出正面朝上用2×SSC漂洗2次。然后将尼龙膜夹在两张滤纸的中间，水平置于120℃的烤箱中真空烤膜30min，以固定DNA。同时将转膜后的琼脂糖凝胶用EB染色15min并进行紫外显影，确定DNA无残留；
7)按照10mL/100cm2尼龙膜的用量将适当体积的DIG Easy Hyb(Roche，11796895001)预杂交液加入到一支15mL离心管中于42℃循环水浴中预温。同时准备另一管7mL DIG Easy Hyb，于42℃循环水浴中预温；
8)将尼龙膜置于杂交桶内，然后将预温的杂交液加入到杂交桶内，小心调整膜，确保膜与桶壁间无气泡。将其置杂交炉内，设置42℃，进行预杂交30分钟；
9)在预杂交期间按照如下所示准备探针：
探针引物如表2所示：
表2探针引物
制备探针的PCR反应体系：
10)取10μL标记探针加入40μL灭菌水配置50μL体系置于PCR仪上99℃变性5 min。随后立即置于冰水混合物中静置5min，再将探针加入到新的7mL杂交液中。预杂交结束后弃尽预杂交液，再加入含标记探针的杂交液，将其置于杂交炉内，42℃进行杂交16h；
11)杂交完成后，回收杂交液并将其保存于-20℃(下次使用前，需于68℃变性10min)。取出尼龙膜正面朝上用2×SSC/0.1％SDS常温漂洗2次每次15min，再用事先 65℃预温的0.5×SSC/0.1％SDS于65℃水浴中不断晃动漂洗2次每次15min。洗脱期间可配制需后续使用的Washing buffer和blocking buffer；
12)洗脱完成后将洗脱液倒掉，加入100mL 1×Washing buffer在脱色摇床上室温漂洗尼龙膜5min；
13)弃尽Washing buffer，加入90mL 1×blocking buffer，在脱色摇床上室温封闭尼龙膜30min；
14)封闭过程中，可准备Anti-Digoxigenin-AP(Roche，11093274910)抗体。将抗体于4℃10000rpm离心5min后吸取中间层抗体2μL，按1:15000比例稀释至30mL blockingbuffer(Roche，11093657910)中。待封闭结束时，将封闭液倒掉，加入含有抗体的封闭液，在脱色摇床上室温孵育尼龙膜30min；
15)弃尽抗体溶液后，用100mL 1×Washing buffer(含0.3％吐温20的5X马来酸溶液)于室温漂洗尼龙膜2次每次15min。漂洗期间可配制需后续使用的Detection buffer(Roche，11093657910)；
16)弃尽Washing buffer后，加入30mL 1×Detection buffer室温平衡处理尼龙膜5 min；
17)处理完成后，将尼龙膜取出正面朝上置于显影夹内保鲜膜上，在暗室内将CDP-Star,ready-to-use(Roche，12041677001)均匀逐滴加入到尼龙膜上至完全覆盖其表面后，覆盖保鲜膜于尼龙膜正面，展平去除气泡后盖上显影夹，于室温反应5分钟； 18)将膜置于Bio-Rad显影仪(Bio-Rad)中进行显影，显影时间与针标记效率及 gDNA用量相关。观察分析条带。
结果如图8所示，阳性细胞均有4.9kb大小的目的条带。
另外，以上述同样的打靶方法比较了不同的质粒载体的打靶效果，具体结果如下：
表3使用不同载体打靶效率统计
可见，将筛选表达框NEO切掉，同时缩小供体质粒的大小，确实能将打靶效率提高了3倍以上。
4.造血祖细胞分化
将得到的2bF8-iPSCs按照Stem Cell公司的STEMdiffTMhematopoieticProgenitor Kit (Catalog#05310)使用说明，定向分化成造血祖细胞(2bF8-HPCs)，
1)将2bF8-iPSC培养至汇合度约80％时，EDTA消化3分钟，仍用mTeSR培养基将细胞吹散成团块，按照12孔板每孔16-40个克隆/6孔板每孔40-80个克隆的密度接种细胞团块，摇匀后放入温箱培养，该天记为Day-1。
2)细胞团块接种后第二天，换用上述分化Kit中含有A补充物的培养基(Diff A)培养，该天记为Day0。
3)每天观察细胞形态，Day1不换液，Day2半量换液，将原孔培养基轻轻吸出一半体积，再加入等体积的新鲜Diff A培养基。
4)Day3将培养基全部吸出丢弃，换用上述含有B补充物的培养基(Diff B)培养。
5)随后在Day5、Day7、Day10半量换液，随着培养进程推进，逐渐会有细胞从孔底脱落变成悬浮细胞，所以半量换液时，应先将准备丢弃的培养基离心，将细胞保留下来，再用新鲜培养基将细胞重悬接种回孔板中。
6)在Day12即可收获到分化的HPC。
分化的形态图如图9所示；细胞接种时(Day 0)成克隆状贴壁生长，随着分化的进行(Day 3)逐渐变化为颗粒状单层贴壁细胞形态，随后持续几天细胞数量扩增，并有少量贴壁细胞从培养板底部脱落成悬浮状单细胞，直到分化结束时(Day 12)大量细胞悬浮生长。
5.HPCs磁珠分选
然后，按照Stem Cell公司的Direct CD34 Progenitor Cell Isolation Kit使用说明，再将分化得到的2bF8-HPCs进行分选纯化。
1)当细胞培养至Day12，用枪头轻轻吹匀培养基，收集到15mL离心管中；
2)使用新鲜的F12培养基(Gibco，11765054)轻轻吹洗两次，收集到上述离心管中；
3)用DPBS清洗一遍，丢弃液体。加入1/2培养基体积的Accutase(Gibco，A1110501)消化液，放置于培养箱中37℃消化20分钟后，收集至上述离心管中；
4)重复第2步；
5)将收集的细胞悬液轻轻吹打使细胞分散开，随后通过40um细胞筛，将滤下的细胞悬液以300g转速离心5分钟；
6)离心后弃上清，用1mL预冷的MAC buffer(含0.5％BSA、2mM EDTA的DPBS 溶液)重悬细胞，取10uL细胞悬液稀释进行台盼蓝染色计数。
7)将剩余细胞悬液以300g转速离心5分钟；
8)离心后弃上清，使用60uL MAC buffer重悬细胞，按照细胞数量加入一定体积的上述分选试剂盒中的FCR混匀(20uL/107细胞)，加入等体积的CD34抗体，4℃放置 15分钟；
9)孵育结束后，加入1mL MAC buffer混匀，以300g转速离心5分钟；
10)离心的同时，将分选磁柱放置在磁板上，加入3mL MAC buffer平衡柱子；
11)离心后弃上清，用1mL预冷的MAC buffer重悬细胞，加入平衡后的分选磁柱中，等待其自主流下；
12)细胞悬液全部通过后，在柱子中加入3mL预冷的MAC buffer，待其自主留下，重复三次；
13)最后将分选柱从磁力架上取下，准备干净的15mL离心管，将柱子控制在离心管上方，加入5mL MAC buffer后，快速一次性将细胞推至离心管中；
14)细胞悬液以300g转速离心5分钟，丢弃上清，收集到的CD34阳性细胞可用于后续鉴定实验或使用CD34细胞扩增培养基重悬，接种至低吸附孔板中。
6.HPCs鉴定
分选纯化后的细胞通过表面标记物抗体染色：
1)将4.5分选收集到的细胞用含5％BSA的DPBS重悬后计数；
2)取104细胞放入EP管中，100g离心5分钟；
3)离心后弃上清，用100uL含5％BSA的DPBS重悬细胞；
4)在细胞悬液中加入HPC表面标记抗体CD34、CD41、CD43、CD45、CD38及死活染料(BD，Becton,Dickinson and Company)，轻轻混匀后，避光放置于冰上孵育 30分钟；
5)孵育结束后100g离心5分钟，吸弃上清，用200uL含5％BSA的DPBS重悬细胞；
6)将细胞悬液在细胞流式仪上机检测，整理分析数据。
细胞流式分析的结果如图10所示，分选后CD34阳性细胞的比例高于90％， 2bF8-HPCs呈CD34阳性、CD43阳性、CD38阴性，并且包含少部分CD41a阳性细胞 (巨核-血小板表面标记)，符合造血祖细胞鉴定标准。
7.F8在HPC中的表达鉴定
7.1QPCR检测HPC细胞阶段F8基因表达情况
1)将分选纯化后收集到的细胞抽提细胞总RNA；
①清理超净工作台，并开启紫外照射灭菌20min；
②弃去细胞悬液上清，用中枪头将残余培养基吸干净，加入500uL的TrizolReagent (invitrogen，15596026)，室温孵育5min后转移至EP管中；
③每管加入200uL三氯甲烷，用力振荡混匀15s，室温静置3min，然后12000g， 4℃离心，15min；
④离心后，EP管中的液体分层，下层为红色的酚氯仿层，上层为无色透明的水层，RNA溶解在上层液体中，将EP管倾斜45°，小心将上层清液转移到新的EP管中，务必不要吸到下层的液体；
⑤在EP管中加入500uL的异丙醇，颠倒混匀后室温静置10min，12,000g，4℃离心10min；
⑥离心后可见RNA沉淀到管底，弃去上清，加入1mL DEPC水配制的75％乙醇，短暂振荡样品后，7500×g，4℃离心5min；
⑦弃去上清，点离后用中枪头吸去残余的液体，自然风干5-10min，加入适量的无核酸酶的水，用中枪头轻轻吹打混匀，将RNA样品置于55-60℃孵育10-15min，使 RNA充分溶解；
测量RNA样品的吸光度值，在样品上标记浓度，继续下一步实验或保存在-80℃。
2)使用逆转录试剂盒II 1st Strand cDNA Synthesis Kit(Vazyme，R212-01) 将抽提的RNA逆转为cDNA；
①在无核酸酶的离心管中配制如下混合液：
②将上述体系置于PCR仪中，42℃孵育2min，去除基因组DNA残留；
③配置逆转录反应体系：
④将上述体系置于PCR仪中，50℃孵育15min，85℃，5s；反应产物可以立即用于PCR反应，或短期保存在-20℃，长期保存需分装后保存在-70℃，避免反复冻融。
3)通过RT-qPCR检测F8基因表达，分析结果。
使用QPCR试剂盒(Vazyme，Q711-02/03)配置如下体系：
将样品放入Bio-Rad荧光定量PCR仪，按照如下设置程序：
| 预变性 | 95℃ | 3min |
| 循环反应(40个循环) | 95℃ | 10s |
| 60℃ | 30s | |
| 融解曲线 | 95℃ | 15s |
| 60℃ | 1min | |
| 95℃ | 15s |
反应结束后用Bio-Rad CFX Manager软件分析基因的转录表达情况。
结果如图11所示。2bF8-iPSCs的转录水平F8基因表达量显著高于正常人iPSCs(hiPSCs)的转录水平F8基因表达量，同样，2bF8-HPCs转录水平F8基因表达量显著高于正常人HPCs(hHPCs)的转录水平F8基因表达量。
7.2ELISA检测细胞培养上清和细胞裂解液中的FⅧ含量
使用Affinity Biologicals公司的F8C-ELISA试剂盒(EIA8-0045R1)进行检测。
1)细胞计数后于相应的培养基中培养24h，收集培养基上清和细胞；
2)将收集到的细胞再次计数，记录，用500uL细胞裂解液重悬细胞，放入液氮快速冷冻细胞，取出放入37℃水浴箱中融解，该过程重复三次；
3)将裂解后的样品400g离心10分钟，取上清作为待测样品；
4)用coating buffer将Capture antibody以1:100稀释，在96孔酶标板中每孔加100 μL，室温静置孵育2h；
5)按照10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625、0ng/mL浓度梯度稀释标准品；
6)分别设置空白孔、标准孔、待测样品孔，其中空白孔不加入样品和酶标试剂。酶标包被板加样过程中因将样品直接加至板孔底部不触及孔壁；
7)用封板膜封板后，置于37℃孵育2h；
8)揭开封板膜后吸尽液体。每孔加入100μL 1×washing buffer静置30s后吸弃，反复洗涤孔板5次；
9)每孔加入50μL detecting antibody，空白孔除外。用封板膜封板后，置于37℃孵育1h；
10)同步骤5)再次洗涤孔板5次；
11)在12mL substrate Buffer中加入OPD药片配置OPD溶液，加入12μL 30％的过氧化氢，在每孔中加入50μL，放置15分钟；
12)每孔加50μL stopping solution，终止显色反应；
13)终止显色后15min内于酶标仪中490nm波长下检测各样品孔的OD值，绘制标准曲线并计算样品中FⅧ蛋白含量。
结果如图12所示。2bF8-HPCs和未整合的hHPCs在培养上清中均检测不到FⅧ蛋白的分泌表达，但在细胞裂解液中，HPCs的FⅧ蛋白表达量显著高于iPSCs的FⅧ蛋白表达量。与图13中rDNA区定点基因添加通用型启动子启动的BDD-F8的iPSCs分化而来的MSCs中FVIII表达分泌量相比，本发明中HPCs中FVIII表达分泌显著提高，可以更加有效治疗血友病A。
SEQUENCE LISTING
<110> 中南大学
<120> 一种重组载体及其制备方法和应用
<130> 22
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 889
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
gtgctcaatg ctgtgcctac gtgtgttagc ccacgcggcc agcctgagga gtcagggaag 60
gctcccctag gcaaagcccc caaccagaat caagtcttaa tggttaaaga gctccatcac 120
ccaaaaagga ttgagggcct accttcaact gaacagctaa tgcataatct cagaaactgt 180
gagtcaaaat tccctggaat aactccactt tatccccaat ctccttgcca cctagaccaa 240
ggtccattca ccaccctgtc cccagcactg actgcactgc tgtggccaca ctaaagcttg 300
gctcaagacg gaggaggagt gaggaagctg ctgcaccaat atggctggtt gaggccgccc 360
aaggtcctag aaggaggaag tgggtaaatg ccatatccaa aaagatacag aagcctcagg 420
ttttatcggg ggcagcagct tccttctcct tccccgacct gtggccaagt cacaaagcac 480
cacagctgta cagccagatg ggggaaggga ggagattaga actgtaggct agagtagaca 540
agtatggacc agttcacaat cacgctatcc caagcagaaa gtgatggtgg cttggactag 600
cacggtggta gtagagatgg ggtaaagatt caagagacat cattgatagg cagaaccaat 660
aggacatggt aataaactat tctcaggaaa ggggaggagt catggctttc agccatgagc 720
atccaccctc tgggtggcct cacccacttc ctggcaattc tagccaccat gagtccaggg 780
gctatagccc tttgctctgc ccgttgctca gcaagttact tggggttcca gtttgataag 840
aaaagacttc ctgtggagga atctgaaggg aaggaggagg agctggccc 889
<210> 2
<211> 4416
<212> DNA
<213> 人工合成
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accagaagat actacctggg tgcagtggaa ctgtcatggg actatatgca aagtgatctc 120
ggtgagctgc ctgtggacgc aagatttcct cctagagtgc caaaatcttt tccattcaac 180
acctcagtcg tgtacaaaaa gactctgttt gtagaattca cggatcacct tttcaacatc 240
gctaagccaa ggccaccctg gatgggtctg ctaggtccta ccatccaggc tgaggtttat 300
gatacagtgg tcattacact taagaacatg gcttcccatc ctgtcagtct tcatgctgtt 360
ggtgtatcct actggaaagc ttctgaggga gctgaatatg atgatcagac cagtcaaagg 420
gagaaagaag atgataaagt cttccctggt ggaagccata catatgtctg gcaggtcctg 480
aaagagaatg gtccaatggc ctctgaccca ctgtgcctta cctactcata tctttctcat 540
gtggacctgg taaaagactt gaattcaggc ctcattggag ccctactagt atgtagagaa 600
gggagtctgg ccaaggaaaa gacacagacc ttgcacaaat ttatactact ttttgctgta 660
tttgatgaag ggaaaagttg gcactcagaa acaaagaact ccttgatgca ggatagggat 720
gctgcatctg ctcgggcctg gcctaaaatg cacacagtca atggttatgt aaacaggtct 780
ctgccaggtc tgattggatg ccacaggaaa tcagtctatt ggcatgtgat tggaatgggc 840
accactcctg aagtgcactc aatattcctc gaaggtcaca catttcttgt gaggaaccat 900
cgccaggcgt ccttggaaat ctcgccaata actttcctta ctgctcaaac actcttgatg 960
gacgagggac agtttctact gagctgtcat atctcttccc accaacatga tggcatggaa 1020
gcttatgtca aagtagacag ctgtccagag gaaccccaac tacgaatgaa aaataatgaa 1080
gaagcggaag actatgatga tgatcttact gattctgaaa tggatgtggt caggtttgat 1140
gatgacaact ctccttcctt tatccaaatt cgctcagttg ccaagaagca tcctaaaact 1200
tgggtacatt acattgctgc tgaagaggag gactgggact atgctccctt agtcctcgcc 1260
cccgatgaca gaagttataa aagtcaatat ttgaacaatg gccctcagcg gattggtagg 1320
aagtacaaaa aagtccgatt tatggcatac acagatgaaa cctttaagac tcgtgaagct 1380
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ttgattatat ttaagaatca agcaagcaga ccatataaca tctaccctca cggaatcact 1500
gatgtccgtc ctttgtattc aaggagatta ccaaaaggtg taaaacattt gaaggatttt 1560
ccaattctgc caggagaaat attcaaatat aaatggacag tgactgtaga agatgggcca 1620
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gatctagctt caggactcat tggccctctc ctcatctgct acaaagaatc tgtagatcaa 1740
agaggaaacc agataatgtc agacaagagg aatgtcatcc tgttttctgt atttgatgag 1800
aaccgaagct ggtacctcac agagaatata caacgctttc tccccaatcc agctggagtg 1860
cagcttgagg atccagagtt ccaagcctcc aacatcatgc acagcatcaa tggctatgtt 1920
tttgatagtt tgcagttgtc agtttgtttg catgaggtgg catactggta cattctaagc 1980
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ctaaatagct tggcgtaatc atggtcatag ctgtttcctg tgtgaaattg ttatccgctc 9420
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tggcctaact acggctacac tagaagaaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca 10260
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gtcgtgtaga taactacgat acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc tgcaatgata 10680
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cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt tgccattgct 10860
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cagagtcccg ctcagaagaa ct 22
Claims (6)
1.一种重组载体，其特征在于，包含血小板特异性启动子及其驱动的BDD-F8基因表达框的表达盒，其中所述BDD-F8基因表达框的序列如SEQ ID NO.2所示；所述血小板特异性启动子为ITGA2B，其序列如SEQ ID NO.1所示；所述重组载体的序列如SEQ ID NO.4所示；
所述重组载体是将血小板特异性启动子连接至载体骨架mini-pHrneo的BamH1限制性内切酶位点；将BDD-F8基因表达框连接至mini-pHrneo的Nhe1限制性内切酶位点；所述连接酶为T4连接酶Thermo 15224041；所述载体骨架mini-pHrneo的序列如SEQ ID NO.3所示；
所述载体为非病毒载体；
所述重组载体将BDD-F8的基因定点整合在基因组中。
2.一种由如权利要求1所述的重组载体制备的诱导性多能干细胞，其特征在于，包含血小板特异性启动子及其驱动的BDD-F8基因表达框的表达盒，其中所述BDD-F8基因表达框的序列如SEQ ID NO.2所示；所述血小板特异性启动子为ITGA2B，其序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求2所述的诱导性多能干细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）构建血友病A病人特异性iPSCs；
（2）利用TALENickase与权利要求1所述的重组载体对血友病A病人特异性iPSCs打靶，获得定点整合的诱导性多能干细胞。
4.一种造血祖细胞，其特征在于，由权利要求2所述的诱导性多能干细胞定向分化而成。
5.根据权利要求1所述的重组载体、包含权利要求1所述的重组载体的表达盒、权利要求2所述的诱导性多能干细胞或权利要求4所述的造血祖细胞在制备表达BDDFVIII或治疗A型血友病的药物和/或试剂中的应用。
6.一种治疗A型血友病的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的重组载体、权利要求2所述的诱导性多能干细胞或权利要求4所述的造血祖细胞中的任意一种或者多种。
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