KR20200132893A - 합성 dna 벡터 및 사용 방법 - Google Patents

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KR20200132893A
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브루스 씨. 슈넵
필립 알. 존슨
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인터갈락틱 테라퓨틱스, 인크.
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Abstract

본원에서는 이종성 유전자를 포함하는 단리된 DNA 벡터이며, 여기서 DNA 벡터에는 생체내 지속을 폐기할 수 있는 박테리아 플라스미드 DNA 및/또는 박테리아 시그니처가 없는 것인 단리된 DNA 벡터를 제공한다. 본 발명은 또한 대상체에서 이종성 유전자의 장기간의 에피솜 발현의 유도를 위해 사용될 수 있는, 본 발명의 DNA 벡터를 포함하는 제약 조성물 (비-면역원성 제약 조성물)을 특징으로 한다. 본 발명은 표적 유전자 중의 결함과 연관된 장애를 치료하는 방법을 포함하는, 본 발명의 DNA 벡터를 투여함으로써 대상체를 치료하는 방법을 포함한다.

Description

합성 DNA 벡터 및 사용 방법
서열 목록
본 출원은 ASCII 포맷으로 전자 제출된 서열 목록을 포함하고, 상기 서열 목록은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다. 2019년 3월 13일 작성된 상기 ASCII 사본 명칭은 51219-012WO4_Sequence_Listing_03.13.19_ST25이고, 그 크기는 18,483 바이트이다.
본 발명의 분야
일반적으로, 본 발명은 합성 DNA 벡터를 특징으로 한다.
유전자 요법은 대상체에서 장애의 기초가 되는 유전자 결함을 교정하기 위한 이종성 유전자의 표적 세포로의 형질도입을 포함한다. 지난 수십 년 동안 유전자 요법에서의 사용을 위해 다양한 형질도입 접근법이 개발되어 왔다. 예를 들어, 전통적인 박테리아 플라스미드 DNA 벡터가 유전자 전달에서 다용도 도구를 대표하지만, 그는 박테리아 기원이기 때문에 한계를 보일 수 있다. 플라스미드 DNA 벡터는박테리아 유전자, 예컨대, 항생제 내성 유전자 및 복제 기점을 포함한다. 추가로, 플라스미드 DNA 벡터는 박테리아 시그니처, 예컨대, CpG 모티프를 포함한다. 추가로, 플라스미드 DNA 벡터 제조를 위해 박테리아 발현 시스템을 사용하는 것은 박테리아 숙주로부터의 오염 불순물, 예컨대, 내독소 또는 박테리아 게놈 DNA 및 RNA를 도입할 수 있는 위험을 포함하며, 이는 예컨대, 전사 침묵화에 의한 생체내 유전자 발현 손실을 일으킬 수 있다.
재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV) 벡터는 다양한 모델 시스템에서 고효율의 유전자 전달이라는 기록이 확립되어 있으며, 현재는 매우 다양한 인간 질환에서 치료 양식으로서 시험되고 있다. rAAV 벡터의 게놈은 생체내에서 (예컨대, 유사분열 후 세포에서) 원형 에피솜으로서 지속될 수 있다. 감염 후, 단일 가닥 rAAV DNA는 세포 핵 내에서 이중 가닥 원형 DNA로 전환되고, 세포가 살아있는 동안 에피솜 형태로 지속된다. 따라서, AAV 벡터 시스템의 실질적인 이점은 표적 세포에서 장기간 동안 지속될 수 있는 능력이다. 한편, AAV 벡터는 예컨대, 패키징 능력이 약 4.5 Kb로 제한되어 있다는 점, 바이러스 단백질의 면역원성, 및 제조상 어려움과 같은 추가의 단점을 포함할 수 있다.
따라서, 관련 기술분야에서는 큰 페이로드를 가능하게 하고, 부작용 (예컨대, 염증)의 위험은 감소시킴과 동시에, 예컨대, rAAV가 제공하는 것과 같이 유전자 발현의 장기간 지속을 증진시키는 다용도의 효율적인 방법이 요구되고 있다.
본 발명의 한 측면에서, rAAV 벡터의 생체내 지속을 반복하는 비-바이러스성 단리된 원형 DNA 벡터를 제공한다. 본원에 제공된 DNA 벡터는 비-면역원성이고, AAV 패키징 능력이 약 4.5 Kb로 제한되지 않는다. 본 발명은 또한 (예컨대, 박테리아 발현 시스템의 부재하에 시험관내에서) 원형 DNA 벡터를 제조하는 방법, 원형 DNA 벡터를 포함하는 제약 조성물, 및 예컨대, 이종성 유전자의 지속적인 에피솜 발현을 유도하기 위해, 및 결함성 유전자와 연관된 질환을 치료하기 위해, 본원에 기술된 벡터를 사용하는 방법을 특징으로 한다.
한 측면에서, 본 발명은 하나 이상의 이종성 유전자를 포함하는 단리된 원형 DNA 벡터이며, 여기서 DNA 벡터에는 복제 기점 (예컨대, 박테리아 복제 기점) 및/또는 약물 내성 유전자 (예컨대, 박테리아 플라스미드의 부분으로서)가 결여된 것인 단리된 원형 DNA 벡터를 제공한다. 예를 들어, 하나 이상의 이종성 유전자를 포함하는 단리된 원형 DNA 벡터에는 복제 기점 (예컨대, 박테리아 복제 기점)이 결여되어 있을 수 있다. 추가로, 또는 대안적으로, 하나 이상의 이종성 유전자를 포함하는 단리된 원형 DNA 벡터에는 약물 내성 유전자 (예컨대, 박테리아 플라스미드의 부분으로서)가 결여되어 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 이종성 유전자를 포함하는 단리된 원형 DNA 벡터에는 복제 기점 (예컨대, 박테리아 복제 기점) 및 약물 내성 유전자 (예컨대, 박테리아 플라스미드의 부분으로서)가 결여되어 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, DNA 분자에는 박테리아 플라스미드 DNA가 결여되어 있다. 일부 실시양태에서, DNA 벡터에는 면역원성 박테리아 시그니처 (예컨대, 하나 이상의 박테리아-연관 CpG 모티프, 예컨대, 비메틸화된 CpG 모티프, 예컨대, CpG 섬)가 결여되어 있다. 일부 실시양태에서, DNA 벡터에는 RNA 폴리머라제 정지 부위 (예컨대, RNA 폴리머라제 II (RNAPII) 정지 부위)가 결여되어 있다.
일부 실시양태에서, 단리된 원형 DNA 벡터는 멘델(Mendelian)-유전성 망막 이영양증 (예컨대, 레버 선천성 흑암시(Leber's congenital amaurosis: LCA), 스타가트병(Stargardt Disease), 탄력섬유성 위황색종, 간체 추체 이영양증, 삼출성 유리체망막병증, 주버트 증후군(Joubert Syndrome), CSNB-1C, 색소성 망막염, 스티클러 증후군, 소두증 및 맥락망막병증, 색소성 망막염, CSNB 2, 어셔 증후군(Usher syndrome), 및 와그너 증후군(Wagner syndrome))을 치료하도록 구성된 치료 단백질을 코딩하는 하나 이상의 이종성 유전자를 포함한다. 예를 들어, 하나 이상의 이종성 유전자는 ABCA4, CEP290, ABCC6, RIMS1, LRP5, CC2D2A, TRPM1, IFT-172, COL11A1, TUBGCP6, KIAA1549, CACNA1F, MYO7A, VCAN, USH2A, 및 HMCN1일 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 ABCA4, CEP290, ABCC6, RIMS1, LRP5, CC2D2A, TRPM1, IFT-172, COL11A1, TUBGCP6, KIAA1549, CACNA1F, MYO7A, VCAN, USH2A, 및 HMCN1로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 이종성 유전자를 갖는 단리된 원형 DNA 벡터이며, 여기서 DNA 벡터에는 복제 기점 및/또는 약물 내성 유전자가 결여된 것인 단리된 원형 DNA 벡터를 제공한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 이종성 유전자는 망막 이영양증 (예컨대, 멘델-유전성 망막 이영양증, 예컨대, LCA, 스타가트병, 탄력섬유성 위황색종, 간체 추체 이영양증, 삼출성 유리체망막병증, 주버트 증후군, CSNB-1C, 색소성 망막염, 스티클러 증후군, 소두증 및 맥락망막병증, 색소성 망막염, CSNB 2, 어셔 증후군, 및 와그너 증후군으로 이루어진 군으로부터 선택되는 망막 이영양증)을 치료하도록 구성된 치료 단백질을 코딩한다.
또 다른 측면에서, 본원에서는 치료 단백질 (예컨대, 항체 또는 그의 부분, 성장 인자, 인터류킨, 인터페론, 항-아폽토시스 인자, 시토카인, 또는 항-당뇨병성 인자)을 코딩하는 하나 이상의 이종성 유전자를 갖는 단리된 원형 DNA 벡터이며, 여기서 DNA 벡터에는 복제 기점 및/또는 약물 내성 유전자가 결여된 것인 단리된 원형 DNA 벡터를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 트랜스-스플라이싱 분자를 포함하는 하나 이상의 이종성 유전자를 갖는 단리된 원형 DNA 벡터이며, 여기서 DNA 벡터에는 복제 기점 및/또는 약물 내성 유전자가 결여된 것인 단리된 원형 DNA 벡터를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 간-분비 치료 단백질을 코딩하는 하나 이상의 이종성 유전자를 포함하는 단리된 원형 DNA 벡터이며, 여기서 DNA 벡터에는 복제 기점 및/또는 약물 내성 유전자가 결여된 것인 단리된 원형 DNA 벡터를 제공한다. 일부 실시양태에서, 치료 단백질은 혈액 내로 분비된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 하나 이상의 이종성 유전자를 포함하는 단리된 원형 DNA 벡터이며, 여기서 DNA 벡터는 (a) 말단 반복 서열을 포함하고; (b) 복제 기점 및/또는 약물 내성 유전자가 결여된 것인 단리된 원형 DNA 벡터를 제공한다.
추가의 또 다른 측면에서, 본 발명은 복수의 동일한 앰플리콘을 갖는 단리된 선형 DNA 분자이며, 여기서 복수의 동일한 앰플리콘은 각각 치료 단백질 (예컨대, 망막 이영양증, 예컨대, 멘델-유전성 망막 이영양증을 치료하도록 구성된 치료 단백질)을 코딩하는 이종성 유전자를 포함하고, 여기서 DNA 분자에는 (a) 복제 기점 및/또는 약물 내성 유전자; 및 (b) 재조합 부위가 결여된 것인 단리된 선형 DNA 분자를 제공한다. 일부 실시양태에서, 망막 이영양증은 LCA, 스타가트병, 탄력섬유성 위황색종, 간체 추체 이영양증, 삼출성 유리체망막병증, 주버트 증후군, CSNB-1C, 색소성 망막염, 연령 관련 황반 변성 (AMD), 스티클러 증후군, 소두증 및 맥락망막병증, 색소성 망막염, CSNB 2, 어셔 증후군, 및 와그너 증후군으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 이종성 유전자는 ABCA4, CEP290, ABCC6, RIMS1, LRP5, CC2D2A, TRPM1, IFT-172, C3, COL11A1, TUBGCP6, KIAA1549, CACNA1F, MYO7A, VCAN, USH2A, 및 HMCN1로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 복수의 동일한 앰플리콘을 갖는 단리된 선형 DNA 분자이며, 여기서 복수의 동일한 앰플리콘은 각각 ABCA4, CEP290, ABCC6, RIMS1, LRP5, CC2D2A, TRPM1, IFT-172, C3, COL11A1, TUBGCP6, KIAA1549, CACNA1F, MYO7A, VCAN, USH2A, 및 HMCN1로 이루어진 군으로부터 선택되는 이종성 유전자를 포함하고, 여기서 DNA 분자에는 (a) 복제 기점 및/또는 약물 내성 유전자; 및 (b) 재조합 부위가 결여된 것인 단리된 선형 DNA 분자를 제공한다. 일부 실시양태에서, 이종성 유전자는 망막 이영양증 (예컨대, 멘델-유전성 망막 이영양증, 예컨대, LCA, 스타가트병, 탄력섬유성 위황색종, 간체 추체 이영양증, 삼출성 유리체망막병증, 주버트 증후군, CSNB-1C, 색소성 망막염, AMD, 스티클러 증후군, 소두증 및 맥락망막병증, 색소성 망막염, CSNB 2, 어셔 증후군, 또는 와그너 증후군)을 치료하도록 구성된 치료 단백질을 코딩한다.
또 다른 측면에서, 본원에서는 복수의 동일한 앰플리콘을 갖는 단리된 선형 DNA 분자이며, 여기서 복수의 동일한 앰플리콘은 각각 항체 또는 그의 부분, 응고 인자, 성장 인자, 호르몬, 인터류킨, 인터페론, 항-아폽토시스 인자, 항-종양 인자, 시토카인, 및 항-당뇨병성 인자를 코딩하는 이종성 유전자를 포함하고, 여기서 DNA 분자에는 (a) 복제 기점 및/또는 약물 내성 유전자; 및 (b) 재조합 부위가 결여된 것인 단리된 선형 DNA 분자를 제공한다.
추가의 또 다른 측면에서, 본 발명은 복수의 동일한 앰플리콘을 갖는 단리된 선형 DNA 분자이며, 여기서 복수의 동일한 앰플리콘은 각각 트랜스-스플라이싱 분자를 포함하는 이종성 유전자를 포함하고, 여기서 DNA 분자에는 (a) 복제 기점 및/또는 약물 내성 유전자; 및 (b) 재조합 부위가 결여된 것인 단리된 선형 DNA 분자를 특징으로 한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 복수의 동일한 앰플리콘을 갖는 단리된 선형 DNA 분자이며, 여기서 복수의 동일한 앰플리콘은 각각 간-분비 치료 단백질 (예컨대, 혈액 내로 분비되는 치료 단백질)을 코딩하는 이종성 유전자를 포함하고, 여기서 DNA 분자에는 복제 기점 및/또는 약물 내성 유전자가 결여된 것인 단리된 선형 DNA 분자를 제공한다.
상기 측면들 중 임의의 것의 일부 실시양태에서, 원형 DNA 벡터 또는 선형 DNA 분자는 하나 이상의 말단 반복 서열 (예컨대, 하나 이상의 역위 말단 반복 (ITR) 서열 (예컨대, 2개의 ITR 서열) 또는 그의 부분 (예컨대, 2개의 A 요소, B 요소, C 요소, 또는 D 요소), 또는 긴 말단 반복 (LTR) 서열 (예컨대, 2개의 LTR 서열))을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 말단 반복 서열의 길이는 적어도 10개의 염기쌍 (bp) (예컨대, 10 bp 내지 500 bp, 12 bp 내지 400 bp, 14 bp 내지 300 bp, 16 bp 내지 250 bp, 18 bp 내지 200 bp, 20 bp 내지 180 bp, 25 bp 내지 170 bp, 30 bp 내지 160 bp, 또는 50 bp 내지 150 bp, 예컨대, 10 bp 내지 15 bp, 15 bp 내지 20 bp, 20 bp 내지 25 bp, 25 bp 내지 30 bp, 30 bp 내지 35 bp, 35 bp 내지 40 bp, 40 bp 내지 45 bp, 45 bp 내지 50 bp, 50 bp 내지 55 bp, 55 bp 내지 60 bp, 60 bp 내지 65 bp, 65 bp 내지 70 bp, 70 bp 내지 80 bp, 80 bp 내지 90 bp, 90 bp 내지 100 bp, 100 bp 내지 150 bp, 150 bp 내지 200 bp, 200 bp 내지 300 bp, 300 bp 내지 400 bp, 또는 400 bp 내지 500 bp, 예컨대, 10 bp, 11 bp, 12 bp, 13 bp, 14 bp, 15 bp, 16 bp, 17 bp, 18 bp, 19 bp, 20 bp, 21 bp, 22 bp, 23 bp, 24 bp, 25 bp, 26 bp, 27 bp, 28 bp, 29 bp, 30 bp, 31 bp, 32 bp, 33 bp, 34 bp, 35 bp, 36 bp, 37 bp, 38 bp, 39 bp, 40 bp, 41 bp, 42 bp, 43 bp, 44 bp, 45 bp, 46 bp, 47 bp, 48 bp, 49 bp, 50 bp, 51 bp, 52 bp, 53 bp, 54 bp, 55 bp, 56 bp, 57 bp, 58 bp, 59 bp, 60 bp, 61 bp, 62 bp, 63 bp, 64 bp, 65 bp, 66 bp, 67 bp, 68 bp, 69 bp, 70 bp, 71 bp, 72 bp, 73 bp, 74 bp, 75 bp, 76 bp, 77 bp, 78 bp, 79 bp, 80 bp, 81 bp, 82 bp, 83 bp, 84 bp, 85 bp, 86 bp, 87 bp, 88 bp, 89 bp, 90 bp, 91 bp, 92 bp, 93 bp, 94 bp, 95 bp, 96 bp, 97 bp, 98 bp, 99 bp, 100 bp, 101 bp, 102 bp, 103 bp, 104 bp, 105 bp, 106 bp, 107 bp, 108 bp, 109 bp, 110 bp, 111 bp, 112 bp, 113 bp, 114 bp, 115 bp, 116 bp, 117 bp, 118 bp, 119 bp, 120 bp, 121 bp, 122 bp, 123 bp, 124 bp, 125 bp, 126 bp, 127 bp, 128 bp, 129 bp, 130 bp, 131 bp, 132 bp, 133 bp, 134 bp, 135 bp, 136 bp, 137 bp, 138 bp, 139 bp, 140 bp, 141 bp, 142 bp, 143 bp, 144 bp, 145 bp, 146 bp, 147 bp, 148 bp, 149 bp, 150 bp, 또는 그 초과)이다. 일부 실시양태에서, DNA 벡터는 DD 요소를 포함한다).
또 다른 측면에서, 본 발명은 복수의 동일한 앰플리콘을 포함하는 단리된 선형 DNA 분자이며, 여기서 복수의 동일한 앰플리콘은 각각 이종성 유전자를 포함하고, 여기서 DNA 분자는 (a) 말단 반복 서열 (예컨대, 상기 언급된 말단 반복 서열 중 임의의 것)을 포함하고; (b) 복제 기점 및/또는 약물 내성 유전자가 결여된 것인 단리된 선형 DNA 분자를 특징으로 한다.
일부 실시양태에서, 원형 DNA 벡터는 이종성 유전자 (예컨대, 하나 이상의 이종성 유전자)를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 이종성 유전자의 길이는 4.5 Kb 초과이다 (예컨대, 하나 이상의 이종성 유전자는 함께 또는 각각 단독으로 그 길이가 4.5 Kb 내지 25 Kb, 4.6 Kb 내지 24 Kb, 4.7 Kb 내지 23 Kb, 4.8 Kb 내지 22 Kb, 4.9 Kb 내지 21 Kb, 5.0 Kb 내지 20 Kb, 5.5 Kb 내지 18 Kb, 6.0 Kb 내지 17 Kb, 6.5 Kb 내지 16 Kb, 7.0 Kb 내지 15 Kb, 7.5 Kb 내지 14 Kb, 8.0 Kb 내지 13 Kb, 8.5 Kb 내지 12.5 Kb, 9.0 Kb 내지 12.0 Kb, 9.5 Kb 내지 11.5 Kb, 또는 10.0 Kb 내지 11.0 Kb, 예컨대, 그 길이가 4.5 Kb 내지 8 Kb, 8 Kb 내지 10 Kb, 10 Kb 내지 15 Kb, 15 Kb 내지 20 Kb, 또는 그 초과, 예컨대, 그 길이가 4.5 Kb 내지 5.0 Kb, 5.0 Kb 내지 5.5 Kb, 5.5 Kb 내지 6.0 Kb, 6.0 Kb 내지 6.5 Kb, 6.5 Kb 내지 7.0 Kb, 7.0 Kb 내지 7.5 Kb, 7.5 Kb 내지 8.0 Kb, 8.0 Kb 내지 8.5 Kb, 8.5 Kb 내지 9.0 Kb, 9.0 Kb 내지 9.5 Kb, 9.5 Kb 내지 10 Kb, 10 Kb 내지 10.5 Kb, 10.5 Kb 내지 11 Kb, 11 Kb 내지 11.5 Kb, 11.5 Kb 내지 12 Kb, 12 Kb 내지 12.5 Kb, 12.5 Kb 내지 13 Kb, 13 Kb 내지 13.5 Kb, 13.5 Kb 내지 14 Kb, 14 Kb 내지 14.5 Kb, 14.5 Kb 내지 15 Kb, 15 Kb 내지 15.5 Kb, 15.5 Kb 내지 16 Kb, 16 Kb 내지 16.5 Kb, 16.5 Kb 내지 17 Kb, 17 Kb 내지 17.5 Kb, 17.5 Kb 내지 18 Kb, 18 Kb 내지 18.5 Kb, 18.5 Kb 내지 19 Kb, 19 Kb 내지 19.5 Kb, 19.5 Kb 내지 20 Kb, 20 Kb 내지 21 Kb, 21 Kb 내지 22 Kb, 22 Kb 내지 23 Kb, 23 Kb 내지 24 Kb, 24 Kb 내지 25 Kb, 또는 그 초과, 예컨대, 그 길이가 약 4.5 Kb, 약 5.0 Kb, 약 5.5 Kb, 약 6.0 Kb, 약 6.5 Kb, 약 7.0 Kb, 약 7.5 Kb, 약 8.0 Kb, 약 8.5 Kb, 약 9.0 Kb, 약 9.5 Kb, 약 10 Kb, 약 11 Kb, 약 12 Kb, 약 13 Kb, 약 14 Kb, 약 15 Kb, 약 16 Kb, 약 17 Kb, 약 18 Kb, 약 19 Kb, 약 20 Kb, 또는 그 초과이다).
2개 이상의 이종성 유전자를 갖는 원형 DNA 벡터의 실시양태에서, 이종성 유전자는 동일한 유전자 또는 상이한 유전자일 수 있다 (예컨대, 이종성 유전자는 기능적으로 (예컨대, 신호전달 경로의 일부로서) 또는 구조적으로 (예컨대, 항체의 중쇄 및 경쇄 또는 그의 단편의, 예컨대 이량체화를 통해) 상호작용하는 펩티드를 코딩할 수 있다).
일부 실시양태에서, 원형 DNA 벡터의 이종성 유전자는 하나 이상의 트랜스-스플라이싱 분자를 포함한다.
일부 실시양태에서, 원형 DNA 벡터는 단량체 원형 벡터, 이량체 원형 벡터, 삼량체 원형 벡터 등)이다. 일부 실시양태에서, DNA 벡터는 단량체 원형 벡터이다. 일부 실시양태에서, 원형 DNA 벡터 (예컨대, 단량체 원형 벡터)는 이중 가닥이다. 일부 실시양태에서, 원형 DNA 벡터는 슈퍼코일드 (예컨대, 단량체 슈퍼코일드)이다.
일부 실시양태에서, 원형 DNA 벡터는 하나 이상의 이종성 유전자 상류에 프로모터 서열을 포함한다. 추가로 또는 대안적으로, 원형 DNA 벡터는 하나 이상의 이종성 유전자 하류에 폴리아데닐화 부위를 포함할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 원형 DNA 벡터는 5'에서 3'으로, 또는 3'에서 5'로 작동적으로 연결된 하기 요소: (i) 프로모터 서열; (ii) 하나 이상의 이종성 유전자; (iii) 폴리아데닐화 부위; 및 (iv) 말단 반복 서열 (예컨대, 하나 이상의 말단 반복 서열 (예컨대, 하나 이상의 역위 말단 반복 (ITR) 서열 (예컨대, 2개의 ITR 서열) 또는 긴 말단 반복 (LTR) 서열 (예컨대, 2개의 LTR 서열)))을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 단리된 원형 DNA 벡터 (예컨대, 본원에 기술된 원형 DNA 벡터 중 임의의 것)를 제조하는 방법을 특징으로 한다. 본 방법은 (i) AAV 게놈 (예컨대, 재조합 AAV (rAAV) 게놈, 예컨대, AAV 에피솜)을 포함하는 원형 DNA 분자를 포함하는 샘플을 제공하는 단계이며, 여기서 AAV 게놈은 이종성 유전자 및 말단 반복 서열 (예컨대, 하나 이상의 말단 반복 서열 (예컨대, 하나 이상의 역위 말단 반복 (ITR) 서열 (예컨대, 2개의 ITR 서열) 또는 긴 말단 반복 (LTR) 서열 (예컨대, 2개의 LTR 서열)))을 포함하는 것인 단계; (ii) 폴리머라제 (예컨대, 파지-폴리머라제)-매개 롤링-서클 증폭 (예컨대, 등온 폴리머라제 (예컨대, 파지 폴리머라제)-매개 롤링-서클 증폭)을 사용하여 AAV 게놈을 증폭시켜 선형 콘카타머를 생성하는 단계; (iii) 제한 효소를 사용하여 콘카타머를 분해하여 AAV 게놈을 생성하는 단계; 및 (iv) AAV 게놈을 자기-라이게이션시켜 이종성 유전자 및 말단 반복 서열을 포함하는 단리된 DNA 벡터를 제조하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 단리된 DNA 벡터를 칼럼 정제하여 단리된 DNA 벡터로부터 슈퍼코일드 DNA를 정제하는 단계를 추가로 포함한다. 슈퍼코일드 DNA는 단량체 슈퍼코일드 DNA일 수 있다. 일부 실시양태에서, 개방 이완형 원형 DNA가 칼럼 정제에서 슈퍼코일드 DNA로부터 분리되고, 이는 폐기될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이종성 유전자는 이전의 상기 측면에 기술된 이종성 유전자 중 임의의 것, 예컨대, 망막 이영양증 (예컨대, 멘델-유전성 망막 이영양증, LCA, 스타가트병, 탄력섬유성 위황색종, 간체 추체 이영양증, 삼출성 유리체망막병증, 주버트 증후군, CSNB-1C, 색소성 망막염, 연령 관련 황반 변성 (AMD), 스티클러 증후군, 소두증 및 맥락망막병증, 색소성 망막염, CSNB 2, 어셔 증후군, 및 와그너 증후군으로 이루어진 군으로부터 선택되는 망막 이영양증)을 치료하도록 구성된 치료 단백질을 코딩하는 이종성 유전자; 하기: ABCA4, CEP290, ABCC6, RIMS1, LRP5, CC2D2A, TRPM1, IFT-172, C3, COL11A1, TUBGCP6, KIAA1549, CACNA1F, MYO7A, VCAN, USH2A, 및 HMCN1 중 하나 이상의 것을 포함하는 이종성 유전자; 항체 또는 그의 부분, 응고 인자, 성장 인자, 호르몬, 인터류킨, 인터페론, 항-아폽토시스 인자, 항-종양 인자, 시토카인, 및 항-당뇨병성 인자를 코딩하는 이종성 유전자; 및/또는 트랜스-스플라이싱 분자인 이종성 유전자이다.
폴리머라제는 고온성 폴리머라제, 또는 (예컨대, 참조 폴리머라제와 비교하여) GC가 풍부한 잔기를 통해 높은 진행도를 갖는 폴리머라제일 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리머라제는 파지 폴리머라제이다. 일부 실시양태에서, 파지 폴리머라제는 Phi29 DNA 폴리머라제이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (i) AAV 게놈 (예컨대, AAV 에피솜)을 포함하는 원형 DNA 분자를 포함하는 샘플을 제공하는 단계이며, 여기서 AAV 게놈은 이종성 유전자 및 DD 요소를 포함하는 것인 단계; (ii) 제1 폴리머라제-매개 롤링-서클 증폭 (예컨대, 등온 폴리머라제-매개 롤링-서클 증폭)을 사용하여 AAV 게놈을 증폭시켜 제1 선형 콘카타머를 생성하는 단계; (iii) 제한 효소를 사용하여 제1 선형 콘카타머를 분해하여 제1 AAV 게놈을 생성하는 단계; (iv) 제1 AAV 게놈을 플라스미드 벡터로 클로닝하는 단계; (v) 말단 반복 서열 (예컨대, 하나 이상의 말단 반복 서열 (예컨대, 하나 이상의 역위 말단 반복 (ITR) 서열 (예컨대, 2개의 ITR 서열) 또는 긴 말단 반복 (LTR) 서열 (예컨대, 2개의 LTR 서열)))을 포함하는 플라스미드 클론을 확인하는 단계; (vi) 말단 반복 서열을 포함하는 플라스미드 클론을 분해하여 제2 AAV 게놈을 생성하는 단계; (vii) 제2 AAV 게놈을 자기-라이게이션시켜 원형 DNA 주형을 제조하는 단계; (viii) 제2 폴리머라제-매개 롤링-서클 증폭 (예컨대, 등온 폴리머라제-매개 롤링-서클 증폭)을 사용하여 원형 DNA 주형을 증폭시켜 제2 선형 콘카타머를 생성하는 단계; (ix) 제한 효소를 사용하여 제2 선형 콘카타머를 분해하여 제3 AAV 게놈을 생성하는 단계; 및 (x) 제3 AAV 게놈을 자기-라이게이션시켜 이종성 유전자 및 말단 반복 서열을 포함하는 단리된 DNA 벡터를 제조하는 단계를 포함하는, 단리된 원형 DNA 벡터를 제조하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 원형 DNA 벡터를 제조하는 방법에서 사용되는 폴리머라제는 파지 폴리머라제 (예컨대, Phi29 DNA 폴리머라제)이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (i) AAV 게놈 (예컨대, 재조합 AAV (rAAV) 게놈, 예컨대, AAV 에피솜)을 포함하는 원형 DNA 분자를 포함하는 샘플을 제공하는 단계이며, 여기서 AAV 게놈은 이종성 유전자 및 말단 반복 서열 (예컨대, 하나 이상의 말단 반복 서열 (예컨대, 하나 이상의 역위 말단 반복 (ITR) 서열 (예컨대, 2개의 ITR 서열) 또는 긴 말단 반복 (LTR) 서열 (예컨대, 2개의 LTR 서열)))을 포함하는 것인 단계; (ii) 폴리머라제-매개 롤링-서클 증폭 (예컨대, 등온 폴리머라제-매개 롤링-서클 증폭)을 사용하여 AAV 게놈을 증폭시켜 선형 콘카타머를 생성하는 단계; (iii) 제한 효소를 사용하여 콘카타머를 분해하여 AAV 게놈을 생성하는 단계; 및 (iv) AAV 게놈을 자기-라이게이션시켜 이종성 유전자 및 말단 반복 서열을 포함하는 단리된 원형 DNA 벡터를 제조하는 단계를 포함하는, 치료 원형 DNA 벡터를 제조하는 시험관내 방법을 특징으로 한다. 일부 실시양태에서, 폴리머라제는 파지 폴리머라제 (예컨대, Phi29 DNA 폴리머라제)이다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 단리된 DNA 벡터를 칼럼 정제하여 단리된 DNA 벡터로부터 슈퍼코일드 DNA를 정제하는 단계를 추가로 포함한다. 슈퍼코일드 DNA는 단량체 슈퍼코일드 DNA일 수 있다. 일부 실시양태에서, 개방 이완형 원형 DNA가 칼럼 정제에서 슈퍼코일드 DNA로부터 분리되고, 이는 폐기될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본원에서는 상기 언급된 원형 DNA 벡터 중 임의의 하나 이상의 것 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 비-면역원성이다 (예컨대, 박테리아 성분, 예컨대, 박테리아 시그니처, 예컨대, CpG 모티프가 실질적으로 없다). 일부 실시양태에서, 제약 조성물에는 바이러스 입자가 실질적으로 없다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 이종성 유전자의 발현을 필요로 하는 대상체에게 상기 언급된 원형 DNA 벡터 중 임의의 것 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물 (예컨대, 비-면역원성 제약 조성물)을 투여하는 단계를 포함하는, 이종성 유전자의 발현을 필요로 하는 대상체에서 이종성 유전자의 발현 (예컨대, 에피솜 발현)을 유도하는 방법을 특징으로 한다.
추가의 또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기술된 원형 DNA 벡터 및 조성물 (예컨대, 상기 측면들의 원형 DNA 벡터들 중 임의의 것 또는 그의 조성물)을 사용하여 치료하는 방법을 특징으로 한다. 본 발명은 대상체에게 상기 측면들 중 임의의 것의 제약 조성물을 치료 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 장애 (예컨대, 안구 장애, 예컨대, 망막 이영양증, 예컨대, 멘델-유전성 망막 이영양증)를 치료하는 방법을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 반복적으로 (예컨대, 약 1일 2회, 약 1일 1회, 약 주 5회, 약 주 4회, 약 주 3회, 약 주 2회, 약 주 1회, 약 월 2회, 약 월 1회, 약 매 6주마다 1회, 약 매 2개월마다 1회, 약 매 3개월마다 1회, 약 매 4개월마다 1회, 약 연 2회, 약 연 1회, 또는 그보다 덜 빈번하게) 투여된다.
일부 실시양태에서, 제약 조성물은 국소적으로 (예컨대, 안구에, (예컨대, 유리체내로), 간내, 대뇌내, 근육내, 에어로졸화에 의해, 진피내, 경피, 또는 피하) 투여된다. 일부 실시양태에서, 대상체는 레버 선천성 흑암시 (LCA), 스타가트병, 탄력섬유성 위황색종, 간체 추체 이영양증, 삼출성 유리체망막병증, 주버트 증후군, CSNB-1C, 연령 관련 황반 변성, 색소성 망막염, 스티클러 증후군, 소두증 및 맥락망막병증, 색소성 망막염, CSNB 2, 어셔 증후군, 또는 와그너 증후군 치료를 받고 있는 중인 대상체이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 박테리아 플라스미드 DNA가 없는 DNA 분자 중 이중 D (DD) 요소를 포함함으로써 rAAV 벡터의 생체내 지속을 반복하는 비-바이러스성 단리된 DNA 벡터를 특징으로 한다. 따라서, 본원에 제공된 DNA 벡터는 비-면역원성이고, AAV 패키징 능력이 약 4.5 Kb로 제한되지 않는다. 본 발명은 또한 DD 함유 DNA 벡터를 제조하는 방법, DD 함유 DNA 벡터를 포함하는 제약 조성물, 및 예컨대, 이종성 유전자의 에피솜 발현을 유도하기 위해, 및 결함성 유전자와 연관된 질환을 치료하기 위해, 본원에 기술된 벡터를 사용하는 방법을 특징으로 한다.
한 측면에서, 본 발명은 DD 요소를 포함하는 단리된 DNA 벡터이며, 여기서 DNA 벡터에는 복제 기점 (예컨대, 박테리아 복제 기점) 및/또는 약물 내성 유전자 (예컨대, 박테리아 플라스미드의 부분으로서)가 결여된 것인 단리된 DNA 벡터를 제공한다. 예를 들어, DD 요소를 포함하는 단리된 DNA 벡터에는 복제 기점 (예컨대, 박테리아 복제 기점)이 결여되어 있을 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, DD 요소를 포함하는 단리된 DNA 벡터에는 약물 내성 유전자 (예컨대, 박테리아 플라스미드의 부분으로서)가 결여되어 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, DD 요소를 포함하는 단리된 DNA 벡터에는 복제 기점 (예컨대, 박테리아 복제 기점) 및 약물 내성 유전자 (예컨대, 박테리아 플라스미드의 부분으로서)가 결여되어 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, DNA 분자에는 박테리아 플라스미드 DNA가 결여되어 있다. 일부 실시양태에서, DNA 벡터에는 면역원성 박테리아 시그니처 (예컨대, 하나 이상의 박테리아-연관 CpG 모티프, 예컨대, 비메틸화된 CpG 모티프)가 결여되어 있다. 일부 실시양태에서, DNA 벡터에는 RNA 폴리머라제 정지 부위 (예컨대, RNA 폴리머라제 II (RNAPII) 정지 부위)가 결여되어 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 DD 요소 및 박테리아 복제 기점 및/또는 약물 내성 유전자 (예컨대, 박테리아 플라스미드의 부분으로서)를 포함하는 단리된 DNA 벡터를 특징으로 한다.
상기 측면들 중 어느 하나의 것의 일부 실시양태에서, DNA 벡터는 이종성 유전자 (예컨대, 하나 이상의 이종성 유전자)를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 이종성 유전자의 길이는 4.5 Kb 초과이다 (예컨대, 하나 이상의 이종성 유전자는 함께 또는 각각 단독으로 그 길이가 4.5 Kb 내지 25 Kb, 4.6 Kb 내지 24 Kb, 4.7 Kb 내지 23 Kb, 4.8 Kb 내지 22 Kb, 4.9 Kb 내지 21 Kb, 5.0 Kb 내지 20 Kb, 5.5 Kb 내지 18 Kb, 6.0 Kb 내지 17 Kb, 6.5 Kb 내지 16 Kb, 7.0 Kb 내지 15 Kb, 7.5 Kb 내지 14 Kb, 8.0 Kb 내지 13 Kb, 8.5 Kb 내지 12.5 Kb, 9.0 Kb 내지 12.0 Kb, 9.5 Kb 내지 11.5 Kb, 또는 10.0 Kb 내지 11.0 Kb, 예컨대, 그 길이가 4.5 Kb 내지 8 Kb, 8 Kb 내지 10 Kb, 10 Kb 내지 15 Kb, 15 Kb 내지 20 Kb, 또는 그 초과, 예컨대, 그 길이가 4.5 Kb 내지 5.0 Kb, 5.0 Kb 내지 5.5 Kb, 5.5 Kb 내지 6.0 Kb, 6.0 Kb 내지 6.5 Kb, 6.5 Kb 내지 7.0 Kb, 7.0 Kb 내지 7.5 Kb, 7.5 Kb 내지 8.0 Kb, 8.0 Kb 내지 8.5 Kb, 8.5 Kb 내지 9.0 Kb, 9.0 Kb 내지 9.5 Kb, 9.5 Kb 내지 10 Kb, 10 Kb 내지 10.5 Kb, 10.5 Kb 내지 11 Kb, 11 Kb 내지 11.5 Kb, 11.5 Kb 내지 12 Kb, 12 Kb 내지 12.5 Kb, 12.5 Kb 내지 13 Kb, 13 Kb 내지 13.5 Kb, 13.5 Kb 내지 14 Kb, 14 Kb 내지 14.5 Kb, 14.5 Kb 내지 15 Kb, 15 Kb 내지 15.5 Kb, 15.5 Kb 내지 16 Kb, 16 Kb 내지 16.5 Kb, 16.5 Kb 내지 17 Kb, 17 Kb 내지 17.5 Kb, 17.5 Kb 내지 18 Kb, 18 Kb 내지 18.5 Kb, 18.5 Kb 내지 19 Kb, 19 Kb 내지 19.5 Kb, 19.5 Kb 내지 20 Kb, 20 Kb 내지 21 Kb, 21 Kb 내지 22 Kb, 22 Kb 내지 23 Kb, 23 Kb 내지 24 Kb, 24 Kb 내지 25 Kb, 또는 그 초과, 예컨대, 그 길이가 약 4.5 Kb, 약 5.0 Kb, 약 5.5 Kb, 약 6.0 Kb, 약 6.5 Kb, 약 7.0 Kb, 약 7.5 Kb, 약 8.0 Kb, 약 8.5 Kb, 약 9.0 Kb, 약 9.5 Kb, 약 10 Kb, 약 11 Kb, 약 12 Kb, 약 13 Kb, 약 14 Kb, 약 15 Kb, 약 16 Kb, 약 17 Kb, 약 18 Kb, 약 19 Kb, 약 20 Kb, 또는 그 초과)이다.
2개 이상의 이종성 유전자를 갖는 실시양태에서, 이종성 유전자는 동일한 유전자 또는 상이한 유전자일 수 있다 (예컨대, 이종성 유전자는 기능적으로 (예컨대, 신호전달 경로의 일부로서) 또는 구조적으로 (예컨대, 항체의 중쇄 및 경쇄 또는 그의 단편의, 예컨대 이량체화를 통해) 상호작용하는 펩티드를 코딩할 수 있다).
일부 실시양태에서, 이종성 유전자는 하나 이상의 트랜스-스플라이싱 분자를 포함한다.
일부 실시양태에서, DNA 벡터는 원형 벡터 (예컨대, 단량체 원형 벡터, 이량체 원형 벡터, 삼량체 원형 벡터 등)이다. 일부 실시양태에서, DNA 벡터는 단량체 원형 벡터이다.
일부 실시양태에서, DNA 벡터는 하나 이상의 이종성 유전자 상류에 프로모터 서열을 포함한다. 추가로 또는 대안적으로, DNA 벡터는 하나 이상의 이종성 유전자 하류에 폴리아데닐화 부위를 포함할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, DNA 벡터는 5'에서 3'으로, 또는 3'에서 5'로 작동적으로 연결된 하기 요소: (i) 프로모터 서열; (ii) 하나 이상의 이종성 유전자; (iii) 폴리아데닐화 부위; 및 (iv) DD 요소를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (i) AAV 게놈 (예컨대, 재조합 AAV (rAAV) 게놈, 예컨대, AAV 에피솜)을 포함하는 원형 DNA 분자를 포함하는 샘플을 제공하는 단계이며, 여기서 AAV 게놈은 이종성 유전자 및 DD 요소를 포함하는 것인 단계; (ii) 폴리머라제 (예컨대, 파지-폴리머라제)-매개 롤링-서클 증폭 (예컨대, 등온 폴리머라제 (예컨대, 파지 폴리머라제)-매개 롤링-서클 증폭)을 사용하여 AAV 게놈을 증폭시켜 선형 콘카타머를 생성하는 단계; (iii) 제한 효소를 사용하여 콘카타머를 분해하여 AAV 게놈을 생성하는 단계; 및 (iv) AAV 게놈을 자기-라이게이션시켜 이종성 유전자 및 DD 요소를 포함하는 단리된 DNA 벡터를 제조하는 단계를 포함하는, 단리된 DNA 벡터 (예컨대, 본원에 기술된 DNA 벡터 중 임의의 것)를 제조하는 방법을 특징으로 한다. 폴리머라제는 고온성 폴리머라제, 또는 (예컨대, 참조 폴리머라제와 비교하여) GC가 풍부한 잔기를 통해 높은 진행도를 갖는 폴리머라제일 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리머라제는 파지 폴리머라제이다. 일부 실시양태에서, 파지 폴리머라제는 Phi29 DNA 폴리머라제이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (i) AAV 게놈 (예컨대, AAV 에피솜)을 포함하는 원형 DNA 분자를 포함하는 샘플을 제공하는 단계이며, 여기서 AAV 게놈은 이종성 유전자 및 DD 요소를 포함하는 것인 단계; (ii) 제1 폴리머라제-매개 롤링-서클 증폭 (예컨대, 등온 폴리머라제-매개 롤링-서클 증폭)을 사용하여 AAV 게놈을 증폭시켜 제1 선형 콘카타머를 생성하는 단계; (iii) 제한 효소를 사용하여 제1 선형 콘카타머를 분해하여 제1 AAV 게놈을 생성하는 단계; (iv) 제1 AAV 게놈을 플라스미드 벡터로 클로닝하는 단계; (v) DD 요소를 포함하는 플라스미드 클론을 확인하는 단계; (vi) DD 요소를 포함하는 플라스미드 클론을 분해하여 제2 AAV 게놈을 생성하는 단계; (vii) 제2 AAV 게놈을 자기-라이게이션시켜 원형 DNA 주형을 제조하는 단계; (viii) 제2 폴리머라제-매개 롤링-서클 증폭 (예컨대, 등온 폴리머라제-매개 롤링-서클 증폭)을 사용하여 원형 DNA 주형을 증폭시켜 제2 선형 콘카타머를 생성하는 단계; (ix) 제한 효소를 사용하여 제2 선형 콘카타머를 분해하여 제3 AAV 게놈을 생성하는 단계; 및 (x) 제3 AAV 게놈을 자기-라이게이션시켜 이종성 유전자 및 DD 요소를 포함하는 단리된 DNA 벡터를 제조하는 단계를 포함하는, 단리된 DNA 벡터를 제조하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 폴리머라제는 파지 폴리머라제 (예컨대, Phi29 DNA 폴리머라제)이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (i) AAV 게놈 (예컨대, 재조합 AAV (rAAV) 게놈, 예컨대, AAV 에피솜)을 포함하는 원형 DNA 분자를 포함하는 샘플을 제공하는 단계이며, 여기서 AAV 게놈은 이종성 유전자 및 DD 요소를 포함하는 것인 단계; (ii) 폴리머라제-매개 롤링-서클 증폭 (예컨대, 등온 폴리머라제-매개 롤링-서클 증폭)을 사용하여 AAV 게놈을 증폭시켜 선형 콘카타머를 생성하는 단계; (iii) 제한 효소를 사용하여 콘카타머를 분해하여 AAV 게놈을 생성하는 단계; 및 (iv) AAV 게놈을 자기-라이게이션시켜 이종성 유전자 및 DD 요소를 포함하는 단리된 DNA 벡터를 제조하는 단계를 포함하는, 치료 DNA 벡터를 제조하는 시험관내 방법을 특징으로 한다. 일부 실시양태에서, 폴리머라제는 파지 폴리머라제 (예컨대, Phi29 DNA 폴리머라제)이다.
또 다른 측면에서, 본원에서는 상기 측면들 중 임의의 것의 DNA 벡터 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 비-면역원성이다 (예컨대, 면역원성 성분, 예컨대, 박테리아 시그니처, 예컨대, CpG 모티프가 실질적으로 없다). 일부 실시양태에서, 제약 조성물에는 바이러스 입자가 실질적으로 없다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 이종성 유전자의 발현을 필요로 하는 대상체에게 상기 측면들 중 임의의 것의 DNA 벡터 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물 (예컨대, 비-면역원성 제약 조성물)을 투여하는 단계를 포함하는, 이종성 유전자의 발현을 필요로 하는 대상체에서 이종성 유전자의 발현 (예컨대, 에피솜 발현)을 유도하는 방법을 특징으로 한다. 일부 실시양태에서, 발현은 대상체의 간에서 유도된다. 간은 이종성 유전자에 의해 코딩된 치료 단백질을 (예컨대, 혈액 내로) 분비할 수 있다.
추가의 또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기술된 DNA 벡터 및 조성물 (예컨대, 상기 측면의 벡터 또는 조성물 중 임의의 것)을 사용한 치료 방법을 특징으로 한다. 본 발명은 대상체에게 상기 측면 중 임의의 것의 제약 조성물을 치료 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 장애 (예컨대, 안구 장애, 예컨대, 망막 이영양증, 예컨대, 멘델-유전성 망막 이영양증)를 치료하는 방법을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 반복적으로 (예컨대, 약 1일 2회, 약 1일 1회, 약 주 5회, 약 주 4회, 약 주 3회, 약 주 2회, 약 주 1회, 약 월 2회, 약 월 1회, 약 매 6주마다 1회, 약 매 2개월마다 1회, 약 매 3개월마다 1회, 약 매 4개월마다 1회, 약 연 2회, 약 연 1회, 또는 그보다 덜 빈번하게) 투여된다.
일부 실시양태에서, 제약 조성물은 국소적으로 (예컨대, 안구에, (예컨대, 유리체내로), 간내, 대뇌내, 근육내, 에어로졸화에 의해, 진피내, 경피, 또는 피하) 투여된다. 다른 실시양태에서, 제약 조성물은 전신으로 (예컨대, 정맥내로) 투여된다. 일부 실시양태에서, 대상체는 레버 선천성 흑암시 (LCA), 스타가트병, 탄력섬유성 위황색종, 간체 추체 이영양증, 삼출성 유리체망막병증, 주버트 증후군, CSNB-1C, 연령 관련 황반 변성, 색소성 망막염, 스티클러 증후군, 소두증 및 맥락망막병증, 색소성 망막염, CSNB 2, 어셔 증후군, 또는 와그너 증후군 치료를 받고 있는 중인 대상체이다.
도 1은 AAV2의 말단 반복 서열 (이 경우, 이중 D (DD) 요소)의 형성을 보여주는 개략적 다이어그램이다. AAV2 역위 말단 반복부 (ITR)의 길이는 145 bp이고, AAV 게놈의 각 말단에 위치한다. ITR은 염기쌍을 형성할 수 있고, 헤어핀 유사 구조를 형성할 수 있는 (A, B, C, 및 D로 지정된) 역위 서열을 함유한다. 단일 ITR은 2개의 "A," "B," 및 "C" 영역, 및 단일 "D" 영역을 함유한다. 2개의 ITR은 재조합하여 길이가 165 bp이고, 단일 ITR과 유사하지만, 이제는 2개의 "D" 영역을 함유하는 것인 DD 요소를 형성할 수 있다.
도 2a-2i는 ITR 내의 A, B, C, 및 D 요소의 위치 및 서열을 보여주는, 다양한 AAV 혈청형에 대한 예시적인 ITR 서열을 나타낸 연속 도해이다. 도 2a는 AAV1 ITR의 도해이다. 도 2b는 AAV2 ITR의 도해이다. 도 2c는 AAV3 ITR의 도해이다. 도 2d는 AAV4 ITR의 도해이다. 도 2e는 AAV5 ITR의 도해이다. 도 2f는 AAV6 ITR의 도해이다. 도 2g는 AAV7 ITR의 도해이다. 도 2h는 부분 AAV8 ITR의 도해이다. 도 2i는 부분 AAV9 ITR의 도해이다.
도 3a는 실시예에 기술된 DD 벡터 제조 및 특징화 프로세스의 예시적인 단계를 보여주는 흐름도이다. 제1 단계는 하류 기능에 필요한 발현 카세트 (예컨대, 이종성 유전자)를 함유하는 바이러스 rAAV 벡터를 생성 또는 수득하는 것이다. 바이러스는 시험관내에서 세포를 감염시키고, DD 요소를 포함하는 원형, 이중 가닥 에피솜을 형성한다. 제2 주요 단계에서, 원형 rAAV 게놈을 세포로부터 클로닝하고, 서열분석하여 DD 요소의 존재를 확인한다. 이어서, 이를 사용하여 롤링-서클 증폭을 사용하여 시험관내에서 DD 벡터를 제조하기 위한 (단계 3 및 4) 플라스미드 기반 주형을 생성할 수 있다. 최종 단계는 생체내 연구를 진행하기 전에 시험관내에서 DD 벡터 유전자 발현을 확인하는 것이다.
도 3b는 실시예에 기술된 합성 원형 벡터 제조 및 특징화 프로세스의 예시적인 단계를 보여주는 흐름도이다. 제1 단계는 하류 기능에 필요한 발현 카세트 (예컨대, 이종성 유전자)를 함유하는 바이러스 rAAV 벡터를 생성 또는 수득하는 것이다. 바이러스는 시험관내에서 세포를 감염시키고, 말단 반복 서열 (이 경우, DD 요소)을 포함하는 원형, 이중 가닥 에피솜을 형성한다. 제2 주요 단계에서, 원형 rAAV 게놈을 세포로부터 클로닝하고, 서열분석하여 DD 요소의 존재를 확인한다. 이어서, 이를 사용하여 롤링-서클 증폭을 사용하여 시험관내에서 DD 벡터를 제조하기 위한 (단계 3 및 4) 플라스미드 기반 주형을 생성할 수 있다. 최종 단계는 생체내 연구를 진행하기 전에 시험관내에서 DD 벡터 유전자 발현을 확인하는 것이다.
도 4는 시험관내에서 원형 rAAV 게놈을 생성하는 프로세스를 보여주는 개략적 다이어그램이다. 관심 rAAV 게놈을 포함하는 플라스미드를 추가의 AAV 생산 플라스미드로 형질감염시켜 (삼중 형질감염) 패키징된 게놈을 함유하는 rAAV 바이러스 벡터 (혈청형 2)를 생성한다. 생성된 바이러스가 HEK293T 세포를 감염시키고, 여기서 원형 rAAV 게놈이 생성된다.
도 5는 rAAV 원형 게놈의 검출을 위한 롤링-서클 증폭 반응을 보여주는 개략적 다이어그램이다. AAV 게놈 내에서는 커팅하지 않는 제한 효소 (이 경우, AvrII)로 전체 세포 DNA를 분해하였다. 이어서, 선형 단편은 분해하지만, 원형, 이중 가닥 DNA는 무손상 상태 그대로 남겨두는 플라스미드-세이프(Plasmid-Safe) DNase로 DNA를 처리하였다. 분해 반응은 랜덤 프라이머 및 Phi29 DNA 폴리머라제를 사용하는 선형 롤링-서클 증폭을 위한 주형으로서 작용하였다. 원형 AAV 에피솜의 증폭 후, 큰 선형 콘카타머 어레이가 생성되었다. 이어서, 단일 지점에서 AAV 게놈을 절단하는 EcoRI로 제한 효소 분해하여 선형 어레이를 단위 길이의 단량체 AAV 게놈으로 분해하였다. 이어서, 추가의 서열 분석을 위해 단위 길이의 AAV 게놈을 pBlueScript 벡터로 클로닝하였다.
도 6a-6j는 다양한 AAV2 말단 반복 서열 (이 경우, DD 요소)의 예시적인 서열을 보여주는 도해 시리즈이다. 도 6a는 5'에서 3' 구조로 작동적으로 연결된 5' D 요소, 5' A 요소, 5' C 요소, 3' C 요소, 5' B 요소, 3' B 요소, 3' A 요소, 및 3' D 요소를 포함하는 표준 DD 요소 (서열식별번호(SEQ ID NO:) 9)의 도해이다. 도 6b는 5'에서 3' 구조로 작동적으로 연결된 5' D 요소, 5' A 요소, 5' B 요소, 3' B 요소, 5' C 요소, 3' C 요소, 3' A 요소, 및 3' D 요소를 포함하는 표준 DD 요소 (서열식별번호 10)의 도해이다. 도 6c는 5'에서 3' 구조로 작동적으로 연결된 5' D 요소, 5' A 요소, 5' C 요소, 3' C 요소, 3' A 요소, 및 3' D 요소를 포함하는, B 요소가 결실된 DD 요소 (서열식별번호 11)의 도해이다. 도 6d는 5'에서 3' 구조로 작동적으로 연결된 5' D 요소, 5' A 요소, 5' B 요소, 3' B 요소, 3' A 요소, 및 3' D 요소를 포함하는, C 요소가 결실된 DD 요소 (서열식별번호 12)의 도해이다. 도 6e는 5'에서 3' 구조로 작동적으로 연결된 5' D 요소, 5' A 요소, 3' A 요소, 및 3' D 요소를 포함하는, B 및 C 요소가 결실된 DD 요소 (서열식별번호 13)의 도해이다. 도 6f는 5'에서 3' 구조로 작동적으로 연결된 5' D 요소 및 3' D 요소를 포함하는, A, B, 및 C 요소가 결실된 DD 요소 (서열식별번호 14)의 도해이다. 도 6g는 5'에서 3' 구조로 작동적으로 연결된 5' D 요소, 5' A 요소, 5' C 요소, 3' A 요소를 대시하는 핵산 서열, 및 및 3' D 요소를 포함하는 DD 요소 (서열식별번호 15)의 도해이다. 도 6h는 5'에서 3' 구조로 작동적으로 연결된 5' D 요소, 5' A 요소, 3' A 요소와 중첩된 5' C 요소, 및 3' D 요소를 포함하는 DD 요소 (서열식별번호 16)의 도해이다. 도 6i는 5'에서 3' 구조로 작동적으로 연결된 5' D 요소, 부분 5' A 요소, 부분 3' A 요소, 및 3' D 요소를 포함하는 DD 요소 (서열식별번호 17)의 도해이다. 도 6j는 5'에서 3' 구조로 작동적으로 연결된 5' D 요소, 5' A 요소, 부분 3' A 요소, 및 3' D 요소를 포함하는 DD 요소 (서열식별번호 18)의 도해이다.
도 7은 플라스미드-유래 원형 주형의 생성을 보여주는 개략적 도해이다. 플라스미드 TG-18을 먼저 EcoRI로 분해하여 말단 반복 서열 (DD 요소; 나비넥타이 모양으로 표시)을 함유하는 선형 rAAV 게놈을 유리시킨다. 선형 단편의 말단을 함께 라이게이션시켜 이중 가닥 원을 형성한다.
도 8은 주형 형성 프로세스의 상이한 단계에서의 DNA 밴드를 함유하는 아가로스 겔의 사진이다. 레인 1은 pBlueScript 벡터로부터 유리된 선형 DNA 단편이다. 상기 단편은 CMV 프로모터, eGFP cDNA, BGHpA, 및 말단 반복 서열 (DD 요소)을 함유한다. 레인 2는 레인 1로부터의 선형 단편의 자기-라이게이션의 결과물이다. 다중 DNA 형태가 존재하고, 하나 또는 다중 DNA 단편의 라이게이션으로부터 생성된 다양한 크기의 원형 및 선형 DNA를 포함한다. 레인 3은 원형 DNA가 아닌 선형 DNA를 분해하는 플라스미드-세이프 DNase 처리 후에 남아있는 DNA를 보여주는 것이다.
도 9는 말단 반복 서열 (DD 요소)을 증폭시키는 데 있어서 Phi29 충실성을 분석하기 위한 프로세스를 보여주는 개략적 다이어그램이다. 박테리아-유래 원형 DD 벡터는 랜덤 프라이머 및 Phi29 DNA 폴리머라제를 사용하는 선형 롤링-서클 증폭을 위한 주형으로서 작용한다. 원형 AAV 에피솜 증폭 후, 큰 선형 콘카타머 어레이가 생성된다. 이어서, 선형 어레이를 제한 효소 분해에 의해 분해하여 DD 요소의 존재에 대해 평가한다. SwaI 효소는 DD 요소 양측을 커팅하여 244 bp 단편을 생성한다. AhdI 효소는 DD 요소 내에서 1회 커팅하고, 콘카타머를 2.1 Kb 단위 길이의 단편으로 분해시킨다.
도 10은 증폭된 DNA의 Swat 분해의 결과물을 보여주는 아가로스 겔의 사진이다. 1 ng 또는 6 ng의 TG-18 플라스미드 주형으로부터 증폭된 DNA를 SwaI로 분해하여 244 bp 단편 (레인 2 및 3, 화살표 표시)을 생성하였다. 이는 원래의 TG-18 플라스미드 벡터로부터 유리된 단편 (레인 1)과 동일하다. SwaI 분해를 사용하여 TG-18로부터 DD 요소를 제거함으로써 생성된, DD 요소가 결여된 플라스미드 주형 (TG-dDD)으로부터 증폭된 DNA 또한 포함되어 있다 (레인 4 및 5).
도 11은 증폭된 DNA의 AhdI 분해를 보여주는 아가로스 겔의 사진이다. AhdI는 DD 요소 내에서 1회 커팅한다. 1 ng 또는 6 ng의 TG-18 플라스미드 주형으로부터 증폭된 DNA를 AhdI로 분해하여 2.1 kb 단편 (레인 1 및 2, 화살표 표시)을 생성하였다. DD 요소가 결여된 플라스미드 주형 (TG-dDD; 레인 3 및 4)으로부터 증폭된 DNA 또한 포함되어 있다. 상기 DNA는 DD 요소를 함유하지 않으며, AhdI로 분해되지 않아야 한다.
도 12a는 박테리아 플라스미드-유래 주형의 자기-라이게이션을 보여주는 개략적 다이어그램이다. 말단 반복 서열 함유 벡터 (여기서, DD 요소 함유 벡터)를 갖는 플라스미드를 먼저 EcoRI로 분해하여 나비넥타이 모양으로 표시된 유전자 서열 내의 말단 반복 서열 (DD 요소)을 함유하는 선형 rAAV 게놈을 유리시킨다. 선형 단편의 말단을 함께 라이게이션시켜 이중 가닥 원을 형성한다.
도 12b는 주형 형성 프로세스의 상이한 단계에서의 DNA를 보여주는 아가로스 겔의 사진이다. 레인 1은 pBlueScript 벡터로부터 유리된 선형 DNA 단편이다. 상기 단편은 CMV 프로모터, eGFP cDNA, BGHpA, 및 DD 요소를 함유한다. 레인 2는 레인 1로부터의 선형 단편의 자기-라이게이션의 결과물이다. 다중 DNA 형태가 존재하고, 하나 또는 다중 DNA 단편의 라이게이션으로부터 생성된 다양한 크기의 원형 DNA 뿐만 아니라, 선형 DNA를 포함한다. 레인 3은 원형 DNA가 아닌 선형 DNA를 분해하는 플라스미드-세이프 DNase 처리 후에 남아있는 DNA를 보여주는 것이다.
도 13a는 Phi29 폴리머라제에 의한 선형 콘카타머 제조를 보여주는 개략적 다이어그램이다. 도 11a 및 11b에 제시된 박테리아-유래 주형이 랜덤 프라이머 및 Phi29 DNA 폴리머라제를 사용하는 선형 RCA에 대한 주형으로서 작용하였다. 원형 AAV 에피솜 증폭 후, 큰 선형 콘카타머 어레이가 생성되었다. 이어서, 선형 어레이를 EcoRI를 사용하는 제한 효소 분해에 의해 단위 길이의 단량체 AAV 게놈으로 분해하였다.
도 13b는 크기 분획화 분해된 DNA를 보여주는 아가로스 겔의 사진이다.
도 14a는 선형 형태에서 원형 생성물로 자기-라이게이션된 시험관내-유래 rAAV 게놈의 개략도이다.
도 14b는 도 14a에 도시된 생성된 단량체 원형 DNA 벡터를 보여주는 아가로스 겔의 사진이다. DNA 대다수는 단량체 슈퍼코일드 원형 DNA이다.
도 15a는 도 14b에서 특징화된 합성 벡터로 형질감염된 세포의 GFP 형광을 보여주는 현미경 사진이다. 형광은 스펙트라맥스 미니맥스300 이미징 사이토미터(Spectramax MiniMax300 Imaging Cytometer)를 사용하여 검출하였다.
도 15b는 rAAV 게놈을 함유하는 원래의 플라스미드로 형질감염된 세포의 GFP 형광을 보여주는 현미경 사진이다. 형광은 스펙트라맥스 미니맥스300 이미징 사이토미터를 사용하여 검출하였다.
도 16은 pBS 단독 (레인 1), 시험관내-제조된 TG-18-유래 DD 벡터 (레인 2), DD 요소가 결여된 시험관내-제조된 TG-18-유래 벡터 (레인 3), 플라스미드-유래 TG-18-유래 DD 벡터 (레인 4), 및 DD 요소가 결여된 플라스미드-유래 TG-18-유래 벡터 (레인 5)로 형질감염된 세포에 의한 GFP 발현을 보여주는 웨스턴 블롯의 사진이다. 항-튜불린 염색을 보여주는 밴드가 대조군으로 제시된다.
도 17은 롤링-서클 증폭을 사용하여 합성 DNA 벡터를 제조하는 예시적인 프로세스를 보여주는 개략적 다이어그램이다. 본 프로세스는 슈퍼코일드 DNA 단량체로부터 개방 원형 DNA 분자를 분리하는 칼럼 정제를 포함한다.
본 발명은 AAV 벡터와 유사한 방식으로 휴지 세포 (예컨대, 유사분열 후 세포)의 장기간의 형질도입을 제공하는 비-바이러스성 DNA 벡터를 특징으로 한다. 본 발명은 부분적으로는 (예를 들어, 박테리아 발현 및 부위-특이적 재조합과는 대조적으로) 등온 롤링-서클 증폭 및 라이게이션-매개 원형화에 의해 원형 AAV 유사 DNA 벡터 (예컨대, 말단 반복 서열, 예컨대, DD 요소를 함유하는 DNA 벡터)를 합성에 의해 제조하는 시험관내 무세포 시스템의 개발에 기초한다. 본 방법을 통해 원형 AAV 유사 DNA 벡터 제조의 확장성 및 제조 효율을 개선시킬 수 있다. 또한, 본 방법에 의해 제조된 벡터는 플라스미드-DNA 벡터와 연관된 다수의 문제들, 예컨대, 문헌 [Lu et al., Mol . Ther. 2017, 25(5): 1187-98] (상기 문헌은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)에서 논의된 문제들을 극복하도록 디자인된 것이다. 예를 들어, CpG 섬 및/또는 박테리아 플라스미드 DNA 서열, 예컨대, RNAPII 정지 부위의 존재를 제거하거나, 또는 감소시킴으로써, 전사 침묵화는 감소 또는 제거될 수 있고, 이에 의해 이종성 유전자의 지속은 증가될 수 있다. 추가로, 면역원성 성분 (예컨대, 박테리아 내독소, DNA, 또는 RNA, 또는 박테리아 시그니처, 예컨대, CpG 모티프)의 존재를 제거함으로써, 숙주 면역계를 자극시킬 수 있는 위험은 감소된다. 그러한 이익은 특히 특정 장애, 예컨대, 망막 이영양증 (예컨대, 멘델-유전성 망막 이영양증) 치료에서 이롭다.
따라서, 본 발명의 벡터는 (i) 박테리아 플라스미드 DNA 서열 (예컨대, RNAPII 정지 부위, 복제 기점, 및/또는 내성 유전자) 및 다른 박테리아 시그니처 (예컨대, 면역원성 CpG 모티프)가 실질적으로 없고/거나; (ii) 전적으로 시험관에서 합성 및 증폭될 수 있는 (예컨대, 박테리아에서의 복제가 불필요한, 예컨대, 박테리아 복제 기점 및 박테리아 내성 유전자가 불필요한) 합성 DNA 벡터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 AAV 벡터의 특징인 DD 요소를 함유한다. 본 발명을 통해 표적 세포 (예컨대, 망막 세포)는 바이러스 그 자체를 필요로 하지 않으면서, AAV 바이러스 DNA와 같이 거동하는 (예컨대, 낮은 전사 침묵화 및 증진된 지속을 보이는) 이종성 유전자를 갖는 DNA 벡터로 형질도입될 수 있다.
I. 정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해, 및 본 출원에서 사용되는 다수의 용어에 대한 일반 가이드를 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 제공하는 공개 서적을 참조로 하여 보편적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 정의와 참조된 공개문헌의 정의가 서로 상충하는 경우, 본원에서 제공된 정의가 조정하여야 한다.
본원에서 사용되는, "원형 벡터" 또는 "원형 DNA 벡터"라는 용어는 원형 형태의 핵산 분자를 지칭한다. 상기 원형 형태는 전형적으로 롤링-서클 증폭에 의해 콘카타머로 증폭될 수 있다. 본원에서 사용되는, 그의 말단에 공동 결합된 가닥 (예컨대, 헤어핀 루프 또는 다른 구조체 의해, 예컨대 공유적으로 접합된 백본)을 갖는 선형 이중 가닥 핵산은 원형 벡터가 아니다.
본원에서 사용되는, "멘델-유전성 망막 이영양증"은 가변 침투도 (즉, 완전 또는 감소된 침투도)를 보이면 멘델 유전 패턴을 따르는 망막 장애를 지칭한다. 멘델-유전성 망막 이영양증은 (a) (우성 장애에서와 같이) 한 대립유전자에서의 단일 돌연변이, 또는 (b) (열성 장애에서와 같이) 각 대립유전자에서의 단일 돌연변이의 결과로서 발생할 수 있다. 돌연변이화는 점 돌연변이, 삽입, 결실, 또는 스플라이스 변이체 돌연변이일 수 있다. 예시적인 멘델-유전성 망막 이영양증으로는 레버 선천성 흑암시 (LCA), 스타가트병, 탄력섬유성 위황색종, 간체 추체 이영양증, 삼출성 유리체망막병증, 주버트 증후군, CSNB-1C, 색소성 망막염, 스티클러 증후군, 소두증 및 맥락망막병증, 색소성 망막염, CSNB 2, 어셔 증후군, 및 와그너 증후군을 포함한다. 멘델-유전성 망막 이영양증은 예컨대, 연령 관련 황반 변성 (AMD)과 같은 질환의 발병 가능성과 함께 다중의 유전적 연관성을 갖는 다인성 장애를 포함하지 않는다.
본원에서 사용되는, "말단 반복 서열"이라는 용어는 서열이 핵산 분자의 인접부에서 반복되는 것인 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자의 부분을 지칭한다. 서열은 동일한 방향으로 또는 역방향으로 (예컨대, 각각 ABCDABCD 또는 ABCDDCBA) 반복될 수 있다. 일부 실시양태에서, 예를 들어, 말단 반복 서열은 역위 말단 반복 서열 (ITR) 또는 긴 말단 반복 서열 (LTR)일 수 있거나, 또는 그로부터 유래된 것 (예컨대, 그의 라이게이션의 생성물)일 수 있다. ITR-유래 말단 반복 서열은 반복된 A 요소, B, 요소, C 요소, 및/또는 D 요소를 가질 수 있다 (여기서, A, B, C, 및 D 요소는 서열식별번호 31-37에 의해 정의되고, 도 2a-2h에 도시되어 있다). 예를 들어, 도 6a-6j는 각각 말단 반복 서열이고, 모든 DD 요소 (예컨대, 서열식별번호 9 또는 10)는 말단 반복 서열의 예이다. 말단 반복 서열은 상동성 재조합 (예컨대, 분자간 상동성 재조합 또는 분자내 상동성 재조합)으로부터 생성되는 구조를 가질 수 있다.
"역위 말단 반복부" 또는 "ITR"이라는 용어는 문헌 [Muzyczka and Berns, Fields Virology 2001, 2: 2327-2359]에 기술되어 있는 바와 같이, AAV 용균 및 잠복 생활사를 완료하는 데 필요한, T 형상의 회문식 구조를 형성할 수 있는, AAV 및/또는 재조합 AAV (rAAV)에 존재하는 핵산 스트레치를 지칭한다. "이중-D 요소" 및 "DD 요소"라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 이는 핵산의 동일한 가닥 상에 5' D 요소 (즉, 서열식별번호 1, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 38, 및 40으로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 서열과 적어도 80%의 상동성 (예컨대, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%의 상동성)을 갖는 핵산 서열) 및 3' D 요소 (즉, 서열식별번호 8, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 39, 및 41로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 서열과 적어도 80%의 상동성 (예컨대, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%의 상동성)을 갖는 핵산 서열)를 갖는 DNA 구조인 말단 반복 서열의 한 유형을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 5' D 요소는 서열식별번호 1의 핵산 서열과 100% 상동성이고/거나, 3' D 요소는 서열식별번호 8의 핵산 서열과 100% 상동성이다. DD 요소는 도 1에 제시된 바와 같이, 라이게이션에 의해 동일한 분자 (분자내 재조합) 또는 상이한 분자 (분자간 재조합)로부터의 2개의 AAV 역위 말단 반복부 (ITR)를 연결시킴으로써 생성될 수 있다. 상기 라이게이션은 임의의 AAV 혈청형의 ITR 사이에 이루어질 수 있으며, 그의 예시적인 구조는 도 2a-2i에 제시되어 있다. DD 요소는 단일 핵산 가닥 상에 2개의 D 요소를 함유하고, 5' D 요소의 3' 말단을 3' D 요소의 5' 말단과 작동적으로 연결하는, 추가 요소, 예컨대, 하나 이상의 A, B, 및/또는 C 요소, 또는 그의 부분(들)을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 5' D 요소의 3' 말단과 3' 요소의 5' 말단 사이에 어떤 이종성 유전자도 존재하지 않는다. AAV2로부터 유래된 예시적인 DD 요소의 서열은 도 6a-6j에 각각 제시되어 있다. 다른 AAV 혈청형 (예컨대, AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, 또는 AAV9)으로부터의 DD 요소가 사용될 수 있다. AAV 혈청형 1-7로부터의 대표적인 5' 및 3' D 요소는 하기에 제공되어 있다.
표 1. AAV 혈청형 1-7로부터의 대표적인 5' 및 3' D 요소
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"이종성 유전자"라는 용어는 자연적으로는 바이러스 게놈의 부분으로서 존재하지 않는 유전자를 지칭한다. 예를 들어, 이종성 유전자는 포유동물 유전자, 예컨대, 치료 유전자, 예컨대, 치료 단백질을 코딩하는 포유동물 유전자일 수 있다. 일부 실시양태에서, 이종성 유전자는 표적 세포 및/또는 대상체에서 결함이 있거나, 또는 그에 부재하는 단백질 또는 그의 부분을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 이종성 유전자는 표적 세포 및/또는 대상체에서 결함이 있거나, 또는 그에 부재하는 단백질을 코딩하는 하나 이상의 엑손을 함유한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 이종성 유전자는 예컨대, WO 2017/087900 (상기 문헌은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)에 기술된 바와 같이, 하나 이상의 트랜스-스플라이싱 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이종성 유전자는 치료 핵산, 예컨대, 치료 RNA (예컨대, 마이크로RNA)를 포함한다.
본원에서 사용되는, "트랜스-스플라이싱 분자"는 3개의 주요 요소: (a) 트랜스-스플라이싱 분자를 그의 표적 유전자 (예컨대, 프리-mRNA)에 테더링함으로써 특이성을 부여하는 결합 도메인; (b) 스플라이싱 도메인 (예컨대, 3' 또는 5' 스플라이스 부위를 갖는 스플라이싱 도메인); 및 (c) 표적 유전자에서 하나 이상의 엑손 (예컨대, 하나 이상의 돌연변이화된 엑손)을 대체할 수 있으며, 표적 유전자 상에서 트랜스-스플라이싱되도록 구성된 코딩 서열을 갖는다.
"프로모터"라는 용어는 프로모터에 작동가능하게 연결된 이종성 유전자의 전사를 조절하는 서열을 지칭한다. 프로모터는 RNA 폴리머라제 및 효율적인 전사를 위해 요구되는 다른 전사 인자에 대한 전사 및/또는 인식 부위로 유도하는 데 충분한 서열을 제공하고, 세포-특이적 발현을 지시할 수 있다. 전사를 지시하는 데 충분한 서열 이외에도, 본 발명의 프로모터 서열은 또한 전사를 조정하는 데 관여하는 다른 조절 요소 (예컨대, 인핸서, 코작(kozak) 서열, 및 인트론) 서열을 포함할 수 있다. 관련 기술분야에 공지되고, 본원에 기술된 바이러스 벡터에서 유용한 프로모터의 예로는 CMV 프로모터, CBA 프로모터, smCBA 프로모터, 및 면역글로불린 유전자, SV40, 또는 다른 조직 특이적 유전자로부터 유래된 상기 프로모터를 포함한다. 공지된 조절 요소를 혼합하고, 매칭시킴으로써 기능성 프로모터를 생성하는 표준 기술이 관련 기술분야에 공지되어 있다. "말단절단된 프로모터"는 또한 프로모터 단편으로부터, 또는 공지된 조절 요소의 단편을 혼합 및 매칭시킴으로써 생성될 수 있고; 예를 들어, smCBA 프로모터는 CBA 프로모터의 말단절단된 형태이다.
본원에서 사용되는, 벡터 또는 조성물 (예컨대, 본 발명의 DNA 벡터를 함유하는 제약 조성물)의 경우, 조성물이 치료상 관련 용량에서 측정가능한 염증성 반응 (예컨대, 톨 유사 수용체 신호전달과 연관된 표현형)을 유도하지 않는다면, 면역원성 성분, 예컨대, 면역원성 박테리아 시그니처가 "실질적으로 없는" 것이다. 면역원성 성분의 존재에 대하여 조성물을 스크리닝하는 방법은 관련 기술분야에 공지된 방법에 따른 시험관내 및 생체내 동물 검정법을 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역원성 성분이 실질적으로 없는 벡터 또는 조성물이 비-면역원성인 것이다.
본원에서 사용되는, "비-면역원성"이라는 용어는 벡터 또는 조성물이 치료상 관련 용량에서 측정가능한 염증성 반응 (예컨대, 톨 유사 수용체 신호전달과 연관된 표현형)을 유도하지 않는다는 것을 의미한다. 면역원성 성분의 존재에 대하여 조성물을 스크리닝하는 방법은 관련 기술분야에 공지된 방법에 따른 시험관내 및 생체내 동물 검정법을 포함한다. 예를 들어, 벡터 또는 조성물이 비-면역원성인지 여부를 결정하는 데 적합한 시험관내 검정법은 벡터 또는 조성물의 존재하에서 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 또는 인간 PBMC-유래 골수 세포 (예컨대, 단핵구)를 배양하고, 8시간 경과 후 배양물 중 IL-1β, IL-6, 및/또는 IL-12의 양을 측정하는 것을 포함한다. 음성 대조군과 비교하여 벡터 또는 조성물을 함유하는 샘플 중 IL-1β, IL-6, 및/또는 IL-12의 농도가 증가하지 않았다면, 벡터 또는 조성물은 비-면역원성인 것이다.
본원에서 사용되는, "콘카타머"란, 전형적으로 연속적으로 연결된, 동일한 또는 실질적으로 동일한 핵산 서열 (예컨대, 서브유니트)의 다중 카피를 포함하는 핵산 분자를 지칭한다.
본원에서 사용되는, "단리된"이라는 용어는 인공적으로 제조된 것을 의미한다. 일부 실시양태에서, DNA 벡터와 관련하여, "단리된"이라는 용어는 (i) 시험관내에서 예를 들어, 롤링-서클 증폭 또는 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의해 증폭되거나; (ii) 분자 클로닝에 의해 재조합적으로 제조되거나; (iii) 예로서, 제한 엔도뉴클레아제 절단 및 겔 전기영동 분획화, 또는 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제되거나; 또는 (iv) 예를 들어, 화학 합성에 의해 합성된 DNA 벡터를 지칭한다. 단리된 DNA 벡터는 관련 기술분야에 널리 공지된 재조합 DNA 기술에 의해 쉽게 조작될 수 있는 것이다. 따라서, 5' 및 3' 제한 부위가 공지되어 있는 벡터 내에 함유되어 있거나, 또는 그에 대한 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 프라이머 서열이 개시되어 있는 뉴클레오티드 서열은 단리된 것으로 간주되지만, 그의 천연 숙주에 그의 천연 상태로 존재하는 핵산 서열은 단리된 것으로 간주되지 않는다. 단리된 DNA 벡터는 실질적으로 정제될 수 있지만, 정제될 필요는 없다.
본원에서 사용되는, "벡터"란, 이종성 유전자가 후속하여 표적 세포에서 복제, 프로세싱 및/또는 발현될 수 있게 이종성 유전자를 표적 세포 내로 운반할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 표적 세포 또는 숙주 세포가 (예컨대, DD 요소를 생성함으로써) 벡터의 게놈을 프로세싱한 후에는 게놈은 벡터로 간주되지 않는다.
본원에서 사용되는, "표적 세포"란, 표적 유전자를 발현하고, 벡터가 감염시키거나, 또는 감염시키고자 하는 임의의 세포를 지칭한다. 벡터는 대상체에 (계내에) 상주하는 표적 세포, 또는 배양물 중의 표적 세포를 감염시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 표적 세포는 유사분열 후 세포이다. 표적 세포는 척추 및 무척추 동물 세포 (및 동물 기원의 세포주), 둘 모두를 포함한다. 척추 세포의 대표적인 예로는 포유동물 세포, 예컨대, 인간, 설치류 (예컨대, 래트 및 마우스), 및 유제류 (예컨대, 소, 염소, 양, 및 돼지)를 포함한다. 표적 세포는 안구 세포, 예컨대, 망막 세포를 포함한다. 대안적으로, 표적 세포는 줄기 세포 (예컨대, 만능성 세포 (즉, 그의 후손이 수개의 한정된 세포 유형, 예컨대, 조혈 줄기 세포 또는 다른 줄기 세포로 분화될 수 있는 것인 세포) 또는 전능성 세포 (즉, 그의 후손이 유기체에서 임의의 세포 유형이 될 수 있는 세포, 예컨대, 배아 줄기 세포, 및 체세포 줄기 세포, 예컨대, 조혈 세포))일 수 있다. 추가의 다른 실시양태에서, 표적 세포는 난모세포, 난자, 배아 세포, 접합체, 정자 세포, 및 다양한 기관 또는 조직으로부터의 체세포 (비-줄기) 성숙 세포, 예컨대, 간세포, 신경 세포, 근육 세포 및 혈액 세포 (예컨대, 림프구)를 포함한다.
"숙주 세포"란, 관심 DNA 벡터를 보유하는 임의의 세포를 지칭한다. 숙주 세포는 본 개시내용에 의해 기술되는 바와 같이, DNA 벡터의 수용자로서 사용될 수 있다. 본 용어는 형질감염된 원래 세포의 자손을 포함한다. 따라서, 본원에서 사용되는, "숙주 세포"란, 이종성 유전자로 (예컨대, 본원에 기술된 DNA 벡터에 의해) 형질감염된 세포를 지칭할 수 있다. 단일 모체 세포의 자손은 자연적, 우발적, 또는 고의적인 돌연변이에 기인하여, 형태가 또는 게놈 또는 전체 DNA 상보체가 원래의 모체와 완전히 동일할 필요는 없을 수도 있음이 이해된다.
본원에서 사용되는, "대상체"라는 용어는 본원에 기술된 치료 또는 예방 방법을 필요로 하는 임의의 포유동물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 상기와 같은 치료 또는 예방을 필요로 하는 다른 포유동물로는 비-인간 영장류를 비롯한, 개, 고양이, 또는 다른 사육 동물, 말, 가축, 실험실용 동물 등을 포함한다. 대상체는 수컷 또는 암컷일 수 있다. 한 실시양태에서, 대상체는 표적 유전자에서의 돌연변이에 의해 유발된 질환 또는 장애를 앓는 대상체이다. 또 다른 실시양태에서, 대상체는 표적 유전자에서의 돌연변이에 의해 유발되는 질환 또는 장애가 발병될 위험이 있는 대상체이다. 또 다른 실시양태에서, 대상체는 표적 유전자에서의 돌연변이에 의해 유발된 질환 또는 장애의 임상적 징후를 보인 대상체이다. 대상체는 치료 또는 예방 요법이 도움이 될 수 있는 임의의 연령의 대상체일 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 대상체는 0-5세, 5-10세, 10-20세, 20-30세, 30-50세, 50-70세, 또는 70세 초과의 대상체이다.
본원에서 사용되는, 벡터 또는 그의 조성물의 "유효량" 또는 "유효 용량"이란, 예컨대, 선택된 투여 형태, 경로, 및/또는 스케줄에 따라 세포 또는 유기체로 전달되었을 때, 원하는 생물학적 및/또는 약리학적 효과를 달성하는 데 충분한 양을 지칭한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자가 이해하는 바와 같이, 효과가 있는 특정 벡터 또는 조성물의 절대량은 원하는 생물학적 또는 약리학적 종점, 전달하고자 하는 작용제, 표적 조직 등과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다. "유효량"은 단일 용량으로 또는 다회 용량의 사용을 통해 세포와 접촉될 수 있거나, 또는 대상체에게 투여될 수 있다는 것도 관련 기술분야의 통상의 기술자는 추가로 이해할 것이다.
본원에서 사용되는, "지속"이라는 용어는 유전자가 세포에서 발현가능한 지속 시간을 지칭한다. DNA 벡터의 지속, 또는 DNA 벡터 내의 이종성 유전자의 지속은 관련 기술분야에 공지된 임의의 유전자 발현 특징화 방법을 사용하여, 참조 벡터, 예컨대, 박테리아에서 생산된 대조군 벡터 (예컨대, 박테리아에서 생산되거나, 또는 본 발명의 벡터에 존재하지 않는 하나 이상의 박테리아 시그니처를 갖는 원형 벡터) 대비로 정량화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 대조군 벡터에는 DD 요소가 결여되어 있다. 추가로 또는 대안적으로, 지속은 벡터 투여 이후 임의의 주어진 시점에 정량화될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 발명의 DNA 벡터의 이종성 유전자는, 그의 발현이 벡터 투여 후 6개월째에 계내에서 검출되었다면, 투여 후 적어도 6개월 동안 지속되는 것이다. 일부 실시양태에서, 유전자는 그의 전사가 투여 후 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 1년, 2년, 또는 그 초과의 시점에 검출가능하다면, 표적 세포에서 "지속"되는 것이다. 일부 실시양태에서, 유전자가 투여 후 주어진 기간 후에도 (예컨대, 투여 후 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 1년, 2년, 또는 그 초과의 기간 후에도) 원래의 발현 수준의 임의의 검출가능한 분율 (예컨대, 원래의 발현 수준의 적어도 1%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 70%, 또는 적어도 100%)로 그대로 유지된다면, 지속된다고 말할 수 있다.
본원에서 사용되는, "돌연변이"란, 결함성 (예컨대, 비-기능성, 감소된 기능, 비정상적인 기능, 생산된 정상적인 양보다 더 적은 양의) 단백질 생성물을 유발하는 임의의 비정상적인 핵산 서열을 지칭한다. 돌연변이는 염기쌍 돌연변이 (예컨대, 단일 뉴클레오티드 다형성), 미스센스 돌연변이, 프레임시프트 돌연변이, 결실, 삽입, 및 스플라이스 돌연변이를 포함한다.
본원에서 사용되는, "돌연변이와 연관된 장애" 또는 "장애와 연관된 돌연변이"라는 용어는 장애와 돌연변이 사이의 상관관계를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이와 연관된 장애는 전체적으로 또는 부분적으로, 또는 직접적으로 또는 간접적으로 돌연변이에 의해 유발되는 것으로 공지되어 있거나, 또는 그러한 것으로 의심되는 것이다. 예를 들어, 돌연변이를 갖는 대상체는 장애가 발병할 위험이 있을 수 있고, 위험은 추가로 다른 인자, 예컨대, (예컨대, 동일한 또는 상이한 유전자에서의) 다른 (예컨대, 비의존적) 돌연변이, 또는 환경 인자에 의존할 수 있다.
본원에서 사용되는, "치료"라는 용어 또는 그의 문법상 파생어는 질환의 진행을 감소시키거나, 질환 증상의 중증도를 감소시키거나, 질환 증상의 진행을 지연시키거나, 질환 증상을 제거하거나, 또는 질환의 발병을 지연시키는 것으로 정의된다.
본원에서 사용되는, 장애의 "예방"이라는 용어 또는 그의 문법상 파생어는 질환의 발병 위험을 감소시키는 것, 예컨대, 돌연변이와 연관된 장애 발병 위험이 있는 대상체를 위한 예방 요법으로 정의된다. 대상체는 관련 기술분야에 공지되거나, 또는 본원에 기술된 임의의 적합한 방법에 따라 장애와 연관된 돌연변이를 확인함으로써 장애 발병 "위험이 있는" 것을 특징으로 할 수 있다. 일부 실시양태에서, 장애 발병 위험이 있는 대상체는 장애와 연관된 하나 이상의 돌연변이를 갖는다. 추가로 또는 대안적으로, 대상체가 장애의 가족력이 있다면, 대상체는 장애 발병 "위험이 있는" 것을 특징으로 할 수 있다.
본원에 기술된 방법에서 사용되는, "투여하는"이라는 용어 또는 그의 문법상 파생어는 그를 필요로 하는 대상체, 예컨대, 표적화된 유전자에 돌연변이 또는 결함을 갖는 대상체에게 조성물, 또는 생체외 처리된 세포를 전달하는 것을 지칭한다. 예를 들어, 안구 세포가 표적화되는 한 실시양태에서, 방법은 조성물을 망막하 주사에 의해 광수용체 세포 또는 다른 안구 세포로 전달하는 것을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 안구 세포에의 유리체내 주사 또는 안검 정맥을 통한 안구 세포에의 주사가 사용될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 조성물은 정맥내로 투여된다. 추가의 또 다른 투여 방법은 본 개시내용을 고려하여 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 선택될 수 있다.
"제약상 허용되는"이라는 용어는 포유동물, 예컨대, 인간에게 투여하는 데 안전한 것을 의미한다. 일부 실시양태에서, 제약상 허용되는 조성물은 동물에서, 및 더욱 특히 인간에서의 사용을 위한 것으로 연방 또는 주 정부의 규제 기관의 승인을 받거나, 또는 미국 약전(U. S. Pharmacopeia) 또는 일반적으로 인정되는 다른 약전에 열거되어 있는 것이다.
"담체"라는 용어는 본 발명의 벡터 또는 조성물과 함께 투여되는 희석제, 애주번트, 부형제, 또는 비히클을 지칭한다. 적합한 제약 담체의 예는 문헌 ["Remington's Pharmaceutical Sciences," Mack Publishing Co., Easton, PA., 2nd edition, 2005]에 기술되어 있다.
"하나"라는 용어는 "하나 이상의 것"을 의미한다. 예를 들어, "한 유전자"는 하나 이상의 상기 유전자를 나타내는 것으로 이해된다. 따라서, "하나", "하나 이상의 것," 및 "적어도 하나"라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
본원에서 사용되는, "약"이라는 용어는 달리 명시되지 않는 한, 참조 값으로부터 ± 10% 변동 이내의 값을 지칭한다.
다양한 자료 또는 참고문헌 사이에 정의가 서로 상충하는 경우, 본원에서 제공된 정의가 우선하여야 한다.
II. 벡터
본원에서는 이종성 유전자 및 이중 D (DD) 요소를 특징으로 하는 합성 DNA 벡터를 제공한다. DD 요소를 갖는 합성 DNA 벡터는 세포내에서 (예컨대, 휴지 세포, 예컨대, 유사분열 후 세포에서) 예컨대, AAV 벡터와 유사한 방식으로 에피솜으로서 지속될 수 있다. 본원에서 제공된 벡터는, 바이러스 벡터에 고유한 성분 (예컨대, 바이러스 단백질) 및 박테리아 플라스미드 DNA, 예컨대, 면역원성 성분 (예컨대, 면역원성 박테리아 시그니처 (예컨대, CpG 섬 또는 CpG 모티프)) 또는 추가로 또는 다르게는 지속 감소와 연관된 성분 (예컨대, CpG 섬 또는 CpG 모티프)이 없는, 네이키드 DNA 벡터일 수 있다.
본원에서 원형 DNA 벡터로 지칭되는, 복제 기점 및/또는 약물 내성 유전자 없이, 이종성 유전자를 특징으로 하는 합성 원형 DNA 벡터를 추가로 제공한다. 본 발명은 합성에 의해 제조된 원형 DNA 벡터를 제공한다.
합성 원형 DNA 벡터는 세포내에서 (예컨대, 휴지 세포, 예컨대, 유사분열 후 세포에서) 예컨대, AAV 벡터와 유사한 방식으로 에피솜으로서 지속될 수 있다. 본원에서 제공된 벡터는, 바이러스 벡터에 고유한 성분 (예컨대, 바이러스 단백질) 및 박테리아 플라스미드 DNA, 예컨대, 면역원성 성분 (예컨대, 면역원성 박테리아 시그니처 (예컨대, CpG 모티프)) 또는 추가로 또는 다르게는 지속 감소와 연관된 성분 (예컨대, CpG 섬)이 없는, 네이키드 DNA 벡터일 수 있다.
각각의 상기 언급된 벡터에 관한 일부 실시양태에서, DNA 벡터는 생체내 지속된다 (예컨대, 원형성 및 비-박테리아성 성질 (즉, 시험관내 합성에 의한 것)은 DNA 벡터의 이종성 유전자의 장기간의 전사 또는 발현과 연관이 있다). 일부 실시양태에서, 원형 DNA 벡터의 지속은 참조 벡터 (예컨대, 박테리아에서 생산되거나, 또는 본 발명의 벡터에 존재하지 않는 하나 이상의 박테리아 시그니처를 갖는 원형 벡터)보다 5% 내지 50% 더 크거나, 50% 내지 100% 더 크거나, 1배 내지 5배, 또는 5배 내지 10배 (예컨대, 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 75%, 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 또는 그 초과) 더 크다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 원형 DNA 벡터는 1주 내지 4주, 1개월 내지 4개월, 4개월 내지 1년, 1년 내지 5년, 5년 내지 20년, 또는 20년 내지 50년 (예컨대, 적어도 1주, 적어도 2주, 적어도 1개월, 적어도 4개월, 적어도 1년, 적어도 2년, 적어도 5년, 적어도 10년, 적어도 20년, 적어도 30년, 적어도 40년, 또는 적어도 50년) 동안 지속된다. 일부 실시양태에서, DNA 벡터는 지속 증가와 연관이 있을 수 있는 DD 요소를 포함한다.
DNA 벡터는 원형 DNA 벡터일 수 있다. 원형 DNA 벡터는 단량체, 이량체, 삼량체, 사량체, 오량체, 육량체 등일 수 있다. 바람직하게, 원형 DNA 벡터는 단량체이다. 다른 바람직한 실시양태에서, 원형 DNA 벡터는 단량체, 슈퍼코일드 원형 DNA 분자이다. 일부 실시양태에서, DNA 벡터는 닉이 있는 벡터이다. 일부 실시양태에서, DNA 벡터는 개방 원형 벡터이다. 일부 실시양태에서, DNA 벡터는 이중 가닥 원형 벡터이다.
추가로 또는 대안적으로, DNA 벡터는 DD 요소를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, DNA 벡터 (예컨대, 원형 DNA 벡터, 예컨대, 단량체 원형 DNA 벡터)는 5'에서 3' 방향으로 작동적으로 연결된 (i) 5' D 요소, (ii) 이종성 유전자, 및 (iii) 3' D 요소를 포함한다. 일부 실시양태에서, DNA 벡터는 5'에서 3' 방향으로 작동적으로 연결된 (i) 5' D 요소, (ii) 프로모터, (iii) 이종성 유전자, 및 (iv) 3' D 요소를 포함한다. 일부 실시양태에서, DNA 벡터는 5'에서 3' 방향으로 작동적으로 연결된 (i) 5' D 요소, (ii) 프로모터, (iii) 이종성 유전자, (iv) 폴리아데닐화 부위, 및 (v) 3' D 요소를 포함한다.
예를 들어, DNA 벡터는 5'에서 3' 방향으로 작동적으로 연결된 (i) 5' A 요소, (ii) 5' D 요소, (iii) 이종성 유전자, (iv) 3' D 요소, 및 (v) 5' A 요소를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, DNA 벡터는 5'에서 3' 방향으로 (i) 5' A 요소, (ii) 5' D 요소, (iii) 프로모터, (iv) 이종성 유전자, (v) 3' D 요소, 및 (vi) 5' A 요소를 포함한다. 일부 실시양태에서, DNA 벡터는 5'에서 3' 방향으로 (i) 5' A 요소, (ii) 5' D 요소, (iii) 프로모터, (iv) 이종성 유전자, (v) 폴리아데닐화 부위, (vi) 3' D 요소, 및 (vii) 5' A 요소를 포함한다. 일부 실시양태에서, DNA 벡터는 5'에서 3' 방향으로 (i) 5' C 요소, (ii) 5' A 요소, (iii) 5' D 요소, (iv) 이종성 유전자, (v) 3' D 요소, (vi) 3' A 요소, 및 (vii) 3' B 요소를 포함한다. 일부 실시양태에서, DNA 벡터는 5'에서 3' 방향으로 (i) 5' C 요소, (ii) 5' A 요소, (iii) 5' D 요소, (iv) 프로모터, (v) 이종성 유전자, (vi) 3' D 요소, (vii) 3' A 요소, 및 (viii) 3' B 요소를 포함한다. 일부 실시양태에서, DNA 벡터는 5'에서 3' 방향으로 (i) 5' C 요소, (ii) 5' A 요소, (iii) 5' D 요소, (iv) 프로모터, (v) 이종성 유전자, (vi) 폴리아데닐화 부위, (vii) 3' D 요소, (viii) 3' A 요소, 및 (ix) 3' B 요소를 포함한다.
일부 실시양태에서, DNA 벡터는 동일한 핵산 (예컨대, DNA) 가닥 상에 적어도 5' D 요소 및 3' D 요소를 갖는 핵산 서열을 갖는 DD 요소를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, DNA 벡터는 5'에서 3' 방향으로 작동적으로 연결된 (i) 이종성 유전자 및 (ii) DD 요소를 포함한다. 일부 실시양태에서, DNA 벡터는 5'에서 3' 방향으로 (i) 프로모터, (ii) 이종성 유전자, 및 (iii) DD 요소를 포함한다. 일부 실시양태에서, DNA 벡터는 5'에서 3' 방향으로 (i) 이종성 유전자, (ii) 폴리아데닐화 부위, 및 (iii) DD 요소를 포함한다. 일부 실시양태에서, DNA 벡터는 5'에서 3' 방향으로 (i) 프로모터, (ii) 이종성 유전자, (iii) 폴리아데닐화 부위, 및 (iv) DD 요소를 포함한다.
말단 반복 서열
본 발명의 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 벡터 및 조성물은 예컨대, 원형화의 결과로서 예컨대, ITR, LTR, 또는 다른 말단 구조로부터 유도될 수 있는 말단 반복 서열을 포함한다. 말단 반복 서열의 길이는 적어도 10개의 염기쌍 (bp) (예컨대, 10 bp 내지 500 bp, 12 bp 내지 400 bp, 14 bp 내지 300 bp, 16 bp 내지 250 bp, 18 bp 내지 200 bp, 20 bp 내지 180 bp, 25 bp 내지 170 bp, 30 bp 내지 160 bp, 또는 50 bp 내지 150 bp, 예컨대, 10 bp 내지 15 bp, 15 bp 내지 20 bp, 20 bp 내지 25 bp, 25 bp 내지 30 bp, 30 bp 내지 35 bp, 35 bp 내지 40 bp, 40 bp 내지 45 bp, 45 bp 내지 50 bp, 50 bp 내지 55 bp, 55 bp 내지 60 bp, 60 bp 내지 65 bp, 65 bp 내지 70 bp, 70 bp 내지 80 bp, 80 bp 내지 90 bp, 90 bp 내지 100 bp, 100 bp 내지 150 bp, 150 bp 내지 200 bp, 200 bp 내지 300 bp, 300 bp 내지 400 bp, 또는 400 bp 내지 500 bp, 예컨대, 10 bp, 11 bp, 12 bp, 13 bp, 14 bp, 15 bp, 16 bp, 17 bp, 18 bp, 19 bp, 20 bp, 21 bp, 22 bp, 23 bp, 24 bp, 25 bp, 26 bp, 27 bp, 28 bp, 29 bp, 30 bp, 31 bp, 32 bp, 33 bp, 34 bp, 35 bp, 36 bp, 37 bp, 38 bp, 39 bp, 40 bp, 41 bp, 42 bp, 43 bp, 44 bp, 45 bp, 46 bp, 47 bp, 48 bp, 49 bp, 50 bp, 51 bp, 52 bp, 53 bp, 54 bp, 55 bp, 56 bp, 57 bp, 58 bp, 59 bp, 60 bp, 61 bp, 62 bp, 63 bp, 64 bp, 65 bp, 66 bp, 67 bp, 68 bp, 69 bp, 70 bp, 71 bp, 72 bp, 73 bp, 74 bp, 75 bp, 76 bp, 77 bp, 78 bp, 79 bp, 80 bp, 81 bp, 82 bp, 83 bp, 84 bp, 85 bp, 86 bp, 87 bp, 88 bp, 89 bp, 90 bp, 91 bp, 92 bp, 93 bp, 94 bp, 95 bp, 96 bp, 97 bp, 98 bp, 99 bp, 100 bp, 101 bp, 102 bp, 103 bp, 104 bp, 105 bp, 106 bp, 107 bp, 108 bp, 109 bp, 110 bp, 111 bp, 112 bp, 113 bp, 114 bp, 115 bp, 116 bp, 117 bp, 118 bp, 119 bp, 120 bp, 121 bp, 122 bp, 123 bp, 124 bp, 125 bp, 126 bp, 127 bp, 128 bp, 129 bp, 130 bp, 131 bp, 132 bp, 133 bp, 134 bp, 135 bp, 136 bp, 137 bp, 138 bp, 139 bp, 140 bp, 141 bp, 142 bp, 143 bp, 144 bp, 145 bp, 146 bp, 147 bp, 148 bp, 149 bp, 150 bp, 또는 그 초과)일 수 있다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 합성 벡터의 말단 반복 서열은 DD 요소 (예컨대, ITR의 하나 이상의 부분으로부터 유래되고/거나, 그를 함유하는 DD 요소)일 수 있다. DD 요소는 단일 DNA 분자 상에 2개의 D 요소를 함유한다. 일부 실시양태에서, 2개의 D 요소는 약 125개의 핵산만큼 이격되어 있다. DD 요소는 임의 혈청형의 AAV, 예컨대, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, 또는 AAV9로부터 유래될 수 있다.
일부 실시양태에서, DD 요소는 예를 들어, 도 6f에 제시된 구조로 서로 직접 연결된 2개의 D 요소를 포함한다. 따라서, 일부 실시양태에서, DD 요소는 서열식별번호 14의 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, DD 요소는 서열식별번호 14의 핵산 서열과 80%, 82.5%, 85%, 87.5%, 90%, 92.5%, 95%, 97.5%, 또는 100% 상동성이다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 DD 요소는 5' D 요소를 3' D 요소로부터 이격시키는 적어도 하나의 추가 요소, 예컨대, 하나 이상의 A 요소; 하나 이상의 B 요소; 및/또는 하나 이상의 C 요소를 갖고, 이는 임의의 적합한 순서로 배열될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, DD 요소는 5'에서 3' 구조로 작동적으로 연결된 (i) 5' D 요소 (즉, 서열식별번호 1, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 38, 또는 40 중 어느 하나의 핵산 서열과 적어도 80%의 상동성 (예컨대, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%의 상동성)을 갖는 핵산 서열); (ii) 하나 이상의 내부 핵산 (예컨대, 비-이종성 핵산), 및 (iii) 3' D 요소 (즉, 서열식별번호 8, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 39, 또는 41 중 어느 하나의 핵산 서열과 적어도 80%의 상동성 (예컨대, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%의 상동성)을 갖는 핵산 서열)를 포함한다. 일부 실시양태에서, (ii)의 하나 이상의 핵산은 1-125개의 핵산, 2-100개의 핵산, 5-80개의 핵산, 또는 10-50개의 핵산, 예컨대, 1-20개의 핵산, 20-40개의 핵산, 40-60개의 핵산, 60-80개의 핵산, 80-100개의 핵산, 또는 100-125개의 핵산, 예컨대, 1-5개의 핵산, 5-10개의 핵산, 10-15개의 핵산, 15-20개의 핵산, 20-25개의 핵산, 25-30개의 핵산, 30-35개의 핵산, 35-40개의 핵산, 40-45개의 핵산, 45-50개의 핵산, 50-55개의 핵산, 55-60개의 핵산, 60-65개의 핵산, 65-70개의 핵산, 70-75개의 핵산, 75-80개의 핵산, 80-85개의 핵산, 85-90개의 핵산, 90-95개의 핵산, 95-100개의 핵산, 100-105개의 핵산, 105-110개의 핵산, 110-115개의 핵산, 115-120개의 핵산, 120-125개의 핵산, 예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69 ,70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 또는 125개의 핵산이다.
일부 실시양태에서, DD 요소는 2개의 A 요소 (예컨대, 5' A 요소 (예컨대, 서열식별번호 2) 및 3' A 요소 (예컨대, 서열식별번호 7)), 2개의 B 요소 (예컨대, 5' B 요소 (예컨대, 서열식별번호 5) 및 3' B 요소 (예컨대, 서열식별번호 6)), 및 2개의 C 요소, 예컨대, 서열식별번호 1-8 이외에도, 2개의 D 요소 (예컨대, 5' D 요소 (예컨대, 서열식별번호 1, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 38, 또는 40) 및 3' D 요소 (예컨대, 서열식별번호 8, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 39, 또는 41))를 포함한다. 서열식별번호 1-8의 핵산 서열은 예를 들어, 도 6a에 제시된 바와 같이 5'에서 3' 방향으로 순서대로 작동적으로 연결될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, DD 요소는 서열식별번호 9의 핵산 서열을 포함한다. 대안적으로, 서열식별번호 1-8은 임의의 적합한 순서로 작동적으로 연결될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, DD 요소는 서열식별번호 10의 핵산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 서열식별번호 1 및 8 (즉, 2개의 D 요소)은 나머지 요소 및/또는 D 요소 내의 핵산에 플랭킹된다.
서열식별번호 1-8의 요소는 각각 서로 직접 연결될 수 있거나, 또는 간접적으로 연결될 수 있고 (예컨대, 작동적으로 연결될 수 있고), 예컨대, 서열식별번호 1-8은 5'에서 3' 방향으로 작동적으로 연결될 수 있다. 대안적으로, 도 6a 및 6b에 제시된 바와 같이, 하나 이상의 작동적으로 연결된 요소를 이격시키는 하나 이상의 핵산이 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, DD 요소는 5' D 요소 및 3' D 요소 사이에 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5개, 또는 그 초과의 하기의 요소 쌍: 5' D 요소 및 5' A 요소, 5' D 요소 및 5' B 요소, 5' D 요소 및 3' B 요소, 5' D 요소 및 5' C 요소, 5' D 요소 및 3' C 요소, 5' D 요소 및 3' A 요소, 5' D 요소 및 3' D 요소, 5' A 요소 및 5' B 요소, 5' A 요소 및 3' B 요소, 5' A 요소 및 5' C 요소, 5' A 요소 및 3' C 요소, 5' A 요소 및 3' A 요소, 5' A 요소 및 3' D 요소, 5' B 요소 및 3' B 요소, 5' B 요소 및 5' C 요소, 5' B 요소 및 3' C 요소, 5' B 요소 및 3' A 요소, 5' B 요소 및 3' D 요소, 3' B 요소 및 5' C 요소, 3' B 요소 및 3' C 요소, 3' B 요소 및 3' A 요소, 3' B 요소 및 3' D 요소, 5' C 요소 및 3' C 요소, 5' C 요소 및 3' A 요소, 5' C 요소 및 3' D 요소, 3' C 요소 및 3' A 요소, 3' C 요소 및 3' D 요소, 또는 3' A 요소 및 3' D 요소 사이에) 배치된 1-100개의 추가의 핵산 (예컨대, 3-50개의 핵산, 예컨대, 3-10개의 핵산, 예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12개, 또는 그 초과의 추가의 핵산)을 포함한다.
추가 핵산은 도 6a 및 6b에 AhdI 부위로 제시된 바와 같이, 예를 들어, 제한 부위로서 작용할 수 있다.
일부 실시양태에서, 요소 A, B, 또는 C (예컨대, 서열식별번호 2-7) 중 하나 이상의 것이 부재한다. 예를 들어, 도 6c는 B 요소가 없는 AAV2-유래 DD 요소를 보여주는 것이다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명의 DD 요소는 서열식별번호 11과 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 상동성을 갖는 핵산 서열을 가질 수 있다. 유사하게, 도 6d는 C 요소가 없는 DD 요소를 보여주는 것이다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명의 DD 요소는 서열식별번호 12와 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 상동성을 갖는 핵산 서열을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, DD 요소는 예컨대, 도 6e에 제시된 바와 같이, B 또는 C 요소를 포함하지 않는다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명의 DD 요소는 서열식별번호 13과 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 상동성을 갖는 핵산 서열을 가질 수 있다.
대안적으로, 요소 A, B, 또는 C (예컨대, 서열식별번호 2-7) 중 하나 이상의 것은 예컨대, 그의 3' A 요소 대신 상이한 핵산 서열을 갖는 적합한 DD 요소를 보여주는 도 6g에서와 같이, 상이한 핵산 서열로 대체될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, DD 요소는 서열식별번호 1-3 및 8을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 DD 요소는 서열식별번호 15와 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 상동성을 갖는 핵산 서열을 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6개, 또는 그 초과의) 핵산은 2개의 인접한 요소 사이에서 중첩된다. 예를 들어, 제1 요소의 3'-말단의 하나 이상의 핵산이 그의 3' 말단에 연결된 제2 요소의 5'-말단의 하나 이상의 핵산과 매칭되는 일부 실시양태에서, 중첩 핵산이 반복될 필요는 없다. 상기 DD 요소의 예는 5' C 요소의 3' 말단이 3' A 요소의 5' 말단과 중첩되어 있는 도 6h에 제시되어 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명의 DD 요소는 서열식별번호 16과 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 상동성을 갖는 핵산 서열을 가질 수 있다.
5' 및 3' D 요소 사이의 핵산 서열은 5' 또는 3' A 요소, 5' 또는 3' B 요소, 또는 5' 또는 3' C 요소 중 임의의 하나 이상의 것의 부분일 수 있다. 특정 실시양태에서, DD 요소는 예컨대, 도 6i 및 6j에 제시된 하나 이상의 부분 A 요소를 포함한다. 부분 A 요소는 서열식별번호 2 또는 7로서 6개 이상의 연속 매칭 핵산 (예컨대, 6-40, 8-35, 10-30, 또는 15-25개, 예컨대, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 또는 40개의 연속 매칭 핵산)을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 DD 요소는 서열식별번호 17과 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 상동성을 갖는 핵산 서열을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 DD 요소는 서열식별번호 18과 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 상동성을 갖는 핵산 서열을 가질 수 있다.
AAV2-유래 DD 요소 및 그의 서브요소의 예시적인 핵산 서열은 하기 표 2에 제공되어 있다.
표 2. DD 요소 및 그의 서브요소의 예시적인 핵산 서열
Figure pct00002
Figure pct00003
이종성 유전자
본 발명의 벡터 (예컨대, DD 요소를 함유하거나, 원형 구조를 갖거나, 또는 그 둘 모두를 갖는 DNA 벡터) 중 임의의 것은 이종성 유전자를 표적 세포 내로 삽입하는 데 사용될 수 있다. 본원에 개시된 바와 같이, 매우 다양한 이종성 유전자가 본 벡터에 의해 표적 세포로 전달될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이종성 유전자는 이종성 유전자, 예컨대, 치료 단백질, 예컨대, 표적 세포 및/또는 대상체에서 결함이 있거나, 또는 그에 부재하는 단백질을 코딩하는 유전자의 발현에 의해 치료될 수 있는 질환과 연관이 있는 돌연변이를 갖는 표적 세포를 형질감염시키도록 구성된다. 상기 경우에서, 이종성 유전자는 (예컨대, 트랜스-스플라이싱 분자의 부분으로서) 안구 단백질, 예컨대, CEP290, ABCA4, ABCC6, RIMS1, LRP5, CC2D2A, TRPM1, C3, IFT172, COL11A1, TUBGCP6, KIAA1549, CACNA1F, SNRNP200, RP 1, MYO7A, PRPF8, VCAN, USH2A, 및 HMCN1 모두 또는 그의 부분을 코딩할 수 있다. 다른 예시적인 치료 단백질로는 성장 인자, 인터류킨, 인터페론, 항-아폽토시스 인자, 시토카인, 항-당뇨병성 인자, 항-아폽토시스제, 응고 인자, 항-종양 인자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리펩티드를 포함한다. 치료 단백질로는 BDNF, CNTF, CSF, EGF, FGF, G-SCF, GM-CSF, 고나도트로핀, IFN, IFG-1, M-CSF, NGF, PDGF, PEDF, TGF, VEGF, TGF-B2, TNF, 프로락틴, 소마토트로핀, XIAP1, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-10, 바이러스 IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, 및/또는 IL-18을 포함할 수 있다.
예를 들어, 트랜스제닉 동물에서 성장을 촉진시키는 성장 호르몬, 또는 인슐린 유사 성장 인자 (IGF), α-항-트립신, 에리트로포이에틴 (EPO), 혈액 응고계의 인자 VIII, IX, X, 및 XI, LDL-수용체, GATA-1 등을 비롯한, 관심 폴리펩티드를 코딩하는 다른 이종성 유전자가 본 발명의 벡터의 부분으로서 포함될 수 있다. 핵산 서열은 예컨대, 아폽토시스 또는 아폽토시스 관련 효소를 코딩하는 자살 유전자, 및 AlF, Apaf, (예컨대, Apaf-1, Apaf-2, 또는 Apaf-3) APO-2 (L), APO-3 (L), 아포파인, Bad, Bak, Bax, Bcl-2, Bcl-x.sub.L, Bcl-x.sub.S, bik, CAD, 칼파인, 카스파제, 예컨대 카스파제-1, 카스파제-2, 카스파제-3, 카스파제-4, 카스파제-5, 카스파제-6, 카스파제-7, 카스파제-8, 카스파제-9, 카스파제-10, 카스파제-11, 또는 그랜자임 B, ced-3, ced-9, 세라미드, c-Jun, c-Myc, CPP32, crm A, 시토크롬 c, D4-GDP-DI, Daxx, CdR1, DcR1, DD, DED, DISC, DNA-PK.sub.CS, DR3, DR4, DR5, FADD/MORT-1, FAK, Fas, Fas-리간드 CD95/fas (수용체), FLICE/MACH, FLIP, 포드린, fos, G-액틴, Gas-2, 겔솔린, 글루코코르티코이드/글루코코르티코이드 수용체, 그랜자임 A/B, hnRNP C1/C2, ICAD, ICE, JNK, 라민 A/B, MAP, MCL-1, Mdm-2, MEKK-1, MORT-1, NEDD, NF-κB, NuMa, p53, PAK-2, PARP, 퍼포린, PITSLRE, PKC-델타, pRb, 프레세닐린, prICE, RAIDD, Ras, RIP, 스핑고미엘리나제, SREBP, 단순 헤르페스로부터의 티미딘 키나제, TNF-α, TNF-α 수용체, TRADD, TRAF2, TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRAIL-R3, 트랜스글루타미나제, U1 70 kDa snRNP, YAMA 등을 포함하는 유전자를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 이종성 유전자는 항체, 또는 그의 부분, 단편, 또는 변이체를 코딩한다. 항체는 항원에 결합할 수 있는 단편, 예컨대, Fv, 단일-쇄 Fv (scFv), Fab, Fab', 디-scFv, sdAb (단일 도메인 항체) 및 (Fab')2 (화학적으로 연결된 F(ab')2 포함)를 포함한다. 항체의 파파인 분해를 통해, 각각이 단일 항원-결합 부위를 갖는, "Fab" 단편으로 불리는 2개의 동일한 항원-결합 단편, 및 나머지 "Fc" 단편이 생성되며, 상기 단편의 명칭은 쉽게 결정화될 수 있는 그의 능력을 반영한다. 펩신 처리를 통해 2개의 항원-결합 부위를 갖고, 여전히 항원과 가교 결합할 수 있는 F(ab')2 단편이 생성된다. 항체는 또한 키메라 항체 및 인간화 항체도 포함한다. 추가로, 본원에 제공된 항체 구축물의 경우, 다른 유기체로부터의 서열을 갖는 변이체 또한 고려된다. 따라서, 인간 버전의 항체가 개시된다면, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 인간 서열 기반 항체를 마우스, 래트, 고양이, 개, 말 등의 서열로 형질전환시키는 방법에 대해 이해할 것이다. 항체 단편은 또한 어느 배향이든 단일 쇄 scFv, 텐덤 디-scFv, 디아바디, 텐덤 트리-sdcFv, 미니바디 등을 포함한다. 일부 실시양태에서, 예컨대, 항체가 scFv일 때, 이종성 유전자의 단일 폴리뉴클레오티드는 함께 연결된 중쇄 및 경쇄, 둘 모두를 포함하는 단일 폴리펩티드를 코딩한다. 항체 단편은 또한 나노바디 (예컨대, sdAb, 단일, 단량체 도메인, 예컨대, 경쇄 없이, 중쇄의 가변 도메인 한쌍을 갖는 항체)를 포함한다. 다중특이적 항체 (예컨대, 이중특이적 항체, 삼중특이적 항체 등)는 관련 기술분야에 공지되어 있고, 본 발명의 이종성 유전자의 발현 생성물로서 고려된다.
일부 실시양태에서, 이종성 유전자는 예를 들어, 특정 세포 및 조직에서 이종성 유전자 발현을 확인하는 데 유용할 수 있는 리포터 서열을 포함한다. 트랜스진으로 제공될 수 있는 리포터 서열로는 제한 없이, β-락타마제, β-갈락토시다제 (LacZ), 알칼리성 포스파타제, 티미딘 키나제, 녹색 형광 단백질 (GFP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 (CAT), 루시페라제, 및 관련 기술분야에 널리 공지된 다른 것을 코딩하는 DNA 서열을 포함한다. 리포터 서열이 그의 발현을 구동시키는 조절 요소와 회합되어 있을 때, 이는 효소, 방사선, 비색, 형광 또는 다른 분광분석 검정법, 형광성 활성화 세포 분류 검정법 및 면역 검정법 (효소 결합 면역흡착성 검정법 (ELISA) 포함), 방사면역검정법 (RIA), 및 면역조직화학법을 비롯한, 통상의 수단에 의해 검출가능한 신호를 제공한다. 예를 들어, 마커 서열이 LacZ 유전자인 경우, 신호를 보유하는 벡터의 존재는 β-갈락토시다제 활성에 대한 검정법에 의해 검출된다. 트랜스진이 녹색 형광 단백질 또는 루시페라제인 경우, 신호를 보유하는 벡터는 루미노미터에서 발색 또는 발광에 의해 시각적으로 측정될 수 있다.
일부 실시양태에서, 이종성 유전자는 코딩 서열을 포함하지 않는다. 비-코딩 서열, 예컨대, shRNA, 프로모터, 인핸서, (예컨대, 항체 인식을 위해) DNA를 마킹하는 서열, PCR 증폭 부위, 제한 효소 부위를 정의하는 서열, 부위-특이적 리콤비나제 인식 부위, 핵산에 결합하고/거나, 핵산을 변형시키는 단백질에 의해 인식되는 서열, 및 링커가 벡터에 포함될 수 있다. 이종성 유전자가 트랜스-스플라이싱 분자인 경우, 비-코딩 서열은 표적 인트론에 결합하는 결합 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 이종성 유전자의 길이는 0.1 Kb 내지 100 Kb이다 (예컨대, 이종성 유전자의 길이는 0.2 Kb 내지 90 Kb, 0.5 Kb 내지 80 Kb, 1.0 Kb 내지 70 Kb, 1.5 Kb 내지 60 Kb, 2.0 Kb 내지 50 Kb, 2.5 Kb 내지 45 Kb, 3.0 Kb 내지 40 Kb, 3.5 Kb 내지 35 Kb, 4.0 Kb 내지 30 Kb, 4.5 Kb 내지 25 Kb, 4.6 Kb 내지 24 Kb, 4.7 Kb 내지 23 Kb, 4.8 Kb 내지 22 Kb, 4.9 Kb 내지 21 Kb, 5.0 Kb 내지 20 Kb, 5.5 Kb 내지 18 Kb, 6.0 Kb 내지 17 Kb, 6.5 Kb 내지 16 Kb, 7.0 Kb 내지 15 Kb, 7.5 Kb 내지 14 Kb, 8.0 Kb 내지 13 Kb, 8.5 Kb 내지 12.5 Kb, 9.0 Kb 내지 12.0 Kb, 9.5 Kb 내지 11.5 Kb, 또는 10.0 Kb 내지 11.0 Kb, 예컨대, 그 길이는 0.1 Kb 내지 0.5 Kb, 0.5 Kb 내지 1.0 Kb, 1.0 Kb 내지 2.5 Kb, 2.5 Kb 내지 4.5 Kb, 4.5 Kb 내지 8 Kb, 8 Kb 내지 10 Kb, 10 Kb 내지 15 Kb, 15 Kb 내지 20 Kb, 또는 그 초과, 예컨대, 그 길이는 0.1 Kb 내지 0.25 Kb, 0.25 Kb 내지 0.5 Kb, 0.5 Kb 내지 1.0 Kb, 1.0 Kb 내지 1.5 Kb, 1.5 Kb 내지 2.0 Kb, 2.0 Kb 내지 2.5 Kb, 2.5 Kb 내지 3.0 Kb, 3.0 Kb 내지 3.5 Kb, 3.5 Kb 내지 4.0 Kb, 4.0 Kb 내지 4.5 Kb, 4.5 Kb 내지 5.0 Kb, 5.0 Kb 내지 5.5 Kb, 5.5 Kb 내지 6.0 Kb, 6.0 Kb 내지 6.5 Kb, 6.5 Kb 내지 7.0 Kb, 7.0 Kb 내지 7.5 Kb, 7.5 Kb 내지 8.0 Kb, 8.0 Kb 내지 8.5 Kb, 8.5 Kb 내지 9.0 Kb, 9.0 Kb 내지 9.5 Kb, 9.5 Kb 내지 10 Kb, 10 Kb 내지 10.5 Kb, 10.5 Kb 내지 11 Kb, 11 Kb 내지 11.5 Kb, 11.5 Kb 내지 12 Kb, 12 Kb 내지 12.5 Kb, 12.5 Kb 내지 13 Kb, 13 Kb 내지 13.5 Kb, 13.5 Kb 내지 14 Kb, 14 Kb 내지 14.5 Kb, 14.5 Kb 내지 15 Kb, 15 Kb 내지 15.5 Kb, 15.5 Kb 내지 16 Kb, 16 Kb 내지 16.5 Kb, 16.5 Kb 내지 17 Kb, 17 Kb 내지 17.5 Kb, 17.5 Kb 내지 18 Kb, 18 Kb 내지 18.5 Kb, 18.5 Kb 내지 19 Kb, 19 Kb 내지 19.5 Kb, 19.5 Kb 내지 20 Kb, 20 Kb 내지 21 Kb, 21 Kb 내지 22 Kb, 22 Kb 내지 23 Kb, 23 Kb 내지 24 Kb, 24 Kb 내지 25 Kb, 또는 그 초과, 예컨대, 그 길이는 약 4.5 Kb, 약 5.0 Kb, 약 5.5 Kb, 약 6.0 Kb, 약 6.5 Kb, 약 7.0 Kb, 약 7.5 Kb, 약 8.0 Kb, 약 8.5 Kb, 약 9.0 Kb, 약 9.5 Kb, 약 10 Kb, 약 11 Kb, 약 12 Kb, 약 13 Kb, 약 14 Kb, 약 15 Kb, 약 16 Kb, 약 17 Kb, 약 18 Kb, 약 19 Kb, 약 20 Kb, 또는 그 초과)이다.
제어 요소
말단 반복 서열 (예컨대, DD 요소) 및 이종성 유전자 이외에도, 본 발명의 DNA 벡터 (예컨대, 본원에 기술된 바와 같은 원형 DNA 벡터)는 표적 세포에서의 전사, 번역 및/또는 발현을 허용하는 방식으로 이종성 유전자에 작동가능하게 연결된, 필요한 통상의 제어 요소를 포함할 수 있다.
발현 제어 서열은 적절한 전사 개시, 종결, 프로모터, 및 인핸서 서열; 효율적인 RNA 프로세싱 신호, 예컨대, 스플라이싱 및 폴리아데닐화 (폴리A) 신호; 세포질 mRNA를 안정화시키는 서열; 번역 효율을 증진시키는 서열 (즉, 코작 공통 서열); 단백질 안정성을 증진시키는 서열; 및 코딩된 생성물의 분비를 증진시키는 서열을 포함한다. 천연, 구성적, 유도성, 및/또는 조직-특이적인 프로모터를 비롯한, 각종의 발현 제어 서열이 관련 기술분야에 공지되어 있고, 이는 본 발명의 부분으로서 사용될 수 있다. 프로모터 영역이 이종성 유전자의 전사를 발휘시킬 수 있고, 이에 의해 생성된 전사체가 원하는 단백질 또는 폴리펩티드로 번역될 수 있다면, 프로모터 영역은 상기 유전자에 작동가능하게 연결되어 있는 것이다. 본원에 기술된 DNA 벡터의 부분으로서 유용한 프로모터로는 구성적 및 유도성 프로모터를 포함한다. 구성적 프로모터의 예로는 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터 (임의적으로, CMV 인핸서 포함), 레트로바이러스 라우스 육종 바이러스 (RSV) LTR 프로모터 (임의적으로, RSV 인핸서 포함), SV40 프로모터, 디히드로폴레이트 리덕타제 프로모터, β-액틴 프로모터, 포스포글리세롤 키나제 (PGK) 프로모터, 및 EF1 a 프로모터를 포함한다.
유도성 프로모터를 통해 유전자 발현을 조절할 수 있고, 유도성 프로모터는 외부에서 공급되는 화합물, 환경 요인, 예컨대, 온도, 또는 특정 생리적 상태, 예컨대, 급성기, 세포의 특정 분화 상태의 존재에 의해, 또는 오직 복제 세포에서만 조절될 수 있다. 유도성 프로모터 및 유도성 시스템은 다양한 상업적 공급원으로부터 이용가능하다. 다수의 다른 시스템도 기술되어 있고, 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 쉽게 선택될 수 있다. 외부에서 공급되는 프로모터에 의해 조절되는 유도성 프로모터의 예로는 아연-유도성 양 메탈로티오닌 (MT) 프로모터, 덱사메타손-유도성 마우스 유방 종양 바이러스 프로모터, T7 폴리머라제 프로모터 시스템, 에크디손 곤충 프로모터, 테트라시클린-억제성 시스템, 테트라시클린-유도성 시스템, RU486-유도성 시스템, 및 라파마이신-유도성 시스템을 포함한다. 이와 관련하여 유용할 수 있는 추가의 다른 유형의 유도성 프로모터는 특정 생리적 상태, 예컨대, 온도, 급성기, 세포의 특정 분화 상태에 의해, 또는 오직 복제 세포에서만 조절되는 것이다.
또 다른 실시양태에서, 이종성 유전자에 대한 천연 프로모터가 사용된다. 천연 프로모터는 이종성 유전자의 발현이 천연 발현을 모방하여야 하는 것이 요구될 경우에 바람직할 수 있다. 이종성 유전자의 발현이 일시적으로 또는 발생학적으로, 또는 조직-특이적 방식으로, 또는 특정 전사 자극에 대한 반응으로 조절되어야 할 때, 천연 프로모터가 사용될 수 있다. 추가 실시양태에서, 다른 천연 발현 제어 요소, 예컨대, 인핸서 요소, 폴리아데닐화 부위, 또는 코작 공통 서열 또한 천연 발현을 모방하는 데 사용될 수 있다.
단백질을 코딩하는 이종성 유전자의 경우, 폴리아데닐화 (pA) 서열은 이종성 유전자 뒤 및 말단 반복 서열 앞에 삽입될 수 있다. 본 개시내용에서 유용한 이종성 유전자는 또한, 바람직하게는 프로모터/인핸서 서열과 이종성 유전자 사이에 위치하는 인트론을 함유할 수 있다. 인트론 및 다른 공통 벡터 요소의 선택은 통상적이며, 상기와 같은 다수의 서열이 이용가능하다.
숙주 세포에서의 유전자 발현을 위해 필요한 조절 서열의 정확한 성질은 종, 조직, 또는 세포 유형마다 달라질 수 있지만, 일반적으로는 필요에 따라, 각각 전사 및 번역 개시에 관여하는 5' 비-전사 서열 및 5' 비-번역 서열, 예컨대, TATA 박스, 캡핑 서열, CAAT 서열, 인핸서 요소 등을 포함하여야 한다. 특히, 상기 5' 비-전사 조절 서열은 작동가능하게 연결된 유전자의 전사 제어를 위해 프로모터 서열을 포함하는 프로모터 영역을 포함할 것이다. 조절 서열은 또한 필요에 따라 인핸서 서열 또는 상류 활성인자 서열을 포함할 수 있다. 본 개시내용의 벡터는 임의적으로 5' 리더 또는 신호 서열을 포함할 수 있다.
III. 제조 방법
본원에서는 합성 DNA 벡터 (예컨대, 본원에 기술된 바와 같은 원형 DNA 벡터 및/또는 DD 요소를 갖는 DNA 벡터)를 제조하는 방법을 제공한다. 특히, 본원에서 제공된 방법은 박테리아 세포 합성에 의한 것보다 (예컨대, 세포 부재하에서의) 시험관내 합성을 포함한다. DNA 벡터 (예컨대, 본원에 기술된 바와 같은 원형 DNA 벡터 및/또는 DD 요소를 함유하는 DNA 벡터)의 시험관내 합성은 폴리머라제, 예컨대, 파지 폴리머라제 (예컨대, Phi29 폴리머라제)를 사용한 효과적인 복제에 의존한다. 일부 실시양태에서, Phi29 폴리머라제는 말단 반복 서열, 예컨대, DD 요소의 복제를 프로세싱하는 데 특히 유용하다. 본원에 사용된 폴리머라제는 GC가 풍부한 잔기를 통해 높은 진행도를 갖는 고온성 폴리머라제일 수 있다. 일부 실시양태에서, DD 요소를 복제시키는 데 (예컨대, 증폭시키는 데) 사용되는 폴리머라제는 Phi29 폴리머라제이다. 본 발명의 DNA 벡터를 제조하는 특정 방법은 하기 실시예에 상세하게 기술되어 있다.
일반적으로, 본 발명의 DNA 벡터 (예컨대, 본원에 기술된 바와 같은 원형 DNA 벡터)의 제조는 이종성 유전자 및 말단 반복 서열 (예컨대, DD 요소)을 갖는 AAV 게놈 (예컨대, rAAV 게놈)을 포함하는 원형 DNA 분자를 갖는 샘플을 제공하는 단계로 시작될 수 있다. 예를 들어, 샘플은 AAV 벡터 (예컨대, rAAV 벡터)로 감염된 세포 (예컨대, 포유동물 세포)로부터의 용해물 또는 다른 시료일 수 있다. 이중 가닥 원형 DNA는 표준 DNA 추출/단리 기술을 사용하여 세포로부터 수득될 수 있다. 일부 실시양태에서, 선형 DNA는 예컨대, 플라스미드-세이프 DNase를 사용하여 특이적으로 분해됨으로써 원형 DNA를 정제한다.
이어서, 폴리머라제 (예컨대, 파지 폴리머라제, 예컨대, Phi29 DNA 폴리머라제; 템플리파이(TempliPhi) 키트, GE 헬쓰케어(GE Healthcare)), 프라이머 (예컨대, 랜덤 프라이머), 및 뉴클레오티드 혼합물 (예컨대, dNTP, 예컨대, dATP, dCTP, dGTP, 및 dTTP)과 함께 AAV 게놈을 갖는 이중 가닥 원형 DNA를 인큐베이션시킴으로써 상기 DNA를 시험관내에서 무세포 시료 중에서 증폭시킬 수 있다. 폴리머라제 (예컨대, 파지 폴리머라제, 예컨대, Phi29 폴리머라제)는 롤링-서클 증폭 (예컨대, 등온 롤링-서클 증폭)에 의해 AAV 게놈 (예컨대, 무손상 말단 반복 서열, 예컨대, DD 요소를 포함하는 AAV 게놈)을 증폭시켜 복수의 AAV 게놈 카피를 갖는 선형 콘카타머를 생성한다. 적합한 폴리머라제로는 고온성 폴리머라제, 및 GC가 풍부한 잔기를 통해 높은 진행도를 특징으로 하는 폴리머라제를 포함한다.
게놈 내에서 1회 커팅하기 위해 제한 효소를 사용하여 생성된 콘카타머를 분해하여 이종성 유전자 및 말단 반복 서열 (예컨대, DD 요소)을 포함하는 단위 길이의 선형 AAV 게놈을 생성할 수 있다. 상기 선형 DNA 분자의 자기-라이게이션을 통해, 이종성 유전자 및 무손상 말단 반복 서열 (예컨대, DD 요소)이 완비된, 본 발명의 원형, 합성 DNA 벡터가 생성된다. 대안적으로, 자기-라이게이션 이전에, 선형 DNA 분자를 공지된 기술에 따라 플라스미드 벡터로 클로닝할 수 있고, 이는 하기 실시예에 예시된 바와 같이, 자기-라이게이션 이전에, 최종 DNA 벡터 (예컨대, 본원에 기술된 바와 같은 원형 벡터 및/또는 DD 함유 DNA 벡터)를 형성하는 것을 특징으로 할 수 있다.
게놈의 복제 및 증폭은 무세포 조건하에서 폴리머라제를 사용함으로써 실현될 수 있기 때문에, 합성 DNA 벡터는 그가 클로닝되어 있는 플라스미드의 박테리아 성분으로부터 단리될 수 있고, 박테리아 시그니처, 예컨대, 박테리아 CpG 모티프는 단리된 벡터에는 존재하지 않는다.
IV. 제약 조성물
본원에서는 제약상 허용되는 담체 중 본원에 기술된 DNA 벡터 (예컨대, 합성 DNA 벡터) 중 임의의 것 (예컨대, DD 요소를 함유하는 DNA 벡터 및/또는 상기 기술된 원형 DNA 벡터)을 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 본원에 기술된 제약 조성물에는 오염물질, 예컨대, 바이러스 입자, 바이러스 캡시드 단백질, 또는 그의 펩티드 단편이 실질적으로 없다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 제약 조성물은 비-면역원성이다. 예를 들어, 비-면역원성 제약 조성물에는 선천성 면역계의 세포에 의해 인식될 수 있는 병원체 연관 분자 패턴이 실질적으로 없을 수 있다. 상기 병원체 연관 분자 패턴으로는 CpG 모티프 (예컨대, 비메틸화된 CpG 모티프 또는 저메틸화된 CpG 모티프), 내독소 (예컨대, 지질다당류 (LPS), 예컨대, 박테리아 LPS), 플라젤린, 리포테이코산, 펩티도글리칸, 및 바이러스 핵산 분자, 예컨대, 이중 가닥 RNA를 포함한다.
본원에 기술된 제약 조성물은 통상의 방법에 의해서 오염에 대하여 평가될 수 있고, 적합한 투여 경로를 위한 것으로 의도되는 제약 조성물로 제제화될 수 있다. DNA 벡터를 함유하는 추가의 다른 조성물은 적합한 담체와 함께 유사하게 제제화될 수 있다. 상기 제제는 특별히 표적 세포에의 투여를 위해 지시된, 제약상 및/또는 생리학상 허용되는 비히클 또는 담체 사용을 포함한다. 한 실시양태에서, 표적 세포에의 투여를 위해 적합한 담체로는 완충처리된 염수, 등장성 염화나트륨 용액, 또는 pH를 적절한 생리학적 수준으로 유지시키기 위한 다른 완충제, 예컨대, HEPES, 및 임의적으로, 다른 의학적 작용제, 제약 작용제, 안정화제, 완충제, 담체, 애주번트, 또는 희석제를 포함한다.
일부 실시양태에서, 담체는 주사용 액체이다. 예시적인 생리학상 허용되는 담체로는 멸균 발열성 물질 제거수 및 멸균 발열성 물질 제거 포스페이트 완충처리된 염수를 포함한다. 각종의 상기와 같은 공지된 담체가 미국 특허 번호 7,629,322 (본원에서 참조로 포함)에 제공되어 있다. 한 실시양태에서, 담체는 등장성 염화나트륨 용액이다. 또 다른 실시양태에서, 담체는 균형 잡힌 염 용액이다. 한 실시양태에서, 담체는 트윈을 포함한다. 벡터가 장기간 저장되어야 한다면, 이는 글리세롤 또는 트윈20(Tween20)의 존재하에서 냉동될 수 있다.
다른 실시양태에서, 본원에 기술된 벡터를 함유하는 조성물은 계면활성제를 포함한다. 유용한 계면활성제, 예컨대, 플루로닉(Pluronic) F68 (폴록사머(Poloxamer) 188, 루트롤(LUTROL)® F68로도 공지)은 AAV가 불활성 표면에 점착되지 못하게 막기 때문에 포함할 수 있고, 이에 의해 원하는 용량이 확실하게 전달될 수 있다. 담체는 등장성 염화나트륨 용액이고, 계면활성제 플루로닉 F68을 포함한다.
전달 비히클, 예컨대, 리포솜, 나노입자, 마이크로입자, 미소구, 지질 입자, 소포체 등이 본 개시내용의 조성물을 적합한 숙주 세포 내로 도입하는 데 사용될 수 있다. 특히, DNA 벡터는 지질 입자, 리포솜, 소포체, 또는 나노입자에의 캡슐화에 의한 전달을 위해 제제화될 수 있다. 일부 실시양태에서, DNA 벡터는 전달 비히클, 예컨대, 폴록사머 및/또는 다가양이온성 물질과 복합체를 형성한다.
본 발명의 DNA 벡터 중 임의의 것 (예컨대, 본원에 기술된 원형 DNA 벡터 및/또는 DD 요소를 포함하는 DNA 벡터)을 갖는 제약 조성물은 10 ㎍ 내지 10 mg (예컨대, 25 ㎍ 내지 5.0 mg, 50 ㎍ 내지 2.0 mg, 또는 100 ㎍ 내지 1.0 mg의 DNA, 예컨대, 10 ㎍ 내지 20 ㎍, 20 ㎍ 내지 30 ㎍, 30 ㎍ 내지 40 ㎍, 40 ㎍ 내지 50 ㎍, 50 ㎍ 내지 75 ㎍, 75 ㎍ 내지 100 ㎍, 100 ㎍ 내지 200 ㎍, 200 ㎍ 내지 300 ㎍, 300 ㎍ 내지 400 ㎍, 400 ㎍ 내지 500 ㎍, 500 ㎍ 내지 1.0 mg, 1.0 mg 내지 5.0 mg, 또는 5.0 mg 내지 10 mg의 DNA, 예컨대, 약 10 ㎍, 약 20 ㎍, 약 30 ㎍, 약 40 ㎍, 약 50 ㎍, 약 60 ㎍, 약 70 ㎍, 약 80 ㎍, 약 90 ㎍, 약 100 ㎍, 약 150 ㎍, 약 200 ㎍, 약 250 ㎍, 약 300 ㎍, 약 350 ㎍, 약 400 ㎍, 약 450 ㎍, 약 500 ㎍, 약 600 ㎍, 약 700 ㎍, 약 750 ㎍, 약 1.0 mg, 약 2.0 mg, 약 2.5 mg, 약 5.0 mg, 약 7.5 mg, 또는 약 10 mg의 DNA)의 DNA 정량을 함유하는 단위 용량을 함유할 수 있다.
일부 실시양태에서, 제약 조성물은 적어도 약 0.01중량%의 DNA 벡터를 함유한다. 예를 들어, 제약 조성물은 0.01중량% 내지 80중량%의 DNA 벡터 (예컨대, 0.05중량% 내지 50중량%, 0.1중량% 내지 10중량%, 0.5중량% 내지 5중량%, 또는 1중량% 내지 2.5중량%의 DNA 벡터, 예컨대, 0.01중량% 내지 0.05중량%, 0.05중량% 내지 0.1중량%, 0.1중량% 내지 0.5중량%, 0.5중량% 내지 1.0중량%, 1.0중량% 내지 2중량%, 2중량% 내지 3중량%, 3중량% 내지 5중량%, 5중량% 내지 10중량%, 10중량% 내지 20중량%, 또는 20중량% 내지 50중량%의 DNA 벡터)를 함유할 수 있다.
본 발명의 제약 조성물은 단량체 형태의 본원에 기술된 합성 원형 DNA 벡터 중 임의의 것 (예컨대, 50% 초과의 단량체, 60% 초과의 단량체, 70% 초과의 단량체, 80% 초과의 단량체, 90% 초과의 단량체, 95% 초과의 단량체, 97% 초과의 단량체, 98% 초과의 단량체, 또는 99% 초과의 단량체)을 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물 중 70% 내지 99.99%의 합성 원형 DNA 벡터 분자가 단량체이다 (예컨대, 제약 조성물 중 70% 내지 99.9%, 70% 내지 99.5%, 70% 내지 99%, 75% 내지 99.9%, 75% 내지 99.5%, 75% 내지 99%, 80% 내지 99.9%, 80% 내지 99.5%, 80% 내지 99%, 85% 내지 99.9%, 85% 내지 99.5%, 85% 내지 99%, 90% 내지 99.9%, 90% 내지 99.5%, 90% 내지 99%, 95% 내지 99.9%, 95% 내지 99.5%, 또는 95% 내지 99%의 합성 원형 DNA 벡터 분자가 단량체이고, 예컨대, 제약 조성물 중 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 99.9%의 합성 원형 DNA 벡터 분자가 단량체이다).
V. 사용 방법
본원에서는 이종성 유전자의 발현을 필요로 하는 대상체에게 본원에 기술된 DNA 벡터 중 임의의 것 (예컨대, 본원에 기술된 것과 같은 원형 DNA 벡터 및/또는 DD 요소를 포함하는 DNA 벡터) 또는 그의 제약 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, (예컨대, 유전자 요법 섭생의 부분으로서) 이종성 유전자의 발현을 필요로 하는 대상체에서 이종성 유전자의 발현 (예컨대, 에피솜 발현)을 유도하는 방법을 제공한다. 이종성 유전자를 함유하는 대상체의 세포는 예컨대, 써던 블롯팅 또는 PCR 분석에 의해 숙주 세포의 핵산 서열 (예컨대, RNA 서열, 예컨대, mRNA 서열)을 조사하여 벡터에 함유되어 있는 이종성 유전자의 존재에 대해 검정함으로써 특징화될 수 있다. 대안적으로, 대상체에서의 이종성 유전자의 발현은 이종성 유전자에 상응하는 표적 유전자 중의 결함 또는 돌연변이와 연관된 질환의 진행을 모니터링함으로써 (예컨대, 정량적으로 또는 정질적으로) 특징화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이종성 유전자의 발현 (예컨대, 에피솜 발현)은 질환과 연관된 하나 이상의 증상의 감소를 관찰함으로써 확인된다.
따라서, 본 발명은 대상체에게 본원에 기술된 DNA 벡터 중 임의의 것 (예컨대, 본원에 기술된 바와 같은 원형 DNA 벡터 및/또는 DD 요소를 포함하는 DNA 벡터) 또는 그의 제약 조성물을 투여함으로써 대상체에서 표적 유전자 (예컨대, 이종성 유전자에 상응하는 유전자) 중의 결함과 연관된 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 질환은 안구 질환이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 (예컨대, 트랜스-스플라이싱 분자의 부분으로서) 이종성 CEP290 유전자 또는 그의 부분을 갖는 DNA 벡터를 사용하여 레버 선천성 흑암시 (LCA, 예컨대, LCA 10)에 대해 치료받고 있는 중인 대상체이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 (예컨대, 트랜스-스플라이싱 분자의 부분으로서) 이종성 ABCA4 유전자 또는 그의 부분을 갖는 DNA 벡터를 사용하여 스타가트병에 대해 치료받고 있는 중인 대상체이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 (예컨대, 트랜스-스플라이싱 분자의 부분으로서) 이종성 ABCC6 유전자 또는 그의 부분을 갖는 DNA 벡터를 사용하여 탄력섬유성 위황색종에 대해 치료받고 있는 중인 대상체이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 (예컨대, 트랜스-스플라이싱 분자의 부분으로서) 이종성 RIMS1 유전자 또는 그의 부분을 갖는 DNA 벡터를 사용하여 간체 추체 이영양증 (예컨대, 간체 추체 이영양증 7)에 대해 치료받고 있는 중인 대상체이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 (예컨대, 트랜스-스플라이싱 분자의 부분으로서) 이종성 LRP5 유전자 또는 그의 부분을 갖는 DNA 벡터를 사용하여 삼출성 유리체망막병증에 대해 치료받고 있는 중인 대상체이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 (예컨대, 트랜스-스플라이싱 분자의 부분으로서) 이종성 CC2D2A 유전자 또는 그의 부분을 갖는 DNA 벡터를 사용하여 주버트 증후군에 대해 치료받고 있는 중인 대상체이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 (예컨대, 트랜스-스플라이싱 분자의 부분으로서) 이종성 TRPM1 유전자 또는 그의 부분을 갖는 DNA 벡터를 사용하여 CSNB-1C에 대해 치료받고 있는 중인 대상체이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 (예컨대, 트랜스-스플라이싱 분자의 부분으로서) 이종성 C3 유전자 또는 그의 부분을 갖는 DNA 벡터를 사용하여 연령 관련 황반 변성에 대해 치료받고 있는 중인 대상체이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 (예컨대, 트랜스-스플라이싱 분자의 부분으로서) 이종성 IFT172 유전자 또는 그의 부분을 갖는 DNA 벡터를 사용하여 색소성 망막염 71에 대해 치료받고 있는 중인 대상체이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 (예컨대, 트랜스-스플라이싱 분자의 부분으로서) 이종성 COL11A1 유전자 또는 그의 부분을 갖는 DNA 벡터를 사용하여 스티클러 증후군 (예컨대, 스티클러 증후군 2)에 대해 치료받고 있는 중인 대상체이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 (예컨대, 트랜스-스플라이싱 분자의 부분으로서) 이종성 TUBGCP6 유전자 또는 그의 부분을 갖는 DNA 벡터를 사용하여 소두증 및 맥락망막병증에 대해 치료받고 있는 중인 대상체이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 (예컨대, 트랜스-스플라이싱 분자의 부분으로서) 이종성 KIAA1549 유전자 또는 그의 부분을 갖는 DNA 벡터를 사용하여 색소성 망막염 (예컨대, RP 열성)에 대해 치료받고 있는 중인 대상체이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 (예컨대, 트랜스-스플라이싱 분자의 부분으로서) 이종성 CACNA1F 유전자 또는 그의 부분을 갖는 DNA 벡터를 사용하여 CSNB 2에 대해 치료받고 있는 중인 대상체이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 (예컨대, 트랜스-스플라이싱 분자의 부분으로서) 이종성 MYO7A 유전자 또는 그의 부분을 갖는 DNA 벡터를 사용하여 어셔 증후군 (예컨대, 어셔 증후군 타입 1B)에 대해 치료받고 있는 중인 대상체이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 (예컨대, 트랜스-스플라이싱 분자의 부분으로서) 이종성 VCAN 유전자 또는 그의 부분을 갖는 DNA 벡터를 사용하여 와그너 증후군에 대해 치료받고 있는 중인 대상체이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 (예컨대, 트랜스-스플라이싱 분자의 부분으로서) 이종성 USH2A 유전자 또는 그의 부분을 갖는 DNA 벡터를 사용하여 어셔 증후군 타입 2A에 대해 치료받고 있는 중인 대상체이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 (예컨대, 트랜스-스플라이싱 분자의 부분으로서) 이종성 HMCN1 유전자 또는 그의 부분을 갖는 DNA 벡터를 사용하여 AMD 1에 대해 치료받고 있는 중인 대상체이다.
본 발명의 벡터 중 임의의 것 (예컨대, 본원에 기술된 바와 같은 원형 DNA 벡터 및/또는 DD 요소를 포함하는 DNA 벡터)은 10 ㎍ 내지 10 mg의 DNA (예컨대, 25 ㎍ 내지 5.0 mg, 50 ㎍ 내지 2.0 mg, 또는 100 ㎍ 내지 1.0 mg의 DNA, 예컨대, 10 ㎍ 내지 20 ㎍, 20 ㎍ 내지 30 ㎍, 30 ㎍ 내지 40 ㎍, 40 ㎍ 내지 50 ㎍, 50 ㎍ 내지 75 ㎍, 75 ㎍ 내지 100 ㎍, 100 ㎍ 내지 200 ㎍, 200 ㎍ 내지 300 ㎍, 300 ㎍ 내지 400 ㎍, 400 ㎍ 내지 500 ㎍, 500 ㎍ 내지 1.0 mg, 1.0 mg 내지 5.0 mg, 또는 5.0 mg 내지 10 mg의 DNA, 예컨대, 약 10 ㎍, 약 20 ㎍, 약 30 ㎍, 약 40 ㎍, 약 50 ㎍, 약 60 ㎍, 약 70 ㎍, 약 80 ㎍, 약 90 ㎍, 약 100 ㎍, 약 150 ㎍, 약 200 ㎍, 약 250 ㎍, 약 300 ㎍, 약 350 ㎍, 약 400 ㎍, 약 450 ㎍, 약 500 ㎍, 약 600 ㎍, 약 700 ㎍, 약 750 ㎍, 약 1.0 mg, 약 2.0 mg, 약 2.5 mg, 약 5.0 mg, 약 7.5 mg, 또는 약 10 mg의 DNA)인 투여량으로 대상체에게 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 DNA 벡터 (예컨대, 본원에 기술된 바와 같은 원형 DNA 벡터 및/또는 DD 요소를 포함하는 DNA 벡터), 또는 그의 조성물의 투여는 비-면역원성이거나, 또는 다른 유전자 요법 벡터 (예컨대, 플라스미드 DNA 벡터 및 바이러스 벡터)의 투여와 비교하여 대상체에서 면역 반응을 유도하는 데 있어 그 가능성은 더 작다. 벡터의 면역원성을 평가하는 방법은 상기 기술되어 있다.
본원에 제공된 합성 DNA 벡터 (예컨대, 본원에 기술된 바와 같은 원형 DNA 벡터 및/또는 DD 요소를 포함하는 DNA 벡터)는 상기 논의된 바와 같이, 면역 반응을 일으키지 않으면서, 또는 AAV 벡터와 비교하여 감소된 면역 반응을 유도하지 않으면서, 표적 세포를 감염시킬 수 있는 그의 능력에 기인하여 투약을 반복하도록 순응가능할 수 있다. 따라서, 본 발명은 본원에 기술된 벡터 및 제약 조성물을 반복 투여하는 방법을 제공한다. 상기 언급된 투약 정량 중 임의의 것이 적합한 빈도 및 지속 기간으로 반복될 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 약 1일 2회, 약 1일 1회, 약 주 5회, 약 주 4회, 약 주 3회, 약 주 2회, 약 주 1회, 약 월 2회, 약 월 1회, 약 매 6주마다 1회, 약 매 2개월마다 1회, 약 매 3개월마다 1회, 약 매 4개월마다 1회, 연 2회, 연 1회, 또는 그보다 덜 빈번하게 용량을 받는다. 일부 실시양태에서, 투약 횟수 및 빈도는 표적 세포의 교체율과 부합한다. 본원에 기술된 벡터를 사용하여 형질감염된 장수명 유사분열 후 표적 세포에서, 단일 용량의 벡터는 상당 기간 동안 표적 세포 내에서 이종성 유전자의 발현을 유지시키는 데 충분할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 다른 실시양태에서, 본원에 제공된 DNA 벡터는 단일 용량으로 대상체에게 투여될 수 있다. 이종성 핵산이 대상체에게 전달되는 발생 횟수는 임상적 (예컨대, 치료) 이익을 유지하는 데 요구되는 횟수가 될 수 있다.
본 발명의 방법은 DNA 벡터 (예컨대, 본원에 기술된 바와 같은 원형 DNA 벡터 및/또는 DD 요소를 함유하는 DNA 벡터), 또는 그의 제약 조성물을 임의의 적합한 경로를 통해 투여하는 것을 포함한다. DNA 벡터, 또는 그의 제약 조성물은 전신으로 또는 국소적으로, 예컨대, 정맥내로, 안구에 (예컨대, 유리체내로, 망막하로, 점안제에 의해, 안구내로, 안와내로), 근육내로, 유리체내로 (예컨대, 유리체내 주사에 의해), 진피내로, 간내로, 대뇌내로, 근육내로, 경피적으로, 동맥내로, 복강내로, 병변내로, 두개내로, 관절내로, 전립선내로, 흉막내로, 기관내로, 경막내로, 질내로, 직장내로, 종양내로, 피하로, 결막하로, 방광내, 점막으로, 심낭내로, 제대내로, 경구적으로, 국부적으로, 경피적으로, 흡입에 의해, 에어로졸화에 의해, 주사에 의해 (예컨대, 분사 주사에 의해), 전기천공에 의해, 이식에 의해, 주입에 의해 (예컨대, 연속 주입에 의해), 표적 세포를 직접 국재화 관류 배딩함으로써, 카테터에 의하여, 세척에 의하여, 크림 제형으로, 또는 지질 조성물로 투여될 수 있다.
추가로 또는 대안적으로, 벡터는 예컨대, 개별 환자로부터 체외이식된 세포, 이어서, 예컨대, 벡터가 도입된 세포에 대한 선택 후, 환자 내로의 숙주 세포의 재이식에 의해 생체외에서 숙주 세포에 투여될 수 있다. 따라서, 일부 측면에서, 본 개시내용은 형질감염된 숙주 세포, 및 질환 치료를 위해 상기 숙주 세포를 투여하는 방법을 제공한다.
본원에 기술된 벡터 중 임의의 것의 형질감염 효율의 평가는 관련 기술분야에 공지되거나, 또는 본원에 기술된 임의의 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 형질감염된 세포를 단리시키는 것은 또한 표준 기술에 따라 수행될 수 있다. 예를 들어, 이종성 유전자를 포함하는 세포는 이종성 유전자를 포함하는 세포 또는 세포들의 확인 및 단리에 도움을 주는, 이종성 유전자의 서열에 의해 코딩된 시각적 마커, 예컨대, 형광 단백질 (예컨대, GFP) 또는 다른 리포터 단백질을 발현할 수 있다. 이종성 유전자를 함유하는 세포는 유전자로부터의 선별가능한 마커를 발현할 수 있다. 특정 조건, 예를 들어, 세포독성 물질에 의해 노출, 또는 보통 생존을 위해 요구되는 영양소 또는 기질이 없는 상태에서의 세포 생존은 선별가능한 마커의 발현 또는 비발현에 의존할 수 있다. 따라서, 상기 조건하에서 세포의 생존 또는 생존 또는 비생존을 통해 이종성 유전자를 함유하는 세포 또는 세포의 콜로니를 확인 및 단리시킬 수 있다. 이종성 유전자를 함유하는 세포는 또한 예컨대, 써던 블롯팅 또는 PCR 분석에 의해 숙주 세포의 핵산 서열 (예컨대, RNA 서열, 예컨대, mRNA 서열)을 조사하여 벡터에 함유되어 있는 이종성 유전자의 존재에 대해 검정함으로써 특징화될 수 있다.
하기 실시예는 본원에 기술된 실시양태의 범주를 제한하지 않는다. 하기 실시예에서 변형될 수 있고, 이는 본 발명의 정신 및 범주에 포함되는 것으로 의도됨을 관련 기술분야의 통상의 기술자는 이해할 것이다.
실시예
재조합 AAV (rAAV) 벡터는 다양한 모델 시스템에서 고효율 유전자 전달에 관한 보고가 확립되어 있으며, 현재는 매우 다양한 인간 질환에서 치료 방식으로서 시험되고 있다. 동물 및 인간에서의 연구 결과, rAAV 벡터 게놈은 대개 원형 에피솜과 같이 생체내에서 지속되는 것으로 나타났다. 본 발명은 상기와 같은 지속은 원형 DNA 벡터를 생산하는 합성 기술을 사용하여 반복될 수 있다는 발견에 기초한다. 동물 및 인간, 둘 모두로부터 단리된 rAAV 에피솜 게놈의 분자적 분석 결과, 이들 원형 게놈은 말단 반복 서열을 함유하는 것으로 밝혀졌다. 하기 예 중 일부에서, rAAV 에피솜 게놈 내에서 확인된 말단 반복 서열은 이중 D (DD) 요소를 포함하는데, 이는 도 1에 제시된, 선형 AAV 게놈 각 말단에 위치하는 역위 말단 반복부 (ITR)의 재조합의 결과이다. 박테리아에서 생산된 DNA는, 생체내 플라스미드 및 유전자 발현을 손실시킬 수 있는, 고유한 박테리아 시그니처 (CpG 모티프) 뿐만 아니라, 박테리아 그 자체로부터의 불순물 (내독소, 박테리아 게놈 DNA 및 RNA)을 함유하기 때문에, 상기 합성 DNA 벡터는 박테리아에서 생성된 벡터와 비교하였을 때, 숙주에서 면역원성 및 염증을 감소시킬 수 있다.
실시예 1. DD 요소를 갖는 DNA 벡터의 합성 제조
단계 1 - rAAV2 - eGFP 바이러스 제조, 이어서, 세포 형질도입.
BGHpA 신호와 함께 eGFP 단백질을 구동시키는 CMV 인핸서/프로모터로 이루어진 발현 카세트에 플랭킹된 AAV2 ITR을 함유한 플라스미드 pAAV-BASIC-EGFP를 수득하였다 (벡터 바이오랩스(Vector Biolabs: 미국 펜실베니아주 말번)). rAAV2-eGFP 바이러스 벡터를 제조하는 데 상기 플라스미드를 HEK293T 세포에서 삼중 형질감염 전략법에서 사용하였다. 삼중 형질감염에서 사용된 나머지 다른 두 플라스미드는 AAV 헬퍼 플라스미드 pRep-Cap2 (파트 번호 0912; 어플라이드 비로믹스(Applied Viromics: 미국 캘리포니아주 프레몬트)) 및 pHELP (파트 번호 0913; 어플라이드 비로믹스, 미국 캘리포니아주 프레몬트)였다. 인산칼슘 키트 (프로펙션 머메일리언 트랜스펙션 시스템(Profection Mammalian Transfection System), 파트 번호 TM012; 프로메가(Promega: 미국 위스콘신주 매디슨))를 사용하여 세포를 형질감염시켰다. 형질감염 후 48시간째, 냉동/해동에 의해 세포를 용해시키고, 벤조나제로 처리하여 조 바이러스 용해물을 생성하였다. qPCR에 의하면 조 용해물 중 바이러스 역가는 5.3 x 1012개 DNase-저항성 입자 (DRP)/mL인 것으로 결정되었다. 원형 rAAV 게놈을 생성하기 위해, HEK293T 세포를 1 x 105의 감염 다중도 (MOI)로 rAAV2-eGFP 바이러스로 감염시켰다. 이 프로세스는 도 4에 요약되어 있다.
단계 2 - DD 요소를 갖는 rAAV 게놈의 클로닝 및 특징화 .
DD 요소를 갖는 rAAV 게놈의 클로닝 및 특징화에 관한 요약은 도 5에 제시되어 있다. 감염 후 7일째에 감염된 세포를 수거하고, DN이지 블러드 앤드 티슈 키트(DNeasy Blood and Tissue kit) (퀴아젠(Qiagen: 미국 메릴랜드주 저먼타운))를 사용하여 세포로부터 전체 세포 DNA를 추출하였다. 남은 선형 rAAV 게놈을 제거하기 위해, DNA를, 특이적으로 선형 DNA를 분해하는 플라스미드-세이프 DNase (루시겐(Lucigen: 미국 위스콘신주 미들턴))로 처리하여 이중 가닥 원형 rAAV 게놈은 무손상 상태 그대로 유지시켰다. 템플리파이™ 키트 (파트 번호 25640010, GE 헬쓰케어; 미국 펜실베이니아주 피츠버그)를 사용하여 남은 원형 rAAV 게놈을 증폭시켰다. 템플리파이™ 키트는 박테리오파지 Phi29 DNA 폴리머라제를 사용하여 원형 DNA를 지수적으로 증폭시키기 위해 등온 롤링-서클 증폭 (RCA)을 사용하는 Phi29 폴리머라제를 함유한다. Phi29 증폭의 결과는 DNA의 긴 선형 콘카타머이다. 이어서, rAAV 게놈 내에서 1회 커팅하는 효소 (EcoRI)로 상기 DNA를 분해하여 단위 길이의 게놈을 생성하고, pBlueScript II KS+ 플라스미드 (파트 번호 212207, 애질런트 테크놀러지즈(Agilent Technologies; 미국 일리노이주 시카고))로 클로닝한다.
생성된 클론 내의 DD 요소를 서열분석하였고, 길이가 165 bp인 (결실 또는 재배열이 없는) 무손상 DD 요소를 갖는 클론 "TG-18"을 확인하였다. 클론 TG-18의 서열은 도 6a에 제시되어 있다.
단계 3 - DD 벡터 제조를 위한 주형 생성
DD 요소를 함유한 rAAV 게놈 (클론 TG-18) 확인 후, 다음 단계는 하류의 DD 벡터 제조를 위해 원형 주형을 생성하는 것이었다. 플라스미드 TG-18을 제한 효소 EcoRI로 분해하였고, 이에 의해 플라스미드 백본으로부터 선형 단위 길이의 rAAV 게놈이 유리되었다. 이어서, 선형 단편을 (이종성 DNA 조각과 라이게이션시키기보다는) 자기-라이게이션시켜 원형 rAAV 게놈을 재생성하였다. 원형 생성물 형성을 위해 라이게이션되지 않은 임의의 선형 단편은 플라스미드-세이프 DNase 처리에 의해 제거하였다. 상기 프로세스의 예는 도 7에 제시되어 있다.
단계 4 - 시험관에서의 DD 벡터 제조
단계 3에서 제조된 원형 rAAV 게놈은 박테리아에서 기원하는 것이었고, 숙주에서 지속을 감소시키고/거나, 면역원성일 수 있는 잠재능을 갖는 박테리아 시그니처를 함유한다. 단계 4는 시험관내에서 상기 원형 주형을 증폭시켜 박테리아 시그니처 및 오염물질이 없는 rAAV 게놈을 더 많인 생성한다. 이는 박테리아에서 제조된 종래의 유전자 전달 벡터에 비하여 이롭다. 시험관 제조를 위해, 템플리파이™ 키트 (파트 번호 25640010, GE 헬쓰케어; 미국 펜실베이니아주 피츠버그)를 사용하여 원형 주형을 증폭시켰다. 템플리파이™ 키트는 박테리오파지 Phi29 DNA 폴리머라제를 사용하여 원형 DNA를 지수적으로 증폭시키기 위해 등온 롤링-서클 증폭 (RCA)을 사용하는 Phi29 폴리머라제를 함유한다. Phi29 증폭의 결과물은 DNA의 긴 선형 콘카타머였다. 본 발명자들은 증폭된 DNA를 조사하여 DD 요소가 Phi29 DNA 폴리머라제로 충실히 복제되었는지 여부를 알아보았다. 결과는 도 8에 제시되어 있다.
증폭된 DNA를 먼저 DD 요소의 양측을 커팅하는 SwaI로 분해하여 (도 9) 길이가 244 bp인 단편을 유리시켰다. 증폭된 DNA로부터의 SwaI 단편은 원래의 TG-18 pBlueScript 플라스미드로부터의 SwaI 단편과 크기가 동일하였고 (도 10, 화살표 표시), 이는 Phi29가 DD 요소를 증폭시킬 수 있다는 것을 시사하는 것이다. DD 요소 내에서 커팅하는 AhdI로 분해하여 증폭된 DD 요소의 완전성을 추가로 분석하였다. 도 11 (화살표 표시)에서 입증되는 바와 같이, AhdI는 DD 벡터 내에서 1회 커팅하고, 콘카타머 DNA를 2.1 kb 단위 길이의 게놈으로 분해시킨다.
DD 벡터 내의 DD 요소가 충실히 증폭될 수 있다고 증명되었으며, 다음 단계는 최종 원형 DD 벡터 생성물을 생성하는 것이었다. 제조 전략법의 아웃라인은 도 12-14에 제시되어 있다. 박테리오파지 Phi29 DNA 폴리머라제를 사용하여 원형 DNA를 지수적으로 증폭시키기 위해 등온 RCA를 사용하는 Phi29 폴리머라제를 사용하여 단계 3에서 제조된 원형 rAAV 게놈을 증폭시켰다. Phi29 증폭의 결과물은 DNA의 긴 선형 콘카타머였다 (도 13a). 이어서, 상기 DNA를, rAAV 게놈 내에서 1회 커팅하는 효소 (EcoRI)로 분해하여 AAV 게놈 (즉, 단위 길이의 AAV 게놈; 도 13a)을 생성하였다. 이어서, 상기 AAV 게놈을 자기-라이게이션시켜 원형 rAAV 게놈을 재생성하였다 (도 14a). 원형 생성물 형성을 위해 라이게이션되지 않은 임의의 선형 단편은 플라스미드-세이프 DNase 처리에 의해 제거하였다.
단계 5 - DD 벡터의 유전자 발현 확인
시험관내 제조 프로세스에서 마지막 단계는 DD 벡터가 생물학적으로 활성인지 (즉, 배양된 세포에서 트랜스진을 발현하는지) 확인하는 것이다. 리포펙타민 2000(Lipofectamine 2000) (라이프 테크놀러지즈(Life Technologies: 미국 캘리포니아주 칼즈배드))을 사용하여 HEK293T 세포를 이종성 유전자로서 eGFP 발현 카세트를 함유하는 DD 함유 DNA 벡터로 형질감염시켰다. 48시간 후, 면역형광 (도 15a 및 15b) 또는 웨스턴 블롯팅 (도 16)에 의해 세포를 GFP 발현에 대하여 분석하였다.
실시예 2. 원형 DNA 벡터의 합성 제조
벡터가 어떤 박테리아 플라스미드 DNA 서열도 함유하지 않고, 전적으로 시험관내에서 합성된 (박테리아에서의 복제가 요구되지 않는) 단량체 DNA 벡터를 제조하였다. 그러므로, 합성 DNA 벡터는 바이러스 그 자체는 필요로 하지 않으면서 AAV 바이러스 DNA처럼 거동하는 트랜스진 DNA를 주어진 표적 세포에 부여할 수 있다. 본 전략법은 바이러스 벡터에 비하여 여러 가지 이점을 제공한다. 첫째, 일반 바이러스 벡터로 패키징하기에는 너무 큰 유전자도 전달할 수 있다. 추가로, 면역 반응을 일으켜 또 다른 바이러스 벡터의 반복 투약을 막는 바이러스 단백질이 존재하지 않으며, 반복 투약이 가능하다. 추가로, 시험관내 합성 프로세스는 다른 바이러스 벡터에 비하여 더 효율적인 제조를 위한 잠재능이 더 크다.
합성 원형 DNA 벡터를 생성하는 예시적인 프로세스가 도 17에 제시되어 있다. phi29 폴리머라제를 사용하여 슈퍼코일드 단량체 DNA 주형 증폭을 수행함으로써 반복된 DNA 단편 사이의 경계를 정의하는 제한 부위를 갖는 선형 콘카타머 DNA를 생성하였다. DNA를 단위 길이의 단편으로 절단하는 제한 효소를 사용하여 콘카타머를 분해시켰다. 이어서, DNA 리가제를 첨가하여 DNA 단편의 자기-라이게이션을 유도함으로써 개방 이완형 원형 및 슈퍼코일드 DNA 단량체를 포함하는 DNA 구조의 혼합물을 형성하였다. 슈퍼코일드의 공유 폐쇄 원형 형태의 플라스미드 DNA가 개방 원형 형태로부터 분리될 수 있도록 허용하는 선택성을 갖는 티오친화성(thiophilic) 방향족 흡착 크로마토그래피 수지 (플라스미드셀렉트 X트라(Plasmidselect Xtra), GE 헬쓰케어 28-4024-01)를 사용하여 상기 혼합물을 칼럼 정제하였다. 상기 정제로부터 수득된 슈퍼코일드 DNA 단량체를 회수하였고, 이는 본원에 기술된 방법에서 사용될 수 있거나, 또는 대안적으로 추가 증폭을 위한 주형으로서의 역할을 할 수 있다.
실시예 3. 생체내 지속 특징화 - GFP 발현
본 발명의 합성 원형 DNA 벡터의 지속 정도를 특징화하기 위해, 각각 상이한 DNA 벡터: (1) 지속의 음성 대조군으로서 플라스미드 CAG-GFP (서열식별번호 42); (2) ΔDD CAG-GFP (DD 요소가 결여된 합성 원형 DNA 벡터); 및 (3) DD CAG-GFP (DD 요소를 갖는 합성 원형 DNA 벡터)를 포함하는 3개의 조성물을 마우스에 투여하였다. 각 군은 총 32마리의 마우스를 함유하였고 (각 시점당 마우스 8마리씩), 각 조성물을 마우스 1마리당 10 ㎍ DNA씩 유체역학적 주사에 의해 투여하였다. 각 군으로부터 마우스 8마리씩 하기 시점: 2주째, 4주째, 8주째, 및 16주째에 각각 희생시키고, 간 조직을 수거하고, 각 시점에 프로세싱하였다. 간 세포에서의 GFP 발현을 공지 방법에 따라 정량화하고, 각 시점에 군 간의 비교를 수행하였다. 합성 원형 CAG-GFP를 투여받은 마우스로부터의 간 세포가 플라스미드 CAG-GFP를 투여받은 마우스로부터의 간 세포와 비교하여 더 높은 수준으로 GFP를 발현하였다면, 합성 원형 CAG-GFP는 고도의 지속성을 나타내는 것으로 결정되었다.
실시예 4. 생체내 지속 특징화 - mSEAP 발현
본 발명의 합성 원형 DNA 벡터의 지속 정도를 특징화하는 또 다른 연구는, 마우스에서 내재적으로 발현되지 않는 마우스 분비 알칼리성 포스파타제 (mSEAP)의 이종성 발현을 포함한다. 본 실험에서는 마우스에 각각 상이한 DNA 벡터: (1) 지속의 음성 대조군으로서 플라스미드 CAG-mSEAP; (2) CpG 모티프가 결여된, 플라스미드 CAG-mSEAP-ΔCpG; (3) DD 요소 및 CpG 모티프가 결여된, ΔDD CAG-mSEAP-ΔCpG; 및 (4) DD 요소는 포함하고, CpG 모티프는 결여된, DD CAG-mSEAP ΔCpG를 포함하는 4개의 조성물을 투여하였다. 각 군은 12마리의 마우스를 함유하였고, 각 조성물을 마우스 1마리당 20 ㎍ DNA씩 유체역학적 주사에 의해 투여하였다. 각 군으로부터 마우스 2마리씩 하기 시점: 2주째, 4주째, 8주째, 12주째, 16주째, 및 24주째에 각각 희생시키고, 200 ㎕의 혈액을 수집하였다. 각 샘플 중 mSEAP의 혈청 농도를 공지 방법에 따라 정량화하고, 각 시점에 군 간의 비교를 수행하였다.
실험군 간의 mSEAP 농도 비교를 수행함으로써 CpG 모티프 및/또는 DD 요소가 지속에 미치는 효과를 정량화하였다. 예를 들어, 조기 시점에 혈청 mSEAP 수준은 실험군 간에 대략적으로 등가였지만; 더 이후의 후기 시점에서는 지속성이 더 높은 벡터를 투여받은 마우스가 더 큰 농도의 mSEAP를 보였다.
열거된 실시양태
본원에 기술된 기술의 일부 실시양태는 하기 넘버링된 패러그래프 중 임의의 것에 따라 정의될 수 있다:
1. 이중 D (DD) 요소를 포함하는 단리된 DNA 벡터이며, 여기서 DNA 분자에는 복제 기점 및/또는 약물 내성 유전자가 결여된 것인 단리된 DNA 벡터.
2. 패러그래프 1에 있어서, DNA 벡터에는 박테리아 플라스미드 DNA가 결여된 것인 DNA 벡터.
3. 패러그래프 1 또는 2 중 어느 한 패러그래프에 있어서, DNA 벡터에는 면역원성 박테리아 시그니처 및/또는 RNA 폴리머라제 정지 부위가 결여된 것인 DNA 벡터.
4. DD 요소 및 박테리아 복제 기점 및/또는 약물 내성 유전자를 포함하는 단리된 DNA 벡터.
5. 패러그래프 1 내지 4 중 어느 한 패러그래프에 있어서, DNA 벡터가 추가로 하나 이상의 이종성 유전자를 포함하는 것인 DNA 벡터.
6. 패러그래프 5에 있어서, 이종성 유전자의 길이가 4.5 Kb 초과인 DNA 벡터.
7. 패러그래프 1 내지 6 중 어느 한 패러그래프에 있어서, DNA 벡터가 원형 벡터인 DNA 벡터.
8. 패러그래프 7에 있어서, 원형 벡터가 단량체 원형 벡터인 DNA 벡터.
9. 패러그래프 6 내지 8 중 어느 한 패러그래프에 있어서, DNA 벡터가 하나 이상의 이종성 유전자 상류에 프로모터 서열을 포함하는 것인 DNA 벡터.
10. 패러그래프 6 내지 9 중 어느 한 패러그래프에 있어서, DNA 벡터가 하나 이상의 이종성 유전자 하류에 폴리아데닐화 부위를 포함하는 것인 DNA 벡터.
11. 패러그래프 10에 있어서, 하나 이상의 이종성 유전자가 트랜스-스플라이싱 분자를 포함하는 것인 DNA 벡터.
12. 패러그래프 10 또는 11에 있어서, 하기 요소: (i) 프로모터 서열; (ii) 하나 이상의 이종성 유전자; (iii) 폴리아데닐화 부위; 및 (iv) DD 요소가 5'에서 3' 방향으로 작동적으로 연결되어 있는 것인 DNA 벡터.
13. (i) AAV 게놈을 포함하는 원형 DNA 분자를 포함하는 샘플을 제공하는 단계이며, 여기서 AAV 게놈은 이종성 유전자 및 DD 요소를 포함하는 것인 단계; (ii) 폴리머라제-매개 롤링-서클 증폭을 사용하여 AAV 게놈을 증폭시켜 선형 콘카타머를 생성하는 단계; (iii) 제한 효소를 사용하여 콘카타머를 분해하여 단위 길이의 선형 DNA 분자를 생성하는 단계; 및 (iv) 단위 길이의 선형 DNA 분자를 자기-라이게이션시켜 이종성 유전자 및 DD 요소를 포함하는 단리된 DNA 벡터를 제조하는 단계를 포함하는, 단리된 DNA 벡터를 제조하는 방법.
14. (i) AAV 게놈을 포함하는 원형 DNA 분자를 포함하는 샘플을 제공하는 단계이며, 여기서 AAV 게놈은 이종성 유전자 및 DD 요소를 포함하는 것인 단계; (ii) 제1 폴리머라제-매개 롤링-서클 증폭을 사용하여 AAV 게놈을 증폭시켜 제1 선형 콘카타머를 생성하는 단계; (iii) 제한 효소를 사용하여 제1 선형 콘카타머를 분해하여 제1 단위 길이의 선형 DNA 분자를 생성하는 단계; (iv) 제1 단위 길이의 선형 DNA 분자를 플라스미드 벡터로 클로닝하는 단계; (v) DD 요소를 포함하는 플라스미드 클론을 확인하는 단계; (vi) DD 요소를 포함하는 플라스미드 클론을 분해하여 제2 단위 길이의 선형 DNA 분자를 생성하는 단계; (vii) 제2 단위 길이의 선형 DNA 분자를 자기-라이게이션시켜 원형 DNA 주형을 제조하는 단계; (viii) 제2 폴리머라제-매개 롤링-서클 증폭을 사용하여 원형 DNA 주형을 증폭시켜 제2 선형 콘카타머를 생성하는 단계; (ix) 제한 효소를 사용하여 제2 선형 콘카타머를 분해하여 제3 단위 길이의 선형 DNA 분자를 생성하는 단계; 및 (x) 제3 단위 길이의 선형 DNA 분자를 자기-라이게이션시켜 이종성 유전자 및 DD 요소를 포함하는 단리된 DNA 벡터를 제조하는 단계를 포함하는, 단리된 DNA 벡터를 제조하는 방법.
15. 패러그래프 13 또는 14에 있어서, 폴리머라제-매개 롤링-서클 증폭이 등온 롤링-서클 증폭인 방법.
16. 패러그래프 13 내지 15 중 어느 한 패러그래프에 있어서, 폴리머라제가 Phi29 DNA 폴리머라제인 방법.
17. (i) AAV 게놈을 포함하는 원형 DNA 분자를 포함하는 샘플을 제공하는 단계이며, 여기서 AAV 게놈은 이종성 유전자 및 DD 요소를 포함하는 것인 단계; (ii) 폴리머라제-매개 롤링-서클 증폭을 사용하여 AAV 게놈을 증폭시켜 선형 콘카타머를 생성하는 단계; (iii) 제한 효소를 사용하여 콘카타머를 분해하여 단위 길이의 선형 DNA 분자를 생성하는 단계; 및 (iv) 단위 길이의 선형 DNA 분자를 자기-라이게이션시켜 이종성 유전자 및 DD 요소를 포함하는 치료 DNA 벡터를 제조하는 단계를 포함하는, 치료 DNA 벡터를 제조하는 시험관내 방법.
18. 패러그래프 17에 있어서, 폴리머라제-매개 롤링-서클 증폭이 등온 롤링-서클 증폭인 방법.
19. 패러그래프 17 또는 18에 있어서, 폴리머라제가 Phi29 DNA 폴리머라제인 방법.
20. 패러그래프 1 내지 12 중 어느 한 패러그래프의 DNA 벡터, 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
21. 패러그래프 20에 있어서, 비-면역원성인 제약 조성물.
22. 이종성 유전자의 에피솜 발현을 필요로 하는 대상체에게 패러그래프 1 내지 11 중 어느 한 패러그래프의 단리된 DNA 벡터, 또는 패러그래프 20 또는 21의 제약 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 이종성 유전자의 에피솜 발현을 필요로 하는 대상체에서 이종성 유전자의 에피솜 발현을 유도하는 방법.
23. 대상체에게 패러그래프 1 내지 12 중 어느 한 패러그래프의 단리된 DNA 벡터, 또는 패러그래프 20 또는 21의 제약 조성물을 치료 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 장애를 치료하는 방법.
24. 패러그래프 22 또는 23에 있어서, 단리된 DNA 벡터 또는 제약 조성물이 반복적으로 투여되는 것인 방법.
25. 패러그래프 22 내지 24 중 어느 한 패러그래프에 있어서, 단리된 DNA 벡터 또는 제약 조성물이 국소적으로 투여되는 것인 방법.
26. 패러그래프 25에 있어서, 단리된 DNA 벡터 또는 제약 조성물이 유리체내로 투여되는 것인 방법.
27. 패러그래프 22 내지 26 중 어느 한 패러그래프에 있어서, 장애가 안구 장애인 방법.
28. 패러그래프 22 내지 27 중 어느 한 패러그래프에 있어서, 안구 장애가 레버 선천성 흑암시 (LCA), 스타가트병, 탄력섬유성 위황색종, 간체 추체 이영양증, 삼출성 유리체망막병증, 주버트 증후군, CSNB-1C, 연령 관련 황반 변성, 색소성 망막염, 스티클러 증후군, 소두증 및 맥락망막병증, 색소성 망막염, CSNB 2, 어셔 증후군, 또는 와그너 증후군인 방법.
하기 추가의 넘버링된 패러그래프는 추가로 본원에 기술된 본 발명의 일부 실시양태를 정의된다:
1. 하나 이상의 이종성 유전자를 포함하는 단리된 원형 DNA 벡터이며, 여기서 DNA 벡터에는 복제 기점 및/또는 약물 내성 유전자가 결여된 것인 단리된 원형 DNA 벡터.
2. 패러그래프 1에 있어서, DNA 벡터에는 박테리아 플라스미드 DNA가 결여된 것인 DNA 벡터.
3. 패러그래프 1 또는 2 중 어느 한 패러그래프에 있어서, DNA 벡터에는 면역원성 박테리아 시그니처 및/또는 RNA 폴리머라제 정지 부위가 결여된 것인 DNA 벡터.
4. 패러그래프 1 내지 3 중 어느 한 패러그래프에 있어서, DNA 벡터에는 CpG 섬이 실질적으로 없는 것인 DNA 벡터.
5. 패러그래프 1 내지 4 중 어느 한 패러그래프에 있어서, 말단 반복 서열을 추가로 포함하는 DNA 벡터.
6. 패러그래프 5에 있어서, 말단 반복 서열의 길이가 적어도 10 bp인 DNA 벡터.
7. 패러그래프 1 내지 6 중 어느 한 패러그래프에 있어서, 이종성 유전자의 길이가 4.5 Kb 초과인 DNA 벡터.
8. 패러그래프 1 내지 7 중 어느 한 패러그래프에 있어서, DNA 벡터가 이중 가닥인 DNA 벡터.
9. 패러그래프 8에 있어서, 이중 가닥 벡터가 단량체인 DNA 벡터.
10. 패러그래프 1 내지 9 중 어느 한 패러그래프에 있어서, DNA 벡터가 하나 이상의 이종성 유전자 상류에 프로모터 서열을 포함하는 것인 DNA 벡터.
11. 패러그래프 1 내지 10 중 어느 한 패러그래프에 있어서, DNA 벡터가 하나 이상의 이종성 유전자 하류에 폴리아데닐화 부위를 포함하는 것인 DNA 벡터.
12. 패러그래프 1 내지 11 중 어느 한 패러그래프에 있어서, 하나 이상의 이종성 유전자가 트랜스-스플라이싱 분자를 포함하는 것인 DNA 벡터.
13. 패러그래프 11 또는 12에 있어서, 하기 요소: (i) 프로모터 서열; (ii) 하나 이상의 이종성 유전자; (iii) 폴리아데닐화 부위; 및 (iv) 말단 반복 서열이 5'에서 3' 방향으로 작동적으로 연결되어 있는 것인 DNA 벡터.
14. (i) AAV 게놈을 포함하는 원형 DNA 벡터를 포함하는 샘플을 제공하는 단계이며, 여기서 AAV 게놈은 이종성 유전자를 포함하는 것인 단계; (ii) 폴리머라제-매개 롤링-서클 증폭을 사용하여 AAV 게놈을 증폭시켜 선형 콘카타머를 생성하는 단계; (iii) 제한 효소를 사용하여 콘카타머를 분해하여 다중 AAV 게놈을 생성하는 단계; 및 (iv) 다중 AAV 게놈을 각각 자기-라이게이션시켜 이종성 유전자를 포함하는 단리된 DNA 벡터를 제조하는 단계를 포함하는, 단리된 DNA 벡터를 제조하는 방법.
15. 패러그래프 14에 있어서, AAV 게놈이 말단 반복 서열을 포함하는 것인 방법.
16. 패러그래프 14 또는 15에 있어서, 이종성 유전자를 포함하는 단리된 DNA 벡터를 칼럼 정제하여 단리된 DNA 벡터로부터 슈퍼코일드 DNA를 정제하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
17. (i) AAV 게놈을 포함하는 원형 DNA 벡터를 포함하는 샘플을 제공하는 단계이며, 여기서 AAV 게놈은 이종성 유전자 및 말단 반복 서열을 포함하는 것인 단계; (ii) 제1 폴리머라제-매개 롤링-서클 증폭을 사용하여 AAV 게놈을 증폭시켜 제1 선형 콘카타머를 생성하는 단계; (iii) 제한 효소를 사용하여 제1 선형 콘카타머를 분해하여 제1 AAV 게놈을 생성하는 단계; (iv) 제1 AAV 게놈을 플라스미드 벡터로 클로닝하는 단계; (v) 말단 반복 서열을 포함하는 플라스미드 클론을 확인하는 단계; (vi) 말단 반복 서열을 포함하는 플라스미드 클론을 분해하여 제2 AAV 게놈을 생성하는 단계; (vii) 제2 AAV 게놈을 자기-라이게이션시켜 원형 DNA 주형을 제조하는 단계; (viii) 제2 폴리머라제-매개 롤링-서클 증폭을 사용하여 원형 DNA 주형을 증폭시켜 제2 선형 콘카타머를 생성하는 단계; (ix) 제한 효소를 사용하여 제2 선형 콘카타머를 분해하여 제3 AAV 게놈을 생성하는 단계; 및 (x) 제3 AAV 게놈을 자기-라이게이션시켜 이종성 유전자 및 말단 반복 서열을 포함하는 단리된 DNA 벡터를 제조하는 단계를 포함하는, 단리된 DNA 벡터를 제조하는 방법.
18. 패러그래프 14 내지 17 중 어느 한 패러그래프에 있어서, 폴리머라제-매개 롤링-서클 증폭이 등온 롤링-서클 증폭인 방법.
19. 패러그래프 14 내지 18 중 어느 한 패러그래프에 있어서, 폴리머라제가 Phi29 DNA 폴리머라제인 방법.
20. (i) AAV 게놈을 포함하는 원형 DNA 벡터를 포함하는 샘플을 제공하는 단계이며, 여기서 AAV 게놈은 이종성 유전자를 포함하는 것인 단계; (ii) 폴리머라제-매개 롤링-서클 증폭을 사용하여 AAV 게놈을 증폭시켜 선형 콘카타머를 생성하는 단계; (iii) 제한 효소를 사용하여 콘카타머를 분해하여 AAV 게놈을 생성하는 단계; 및 (iv) AAV 게놈을 자기-라이게이션시켜 이종성 유전자를 포함하는 치료 DNA 벡터를 제조하는 단계를 포함하는, 치료 DNA 벡터를 제조하는 시험관내 방법.
21. 패러그래프 20에 있어서, 이종성 유전자를 포함하는 단리된 DNA 벡터를 칼럼 정제하여 단리된 DNA 벡터로부터 슈퍼코일드 DNA를 정제하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
22. 패러그래프 20 또는 21에 있어서, 폴리머라제-매개 롤링-서클 증폭이 등온 롤링-서클 증폭인 방법.
23. 패러그래프 20 내지 22 중 어느 한 패러그래프에 있어서, 폴리머라제가 Phi29 DNA 폴리머라제인 방법.
24. 패러그래프 1 내지 13 중 어느 한 패러그래프의 DNA 벡터, 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
25. 패러그래프 24에 있어서, 비-면역원성인 제약 조성물.
26. 이종성 유전자의 에피솜 발현을 필요로 하는 대상체에게 패러그래프 1 내지 13 중 어느 한 패러그래프의 단리된 DNA 벡터, 또는 패러그래프 24 또는 25의 제약 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 이종성 유전자의 에피솜 발현을 필요로 하는 대상체에서 이종성 유전자의 에피솜 발현을 유도하는 방법.
27. 대상체에게 패러그래프 1 내지 13 중 어느 한 패러그래프의 단리된 DNA 벡터, 또는 패러그래프 24 또는 25의 제약 조성물을 치료 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 장애를 치료하는 방법.
28. 패러그래프 26 또는 27에 있어서, 단리된 DNA 벡터 또는 제약 조성물이 반복적으로 투여되는 것인 방법.
29. 패러그래프 26 내지 28 중 어느 한 패러그래프에 있어서, 단리된 DNA 벡터 또는 제약 조성물이 국소적으로 투여되는 것인 방법.
30. 패러그래프 29에 있어서, 단리된 DNA 벡터 또는 제약 조성물이 유리체내로 투여되는 것인 방법.
31. 패러그래프 26 내지 30 중 어느 한 패러그래프에 있어서, 장애가 안구 장애인 방법.
32. 패러그래프 31에 있어서, 안구 장애가 LCA, 스타가트병, 탄력섬유성 위황색종, 간체 추체 이영양증, 삼출성 유리체망막병증, 주버트 증후군, CSNB-1C, 연령 관련 황반 변성, 색소성 망막염, 스티클러 증후군, 소두증 및 맥락망막병증, 색소성 망막염, CSNB 2, 어셔 증후군, 또는 와그너 증후군인 방법.
33. 이중 D (DD) 요소를 포함하는 단리된 DNA 벡터이며, 여기서 DNA 벡터에는 복제 기점 및/또는 약물 내성 유전자가 결여된 것인 단리된 DNA 벡터.
34. 패러그래프 33에 있어서, DNA 벡터에는 박테리아 플라스미드 DNA가 결여된 것인 DNA 벡터.
35. 패러그래프 33 또는 34 중 어느 한 패러그래프에 있어서, DNA 벡터에는 면역원성 박테리아 시그니처 및/또는 RNA 폴리머라제 정지 부위가 결여된 것인 DNA 벡터.
36. DD 요소 및 박테리아 복제 기점 및/또는 약물 내성 유전자를 포함하는 단리된 DNA 벡터.
37. 패러그래프 33 내지 36 중 어느 한 패러그래프에 있어서, DNA 벡터가 추가로 하나 이상의 이종성 유전자를 포함하는 것인 DNA 벡터.
38. 패러그래프 36에 있어서, 이종성 유전자의 길이가 4.5 Kb 초과인 DNA 벡터.
39. 패러그래프 33 내지 38 중 어느 한 패러그래프에 있어서, DNA 벡터가 원형 벡터인 DNA 벡터.
40. 패러그래프 39에 있어서, 원형 벡터가 단량체 원형 벡터인 DNA 벡터.
41. 패러그래프 38 내지 40 중 어느 한 패러그래프에 있어서, DNA 벡터가 하나 이상의 이종성 유전자 상류에 프로모터 서열을 포함하는 것인 DNA 벡터.
42. 패러그래프 38 내지 41 중 어느 한 패러그래프에 있어서, DNA 벡터가 하나 이상의 이종성 유전자 하류에 폴리아데닐화 부위를 포함하는 것인 DNA 벡터.
43. 패러그래프 42에 있어서, 하나 이상의 이종성 유전자가 트랜스-스플라이싱 분자를 포함하는 것인 DNA 벡터.
44. 패러그래프 42 또는 43에 있어서, 하기 요소: (i) 프로모터 서열; (ii) 하나 이상의 이종성 유전자; (iii) 폴리아데닐화 부위; 및 (iv) DD 요소가 5'에서 3' 방향으로 작동적으로 연결되어 있는 것인 DNA 벡터.
45. (i) AAV 게놈을 포함하는 원형 DNA 벡터를 포함하는 샘플을 제공하는 단계이며, 여기서 AAV 게놈은 이종성 유전자 및 DD 요소를 포함하는 것인 단계; (ii) 폴리머라제-매개 롤링-서클 증폭을 사용하여 AAV 게놈을 증폭시켜 선형 콘카타머를 생성하는 단계; (iii) 제한 효소를 사용하여 콘카타머를 분해하여 다중 AAV 게놈을 생성하는 단계; 및 (iv) 다중 AAV 게놈을 각각 자기-라이게이션시켜 이종성 유전자 및 DD 요소를 포함하는 단리된 DNA 벡터를 제조하는 단계를 포함하는, 단리된 DNA 벡터를 제조하는 방법.
46. (i) AAV 게놈을 포함하는 원형 DNA 벡터를 포함하는 샘플을 제공하는 단계이며, 여기서 AAV 게놈은 이종성 유전자 및 DD 요소를 포함하는 것인 단계; (ii) 제1 폴리머라제-매개 롤링-서클 증폭을 사용하여 AAV 게놈을 증폭시켜 제1 선형 콘카타머를 생성하는 단계; (iii) 제한 효소를 사용하여 제1 선형 콘카타머를 분해하여 제1 AAV 게놈을 생성하는 단계; (iv) 제1 AAV 게놈을 플라스미드 벡터로 클로닝하는 단계; (v) DD 요소를 포함하는 플라스미드 클론을 확인하는 단계; (vi) DD 요소를 포함하는 플라스미드 클론을 분해하여 제2 AAV 게놈을 생성하는 단계; (vii) 제2 AAV 게놈을 자기-라이게이션시켜 원형 DNA 주형을 제조하는 단계; (viii) 제2 폴리머라제-매개 롤링-서클 증폭을 사용하여 원형 DNA 주형을 증폭시켜 제2 선형 콘카타머를 생성하는 단계; (ix) 제한 효소를 사용하여 제2 선형 콘카타머를 분해하여 제3 AAV 게놈을 생성하는 단계; 및 (x) 제3 AAV 게놈을 자기-라이게이션시켜 이종성 유전자 및 DD 요소를 포함하는 단리된 DNA 벡터를 제조하는 단계를 포함하는, 단리된 DNA 벡터를 제조하는 방법.
47. 패러그래프 45 또는 46에 있어서, 폴리머라제-매개 롤링-서클 증폭이 등온 롤링-서클 증폭인 방법.
48. 패러그래프 45 내지 47 중 어느 한 패러그래프에 있어서, 폴리머라제가 Phi29 DNA 폴리머라제인 방법.
49. (i) AAV 게놈을 포함하는 원형 DNA 벡터를 포함하는 샘플을 제공하는 단계이며, 여기서 AAV 게놈은 이종성 유전자 및 DD 요소를 포함하는 것인 단계; (ii) 폴리머라제-매개 롤링-서클 증폭을 사용하여 AAV 게놈을 증폭시켜 선형 콘카타머를 생성하는 단계; (iii) 제한 효소를 사용하여 콘카타머를 분해하여 AAV 게놈을 생성하는 단계; 및 (iv) AAV 게놈을 자기-라이게이션시켜 이종성 유전자 및 DD 요소를 포함하는 치료 DNA 벡터를 제조하는 단계를 포함하는, 치료 DNA 벡터를 제조하는 시험관내 방법.
50. 패러그래프 49에 있어서, 폴리머라제-매개 롤링-서클 증폭이 등온 롤링-서클 증폭인 방법.
51. 패러그래프 49 또는 50에 있어서, 폴리머라제가 Phi29 DNA 폴리머라제인 방법.
52. 패러그래프 33 내지 44 중 어느 한 패러그래프의 DNA 벡터, 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
53. 패러그래프 52에 있어서, 비-면역원성인 제약 조성물.
54. 이종성 유전자의 에피솜 발현을 필요로 하는 대상체에게 패러그래프 33 내지 45 중 어느 한 패러그래프의 단리된 DNA 벡터, 또는 패러그래프 52 또는 53의 제약 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 이종성 유전자의 에피솜 발현을 필요로 하는 대상체에서 이종성 유전자의 에피솜 발현을 유도하는 방법.
55. 대상체에게 패러그래프 33 내지 44 중 어느 한 패러그래프의 단리된 DNA 벡터, 또는 패러그래프 52 또는 53의 제약 조성물을 치료 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 장애를 치료하는 방법.
56. 패러그래프 54 또는 55에 있어서, 단리된 DNA 벡터 또는 제약 조성물이 반복적으로 투여되는 것인 방법.
57. 패러그래프 54 내지 56 중 어느 한 패러그래프에 있어서, 단리된 DNA 벡터 또는 제약 조성물이 국소적으로 투여되는 것인 방법.
58. 패러그래프 57에 있어서, 단리된 DNA 벡터 또는 제약 조성물이 유리체내로 투여되는 것인 방법.
59. 패러그래프 54 내지 58 중 어느 한 패러그래프에 있어서, 장애가 안구 장애인 방법.
60. 패러그래프 54 내지 59 중 어느 한 패러그래프에 있어서, 안구 장애가 레버 선천성 흑암시 (LCA), 스타가트병, 탄력섬유성 위황색종, 간체 추체 이영양증, 삼출성 유리체망막병증, 주버트 증후군, CSNB-1C, 연령 관련 황반 변성, 색소성 망막염, 스티클러 증후군, 소두증 및 맥락망막병증, 색소성 망막염, CSNB 2, 어셔 증후군, 또는 와그너 증후군인 방법.
하기 추가의 넘버링된 패러그래프는 추가로 본원에 기술된 본 발명의 일부 실시양태를 정의된다:
1. 멘델-유전성 망막 이영양증을 치료하도록 구성된 치료 단백질을 코딩하는 하나 이상의 이종성 유전자를 포함하는 단리된 원형 DNA 벡터이며, 여기서 DNA 벡터에는 복제 기점 및/또는 약물 내성 유전자가 결여된 것인 단리된 원형 DNA 벡터.
2. 패러그래프 1에 있어서, 멘델-유전성 망막 이영양증이 레버 선천성 흑암시 (LCA), 스타가트병, 탄력섬유성 위황색종, 간체 추체 이영양증, 삼출성 유리체망막병증, 주버트 증후군, CSNB-1C, 색소성 망막염, 스티클러 증후군, 소두증 및 맥락망막병증, 색소성 망막염, CSNB 2, 어셔 증후군, 및 와그너 증후군으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 DNA 벡터.
3. 패러그래프 1 또는 2에 있어서, 하나 이상의 이종성 유전자가 ABCA4, CEP290, ABCC6, RIMS1, LRP5, CC2D2A, TRPM1, IFT-172, COL11A1, TUBGCP6, KIAA1549, CACNA1F, MYO7A, VCAN, USH2A, 및 HMCN1로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 DNA 벡터.
4. ABCA4, CEP290, ABCC6, RIMS1, LRP5, CC2D2A, TRPM1, IFT-172, COL11A1, TUBGCP6, KIAA1549, CACNA1F, MYO7A, VCAN, USH2A, 및 HMCN1로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 이종성 유전자를 포함하는 단리된 원형 DNA 벡터이며, 여기서 DNA 벡터에는 복제 기점 및/또는 약물 내성 유전자가 결여된 것인 단리된 원형 DNA 벡터.
5. 패러그래프 4에 있어서, 하나 이상의 이종성 유전자가 LCA, 스타가트병, 탄력섬유성 위황색종, 간체 추체 이영양증, 삼출성 유리체망막병증, 주버트 증후군, CSNB-1C, 색소성 망막염, 스티클러 증후군, 소두증 및 맥락망막병증, 색소성 망막염, CSNB 2, 어셔 증후군, 및 와그너 증후군으로 이루어진 군으로부터 선택되는 멘델-유전성 망막 이영양증을 치료하도록 구성된 치료 단백질을 코딩하는 것인 DNA 벡터.
6. 항체 또는 그의 부분, 성장 인자, 인터류킨, 인터페론, 항-아폽토시스 인자, 시토카인, 및 항-당뇨병성 인자로 이루어진 군으로부터 선택되는 치료 단백질을 코딩하는 하나 이상의 이종성 유전자를 포함하는 단리된 원형 DNA 벡터이며, 여기서 DNA 벡터에는 복제 기점 및/또는 약물 내성 유전자가 결여된 것인 단리된 원형 DNA 벡터.
7. 트랜스-스플라이싱 분자를 포함하는 하나 이상의 이종성 유전자를 포함하는 단리된 원형 DNA 벡터이며, 여기서 DNA 벡터에는 복제 기점 및/또는 약물 내성 유전자가 결여된 것인 단리된 원형 DNA 벡터.
8. 간-분비 치료 단백질을 코딩하는 하나 이상의 이종성 유전자를 포함하는 단리된 원형 DNA 벡터이며, 여기서 DNA 벡터에는 복제 기점 및/또는 약물 내성 유전자가 결여된 것인 단리된 원형 DNA 벡터.
9. 패러그래프 8에 있어서, 치료 단백질이 혈액 내로 분비되는 것인 DNA 벡터.
10. 패러그래프 1 내지 9 중 어느 한 패러그래프에 있어서, DNA 벡터가 말단 반복 서열을 포함하는 것인 DNA 벡터.
11. 패러그래프 10에 있어서, 말단 반복 서열의 길이가 적어도 10 bp인 DNA 벡터.
12. 하나 이상의 이종성 유전자를 포함하는 단리된 원형 DNA 벡터이며, 여기서 DNA 벡터는 (a) 말단 반복 서열을 포함하고; (b) 복제 기점 및/또는 약물 내성 유전자가 결여된 것인 단리된 원형 DNA 벡터.
13. 패러그래프 1 내지 12 중 어느 한 패러그래프에 있어서, DNA 벡터에는 박테리아 플라스미드 DNA가 결여된 것인 DNA 벡터.
14. 패러그래프 1 내지 13 중 어느 한 패러그래프에 있어서, DNA 벡터에는 (a) 면역원성 박테리아 시그니처; 및/또는 (b) RNA 폴리머라제 정지 부위가 결여된 것인 DNA 벡터.
15. 패러그래프 1 내지 14 중 어느 한 패러그래프에 있어서, DNA 벡터에는 CpG 섬이 실질적으로 없는 것인 DNA 벡터.
16. 패러그래프 1 내지 15 중 어느 한 패러그래프에 있어서, 이종성 유전자의 길이가 4.5 Kb 초과인 DNA 벡터.
17. 패러그래프 1 내지 15 중 어느 한 패러그래프에 있어서, DNA 벡터가 이중 가닥인 DNA 벡터.
18. 패러그래프 17에 있어서, 이중 가닥 벡터가 단량체인 DNA 벡터.
19. 패러그래프 1 내지 18 중 어느 한 패러그래프에 있어서, DNA 벡터가 하나 이상의 이종성 유전자 상류에 프로모터 서열을 포함하는 것인 DNA 벡터.
20. 패러그래프 1 내지 19 중 어느 한 패러그래프에 있어서, DNA 벡터가 하나 이상의 이종성 유전자 하류에 폴리아데닐화 부위를 포함하는 것인 DNA 벡터.
21. 패러그래프 20에 있어서, 하기 요소: (i) 프로모터 서열; (ii) 하나 이상의 이종성 유전자; (iii) 폴리아데닐화 부위; 및 (iv) 말단 반복 서열이 5'에서 3' 방향으로 작동적으로 연결되어 있는 것인 DNA 벡터.
22. 복수의 동일한 앰플리콘을 포함하는 단리된 선형 DNA 분자이며, 여기서 복수의 동일한 앰플리콘은 각각 망막 이영양증을 치료하도록 구성된 치료 단백질을 코딩하는 이종성 유전자를 포함하고, 여기서 DNA 분자에는 (a) 복제 기점 및/또는 약물 내성 유전자; 및 (b) 재조합 부위가 결여된 것인 단리된 선형 DNA 분자.
23. 패러그래프 22에 있어서, 멘델-유전성 망막 이영양증이 LCA, 스타가트병, 탄력섬유성 위황색종, 간체 추체 이영양증, 삼출성 유리체망막병증, 주버트 증후군, CSNB-1C, 색소성 망막염, 연령 관련 황반 변성 (AMD), 스티클러 증후군, 소두증 및 맥락망막병증, 색소성 망막염, CSNB 2, 어셔 증후군, 및 와그너 증후군으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 DNA 분자.
24. 패러그래프 22 또는 23에 있어서, 하나 이상의 이종성 유전자가 ABCA4, CEP290, ABCC6, RIMS1, LRP5, CC2D2A, TRPM1, IFT-172, C3, COL11A1, TUBGCP6, KIAA1549, CACNA1F, MYO7A, VCAN, USH2A, 및 HMCN1로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 DNA 분자.
25. 복수의 동일한 앰플리콘을 포함하는 단리된 선형 DNA 분자이며, 여기서 복수의 동일한 앰플리콘은 각각 ABCA4, CEP290, ABCC6, RIMS1, LRP5, CC2D2A, TRPM1, IFT-172, C3, COL11A1, TUBGCP6, KIAA1549, CACNA1F, MYO7A, VCAN, USH2A, 및 HMCN1로 이루어진 군으로부터 선택되는 이종성 유전자를 포함하고, 여기서 DNA 분자에는 (a) 복제 기점 및/또는 약물 내성 유전자; 및 (b) 재조합 부위가 결여된 것인 단리된 선형 DNA 분자.
26. 패러그래프 25에 있어서, 이종성 유전자가 LCA, 스타가트병, 탄력섬유성 위황색종, 간체 추체 이영양증, 삼출성 유리체망막병증, 주버트 증후군, CSNB-1C, 색소성 망막염, AMD, 스티클러 증후군, 소두증 및 맥락망막병증, 색소성 망막염, CSNB 2, 어셔 증후군, 및 와그너 증후군으로 이루어진 군으로부터 선택되는 멘델-유전성 망막 이영양증을 치료하도록 구성된 치료 단백질을 코딩하는 것인 DNA 분자.
27. 복수의 동일한 앰플리콘을 포함하는 단리된 선형 DNA 분자이며, 여기서 복수의 동일한 앰플리콘은 각각 항체 또는 그의 부분, 응고 인자, 성장 인자, 호르몬, 인터류킨, 인터페론, 항-아폽토시스 인자, 항-종양 인자, 시토카인, 및 항-당뇨병성 인자를 코딩하는 이종성 유전자를 포함하고, 여기서 DNA 분자에는 (a) 복제 기점 및/또는 약물 내성 유전자; 및 (b) 재조합 부위가 결여된 것인 단리된 선형 DNA 분자.
28. 복수의 동일한 앰플리콘을 포함하는 단리된 선형 DNA 분자이며, 여기서 복수의 동일한 앰플리콘은 각각 트랜스-스플라이싱 분자를 포함하는 이종성 유전자를 포함하고, 여기서 DNA 분자에는 (a) 복제 기점 및/또는 약물 내성 유전자; 및 (b) 재조합 부위가 결여된 것인 단리된 선형 DNA 분자.
29. 복수의 동일한 앰플리콘을 포함하는 단리된 선형 DNA 분자이며, 여기서 복수의 동일한 앰플리콘은 각각 간-분비 치료 단백질을 코딩하는 이종성 유전자를 포함하고, 여기서 DNA 분자에는 복제 기점 및/또는 약물 내성 유전자가 결여된 것인 단리된 선형 DNA 분자.
30. 패러그래프 29에 있어서, 치료 단백질이 혈액 내로 분비되는 것인 DNA 분자.
31. 패러그래프 22 내지 30 중 어느 한 패러그래프에 있어서, 동일한 앰플리콘이 각각 말단 반복 서열을 포함하는 것인 DNA 분자.
32. 복수의 동일한 앰플리콘을 포함하는 단리된 선형 DNA 분자이며, 여기서 복수의 동일한 앰플리콘은 각각 이종성 유전자를 포함하고, 여기서 DNA 분자는 (a) 말단 반복 서열을 포함하고; (b) 복제 기점 및/또는 약물 내성 유전자가 결여된 것인 단리된 선형 DNA 분자.
33. 패러그래프 31 또는 32에 있어서, 말단 반복 서열의 길이가 적어도 10 bp인 DNA 분자.
34. 패러그래프 31 내지 33 중 어느 한 패러그래프에 있어서, 말단 반복 서열이 DD 요소인 DNA 분자.
35. (i) AAV 게놈을 포함하는 원형 DNA 벡터를 포함하는 샘플을 제공하는 단계이며, 여기서 AAV 게놈은 이종성 유전자를 포함하는 것인 단계; (ii) 폴리머라제-매개 롤링-서클 증폭을 사용하여 AAV 게놈을 증폭시켜 선형 콘카타머를 생성하는 단계; (iii) 제한 효소를 사용하여 콘카타머를 분해하여 다중 AAV 게놈을 생성하는 단계; 및 (iv) 다중 AAV 게놈을 각각 자기-라이게이션시켜 이종성 유전자를 포함하는 단리된 DNA 벡터를 제조하는 단계를 포함하고; 여기서, 이종성 유전자는 (a) 멘델-유전성 망막 이영양증을 치료하도록 구성된 치료 단백질을 코딩하고/거나; (b) ABCA4, CEP290, ABCC6, RIMS1, LRP5, CC2D2A, TRPM1, IFT-172, C3, COL11A1, TUBGCP6, KIAA1549, CACNA1F, MYO7A, VCAN, USH2A, 및 HMCN1로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나; (c) 항체 또는 그의 부분, 응고 인자, 성장 인자, 호르몬, 인터류킨, 인터페론, 항-아폽토시스 인자, 항-종양 인자, 시토카인, 및 항-당뇨병성 인자를 코딩하고/거나; (d) 트랜스-스플라이싱 분자이고/거나; (e) 간-분비 치료 단백질을 코딩하는 것인, 단리된 DNA 벡터를 제조하는 방법.
36. 패러그래프 35에 있어서, AAV 게놈이 말단 반복 서열을 포함하는 것인 방법.
37. 패러그래프 35 또는 36에 있어서, 이종성 유전자를 포함하는 단리된 DNA 벡터를 칼럼 정제하여 단리된 DNA 벡터로부터 슈퍼코일드 DNA를 정제하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
38. (i) AAV 게놈을 포함하는 원형 DNA 벡터를 포함하는 샘플을 제공하는 단계이며, 여기서 AAV 게놈은 이종성 유전자 및 말단 반복 서열을 포함하는 것인 단계; (ii) 제1 폴리머라제-매개 롤링-서클 증폭을 사용하여 AAV 게놈을 증폭시켜 제1 선형 콘카타머를 생성하는 단계; (iii) 제한 효소를 사용하여 제1 선형 콘카타머를 분해하여 제1 AAV 게놈을 생성하는 단계; (iv) 제1 AAV 게놈을 플라스미드 벡터로 클로닝하는 단계; (v) 말단 반복 서열을 포함하는 플라스미드 클론을 확인하는 단계; (vi) 말단 반복 서열을 포함하는 플라스미드 클론을 분해하여 제2 AAV 게놈을 생성하는 단계; (vii) 제2 AAV 게놈을 자기-라이게이션시켜 원형 DNA 주형을 제조하는 단계; (viii) 제2 폴리머라제-매개 롤링-서클 증폭을 사용하여 원형 DNA 주형을 증폭시켜 제2 선형 콘카타머를 생성하는 단계; (ix) 제한 효소를 사용하여 제2 선형 콘카타머를 분해하여 제3 AAV 게놈을 생성하는 단계; 및 (x) 제3 AAV 게놈을 자기-라이게이션시켜 이종성 유전자 및 말단 반복 서열을 포함하는 단리된 DNA 벡터를 제조하는 단계를 포함하는, 단리된 DNA 벡터를 제조하는 방법.
39. 패러그래프 35 내지 38 중 어느 한 패러그래프에 있어서, 폴리머라제-매개 롤링-서클 증폭이 등온 롤링-서클 증폭인 방법.
40. 패러그래프 35 내지 39 중 어느 한 패러그래프에 있어서, 폴리머라제가 Phi29 DNA 폴리머라제인 방법.
41. (i) AAV 게놈을 포함하는 원형 DNA 벡터를 포함하는 샘플을 제공하는 단계이며, 여기서 AAV 게놈은 이종성 유전자를 포함하는 것인 단계; (ii) 폴리머라제-매개 롤링-서클 증폭을 사용하여 AAV 게놈을 증폭시켜 선형 콘카타머를 생성하는 단계; (iii) 제한 효소를 사용하여 콘카타머를 분해하여 AAV 게놈을 생성하는 단계; 및 (iv) AAV 게놈을 자기-라이게이션시켜 이종성 유전자를 포함하는 치료 DNA 벡터를 제조하는 단계를 포함하는, 치료 DNA 벡터를 제조하는 시험관내 방법.
42. 패러그래프 41에 있어서, 이종성 유전자를 포함하는 단리된 DNA 벡터를 칼럼 정제하여 단리된 DNA 벡터로부터 슈퍼코일드 DNA를 정제하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
43. 패러그래프 41 또는 42에 있어서, 폴리머라제-매개 롤링-서클 증폭이 등온 롤링-서클 증폭인 방법.
44. 패러그래프 41 내지 43 중 어느 한 패러그래프에 있어서, 폴리머라제가 Phi29 DNA 폴리머라제인 방법.
45. 패러그래프 1 내지 21 중 어느 한 패러그래프의 DNA 벡터, 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
46. 패러그래프 45에 있어서, 비-면역원성인 제약 조성물.
47. 이종성 유전자의 에피솜 발현을 필요로 하는 대상체에게 패러그래프 1 내지 21 중 어느 한 패러그래프의 단리된 DNA 벡터, 또는 패러그래프 45 또는 46의 제약 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 이종성 유전자의 에피솜 발현을 필요로 하는 대상체에서 이종성 유전자의 에피솜 발현을 유도하는 방법.
48. 대상체에게 패러그래프 1 내지 21 중 어느 한 패러그래프의 단리된 DNA 벡터, 또는 패러그래프 43 또는 44의 제약 조성물을 치료 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 장애를 치료하는 방법.
49. 패러그래프 47 또는 48에 있어서, 단리된 DNA 벡터 또는 제약 조성물이 반복적으로 투여되는 것인 방법.
50. 패러그래프 47 내지 49 중 어느 한 패러그래프에 있어서, 단리된 DNA 벡터 또는 제약 조성물이 국소적으로 투여되는 것인 방법.
51. 패러그래프 50에 있어서, 단리된 DNA 벡터 또는 제약 조성물이 유리체내로 투여되는 것인 방법.
52. 패러그래프 47 내지 51 중 어느 한 패러그래프에 있어서, 장애가 안구 장애인 방법.
53. 패러그래프 52에 있어서, 안구 장애가 멘델-유전성 망막 이영양증인 방법.
54. 패러그래프 53에 있어서, 안구 장애가 LCA, 스타가트병, 탄력섬유성 위황색종, 간체 추체 이영양증, 삼출성 유리체망막병증, 주버트 증후군, CSNB-1C, 연령 관련 황반 변성, 색소성 망막염, 스티클러 증후군, 소두증 및 맥락망막병증, 색소성 망막염, CSNB 2, 어셔 증후군, 또는 와그너 증후군인 방법.
55. 이중 D (DD) 요소를 포함하는 단리된 DNA 벡터이며, 여기서 DNA 벡터에는 복제 기점 및/또는 약물 내성 유전자가 결여된 것인 단리된 DNA 벡터.
56. 패러그래프 55에 있어서, DNA 벡터에는 박테리아 플라스미드 DNA가 결여된 것인 DNA 벡터.
57. 패러그래프 55 또는 56 중 어느 한 패러그래프에 있어서, DNA 벡터에는 면역원성 박테리아 시그니처 및/또는 RNA 폴리머라제 정지 부위가 결여된 것인 DNA 벡터.
58. DD 요소 및 박테리아 복제 기점 및/또는 약물 내성 유전자를 포함하는 단리된 DNA 벡터.
59. 패러그래프 55 내지 57 중 어느 한 패러그래프에 있어서, DNA 벡터가 추가로 하나 이상의 이종성 유전자를 포함하는 것인 DNA 벡터.
60. 패러그래프 59에 있어서, 이종성 유전자의 길이가 4.5 Kb 초과인 DNA 벡터.
61. 패러그래프 55 내지 60 중 어느 한 패러그래프에 있어서, DNA 벡터가 원형 벡터인 DNA 벡터.
62. 패러그래프 61에 있어서, 원형 벡터가 단량체 원형 벡터인 DNA 벡터.
63. 패러그래프 60 내지 62 중 어느 한 패러그래프에 있어서, DNA 벡터가 하나 이상의 이종성 유전자 상류에 프로모터 서열을 포함하는 것인 DNA 벡터.
64. 패러그래프 60 내지 63 중 어느 한 패러그래프에 있어서, DNA 벡터가 하나 이상의 이종성 유전자 하류에 폴리아데닐화 부위를 포함하는 것인 DNA 벡터.
65. 패러그래프 64에 있어서, 하나 이상의 이종성 유전자가 트랜스-스플라이싱 분자를 포함하는 것인 DNA 벡터.
66. 패러그래프 64 또는 65에 있어서, 하기 요소: (i) 프로모터 서열; (ii) 하나 이상의 이종성 유전자; (iii) 폴리아데닐화 부위; 및 (iv) DD 요소가 5'에서 3' 방향으로 작동적으로 연결되어 있는 것인 DNA 벡터.
67. (i) AAV 게놈을 포함하는 원형 DNA 벡터를 포함하는 샘플을 제공하는 단계이며, 여기서 AAV 게놈은 이종성 유전자 및 DD 요소를 포함하는 것인 단계; (ii) 폴리머라제-매개 롤링-서클 증폭을 사용하여 AAV 게놈을 증폭시켜 선형 콘카타머를 생성하는 단계; (iii) 제한 효소를 사용하여 콘카타머를 분해하여 다중 AAV 게놈을 생성하는 단계; 및 (iv) 다중 AAV 게놈을 각각 자기-라이게이션시켜 이종성 유전자 및 DD 요소를 포함하는 단리된 DNA 벡터를 제조하는 단계를 포함하는, 단리된 DNA 벡터를 제조하는 방법.
68. (i) AAV 게놈을 포함하는 원형 DNA 벡터를 포함하는 샘플을 제공하는 단계이며, 여기서 AAV 게놈은 이종성 유전자 및 DD 요소를 포함하는 것인 단계; (ii) 제1 폴리머라제-매개 롤링-서클 증폭을 사용하여 AAV 게놈을 증폭시켜 제1 선형 콘카타머를 생성하는 단계; (iii) 제한 효소를 사용하여 제1 선형 콘카타머를 분해하여 제1 AAV 게놈을 생성하는 단계; (iv) 제1 AAV 게놈을 플라스미드 벡터로 클로닝하는 단계; (v) DD 요소를 포함하는 플라스미드 클론을 확인하는 단계; (vi) DD 요소를 포함하는 플라스미드 클론을 분해하여 제2 AAV 게놈을 생성하는 단계; (vii) 제2 AAV 게놈을 자기-라이게이션시켜 원형 DNA 주형을 제조하는 단계; (viii) 제2 폴리머라제-매개 롤링-서클 증폭을 사용하여 원형 DNA 주형을 증폭시켜 제2 선형 콘카타머를 생성하는 단계; (ix) 제한 효소를 사용하여 제2 선형 콘카타머를 분해하여 제3 AAV 게놈을 생성하는 단계; 및 (x) 제3 AAV 게놈을 자기-라이게이션시켜 이종성 유전자 및 DD 요소를 포함하는 단리된 DNA 벡터를 제조하는 단계를 포함하는, 단리된 DNA 벡터를 제조하는 방법.
69. 패러그래프 67 또는 68에 있어서, 폴리머라제-매개 롤링-서클 증폭이 등온 롤링-서클 증폭인 방법.
70. 패러그래프 67 내지 69 중 어느 한 패러그래프에 있어서, 폴리머라제가 Phi29 DNA 폴리머라제인 방법.
71. (i) AAV 게놈을 포함하는 원형 DNA 벡터를 포함하는 샘플을 제공하는 단계이며, 여기서 AAV 게놈은 이종성 유전자 및 DD 요소를 포함하는 것인 단계; (ii) 폴리머라제-매개 롤링-서클 증폭을 사용하여 AAV 게놈을 증폭시켜 선형 콘카타머를 생성하는 단계; (iii) 제한 효소를 사용하여 콘카타머를 분해하여 AAV 게놈을 생성하는 단계; 및 (iv) AAV 게놈을 자기-라이게이션시켜 이종성 유전자 및 DD 요소를 포함하는 치료 DNA 벡터를 제조하는 단계를 포함하는, 치료 DNA 벡터를 제조하는 시험관내 방법.
72. 패러그래프 71에 있어서, 폴리머라제-매개 롤링-서클 증폭이 등온 롤링-서클 증폭인 방법.
73. 패러그래프 71 또는 72에 있어서, 폴리머라제가 Phi29 DNA 폴리머라제인 방법.
74. 패러그래프 55 내지 66 중 어느 한 패러그래프의 DNA 벡터, 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
75. 패러그래프 74에 있어서, 비-면역원성인 제약 조성물.
76. 이종성 유전자의 에피솜 발현을 필요로 하는 대상체에게 패러그래프 55 내지 66 중 어느 한 패러그래프의 단리된 DNA 벡터, 또는 패러그래프 74 또는 75의 제약 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 이종성 유전자의 에피솜 발현을 필요로 하는 대상체에서 이종성 유전자의 에피솜 발현을 유도하는 방법.
77. 대상체에게 패러그래프 55 내지 66 중 어느 한 패러그래프의 단리된 DNA 벡터, 또는 패러그래프 74 또는 75의 제약 조성물을 치료 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 장애를 치료하는 방법.
78. 패러그래프 76 또는 77에 있어서, 단리된 DNA 벡터 또는 제약 조성물이 반복적으로 투여되는 것인 방법.
79. 패러그래프 76 내지 78 중 어느 한 패러그래프에 있어서, 단리된 DNA 벡터 또는 제약 조성물이 국소적으로 투여되는 것인 방법.
80. 패러그래프 79에 있어서, 단리된 DNA 벡터 또는 제약 조성물이 유리체내로 투여되는 것인 방법.
81. 패러그래프 76 내지 80 중 어느 한 패러그래프에 있어서, 장애가 안구 장애인 방법.
82. 패러그래프 81에 있어서, 안구 장애가 멘델-유전성 망막 이영양증인 방법.
83. 패러그래프 76 내지 82 중 어느 한 패러그래프에 있어서, 안구 장애가 LCA, 스타가트병, 탄력섬유성 위황색종, 간체 추체 이영양증, 삼출성 유리체망막병증, 주버트 증후군, CSNB-1C, 연령 관련 황반 변성, 색소성 망막염, 스티클러 증후군, 소두증 및 맥락망막병증, 색소성 망막염, CSNB 2, 어셔 증후군, 또는 와그너 증후군인 방법.
다른 실시양태
본 명세서에서 언급된 모든 공개문헌, 특허, 및 특허 출원은, 마치 각각의 독립 공개문헌 또는 특허 출원이 참조로 포함되는 것으로 구체적으로 및 개별적으로 명시된 것과 같은 정도로 본원에서 참조로 포함된다.
본 발명은 그의 구체적인 실시양태와 함께 기술되었지만, 이는 추가로 변형될 수 있고, 본 출원은 일반적으로 본 발명의 원리를 따르고, 본 발명이 속하는 관련 기술분야를 포함하는 공지된 또는 관습적 실행 범위 내에 포함되는, 본 개시내용으로부터의 상기와 같은 벗어남을 포괄하는 본 발명의 임의의 변형, 용도, 또는 적합화를 포함하는 것으로 의도되고, 본원에서 상기 기술된 필수 특징에 적용될 수 있고, 청구범위의 범주를 따른다는 것을 이해할 것이다.
다른 실시양태는 청구범위 내에 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> Limelight Bio, Inc. <120> SYNTHETIC DNA VECTORS AND METHODS OF USE <130> 51219-012WO4 <150> US 62/749,369 <151> 2018-10-23 <150> US 62/643,336 <151> 2018-03-15 <160> 42 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 1 aggaacccct agtgatggag 20 <210> 2 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 2 ttggccactc cctctctgcg cgctdgctcg ctcactgagg c 41 <210> 3 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 3 cgcccgggc 9 <210> 4 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 4 gcccgggcg 9 <210> 5 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 5 cgggcgacc 9 <210> 6 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 6 ggtcgcccg 9 <210> 7 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 7 gcctcagtga 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Claims (86)

  1. 멘델-유전성 망막 이영양증(Mendelian-heritable retinal dystrophy)을 치료하도록 구성된 치료 단백질을 코딩하는 하나 이상의 이종성 유전자를 포함하는 단리된 원형 DNA 벡터이며, 여기서 DNA 벡터에는 복제 기점 및/또는 약물 내성 유전자가 결여된 것인 단리된 원형 DNA 벡터.
  2. 제1항에 있어서, 멘델-유전성 망막 이영양증이 스타가트병(Stargardt Disease), 레버 선천성 흑암시(Leber's congenital amaurosis: LCA), 탄력섬유성 위황색종, 간체 추체 이영양증, 삼출성 유리체망막병증, 주버트 증후군(Joubert Syndrome), CSNB-1C, 색소성 망막염, 스티클러 증후군, 소두증 및 맥락망막병증, 색소성 망막염, CSNB 2, 어셔 증후군(Usher syndrome), 및 와그너 증후군(Wagner syndrome)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 DNA 벡터.
  3. 제1항에 있어서, 하나 이상의 이종성 유전자가 ABCA4, CEP290, ABCC6, RIMS1, LRP5, CC2D2A, TRPM1, IFT-172, COL11A1, TUBGCP6, KIAA1549, CACNA1F, MYO7A, VCAN, USH2A, 및 HMCN1로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 DNA 벡터.
  4. ABCA4, CEP290, ABCC6, RIMS1, LRP5, CC2D2A, TRPM1, IFT-172, COL11A1, TUBGCP6, KIAA1549, CACNA1F, MYO7A, VCAN, USH2A, 및 HMCN1로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 이종성 유전자를 포함하는 단리된 원형 DNA 벡터이며, 여기서 DNA 벡터에는 복제 기점 및/또는 약물 내성 유전자가 결여된 것인 단리된 원형 DNA 벡터.
  5. 제4항에 있어서, 하나 이상의 이종성 유전자가 스타가트병, LCA, 탄력섬유성 위황색종, 간체 추체 이영양증, 삼출성 유리체망막병증, 주버트 증후군, CSNB-1C, 색소성 망막염, 스티클러 증후군, 소두증 및 맥락망막병증, 색소성 망막염, CSNB 2, 어셔 증후군, 및 와그너 증후군으로 이루어진 군으로부터 선택되는 멘델-유전성 망막 이영양증을 치료하도록 구성된 치료 단백질을 코딩하는 것인 DNA 벡터.
  6. 항체 또는 그의 부분, 성장 인자, 인터류킨, 인터페론, 항-아폽토시스 인자, 시토카인, 및 항-당뇨병성 인자로 이루어진 군으로부터 선택되는 치료 단백질을 코딩하는 하나 이상의 이종성 유전자를 포함하는 단리된 원형 DNA 벡터이며, 여기서 DNA 벡터에는 복제 기점 및/또는 약물 내성 유전자가 결여된 것인 단리된 원형 DNA 벡터.
  7. 트랜스-스플라이싱 분자를 포함하는 하나 이상의 이종성 유전자를 포함하는 단리된 원형 DNA 벡터이며, 여기서 DNA 벡터에는 복제 기점 및/또는 약물 내성 유전자가 결여된 것인 단리된 원형 DNA 벡터.
  8. 간-분비 치료 단백질을 코딩하는 하나 이상의 이종성 유전자를 포함하는 단리된 원형 DNA 벡터이며, 여기서 DNA 벡터에는 복제 기점 및/또는 약물 내성 유전자가 결여된 것인 단리된 원형 DNA 벡터.
  9. 제8항에 있어서, 치료 단백질이 혈액으로 분비되는 것인 DNA 벡터.
  10. 제1항에 있어서, DNA 벡터가 말단 반복 서열을 포함하는 것인 DNA 벡터.
  11. 제10항에 있어서, 말단 반복 서열의 길이가 적어도 10 bp인 DNA 벡터.
  12. 하나 이상의 이종성 유전자를 포함하는 단리된 원형 DNA 벡터이며, 여기서 DNA 벡터는
    (a) 말단 반복 서열을 포함하고;
    (b) 복제 기점 및/또는 약물 내성 유전자가 결여된 것인 단리된 원형 DNA 벡터.
  13. 제1항에 있어서, DNA 벡터에는 박테리아 플라스미드 DNA가 결여된 것인 DNA 벡터.
  14. 제1항에 있어서, DNA 벡터에는
    (a) 면역원성 박테리아 시그니처; 및/또는
    (b) RNA 폴리머라제 정지 부위가 결여된 것인 DNA 벡터.
  15. 제1항에 있어서, DNA 벡터에는 CpG 섬이 실질적으로 없는 것인 DNA 벡터.
  16. 제1항에 있어서, 이종성 유전자의 길이가 4.5 Kb 초과인 DNA 벡터.
  17. 제1항에 있어서, DNA 벡터가 이중 가닥인 DNA 벡터.
  18. 제17항에 있어서, 이중 가닥 벡터가 단량체인 DNA 벡터.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, DNA 벡터가 하나 이상의 이종성 유전자 상류에 프로모터 서열을 포함하는 것인 DNA 벡터.
  20. 제1항에 있어서, DNA 벡터가 하나 이상의 이종성 유전자 하류에 폴리아데닐화 부위를 포함하는 것인 DNA 벡터.
  21. 제20항에 있어서, 하기 요소:
    (i) 프로모터 서열;
    (ii) 하나 이상의 이종성 유전자;
    (iii) 폴리아데닐화 부위; 및
    (iv) 말단 반복 서열
    이 5'에서 3' 방향으로 작동적으로 연결되어 있는 것인 DNA 벡터.
  22. 복수의 동일한 앰플리콘을 포함하는 단리된 선형 DNA 분자이며, 여기서 복수의 동일한 앰플리콘은 각각 망막 이영양증을 치료하도록 구성된 치료 단백질을 코딩하는 이종성 유전자를 포함하고, 여기서 DNA 분자에는 (a) 복제 기점 및/또는 약물 내성 유전자; 및 (b) 재조합 부위가 결여된 것인 단리된 선형 DNA 분자.
  23. 제22항에 있어서, 멘델-유전성 망막 이영양증이 스타가트병, LCA, 탄력섬유성 위황색종, 간체 추체 이영양증, 삼출성 유리체망막병증, 주버트 증후군, CSNB-1C, 색소성 망막염, 연령 관련 황반 변성 (AMD), 스티클러 증후군, 소두증 및 맥락망막병증, 색소성 망막염, CSNB 2, 어셔 증후군, 및 와그너 증후군으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 DNA 분자.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 하나 이상의 이종성 유전자가 ABCA4, CEP290, ABCC6, RIMS1, LRP5, CC2D2A, TRPM1, IFT-172, C3, COL11A1, TUBGCP6, KIAA1549, CACNA1F, MYO7A, VCAN, USH2A, 및 HMCN1로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 DNA 분자.
  25. 복수의 동일한 앰플리콘을 포함하는 단리된 선형 DNA 분자이며, 여기서 복수의 동일한 앰플리콘은 각각 ABCA4, CEP290, ABCC6, RIMS1, LRP5, CC2D2A, TRPM1, IFT-172, C3, COL11A1, TUBGCP6, KIAA1549, CACNA1F, MYO7A, VCAN, USH2A, 및 HMCN1로 이루어진 군으로부터 선택되는 이종성 유전자를 포함하고, 여기서 DNA 분자에는 (a) 복제 기점 및/또는 약물 내성 유전자; 및 (b) 재조합 부위가 결여된 것인 단리된 선형 DNA 분자.
  26. 제25항에 있어서, 이종성 유전자가 스타가트병, LCA, 탄력섬유성 위황색종, 간체 추체 이영양증, 삼출성 유리체망막병증, 주버트 증후군, CSNB-1C, 색소성 망막염, AMD, 스티클러 증후군, 소두증 및 맥락망막병증, 색소성 망막염, CSNB 2, 어셔 증후군, 및 와그너 증후군으로 이루어진 군으로부터 선택되는 멘델-유전성 망막 이영양증을 치료하도록 구성된 치료 단백질을 코딩하는 것인 DNA 분자.
  27. 복수의 동일한 앰플리콘을 포함하는 단리된 선형 DNA 분자이며, 여기서 복수의 동일한 앰플리콘은 각각 항체 또는 그의 부분, 응고 인자, 성장 인자, 호르몬, 인터류킨, 인터페론, 항-아폽토시스 인자, 항-종양 인자, 시토카인, 및 항-당뇨병성 인자를 코딩하는 이종성 유전자를 포함하고, 여기서 DNA 분자에는 (a) 복제 기점 및/또는 약물 내성 유전자; 및 (b) 재조합 부위가 결여된 것인 단리된 선형 DNA 분자.
  28. 복수의 동일한 앰플리콘을 포함하는 단리된 선형 DNA 분자이며, 여기서 복수의 동일한 앰플리콘은 각각 트랜스-스플라이싱 분자를 포함하는 이종성 유전자를 포함하고, 여기서 DNA 분자에는 (a) 복제 기점 및/또는 약물 내성 유전자; 및 (b) 재조합 부위가 결여된 것인 단리된 선형 DNA 분자.
  29. 복수의 동일한 앰플리콘을 포함하는 단리된 선형 DNA 분자이며, 여기서 복수의 동일한 앰플리콘은 각각 간-분비 치료 단백질을 코딩하는 이종성 유전자를 포함하고, 여기서 DNA 분자에는 복제 기점 및/또는 약물 내성 유전자가 결여된 것인 단리된 선형 DNA 분자.
  30. 제29항에 있어서, 치료 단백질이 혈액 내로 분비되는 것인 DNA 분자.
  31. 제22항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 동일한 앰플리콘이 각각 말단 반복 서열을 포함하는 것인 DNA 분자.
  32. 복수의 동일한 앰플리콘을 포함하는 단리된 선형 DNA 분자이며, 여기서 복수의 동일한 앰플리콘은 각각 이종성 유전자를 포함하고, 여기서 DNA 분자는 (a) 말단 반복 서열을 포함하고; (b) 복제 기점 및/또는 약물 내성 유전자가 결여된 것인 단리된 선형 DNA 분자.
  33. 제31항 또는 제32항에 있어서, 말단 반복 서열의 길이가 적어도 10 bp인 DNA 분자.
  34. 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 말단 반복 서열이 DD 요소인 DNA 분자.
  35. (i) AAV 게놈을 포함하는 원형 DNA 벡터를 포함하는 샘플을 제공하는 단계이며, 여기서 AAV 게놈은 이종성 유전자를 포함하는 것인 단계;
    (ii) 폴리머라제-매개 롤링-서클 증폭을 사용하여 AAV 게놈을 증폭시켜 선형 콘카타머를 생성하는 단계;
    (iii) 제한 효소를 사용하여 콘카타머를 분해하여 다중 AAV 게놈을 생성하는 단계; 및
    (iv) 다중 AAV 게놈을 각각 자기-라이게이션시켜 이종성 유전자를 포함하는 단리된 DNA 벡터를 제조하는 단계를 포함하고;
    여기서, 이종성 유전자는
    (a) 멘델-유전성 망막 이영양증을 치료하도록 구성된 치료 단백질을 코딩하고/거나;
    (b) ABCA4, CEP290, ABCC6, RIMS1, LRP5, CC2D2A, TRPM1, IFT-172, C3, COL11A1, TUBGCP6, KIAA1549, CACNA1F, MYO7A, VCAN, USH2A, 및 HMCN1로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나;
    (c) 항체 또는 그의 부분, 응고 인자, 성장 인자, 호르몬, 인터류킨, 인터페론, 항-아폽토시스 인자, 항-종양 인자, 시토카인, 및 항-당뇨병성 인자를 코딩하고/거나;
    (d) 트랜스-스플라이싱 분자이고/거나;
    (e) 간-분비 치료 단백질을 코딩하는 것인, 단리된 DNA 벡터를 제조하는 방법.
  36. 제35항에 있어서, AAV 게놈이 말단 반복 서열을 포함하는 것인 방법.
  37. 제35항 또는 제36항에 있어서, 이종성 유전자를 포함하는 단리된 DNA 벡터를 칼럼 정제하여 단리된 DNA 벡터로부터 슈퍼코일드 DNA를 정제하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  38. (i) AAV 게놈을 포함하는 원형 DNA 벡터를 포함하는 샘플을 제공하는 단계이며, 여기서 AAV 게놈은 이종성 유전자 및 말단 반복 서열을 포함하는 것인 단계;
    (ii) 제1 폴리머라제-매개 롤링-서클 증폭을 사용하여 AAV 게놈을 증폭시켜 제1 선형 콘카타머를 생성하는 단계;
    (iii) 제한 효소를 사용하여 제1 선형 콘카타머를 분해하여 제1 AAV 게놈을 생성하는 단계;
    (iv) 제1 AAV 게놈을 플라스미드 벡터로 클로닝하는 단계;
    (v) 말단 반복 서열을 포함하는 플라스미드 클론을 확인하는 단계;
    (vi) 말단 반복 서열을 포함하는 플라스미드 클론을 분해하여 제2 AAV 게놈을 생성하는 단계;
    (vii) 제2 AAV 게놈을 자기-라이게이션시켜 원형 DNA 주형을 제조하는 단계;
    (viii) 제2 폴리머라제-매개 롤링-서클 증폭을 사용하여 원형 DNA 주형을 증폭시켜 제2 선형 콘카타머를 생성하는 단계;
    (ix) 제한 효소를 사용하여 제2 선형 콘카타머를 분해하여 제3 AAV 게놈을 생성하는 단계; 및
    (x) 제3 AAV 게놈을 자기-라이게이션시켜 이종성 유전자 및 말단 반복 서열을 포함하는 단리된 DNA 벡터를 제조하는 단계
    를 포함하는, 단리된 DNA 벡터를 제조하는 방법.
  39. 제35항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리머라제-매개 롤링-서클 증폭이 등온 롤링-서클 증폭인 방법.
  40. 제35항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리머라제가 Phi29 DNA 폴리머라제인 방법.
  41. (i) AAV 게놈을 포함하는 원형 DNA 벡터를 포함하는 샘플을 제공하는 단계이며, 여기서 AAV 게놈은 이종성 유전자를 포함하는 것인 단계;
    (ii) 폴리머라제-매개 롤링-서클 증폭을 사용하여 AAV 게놈을 증폭시켜 선형 콘카타머를 생성하는 단계;
    (iii) 제한 효소를 사용하여 콘카타머를 분해하여 AAV 게놈을 생성하는 단계; 및
    (iv) AAV 게놈을 자기-라이게이션시켜 이종성 유전자를 포함하는 치료 DNA 벡터를 제조하는 단계
    를 포함하는, 치료 DNA 벡터를 제조하는 시험관내 방법.
  42. 제41항에 있어서, 이종성 유전자를 포함하는 단리된 DNA 벡터를 칼럼 정제하여 단리된 DNA 벡터로부터 슈퍼코일드 DNA를 정제하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  43. 제41항 또는 제42항에 있어서, 폴리머라제-매개 롤링-서클 증폭이 등온 롤링-서클 증폭인 방법.
  44. 제41항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리머라제가 Phi29 DNA 폴리머라제인 방법.
  45. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 DNA 벡터 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
  46. 제45항에 있어서, 비-면역원성인 제약 조성물.
  47. 이종성 유전자의 에피솜 발현을 필요로 하는 대상체에게 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 단리된 DNA 벡터, 또는 제45항 또는 제46항의 제약 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 이종성 유전자의 에피솜 발현을 필요로 하는 대상체에서 이종성 유전자의 에피솜 발현을 유도하는 방법.
  48. 대상체에게 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 단리된 DNA 벡터, 또는 제43항 또는 제44항의 제약 조성물을 치료 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 장애를 치료하는 방법.
  49. 제47항 또는 제48항에 있어서, 단리된 DNA 벡터 또는 제약 조성물이 반복적으로 투여되는 것인 방법.
  50. 제47항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 DNA 벡터 또는 제약 조성물이 국소적으로 투여되는 것인 방법.
  51. 제50항에 있어서, 단리된 DNA 벡터 또는 제약 조성물이 유리체내로 투여되는 것인 방법.
  52. 제47항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 장애가 안구 장애인 방법.
  53. 제52항에 있어서, 안구 장애가 멘델-유전성 망막 이영양증인 방법.
  54. 제53항에 있어서, 안구 장애가 LCA, 스타가트병, 탄력섬유성 위황색종, 간체 추체 이영양증, 삼출성 유리체망막병증, 주버트 증후군, CSNB-1C, 연령 관련 황반 변성, 색소성 망막염, 스티클러 증후군, 소두증 및 맥락망막병증, 색소성 망막염, CSNB 2, 어셔 증후군, 또는 와그너 증후군인 방법.
  55. 이중 D (DD) 요소를 포함하는 단리된 DNA 벡터이며, 여기서 DNA 벡터에는 복제 기점 및/또는 약물 내성 유전자가 결여된 것인 단리된 DNA 벡터.
  56. 제55항에 있어서, DNA 벡터에는 박테리아 플라스미드 DNA가 결여된 것인 DNA 벡터.
  57. 제55항 또는 제56항에 있어서, DNA 벡터에는 면역원성 박테리아 시그니처 및/또는 RNA 폴리머라제 정지 부위가 결여된 것인 DNA 벡터.
  58. DD 요소 및 박테리아 복제 기점 및/또는 약물 내성 유전자를 포함하는 단리된 DNA 벡터.
  59. 제55항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, DNA 벡터가 추가로 하나 이상의 이종성 유전자를 포함하는 것인 DNA 벡터.
  60. 제59항에 있어서, 이종성 유전자의 길이가 4.5 Kb 초과인 DNA 벡터.
  61. 제55항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, DNA 벡터가 원형 벡터인 DNA 벡터.
  62. 제61항에 있어서, 원형 벡터가 단량체 원형 벡터인 DNA 벡터.
  63. 제60항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, DNA 벡터가 하나 이상의 이종성 유전자 상류에 프로모터 서열을 포함하는 것인 DNA 벡터.
  64. 제60항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, DNA 벡터가 하나 이상의 이종성 유전자 하류에 폴리아데닐화 부위를 포함하는 것인 DNA 벡터.
  65. 제64항에 있어서, 하나 이상의 이종성 유전자가 트랜스-스플라이싱 분자를 포함하는 것인 DNA 벡터.
  66. 제64항 또는 제65항에 있어서, 하기 요소:
    (i) 프로모터 서열;
    (ii) 하나 이상의 이종성 유전자;
    (iii) 폴리아데닐화 부위; 및
    (iv) DD 요소가 5'에서 3' 방향으로 작동적으로 연결되어 있는 것인 DNA 벡터.
  67. (i) AAV 게놈을 포함하는 원형 DNA 벡터를 포함하는 샘플을 제공하는 단계이며, 여기서 AAV 게놈은 이종성 유전자 및 DD 요소를 포함하는 것인 단계;
    (ii) 폴리머라제-매개 롤링-서클 증폭을 사용하여 AAV 게놈을 증폭시켜 선형 콘카타머를 생성하는 단계;
    (iii) 제한 효소를 사용하여 콘카타머를 분해하여 다중 AAV 게놈을 생성하는 단계; 및
    (iv) 다중 AAV 게놈을 각각 자기-라이게이션시켜 이종성 유전자 및 DD 요소를 포함하는 단리된 DNA 벡터를 제조하는 단계
    를 포함하는, 단리된 DNA 벡터를 제조하는 방법.
  68. (i) AAV 게놈을 포함하는 원형 DNA 벡터를 포함하는 샘플을 제공하는 단계이며, 여기서 AAV 게놈은 이종성 유전자 및 DD 요소를 포함하는 것인 단계;
    (ii) 제1 폴리머라제-매개 롤링-서클 증폭을 사용하여 AAV 게놈을 증폭시켜 제1 선형 콘카타머를 생성하는 단계;
    (iii) 제한 효소를 사용하여 제1 선형 콘카타머를 분해하여 제1 AAV 게놈을 생성하는 단계;
    (iv) 제1 AAV 게놈을 플라스미드 벡터로 클로닝하는 단계;
    (v) DD 요소를 포함하는 플라스미드 클론을 확인하는 단계;
    (vi) DD 요소를 포함하는 플라스미드 클론을 분해하여 제2 AAV 게놈을 생성하는 단계;
    (vii) 제2 AAV 게놈을 자기-라이게이션시켜 원형 DNA 주형을 제조하는 단계;
    (viii) 제2 폴리머라제-매개 롤링-서클 증폭을 사용하여 원형 DNA 주형을 증폭시켜 제2 선형 콘카타머를 생성하는 단계;
    (ix) 제한 효소를 사용하여 제2 선형 콘카타머를 분해하여 제3 AAV 게놈을 생성하는 단계; 및
    (x) 제3 AAV 게놈을 자기-라이게이션시켜 이종성 유전자 및 DD 요소를 포함하는 단리된 DNA 벡터를 제조하는 단계
    를 포함하는, 단리된 DNA 벡터를 제조하는 방법.
  69. 제67항 또는 제68항에 있어서, 폴리머라제-매개 롤링-서클 증폭이 등온 롤링-서클 증폭인 방법.
  70. 제67항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리머라제가 Phi29 DNA 폴리머라제인 방법.
  71. (i) AAV 게놈을 포함하는 원형 DNA 벡터를 포함하는 샘플을 제공하는 단계이며, 여기서 AAV 게놈은 이종성 유전자 및 DD 요소를 포함하는 것인 단계;
    (ii) 폴리머라제-매개 롤링-서클 증폭을 사용하여 AAV 게놈을 증폭시켜 선형 콘카타머를 생성하는 단계;
    (iii) 제한 효소를 사용하여 콘카타머를 분해하여 AAV 게놈을 생성하는 단계; 및
    (iv) AAV 게놈을 자기-라이게이션시켜 이종성 유전자 및 DD 요소를 포함하는 치료 DNA 벡터를 제조하는 단계
    를 포함하는, 치료 DNA 벡터를 제조하는 시험관내 방법.
  72. 제71항에 있어서, 폴리머라제-매개 롤링-서클 증폭이 등온 롤링-서클 증폭인 방법.
  73. 제71항 또는 제72항에 있어서, 폴리머라제가 Phi29 DNA 폴리머라제인 방법.
  74. 제55항 내지 제66항 중 어느 한 항의 DNA 벡터 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
  75. 제74항에 있어서, 비-면역원성인 제약 조성물.
  76. 이종성 유전자의 에피솜 발현을 필요로 하는 대상체에게 제55항 내지 제66항 중 어느 한 항의 단리된 DNA 벡터, 또는 제74항 또는 제75항의 제약 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 이종성 유전자의 에피솜 발현을 필요로 하는 대상체에서 이종성 유전자의 에피솜 발현을 유도하는 방법.
  77. 대상체에게 제55항 내지 제66항 중 어느 한 항의 단리된 DNA 벡터, 또는 제74항 또는 제75항의 제약 조성물을 치료 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 장애를 치료하는 방법.
  78. 제76항 또는 제77항에 있어서, 단리된 DNA 벡터 또는 제약 조성물이 반복적으로 투여되는 것인 방법.
  79. 제76항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 DNA 벡터 또는 제약 조성물이 국소적으로 투여되는 것인 방법.
  80. 제79항에 있어서, 단리된 DNA 벡터 또는 제약 조성물이 유리체내로 투여되는 것인 방법.
  81. 제76항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 장애가 안구 장애인 방법.
  82. 제81항에 있어서, 안구 장애가 멘델-유전성 망막 이영양증인 방법.
  83. 제76항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 안구 장애가 LCA, 스타가트병, 탄력섬유성 위황색종, 간체 추체 이영양증, 삼출성 유리체망막병증, 주버트 증후군, CSNB-1C, 연령 관련 황반 변성, 색소성 망막염, 스티클러 증후군, 소두증 및 맥락망막병증, 색소성 망막염, CSNB 2, 어셔 증후군, 또는 와그너 증후군인 방법.
  84. 제76항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 에피솜 발현이 대상체의 간에서 유도되는 것인 방법.
  85. 제84항에 있어서, 간이 이종성 유전자에 의해 코딩된 치료 단백질을 분비하는 것인 방법.
  86. 제85항에 있어서, 간이 치료 단백질을 혈액 내로 분비하는 것인 방법.
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