JP2023507174A - Ｄｍｄ変異の修正のための方法及び組成物 - Google Patents

Abstract

筋ジストロフィー患者のゲノムにある疾患関連変異を除去し、任意に置換することによって、ＤＭＤを含む、筋ジストロフィーを処置するための方法及び組成物が本明細書中で開示されている。（エクソン４５～５５のＤＭＤ「ホットスポット」内に含まれるものを含む）既存のヒトＤＭＤ変異の大部分を効果的に修正するであろうインビボ治療用物質を送達するために、エクソン４５～５５をコードするイントロンを含まない合成ＤＮＡ配列のＤＭＤ遺伝子座における相同組換え非依存的組込みを可能にするデュアルｇＲＮＡ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースのシステムが本明細書中で開示されている。【選択図】図４

Description

関連出願
本出願は、２０１９年１２月１６日に出願された米国仮出願第６２／９４８，６６５号の利益を主張するものであり、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。

デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、タンパク質ジストロフィンの発現の欠陥から生じる。ＤＭＤ患者のおよそ６０％は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン４４から５６の間に変異を有する。ＤＭＤは、生後１年以内に見られることのある重大な運動障害をもたらす。大半のＤＭＤ患者は、１０～１４歳までに車椅子に頼り、ＤＭＤの個人は、一般に１０代後半または２０代前半に呼吸不全及び／または心不全で死亡する。

（エクソン４５～５５のＤＭＤ「ホットスポット」内に含まれるものを含む）既存のヒトＤＭＤ変異の大部分を効果的に修正するであろうインビボ治療用物質を送達するために、エクソン４５～５５をコードするイントロンを含まない合成ＤＮＡ配列のＤＭＤ遺伝子座における相同組換え非依存的組込みを可能にするデュアルｇＲＮＡ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースのシステムが本明細書中で開示されている。このアプローチによるエクソン４５～５５の除去及び置換の成功は、完全長型ジストロフィンタンパク質の発現の回復をもたらすが、除去単独では、フレームシフトエクソンを除去し、変異配列を「再構成」して、部分的に機能的なタンパク質を発現させることによって切断型ジストロフィン（これも治療効果がある）をもたらす。したがって、この戦略は、２つの異なる結果をもたらし、これらはともに治療的可能性を有する。

本開示のいくつかの態様は、哺乳動物の筋肉または筋肉前駆細胞のゲノムを改変するための方法であって、細胞をＣａｓタンパク質ならびに第１及び第２のガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）と接触させ、それによってＤＭＤのイントロン４４からイントロン５５の間に位置する哺乳動物の筋肉または筋肉前駆細胞のゲノムを改変することを含み、第１のｇＲＮＡは、ＤＭＤのイントロン４４に位置する第１の標的部位とハイブリダイズし、第２のｇＲＮＡは、ＤＭＤのイントロン５５に位置する第２の標的部位とハイブリダイズする、方法を対象とする。

いくつかの実施形態では、ゲノムの改変は、ＤＭＤのイントロン４４からイントロン５５の間のヌクレオチド配列の除去を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、細胞を野生型ＤＭＤのエクソン４５から５５のヌクレオチド配列を含む鋳型ＤＮＡと接触させることをさらに含む。いくつかの実施形態では、鋳型ＤＮＡは、野生型ＤＭＤのエクソン４５から５５のヌクレオチド配列と隣接する第１及び第２の標的部位の一部を含む。いくつかの実施形態では、ゲノムの改変は、野生型ＤＭＤのエクソン４５から５５を含む鋳型ＤＮＡによるＤＭＤのイントロン４４からイントロン５５の間のヌクレオチド配列の置換を含む。いくつかの実施形態では、ＤＭＤのイントロン４４からイントロン５５の間のヌクレオチド配列の置換は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）により生じる。

いくつかの実施形態では、ＤＭＤのイントロン４４からイントロン５５の間に位置する哺乳動物の筋肉または筋肉前駆細胞のゲノムは、疾患または状態と関連する変異を含む。いくつかの実施形態では、疾患または状態は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーである。

いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、筋ジストロフィーを有し、ＤＭＤ遺伝子のイントロン４４からイントロン５５の間に位置する変異を有する対象の細胞から誘導された人工多能性幹細胞である。いくつかの実施形態では、対象は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーを有する。

いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９である。いくつかの実施形態では、細胞は、Ｃａｓタンパク質、第１のｇＲＮＡ、第２のｇＲＮＡ、または鋳型ＤＮＡを形質導入する１つ以上のウイルスと接触させられる。いくつかの実施形態では、１つ以上のウイルスは、ＡＡＶウイルスである。いくつかの実施形態では、細胞は、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を細胞に形質導入する第１のウイルスならびに第１のｇＲＮＡ、第２のｇＲＮＡ、及び鋳型ＤＮＡをコードする核酸を細胞に形質導入する第２のウイルスと接触させられる。いくつかの実施形態では、少なくとも第１のウイルスまたは第２のウイルスは、ＡＡＶウイルスである。

いくつかの実施形態では、改変されたゲノムを有する細胞は、野生型ＤＭＤのエクソン４５から５５によってコードされるアミノ酸配列が欠如した切断型の機能的なジストロフィンを発現する。いくつかの実施形態では、改変されたゲノムを有する細胞は、野生型ＤＭＤのエクソン４５から５５によってコードされるアミノ酸配列を含む完全長型ジストロフィンを発現する。いくつかの実施形態では、細胞は、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで接触させられる。いくつかの実施形態では、細胞は、配列番号２６または２７の核酸を誘導するウイルス、あるいは１または２つのｇＲＮＡ及び鋳型のうちの１つ以上を誘導するその一部と接触させられる。

本開示のいくつかの態様は、処置を必要とする対象において筋ジストロフィーを処置する方法であって、患者の筋肉または筋肉前駆細胞をＣａｓタンパク質ならびに第１及び第２のガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）と接触させ、それによって細胞のゲノムを改変することを含み、第１のｇＲＮＡは、ＤＭＤのイントロン４４に位置する第１の標的部位とハイブリダイズし、第２のｇＲＮＡは、ＤＭＤのイントロン５５に位置する第２の標的部位とハイブリダイズし、対象のゲノムは、ＤＭＤ遺伝子のイントロン４４からイントロン５５の間に位置する変異を含む、方法を対象とする。いくつかの実施形態では、ゲノムの改変は、ＤＭＤのイントロン４４からイントロン５５の間のヌクレオチド配列の除去を含む。

いくつかの実施形態では、本方法は、細胞を野生型ＤＭＤのエクソン４５から５５のヌクレオチド配列を含む鋳型ＤＮＡと接触させることをさらに含む。いくつかの実施形態では、鋳型ＤＮＡは、野生型ＤＭＤのエクソン４５から５５のヌクレオチド配列と隣接する第１及び第２の標的部位の一部を含む。いくつかの実施形態では、ゲノムの改変は、野生型ＤＭＤのエクソン４５から５５を含む鋳型ＤＮＡによるＤＭＤのイントロン４４からイントロン５５の間のヌクレオチド配列の置換を含む。いくつかの実施形態では、ＤＭＤのイントロン４４からイントロン５５の間のヌクレオチド配列の置換は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）により生じる。いくつかの実施形態では、筋ジストロフィーは、デュシェンヌ型筋ジストロフィーである。

いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９（例えば、ｓａＣａｓ９、ＳａｕｒｉＣａｓ９、ＫＫＨ Ｃａｓ９、ｓｐＣａｓ９）である。いくつかの実施形態では、細胞は、Ｃａｓタンパク質、第１のｇＲＮＡ、第２のｇＲＮＡ、または鋳型ＤＮＡを形質導入する１つ以上のウイルスと接触させられる。いくつかの実施形態では、１つ以上のウイルスは、ＡＡＶウイルスである。いくつかの実施形態では、対象は、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を細胞に形質導入する第１のウイルスならびに第１のｇＲＮＡ、第２のｇＲＮＡ、及び鋳型ＤＮＡをコードする核酸を細胞に形質導入する第２のウイルスを投与される。いくつかの実施形態では、少なくとも第１のウイルスまたは第２のウイルスは、ＡＡＶウイルスである。

いくつかの実施形態では、改変されたゲノムを有する細胞は、野生型ＤＭＤのエクソン４５から５５によってコードされるアミノ酸配列が欠如した切断型ジストロフィンを発現する。いくつかの実施形態では、改変されたゲノムを有する細胞は、野生型ＤＭＤのエクソン４５から５５によってコードされるアミノ酸配列を含む完全長型ジストロフィンを発現する。いくつかの実施形態では、細胞は、エクスビボ、またはインビボで接触させられる。いくつかの実施形態では、細胞は、配列番号２６または２７の核酸を誘導するウイルス、あるいは１または２つのｇＲＮＡ及び鋳型のうちの１つ以上を誘導するその一部と接触させられる。

本開示のいくつかの態様は、哺乳動物の筋肉または筋肉前駆細胞のゲノムを改変するための方法であって、細胞をＣａｓタンパク質ならびに第１及び第２のガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）と接触させ、それによって第１の標的部位と第２の標的部位との間に位置する哺乳動物の筋肉または筋肉前駆細胞のゲノムを改変することを含み、第１のｇＲＮＡは、ＤＭＤの第１のイントロンに位置する第１の標的部位とハイブリダイズし、第２のｇＲＮＡは、ＤＭＤの別のイントロンに位置する第２の標的部位とハイブリダイズする、方法を対象とする。いくつかの実施形態では、ＤＭＤエクソン２３は、第１の標的部位と第２の標的部位との間に位置する。

いくつかの実施形態では、本方法は、細胞を第１の標的部位と第２の標的部位との間に位置するＤＭＤエクソンのヌクレオチド配列を含む鋳型ＤＮＡと接触させることをさらに含む。いくつかの実施形態では、鋳型ＤＮＡは、第１の標的部位と第２の標的部位との間に位置するＤＭＤエクソンのヌクレオチド配列と隣接する第１及び第２の標的部位の一部を含む。いくつかの実施形態では、ゲノムの改変は、第１の標的部位と第２の標的部位との間に位置するＤＭＤエクソンのヌクレオチド配列を含む鋳型ＤＮＡによる第１の標的部位と第２の標的部位との間に位置するヌクレオチド配列の置換を含む。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列の置換は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）により生じる。

いくつかの実施形態では、第１の標的部位と第２の標的部位との間に位置する細胞のゲノムは、疾患または状態と関連する変異を含む。いくつかの実施形態では、疾患または状態は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーである。いくつかの実施形態では、細胞は、筋ジストロフィーを有し、第１の標的部位と第２の標的部位との間に位置する変異を有する対象の細胞から誘導された人工多能性幹細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、Ｃａｓタンパク質、第１のｇＲＮＡ、第２のｇＲＮＡ、または鋳型ＤＮＡを形質導入する１つ以上のウイルスと接触させられる。いくつかの実施形態では、細胞は、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を細胞に形質導入する第１のウイルスならびに第１のｇＲＮＡ、第２のｇＲＮＡ、及び鋳型ＤＮＡをコードする核酸を細胞に形質導入する第２のウイルスと接触させられる。いくつかの実施形態では、第１のウイルスまたは第２のウイルスは、ＡＡＶウイルスである。いくつかの実施形態では、改変されたゲノムを有する細胞は、機能的な切断型ジストロフィンを発現することができる。いくつかの実施形態では、改変されたゲノムを有する細胞は、完全長型ジストロフィンを発現することができる。いくつかの実施形態では、細胞は、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで接触させられる。

本開示のいくつかの態様は、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を細胞に形質導入する第１のウイルスならびに第１のｇＲＮＡ、第２のｇＲＮＡ、及び鋳型ＤＮＡをコードする核酸を細胞に形質導入する第２のウイルスを含む組成物であって、第１のｇＲＮＡは、ＤＭＤの第１のイントロンに位置する第１の標的部位とハイブリダイズし、第２のｇＲＮＡは、ＤＭＤの別のイントロンに位置する第２の標的部位とハイブリダイズし、鋳型ＤＮＡは、第１の標的部位と第２の標的部位との間に位置する１つ以上のＤＭＤエクソンをコードする、組成物に関する。いくつかの実施形態では、鋳型ＤＮＡは、１つ以上のエクソンと隣接する第１及び第２の標的部位の一部をさらに含む。

特許または出願ファイルは、カラーで描かれた少なくとも１つの図面を含む。カラー図面を含むこの特許または特許出願公開のコピーは、請求及び必要な料金の支払いに応じて官庁により提供されるであろう。

２つのＡＡＶを用いた変異型エクソン２３の削除の概略を示す。第１のＡＡＶはＳａＣａｓ９のための配列を提供し、第２はエクソン２３に隣接する標的部位を有する２つのｇＲＮＡを提供する。示された結果は、変異エクソンの削除であり、機能的な切断型ジストロフィンの産生をもたらす。 ２つのＡＡＶを用いた変異型エクソン２３の削除の概略を示す。第１のＡＡＶはＳａＣａｓ９のための配列を提供し、第２はエクソン２３に隣接する標的部位と、２つのｇＲＮＡの標的部位によって隣接された野生型エクソン２３配列とを有する２つのｇＲＮＡを提供する。示された結果は変異エクソンの削除であり、機能的な切断型ジストロフィンの産生をもたらす。 ２つのＡＡＶを用いた変異型エクソン２３の削除及び置換の概略を示す。第１のＡＡＶはＳａＣａｓ９のための配列を提供し、第２のＡＡＶはエクソン２３に隣接する標的部位と、２つのｇＲＮＡの標的部位によって隣接された野生型エクソン２３配列とを有する２つのｇＲＮＡを提供する。示された結果は、機能的な切断型ジストロフィン、または第２のＡＡＶからの野生型エクソン２３配列とのＮＨＥＪによって置換された変異型エクソン２３を有する完全なジストロフィンタンパク質のいずれかの産生をもたらす変異型エクソンの削除である。 ２つのＡＡＶを用いた変異型エクソン２３の削除及び置換のための概略を示す。上記図３における説明を参照。図４に示す概略は、第２のＡＡＶからの野生型エクソン２３配列が間違った方向でゲノムにＮＨＥＪにより挿入される場合、ｇＲＮＡ標的部位が再構成され、挿入物が切除され、機能的な切断型ジストロフィンの産生をもたらすことをさらに提供する。 デュシェンヌ患者の６０％における変異の位置であるエクソン４５～５５に対する、図１～４に詳述したエクソン削除及び置換方法の使用を示す。この方法は、機能的な切断型ジストロフィンまたは置換エクソン４５～５５を含む全長ジストロフィンの産生をもたらし得る。 ＨＥＫ２９３細胞におけるエクソン４５～５５での変異「ホットスポット」を標的とするヒトＤＭＤエクソンの削除及び置換方法の結果を示す。 挿入配列及びイントロン５５の接合部における正しい方向への置換エクソン４５～５５のＮＨＥＪから予測されるライゲーション配列を示す概略である。本明細書に示す配列データにより、挿入に成功したことが確認される。図７に示すプライマーペア６０５及び６０６を用いたＰＣＲは、正しい方向での置換エクソン４５～５５の挿入が成功した場合にのみ、ＰＣＲ増幅産物をもたらす。 挿入配列及びイントロン４４の接合部における正しい方向への置換エクソン４５～５５のＮＨＥＪから予測されるライゲーション配列を示す概略である。本明細書に示す配列データにより、挿入に成功したことが確認される。プライマーペア６０３及び６０６を用いたＰＣＲを図８に示す。 イントロン４４及び５５のＮＨＥＪから予測されるライゲーション配列を示す概略である。本明細書に示す配列データにより、エクソン４５～５５の削除が確認される。プライマーペア６０３及び６０６を用いたＰＣＲを図８に示す。 削除産物のＰＣＲ増幅を示す。 鋳型とイントロン５５との間の接合部のＰＣＲ増幅を示す。 イントロン４４とイントロン５５との間の接合部のＰＣＲ増幅を示す。 イントロン４４と鋳型との間の接合部のディープアンプリコンシーケンスによって検出された上位５つのバリアントを示す。 イントロン４４からイントロン５５までのｈＤＭＤ（ＮＧ＿０１２２３２．１）の配列を示す概略である。 エクソン４５～５５、及びエクソンに隣接するイントロン４４とイントロン５５の部分を含むＤＮＡ鋳型と、ｇＲＮＡ標的配列を含むＨＩＴＩ Ｂの配列を示す概略である。 エクソン４５～５５、及びエクソンに隣接するイントロン４４とイントロン５５の部分を含むＤＮＡ鋳型と、ｇＲＮＡ標的配列を含むＨＩＴＩ Ｋの配列を示す概略である。 Ｒｕｎｘ１及びＰｓｃｋ９切断対照でヌクレオフェクションした細胞から増幅したＤＮＡにおけるＲｕｎｘ１遺伝子座及びＰｓｃｋ９遺伝子座のインデルのＩＣＥ定量化を示す。 示されたＣａｓ９複合体でヌクレオフェクションした細胞から増幅したＤＮＡにおけるｍｄｘ遺伝子座の修飾対立遺伝子のディープアンプリコンシーケンス定量化を示す。 タモキシフェン注射プロトコルの結果を示す。タモキシフェン注射プロトコルの概略。 タモキシフェン注射プロトコルの結果を示す。ビヒクル注射したＰａｘ７－ＣｒｅＥＲ^{Ｔ２＋／－}、Ｒｏｓａ２６－ＬＳＬ－ＳｐＣａｓ９－Ｐ２Ａ－ＥＧＦＰ^＋／－マウス、またはＰ１６－Ｐ１９から毎日注射し、最初の注射の５日後に収穫した３匹の複製Ｐａｘ７－ＣｒｅＥＲ^{Ｔ２＋／－}、Ｒｏｓａ２６－ＬＳＬ－ＳｐＣａｓ９－Ｐ２Ａ－ＥＧＦＰ^＋／－動物からＰ２１で分離したサテライト細胞の代表的ＦＡＣＳ解析である。 タモキシフェン注射プロトコルの結果を示す。タモキシフェン処理Ｐａｘ７－ＣｒｅＥＲ^{Ｔ２＋／－}、Ｒｏｓａ２６－ＬＳＬ－ＳｐＣａｓ９－Ｐ２Ａ－ＥＧＦＰ^＋／－マウスからのＥＧＦＰ－及びＥＧＦＰ＋細胞を選別するためのゲーティング方法である。プロットは、サテライト細胞マーカー（ＣＤ４５－Ｓｃａ１－Ｍａｃ１－ＣＸＣＲ４＋ＣＤ２９＋）について事前にゲーティングされる。 タモキシフェン注射プロトコルの結果を示す。（Ｃ）のＥＧＦＰ－及びＥＧＦＰ＋ゲートから選別されたサテライト細胞の共焦点画像である。 ビヒクル注射または５ｄｐｉ（Ｐ１６～１９）Ｐａｘ７－ＣｒｅＥＲ^{Ｔ２＋／－}、Ｒｏｓａ２６－ＬＳＬ－ＳｐＣａｓ９－Ｐ２Ａ－ＥＧＦＰ^＋／－マウスからＰ２１で分離した前脛骨筋の断面の免疫蛍光解析を示す。ＥＧＦＰは、ビヒクルではなくタモキシフェンを注射したマウスのＰａｘ７＋サテライト細胞で検出され、ＥＧＦＰは筋繊維で検出されない。 タモキシフェン注射プロトコルの結果を示す。タモキシフェン注射プロトコルの概略。 タモキシフェン注射プロトコルの結果を示す。ビヒクル注射したＰａｘ７－ＣｒｅＥＲ^{Ｔ２＋／－}、Ｒｏｓａ２６－ＬＳＬ－ＳｐＣａｓ９－Ｐ２Ａ－ＥＧＦＰ^＋／－マウス、またはＰ１６－Ｐ１９から毎日注射し、最初の注射の２６日後に収穫した３匹の複製Ｐａｘ７－ＣｒｅＥＲ^{Ｔ２＋／－}、Ｒｏｓａ２６－ＬＳＬ－ＳｐＣａｓ９－Ｐ２Ａ－ＥＧＦＰ^＋／－動物からＰ４２で分離したサテライト細胞の代表的ＦＡＣＳ解析である。プロットは、サテライト細胞マーカー（ＣＤ４５－Ｓｃａ１－Ｍａｃ１－ＣＸＣＲ４＋ＣＤ２９＋）について事前にゲーティングされる。

発明の詳細な説明
ＤＭＤのエクソン４５～５５を改変する方法
本開示のいくつかの態様は、哺乳動物の筋肉または筋肉前駆細胞のゲノムを改変するための方法であって、細胞をＣａｓタンパク質ならびに第１及び第２のガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）と接触させ、それによってＤＭＤのイントロン４４からイントロン５５の間に位置する哺乳動物の筋肉または筋肉前駆細胞のゲノムを改変することを含み、第１のｇＲＮＡは、ＤＭＤのイントロン４４に位置する第１の標的部位とハイブリダイズし、第２のｇＲＮＡは、ＤＭＤのイントロン５５に位置する第２の標的部位とハイブリダイズする、方法に関する。

本明細書中で使用される場合、「筋肉または筋肉前駆細胞」という語句は、発生のすべての段階におけるあらゆる分類の筋細胞を広く指す。したがって、「筋肉または筋肉前駆細胞」は、例えば、筋芽細胞などの未分化筋細胞、ならびに例えば、最終分化筋管などの分化筋細胞の両方を包含する。「筋肉または筋肉前駆細胞」はまた、横紋筋細胞（例えば、骨格筋細胞）、平滑筋細胞（例えば、腸筋細胞）、及び心筋細胞を含むが、これらに限定されないさまざまな組織学的タイプの筋細胞も包含する。いくつかの実施形態では、「筋肉または筋肉前駆細胞」は、骨格筋細胞または骨格筋前駆細胞である。いくつかの実施形態では、「筋肉または筋肉前駆細胞」は、骨格筋細胞、骨格筋前駆細胞、心筋細胞、または心筋前駆細胞である。

哺乳動物の細胞は、限定されない。いくつかの実施形態では、細胞は、霊長類、げっ歯類、家畜または狩猟動物の細胞である。霊長類としては、チンパンジー、カニクイザル、クモザル、及び例えば、アカゲザルなどのマカクが挙げられる。げっ歯類としては、マウス、ラット、ウッドチャック、フェレット、ウサギ及びハムスターが挙げられる。家畜及び狩猟動物としては、ウシ、ウマ、ブタ、シカ、バイソン、バッファロー、ネコ種、例えば、イエネコ、イヌ種、例えば、イヌ、キツネ、及びオオカミが挙げられる。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒトまたはイヌの細胞である。

いくつかの実施形態では、細胞は、幹細胞または人工多能性幹細胞である。いくつかの実施形態では、人工多能性幹細胞は、筋ジストロフィーの対象の細胞から誘導された人工多能性幹細胞である。いくつかの実施形態では、人工多能性幹細胞は、筋ジストロフィーを有し、ＤＭＤ遺伝子のイントロン４４からイントロン５５の間に位置する変異を有する対象の細胞から誘導される。いくつかの実施形態では、変異は、フレームシフト変異である。

Ｃａｓタンパク質は、限定されない。クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）ＩＩ型システムは、ゲノム操作のためのＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ技術として使用するために改変された細菌の獲得免疫システムである。細菌のシステムは、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡと呼ばれる２つの内在性細菌ＲＮＡならびにＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９を含む。ｔｒａｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡと部分的な相補性を有し、それと複合体を形成する。Ｃａｓタンパク質は、ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体によって標的配列に誘導され、これは標的内でｃｒＲＮＡ配列と相補配列との間にＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを形成する。ゲノム改変に使用するために、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ構成要素は、組み合わされて単一のキメラガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡまたはｇＲＮＡ）にされることが多く、その場合、ｃｒＲＮＡの標的特異性及びｔｒａｃｒＲＮＡの特性が組み合わされて、Ｃａｓタンパク質がＤＮＡを切断できるようにＣａｓタンパク質を標的配列に局在させる単一の転写物にされる。ｇＲＮＡは、多くの場合に所望の標的配列と相補的、またはそれと相同なおよそ２０ヌクレオチドのガイド配列に続いて、約８０ｎｔのハイブリッドｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡを含む。当業者は、ガイドＲＮＡが標的配列と完全に相補的または相同である必要はないことを理解する。例えば、いくつかの実施形態では、それは１つまたは２つのミスマッチを有する場合がある。ｇＲＮＡがハイブリダイズするゲノム配列には、通常、片側にプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列が隣接しているが、当業者は、ある特定のＣａｓタンパク質がＰＡＭ配列に対して緩やかな要件を有する場合があることを十分に理解する。ＰＡＭ配列はゲノムＤＮＡ中に存在するが、ｇＲＮＡ配列中には存在しない。Ｃａｓタンパク質は、正確な標的配列及びＰＡＭ配列を有する任意のＤＮＡ配列を対象とすることになる。ＰＡＭ配列は、Ｃａｓタンパク質が由来する細菌の種に応じて変化する。Ｃａｓタンパク質の具体例としては、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９及びＣａｓ１０が挙げられる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質を含む。例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ｓｐ）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ、またはＴｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ由来のＣａｓ９が使用されてもよい。これらのＣａｓ９タンパク質のＰＡＭ配列は、それぞれＮＧＧ、ＮＮＮＮＧＡＴＴ、ＮＮＡＧＡＡ、ＮＡＡＡＡＣである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ｓａＣａｓ９）に由来する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９は、単純なＮＮＧＧ ＰＡＭを認識し、ゲノム編集に高い活性を示し、ゲノム編集のためにＡＡＶにパッケージングされる程十分に小型である、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｉｃｕｌａｒｉｓ （ＳａｕｒｉＣａｓ９）由来の小さなＣａｓ９オルソログである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ（ＣｊＣａｓ９）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ Ｃａｓ９（ＮｍｅＣａｓ９）、Ｃａｓ１２ｂ（Ｓｔｒｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．２０１９ Ｊａｎ ２２；１０（１）：２１２を参照）、またはＣａｓＸ（Ｎａｔｕｒｅ．２０１９ Ｆｅｂ ４．ｐｉｉ：１０．１０３８／ｓ４１５８６－０１９－０９０８－ｘ．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５８６－０１９－０９０８－ｘを参照）である。

Ｃａｓタンパク質の操作されたバリアントが多数開発されており、ある特定の実施形態において使用されてもよい。例えば、Ｃａｓ９の操作されたバリアントは、当該技術分野において知られている。さらに、当然のことながら、生物学的に活性なフラグメントまたはバリアントが使用されてもよい。他の選択肢としては、ハイブリッド部位特異的ヌクレアーゼの使用が挙げられる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ誘導型ＦｏｋＩヌクレアーゼ（ＲＦＮ）では、ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインが、触媒的に不活性なＣａｓ９タンパク質（ｄＣａｓ９）タンパク質のアミノ末端に融合される。ＲＦＮは二量体として機能し、２つのガイドＲＮＡを利用する（Ｔｓａｉ，ＱＳ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１４；３２（６）：５６９－５７６）。一本鎖ＤＮＡ切断を生成する部位特異的ヌクレアーゼも、ゲノム編集に有用である。「ニッカーゼ」と呼ばれることもある、そのようなヌクレアーゼは、２つのヌクレアーゼドメインを含む部位特異的ヌクレアーゼ（ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、及びＣａｓタンパク質など）の２つのヌクレアーゼドメインのうちの１つの重要な触媒残基に変異（例えば、アラニン置換）を誘導することによって生成することができる。そのような変異の例としては、ＳｐＣａｓ９におけるまたは他のＣａｓ９タンパク質の相同な位置におけるＤ１０Ａ、Ｎ８６３Ａ、及びＨ８４０Ａが挙げられる。ニックは、一部の細胞型では低効率でＨＤＲを刺激し得る。互いに近く、反対の鎖上に存在する一対の配列を標的とする２つのニッカーゼは、各鎖上に一本鎖切断を作成して（「ダブルニッキング」）、ＤＳＢを効果的に生成し得、これは場合によりドナーＤＮＡ鋳型を使用してＨＤＲによって修復され得る（Ｒａｎ，Ｆ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １５４，１３８０－１３８９（２０１３））。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＳｐＣａｓ９バリアントである。いくつかの実施形態では、ＳｐＣａｓ９バリアントは、Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ三重バリアントまたはＮ４９７Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ四重バリアントである。参照によってその全体が本明細書に組み込まれるＫｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｈｉｇｈ－ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｗｉｔｈ ｎｏ ｄｅｔｅｃｔａｂｌｅ ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ｅｆｆｅｃｔｓ，”Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．５２９，ｐｐ．４９０－４９５（及び補足資料）（２０１６）を参照。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、クラス２タイプＶ－Ｂ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質のＣ２ｃ１である。参照によってその全体が本明細書に組み込まれるＹａｎｇ ｅｔ ａｌ．，“ＰＡＭ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｔａｒｇｅｔ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｌｅａｖａｇｅ ｂｙ Ｃ２ｃ１ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ，”Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．１６７，ｐｐ．１８１４－１８２８（２０１６）を参照。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、参照によって本明細書に組み込まれるＵＳ２０１６０３１９２６０「Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｗｉｔｈ Ａｌｔｅｒｅｄ ＰＡＭ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ」に記載されているものである。

いくつかの実施形態では、第１及び第２のｇＲＮＡの標的配列は、配列番号６及び配列番号７である。いくつかの実施形態では、第１及び第２のｇＲＮＡの標的配列は、配列番号８及び配列番号９である。いくつかの実施形態では、第１及び第２のｇＲＮＡは、本明細書に記載されている任意のｇＲＮＡ対またはｇＲＮＡ標的配列の対である。いくつかの実施形態では、第１及び第２のｇＲＮＡは、表１に示されるｇＲＮＡ標的配列の対を有する。

ＤＭＤ遺伝子は、限定されない。いくつかの実施形態では、ＤＭＤ遺伝子は、ヒトＤＭＤ遺伝子（Ｇｅｎｅ ＩＤ：１７５６）である。ジストロフィン（ＤＭＤ）遺伝子は、既知の最大の遺伝子である。ＤＭＤは、Ｘ染色体の２．２Ｍｂに及び、大部分は７９のエクソンから誘導される１４ｋｂの転写物をコードする。骨格筋、平滑筋、及び心筋細胞において発現される完全長型ジストロフィンタンパク質は、３６８５アミノ酸であり、４２７ｋＤの分子量を有する。重症のデュシェンヌ表現型は、一般に骨格筋及び心筋からの完全長型ジストロフィンタンパク質の喪失と関連し、これは、衰弱性筋変性及び、最終的に、心不全に至る。多くのさまざまなＤＭＤ変異が示されてきたが、それらの多くは、結果として重症のデュシェンヌ型筋ジストロフィーまたはそれより軽症のベッカー型筋ジストロフィーのいずれかをもたらす。Ｌｅｉｄｅｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒは、参照によって本明細書に組み込まれるＤＭＤ遺伝子の変異のデータベース（ｗｗｗ．ｄｍｄ．ｎｌ）を管理する。

いくつかの実施形態では、ゲノムの改変は、ＤＭＤのイントロン４４からイントロン５５の間のヌクレオチド配列の除去を含む。いくつかの実施形態では、改変されたゲノムは、配列番号５の配列を含み、図９に「ダッシュ」として示されるヌクレオチドは、存在しないか、または１～１０個の挿入アミノ酸を含む。

いくつかの実施形態では、本方法は、細胞を野生型ＤＭＤのエクソン４５から５５のヌクレオチド配列を含む鋳型ＤＮＡと接触させるステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、エクソン４５～５５のヌクレオチド配列は、配列番号２８と相同もしくは同一のヌクレオチド配列または配列番号２８と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、もしくは９９．９％相同なヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、鋳型配列は、配列番号１０もしくは１１と相同または同一のヌクレオチド配列またはその一部を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、鋳型配列は、配列番号１０、１１、もしくは２８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％以上相同または同一であるか、またはその一部である。いくつかの実施形態では、鋳型ＤＮＡは、野生型ＤＭＤのエクソン４５から５５のヌクレオチド配列と隣接する第１及び第２の標的部位の一部を含む。この態様で使用されるとおり、鋳型ＤＮＡは、標的配列内のＣａｓによる切断後の配列を含む。鋳型ＤＮＡの標的配列は、細胞のゲノムにおいてエクソン４５～５５のいずれかの側にある標的部位の位置とはインサートの反対側に位置していなければならない。それにより、鋳型からのゲノムＤＮＡへのエクソン４５～５５の正しい方向での挿入時に、標的部位が破壊されることになる。しかしながら、エクソン４５～５５が間違った方向に挿入された場合、標的部位は、再構成されることになり、ガイド配列とのハイブリダイゼーション時にＣａｓタンパク質によって再び切断され得る。例えば、図４を参照のこと。

いくつかの実施形態では、ゲノムの改変は、野生型ＤＭＤのエクソン４５から５５を含む鋳型ＤＮＡによるＤＭＤのイントロン４４からイントロン５５の間のヌクレオチド配列の置換を含む。いくつかの実施形態では、置換されたヌクレオチド配列は、配列番号２８または配列番号２８と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、もしくは９９．９％相同なヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ＤＭＤのイントロン４４からイントロン５５の間のヌクレオチド配列の置換は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）により生じる。非相同末端結合（ＮＨＥＪ）は、ＤＮＡの二本鎖切断を修復する経路である。修復をガイドする相同配列を必要とする相同組換え修復とは対照的に、相同鋳型を必要とせずに、切断末端が直接ライゲーションされるため、ＮＨＥＪは「非相同」とも呼ばれる。

いくつかの実施形態では、ＤＭＤのイントロン４４からイントロン５５の間に位置する哺乳動物の筋肉または筋肉前駆細胞のゲノムは、疾患または状態と関連する変異を含む。いくつかの実施形態では、疾患または状態は、筋ジストロフィーである。いくつかの実施形態では、筋ジストロフィーは、筋強直性筋ジストロフィー、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー、眼咽頭型筋ジストロフィー、遠位型筋ジストロフィー、及びエメリ・ドレフュス型筋ジストロフィーから選択される。いくつかの実施形態では、疾患または状態は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーである。

いくつかの実施形態では、細胞は、Ｃａｓタンパク質、第１のｇＲＮＡ、第２のｇＲＮＡ、及び／または鋳型ＤＮＡのうちの１つ以上を形質導入する１つ以上のウイルスと接触させられる。本明細書全体にわたって開示される方法での使用に好適なウイルスとしては、例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス（例えば、レンチウイルス）、ワクシニアウイルス及び他のポックスウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス）などが挙げられる。ウイルスは、宿主細胞に導入されたときに感染性ウイルスを産生するのに十分なウイルスの遺伝情報を含んでいても、または含んでいなくてもよい。すなわち、ウイルスベクターは、複製可能であっても、または複製欠損であってもよい。

いくつかの実施形態では、ウイルスは、アデノ随伴ウイルスである。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、小さな（２０ｎｍ）複製欠損非エンベロープウイルスである。ＡＡＶゲノムは、約４．７キロベース長の一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）である。ゲノムは、ＤＮＡ鎖の両端に逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）、ならびに２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）：ｒｅｐ及びｃａｐを含む。ＡＡＶゲノムは、１９番染色体上の特定の部位に最も頻繁に組み込まれる。ゲノム中へのランダムな組込みは、ごくわずかな頻度で生じる。組込み能力は、ベクターからｒｅｐ ＯＲＦの少なくとも一部を除去することによって排除される場合があり、結果としてエピソームの状態を保持し、少なくとも非分裂細胞中で持続的な発現を提供するベクターをもたらす。ＡＡＶを遺伝子導入ベクターとして使用するために、プロモーターに機能的に連結される、所望のタンパク質またはＲＮＡをコードする核酸配列、例えば、ＡＴＰＩＦ１を阻害するポリペプチドまたはＲＮＡをコードする核酸配列を含む核酸が、ＡＡＶゲノムの逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）間に挿入される。例えば、遺伝子治療のためのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）及びベクターとしてのその使用については、Ｓｎｙｄｅｒ，ＲＯ ａｎｄ Ｍｏｕｌｌｉｅｒ，Ｐ．，Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．８０７．Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，２０１１でも述べられている。

いくつかの実施形態では、ＡＡＶは、ＡＡＶ血清型６、８、９、１０またはＡｎｃ８０である（ＷＯ２０１５０５４６５３に開示され、参照によって本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ血清型は、ＡＡＶ血清型２である。任意のＡＡＶ血清型、または改変ＡＡＶ血清型が適宜使用されてよく、かつ限定されない。

別の好適なＡＡＶは、例えば、ｒｈｌＯであってよい［例えば、ＷＯ２００３／０４２３９７を参照のこと］。さらに他のＡＡＶ供給源としては、例えば、ＡＡＶ９［例えば、ＵＳ７，９０６，１１１、ＵＳ２０１１－０２３６３５３－Ａ１を参照のこと］、及び／またはｈｕ３７［例えば、ＵＳ７，９０６，１１１、ＵＳ２０１１－０２３６３５３－Ａ１を参照のこと］、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８［例えば、米国特許第７７９０４４９号、米国特許第７２８２１９９号を参照のこと］などが挙げられてよい。これらの及び他の好適なＡＡＶの配列に加えて、ＡＡＶベクターを生成する方法については、例えば、ＷＯ２００３／０４２３９７、ＷＯ２００５／０３３３２１、ＷＯ２００６／１１０６８９、米国特許第７７９０４４９号、米国特許第７２８２１９９号、及びＵＳ７５８８７７２Ｂ２を参照のこと。さらに他のＡＡＶが、場合により、選択されたＡＡＶカプシドの組織選択性を考慮に入れて選択されてよい。組換えＡＡＶベクター（ＡＡＶウイルス粒子）は、ＡＡＶカプシド内にパッケージングされた、５’ＡＡＶ ＩＴＲ、本明細書に記載される発現カセット及び３’ＡＡＶ ＩＴＲを含有する核酸分子を含んでよい。本明細書に記載されるように、発現カセットは、各発現カセット内にオープンリーディングフレーム（複数可）のための調節エレメントを含有してよく、核酸分子は、場合により追加の調節エレメントを含有してよい。

ＡＡＶベクターは、全長ＡＡＶ ５’逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）及び全長３’ＩＴＲを含有してよい。ＡＩＴＲと称される５’ＩＴＲの短縮型が記載されていて、それはＤ－配列及び末端分解部位（ｔｒｓ）が欠失している。「ｓｃ」という略語は、自己相補的であることを指す。「自己相補的ＡＡＶ」は、組換えＡＡＶ核酸配列が保有しているコード領域が、分子内二本鎖ＤＮＡ鋳型を形成するように設計されている構築物を指す。感染時、第２鎖の細胞媒介合成を待つのではなく、ｓｃＡＡＶの２つの相補的な半分が会合して、すぐに複製及び転写を行う準備ができている１本の二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）単位を形成することになる。例えば、Ｄ Ｍ ＭｃＣａｒｔｙ ｅｔ ａｌ，“Ｓｅｌｆ－ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ（ｓｃＡＡＶ） ｖｅｃｔｏｒｓ ｐｒｏｍｏｔｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｏｆ ＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，（Ａｕｇｕｓｔ ２００１），Ｖｏｌ ８，Ｎｕｍｂｅｒ １６，Ｐａｇｅｓ １２４８－１２５４を参照のこと。自己相補的ＡＡＶは、例えば、米国特許第６，５９６，５３５号、同第７，１２５，７１７号、及び同第７，４５６，６８３号に記載され、その各々の全体が参照によって本明細書に組み込まれる。

偽型ＡＡＶが産生される場合、ＩＴＲは、カプシドのＡＡＶ供給源とは異なる供給源から選択される。例えば、ＡＡＶ２ ＩＴＲは、選択された細胞受容体、標的組織またはウイルス標的に対して特定の効率を有するＡＡＶキャプシドと共に使用するために選択され得る。一実施形態では、ＡＡＶ２に由来するＩＴＲ配列、またはその欠失型（ＡＩＴＲ）が、便宜上、かつ規制当局の承認を早めるために使用される。しかしながら、他のＡＡＶ供給源に由来するＩＴＲが選択されてもよい。ＩＴＲの供給源がＡＡＶ２に由来し、ＡＡＶカプシドが別のＡＡＶ供給源に由来する場合、得られたベクターは偽型と称される場合がある。しかしながら、ＡＡＶ ＩＴＲの他の供給源が利用されてもよい。

一本鎖ＡＡＶウイルスベクターが使用されてよい。対象への送達に適したＡＡＶウイルスベクターを生成及び単離するための方法が当該技術分野において知られている。例えば、米国特許第７７９０４４９号；米国特許第７２８２１９９号；ＷＯ２００３／０４２３９７；ＷＯ２００５／０３３３２１、ＷＯ２００６／１１０６８９；及び米国特許第７５８８７７２Ｂ２号を参照のこと。１つのシステムでは、産生細胞株が、ＩＴＲに隣接する導入遺伝子をコードする構築物ならびにｒｅｐ及びｃａｐをコードする構築物（複数可）で一過性トランスフェクトされる。第２システムでは、ｒｅｐ及びｃａｐを安定して供給するパッケージング細胞株が、ＩＴＲに隣接する導入遺伝子をコードする構築物で（一過性または安定に）トランスフェクトされる。こうしたシステムのそれぞれにおいて、ＡＡＶビリオンは、ヘルパーアデノウイルスまたはヘルペスウイルスの感染に応じて産生され、混入ウイルスからｒＡＡＶを分離する必要がある。最近では、ＡＡＶを回復させるためにヘルパーウイルスの感染を必要としないシステムが開発され、必要とされるヘルパー機能（すなわち、アデノウイルスＥｌ、Ｅ２ａ、ＶＡ、及びＥ４またはヘルペスウイルスＵＬ５、ＵＬ８、ＵＬ５２、及びＵＬ２９、ならびにヘルペスウイルスポリメラーゼ）もトランスでシステムによって供給される。これらの新しいシステムでは、ヘルパー機能は、必要とされるヘルパー機能をコードする構築物による細胞の一過性トランスフェクションによって供給されてもよく、または細胞は、ヘルパー機能をコードする遺伝子を安定して含むよう操作することができ、その発現は、転写または転写後レベルで制御することができる。さらに別のシステムでは、ＩＴＲに隣接する導入遺伝子及びｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子は、バキュロウイルスベースのベクターの感染によって昆虫細胞に導入される。これらの産生システムに対する概説に関しては、一般に、例えば、それぞれの内容全体が参照によって本明細書に組み込まれるＺｈａｎｇ ｅｔ ａｌ，２００９，“Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ－ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｈｙｂｒｉｄ ｆｏｒ ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，”Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０：９２２－９２９を参照のこと。これら及びその他のＡＡＶ産生システムを作製及び使用する方法は、以下の米国特許にも記載されており、その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる：５，１３９，９４１；５，７４１，６８３；６，０５７，１５２；６，２０４，０５９；６，２６８，２１３；６，４９１，９０７；６，６６０，５１４；６，９５１，７５３；７，０９４，６０４；７，１７２，８９３；７，２０１，８９８；７，２２９，８２３；及び７，４３９，０６５。

別の実施形態では、導入ウイルス、例えば、ヘルペスウイルスまたはレンチウイルスを含む他のウイルスベクターが使用されてもよいが、その他のウイルスが選択されてもよい。好適には、これらの他のベクターのうち１つが生成される場合、それは複製欠損ウイルスベクターとして産生される。「複製欠損ウイルス」または「ウイルスベクター」とは、目的の遺伝子を含む発現カセットがウイルスキャプシドまたはエンベロープにパッケージングされた合成または人工のウイルス粒子を指し、ウイルスキャプシドまたはエンベロープ内にパッケージングもされる任意のウイルスゲノム配列は、複製欠損であり；すなわち、それらは、子孫ビリオンを生成し得ないが、標的細胞を感染させる能力を保持し得る。一実施形態において、ウイルスベクターのゲノムは、複製に必要な酵素をコードする遺伝子を含まない（このゲノムは、人工ゲノムの増幅及びパッケージングに必要なシグナルに隣接する目的の導入遺伝子のみを含む「ガットレス」であるように操作されてもよい）が、これらの遺伝子は生成中に供給されてもよい。

１つ以上のウイルスは、哺乳動物細胞において発現（例えば、Ｃａｓタンパク質、鋳型ＤＮＡ、及び／または１つ以上のｇＲＮＡの発現）を誘導することができる、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、レトロウイルス、サルウイルス（例えば、ＳＶ４０）、パピローマウイルス、ヘルペスウイルスもしくは哺乳動物細胞に感染するその他のウイルス由来の適したウイルスプロモーターなどのプロモーター、または例えば、遺伝子由来の、例えば、ＥＦ１アルファ、ユビキチン（例えば、ユビキチンＢまたはＣ）、グロビン、アクチン、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）などの哺乳動物プロモーター、あるいはＣＡＧプロモーター（ＣＭＶ早期エンハンサーエレメント及びニワトリベータアクチンプロモーターの組み合わせ）などの複合プロモーターを含んでもよい。いくつかの実施形態では、ヒトプロモーターが使用されてよい。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ＣＭＶプロモーター、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター、構成的プロモーター、及びユビキタスプロモーターから選択される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、特定の細胞型における発現を誘導する。例えば、筋前駆細胞特異的プロモーター。

本明細書に開示される各方法のいくつかの実施形態では、好適な組織特異的プロモーターは、ワールドワイドウェブのｔｉｐｒｏｄ．ｂｉｏｉｎｆ．ｍｅｄ．ｕｎｉ－ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ．ｄｅ／で利用可能な「ＴｉＰｒｏＤ：Ｔｉｓｓｕｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｄａｔａｂａｓｅ」に記載されている組織特異的プロモーターから当業者であれば得られ得る。

いくつかの実施形態では、細胞は、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を細胞に形質導入する第１のウイルスならびに第１のｇＲＮＡ、第２のｇＲＮＡ、及び鋳型ＤＮＡをコードする核酸を細胞に形質導入する第２のウイルスと接触させられる。いくつかの実施形態では、少なくとも第１のウイルスまたは第２のウイルスは、ＡＡＶウイルスである。いくつかの実施形態では、細胞は、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を細胞に形質導入する第１のウイルス及び配列番号２６（ＨＩＴＩ Ｂ）の核酸を形質導入する第２のウイルスと接触させられる。いくつかの実施形態では、細胞は、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を細胞に形質導入する第１のウイルス及び配列番号２７（ＨＩＴＩ Ｋ）の核酸を形質導入する第２のウイルスと接触させられる。

いくつかの実施形態では、改変されたゲノムで処理された細胞は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン４５から５５によってコードされるアミノ酸配列が欠如した機能的な切断型ジストロフィンを発現する。いくつかの実施形態では、改変されたゲノムで処理された細胞は、野生型ＤＭＤのエクソン４５から５５によってコードされるアミノ酸配列を含む完全長型ジストロフィンを発現する。いくつかの実施形態では、改変されたゲノムで処理された細胞は、配列番号２８または配列番号２８と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、もしくは９９．９％相同なヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む完全長型ジストロフィンを発現する。

いくつかの実施形態では、細胞は、インビトロで接触させられる。いくつかの実施形態では、細胞は、対象から得られ、エクスビボで接触させられる。いくつかの実施形態では、処理された細胞は、対象に投与される。いくつかの実施形態では、細胞は、インビボで接触させられる。いくつかの実施形態では、対象は、本明細書に記載されている１つ以上のウイルスを投与され、結果として細胞が本明細書に記載されているＣａｓ９、ｇＲＮＡ及び鋳型ＤＮＡと接触させられる。

イントロン４４からイントロン５５の間に位置する変異を有する筋ジストロフィー患者を処置する方法
本開示のいくつかの態様は、処置を必要とする対象において筋ジストロフィーを処置する方法であって、患者の筋肉または筋肉前駆細胞をＣａｓタンパク質ならびに第１及び第２のガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）と接触させ、それによって細胞のゲノムを改変することを含み、第１のｇＲＮＡは、ＤＭＤのイントロン４４に位置する第１の標的部位とハイブリダイズし、第２のｇＲＮＡは、ＤＭＤのイントロン５５に位置する第２の標的部位とハイブリダイズし、対象のゲノムは、ＤＭＤ遺伝子のイントロン４４からイントロン５５の間に位置する変異を含む、方法を対象とする。

いくつかの実施形態では、対象の筋肉または筋肉前駆細胞の少なくとも１％、２％、３％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％以上が、本明細書中で開示されている方法によって改変されたそのゲノムを有する。

本明細書で使用される場合、疾患、障害または病状（例えば、筋ジストロフィー）に関連して使用される場合の「処置する」、「処置」、「処置すること」、または「改善」は、状態の治療的処置を指し、目的は、症状または状態の進行または重症度を逆転、軽減、改善、阻害、鈍化または停止することである。「処置すること」という用語は、状態の少なくとも１つの有害作用または症状を減少または軽減させることを含む。１つ以上の症状または臨床マーカーが低減された場合、処置は、一般に「有効」である。あるいは、状態の進行が低減または停止された場合、処置は「有効」である。すなわち、「処置」は、症状またはマーカーの改善だけでなく、処置が行われない場合に予想される症状の進行または悪化の停止または少なくとも遅延も含む。有益なまたは所望の臨床結果としては、処置が行われない場合に予想されるものと比較した場合に、１つ以上の症状（複数可）の軽減、欠損程度の縮小、安定した（すなわち、悪化しない）状態が挙げられるが、これらに限定されない。

障害または疾患に対する所与の処置の有効性は、熟練した臨床医によって決定され得る。ただし、処置は、本明細書に記載される薬剤または組成物による処置後に、障害の徴候または症状のうちのいずれか１つまたはすべてが有益な様式で改変され、その他の臨床的に認められる症状が、例えば、少なくとも１０％改善または回復した場合に、用語が本明細書中で使用されるとおり「有効な処置」と見なされる。また、有効性は、個体が入院施設で評価されたとおりに悪化しないことまたは医療介入を必要としない（すなわち、疾患の進行が停止している）ことによっても測定され得る。これらの指標を測定する方法は当業者に既知であり、及び／または本明細書に記載されている。

筋ジストロフィーは限定されず、本明細書に記載されている任意の筋ジストロフィーであり得る。いくつかの実施形態では、筋ジストロフィーは、ベッカー型筋ジストロフィーまたはデュシェンヌ型筋ジストロフィーである。患者の筋肉または筋肉前駆細胞は限定されず、本明細書に記載されている任意の筋肉または筋肉前駆細胞であり得る。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト細胞またはイヌ細胞である。いくつかの実施形態では、「筋肉または筋肉前駆細胞」は、骨格筋細胞または骨格筋前駆細胞である。

Ｃａｓタンパク質は限定されず、本明細書に記載されている任意のＣａｓタンパク質であり得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９（例えば、ｓａＣａｓ９）である。ｇＲＮＡは限定されず、任意の適切なｇＲＮＡであり得る。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの標的配列は、配列番号６～９に示される標的配列から選択される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ対は、配列番号６～７または配列番号８～９に示される標的配列に結合する。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ対は、表１に示される標的配列に結合する。

いくつかの実施形態では、ゲノムの改変は、ＤＭＤのイントロン４４からイントロン５５の間のヌクレオチド配列の除去を含む。

いくつかの実施形態では、本方法は、細胞を野生型ＤＭＤのエクソン４５から５５のヌクレオチド配列を含む鋳型ＤＮＡと接触させることをさらに含む。いくつかの実施形態では、エクソン４５から５５のヌクレオチド配列は、配列番号２８を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、鋳型ＤＮＡは、野生型ＤＭＤのエクソン４５から５５のヌクレオチド配列と隣接する第１及び第２の標的部位の一部を含む。本明細書に記載されるとおり、標的部位は、対象のゲノムにおいて標的配列の位置とは野生型ＤＭＤのエクソン４５から５５のヌクレオチド配列の反対の末端に位置し得る。そのような構成は、置換エクソン配列の正しい挿入時には標的とする配列を喪失させるが、置換エクソン配列が正しい方向で挿入されない場合は、標的配列を再構成する（場合によって、Ｃａｓタンパク質による切断が続く）。

いくつかの実施形態では、ゲノムの改変は、野生型ＤＭＤのエクソン４５から５５を含む鋳型ＤＮＡによるＤＭＤのイントロン４４からイントロン５５の間のヌクレオチド配列の置換を含む。いくつかの実施形態では、ゲノムの改変は、配列番号１０または１１のヌクレオチド配列によるＤＭＤのイントロン４４からイントロン５５の間のヌクレオチド配列の置換を含む。いくつかの実施形態では、ＤＭＤのイントロン４４からイントロン５５の間のヌクレオチド配列の置換は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）により生じる。

いくつかの実施形態では、細胞は、Ｃａｓタンパク質、第１のｇＲＮＡ、第２のｇＲＮＡ、または鋳型ＤＮＡを形質導入する１つ以上のウイルスと接触させられる。ウイルスは限定されず、本明細書に記載されている任意のウイルスであり得る。いくつかの実施形態では、１つ以上のウイルスは、ＡＡＶウイルスである。いくつかの実施形態では、対象は、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を細胞に形質導入する第１のウイルスならびに第１のｇＲＮＡ、第２のｇＲＮＡ、及び鋳型ＤＮＡをコードする核酸を細胞に形質導入する第２のウイルスを投与される。いくつかの実施形態では、第２のウイルスは、配列番号２６または２７のヌクレオチド配列を形質導入する。

いくつかの実施形態では、改変されたゲノムを有する細胞は、野生型ＤＭＤのエクソン４５から５５によってコードされるアミノ酸配列が欠如した機能的な切断型ジストロフィンを発現する。いくつかの実施形態では、改変されたゲノムを有する細胞は、野生型ＤＭＤのエクソン４５から５５によってコードされるアミノ酸配列を含む完全長型ジストロフィンを発現する。いくつかの実施形態では、改変されたゲノムを有する細胞は、配列番号２８または配列番号２８と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、もしくは９９．９％相同なヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む完全長型ジストロフィンを発現する。

いくつかの実施形態では、細胞は、エクスビボ、またはインビボで接触させられる。本明細書で使用される場合、細胞を１つ以上のウイルスと「接触させること」は、対象の全身に（例えば、静脈内に）または局所的に（例えば、筋肉内注射）ウイルスを投与することを含み得る。あるいは、他の投与経路が選択されてよい（例えば、経口、吸入、鼻腔内、気管内、動脈内、眼内、静脈内、筋肉内、及び他の親経路）。接触方法は限定されず、当該技術分野において利用可能な任意の好適な方法であってよい。

いくつかの実施形態では、ウイルス組成物は、ヒト患者に対して約１．０×１０^９ＧＣ～約１．０×１０^１５ＧＣの範囲内（体重が７０ｋｇの平均的な対象を処置するために）、好ましくは１．０×１０^１２ＧＣ～１．０×１０^１４ＧＣである複製欠損ウイルスの量を含有するために投与単位で製剤化され得る。好ましくは、製剤中の複製欠損ウイルスの用量は、１．０×１０^９ＧＣ、５．０×１０^９ＧＣ、１．０×１０^１０ＧＣ、５．０×１０^１０ＧＣ、１．０×１０^１１ＧＣ、５．０×１０^１１ＧＣ、１．０×１０^１２ＧＣ、５．０×１０^１２ＧＣ、または１．０×１０^１３ＧＣ、５．０×１０^１３ＧＣ、１．０×１０^１４ＧＣ、５．０×１０^１４ＧＣ、または１．０×１０^１５ＧＣである。

筋ジストロフィーを処置するさらなる方法
本開示のいくつかの態様は、哺乳動物の筋肉または筋肉前駆細胞のゲノムを改変するための方法であって、細胞をＣａｓタンパク質ならびに第１及び第２のガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）と接触させ、それによって第１の標的部位と第２の標的部位との間に位置する哺乳動物の筋肉または筋肉前駆細胞のゲノムを改変することを含み、第１のｇＲＮＡは、ＤＭＤの第１のイントロンに位置する第１の標的部位とハイブリダイズし、第２のｇＲＮＡは、ＤＭＤの別のイントロンに位置する第２の標的部位とハイブリダイズする、方法を対象とする。

標的部位間に位置するＤＭＤエクソンは、限定されない。いくつかの実施形態では、標的部位間に位置するＤＭＤエクソンは、機能的なジストロフィンタンパク質（すなわち、機能的な切断型ジストロフィンタンパク質）を産生するために必須ではない。いくつかの実施形態では、ＤＭＤエクソン２３は、第１の標的部位と第２の標的部位との間に位置する。

いくつかの実施形態では、対象の筋肉または筋肉前駆細胞の少なくとも１％、２％、３％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％以上が、本明細書中で開示されている方法によって改変されたそのゲノムを有する。

筋ジストロフィーは限定されず、本明細書に記載されている任意の筋ジストロフィーであり得る。いくつかの実施形態では、筋ジストロフィーは、ベッカー型筋ジストロフィーまたはデュシェンヌ型筋ジストロフィーである。患者の筋肉または筋肉前駆細胞は限定されず、本明細書に記載されている任意の筋肉または筋肉前駆細胞であり得る。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。いくつかの実施形態では、「筋肉または筋肉前駆細胞」は、骨格筋細胞または骨格筋前駆細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、幹細胞または人工多能性幹細胞である。いくつかの実施形態では、人工多能性幹細胞は、対象の細胞から誘導される。

Ｃａｓタンパク質は限定されず、本明細書に記載されている任意のＣａｓタンパク質であり得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９（例えば、ｓａＣａｓ９、ｓｐＣａｓ９、ＳａｕｒｉＣａｓ９、ＫＫＨＣａｓ９）である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、単独または１から２つのｇＲＮＡを伴い適したウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ）にパッケージングされる程十分に小さい。ｇＲＮＡは限定されず、任意の適切なｇＲＮＡであり得る。

いくつかの実施形態では、本方法は、細胞を第１の標的部位と第２の標的部位との間に位置するＤＭＤエクソンのヌクレオチド配列を含む鋳型ＤＮＡと接触させることをさらに含む。いくつかの実施形態では、鋳型ＤＮＡは、第１の標的部位と第２の標的部位との間に位置するＤＭＤエクソンのヌクレオチド配列と隣接する第１及び第２の標的部位の一部を含む。本明細書に記載されるとおり、標的部位は、対象のゲノムにおいて標的配列の位置とはＤＭＤエクソンのヌクレオチド配列の反対の末端に位置し得る。そのような構成は、置換エクソン配列の正しい挿入時には標的とする配列を喪失させるが、置換エクソン配列が正しい方向で挿入されない場合は、標的配列を再構成する（場合によって、Ｃａｓタンパク質による切断が続く）。

いくつかの実施形態では、ゲノムの改変は、第１の標的部位と第２の標的部位との間に位置するＤＭＤエクソンのヌクレオチド配列を含む鋳型ＤＮＡによる第１の標的部位と第２の標的部位との間に位置するヌクレオチド配列の置換を含む。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列の鋳型配列による置換は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）により生じる。

いくつかの実施形態では、第１の標的部位と第２の標的部位との間に位置する細胞のゲノムは、疾患または状態と関連する変異を含む。疾患または状態は限定されず、本明細書に記載されている任意の疾患または状態であり得る。いくつかの実施形態では、疾患または状態は、筋ジストロフィーである。いくつかの実施形態では、疾患または状態は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーまたはベッカー型筋ジストロフィーである。

いくつかの実施形態では、細胞は、Ｃａｓタンパク質、第１のｇＲＮＡ、第２のｇＲＮＡ、または鋳型ＤＮＡを形質導入する１つ以上のウイルスと接触させられる。いくつかの実施形態では、細胞は、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を細胞に形質導入する第１のウイルスならびに第１のｇＲＮＡ、第２のｇＲＮＡ、及び鋳型ＤＮＡをコードする核酸を細胞に形質導入する第２のウイルスと接触させられる。ウイルスは限定されず、本明細書に記載されている任意のウイルスであり得る。いくつかの実施形態では、少なくとも第１のウイルスまたは第２のウイルスは、ＡＡＶウイルスである。

いくつかの実施形態では、改変されたゲノムを有する細胞は、１つ以上のＤＭＤエクソンによってコードされるアミノ酸配列が欠如した機能的な切断型ジストロフィンを発現する。いくつかの実施形態では、改変されたゲノムを有する細胞は、完全長型ジストロフィンを発現する。

いくつかの実施形態では、細胞は、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで接触させられる。

組成物
本開示のいくつかの態様は、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を細胞に形質導入する第１のウイルスならびに第１のｇＲＮＡ、第２のｇＲＮＡ、及び鋳型ＤＮＡをコードする核酸を細胞に形質導入する第２のウイルスを含む組成物であって、第１のｇＲＮＡは、ＤＭＤの第１のイントロンに位置する第１の標的部位とハイブリダイズし、第２のｇＲＮＡは、ＤＭＤの別のイントロンに位置する第２の標的部位とハイブリダイズし、鋳型ＤＮＡは、第１の標的部位と第２の標的部位との間に位置する１つ以上のＤＭＤエクソンをコードする、組成物に関する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、本明細書に記載されているＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）である。いくつかの実施形態では、第１のｇＲＮＡ、第２のｇＲＮＡ、及び鋳型ＤＮＡが本明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、第１のＡＡＶ及び第２のＡＡＶを含む組成物は、ＤＭＤのイントロン４４から５５の間に位置する対象のＤＭＤの配列をエクソン４５～５５をコードする配列で置換するために使用することができる。いくつかの実施形態では、ＤＭＤのイントロン４４から５５の間に位置する対象のＤＭＤの配列をエクソン４５～５５をコードする配列で置換する際に使用するための第１のＡＡＶ及び第２のＡＡＶが本明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、第１のＡＡＶ及び第２のＡＡＶを含む組成物は、ＤＭＤのイントロン２２と２３との間に位置する対象のＤＭＤの配列を、エクソン２３をコードする配列で置換するために使用することができる。

「減少させる」、「低減する」、「低減される」、「低減」、「減少」、及び「阻害する」という用語はすべて、本明細書では一般に、基準と比較して統計的に有意な量の減少を意味するよう使用される。ただし、誤解を避けるために、「低減する」、「低減」もしくは「減少させる」または「阻害する」は、一般に、基準レベルと比較して少なくとも１０％の減少を意味し、例えば、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％までの減少及び例えば、基準レベルと比較して所与の要素またはパラメーターの完全な不在を含む減少、あるいは所与の処置がない場合と比較して１０～９９％の間のあらゆる減少を含むことができる。

「増加した」、「増加する」または「増大させる」または「活性化する」という用語はすべて、本明細書では一般に、静的に有意な量の増加を意味するよう使用される。誤解を避けるために、「増加した」、「増加する」、「増大させる」、または「活性化する」という用語は、基準レベルと比較して少なくとも１０％の増加、例えば、少なくとも約２０％、もしくは少なくとも約３０％、もしくは少なくとも約４０％、もしくは少なくとも約５０％、もしくは少なくとも約６０％、もしくは少なくとも約７０％、もしくは少なくとも約８０％、もしくは少なくとも約９０％までの増加及び１００％の増加を含む増加もしくは基準レベルと比較して１０～１００％の間のあらゆる増加、あるいは少なくとも約２倍、もしくは少なくとも約３倍、もしくは少なくとも約４倍、もしくは少なくとも約５倍もしくは少なくとも約１０倍の増加、または基準レベルと比較して２倍から１０倍以上の間のあらゆる増加を意味する。

本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という用語は、組成物、方法、及び方法または組成物に不可欠な、それらの各々の構成成分（複数可）に関連して使用されるが、不可欠であろうとなかろうと、指定されていない要素を含むことについて制限されない。

「からなる」という用語は、本明細書に記載の組成物、方法、及びそれらのそれぞれの構成要素を指し、これらは、実施形態の説明に記載されていないいかなる要素も除く。

本明細書で使用される場合、「から本質的にからなる」という用語は、所与の実施形態に必要な要素を指す。用語は、その実施形態の基本的及び新規または機能的特徴（複数可）に実質的に影響を及ぼさない要素の存在を可能にする。

「統計学的に有意な」または「有意に」という用語は、統計的有意性を指し、一般に０．０５よりも大きい（関連する統計的検定によって算出される）「ｐ」値を意味する。当業者は、任意の特定の実験に関連する統計的検定が、分析されているデータの種類に依存することを容易に理解することになる。追加の定義は、以下で個々の節の本文中において提供される。

細胞生物学及び分子生物学の一般的な用語の定義は、Ｍｅｒｃｋ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓによって出版された“Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ”，１９ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００６（ＩＳＢＮ ０－９１１９１０－１９－０）；Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．によって出版されたＲｏｂｅｒｔＳ．Ｐｏｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９４（ＩＳＢＮ ０－６３２－０２１８２－９）；Ｅｌｓｅｖｉｅｒによって出版されたＴｈｅ ＥＬＩＳＡ ｇｕｉｄｅｂｏｏｋ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ １４９）ｂｙ Ｃｒｏｗｔｈｅｒ Ｊ．Ｒ．（２０００）；Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｂｙ Ｗｅｒｎｅｒ Ｌｕｔｔｍａｎｎ，２００６で見つけることができる。分子生物学の一般的な用語の定義は、Ｊｏｎｅｓ ＆ Ｂａｒｔｌｅｔｔ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇによって出版されたＢｅｎｊａｍｉｎ Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ Ｘ，２００９（ＩＳＢＮ－１０：０７６３７６６３２１）；ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．によって出版されたＫｅｎｄｒｅｗ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，１９９５（ＩＳＢＮ １－５６０８１－５６９－８）及びＣｕｎ－ｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２００９，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．でも見つけることができる。

別段の記載がない限り、本発明は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３ｅｄ．），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，ＵＳＡ（２００１）及びＤａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ（１９９５）に記載されているような、標準的な手順を使用して実施され、その両方とも、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。

本開示の実施形態の説明は、網羅的であること、または本開示を開示された正確な形式に限定することを意図するものではない。本開示の特定の実施形態、及びそれに対する例が、説明のために本明細書において記載されているが、関連分野の当業者が認識するであろうとおり、種々の等価な改変物が、本開示の範囲内において可能である。例えば、方法ステップまたは機能が所与の順序で提示されているが、代替的実施形態は、機能を異なる順序で行ってもよく、または機能は、実質的に同時に行われてもよい。本明細書において提供される本開示の教示は、適切であれば他の手順または方法に適用可能である。本明細書に記載されている各種実施形態は、さらなる実施形態を提供するために組み合わされてもよい。本開示の態様は、必要に応じて、上記の参考文献及び出願の組成物、機能及び概念を使用して、本開示のさらに別の実施形態を提供するために改変されてもよい。これら及びその他の変更が、詳細な説明に照らして、本開示に対して行われてもよい。

前述の実施形態のいずれかの特定の要素も、他の実施形態の要素に対して組み合わされても、または置換されてもよい。さらに、本開示の特定の実施形態に関連する利点が、これらの実施形態の文脈において記載されてきたが、他の実施形態もそのような利点を示すことがあり、本開示の範囲内にあるために、必ずしもすべての実施形態がそのような利点を示す必要はない。

特定されたすべての特許及び他の刊行物は、例えば、本発明と関連して使用され得る、かかる刊行物に記述される手順を記述及び開示する目的で参照することにより、明示的に本明細書に組み込まれる。これらの刊行物は、本出願の出願日以前の、それらの開示のためにのみ提供される。この点に関して、先行発明もしくは先行刊行物、または他の任意の理由により、発明者らがそのような開示に先行する権利がないことを認めるものと解釈されるべきではない。これらの文献の日付または内容に関する描写に関する記載の全ては、出願人に利用可能な情報に基づいているが、これらの文献の日付または内容の正確さについて認めるものではない。

当業者は、本発明が、目的を実行し、言及される目的及び利点、ならびにそれに固有のものを得るのによく適合していることを容易に理解する。本明細書中の説明及び例の詳細は、特定の実施形態を代表するものであり、例示的なものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。その中の改変及びその他の使用を、当業者は思いつくであろう。これらの改変は、本発明の趣旨の範囲内に含まれる。本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく、本明細書中で開示されている本発明にさまざまな置換及び改変が行われてもよいことは当業者に容易にわかるであろう。

冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、本明細書及び特許請求の範囲において本明細書中で使用される場合、明らかに反対のことが示されない限り、複数の指示対象を含むことが理解されるべきである。群の１つ以上の要素の間に「または」を含む請求項または明細書は、その反対が示されるか、または別途文脈から明白でない限り、１つ、２つ以上、またはすべての群要素が、所与の製品または過程において存在するか、用いられるか、または別途関連している場合に、満たされると考えられる。本発明は、群の正確に１つの要素が、所与の製品または過程において存在するか、用いられるか、または別途関連している実施形態を含む。本発明はまた、２つ以上、またはすべての群要素が、所与の製品または過程において存在するか、用いられるか、または別途関連している実施形態も含む。さらに、別に指示がある場合を除いてまたは不一致もしくは矛盾が生じるであろうことが当業者には明白である場合を除いて、本発明が、１つ以上の挙げられた請求項の１つ以上の限定、要素、条項、記述用語などが同じ基本請求項（または、関連する場合、任意の他の請求項）に従属する別の請求項に組み込まれるすべての変形物、組み合わせ、及び置換物を提供することが理解されるべきである。本明細書に記載されているすべての実施形態は、適切な場合には、本発明のすべての異なる態様に適用可能であることが想定される。適切な場合はいつでも、任意の実施形態または態様を１つ以上の他のそのような実施形態または態様と自由に組み合わせることができることも想定される。要素が、一覧として、例えば、マーカッシュ群または同様の形式で提示される場合、要素の各サブグループも開示され、任意の要素（複数可）が群から削除され得ることが理解されるべきである。一般に、本発明または本発明の態様が、特定の要素、特徴等を含むように言及される場合、本発明の特定の実施形態または本発明の態様は、そのような要素、特徴等からなる、またはそれらから本質的になることを理解するべきである。簡略化するために、これらの実施形態は、本明細書において、いかなる場合でも、非常に多くの言葉で具体的に記載されている訳ではない。特定の除外が本明細書に列挙されているかどうかにかかわらず、本発明の任意の実施形態または態様が、特許請求の範囲から明示的に除外され得ることも理解されるべきである。例えば、任意の１つ以上の活性剤、添加剤、成分、任意の薬剤、生物の種類、障害、対象、またはそれらの組合せが除外され得る。

請求項または明細書が物質の組成物に関する場合、別に指示がある場合を除いてまたは不一致もしくは矛盾が生じるであろうことが当業者には明白である場合を除いて、本明細書中で開示されている方法のいずれかに従って物質の組成物を生成または使用する方法、及び本明細書中で開示されている目的のいずれかのために物質の組成物を使用する方法が本発明の態様であることが理解されるべきである。請求項または明細書が方法に関する場合、例えば、別に指示がある場合を除いて、または矛盾もしくは不一致が生じることになると当業者に明らかでない限り、方法の実施に有用な組成物を作製する方法、及び方法に従って生成された製品が本発明の態様であると理解されるべきである。

本明細書中で範囲が示される場合、本発明は、エンドポイントが含まれる実施形態、両エンドポイントが除外される実施形態、及び一方のエンドポイントが含まれ、他方が除外される実施形態を含む。別に指示がある場合を除いて、両エンドポイントが含まれていると想定されるべきである。さらに、別に指示がある場合を除いて、または別途文脈及び当業者の理解から明白でない限り、範囲として表される値は、文脈が別途明確に指示しない限り、範囲の下限の単位の１０分の１まで、本発明の異なる実施形態の明記された範囲内の任意の特定の値または部分範囲をとることができることが理解されるべきである。一連の数値が本明細書中で明記される場合、本発明が、一連の値の中の任意の２つの値によって定義される任意の間にある値または範囲と類似して関連する実施形態を含むこと、最低値が最小とされてもよく、最大値が最大とされてもよいことも理解されるべきである。数値は、本明細書中で使用される場合、パーセンテージとして表される値を含む。数値の前に「約」または「およそ」が付いている本発明の任意の実施形態に関して、本発明は、厳密な値が列挙される実施形態を含む。数値の前に「約」または「およそ」が付いていない本発明の任意の実施形態に関して、本発明は、値の前に「約」または「およそ」が付いている実施形態を含む。

「およそ」または「約」は、別に明記されない、または別に文脈から明白でない限り（そのような数値が可能な値の１００％を許容されないほど上回る場合を除いて）、一般に１％の範囲内、またはいくつかの実施形態では、数値の５％の範囲内、またはいくつかの実施形態では、いずれかの（数値より大きいか、または小さい）方向に数値の１０％の範囲内にある数を含む。明確に反対のことが示されていない限り、２つ以上の行為を含む本明細書中で特許請求されるいずれかの方法において、方法の行為の順序は、必ずしも方法の行為が列挙されている順序に限定されず、本発明は、順序がそのように限定されない実施形態を含むことが理解されるべきである。別に指示がある場合を除いて、または文脈から明らかでない限り、本明細書に記載される任意の製品または組成物が、「単離されている」と見なされる場合があることも理解されるべきである。

実施例１
ヒトＤＭＤ遺伝子のイントロン４４またはイントロン５５内の別々の領域を標的とする１６の候補Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）適合ｇＲＮＡペアが同定された。次に、コンビナトリアルアプローチを用いて、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における切断効率をテストした。具体的には、ＳａＣａｓ９とｇＲＮＡで細胞をトランスフェクションし、トランスフェクション後５日目にトランスフェクションした細胞からＤＮＡを抽出した。各ｇＲＮＡペアについて、最遠位切断部位の上流と下流のプライマーを設計し、各ｇＲＮＡが効率的に切断し、非相同末端接合（ＮＨＥＪ）が２つの接合部をライゲートした場合にのみＰＣＲで増幅する、イントロン４４と５５の接合部をＰＣＲ増幅させるために使用した。増幅された産物はアガロースゲル上で実行され、期待されるサイズにスクリーニングされた。ガイドペア「Ｂ」及び「Ｋ」は、予想されるサイズ及びバンド強度に基づいて、最も効率的であると同定された（図１０）。

ダブル切断－置換方法を用いてエクソン４５～５５をゲノムレベルで置換できるかどうかを試験するために、エクソン４５～５５の正しいコーディング配列と、どちらかの端部上で隣接するイントロン配列の約２００ｂｐとをそれぞれ含む２つの鋳型を設計した。各鋳型はまた、逆方向のガイドペア（すなわち、エクソン４５に近接するイントロン５５ｇＲＮＡのリバース、及びエクソン５５に近接するイントロン４４ｇＲＮＡのリバース）の１つによって隣接された。例えば、ＡＡＶ－ｇＲＮＡ－ＨＩＴＩ－Ｄｍｄ鋳型の青色領域とｍｄｘゲノムの青色領域におけるｇＲＮＡ１切断部位、及び鋳型とｍｄｘゲノムの黄色領域におけるｇＲＮＡ２の切断部位を示す図２を参照。

ＮＨＥＪによる鋳型が、ゲノム切断部位間に正確に挿入され得ることを確認するために、各ガイドペアを、対応するＤＮＡ鋳型と共に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に別々にトランスフェクトし、トランスフェクション後５日目にＤＮＡを採取した。鋳型の正確な挿入を検出するために、鋳型上のゲノムイントロン４４とエクソン４５の間の接合、及び鋳型上のエクソン５５とゲノムイントロン５５の間の接合の存在についてのＰＣＲを実施した。さらに、鋳型挿入のないイントロン－イントロン接合についても、この可能性が治療的であることから、アッセイした。

鋳型上のエクソン５５とイントロン５５との間の接合部について増幅を続けると、両ガイドペアについて予想されるサイズのバンドが認められた（図１１）だけでなく、イントロン－イントロン接合部についても両ガイドペアについて鋳型がない場合、予想されるサイズのバンドが認められた（図１２）。ライゲーションイベントの頻度を定量し、インデルをスクリーニングするために、鋳型上のイントロン４４とエクソン４５の間の接合部でディープアンプリコンシーケンスを行った（図１３）。興味深いことに、２つのガイドペア（「Ｂ」３７％、「Ｋ」８３％）の間で－１または完全なライゲーションの効率における差異が検出された。これは、マイクロホモロジー効果によるか、またはガイドペア「Ｂ」がより多くのオフターゲット部位を有するためだろう。

これらの実験に続き、このシステムとその効果をさらに特徴づけるためのフォローアップ実験を実行した。補正後のＲＮＡ及びタンパク質産生を正確に定量するために、ジストロフィンの喪失をもたらすエクソン４５から５５のスパン内の変異を含むヒトＤＭＤ筋芽細胞との以前のトランスフェクションを繰り返す。この実験により、ＤＮＡレベルの編集がジストロフィンのＲＮＡ及びタンパク質産生の救済につながるかどうかを検出することが可能である。次のステップは、ヒトの異種移植モデルを用いたインビボへの移行であり、ヒトの筋肉をマウスに移植し、上記のゲノム編集機構を搭載したＡＡＶベクターをマウスに全身投与し、ヒトの筋肉に遺伝子導入することが可能である。

配列

ｇＲＮＡ及び鋳型配列

ＨＩＴＩ Ｂ ｇＲＮＡの標的配列：ＣＴＡＡＧＧＡＡＡＧＡＡＣＴＴＣＡＣＡＡ（配列番号６）及びＴＴＧＴＧＡＡＧＴＴＣＴＴＴＣＣＴＴＡＧ（配列番号７）（すなわち、ｇＲＮＡペア「Ｂ」）

ＨＩＴＩ Ｋ ｇＲＮＡ：ＣＴＧＣＣＴＧＴＣＴＣＣＣＡＧＴＣＡＡＡ（配列番号８）及びＡＴＴＴＴＧＣＴＡＣＡＴＡＴＴＴＣＡＧＧ（配列番号９）（すなわち、ｇＲＮＡペア「Ｋ」）

ＨＩＴＩ Ｂ鋳型（配列番号１０）：ＡＣＴＣＧＧＡＴＧＴＴＴＡＡＣＴＧＡＣＴＴＧＣＣＴＡＣＡＴＧＴＣＡＧＴＴＴＣＡＴＡＧＧＧＡＡＡＴＴＴＴＣＡＣＡＴＧＧＡＧＣＴＴＴＴＧＴＡＴＴＴＣＴＴＴＣＴＴＴＧＣＣＡＧＴＡＣＡＡＣＴＧＣＡＴＧＴＧＧＴＡＧＣＡＣＡＣＴＧＴＴＴＡＡＴＣＴＴＴＴＣＴＣＡＡＡＴＡＡＡＡＡＧＡＣＡＴＧＧＧＧＣＴＴＣＡＴＴＴＴＴＧＴＴＴＴＧＣＣＴＴＴＴＴＧＧＴＡＴＣＴＴＡＣＡＧＧＡＡＣＴＣＣＡＧＧＡＴＧＧＣＡＴＴＧＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＡＡＣＴＧＴＴＧＴＣＡＧＡＡＣＡＴＴＧＡＡＴＧＣＡＡＣＴＧＧＧＧＡＡＧＡＡＡＴＡＡＴＴＣＡＧＣＡＡＴＣＣＴＣＡＡＡＡＡＣＡＧＡＴＧＣＣＡＧＴＡＴＴＣＴＡＣＡＧＧＡＡＡＡＡＴＴＧＧＧＡＡＧＣＣＴＧＡＡＴＣＴＧＣＧＧＴＧＧＣＡＧＧＡＧＧＴＣＴＧＣＡＡＡＣＡＧＣＴＧＴＣＡＧＡＣＡＧＡＡＡＡＡＡＧＡＧＧＣＴＡＧＡＡＧＡＡＣＡＡＡＡＧＡＡＴＡＴＣＴＴＧＴＣＡＧＡＡＴＴＴＣＡＡＡＧＡＧＡＴＴＴＡＡＡＴＧＡＡＴＴＴＧＴＴＴＴＡＴＧＧＴＴＧＧＡＧＧＡＡＧＣＡＧＡＴＡＡＣＡＴＴＧＣＴＡＧＴＡＴＣＣＣＡＣＴＴＧＡＡＣＣＴＧＧＡＡＡＡＧＡＧＣＡＧＣＡＡＣＴＡＡＡＡＧＡＡＡＡＧＣＴＴＧＡＧＣＡＡＧＴＣＡＡＧＴＴＡＣＴＧＧＴＧＧＡＡＧＡＧＴＴＧＣＣＣＣＴＧＣＧＣＣＡＧＧＧＡＡＴＴＣＴＣＡＡＡＣＡＡＴＴＡＡＡＴＧＡＡＡＣＴＧＧＡＧＧＡＣＣＣＧＴＧＣＴＴＧＴＡＡＧＴＧＣＴＣＣＣＡＴＡＡＧＣＣＣＡＧＡＡＧＡＧＣＡＡＧＡＴＡＡＡＣＴＴＧＡＡＡＡＴＡＡＧＣＴＣＡＡＧＣＡＧＡＣＡＡＡＴＣＴＣＣＡＧＴＧＧＡＴＡＡＡＧＧＴＴＴＣＣＡＧＡＧＣＴＴＴＡＣＣＴＧＡＧＡＡＡＣＡＡＧＧＡＧＡＡＡＴＴＧＡＡＧＣＴＣＡＡＡＴＡＡＡＡＧＡＣＣＴＴＧＧＧＣＡＧＣＴＴＧＡＡＡＡＡＡＡＧＣＴＴＧＡＡＧＡＣＣＴＴＧＡＡＧＡＧＣＡＧＴＴＡＡＡＴＣＡＴＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＧＧＴＴＡＴＣＴＣＣＴＡＴＴＡＧＧＡＡＴＣＡＧＴＴＧＧＡＡＡＴＴＴＡＴＡＡＣＣＡＡＣＣＡＡＡＣＣＡＡＧＡＡＧＧＡＣＣＡＴＴＴＧＡＣＧＴＴＡＡＧＧＡＡＡＣＴＧＡＡＡＴＡＧＣＡＧＴＴＣＡＡＧＣＴＡＡＡＣＡＡＣＣＧＧＡＴＧＴＧＧＡＡＧＡＧＡＴＴＴＴＧＴＣＴＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＡＴＴＴＧＴＡＣＡＡＧＧＡＡＡＡＡＣＣＡＧＣＣＡＣＴＣＡＧＣＣＡＧＴＧＡＡＧＡＧＧＡＡＧＴＴＡＧＡＡＧＡＴＣＴＧＡＧＣＴＣＴＧＡＧＴＧＧＡＡＧＧＣＧＧＴＡＡＡＣＣＧＴＴＴＡＣＴＴＣＡＡＧＡＧＣＴＧＡＧＧＧＣＡＡＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＡＧＣＴＣＣＴＧＧＡＣＴＧＡＣＣＡＣＴＡＴＴＧＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＴＡＣＴＣＡＧＡＣＴＧＴＴＡＣＴＣＴＧＧＴＧＡＣＡＣＡＡＣＣＴＧＴＧＧＴＴＡＣＴＡＡＧＧＡＡＡＣＴＧＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＣＴＡＧＡＡＡＴＧＣＣＡＴＣＴＴＣＣＴＴＧＡＴＧＴＴＧＧＡＧＧＴＡＣＣＴＧＣＴＣＴＧＧＣＡＧＡＴＴＴＣＡＡＣＣＧＧＧＣＴＴＧＧＡＣＡＧＡＡＣＴＴＡＣＣＧＡＣＴＧＧＣＴＴＴＣＴＣＴＧＣＴＴＧＡＴＣＡＡＧＴＴＡＴＡＡＡＡＴＣＡＣＡＧＡＧＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＧＧＴＧＡＣＣＴＴＧＡＧＧＡＴＡＴＣＡＡＣＧＡＧＡＴＧＡＴＣＡＴＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＧＣＡＡＣＡＡＴＧＣＡＧＧＡＴＴＴＧＧＡＡＣＡＧＡＧＧＣＧＴＣＣＣＣＡＧＴＴＧＧＡＡＧＡＡＣＴＣＡＴＴＡＣＣＧＣＴＧＣＣＣＡＡＡＡＴＴＴＧＡＡＡＡＡＣＡＡＧＡＣＣＡＧＣＡＡＴＣＡＡＧＡＧＧＣＴＡＧＡＡＣＡＡＴＣＡＴＴＡＣＧＧＡＴＣＧＡＡＴＴＧＡＡＡＧＡＡＴＴＣＡＧＡＡＴＣＡＧＴＧＧＧＡＴＧＡＡＧＴＡＣＡＡＧＡＡＣＡＣＣＴＴＣＡＧＡＡＣＣＧＧＡＧＧＣＡＡＣＡＧＴＴＧＡＡＴＧＡＡＡＴＧＴＴＡＡＡＧＧＡＴＴＣＡＡＣＡＣＡＡＴＧＧＣＴＧＧＡＡＧＣＴＡＡＧＧＡＡＧＡＡＧＣＴＧＡＧＣＡＧＧＴＣＴＴＡＧＧＡＣＡＧＧＣＣＡＧＡＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＡＧＴＣＡＴＧＧＡＡＧＧＡＧＧＧＴＣＣＣＴＡＴＡＣＡＧＴＡＧＡＴＧＣＡＡＴＣＣＡＡＡＡＧＡＡＡＡＴＣＡＣＡＧＡＡＡＣＣＡＡＧＣＡＧＴＴＧＧＣＣＡＡＡＧＡＣＣＴＣＣＧＣＣＡＧＴＧＧＣＡＧＡＣＡＡＡＴＧＴＡＧＡＴＧＴＧＧＣＡＡＡＴＧＡＣＴＴＧＧＣＣＣＴＧＡＡＡＣＴＴＣＴＣＣＧＧＧＡＴＴＡＴＴＣＴＧＣＡＧＡＴＧＡＴＡＣＣＡＧＡＡＡＡＧＴＣＣＡＣＡＴＧＡＴＡＡＣＡＧＡＧＡＡＴＡＴＣＡＡＴＧＣＣＴＣＴＴＧＧＡＧＡＡＧＣＡＴＴＣＡＴＡＡＡＡＧＧＧＴＧＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＡＧＧＣＴＧＣＴＴＴＧＧＡＡＧＡＡＡＣＴＣＡＴＡＧＡＴＴＡＣＴＧＣＡＡＣＡＧＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＡＣＣＴＧＧＡＡＡＡＧＴＴＴＣＴＴＧＣＣＴＧＧＣＴＴＡＣＡＧＡＡＧＣＴＧＡＡＡＣＡＡＣＴＧＣＣＡＡＴＧＴＣＣＴＡＣＡＧＧＡＴＧＣＴＡＣＣＣＧＴＡＡＧＧＡＡＡＧＧＣＴＣＣＴＡＧＡＡＧＡＣＴＣＣＡＡＧＧＧＡＧＴＡＡＡＡＧＡＧＣＴＧＡＴＧＡＡＡＣＡＡＴＧＧＣＡＡＧＴＡＡＧＴＣＡＧＧＣＡＴＴＴＣＣＧＣＴＴＴＡＧＣＡＣＴＣＴＴＧＴＧＧＡＴＣＣＡＡＴＴＧＡＡＣＡＡＴＴＣＴＣＡＧＣＡＴＴＴＧＴＡＣＴＴＧＴＡＡＣＴＧＡＣＡＡＧＣＣＡＧＧＧＡＣＡＡＡＡＣＡＡＡＡＴＡＧＴＴＧＣＴＴＴＴＡＴＡＣＡＧＣＣＴＧＡＴＧＴＡＴＴＴＣＧＧＴＡＴＴＴＧＧＡＣＡＡＧＧＡＧＧＡＧＡＧＡＧＣＴＡＡＧＧＡＡＡＧＡＡＣＴＴＣＡＣＡＡＡＡＧＡＡＴ

ＨＩＴＩ Ｋ鋳型（配列番号１１）：ＧＡＡＣＴＣＣＡＧＧＡＴＧＧＣＡＴＴＧＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＡＡＣＴＧＴＴＧＴＣＡＧＡＡＣＡＴＴＧＡＡＴＧＣＡＡＣＴＧＧＧＧＡＡＧＡＡＡＴＡＡＴＴＣＡＧＣＡＡＴＣＣＴＣＡＡＡＡＡＣＡＧＡＴＧＣＣＡＧＴＡＴＴＣＴＡＣＡＧＧＡＡＡＡＡＴＴＧＧＧＡＡＧＣＣＴＧＡＡＴＣＴＧＣＧＧＴＧＧＣＡＧＧＡＧＧＴＣＴＧＣＡＡＡＣＡＧＣＴＧＴＣＡＧＡＣＡＧＡＡＡＡＡＡＧＡＧＧＣＴＡＧＡＡＧＡＡＣＡＡＡＡＧＡＡＴＡＴＣＴＴＧＴＣＡＧＡＡＴＴＴＣＡＡＡＧＡＧＡＴＴＴＡＡＡＴＧＡＡＴＴＴＧＴＴＴＴＡＴＧＧＴＴＧＧＡＧＧＡＡＧＣＡＧＡＴＡＡＣＡＴＴＧＣＴＡＧＴＡＴＣＣＣＡＣＴＴＧＡＡＣＣＴＧＧＡＡＡＡＧＡＧＣＡＧＣＡＡＣＴＡＡＡＡＧＡＡＡＡＧＣＴＴＧＡＧＣＡＡＧＴＣＡＡＧＴＴＡＣＴＧＧＴＧＧＡＡＧＡＧＴＴＧＣＣＣＣＴＧＣＧＣＣＡＧＧＧＡＡＴＴＣＴＣＡＡＡＣＡＡＴＴＡＡＡＴＧＡＡＡＣＴＧＧＡＧＧＡＣＣＣＧＴＧＣＴＴＧＴＡＡＧＴＧＣＴＣＣＣＡＴＡＡＧＣＣＣＡＧＡＡＧＡＧＣＡＡＧＡＴＡＡＡＣＴＴＧＡＡＡＡＴＡＡＧＣＴＣＡＡＧＣＡＧＡＣＡＡＡＴＣＴＣＣＡＧＴＧＧＡＴＡＡＡＧＧＴＴＴＣＣＡＧＡＧＣＴＴＴＡＣＣＴＧＡＧＡＡＡＣＡＡＧＧＡＧＡＡＡＴＴＧＡＡＧＣＴＣＡＡＡＴＡＡＡＡＧＡＣＣＴＴＧＧＧＣＡＧＣＴＴＧＡＡＡＡＡＡＡＧＣＴＴＧＡＡＧＡＣＣＴＴＧＡＡＧＡＧＣＡＧＴＴＡＡＡＴＣＡＴＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＧＧＴＴＡＴＣＴＣＣＴＡＴＴＡＧＧＡＡＴＣＡＧＴＴＧＧＡＡＡＴＴＴＡＴＡＡＣＣＡＡＣＣＡＡＡＣＣＡＡＧＡＡＧＧＡＣＣＡＴＴＴＧＡＣＧＴＴＡＡＧＧＡＡＡＣＴＧＡＡＡＴＡＧＣＡＧＴＴＣＡＡＧＣＴＡＡＡＣＡＡＣＣＧＧＡＴＧＴＧＧＡＡＧＡＧＡＴＴＴＴＧＴＣＴＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＡＴＴＴＧＴＡＣＡＡＧＧＡＡＡＡＡＣＣＡＧＣＣＡＣＴＣＡＧＣＣＡＧＴＧＡＡＧＡＧＧＡＡＧＴＴＡＧＡＡＧＡＴＣＴＧＡＧＣＴＣＴＧＡＧＴＧＧＡＡＧＧＣＧＧＴＡＡＡＣＣＧＴＴＴＡＣＴＴＣＡＡＧＡＧＣＴＧＡＧＧＧＣＡＡＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＡＧＣＴＣＣＴＧＧＡＣＴＧＡＣＣＡＣＴＡＴＴＧＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＴＡＣＴＣＡＧＡＣＴＧＴＴＡＣＴＣＴＧＧＴＧＡＣＡＣＡＡＣＣＴＧＴＧＧＴＴＡＣＴＡＡＧＧＡＡＡＣＴＧＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＣＴＡＧＡＡＡＴＧＣＣＡＴＣＴＴＣＣＴＴＧＡＴＧＴＴＧＧＡＧＧＴＡＣＣＴＧＣＴＣＴＧＧＣＡＧＡＴＴＴＣＡＡＣＣＧＧＧＣＴＴＧＧＡＣＡＧＡＡＣＴＴＡＣＣＧＡＣＴＧＧＣＴＴＴＣＴＣＴＧＣＴＴＧＡＴＣＡＡＧＴＴＡＴＡＡＡＡＴＣＡＣＡＧＡＧＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＧＧＴＧＡＣＣＴＴＧＡＧＧＡＴＡＴＣＡＡＣＧＡＧＡＴＧＡＴＣＡＴＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＧＣＡＡＣＡＡＴＧＣＡＧＧＡＴＴＴＧＧＡＡＣＡＧＡＧＧＣＧＴＣＣＣＣＡＧＴＴＧＧＡＡＧＡＡＣＴＣＡＴＴＡＣＣＧＣＴＧＣＣＣＡＡＡＡＴＴＴＧＡＡＡＡＡＣＡＡＧＡＣＣＡＧＣＡＡＴＣＡＡＧＡＧＧＣＴＡＧＡＡＣＡＡＴＣＡＴＴＡＣＧＧＡＴＣＧＡＡＴＴＧＡＡＡＧＡＡＴＴＣＡＧＡＡＴＣＡＧＴＧＧＧＡＴＧＡＡＧＴＡＣＡＡＧＡＡＣＡＣＣＴＴＣＡＧＡＡＣＣＧＧＡＧＧＣＡＡＣＡＧＴＴＧＡＡＴＧＡＡＡＴＧＴＴＡＡＡＧＧＡＴＴＣＡＡＣＡＣＡＡＴＧＧＣＴＧＧＡＡＧＣＴＡＡＧＧＡＡＧＡＡＧＣＴＧＡＧＣＡＧＧＴＣＴＴＡＧＧＡＣＡＧＧＣＣＡＧＡＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＡＧＴＣＡＴＧＧＡＡＧＧＡＧＧＧＴＣＣＣＴＡＴＡＣＡＧＴＡＧＡＴＧＣＡＡＴＣＣＡＡＡＡＧＡＡＡＡＴＣＡＣＡＧＡＡＡＣＣＡＡＧＣＡＧＴＴＧＧＣＣＡＡＡＧＡＣＣＴＣＣＧＣＣＡＧＴＧＧＣＡＧＡＣＡＡＡＴＧＴＡＧＡＴＧＴＧＧＣＡＡＡＴＧＡＣＴＴＧＧＣＣＣＴＧＡＡＡＣＴＴＣＴＣＣＧＧＧＡＴＴＡＴＴＣＴＧＣＡＧＡＴＧＡＴＡＣＣＡＧＡＡＡＡＧＴＣＣＡＣＡＴＧＡＴＡＡＣＡＧＡＧＡＡＴＡＴＣＡＡＴＧＣＣＴＣＴＴＧＧＡＧＡＡＧＣＡＴＴＣＡＴＡＡＡＡＧＧＧＴＧＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＡＧＧＣＴＧＣＴＴＴＧＧＡＡＧＡＡＡＣＴＣＡＴＡＧＡＴＴＡＣＴＧＣＡＡＣＡＧＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＡＣＣＴＧＧＡＡＡＡＧＴＴＴＣＴＴＧＣＣＴＧＧＣＴＴＡＣＡＧＡＡＧＣＴＧＡＡＡＣＡＡＣＴＧＣＣＡＡＴＧＴＣＣＴＡＣＡＧＧＡＴＧＣＴＡＣＣＣＧＴＡＡＧＧＡＡＡＧＧＣＴＣＣＴＡＧＡＡＧＡＣＴＣＣＡＡＧＧＧＡＧＴＡＡＡＡＧＡＧＣＴＧＡＴＧＡＡＡＣＡＡＴＧＧＣＡＡＧＴＡＡＧＴＣＡＧＧＣＡＴＴＴＣＣＧＣＴＴＴＡＧＣＡＣＴＣＴＴＧＴＧＧＡＴＣＣＡＡＴＴＧＡＡＣＡＡＴＴＣＴＣＡＧＣＡＴＴＴＧＴＡＣＴＴＧＴＡＡＣＴＧＡＣＡＣＣＣＡＧＣＣＴＧＡＡＡＴＡＴＧＴＡＧＣＡＡＡＡＴ

ｇＲＮＡスクリーニング用ＰＣＲ

Ｓｃｒｅｅｎ＿Ｆ：ＧＡＧＧＣＣＡＡＡＡＣＡＡＴＧＣＡＧＡＧ（配列番号１２）

Ｓｃｒｅｅｎ＿Ｒ：ＧＧＡＧＡＧＡＡＡＡＴＣＴＴＣＴＴＧＡＣＡＡＣＡＣ（配列番号１３）

プライマーは、フォワードプライマーがイントロン４４の全てのｇＲＮＡ切断部位の上流にあり、リバースプライマーがイントロン５５の全てのｇＲＮＡ切断部位の下流にあるように、任意のガイドペアを有する介在配列の削除が同じプライマーで増幅されるように選択された。延長時間は、製造元の指示に従い、各ｇＲＮＡペアの予想される削除のアンプリコンサイズに応じて変更した。

削除及び正しい挿入の検証のためのＰＣＲプライマー

ＨＩＴＩ Ｂ

５’挿入接合部

Ｆ：ＴＧＧＡＡＣＡＣＡＧＴＴＡＡＴＴＣＡＣＴＴＧＧ（配列番号１４）

Ｒ：ＣＣＧＣＡＧＡＴＴＣＡＧＧＣＴＴＣＣ（配列番号１５）

３’挿入接合部

Ｆ：ＣＴＧＡＡＡＣＡＡＣＴＧＣＣＡＡＴＧＴＣＣ（配列番号１６）

Ｒ：ＡＣＣＡＣＣＴＴＡＧＴＴＡＴＴＣＣＴＣＣ（配列番号１７）

削除

Ｆ：ＴＧＧＡＡＣＡＣＡＧＴＴＡＡＴＴＣＡＣＴＴＧＧ（配列番号１８）

Ｒ：ＡＣＣＡＣＣＴＴＡＧＴＴＡＴＴＣＣＴＣＣ（配列番号１９）

ＨＩＴＩ Ｋ

５’挿入接合部

Ｆ：ＧＴＡＧＣＡＴＡＡＴＧＧＧＧＴＴＴＣＴＧＣ（配列番号２０）

Ｒ：ＣＣＧＣＡＧＡＴＴＣＡＧＧＣＴＴＣＣ（配列番号２１）

３’挿入接合部

Ｆ：ＣＴＧＡＡＡＣＡＡＣＴＧＣＣＡＡＴＧＴＣＣ（配列番号２２）

Ｒ：ＧＣＴＣＡＡＧＴＴＴＴＣＡＧＣＣＡＣＡＧ（配列番号２３）

削除

Ｆ：ＧＴＡＧＣＡＴＡＡＴＧＧＧＧＴＴＴＣＴＧＣ（配列番号２４）

Ｒ：ＣＣＧＣＡＧＡＴＴＣＡＧＧＣＴＴＣＣ（配列番号２５）

ＨＩＴＩ Ｂ 全配列（配列番号２６）：

ｃｔａａｃｔａｇｔｃｔａｇａｃｔａｇｃｔａａｔｇｔａｃａａａａａａｇｃａｇｇｃｔｔｔａａａｇｇａａｃｃａａｔｔｃａｇｔｃｇａｃｔｇｇａｔｃｃｇｇｔａｃｃａａｇｇｔｃｇｇｇｃａｇｇａａｇａｇｇｇｃｃｔａｔｔｔｃｃｃａｔｇａｔｔｃｃｔｔｃａｔａｔｔｔｇｃａｔａｔａｃｇａｔａｃａａｇｇｃｔｇｔｔａｇａｇａｇａｔａａｔｔａｇａａｔｔａａｔｔｔｇａｃｔｇｔａａａｃａｃａａａｇａｔａｔｔａｇｔａｃａａａａｔａｃｇｔｇａｃｇｔａｇａａａｇｔａａｔａａｔｔｔｃｔｔｇｇｇｔａｇｔｔｔｇｃａｇｔｔｔｔａａａａｔｔａｔｇｔｔｔｔａａａａｔｇｇａｃｔａｔｃａｔａｔｇｃｔｔａｃｃｇｔａａｃｔｔｇａａａｇｔａｔｔｔｃｇａｔｔｔｃｔｔｇｇｃｔｔｔａｔａｔａｔｃｔｔｇｔｇｇａａａｇｇａｃｇａａａｃａｃｃｇｔａｇｇｃａａｇｔｃａｇｔｔａａａｃａｔｇｔｔｔａａｇｔａｃｔｃｔｇｔｇｃｔｇｇａａａｃａｇｃａｃａｇａａｔｃｔａｃｔｔａａａｃａａｇｇｃａａａａｔｇｃｃｇｔｇｔｔｔａｔｃｔｃｇｔｃａａｃｔｔｇｔｔｇｇｃｇａｇａｔｔｔｔｔｔｔｔａｔａａｇｃｔｔｃｃｔｇｔａｃａｇａａｔｔｃｇｔｃｔｇｃａａｇｇｇｃｇａａｔｔｃｔｇｃａｇｃｇｔｃｃｃｔｇｔａｃａａａａａａｇｃａｇｇｃｔｔｔａａａｇｇａａｃｃａａｔｔｃａｇｔｃｇａｃｔｇｇａｔｃｃｇｇｔａｃｃａａｇｇｔｃｇｇｇｃａｇｇａａｇａｇｇｇｃｃｔａｔｔｔｃｃｃａｔｇａｔｔｃｃｔｔｃａｔａｔｔｔｇｃａｔａｔａｃｇａｔａｃａａｇｇｃｔｇｔｔａｇａｇａｇａｔａａｔｔａｇａａｔｔａａｔｔｔｇａｃｔｇｔａａａｃａｃａａａｇａｔａｔｔａｇｔａｃａａａａｔａｃｇｔｇａｃｇｔａｇａａａｇｔａａｔａａｔｔｔｃｔｔｇｇｇｔａｇｔｔｔｇｃａｇｔｔｔｔａａａａｔｔａｔｇｔｔｔｔａａａａｔｇｇａｃｔａｔｃａｔａｔｇｃｔｔａｃｃｇｔａａｃｔｔｇａａａｇｔａｔｔｔｃｇａｔｔｔｃｔｔｇｇｃｔｔｔａｔａｔａｔｃｔｔｇｔｇｇａａａｇｇａｃｇａａａｃａｃｃｇｔｔｇｔｇａａｇｔｔｃｔｔｔｃｃｔｔａｇｇｔｔｔａａｇｔａｃｔｃｔｇｔｇｃｔｇｇａａａｃａｇｃａｃａｇａａｔｃｔａｃｔｔａａａｃａａｇｇｃａａａａｔｇｃｃｇｔｇｔｔｔａｔｃｔｃｇｔｃａａｃｔｔｇｔｔｇｇｃｇａｇａｔｔｔｔｔｔｔｔａｔａａｇｃｔｔｃｃｔｇｔａｃａｇａａｔｔｃｇｔｃｔｇｃａａｇｇｇｃｇａａｔｔｃｔｇｃａｇｃｇｔｃｃｃａｃｔｃｇｇａｔｇｔｔｔａａｃｔｇａｃｔｔｇｃｃｔａｃａｔｇｔｃａｇｔｔｔｃａｔａｇｇｇａａａｔｔｔｔｃａｃａｔｇｇａｇｃｔｔｔｔｇｔａｔｔｔｃｔｔｔｃｔｔｔｇｃｃａｇｔａｃａａｃｔｇｃａｔｇｔｇｇｔａｇｃａｃａｃｔｇｔｔｔａａｔｃｔｔｔｔｃｔｃａａａｔａａａａａｇａｃａｔｇｇｇｇｃｔｔｃａｔｔｔｔｔｇｔｔｔｔｇｃｃｔｔｔｔｔｇｇｔａｔｃｔｔａｃａｇｇａａｃｔｃｃａｇｇａｔｇｇｃａｔｔｇｇｇｃａｇｃｇｇｃａａａｃｔｇｔｔｇｔｃａｇａａｃａｔｔｇａａｔｇｃａａｃｔｇｇｇｇａａｇａａａｔａａｔｔｃａｇｃａａｔｃｃｔｃａａａａａｃａｇａｔｇｃｃａｇｔａｔｔｃｔａｃａｇｇａａａａａｔｔｇｇｇａａｇｃｃｔｇａａｔｃｔｇｃｇｇｔｇｇｃａｇｇａｇｇｔｃｔｇｃａａａｃａｇｃｔｇｔｃａｇａｃａｇａａａａａａｇａｇｇｃｔａｇａａｇａａｃａａａａｇａａｔａｔｃｔｔｇｔｃａｇａａｔｔｔｃａａａｇａｇａｔｔｔａａａｔｇａａｔｔｔｇｔｔｔｔａｔｇｇｔｔｇｇａｇｇａａｇｃａｇａｔａａｃａｔｔｇｃｔａｇｔａｔｃｃｃａｃｔｔｇａａｃｃｔｇｇａａａａｇａｇｃａｇｃａａｃｔａａａａｇａａａａｇｃｔｔｇａｇｃａａｇｔｃａａｇｔｔａｃｔｇｇｔｇｇａａｇａｇｔｔｇｃｃｃｃｔｇｃｇｃｃａｇｇｇａａｔｔｃｔｃａａａｃａａｔｔａａａｔｇａａａｃｔｇｇａｇｇａｃｃｃｇｔｇｃｔｔｇｔａａｇｔｇｃｔｃｃｃａｔａａｇｃｃｃａｇａａｇａｇｃａａｇａｔａａａｃｔｔｇａａａａｔａａｇｃｔｃａａｇｃａｇａｃａａａｔｃｔｃｃａｇｔｇｇａｔａａａｇｇｔｔｔｃｃａｇａｇｃｔｔｔａｃｃｔｇａｇａａａｃａａｇｇａｇａａａｔｔｇａａｇｃｔｃａａａｔａａａａｇａｃｃｔｔｇｇｇｃａｇｃｔｔｇａａａａａａａｇｃｔｔｇａａｇａｃｃｔｔｇａａｇａｇｃａｇｔｔａａａｔｃａｔｃｔｇｃｔｇｃｔｇｔｇｇｔｔａｔｃｔｃｃｔａｔｔａｇｇａａｔｃａｇｔｔｇｇａａａｔｔｔａｔａａｃｃａａｃｃａａａｃｃａａｇａａｇｇａｃｃａｔｔｔｇａｃｇｔｔａａｇｇａａａｃｔｇａａａｔａｇｃａｇｔｔｃａａｇｃｔａａａｃａａｃｃｇｇａｔｇｔｇｇａａｇａｇａｔｔｔｔｇｔｃｔａａａｇｇｇｃａｇｃａｔｔｔｇｔａｃａａｇｇａａａａａｃｃａｇｃｃａｃｔｃａｇｃｃａｇｔｇａａｇａｇｇａａｇｔｔａｇａａｇａｔｃｔｇａｇｃｔｃｔｇａｇｔｇｇａａｇｇｃｇｇｔａａａｃｃｇｔｔｔａｃｔｔｃａａｇａｇｃｔｇａｇｇｇｃａａａｇｃａｇｃｃｔｇａｃｃｔａｇｃｔｃｃｔｇｇａｃｔｇａｃｃａｃｔａｔｔｇｇａｇｃｃｔｃｔｃｃｔａｃｔｃａｇａｃｔｇｔｔａｃｔｃｔｇｇｔｇａｃａｃａａｃｃｔｇｔｇｇｔｔａｃｔａａｇｇａａａｃｔｇｃｃａｔｃｔｃｃａａａｃｔａｇａａａｔｇｃｃａｔｃｔｔｃｃｔｔｇａｔｇｔｔｇｇａｇｇｔａｃｃｔｇｃｔｃｔｇｇｃａｇａｔｔｔｃａａｃｃｇｇｇｃｔｔｇｇａｃａｇａａｃｔｔａｃｃｇａｃｔｇｇｃｔｔｔｃｔｃｔｇｃｔｔｇａｔｃａａｇｔｔａｔａａａａｔｃａｃａｇａｇｇｇｔｇａｔｇｇｔｇｇｇｔｇａｃｃｔｔｇａｇｇａｔａｔｃａａｃｇａｇａｔｇａｔｃａｔｃａａｇｃａｇａａｇｇｃａａｃａａｔｇｃａｇｇａｔｔｔｇｇａａｃａｇａｇｇｃｇｔｃｃｃｃａｇｔｔｇｇａａｇａａｃｔｃａｔｔａｃｃｇｃｔｇｃｃｃａａａａｔｔｔｇａａａａａｃａａｇａｃｃａｇｃａａｔｃａａｇａｇｇｃｔａｇａａｃａａｔｃａｔｔａｃｇｇａｔｃｇａａｔｔｇａａａｇａａｔｔｃａｇａａｔｃａｇｔｇｇｇａｔｇａａｇｔａｃａａｇａａｃａｃｃｔｔｃａｇａａｃｃｇｇａｇｇｃａａｃａｇｔｔｇａａｔｇａａａｔｇｔｔａａａｇｇａｔｔｃａａｃａｃａａｔｇｇｃｔｇｇａａｇｃｔａａｇｇａａｇａａｇｃｔｇａｇｃａｇｇｔｃｔｔａｇｇａｃａｇｇｃｃａｇａｇｃｃａａｇｃｔｔｇａｇｔｃａｔｇｇａａｇｇａｇｇｇｔｃｃｃｔａｔａｃａｇｔａｇａｔｇｃａａｔｃｃａａａａｇａａａａｔｃａｃａｇａａａｃｃａａｇｃａｇｔｔｇｇｃｃａａａｇａｃｃｔｃｃｇｃｃａｇｔｇｇｃａｇａｃａａａｔｇｔａｇａｔｇｔｇｇｃａａａｔｇａｃｔｔｇｇｃｃｃｔｇａａａｃｔｔｃｔｃｃｇｇｇａｔｔａｔｔｃｔｇｃａｇａｔｇａｔａｃｃａｇａａａａｇｔｃｃａｃａｔｇａｔａａｃａｇａｇａａｔａｔｃａａｔｇｃｃｔｃｔｔｇｇａｇａａｇｃａｔｔｃａｔａａａａｇｇｇｔｇａｇｔｇａｇｃｇａｇａｇｇｃｔｇｃｔｔｔｇｇａａｇａａａｃｔｃａｔａｇａｔｔａｃｔｇｃａａｃａｇｔｔｃｃｃｃｃｔｇｇａｃｃｔｇｇａａａａｇｔｔｔｃｔｔｇｃｃｔｇｇｃｔｔａｃａｇａａｇｃｔｇａａａｃａａｃｔｇｃｃａａｔｇｔｃｃｔａｃａｇｇａｔｇｃｔａｃｃｃｇｔａａｇｇａａａｇｇｃｔｃｃｔａｇａａｇａｃｔｃｃａａｇｇｇａｇｔａａａａｇａｇｃｔｇａｔｇａａａｃａａｔｇｇｃａａｇｔａａｇｔｃａｇｇｃａｔｔｔｃｃｇｃｔｔｔａｇｃａｃｔｃｔｔｇｔｇｇａｔｃｃａａｔｔｇａａｃａａｔｔｃｔｃａｇｃａｔｔｔｇｔａｃｔｔｇｔａａｃｔｇａｃａａｇｃｃａｇｇｇａｃａａａａｃａａａａｔａｇｔｔｇｃｔｔｔｔａｔａｃａｇｃｃｔｇａｔｇｔａｔｔｔｃｇｇｔａｔｔｔｇｇａｃａａｇｇａｇｇａｇａｇａｇｃｔａａｇｇａａａｇａａｃｔｔｃａｃａａａａｇａａｔａｔａａｇａａｔｇｃｇｇｃｃｇｃｔａａａｃｔａｔ

ＨＩＴＩ Ｋ 全配列（配列番号２７）

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ヒト野生型ＤＭＤエクソン４５－５５（配列番号２８）

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その他のｇＲＮＡ標的配列

実施例２－インビボでのＤｍｄ遺伝子修飾に関連する革新的な遺伝子置換システムの開発。

出願人らは、Ｄｍｄ遺伝子の病原性変異を野生型、非病原性配列で特異的に置換することを可能にするために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９刺激相同性指向性修復（ＨＤＲ）に基づく正確なゲノム修正方法を開発中である。したがって、出願人らは、ＳａＣａｓ９、ＮｍｅＣａｓ９、ＫＫＨ ＳａＣａｓ９、またはＳａｕｒｉＣａｓ９によって変異部位の５ｂｐ以内に標的化可能な３つのＤｍｄ変異、ｍｄｘ、ｍｄｘ^４ｃｖ、及びｍｄｘ^５ｃｖを同定した。

適合するＣａｓ９エンドヌクレアーゼ活性を適切な場所に向ける能力について、これらの候補切断部位を標的とするｇＲＮＡをスクリーニングするために、ｍｄｘ尾端線維芽細胞（ＴＴＦ）を、Ｃａｓ９オルソログ及びｍｄｘ遺伝子座を標的とするｇＲＮＡでヌクレオフェクションした（表２）。ヌクレオフェクション後３日目にゲノムＤＮＡを採取し、ＰＣＲを行ってｍｄｘ、Ｐｃｓｋ９、及びＲｕｎｘ１遺伝子座（Ｐｃｓｋ９及びＲｕｎｘ１は以前に検証済みのｇＲＮＡを用いて標的とし、それぞれＫＫＨ ＳａＣａｓ９及びＳａｕｒｉＣａｓ９の切断活性と特異性の両方に関して、対照として機能する）を増幅させることを実行した。

ＩＣＥ解析により、ＫＫＨ ＳａＣａｓ９及びＳａｕｒｉＣａｓ９の両方が、対照Ｐｃｓｋ９及びＲｕｎｘ１遺伝子座のそれぞれで活性だったことが確認された（図１７Ａ）。Ｄｍｄ遺伝子のエクソン２３のディープアンプリコンシーケンスにより、細胞を対照ＳａｕｒｉＣａｓ９＋ＳａｕｒｉＣａｓ９ Ｐｃｓｋ９ ｇＲＮＡ細胞でトランスフェクトするとｍｄｘ遺伝子座にインデルが検出されなかったが、ＳａｕｒｉＣａｓ９＋ＳａｕｒｉＣａｓ９ ｍｄｘ ｇＲＮＡ細胞では、対立遺伝子の～１２％がｍｄｘ部位にインデルを含んでいたことがさらに判明した（図１７Ｂ）。一方、ＫＫＨ ＳａＣａｓ９＋ＫＫＨ ＳａＣａｓ９ ｍｄｘ ｇＲＮＡについては、ｍｄｘ遺伝子座に活性が検出されなかった（図１７Ｂ）。

その後の努力は、ＳａｕｒｉＣａｓ９ ｍｄｘ ｇＲＮＡに集中した。驚いたことに、このｇＲＮＡは、ＳａｕｒｉＣａｓ９の切断をｍｄｘ変異から０ｂｐ離れたところに誘導し、最適なＨＤＲ効率のための非常に魅力的な候補ｇＲＮＡとするものである。

実施例３－筋肉及びサテライト細胞に対する送達機構の探索

骨格筋内の特定の細胞型の標的化がＨＤＲ率を有する影響を照明するために、サテライト細胞とも呼ばれる筋幹細胞にＣａｓ９発現を制限するシステムを設計した。これを達成するために、Ｐａｘ７－ＣｒｅＥＲ^Ｔ２遺伝子導入マウス系統を、Ｒｏｓａ２６－ＬＳＬ－ＳｐＣａｓ９－Ｐ２Ａ－ＥＧＦＰ遺伝子導入マウス系統と交配させた。Ｐａｘ７を発現する細胞でタモキシフェンによりＣｒｅＥＲ^Ｔ２が誘導されると、ＳｐＣａｓ９とＥＧＦＰがバイシストロン的に発現される。Ｐａｘ７の発現は生後間もないマウスの筋肉内のサテライト細胞に限られるため、このシステムではＳｐＣａｓ９とＥＧＦＰの発現をサテライト細胞のみに限定する。一旦サテライト細胞がＳｐＣａｓ９を発現したら、サテライト細胞に限定したカラースイッチングシステム可能にし、ＥＧＦＰ遺伝子座を標的とするＳｐＣａｓ９ ｇＲＮＡをＢＦＰドナー鋳型とともにＡＡＶを介して送達することが可能である。このシステムは、ＳｐＣａｓ９及びＥＧＦＰ発現が筋線維のみに制限される類似のシステムと結合される場合、サテライト細胞における編集が筋線維において検出可能なレベルのＨＤＲをもたらすのに十分であるかどうかを決定することが可能である。

タモキシフェン誘導を最適化するために、注射のどのような投与量及び時間経過が、筋線維での発現をもたらすことなくサテライト細胞でのＳｐＣａｓ９及びＧＦＰの発現を最大化するかを調べた。マウスにＰ１６で７５ｍｇ／ｋｇのタモキシフェンを４日間毎日注射し、Ｐ１９でその最後の１回とし、その後Ｐ２１でサテライト細胞分離のために筋肉を採取した（図１８Ａ）。ＦＡＣＳ解析は、Ｐ１６－Ｐ１９から毎日タモキシフェンを注射するこの方法により、Ｐ２１で解析したサテライト細胞の２５％～３０％において検出可能なＧＦＰ蛍光を生じたことを示した（図１８Ｂ）。これらの結果を確認するために、それらの蛍光プロファイルに基づいてタモキシフェン注射マウスから分離されたサテライト細胞の２つのサブセット、ＥＧＦＰ－またはＥＧＦＰ＋（図１８Ｃ）のいずれかを培養した。共焦点顕微鏡を介したＥＧＦＰシグナル強度の検出により、サテライト細胞の２つのサブセットが別々の集団であることを確認した（図１８Ｄ）。タモキシフェン注射のこの方法は、サテライト細胞において検出可能な遺伝子導入発現を誘導するのに十分であることを知って、発現がサテライト細胞のみに限定されるか否か、またはＥＧＦＰ（したがってＳｐＣａｓ９も）が、Ｐ１６～１９で注射しＰ２１で採取したマウスの筋繊維において追加的に検出され得るかどうかを次に求めた。そこで、出願人らは、注射したマウスの前脛骨筋（ＴＡ）を凍結採取し、Ｐａｘ７を染色し、及び画像化した。重要なことに、ビヒクルまたはタモキシフェンを注射したマウスの筋繊維においていずれも、ＧＦＰ＋筋繊維が検出されなかった（図１９）。さらに、凍結切片で検出されたすべてのＧＦＰ＋細胞は、Ｐａｘ７及びＤＡＰＩ対比染色と共局在し、サテライト細胞であることが確認された（図１９）。これらのデータは、ＥＧＦＰ及びＳｐＣａｓ９の発現を生後骨格筋のサテライト細胞区画に制限するためのこの遺伝子導入システムを検証する。

有意なタモキシフェン誘導がＰ１６－Ｐ１９に注射した後のマウスで観察されたことを受けて、出願人らは、組換え効率が注入後のより遅い時点で増加する可能性があるか、またはタモキシフェン誘導後の時間の増加とともにＥＧＦＰが筋繊維内にも検出される可能性があるかを決定することに興味を持った（図２０Ａ）。そこで、マウスの第２のグループ（Ｐ１６－Ｐ１９で注射）は、Ｐ４２で採取された。ＦＡＣＳ解析は、Ｐ１６－１９からの毎日のタモキシフェン注射が、Ｐ４２においてサテライト細胞の５０％～６５％において検出可能なＳｐＣａｓ９－ＥＧＦＰをもたらしたことを実証した（図２０Ｂ）。組織学的な解析が行われている。

ｍｄｘ遺伝子座を切断することができるｇＲＮＡを同定したことを受けて、インビトロでこの変異を正確に修正するためのＣＲＩＳＰＲ－ＡＡＶ－ＨＤＲシステムの能力をテストするために、ＨＤＲ鋳型の設計及びクローニングを進めている。これまでの研究で、通常はドナー鋳型の長さが長いほど、インビトロでのＨＤＲ効率が高くなることが分かっているが、知られている限りでは、インビボでの応用については、ＨＤＲ鋳型の長さを変えることの効果は調べられていなかった。そこで、５種類の相同性アーム長を持つ鋳型を設計し、ＡＡＶにパッケージしたｍｄｘ標的ＳａｕｒｉＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体とともにこれらの鋳型の筋肉内注射を行う予定である。現在、これらの鋳型をＡＡＶ互換のプラスミドバックボーンにクローニングしているところである。その間に、ＳａｕｒｉＣａｓ９による編集後のジストロフィンの発現回復を検出するために、ジストロフィン染色の最適化に着手している。

Ｃａｓ９活性が筋繊維における効率的なＨＤＲに必要であるかどうかを理解するために、出願人らは、サテライト細胞における発現を除外しながら筋核に遺伝子編集を制限することに関心を持っている。この目的のために、出願人らは、ヒト骨格アクチン（ＨＳＡ）－ＭｅｒＣｒｅＭｅｒマウスをＲｏｓａ２６－ＬＳＬ－ＳｐＣａｓ９－Ｐ２Ａ－ＥＧＦＰマウスに交配し、筋前駆細胞から排除しながら筋核においてのみＣｒｅの誘導を可能にすることを計画している。これらのマウスは効率的な繁殖ができないが、出願人らは小さなコホート動物を入手し、タモキシフェンの注射を開始した。出願人らは、サテライト細胞がＣａｓ９－ＥＧＦＰを発現しないことを確認するためにサテライト細胞のＦＡＣＳ解析を行うことを計画しており、また、ＥＧＦＰを検出するために筋繊維の凍結採取及び画像化のために筋肉を収集する予定である。

さらに、出願人らは、Ｐａｘ７－ＣｒｅＥＲ^{Ｔ２＋／－}、Ｒｏｓａ２６－ＬＳＬ－ＳｐＣａｓ９－Ｐ２Ａ－ＥＧＦＰ^＋／－マウス系におけるタモキシフェン注射をさらに最適化している段階である。タモキシフェンの投与量を（７５ｍｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇに）増やし、注射の回数を（４回から５回に）増やすことにより、出願人らは、組換え効率をさらに高め、これらのマウスのサテライト細胞における遺伝子編集イベントの機会を最大化しようと計画している。タモキシフェン誘導後のＥＧＦＰ標的ｇＲＮＡ及びＢＦＰドナー鋳型の最終的な送達を準備するために、出願人らは、我々のＨＤＲシステムのこれらの構成要素のそれぞれをコード化するＡＡＶの高タイターバッチをパッケージ化して製造している段階である。

Claims (53)

1. 哺乳動物の筋肉または筋肉前駆細胞のゲノムを改変するための方法であって、前記細胞をＣａｓタンパク質ならびに第１及び第２のガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）と接触させ、それによってＤＭＤのイントロン４４からイントロン５５の間に位置する前記哺乳動物の筋肉または筋肉前駆細胞の前記ゲノムを改変することを含み、前記第１のｇＲＮＡは、ＤＭＤのイントロン４４に位置する第１の標的部位とハイブリダイズし、前記第２のｇＲＮＡは、ＤＭＤのイントロン５５に位置する第２の標的部位とハイブリダイズする、方法。
2. 前記ゲノムの前記改変は、ＤＭＤのイントロン４４からイントロン５５の間のヌクレオチド配列の除去を含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記細胞を野生型ＤＭＤのエクソン４５から５５の前記ヌクレオチド配列を含む鋳型ＤＮＡと接触させることをさらに含む、請求項１～２に記載の方法。
4. 前記鋳型ＤＮＡは、野生型ＤＭＤのエクソン４５から５５の前記ヌクレオチド配列と隣接する前記第１及び前記第２の標的部位の一部を含む、請求項３に記載の方法。
5. 前記ゲノムの前記改変は、野生型ＤＭＤのエクソン４５から５５を含む鋳型ＤＮＡによるＤＭＤのイントロン４４からイントロン５５の間の前記ヌクレオチド配列の置換を含む、請求項３～４に記載の方法。
6. ＤＭＤのイントロン４４からイントロン５５の間の前記ヌクレオチド配列の前記置換は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）により生じる、請求項５に記載の方法。
7. ＤＭＤのイントロン４４からイントロン５５の間に位置する前記哺乳動物の筋肉または筋肉前駆細胞の前記ゲノムは、疾患または状態と関連する変異を含む、請求項１～６に記載の方法。
8. 前記疾患または状態は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーである、請求項７に記載の方法。
9. 前記細胞は、ヒト細胞である、請求項１～８に記載の方法。
10. 前記細胞は、筋ジストロフィーを有し、ＤＭＤ遺伝子のイントロン４４からイントロン５５の間に位置する変異を有する対象の細胞から誘導された人工多能性幹細胞である、請求項１～９に記載の方法。
11. 前記対象は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーを有する、請求項１０に記載の方法。
12. 前記Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９であり、任意に、前記Ｃａｓ９は、ｓａＣａｓ９、ｓｐＣａｓ９、及びＳａｕｒｉＣａｓ９から選択される、請求項１～１１に記載の方法。
13. 前記細胞は、前記Ｃａｓタンパク質、前記第１のｇＲＮＡ、前記第２のｇＲＮＡ、または前記鋳型ＤＮＡを形質導入する１つ以上のウイルスと接触させられる、請求項１～１２に記載の方法。
14. 前記１つ以上のウイルスは、ＡＡＶウイルスである、請求項１４に記載の方法。
15. 前記細胞は、前記Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を前記細胞に形質導入する第１のウイルスならびに前記第１のｇＲＮＡ、前記第２のｇＲＮＡ、及び鋳型ＤＮＡをコードする核酸を前記細胞に形質導入する第２のウイルスと接触させられる、請求項１～１２に記載の方法。
16. 少なくとも前記第１のウイルスまたは前記第２のウイルスは、ＡＡＶウイルスである、請求項１５に記載の方法。
17. 改変されたゲノムを有する前記細胞は、野生型ＤＭＤのエクソン４５から５５によってコードされるアミノ酸配列が欠如した切断型の機能的なジストロフィンを発現する、請求項１～１６に記載の方法。
18. 改変されたゲノムを有する前記細胞は、野生型ＤＭＤのエクソン４５から５５によってコードされるアミノ酸配列を含む完全長型ジストロフィンを発現する、請求項３～１６に記載の方法。
19. 前記細胞は、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで接触させられる、請求項１～１８に記載の方法。
20. 前記細胞は、配列番号２６または２７の核酸を誘導するウイルス、あるいは１または２つのｇＲＮＡ及び鋳型のうちの１つ以上を誘導するその一部と接触させられる、請求項１～１９に記載の方法。
21. 処置を必要とする対象において筋ジストロフィーを処置する方法であって、患者の筋肉または筋肉前駆細胞をＣａｓタンパク質ならびに第１及び第２のガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）と接触させ、それによって前記細胞のゲノムを改変することを含み、前記第１のｇＲＮＡは、ＤＭＤのイントロン４４に位置する第１の標的部位とハイブリダイズし、前記第２のｇＲＮＡは、ＤＭＤのイントロン５５に位置する第２の標的部位とハイブリダイズし、前記対象のゲノムは、ＤＭＤ遺伝子のイントロン４４からイントロン５５の間に位置する変異を含む、方法。
22. 前記ゲノムの前記改変は、ＤＭＤのイントロン４４からイントロン５５の間のヌクレオチド配列の除去を含む、請求項２１に記載の方法。
23. 前記細胞を野生型ＤＭＤのエクソン４５から５５の前記ヌクレオチド配列を含む鋳型ＤＮＡと接触させることをさらに含む、請求項２１～２２に記載の方法。
24. 前記鋳型ＤＮＡは、野生型ＤＭＤのエクソン４５から５５の前記ヌクレオチド配列と隣接する前記第１及び前記第２の標的部位の一部を含む、請求項２３に記載の方法。
25. 前記ゲノムの前記改変は、野生型ＤＭＤのエクソン４５から５５を含む鋳型ＤＮＡによるＤＭＤのイントロン４４からイントロン５５の間の前記ヌクレオチド配列の置換を含む、請求項２３～２４に記載の方法。
26. ＤＭＤのイントロン４４からイントロン５５の間の前記ヌクレオチド配列の前記置換は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）により生じる、請求項２５に記載の方法。
27. 前記筋ジストロフィーは、デュシェンヌ型筋ジストロフィーである、請求項２１～２６に記載の方法。
28. 前記Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９であり、任意に、前記Ｃａｓ９は、ｓａＣａｓ９、ｓｐＣａｓ９、及びＳａｕｒｉＣａｓ９から選択される、請求項２１～２７に記載の方法。
29. 前記対象は、前記Ｃａｓタンパク質、前記第１のｇＲＮＡ、前記第２のｇＲＮＡ、または前記鋳型ＤＮＡを形質導入する１つ以上のウイルスを投与される、請求項２１～２８に記載の方法。
30. 前記１つ以上のウイルスは、ＡＡＶウイルスである、請求項２９に記載の方法。
31. 前記対象は、前記Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を前記細胞に形質導入する第１のウイルスならびに前記第１のｇＲＮＡ、前記第２のｇＲＮＡ、及び前記鋳型ＤＮＡをコードする核酸を前記細胞に形質導入する第２のウイルスを投与される、請求項２１～２８に記載の方法。
32. 少なくとも前記第１のウイルスまたは前記第２のウイルスは、ＡＡＶウイルスである、請求項３１に記載の方法。
33. 改変されたゲノムを有する前記細胞は、野生型ＤＭＤのエクソン４５から５５によってコードされるアミノ酸配列が欠如した切断型ジストロフィンを発現する、請求項２１～３２に記載の方法。
34. 改変されたゲノムを有する前記細胞は、野生型ＤＭＤのエクソン４５から５５によってコードされるアミノ酸配列を含む完全長型ジストロフィンを発現する、請求項２３～３２に記載の方法。
35. 前記細胞は、エクスビボ、またはインビボで接触させられる、請求項２１～３４に記載の方法。
36. 前記細胞は、配列番号２６または２７の核酸を誘導するウイルス、あるいは１または２つのｇＲＮＡ及び鋳型のうちの１つ以上を誘導するその一部と接触させられる、請求項２１～３５に記載の方法。
37. 哺乳動物の筋肉または筋肉前駆細胞のゲノムを改変するための方法であって、前記細胞をＣａｓタンパク質ならびに第１及び第２のガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）と接触させ、それによって第１の標的部位と第２の標的部位との間に位置する前記哺乳動物の筋肉または筋肉前駆細胞の前記ゲノムを改変することを含み、前記第１のｇＲＮＡは、ＤＭＤの第１のイントロンに位置する前記第１の標的部位とハイブリダイズし、前記第２のｇＲＮＡは、ＤＭＤの別のイントロンに位置する前記第２の標的部位とハイブリダイズする、方法。
38. ＤＭＤエクソン２３は、前記第１の標的部位と前記第２の標的部位との間に位置する、請求項３７に記載の方法。
39. 前記細胞を前記第１の標的部位と前記第２の標的部位との間に位置するＤＭＤエクソンのヌクレオチド配列を含む鋳型ＤＮＡと接触させることをさらに含む、請求項３７～３８に記載の方法。
40. 前記鋳型ＤＮＡは、前記第１の標的部位と前記第２の標的部位との間に位置するＤＭＤエクソンの前記ヌクレオチド配列と隣接する前記第１及び前記第２の標的部位の一部を含む、請求項３９に記載の方法。
41. 前記ゲノムの前記改変は、前記第１の標的部位と前記第２の標的部位との間に位置するＤＭＤエクソンの前記ヌクレオチド配列を含む鋳型ＤＮＡによる前記第１の標的部位と前記第２の標的部位との間に位置する前記ヌクレオチド配列の置換を含む、請求項３９～４０に記載の方法。
42. 前記ヌクレオチド配列の前記置換は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）により生じる、請求項４１に記載の方法。
43. 前記第１の標的部位と前記第２の標的部位との間に位置する前記細胞の前記ゲノムは、疾患または状態と関連する変異を含む、請求項３７～４２に記載の方法。
44. 前記疾患または状態は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーである、請求項４３に記載の方法。
45. 前記細胞は、筋ジストロフィーを有し、前記第１の標的部位と前記第２の標的部位との間に位置する変異を有する対象の細胞から誘導された人工多能性幹細胞である、請求項３７～４４に記載の方法。
46. 前記細胞は、前記Ｃａｓタンパク質、前記第１のｇＲＮＡ、前記第２のｇＲＮＡ、または前記鋳型ＤＮＡを形質導入する１つ以上のウイルスと接触させられる、請求項３７～４５に記載の方法。
47. 前記細胞は、前記Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を前記細胞に形質導入する第１のウイルスならびに前記第１のｇＲＮＡ、前記第２のｇＲＮＡ、及び前記鋳型ＤＮＡをコードする核酸を前記細胞に形質導入する第２のウイルスと接触させられる、請求項３７～４５に記載の方法。
48. 少なくとも前記第１のウイルスまたは前記第２のウイルスは、ＡＡＶウイルスである、請求項４７に記載の方法。
49. 改変されたゲノムを有する前記細胞は、機能的な切断型ジストロフィンを発現することができる、請求項３７～４８に記載の方法。
50. 改変されたゲノムを有する前記細胞は、完全長型ジストロフィンを発現することができる、請求項３７～４８に記載の方法。
51. 前記細胞は、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで接触させられる、請求項３７～５０に記載の方法。
52. Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を細胞に形質導入する第１のウイルスならびに第１のｇＲＮＡ、第２のｇＲＮＡ、及び鋳型ＤＮＡをコードする核酸を細胞に形質導入する第２のウイルスを含む組成物であって、前記第１のｇＲＮＡは、ＤＭＤの第１のイントロンに位置する第１の標的部位とハイブリダイズし、前記第２のｇＲＮＡは、ＤＭＤの別のイントロンに位置する第２の標的部位とハイブリダイズし、前記鋳型ＤＮＡは、前記第１の標的部位と前記第２の標的部位との間に位置する１つ以上のＤＭＤエクソンをコードする、組成物。
53. 前記鋳型ＤＮＡは、前記１つ以上のエクソンと隣接する前記第１及び前記第２の標的部位をさらに含む、請求項５２に記載の組成物。

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