JP2024529294A - ミオシン重鎖塩基編集のための組成物および方法 - Google Patents

ミオシン重鎖塩基編集のための組成物および方法 Download PDF

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Abstract

本明細書中の開示は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系のために設計された、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）と、Ｃａｓ９ニッカーゼおよびデアミナーゼを含む融合タンパク質とを含む組成物、ならびに１つまたはそれ以上の心筋症を予防、改善または治療するためのその使用方法を対象とする。

Description

［関連出願の相互参照］
本出願は、２０２１年７月１日出願の米国仮出願第６３／２１７，６１８号、および２０２１年７月２日出願の米国仮出願第６３／２１８，２２１号の利益を主張し、当該出願の開示は、それらの全体が参照により本明細書の一部をなすものとする。
［配列表の参照による組込み］
本出願は、コンピューター可読形式においてＰａｔｅｎｔＣｅｎｔｅｒを介して提出されており、その全体を参照により本明細書に組み込む配列表を含有する。２０２２年７月１日に作出されたコンピューター可読ファイルは、ＵＴＳＷ－３９２３－ＰＣＴ（１０６５４６－７２８５６１）．ｘｍｌと命名され、約３６８，０００バイトのサイズである。
１．分野
本発明の概念は、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）と、デアミナーゼおよびＣａｓ９ニッカーゼまたは非活性化Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを含む融合タンパク質とを含む組成物、ならびに１つまたはそれ以上の心筋症を予防、改善または治療するためのその使用方法を対象とする。
２．関連分野の説明
心筋症は、心筋が肥大し、厚くなり、かつ／または硬直することを引き起こす、心筋の疾患である。心筋症が進行すると、心臓は弱くなり、心不全または不規則な心拍（すなわち、不整脈）をもたらし得る。肥大型心筋症（ＨＣＭ）は、多くの場合、筋節、細胞骨格および／または接着斑遺伝子における遺伝子突然変異から生ずる主要なタイプの心筋症である。現在、移植は別として、これらの心筋症のための治療法はない。そのため、これらの心疾患の治療のための医療分野における要求が存在する。
本開示は、少なくとも部分的には、塩基対編集を通じて遺伝子突然変異を修正することによって、ＨＣＭなどの家族性心筋症と関連付けられる表現型をうまく逆行させる、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）－ＣＲＩＳＰＲ会合タンパク質９（Ｃａｓ９）系を伴う使用のためのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の発見に基づく。
本開示の態様は、配列番号１または２のＤＮＡヌクレオチド配列に対応するスペーサー配列を含むｇＲＮＡを提供する。一部の態様において、ｇＲＮＡは、配列番号５または６との少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有するスペーサー配列を含む。例えば、一部の態様において、ｇＲＮＡは、配列番号５または６を含むかまたはからなるスペーサー配列を含み得る。
本開示の他の態様は、Ｃａｓ９ニッカーゼまたは非活性化Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼに共有結合されたデアミナーゼを含む融合タンパク質を提供する。
様々な態様において、デアミナーゼは、ＡＢＥｍａｘ、ＡＢＥ８ｅ、ＡＢＥ７．１０およびそれらの任意の機能的バリアントからなる群から選択され得る。様々な場合において、デアミナーゼは、配列番号７、９および１１のいずれか１つと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含み得る。例えば、デアミナーゼは、配列番号７、９および１１を含むアミノ酸配列を含み得る。一部の実施形態において、デアミナーゼは、配列番号７を含むアミノ酸配列を含む。
本開示の様々な態様において、Ｃａｓ９ニッカーゼまたは非活性化Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、ＳｐＲＹ、ＳｐＧ、ＳｐＣａｓ９－ＮＧ、ＳｐＣａｓ９－ＶＲＱＲまたはそれらのバリアントから選択される。一部の態様において、Ｃａｓ９ニッカーゼまたは非活性化Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、配列番号１５、１７、１９および２１のいずれか１つと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼまたは非活性化Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、配列番号１５、１７、１９および２１（ＳｐＲＹ、ＳｐＧ、ＳｐＣａｓ９－ＮＧ、ＳｐＣａｓ９－ＶＲＱＲ）のいずれか１つを含むアミノ酸配列を含み得る。一部の態様において、Ｃａｓ９ニッカーゼまたは非活性化Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、配列番号１５を含むアミノ酸配列を含む。
本開示の態様のいずれかにおいて、デアミナーゼは、ペプチドリンカーを介してＣａｓ９ニッカーゼまたは非活性化Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼに共有結合され得る。一部の態様において、ペプチドリンカーは、配列番号２７を含むアミノ酸配列を含む。
本明細書において説明される融合タンパク質のいずれかにおいて、デアミナーゼおよび／またはＣａｓ９ニッカーゼもしくは非活性化Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、核局在化シグナル（ＮＬＳ）ペプチドをさらに含む。様々な態様において、核局在化シグナル（ＮＬＳ）ペプチドは、配列番号３１～４２のいずれか１つから選択され得る。一部の態様において、核局在化シグナル（ＮＬＳ）ペプチドは、配列番号３１または配列番号３２を含み得る。
本開示の態様のいずれかにおいて、配列番号４５～６０のいずれか１つと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む融合タンパク質が提供される。一部の態様において、融合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号４５～６０のいずれか１つを含むかまたはからなる。一部の態様において、融合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号４５または４６（ＡＢＥｍａｘ－ＳｐＣａｓ９＿ＶＲＱＲ）を含むかまたはからなる。
本開示のさらなる態様は、本明細書において説明される任意のｇＲＮＡをコードする単離された核酸を提供する。他の態様は、本明細書において提供される融合タンパク質をコードする単離された核酸を提供する。また、ｇＲＮＡおよび／または融合タンパク質もしくはその断片をコードする核酸のうちの１つまたはそれ以上を含むウイルスベクターが提供される。一部の態様において、（ａ）請求項４～２０のいずれか１項に記載の融合タンパク質の第１の断片をコードする核酸を含む第１のウイルスベクターと、（ｂ）融合タンパク質の第２の断片をコードする第２のウイルスベクターとを含み、融合タンパク質の第１の断片および第２の断片が、タンパク質トランススプライシングを受けて融合タンパク質を形成し得る、１対のウイルスベクターが提供される。任意の態様において、第１および／または第２のウイルスベクターは、配列番号１または２を標的化するｇＲＮＡをコードする核酸をさらに含み得る。
本開示のさらなる態様は、本明細書において提供されるｇＲＮＡまたは融合タンパク質（もしくはその断片）をコードする任意の単離された核酸、本明細書において提供されるウイルスベクターおよび／または１対のウイルスベクター、ならびに薬学的に許容される担体、希釈剤および／または賦形剤を含む医薬組成物を提供する。一部の態様において、医薬組成物は、リポソームをさらに含み得る。
本開示のさらなる態様は、細胞内のＭＹＨ７遺伝子における突然変異を修正する方法であって、細胞へ、Ｃａｓ９ニッカーゼもしくは非活性化Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、デアミナーゼ、および配列番号１もしくは２のいずれか１つから選択されるＤＮＡヌクレオチド配列を標的化するｇＲＮＡ、またはＣａｓ９ニッカーゼもしくは非活性化Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、デアミナーゼおよび／もしくはｇＲＮＡをコードする１つもしくはそれ以上の核酸を送達して、ＭＹＨ７遺伝子内またはその近傍の少なくとも１つのヌクレオチドの１つまたはそれ以上の突然変異をもたらす、ＭＹＨ７遺伝子内またはその近傍における１つまたはそれ以上の一本鎖切断（ＳＳＢ）を引き起こし、これによって、ＭＹＨ７遺伝子における突然変異を修正することを含む方法を提供する。一部の態様において、方法は、細胞へ、本明細書において説明される核酸、ウイルスベクターまたはウイルスベクターの対を送達することを含む。
本開示のさらなる態様は、それを必要とする対象において、ＭＹＨ７遺伝子における突然変異によって引き起こされる心筋症を治療する方法であって、ＭＹＨ７遺伝子を発現する、対象における少なくとも１つの細胞へ、ＲＮＡによりガイドされるＤＮＡニッカーゼ、デアミナーゼ、および配列番号１もしくは２のいずれか１つから選択されるＤＮＡヌクレオチド配列を標的化するｇＲＮＡ、またはＲＮＡによりガイドされるニッカーゼ、デアミナーゼ、および／もしくはｇＲＮＡをコードする１つもしくはそれ以上の核酸を送達して、ＭＹＨ７遺伝子内またはその近傍の少なくとも１つのヌクレオチドの１つまたはそれ以上の突然変異をもたらす、ＭＹＨ７遺伝子内またはその近傍における１つまたはそれ以上の一本鎖切断（ＳＳＢ）を引き起こし、これによって、対象の少なくとも１つの細胞においてＭＹＨ７遺伝子における突然変異を修正することを含む方法を提供する。一部の態様において、方法は、本明細書において提供されるｇＲＮＡおよび／または融合タンパク質のうちの１つまたはそれ以上をコードする核酸または核酸を含むウイルスベクターを含む医薬組成物を対象に投与することを含む。様々な態様において、ＭＹＨ７遺伝子内の突然変異は、突然変異したＭＹＨ７遺伝子によってコードされるタンパク質生成物における単一のアミノ酸置換をもたらす１つまたはそれ以上の単一ヌクレオチド多型を含む。様々な態様において、タンパク質生成物は、ミオシンタンパク質またはペプチドであってもよく、単一のアミノ酸置換は、配列番号９６によるＲ４０３Ｑを含む。
本開示のさらなる態様は、ヒト化突然変異型Ｍｙｈ６対立遺伝子を形成するために、内因性マウスＭｙｈ６遺伝子内に挿入されたＭＹＨ７ ｃ．１２０８ Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｒ４０３Ｑ）ヒトミスセンス突然変異を含むヒト核酸を含む、遺伝子編集されたマウスを対象とする。一部の態様において、ヒト核酸は、ミスセンス突然変異に隣接しかつその上流にある第１のポリヌクレオチドと、ミスセンス突然変異に隣接しかつその下流にある第２のポリヌクレオチドとをさらに含む。様々な態様において、第１のポリヌクレオチドは、約３０～７５ヌクレオチド、約３５～約７０ヌクレオチド、約４０～約６５ヌクレオチドまたは約４５～約６０ヌクレオチドを含む。一部の態様において、第１のポリヌクレオチドは、５５ヌクレオチドを含むかまたはからなる。一部の態様において、第２のポリヌクレオチドは、約１０～３０ヌクレオチド、約１５～２５ヌクレオチドまたは約２０～２５ヌクレオチドを含む。さらなる態様において、第２のポリヌクレオチドは、２１ヌクレオチドを含むかまたはからなる。様々な態様において、ヒト核酸は、配列番号９７のヌクレオチド配列を含む。本明細書中の態様のいずれかにおいて、マウスの少なくとも１つの細胞は、配列番号９４を含む野生型ミオシンタンパク質と比較して、Ｒ４０４Ｑ置換を含む突然変異型ミオシンタンパク質を発現する。さらなる態様において、また、マウスは、野生型Ｍｙｈ６対立遺伝子を含んでもよく、マウスは、ヒト化突然変異型Ｍｙｈ６対立遺伝子についてヘテロ接合性である。
以下の図面は、本明細書の部分を形成し、本開示のある特定の態様をさらに実証するために含まれ、これらは、本明細書において示される特定の実施形態の詳細な説明と共に図面を参照することによって、より良く理解され得る。本発明の概念の実施形態は、例として例示され、この例においては、参照と同様に、数字は同様の要素を示す。
図１Ａ～１Ｃは、本開示の様々な態様による、ヒト細胞におけるＭＹＨ７突然変異の修正のために使用される例示的なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系を例示する代表的な模式図およびグラフを示す図である。図１Ａは、ｇＲＮＡ設計の例示的な概略を例示する図を示す。図１Ｂは、ヒトｉＰＳＣ細胞へのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系トランスフェクションの例示的な概略を例示する図を示す。図１Ｃは、ＭＹＨ７ Ｒ４０３Ｑ突然変異を修正するための例示的なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系の編集効率を例示するグラフを示す。 図２Ａおよび２Ｂは、本開示の様々な態様による、ヒト細胞におけるＭＹＨ７突然変異の修正のために使用される例示的なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系を例示する代表的な模式図およびグラフを示す図である。図２Ａは、ＭＹＨ７ Ｒ４０３Ｑ突然変異を修正するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系の投与後のヒトｉＰＳＣ細胞の分化の例示的な概略を例示する図を示す。図２Ｂは、ＭＹＨ７ Ｒ４０３Ｑ突然変異を修正するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系の投与後の、心筋細胞へ分化したヒトｉＰＳＣ細胞における高収縮性の減少を示すグラフを示す。 図３Ａおよび３Ｂは、本開示の様々な態様による、マウスミオシン重鎖６（Ｍｙｈ６）遺伝子（図３Ｂ）内においてヒトの同じ疾患を引き起こす突然変異を標的化するヒトＭＹＨ７ ｐ．Ｒ４０３Ｑ突然変異（図３Ａ）をモデル化するように生成された遺伝子改変マウス系統を例示する代表的な模式図を示す図である。 図４Ａ～４Ｅは、本開示の様々な態様による、発達段階Ｐ８の野生型（ＷＴ；図４Ａ）、４０３／＋（図４Ｂ）および４０３／４０３マウス（図４Ｃ）マウスの心臓表現型の発達、ならびに生後６ヶ月の野生型（ＷＴ；図４Ｄ）および４０３／＋（図４Ｅ）マウスの心臓線維症を例示する代表的な画像を示す図である。 図５は、本開示の様々な態様による、ヒトＭＹＨ７ ｐ．Ｒ４０３Ｑ突然変異のマウスモデルにおけるＭｙｈ６．Ｒ４０３Ｑ突然変異の修正のためのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系を例示する代表的な模式図を示す図である。 図６Ａは、相同組換え修復により同質遺伝子ＨＤ４０３／＋およびＨＤ４０３／４０３ｉＰＳＣを生成するための代表的な模式図を示す図である。健康なドナー（ＨＤＷＴ）に由来するｉＰＳＣを使用して、ＭＹＨ７ ｐ．Ｒ４０３Ｑ（ｃ．１２０８Ｇ＞Ａ）突然変異を、ＳｐＣａｓ９、ｓｇＲＮＡ（緑色で色付けしたスペーサー配列、金色で色付けしたＰＡＭ配列）、および突然変異を含有する一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）ドナー鋳型を使用する、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ベースの相同組換え修復により導入した。ヘテロ接合性遺伝子型（ＨＤ４０３／＋）およびホモ接合性遺伝子型（ＨＤ４０３／４０３）を単離した。突然変異挿入および対応するアミノ酸変化を強調するクロマトグラムを、示される遺伝子型について示す。赤色矢印は、アミノ酸４０３におけるコードヌクレオチド１２０８を示す。 図６Ｂは、高相同性ＭＹＨ６遺伝子上に突然変異挿入がないことを示すサンガーシークエンシングクロマトグラムを示す図である。赤色矢印は、コードヌクレオチド１２１１およびアミノ酸４０４を示す。 図６Ｃは、図６Ａ～６Ｂにおいて生成されたｉＰＳＣに由来する心筋細胞の代表的な画像を示す図である。（アルファ－アクチニンは緑色で色付けし、核は青色のＤＡＰＩ（４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール）によって示される）。スケールバーは２５μｍ。 図７Ａは、例示的なｓｇＲＮＡである、ｈ４０３＿ｓｇＲＮＡが、ＭＹＨ７ ｃ．１２０８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｒ４０３Ｑ）ミスセンス突然変異を修正するための塩基編集の方法においてどのように使用され得るかを示す図である。具体的には、塩基編集は、突然変異性中性荷電グルタミンを正荷電アルギニンに変換し戻し、ミオシンヘッドの適切な機能を回復させることができた。 図７Ｂは、一部の例示的な方法において、８つの候補塩基エディターバリアントが、ホモ接合性ＭＹＨ７ ｃ．１２０８Ｇ＞Ａ ｉＰＳＣ株（ＨＤ４０３／４０３）内において、候補ｈ４０３＿ｓｇＲＮＡを使用して病原性アデニンをグアニンに修正することにおけるそれらの効率についてどのようにスクリーニングされたかを例示する図である。 図７Ｃは、候補塩基エディターのトランスフェクション７２時間後のＨＤ４０３／４０３ ｉＰＳＣにおける標的プロトスペーサー内のすべてのアデニンのＤＮＡ編集効率を示す代表的な棒グラフを示す図である。データは３つの技術的反復にわたる平均値±ｓ．ｄ．である。番号付けは、ＰＡＭの５’の最初の塩基を１とし、標的突然変異性アデニンはＡ１６位である。 図８Ａは、健康なドナー（ＨＤ）ならびに２人のＨＣＭ患者（ＨＣＭ１およびＨＣＭ２）からのｉＰＳＣをリプログラミングし、続いてＨＤ株について突然変異ノックイン、ならびにＨＤＭ１およびＨＣＭ２株について塩基編集修正をするためのワークフローを示す図である。同質遺伝子クローン株を単離し、ＣＭに分化させ、ｉＰＳＣ－ＣＭ機能の下流解析に使用した。 図８Ｂは、オンターゲットプロトスペーサー、ｈ４０３＿ｓｇＲＮＡ内のすべてのアデニン残基の編集を測定するディープシークエンシング実験からの結果を示す図である。標的病原性アデニンは、Ａ１６である。ディープシークエンシングを、ＡＢＥ処理ＭＹＨ７４０３／＋ＨＣＭ１およびＭＹＨ７４０３／＋ＨＣＭ２ ｉＰＳＣについて行った。 図８Ｃは、ＨＤ、ＨＣＭ１およびＨＣＭ２患者からのＭＹＨ７４０３／＋およびＭＹＨ７ＷＴ ｉＰＳＣ－ＣＭの収縮期力のピークを示す図である。対応のないスチューデント両側ｔ検定による＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。 図８Ｄは、電子伝達系複合体阻害剤である、オリゴマイシン、カルボニルシアニドｍ－クロロフェニルヒドラゾン（ＣＣＣＰ）およびアンチマイシンＡ（ＡｎｔＡ）への曝露後の、示される細胞株における時間の関数としての酸素消費速度（ＯＣＲ）（上部）、ならびに示される細胞株についての基線ＯＣＲの４つの時点にわたる値の平均値および分布（下部左）ならびに最大ＯＣＲ（下部右）を示す図である。対応のないスチューデント両側ｔ検定による＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。 図９は、上位８位までのＣＲＩＳＰＯＲにより特定した候補オフターゲット遺伝子座のプロトスペーサー内の５８個のアデニンについての編集を測定するためのディープシークエンシング解析からの結果を示す図である。 図１０は、グルタミン４０３の周囲のアミノ酸レベル（上部）およびＤＮＡ配列レベル（下部）におけるマウスα－ミオシン重鎖（Ｍｙｈ６）およびヒトβ－ミオシン重鎖（ＭＹＨ７）についての相同性比較を示す図である。ｈ４０３＿ｓｇＲＮＡは緑色で示され、ＰＡＭ配列は黄色で示される。ＰＡＭのすぐ５’のアデニンヌクレオチドを１位としてカウントすると、病原性ｃ．１２０８ Ｇ＞Ａヌクレオチドは、１４～１７位の標準塩基編集ウィンドウ内にある。 図１１Ａは、ネイティブマウスＭｙｈ６ゲノム配列の部分を、ｐ．Ｒ４０３Ｑ突然変異を含有するヒトＭＹＨ７配列で置換することによって、ヒト化ＨＣＭマウスモデルがどのように生成されたかを示す図である。サンガーシークエンシングクロマトグラムは、ネイティブＭｙｈ６ＷＴ配列（上部）、ヒト化Ｍｙｈ６ｈ４０３／＋マウスモデル配列（中央）および患者由来ｉＰＳＣ株配列（下部）を示す。黄色の四角は、ノックインされたヒトヌクレオチドを示す。 図１１Ｂは、生後８日における野生型（左）、ヘテロ接合性（中央）およびホモ接合性（右）遺伝子型についての、ヒト化マウスモデルの全組織（上部）、ならびに冠状断面（四腔）（中央）および横断面（下部）のマッソン・トリクローム染色を示す図である。スケールバーは１ｍｍ。 図１１Ｃは、９月齢における野生型（左）およびヘテロ接合性（右）遺伝子型についての、ヒト化マウスモデルの心臓切片のマッソン・トリクローム、ピクロシリウス・レッドならびにヘマトキシリンおよびエオシン染色を示す図である。スケールバーは、上部の１０倍画像について１ｍｍ、中央の１０倍画像について１００μｍ、下部の４０倍画像について２５μｍ。 図１２Ａは、ヒトＭＹＨ７ ｐ．Ｒ４０３Ｑ突然変異を標的化するＡＢＥｍａｘ－ＶＲＱＲ塩基エディター半分およびｈ４０３＿ｓｇＲＮＡをコードするデュアルＡＡＶ９－ＡＢＥ系の模式図を示す図である。 図１２Ｂは、Ｐ０におけるＭｙｈ６ｈ４０３／＋またはＭｙｈ６ｈ４０３／＋マウスへの食塩水またはデュアルＡＡＶ９ ＡＢＥの胸腔内注射、および続く連続心エコーについての実験概要を示す図である。０．１％シクロスポリンＡを補充した固形飼料餌を５週齢において１１週間与えた。 図１２Ｃは、８～１６週齢のＭｙｈ６ＷＴマウス、Ｍｙｈ６ｈ４０３／＋マウスまたはＡＢＥ処置Ｍｙｈ６ｈ４０３／＋マウスの、拡張期における左心室前壁の厚さを示す図である。各群についてｎ＝５。 図１２Ｄは、８～１６週齢のＭｙｈ６ＷＴマウス、Ｍｙｈ６ｈ４０３／＋マウスまたはＡＢＥ処置Ｍｙｈ６ｈ４０３／＋マウスの、拡張期における左心室後壁の厚さを示す図である。各群についてｎ＝５。 図１２Ｅは、８～１６週齢のＭｙｈ６ＷＴマウス、Ｍｙｈ６ｈ４０３／＋マウスまたはＡＢＥ処置Ｍｙｈ６ｈ４０３／＋マウスの、拡張期における左心室内部直径を示す図である。各群についてｎ＝５。 図１２Ｆは、８～１６週齢のＭｙｈ６ＷＴマウス、Ｍｙｈ６ｈ４０３／＋マウスまたはＡＢＥ処置Ｍｙｈ６ｈ４０３／＋マウスの、収縮期における左心室内部直径を示す図である。各群についてｎ＝５。 図１２Ｇは、８～１６週齢のＭｙｈ６ＷＴマウス、Ｍｙｈ６ｈ４０３／＋マウスまたはＡＢＥ処置Ｍｙｈ６ｈ４０３／＋マウスの、駆出率を示す図である。各群についてｎ＝５。 図１２Ｈは、８～１６週齢のＭｙｈ６ＷＴマウス、Ｍｙｈ６ｈ４０３／＋マウスまたはＡＢＥ処置Ｍｙｈ６ｈ４０３／＋マウスの、短縮率を示す図である。各群についてｎ＝５。 図１２Ｉは、Ｍｙｈ６ＷＴマウス、Ｍｙｈ６ｈ４０３／＋マウスまたはＡＢＥ処置Ｍｙｈ６ｈ４０３／＋マウスについての、連続（５００μｍ間隔）横断面の代表的なマッソン・トリクローム染色を示す図である。スケールバーは１ｍｍ。 図１２Ｊは、１２Ｉにおける各実験群についてｎ＝３～５匹のマウスからの心室横断面積を示す図である。データは、平均値±ｓ．ｄ．である。対応のないスチューデント両側ｔ検定による＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。 図１２Ｋは、１２Ｉにおける各実験群についてｎ＝３～５匹のマウスからの平均の壁の厚さを示す図である。データは、平均値±ｓ．ｄ．である。対応のないスチューデント両側ｔ検定による＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。 図１２Ｌは、１２Ｉにおける各実験群についてｎ＝３～５匹のマウスからの脛骨の長さ（ＴＬ）に対する心重量（ＨＷ）を示す図である。データは、平均値±ｓ．ｄ．である。対応のないスチューデント両側ｔ検定による＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。 図１２Ｍは、１２Ｉにおける各実験群についてｎ＝３～５匹のマウスからのコラーゲン面積の百分率を示す図である。データは、平均値±ｓ．ｄ．である。対応のないスチューデント両側ｔ検定による＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。 図１３Ａは、Ｍｙｈ６ｈ４０３／ｈ４０３マウスをＡＢＥ－ＡＡＶ９または食塩水により処置するための注射の詳細を示す図である。 図１３Ｂは、低（ＡＡＶ低、ｎ＝３）または高用量（ＡＡＶ高、ｎ＝５）での、Ｍｙｈ６ＷＴマウス（ｎ＝７）、Ｍｙｈ６ｈ４０３／＋マウス（ｎ＝８）、Ｍｙｈ６ｈ４０３／ｈ４０３マウス（ｎ＝６）およびＡＢＥ処置Ｍｙｈ６ｈ４０３／ｈ４０３マウスについての代表的なカプラン・マイヤー曲線を示す図である。寿命中央値は、Ｍｙｈ６ＷＴおよびＭｙｈ６ｈ４０３／＋マウス、４０日超；Ｍｙｈ６ｈ４０３／ｈ４０３マウス、７日；ＡＡＶ低Ｍｙｈ６ｈ４０３／ｈ４０３マウス、９日（１．３倍長い、Ｐ＜０．０５）；ＡＡＶ高Ｍｙｈ６ｈ４０３／ｈ４０３マウス、１５日（２．１倍長い、Ｐ＜０．０１）。マンテル・コックス検定による＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。 図１３Ｃは、ｃＤＮＡレベルにおける標的病原性アデニンの３５％のオンターゲット編集を示す、Ｍｙｈ６ｈ４０３／ｈ４０３マウスおよびＡＡＶ高Ｍｙｈ６ｈ４０３／ｈ４０３マウスについてのサンガーシークエンシングクロマトグラムを示す図である。 図１３Ｄは、１５日齢におけるＡＡＶ高Ｍｙｈ６ｈ４０３／ｈ４０３マウスの四腔区画およびマッソン・トリクローム染色を示す図である。 図１４Ａは、マウスにおけるデュアルＡＡＶ９ ＡＢＥ注射後にゲノムおよびトランスクリプトーム変化を測定するための概要を示す図である。心筋細胞核を１８週齢のＭｙｈ６ＷＴマウス、Ｍｙｈ６ｈ４０３／＋マウスまたはＡＢＥ処置Ｍｙｈ６ｈ４０３／＋マウスから単離して、ゲノム修正およびトランスクリプトーム変化を評価した。 図１４Ｂは、デュアルＡＡＶ９ ＡＢＥ処置後の、病原性アデニンヌクレオチドを修正することについてのＤＮＡ編集効率を示す図である。データは、平均値±ｓ．ｄ．である。 図１４Ｃは、Ｍｙｈ６ｈ４０３／＋マウスと比較した、ＡＢＥ処置Ｍｙｈ６ｈ４０３／＋マウスにおける発現された突然変異型転写産物の百分率を示す図である。データは、平均値±ｓ．ｄ．である。対応のないスチューデント両側ｔ検定による＊Ｐ＜０．０５、各群についてｎ＝３の生物学的反復。 図１４Ｄは、食塩水処置マウスと比較した、ＡＢＥ処置Ｍｙｈ６ｈ４０３／＋マウスにおけるバイスタンダー編集を示す図である。データは、平均値±ｓ．ｄ．である。対応のないスチューデント両側ｔ検定による＊Ｐ＜０．０５、各群についてｎ＝３の生物学的反復。 図１４Ｅは、Ｍｙｈ６ＷＴマウス、Ｍｙｈ６ｈ４０３／＋マウスおよびＡＢＥ処置Ｍｙｈ６ｈ４０３／＋マウスにおけるＡ－ｔｏ－Ｉ ＲＮＡ編集のトランスクリプトーム－ワイド核レベルを示す図である。データは、平均値±ｓ．ｄ．である。 図１４Ｆは、Ｍｙｈ６ＷＴまたはＭｙｈ６ｈ４０３／＋マウスおよびＡＢＥ処置Ｍｙｈ６ｈ４０３／＋マウスにおいて２５７個の差次的に発現された遺伝子のヒートマップを示す図である。試料および遺伝子は、階層クラスタリングによって整列される。データは、各列の合計によって尺度付けられ、最小列および最大列として表示される。ＡＢＥ処置Ｍｙｈ６ｈ４０３／＋マウスは、Ｍｙｈ６ＷＴマウスとクラスター化する。 図１４Ｇは、Ｍｙｈ６ＷＴマウスについて正規化されたＭｙｈ６ｈ４０３／＋マウスおよびＡＢＥ処置Ｍｙｈ６ｈ４０３／＋マウスについてのＮｐｐａ ｍＲＮＡ発現の倍数変化発現を示す図である。ＲＮＡ－ｓｅｑおよびｑＰＣＲからのデータ。データは、平均値±ｓ．ｄ．である。対応のないスチューデント両側ｔ検定による＊Ｐ＜０．０５、各群についてｎ＝３の生物学的反復。 図１５Ａは、１６週齢におけるＭｙｈ６ＷＴマウス、Ｍｙｈ６ｈ４０３／＋マウスまたはＡＢＥ処置Ｍｙｈ６ｈ４０３／＋マウスについての代表的なＭモード画像を示す図である。 図１５Ｂは、Ｍｙｈ６ＷＴマウスと比較した、Ｍｙｈ６ｈ４０３／＋マウスにおけるアップレギュレートされた（赤色）およびダウンレギュレートされた（青色）遺伝子の倍数変化およびｐ値を示す代表的なボルケーノプロットを示す図である。 図１５Ｃは、Ｍｙｈ６ｈ４０３／＋マウスと比較した、ＡＢＥ処置Ｍｙｈ６ｈ４０３／＋マウスにおけるアップレギュレートされた（赤色）およびダウンレギュレートされた（青色）遺伝子の倍数変化およびｐ値を示す代表的なボルケーノプロットを示す図である。 図１５Ｄは、Ｍｙｈ６ＷＴマウスと比較した、ＡＢＥ処置Ｍｙｈ６ｈ４０３／＋マウスにおけるアップレギュレートされた（赤色）およびダウンレギュレートされた（青色）遺伝子の倍数変化およびｐ値を示す代表的なボルケーノプロットを示す図である。
以下の詳細な説明は、本発明の概念の様々な実施形態を例示する附属の図面を参照する。図面および説明は、当業者が本発明の概念を実施することを可能にするのに十分に詳細に、本発明の概念の態様および実施形態を説明することを意図する。本発明の概念の範囲から逸脱することなく、他の成分を利用してもよく、改変を行ってもよい。それゆえ、以下の説明は、限定的な意味においてとられるべきではない。本発明の概念の範囲は、附属の特許請求の範囲、およびそのような特許請求の範囲が権利を与えられる均等物の全範囲によってのみ定義される。
本開示は、少なくとも部分的には、塩基対編集を通じて遺伝子突然変異を修正することにより、家族性心筋症ＨＣＭと関連付けられる表現型をうまく逆行させる、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）－ＣＲＩＳＰＲ会合タンパク質９（Ｃａｓ９）系を伴う使用のためのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の発見に基づく。様々な態様において、また、本開示は、デアミナーゼとＣａｓ９関連ニッカーゼ（例えば、一本鎖切断を生成するエンドヌクレアーゼ）とを組み合わせて、これらの遺伝子突然変異を修正するための塩基対編集を行う新規融合タンパク質を提供する。したがって、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系のために設計されたシングルガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む組成物、および１つまたはそれ以上の心筋症を予防、改善または治療するためのその使用方法が本明細書において提供される。また、本明細書において提供される組成物および方法を試験するために使用され得る、ＨＣＭと関連付けられる突然変異を含むマウスモデルが提供される。
Ｉ．用語
本明細書において用いられる語法および用語は、説明の目的のためであり、限定としてみなされるべきではない。例えば、単数の用語、例えば「ａ」の使用は、品目の数の限定として意図されない。また、関連用語、例えば非限定的に「上」、「下」、「左」、「右」、「上部」、「下部」、「下へ」、「上へ」および「側」の使用は、図面についての特定の参照において明確にするために説明において使用され、本発明の概念の範囲または附属の特許請求の範囲を限定するとは意図されない。
さらに、本発明の概念は多くの様々な形態の実施形態を受け入れやすいので、本開示は本発明の概念の原理の一例として考えられ、本発明の概念を、示されかつ説明される特定の実施形態に限定するとは意図されないことが意図される。本発明の概念の特性の任意の１つは、別々に、または他の任意の特性と組み合わせて使用され得る。説明における「実施形態（単数）」、「実施形態（複数）」という用語および／または同様のものについての言及は、言及される特性（単数）および／または特性（複数）が少なくとも説明の一態様に含まれることを意味する。説明における「実施形態（単数）」、「実施形態（複数）」という用語および／または同様のものについての別々の言及は、そのように説明されない限りおよび／または説明から当業者に容易に明らかである場合を除外して、必ずしも同じ実施形態を言及せず、また、相互に排他的ではない。例えば、一実施形態において説明される特性、構造、プロセス、ステップ、作用その他は、他の実施形態にも含まれ得るが、必ずしも含まれない。したがって、本発明の概念は、本明細書において説明される実施形態の様々な組合せおよび／または統合を含み得る。加えて、本明細書において説明される本開示のすべての態様は、その実施に必須ではない。同様に、本発明の概念の他の系、方法、特性および利点は、図面および説明を吟味すれば当業者に明らかであるか、または明らかになる。すべてのそのような追加の系、方法、特性および利点は本説明に含まれ、本発明の概念の範囲内であり、特許請求の範囲によって包含されることが意図される。
本明細書において使用される場合、「約」という用語は、列挙される値、例えば、量、用量、温度、時間、百分率などと比較して、±１０％、±９％、±８％、±７％、±６％、±５％、±４％、±３％、±２％または±１％を意味し得る。
「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「を包含する」および「を有する」という用語は、本開示において互換的に使用される。「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「を包含する」および「を有する」という用語は、そのように説明されるものを含むが、必ずしもそれに限定されないことを意味する。
「または」および「および／または」という用語は、本明細書において使用される場合、包括的なもの、または任意の１つもしくは任意の組合せを意味するものとして解釈すべきである。それゆえ、「Ａ、ＢまたはＣ」または「Ａ、Ｂおよび／またはＣ」とは、「Ａ」、「Ｂ」または「Ｃ」；「ＡおよびＢ」；「ＡおよびＣ」；「ＢおよびＣ」；「Ａ、ＢおよびＣ」のいずれかを意味する。この定義の例外は、要素、機能、ステップまたは行為がなんらかの方法で本質的に相互に排他的である場合のみ起こる。
本明細書において使用される場合、「治療する」、「治療すること」、「治療」などの用語は、別のように示されない限り、そのような用語が適用される疾患、障害もしくは状態、またはそのような疾患、障害もしくは状態の１つもしくはそれ以上の症状を逆行させるか、緩和するか、そのプロセスを阻害するか、または予防することを指す場合があり、症状もしくは合併症の開始を予防し、または症状もしくは合併症を緩和し、または状態もしくは障害を除去するための、本明細書において説明される組成物、医薬組成物または剤形のいずれかの投与を含む。
「核酸」または「ポリヌクレオチド」という用語は、一本鎖または二本鎖形態のいずれかの、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）およびそれらのポリマーを指す。具体的に限定されない限り、この用語は、参照核酸と類似する結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドと同様の様式において代謝される、天然ヌクレオチドの公知のアナログを含有する核酸を包含する。別に示されない限り、また、特定の核酸配列は、明確に示される配列はもちろん、保存的に改変されたそのバリアント（例えば、縮重コドン置換）、対立遺伝子、オルソログ、ＳＮＰおよび相補的配列を暗に包含する。具体的に、縮重コドン置換は、１つまたはそれ以上の選択された（またはすべての）コドンの第３の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基により置換された配列を生成することによって達成され得る（Ｂａｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． １９：５０８１ （１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６０：２６０５－２６０８ （１９８５）；およびＲｏｓｓｏｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１－９８ （１９９４））。
「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、互換的に使用され、ペプチド結合によって共有結合されるアミノ酸残基からなる化合物を指す。タンパク質またはペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含有しなければならず、タンパク質またはペプチドの配列を構成し得るアミノ酸の最大数に限定はない。ポリペプチドは、ペプチド結合によって互いに接合される２つまたはそれ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質を含む。本明細書において使用される場合、この用語は、当該技術分野において一般に、例えば、ペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーとも称される短鎖、ならびに当該技術分野において一般的にタンパク質と称され、その多くのタイプが存在する、より長い鎖の両方を指す。「ポリペプチド」として、例えば、数ある中で、生物学的に活性な断片、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドのバリアント、改変されたポリペプチド、誘導体、アナログ、融合タンパク質が挙げられる。ポリペプチドは、天然ペプチド、組換えペプチドまたはそれらの組合せを含む。
また、明らかにそれに反することが示されない限り、２つ以上のステップまたは行為を含む本明細書において請求される任意の方法において、方法のステップまたは行為の順序は、方法のステップまたは行為が列挙される順序に必ずしも限定されないことを理解すべきである。
ＩＩ．組成物
本開示は、１つまたはそれ以上の心筋症を予防、改善または治療するための組成物を提供する。一部の実施形態において、本明細書中の組成物は、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含み得る。一部の実施形態において、本明細書中の組成物は、ＲＮＡによりガイドされるエンドヌクレアーゼに共有結合されたデアミナーゼを含む融合タンパク質を含み得る。一部の実施形態において、本明細書中の組成物は、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）－ＣＲＩＳＰＲ会合タンパク質９（Ｃａｓ９）系を含み得る。一部の実施形態において、本明細書中の組成物は、本明細書において開示されるｇＲＮＡおよび／またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系の送達のためのＡＡＶベクター、ＡＡＶウイルス粒子またはそれらの組合せを含み得る。一部の実施形態において、本明細書中の組成物は、１つまたはそれ以上の医薬組成物を形成するように製剤化され得る。
（ａ）ｇＲＮＡ
一般的に、ガイドポリヌクレオチドは、適合する核酸誘導型ヌクレアーゼと複合体形成することができ、標的配列とハイブリダイズすることができ、これによって、ヌクレアーゼを標的配列へ方向付ける。ガイドポリヌクレオチドと複合体形成することができる対象の核酸誘導型ヌクレアーゼは、ガイドポリヌクレオチドと適合性である核酸誘導型ヌクレアーゼと称され得る。加えて、核酸誘導型ヌクレアーゼと複合体形成することが可能なガイドポリヌクレオチドは、核酸誘導型ヌクレアーゼと適合性であるガイドポリヌクレオチドまたはガイド核酸と称され得る。
一部の実施形態において、本明細書において開示される操作されたポリヌクレオチド（ｇＲＮＡ）は、合成ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡを包含する断片に分けられ得る。一部の態様において、本明細書中のｇＲＮＡは、５’－ＣＣＴ ＣＡＧ ＧＴＧ ＡＡＡ ＧＴＧ ＧＧＣ ＡＡ－３’（配列番号１）のヌクレオチド配列との少なくとも８５％の配列同一性（例えば、約８５％、９０％、９５％、９９％、１００％）を有する核酸配列を含み得る。一部の態様において、本明細書中のｇＲＮＡは、５’－ＣＣＴ ＣＡＧ ＧＴＧ ＡＡＧ ＧＴＧ ＧＧＧ ＡＡ－３’（配列番号２）のヌクレオチド配列との少なくとも８５％の配列同一性（例えば、約８５％、９０％、９５％、９９％、１００％）を有する核酸配列を含み得る。一部の態様において、本明細書中のｇＲＮＡは、５’－ＣＣＵ ＣＡＧ ＧＵＧ ＡＡＡ ＧＵＧ ＧＧＣ ＡＡ－３’（配列番号５）のヌクレオチド配列との少なくとも８５％の配列同一性（例えば、約８５％、９０％、９５％、９９％、１００％）を有する核酸配列を含み得る。一部の態様において、本明細書中のｇＲＮＡは、５’－ＣＣＵ ＣＡＧ ＧＵＧ ＡＡＧ ＧＵＧ ＧＧＧ ＡＡ－３’（配列番号６）のヌクレオチド配列との少なくとも８５％の配列同一性（例えば、約８５％、９０％、９５％、９９％、１００％）を有する核酸配列を含み得る。一部の態様において、本明細書中のｇＲＮＡは、５’－ＣＣＴ ＣＡＧ ＧＴＧ ＡＡＡ ＧＴＧ ＧＧＣ ＡＡ－３’（配列番号１）の核酸配列を含み得る。一部の態様において、本明細書中のｇＲＮＡは、５’－ＣＣＴ ＣＡＧ ＧＴＧ ＡＡＧ ＧＴＧ ＧＧＧ ＡＡ－３’（配列番号２）のヌクレオチド配列を含み得る。一部の態様において、本明細書中のｇＲＮＡは、ＣＣＵ ＣＡＧ ＧＵＧ ＡＡＡ ＧＵＧ ＧＧＣ ＡＡ－３’（配列番号５）のヌクレオチド配列を含み得る。一部の態様において、本明細書中のｇＲＮＡは、５’－ＣＣＵ ＣＡＧ ＧＵＧ ＡＡＧ ＧＵＧ ＧＧＧ ＡＡ－３’（配列番号６）のヌクレオチド配列を含み得る。
一部の実施形態において、本明細書中のｇＲＮＡは、改変されたまたは天然に存在しないヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、本明細書において開示されるプラスミド、直鎖状構築物または編集カセットなどのポリヌクレオチド分子上のＤＮＡ配列によってコードされ得る。一部の態様において、ｇＲＮＡは、配列番号１を含むＤＮＡ配列によってコードされ得る。一部の態様において、ＲＮＡガイドポリヌクレオチドは、配列番号２を含むＤＮＡ配列によってコードされ得る。
一部の実施形態において、本明細書中のガイドポリヌクレオチド（例えば、ｇＲＮＡ）は、スペーサー配列を含み得る。スペーサー配列は、標的配列とハイブリダイズし、複合体形成した、核酸誘導型ヌクレアーゼの、標的配列への配列特異的結合を指示するのに十分な、標的ポリヌクレオチド配列との相補性を有するポリヌクレオチド配列である。換言すれば、ｇＲＮＡ分子のスペーサー配列は、ＤＮＡ配列「を標的化する」かまたはＤＮＡ配列「に対応する」と理解される。ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、好適な整列アルゴリズムを使用して最適に整列された場合、約５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％もしくはそれ以上、または約５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％超もしくはそれ以上であり得る。最適整列は、配列を整列するための任意の好適なアルゴリズムの使用により決定され得る。一部の実施形態において、本明細書中のガイド配列は、約５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、７５もしくはそれ以上、または約５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、７５超もしくはそれ以上のヌクレオチドの長さであり得る。他の実施形態において、本明細書中のスペーサー配列は、約７５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０ヌクレオチド未満の長さであり得る。好ましくは、スペーサー配列は、１０～３０ヌクレオチドの長さである。一部の態様において、本明細書中のスペーサー配列は、１５～２０ヌクレオチドの長さであり得る。
一部の実施形態において、本明細書中のガイドポリヌクレオチド（例えば、ｇＲＮＡ）は、スキャフォールド配列を含み得る。一般的に「スキャフォールド配列」とは、標的化可能なヌクレアーゼ複合体（例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系）の形成を促進するのに十分な配列を有する任意の配列を含む場合があり、ここで、標的化可能なヌクレアーゼ複合体とは、核酸誘導型ヌクレアーゼを含むが、これに限定されず、ガイドポリヌクレオチドとは、スキャフォールド配列およびガイド配列を含み得る。標的化可能なヌクレアーゼ複合体の形成を促進するのに十分な、スキャフォールド配列内の配列は、スキャフォールド配列内の２つの配列領域、例えば、二次構造の形成に関与する１つまたは２つの配列領域の長さに沿ってある程度の相補性を含み得る。一部の態様において、１つまたは２つの配列領域は、同じポリヌクレオチド上に含まれるか、またはこれにコードされ得る。一部の態様において、１つまたは２つの配列領域は、別々のポリヌクレオチド上に含まれるか、またはこれらにコードされ得る。最適整列は、任意の好適な整列アルゴリズムによって決定することができ、１つまたは２ついずれかの配列領域内の二次構造、例えば自己相補性をさらに考慮してもよい。一部の実施形態において、最適に整列された場合の２つのうちのより短いほうの長さに沿った、１つまたは２つの配列領域間の相補性の程度は、約２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７．５％、９９％もしくはそれより高いか、または約２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７．５％、９９％超もしくはそれより高い。一部の実施形態において、２つの配列領域のうちの少なくとも１つは、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０もしくはそれ以上、または約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０超もしくはそれ以上のヌクレオチドの長さであり得る。
一部の実施形態において、本明細書中の主題のガイドポリヌクレオチドのスキャフォールド配列は、二次構造を含み得る。一部の実施形態において、二次構造は、シュードノット領域を含み得る。一部の実施形態において、本明細書中のガイドポリヌクレオチドの、核酸誘導型ヌクレアーゼへの結合動態は、部分的には、スキャフォールド配列内の二次構造によって決定される。一部の実施形態において、本明細書中のガイドポリヌクレオチドの、核酸誘導型ヌクレアーゼへの結合動態は、部分的には、スキャフォールド配列を有する核酸配列によって決定される。
ある特定の実施形態において、置換ｇＲＮＡ配列がいつ作出されるか、または欠失もしくは挿入突然変異体がいつ作出されるかを試験するために、スペーサー突然変異がプラスミドへ導入され得る。これらのプラスミド構築物の各々は、ゲノム編集の正確さおよび効率、例えば欠失、置換または挿入を有することを試験するために使用され得る。あるいは、一部の実施形態において、本明細書において開示される組成物および方法によって作出されたｇＲＮＡ構築物は、所定の期間にわたって編集効率を観察することによって、選択標的に対する最適ゲノム編集時間について試験され得る。これらの実施形態に従って、本明細書において開示される組成物および方法によって作出されたｇＲＮＡ構築物は、編集効率および正確さを最適化するために、最適ゲノム編集ウィンドウについて試験され得る。
本明細書において開示される操作されたｇＲＮＡの使用のための標的ポリヌクレオチドの例として、シグナル伝達生化学経路と関連付けられる配列／遺伝子または遺伝子セグメント、例えばシグナル伝達生化学経路関連遺伝子またはポリヌクレオチドが挙げられ得る。本明細書において開示される操作されたｇＲＮＡの使用のための標的ポリヌクレオチドの、本明細書において企図される他の実施形態に関連する例は、疾患関連遺伝子またはポリヌクレオチドに関連するものを含み得る。
「疾患関連」または「障害関連」遺伝子またはポリヌクレオチドとは、対照と比較して異常なレベルの転写もしくは翻訳産物をもたらすか、または非疾患対照の組織もしくは細胞と比較して疾患に影響される組織に由来する細胞において異常な形態をもたらす任意の遺伝子またはポリヌクレオチドを指し得る。それは異常に高レベルで発現されるようになる遺伝子であってもよく、それは異常に低レベルで発現されるようになる遺伝子であってもよく、または遺伝子が１つもしくはそれ以上の突然変異を含有する場合、および変更された発現もしくは突然変異した遺伝子の発現が健康状態もしくは障害の発生および／もしくは進行と直接的に相関する場合であってもよい。疾患または障害関連遺伝子とは、疾患または障害の原因または進行の直接的な原因であるか、またはその原因である遺伝子と連鎖不平衡にある突然変異または遺伝子変動を有する遺伝子を指し得る。転写または翻訳された生成物は、公知であっても、未知であってもよく、正常レベルであっても、異常レベルであってもよい。
一部の実施形態において、本明細書において開示されるｇＲＮＡは、心筋症関連遺伝子またはポリヌクレオチドに関連するポリヌクレオチドを標的化し得る。一部の態様において、心筋症関連遺伝子またはポリヌクレオチドは、ＨＣＭ関連遺伝子またはポリヌクレオチドであり得る。一部の実施形態において、本明細書において開示されるｇＲＮＡは、心筋症関連遺伝子、例えば、非限定的に、ＴＴＮ、ＭＹＨ７、ＭＹＨ６、ＭＹＰＮ、ＴＮＮＴ２、ＴＰＭ１またはそれらの任意の組合せに関連するポリヌクレオチドを標的化し得る。一部の態様において、本明細書において開示されるｇＲＮＡは、１つまたはそれ以上の心筋症関連遺伝子、例えば、ＭＹＨ７、ＭＹＢＰＣ３、ＴＮＮＣ１またはそれらの組合せに関連するポリヌクレオチドを標的化し得る。
一部の実施形態において、本明細書において開示されるｇＲＮＡは、１つまたはそれ以上の突然変異を有する心筋症関連遺伝子またはポリヌクレオチドに関連するポリヌクレオチドを標的化し得る。一部の実施形態において、本明細書において開示されるｇＲＮＡは、１つまたはそれ以上の突然変異を有する心筋症関連遺伝子に関連するポリヌクレオチドを標的化する場合があり、ここで、心筋症関連遺伝子は、ＴＴＮ、ＭＹＨ７、ＭＹＨ６、ＭＹＰＮ、ＴＮＮＴ２、ＴＰＭ１またはそれらの任意の組合せであり得る。一部の態様において、本明細書において開示されるｇＲＮＡは、１つまたはそれ以上の突然変異を有する心筋症関連遺伝子に関連するポリヌクレオチドを標的化する場合があり、ここで、心筋症関連遺伝子は、ＭＹＨ７またはその組合せであり得る。一部の例において、本明細書において開示されるｇＲＮＡは、ＭＹＨ７遺伝子またはその哺乳動物の同等物においてＲ４０３Ｑ突然変異に関連するポリヌクレオチドを標的化し得る。
（ｂ）塩基エディター
塩基編集は、遺伝子ベースの疾患を修正し、潜在的に治癒させる魅力的な方法として出現した。塩基エディターは、Ｃａｓ９ニッカーゼまたは非活性化Ｃａｓ９とデアミナーゼタンパク質との融合タンパク質であり、これは、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）部位に関連する規定の編集ウィンドウ内において、二本鎖切断を伴わずに塩基対編集を可能にする。アデニン塩基エディター（ＡＢＥ）は、デオキシアデノシンデアミナーゼを使用して、イノシン中間体を介して、ＤＮＡ Ａ・Ｔ塩基対をＧ・Ｃ塩基対に変換し、インビボおよびインビトロで多くの有糸分裂後細胞において機能することが以前に示されている。
したがって、一部の実施形態において、本明細書中の組成物は、デアミナーゼとＣａｓ９ニッカーゼまたは非活性化Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼとを含む融合タンパク質をさらに含む。好適なデアミナーゼおよびＣａｓ９ニッカーゼまたは非活性化Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、以下により詳細に説明される。一部の態様において、融合タンパク質は、デアミナーゼとＲＮＡによりガイドされるエンドヌクレアーゼとを接続するフレキシブルペプチドリンカーをさらに含み得る。さらに他の態様において、他の二次成分（例えば、核局在化配列）もまた、融合タンパク質に含まれ得る。
一部の実施形態において、本明細書において提供される塩基エディターは、１つまたはそれ以上のタンパク質ドメインを含み、これによって、塩基エディターを生成する組換え融合タンパク質として製造され得る。ある特定の実施形態において、本明細書において提供される塩基エディターは、塩基エディタータンパク質の塩基編集活性（例えば、効率、選択性および／または特異性）を改善する１つまたはそれ以上の特性を含む。例えば、本明細書において提供される塩基エディタータンパク質は、ヌクレアーゼ活性が低減したＣａｓ９ドメインを含み得る。一部の実施形態において、本明細書において提供される塩基エディタータンパク質は、ヌクレアーゼ活性を有しないＣａｓ９ドメイン（ｄＣａｓ９）、またはＣａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）と称される、二重鎖ＤＮＡ分子の１つの鎖を切断するＣａｓ９ドメインを有し得る。任意の特定の理論に束縛されるものではないが、触媒残基（例えば、Ｈ８４０）の存在は、標的化されたＡの反対のＴを含有する編集されない（例えば、脱アミノ化されない）鎖を切断するＣａｓ９の活性を維持する。Ｃａｓ９の触媒残基（例えば、Ｄ１０～Ａ１０）の突然変異は、標的化されたＡ残基を含有する編集される鎖の切断を防止する。そのようなＣａｓ９バリアントは、ｇＲＮＡにより規定される標的配列に基づく特定のロケーションにおいて一本鎖ＤＮＡ切断（ニック）を生成することが可能であり、編集されない鎖の修復をもたらし、最終的に編集されない鎖上のＴからＣへの変化をもたらす。
（ｉ）デアミナーゼ
様々な態様において、融合タンパク質は、アデニン塩基エディター（ＡＢＥ）としてデアミナーゼを含む。複合体において使用され得る好適なデアミナーゼは、ＡＢＥ－ｍａｘ、ＡＢＥ８ｅまたはＡＢＥ７．１０である。参照を容易にするために、これらの例示的なデアミナーゼをコードするアミノ酸配列および核酸配列は、表１および２に示される。また、以下により詳細に説明される核局在化シグナル（ＮＬＳ）（各表の下線および太字）を含む例示的なデアミナーゼの配列が含まれる。
様々な態様において、デアミナーゼは、配列番号７、９および１１のいずれか１つと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む。様々な態様において、デアミナーゼは、配列番号７、９および１１のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の態様において、デアミナーゼは、配列番号７のアミノ酸配列を含む。一部の態様において、デアミナーゼは、配列番号９のアミノ酸配列を含む。一部の態様において、デアミナーゼは、配列番号１１のアミノ酸配列を含む。
様々な態様において、デアミナーゼは、核局在化シグナル（ＮＬＳ）をさらに含む。好適な核局在化シグナルは、以下に説明される。一部の態様において、核局在化シグナルは、ＭＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号３１）を含む。一部の態様において、ＮＬＳをさらに含むデアミナーゼは、配列番号８または１０のいずれか１つと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む。様々な態様において、ＮＬＳをさらに含むデアミナーゼは、配列番号８または１０のアミノ酸配列を含む。様々な態様において、ＮＬＳをさらに含むデアミナーゼは、配列番号８のアミノ酸配列を含む。様々な態様において、ＮＬＳをさらに含むデアミナーゼは、配列番号１０のアミノ酸配列を含む。
様々な態様において、デアミナーゼは、配列番号１２、１３、１４、２８、７４および７５のいずれか１つを含む核酸によってコードされる。以下の表２に示される通り、配列番号１２、１３および２８は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）をさらに含むＡＢＥｍａｘおよびＡＢＥ８ｅに対応し、ＮＬＳをコードする配列は以下の表において太字および下線で示される。配列番号７４、７５および１４は、それぞれ、核局在化シグナルを伴わないＡＢＥｍａｘ、ＡＢＥ８ｅおよびＡＢＥ７．１０に対応する。一部の態様において、本明細書において提供される融合タンパク質におけるデアミナーゼは、配列番号１２または７４を含む核酸によってコードされる。一部の態様において、本明細書において提供される融合タンパク質におけるデアミナーゼは、配列番号１３または７５を含む核酸によってコードされる。一部の態様において、本明細書において提供される融合タンパク質におけるデアミナーゼは、配列番号１４または２８を含む核酸によってコードされる。
（ｉｉ）Ｃａｓ９ニッカーゼまたは非活性化Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ
様々な態様において、本明細書において使用される融合タンパク質（例えば、塩基エディター）は、Ｃａｓ９ニッカーゼまたは非活性化Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを含む。これらのタンパク質は、原核生物における天然に存在する防御機構であり、遺伝子編集に使用される、ＲＮＡによりガイドされるＤＮＡ標的化プラットホームとして作り変えられたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系に由来する。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系は、ＤＮＡヌクレアーゼＣａｓ９、ならびに２つの非コードＲＮＡである、ｃｒｉｓｐｒＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）（すなわち、ｇＲＮＡ）に頼って、ＤＮＡの切断を標的化する。ＣＲＩＳＰＲは、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ）の略語であり、これは、例えば原核生物に感染したまたはこれを攻撃したウイルスによって、以前に細胞に曝露された外来性ＤＮＡとの類似性を有するＤＮＡの断片（スペーサーＤＮＡ）を含有する、細菌および古細菌のゲノムに見出されるＤＮＡ配列のファミリーである。これらのＤＮＡの断片は、原核生物が、例えば後続の攻撃における同様のウイルスからの、再導入に際して、類似する外来性ＤＮＡを検出および破壊するために使用される。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の転写は、外来性外因性ＤＮＡを認識および切断することが可能なＣａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）タンパク質と会合し、かつこれを標的化する、スペーサー配列を含むＲＮＡ分子の形成をもたらす。多くの種類およびクラスのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系が説明されている（例えば、Ｋｏｏｎｉｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１７）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ３７：６７－７８を参照されたい）。
ｃｒＲＮＡは、典型的に標的ＤＮＡ中の２０ヌクレオチド（ｎｔ）配列とのワトソン・クリック塩基対形成を通してＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体の配列認識および特異性を駆動する。ｃｒＲＮＡ中の５’の２０ｎｔの配列を変化させることは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体の、特異的遺伝子座への標的化を可能にする。標的配列に、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と称される特定の短いＤＮＡモチーフ（配列ＮＧＧを伴う）が続く場合、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体は、ｃｒＲＮＡの最初の２０ｎｔに適合する配列を含有するＤＮＡ配列にのみ結合する。ｔｒａｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡの３’末端とハイブリダイズして、ＲＮＡ二重鎖構造を形成し、これにＣａｓ９エンドヌクレアーゼが結合して、触媒活性ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体を形成し、これはその後、標的ＤＮＡを切断し得る。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体が標的部位においてＤＮＡに結合すると、Ｃａｓ９酵素内の２つの独立したヌクレアーゼドメインの各々は、ＰＡＭ部位の上流のＤＮＡ鎖の１つを切断し、二本鎖切断（ＤＳＢ）を残し、ここでＤＮＡの両方の鎖は塩基対を終結する（平滑末端）。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体の、特定の標的部位におけるＤＮＡへの結合、および部位特異的ＤＳＢの形成後、次の重要なステップは、ＤＳＢの修復である。細胞は２つの主要なＤＮＡ修復経路である、非相同末端結合（ＮＨＥＪ：ｎｏｎ－ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｅｎｄ ｊｏｉｎｉｎｇ）および相同組換え修復（ＨＤＲ：ｈｏｍｏｌｏｇｙ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｒｅｐａｉｒ）を使用して、ＤＳＢを修復する。
ＮＨＥＪは、非分裂細胞を含む大多数の細胞種において高度に活性であるように見える強固な修復機構である。ＮＨＥＪは、エラーを起こしやすく、多くの場合、ＤＳＢの部位における１個～数百個のヌクレオチド間の除去または付加をもたらし得るが、そのような改変は典型的には２０ｎｔ未満である。結果として生じる挿入および欠失（インデル）は、遺伝子のコード領域または非コード領域を破壊し得る。あるいは、ＨＤＲは、内因的にまたは外因的に提供された相同ドナーＤＮＡの長い範囲を使用して、高い忠実度でＤＳＢを修復する。ＨＤＲは、分裂細胞においてのみ活性であり、ほとんどの細胞種において比較的低頻度で起こる。本開示の多くの実施形態において、ＮＨＥＪは、修復オペラントとして利用される。
一部の実施形態において、Ｃａｓ９（ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９）エンドヌクレアーゼは、本明細書において説明される１つまたはそれ以上の心筋症を予防、改善または治療するために本明細書中のＣＲＩＳＰＲ法において使用され得る。「Ｃａｓ９分子」とは、本明細書において使用される場合、ｇＲＮＡ分子と相互作用し、ｇＲＮＡ分子と共同して、標的配列およびＰＡＭ配列を含む部位に局在化し（例えば標的化するかまたは存在し）得る分子を指す。Ｃａｓ９タンパク質は、多くのＣＲＩＳＰＲ系において存在することが公知であり、メタノコッカス・マリパルディス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ）、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、コリネバクテリウム・エフィシエンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・クロッペンステドティ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋｒｏｐｐｅｎｓｔｅｄｔｉｉ）、マイコバクテリウム・アブセサス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｂｓｃｅｓｓｕｓ）、ノカルジア・ファルシニカ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｆａｒｃｉｎｉｃａ）、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）、ロドコッカス・ジョスティ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｊｏｓｔｉｉ）、ロドコッカス・オパカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｏｐａｃｕｓ）、アシドサーマス・セルロリティカス（Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）、アルスロバクター・クロロフェノリカス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌｉｃｕｓ）、クリベラ・フラビダ（Ｋｒｉｂｂｅｌｌａ ｆｌａｖｉｄａ）、サーモモノスポラ・クルバータ（Ｔｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｃｕｒｖａｔａ）、ビフィドバクテリウム・デンティウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｅｎｔｉｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）、スラッキア・へリオトリニレデュセンス（Ｓｌａｃｋｉａ ｈｅｌｉｏｔｒｉｎｉｒｅｄｕｃｅｎｓ）、ペルセフォネラ・マリナ（Ｐｅｒｓｅｐｈｏｎｅｌｌａ ｍａｒｉｎａ）、バクテロイデス・フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）、カプノシトファガ・オクラセア（Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ ｏｃｈｒａｃｅａ）、フラボバクテリウム・サイクロフィラム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍ）、アッカーマンシア・ムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）、ロセイフレクサス・カステンホルジ（Ｒｏｓｅｉｆｌｅｘｕｓ ｃａｓｔｅｎｈｏｌｚｉｉ）、ロセイフレクサス（Ｒｏｓｅｉｆｌｅｘｕｓ）、シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、エルシミクロビウム・ミヌタム（Ｅｌｕｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｍｉｎｕｔｕｍ）、フィブロバクター・サクシノジェネス（Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）、セレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、リステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）、カゼイ菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・ディスガラクティエ・エキシミリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ）、ストレプトコッカス・エクイ・ズーエピデミカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ）、ストレプトコッカス・ギャロリティカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）、ストレプトコッカス・ゴルドニ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｄｏｎｉｉ）、ミュータンス菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、化膿性連鎖球菌Ｍ１ ＧＡＳ、化膿性連鎖球菌ＭＧＡＳ５００５、化膿性連鎖球菌ＭＧＡＳ２０９６、化膿性連鎖球菌ＭＧＡＳ９４２９、化膿性連鎖球菌ＭＧＡＳ１０２７０、化膿性連鎖球菌ＭＧＡＳ６１８０、化膿性連鎖球菌ＭＧＡＳ３１５、化膿性連鎖球菌ＳＳＩ－１、化膿性連鎖球菌ＭＧＡＳ １０７５０、化膿性連鎖球菌ＮＺ１３１、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＮＲＺ１０６６、ストレプトコッカス・サーモフィルスＬＭＤ－９、ストレプトコッカス・サーモフィルスＬＭＧ １８３１１、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、スタフィロコッカス・アウリクラーリス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｉｃｕｌａｒｉｓ）、スタフィロコッカス・ルートラエ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｒａｅ）、スタフィロコッカス・ルグドゥネンシス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ）、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）Ａ３ Ｌｏｃｈ Ｍａｒｅｅ、ボツリヌス菌Ｂ Ｅｋｌｕｎｄ １７Ｂ、ボツリヌス菌Ｂａ４ ６５７、ボツリヌス菌Ｆ Ｌａｎｇｅｌａｎｄ、クロストリジウム・セルロリティカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）Ｈ１０、フィネゴルディア・マグナ（Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ ｍａｇｎａ）ＡＴＣＣ ２９３２８、ユーバクテリウム・レクタレ（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｅｃｔａｌｅ）ＡＴＣＣ ３３６５６、マイコプラズマ・ガリセプティカム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）、マイコプラズマ・モービレ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｍｏｂｉｌｅ）１６３Ｋ、マイコプラズマ・ペネトランス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｅｎｅｔｒａｎｓ）、マイコプラズマ・シノビエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｓｙｎｏｖｉａｅ）５３、ストレプトバチルス・モニリフォルミス（Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）ＤＳＭ １２１１２、ブラディリゾビウム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）ＢＴＡｉ１、ニトロバクター・ハンブルジェネシス（Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｈａｍｂｕｒｇｅｎｓｉｓ）Ｘ１４、ロドシュードモナス・パルストリス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）ＢｉｓＢ１８、ロドシュードモナス・パルストリスＢｉｓＢ５、パルビバカラム・ラバメンティボランス（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ）ＤＳ－１、ディノロセオバクター・シバエ（Ｄｉｎｏｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ ｓｈｉｂａｅ）ＤＦＬ １２、グルコナセトバクター・ディアゾトロフィカス（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）Ｐａｌ ５ ＦＡＰＥＲＪ、グルコナセトバクター・ディアゾトロフィカスＰａｌ ５ ＪＧＩ、アゾスピリラム属（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）Ｂ５１０ ｕｉｄ４６０８５、ロドスピリラム・ラブラム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍ）ＡＴＣＣ １１１７０、ディアフォロバクター属（Ｄｉａｐｈｏｒｏｂａｃｔｅｒ）ＴＰＳＹ ｕｉｄ２９９７５、ベルミネフロバクター・エイセニアエ（Ｖｅｒｍｉｎｅｐｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｅｉｓｅｎｉａｅ）ＥＦ０１－２、骨髄炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）０５３４４２、骨髄炎菌アルファ１４、骨髄炎菌Ｚ２４９１、デスルフォビブリオ・サレキシジェンス（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｓａｌｅｘｉｇｅｎｓ）ＤＳＭ ２６３８、カンピロバクター・ジェジュニ・ドイレイ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ ｄｏｙｌｅｉ）２６９ ９７、カンピロバクター・ジェジュニ８１１１６、カンピロバクター・ジェジュニ、カンピロバクター・ラリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｌａｒｉ）ＲＭ２１００、ヘリコバクター・ヘパティカス（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｈｅｐａｔｉｃｕｓ）、ウォリネラ・サクシノジェネス（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）、トルモナス・アウエンシス（Ｔｏｌｕｍｏｎａｓ ａｕｅｎｓｉｓ）ＤＳＭ ９１８７、シュードアルテロモナス・アトランティカ（Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ａｔｌａｎｔｉｃａ）Ｔ６ｃ、シェワネラ・ペアレアナ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｐｅａｌｅａｎａ）ＡＴＣＣ ７００３４５、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）Ｐａｒｉｓ、アクティノバチルス・サクシノジェネス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）１３０Ｚ、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）ノビシダ（ｎｏｖｉｃｉｄａ）Ｕ１１２、野兎病菌ホラルクティカ（ｈｏｌａｒｃｔｉｃａ）、野兎病菌ＦＳＣ １９８、野兎病菌、野兎病菌ＷＹ９６－３４１８およびトレポネーマ・デンティコラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）ＡＴＣＣ ３５４０５などを含むが、これらに限定されない。
様々な実施形態において、改善された塩基エディターは、ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓタンパク質を含む場合があり、これは、「ｄＣａｓ」または「ｄＣａｓ９」タンパク質（ヌクレアーゼ「死（ｄｅａｄ）」Ｃａｓ９の意味）と互換的に称され得る。あるいは、本明細書において使用される場合、ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ９タンパク質は、「非活性化Ｃａｓ９」と称され得る。不活性ＤＮＡ切断ドメインを有するＣａｓ９タンパク質（またはその断片）を生成するための方法は公知である（例えば、Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ．３３７：８１６－８２１（２０１２）；Ｑｉ ｅｔ ａｌ，“Ｒｅｐｕｒｐｏｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ ａｓ ａｎ ＲＮＡ－Ｇｕｉｄｅｄ Ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ” （２０１３） Ｃｅｌｌ． ２８； １５２（５）： １１７３－８３を参照されたく、その各々の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる）。例えば、Ｃａｓ９のＤＮＡ切断ドメインは、２つのサブドメインである、ＨＮＨヌクレアーゼサブドメインおよびＲｕｖＣＩサブドメインを含むことが公知である。ＨＮＨサブドメインは、ｇＲＮＡに相補的な鎖を切断し、一方で、ＲｕｖＣＩサブドメインは、非相補鎖を切断する。これらのサブドメイン内の突然変異は、Ｃａｓ９のヌクレアーゼ活性をサイレンシングし得る。例えば、突然変異Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａは、化膿性連鎖球菌Ｃａｓ９のヌクレアーゼ活性を完全に不活性化する（Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ，ｃｉｅｎｃｅ．３３７：８１６－８２１（２０１２）；Ｑｉ ｅｔ ａｌ， Ｃｅｌｌ． ２８；１５２（５）：１１７３－８３（２０１３））。一部の実施形態において、Ｃａｓ９の断片を含むタンパク質が提供される。例えば、一部の実施形態において、タンパク質は、２つのＣａｓ９ドメインである（１）Ｃａｓ９のｇＲＮＡ結合ドメインまたは（２）Ｃａｓ９のＤＮＡ切断ドメインのうちの１つを含む。
一部の実施形態において、Ｃａｓ９またはその断片を含むタンパク質は、「Ｃａｓ９バリアント」と称される。Ｃａｓ９バリアントは、Ｃａｓ９またはその断片との相同性を共有する。例えば、Ｃａｓ９バリアントは、野生型Ｃａｓ９と少なくとも約７０％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一、少なくとも約９９．５％同一または少なくとも約９９．９％同一である。一部の実施形態において、Ｃａｓ９バリアントは、野生型Ｃａｓ９と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２１、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０個またはそれ以上のアミノ酸変化を有し得る。一部の実施形態において、Ｃａｓ９バリアントは、Ｃａｓ９の断片（例えば、ｇＲＮＡ結合ドメインまたはＤＮＡ切断ドメイン）が、野生型Ｃａｓ９の対応する断片と少なくとも約７０％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一、少なくとも約９９．５％同一または少なくとも約９９．９％同一であるような、断片を含む。一部の実施形態において、断片は、対応する野生型Ｃａｓ９のアミノ酸の長さの少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または少なくとも９９．５％である。
一部の実施形態において、Ｃａｓ９断片は、少なくとも１００アミノ酸の長さである。一部の実施形態において、断片は、少なくとも１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０または少なくとも１３００アミノ酸の長さである。一部の実施形態において、野生型Ｃａｓ９は、化膿性連鎖球菌由来のＣａｓ９（ＮＣＢＩ基準配列：ＮＣ＿０ｌ７０５３．ｌ）に対応する。他の実施形態において、野生型Ｃａｓ９は、化膿性連鎖球菌由来のＣａｓ９（ＮＣＢＩ基準配列：ＮＣ＿００２７３７．２）に対応する。さらに他の実施形態において、Ｃａｓ９は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ活性を不活性化させる１つまたはそれ以上の突然変異を有するＣａｓ９アミノ酸配列に対応するか、または部分的にもしくは全体的に含む。
一部の実施形態において、Ｃａｓ９ドメインは、化膿性連鎖球菌由来のＣａｓ９（ＮＣＢＩ基準配列：ＮＣ＿０ｌ７０５３．ｌ）などの野生型配列と比較して、８４０位における残基と同時に、Ｄ１０Ａ突然変異を含む。任意の特定の理論に束縛されるものではないが、触媒残基Ｈ８４０の存在は、Ｃａｓ９の、標的化されるＣの反対側のＧを含有する編集されない（脱アミノ化されない）鎖を切断する活性を回復させる。Ｈ８４０の回復（例えばＡ８４０からの）は、Ｃを含有する標的鎖の切断をもたらさない。そのようなＣａｓ９バリアントは、ｇＲＮＡによって規定される標的配列に基づく特定のロケーションにおいて一本鎖ＤＮＡ切断（ニック）を生成することが可能であり、編集されない鎖の修復をもたらす。アデノシン塩基エディターに関係して、アデノシン（Ａ）は、脱アミノ化されてイノシン（Ｉ）になり、編集されない鎖（脱アミノ化されたＡと塩基対形成していたＴを含む）にニックが形成され、脱アミノ化されたＡと塩基対形成していたＴの除去を促進し、Ａ－Ｔ塩基対がＧ－Ｃ塩基対に突然変異することをもたらす。Ｔを有する編集されない鎖にニックを入れることは、ミスマッチ修復機構によるＴの除去を促進する。
他の実施形態において、Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａ以外の突然変異を有するｄＣａｓ９バリアントが提供され、これは、例えば、ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）をもたらす。そのような突然変異は、例として、化膿性連鎖球菌由来のＣａｓ９などの野生型配列（ＮＣＢＩ基準配列：ＮＣ＿０ｌ７０５３．ｌ）を参照して、Ｄ１０およびＨ８２０における他のアミノ酸置換、またはＣａｓ９のヌクレアーゼドメイン内の他の置換（例えば、ＨＮＨヌクレアーゼサブドメインおよび／もしくはＲｕｖＣＩサブドメインにおける置換）を含む。一部の実施形態において、ＮＣＢＩ基準配列：ＮＣ＿０ｌ７０５３．ｌと少なくとも約７０％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一、少なくとも約９９．５％同一または少なくとも約９９．９％同一であるｄＣａｓ９のバリアントまたはホモログ（例えば、化膿性連鎖球菌由来のＣａｓ９のバリアント（ＮＣＢＩ基準配列：ＮＣ＿０ｌ７０５３．ｌ））が提供される。一部の実施形態において、ＮＣ＿０ｌ７０５３．ｌよりも、約５アミノ酸、約１０アミノ酸、約１５アミノ酸、約２０アミノ酸、約２５アミノ酸、約３０アミノ酸、約４０アミノ酸、約５０アミノ酸、約７５アミノ酸、約１００アミノ酸またはそれ以上短いか、または長いアミノ酸配列を有するｄＣａｓ９のバリアント（例えば、ＮＣＢＩ基準配列：ＮＣ＿０ｌ７０５３．ｌのバリアント）が提供される。
一部の実施形態において、本明細書において提供される塩基エディターは、Ｃａｓ９タンパク質の全長アミノ酸配列、例えば、本明細書において提供されるＣａｓ９配列の１つを含む。しかしながら、他の実施形態において、本明細書において提供される融合タンパク質は、全長Ｃａｓ９配列を含まないが、その断片のみを含む。例えば、一部の実施形態において、本明細書において提供されるＣａｓ９融合タンパク質は、Ｃａｓ９断片を含み、その断片は、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡに結合するが、例えば、それがヌクレアーゼドメインの切断型のみを含むか、またはヌクレアーゼドメインを全く含まないという点において、機能的ヌクレアーゼドメインを含まない。好適なＣａｓ９ドメインおよびＣａｓ９断片の例示的なアミノ酸配列は、本明細書において提供され、Ｃａｓ９ドメインおよび断片の追加の好適な配列は、当業者に明らかである。
バリアントおよびホモログを含む追加のＣａｓ９タンパク質は、本開示の範囲内であることを理解すべきである。全体を参照により本明細書に組み込むＰＣＴ出願公開公報第２０２００５１３６０Ａ１号は、一部の好適なＣａｓ９バリアントである、ニッカーゼおよび非活性化Ｃａｓ９タンパク質を開示する。例示的なＣａｓ９タンパク質は、以下に提供されるものを含むが、これらに限定されない。これらの例示的なニッカーゼおよび非活性化Ｃａｓ９タンパク質の例示的なアミノ酸配列およびコード核酸配列は、以下の表３および４に示される。
様々な態様において、Ｃａｓ９ニッカーゼまたは非活性化Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、ＳｐＲＹ、ＳｐＧ、ＳｐＣａｓ９－ＮＧ、ＳｐＣａｓ９－ＶＲＱＲまたはそのバリアントから選択される。様々な態様において、Ｃａｓ９ニッカーゼまたは非活性化Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、配列番号１５、１７、１９および２１のいずれか１つと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、一部の態様において、Ｃａｓ９ニッカーゼまたは非活性化Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、配列番号１５、１７、１９および２１のいずれか１つを含むアミノ酸配列を含む。一部の態様において、Ｃａｓ９ニッカーゼまたは非活性化Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、配列番号１５を含むアミノ酸配列を含む。一部の態様において、Ｃａｓ９ニッカーゼまたは非活性化Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、配列番号１７を含むアミノ酸配列を含む。一部の態様において、Ｃａｓ９ニッカーゼまたは非活性化Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、配列番号１９を含むアミノ酸配列を含む。一部の態様において、Ｃａｓ９ニッカーゼまたは非活性化Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、配列番号２１を含むアミノ酸配列を含む。
様々な態様において、Ｃａｓ９ニッカーゼまたは非活性化Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、核局在化シグナルをさらに含み得る。一部の態様において、核局在化シグナルは、ＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号３２）を含む。一部の態様において、核局在化シグナルは、短いペプチドリンカーを介してＣａｓ９ニッカーゼまたは非活性化Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼに接続される。したがって、一部の態様において、リンカーを介してＮＬＳを含むＣａｓ９ニッカーゼまたは非活性化Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、配列番号１６、１８、２０および２２のいずれか１つと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含み得る。一部の態様において、リンカーを介してＮＬＳを含むＣａｓ９ニッカーゼまたは非活性化Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、配列番号１６、１８、２０および２２のいずれか１つを含むアミノ酸配列を含み得る。様々な態様において、リンカーを介してＮＬＳを含むＣａｓ９ニッカーゼまたは非活性化Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、配列番号１６のアミノ酸配列を含み得る。様々な態様において、リンカーを介してＮＬＳを含むＣａｓ９ニッカーゼまたは非活性化Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、配列番号１８のアミノ酸配列を含み得る。様々な態様において、リンカーを介してＮＬＳを含むＣａｓ９ニッカーゼまたは非活性化Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、配列番号２０のアミノ酸配列を含み得る。様々な態様において、リンカーを介してＮＬＳを含むＣａｓ９ニッカーゼまたは非活性化Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、配列番号２２のアミノ酸配列を含み得る。
様々な態様において、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼまたは非活性化Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、配列番号２３～２６、８３および１００～１０２のいずれか１つを含む核酸によってコードされる。以下の表４に示される通り、配列番号２３～２６は、各々が、リンカーをコードする核酸を介して各核酸の３’末端に結合された核局在化シグナル（ＮＬＳ）をさらに含む、ＳｐＣａｓ９－ＶＲＱＲ、ＳｐＲＹ、ＳｐＧおよびＳｐＣａｓ９－ＮＧに対応する。これらの配列の各々において、リンカーをコードする核酸は下線で示され、ＮＬＳをコードする核酸は太字で示される。配列番号８３および１００～１０２は、リンカーまたはＮＬＳを伴わない同じタンパク質（ＳｐＣａｓ９－ＶＲＱＲ、ＳｐＲＹ、ＳｐＧおよびＳｐＣａｓ９－ＮＧ）をコードする。
一部の態様において、本明細書において提供される融合タンパク質におけるＳｐＣａｓ９ニッカーゼまたは非活性化Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、配列番号８３を含む核酸によってコードされる。一部の態様において、本明細書において提供される融合タンパク質におけるＳｐＣａｓ９ニッカーゼまたは非活性化Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、配列番号１００を含む核酸によってコードされる。一部の態様において、本明細書において提供される融合タンパク質におけるＳｐＣａｓ９ニッカーゼまたは非活性化Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、配列番号１０１を含む核酸によってコードされる。一部の態様において、本明細書において提供される融合タンパク質におけるＳｐＣａｓ９ニッカーゼまたは非活性化Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、配列番号１０２を含む核酸によってコードされる。
一部の態様において、本明細書において提供される融合タンパク質におけるＳｐＣａｓ９ニッカーゼまたは非活性化Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、核局在化シグナル（ＮＬＳ）をさらに含み、配列番号２３を含む核酸によってコードされる。一部の態様において、本明細書において提供される融合タンパク質におけるＳｐＣａｓ９ニッカーゼまたは非活性化Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、核局在化シグナル（ＮＬＳ）をさらに含み、配列番号２４を含む核酸によってコードされる。一部の態様において、本明細書において提供される融合タンパク質におけるＳｐＣａｓ９ニッカーゼまたは非活性化Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、核局在化シグナル（ＮＬＳ）をさらに含み、配列番号２５を含む核酸によってコードされる。一部の態様において、本明細書において提供される融合タンパク質におけるＳｐＣａｓ９ニッカーゼまたは非活性化Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、核局在化シグナル（ＮＬＳ）をさらに含み、配列番号２６を含む核酸によってコードされる。
一部の実施形態において、本明細書中のＣａｓ９酵素は、連鎖状球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）またはそのバリアント由来であり得る。野生型Ｃａｓ９を使用してもよく、本明細書において提供されるＣａｓ９の改変型（例えば、Ｃａｓ９の進化型、またはＣａｓ９オルソログもしくはバリアント）を使用してもよいことを理解すべきである。一部の態様において、本明細書中のＣａｓ９酵素は、化膿性連鎖球菌Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）バリアントであり得る。一部の態様において、本明細書中のＣａｓ９酵素は、ＮＧＧ ＰＡＭと適合性の化膿性連鎖球菌Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）バリアントであり得る。基準のＰＡＭは、配列５’－ＮＧＧ－３’であり、ここで、「Ｎ」は、任意の核酸塩基であり、これに２つのグアニン（「Ｇ」）核酸塩基が続く。一部の態様において、本明細書中のＣａｓ９酵素は、非ＮＧＧのＰＡＭと適合性の化膿性連鎖球菌Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）バリアントであり得る。一部の態様において、本明細書中のＣａｓ９酵素は、ＴＧＡＧおよび／またはＣＧＡＧから選択される非ＮＧＧ ＰＡＭと適合性の化膿性連鎖球菌Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）バリアントであり得る。一部の態様において、本明細書中のＣａｓ９酵素は、非ＮＧＧ ＰＡＭと適合性の化膿性連鎖球菌Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）バリアントを使用するアデニン塩基エディター（ＡＢＥ）のバリアントであるＡＢＥｍａｘであり得る。一部の例において、本明細書中のＣａｓ９酵素は、ＡＢＥｍａｘ－ＳｐＣａｓ９－ＮＧであり得る。
一部の実施形態において、活性Ｃａｓ９分子の、標的核酸と相互作用し、これを切断する能力は、ＰＡＭ配列依存性である。ＰＡＭ配列は、標的核酸中の配列である。一部の実施形態において、本明細書中のＰＡＭは、ＴＧＡＧまたはＣＧＡＧのヌクレオチド配列との少なくとも８５％（例えば、約８５％、９０％、９５％、９９％、１００％）の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を有し得る。一部の実施形態において、本明細書中のＰＡＭは、ＴＧＡＧまたはＣＧＡＧのヌクレオチド配列を有し得る。一部の実施形態において、標的核酸の切断は、ＰＡＭ配列の上流で起こる。様々な細菌種由来の活性Ｃａｓ９分子は、様々な配列モチーフ（例えば、ＰＡＭ配列）を認識し得る。一部の実施形態において、化膿性連鎖球菌の活性Ｃａｓ９分子は、配列モチーフ「ＮＧＧ」を認識することができ、その配列から１～１０、例えば、３～５塩基対上流の標的核酸配列の切断を指示する。一部の実施形態において、化膿性連鎖球菌の活性Ｃａｓ９分子は、非ＮＧＧ配列モチーフを認識することができ、その配列から１～１０、例えば、３～５塩基対上流の標的核酸配列の切断を指示する。
（ｉｉｉ）融合タンパク質中の追加のエレメント
様々な態様において、融合タンパク質は、１つまたはそれ以上の追加のエレメントを含有し得る。様々な例において、融合タンパク質は、例えば、デアミナーゼおよびＳｐＣａｓ９ニッカーゼもしくは非活性化Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを共有結合するか、または各タンパク質を１つもしくはそれ以上の核局在化シグナルへ連結するためのペプチドリンカーをさらに含み得る。同様に、核局在化シグナルは、デアミナーゼおよび／またはＳｐＣａｓ９ニッカーゼもしくは非活性化Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼのいずれかの部分として融合タンパク質中に含まれ得る追加のエレメントである。
したがって、様々な態様において、融合タンパク質は、フレキシブルペプチドリンカーをさらに含む。好適なリンカーは、以下の表５に示される。一部の態様において、フレキシブルリンカーは、デアミナーゼおよびＳｐＣａｓ９ニッカーゼまたは非活性化Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを共有結合し得る。例えば、一部の態様において、リンカーは、配列番号２７を含み得る。様々な態様において、フレキシブルリンカーは、デアミナーゼまたはＳｐＣａｓ９ニッカーゼもしくは非活性化Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼのいずれかのＮまたはＣ末端へ核局在化シグナルを接続し得る。例えば、リンカーは、ＳＧＧＳ（配列番号１０３）を含み得る。フレキシブルペプチドリンカーは、核酸によってコードされ得る。リンカーをコードし得る好適な核酸は、以下の表６に示される。一部の態様において、リンカーは、配列番号２９または３０を含む核酸によってコードされ得る。一部の態様において、リンカーは、配列番号７８を含む核酸によってコードされ得る。
さらなる態様において、融合タンパク質は、１つまたはそれ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）をさらに含み得る。１つまたはそれ以上のＮＬＳは、デアミナーゼおよび／またはＣａｓ９ニッカーゼもしくは非活性化Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼのいずれかまたは両方に共有結合または連結され得る。例えば、一部の態様において、ＮＬＳは、デアミナーゼのＮまたはＣ末端に連結され得る。他の態様において、ＮＬＳは、Ｃａｓ９ニッカーゼまたは非活性化Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼのＮまたはＣ末端に連結され得る。例えば、一部の態様において、ＮＬＳを、デアミナーゼのＮ末端に連結してもよく、別のＮＬＳを、Ｃａｓ９ニッカーゼまたは非活性化Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼのＣ末端に連結してもよい。
例示的なＮＬＳとして、ｃ－ｍｙｃ ＮＬＳ、ＳＶ４０ ＮＬＳ、ｈｎＲＮＰＡＩ Ｍ９ ＮＬＳ、ヌクレオプラスミンＮＬＳ、インポーチン－アルファ由来のＩＢＢドメインの配列ＲＭＲＫＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ（配列番号３３）、筋腫Ｔタンパク質の配列ＶＳＲＫＲＰＲＰ（配列番号３４）およびＰＰＫＫＡＲＥＤ（配列番号３５）、ヒトｐ５３の配列ＰＱＰＫＫＫＰ（配列番号１０４）、マウスｃ－ａｂｌＩＶの配列ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ（配列番号３６）、インフルエンザウイルスＮＳ１の配列ＤＲＬＲＲ（配列番号３７）およびＰＫＱＫＫＲＫ（配列番号３８）、肝炎ウイルスデルタ抗原の配列ＲＫＬＫＫＫＩＫＫ（配列番号３９）、ならびにマウスＭｘ１タンパク質の配列ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ（配列番号４０）が挙げられる。さらなる許容可能な核局在化シグナルとして、双節型核局在化配列、例えば、ヒトポリ（ＡＤＰ－リボース）ポリメラーゼの配列ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ（配列番号４１）またはステロイドホルモン受容体（ヒト）グルココルチコイドの配列ＲＫＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫ（配列番号４２）が挙げられる。追加の例示的なＮＬＳとして、ＭＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号３１）およびＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号３２）が挙げられる。他の好適な核局在化シグナル（ＮＬＳ）は、当業者に公知である。
（ｉｉｉ）例示的な融合タンパク質
以前の開示に従って、例示的な融合タンパク質は、上記に示される少なくとも１つのデアミナーゼと、少なくとも１つのＣａｓ９ニッカーゼまたは非活性化Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼとを組み合わせることによって提供され得る。想定され得る非限定的な組合せとして、ＡＢＥｍａｘ－ＶＲＱＲ、ＡＢＥｍａｘ－ＳｐＣａｓ９－ＮＧ、ＡＢＥｍａｘ－ＳｐＲＹ、ＡＢＥｍａｘ－ＳｐＧ、ＡＢＥ８ｅ－ＶＲＱＲ、ＡＢＥ８ｅ－ＳｐＣａｓ９－ＮＧ、ＡＢＥ８ｅ－ＳｐＲＹおよびＡＢＥ８ｅ－ＳｐＧが挙げられる。これらの融合タンパク質の各々は、デアミナーゼとＣａｓ９タンパク質とを接続するリンカー（例えば、配列番号２７または２８）をさらに含み得る。さらに、これらの融合タンパク質の各々は、１つまたはそれ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）をさらに含み得る。核局在化シグナルを伴う、および伴わない、これらの融合タンパク質についての例示的なアミノ酸配列は、以下の表７に示される。
様々な態様において、融合タンパク質は、配列番号４５～６０のいずれか１つと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む。一部の態様において、融合タンパク質は、配列番号４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７および５９のいずれか１つと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む。一部の態様において、融合タンパク質は、配列番号４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７および５９のいずれか１つを含むアミノ酸配列を含む。一部の態様において、融合タンパク質は、１つまたはそれ以上の核局在化配列（ＮＬＳ）をさらに含む。様々な場合、それゆえ、融合タンパク質は、配列番号４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８および６０のいずれか１つと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含み得る。様々な態様において、融合タンパク質は、配列番号４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８および６０のいずれか１つを含むアミノ酸配列を含み得る。一部の態様において、融合タンパク質は、配列番号４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８および６０のいずれか１つからなるアミノ酸配列を含み得る。
様々な態様において、本明細書において提供される融合タンパク質は、１つまたはそれ以上の核酸によってコードされ得る。一部の態様において、融合タンパク質は、単一の核酸によってコードされ得る。上記に説明される全長融合タンパク質（リンカーおよびＮＬＳを含む）をコードする好適な核酸は、本明細書中の表８に示される。一部の態様において、融合タンパク質は、配列番号６１～６８のいずれか１つを含む核酸によってコードされ得る。一部の態様において、融合タンパク質は、配列番号７３、７９および１４７～１５２のいずれか１つを含む核酸によってコードされ得る。
（ｃ）ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集系
一部の実施形態において、本明細書中の操作されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集系（例えば、哺乳動物細胞における遺伝子編集のための）は、（１）標的化ドメイン（ゲノムＤＮＡ標的配列にハイブリダイズすることが可能である）と、Ｃａｓ、例えばＣａｓ９酵素に結合することが可能である配列とを含む、本明細書において開示されるガイドＲＮＡ分子（ｇＲＮＡ）、および（２）塩基エディター（例えば、デアミナーゼとＣａｓ９ニッカーゼまたは非活性化Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼとの融合タンパク質）を含み得る。一部の態様において、操作されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集系は、配列番号１または２の配列を標的化するｇＲＮＡと、配列番号４５～６０のいずれか１つを含む融合タンパク質とを含む。一部の態様において、操作されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集系は、配列番号１の配列を標的化するｇＲＮＡ（すなわち、配列番号５のスペーサー配列を含む）と、配列番号４５または４６を含む融合タンパク質とを含む。一部の態様において、操作されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集系は、配列番号２の配列を標的化するｇＲＮＡ（すなわち、配列番号６のスペーサー配列を含む）と、配列番号４５または４６を含む融合タンパク質とを含む。
（ｉ）ＣＲＩＳＰＲ系のさらなる要素
ｇＲＮＡは、ｔｒａｃｒドメインと称されるドメインを含み得る。標的化ドメインと、Ｃａｓ、例えばＣａｓ９酵素に結合することが可能である配列とは、同じ分子（シングルｇＲＮＡ、キメラｇＲＮＡもしくはｓｇＲＮＡと称される場合もある）または異なる分子（デュアルｇＲＮＡもしくはｄｇＲＮＡと称される場合もある）上に配置され得る。異なる分子上に配置される場合、各々は、分子が、例えばハイブリダイゼーションを通して、会合することを可能にするハイブリダイゼーションドメインを含む。
ある特定の実施形態において、標的配列において二本鎖切断を生成するために、本明細書中のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系は、ガイド核酸（ｇＲＮＡ）によって決定される標的配列に結合することができ、ヌクレアーゼは、標的配列に隣接するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を認識して、標的配列を切断する。一部の実施形態において、本明細書中のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系は、核酸誘導型ヌクレアーゼと適合性のスキャフォールド配列を含み得る。他の実施形態において、ガイド配列は、標的配列の効率的な編集のために任意の所望の標的配列に相補的になるように操作され得る。他の実施形態において、ガイド配列は、任意の所望の標的配列にハイブリダイズするように操作され得る。一部の実施形態において、標的核酸配列は、２０ヌクレオチドの長さを有する。一部の実施形態において、標的核酸は、２０ヌクレオチド未満の長さを有する。一部の実施形態において、標的核酸は、２０ヌクレオチド超の長さを有する。一部の実施形態において、標的核酸は、少なくとも５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０またはそれ以上のヌクレオチドの長さを有する。一部の実施形態において、標的核酸は、多くて５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０またはそれ以上のヌクレオチドの長さを有する。
一部の実施形態において、本明細書中のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系の標的配列は、確認またはその他のために、原核細胞もしくは真核細胞について、またはインビトロ系において内因性または外因性の任意のポリヌクレオチドであり得る。他の実施形態において、標的配列は、真核細胞の核に存在するポリヌクレオチドであり得る。標的配列は、遺伝子産物（例えば、タンパク質）をコードする配列、または非コード配列（例えば、調節ポリヌクレオチドまたはジャンクＤＮＡ）であり得る。標的配列は、ＰＡＭ、すなわち、本明細書中のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系によって認識される短い配列を伴うはずであることが、本明細書において企図される。一部の実施形態において、ＰＡＭについての配列および長さの必要条件は、選択される、核酸誘導型ヌクレアーゼによって異なる。ある特定の実施形態において、ＰＡＭ配列は、所望のＰＡＭに依存して、標的配列に隣接する約２～５塩基対またはそれより長い配列であり得る。ＰＡＭ配列の例は、以下の実施例の節において示され、これらは本発明の概念のこの態様を限定するとは意図されないので、当業者は、所与の、核酸誘導型ヌクレアーゼとの使用のためのさらなるＰＡＭ配列を特定することが可能である。さらに、ＰＡＭ相互作用（ＰＩ）ドメインの操作は、ＰＡＭ特異性のプログラミングを可能にし、標的部位認識忠実度を改善し、核酸誘導型ヌクレアーゼのゲノム操作プラットホームの汎用性を増加させることができる。
（ｄ）単離された核酸およびベクター
様々な態様において、本明細書において提供されるＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集系の１つまたはそれ以上の成分（例えば、ｇＲＮＡおよび／または融合タンパク質（塩基エディター））は、核酸（例えば、上記に説明される核酸）によってコードされ得る。したがって、上記に説明される１つまたはそれ以上のｇＲＮＡをコードする単離された核酸が、本明細書において提供される。また、デアミナーゼと、Ｃａｓ９ニッカーゼまたはＣａｓ９エンドヌクレアーゼとを含む融合タンパク質をコードする単離された核酸が、提供される。本開示に従って単離された核酸として提供され得る例示的な核酸は、上記の表において説明される。
本明細書中のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系の成分をコードするポリヌクレオチド配列は、１つまたはそれ以上のベクターを含み得る。「ベクター」という用語は、本明細書において使用される場合、それが連結されている別の核酸を輸送することが可能な核酸分子を指し得る。ベクターとして、一本鎖、二本鎖または部分的二本鎖である核酸分子；１つまたはそれ以上の遊離末端を含むか、遊離末端を含まない（例えば、環状）核酸分子；ＤＮＡ、ＲＮＡまたはこれらの両方を含む核酸分子；および当該技術分野において公知のポリヌクレオチドの他の変形が挙げられるが、これらに限定されない。ベクターの１つのタイプとして「プラスミド」があり、これは、例えば標準の分子クローニング技術によって、追加のＤＮＡセグメントが挿入され得る環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別のタイプのベクターとして、ウイルスベクターがあり、ここでは、ウイルス由来ＤＮＡまたはＲＮＡ配列が、ウイルス（例えば、レトロウイルス、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、複製欠損アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）へのパッケージングのためにベクターに存在する。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入に際して宿主細胞のゲノムに組み込まれ得る。組換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸の発現に好適な形態の、本発明の概念の核酸を含んでもよく、組換え発現ベクターが、発現に使用される予定の宿主細胞に基づいて選択され得る、発現される予定の核酸配列に作動可能に連結される、１つまたはそれ以上の調節エレメントを含むことを意味し得る。
一部の実施形態において、調節エレメントは、標的化可能なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系の１つまたはそれ以上の成分の発現を駆動するために、本明細書中の標的化可能なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系の１つまたはそれ以上のエレメントに作動可能に連結され得る。
一部の実施形態において、ベクターは、本明細書中のＣａｓ９ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結された調節エレメントを含み得る。本明細書中のＣａｓ９ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、特定の細胞、例えば、原核または真核細胞における発現のためにコドン最適化され得る。真核細胞とは、酵母、真菌、藻類、植物、動物またはヒト細胞であり得る。真核細胞は、特定の生物、例えば、非限定的にヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、または非ヒト霊長類を含む非ヒト哺乳動物を含む哺乳動物に由来する細胞であり得る。植物細胞は、種子、懸濁培養物、胚、分裂組織、カルス組織、葉、根、新芽、配偶体、胞子体、花粉および小胞子由来の細胞を含み得るが、これらに限定されない。
本明細書において使用される場合、「コドン最適化」とは、ネイティブアミノ酸配列を維持しながら、ネイティブ配列の少なくとも１つまたはそれ以上のコドンを、宿主細胞の遺伝子においてより頻繁にまたは最も頻繁に使用されるコドンにより置換することによって、目的の宿主細胞における発現の向上のために核酸配列を改変するプロセスを指し得る。様々な種が、特定のアミノ酸のある特定のコドンについて特定の偏りを呈する。本明細書において企図される通り、遺伝子は、コドン最適化に基づいて、所与の生物における最適遺伝子発現のために調整され得る。コドン利用表は、例えば「コドン利用データベース」において、容易に入手可能である。
一部の実施形態において、本明細書中のＣａｓ９ヌクレアーゼおよび１つまたはそれ以上のガイド核酸（例えば、ｇＲＮＡ）は、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかとして送達され得る。本明細書中のＣａｓ９ヌクレアーゼおよびガイド核酸の、両方ともＲＮＡ（非改変、または塩基もしくは骨格改変を含有する）分子としての送達は、核酸誘導型ヌクレアーゼが、細胞内に持続する時間を低減するために使用され得る（例えば、半減期の低減）。これは、標的細胞におけるオフターゲット切断活性のレベルを低減することができる。ｍＲＮＡとしてのＣａｓ９ヌクレアーゼの送達は、タンパク質に翻訳されるのに時間がかかるので、本明細書中の態様は、核酸誘導型ヌクレアーゼタンパク質との相互作用に使用可能なガイド核酸のレベルを最大限にするために、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡの送達の数時間後に、ガイド核酸を送達することを含み得る。他の場合、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡおよびガイド核酸は、同時に送達され得る。他の例において、ガイド核酸は、連続して、例えばＣａｓ９ ｍＲＮＡの０．５、１、２、３、４時間後またはそれ以上後に送達され得る。
一部の実施形態において、ＲＮＡの形態の、またはＤＮＡ発現カセット上にコードされるガイド核酸（例えば、ｇＲＮＡ）は、ベクターまたは染色体上にコードされる、核酸誘導型ヌクレアーゼを含む宿主細胞に導入され得る。ガイド核酸は、１つまたはそれ以上のポリヌクレオチドを有するカセットにおいて提供される場合があり、１つまたはそれ以上のポリヌクレオチドは、カセットにおいて連続であっても、非連続であってもよい。一部の実施形態において、ガイド核酸は、単一の連続ポリヌクレオチドとしてカセットにおいて提供され得る。他の実施形態において、追跡剤は、分布および活性を追跡するためにガイド核酸に付加され得る。
他の実施形態において、様々な送達系を使用して、ｇＲＮＡおよび／またはＣａｓ９ヌクレアーゼを宿主細胞へ導入することができる。これらの実施形態に従って、本明細書において開示される実施形態のための使用の系は、酵母系、リポフェクション系、マイクロインジェクション系、微粒子銃系、ビロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオン、脂質：核酸コンジュゲート、ビリオン、人工ビリオン、ウイルスベクター、エレクトロポレーション、細胞浸透性ペプチド、ナノ粒子、ナノワイヤおよび／またはエキソソームを含み得るが、これらに限定されない。
一部の実施形態において、１つもしくはそれ以上のポリヌクレオチド、例えば、本明細書において説明される１つもしくはそれ以上のベクターもしくは直鎖状ポリヌクレオチド、１つもしくはそれ以上のその転写産物、および／またはそれから転写される１つもしくはそれ以上のタンパク質を、宿主細胞へ送達するための方法が、提供される。一部の態様において、本発明の概念は、そのような方法によって生産される細胞をさらに提供し、生物は、そのような細胞を含み得るか、またはそのような細胞から生産され得る。一部の実施形態において、操作されたヌクレアーゼは、ガイド核酸と共に（および場合によりガイド核酸と複合体形成して）細胞へ送達される。
ある特定の実施形態において、従来型ウイルスおよび非ウイルスベースの遺伝子移行法は、細胞、例えば原核細胞、真核細胞、植物細胞、哺乳動物細胞または標的組織において核酸を導入するために使用され得る。そのような方法は、本明細書中のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系の成分をコードする核酸を、培養中の細胞または宿主生物へ投与するために使用され得る。非ウイルスベクター送達系は、ＤＮＡプラスミド、ＲＮＡ（例えば、本明細書において説明されるベクターの転写産物）、ネイキッド核酸、および送達媒体、例えばリポソームと複合体形成した核酸を含む。ウイルスベクター送達系は、ＤＮＡおよびＲＮＡウイルスを含み、これらは、エピソーム性を有するか、または細胞への送達後にゲノムに組み込まれる。当該技術分野において公知の任意の遺伝子療法は、本明細書中の使用を企図される。核酸の非ウイルス送達の方法は、本明細書中で企図される。また、アデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターは、例えば、核酸およびペプチドのインビトロ生産において、ならびにインビボおよびエクスビボ遺伝子療法手技のために、細胞に標的核酸を形質導入するために使用され得る。
一部の実施形態において、本明細書中の構築物のいずれか（例えば、ｇＲＮＡ、デアミナーゼとＣａｓ９ニッカーゼまたは非活性化Ｃａｓ９タンパク質とを含む融合タンパク質）をコードする核酸は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を使用して細胞へ送達され得る。ＡＡＶは、宿主ゲノムへ部位特異的に組み込まれ、それゆえ導入遺伝子を送達し得る小ウイルスである。末端逆位配列（ＩＴＲ）は、ＡＡＶゲノムおよび／または目的の導入遺伝子の両端に存在し、複製起点として働く。また、ＡＡＶゲノムには、ｒｅｐおよびｃａｐタンパク質も存在し、これらは、転写されると、標的細胞への送達のためにＡＡＶゲノムを被包するカプシドを形成する。ＡＡＶ血清型を与えるこれらのカプシド上の表面受容体は、どの標的器官にカプシドが主に結合するか、およびしたがって、どの細胞にＡＡＶが最も効率的に感染するかを決定する。現在公知のヒトＡＡＶ血清型は１２種ある。一部の実施形態において、任意の哺乳動物ＡＡＶ血清型は、本明細書において説明されるコード核酸を送達するために本明細書において使用され得る。アデノ随伴ウイルスは、いくつかの理由のために遺伝子療法に最も頻繁に使用されるウイルスの１つである。第１に、ＡＡＶは、ヒトを含む哺乳動物への投与に際して免疫応答を誘発しない。第２に、ＡＡＶは、特に、適切なＡＡＶ血清型の選択について考慮した場合、標的細胞へ効率的に送達される。最後に、このゲノムは組み込まれることなく宿主細胞において持続し得るので、ＡＡＶは、分裂細胞および非分裂細胞の両方に感染する能力を有する。この資質のために、それらは遺伝子療法の理想的な候補である。
一部の実施形態において、本明細書において開示されるポリヌクレオチド（例えば、ｇＲＮＡ、Ｃａｓ９）は、少なくとも１つのＡＡＶベクターを使用して細胞へ送達され得る。ＡＡＶベクターは、典型的に、タンパク質ベースのカプシド、およびカプシドによってカプシド形成された核酸を含む。核酸は、例えば、末端逆位配列によって両側を挟まれた導入遺伝子を含むベクターゲノムであり得る。ＡＡＶ「カプシド」は、個々の「カプシドタンパク質」または「サブユニット」を含む球形に近いタンパク質の殻である。ＡＡＶカプシドは、典型的に、会合し、Ｔ＝１正二十面体対称に配置される約６０個のカプシドタンパク質サブユニットを含む。ＡＡＶベクターがＡＡＶカプシドタンパク質を含むと本明細書において説明される場合、ＡＡＶベクターはカプシドを含み、ここで、カプシドは、１つまたはそれ以上のＡＡＶカプシドタンパク質（すなわち、サブユニット）を含むことが理解される。また、導入遺伝子を含む任意のベクターゲノムまたは核酸を含まないカプシドを指す「ウイルス様（ｖｉｒａｌ－ｌｉｋｅ）粒子」または「ウイルス様（ｖｉｒｕｓ－ｌｉｋｅ）粒子」が、本明細書において説明される。本開示のウイルスベクターは、さらに、国際特許公開公報第００／２８００４号およびＣｈａｏ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：６１９において説明されるように、「標的化された」ウイルスベクター（例えば、方向付けられた指向性を有する）および／または「ハイブリッド」パルボウイルス（すなわち、ウイルスＴＲおよびウイルスカプシドが異なるパルボウイルス由来である）であってもよい。本開示のウイルスベクターは、さらに、国際特許公開公報第０１／９２５５１号（その開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）において説明されるように二重鎖パルボウイルス粒子であってもよい。したがって、一部の実施形態において、二本鎖（二重鎖）ゲノムは、本発明の概念のウイルスカプシドにパッケージングされ得る。さらに、ウイルスカプシドまたはゲノムエレメントは、挿入、欠失および／または置換を含む他の改変を含有し得る。
一部の実施形態において、本明細書中のｇＲＮＡおよび／または融合タンパク質をコードする単離された核酸は、ＡＡＶベクター（例えばＡＡＶ－Ｃａｓ９ベクター）へパッケージングされ得る。一部の実施形態において、ＡＡＶベクターは、野生型ＡＡＶベクターである。一部の実施形態において、ＡＡＶベクターは、１つまたはそれ以上の突然変異を含有する。一部の実施形態において、ＡＡＶベクターは、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１またはそれらの任意の組合せのＡＡＶベクターから単離されるか、またはそれらに由来する。
例示的なＡＡＶ－Ｃａｓ９ベクターは、Ｃａｓ９配列を含む中心配列領域を両側から挟む２つのＩＴＲ（末端逆位）配列を含有する。一部の実施形態において、ＩＴＲは、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１またはそれらの任意の組合せのＡＡＶベクターから単離されるか、またはそれらに由来する。一部の実施形態において、ＩＴＲは、ＡＡＶ血清型についての全長および／または野生型配列を含むかまたはからなる。一部の実施形態において、ＩＴＲは、ＡＡＶ血清型についての切断型配列を含むかまたはからなる。一部の実施形態において、ＩＴＲは、ＡＡＶ血清型についての伸長された配列を含むかまたはからなる。一部の実施形態において、ＩＴＲは、同じＡＡＶ血清型についての野生型配列と比較して、配列変動を含む配列を含むかまたはからなる。一部の実施形態において、配列変動は、置換、欠失、挿入、逆位または転位のうちの１つまたはそれ以上を含む。一部の実施形態において、ＩＴＲは、少なくとも１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９または１５０塩基対を含むかまたはからなる。一部の実施形態において、ＩＴＲは、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９または１５０塩基対を含むかまたはからなる。一部の実施形態において、ＩＴＲは、１１０±１０塩基対の長さを有する。一部の実施形態において、ＩＴＲは、１２０±１０塩基対の長さを有する。一部の実施形態において、ＩＴＲは、１３０±１０塩基対の長さを有する。一部の実施形態において、ＩＴＲは、１４０±１０塩基対の長さを有する。一部の実施形態において、ＩＴＲは、１５０±１０塩基対の長さを有する。一部の実施形態において、ＩＴＲは、１１５、１４５または１４１塩基対の長さを有する。
一部の実施形態において、ＡＡＶ－Ｃａｓ９ベクターは、１つまたはそれ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含有し得る。一部の実施形態において、ＡＡＶ－Ｃａｓ９ベクターは、１、２、３、４または５つの核局在化シグナルを含有する。例示的なＮＬＳとして、配列番号３１および３２が挙げられる。他の例示的なＮＬＳとして、ｃ－ｍｙｃ ＮＬＳ、ＳＶ４０ ＮＬＳ、ｈｎＲＮＰＡＩ Ｍ９ ＮＬＳ、ヌクレオプラスミンＮＬＳ、インポーチン－アルファ由来のＩＢＢドメインの配列ＲＭＲＫＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ（配列番号３３）、筋腫Ｔタンパク質の配列ＶＳＲＫＲＰＲＰ（配列番号３４）およびＰＰＫＫＡＲＥＤ（配列番号３５）、ヒトｐ５３の配列ＰＱＰＫＫＫＰＬ（配列番号１０４）、マウスｃ－ａｂｌ ＩＶの配列ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ（配列番号３６）、インフルエンザウイルスＮＳ１の配列ＤＲＬＲＲ（配列番号３７）およびＰＫＱＫＫＲＫ（配列番号３８）、肝炎ウイルスデルタ抗原の配列ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ（配列番号３９）、ならびにマウスＭｘ１タンパク質の配列ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ（配列番号４０）が挙げられる。さらなる許容可能な核局在化シグナルとして、双節型核局在化配列、例えば、ヒトポリ（ＡＤＰ－リボース）ポリメラーゼの配列ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ（配列番号４１）またはステロイドホルモン受容体（ヒト）グルココルチコイドの配列ＲＫＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫ（配列番号４２）が挙げられる。
一部の実施形態において、ＡＡＶ－Ｃａｓ９ベクターは、ベクターのパッケージング、ならびに融合タンパク質および／またはｇＲＮＡの発現を促進するための追加のエレメントを含み得る。一部の実施形態において、ＡＡＶ－Ｃａｓ９ベクターは、ポリＡ配列を含み得る。一部の実施形態において、ポリＡ配列は、ｂｇＨｉ－ポリＡ配列であり得る。一部の実施形態において、ＡＡＶ－Ｃａｓ９ベクターは、レギュレータエレメントを含み得る。一部の実施形態において、レギュレータエレメントは、アクチベーターまたはリプレッサーである。一部の実施形態において、レギュレータエレメントは、転写後調節エレメント（例えば、ＷＰＲＥ－３：ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント－３）である。
一部の実施形態において、ＡＡＶ－Ｃａｓ９は、１つまたはそれ以上のプロモーターを含有し得る。一部の実施形態において、１つまたはそれ以上のプロモーターは、Ｃａｓ９の発現を駆動する。一部の実施形態において、１つまたはそれ以上のプロモーターは、筋特異的プロモーターである。例示的な筋特異的プロモーターとして、ミオシン軽鎖－２プロモーター、α－アクチンプロモーター、トロポニン１プロモーター、Ｎａ＋／Ｃａ２＋交換体プロモーター、ジストロフィンプロモーター、α７インテグリンプロモーター、脳ナトリウム利尿ペプチドプロモーター、αＢ－クリスタリン／低分子ヒートショックタンパク質プロモーター、α－ミオシン重鎖プロモーター、ＡＮＦプロモーター、ＣＫ８プロモーターおよびＣＫ８ｅプロモーターが挙げられる。一部の実施形態において、１つまたはそれ以上のプロモーターは、心特異的プロモーターである。例示的な心特異的プロモーターとして、心筋トロポニンＴおよびα－ミオシン重鎖プロモーターが挙げられる。
一部の実施形態において、ＡＡＶ－Ｃａｓ９ベクターは、酵母、細菌、昆虫細胞または哺乳動物細胞における生産のために最適化され得る。一部の実施形態において、ＡＡＶ－Ｃａｓ９ベクターは、ヒト細胞における発現のために最適化され得る。一部の実施形態において、ＡＡＶ－Ｃａｓ９ベクターは、バキュロウイルス発現系における発現のために最適化され得る。
本開示の遺伝子編集構築物の一部の実施形態において、構築物は、プロモーターと、本明細書において説明される融合タンパク質をコードする核酸とを含むかまたはからなる。一部の実施形態において、構築物は、心筋トロポニンＴプロモーターと、デアミナーゼおよびＣａｓ９ヌクレアーゼを含む融合タンパク質をコードする核酸とを含むかまたはからなる。一部の実施形態において、構築物は、心筋トロポニンＴプロモーターと、デアミナーゼおよび化膿性ブドウ球菌から単離されたかまたはこれに由来するＣａｓ９ニッカーゼ（「ＳｐＣａｓ９」）を含む融合タンパク質をコードする核酸とを含むかまたはからなる。本明細書中のＡＡＶベクターにおいて使用され得る例示的なプロモーターは、配列番号７２を含み得る。
一部の実施形態において、プロモーターとヌクレアーゼとを含む構築物は、少なくとも２つの末端逆位（ＩＴＲ）配列をさらに含む。一部の実施形態において、プロモーターとヌクレアーゼとを含む構築物は、血清型２のＡＡＶ（ＡＡＶ２）から単離されたかまたはこれに由来する少なくとも２つのＩＴＲ配列をさらに含む。一部の実施形態において、プロモーターとヌクレアーゼとを含む構築物は、少なくとも２つのＩＴＲ配列をさらに含み、各々は、配列番号７１または８５のヌクレオチド配列を含むかまたはからなる。一部の実施形態において、プロモーターとヌクレアーゼとを含む構築物は、少なくとも２つのＩＴＲ配列をさらに含み、ここで、第１のＩＴＲ配列は、配列番号７１のヌクレオチド配列を含むかまたはからなり、第２のＩＴＲ配列は、ヌクレオチド配列８５を含むかまたはからなる。一部の実施形態において、構築物は、５’から３’へ、第１のＩＴＲ、プロモーター（例えば、心筋トロポニンＴプロモーター）をコードする配列、核局在化シグナルをコードする配列、デアミナーゼをコードする配列、フレキシブルペプチドリンカーをコードする配列、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼの断片（例えば、Ｎ末端半分）をコードする配列、ｇＲＮＡをコードする配列、および第２のＩＴＲを含むかまたはからなる。一部の実施形態において、構築物は、５’から３’へ、第１のＩＴＲ、プロモーター（例えば、心筋トロポニンＴプロモーター）をコードする配列、核局在化シグナルをコードする配列、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼの第２の断片（例えば、Ｃ末端半分）をコードする配列、ｇＲＮＡをコードする配列、および第２のＩＴＲを含むかまたはからなる。
（ｅ）塩基エディターおよびｇＲＮＡのＡＡＶ送達
本開示の一部の態様は、スプリット塩基エディターデュアルＡＡＶ法（ｓｐｌｉｔ－ｂａｓｅ ｅｄｉｔｏｒ ｄｕａｌ ＡＡＶ ｓｔｒａｔｅｇｙ）を使用する、塩基エディター（およびそれらの関連付けられるｇＲＮＡ）の送達に関する。動物における塩基エディターの送達に対する１つの障害は、ＦＤＡによって承認された唯一のインビボ遺伝子療法ベクターである効率的かつ広範に使用されている送達剤であるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に塩基エディターをパッケージングすることができないことであった。塩基エディターをコードするＤＮＡの大きなサイズ（化膿性連鎖球菌Ｃａｓ９を含有する塩基エディターについて、任意のガイドＲＮＡまたは調節配列を含まず、５．２ｋｂ）は、５ｋｂ未満のゲノムパッケージングサイズ限界を有するＡＡＶへのパッケージングを不可能にし得る。
このパッケージングサイズ限界を回避し、ＡＡＶを使用して塩基エディターを送達するために、スプリット塩基エディターデュアルＡＡＶ法を考案し、ここでは、アデニン塩基エディター（ＡＢＥ）をＮ末端半分およびＣ末端半分に分ける。この方法は、ＰＣＴ特許出願公開公報第２０２０２３６９８２Ａ１号において説明されており、その全体の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。各塩基エディター半分は、ファストスプライシングスプリットインテイン（ｆａｓｔ－ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｓｐｌｉｔ－ｉｎｔｅｉｎ）の半分に融合される。各塩基エディター－スプリットインテイン半分を発現するＡＡＶ粒子による同時感染後、トランスでのタンパク質スプライシングは、全長塩基エディターを再構成する。スプリットＣａｓ９を架橋するために低分子またはｓｇＲＮＡを利用する他の手法とは異なり、インテイン・スプライシングは、すべての外因性配列を除去し、スプリット部位においてネイティブペプチド結合を再生し、非改変塩基エディターと配列が同一である単一の再構成されたタンパク質をもたらす。
ＰＣＴ特許出願公開公報第２０２０２３６９８２Ａ１号は、例えばｒＡＡＶベクターを介して、Ｃａｓ９タンパク質または核酸塩基エディターを細胞へ送達するための、核酸分子、組成物、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）粒子、キットおよび方法をさらに提供する。典型的に、Ｃａｓ９タンパク質または核酸塩基エディターは、「スプリット」されてＮ末端部分およびＣ末端部分になる。Ｃａｓ９タンパク質または核酸塩基エディターのＮ末端部分またはＣ末端部分は、それぞれ、インテイン系の１つのメンバーに融合され得る。生ずる融合タンパク質は、別々のベクター（例えば、別々のｒＡＡＶベクター）上で１つの細胞へ送達され、同時発現される場合、接合されて、完全かつ機能的なＣａｓ９タンパク質または核酸塩基エディターを形成し得る（例えば、インテイン媒介タンパク質スプライシングを介して）。スプリットＣａｓ９タンパク質または核酸塩基エディターの高発現レベルのための、送達ベクターにおける調節エレメントの実験的試験が本明細書においてさらに提供される。
一部の実施形態において、アデニン塩基エディター（ＡＢＥ）は、ＡＢＥのＣａｓ９ドメイン内においてスプリットされる。一部の実施形態において、ＡＢＥは、配列、
を有するＣａｓ９（例えば、Ｃａｓ９－ＶＲＱＲ）のＧｌｕ５７３とＣｙｓ５７４との間においてスプリットされる。
明確にする目的のために、残基Ｅ５７３およびＣ５７４は、配列番号１５の上記配列において太字および下線で示される。異なるＣａｓ９配列（例えば、上記に列挙される配列番号１６～２２）を有するＡＢＥは、配列番号１５のＣａｓ９と比較して、同じまたは異なる残基（例えば、本明細書において例示されるように、配列番号１５の残基５７３または５７４から少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０または１００残基である残基）においてスプリットされ得ることを理解すべきである。また、配列番号１５は、開始コドンとしての開始アミノ酸残基としてメチオニンを含有することが理解される。Ｃａｓ９タンパク質がＮ末端の核局在化配列を伴って発現された場合のように、このアミノ酸が省かれた場合、スプリットされる対応する残基は、Ｅ５７２およびＣ５７３である。また、Ｃａｓ９タンパク質（本明細書において説明される）に共有結合されたデアミナーゼを含む全長融合タンパク質もまた、Ｃａｓ９タンパク質における相当するロケーションにおいてスプリットされ得ることが理解され得る。例えば、配列番号４６を含む融合タンパク質は、配列番号４６によるＥ９８７およびＣ９８８においてスプリットされ得る。他のＣａｓ９配列において、および本明細書において説明される融合タンパク質（例えば、塩基エディター）において、対応する残基を特定するために有用なツール（例えば、ＢＬＡＳＴ）は、当該技術分野において公知であり、当業者は、そのような対応する残基をどのように決定するかを理解し得る。一部の実施形態において、塩基エディターをスプリットするために使用されるインテインは、Ｎｐｕインテインである。一部の実施形態において、インテインは、配列番号１５３または１５４のアミノ酸配列を含み、ここで、配列番号１５３は、Ｎｐｕ ＤｎａＥ Ｎ末端タンパク質であり、配列番号１５４は、Ｎｐｕ ＤｎａＥ Ｃ末端タンパク質である。
Ｎｐｕ ＤｎａＥ Ｎ末端タンパク質：
ＣＬＳＹＥＴＥＩＬＴＶＥＹＧＬＬＰＩＧＫＩＶＥＫＲＩＥＣＴＶＹＳＶＤＮＮＧＮＩＹＴＱＰＶＡＱＷＨＤＲＧＥＱＥＶＦＥＹＣＬＥＤＧＳＬＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＶＤＧＱＭＬＰＩＤ（配列番号１５３）
Ｎｐｕ ＤｎａＥ Ｃ末端タンパク質：
ＩＫＩＡＴＲＫＹＬＧＫＱＮＶＹＤＩＧＶＥＲＤＨＮＦＡＬＫＮＧＦＩＡＳＮ（配列番号１５４）
一部の実施形態において、５’から３’へ、第１のＩＴＲ、プロモーターをコードする配列、ｇＲＮＡおよび／またはＣａｓ９ニッカーゼもしくはその断片をコードする配列、ならびに第２のＩＴＲを含むかまたはからなる構築物は、ポリＡ配列をさらに含む。一部の実施形態において、ポリＡ配列は、ｂＧＨ配列を含むかまたはからなる。本開示の例示的なｂＧＨ配列は、配列番号８１のヌクレオチド配列（ｃｔｇｔｇｃｃｔｔｃｔａｇｔｔｇｃｃａｇｃｃａｔｃｔｇｔｔｇｔｔｔｇｃｃｃｃｔｃｃｃｃｃｇｔｇｃｃｔｔｃｃｔｔｇａｃｃｃｔｇｇａａｇｇｔｇｃｃａｃｔｃｃｃａｃｔｇｔｃｃｔｔｔｃｃｔａａｔａａａａｔｇａｇｇａａａｔｔｇｃａｔｃｇｃａｔｔｇｔｃｔｇａｇｔａｇｇｔｇｔｃａｔｔｃｔａｔｔｃｔｇｇｇｇｇｇｔｇｇｇｇｔｇｇｇｇｃａｇｇａｃａｇｃａａｇｇｇｇｇａｇｇａｔｔｇｇｇａａｇａｃａａｔａｇｃａｇｇｃａｔｇｃｔｇｇｇｇａｔｇｃｇｇｔｇｇｇｃｔｃｔａｔｇｇ）を含むかまたはからなる。一部の実施形態において、構築物は、５’から３’へ、第１のＩＴＲ、プロモーターをコードする配列、融合タンパク質（以下「塩基エディター」）またはその断片をコードする配列、ポリＡ配列、ｇＲＮＡをコードする配列、および第２のＩＴＲを含むかまたはからなる。一部の実施形態において、構築物は、５’から３’へ、第１のＩＴＲ、プロモーターをコードする配列、融合タンパク質（以下「塩基エディター」）またはその断片をコードする配列、ｂｇＨポリＡ配列、ｇＲＮＡをコードする配列、および第２のＩＴＲを含むかまたはからなる。一部の実施形態において、構築物は、５’から３’へ、第１のＡＡＶ２ ＩＴＲ、心筋トロポニンＴプロモーターをコードする配列、融合タンパク質（以下「塩基エディター」）またはその断片をコードする配列、ｂｇＨポリＡ配列、ｇＲＮＡをコードする配列、および第２のＡＡＶ２ ＩＴＲを含むかまたはからなる。一部の実施形態において、５’から３’へ、第１のＩＴＲ、プロモーターをコードする配列、融合タンパク質（以下「塩基エディター」）またはその断片をコードする配列、ポリＡ配列、ｇＲＮＡをコードする配列、および第２のＩＴＲを含む構築物は、少なくとも１つの核局在化シグナルをさらに含む。一部の実施形態において、５’から３’へ、第１のＩＴＲ、プロモーターをコードする配列、融合タンパク質（以下「塩基エディター」）またはその断片をコードする配列、ポリＡ配列、ｇＲＮＡをコードする配列、および第２のＩＴＲを含む構築物は、少なくとも２つの核局在化シグナルをさらに含む。本開示の核局在化シグナルをコードする例示的な配列は、配列番号４３、４４および９０のいずれかを含むかまたはからなる。一部の実施形態において、構築物は、５’から３’へ、第１のＩＴＲ、プロモーターをコードする配列、第１の核局在化シグナルをコードする配列、融合タンパク質（以下「塩基エディター」）またはその断片をコードする配列、ポリＡ配列、ｇＲＮＡをコードする配列、および第２のＩＴＲを含むかまたはからなる。一部の実施形態において、構築物は、５’から３’へ、第１のＩＴＲ、プロモーターをコードする配列、第１の核局在化シグナルをコードする配列、融合タンパク質（以下「塩基エディター」）またはその断片をコードする配列、第２の核局在化シグナルをコードする配列、ポリＡ配列をコードする配列、ｇＲＮＡをコードする配列、および第２のＩＴＲを含むかまたはからなる。一部の実施形態において、５’から３’へ、第１のＩＴＲ、プロモーターをコードする配列、第１の核局在化シグナルをコードする配列、融合タンパク質（以下「塩基エディター」）またはその断片をコードする配列、第２の核局在化シグナルをコードする配列、ポリＡ配列、ｇＲＮＡをコードする配列、および第２のＩＴＲを含む構築物は、停止コドンをさらに含む。停止コドンは、ＴＡＧ、ＴＡＡまたはＴＧＡの配列を有し得る。一部の実施形態において、構築物は、５’から３’へ、第１のＩＴＲ、プロモーターをコードする配列、第１の核局在化シグナルをコードする配列、融合タンパク質（以下「塩基エディター」）またはその断片をコードする配列、第２の核局在化シグナルをコードする配列、停止コドン、ポリＡ配列、ｇＲＮＡをコードする配列、および第２のＩＴＲを含むかまたはからなる。一部の実施形態において、５’から３’へ、第１のＩＴＲ、プロモーターをコードする配列、第１の核局在化シグナルをコードする配列、ヌクレアーゼをコードする配列、第２の核局在化シグナルをコードする配列、停止コドン、ポリＡ配列、および第２のＩＴＲを含むかまたはからなる構築物は、調節配列をさらに含む。調節配列は、翻訳後調節エレメントをコードし得る。例えば、本開示の例示的な調節配列は、配列番号８０のヌクレオチド配列（ＷＰＲＥ－３（ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント－３）をコードする）を含むかまたはからなる。一部の実施形態において、構築物は、５’から３’へ、第１のＩＴＲ、プロモーターをコードする配列、第１の核局在化シグナルをコードする配列、融合タンパク質（以下「塩基エディター」）またはその断片をコードする配列、第２の核局在化シグナルをコードする配列、停止コドン、調節エレメントをコードする配列（例えば、配列番号８０）、ポリＡ配列、ｇＲＮＡをコードする配列、および第２のＩＴＲを含むかまたはからなる。一部の実施形態において、５’から３’へ、第１のＩＴＲ、プロモーターをコードする配列、第１の核局在化シグナルをコードする配列、融合タンパク質（以下「塩基エディター」）またはその断片をコードする配列、第２の核局在化シグナルをコードする配列、停止コドン、調節配列、ポリＡ配列、ｇＲＮＡをコードする配列、および第２のＩＴＲを含むかまたはからなる構築物は、１つまたはそれ以上のｇＲＮＡスキャフォールド配列をさらに含む。好適なｇＲＮＡスキャフォールド配列は、配列番号８２、８４、１６５および／または１６６のいずれかを含み得る。
配列番号８２：
ＧＡＧＧＧＣＣＴＡＴＴＴＣＣＣＡＴＧＡＴＴＣＣＴＴＣＡＴＡＴＴＴＧＣＡＴＡＴＡＣＧＡＴＡＣＡＡＧＧＣＴＧＴＴＡＧＡＧＡＧＡＴＡＡＴＴＡＧＡＡＴＴＡＡＴＴＴＧＡＣＴＧＴＡＡＡＣＡＣＡＡＡＧＡＴＡＴＴＡＧＴＡＣＡＡＡＡＴＡＣＧＴＧＡＣＧＴＡＧＡＡＡＧＴＡＡＴＡＡＴＴＴＣＴＴＧＧＧＴＡＧＴＴＴＧＣＡＧＴＴＴＴＡＡＡＡＴＴＡＴＧＴＴＴＴＡＡＡＡＴＧＧＡＣＴＡＴＣＡＴＡＴＧＣＴＴＡＣＣＧＴＡＡＣＴＴＧＡＡＡＧＴＡＴＴＴＣＧＡＴＴＴＣＴＴＧＧＣＴＴＴＡＴＡＴＡＴＣＴＴＧＴＧＧＡＡＡＧＧＡＣＧＡＡＡＣＡＣＣＧ
配列番号８４：
ＧＣＴＴＡＡＧＡＧＣＴＡＴＧＣＴＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＴＡＡＧＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣＧＴＴＡＴＣＡＡＣＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＧＧＣＡＣＣＧＡＧＴＣＧＧＴＧＣ
配列番号１６５：
ＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣＧＴＴＡＴＣＡＡＣＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＧＧＣＡＣＣＧＡＧＴＣＧＧＴＧＣ
配列番号１６６：
ＧＴＴＴＡＡＧＡＧＣＴＡＴＧＣＴＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＴＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣＧＴＴＡＴＣＡＡＣＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＧＧＣＡＣＣＧＡＧＴＣＧＧＴＧＣＴＴＴＴ
したがって、一部の実施形態において、構築物は、５’から３’へ、第１のＩＴＲ、プロモーターをコードする配列、第１の核局在化シグナルをコードする配列、融合タンパク質（以下「塩基エディター」）またはその断片をコードする配列、第２の核局在化シグナルをコードする配列、停止コドン、調節配列、ポリＡ配列、第１のｇＲＮＡスキャフォールド配列をコードする配列、ｇＲＮＡをコードする配列、第２のｇＲＮＡスキャフォールド配列をコードする配列、および第２のＩＴＲを含むかまたはからなり得る。
一部の実施形態において、構築物は、１つまたはそれ以上のスペーサー配列をさらに含み得る。本開示の例示的なスペーサー配列は、１～１５００ヌクレオチドの長さを有し、その間のすべての範囲の長さも含む。一部の実施形態において、スペーサー配列は、ＩＴＲ、プロモーター、核局在化配列、融合タンパク質（以下「塩基エディター」）をコードする配列、停止コドン、ポリＡ配列、ｇＲＮＡスキャフォールド、ｇＲＮＡをコードする核酸、および／または調節エレメントの５’または３’のいずれかに位置付けられ得る。
本明細書中の本開示に従って、ｇＲＮＡおよび／または融合タンパク質（塩基エディター）もしくはその断片をコードする核酸のうちの１つまたはそれ以上を含む例示的なウイルスベクターが提供される。また、本明細書において説明される融合タンパク質の第１の断片をコードする第１のウイルスベクター、および融合タンパク質の第２の断片をコードする第２のウイルスベクターを含む１対のウイルスベクターが提供され、ここで、第１および第２の断片は、翻訳後スプライシングによって細胞において再結合して、機能的融合タンパク質（上記に説明される）を形成し得る。２つの例示的なベクターは、重要な成分と共に、以下の表９および１０において説明される。
一部の態様において、上記の表において示される各ＡＡＶベクターは、ＡＢＥｍａｘ－ＶＲＱＲのＮ末端半分（配列番号６９）またはＣ末端半分（配列番号７０）のいずれかを発現する。２つのタンパク質半分が接触した場合、それらはタンパク質トランススプライシングを受けて、完全なタンパク質を形成する。配列番号６９および７０は、以下の表１２に示される。各配列は、下線で示される「ＮＰＵインテイン断片」（配列番号１５３および１５４）を有する。この断片は、最終タンパク質構築物から除去されて、完全な融合タンパク質が形成される。
一部の実施形態において、本明細書において開示されるＡＡＶベクターは、標的細胞における導入遺伝子発現のためにゲノムを送達するために使用され得るウイルス粒子にパッケージングされ得る。一部の実施形態において、本明細書において開示されるＡＡＶベクターは、一過性のトランスフェクション、生産性細胞株の使用、ウイルス特性を組み合わせてＡｄ－ＡＡＶハイブリッドにすること、ヘルペスウイルス系の使用、またはバキュロウイルスを使用する昆虫細胞における生産によって粒子へパッケージングされ得る。
一部の実施形態において、本明細書中のパッケージング細胞を生成する方法は、ＡＡＶ粒子生産に必要な成分のすべてを安定に発現する細胞株を作出することを含む。例えば、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を欠くｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムから分離したＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、ならびに選択可能なマーカー、例えばネオマイシン抵抗性遺伝子を含むプラスミド（または多数のプラスミド）は、細胞のゲノムに組み込まれる。ＡＡＶゲノムは、ＧＣテーリング（Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ６．ＵＳＡ，７９：２０７７－２０８１）、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含有する合成リンカーの付加（Ｌａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｇｅｎｅ，２３：６５－７３）、または直接的な平滑末端ライゲーション（Ｓｅｎａｐａｔｈｙ ＆ Ｃａｒｔｅｒ，１９８４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９：４６６１－４６６６）などの手技によって細菌プラスミドへ導入されている。その後、パッケージング細胞株に、アデノウイルスなどのヘルパーウイルスを感染させる。この方法の利点は、細胞が選択可能であり、かつｒＡＡＶのラージスケール生産に好適であることである。好適な方法の他の例は、ｒＡＡＶゲノムならびに／またはｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子をパッケージング細胞へ導入するために、プラスミドではなくアデノウイルスまたはバキュロウイルスを用いる。
一部の実施形態において、宿主細胞は、本明細書において説明される１つまたはそれ以上のベクター、直鎖状ポリヌクレオチド、ポリペプチド、核酸－タンパク質複合体またはそれらの任意の組合せを一過的にまたは非一過的にトランスフェクトされる。一部の実施形態において、細胞は、インビトロで、培養物中で、またはエクスビボでトランスフェクトされ得る。一部の実施形態において、トランスフェクションは対象において天然に起こるので、細胞はトランスフェクトされ得る。一部の実施形態において、トランスフェクトされる細胞は、対象から採取され得る。一部の実施形態において、細胞は、対象から採取された細胞、例えば細胞株に由来する。
一部の実施形態において、本明細書において説明される１つまたはそれ以上のベクター、直鎖状ポリヌクレオチド、ポリペプチド、核酸－タンパク質複合体またはそれらの任意の組合せをトランスフェクトされた細胞は、新しい細胞株を確立するために使用してもよく、１つまたはそれ以上のトランスフェクション由来配列を含み得る。一部の実施形態において、本明細書において説明される操作された核酸誘導型ヌクレアーゼ系の成分を一過的にトランスフェクトされ（例えば、１つもしくはそれ以上のベクターの一過性のトランスフェクション、またはＲＮＡによるトランスフェクションによって）、操作されたヌクレアーゼ複合体の活性を通して改変された細胞は、新しい細胞株を確立するために使用してもよく、改変を含有するが任意の他の外因性配列を欠く細胞を含み得る。
本明細書において開示される一部の実施形態は、例えば、遺伝子を標的化およびノックアウトし、遺伝子を増幅し、かつ／またはＤＮＡ反復不安定性および医学的障害と関連付けられる特定の突然変異を修復するための、本明細書において開示されるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系の使用に関する。一部の実施形態において、本明細書中のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系は、ゲノム不安定性のこれらの欠陥を利用し、修正するために使用され得る。他の実施形態において、本明細書において開示されるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系は、心筋症と関連付けられる遺伝子における欠陥を修正するために使用され得る。
Ｃ．医薬組成物
本明細書において開示されるＡＡＶウイルス粒子、ＡＡＶベクター、ポリヌクレオチド、またはポリヌクレオチドをコードするベクターのいずれかは、医薬組成物に製剤化され得る。一部の実施形態において、医薬組成物は、１つまたはそれ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤をさらに含み得る。本方法において使用される予定の医薬組成物のいずれかは、凍結乾燥製剤または水溶液の形態において薬学的に許容される担体、賦形剤または安定化剤を含み得る。
医薬組成物中の担体は、それが組成物の有効成分と適合性であり、好ましくは、有効成分を安定化することが可能であり、処置される予定の対象にとって有害でないという意味において「許容され」なければならない。例えば、「薬学的に許容される」とは、哺乳動物（例えば、ヒト）に投与された場合、生理学的に忍容でき、典型的に不都合な反応を生産しないような成分を含む、組成物の分子実体および他の成分を指し得る。一部の例において、本明細書において開示される医薬組成物において使用される「薬学的に許容される」担体は、哺乳類における、より特にヒトにおける使用について、連邦もしくは州政府の規制当局によって承認されたか、または米国薬局方もしくは他の一般的に認められている薬局方において列挙される担体であり得る。
緩衝液を含む薬学的に許容される担体は、当該技術分野において周知であり、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化物質；保存剤；低分子量ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；アミノ酸；疎水性ポリマー；単糖；二糖；および他の炭水化物；金属複合体；ならびに／または非イオン性界面活性剤を含み得る。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２０ｔｈ Ｅｄ．（２０００）Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｅｄ．Ｋ． Ｅ．Ｈｏｏｖｅｒを参照されたい。
一部の実施形態において、医薬組成物または製剤は、皮下、筋内、静脈内、腹腔内、心臓内、関節内または空洞内注射による投与のためであり得る。一部の実施形態において、医薬組成物または製剤は、非経口投与、例えば、静脈内、脳室内注射、大槽内注射、柔組織内注射、腹腔内、心臓内、関節内もしくは空洞内注射、またはそれらの組合せのためである。そのような薬学的に許容される担体は、滅菌液体、例えば、水、および石油、動物、植物または合成起源の油を含む油、例えばピーナッツ油、大豆油、鉱油などであり得る。食塩水および水性デキストロース、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ならびにグリセロール溶液もまた、液体担体として、特に注射用溶液のために用いることができる。本明細書において開示される医薬組成物は、追加の成分、例えば、保存剤、緩衝液、等張化剤、抗酸化物質および安定化剤、非イオン性湿潤または清澄剤、粘性増加剤などをさらに含み得る。本明細書において説明される医薬組成物は、単一の単位投与量で、または多数の剤形で包装され得る。
非経口投与に好適な製剤は、抗酸化物質、緩衝液、静菌剤、およびその製剤を、意図されるレシピエントの血液と等張にする溶質を含有し得る水性および非水性滅菌注射用溶液；ならびに懸濁剤および増粘剤を含み得る水性および非水性滅菌懸濁液を含む。水溶液は、好適に（好ましくは３～９のｐＨに）緩衝され得る。滅菌条件下における好適な非経口製剤の調製は、当業者に周知の標準の製薬技法によって容易に達成される。
インビボ投与に使用される予定の医薬組成物は、無菌であるべきである。これは、例えば、滅菌濾過膜を通した濾過によって、容易に達成される。滅菌注射用溶液は、一般的に、必要とされる量のＡＡＶ粒子を、必要に応じて上記に列挙される様々な他の成分を含む適切な溶媒に組み込み、続いて濾過滅菌することによって調製される。一般的に、分散液は、滅菌された有効成分を、基本分散媒体および上記に列挙される成分のうちの必要とされる他の成分を含有する滅菌媒体へ組み込むことによって調製される。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、有効成分および任意の追加の所望の成分の以前に滅菌濾過された溶液から、それらの粉末を産出する真空乾燥および凍結乾燥技法である。
また、本明細書において開示される医薬組成物は、他の成分、例えば、希釈剤および補助剤を含み得る。許容可能な担体、希釈剤および補助剤は、レシピエントにとって非毒性であり、好ましくは用いられる投与量および濃度において不活性であり、リン酸塩、クエン酸塩もしくは他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸などの抗酸化物質；低分子量ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンもしくはリジンなどのアミノ酸；単糖、二糖、およびグルコース、マンノースもしくはデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；マンニトールもしくはソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成対イオン；ならびに／またはＴｗｅｅｎ、プルロニックもしくはポリエチレングリコールなどの非イオン性界面活性剤を含む。
Ｄ．遺伝子編集された生物－モデル系
本開示のさらなる態様は、本明細書において提供される遺伝編集技法および組成物を試験するために使用され得る遺伝編集された生物（例えば、哺乳動物生物）を対象とする。例えば、一態様において、本明細書中の遺伝子編集組成物は、一般的に、心筋症と関連付けられる遺伝子突然変異を修正するために、ヒト遺伝子の突然変異部位において塩基編集を行うための、ｇＲＮＡと、ニッカーゼおよびデアミナーゼの融合タンパク質とを含む。しかしながら、対応するマウス遺伝子（ＭＹＨ６）はヒト遺伝子（ＭＹＨ７）とは異なり、同等の突然変異はマウスＭＹＨ６およびヒトＭＹＨ７について存在しないので、この方策を試験するために好適なマウスモデルは存在しない。このことは、ヒトＭＹＨ７遺伝子について最適化されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集系は、マウスＭＹＨ６遺伝子に対して任意の効果を有しない場合があることを意味する。
したがって、本開示のさらなる態様に従って、遺伝子編集されたマウスであって、ヒト化突然変異型Ｍｙｈ６対立遺伝子を形成するように内因性マウスＭｙｈ６遺伝子内に挿入されたＭＹＨ７ ｃ．１２０８ Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｒ４０３Ｑ）ヒトミスセンス突然変異を含むヒト核酸を含むマウスが提供される。一部の態様において、ヒト核酸は、ミスセンス突然変異に隣接し、その上流にある第１のポリヌクレオチドと、ミスセンス突然変異に隣接し、その下流にある第２のポリヌクレオチドとをさらに含む。例えば、一部の態様において、第１のポリヌクレオチドは、約３０～７５ヌクレオチド、約３５～約７０ヌクレオチド、約４０～約６５ヌクレオチド、または約４５～約６０ヌクレオチドを含む。例えば、第１のポリヌクレオチドは、約５５ヌクレオチドを含み得る。他の態様において、第２のポリヌクレオチドは、約１０～３０ヌクレオチド、約１５～２５ヌクレオチド、または約２０～２５ヌクレオチドを含む。例えば、第２のポリヌクレオチドは、２１ヌクレオチドを含むかまたはからなり得る。内因性Ｍｙｈ６遺伝子に挿入され得る例示的なヒト核酸は、以下の表に示される。また、ネイティブＭｙＨ６対立遺伝子が示される。表１３に示される通り、ヒト化核酸は、ＭＹＨ７遺伝子の相当部分と同一であり、マウスＭｙＨ６遺伝子と比較して置換を含む（下線で示す）。ミスセンス突然変異は、太字および下線で示される。配列番号１５８（表１４Ｃ）は、Ｇ＞Ａ突然変異を含む任意選択のヒト化対立遺伝子を示し、ここで、ヌクレオチドＮ１～Ｎ６は、ネイティブマウスヌクレオチドまたはヒト化ヌクレオチドから選択され得る。様々な態様において、ヒト化突然変異型Ｍｙｈ６対立遺伝子は、ネイティブＭｙｈ６対立遺伝子（配列番号９９または配列番号１６３）と比較して、配列番号１５８による少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５または少なくとも６個の突然変異を含む。表１４Ａ～１４Ｃは、全長マウスおよびヒト突然変異型および野生型ＭＹＨ６およびＭＹＨ７タンパク質配列（表１４Ａ）、全長ヒトおよびマウス突然変異型および野生型遺伝子転写産物（ｃＤＮＡ配列）（表１４Ｂ）、ならびにＭｙｈ６対立遺伝子の中および周囲の任意選択のヒト化突然変異を包含する追加の配列（表１４Ｃ）をさらに示す。
様々な態様において、遺伝子編集されたマウスの少なくとも１つの細胞は、配列番号９４を含む野生型ミオシンタンパク質と比較して、Ｒ４０４Ｑ置換を含む突然変異型ミオシンタンパク質を発現する。参照を容易にするために、表１４は、ネイティブＭｙｈ６タンパク質（マウス）、ネイティブヒトＭｙｈ７タンパク質、および上記に説明されるヒト化Ｍｙｈ６対立遺伝子によって発現される突然変異型Ｍｙｈ６タンパク質の配列を示す。したがって、様々な態様において、遺伝子編集されたマウスの少なくとも１つの細胞は、配列番号９６を含む突然変異型ミオシンタンパク質を発現する。一部の態様において、マウスは、突然変異型Ｍｙｈ６対立遺伝子についてヘテロ接合性であり、野生型Ｍｙｈ６対立遺伝子をさらに含む。
遺伝子編集されたマウスは、当該技術分野において公知の方法に従って作出され得る。一部の態様において、遺伝子編集されたマウスは、当該技術分野において説明されるプロトコール（例えば、Ｈ．Ｍｉｕｒａ，Ｒ．Ｍ．Ｑｕａｄｒｏｓ，Ｃ．Ｂ．Ｇｕｒｕｍｕｒｔｈｙ，Ｍ．Ｏｈｔｓｕｋａ，Ｅａｓｉ－ＣＲＩＳＰＲ ｆｏｒ ｃｒｅａｔｉｎｇ ｋｎｏｃｋ－ｉｎ ａｎｄ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌｓ ｕｓｉｎｇ ｌｏｎｇ ｓｓＤＮＡ ｄｏｎｏｒｓ．Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ１３，１９５－２１５（２０１８、その全体が参照により本明細書に組み込まれる））に従って、接合体にＣａｓ９ ｍＲＮＡ（５０ｎｇ／μＬ）（配列番号９４、ＩＤＴ）、ｓｇＲＮＡ（２０ｎｇ／μＬ）（配列番号９３、ＩＤＴ）およびｓｓＯＤＮドナー鋳型（１５ｎｇ／μＬ）（配列番号９２、ＩＤＴ）をマイクロインジェクションすることによって作出される。以下の表１５は、本明細書中の遺伝子編集されたマウスを生成するためのこれらの方法に従って使用され得るＣａｓ９ ｍＲＮＡ、ｓｇＲＮＡおよびｓｓＯＤＮドナー鋳型の例示的な核酸を示す。
ＩＩＩ．方法
様々な態様において、細胞内のＭＹＨ７遺伝子における突然変異を修正する方法であって、細胞へ、Ｃａｓ９ニッカーゼもしくは非活性化Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、デアミナーゼ、および配列番号１もしくは２のいずれか１つから選択されるＤＮＡヌクレオチド配列を標的化するｇＲＮＡ、またはＣａｓ９ニッカーゼもしくは非活性化Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、デアミナーゼおよび／もしくはｇＲＮＡをコードする１つもしくはそれ以上の核酸を送達して、ＭＹＨ７遺伝子内またはその近傍の少なくとも１つのヌクレオチドの１つまたはそれ以上の突然変異をもたらす、ＭＹＨ７遺伝子内またはその近傍における１つまたはそれ以上の一本鎖切断（ＳＳＢ）を引き起こし、これによって、ＭＹＨ７遺伝子における突然変異を修正することを含む方法が提供される。様々な態様において、方法は、細胞へ、本明細書において説明されるｇＲＮＡおよび／または融合タンパク質をコードする核酸を送達することを含み得る。核酸は、ウイルスベクターにおいて送達され得る。一部の態様において、核酸は、２つのウイルスベクター（例えば、上記の表１２および１３において説明されるベクター）において送達され得る。
さらなる態様において、それを必要とする対象において、ＭＹＨ７遺伝子における突然変異によって引き起こされる心筋症を治療する方法であって、ＭＹＨ７遺伝子を発現する、対象における少なくとも１つの細胞へ、Ｃａｓ９ニッカーゼもしくは非活性化Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、デアミナーゼ、および配列番号１もしくは２のいずれか１つから選択されるＤＮＡヌクレオチド配列を標的化するｇＲＮＡ、またはＲＮＡによりガイドされるニッカーゼ、デアミナーゼおよび／もしくはｇＲＮＡをコードする１つもしくはそれ以上の核酸を送達して、ＭＹＨ７遺伝子内またはその近傍の少なくとも１つのヌクレオチドの１つまたはそれ以上の突然変異をもたらす、ＭＹＨ７遺伝子内またはその近傍における１つまたはそれ以上の一本鎖切断（ＳＳＢ）を引き起こし、これによって、対象の少なくとも１つの細胞においてＭＹＨ７遺伝子における突然変異を修正することを含む方法が提供される。様々な態様において、ｇＲＮＡによりガイドされるニッカーゼ、デアミナーゼ、およびｇＲＮＡは、本明細書において説明される任意の医薬組成物において送達され得る。一部の態様において、Ｃａｓ９ニッカーゼ／非活性化Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼおよびデアミナーゼは、融合タンパク質（例えば、本明細書において説明される任意の融合タンパク質）として送達される。様々な態様において、方法は、融合タンパク質および／またはｇＲＮＡをコードする１つまたはそれ以上のウイルスベクターを対象に投与することを含む。
様々な態様において、これらの方法のいずれかによって修正されるＭＹＨ７遺伝子における突然変異は、突然変異したＭＹＨ７遺伝子によってコードされるタンパク質生成物において単一のアミノ酸置換をもたらす１つまたはそれ以上の単一ヌクレオチド多型を含む。一部の場合、タンパク質生成物は、ミオシンタンパク質またはペプチドであり、単一のアミノ酸置換は、配列番号９６によるＲ４０３Ｑを含む。
様々な実施形態において、本明細書において開示される組成物は、必要とする対象への投与後に心疾患を治療するために有効であり得る。他の実施形態において、本明細書において開示される組成物は、必要とする対象への投与後に１つまたはそれ以上の心筋症を治療するために有効であり得る。さらに他の実施形態において、本明細書において開示される組成物は、必要とする対象への投与後にＨＣＭを治療するために有効であり得る。他の実施形態において、本明細書において開示される組成物は、必要とする対象への投与後にＨＣＭの少なくとも１つの症状を改善するために有効であり得る。
本明細書中の好適な対象は、ヒト、家畜動物、コンパニオン・アニマル、実験動物または動物学的動物を含む。一部の実施形態において、対象は、げっ歯類、例えば、マウス、ラット、モルモットなどであり得る。一部の実施形態において、対象は、家畜動物であり得る。好適な家畜動物の非限定的な例として、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ラマおよびアルパカが挙げられ得る。一部の実施形態において、対象は、コンパニオン・アニマルであり得る。コンパニオン・アニマルの非限定的な例として、イヌ、ネコ、ウサギおよび鳥などのペットが挙げられ得る。また別の実施形態において、対象は、動物学的動物（ｚｏｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｉｍａｌ）であり得る。本明細書において使用される場合、「動物学的動物」とは、動物園において見出され得る動物を指す。そのような動物は、非ヒト霊長類、大型ネコ、オオカミおよびクマを含み得る。特定の実施形態において、動物は実験動物である。実験動物の非限定的な例として、げっ歯類、イヌ、ネコおよび非ヒト霊長類が挙げられ得る。ある特定の実施形態において、動物は、げっ歯類である。げっ歯類の非限定的な例として、マウス、ラット、モルモットなどが挙げられ得る。好ましい実施形態において、対象は、ヒトである。
様々な実施形態において、必要とする対象は、少なくとも１つの心疾患と診断されている場合がある。一部の態様において、対象は、１つまたはそれ以上の心筋症を有し得る。一部の実施形態において、対象は、ＨＣＭを有し得る。一部の実施形態において、対象は、ＨＣＭの少なくとも１つの症状を有し得る。一部の態様において、ＨＣＭの症状は、疲労であり得る。一部の実施形態において、ＨＣＭの症状は、呼吸困難であり得る。一部の実施形態において、ＨＣＭの症状は、浮腫であり得る。一部の実施形態において、ＨＣＭの症状は、腹水であり得る。一部の実施形態において、ＨＣＭの症状は、胸部痛であり得る。さらに他の態様において、ＨＣＭの症状は、心雑音であり得る。
一部の実施形態において、本明細書において開示される組成物を投与する方法は、同一の疾患状態および予測されるアウトカムを有する治療されていない対象における、心筋症により誘発される心臓線維症と比較して、心筋症により誘発される心臓線維症を減少および／または逆行させ得る。一部の実施形態において、本明細書において開示される組成物を投与する方法は、同一の疾患状態および予測されるアウトカムを有する治療されていない対象における、心筋症により誘発される左心室拡張と比較して、心筋症により誘発される左心室拡張を減少および／または逆行させ得る。
本開示の他の実施形態は、必要とする対象へ、本明細書において開示される組成物を投与する方法であって、投与が、心筋症（例えば、ＨＣＭ）を治療する、方法である。本開示のさらなる他の実施形態は、必要とする対象へ、本明細書において開示される組成物を投与する方法であって、心筋症（例えば、ＨＣＭ）の少なくとも１つの症状が、投与後１ヶ月以内に少なくとも２５％改善される、方法である。
様々な実施形態において、本明細書において開示される組成物は、非経口投与によって投与され得る。本明細書において使用される場合、「非経口投与によって」とは、消化管を通した投与以外の経路を介する、本明細書において開示される組成物の投与を指す。一部の実施形態において、本明細書において開示される組成物は、非経口注射によって投与され得る。一部の態様において、非経口注射による開示される組成物の投与は、皮下、筋内、静脈内、腹腔内、心臓内、関節内または空洞内注射による投与であり得る。一部の実施形態において、非経口注射による開示される組成物の投与は、当該分野において公知の緩徐またはボーラス法による投与であり得る。一部の実施形態において、非経口注射による投与の経路は、標的ロケーションによって決定され得る。一部の実施形態において、本明細書において開示される組成物は、心臓内注射による非経口投与のために製剤化され得る。一部の実施形態において、本明細書において開示される組成物は、カテーテルベースの冠動脈内注入による非経口投与のために製剤化され得る。一部の実施形態において、本明細書において開示される組成物は、心膜注射による非経口投与のために製剤化され得る。
様々な実施形態において、投与される予定の本明細書において開示される組成物の用量は、特に限定されず、予防および／または治療処置の目的、疾患の種類、対象の体重または年齢、疾患の重症度などの条件に依存して適切に選択され得る。一部の実施形態において、本明細書において開示される組成物の用量の投与は、治療有効量の本明細書において開示される組成物を含み得る。本明細書において使用される場合、「治療有効」という用語は、心疾患を治療するか、心疾患と関連付けられる少なくとも１つの症状の提示を低減するか、心臓線維症を逆行／予防するか、少なくとも１つの心室の拡張を逆行／予防するか、心臓総重量を低減するか、心機能を改善するか、生存可能性を増加させるか、またはそれらの組合せである、投与される組成物の量を指す。
一部の実施形態において、本明細書において開示される組成物は、それを必要とする対象へ１回投与され得る。一部の実施形態において、本明細書において開示される組成物は、それを必要とする対象へ２回以上投与され得る。一部の実施形態において、本明細書において開示される組成物の第１の投与に、本明細書において開示される組成物の第２の投与が続き得る。一部の実施形態において、本明細書において開示される組成物の第１の投与に、本明細書において開示される組成物の第２および第３の投与が続き得る。一部の実施形態において、本明細書において開示される組成物の第１の投与に、本明細書において開示される組成物の第２、第３および第４の投与が続き得る。一部の実施形態において、本明細書において開示される組成物の第１の投与に、本明細書において開示される組成物の第２、第３、第４および第５の投与が続き得る。
組成物が、それを必要とする対象へ投与され得る回数は、医療専門家の裁量、心疾患の重症度、および製剤への対象の応答に依存し得る。一部の実施形態において、本明細書において開示される組成物は、持続的に投与してもよく、あるいは、投与される組成物の用量は、ある特定の時間の長さの間、一時的に低減または一時的に保留してもよい（すなわち、「組成物休み」）。一部の態様において、組成物休みの長さは、２日～１年で変動してもよく、単に例として、２日、１週間、１ヶ月、６ヶ月および１年を含む。別の態様において、組成物休み中の用量低減は、１０％～１００％であってもよく、単に例として、１０％、２５％、５０％、７５％および１００％を含む。
様々な実施形態において、本明細書において開示される組成物の所望の毎日の用量は、単一の用量で、または同時に（もしくは短い期間にわたり）もしくは適切な間隔で投与される分割された用量として提示され得る。他の実施形態において、本明細書において開示される組成物の投与は、約１日１回、約１日２回、約１日３回対象へ投与され得る。さらに他の実施形態において、本明細書において開示される組成物の投与は、少なくとも１日１回、少なくとも１日１回約２日間、少なくとも１日１回約３日間、少なくとも１日１回約４日間、少なくとも１日１回約５日間、少なくとも１日１回約６日間、少なくとも１日１回約１週間、少なくとも１日１回約２週間、少なくとも１日１回約３週間、少なくとも１日１回約４週間、少なくとも１日１回約８週間、少なくとも１日１回約１２週間、少なくとも１日１回約１６週間、少なくとも１日１回約２４週間、少なくとも１日１回約５２週間およびそれ以上、対象へ投与され得る。好ましい実施形態において、本明細書において開示される組成物の投与は、１回約４週間対象へ投与され得る。
一部の実施形態において、開示される組成物は最初に投与され、続いて１つまたはそれ以上の異なる組成物または治療レジメンの後続の投与が続いてもよい。他の実施形態において、開示される組成物は、１つまたはそれ以上の異なる組成物または治療レジメンの投与後に投与してもよい。
ＩＶ．キット
本開示の一部の実施形態は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系および／または本明細書において開示される新規ｇＲＮＡもしくは本明細書において開示される公知のｇＲＮＡをパッケージングおよび輸送するためのキットを含み、少なくとも１つ容器をさらに含む。
一部の実施形態において、キットは、本明細書において説明される方法のいずれかにおけるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系、ｇＲＮＡおよびまたはＡＡＶ粒子の使用のための使用説明書をさらに含み得る。含まれる使用説明書は、対象において意図される活性を達成するための、対象への本明細書において開示される医薬組成物の投与の説明を含み得る。キットは、対象が治療を必要とするかどうかを特定することに基づく、治療に好適な対象を選択する説明をさらに含み得る。一部の実施形態において、使用説明書は、心筋症を有するか、または有することが疑われる対象へ、本明細書において開示される医薬組成物を投与する説明を含み得る。
明らかである通り、本系は、目的の任意のポリヌクレオチド配列を標的化するために使用され得ることが想定される。本系を使用して完全に治療され得る状態または疾患の一部の例は、本明細書中の図面および表に含まれ、それらの状態と現在関連付けられる遺伝子の例もまた、本明細書中の図面および表に示される。しかしながら、例示される遺伝子は、網羅的なものではない。本開示の追加の目的、利点および新規特性は、本開示に照らして以下の実施例を再検討することで当業者に明らかになる。以下の実施例は、限定であるとは意図されない。
いくつかの実施形態を説明したので、様々な改変、代替の構造、および均等物が、本発明の概念の趣旨から逸脱することなく、使用され得ることが当業者によって認識される。加えて、いくつかの周知のプロセスおよび要素は、本発明の概念を不必要に曖昧にすることを避けるために説明されていない。したがって、本説明は、本発明の概念の範囲の限定として解釈すべきではない。
当業者は、本開示の実施形態が例のために、限定のためではなく教示することを理解する。それゆえ、本説明に含有されるか、または附属の図面に示される事柄は、例示として、限定の意味ではなく解釈すべきである。以下の特許請求の範囲は、本明細書において説明されるすべての包括的および特定の特性、ならびに方法およびアセンブリの範囲のすべての記述を包含すると意図され、これらは、言葉としては、その中に入ると言われ得る。
以下の実施例は、本開示の好ましい実施形態を実証するために含まれる。以下の実施例において開示される技法は、本発明者によって本開示の実施において十分に機能することが発見された技法を表し、したがって、その実施のための好ましい様式を構成すると考えられ得ることを当業者は理解すべきである。しかしながら、当業者は、本開示に照らして、多くの変化が、本開示の趣旨および範囲から逸脱することなく、開示される特定の実施形態においてなされ、それでも同様のまたは類似する結果を得ることができることを理解する。
［実施例１］
例示的な方法において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を、ヒト細胞におけるＭＹＨ７突然変異の修正のために使用した。簡潔に説明すると、ＭＹＨ７ ｃ．１２０８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｒ４０３Ｑ）突然変異を含有する患者由来の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）（Ｍｕｔ）を、これらの例示的な研究において使用した。ＭＹＨ７ ｐ．Ｒ４０３Ｑ突然変異は、すべてのＨＣＭを引き起こす突然変異のうちの３分の１において起こり、コードヌクレオチド１２０８におけるグアニンからアデニンへの突然変異をもたらし、最終的なタンパク質におけるアミノ酸４０３の、アルギニンからグルタミンへの変換をもたらす。図１Ａは、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）５’－ＴＧＡＧ－３’を伴う配列５’－ＣＣＴ ＣＡＧ ＧＴＧ ＡＡＡ ＧＴＧ ＧＧＣ ＡＡ－３’（配列番号１）を有するｇＲＮＡを示す。プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）５’－ＴＧＡＧ－３’を伴う配列５’－ＣＣＴ ＣＡＧ ＧＴＧ ＡＡＡ ＧＴＧ ＧＧＣ ＡＡ－３’（配列番号１）を有するｇＲＮＡをコードするプラスミド、およびＡＢＥｍａｘ－ＳｐＣａｓ９－ＮＧをコードするプラスミドのヌクレオフェクション（図１Ｂ）後、隣接するアデニンヌクレオチドの顕著なバイスタンダー編集を伴わない、突然変異型アデニンヌクレオチドを野生型グアニンヌクレオチドへ戻す強固な編集（図１Ｃ）。
次に、ＭＹＨ７ ｃ．１２０８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｒ４０３Ｑ）突然変異を含有する患者由来の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）（Ｍｕｔ）、または上記に説明されるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９法を使用して修正されたｉＰＳＣ（Ｃｏｒ）を単離し、心筋細胞へ分化させた（ｉＰＳＣ－ＣＭ）（図２Ａ、図６Ｃ）。Ｍｕｔ ｉＰＳＣ－ＣＭおよびＣｏｒ ｉＰＳＣ－ＣＭによる力発生の解析は、Ｃｏｒ株における顕著な低減を示し、ＭＹＨ７ ｐ．Ｒ４０３Ｑ突然変異の修正は、高収縮性の表現型を減少させることを実証した（図２Ｂ）。これらのデータは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９が、患者において見出される高収縮性表現型の改善のために使用され得ることを示唆した。
［実施例２］
別の例示的な方法において、ヒトＭＹＨ７ ｐ．Ｒ４０３Ｑ突然変異をモデル化するために遺伝子改変マウス系統を生成した（図３Ａ）。具体的には、このマウス系統は、マウスにおいて優勢に発現するミオシンアイソフォームである、マウスミオシン重鎖６（Ｍｙｈ６）遺伝子内において同じヒト疾患を引き起こす突然変異を含有した（図３Ｂ）。１つの対立遺伝子上にミスセンス突然変異を有するマウス（４０３／＋）、および両方の対立遺伝子上にミスセンス突然変異を有するマウス（４０３／４０３）を、発達から心臓表現型について、ミスセンス突然変異を含有しないマウス（野生型、または「ＷＴ」）と接近した状態でモニターした。４０３／４０３マウスは、Ｐ８において心臓の拡張を示し始める（図４Ａ～４Ｃ）。４０３／＋マウスにおいて生後６ヶ月に著しい心臓線維症が観察された（図４Ｄおよび４Ｅ）。
ヒトＭＹＨ７ ｐ．Ｒ４０３Ｑ突然変異のマウスモデルにおけるＭｙｈ６．Ｒ４０３Ｑ突然変異を修正するために、マウス系統におけるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベースの修正のためのＰＡＭ ５’－ＣＧＡＧ－３’（配列番号４）を伴う配列５’－ＣＣＴ ＣＡＧ ＧＴＧ ＡＡＧ ＧＴＧ ＧＧＧ ＡＡ－３’（配列番号２）を有するｓｇＲＮＡを設計した（図５）。マウスにおけるオンターゲットおよびオフターゲット編集効率を、ＡＡＶ送達および／またはＡ塩基エディターを使用して決定する。ヒトＭＹＨ７ ｐ．Ｒ４０３Ｑ突然変異のマウスモデルへＡＡＶを介してｓｇＲＮＡを投与した後、心機能を評価し、ｓｇＲＮＡの投与前の心機能と比較して、マウスにおける表現型救済を測定する。
［実施例３：ヒトｉＰＳＣにおいてＲ４０３Ｑ突然変異を修正するＡＢＥの特定］
塩基エディターは、Ｃａｓ９ニッカーゼまたは非活性化Ｃａｓ９と、デアミナーゼタンパク質との融合タンパク質であり、これは、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）部位に関連する規定の編集ウィンドウ内で二本鎖切断を伴わない塩基対編集を可能にする。アデニン塩基エディター（ＡＢＥ）は、デオキシアデノシンデアミナーゼを使用して、ＤＮＡのＡ・Ｔ塩基対を、イノシン中間体を介してＧ・Ｃ塩基対に変換する。様々なアデニン塩基エディター（ＡＢＥ）をそれらの効率についてスクリーニングするために、健康なドナー（ＨＤＷＴ）に由来するヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）株に、ＭＹＨ７ ｃ．１２０８ Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｒ４０３Ｑ）病原性ミスセンス突然変異を、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ベースの相同組換え修復を使用して挿入した。患者において見出されるヘテロ接合性遺伝子型を反映する同質遺伝子ヘテロ接合性突然変異クローン（ＨＤ４０３／＋）、および患者において以前に示されていない同質遺伝子ホモ接合性突然変異クローン（ＨＤ４０３／４０３）を単離した。シークエンシングにより、これらのクローンの生成中に高相同性ＭＹＨ６遺伝子上に突然変異がないことを確認した（図６Ａ～６Ｂ）。
ＡＢＥは、プロトスペーサー位置１４～１７（ＰＡＭ配列の５’のすぐ隣の第１のヌクレオチドをプロトスペーサー位置１としてカウントする）において最適活性ウィンドウを有するので、プロトスペーサー位置１６にＭＹＨ７ ｃ．１２０８ Ｇ＞Ａ突然変異を入れるｓｇＲＮＡを、ＮＧＡ ＰＡＭと共に選択した（ｈ４０３＿ｓｇＲＮＡ）（図７Ａ）。任意のバイスタンダー編集を導入することなく、病原性ヌクレオチドを野生型ヌクレオチドに効率的に修正し戻すことが可能な最適ＡＢＥを特定するために、最適化されたＡＢＥｍａｘ（配列番号７）、狭小ウィンドウ型ＡＢＥ７．１０バリアント（配列番号１１）、または高プロセス性広幅ウィンドウ進化型ＡＢＥ７．１０バリアントであるＡＢＥ８ｅ（配列番号９）のいずれかを含む、様々な操作されたデアミナーゼを試験した。各デアミナーゼバリアントについてのアミノ酸および核酸配列は、上記表１および２に示される。各操作されたデアミナーゼバリアントを、ＮＲＮ ＰＡＭを標的化するＳｐＲＹ（配列番号１７）；ＮＧＮ ＰＡＭを標的化するＳｐＧ（配列番号１９）；ＮＧ ＰＡＭを標的化するＳｐＣａｓ９－ＮＧ（配列番号２１）；またはＮＧＡ ＰＡＭを標的化するＳｐＣａｓ９－ＶＲＱＲ（配列番号１５）を含む、操作されたＳｐＣａｓ９バリアントに融合した。各ＳｐＣａｓ９バリアントについてのアミノ酸および核酸配列は、上記表３および４に示される。その後、これらのＡＢＥを、ｈ４０３＿ｓｇＲＮＡ（配列番号１、図７Ｂ）での一過性のトランスフェクションによる、私たちのＨＤ４０３／４０３ ｉＰＳＣ株におけるそれらの修正効率についてスクリーニングした。病原性アデニンの同様の編集効率は、試験したすべてのＡＢＥｍａｘ－ＳｐＣａｓ９バリアントで達成され、ＡＢＥｍａｘ－ＳｐＲＹでの２６±２．３％からＡＢＥｍａｘ－ＶＲＱＲでの３４±２．５％に及び、隣接アデニンのバイスタンダー編集は最小限であった（３つのバイスタンダーにわたる平均は、２．６±１．７％であった）。ＡＢＥ８ｅ－ＳｐＣａｓ９バリアントは、より高い編集効率を達成し、ＡＢＥ８ｅ－ＳｐＲＹ（配列番号５７）での２７±２．６％からＡＢＥ８ｅ－ＳｐＧ（配列番号５９）での３７±１．５％に及び、隣接アデニンのバイスタンダー編集はわずかに増加した（３つのバイスタンダーにわたる平均は、４．０±２．０％であった）（図７Ｃ）。これらのバイスタンダー編集は、編集の組合せによってβ－ミオシン重鎖におけるＫ４０５Ｅ、Ｋ４０５ＲまたはＫ４０５Ｇ突然変異をもたらすと予測されるが、これらの突然変異の、β－ミオシン重鎖機能に対する結果は説明されていない。次の実験について、潜在的なバイスタンダー編集を低減するために、より狭小化したウィンドウのＡＢＥｍａｘを使用し、潜在的なＣａｓ依存性オフターゲット編集を低減するために、より厳格なＰＡＭ必要条件を有するＳｐＣａｓ９－ＶＲＱＲバリアントを使用した。生ずる融合タンパク質（ＡＢＥｍａｘ－ＶＲＱＲ）は、配列番号４５のアミノ酸配列を有した。以下の実施例において使用された、核局在化配列をさらに含む同じ融合タンパク質は、配列番号４６のアミノ酸配列を有する。これらの実施例において説明されるすべてのデアミナーゼ－ニッカーゼタンパク質についてのアミノ酸配列およびコード核酸は、上記表７および８に示される。
［実施例４：ＨＣＭ患者由来ｉＰＳＣにおける修正効率およびオフターゲットＤＮＡ編集解析］
ＡＢＥｍａｘ－ＶＲＱＲおよびｈ４０３＿ｓｇＲＮＡ系を疾患モデルに適用するために、ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は、ＭＹＨ７４０３／＋突然変異を有する２人のＨＣＭ患者に由来した（ＨＣＭ１４０３／＋およびＨＣＭ２４０３／＋）。ＭＹＨ７４０３／＋突然変異を、ＡＢＥｍａｘ－ＶＲＱＲ－Ｐ２ａ－ＥＧＦＰおよびｈ４０３＿ｓｇＲＮＡ（配列番号１）のプラスミドヌクレオフェクションにより修正し、ＧＦＰ＋細胞の蛍光活性化セルソーティングを行った（図８Ａ）。ハイスループットシークエンシング（ＨＴＳ）により、９８～９９％のオンターゲット編集にもかかわらず、８つの試験したオフターゲット遺伝子座候補についてのすべての５８個のアデニン塩基においてオフターゲットＤＮＡ編集は最小限しかまたは全く起こらなかったこと（０．１２％またはそれ未満）が明らかになり、このことは、バイオインフォマティクスツールであるＣＲＩＳＰＯＲを使用して特定された（図８Ｂおよび図９ならびに以下の表１６）。β－ミオシンのアミノ酸５０５（Ｋ５０５）についての３つのバイスタンダーアデニンにおいて、低頻度（０．０３～０．４８％）のバイスタンダー編集が観察された。次の特徴付けのために、バイスタンダー編集または高相同性ＭＹＨ６遺伝子の編集を含有しない、ＨＣＭ患者由来のｉＰＳＣの修正されたクローン株（ＨＣＭ１ＷＴおよびＨＣＭ２ＷＴ）を単離した。これらの結果は、ＡＢＥｍａｘ－ＶＲＱＲを伴うｈ４０３＿ｓｇＲＮＡは、最小限のバイスタンダー編集で、かつ、ほとんど乃至まったくＤＮＡオフターゲット編集を伴わずに、標的病原性ミスセンス突然変異を効率的かつ特異的に修正することができることを示唆する。
［実施例５：ＡＢＥにより修正した患者ｉＰＳＣ由来ＣＭの機能解析］
ヒト心筋細胞（ＣＭ）における塩基編集修正の機能的結果を決定するために、ＭＹＨ７４０３／＋突然変異クローン株およびＭＹＨ７ＷＴ健康クローン株の両方を、すべての３種の患者由来株（ＨＤ、ＨＣＭ１およびＨＣＭ２）について、ＣＭに分化させて、ＣＭ機能に対する遺伝子編集修正の効果を調査した（図８Ａ）。
ＣＭの特徴的な特性は、収縮力の発生である。ＨＣＭは高収縮性をもたらし、これは力発生の増加をもたらし得る。遺伝子編集修正が、私たちのＨＣＭ患者由来株において高収縮性力発生を低減し得るかどうかを調査するために、ｉＰＳＣ－ＣＭを、柔らかいポリジメチルシロキサン表面上に単一細胞密度で播種し、収縮するＣＭの高フレームレートビデオを記録し、収縮期の力ピークを計算した。ＨＤ４０３／＋ ｉＰＳＣ－ＣＭは、健康なドナーに元々由来するＨＤＷＴ ｉＰＳＣ－ＣＭと比較して、収縮期の力ピークにおける１．７倍の増加を示した。他方で、修正されたＨＣＭ１ＷＴおよびＨＣＭ２ＷＴ ＣＭは、それぞれ、それらの同質遺伝子ＨＣＭ１４０３／＋およびＨＣＭ２４０３／＋相当物と比較して、収縮期の力ピークにおける２．０倍および１．６倍の減少を示した（図８Ｃ）。
以前の研究から、ＨＣＭ突然変異がＡＴＰ消費の増加および細胞代謝の変更を引き起こすことが示されているので、細胞エネルギー機構における変化を遺伝子編集修正後の代謝流量アッセイによって評価した。基礎的酸素消費速度（ＯＣＲ）は、ＨＤＷＴ ｉＰＳＣ－ＣＭと比較して、ＨＤ４０３／＋ ｉＰＳＣ－ＣＭにおいて１．６倍増加し、ＨＤ４０３／＋ ｉＰＳＣ－ＣＭは、ＨＤＷＴ ｉＰＳＣ－ＣＭと比較して、最大ＯＣＲの２．１倍増加を有した。修正されたＨＣＭ１ＷＴおよびＨＣＭ２ＷＴ ＣＭは、同質遺伝子ＨＣＭ１４０３／＋およびＨＣＭ２４０３／＋ ＣＭと比較して、それぞれ、基礎的ＯＣＲにおける１．４倍および１．２倍低減、ならびにそれぞれ、最大ＯＣＲにおける３．７倍および２．１倍低減を示した（図８Ｄ）。これらのデータは、ヒトＨＣＭ ＣＭにおける病原性突然変異の修正が、高収縮性表現型を低減し、正常な細胞エネルギー機構を回復するのに十分であることを実証する。
［実施例６：ＨＣＭのヒト化マウスモデルの開発］
上記に説明される塩基編集の方法を、ＨＣＭのマウスモデルに適用した。β－ミオシン重鎖は、ヒト成人心臓において見出される顕性ミオシンアイソフォームである一方で、高相同性α－ミオシン重鎖は、マウス成体心臓において発現される顕性ミオシンアイソフォームであり、Ｍｙｈ６遺伝子によってコードされる。したがって、これらの発現の相違を考慮するために、以前に説明されるＨＣＭのマウスモデルは、マウスＭｙｈ６遺伝子上に、対応するヒトＭＹＨ７突然変異を有した。Ｒ４０３の周辺の３０個のアミノ酸はヒトＭＹＨ７とマウスＭｙｈ６との間で１００％同一である一方で、タンパク質のこの領域をコードするＤＮＡ配列は同一ではない（図１０）。したがって、ヒトゲノムについて開発したｓｇＲＮＡおよび編集法は、マウスモデルに直接的に適用可能ではないかもしれない。
私たちのヒト配列特異的塩基編集法を使用して前臨床研究を行うために、マウスＭｙｈ６遺伝子内にＭＹＨ７ ｃ．１２０８ Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｒ４０３Ｑ）ヒトミスセンス突然変異を含有し、ヒトゲノム特異的ＣＲＩＳＰＲ法の試験を可能にするためにその突然変異から少なくとも２２ヌクレオチド上流および下流のヒトＤＮＡ配列同一性も有する、ヒト化マウスモデルを生成した（図１１Ａ）。他のＭｙｈ６対立遺伝子は、非改変マウスゲノム配列を含有した。このヒト化マウスモデル（Ｍｙｈ６ｈ４０３／＋）は、以前に説明したＭｙｈ６ ｐ．Ｒ４０３Ｑマウスモデルの表現型を反映する。最も注目すべきことに、ホモ接合性マウス（Ｍｙｈ６ｈ４０３／ｈ４０３）は、心房の拡張、広範囲の間質性線維症を有し、生後第１週以内に死亡する（図１１Ｂ）。９ヶ月齢で、Ｍｙｈ６ｈ４０３／＋マウスは、顕著な心室肥大、筋細胞錯綜配列および線維症を伴う心筋症を発症した（図１１Ｃ）。
［実施例７：ヒトＨＣＭのマウスモデルのインビボＡＢＥ処置］
ＡＢＥｍａｘ－ＶＲＱＲおよびｈ４０３＿ｓｇＲＮＡを、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）内にパッケージングした。全長塩基エディター（約５．６ｋｂ）は、単一のＡＡＶ９のパッケージング限界（約４．７ｋｂ）を超えたので、塩基エディターを２つのＡＡＶ９（配列番号８６および９１）に分け、トランススプライシングインテインを使用して、タンパク質発現に際して細胞において全長塩基エディターを再構成させた。ＡＡＶ９は、広い組織指向性を含有するので、心筋トロポニンＴプロモーターを使用して、塩基エディターの発現をＣＭに限定した。このデュアルＡＡＶ９系について、各ＡＡＶ９は、ｈ４０３＿ｓｇＲＮＡをコードする発現カセットの単一のコピーもまた含有した（図１２Ａ）。２つのベクターは、それらの構成成分と共に、上記表９および１０に示される。
私たちのデュアルＡＡＶ９－ＡＢＥ系の効率を、生後第１週以内に死亡するＭｙｈ６ｈ４０３／ｈ４０３マウスを救済しようとすることによって確証した。注目すべきことに、ホモ接合性遺伝子型を有するヒト患者は報告されていない。Ｐ０（生後０日）のＭｙｈ６ｈ４０３／ｈ４０３の子に、食塩水、低用量（４×１０１３ｖｇ／ｋｇ）または高用量（１．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ）の各ＡＡＶ９（全部で、低について８×１０１３ｖｇ／ｋｇ、高について３×１０１４ｖｇ／ｋｇ）のいずれかを胸腔内注射し、それらの発達をモニターした（図１３Ａ）。３×１０１４ｖｇ／ｋｇの高用量は、臨床試験において投与される最も高い用量である。Ｍｙｈ６ｈ４０３／＋およびＭｙｈ６ＷＴマウスは、離乳後も生存し、成体に成長した。食塩水を注射したマウスの生存中央値は、７．０日であり、一方で、低用量ＡＢＥにより処置されたマウスの生存中央値は、９．０日に増加した（１．３倍長い、マンテル・コックス検定によるＰ＜０．０５）。高用量ＡＢＥにより処置されたマウスの生存中央値は、１５．０日に増加した（２．１倍長い、マンテル・コックス検定によるＰ＜０．０１）（図１３Ｂ）。高用量マウスの心臓のｃＤＮＡのサンガーシークエンシングは、転写産物レベルでの病原性突然変異型ヌクレオチドの３５％修正を示し、私たちのデュアルＡＡＶ９－ＡＢＥ系が心臓における編集を可能にしたことを示唆した（図１３Ａ～１３Ｄ）。
ＭＹＨ７ ｐ．Ｒ４０３Ｑ突然変異は、ヒト患者においてヘテロ接合型でのみ存在するので、ＡＡＶ９－ＡＢＥ系を、Ｍｙｈ６ｈ４０３／＋マウスにおいてＨＣＭ疾患の開始を予防するように配置した。Ｍｙｈ６ｈ４０３／＋Ｐ０の子に、食塩水または１×１０１４ｖｇ／ｋｇの各ＡＡＶ９（全部で２×１０１４ｖｇ／ｋｇ）のいずれかを胸腔内注射し、それらの同腹子Ｍｙｈ６ＷＴ対照の子に食塩水を注射した（図１２Ｂ）。５週齢で、マウスを、筋節突然変異のマウスモデルにおいてＨＣＭの開始を加速することが以前に示されている０．１％シクロスポリンＡの固形飼料に変えた。疾患進行をモニターするために８、１２および１６週齢において連続心エコーを行った。Ｍｙｈ６ｈ４０３／＋マウスは、Ｍｙｈ６ＷＴ対照と比較してＨＣＭの特性の増加を有し、これは、拡張期における左心室前壁の厚さ（ＬＶＡＷ；ｄ）の増加（１．０７±０．０４４３ｍｍ対０．８８３±０．０４４１ｍｍ、Ｐ＝０．０１７）および左心室後壁の厚さ（ＬＶＰＷ；ｄ）の増加（１．０４±０．０８０９ｍｍ対０．８６７±０．０５９０ｍｍ、Ｐ＝０．１２８）を含んだ。また、これらのマウスは、拡張期における左心室内径（ＬＶＩＤ；ｄ）の減少（２．３４±０．１４２ｍｍ対２．８１±０．０５４０ｍｍ、Ｐ＝０．０１５）および収縮期における（ＬＶＩＤ；ｓ）減少（０．９４０±０．０７１３ｍｍ対１．２４±０．０５２０、Ｐ＝０．０１０）を有し、心駆出率（ＥＦ）および短縮率（ＦＳ）のわずかな増加を伴った。Ｍｙｈ６ｈ４０３／＋マウスの心室壁の厚さの増加、および同時発生する心室直径の減少は、ヒト患者における臨床進行と一致する。
対照的に、ＡＢＥにより処置されたＭｙｈ６ｈ４０３／＋マウスは、Ｍｙｈ６ＷＴ対照マウスに匹敵する心エコー測定を有し、病原性ヌクレオチドの遺伝子修正は、ＨＣＭの開始を予防するのに十分であることを示唆した（図１２Ｃ～１２Ｈ、表１、図１５Ａ）。また、組織学的分析は、Ｍｙｈ６ＷＴ対照マウスと比較したＭｙｈ６ｈ４０３／＋マウスにおける心臓壁の厚さの増加および心室直径の減少を明らかにし、一方で、ＡＢＥにより処置されたＭｙｈ６ｈ４０３／＋マウスは、Ｍｙｈ６ＷＴ対照マウスと同様の心臓寸法を有した（図１２Ｉ～１２Ｋ）。脛骨の長さについて正規化すると、Ｍｙｈ６ｈ４０３／＋マウスは、Ｍｙｈ６ＷＴ対照マウスと比較して、心臓重量として１．３倍大きい心臓を有し、一方で、ＡＢＥにより処置されたＭｙｈ６ｈ４０３／＋マウスは、Ｍｙｈ６ＷＴマウスと比較して、心臓重量として顕著な差を有しなかった（図１２Ｌ）。線維症の測定として、Ｍｙｈ６ｈ４０３／＋マウスの心臓は、Ｍｙｈ６ＷＴ対照マウスと比較して、３．０倍多いコラーゲン面積を有し、一方で、ＡＢＥにより処置されたＭｙｈ６ｈ４０３／＋マウスは、Ｍｙｈ６ＷＴマウスと比較して、コラーゲン面積の顕著な差を有しなかった（図１２Ｍ）。これらのデータは、デュアルＡＡＶ９ ＡＢＥ処置が、心臓のＨＣＭにより媒介される病理学的リモデリングの開始を予防するのに十分であったことを示唆する。
［実施例８：ＡＢＥにより処置されたマウスのゲノムおよびトランスクリプトーム解析］
塩基編集後のゲノムおよびトランスクリプトーム変化を特定するために、食塩水により処置されたＭｙｈ６ＷＴ対照マウス、食塩水により処置されたＭｙｈ６ｈ４０３／＋マウス、およびＡＢＥにより処置されたＭｙｈ６ｈ４０３／＋マウスから、ＣＭ核を単離した（図１４Ａ）。デュアルＡＡＶ９ ＡＢＥ処置後のオンターゲット編集効率を、最初に評価した。ＡＢＥにより処置されたＭｙｈ６ｈ４０３／＋マウスにおいて、標的病原性アデニンのＤＮＡ編集効率は、３２．３±２．８７％であり、Ｍｙｈ６ｈ４０３／＋マウスと比較して、突然変異型転写産物の３３．１±９．０８％低減をもたらし（図１４Ｂ～Ｃ）、これは、突然変異型転写産物の塩基編集またはＲＮＡｉベースのノックダウンを使用する他のインビボ研究に匹敵する。さらに、ＡＢＥにより処置されたＭｙｈ６ｈ４０３／＋マウスにおける検出可能なバイスタンダー編集はなかった（図１４Ｄ）。その後、ＡＢＥｍａｘはデアミナーゼ活性を含有するので、トランスクリプトーム－ワイドＲＮＡシークエンシング（ＲＮＡ－ｓｅｑ）を使用して潜在的なオフターゲットＲＮＡ編集を評価した。ＲＮＡ－ｓｅｑ解析は、食塩水により処置されたマウスのトランスクリプトームにおけるＡ－ｔｏ－Ｉ編集の平均頻度と比較して、ＡＢＥにより処置されたマウスのトランスクリプトームにおけるＡ－ｔｏ－Ｉ編集の平均頻度において顕著な変化がないことを明らかにした（図１４Ｅ）。この発見は、私たちのデュアルＡＡＶ９－ＡＢＥ系によるインビボ処置は、ＲＮＡ脱アミノ化を、内因性細胞デアミナーゼ活性のバックグラウンドレベルを超えるほど増加しないことを示唆する。
ＲＮＡ－ｓｅｑにより、ＡＢＥにより処置されたＭｙｈ６ｈ４０３／＋マウスにおいてトランスクリプトームワイド変化を評価した。２５７個の差次的に調節される遺伝子を、Ｍｙｈ６ＷＴマウスとＭｙｈ６ｈ４０３／＋マウスとの間で特定した。ヒートマップは、ＡＢＥにより処置されたＭｙｈ６ｈ４０３／＋マウスは、Ｍｙｈ６ｈ４０３／＋マウスよりもＭｙｈ６ＷＴマウスと同様のトランスクリプトームプロファイルを有することを示した（図１４Ｆ、図１５Ｂ～１５Ｄ）。Ｍｙｈ６ｈ４０３／＋マウスとＭｙｈ６ＷＴマウスとの間で差次的に調節される遺伝子の遺伝子オントロジー解析は、細胞間シグナル伝達および血管新生の調節不全を示し、一方で、細胞間シグナル伝達は、Ｍｙｈ６ｈ４０３／＋マウスとＡＢＥにより処置されたＭｙｈ６ｈ４０３／＋マウスとの間で調節不全があった（以下の表１７）。加えて、原型の肥大症マーカーＮｐｐａの発現は、Ｍｙｈ６ＷＴマウスと比較して、Ｍｙｈ６ｈ４０３／＋マウスにおいて２．８倍高く、一方で、ＡＢＥにより処置されたＭｙｈ６ｈ４０３／＋マウスにおけるＮｐｐａの発現は、ＭｙｈＷＴマウスと有意な差はなかった（図１４Ｇ）。合わせると、これらのデータは、デュアルＡＡＶ９－ＡＢＥ系が、ゲノムＤＮＡにおいて病原性突然変異型ヌクレオチドを効率的に修正し、トランスクリプトーム調節不全を予防することができることを示唆する。
［実施例９：材料および方法］
研究設計および承認。本研究の目的は、ＨＣＭを引き起こす病原性突然変異の塩基編集修正は、ヒトＣＭおよびヒト化マウスモデルにおいてＨＣＭ病理学的特性の開始を予防し得るかどうかを決定することであった。ヒトＣＭにおいて、これは、ＨＣＭ患者由来のｉＰＳＣの塩基編集修正、および特徴的ＣＭ機能の変化を測定することによって行われた。ヒト化マウスモデルにおいて、デュアルＡＡＶ９系を使用して、塩基編集成分をＣＭへ送達し、心機能における変化、寸法およびトランスクリプトミクスを測定した。すべての実験について、複製物の数、複製物の種類、および使用される統計検定は、図の凡例において報告される。インビトロＣＭ実験について、３つの別々の分化からデータを収集し、外れ値または他のデータ点を除外しなかった。インビボ実験について、遺伝子型に基づいて、雄マウスを処置に割り当てた。心エコー測定を盲検様式において行った。平均値から２超の標準偏差の体重低減を有する発育不良のマウスは除外した。エンドポイントは、心エコー測定における変化によってガイドした。この原稿において説明される動物実験は、ＵＴ米国南西部実験動物委員会（ＵＴ Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）の監督下において承認および実施された。
プラスミドおよびベクター構築。ｐＳｐＣａｓ９（ＢＢ）－２Ａ－ＧＦＰ（ＰＸ４５８）プラスミドは、Ｆｅｎｇ Ｚｈａｎｇから寄贈され（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド４８１３８番）、以下の塩基エディターおよびＳｐＣａｓ９ニッカーゼにおいてクローニングするための基本のスキャフォールドとして使用した。ＡＢＥ８ｅは、Ｄａｖｉｄ Ｌｉｕから寄贈され（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド１３８４８９番）；ＶＲＱＲ－ＡＢＥｍａｘは、Ｄａｖｉｄ Ｌｉｕから寄贈され（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド１１９８１１番）；ＮＧ－ＡＢＥｍａｘは、Ｄａｖｉｄ Ｌｉｕから寄贈され（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド１２４１６３番）；ｐＣＭＶ－Ｔ７－ＳｐＧ－ＨＦ１－Ｐ２Ａ－ＥＧＦＰ（ＲＴＷ５０００）は、Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒから寄贈され（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド１３９９９６番）；ｐＣＭＶ－Ｔ７－ＳｐＲＹ－ＨＦ１－Ｐ２Ａ－ＥＧＦＰ（ＲＴＷ５００８）は、Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒから寄贈された（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド１３９９９７番）。Ｎ末端ＡＢＥ構築物およびＣ末端ＡＢＥ構築物は、Ｃｂｈ＿ｖ５ ＡＡＶ－ＡＢＥ Ｎ末端（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド１３７１７７番）およびＣｂｈ＿ｖ５ ＡＡＶ－ＡＢＥ Ｃ末端（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド１３７１７８番）から適合され、Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅによって合成された。選択したプラスミドのＰＣＲ増幅は、ＰｒｉｍｅＳｔａｒ ＧＸＬポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ）を使用して行い、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（ＮＥＢ）を使用して、制限酵素消化デスティネーションベクターにクローニングした。
患者由来ｉＰＳＣおよび同質遺伝子突然変異株の生成。ＭＹＨ７ ｃ．１２０８ Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｒ４０３Ｑ）突然変異を有する２人の患者からの末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、センダイウイルスを使用してｉＰＳＣにリプログラミングした（ＨＣＭ１およびＨＣＭ１）。ＨＣＭ１株は、ＨＣＭの広範な家族歴、ならびに左心室駆出率の低減歴および低い最大酸素摂取量（ＶＯ２ ｍａｘ）を伴う非閉塞性ＨＣＭを有する５６歳の女性に由来した。完全心ブロックのために両室ペースメーカーが設置された。ＨＣＭ２株は、ＨＣＭ歴、植込み型心臓除細動器、およびＨＣＭの強い家族歴を有する３２歳の男性に由来した。彼は、左心室の拡張を有するが、ＶＯ２ ｍａｘ、代謝当量（ＭＥＴ）の改善を有し、心肺運動負荷試験による心房細動の証拠を有しなかった。ＵＴ Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ Ｗｅｌｌｓｔｏｎｅ Ｍｙｏｅｄｉｔｉｎｇ Ｃｏｒｅにおいて、健康な男性ドナー（ＨＤ）由来のＰＢＭＣを、センダイウイルス（ＣｙｔｏＴｕｎｅ ２．０センダイリプログラミングキット、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してｉＰＳＣにリプログラミングした。相同組換え修復によりＭＹＨ７ ｃ．１２０８ Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｒ４０３Ｑ）突然変異を含有する同質遺伝子ｉＰＳＣを生成するために、Ｐ３ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃｅｌｌ ４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｘキット（Ｌｏｎｚａ）を使用して、ＨＤ ｉＰＳＣに、突然変異をコードする一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）鋳型（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＩＤＴ）、ならびにＳｐＣａｓ９－Ｐ２ａ－ＥＧＦＰおよびＭＹＨ７を標的化するｓｇＲＮＡをコードするＰＸ４５８プラスミドをヌクレオフェクトした。ＨＣＭ１およびＨＣＭ２患者由来株の塩基編集修正のために、ｉＰＳＣに、ＡＢＥｍａｘ－ＶＲＱＲ－Ｐ２ａ－ＥＧＦＰおよびｈ４０３＿ｓｇＲＮＡをコードするプラスミドをヌクレオフェクトした。４８時間後、ＧＦＰ＋ｉＰＳＣを、蛍光活性化セルソーティングによって収集し、クローン増殖し、サンガーシークエンシングによって遺伝子型を決定した（使用したプライマーについて表１８を参照されたい）。
ｉＰＳＣ維持および分化。ｉＰＳＣ培養および分化を、以前に説明されるように行った（Ｆ．Ｃｈｅｍｅｌｌｏ，Ａ．Ｃ．Ｃｈａｉ，Ｈ．Ｌｉ，Ｃ．Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ－Ｃａｙｃｅｄｏ，Ｅ．Ｓａｎｃｈｅｚ－Ｏｒｔｉｚ，Ａ．Ａｔｍａｎｌｉ，Ａ．Ａ．Ｍｉｒｅａｕｌｔ，Ｎ．Ｌｉｕ，Ｒ．Ｂａｓｓｅｌ－Ｄｕｂｙ，Ｅ．Ｎ．Ｏｌｓｏｎ，Ｐｒｅｃｉｓｅ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｅｘｏｎ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｂｙ ｂａｓｅ ａｎｄ ｐｒｉｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ．Ｓｃｉ Ａｄｖ７，（２０２１））。簡潔に説明すると、ｉＰＳＣを、マトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ）によりコーティングした組織培養ポリスチレンプレート上で培養し、ｍＴｅＳＲ１培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬ）中において維持し、Ｖｅｒｓｅｎｅを使用して７０～８０％コンフルエンシーにて継代した。ｉＰＳＣを、インスリンを伴わないアスコルビン酸（５０μｇ／ｍＬ）およびＢ２７を補充したＲＰＭＩ（ＲＰＭＩ／Ｂ２７－）中でのＣＨＩＲ９９０２１（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）による２４時間の処理によって７０～８０％コンフルエンシーにてＣＭに分化させた（０日（ｄ）～ｄ１）。ｄ１において、培地をＲＰＭＩ／Ｂ２７－で置換した。ｄ３において、細胞を、ＷＮＴ－Ｃ５９（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）を補充したＲＰＭＩ／Ｂ２７－で処理した。ｄ５において、培地をＲＰＭＩ／Ｂ２７－に交換した。ｄ７からそれ以降、ｉＰＳＣ－ＣＭを、アスコルビン酸（５０μｇ／ｍＬ）およびＢ２７を補充したＲＰＭＩ（ＲＰＭＩ／Ｂ２７）中で維持し、３～４日毎に培地を交換した。５ｍＭ ＤＬ－乳酸ナトリウムおよびＣＤＭ３補助剤（５００μｇ／ｍＬイネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）由来組換えヒトアルブミン、Ａ０２３７、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ；および２１３μｇ／ｍＬ Ｌ－アスコルビン酸２－リン酸塩、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充したグルコース不含ＲＰＭＩ中において細胞を培養することによるＣＭの代謝選択を、ｄ１０に開始して６日間行った。それらの成熟を誘導するために、ｉＰＳＣ－ＣＭを、Ｂ２７、５０μｍｏｌパルミチン酸、１００μｍｏｌオレイン酸、１０ｍｍｏｌガラクトース、および１ｍｍｏｌグルタミン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充したグルコース不含ＲＰＭＩ中において維持した。すべてのＣＭ機能研究をｄ４０～５０において行った。
プラスミドトランスフェクションおよび編集効率解析。ｉＰＳＣを、トランスフェクションの２４時間前に４８ウェルプレート上に播種した。約２０％コンフルエンシーにおいて、１ウェル当たり１μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ Ｓｔｅｍトランスフェクション試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して、細胞に、塩基エディターおよびｈ４０３＿ｓｇＲＮＡをコードする０．５μｇのプラスミドを一過的にトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞を、Ｄｉｒｅｃｔ ＰＣＲ溶解試薬（Ｃｅｌｌ）（Ｖｉａｇｅｎ）中で溶解した。標的部位のＰＣＲ増幅をＰｒｉｍｅＳｔａｒ ＧＸＬポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ）を使用して行い、ＰＣＲクリーンアップを、ＥｘｏＳａｐ－ＩＴ Ｅｘｐｒｅｓｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して行い、その後サンガーシークエンシングを行った。ＥｄｉｔＲを使用してクロマトグラムを解析し、塩基編集効率を決定した。
ｉＰＳＣ－ＣＭの収縮性解析。ｉＰＳＣ－ＣＭを、以前に確立されたプロトコール（Ａ．Ａｔｍａｎｌｉ，Ａ．Ｃ．Ｃｈａｉ，Ｍ．Ｃｕｉ，Ｚ．Ｗａｎｇ，Ｔ．Ｎｉｓｈｉｙａｍａ，Ｒ．Ｂａｓｓｅｌ－Ｄｕｂｙ，Ｅ．Ｎ．Ｏｌｓｏｎ，Ｃａｒｄｉａｃ Ｍｙｏｅｄｉｔｉｎｇ Ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ Ｃａｒｄｉａｃ Ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ ａｎｄ Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ Ｍｕｓｃｕｌａｒ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ１２９，６０２－６１６（２０２１））に従って調製されたフレキシブルポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）５２７基材（ヤング率＝５ｋＰａ）上に単一細胞密度で播種した。収縮するｉＰＳＣ－ＣＭの記録を、３７℃においてＮｉｃｏｎ Ａ１Ｒ＋共焦点システムを使用して、共鳴スキャニングモードにて１秒当たり５９フレームで取得した。ｉＰＳＣ－ＣＭの収縮力発生を、以前に確立された方法を使用して定量した。簡潔に説明すると、Ｆｉｊｉを使用して記録を解析して、最大および最小細胞長、ならびに収縮中の細胞幅を測定した。以前に公開されたカスタマイズしたＭａｔｌａｂコードを使用して、収縮期の力ピークを計算した（Ｊ．Ｄ．Ｋｉｊｌｓｔｒａ，Ｄ．Ｈｕ， Ｎ．Ｍｉｔｔａｌ，Ｅ．Ｋａｕｓｅｌ，Ｐ．ｖａｎ ｄｅｒ Ｍｅｅｒ，Ａ．Ｇａｒａｋａｎｉ，Ｉ．Ｊ．Ｄｏｍｉａｎ，Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｅ Ｋｉｎｅｔｉｃｓ，Ｆｏｒｃｅ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ Ｓｉｎｇｌｅ Ｈｕｍａｎ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ５，１２２６－１２３８（２０１５））。
ｉＰＳＣ－ＣＭの細胞外流解析。ｉＰＳＣ－ＣＭを、マトリゲルでコーティングしたＳｅａｈｏｒｓｅ ＸＦｅ９６ Ｖ３ ＰＳ細胞培養マイクロプレート（Ａｇｉｌｅｎｔ）中に１ウェル当たり４０，０００個の細胞で播種した。播種の１週間後、細胞を、事前に温めたアッセイ培地（２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウムおよび１０ｍＭグルコースを含み、ピルビン酸塩を含まないＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ Ｄ５０３０）、ｐＨ７．４）で３回洗浄し、非ＣＯ２インキュベーター中において３７℃にて６０分間インキュベートした。Ｓｅａｈｏｒｓｅ ＸＦｅ９６器具において、２分間の測定、１０秒間の待機、および３分間の混合の連続周期を使用して、酸素消費速度（ＯＣＲ）を測定した。オリゴマイシン（最終濃度２μＭ）、ＣＣＣＰ（最終濃度１μＭ）およびアンチマイシンＡ（最終濃度１μＭ）を、示される時間間隔で注射することによって、ミトコンドリアストレステストを行った。データを、ＷＡＶＥソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して解析した。
免疫蛍光染色。ｉＰＳＣ－ＣＭを、ガラス表面上に播種し、４％パラホルムアルデヒドにより１０分間固定し、続いて５％ヤギ血清／０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）により１時間ブロッキングした。一次および二次抗体を、ブロッキング緩衝液中に希釈し、細胞に添加して、それぞれ、２時間および１時間置いた。ＤＡＰＩを使用して核を対比染色した。使用した抗体は、筋節α－アクチニン（クローンＥＡ－５３、Ａ７８１１、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、１：６００希釈）、およびヤギ抗マウスＩｇＧ１ Ａｌｅｘａ ４８８（Ａ２１１２１、Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ、１：６００希釈）を含んだ。
オフターゲット解析。オフターゲット部位候補をＣＲＩＳＰＯＲにより特定し、ＰＣＲ産物を得ることに成功した、切断頻度決定（ＣＦＤ）スコアによる上位８部位を選択した。ＡＢＥｍａｘ－ＶＲＱＲ－Ｐ２ａ－ＥＧＦＰおよびｈ４０３＿ｓｇＲＮＡをコードするプラスミドをヌクレオフェクトしたＨＣＭ１、ＨＣＭ２およびＨＤ細胞株から、ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、ゲノムＤＮＡを単離し、ＧＦＰ＋細胞についてソーティングした。ＰｒｉｍｅＳｔａｒ ＧＸＬポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ）を使用して標的部位をＰＣＲ増幅し、第２ラウンドのＰＣＲを使用して、Ｉｌｌｕｍｉｎａフローセル結合配列およびバーコードを付加した。ＰＣＲ産物を、ＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）により精製し、２２００ ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ）で完全性について解析し、ＱｕＢｉｔ ｄｓＤＮＡ高感度アッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって定量し、その後プールし、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ上にロードした。多重分離後、得られるリードを、編集頻度についてＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏ２により解析した（Ｋ．Ｃｌｅｍｅｎｔ，Ｈ．Ｒｅｅｓ，Ｍ．Ｃ．Ｃａｎｖｅｒ，Ｊ．Ｍ．Ｇｅｈｒｋｅ，Ｒ．Ｆａｒｏｕｎｉ，Ｊ．Ｙ．Ｈｓｕ，Ｍ．Ａ．Ｃｏｌｅ， Ｄ．Ｒ．Ｌｉｕ，Ｊ．Ｋ．Ｊｏｕｎｇ，Ｄ．Ｅ．Ｂａｕｅｒ，Ｌ．Ｐｉｎｅｌｌｏ，ＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏ２ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ａｃｃｕｒａｔｅ ａｎｄ ｒａｐｉｄ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ３７，２２４－２２６（２０１９））。
アデノ随伴ウイルスの生成。組換えＡＡＶ９（ｒＡＡＶ９）ウイルスを、ミシガン大学Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｒｅにおいてイオジキサノール勾配を通した超遠心分離を使用して作成した。ｒＡＡＶ９を、Ａｍｉｃｏｎ超遠心分離フィルターユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用してＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳ＋０．００１％プルロニックＦ６８中に再懸濁した。ｑＰＣＲによってタイターを評価した。ｒＡＡＶ９を２５μＬ一定分量において－８０℃にて保存した。
マウス。マウスを障壁のある施設において、１２時間：１２時間の明暗周期にて飼い、標準の固形飼料（２９１６ Ｔｅｋｌａｄ Ｇｌｏｂａｌ）で維持した。改変したプロトコール（Ｈ．Ｍｉｕｒａ，Ｒ．Ｍ．Ｑｕａｄｒｏｓ，Ｃ．Ｂ．Ｇｕｒｕｍｕｒｔｈｙ，Ｍ．Ｏｈｔｓｕｋａ，Ｅａｓｉ－ＣＲＩＳＰＲ ｆｏｒ ｃｒｅａｔｉｎｇ ｋｎｏｃｋ－ｉｎ ａｎｄ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌｓ ｕｓｉｎｇ ｌｏｎｇ ｓｓＤＮＡ ｄｏｎｏｒｓ． Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ１３，１９５－２１５（２０１８））に従って、接合子に、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ（５０ｎｇ／μＬ）（ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ｓｇＲＮＡ（２０ｎｇ／μＬ）（ＩＤＴ）およびｓｓＯＤＮドナー鋳型（１５ｎｇ／μＬ）（ＩＤＴ）をマイクロインジェクションすることによって、ヒト化Ｍｙｈ６ｈ４０３／＋突然変異を導入した。遺伝子型決定を、カスタムＴａｑＭａｎ ＳＮＰ遺伝子型決定アッセイ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して行った。ＨＣＭの開始を加速させるために、シクロスポリンＡ（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ）を１ｇ／ｋｇおよび青色食物染料を０．２ｇ／ｋｇ含有するカスタム固形飼料（２９１６ Ｔｅｋｌａｄ Ｇｌｏｂａｌ ｂａｓｅ）でマウスを処置した。注射のために、マウスをＰ０において遺伝子型決定し、食塩水またはＡＡＶ９用量のいずれかを単一の４０μＬボーラスにより、３１Ｇインスリンシリンジを使用して、心臓および肺を避け、横隔膜を通して、下縦隔への剣状突起下による手法により与えた。
経胸壁心エコー。ＶｉｓｕａｌＳｏｎｉｃｓ Ｖｅｖｏ２１００画像化システムを使用する二次元経胸壁心エコーによって、意識下のマウスの心機能を評価した。Ｍ－モードトレーシングを使用して、拡張期におけるＬＶ前壁の厚さ（ＬＶＡＷ；ｄ）、拡張期におけるＬＶ後壁の厚さ（ＬＶＰＷ；ｄ）、ならびに拡張終期および収縮終期におけるＬＶ内部直径（ＬＶＩＤｄおよびＬＶＩＤｓ）を測定した。以下の式に従って、ＦＳを計算した。ＦＳ（％）＝［（ＬＶＩＤｄ－ＬＶＩＤｓ）／ＬＶＩＤｄ］×１００。以下の式に従って、ＥＦを計算した。ＥＦ（％）＝［（ＬＶＥＤＶ－ＬＶＥＳＶ）／ＬＶＥＤＶ］×１００。すべての測定は、熟練した技師が研究について盲検様式にて行った。
組織学。マウス心臓を切除し、心臓麻痺性０．２Ｍ ＫＣｌを含むＰＢＳ中に５分間浸し、その後ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒド中において一晩固定し、続いて７０％エタノール中にて脱水し、パラフィン包埋した。５００μｍ間隔で連続横断面を切り出し、スライドに載せ、続いてＨ＆Ｅ染色またはマッソン・トリクローム染色を行った。画像をＢＺ－Ｘ ａｌｌ－ｉｎ－ｏｎｅ顕微鏡（Ｋｅｙｅｎｃｅ）において１０倍または４０倍の倍率で取得した。
ＣＭ核単離。各核試料のために、心室組織を単離した。ＣＭ核を、以前に説明される通りに（Ｍ．Ｃｕｉ，Ｅ．Ｎ．Ｏｌｓｏｎ，Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｆｏｒ Ｓｉｎｇｌｅ－Ｎｕｃｌｅｕｓ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃｓ ｏｆ Ｄｉｐｌｏｉｄ ａｎｄ Ｔｅｔｒａｐｌｏｉｄ Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ ｉｎ Ｍｕｒｉｎｅ Ｈｅａｒｔｓ． ＳＴＡＲ Ｐｒｏｔｏｃ１，１０００４９（２０２０））単離した。単離した核を即座に下流の加工に使用するか、またはＮｕｃｌｅｉ ＰＵＲＥ保存緩衝液（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）中において－８０℃にて保存した。ＲＮＡ－ｓｅｑおよびｑＰＣＲのために、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｃｒｏキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して核からＲＮＡを単離した。ＤＮＡシークエンシングのために、核を、Ｄｉｒｅｃｔ ＰＣＲ溶解試薬（Ｃｅｌｌ）（Ｖｉａｇｅｎ）中に溶解した。
ＲＮＡ－ｓｅｑライブラリー調製、シークエンシングおよび解析。ＲＮＡ－ｓｅｑライブラリーを、ＳＭＡＲＴｅｒ Ｓｔｒａｎｄｅｄ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ－Ｓｅｑ Ｋｉｔ ｖ２－Ｐｉｃｏ Ｉｎｐｕｔ Ｍａｍｍａｌｉａｎキット（Ｔａｋａｒａ）を使用して、Ｉｌｌｕｍｉｎａシークエンシングアダプターを含有して生成した。ライブラリーを２２００ ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ）において可視化し、ＱｕＢｉｔ ｄｓＤＮＡ高感度アッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって定量し、その後プールし、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑ ５００上にロードした。ＦａｓｔＱＣツール（バージョン０．１１．８）を、ＲＮＡ－ｓｅｑデータの品質管理のために使用し、トリミングのために低品質またはリードのアダプター部分を決定した。Ｔｒｉｍｍｏｍａｔｉｃ（バージョン０．３９）を使用してリードトリミングを行い、ＲＳｅＱＣ（バージョン４．０．０）を使用してストランドネス（ｓｔｒａｎｄｎｅｓｓ）を決定し、その後、リードを、ＨｉＳＡＴ２（バージョン２．１．０）を使用してデフォルト設定および－ｒｎａ－ｓｔｒａｎｄｎｅｓｓ Ｒにてｍｍ１０参照ゲノムに対して整列させた。整列させたリードを、ｆｅａｔｕｒｅＣｏｕｎｔｓ（バージョン１．６．２）を使用してカウントした。Ｒ ｐａｃｋａｇｅ ＤＥＳｅｑ（バージョン１．３８．０）を使用して差次的遺伝子発現解析を行った。２超の倍数変化および０．０１未満のｐ値を有する遺伝子を、試料群比較間のＤＥＧとして設計した。トランスクリプトームワイドシークエンシング解析において配列決定されたアデノシンにおけるＡ－ｔｏ－Ｉ編集の平均百分率を計算するために、私たちは以前の方策を採用した（Ｌ．Ｗ．Ｋｏｂｌａｎ，Ｍ．Ｒ．Ｅｒｄｏｓ，Ｃ．Ｗｉｌｓｏｎ，Ｗ．Ａ．Ｃａｂｒａｌ，Ｊ．Ｍ．Ｌｅｖｙ，Ｚ．Ｍ．Ｘｉｏｎｇ，Ｕ．Ｌ．Ｔａｖａｒｅｚ，Ｌ．Ｍ．Ｄａｖｉｓｏｎ，Ｙ．Ｇ．Ｇｅｔｅ，Ｘ．Ｍａｏ，Ｇ．Ａ．Ｎｅｗｂｙ，Ｓ．Ｐ．Ｄｏｈｅｒｔｙ，Ｎ．Ｎａｒｉｓｕ，Ｑ．Ｓｈｅｎｇ，Ｃ．Ｋｒｉｌｏｗ，Ｃ．Ｙ．Ｌｉｎ，Ｌ．Ｂ．Ｇｏｒｄｏｎ，Ｋ．Ｃａｏ，Ｆ．Ｓ．Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｊ．Ｄ．Ｂｒｏｗｎ，Ｄ．Ｒ．Ｌｉｕ，Ｉｎ ｖｉｖｏ ｂａｓｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｒｅｓｃｕｅｓ Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ－Ｇｉｌｆｏｒｄ ｐｒｏｇｅｒｉａ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｉｎ ｍｉｃｅ．Ｎａｔｕｒｅ ５８９，６０８－６１４（２０２１））。簡潔に説明すると、ＲＥＤＩｔｏｏｌｓ２を使用して、各試料中の編集百分率を定量した。アデノシン以外のヌクレオチドを除去し、１０未満のリード範囲または２５未満のリード品質スコアを有する残りのアデノシンもまたフィルターにかけて、低い試料採取品質または低い配列決定品質のための誤差を避けた。その後、私たちは、各試料中のＡ－ｔｏ－Ｉ変換数を計算し、これを、フィルタリング後の私たちのデータセット中のアデノシンの総数で割って、トランスクリプトーム中のＡ－ｔｏ－Ｉ編集の百分率を得た。
定量的リアルタイムＰＣＲ解析。定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）反応を、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＴａｑＭａｎ Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してアセンブルした。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ５リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してアッセイを行った。発現値を１８Ｓ ｍＲＮＡについて正規化し、倍数変化として表した。
統計。すべてのデータを、示される通り、平均値±ｓ．ｅ．ｍ．または平均値±ｓ．ｄ．として表す。図において示される通り、各２群間の比較のために、対応のない両側スチューデントｔ検定を行った。カプラン・マイヤー解析およびログ・ランク（マンテル・コックス）検定を使用して、異なる遺伝子型間の生存における差を評価した。データ解析は、統計ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）により行った。０．０５未満のＰ値は統計的に有意とみなした。
上記の方法において使用されるオリゴ／プライマーおよび他の核酸は、以下の表１８に示される。

Claims (44)

  1. 配列番号１または２のＤＮＡヌクレオチド配列に対応するスペーサー配列を含むｇＲＮＡ。
  2. 配列番号５または６と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有するスペーサー配列を含む、請求項１に記載のｇＲＮＡ。
  3. 配列番号５または６を含む、またはからなるスペーサー配列を含む、請求項１または２に記載のｇＲＮＡ。
  4. Ｃａｓ９ニッカーゼまたは非活性化Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼに共有結合されたデアミナーゼを含む融合タンパク質。
  5. 前記デアミナーゼが、ＡＢＥｍａｘ、ＡＢＥ８ｅ、ＡＢＥ７．１０およびそれらの任意の機能的バリアントからなる群から選択される、請求項４に記載の融合タンパク質。
  6. 前記デアミナーゼが、配列番号７、９および１１のいずれかと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の融合タンパク質。
  7. 前記デアミナーゼが、配列番号７、９および１１を含むアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の融合タンパク質。
  8. 前記デアミナーゼが、配列番号７を含むアミノ酸配列を含む、請求項７に記載の融合タンパク質。
  9. 前記Ｃａｓ９ニッカーゼまたは非活性化Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼが、ＳｐＲＹ、ＳｐＧ、ＳｐＣａｓ９－ＮＧ、ＳｐＣａｓ９－ＶＲＱＲまたはそれらのバリアントから選択される、請求項４～８のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  10. 前記Ｃａｓ９ニッカーゼまたは非活性化Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼが、配列番号１５、１７、１９および２１のいずれか１つと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む、請求項９に記載の融合タンパク質。
  11. 前記Ｃａｓ９ニッカーゼまたは非活性化Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼが、配列番号１５、１７、１９および２１のいずれか１つを含むアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の融合タンパク質。
  12. 前記Ｃａｓ９ニッカーゼまたは非活性化Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼが、配列番号１５を含むアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載の融合タンパク質。
  13. 前記デアミナーゼが、ペプチドリンカーを介して前記Ｃａｓ９ニッカーゼまたは非活性化Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼに共有結合される、請求項４～１２のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  14. 前記ペプチドリンカーが、配列番号２７を含むアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載の融合タンパク質。
  15. 前記デアミナーゼおよび／または前記Ｃａｓ９ニッカーゼもしくは非活性化Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼが、核局在化シグナル（ＮＬＳ）ペプチドをさらに含む、請求項４～１４のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  16. 前記核局在化シグナル（ＮＬＳ）ペプチドが、配列番号３１～４２のいずれか１つから選択される、請求項１５に記載の融合タンパク質。
  17. 核局在化シグナル（ＮＬＳ）ペプチドが、配列番号３１または配列番号３２を含む、請求項１４．２に記載の融合タンパク質。
  18. 配列番号４５～６０のいずれか１つと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む、請求項４～１８のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  19. 前記アミノ酸配列が、配列番号４５～６０のいずれか１つを含む、またはからなる、請求項１８に記載の融合タンパク質。
  20. 前記アミノ酸配列が、配列番号４５または４６を含む、またはからなる、請求項１９に記載の融合タンパク質。
  21. 請求項１から３のいずれか１項に記載のｇＲＮＡをコードする単離された核酸。
  22. 請求項４から２０のいずれか１項に記載の融合タンパク質またはその断片をコードする単離された核酸。
  23. 請求項２１に記載の核酸および／または請求項２２に記載の核酸を含むウイルスベクター。
  24. （ａ）請求項４～２０のいずれか１項に記載の融合タンパク質の第１の断片をコードする核酸を含む第１のウイルスベクターと、
    （ｂ）前記融合タンパク質の第２の断片をコードする第２のウイルスベクターと
    を含み、前記融合タンパク質の前記第１の断片および前記第２の断片が、前記融合タンパク質を形成するようにタンパク質トランススプライシングを受けることができる、請求項２３に記載の１対のウイルスベクター。
  25. 前記第１および／または第２のウイルスベクターが、請求項１～３のいずれか１項に記載のｇＲＮＡをコードする核酸をさらに含む、請求項２４に記載の１対のウイルスベクター。
  26. 請求項２１もしくは２２に記載の核酸、請求項２３に記載のウイルスベクター、および／または請求項２４もしくは２５に記載の１対のウイルスベクター、ならびに薬学的に許容される担体、希釈剤および／または賦形剤を含む医薬組成物。
  27. リポソームをさらに含む、請求項２６に記載の医薬組成物。
  28. 細胞内のＭＹＨ７遺伝子における突然変異を修正する方法であって、前記ＭＹＨ７遺伝子内またはその近傍の少なくとも１つのヌクレオチドの１つまたはそれ以上の突然変異をもたらす、前記ＭＹＨ７遺伝子内またはその近傍における１つまたはそれ以上の一本鎖切断（ＳＳＢ）を引き起こすために、Ｃａｓ９ニッカーゼもしくは非活性化Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、デアミナーゼ、および配列番号１もしくは２のいずれか１つから選択されるＤＮＡヌクレオチド配列を標的化するｇＲＮＡ、または前記Ｃａｓ９ニッカーゼもしくは非活性化Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、デアミナーゼおよび／もしくはｇＲＮＡをコードする１つもしくはそれ以上の核酸を前記細胞へ送達するステップを含み、その結果、前記ＭＹＨ７遺伝子における前記突然変異を修正する、方法。
  29. 前記細胞へ、請求項２１および／または請求項２２に記載の核酸を送達するステップを含む、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記細胞へ、請求項２３に記載の１つまたはそれ以上のウイルスベクターを送達するステップを含む、請求項２８に記載の方法。
  31. 前記細胞へ、請求項２４および／または２５に記載の１対のウイルスベクターを送達するステップを含む、請求項２８に記載の方法。
  32. それを必要とする対象において、ＭＹＨ７遺伝子における突然変異によって引き起こされる心筋症を治療する方法であって、前記ＭＹＨ７遺伝子内またはその近傍の少なくとも１つのヌクレオチドの１つまたはそれ以上の突然変異をもたらす、前記ＭＹＨ７遺伝子内またはその近傍における１つまたはそれ以上の一本鎖切断（ＳＳＢ）を引き起こすために、ＲＮＡによりガイドされるニッカーゼ、デアミナーゼ、および配列番号１もしくは２のいずれか１つから選択されるＤＮＡヌクレオチド配列を標的化するｇＲＮＡ、またはＲＮＡによりガイドされる前記ニッカーゼ、デアミナーゼ、および／もしくはｇＲＮＡをコードする１つもしくはそれ以上の核酸を前記ＭＹＨ７遺伝子を発現する前記対象における少なくとも１つの細胞へ送達するステップを含み、その結果、前記対象の少なくとも１つの細胞において前記ＭＹＨ７遺伝子における前記突然変異を修正する、方法。
  33. 前記対象へ、請求項２６または２７に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、請求項３２に記載の方法。
  34. 前記ＭＹＨ７遺伝子内の前記突然変異が、突然変異した前記ＭＹＨ７遺伝子によってコードされるタンパク質生成物における単一のアミノ酸置換をもたらす１つまたはそれ以上の単一ヌクレオチド多型を含む、請求項３２または３３に記載の方法。
  35. 前記タンパク質生成物が、ミオシンタンパク質またはペプチドであり、単一の前記アミノ酸置換が、配列番号９６によるＲ４０３Ｑを含む、請求項３４に記載の方法。
  36. ヒト化突然変異型Ｍｙｈ６対立遺伝子を形成するために、内因性マウスＭｙｈ６遺伝子内に挿入されたＭＹＨ７ ｃ．１２０８ Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｒ４０３Ｑ）ヒトミスセンス突然変異を含むヒト核酸を含む遺伝子編集されたマウス。
  37. 前記ヒト核酸が、前記ミスセンス突然変異に隣接しかつその上流にある第１のポリヌクレオチドと、前記ミスセンス突然変異に隣接しかつその下流にある第２のポリヌクレオチドとをさらに含む、請求項３６に記載の遺伝子編集されたマウス。
  38. 前記第１のポリヌクレオチドが、約３０～７５ヌクレオチド、約３５～約７０ヌクレオチド、約４０～約６５ヌクレオチドまたは約４５～約６０ヌクレオチドを含む、請求項３７に記載の遺伝子編集されたマウス。
  39. 前記第１のポリヌクレオチドが、５５ヌクレオチドを含むかまたはからなる、請求項３８に記載の遺伝子編集されたマウス。
  40. 前記第２のポリヌクレオチドが、約１０～３０ヌクレオチド、約１５～２５ヌクレオチドまたは約２０～２５ヌクレオチドを含む、請求項３６～３９のいずれか１項に記載の遺伝子編集されたマウス。
  41. 前記第２のポリヌクレオチドが、２１ヌクレオチドを含むかまたはからなる、請求項３６から４０のいずれか１項に記載の遺伝子編集されたマウス。
  42. 前記ヒト核酸が、配列番号９７のヌクレオチド配列を含む、請求項３６～４１のいずれか１項に記載の遺伝子編集されたマウス。
  43. 前記マウスの少なくとも１つの細胞が、配列番号９４を含む野生型ミオシンタンパク質と比較して、Ｒ４０４Ｑ置換を含む突然変異型ミオシンタンパク質を発現する、請求項３６～４２のいずれか１項に記載の遺伝子編集されたマウス。
  44. 野生型Ｍｙｈ６対立遺伝子をさらに含み、前記ヒト化突然変異型Ｍｙｈ６対立遺伝子についてヘテロ接合性である、請求項３６～４３のいずれか１項に記載の遺伝子編集されたマウス。
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